ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ

Transcription

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
DOKTORA TEZİ
Bilge ALAN
DOĞU AKDENİZ BÖLGESİ’NDE YETİŞTİRİLEN BAZI KIŞLIK
SEBZELERDE HASTALIK YAPAN VİRÜSLERİN TANILANMASI ve
KARAKTERİZASYONU
BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI
ADANA, 2012
SEBZELERDE GÖRÜLEN VİRÜS HASTALIKLARININ SAPTANMASI
Bilge ALAN
DOKTORA TEZİ
Bu Tez 31/01/2012 Tarihinde Aşağıdaki
Oybirliği/Oyçokluğu ile Kabul Edilmiştir.
Jüri
Üyeleri
Tarafından
………………................................................. ……………………........... ..………………………….....
Yard. Doç. Dr. Muharrem A. KAMBEROĞLU Prof. Dr. Mukaddes KAYIM Doç. Dr. Yıldız AKA KAÇAR
DANIŞMAN
ÜYE
ÜYE
...………………......................
Doç. Dr. Doç. Dr. Nihal BUZKAN
.……………………….
Bayram ÇEVİK
ÜYE
ÜYE
Bu Tez Enstitümüz Bitki Koruma Anabilim Dalında hazırlanmıştır.
Kod No:
Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL
Enstitü Müdürü
Bu Çalışma Ç. Ü. Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir.
Proje No: ZF2007D28
Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge ve fotoğrafların kaynak
gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.
ÖZ
DOKTORA TEZİ
SEBZELERDE HASTALIK YAPAN VİRÜSLERİN TANILANMASI ve
KARAKTERİZASYONU
BİLGE ALAN
Danışman : Yrd. Doç. Dr. Muharrem A. KAMBEROĞLU
Yıl: 2012, Sayfa:134
Jüri
: Yrd. Doç. Dr. Muharrem A. KAMBEROĞLU
: Prof. Dr. Mukaddes KAYIM
: Doç. Dr. Yıldız AKA KAÇAR
: Doç. Dr. Nihal BUZKAN
: Doç. Dr. Bayram ÇEVİK
Çalışma, 2007-2010 yılları arasında Doğu Akdeniz Bölgesi’nde yetiştirilen
bazı kışlık sebzelerde (marul, ıspanak, lahana, karnabahar, turp) mevcut virüs
hastalıklarının saptanması ve yaygınlık oranlarının belirlenmesi amacıyla
yürütülmüştür. Surveylerde, simptomatolojik olarak, CMV, TSWV, TuMV, LMV,
MiLBVV, CaMV, RaMV, BWYV, BCTV, BtMV, LBVV ve LiYV ile infekteli
olduğundan şüphelenilen 808 marul, 330 lahana, 137 karnabahar, 225 ıspanak, 65
turp bitkisinden toplam 1595 örnek alınmış ve ELISA yöntemi ile testlenmiştir.
Marulda, MiLBVV, LMV, TSWV, CMV, BWYV sırasıyla 380, 82, 3, 3, 3 bitkide;
ıspanakta BWYV, CMV sırasıyla, 90, 3 bitkide, turpta BWYV, CMV, TuMV
sırasıyla 11, 6, 3 bitkide saptanırken, lahana örneklerinden 10 tanesi TuMV,
karnabahar örneklerinden 1 tanesi de CaMV ile infekteli bulunmuştur. Testlenen
örneklerden 595’inin en az bir virüs ile bulaşık olduğu saptanmış ve infeksiyon oranı
%37.3 olarak hesaplanmıştır.
RT-PCR çalışmalarında beklenen band büyüklükleri elde edilmiştir. Dizi
analizleri sonucunda, çalışmada kullanılan CMV izolatı, Güney Kore, Japonya, Çin
izolatları ile % 44; TSWV izolatı Yunanistan, Sırbistan, Güney Kore izolatları ile %
96; TuMV izolatı Çin izolatı ile %84; LMV izolatı Amerika izolatı ile %99;
MiLBVV izolatı Hollanda izolatı ile % 98; CaMV izolatı, Çin izolatı ile %95;
BWYV izolatı Çin izolatı ile %89; LBVV izolatı ise, İspanya izolatı ile %95
oranında ile benzerlik göstermiştir.
Anahtar kelimeler: Kışlık Sebzeler, DAS-ELISA, Mekanik İnokulasyon, RT-PCR,
Dizi Analizi
I
ABSTRACT
PhD THESIS
IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF VIRUSES
CAUSING DISEASE IN SOME WINTER VEGETABLES GROWN IN THE
EASTERN MEDITERRANEAN REGION
Bilge ALAN
UNIVERSITY OF CUKUROVA
INSTITUTE OF BASIC AND APPLIED SCIENCE
DEPARTMENT OF PLANT PROTECTION
Supervisor : Asst. Prof. Muharrem Arap KAMBEROGLU
Year: 2012, Pages: 134
Jury
: Asst. Prof. Muharrem Arap KAMBEROGLU
: Prof. Dr. Mukaddes KAYIM
: Assoc. Prof. Dr. Yıldız AKA KACAR
: Assoc. Prof. Nihal BUZKAN
: Assoc. Prof. Bayram CEVİK
This study was carried out to detect the viruses and determine their
prevalence on winter vegetable species (lettuce, spinach, cabbage, cauliflower,
radish) cultivated in the Eastern Mediterranean region between 2007-2012.
Samples were taken from 808 lettuce, 330 cabbage, 225 spinach, 65 radishes
and 137 cauliflower plants suspected of being infected with CMV, TSWV, TuMV,
BWYV, LMV, LBVV, CaMV, RaMV, LiYV, BtMV, or BCTV. Totally 1595 plant
samples were tested by ELISA. MiLBVV, LMV, TSWV, CMV, and BWYV were
detected in 380, 82, 3, 3, 3 of lettuce samples respectively. BWYV and CMV were
detected in 90 and 3 of spinach samples, respectively. BWYV, CMV, TuMV were
detected in 11, 6, 3 of radish plants respectively. In addition, 10 cabbage and one
cauliflower plants were found to be infected with TuMV and CaMV respectively. At
least one virus was detected in 595 samples and infection rate of tested plants was
37.3 %. Expected sizes of DNA bands were obtained from RT PCR studies.
Sequence analysis of CMV isolate used in this study showed 44% similarity with
isolates from South Korea, Japan, and China; TSWV isolate showed 96% similarity
with isolates from Greece, Serbia, and South Korea; TuMV isolate showed 84%
similarity with a Chinese isolate; LMV isolate showed 99% similarity with an
American isolate; MiLBVV isolate 98% with and isolate rom Netherland; CaMV
isolate showed 95% similarity with a Chinese isolate, BWYV isolate showed 89%
similarity with a Chinese isolate; and LBVV isolate showed 95% similarity with an
isolate from Spain.
Key Words: Winter Vegetables, Mechanical Inoculation, DAS-ELISA, RT-PCR,
Sequence Analysis
II
TEŞEKKÜR
Çalışmalarımın yürütülmesinde beni yönlendiren danışman hocam Sayın
Yard. Doç. Dr. Muharrem Arap KAMBEROĞLU’na teşekkür ederim.
Çalışmalarımda bilgi ve deneyimleri ile yardımcı ve destek olan Sayın
Mehmet Asil YILMAZ’a teşekkür ederim.
Çalışmalarımın her aşamasında bilgi ve deneyimleri ile bana özveriyle
yardımcı ve destek olan Sayın Prof. Dr. Saadettin BALOĞLU’na teşekkür ederim.
Doktora tezi jüri ve tez izleme komitesi üyeleri Sayın Prof. Dr. Kazım
ABAK, Sayın Prof. Dr. Mukaddes KAYIM, Sayın Doç. Dr. Yıldız AKA KAÇAR,
Sayın Doç. Dr. Nihal BUZKAN ve Sayın Doç. Dr. Bayram ÇEVİK’e çalışmamda
yapıcı, yönlendirici ve olumlu katkılarından dolayı teşekkür ederim.
Laboratuar çalışmalarımdaki yardımlarından ve manevi destekleri ile her
zaman yanımda olan Dr. Hakan FİDAN, Dr. Behçet Kemal ÇAĞLAR ve Zir. Yük.
Müh. A. Dilara ÇETİNKIRAN’a teşekkür ederim.
Hayatımın her aşamasında olduğu gibi doktora çalışmalarım sırasında da
maddi ve manevi hiçbir desteğini esirgemeyen ve beni destekleyen ailemin tüm
fertlerine, gösterdikleri büyük sabırdan dolayı eşim Haşim ALAN ve kızım Defne
Berra ALAN’ a teşekkür ederim.
Projemin yürütülmesinde çalışmalarıma maddi olanak sağlayan Ç.Ü.
Araştırma Fonuna teşekkür ederim
III
İÇİNDEKİLER
SAYFA
ÖZ ......................................................................................................................... ..I
ABSTRACT .......................................................................................................... .II
TEŞEKKÜR .......................................................................................................... III
İÇİNDEKİLER ...................................................................................................... IV
ÇİZELGELER DİZİNİ ........................................................................................ VIII
ŞEKİLLER DİZİNİ ............................................................................................... .X
SİMGELER VE KISALTMALAR ................................................................... .XIV
1. GİRİŞ ...................................................................................................................1
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR .....................................................................................9
2.1. Hıyar Mozaik Virüsü (Cucumber mosaic virus, CMV) ...................................9
2.2. Domates Lekeli Solgunluk Virüsü (Tomato spotted wilt virus, TSWV ........ 10
2.3. Şalgam Mozaik Virüsü (Turnip mosaic virus, TuMV) ................................. 12
2.4. Marul Mozaik Virüsü (Lettuce mosaic virus, LMV) .................................... 15
2.5. Marul iri damar virüsü (Miraflori Lettuce big vein virus, LBVV) ................ 17
2.6. Karnabahar Mozaik Virüsü (Cauliflower mosaic virus, CaMV)................... 21
2.7. Turp Mozaik Virüsü (Radish mosaic virus, RaMV) ..................................... 22
2.8. Şekerpancarı Batı Sarılık Virüsü (Beet western yellow virus, BWYV) ........ 23
2.9. Şekerpancarı Tepe Kıvırcıklık Virüsü (Beet curly top virus, BCTV) ........... 26
2.10. Şekerpancarı Mozaik Virüsü (Beet mosaic virus, BtMV) .......................... 27
2.11. Marul Bulaşıcı Sarılık Virüsü (Lettuce infection yellow virus, LIYV) ....... 28
2.12. Türkiye’de Yapılan Çalışmalar .................................................................. 29
3. MATERYAL VE METOD ................................................................................ 33
3.1. Materyal....................................................................................................... 33
3.1.1. Survey Alanı ve Çalışma Materyali Hakkında Bilgiler .......................... 33
3.1.2. Serolojik Çalışmalarda Kullanılan Materyal ........................................ 35
3.1.3. Mekanik İnokulasyon Çalışmalarında Kullanılan Materyal ................... 35
3.1.4. Toplam Nükleik Asit İzolasyon Çalışmalarında Kullanılan
Materyal ............................................................................................... 36
IV
3.1.5. RT-PCR ve PCR Çalışmalarında Kullanılan Materyal .......................... 36
3.1.6. Agaroz Jel Elektroforez Çalışmalarında Kullanılan Materyal................ 38
3.2. Metod .......................................................................................................... 39
3.2.1. Survey Çalışmaları, Bitki Örneklerinin Toplanması ve Muhafazası ...... 39
3.2.2. İndikatör Bitkilerin Yetiştirilmesi ......................................................... 41
3.2.3. Serolojik Çalışmalar ............................................................................. 41
3.2.3.1. DAS-ELISA ...................................................................................... 42
3.2.4. Mekanik İnokulasyon Yöntemi............................................................. 42
3.2.5. Toplam Nükleik Asit İzolasyonu .......................................................... 43
3.2.6. RT- PCR ve PCR Çalışmaları ............................................................... 44
3.2.7. Agarose Gel Elektroforez Çalışmaları................................................... 48
3.2.8. Dizi Analizleri ve Filogenetik Sınıflandırma Çalışmaları ...................... 48
4. BULGULAR VE TARTIŞMA........................................................................... 51
4.1. Survey ve Örnekleme Çalışmaları ................................................................ 51
4.2. DAS-ELISA................................................................................................. 60
4.3. Mekanik İnokulasyon Çalışmaları ................................................................ 64
4.4. Toplam Nükleik Asit İzolasyon Çalışmaları ................................................. 76
4.5. RT-PCR ve PCR Çalışmaları ....................................................................... 76
4.6. Dizi Belirleme ve Filogenetik Sınıflandırma Çalışmaları .............................. 81
4.6.1. Hıyar Mozaik Virüsü (CMV) Dizi Analizi Çalışması ........................... 81
4.6.2. Domates Lekeli Solgunluk Virüsü (TSWV) Dizi Analizi Çalışması...... 84
4.6.3. Şalgam Mozaik Virüsü (TuMV) Dizi Analizi Çalışması ....................... 87
4.6.4. Marul Mozaik Virüsü (LMV) Dizi Analizi Çalışması ........................... 91
4.6.5. Marul İri Damar Virüsü (MİLBVV) Dizi Analizi Çalışması ................. 94
4.6.6. Marul İri Damar Virüsü (LBVV) Dizi Analizi Çalışması ...................... 98
4.6.7. Karnabahar Mozaik Virüsü (CaMV) Dizi Analizi Çalışması………….101
4.6.8. BWYV Şekerpancarı Batı Sarılık Virüsü (BWYV) Dizi Analizi
Çalışması............................................................................................ 103
V
5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER ......................................................................... 105
KAYNAKLAR ……………………………………….………..……...……....…..111
ÖZGEÇMİŞ ........................................................................................................ 129
EKLER ................................................................................................................ 130
VI
VII
İÇİNDEKİLER
SAYFA
ÖZ ......................................................................................................................... ..I
ABSTRACT .......................................................................................................... .II
TEŞEKKÜR .......................................................................................................... III
İÇİNDEKİLER ...................................................................................................... IV
1. GİRİŞ ...................................................................................................................1
3.1. Materyal....................................................................................................... 33
Materyal ............................................................................................... 36
IV
3.2. Metod .......................................................................................................... 39
3.2.3.1. DAS-ELISA ...................................................................................... 42
4.2. DAS-ELISA................................................................................................. 60
Çalışması............................................................................................ 103
V
KAYNAKLAR ……………………………………….………..……...……....…..111
ÖZGEÇMİŞ ........................................................................................................ 129
EKLER ................................................................................................................ 130
VI
VII
İÇİNDEKİLER
SAYFA
ÖZ ......................................................................................................................... ..I
ABSTRACT .......................................................................................................... .II
TEŞEKKÜR .......................................................................................................... III
İÇİNDEKİLER ...................................................................................................... IV
1. GİRİŞ ...................................................................................................................1
3.1. Materyal....................................................................................................... 33
Materyal ............................................................................................... 36
IV
3.2. Metod .......................................................................................................... 39
3.2.3.1. DAS-ELISA ...................................................................................... 42
4.2. DAS-ELISA................................................................................................. 60
Çalışması............................................................................................ 103
V
KAYNAKLAR ……………………………………….………..……...……....…..111
ÖZGEÇMİŞ ........................................................................................................ 129
EKLER ................................................................................................................ 130
VI
VII
İÇİNDEKİLER
SAYFA
ÖZ ......................................................................................................................... ..I
ABSTRACT .......................................................................................................... .II
TEŞEKKÜR .......................................................................................................... III
İÇİNDEKİLER ...................................................................................................... IV
1. GİRİŞ ...................................................................................................................1
3.1. Materyal....................................................................................................... 33
Materyal ............................................................................................... 36
IV
3.2. Metod .......................................................................................................... 39
3.2.3.1. DAS-ELISA ...................................................................................... 42
4.2. DAS-ELISA................................................................................................. 60
Çalışması............................................................................................ 103
V
KAYNAKLAR ……………………………………….………..……...……....…..111
ÖZGEÇMİŞ ........................................................................................................ 129
EKLER ................................................................................................................ 130
VI
VII
ÇİZELGELER DİZİNİ
SAYFA
Çizelge 1.1.
Kışlık olarak yetiştirilen bazı sebzelerin türleri ve familyası ............ 1
Çizelge 1.2.
Dünyada kışlık sebze (marul, ıspanak, karnabahar, lahana ve turp)
üretiminin ülkelere göre dağılımı (FAO, 2008)................................ 3
Çizelge 1.3.
Kışlık sebzelerin (marul, ıspanak, karnabahar, lahana ve turp) Türkiye
üretim miktarı ve Adana, Mersin, Hatay, Osmaniye ve
Kahramanmaraş illerine dağılımı (TUİK, 2009) .............................. 5
Çizelge 1.4.
Marul bitkisinde görülen hastalık yapan bazı viral etmenler............. 7
Çizelge 1.5. Lahana, karnabahar ve turp bitkisinde görülen hastalık
yapan bazı viral etmenler ................................................................ 7
Çizelge 1.6.
Ispanak bitkisinde görülen hastalık yapan bazı viral etmenler ......... 8
Çizelge 3.1.
Survey yapılan il ve ilçeler, survey alanlarının büyüklüğü (da) ve
örneklenen bitki sayıları .................................................................. 34
Çizelge 3.2.
Mekanik inokulasyon çalışmalarında kullanılan test bitkileri ve
testlenen virüsler ............................................................................. 36
Çizelge 3.3.
Çalışmada kullanılan primer çiftleri ve çoğaltılan bölgenin moleküler
büyüklüğü ....................................................................................... 38
Çizelge 3.4.
Surveylerde kışlık sebzelerde aranan simptomlar ............................. 40
Çizelge 3.5.
PCR ve RT-PCR çalışmalarında kullanılan virüs izolatları,
survey alanı bitki türü ..................................................................... 45
Çizelge 3.6.
RT-PCR ve PCR çalışmasında kullanılan sıcaklık döngüleri............ 47
Çizelge 3.7.
Dizi belirleme çalışmalarında kullanılan virüs, izolat, survey alanı ve
bitki türü ......................................................................................... 49
Çizelge 4.1.
Marul ve lahana survey alanı (da), testlenen ve infekteli bulunan bitki
sayıları ............................................................................................ 62
Çizelge 4.2.
Karnabahar, ıspanak ve turp survey alanı (da), testlenen ve infekteli
bulunan bitki sayıları....................................................................... 63
Çizelge 4.3.
ELISA’da testlenen örneklerde saptanan virüsler ve bulaşıklık
oranları …....................................................................................... 64
VIII
Çizelge 4.4.
Mekanik inokulasyon yapılan indikatör bitkiler ve gözlenen
simptomlar ...................................................................................... 75
Çizelge 4.5.
NCBI Blast: Nükleotid Dizi programına girilen RNA-Polimeraz
gen dizisine göre CMV-I izolatının dünya izolatları ile benzerlik
oranları .......................................................................................... 83
Çizelge 4.6.
NCBI Blast: Nükleotid Dizi programına girilen kılıf protein
gen dizisine göre TSWV-1 izolatının dünya izolatları ile benzerlik
oranları .......................................................................................... 86
Çizelge 4.7.
gen dizisine göre TuMV-T izolatının dünya izolatları ile benzerlik
oranları ........................................................................................... 89
Çizelge 4.8.
gen dizisine göre LMV-4 izolatının dünya izolatları ile benzerlik
oranları ........................................................................................... 93
Çizelge 4.9.
gen dizisine göre MiLBVV-4 izolatının dünya izolatları ile benzerlik
oranları ........................................................................................... 97
Çizelge 4.10. NCBI Blast: Nükleotid Dizi programına girilen kılıf protein
gen dizisine göre LBVV-2 izolatının dünya izolatları ile benzerlik
oranları100
Çizelge 4.11. NCBI Blast: Nükleotid Dizi programına girilen kılıf protein
gen dizisine göre CaMV-1 izolatının dünya izolatları ile benzerlik
oranları ........................................................................................ 102
Çizelge 4.12. NCBI Blast: Nükleotid Dizi programına girilen tamamlayıcı
gen dizisine göre BWYV-Tizolatının dünya izolatları ile benzerlik
oranları ......................................................................................... 104
IX
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 4.1.
SAYFA
Marul, lahana, turp, karnabahar, ıspanak örnek sayıları ve yüzde oranları
............................................................................................................ 54
Şekil 4.2.
(A, B, C, D) MiLBVV ile infekteli marul yapraklarında renk
koyulaşması, damar açılması ve şekil bozukluğu, ................................ 55
Şekil 4.3.
(A, B, C, D) LMV ile infekteli marullarda sarama, yapraklarda
kabarcıklar, şekil bozukluğu ve mozaik simptomları............................ 56
Şekil 4.4. (A) CMV ve MiLBVV karışık infeksiyonunda marul yapraklarında
damar açılması ve sararma (B) MiLBVV ve LBVV ile infekteli marul
yapraklarında şekil bozukluğu, nekroz ve damar açılması (C) TSWV ile
infekteli marul yapraklarında nekrotik lezyonlar (D) TSWV ile infekteli
marul yapraklarında nekroz (E) CMV ile infekteli marul yapraklarında
şekil bozukluğu ve sararma (F) BWYV ile infekteli marulda sararma,
şekil bozukluğu ve gelişme geriliği. ..................................................... 57
Şekil 4.5. (A) BWYV ile infekteli turp yaprağında sararma (B) TuMV ve BWYV
ile infekteli turp yaprağında mozaik (C) TuMV ve BWYV ile infekteli
turp yaprağında mozaik (D) TuMV ve BWYV ile infekteli turp
yaprağında mozaik ve sararma (E) TuMV ve BWYV ile infekteli turp
yaprağında şekil bozukluğu ve mozaik (F) CMV ve BWYV infekteli turp
yaprağında şekil bozukluğu ve mozaik ................................................ 58
Şekil 4.6. (A, B) BWYV ile infekteli ıspanak’da sararma ve gelişme geriliği (C)
CMV ile infekteli ıspanak yapraklarında şekil bozukluğu (D) CMV ile
infekteli ıspanak yaprağında mozaik, sararma ve şekil bozukluğu ........ 59
Şekil 4.7. (A) TuMV ile infekteli K. lahana yaprağında halkalı lekeler (B) TuMV
ile infekteli lahana yaprağında mozaik, sararma ve damar bandlaşması
(C) CaMV ile infekteli karnabahar yaprağında mozaik ve damar açılması
(D) TuMV ile infekteli lahana yapraklarında mozaik ve sararma ........ 60
Şekil 4.8. CMV ile infekteli (A) N. tabacum L. cv. Xanthi nc yapraklarında mozaik
(B) N. tabacum L. cv. Xanthi nc yapraklarında şekil bozukluğu (C) N.
rustica yapraklarında mozaik (D) kabak yapraklarında mozaik ............ 66
X
Şekil 4.9. CMV ile infekteli A) C. amaranticolor yapraklarında klorotik lokal
lezyon (B) N. benthamiana yapraklarında sararma (C) N. tabacum L. cv.
‘Samsun’ yapraklarında mozaik (D) N glutinosa yapraklarında şekil
bozukluğu ............................................................................................ 67
Şekil 4.10. LMV ile infekteli (A) marul yaprağında mozaik, (B, C) C. amaranticolor
yapraklarında klorotik lokal lezyon (D) C. amaranticolor ‘da nekrotik
lokal lezyon ......................................................................................... 69
Şekil 4.11. MiLBVV infekteli marul yaprağında. (A) damar bandlaşması, mozaik ve
sararma (B) MiLBVV infekteli marul yapraklarında sararma, mozaik,
damar bandlaşması ve daralma ............................................................ 70
Şekil 4.12. TSWV ile infekteli A) N. tabacum L. cv. Xanthi yaprağında meşe yaprağı
deseni ve şekil bozukluğu (B) N. tabacum L. cv. Xanthi yaprağında
nekrotik lokal lezyonlar (C) N. tabacum L. cv. ‘Samsun’ yaprağında
nekrotik lokal lezyonlar ve halkalı lekeler (D) N. tabacum L. cv.
‘Samsun’ yaprağında halkalı lekeler (E) N. tabacum L. cv. Xanthi nc
yaprağında nekrotik lokal lezyonlar (F) C. quinoa ‘da klorotik lokal
lezyonlar.............................................................................................. 72
Şekil 4.13. CaMV ile infekteli (A) karnabahar yapraklarında mozaik (B) lahana
yapraklarında mozaik .......................................................................... 74
Şekil 4.14. TuMV ile infekteli C. amaranticolor yapraklarında klorotik
lokal lezyon ......................................................................................... 74
Şekil 4.15. LBVV’e spesifik primer çifti kullanılarak yapılan Mersin ve Hatay
illerine ait marul izolatları RT-PCR sonuçları (M; 50 bç DNA ladder
A;LBVV-1, B;LBVV-2, C;LBVV-3, D;LBVV-4, E;LBVV-5, F; LBVV6) ........................................................................................................ 77
Şekil 4.16. MiLBVV ye ait primer çifti kullanılarak yapılan Mersin, Adana, Hatay
illerine ait marul’izolatları RT-PCR sonuçları (M; 50 bç DNA ladder,
A;MiLBVV-1, B;MiLBVV-2, C;MiLBVV-3, D;MiLBVV-4,
E;MiLBVV-5, F;MiLBVV-6) .............................................................. 77
XI
Şekil 4.17. LMV ye ait primer çiftleri ve Mersin, Adana, Hatay illerine ait
marul’izolatları ile yapılan RT-PCR sonuçları (M; 50 bç DNA ladder, AB;LMV-1, C-D;LMV-2, E-F;LMV-3) ................................................. 78
Şekil 4.18. CMV ve TSWV’ye ait primer çiftleri ve CMV-turp, CMV-ıspanak, CMV
marul ve TSWV-marul izolatları ile yapılan RT-PCR sonuçları (M;1kb
DNA ladder, A;CMV-T1, B;CMV-T2, C;CMV-I D;CMV-M, E;TSWV1, F;TSWV-2, G;TSWV-3).................................................................. 79
Şekil 4.19. CaMV, TuMV ve BWYV’e ait primer çiftleri ile yapılan RT-PCR
sonuçları (M; 50bç DKA ladder, A;CaMV, B;TuMV-T, C;TuMV-L
izolatı, D;BWYV-M, E;BWYV-T, F;BWYV-I)................................... 80
Şekil 4.20. CMV’nin izolatının farklı üretim bölgelerinden (Japonya, Çin, G.Kore,
Macaristan, Polonya, Avusturalya, İspanya, Amerika) CMV izolatlarıyla
filogenetik ilişkisini gösteren soyağacı (Boostrap 100 tekrarlamalı) ..... 82
Şekil 4.21. TSWV-1 izolatının farklı üretim bölgelerinden (Yunanistan, Sırbistan, G.
Kore, Endonezya, Fransa, Çin, Hollanda) TSWV izolatlarıyla filogenetik
ilişkisini gösteren soyağacı(Boostrap 100 tekrarlamalı) ....................... 85
Şekil 4.22. TuMV-T izolatının farklı üretim bölgelerinden (Japonya, Vietnam, Çin,
İngiltere, YeniZelanda, Tayvan) TuMV izolatlarıyla filogenetik ilişkisini
gösteren soyağacı (Boostrap 100 tekrarlamalı) ..................................... 88
Şekil 4.23. LMV izolatının farklı üretim bölgelerinden (Amerika, Fransa, Brezilya,
Çin, İsrail) LMV izolatlarıyla filogenetik ilişkisini gösteren soyağacı
(Boostrap 100 tekrarlamalı) ................................................................. 92
Şekil 4.24. MiLBV-4 izolatının farklı üretim bölgelerinden (Avusturalya, İspanya,
Almanya, Hollanda) MiLBVV izolatlarıyla filogenetik ilişkisini gösteren
soyağacı (Boostrap 100 tekrarlamalı) ................................................... 96
Şekil 4.25. LBVV-2 izolatının farklı üretim bölgelerinden (Avusturalya, Japonya,
Brezilya, İspanya,İngiltere) LBVV izolatlarıyla filogenetik ilişkisini
gösteren soyağacı (Boostrap 100 tekrarlamalı) ..................................... 99
Şekil 4.26. CaMV-1 izolatının farklı üretim bölgelerinden (Çin, Fransa) CaMV
izolatlarıyla filogenetik ilişkisini gösteren soyağacı (Boostrap 100
tekrarlamalı) ...................................................................................... 102
XII
Şekil 4.27. BWYV-T izolatının farklı üretim bölgelerinden (Çin, Fransa) BWYV
tekrarlamalı) ...................................................................................... 104
XIII
SİMGELER VE KISALTMALAR
µl
:
Mikrolitre
°C
:
Santigrad derece
A
:
Adenin (Adenine)
AMV
:
Yonca mozaik virüsü (Alfalfa mosaic virus)
APS
:
Amonyuım persulfat (Ammonium persülfate)
BBWV
:
Bakla solgunluk virüsü (Broad bean wilt virus)
BCTV
:
Şeker pancarı tepe kıvırcıklık virüsü (Beet curly top virus)
BLAST
:
Basic local aligment search tool
BMCTV
:
Şeker pancarı hafif kıvırcıklık virüsü (Beet mild curly top
virus)
BMYV
:
Şeker pancarı hafif sararma virüsü (Beet mild yellowing virüs)
BNYVV
:
Pancar nekrotik sarı damar virüsü (Beet necrotic yellow vein
virus)
Bp
:
Baz çifti (Base pair)
BPYV
:
Şeker pancarı yalancı sarılık virüsü (Beet pseudo-yellows
virus)
BSA
:
Bovine serum albumin
BSCTV
:
Şeker pancarı şiddetli sararma virüsü (Beet severe curly top
virus)
BtMV
:
Şeker mozaik virüsü (Beet mosaic virus)
BWYV
:
Şeker pancarı sarılık virüsü (Beet western yellow virus)
BYV
:
Şeker sarılık virüsü (Beet yellow virüs)
C
:
Sitozin (Cytosine)
CaMV
:
Karnabahar mozaik virüsü (Cauliflower mosaic virus)
cDNA
:
Komplementer Deoksiribonükleikasid
CMV
:
Hıyar mozaik virüsü (Cucumber mosaic virus)
CP
:
Kılıf protein (Coat protein)
CYSDV
:
Kabakgillerde sarı yanıklar oluşturan virüs (Cucurbit yellow
stunting disorder virus)
XIV
Da
:
Dalton
dATP
:
Deoksiadenozintrifosfat
dCTP
:
Deoksisitidintrifosfat
dd
:
Çift distile
dGTP
:
Deoksiguanozintrifosfat
DİECA-Na
:
Sodyum dietildithiocarbomat
DNA
:
Deoksiribonükleikasid
dNTP
:
Deoksinükleotidtrifosfat
dsRNA
:
Çift iplikli (Double stranded)
DTT
:
Dithiothreitol
EDTA
:
Ethylenediaminetetraacetic acid
EG
:
Elektroforez buffer
ELISA
:
Enzim-linked ımmunosorbent assay
G
:
Guanin (Guanine)
gr
:
Gram
H2O
:
Su
Kb
:
Kilo baz (Kilo base)
kDa
:
Kilo dalton
LBVV
:
Marul iri damar virüsü (Lettuce big vein virus)
LMV
:
Marul mozaik virüsü (Lettuce mosaic virus)
Lt
:
Litre
M
:
Molarite
mg
:
Miligram
MiLBVV
:
Marul iri damar virüsü (Miraflori lettuce big vein virus)
ml
:
Mililitre
mM
:
Milimolar
M-MLV
:
Moloney murine leukemia virus
Mol
:
Mol
MW
:
Molekül ağırlığı
NaDİECA
:
Sodium N, N-Diethylidithiocarbamate, Trihydrate
NCBI
:
The national center for biotechnology ınformation
XV
Nm
:
Nanometre
PAGE
:
Polyacrilamid jel elektroforez
PBNS
:
Yerfıstıgı tomurcuk nekroz virüsü (Peanut bud necrosis virus)
PBS
:
Fosfat tuz tampon çözeltisi (Phosphate buffered saline)
PCR
:
Polimeraz zincir reaksiyonu (Polimeraz chain reaction)
PEG
:
Polietilen Glikol
pH
:
Hidrojen iyonu konsantrasyonu
Pmol
:
Pikomol
Pr
:
Primer
PVX
:
patates x virüsü (Potato virus X)
RaMV
:
Turp mozaik virüsü (Radish Mosaic Virus)
RNA
:
Ribonükleik asit
RNAaz
:
Ribonükleaz
Rpm
:
Dakikadaki devir sayısı
RT
:
Tersine transkripsiyon (Reverse transcription)
T
:
Timin (Thymine)
TAE
:
Tris Asetik Asit
Taq
:
Taq polimeraz (Taq Polymerase)
TCV
:
Turnip crinkle virus
TE
:
Tris EDTA
Tm
:
Termal erime.
TMV
:
Tütün mozaik virüsü (Tobacco mosaic virus)
ToMV
:
Domates mozaik virüsü (Tomato mosaic virus)
TRoV
:
Şalgam rozetleşme virüsü (Turnip rosette virus)
TStV
:
Tütün bodurluk virüsü (Tobacco stunt virus)
TSWV
:
Domates lekeli solgunluk virüsü (Tomato spotted wilt virus)
TuMV
:
Şalgam mozaik virüsü (Turnip mosaic virus)
TYMV
:
Şalgam sararma mozaik virüsü (Turnip yellow mosaic virus)
u
:
Ünite
V
:
Hacim
W/V
:
Ağırlık/Hacim
XVI
1.GİRİŞ
Bilge ALAN
1. GİRİŞ
Türkiye’de önemli bir yere sahip olan sebze tarımı, günümüz ülke nüfusunun
yılda ortalama %2 civarında artmaya devam etmesiyle daha da önem kazanmıştır.
Bugün, insan yaşamı için dengeli beslenmenin sebzesiz olamayacağı, sağlıklı ve
dengeli beslenmenin ana unsurlarından birinin sebze tüketimi olduğu herkes
tarafından bilinmektedir. Bu sebeple sebze üretiminde en iyi, en yüksek verim ve
kalite yakalama çalışmaları ve bunun için yapılan geliştirme faaliyetleri, dünyada ve
ülkemizde çok hızlı bir şekilde ilerlemeye devam etmektedir.
Hem işlenerek, hem de taze olarak değerlendirilen tek veya çok yıllık otsu
bitkiler olan sebzelerin, kök, gövde, sürgün, yaprak, çiçek, meyve ve tohum gibi
bütün kısımları gıda kaynağıdır. Doyurucu özellikleri nedeniyle önemli bir diyet
yiyeceği olan sebzeler, düşük yağ içeriğine sahip olup, vitamin, mineral madde,
karbonhidrat ve protein kaynağıdır. Marul, lahana, karnabahar, turp ve ıspanak
günümüzde Türkiye dâhil olmak üzere dünyanın birçok ülkesinde yaygın olarak
yetiştiriciliği yapılan kış sebzeleridir (Çizelge 1.1). Bu sebzeler ülkemizin kışın çok
soğuk veya çok yağış alan kısımlar hariç diğer bölgelerinde rahatlıkla üretilmektedir.
Çizelge 1.1. Kışlık olarak yetiştirilen bazı sebzelerin türleri ve familyası
Sebze Türleri
Bitki Türleri
Familya
Marul
Lactuca sativa
Asteraceae
Lahana
Brassica oleracea var. capitata
Brassicacea
Karnabahar
Brassica oleracea var. botrytis
Brassicacea
Turp
Raphanus sativus
Brassicacea
Ispanak
Spinacia oleracea
Amaranthaceae
Yılın her mevsiminde salatalarımızın lezzetli ve besleyici öğesi olan marul,
Asteraceae familyası içerisinde, yaprağı yenilen, içerdiği A ve C vitaminleri ve
mineral maddeler ile iştah açıcı sebzeler grubunda bulunan ve bol miktarda tüketilen
bir sebzedir. Türkiye, dünya marul üretiminde önemli bir ülke konumundadır.
Ülkemizde hemen hemen tüm bölgelerde evlerin bahçelerinde yetiştirilen marulun,
1
1.GİRİŞ
Bilge ALAN
ticari boyutta üretimi ise Ege, Marmara ve Akdeniz bölgelerinde haziran-ağustos
arasındaki aylar hariç yılın her mevsiminde yapılmaktadır (Polat, 2001)
Brassicacea familyası içerisinde yer alan yaprağı tüketilen lahana, yumrusu
tüketilen turp ve çiçeği tüketilen karnabahar sebzeleri içerisindeki lahananın büyük
bir kısmı Karadeniz bölgesinde üretilmektedir (Saygılı, 2005). Yıllık veya iki yıllık
kültür bitkilerinden olan turp, diğer ülkelerde olduğu gibi ülkemizde de geniş
alanlarda yetiştirilmekte ve yıl boyunca tüketilmektedir (megep.meb.gov.tr). Soğuk
bölgelerimizde, sebze olarak değerlendirilen
kısımları zarar gördüğü için
karnabaharın üretimi kısıtlanmakla beraber üretim miktarı yıllara göre değişiklik
göstermektedir (bilgi.sitesi.web.tr).
Amaranthaceae familyasından olan ıspanak, yaprağı etli koyu parlak yeşil,
sarımsı yeşil çok sayıda çiçekli tek yıllık otsu bir bitkidir. Asya kıtasının orta ve
güneybatı bölgelerinin yerlisi olan bu bitki dünyanın birçok farklı bölgesinde gıda
olarak tüketilmektedir (tr.wikipedia.org). Ülkemizde ise sadece aşırı yağış alan Doğu
Karadeniz
Bölgesi’nde
çok
sınırlı
olmak
üzere,
bunun
dışındaki
bütün
bölgelerimizde büyük miktarlarda üretilen bir sebzedir (www.gençziraat.com).
Türkiye, yaklaşık 244.146.765 da alanda 24.847.679 tonluk sebze üretimi ile
dünyada ilk 4 ülke arasında yer almış ve üretimin yaklaşık % 87’ si açıkta % 13’ ü,
örtü altında gerçekleşmiştir. Bu sebzeler içerisinde lahana bitkisi 621.864 ton ve
marul bitkisi 439.641 tonluk üretim ile başı çekmiştir (TÜİK, 2010).
2008 yılı verilerine göre, dünyada toplam marul, lahana, karnabahar, ıspanak
ve turp üretim miktarı ve ülkelere göre dağılımı Çizelge 1.2’de verilmiştir.
2
1.GİRİŞ
Bilge ALAN
Çizelge 1.2. Dünyada kışlık sebze (marul, ıspanak, karnabahar, lahana ve turp)
üretiminin ülkelere göre dağılımı (FAO, 2008)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
14
MARUL
Ülke
Üretim (MT)
Çin
12505500
Amerika
4014590
İspanya
1002800
Italya
847666
Hindistan
790000
Japonya
544300
Türkiye
439641
Fransa
420400
Almanya
316741
Meksika
284709
Dünya
23733803
KARNABAHAR
Ülke
Üretim (MT)
Çin
8267877
Hindistan
5777000
Italya
460663
İspanya
439600
Fransa
378581
Meksika
371403
Amerika
308950
Polonya
274904
Pakistan
215629
Türkiye
150843
Dünya
19845519
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
17
TURP
Ülke
Habeşistan
Pakistan
Güney Batı Afrika
Endonezya
Papua Yeni Gine
Peru
Meksika
Türkiye
Nepal
Kolombiya
Dünya
3
LAHANA
Ülke
Üretim (MT)
Çin
12512005
Amerika
353430
Japonya
292700
Türkiye
225746
Endonezya
152130
Fransa
123500
Italya
99800
Kore
93441
Belçika
90000
Pakistan
82239
Dünya
14958727
LAHANA
Ülke
Üretim (MT)
Çin
37072750
Hindistan
5910000
Kore
2901939
Rusya
3169940
Japonya
1389000
Endonezya
1323702
Polonya
1256470
Amerika
941670
Romanya
967627
Türkiye
67461
Dünya
71342347
Üretim (MT)
4762750
432305
320655
360000
346449
264513
180034
158029
114460
91064
9.242.942
1.GİRİŞ
Bilge ALAN
Çizelge 1.2’ye göre; dünyada toplam 1.057.715 ha’lık alanda 23.733.803 ton
marul üretilmiştir (224.387 ton/ha). Dünya marul üretimi sıralamasında 12.505.500
ton üretim ile Çin ilk sırada, Türkiye 439.641 ton üretimle 7. sırada yer almıştır.
Karnabahar yetiştiriciliği ise, dünyada 1.147.559 ha’lık alanda yapılmış ve
üretim 19.845.519 ton civarında olmuştur (172.936 ton/ha). Karnabahar üretiminde
Çin 8.267.877 ton ile dünyada birinci sırada bulunurken, Türkiye 150.843 ton
üretimle 14. sırada yer almıştır.
Ispanak üretim miktarı 1.4958,727 ton olup, bu üretim 895.103 ha alanda
gerçekleştirilmiştir (167.117 ton/ha). Çin 12.512.005 ton üretimle dünyada birinci
sırada yer alırken, Türkiye 225.746 ton ile 4. sırada yer almıştır.
Lahana 3.229.146 ha alanda 71.342.347 ton üretilmiştir (220.932 ton/ha).
Lahana üretiminde, Çin 37.072.750 ton üretimle 1. sırada yer almış Türkiye ise
67.461 ton üretim ile 17. sırada yer almıştır.
Turp 1.206.249 ha’lık bir alanda 9.242.942 ton üretilmiş (76.625 ton/ha) ve
4.762.750 ton üretimle Habeşistan birinci sırada yer almıştır. Türkiye ise 158.029 ton
üretim ile 8. sırada yer almıştır.
4
1.GİRİŞ
Bilge ALAN
5
1.GİRİŞ
Bilge ALAN
2009 verilerine göre, Akdeniz Bölgesi’nde turp’un yoğun olarak yetiştirilmesi
nedeniyle, Osmaniye ili kışlık sebze üretiminde ilk sırada yer almış ve bunu sırası ile
Mersin, Hatay, Adana ve Kahramanmaraş illeri izlemiştir. Marul, lahana, karnabahar
en fazla Mersin’de üretilirken, ıspanak üretimi en fazla Hatay’da, turp üretimi ise, en
fazla Osmaniye’de yapılmıştır. Osmaniye ve Kahramanmaraş’ da ekonomik anlamda
karnabahar üretimi gerçekleşmemiştir (Çizelge 1.3).
Kışlık sebzelerde hastalık yapan birçok hastalık ve zararlı etmen
bulunmaktadır. Bunlar içerisinde viral etmenler, bitkiden bitkiye mekanik yollarla
kolaylıkla bulaşabilmesi, tohum veya vejetatif üretim materyalleri veya vektörler
aracılığıyla çok daha geniş alanlara kısa sürede yayılması ve özellikle diğer
etmenlerde olduğu gibi bunlara karşı kullanılabilecek etkili bir kimyasal mücadele
yönteminin bulunmaması nedeni ile ayrıca bir öneme sahiptirler.
Bu yüzden bitkilerde hastalığa neden olan viral etmenler ile mücadele
stratejisi olarak öncelikle etmenin saptanması, tanılanması ve yayılma yollarının
ortaya konulması ve bunların sonucunda da etmene karşı alınacak kültürel, fiziksel
önlemlerin belirlenmesi gerekmektedir.
Geniş alanlarda yetiştiriciliği yapılan ve yıllık üretim miktarı ile sebzeler
içerisinde ilk sıralarda yer alan marul, lahana, ıspanak, karnabahar ve turp sebzeleri
üzerinde de ekonomik olarak az ya da çok önemli çeşitli viral hastalık etmeninin
varlığı bildirilmiştir (Çizelge 1.4, 1.5, 1.6).
6
1.GİRİŞ
Bilge ALAN
Çizelge 1. 4. Marul bitkisinde görülen hastalık yapan bazı viral etmenler
Viral etmenler
Türkçesi
Alfalfa mosaic virus, AMV
Yonca mozaik virüsü
Beet western yellows virus, BWYV
Şekerpancarı batı sarılık virüsü
Beet yellow stunt virus, BYSV
Şekerpancarı sarı bodurluk virüsü
Bidens mosaic virus, BMV
Bidens mozaik virüsü
Broad bean wilt virus, BBWV
Bakla solgunluk virüsü
Cucumber mosaic virus, CMV
Hıyar mozaik virüsü
Lettuce big vein virus, LBVV
Marul iri damar virüsü
Lettuce ınfectious yellows virus, LİYV
Marul bulasıcı sarılık virüsü
Lettuce mosaic virus, LMV
Marul mozaik virüsü
Lettuce necrotic stunt virus, LNSV
Marul nekrotik bodurluk virüsü
Lettuce necrotic yellows virus, LNYV
Marul nekrotik sarılık virüsü
Lettuce speckles mottle virus, LSMV
Marul nokta beneklenme virüsü
Sowthistle yellow vein virus, SYVV
Sowthistle sarı damar virüsü
Tobacco rattle virus, ToRV
Tütün rattle virüsü
Tobacco ringspot virus, ToRV
Tütün halkalı leke virüsü
Tomato spotted wilt virus, TSWV
Domates lekeli solgunluk virüsü
Turnip mosaic virus, TuMV
Şalgam mozaik virüsü
Çizelge 1.5. Lahana, karnabahar ve turp bitkisinde görülen hastalık yapan bazı viral
etmenler
Viral etmenler
Türkçesi
Beet western yellows virus, BWYV
Cauliflower mosaic virus, CaMV
Karnabahar mozaik virüsü
Radish mosaic virus, RaMV
Turp mozaik virüsü
7
1.GİRİŞ
Bilge ALAN
Çizelge 1.6. Ispanak bitkisinde görülen hastalık yapan bazı viral etmenler
Viral etmenler
Türkçesi
Beet curly top virus, BCTV
Şekerpancarı tepe kıvırcıklık virüsü
Beet mosaic virus, BtMV
Şekerpancarı mozaik virüsü
Beet western yellow virus, BWYV
Broad bean wilt virus, BBWV
Bakla solgunluk virüsü
Cucumber mosaic virus, CMV
Hıyar mozaik virüsü
Lettuce mosaic virus, LMV
Marul mozaik virüsü
Lettuce speckles mottle virus, LSMV
Marul nokta beneklenme virüsü
Tobacco mosaic virus, TMV
Tütün mozaik virüsü
Tomato spotted wilt virus, TSWV
Domates lekeli solgunluk virüsü
Bu virüsler içerisinde LMV, LBVV, TuMV, BWYV, TSWV ve CMV
dünyada marul, lahana, karnabahar, ıspanak, turp gibi birçok bitkide yaygın olarak
görülmekte ve ekonomik olarak büyük kayıplara sebep olmaktadır.
Ülkemizde özellikle kışlık sebzeler üzerinde var olan viral kaynaklı hastalık
etmenlerinin saptanması, yaygınlıklarının ortaya konulması ve karakterizasyonu
konularında kapsamlı çalışmalar bulunmamaktadır. Daha önce yapılan çalışmalarda
bu etmenlerden bazıları saptanmış (Bennett ve Tanrısever, 1957; Fidan ve Türkoğlu,
1988; Döken ve ark., 1993; Güldür ve ark., 1995; Kamberoğlu ve Alan, 2011;
Korkmaz ve ark., 2007; Uzunoğulları ve Beşirli, 2011) fakat daha sonra çalışmalar
devam etmemiş ve detaylandırılmamıştır.
Bu doktora tez çalışmasında, kışlık sebzelerde (marul, ıspanak, lahana,
karnabahar ve turp) hastalık yapan virüslerin saptanması ve bulaşıklık oranlarının
ortaya konulması amacıyla survey çalışmaları yapılmıştır. Bu örneklerdeki viral
etmenler, öncelikle ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) ve/veya RT-PCR
(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction), çalışmaları ile saptanmış ve
biyolojik ve moleküler yöntemler kullanılarak karakterize edilmiştir. Dizi analiz
sonuçları değerlendirilerek elde edilen virüs izolatları diğer dünyadaki izolatlar ile
karşılaştırılarak benzerlik oranları ortaya konulmuştur.
8
2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR
Bilge ALAN
2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR
2.1. Hıyar Mozaik Virüsü (Cucumber mosaic virus, CMV)
CMV, ilk olarak hıyar bitkisi üzerinde (Cucumis sativus) Amerika’da Price
(1934) tarafından rapor edilmiştir. Dünya’da yaygın bir virüstür. Termal
inaktivasyon noktası 55-70 °C İn vitroda yaşam süresi 1-10 gündür. Bromaviridae
familyasına dâhil olup, Cucumovirus grubundandır. Virionlar izometrik ve zarfsızdır.
Genomları doğrusal tek iplikli RNA’lardan meydana gelmiştir (Francki ve Habili,
1987).
Konukçu bitkilerinin (Cucumis sativus ve diğer cucurbitler, Lycopersicon
esculentum, Spinacia oleracea) yapraklarında mozaik, şiddetli sararma, bitkide
gelişme geriliği ve verimde azalma meydana getirmektedir.
Yaprak bitleri (Acyrthosiphon pisum, Aphis craccivora ve Myzus persicae) ile
non persistent olarak, ayrıca tohum ve mekanik yollarla taşınmaktadır.
Wilson ve ark. (1985), Teksas’ın kış bahçesi alanlarında yetiştirilen ıspanak
bitkisinde CMV‘nin bir izolatını teşhis etmişler ve serolojik olarak CMV’ nin S ırkı
ile çok yakından ilişkili olarak bulunması nedeni ile CMV-S teksas ıspanak izolatı
olarak adlandırılmışlardır. Test ettikleri 13 familyanın 12’sinde yetiştirilen bitkilerin
ve yabani konukçularının 39 türünün virüs ile infekteli olduğunu belirlemişlerdir.
İzolat %23.8 den %47.4 e ulaşan bir oran ile üç ıspanak kültürünü önemli derecede
infektelemiş olduğunu saptamışlardır.
Takeshita ve Takanami (2000), CMV’ nin CMV-D8 ırkı’nın Japon turpunda
sistemik olarak infeksiyon meydana getirirken, CMV-Y ırkı’nın sadece lokal
infeksiyon oluşturduğunu gözlemişlerdir. Bu ırklar ile infekteli bitkiler TuMV ile
tekrar bir infeksiyondan sonra şiddetli sistemik mozaik simptomlar göstermiş, CMVY’nin sistemik olarak etkili bir şekilde yayılıp biriktiği ve CMV-D8 in de
taşınmasının TuMV ile artığını belirtmişlerdir.
Soleimani ve ark. (2011), Tahran’da 2002 ve 2003 yıllarında yapılan survey
çalışmasında il genelinde 452 yaprak örneği toplamışlar, DAS-ELISA yöntemi ile
LMV, CMV ve TSWV’nin varlığı tespit etmişlerdir. Belirlenen tek infeksiyon oranı
9
Bilge ALAN
LMV, CMV veya TSWV için sırasıyla % 20,58, 15,93 ve 9,96 olarak belirlenmiştir.
Ayrıca örneklerin %15.28’i LMV + CMV, %8.19’u LMV + TSMV ile ve %7.74’i
CMV + TSWV ile karışık infeksiyon oluşturduğu ve tüm örneklerin %4.65 ini bu üç
virüsün infektelediğini saptamışlardır. Tüm örneklerde ise LMV% 30.54, TSWV%
43.59 ve CMV%48.69 bulunduğunu belirlemişlerdir. İran’da bu çalışma ile
maruldaki TSWV ve Tahran’da CMV ve LMV ilk olarak rapor edilmiştir.
2.2. Domates Lekeli Solgunluk Virüsü (Tomato spotted wilt virus, TSWV)
Domates lekeli solgunluk virüsü (TSWV), 1915 yılında Brittlebank
tarafından Avusturalya’da domates bitkisi üzerinde tespit edilmiştir. Dünyada yaygın
bir virüstür. Tospoviridae familyasındandır. Virionlar izometrik ve etrafı membran
yapısında bir protein zarfla çevrili olup 85 nm dir. Genom yapıları tek iplikçikli üç
ayrı RNA’dan meydana gelmektedir (Gibbs, 1983). Termal inaktivasyon noktası 45
ºC ve İn vitroda yaşam süresi 5 saattir.
TSWV, Tysanoptera takımından Thrips tabaci, T. setosus, T. parmi,
Frankliniela occidentalis, F. shultzei, F. fusca ve Scirtothrips dorsalis ile perzistent
olarak taşınmaktadır (Eckel ve ark., 1996; German ve ark., 1992). Batı çiçek tripsi
(F. occidentalis ), TSWV’nin en önemli vektörü olarak bildirilmiştir (Ullman ve ark.,
1992). Ayrıca, mekanik ve aşı yolu ile taşınma gerçekleşmektedir.
TSWV, infeksiyon zamanı ve çevre koşullarına bağlı olarak değişmekle
birlikte, bulaşık bitkilerde gelişme geriliği, cüceleşme, genel solgunluk, yaprak ve
meyveler üzerinde halkalı lekeler, nekrotik ve klorotik lezyonlar ve genç sürgünlerde
geriye doğru ölüm şeklinde simptomlara neden olmaktadır (Güldür ve ark., 1995).
Cho ve ark. (1987), Hawaii’ de yetiştirilen marullarda TSWV’nin oldukça
yıkıcı bir hastalık olduğunu belirlemişler ve Maui’ de 1981-1984 yılları arasında
thrips surveyi yapmışlardır. TSWV’nin yoğunluğu ve thrips sayısı, yüksek yerlerdeki
üretim yerleriyle karşılaştırıldığında; alçakta (366 m) bulunan bölgelerde daha fazla
olduğunu belirtmişlerdir. TSWV’nin taşınmasında vektörlük yapan üç thrips
(Frankliniella occidentalis, F. scultzei, ve Thrips tabaci) tespit edilmiştir. F.
occidentalis 366 m ve 643 m yüksekliklerde yoğun olarak bulunduğu tespit edilirken,
10
Bilge ALAN
Thrips tabaci’ nin ise 701 m de yoğun olduğu rapor edilmiştir. Kula’ da üç tanesi
(Neohydatothrips gracilipes, Baileyothrips limbatus ve Scirtothrips inermis) Hawaii
için yeni türler olan 23 adet thrips tespit edilmiştir. TSWV’nin bir marul izolatı, lila
püskül çiçeği (Emilia sonchifolia) bitkisine F. occidentalis ile taşınmıştır. TSWV’nin
yaygınlığı ile thrips sayısı arasında belirli bir bağlantı tespit edildiği bildirilmiştir..
Cho ve ark. (1989), Hawaii’de TSWV’ nin periodik olarak marulda şiddetli
kayıplara neden olduğunu gözlemişler ve bazı yıllar özellikle yaz aylarında
maruldaki bu kayıpların %50-90 arasında olduğunu tespit etmişlerdir. Yudin ve ark.
(1990),
TSWV tarafından infekteli
marullarda erken
dönemde
mücadele
yöntemlerinin uygulanmasıyla hastalığın daha çabuk önüne geçilebileceğini
savunmuşlardır. Yapılan bu çalışma sonucunda üretim alanında thrips fazlalığının
fark edilerek mücadeleye başlanması yerine, daha erken dönemde teşhisin hastalığı
kontrol altına almada daha etkili olduğunu ortaya çıkarmışlardır.
Kim ve ark. (2004), Korea Yesan (Güney Kore)’da kırmızı biber (Capsicum
annuum var. grossum) bitkisi yapraklarında nekrotik lekeler ve meyvelerde
malformasyon (kusur) gözlemeleri üzerine yaptıkları çalışmada TSWV’nü izole
etmişler ve Chenopodium amaranticolor, C. quinoa, Petunia hybrida, Nicotiana
glutinosa, Gomphrena globosa, ve Physalis floridana bitkilerine infekte etmişlerdir.
Domates bitkisini de içeren 10 bitkide sistemik olarak TSWV infeksiyonu
gözlemişler ve nükleik asit dizi analizi çalışmalarında TSWV’nin N proteini gen
bankasında farklı TSWV izolatları ile benzerlik oranlarını kıyaslamışlardır. Bu
kıyaslamada sırasıyla %96.5-97.2 nükleotid ve %97.7-98.5 aminoasit benzerliği
gösterdiğini saptamışlardır.
Moreno ve ark. (2004), dünyada lahana ve marulu infektelediği bilinen
virüslerin İspanya’da mevcut olanlarından en önemlilerini ve bu virüslerin dağılımını
belirlemek için 2001-2002 sonbahar ve ilkbahar süresince bir survey düzenlemişler,
İspanya’nın önde marul ve lahana üretilen alanlarında virüs simptomu gösteren
ürünlerden ve bazı tek veya çok yıllık yakın faunalarından örnekleri Yonca mozaik
virüsü (AMV), Bakla solgunluk virüsü (BBWV- 1), Şeker pancarı batı sarılık virüsü
(BWYV), Karnabahar mozaik virüsü (CaMV), Hıyar mozaik virüsü (CMV), Marul
mozaik virüsü (LMV), Bezelye tohum kökenli mozaik virüsü (Psbmv), Şalgam
11
Bilge ALAN
mozaik virüsü (TuMV) ve Domates lekeli solgunluk virüsü (TSWV)’ne ve
Potyvirüsler’e karşı ELISA ile testlemişlerdir. 2002 ilkbaharında CMV ve LMV
marulda en baskın virüsler iken CaMV’nin Nawarra’da lahana ürünlerinde en önemli
virüs olduğunu ve bunu CMV ve BWYV’nin takip ettiğini bildirmişlerdir. Kışın ise
virüslerin spektrumunun farklı olduğunu belirlemişlerdir; Madrid’de marul
ürünlerinde Potyvirüsler geniş alanlara yayılmış fakat Murcia alanında TSWV ve
BWYV’nin en baskın virüsler olduğunu, marulda ortaya çıkarılan baskın potyvirüsün
LMV olduğunu, toplanan örneklerin hiçbirinin PSbMV ve TuMV için pozitif
olmadığını saptamışlardır. Lahana ürünlerinde, özellikle Navarro alanında sonbahar
ve kış ürünlerinde TSWV en çok görülen virüs olarak kaydedilmiştir.
Colariccio ve ark. (2005), Brezilya’da (Sao Paulo State, Sumare ve Campinas
alanlarında), Lettuce cv. veronica üzerinde virüs benzeri belirtiler gözlemişler ve bu
şüpheli marul örneklerini kullanılarak elektron mikroskobu, biyolojik, serolojik ve
moleküler çalışmalar yapmışlardır. Saptanan örneklerden, marulunda içinde
bulunduğu konukçu bitkilere yapılan mekanik inokulasyonlar sonucunda bu bitkiler
üzerinde benzer virüs simptomları meydana gelmiştir. Bunun yanı sıra, Gompherena
globosa test bitkisinde oluşan lokal lezyon ve sistemik mozaik simptomlarda bazı
farklılıklar gözlenmiştir. Yapılan bu çalışmada, Domates klorotik spot virüs (Tomato
chlorotic spot virus)’ün iki izolatı DAS-ELISA ve RT-PCR ile tespit edilmiş ve gen
bankasındaki TCSV dizilimi ile yüksek oranda benzerlik gösterdiği ortaya
konulmuştur. Bu çalışma Brezilya’da ticari hidroponik marul ürünlerinde bir
Tospovirüs’den dolayı kayıplara ilişkin ilk bilgi olarak rapor edilmiştir.
2.3. Şalgam Mozaik Virüsü (Turnip mosaic virus, TuMV)
Şalgam mozaik virüsü (TuMV) ilk olarak Amerika’da lahana bitkisinde
(Brassica campestris ssp. chinensis, B. japonica, B. campestris ssp. rapa) Schultz
(1921). tarafından rapor edilmiştir Potyvirus grubuna dahil Avusturalya, Çin ve
İngiltere başta olmak üzere dünyada yaygın bir virüstür. Termal inaktivasyon noktası
62 °C, İn vitro yaşam süresi 3-4 gündür. Virionlar ipliksi ve zarfsızdır (Provvidenti,
1988).
12
Bilge ALAN
Yaprakbitleri (Myzus persicae ve Brevicoryne brassicae) ile non persistent
olarak taşınır. Ayrıca mekanik olarak ve tohumla da taşınmaktadır.
Konukçu bitkilerde (Capsella bursa-pastoris, Brassica nigra, Brassica
campestris ssp. pekinensis, Stellaria media, Trifolium hybridum, Alliaria officinalis,
Calanthe sp., Hesperis matronalis, Brassica campestris ssp. chinensis, B. campestris
ssp. rapa, B. japonica) klorotik lokal lezyonlar, yapraklarda mozaik, buruşma
simptomları oluşturmaktadır.
Lin ve Lian (1983), Taiwan’ın merkezinde ve güneyinde lahanagillerde rapor
edilmiş olan TuMV’yi lahana türlerine ve diğer test bitkilerine mekanik olarak
taşımıştır. İnfekteli lahana ve turp bitkilerinde siyah halkalı leke ve mozaik
simptomlar gözlemlenmiş, diğer test bitkilerinde ise (şeytan elması, domates, kabak,
kavun, marul, fasulye, biber) simptom gözlenmemiştir, TuMV’nin turp ırkı
karalahana (Brassicao. acephala), başlahana (Botrytis capitata) ve brokoli (Botrytis
italica)’ bitkilerinde de infeksiyon meydana getirmemiştir.
Chivasa ve ark. (2001), Harera’da yetiştirilen lahana (Brassica oleracea var.
capitata) bitkilerinde %90 oranında nekrotik halkalar, çizgiler ve lekeler gözlemiş ve
simptomların çok geniş bir alana yayıldığını saptanmışlardır. İnfekteli bitkilerden
virüs izole edilmiş ve tek bir kültür lezyonu olduğu düşünülmüştür. C. quinoa
bitkisinde TuMV’ün tipik simptomları klorotik nekrotik lokal lezyonlar gözlenmiş ve
TuMVnin varlığı lahana ve C. quinoa’da PAS ELISA (Protein A Sandwich Enzyme
Linked-İmminosorbent Assay) ile doğrulanmıştır. Önceden sadece lahana da varlığı
bilinen TuMV, yapılan surveyde dikotiledonlardan Amaranthus hybridus, Brassica
juncea, Conyza sumatrensis, Galinsoga parviflora, Portulaca oleracea, Sida alba,
Sonchus oleraceus ve Hibiscus esculentus; the monokotiledonlardan Commelina
bengalensis ve Musa sapientum L., Bidens pilosa ve Cyperus esculentus
(monokiledon) de PAS-ELISA da pozitif olarak rapor edilmiştir.
Chen ve ark. (2003), Tayvan’da zambak (Zantedeschia spp.) bitkisinden iki
virüs (RC4 ve YC5) izole etmişler, her iki izolatı mekanik olarak zambak bitkisinin’
çeşitli hibritlerine taşımışlardır. Yapılan elektron mikroskobu çalışmasında 750 nm
büyüklüğünde kıvrımlı partiküllerin varlığını belirlemişlerdir. Turp (TuMV-R) ve
lisianthus bitkisinden (TuMV-L) iki TuMV izolat testlenmiş, RC4 ve YC5 antijenleri
13
Bilge ALAN
ile kuvvetli reaksiyon gösterdiği belirlenmiştir. Klonlama ve dizi analizleri sonucu
her iki izolat arasında %95-99 oranında benzerlik saptanmış ve bu bilgiler
doğrultusunda zambak bitkisinde TuMV’nin doğal infeksiyonu ilk olarak rapor
edilmiştir.
Yeni Zelanda’ da ilk olarak 1936 yılında Chamberlain tarafından varlığı
saptanan TuMV, Corona, ve ark. (2007), tarafından vektörle taşınma, elektron
mikroskopu, mekanik inokulasyon, moleküler ve serolojik yöntemler kullanarak
Safran (Crocus sativus), dönbabadön (Erodium moschatum), lobelya (Lobelia
speciosa), su teresi (Nasturtium officinale) ve latin çiçeği (Tropaelum majus) ) beş
bitkide daha teşhis edilmiştir.
Ishikawa-Suehiro (2007), lahanagillerin yıkıcı bir hastalığı olarak bilinen,
TuMV ile ilgili yaptıkları çalışmayı iki kısımda gerçekleştirmiştir. Birinci kısım
TuMV moleküler ve biyolojik analizler içermekteyken diğer kısımda ise farklı
şekilde partiküllere sahip virüslerin ortaya çıkarılması için hızlı ve kolaylaştırılmış
bir methodolan RT-PCR’ın geliştirilmesini içermiştir.
Sanchez ve ark. (2007), İspanya’nın farklı alanlarında lahana kültürlerinde
TuMV infeksiyonunu ortaya çıkarmışlar ve farklı konukçu bitki türlerinde girit
lahanası (Brassica cretica), sazlık lahana (Brassica juncea), kolza (Brassica napus),
su teresi (Eruca vesicaria subsp. sativa) ve doğu su teresi (Sisymbrium orientale) beş
yeni TuMV izolatını teşhis etmişlerdir. Bu beş izolatın kılıf proteinin (KP) nüleotid
dizilimini belirlemişler ve bu KP nükleotidlerinin filogenetik analizleri sonucu
izolatların iki farklı küme içinde guruplandığını göstermişlerdir
Farzadfar ve ark. (2009) İran’ın sekiz bölgesinde lahanagiller için surveyler
yapmışlar ve TuMV’nin konukçusu olan toplam 532 yabancı ot toplamışlardır. Bu
yabancı otları DAS- ELISA ile test etmişler ve 340 örneği (% 64) TuMV ile bulaşık
olarak saptamışlardır.
Al-Saleh ve ark. (2009), Sudi Arabistan Riyad şehrinde iki bölgede marul ve
turp üzerinde beneklenme, kloroz ve mozaik simptomlar gözlemişler ve yapmış
oldukları mekanik inokulasyon sonucu turp, marul, roka ve hardal bitkilerinde
mozaik simptom, C. amaranticolor’da lokal lezyonlar saptamışlardır. Elektron
mikroskop çalışması sonucunda Potyvirus’e ait kıvrımlı partiküller görülmüştür.
14
Bilge ALAN
DAS-ELISA ile TuMV varlığı belirlenmiş ve RT-PCR çalışmaları ve dizi analizi
sonucunda TuMV-RA-SA gen bankasında diğer izolatlarla %87.7-94.1, TuMV-LSA’nın
ise
diğer
izolatlarla
%85.3-90.9
oranında
benzerlik
gösterdiği
belirlemişlerdir. TuMV-RA-SA ve TuMV-L-SA arasında ise %89 benzerlik
görülmüştür. Yapılan bu çalışma ile Sudi Arabistan’da TuMV marul ve turpda ilk
olarak rapor edilmiştir.
2.4. Marul Mozaik Virüsü (Lettuce mosaic virus, LMV)
Marul mozaik virüsü (LMV), ilk olarak marul bitkisi (Lactuca sativa)’nde
Amerika’da (Florida) rapor edilmiştir (1921). Potyviridae familyasına bağlı
Potyvirus cinsinden tek iplikçikli bir RNA virüsüdür. Virionlar, ipliksi partiküllere
sahip ve zarfsızdır. Termal inaktivasyon noktası 55-60 °C, son sulandırma noktası
10-¹ ve 10-2 dir. İn vitro’da yaşam süresi 1- 2 gündür (Tomlinson, 1970).
Bu virüse dünyada marul yetiştirilen tüm bölgelerde rastlamak mümkündür.
Çoğunluğu Compositae familyasına ait 21 doğal konukçusu ve 121 tür içinde
mekanik olarak taşınabilen (Horvath, 1980) geniş bir konukçu aralığına sahiptir.
Marul (Lactuca sativa), ıspanak (Spinacia oleracea) ve bezelye (Pisum sativum)
ekonomik anlamda önemli doğal konukçusu olan bitkilerdir. Bunun yanında,
Chenopodium album, C. murale, Lamium amplexicaule, Senecio vulgaris, Sonchus
asper ve Stellaria media doğada LMV ile infekteli yaygın yabancı otlardan
bazılarıdır (Tomlinson, 1982).
Birçok kültür bitkisi üzerinde damar açılması, mozaik görünümü, sarı
benekler, nekrotik lekeler ve damar nekrozu şeklinde simptom oluşturan LMV’nin
konukçu dizisi oldukça geniştir (Brunt ve ark., 1996), ve çeşitli dikotiledon
familyalarını kapsamaktadır. Bunlardan bezelye (Pisum sativum), nohut (Cicer
arietinum), hardal (Sinapis arvensis), ıspanak (Spinacia oleracea), yabani safran
(Carthomus tinctarius) ve çeşitli süs bitkilerinde (Osteospermum spp., Gazania spp.,
Bupleurum falcatum vb.) yaygın olarak görülmektedir.
LMV, non persistent olarak doğada 15 yaprak biti türü ile taşınmaktadır.
Fransa’da ilk ve önemli vektörü şeftali yaprakbiti (Myzus persicae) olarak
15
Bilge ALAN
belirlenmiştir. Ayrıca patates yaprakbiti (Macrosiphum euphorbiae), marulda sık
gözlenen etkili bir vektördür. Pamuk yaprakbiti (Aphis gossypii) güney alanlarda
önemli bir yaz vektörü olarak bildirilmiştir (Messiaen ve Lafon, 1965).
Ayrıca LMV, mekanik olarak (% 3-10 oranında), tohumla ve polenle de
taşınmaktadır. Dünyada potansiyel olarak marulun en yıkıcı virüsü olduğu
belirlenmiştir (Dinant ve ark., 1992).
Marul bitkisinde ciddi hastalıklara sebep olduğu belirlenen LMV izolatlarının
geniş bir biyolojik çeşitlilik göstermekte olduğu Revers ve ark., (1997), tarafından
belirlenmiştir.
Marul
ve
LMV
arasındaki
moleküler
ilişkilerin
daha
iyi
anlaşılabilmesi için farklı özellikteki 10 LMV izolatının biyolojik ve moleküler
karakterizasyonu yapılarak biyolojik özellikleri belirlenmiştir. Biyolojik özelliklerin
karşılaştırılması ile moleküler bilgiler temelinde LMV izolatları üç gruba ayrılmıştır.
Bu gruplaşmanın patojeniteden çok coğrafik orjinler ile ilişki olduğu saptanmıştır.
Manoussopoulos ve ark. (1999),’ de Yunanistan’ın iki farklı bölgesindeki
(Heraklion ve Katerini) Afrika papatyası (Dimorphotheca sinuata) bitkilerinde virüs
benzeri simptomlar gözlenmesi üzerine (Heraklion yakılarındaki seralarda; bitkilerde
özellikle yaşlı yapraklarda klorotik leke; hafif bodurluk; Katerini yakınlarında bahçe
bitkilerinde klorotik halka şeklinde) her iki alandan alınan simptomlu bitki
örneklerinden, sağlıklı bitkilere inokulasyon yapılmıştır. İlk alanda bu bitkilerin
özsuyundan yapılan elektron mikroskop gözlemi sonucu ipliksi partiküller
görülürken, ikinci alanda izometrik partiküller belirlenmiştir. İlk alanda LMV’ye ve
ikinci alanda TSWV’ye karşı spesifik antibadiler ile yapılan çalışmalar sonucu LMV
ve TSVW; sırası ile Heraklion ve Katerini bölgelerinde teşhis edilmiştir.
São Paulo State’ in iki bölgesinden LMV’ nin patotip 2 (AF198 mo11 veya
mo1
2
genlerine sahip olmayan infekteli kültürler) ve patotip 4 (AF1999; mo11veya
mo1 2genlerine sahip olan infekteli kültürler) kültürleri klonlanmış ve dizi analizi
yapılmıştır. Avrupa, Orta Doğu- Kuzey Amerika ve iki Brezilya izolatından yapılan
nükleotid karşılaştırmasında homologların %95’den daha fazla olması nedeniyle
ırklar arasında farklılık bulunamamıştır. Buna rağmen yapılan filogenetik analizler
Brezilya izolatı olan AF198’in LMV-R ve LMV-0 (patotip II, sırasıyla Amerika ve
Fransa’dan) ile bir arada olduğunu göstermiştir. İzolat AF199 Fransa’dan iki izolat
16
Bilge ALAN
(LMV-Aud ve LMV-13) ile bir arada bulunmuştur. Bu izolatların Şili’de izole
edilenlerle ile yakın ilişkide olduğu belirtilmiştir. Böylece dünyanın farklı
kısımlarında (mo11 veya mo12) direnç genlerini kırabilen farklı LMV ırklarının
ortaya çıkmasında, mutasyon olaylarının olabileceği fikri ortaya çıkarılmıştır
(Krause-Sakate ve ark., 2001).
Soleimani ve ark (2004), İran’ın Tahran bölgesinde marul’da yapmış
oldukları çalışmada, LMV simptomları gösteren bitkilerden örnekler almışlar ve
immunoprinting yöntemi ile testlemeler sonucunda üç örneğin pozitif olduğu
saptanmıştır. Chenopodium quinoa, C. amaranticolor, Gomphrena globosa,
Nicotiana benthamiana, Lactuca sativa indikatör bitkilerine yapılan mekanik
inokulasyon çalışmasında beklenen simptomları gözlemişler ancak, Salinas 88 marul
çeşidinde herhangi bir simptom gözlenmemiştir.
2.5. Marul İri Damar Virüsü (Miraflori lettuce big vein virus, MiLBVV- Lettuce
big vein virus, LBVV)
Marul iri damar virüsü (LBVV) ilk olarak Jagger and Chandler (1934),
tarafından marul’da Amerika’da rapor edilmiştir. Avusturalya, Çekoslovakya, İtalya,
Japonya, Yeni Zelanda, Hollanda, İngiltere ve Amarika’da yaygın olarak görülen
Varicosavirus grubuna ait bir virüsdür. Termal inaktivasyon noktası 50 °C, İn vitro
da yaşam süresi bir gündür. Virionları yuvarlak şekilli ve zarfsızdır (Kuvata, 1991).
Dünyada marulda ılıman koşullarda iri damar hastalığının nedeni olarak
LBVV (Varicosavirus) vektörünün ise toprak kökenli bir fungus Olpidium brassicae
olduğu bilinmekteydi. Ancak son zamanlarda marullarda iri damar hastalığının
meydana gelmesi ile ilgili olarak ikinci bir virüs olan MiLBVV’ye (Ophiovirus)
rastlanmıştır. LBVV ve MiLBVV, spesifik antiserumlar kullanılarak ELISA testi ile
saptanmış ve ayırt edilmiştir. Her iki virüs mekanik olarak marula ve konukçularına
çok düşük oranda taşınabilmiştir. LBVV, O. brassicae ile taşınmış ancak marul
bitkisinde herhangi bir simptom ortaya çıkmamıştır. MiLBVV’ de aynı şekilde marul
bitkisine taşınmış ve MiLBVV, LBVV’nin varlığına ve yokluğuna bağlı olmadan iri
damar hastalık simptomu meydana getirdiği gözlenmiştir (Lot ve ark., 2001).
17
Bilge ALAN
MiLBVV ve LBVV’nn vektörü (Olpidium brassicae) Chytridiales’dir. Virüs
mekanik inokulasyanla ve aşıyla da taşınmaktadır. Ancak tohumla ve polenle
taşınmamaktadır.,
Konukçu bitkilerinde (Lactuca sativa, Sonchus oleraceus, Sonchus asper)
klorotik lezyonlar, damar açılması veya sararma gibi simptomlar meydana
getirmektedir (Kuvata, 1991).
Colariccio ve ark. (2003), Brezilya’nın São Paulo State şehrinde farklı
alanlardan marul çeşitlerinde tipik damar irileşmesi simptomları gözlemlemeleri
sonucu ılık mevsim süresince (gündüz 18-22 ◦C, gece 10-16°C sıcaklıkta) marul
örnekleri toplanmıştır. MiLBVV ve LBVV’ye spesifik antiserumlar kullanılarak
DAS-ELISA uygulanmış ve elektron mikroskobunda inceleme yapılması sonucu
ELISA testinde her iki virüsün de pozitif olduğu ancak Elektron mikroskobunda ise
sadece LBVV’ nin partiküllerinin var olduğu gözlenmiştir. Bu raporla hastalığın
sebebinin genellikle 20 °C altındaki sıcaklıklarda meydana gelmekte olan LBVV
olduğu ve subtropikal alanlarda LBVV ile MiLBVV arasında bir ilişkilinin
bulunduğu ilk olarak rapor edilmiştir.
Colariccio ve ark. (2005), São Paulo şehrinin büyük sebze yetiştirme
alanlarında surveyler yürütmüşler, Marul ve hindiba (Cichorium endivia) bitkisinin
yapraklarında klorotik lekeler, büyümede durgunluk gözlemişlerdir. Biyolojik,
serolojik testler ve elektron mikroskobu yöntemleriyle LBVV ve MiLBVV’nin
varlığını saptanmışlardır.
Son dönemlerde infekteli marul bitkilerinden iki farklı viral partikül elde
ediliyordu. LBVV, yuvarlak şekilde ve genom yapısı iki negatif iplik RNA dan
oluşmaktaydı. Sınıflandırmada ise Varicasavirus cinsine ait olarak belirlenmişti,
buna karşılık MiLBVV ise ipliksi partiküllü olup genom yapısı dört tek iplikli
RNA’nın çoğalmasından meydana gelmişti ayrıca sınıflandırmada Ophiovirus
cinsine aitti. Bunların yanı sıra Navarro ve ark. (2004), bu iki virüsün bitkide
dağılımına bakmışlar ve LBVV’nin köklerde MiLBVV’nin ise yaşlı yapraklarda
konsantrasyonlarının daha çok olduğunu belirlemişlerdir. Ayrıca marul üretilen
alanlarda LBVV’nin MiLBVV’ye göre daha hızlı yayıldığını saptamışlardır.
18
Bilge ALAN
Sasaya ve ark. (2005), Tütün bodurluk virüsü (Tobacco stunt virüs, TStV) ve
LBVV, arasındaki ilişkiyi değerlendirmek amacıyla 5 TStV ve 3 LBVV izolatının
CP nükleotid dizilimini belirlemişler ve LBVV’nin 4 ispanyol ve 1 japon izolatı ile
karşılaştırmasını yapılmıştır. TStV ve LBVV arasında aminoasit ve nükleleotid
dizilim benzerliği ve ölçüsü sırasıyla %95.6–96.5 ve %97.2–98.7 olarak teşhis
edilmiştir. Filogenetik analizler sonucu nükleotid dizilimi TStV’nin, LBVV’nin
farklı bir türden ırkı ile yakından ilişkili olduğu saptanmıştır.
LBVV, batıda marul bitkisi yapraklarında damar açılması, bitki renginde
koyulaşma, yapraklarda gevrekleşme, sararma, bitkide gür bir görünüm ve marulun
baş bağlamamasına neden olan ciddi bir hastalık olarak belirlenmiştir. Bu hastalığın
en fazla ıslak topraklarda devam ettiği (Campell ve Grogan 1963, Westerlund ve ark
1978a, 1978b; Hayes ve Wintermantel, 2007’den) ve ekim nöbeti yapılmayan
alanlarda daha sık gözlendiğini bildirmişlerdir. Hastalığa karşı genetik dayanıklılık
oluşturmanın uzun süreli korumada bir çözüm olabileceği ve Kaliforniya’da kaliteli
marul yetiştiriciliği için bu yöntemin önemli olduğu düşünülmüştür. infekteli Pavan
ve Pasific cinslerinde simptom oluşumu azaltırken, Virosa cinsinde simptom
meydana gelmediği rapor edilmiştir (Hayes ve Wintermantel, 2007).
Sanches ve ark. (2008), iri damar hastalığına neden olan Lettuce big vein
associated virus (LBVaV) ve Mirafiori lettuce big vein virus (MLBVV) Brezilya’da
karışık infeksiyon halinde saptamışlardır. Marul bitkisinden izole edilen LBVaV’nın
Brezilya izolatları, diğer LBVaV izolatlarını ile en az %93 oranında aminoasit
dizilim benzerliği gösterdiğini belirlemişlerdir.
Mavrıc Plesko ve ark. (2009), Ljubljana (Slovenya)’da bulunan seralarda ve
Sezana yakınlarında özel bir bahçede yetiştirilen marul bitkilerinde iri damar
hastalığı görülmesi üzerine yapılan gözlemlerde bitkilerin deforme olduğunu
yapraklarda klorotik damar açılmalarının meydana geldiğini ve simptomlu bitkilerin
simptomsuzlara oranla daha küçük olduğunu belirlemişlerdir. Araştırıcıların
belirledikleri iki alanda yapmış oldukları denemelerde ilk alandan 6 simptomatik
bitki ve 2 simptomsuz fidede, İkinci alandan 3 simptomatik bitkide MiLBVV ve
LBVV varlığını araştırmak amacı ile RT-PCR ile analiz etmiştir. Yapılan RT-PCR
sonucu ilk alanda MiLBVV ve LBVV karışık infeksiyon olarak 4 bitkide
19
Bilge ALAN
bulunurken, MiLBVV, 2 bitkide yalnız olarak belirlenmiştir, simptomsuz 2 fidede ise
herhangi bir virüse rastlanmamıştır. İkinci alanda ise analiz edilen bütün bitkiler
MiLBVV ve LBVV ile karışık infeksiyon halinde bulunmuştur. Bu çalışma ile
Slovenya’da MiLBVV ve LBVV birlikte ve MiLBVV marulda tek olarak ilk kez
saptanmıştır.
Barcala Tabarrozzi ve ark. (2010), marul iri damar hastalığına neden olan
etmenlerden MiLBVV’nin dünyada yaygın olması nedeniyle Arjantin’ da 20072009 kış döneminde LaPata’da surveyler yapmışlar ve 40 örnekte iri damar hastalığı
simptomları gözlemişlerdir. DAS ELISA ve/veya üniversal primerler kullanılarak
yapılan RT-PCR çalışmaları sonucu MiLBVV’nin varlığını saptamışlardır. Bu
çalışma ile Arjantin’de MiLBVV ilk olarak rapor edilmiştir..
Heidari ve ark. (2010), iri damar hastsalığına neden olan MiLBVV ve
LBVV’nin KP’lerinin benzer ölçülerde ancak farklı morfoloji ve serolojiye sahip
olası nedeniyle Tahran bölgesinde yetiştirilen marullarda MiLBVV ve LBVV tespit
ve ayırt etmek için bu bölgede simptom gösteren 344 örneği DAS-ELISA ve/veya
RT-PCR ile testlemişlerdir. Testlenen örneklerin %0.87 LBVV, %0.57 MiLBVV ve
%1.74 ünü karışık infeksiyon olarak saptamışlardır.
Araya ve ark. (2011), marul bitkisinde yaygın olarak görülen ve ekonomik
kayıpları oldukça fazla olan iri damar hastalığı nedeniyle bitkilerde deformasyon, baş
oluşturamama ve en önemlisi damarlar arasında klorotik açılmalar meydana
gelmekte olduğunu belirlemişler ve infekteli bitkilerde simptom yoğunluğu, protein
ve viral RNA birikimi arasındaki ilişkileri araştırılmışlardır. Doğal olarak infekteli
marul bitkilerindeki simptomları hafif, orta, şiddetli ve simptomsuz olarak
sınıflandırmışlardır. Kılıf protein (KP) birikimi DAS-ELISA ve RT-PCR çalışmaları
ile değerlendirilmiştir. Farklı simptom şiddeti gösteren marul bitkileri arasında bu
hastalık ile ilgili iki virüs için KP birimi arasında fark görülmemiştir. Benzer olarak
MiLBVV-RNA3 veya LBVV-RNA2’nin miktarında iri damar hastalık şiddeti
derecelendirme ölçeğinde fark meydana gelmemiştir. Bu çalışmalar iri damar
hastalığına maruz kalan marullarda meydana gelen simptomun şiddetini, konukçuda
virüsün birikimi ile ilgili olmadığını belirlemişlerdir.
20
Bilge ALAN
2.6. Karnabahar Mozaik Virüsü (Cauliflower mosaic virus, CaMV)
Karnabahar mozaik virüsü (CaMV) ilk olarak 1937 yılında Amerika’da
Tompkins tarafından Şalgam (Brassica campestris) ve Lahana (B. olerace)’ da rapor
edilmiştir. Caulimoviridae familyasından dünyada yaygın bir virüstür. Termal
inaktivasyon noktası 75-80 °C, İn vitro’da yaşam süresi 7-15 gündür. Virionlar
izometrik ve zarfsızdır. Genomlar çift iplikli ve daireseldir. Doğrusal olanları da
bulunmuştur ancak infeksiyon yapma özellikleri bulunmamaktadır (Garrett, 1982).
Küçük bir DNA bitki virüsü olan CaMV’nin (Shepherd ve ark.,1968) DNA sı
bitki hücreleri içerisine yabancı DNA taşımak için potansiyel bir araç olarak
düşünülmüştür (Szeto ve ark., 1977).
Yaprak bitleri (Brevicoryne brassicae, Myzus persicae) ile semi persistent
olarak ve mekanik yolla taşınmaktadır.
Konukçu bitkilerinde (Arabidopsis thaliana, Brassica spp, Raphanus spp. ve
diğer Brassicaceae türlerinde, Resedaceae) damar açılması veya mozaik simptomlar
meydana getirir.
Yamaoka ve ark. (1982), CaMV’nin sentezinin sıcaklıkla yakından ilgili
olduğunu saptamışlardır. Şalgam bitkilerinin protoplastlarında virüs çoğalması için
optimum sıcaklığın 20°C civarında olması gerektiğini fakat hücreler arasında virüs
infeksiyonu sonrası hücre cisimciklerin oluşması için 20°C den daha yüksek sıcaklık
gerektiğini, CaMV’nin çoğalmasının 33°C civarında durduğunu, ancak 20°C de eski
haline geri döndüğünü kaydetmişlerdir. Şalgam bitkilerinde hücrede cisimcik
oluşması ve damar açılma simptomunun meydana gelme sıklığının virüsün artışı ile
doğrudan
ilişkili
olmadığını,
protoplastlarda
normal
cisimcik
oluşumu
gözlenmediğini sadece virüs partiküllerinin birikimi olduğunu bu sonuç hücreler
arasında virüs infeksiyonu sonrası cisimciklerin, CaMV çoğalması için gerekli
olmadığını ortaya koymuşlardır.
Raybould
ve
ark.
(1999),
Dorset
UK’de
lahanagillerin
doğal
populasyonlarında Şekerpancarı batı sarılık virüsü (BWYV), Karnabahar mozaik
virüs (CaMV), Şalgam mozaik virüs (TuMV), Şalgam sarı mozaik virüs (TYMV)’nü
içeren dört virüsün surveyini gerçekleştirmişlerdir. Toplanan örneklerin; %60’ı
21
Bilge ALAN
CaMV, %43’ü BWYV, %43’ü TuMV ve %18’ i TYMV ile infekteli olarak
bulunmuştur.
Farzadfar ve ark. (2005), İran’ın Fars şehrinde lahanagil bitkilerinde
CaMV’nin varlığını saptamak amacı ile surveyler yürütmüşler ve beneklenme,
bantlaşma, mozaik, nekrotik lekeler, gelişme geriliği, sararma simptomları gösteren
farklı lahanagil bitkilerinden süs lahanası (B. oleracea var. Acephala), karnabahar (B.
oleracea var. Botrytis), lahana (B. oleracea var. Capitata), brokoli (B. oleracea var.
İtalica) ve şalgam (B. Rapa)’dan yaprak örnekleri toplamışlar ve DAS_ELISA ile
teslemişlerdir. Simptomlu bitkilerin yapraklarından şalgam (B. rapa,), kanola (B.
Napus), çin lahanası (B. pekinensis,) turp (Raphanus sativus) ve boru çiçeği (Datura
metel)’ne yaptıkları mekanik inokulasyon sonucu CaMV izolatlarının hepsi lahana
bitkilerinde mozaik simptomlara neden olurken bir izolat (Ca-Sh1) boru çiçeğin’de
sistemik infekteli olarak bulunmuştur. Biyolojik ve serolojik çalışmalar, PCR ile
doğrulanmış ve CaMV, İran’da süs lahanası, karnabahar, lahana, brokoli ve şalgam’
da ilk olarak rapor edilmiştir.
Spence ve ark. (2007), Kenya’da kurmuş oldukları sera denemelerinde,
TuMV tek olarak veya CaMV ile bir arada iken ticari lahana fidelerinin sayısında ve
ağırlığında azalmaya sebep olduğunu göstermişlerdir. Virüs inokule edildiğinde
lahanaların %25’i satılamaz duruma gelmiş ve kontrol bitkileri ile kıyaslandığında
yaklaşık 20 kat bir kayıp meydana getirdiği gözlenmiştir. Sadece CaMV infekte
edilen lahana bitkilerinin veriminde önemli ölçüde değişim gözlenmemiş bu nedenle,
TuMV ‘nin daha zararlı olduğunu ve hastalık yönetimde önceliği olması gerektiğini
saptamışlardır. TuMV ile infekteli lahanaların sağlıklı bitkilere göre % 50 daha hafif
olduğu fakat geç infeksiyonlarda daha az zarara sebep olduğu, ayrıca virüs
infeksiyonunun kontrolünde fideliğin içinde bulunduğu döneminde önemli olduğunu
bildirmişlerdir.
2.7. Turp Mozaik Virüsü (Radish mosaic virus, RaMV)
Turp mozaik virüsü (RaMV) ilk olarak Amerika’da (Kalifornia) turp
bitkisinde (Raphanus sativus) rapor edilmiştir (Tompkins, 1939). Avusturalya,
22
Bilge ALAN
Almanya, Macaristan, Italya, Japonya, Fas, Amerika ve Yugoslavya’ da yaygın olan
virüs Comoviridae familyasındandır. Termal inaktivasyon noktası 65-70 °C İn
vitro’da yaşama süresi 14-21 gündür. Virionlar izometrik ve zarfsızdır. Genomlar tek
iplikli RNA virüslerinden meydana gelmektedir. RaMV, Coleoptera takımına dahil
böcekler (Phyllotreta spp., Epitrix hirtipennis ve Diabrotica undecimpunctata),
mekanik ve aşı yolu ile taşınmaktadır (Cambell, 1988).
Spak ve Kubelkova (2000), Rusya ve Çekoslovakya’da yetiştirilmekte olan
çin lahanası, ketencik, şalgam ve hardal bitkilerinden alınan RaMV izolatlarının
serolojik olarak farklılığını, araştırmışlardır. Farklı bölgelerde, hatta bir tarlada
komşu hardal bitkileri arasında dikkat çekecek oranda serolojik bir farklılık
görülmüştür. İzolatlar virüsün yeni bir konukçusu olarak kuzukulağı (Cameline
sativa) n’da rapor edilmiştir.
Farzadfar ve Pourrahim (2004), iran'ın Kazvin ve İsfahan bölgelerinde
karnabahar ve şalgam bitkilerinde mozaik, benek ve kırışıklık simptomları
gözlemişler ve yapılan, mekanik inokulasyon çalışması sonucunda akkaz ayağı’da
klorotik lokal lezyonlar, tütün’de klorotik halkalar, lekeler ve şalgam’da klorotik
lokal lezyonlar ve bunu takiben sistemik mozaik simptomlar rapor etmişlerdir.
Yapılan DAS-ELISA ile RaMV’nün varlığını İran'da ilk olarak rapor etmişlerdir.
2.8. Şekerpancarı Batı Sarılık Virüsü (Beet western yellow virus, BWYV)
Şekerpancarı batı sarılık virüsü (BWYV) ilk olarak Amerika’da pancar,
ıspanak, marul ve turp bitkilerinde rapor edilmiştir (Duffus, 1961). Tüm dünyada
yaygın bir luteovirüstür. Termal inaktivasyon noktası 65°C ve İn vitro’da yaşam
süresi 16 gündür. Virionları izometrik ve zarfsızdır. Genomlar tek iplikli doğrusal
RNA’ lardan meydana gelmiştir.
Geniş konukçu aralığına sahiptir (Beta vulgaris, Spinacia oleracea,
Helianthus annuus, Lactuca sativa, Brassica napus var. napobrassica, B. campestris
ssp. napus, B. campestris ssp. rapa, B. nigra, B. oleracea var. botrytis, Brassica
oleracea var. capitata, Raphanus sativus, Crambe abyssinica, Citrullus lanatus,
Cucumis sativus, Cucurbita pepo, Cicer arietinum, Glycine max, Pisum sativum,
23
Bilge ALAN
Trifolium subterraneum, Vicia faba, Phlox drummondii, Capsicum annuum,
Lycopersicon esculentum).
Konukçu bitkilerinde hafif klorotik lekelenme, sararma, yaşlı yaprakların
incelmesine ve gevrekleşmesine sebep olmaktadır.
BWYV, yaprak bitleri ile (Myzus persicae) persistent olarak taşınır. Vektör
taşınması için bir yardımcı virüse ihtiyacı yoktur. Mekanik, aşı, tohumla ve polenle
taşınmaz (Duffus ve Johnstone,1983).
Timmerman ve ark. (1985), Illinois’da geniş bir konukçu aralığına sahip
olduğu bildirilen BWYV’nin Batı St. Louis alanlarında kışlak konukçusunun kuş otu,
şalgam, ıspanak bitkileri olduğunu belirlenmişler ve ilkbaharda inokulumun kaynağı
olabilecek ürünler üzerinde durmuşlardır. 1983 yılı ilkbahar ayında yapılan araştırma
sonucunda ıspanak bahçelerinin %33, şalgam bahçelerinin ise %80 inin BWYV ile
infekteli olduğunu saptamışlardır. Yeşilbiber ve kırmızı köklü kazayağı bitkisinin
BWYV’nin yazlık konukçusu bunun yanı sıra şalgam ve ıspanak bitkilerinin de
kışlık konukçusu olduğunu ELISA ve diğer birkaç metodla (taşınma, konukçu
aralığı) doğrulamışlardır.
Fortass ve ark. (1997), Fas'ta ta luteovirus infekteli bir nohut bitkisinden,
fener çiçeğine (Physalis floridana) yaprak biti (Myzus persicae) ile virüs taşınmışlar
ve hafif simptomlar elde etmişlerdir. Bilinen baklagil virüslerine karşı western blots
yöntemi uygulanmış ve BWYV güçlü bir reaksiyon meydana getirmiştir. PCR' da
950 bç nin bir parçası çoğaltılmış ve bu parçanın yüksek oranda (% 96) BWYV ile
bir benzerlik gösterirken diğer Luteovirüsler ile daha düşük oranda (%50-60) bir
benzerlik gösterdiğini belirlemişlerdir. Bu çalışma ile Kuzey Afrika'da yetiştirilen
baklagillerden nohut bitkisinde BWYV ilk olarak moleküler düzeyde rapor
edilmiştir.
Hauser (2000), şeker pancarında sararma hastalığına neden olan Luteoviridae
familyasından Polerovirus cinsine Beet mild yellowing virus (BMYV) veya
(BWYV)’ü konukçu aralığı, genomik ve serolojik çalışmalar sonucu üç farklı tür
içinde sınıflandırmıştır. Bu türlerden iki tanesi ilk kez belirlenmiş ve henüz ICTV
tarafından düzenlenmemiştir. Bu ilk türler, BMYV, şeker pancarı ve Capsella
bursapastoris’i infekteleyebilmektedir. İkinci tür Lahana sararma virüs (Brassica
24
Bilge ALAN
yellowing virüs)’ü lahangiller familyası içinde lahana cinsine ait bitkilerin büyük bir
bölümünü infekteleyebilmekte ancak şeker pancarı bitkisini infekteleyememektedir.
Üçüncü tür, Şekerpancarı kloroz virüs (Beet chlorosis virüs)’ü ise şeker pancarı ve
Chenopodium capitatum bitkisini infekteleyebilmekte ancak Capsella bursa-pastoris
bitkisini infekteleyemediği saptanmıştır.
Thurston ve ark. (2001), İgiltere’nin Dorset Bölgesi’nde beş şehirden yabani
hardal bitkilerinden örnekleme yapmışlar ve altı virüse karşı ELISA ile
testlemişlerdir. Şalgam mozaik virüsü (TuMV), Şalgam sarı mozaik virüsü (TYMV),
Şalgam kırışık virüs (TCV), Şalgam rozet virüs (TRoV), Şeker pancarı batı sarılık
virüsü (BWYV) ve Karnabahar mozaik virüs (CaMV)’ün varlığını bildirmişlerdir.
447 örneğin 48 tanesi karışık infeksiyon belirlenirken; TuMV, en az rastlanan virüs
olmuştur. Mekanik veya şeftali yaprak biti (Myzus persicae) ile yapılan
inokulasyonlar sonucu TuMV en hızlı (10 gün) ve ölümcül sistemik nekrozlar
meydana getirmiş, diğer virüslerin her biri sistemik yayılmış ancak ölümcül simptom
göstermemiştir. BWYV ise sistemik olarak yayılmış ancak gözle görülür bir simptom
meydana getirmemiştir.
Shahraeen ve ark. (2003), İran’da önemli bir ürün olan kolza (Brassica napus
ssp. oleifera) için surveyler yapmışlar ve 581 kolza örneğini DAS-ELISA ile
testlemişler ve örneklerde BWYV %14.45, CaMV %12.9, TuMV %9.3, CMV%4.6
ve TSWV ile %0.51 oranında infekteli olarak saptamışlardır. BWYV, TuMV ve
CaMV’nin kolzada ortaya çıkması, İran’da üretilen kolza için dikkati çekecek
önemde olduğu ve infekteli bitkilerin diğer duyarlı sebze ürünleri için inokulum
kaynağı oluşturduğunu bildirmişlerdir.
Xiang ve ark. (2010), Çin’de daha önce şeker pancarında, rapor edilmiş olan
BWYV ve iki Çin izolatının Inner Mongolia (BWYV-IM) ve Gansu (BWYV-GS)
tamamlayıcı genomik RNA dizilerinin üç pancar virüsü (BMYV, BChV ve BWYVUS) ile benzerlik oranlarını karşılaştırmışlardır. İki Çin izolatının genom uzunluğu
5,668 nt olarak belirlenmiş ve BWYV-IM diğer izolatlarla benzerlik oranı sırasıyla
BWYV-GS %97.4, BWYV-US %86.6, BChV %64.4 ve BMYV %70.8 oranında
olduğunu belirlemişlerdir. Sonuçta BWYV Çin izolatlarının en fazla BWYV-US ile
benzerlik göstermekte olduğunu rapor etmişlerdir.
25
Bilge ALAN
2.9. Şekerpancarı Tepe Kıvırcıklık Virüsü (Beet curly top virus, BCTV)
Şekerpancarı tepe kıvırcıklık virüsü (BCTV) Batı Amerika’da şekerpancarı
(Beta vulgaris)’da Ball (1909), tarafından rapor edilmiştir. Afrika, Avrasya,
Amerika, Arjantin, Bolivya, Brezilya, Kanada, Costa Rica, Kıbrıs, Mısır, Hindistan,
İran, İtalya, Meksika, Puerto Rico, İspaya, Türkiye, Amerika ve Uruguay’ da
yaygındır.
BCTV, Geminivirüs grubundan olup, termal inaktivasyon noktası 80 °C ve İn
vitro da yaşama süresi 8 gündür. Virionları zarfsızdır. Genomlar tek iplikli dairesel
DNA moleküllerinden meydana gelmiştir (Boswell, 1985).
Cicadellidae’ler (Kuzey Amerika’ da Circulifer tenellus, Akdeniz havzasında
C. tenellus, C. opacipennis) ile persistent olarak taşınır.
Konukçu bitkilerinde (Spinacia oleracea, Cucurbitaceae, Phaseolus vulgaris,
Linum spp., Capsicum spp., Lycopersicon esculentum, Solanum tuberosum, Beta
vulgaris) genç yapraklarda damar açılması, sert, bodur, sarı, kıvrılmış, kalın, gevrek,
kırılgan ve deformasyona uğramış yaprak oluşumu, floemde nekroz, eksudat akıntısı,
bitkide ölüm simptomları görülmektedir. Aşı ile taşınırken, mekanik ve tohumla
taşınmamaktadır.
Baliji ve ark. (2004), Güney Batı Teksas’ta 1996 yılı süresince ıspanak
bitkisinde, genç yapraklarda kıvrılma, deformasyon, bodurlaşma, sararma ve bitkide
şiddetli gelişme geriliği gözlenmesi ile yapılan klonlama ve southern blot
hibridizasyon yöntemleri sonucu, virüsün tamamlayıcı gen karşılaştırılmasında
ıspanak bitkisinde önceden karakterize edilen Şekerpancarı tepe kıvırcıklı virüsü
(BCTV), Şekerpancarı şiddetli tepe kıvırcıklı virüsü (BSCTV), Şekerpancarı hafif
tepe kıvırcıklı virüsü (BMCTV), ve Yaban turpu tepe kıvırcıklık virüsü (HBCTV) ile
%83.9-64.2 arasında nükleotid dizi benzerliği gösterdiğini ortaya çıkarmışlar ve bu
virüsün Curtovirüs cinsinin yeni bir türü olduğu belirlenmesi ile Ispanak tepe
kıvırcıklık virüsü (ICTV) olarak adlandırılmıştır.
Strausbaugh ve ark. (2008), Batı Amerika Birleşik Devletleri’nde kontrolü
zor bir hastalık olmaya devam eden tepe kıvırcık hastalığına karşı konukçuların
direncini geliştirmek ve hastalık yönetim seçeneklerini belirlemek amacı ile
26
Bilge ALAN
Curtovirüs’lere karşı saha denemeleri ile birlikte 246 ticari alandan örnekleme
yapmışlardır. Yaprak örneklerinden DNA izole edilmiş ve 79 izolatta Şekerpancarı
şiddetli tepe kıvırcıklı virüsü (BSCTV) ve Şekerpancarı hafif tepe kıvırcıklı virüsü
(BMCTV)’ün yaygın olarak bulunduğunu, BCTV’nin ise sadece birkaç izolatta
olduğunu saptamışlardır.
2.10. Şekerpancarı Mozaik Virüsü (Beet mosaic virus, BtMV)
BtMV ilk olarak pancar bitkisinde (Beta vulgaris)
Almanya’da rapor
edilmiştir (Schneider ve Mundry, 1956). Dünyada pancar yetiştirilen tüm alanlarda
görülmektedir (Russell, 1971). Potyvirüs grubundandır. Virionlar filamentous ve
zarfsızdır. Genomları tek iplikli doğrusal RNA’ lardan meydana gelmiştir (Heathcote
ve Woods, 1982).
Yaprak bitleri ile (Myzus persicae, Aphis fabae) non persistent olarak
taşınmaktadır. Mekanik inokulasyon ve aşı ile de taşınırken, tohumla ve polenle
taşınma gerçekleşmemektedir. Konukçu bitkilerinde (Beta vulgaris, Spinacia
oleracea, Chenopodium album, Amaranthus retroflexus, Sonchus arvensis, Melilotus
indicus, Trifolium incarnatum) tepe yapraklarda küçük lokal lezyonlar, beneklenme,
sararma, yaprakların kıvrılması ve damar açılması meydana getirmektedir.
Choueırı ve ark. (2001), Lübnan’ın başlıca şekerpancarı yetiştirilen
alanlarında viral hastalıkların yaygınlığı ve ortaya çıkma nedenlerini belirlemek
amacıyla surveyler yapmışlar ve ticari olarak şeker pancarı üretilen 115 alandan
toplam 1002 örneği ELISA ile Şeker pancarı Nekrotik Sarı Damar virüsü (BNYVV),
Şeker pancarı Sararma virüsü (BYV), Şeker pancarı mozaik virüsü (BtMV), Şeker
pancarı batı sarılık virüsü (BWYV) ve Hıyar mozaik virüsü (CMV)’ne karşı
testlemişler ve örneklerin %39,5'inin, bir veya daha çok virüsle bulaşık olduğunu
saptamışlardır. BtMV, (%56,5) en çok görülen virüs hastalığı olarak teşhis edilirken
BYV %29,5, BNYVV %17 ve BWYV %11 oranlarında olduğu rapor edilmiştir.
Örneklerin %.2'sinin karışık infeksiyon halinde olduğu ve bu infeksiyonlar içerisinde
CMV’ ye rastlanmadığını bildirmişlerdir.
27
Bilge ALAN
Spence ve ark. (2007), yılında Kenya’da pazı (Swiss chard) da BtMV ile
erken inokulasyonu yaprağın niteliğinde önemli derecede azalmaya sebep olmuş
(satılabilir yaprak üretiminde %50 kayıp), BtMV, pazı da hastalık yönetiminde
sadece fideliğin hangi dönemde olduğu değil özellikle bitkilerin fidelikten tarlaya
şaşırtıldığı zamanında önemli olduğunu ortaya çıkarmışlardır.
Wang ve ark. (2007), Çin’in Tai'an, Shandong Bölgesi’nde sebzeleri
infekteleyen virüsleri araştırmak amacı ile saha araştırmaları yürütmüşlerdir. Bir çok
marul’da %30-40 oranında mozaik, buruşma, geriye doğru ölüm simptomları
gözmişler ve bu örneklerin SDS-agar gel double immunodiffusion testinde, Patates Y
virüsü (PVY) ve Şalgam mozaik virüsü (TuMV) için pozitif, Hıyar mozaik virüsü
(CMV), Tütün mozaik virüsü (TMV), ve Patates X virüsü (PVX) için negatif
reaksiyon verdiğini ve Potyvirüs olduğunu belirlemişlerdir. Yapılan RT-PCR ve
BLAST çalışması sonucu etmenin BtMV olduğu saptamışlardır. Marul bitkisinde
doğal infeksiyon halinde BtMV ilk olarak rapor edilmiştir.
İran'ın en önemli şeker pancarı yetiştirilen Razavi Horasan şehrinde,
beneklenme, yaprak kıvrılması ve mozaik şeklinde simptomlara neden olduğu
belirlenen BtMV teşhis etmek amacı ile yapılan surveylerde Meşhed, Neyshabour,
Ghoochan, Torbat-e-Heydariyeh, Torbat-e-reçel, Fariman ve Kashmar bölgelerinden
rastgele örnekler toplanmıştır. Tüm örnekler DAS-ELISA ile testlenmiş ve RT-PCR
çalışması sonucunda 658 bç band elde edilmiştir. Fariman (%33.4) ve Neyshabour
(%4.8) sırasıyla maksimum ve minimum oranlarda BtMV ile infekteli şehir olarak
belirlenmiş ve Razavi Horasan da ortalama infeksiyon oranı 530 örnekte %14,9
olarak saptanmıştır (Gerayeli ve ark., 2010)
2.11. Marul Bulaşıcı Sarılık Virüsü (Lettuce infection yellow virus, LIYV)
Marul bulaşıcı sarılık virüsü (LIYV) Amerika’ da (Arizona ve Kaliforniya);
marul, şeker pancarı, havuç bitkilerinde rapor edilmiştir (Duffus ve ark., 1982).
Amerika’da yaygın bir Closterovirus grubu virüstür. Virion ipliksi ve genomlar tek
iplikli RNA’ lardan meydana gelmiştir.
28
Bilge ALAN
Konukçu bitkilerinde (Lactuca sativa, Citrullus lanatus, Cucumis melo,
Cucurbita pepo, C. maxima, C. moschata, Beta vulgaris, Daucus carota); şiddetli
kloroz ve /veya kırmızılaşma, yapraklarda kıvrılma, gevreklik, damar açılması ve
bitkide gelişme geriliği meydana getirmektedir (Brown ve Nelson, 1986).
Duffus ve Molyneux (1986), Amerika Birleşik Devletlerinin Güney Batısında
marul, şekerpancarı, havuç, diğer bitki ve yabancı otlara konukçuluk yapan yeni bir
sararma hastalığı olarak LIYV tespit etmişlerdir. LIYV semi persistent olarak
beyazsinek (Bemisia tabaci) tarafından taşındığını ancak
mekanik olarak
taşınmamakta olduğunu saptamışlardır. Geniş bir konukçu aralıgına (15 bitki
familyasında 45 tür) sahip bir virüs olarak belirlenen LIYV’ nin kültür bitkilerinde
ekonomik açıdan önemli kayıplara neden olduğunu bildirmişlerdir.
Duffus ve Flock (1982) ve Nameth ve ark., (1985), LIYV’nin California’da
kabakgiller de ciddi kayıplara neden olduğunu, marulda ise infeksiyon sonucu verim
%75 e kadar azalabildiğini bildirmişlerdir. Brown ve Stanghellini (1988) LIYV’ nin
Kuzey Amerika da hydroponical olarak yetiştirilen marullarda ciddi kayıplara neden
olduğunu saptamışlardır (CABI ve EPPO).
Beyazsinekle taşınmakta olan üç Closterovirus (Marul Bulaşıcı Sarılık virüsü
(LIYV), Kabakgil sarı bodurluk bozukluk virüsü, (CYSDV) ve Şekerpancarı yalancı
sarılık virüsü (BPYV)’ün coğrafik olarak ortaya çıkması ve moleküler farklılıklarını
araştırmak amacı ile birçok farklı coğrafik alandan kabakgil toplanmış ve 498 örnek
test edilmiştir. Bu örneklerden hiçbirinde LIYV‘ye rastlanmamıştır (Rubio ve ark.,
1999).
2.12. Türkiye’de Yapılan Çalışmalar
Bennett ve Tanrisever (1957), ülkemizde de ilk olarak BCTV’yi şeker
pancarında rapor etmişlerdir
Fidan ve Türkoğlu (1988), İzmir ili marul yetiştirme alanlarında, 1981-1984
yılları arasında, LMV' nin yaygınlık oranının %5.4 oranında olduğu, % 8-9 oranında
tohumla taşındığı ve şeftali yaprak biti (M. persicae) 'nin LMV'nin vektörü olduğunu
tespit etmişlerdir.
29
Bilge ALAN
Döken ve ark. (1993), Erzurum’da 118 marulda iri damar simptomu
görülmesi üzerine LBVV infekteli marulların köklerinden vektörü Olpidium
brassicae (Wor.) Dong, izole ederek, sağlıklı marul bitkilerine taşımışlardır. İnfekteli
bitkilerin köklerinden elde edilen zoospor süspansiyonların sağlıklı fidelerin kökleri
etrafındaki toprağa yayılması ile inokulasyon yapılmış ve 1 ay sonra marul
fidelerinin yapraklarında simptomlar gözlenmiştir. Marul bitkilerinde iri damar virüs
hastalığına benzer hastalık simptomları İzmir’in marul yetiştirilen alanlarında
önceden görülmüş ancak sağlıklı marul bitkilerine hastalığın taşınması girişiminde
başarısız olunmuştur
TSWV, Tükiye’de ilk olarak tütün bitkisinde; Çanakkale, Balıkesir, Manisa,
Uşak ve Samsun illerinde, domates bitkisi üzerinde; İzmir ve Manisa illeri (Azeri,
1981; 1994) ile Çukurova’da (Güldür ve ark., 1995) saptanmıştır.
Erkan ve ark. (1990), ülkemizde karnabahar ve lahana üretiminin yoğun
olarak yapıldığı yerlerde virüs belirtileri gösteren bir hastalık kaydetmişler ve bitkide
hastalığın, vejetasyon süresinin yarısını geçtikten sonra belirgin olarak gözlendiğini
bildirmişlerdir. Her iki bitkinin genç yaprakların da renk açılması, açık yeşil veya
sarımsı damar bandlaşması, buna karşın daha yaşlı yapraklarda koyu yeşil band
oluşumu ve deformasyon şeklinde simptomlara neden olduğunu ve ayrıca bu
hastalıkla bulaşık bitkilerin bodur kaldığını ve baş oluşturamadığını gözlemişlerdir.
Test bitkilerindeki simptomlar ve serolojik ilişkiler dikkate alınarak CaMV’yi
Türkiye ‘de ilk olarak saptamışlardır.
Marul bitkisinde son derece yaygın olarak bulunan LMV, Türkiye’de GAP
bölgesinde Yılmaz ve ark.(1995), tarafından saptanmıştır.
TSWV’nin varlığı Şanlıurfa’da domates yetiştirilen alanlarda Güldür (1997),
tarafından ilk kez rapor edilmiştir. Arli-Sökmen ve ark. (1998; 1999) Samsun ilinde
biber yetiştirilen alanlarda yapmış oldukları bir çalışmada TSWV’nin varlığını
belirlemişlerdir.
Tok ve Erkan (2006), Bursa ve Çanakkale illerinde şeker pancarı bitkisinde
2003-2004 yılında yapmış oldukları arazi çalışmalarında Çanakkale ilinden 23, Bursa
ilinden 29 olmak üzere toplam 52, mozaik, deformasyon, sararma, kıvırcıklaşma,
klorotik lokal lezyon ve bitkilerde bodurlaşma simptomuna rastlamışlardır. Mekanik
30
Bilge ALAN
inekulasyon ve ELISA sonucu BYV, BtMV ve CMV‘yi saptamışlar ve bu saptanan
virüslerin yaygınlık oranını Çanakkale ili Biga ilçesinde %2.41 ve Bursa ili Mustafa
Kemal Paşa ilçesinde %4.02 olarak belirlemişlerdir.
Korkmaz ve ark., (2007), Türkiye’nin Çanakkale, Balıkesir ve Bursa
şehirlerinde yetiştirilen lahana bitkilerinde (Brassica oleracea, Raphanus sativus and
R. raphanistrum) mozaik, leke, nekrotik halka, gelişme geriliği, sararma gibi
simptom gösteren bitki örneklerini TuMV’nin varlığı için DAS-ELISA yöntemi ile
test etmişler ve 130 yaprak örneğinin altısı dışındaki örnekleri TuMV ile pozitif
olarak belirlemişlerdir. Brüksel lahanası (B. oleracea vars. capitata gemmifera), turp
(R. sativus) ve yabani turp (R. raphanistrum) TuMV ile infekteli bulunurken,
karnabahar veya brokolide infeksiyon gözlenmemiştir. Pozitif sonuç veren
örneklerden yapılan mekanik inokulasyon sonucunda ise, Chenopodium quinoa’da
klorotik lokal lezyonlar, B. rapa da şiddetli mozaik ve gelişme geriliği ile Nicotiana
benthamiana’ da mozaik ve solgunluk simptomları gözlenmiştir. Yapılan PCR
çalışması sonucunda beklenen büyüklüklerde bandlar elde edilmiş ve bu bilgi ile
TuMV, Türkiye’de lahana (B. oleracea), turp (R. sativus) ve yabani turp (R.
raphanistrum) bitkilerinde ilk olarak rapor edilmiştir.
Yardımcı ve Çulal-Kılıç (2009), Batı Akdeniz Bölgesi’nde TSWV’ yi
saptamak amacıyla domates, biber, patates, marul, kabak,
ve hıyar yetiştirilen
alanlarda survey çalışmaları yürütmüşler ve on iki lokasyonda tipik TSWV
simptomu gösteren toplam 337 örneği ELISA ile testlemişlerdir. ELISA sonucunda
157 örneği %46.58 oranında TSWV ile infekteli olarak saptamışlardır. TSWV
infeksiyonu biber, marul, domates ve kabakta sırası ile %66.16, 66.66, 46.94 ve
16.66 oranlarında olduğunu belirlemişlerdir.
Bozdoğan (2009), Antalya ili Merkez, Serik ve Kumluca ilçelerinde
yetiştirilen domates, biber ve marul alanlarında TSWV saptanması ve yaygınlığının
ortaya koyulması amacı ile surveyler yürütmüş, şüpheli domates, biber ve marul
örneklerini ELISA ile testlemiş ve hastalık oranını toplanan örneklerde % 88.25
olarak belirlemiştir. ELISA testi sonucunda TSWV ile bulaşık olduğu belirlenen
örneklerden üç tanesi, A1 (marul), S1 (domates) ve K1 (biber) izolatları şeklinde
kodlamış, mekanik inokulasyon ve RT- PCR çalışmalarında kullanmıştır. A1 izolatı,
31
Bilge ALAN
indikatör bitkiler üzerinde 7-10 gün sonra simptom oluştururken, S1 ve K1
izolatlarının 20-24 gün sonra simptom çıkışına sebep olduğunu gözlemiş ve A1
izolatının daha yüksek patojeniteye sahip olduğu sonucuna varmıştır.
Kamberoğlu ve Alan (2011), Adana ve Mersin illerinde toplam 400 000 da
den fazla bir alanda yapmış oldukları surveylerde simptom gösteren 336 marul
bitkisini DAS-ELISA ile testlemişler ve 4 marul bitkisinde TSWV’yi saptamışlardır.
RT-PCR çalışması ile 811 bç büyüklüğünde band elde ederek bu virüsün varlığını
doğrulamışlardır.
Tuzlalı ve Korkmaz (2011), Çanakkale ve çevresinde karnabahar, lahana ve
bürüksel lahanası bitkilerinde beneklenme, damar bantlaşması, damar açılması
nekrotik lekeler, şekil bozukluğu, kloroz simptomları gösteren 56 örneği DASELISA ile testlemişler ve 41 örnekte CaMV’nin varlığını saptamışlardır. Tüm bu
bilgileri doğrulamak amacı ile bazı örneklerde yapılan PCR sonucunda beklenen
büyüklükte bant elde etmişlerdir.
Uzunoğulları ve Beşirli (2011), Yalova’da marul bitkisi yapraklarında sarı ve
yeşil renkte beneklenmeler, yaprakta kabarma, yaprak kenarlarında deformasyon,
nekrotik lekeler ve bodurluk belirtileri üzerine 400 bitkiden örnek almışlar CMV,
LMV, TSWV için testlemişler ve örneklerin %40’ının LMV ile infekteli olduğunu
saptamışlardır.
32
3.MATERYAL VE METOD
Bilge ALAN
3. MATERYAL VE METOD
3.1. Materyal
3.1.1. Survey Alanı ve Çalışma Materyali Hakkında Bilgiler
Bu çalışmanın materyalini 2007-2010 yılları arasında ilkbahar, sonbahar ve
kış dönemlerinde Adana, Mersin, Hatay, Osmaniye ve Kahramanmaraş illeri ve
çevresinde marul, lahana, karnabahar, ıspanak ve turp yetiştiriciliğinin yaygın olduğu
alanlarda hastalık simptomu gözlenen bitkilerden alınan dokular oluşturmuştur.
Arazi çıkışlarında simptomatolojik olarak, CMV, TSWV, TuMV, LMV,
MiLBVV, LBVV, CaMV, RaMV, BWYV, BCTV, BtMV ve LIYV ile infekteli
olduğundan şüphelenilen 808 marul, 330 lahana, 225 ıspanak, 137 karnabahar ve 65
turp bitkisinden oluşan toplam 1595 bitki örneği toplanmış ve testlemek amacı ile
laboratuvara getirilmiştir (Çizelge 3.1).
Bu çalışma, Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü
Fitopatoloji Anabilim Dalı Viroloji Laboratuvarı, Bitki Virüs Hastalıkları Araştırma
Serası ve mevcut klima odalarında yürütülmüştür.
33
3.MATERYAL VE METOD
Bilge ALAN
34
3.MATERYAL VE METOD
Bilge ALAN
3.1.2. Serolojik Çalışmalarda Kullanılan Materyal
ELISA testlerinde, CMV, TSWV, TuMV, LMV, MiLBVV, CaMV, RaMV
ve BWYV ile infekteli olduğundan şüphe edilen arazi örneklerinden alınan taze bitki
dokuları ile virüs infekteli olduğu ELISA yöntemi sonucunda saptanan örneklerden
yapılan mekanik inokulasyon çalışmalarında simptom gösteren indikatör bitkilerden
elde edilen bitki dokuları materyal olarak kullanılmıştır.
ELISA testleri, ticari olarak temin edilmiş olan ELISA kitleri (CMV, TSWV,
TuMV, LMV, MiLBVV, CaMV, RaMV (BIOREBA) ve BWYV(AGDİA)’ye
spesifik), tampon çözeltiler (Ek-1), düz tabanlı, 96 kuyu içeren Maxi Sorp Mikrotiter
ELISA pleytleri (NUNC-Danimarka), ELISA okuyucusu (Medispec ESR 200 ELISA
Reader), otomatik pipetler ve pipet uçları ile saf su kullanılarak yapılmıştır.
3.1.3. Mekanik İnokulasyon Çalışmalarında Kullanılan Materyal
Mekanik inokulasyon çalışmaları, serolojik çalışmalar sonucu çalışma konusu
virüsler ile infekteli olduğu saptanan bitkilerden alınan taze bitki dokuları, indikatör
bitkiler (Çizelge 3.2), havan ve havaneli, fosfat tampon çözeltisi, 2-merkaptoetanol
sodyum sülfit, karborandum tozu ve çeşme suyu kullanılarak yapılmıştır.
Mekanik inokulasyon çalışmalarında, indikatör bitkilerin tohumlarının
ekilmesi ve fidelerin yetiştirilmesi için kum, yanmış hayvan gübresi, toprak ve torf
karışımı (1:1:1:1), plastik saksılar, plastik küvetler, plastik viyoller, mikro ve makro
besin elementleri içeren gübreler ve zaman zaman zararlı ve hastalık etmenlerine
karşı insektisit ve fungisitler kullanılmıştır.
Çalışmada kullanılan indikatör bitki tohumları, Ç.Ü. Ziraat Fakültesi, Bitki
Koruma Bölümü, Viroloji Laboratuvarı’ndan temin edilmiştir.
35
3.MATERYAL VE METOD
Bilge ALAN
Çizelge 3.2. Mekanik inokulasyon çalışmalarında kullanılan test bitkileri ve testlenen
virüsler
Bitki
Chenopodium amaranticolor
Akkaz ayağı
Virüs
CMV, LBVV, LMV, TSWV
C. quinoa
N. tabacum
‘’
Tütün
CMV, LBVV, TuMV
CMV, TSWV
N. glutinosa
‘’
CMV, TuMV, TSWV
N. benthamiana
‘’
LBVV, LMV
N. clevelandii
‘’
LBVV, TSWV
Gomphrena globosa
Hanım düğmesi
LMV, TSWV
Lactuca sativa
Marul
CMV, LBVV, LMV, TuMV, TSWV
Spinacia oleracea.
Ispanak
CMV, LMV, TuMV, TSWV
Raphanus sativus
Turp
CMV, TuMV, CMV
Brassica olerase
Lahana
CMV, TuMV
Cucumis sativus
Hıyar
CMV, TSWV
Cucurbita pepo
Kabak
TuMV, CMV
Brassica oleracea
Karnabahar
TuMV
3.1.4. Toplam Nükleik Asit İzolasyon Çalışmalarında Kullanılan Materyal
ELISA testleri sonucunda hangi virüsler yazalım ile infekteli olduğu saptanan
arazi örnekleri ile ELISA kiti bulunmayan BCTV, BtMV, LIYV ve LBVV’nin
oluşturduğu simptomlara benzer simptomlar gözlenen arazi örneklerinden alınan
bitki dokuları materyal olarak kullanılmıştır. Ayrıca, mekanik inokulasyon
çalışmalarında simptom gözlenen indikatör bitkilerden elde edilen bitki özsuları da
çalışma materyalini oluşturmuştur.
Toplam nükleik asit izolasyon işleminde; tampon çözeltiler (Ek-2), steril
havan ve havan eli, ependorf tüpleri, ayarlanabilir mikro pipetler ve pipet uçları,
masa tipi soğutmalı santrifüj (Universal 320R) kullanılmıştır.
3.1.5. RT-PCR ve PCR Çalışmalarında Kullanılan Materyal
CMV, TSWV, TuMV, LMV, MiLBVV, CaMV, BWYV, BCTV, BtMV,
LIYV ve LBVV’nin moleküler tanısı ve dizi belirleme çalışmalarında kullanılacak
36
3.MATERYAL VE METOD
Bilge ALAN
DNA’ların elde edilmesi amacıyla yapılan RT-PCR ve PCR yöntemlerinde, virüs ile
bulaşık bitkilerden elde edilen toplam nükleik asitler, Moloney murine leukaemia
virus’den oluşan reverse transcriptase enzimi (MMLV-RT, 200U/μl, FERMENTAS,
EP0441) ve reverse transcriptase reaksiyon tampon çözeltisi, Taq polymeraz
(Termostabil DNA polimeraz enzim, 5U/μl, FERMENTAS, EP0401) ve 10X
reaksiyon tampon çözeltisi, dNTPs set (dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 25 mM,
FERMENTAS
R0181),
MgCI2,
MgCI2
buffer,
RNaz
inhibitör
(40U/μl
FERMENTAS, EO0311), Bench Top 1 kb DNA Ladder marker (FERMENTAS
SM0311), Bench Top 50 bp DNA Ladder marker (FERMENTAS SM0371), saf su,
pipet ve steril pipet uçları, PCR tüpleri ve Çizelge (3.3)’de belirtilen virüs spesifik
primerler (10μM) kullanılarak yapılmıştır.
Virüs genomu üzerinde hedef bölgelerin çoğaltılması işleminde gerekli
sıcaklıklar,
TECHNE
GENIUS
(TC-4000)
sağlanmıştır.
37
marka PCR aleti kullanılarak
3.MATERYAL VE METOD
Bilge ALAN
Çizelge 3.3. Çalışmada kullanılan primer çiftleri ve çoğaltılan bölgenin moleküler
büyüklüğü
Primer
Çiftleri
Dizi
Moleküler Büyüklüğü
(bç) ve Yeri
CMV
RW8-(GGTTCGAAAGAGATATAACCGGG)
RV11-(GTTTATTTACAAG AGCGTACGG)
650-RNA-2
Fınettı-Sialer ve ark.,(1999)
TSWV
L1-TSWVR.(ATCAGTCGAAATGGTCGGCA)
L2-TSWVF.(AATTGCCTTGCAACCAATTC)
276-RNA-Polimeraz
Adkins ve ark. (2005)
TuMV
Tu-8207F (GTG GAA TTC CAA GTG AGT TGC)
Tu-8822R (TCC TTC TTCTCCTTCTCCGC)
615-RNA-Polimeraz
Suehiro ve ark.(2005)
BWYV
LewP0- (CAGAGCTAATCGTTTCTTGAC)
SP1-(TGCGCCTGAGGAATGTAATG)
250-Polimeraz
Beuve ve ark. (2008)
LMV
1196-(AAGGCAGTAAAACTGATG)
1087-(TTTATACTACAGTCTTTA)
800- Kılıf Protein
Skate ve ark. (2001)
CaMV
CaMV1- (GCGTAYACAACAAGTCAGCAA ACA)
CaMV2-(TCCTGGAGATTATTACTCGGGTAGA)
383-DNA
Wolf ve ark. (1999)
LIYV
P26-r2-(ACTATCAGTTATCGACACAACT)
P26-F-(GACCACAGCTTTGACGACGGT)
675-RNA-2
NG ve ark. (2004)
LBVV
VP 248-(GTTTTTGACCCTGATAG)
VP.249 (GTCGACTCTAGACACTTGTTGTTTGTCGTG)
296-Kılıf Protein
Navarro ve ark. (2004)
BtMV
LN 27 (CACTCTGTAATGTGGAACAACTC)
LN 26(GACACTCAGAACTATCTCGACGAAG)
1050-Polyprotein
Nemchinov ve ark.(2004)
BCTV
(GTGGATCAATTTCCAGACAATTATC)
(CCCATAAGAGCCATATCAAACTTC’)
VP.286 TATCAGCTCACATACTCCCTATCG
VP 287.CAACTAGCTCAGAATACATGCAG
DNA
Creamer,ve ark.,(2003)
469 Kılıf Protein
Navarro ve ark. (2004)
MiLBVV
3.1.6. Agaroz Jel Elektroforez Çalışmalarında Kullanılan Materyal
Agaroz jel elektroforez çalışmalarında, toplam nükleik asit izolasyon işlemi
sonucunda elde edilen çalışma konusu virüslere ait toplam nükleik asitler ile RTPCR ve PCR çalışmalarında elde edilen PCR ürünleri materyal olarak kullanılmıştır.
Agaroz jel elektroforez işleminde, agaroz (sigma), tampon çözeltiler (Ek-4),
Mini Sub. DNA Cell Elektroforez cihazı (BIORAD) ve güç kaynağı, UV ışık
kaynağı (UVP Ultraviolet Transilluminator), Video Graphic printer (Sony-Lip 895
CE) ile etidyum bromür muhafaza tankından yararlanılmıştır.
38
3.MATERYAL VE METOD
Bilge ALAN
3.2. Metod
Çalışmada, öncelikle marul, ıspanak, lahana, karnabahar ve turp bitkilerinde
mevcut virüs hastalıklarının ortaya konulması amacıyla, Adana, Mersin, Hatay,
Osmaniye ve Kahramanmaraş illerinin belirlenen bölgelerine arazi çıkışları yapılmış
ve örnekler toplanmıştır. Bu örnekler, ticari olarak antiserumlarının ve primerlerinin
temin edilmesi ile birlikte ELISA ve/veya RT-PCR ve PCR yöntemleri ile
testlenmiştir.
Bu işlemlerden sonra çalışma konusu virüsler ile infekteli olduğu belirlenen
örneklerden alınan dokular kullanılarak var olan virüslerin biyolojik (test bitkileri
üzerine mekanik inokulasyon çalışmalar ile) ve moleküler karakterizasyonları (RTPCR ve PCR çalışmaları ve dizi analizleri ile) gerçekleştirilmiştir.
3.2.1. Survey Çalışmaları, Bitki Örneklerinin Toplanması ve Muhafazası
Survey çalışmaları, 2007-2010 ilkbahar, sonbahar ve kış dönemlerinde
Adana, Mersin, Hatay, Osmaniye ve Kahramanmaraş illeri ile çevresinde marul,
lahana,
karnabahar,
ıspanak
ve
turp
yetiştiriciliği
yapılan
alanlarda
gerçekleştirilmiştir.
Bulaşık olduğundan şüphelenilen bitkilerin belirlenmesi amacıyla öncelikle
simptomatolojik gözlemler yapılmış ve (Çizelge 3.4). CMV, TSWV, TuMV, LMV,
MiLBVV, CaMV, RaMV, BWYV, BCTV BtMV, LIYV ve LBVV ile bulaşık
olduğundan şüphelenilen bitkilerinden sap, gövde, yaprak ve meyve örnekleri
alınarak. örnek kodu verilmiştir. Polietilen torbayla örnek saklama kaplarında
laboratuvara getirilen bitkilerin fotoğrafları çekilmiş ve biyolojik, serolojik ve
moleküler çalışmalarda kullanılıncaya kadar +4 °C’de muhafaza edilmiştir.
39
3.MATERYAL VE METOD
Bilge ALAN
Çizelge 3.4. Surveylerde kışlık sebzelerde aranan simptomlar
Marul
Ispanak
K.babar
Lahana
Turp
CMV
Mozaik, damar açılması, yaprak deformasyonu, kloroz lokal ve sistemik
lezyonlar.
TSWV
Nekrotik ve klorotik lokal lezyonlar, sistemik solgunluk, meyvede ve yaprakta halkalı
leke, mozaik oluşumu, yaprak şeklinde
deformasyon, çiçeklerde renk açılması.
Klorotik lokal lezyonlar yapraklarda mozaik, kıvırcıklık
TUMV
LMV
BWYV
MiLBVV
CaMV
RaMV
LIYV
BtMV
BCTV
Mozaik, damar açılması, yaprak
deformasyonu, kloroz, lokal ve sistemik
lezyonlar
Bitkilerde hafif klorotik lekelenme, sararma, yaşlı yaprakların incelmesi ve
gevrekleşmesi.
Klorotik lezyonlar,
beyaz damar
açılması veya
sararma.
Damar açılması veya
bantlaşması, mozaik
Şiddetli sistemik kloroz ve nekroz yaprak deformasyonu, çizgi ve halka şekilleri,
mozaik, damar nekrozu ve yaprakların rozetleşmesi.
Şiddetli kloroz ve /veya kırmızılaşma,yapraklarda kıvrılma ,gevreklik, damar
açılması ve bitkide gelişme geriliği
Tepe yapraklarda
küçük lokal
lezyonlar,
beneklenme,
sararma,
yaprakların
kıvrılması ve
damar açılması
Genç yapraklarda
damar açılması,
sert, bodur, sarı,
kıvrılmış,kalın,
gevrek, kırılgan ve
deformasyona
uğramış yaprak
oluşumu; floemde
nekroz, eksudat
akıntısı, bitkide
ölüm.
40
3.MATERYAL VE METOD
Bilge ALAN
3.2.2. İndikatör Bitkilerin Yetiştirilmesi
Test bitkilerinin tohumları, kum, yanmış hayvan gübresi, toprak ve torf
karışımını (1:1.1:1) içeren küvetlere ekilmiş ve daha sonra çıkan bitkiler 4-6 yapraklı
dönemde, aynı karışımın bulunduğu plastik saksılara (12 cm çapında ve 15 cm
yüksekliğinde) tek tek şaşırtılmıştır.
İndikatör bitkiler, 22-24°C sıcaklık, %70 nem, 16 saat gündüz ve 8 saat gece
5000 lüks aydınlatma aydınlatma koşullarına sahip kontrollü klima odalarında
yetiştirilmiş ve muhafaza edilmiştir (Choueiri ve ark., 1993).
Bitki Koruma Bölümü Viroloji Laboratuvarı’na ait klima odasında yetiştirilen
bitkiler, zararlı-hastalık ve simptom gelişimi için araştırma boyunca periyodik olarak
her gün kontrol edilmiş ve bitkilerin sağlıklı büyümeleri için gerekli makro ve mikro
besin elementleri sulama suyuna ilave edilmiştir. Hastalık ve zararlılara karşı
gerektiğinde bitkilere pestisit uygulamaları yapılmıştır (Anonymous, 1990).
3.2.3. Serolojik Çalışmalar
Arazi çıkışlarında, simptomatolojik olarak virüs ile bulaşık olduğundan
şüphelenilen bitki örnekleri virüsün varlığının ortaya konulması amacıyla öncelikle
DAS-ELISA yöntemi ile testlenmiştir. Ayrıca, mekanik inokulasyon çalışmaları
sonunda, simptom gözlenen indikatör bitkiler de ELISA testine tabi tutulmuştur.
ELISA çalışmalarında kullanılan pleytlerin her birinde, örnek tampon
çözeltisi ve sağlıklı bitkilerden alınan veya firmalardan ticari olarak temin edilmiş iki
farklı negatif kontrol ve ticari olarak temin edilmiş bir pozitif kontrol kullanılmıştır.
ELISA testlerinde,, sağlıklı kontrol için 405 nm’de elde edilen absorbans değerinin
en az iki katı ve daha fazla absorbans değeri veren örnekler pozitif olarak kabul
edilmiştir (Barba ve Riccioni, 1993; Helguera ve ark., 2002).
41
3.MATERYAL VE METOD
Bilge ALAN
3.2.3.1. DAS-ELISA Testi
DAS-ELISA çalışmaları, Clark ve Adams (1977), Jain ve ark., (1998) ve
ELISA kitinin temin edildiği firma tarafından bildirilen yöntemlere göre modifiye
edilerek aşağıdaki şekilde yürütülmüştür.
1. Testlenen virüse spesifik poliklonal γ-globulin, firmanın (TSWV, CMV,
TuMV, LMV, LBVV, MiLBVV ve CaMV’ye spesifik antiserumlar: BIOREBA ve
BWYV’ e spesifik antiserum: AGDİA) bildirdiği yönteme göre kaplama tamponunda
belli oranda sulandırılarak, ELISA pleytlerine her çukura 100 μl olacak şekilde iki
tekrarlamalı konulmuştur.
2. Pleytler, 30 °C’de 4 saat inkübasyona tabi tutulduktan sonra, yıkama
tamponu ile her yıkama 3’er dakika olacak şekilde 3 kez yıkanmıştır.
3. Ekstraksiyon tampon çözeltisinde 1/10 oranında hazırlanmış olan
ekstrakttan her kuyuya 100 μl konulmuş ve pleytler +4 °C’de bir gece inkübasyona
tabi tutulduktan sonra yıkama tamponu ile yukarıdaki şekilde yıkanmıştır.
4. Konjugat tamponu içerisinde sulandırılmış olan enzimle (alkaline
phosphatase ) işaretli γ-globulinden (konjugate) her kuyuya 100’er μl konulmuş ve
30°C’de 5 saat inkübasyondan sonra pleytler yıkama tamponu ile yıkanmıştır.
5. Pleytlerin her kuyusuna substrate tampon çözeltisinde 1mg/ml olacak
şekilde hazırlanan substrattan (1mg/ml p-nitrophenyl phosphate)100’er μl ilave
edilmiş ve pleytler 30-60 dakika oda sıcaklığında ışıksız ortamda bekletildikten sonra
ELISA okuyucusunda okunmuştur.
ELISA test çalışmalarında kullanılan tampon çözeltiler Ek. 2’de verilmiştir.
3.2.4. Mekanik İnokulasyon Yöntemi
ELISA, RT-PCR ve PCR yöntemleri ile saptanan virüslerin biyolojik
karakterizasyonlarının da yapılması ve toplam nükleik asit çalışmalarında
kullanılacak olan bitkilerin elde edilmesi amacıyla, virüs ile bulaşık olduğu saptanan
arazi örneklerinden alınan dokular kullanılarak indikatör bitkilere mekanik
inokulasyon çalışmaları yapılmıştır.
42
3.MATERYAL VE METOD
Bilge ALAN
Mekanik inokulasyon çalışmalarında kullanmak amacıyla, bulaşık bitkilerden
alınan taze yaprak dokuları, 1:5 oranında, 2-merkaptoetanol veya sodyum sülfit
içeren 0.01M fosfat tampon çözeltisi (pH 7.0) varlığında steril porselen havanda
ezilmiş ve daha önceden karborandum tozu serpilmiş indikatör bitkilerin
yapraklarına mekanik olarak inokule edilmiştir. Kısa bir süre bekledikten sonra
inokulasyon yapılan yapraklar çeşme suyu ile yıkanmış ve indikatör bitkiler simptom
gözlenmesi amacıyla (22-24°C sıcaklık, %70 nem, 16 saat gündüz ve 8 saat gece
5000 lüks aydınlatma) klima odalarında muhafaza edilmiştir (Mandal ve ark., 2001).
Ayrıca, MiLBVV’nin mekanik inokulasyon çalışmalarında, 5mM 2merkaptoetanol, 1mM EDTA (Ethylenediaminetetra acetic acid) ve 5mM NaDIECA
(Sodium N, N-Diethylidithiocarbamate, Trihydrate) içeren 50 mM fosfat tampon
çözeltisi (pH 7.0) kullanılmıştır (Roggero ve ark., 2000).
Çalışmalar, Ç.Ü.Z.F. Bitki Koruma Bölümü Bitki Virüs Hastalıkları
Araştırma Serası ve klima odalarında yürütülmüştür.
3.2.5. Toplam Nükleik Asit İzolasyonu
Toplam nükleik asit izolasyonu, 1. ELISA testleri sonucunda CMV, TSWV,
TuMV, LMV, MiLBVV, CaMV, BWYV ile infekteli olduğu saptanan arazi
örnekleri, 2. ELISA kiti bulunmayan ve simptomatolojik olarak BCTV, BtMV,
LIYV ve LBVV bulaşık olduğundan şüphelenilen arazi örnekleri, 3. Mekanik
inokulasyon çalışmaları sonucunda simptom gösteren otsu indikatör bitkilerden
alınan taze bitki dokuları kullanılarak, Astruc ve ark. (1996)’ nın önerdiği yönteme
göre yürütülmüştür.
Toplam nükleik asit izolasyonu yönteminde izlenen basamaklar:
a. Örnekler ezme tamponu (100mM Tris-HCI pH.8.0, 50mM EDTA b-pH.
7.0, 500 NaCI, 10mM 2.merkapto etanol (1/1000) ) ile 1:2 (ağırlık/hacim) oranında
sulandırılarak ekstrakte edilmiş ve elde edilen bitki özsuyu steril tülbentten
geçirilmiştir.
b. Bitki özsuyundan 1ml alınarak eppendorf tüplerine aktarılmış ve örnekler
3 dakika 4.000 devir/dakika’de santrifüj edilmiştir.
43
3.MATERYAL VE METOD
Bilge ALAN
c. Sıvı kısım üzerine %20’lik Sodyum dodesil sülfat (SDS) çözeltisinden 50
µl ilave edilerek vorteks ile karıştırılmış ve sonra tüpler 65 ºC’de 30 dakika su
banyosunda inkübe edilmiştir.
d. Tüplere 250 µl potasyum asetat (5M) ilave edilerek 20 dakika buz
içerisinde bekletilmiş ve 15 dakika 13.000 devir/dakika santrifüj yapılmıştır.
h. Elde edilen sıvı kısım ikiye bölünmüş ve 500 µl’si eppendorf tüplerine
aktarılarak -70ºC’de saklanmıştır.
Geriye kalan 500 µl sıvı kısım yeni hazırlanan eppendorf tüplerine konulmuş
ve üzerine %100’lük etil alkolden 500 µl ilave edilip 1ml’ ye tamamlanarak vorteks
ile karıştırılmıştır.
ı. Daha sonra tüplere 50µl sodyum asetat (3M) ilave edilmiş ve örnekler
tekrar karıştırılarak -70 ºC’de bir gece bekletilmiştir.
i. Örnekler 15 dakika 14.000 devir/dakika’da santrifüj edilerek sıvı kısım
ortamdan uzaklaştırılmıştır.
j. Eppendorf tüpleri filtre kağıdı üzerinde ters çevrilerek 5 dakika kurutulmuş
ve pellet üzerine % 70’lik etil alkolden 1ml ilave edilmiştir.
k. Örnekler RNA’ları çöktürmek amacıyla 5 dakika 13.000 devir/dakika
santrifüj edilmiş ve tüp içerisindeki etil alkol atılarak eppendorf tüpleri kurutma
kağıtları üzerinde kurutulmuştur.
l. Elde edilen nükleik asitler 50 µl RNaz saf su ile sulandırılarak, 15µl ve 35
µl olmak üzere ikiye bölünmüş ve -70 ºC’de muhafaza edilmiştir.
Daha sonra agaroz jel elektroforez çalışmasıyla toplam nükleik asitlerin
varlığı kontrol edilmiştir.
3.2.6. RT- PCR ve PCR Çalışmaları
Çalışma konusu virüslerin moleküler tanısını yapmak, dizi belirleme
çalışmalarında kullanılacak DNA’ların elde edilmesini sağlamak ve ticari olarak
ELISA kiti bulunmayan BCTV, BtMV, LIYV ve LBVV‘nü moleküler olarak
saptamak amacıyla yapılan RT-PCR ve PCR çalışmaları, Prieto ve ark. (2001) ve
Sidek ve ark. (1999)'a göre modifiye edilerek yürütülmüştür.
44
3.MATERYAL VE METOD
Bilge ALAN
RT- PCR ve PCR çalışmalarında, örnek sayısının çok fazla olması nedeniyle
ELISA’da en yüksek absorbans değerini veren arazi örnekleri ile BCTV, BtMV,
LIYV ve LBVV olabileceğinden şüphelenilen örnekler seçilerek ilçelere ve bitkilere
göre kodlanmış ve moleküler çalışmalarda izolat olarak kullanılmıştır (Çizelge 3.5).
Çizelge 3.5. RT-PCR ve PCR çalışmalarında kullanılan virüs izolatları, survey alanı
bitki türü
Virüs İzolatı
Survey Alanı
Bitki Türü
Yöntem
LBVV-1
LBVV-2
Mersin
Marul
RT-PCR
LBVV-3
LBVV-4
Adana
Marul
RT-PCR
LBVV-5
LBVV-6
Hatay
Marul
RT-PCR
MiLBVV-1
MiLBVV-2
Mersin
Marul
RT-PCR
MiLBVV-3
MiLBVV-4
Adana
Maru
RT-PCR
MiLBVV-5
MiLBVV-6
Hatay
Marul
RT-PCR
LMV-1
LMV-2
Mersin
Marul
RT-PCR
LMV-3
LMV-4
Adana
Marul
RT-PCR
LMV-5
LMV-6
Hatay
Marul
RT-PCR
CMV-I
Adana
Ispanak
RT-PCR
CMV-M
Kahramanmaraş
Marul
RT-PCR
CMV-T
Osmaniye
Turp
RT-PCR
Adana
Marul
RT-PCR
CaMV-1
Mersin
Karnabahar
PCR
TuMV-L
Adana
Lahana
RT-PCR
TuMV-T
Osmaniye
Turp
RT-PCR
BWYV-M
Adana
Marul
RT-PCR
BWYV-I
Osmaniye
Ispanak
RT-PCR
BWYV-T
Osmaniye
Turp
RT-PCR
TSWV-1
TSWV-2
TSWV-3
BCTV
BCTV
Adana
Ispanak
PCR
BtMV
BtMV
Adana
Ispanak
RT-PCR
LIYV
LIYV
Adana
Marul
RT-PCR
İki aşamada gerçekleştirilen RT-PCR yönteminde, birinci aşamada; RT
(Reverse transcription) işlemi ile komplamenter DNA (cDNA)'lar elde edilmiş, ikinci
aşamada ise, cDNA'lar kullanılarak PCR işlemi yapılmıştır.
45
3.MATERYAL VE METOD
Bilge ALAN
I. Aşamada; PCR eppendorf tüpüne 1μl Toplam nükleik asit, 2 μl primer (10
pmol/μl,) ve 10μl su konularak PCR aletinde 95 °C de 3 dakika bekletilerek nükleik
asitlerin denatüre olması sağlanmıştır. Tüpler PCR aletinden alındıktan sonra buz
üzerine konulmuştur. Bu sayede tüp içerisindeki revers primerin RNA üzerindeki
hedef bölgeye yapışması sağlanmıştır. Daha sonra tüp içerisine 10 μl reverse
transcriptase karışımı (1μl ddNTP, 0,1 μl M-MLV enzimi, 5μl RT-buffer, 0,3 μl
RNaz inhibitörü, 3,6 μl saf su) ilave edilerek son hacim 25 μl ye tamamlanmış ve
örnekler 42 °C de 1 saat inkube edilerek cDNA sentezi gerçekleştirilmiştir.
II-PCR aşamasında ise, ayrı bir PCR tüpüne, yukarıdaki işlemde elde edilen
cDNA’dan 1 μl konulmuş, üzerine 16.8 μl saf su, 2.5 μl 10X PCR tampon çözeltisi
(100 mM Tris- HC1 (pH 8.8), 500 mM KC1, % 0.8 Nonidet P40), 1.5 μl MgCl2, 1 μl
dNTP (2 mM), 0.2 μl Taq DNA polimeraz, 1 μl forward primer ve 1 μl revers primer
ilave edilmiştir
Daha sonra tüpler Çizelge 3.6’da görülen sıcaklıklar doğrultusunda
ayarlanmış PCR aletine yerleştirilerek PCR aşaması tamamlanmıştır. RT-PCR
çalışmalarının sonuçları agaroz jel elektroforez yöntemi kullanılarak gözlenmiştir.
Reverse
Transcriptase
çalışması
sonucunda
elde
edilen
cDNA’nın
çoğaltılması sırasında kullanılan 25 mM MgCl2 stok solüsyonu çalışma hacminde
1,5 mM, Mg Free Buffer (10X) son hacimde 1X olacak konsantrasyonda, Taq DNA
Polimeraz (5u/μl) enzimi ve son olarak su son hacmi tamamlayacak miktarda
kullanılmıştır.
Moleküler çalışmalarda, son çalışma hacminde, reverse transcriptase (MMLV, stok 200u/μl) enziminden 10-20u, M-MLV Buffer (stok 5X)’dan 1X, RNaz
inhibitörü (stok 40u/μl)’nden 15u olacak şekilde kullanılmıştır (Cillo ve ark., 2004).
100’er mM olarak satın alınan Deoksinükleotid trifosfat (dTTP, dATP, dGTP,
dCTP)’ lardan 20’ şer μl alınmış ve 25 mM olan 80μl’lik dNTPs karışımına 120μl su
ilave edilmek suretiyle 200 μl’ye tamamlanmıştır. Bu karşım sonucunda dNTP’ler 10
mM olarak elde edilmiştir.
CaMV ve BCTV’nin DNA virüsü olması nedeniyle RT aşaması
uygulanmamış, sadece PCR yöntemi uygulanmıştır. Serolojik çalışmalarda
saptanmayan RaMV’ne karşı RT-PCR çalışması uygulanmamıştır.
46
3.MATERYAL VE METOD
Bilge ALAN
Çizelge 3.6. RT-PCR ve PCR çalışmasında kullanılan sıcaklık döngüleri
LBVV ve MiLBVV
95 °C’de 2 dakika
LMV
1 döngü
95 °C’de 30 saniye
41 °C’de 1dakika
35 döngü
1 döngü
BtMV ve BCTV
1 döngü
35 döngü
RT PCR
30 döngü
1 döngü
CMV
94 ºC’ de 4 dakika
1 döngü
BWYV
1 döngü
1 döngü
94 ºC’ de 30 saniye
35 döngü
35 döngü
72°C’de 3 dakika
1 döngü
TuMV
1 döngü
94 °C'de 2 dakika
1 döngü
35 döngü
1 döngü
TSWV
35 döngü
1 döngü
72 °C'de 10 dakika
BCTV
1 döngü
CaMV
1 döngü
PCR
1 döngü
1 döngü
35 döngü
1 döngü
LİYV
35 döngü
1 döngü
35 döngü
1 döngü
3.2.7. Agaroz Gel Elektroforez Çalışmaları
47
1 döngü
3.MATERYAL VE METOD
Bilge ALAN
Agaroz jel elektroforez çalışması Galitelli ve Minafra (1994),’nın önerdiği
yöntem kullanılarak aşağıda belirtildiği şekilde yürütülmüştür.
a- PCR ürünlerinin büyüklüğüne bağlı olarak agarozun %1,2, %2 ve %1,5
konsantrasyonları 20 ml 1x TBE yada 1x TAE içerisine konulmuştur.
b-Agaroz-TBE karışımı eriyinceye kadar mikrodalgalı bir fırın içerisinde
ısıtılmış ve sonra hacim 30 ml’ye ayarlanmıştır.
c-Karışım tekrar 60°C’ye kadar soğumaya bırakılmış ve tank içerisine
boşaltılarak tarak geçirilmiştir.
d-Jel donduktan sonra tarak dikkatli bir şekilde çıkartılmıştır. Daha sonra
jel’in üzerini 1-2 mm kadar kaplayıncaya kadar tank içerisine TBE ilave edilmiştir.
e- 10 μl örnek üzerine 2 μl yükleme tamponu ilave edildikten sonra, toplam
12 μl karışım jeldeki çukurlara dikkatli bir şekilde yerleştirilmiştir. İlk çukura ticari
bir markır (1μl yükleme tamponu +1μl markır+ 4 μl saf su) konulmuş ve yükleme
tamponundaki turuncu renk (orange G) jelin sonuna gelene kadar jel tankına 40V
elektrik akımı verilmiştir.
f-Elektroforez işlemi tamamlandıktan sonra jel, oda sıcaklığında 10 dakika
10mg/ml etidyum bromür (100 ml H2O +30 μl) karışımı içerisinde boyanmıştır.
Jeldeki fazla etidyum bromür uzaklaştırıncaya kadar 5 dakika saf su
içerisinde tutulmuş ve sonuçlar UV transilluminatörde kontrol edilmiştir. Çalışmada
kullanılan solüsyonlar Ek.4’de verilmiştir.
3.2.8. Dizi Belirleme ve Filogenetik Sınıflandırma Çalışmaları
Serolojik ve moleküler çalışmalar sonucunda çalışma konusu virüsler ile
infekteli olarak saptanan bitkilerden ELISA’da yüksek absorbans değeri veren
örnekler ve PCR da net bir bant oluşturan örnekler, alındıkları bölge ve bitki türlerine
göre seçilmiş ve kod verilerek dizi belirleme ve analiz çalışmalarında izolat olarak
kullanılmıştır (Çizelge 3.7).
48
3.MATERYAL VE METOD
Bilge ALAN
Çizelge 3.7. Dizi belirleme çalışmalarında kullanılan virüs, izolat, survey alanı ve
bitki türleri
Virüs
İzolat
Survey Alanı
Bitki
LBVV
LBVV-2
Mersin
Marul
MiLBVV
MiLBVV-4
Adana
Marul
LMV
LMV-4
Adana
Marul
CMV
CMV-I
Adana
Ispanak
TSWV
TSWV-1
Adana
Marul
CaMV
CaMV-1
Mersin
Karnabahar
TuMV
TuMV-T
Osmaniye
Turp
BWYV
BWYV-T
Osmaniye
Turp
DNA
dizi
belirleme
çalışmaları
iontek
(http://www.iontek.com.tr)
firmasından hizmet alınarak yapılmıştır. Bu amaçla, serolojik ve moleküler olarak
tanısı yapılan virüslere ait PCR ürünleri, diziliminin belirlenmesi için iontek
firmasına gönderilmiştir. Elde edilen sonuçlar doğrultusunda izolatların çoğaltılan
kısımları dünyada saptanmış olan diğer izolatlarla karşılaştırılarak benzerlik oranları
belirlenmiştir.
İzolatların
dünyanın
diğer
izolatları
ile
benzerlik
oranları
belirlenmesinde amacıyla,
1.
NCBI
(The
National
Center
for
Biotechnology
Information)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),
2. BLAST (Basic Local Aligment SearchTool),
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
3. Chromas
(www.technelysium.com.au/chromas.html)
4. ClustalX 2.0.10,
(http://mac.softpedia.com/get/Math-Scientific/ClustalX.shtml)
5. Tree View (http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/rod.html) programları
sırasıyla kullanılmıştır.
49
3.MATERYAL VE METOD
Bilge ALAN
50
4. BULGULAR VE TARTIŞMA
Bilge ALAN
4.1. Survey ve Örnekleme Çalışmaları
Çalışmanın konusunu oluşturan CMV, TSWV, TuMV, LMV, MiLBVV,
LBVV, CaMV, RaMV, BWYV, BCTV, BtMV ve LIYV’ nin saptanması amacıyla
2007-2010 yıllarını kapsayan ilkbahar, sonbahar ve kış dönemlerinde Adana, Mersin
Hatay, Osmaniye ve Kahramanmaraş illeri ile çevresinde marul, lahana, karnabahar,
ıspanak ve turp yetiştiriciliği yapılan toplam 5.524 dekar arazi gezilmiş ve bu
arazilerde bulunan bitkilerin %10’u simptomatolojik olarak tek tek incelenerek
şüpheli bitkilerden örnekler alınmıştır (Şekil 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7).
ELISA testleri sonucunda, alınan örneklerde varlığı saptanan çalışma konusu
virüslerin bitkilerde meydana getirdiği arazi simptomlarının farklı araştırıcıların
bildirdikleri simptomlarla benzer olduğu belirlenmiştir.
Bu çalışmada, CMV’nin infekteli marul bitkilerinde; kıvrılma, sararma,
mozaik, turp bitkilerinde; mozaik, sararma, ve kıvrılma, ıspanak bitkilerinde ise,
deformasyon, bodurluk, yapraklarda kıvrılma meydana getirdiği gözlenmiştir. Genel
olarak CMV ile infekteli bitkilerde gelişme geriliği, kıvrılma, sararma, ve mozaik
simptom en çok gözlenen simptomlar arasında bulunmaktadır. Fletcher (2008)
CMV’nin marul bitkilerinin gelişiminde gerileme, nekrotik yaprak lekeleri ve alacalı
yaprak görünümüne sebep olduğunu bildirmiştir. Thomson ve Procter (1966)
marullarda bodurlaşma, özellikle yaşlı yapraklarda kloroz ve düzensiz nekrotik
lezyonlar oluştuğunu, nekrozların bitkinin çürümesine ve fungal infeksiyonlara
neden olduğun bildirmişlerdir.
TSWV ile bulaşık olduğu saptanan bitkilerde, soğuktan zararlanmış gibi
simptomlar ortaya çıktığı ve kısa sürede bu bitkilerde çürüme meydana geldiği
gözlenmiştir.
Konukçu aralığı çok geniş bir virüs olarak bildirilen TSWV, bitkilerde genel
olarak klorotik lokal lezyon, halkalı leke, deformasyon, geriye doğru ölüm meydana
getirmektedir. Bitkinin erken dönemde infeksiyonlarında, genelde bitkiler ölmekte,
geç dönem infeksiyonlarında ise, bitkilerde solgunluk, sararma, kahverengi nekrozlar
51
Bilge ALAN
veya yapraklarda nekrotik halkalar ile kendini göstermektedir. İnfeksiyon genellikle
bitkinin bir bölgesinde meydana gelmekte ve bitki bükülmüş gibi bir görünüm
almaktadır (Fletcher 2008). Buna ilaveten, Antignus ve ark. (1997) da, TSWV’nin
bulaşık olduğu bitkilerde, doku nekrozları, kıvrılma nekrotik lekeler ve halkalı
lekeler meydana getirdiğini bildirmişlerdir. Benzer simptomlar özellikle doku
nekrozları yaptıkları surveyler sırasında TSWV ile infekteli bulunan bitkilerde
gözlenmiştir.
TuMV, bulaşık genç bitkilerde küçük, açık yeşil, yapraklarda dairesel ve
düzensiz lezyonlar meydana getirmektedir, ilerleyen dönemlerde ise yaprakların ince
uzun olup, simetrisinin bozulması şeklinde simptomlar geliştirmektedir. Bitki erken
dönemde infeksiyona uğradığında, gelişme geriliği meydana gelmektedir (Fletcher
2008), Bunların yanı sıra bitkilerde nekrotik halka, leke ve çizgiler meydana
gelmektedir (Chivasa ve ark., 2001). Özellikle lahana ve turp da TuMV belirgin
simptomlar meydana getirmiş ve araştırıcıların bildirmiş olduğu simptomlar bu
araştırmada yapılan surveylerde bitkilerde gözlenmiştir. Bunların yanı sıra bu
çalışmada, TuMV saptanan turp bitkilerinin aynı zamanda BWYV ile de bulaşık
olduğu kaydedilmiştir.
LMV, infekteli marul bitkilerinde çoğunlukla sararma, kıvrılma ve mozaik
simptom meydana geldiği gözlenmiştir. Marul tarlalarında LBVV ve MiLBVV’ye
göre LMV’nin yoğunluğunun daha az olduğu saptanmıştır. Fletcher (2008), marul
bitkilerinde düzensiz yaprak şekilleri, kıvrılma, yaprak lekeleri ve mozaik simptom,
damar açılması veya nekrozlar, Brunt ve ark. (1996), bitkilerde damar açılması,
mozaik simptom, sararma, nekrotik lekeler meydana geldiğini, Reverse ve ark.
(1997), bitkide bodurluk ve bitkinin verimsiz olduğunu bildirmişlerdir. Dinant ve
ark. (1992), ise yaptıkları gözlemlerde bitkilerde bodurluk, göbek oluşturmama,
lekeler ve damar açılmaları gözlemişlerdir.
LBVV ve MiLBVV ile infekteli olduğu teşhis edilen bitkilerin alınmış olduğu
tüm marul tarlalarında bu hastalığın yaygınlık oranının %90 civarında olduğu yapılan
makroskopik inceleme sonucu belirlenmiş ve bu iki virüsün bitkide en çok
oluşturduğu simptomun marul yapraklarında damar açılması, yaprakların koyu renk
alması ve gürleşmesi şeklinde olduğu gözlenmiştir. Fletcher (2008) hava sıcaklığının
52
Bilge ALAN
16ºC altına düştüğü zaman şiddeti artan iri damar hastalığına sebep olan LBVV ve
MiLBVV’nin gelişmede gerilik medana getirdiği, karakteristik olarak iri damar
oluşumuna sebep olduğunu, yapraklarda kabarmanın görüldüğünü, Hayes (2007) ise,
LBVV ve MiLBVV’nin marul bitkilerinin
yapraklarında damar açılması,
gevrekleşme, bitki renginde koyulaşma ve bitkide dolgun yapraklı bir görünüm
oluştuğunu bildirmişlerdir.
Arazi çalışmalarında, bitkilerde özellikle yapraklarda mozaik ve bitkide genel
gelişme geriliği gözlenmiş ve bu bitkilerde CaMV’nin varlığı ELISA testleri ile
ortaya konulmuştur. Benzer olarak, Farhadzar ve ark. (2005) CaMV ile bulaşık
bitkilerde alacalı renk oluşumu, bantlaşma, mozaik, nekrotik lekeler, sararma,
deformasyon gibi simptomlar ortaya çıktığını bildirmişlerdir.
BWYV ile infekteli olduğu saptanan bitkilerde, arazi koşullarında genel bir
sarama ve ilerleyen dönemlerde gevrek bir yapı gözlenmiştir. Fletcher (2008)
BWYV ile bulaşık bitkilerde, özellikle yaprak uçlarının hafif klorotik lekeli
göründüğünü, yaprakların gitgide sararıp incelerek çabuk kırılır bir duruma geldiğini
ve bu simptomların magnezyum eksikliğine benzemekte olduğunu bildirmiştir.
Simptomatolojik gözlemlerle virüsün kesin tanısı mümkün olmadığından, bu
çalışmada, Adana Mersin, Hatay, Osmaniye ve Kahramanmaraş illerine bağlı
ilçelerde, toplam 5.524 dekar araziden alınan 808 marul, 330 lahana, 137 karnabahar,
255 ıspanak ve 65 turp olmak üzere toplam 1595 örnek spesifik antiserumlar
kullanılarak ELISA ile testlenmiştir.
Çalışmada toplanan marul, lahana, turp, karnabahar, ıspanak örnekleri türler
düzeyinde incelendiği zaman örneklerin % 50’sini marul, % 21’ini lahana, % 16’sını
ıspanak, % 9’unu karnabahar, % 4’ünü turp oluşturmuştur (Şekil 4.1).
53
Bilge ALAN
Şekil 4.1. Marul, lahana, turp, karnabahar, ıspanak örnek sayıları ve yüzde oranları
54
Bilge ALAN
A
B
C
D
Şekil 4.2. (A, B, C, D) MiLBVV ile infekteli marul yapraklarında renk koyulaşması,
damar açılması ve şekil bozukluğu
,
55
Bilge ALAN
A
B
C
D
Şekil 4.3. (A, B, C, D) LMV ile infekteli marullarda sarama, yapraklarda kabarcıklar,
şekil bozukluğu ve mozaik simptomları
56
Bilge ALAN
A
B
C
D
A
E
F
Şekil 4.4. (A) CMV ve MiLBVV karışık infeksiyonunda marul yapraklarında damar
açılması ve sararma (B) MiLBVV ve LBVV ile infekteli marul
yapraklarında şekil bozukluğu, nekroz ve damar açılması (C) TSWV ile
infekteli marul yapraklarında nekrotik lezyonlar (D) TSWV ile infekteli
marul yapraklarında nekroz (E) CMV ile infekteli marul yapraklarında
şekil bozukluğu ve sararma (F) BWYV ile infekteli marulda sararma, şekil
bozukluğu ve gelişme geriliği
57
Bilge ALAN
A
B
C
D
F
E
Şekil 4.5. (A) BWYV ile infekteli turp yaprağında sararma (B) TuMV ve BWYV ile
infekteli turp yaprağında mozaik (C) TuMV ve BWYV ile infekteli turp
yaprağında mozaik (D) TuMV ve BWYV ile infekteli turp yaprağında
mozaik ve sararma (E) TuMV ve BWYV ile infekteli turp yaprağında şekil
bozukluğu ve mozaik (F) CMV ve BWYV infekteli turp yaprağında şekil
bozukluğu ve mozaik
58
Bilge ALAN
B
A
C
D
Şekil 4.6. (A, B) BWYV ile infekteli ıspanak yapraklarında sararma ve gelişme
geriliği (C) CMV ile infekteli ıspanak yapraklarında şekil bozukluğu (D)
CMV ile infekteli ıspanak yapraklarında mozaik, sararma ve şekil
bozukluğu
59
Bilge ALAN
A
B
C
D
Şekil 4.7 (A) TuMV ile infekteli K. lahana yaprağında halkalı lekeler (B) TuMV ile
infekteli lahana yaprağında mozaik, sararma ve damar bandlaşması (C)
CaMV ile infekteli karnabahar yaprağında mozaik ve damar açılması (D)
TuMV ile infekteli lahana yapraklarında mozaik ve sararma
4.2. DAS-ELISA Çalışmaları
Arazi çıkışlarında simptomatolojik olarak, CMV, TSWV, TuMV, LMV,
MiLBVV, CaMV, RaMV ve BWYV ile infekteli olduğundan şüphelenilen 808
marul, 330 lahana, 225 ıspanak, 65 turp ve 137 karnabahardan oluşan toplam 1595
bitki örneği ELISA yöntemi ile testlenmiştir (Çizelge 4.1, 4.2)
ELISA testleri sonucunda, 808 marul bitkisinden 380’inde MiLBVV,
82’sinde LMV, 3’ünde TSWV, 3’ünde CMV, 3’ünde BWYV; 255 ıspanak
bitkisinden 90’ında BWYV, 3’ünde CMV; 330 lahana bitkisinden 10’unda TuMV;
65 turp bitkisinden 11’inde BWYV, 6’sında CMV ve 3’ünde TuMV; 137
60
Bilge ALAN
karanabahar bitkisinden 1 bitkide CaMV infeksiyonu saptanmıştır. RaMV
infeksiyonuna ise, testlenen arazi örneklerinin hiçbirinde rastlanmamıştır.
ELISA testlerinde, toplam 1595 arazi örneğinden 595 tanesi en az bir virüs
bakımından pozitif bulunmuştur.
61
Bilge ALAN
62
Bilge ALAN
63
BULGULAR VE TARTIŞMA
Bilge ALAN
Çizelge 4.3. ELISA’da testlenen örneklerde saptanan virüsler ve bulaşıklık oranları
50
45
40
% İnfeksiyon oranı
35
30
25
20
15
10
5
0
Marul
Lahana
Karnabahar
Turp
Ispanak
LMV
10, 1
-
-
-
-
BWYV
0,37
-
-
16,9
35,2
CMV
0,37
-
-
9,2
1,17
47
-
-
-
-
CaMV
-
-
0,72
-
-
TSWV
0,37
-
-
-
-
TuMV
-
3,03
-
4,61
-
MiLBVV+LMV
2,59
-
-
-
-
MiLBVV+CMV
0,12
-
-
-
-
CMV+BWYV
-
-
-
1,5
-
TuMV+BWYV
-
-
-
4,6
-
MiLBVV
Araziden toplanan örneklerin ELISA yöntemi ile testlenmesi sonucunda, elde
edilen % infeksiyon oranlarına göre, marulda MiLBVV, %47 (380 bitki), turp ve
ıspanakta BWYV sırasıyla (65 bitki) %16,9 ve (255 bitki) %35,2 infeksiyon oranları
ile en fazla saptanan virüsler olarak ortaya konulmuştur. Lahanada, en fazla (330
bitki) %3,03 oranında TuMV, karnabaharda ise, (137 bitki) %0,72 oranında CaMV
infeksiyonu saptanmıştır. Marulda (21 bitki) %2,59 oranında MiLBVV+LMV ve (1
64
Bilge ALAN
bitki) %0,12 oranında MiLBVV+CMV karışık infeksiyonlarına karşılık, turpta (1
bitki) %1,53 oranında CMV+BWYV ve (3 bitki) %4,6 TuMV+BWYV karışık
infeksiyonları
ortaya
konulmuştur.
Testlenen
toplam
1595
bitki
içinde
değerlendirildiğinde 26 örnekte (22 marul, 4 turp) karışık infeksiyon saptanmış ve
infeksiyon oranı %1,46 olarak hesaplanmıştır (Çizelge 4.3).
4.3. Mekanik İnokulasyon Çalışmaları
Yapılan mekanik inokulasyon çalışmaları sonucunda aşağıda verilen bulgular
elde edilmiştir.
Maruldan izole edilen CMV, N. tabacum L. cv. ‘Samsun’ ve N. rustica
yapraklarında mozaik, N. tabacum L. cv. Xanthi nc yapraklarında şekil bozukluğu
meydana getirmiştir. Ispanaktan izole edilen CMV, C. amaranticolor da klorotik
lokal lezyon, N. bentamiana ‘da sararma, N. tabacum L. cv. Xanthi nc ve N. rustica
yapraklarında mozaik simptom meydana getirmiş ve her iki izolat ile aşılanan
indikatör bitkilerde simptomlar inokulasyondan bir hafta sonra gözlenmiştir. Turptan
elde edilen CMV izolatı ise, C. amaranticolor yapraklarında klorotik lokal lezyon, N.
bentamiana yapraklarında sararma, N. tabacum L. cv. ‘Samsun’, N. glutinosa ve N.
tabacum L. cv. Xanthi yapraklarında mozaik,
N. glutinosa yapraklarında şekil
bozukluğuna sebep olmuş ve simptomlar inokulasyondan sonraki dördüncü günden
itibaren gözlenmeye başlamıştır. Bu izolatın aşılandığı kabak bitkisi üzerinde ise,
mozaik, şekil bozukluğu ve sararma simptomları ortaya çıkmıştır (Şekil 4.8, 4.9).
Thomson ve Procter (1966), maruldan izole ettikleri CMV ile mekanik
inokulasyon çalışmalarında, N. glutinosa, N. tabacum L. cv. ‘Samsun’ ve Cucumis
sativus’da sistemik simptomlar gözlemişler ve CMV’nin farklı ırklarından dolayı N.
glutinosa’da
farklı
şiddetlerde
sistemik
simptomlar
meydana
geldiğini
bildirmişlerdir. Ayrıca, C. amaranticolar’da küçük nekrotik lezyonlar ve N.
glutinosa’da klorotik lokal lezyonlar oluştuğunu rapor etmişlerdir
CMV izolatları ile yapılan diğer bir çalışmada, mekanik inokulasyonlarda
hıyar bitkisinde mozaik ve bodurluk, N. rustica ve C. quinoa ‘da nekrotik lokal
lezyonlar gözlendiği bildirilmiştir (Kaper ve Waterworth, 1981).
65
Bilge ALAN
A
B
D
C
Şekil 4.8. CMV ile infekteli (A) N. tabacum L. cv. Xanthi nc yapraklarında mozaik
(B) N. tabacum L. cv. Xanthi nc yapraklarında şekil bozukluğu (C) N.
rustica yapraklarında mozaik (D) kabak yapraklarında mozaik
66
Bilge ALAN
B
A
C
D
Şekil 4.9. CMV ile infekteli A) C. amaranticolor yapraklarında klorotik lokal lezyon
(B) N. benthamiana yapraklarında sararma (C) N. tabacum L. cv. ‘Samsun’
yapraklarında mozaik (D) N. glutinosa yapraklarında şekil bozukluğu ve
mozaik
67
Bilge ALAN
LMV bulaştırılan marul yapraklarında mozaik simptomu ortaya çıkarken, C.
amaranticolor yapaklarında ileri dönemlerde nekrotiğe dönüşen klorotik lokal
lezyonlar gözlenmiştir (Şekil 4.10).
Sao Paulo’da LMV ile yapılan mekanik inokulasyon çalışmalarında sadece
C.quinoa’da lokal lezyonlar gözlenmiş ve bu lezyonları gösteren indikatör
bitkilerden direç geni içeren marul bitkilerine yapılan inokulasyonlar sonucu, LMV
bu bitkilere mekanik olarak taşınmıştır (Stangarling, 1997: Krause-Skate ve ark.,
2001’den). Seçilen altı farklı marul kültüründen iki tanesinde lokal lezyonlar
gözlenmiş ve simptom gösteren bu bitkilerden LMV, N. benthamiana Domin.’e
başarı ile taşınmıştır. Mekanik inokulasyon işlemi %0.1 sodyum sülfit (w/v) içeren
0.2 M potasyom fosfat buffer (pH;7.2) ile, bitkiler 4-6 yapraklı dönemde iken sera
koşullarında, karborandum (600 mesh) kullanılarak gerçekleştirilmiştir (KrauseSkate ve ark., 2001).
68
Bilge ALAN
A
A
B
C
D
Şekil 4.10. LMV ile infekteli (A) marul yaprağında mozaik, (B, C) C. amaranticolor
yapraklarında klorotik lokal lezyonlar (D) C. amaranticolor ‘da nekrotik
lokal lezyonlar
69
Bilge ALAN
Mekanik olarak MiLBVV aşılanan marul yapraklarında damar bandlaşması,
mozaik, sararma ve daralma meydana gelmiştir (Şekil 4.11).
Roggero ve ark. (2000), MiLBVV’nin mekanik inokulasyon çalışmalarında,
C. quinoa, N. occidentalis, N. benthamiana, N. tabacum ‘White Burley’ ve ‘Samsun’
tütün çeşitlerini ve marul bitkilerini kullanmışlardır. İnokulasyondan on gün sonra
serada 15-20 °C’de (gece-gündüz) ve sıcaklığı hiç bir zaman 20°C üzerine
çıkarmadan, C.quinoa, N. tabacum ‘White Burley’ yapraklarında sadece lokal
lezyonlar, N. benthamiana’da inokulasyondan iki hafta sonra simptom gözlenmeyen
sistemik infeksiyon ve N. occidentalis yapraklarında on gün içinde lokal lezyonlar ve
bunu takiben sistemik lekeler ve nekrozlar gözlemişlerdir.
A
B
Şekil 4.11. MiLBVV infekteli marul yaprağında (A) damar bandlaşması, mozaik ve
sararma (B) sararma, mozaik, damar bandlaşması ve daralma
70
Bilge ALAN
Maruldan izole edilen TSWV, N. tabacum L. cv. ‘Samsun’ yapraklarında
nekrotik lokal lezyonlar, halkalı lekeler ve şekil bozukluğu, N. tabacum L. cv. Xanthi
nc yapraklarında, şekil bozukluğu, nekrotik lokal lezyonlar, N. tabacum L. cv. Xanthi
bitkisinde, şekil bozukluğu, nekrotik lokal lezyonlar ve meşe yaprağı deseni, C.
quinoa’ da klorotik lokal lezyonlar, marul yapraklarında daralma, solgunluk ve
geriye doğru ölüm simptomları ortaya çıkmıştır. İndikatör bitkilerde simptomlar
inokulasyondan sonra 7-10 gün içinde gözlenmiştir (Şekil 4.12).
Ie (1970), bildirdiğine göre, Chatzivassiliou ve ark (1996) TSWV ile bulaşık
indikatör bitkilerin yapraklarında genel olarak deformasyon, nekrotik ve klorotik
lezyonlar, solgunluk, halkalı lekeler ve bitkide geriye doğru ölüm şeklinde
simptomlar gözlemişlerdir.
Bozdoğan (2009), maruldan izole etmiş olduğu A1, TSWV izolatını mekanik
inokulasyon çalışmasında kullanmış ve 7-10 gün gibi kısa bir sürede C. quinoa’da
nekrotik lokal lezyonlar, N. glutinosa’da kloroz ve bodurluk simptomlarına ilaveten
geriye ölüm ve nekrotik lokal lezyonlar, N. tabacum L. cv. Xanthi ve N. tabacum L.
cv. ‘Samsun’ da deformasyon, kloroz, kıvrılma ile bitkide bodurluk gözlemiş, N.
tabacum L. cv. Xanthi nc ve N. rustica’da bu simptomlara ilaveten halkalı lekeler de
meydana geldiğini bildirmiştir. Ayrıca C. annum’da benzer olarak deformasyon,
bodurluk, kloroz, yaprak kıvrılması ve halkalı lekeler simptomlarını saptamıştır.
71
Bilge ALAN
B
A
C
D
E
F
Şekil 4.12. TSWV ile infekteli A) N. tabacum L. cv. Xanthi yaprağında meşe yaprağı
deseni ve şekil bozukluğu (B) N. tabacum L. cv. Xanthi yaprağında
nekrotik lokal lezyonlar (C) N. tabacum L. cv. ‘Samsun’ yaprağında
nekrotik lokal lezyonlar ve halkalı lekeler (D) N. tabacum L. cv.
‘Samsun’ yaprağında halkalı lekeler (E) N. tabacum L. cv. Xanthi nc
yaprağında nekrotik lokal lezyonlar (F) C. quinoa ‘da klorotik lokal
lezyonlar
72
Bilge ALAN
Karnabahardan izole edilen CaMV izolatı ise, lahana ve karnabahar
bitkilerinde mozaik ve şekil bozukluğu meydana getirmiştir. İndikatör bitkiler
üzerinde beklenen simptomların çıkışı yaklaşık 30 gün sürmüştür (Şekil 4.13).
Farzadfar ve ark. (2005), İran’da bantlaşma, mozaik, nekrotik lekeler, gelişme
geriliği, sararma simptomları gösteren ve CaMV ile infekteli olarak belirlenen
lahanagillerden (süs lahanası, karnabahar lahana brokoli ve şalgam) şalgam, kanola,
çin lahanası, turp ve boru çiçeği (Datura metel)’ne yapmış oldukları mekanik
inokulasyonlar sonucunda, bitkilerde mozaik simptomlar meydana geldiğini
gözlemiş ve bir izolatın (Ca-Sh1) boru çiçeği’nde sistemik infeksiyona neden
olduğunu bildirmişlerdir.
Lahanadan elde edilen TuMV izolatı, C. amaranticolor bitkilerinde klorotik
lokal lezyonlar meydana getirmiştir (Şekil 4.14).
Eiras ve ark. (2007), Brezilya’da yaban turpunda saptamış oldukları TuMV
izolatından yapmış oldukları mekanik inokulasyonlar sonucunda, C. amaranticolor,
C. quinoa, N. clevelandii, N. megalosiphon, N. sylvestris, N. tabacum ‘White Burley’
ve ‘Samsun’ bitkilerinde nekrotik lokal lezyonlar gözlerken, N. glutinosa ve Brassica
oleraceae da sistemik klorotik lezyonlar, mozaik ve nekrozlar gözlemişlerdir. Ancak
C. murale, Datura stramonium ve C. murale, Datura stramonium ve Gomphrena
globosa bitkilerinde herhangi bir simptom saptamamışlardır.
Harera’da TuMV infekteli, nekrotik halka, çizgi ve leke şeklinde simptom
gösteren lahanadan C. quinoa‘ya yapılan mekanik inokulasyonlar sonucu, bitkilerde
klorotik ve nekrotik lokal lezyonlar gözlenmiştir (Chivasa ve ark.2001)
Lin ve Lian (1983), TuMV infekteli lahana ve turptan 0,1M fosfat buffer
(pH;0,7) ve karborandum (600 mesh) kullanarak mekanik inokulasyon yapmışlar ve
30 gün boyunca serada test bitkilerini gözlemişlerdir. Bitkilerden simptom
göstermeyenlerin infekteli olup olmadığını doğrulamak amacı ile tekrar C.
amaranticolor bitkisine inokule etmişler ve sonuç da Gompherana globosa, C.
amaranticolor, N. tabacum L. cv. ‘Samsun’ bitkilerinde klorotik veya nekrotik lokal
lezyonlar ortaya çıkarken, C. quinoa, N. glutinosa ve N. rustica bitkilerinde sistemik
lezyonlar saptamışlardır.
73
Bilge ALAN
A
B
Şekil 4.13. CaMV ile infekteli (A) karnabahar yapraklarında mozaik (B) lahana
yapraklarında mozaik
Şekil 4.14 TuMV ile infekteli C. amaranticolor yapraklarında klorotik lokal
lezyonlar
.
74
Bilge ALAN
75
Bilge ALAN
4.4. Toplam Nükleik Asit İzolasyon Çalışmaları
Toplam nükleik asitler, 1. ELISA testleri sonucunda, CMV, TSWV, TuMV,
LMV, MiLBVV, CaMV ve BWYV infekteli olduğu saptanan arazi örneklerine ait
taze bitki dokularından 2. ELISA kiti bulunmayan BCTV, BtMV, LIYV ve
LBVV’nin oluşturduğu simptomlara benzer belirtiler gözlenen bitki dokularından 3.
mekanik inokulasyon yöntemi ile virüs bulaştırılan otsu indikatör bitkilerden alınan
taze bitki dokularından elde edilmiş ve TBE tampon çözeltisinde hazırlanan %
1.5’lik agaroz jel kullanılarak elektroforez yöntemi ile gözlenmiştir.
4.5. RT-PCR ve PCR Çalışmaları
Günümüzde viroloji alanında yapılan çalışmalarda yoğun şekilde kullanılan
RT-PCR yöntemi, antiserumu bulunmayan LIYV, BtMV, BCTV ve LBVV’nin
moleküler olarak saptanması ve ELISA testleri sonucu teşhis edilen CMV, TSWV,
TuMV, BWYV, LMV, MiLBVV ve CaMV’nin dizi belirleme çalışmalarında
kullanılan amplifikasyon ürünlerinin elde edilmesi amacıyla ile yürütülmüştür.
Çalışmada, CMV, TSWV, TuMV, LMV, MiLBVV, LBVV, CaMV ve BWYV’ne ait
primer çiftleri ile yapılan PCR işlemlerinde beklenen büyüklüğe sahip bandlar elde
edilmiş, ancak LIYV, BtMV ve BCTV’ye ait primer çiftleri ile yapılan PCR
çalışmalarında herhangi bir band gözlenmemiştir.
76
M
Bilge ALAN
A
B
C
D
E
F
500
250
296 bç LBVV
50
Şekil 4.15. LBVV’e spesifik primer çifti kullanılarak yapılan Mersin ve Hatay
illerine ait marul izolatları RT-PCR sonuçları (M; 50 bç DNA ladder
A;LBVV-1, B;LBVV-2, C;LBVV-3, D;LBVV-4, E;LBVV-5, F;
LBVV-6)
LBVV için VP 248 ve VP 249 kodlu primer çifti kullanılarak maruldan izole
edilen Mersin (LBVV-1, LBVV-2) ve Hatay (LBVV-5, LBVV-6) izolatlarına ait 296
bç büyüklüğünde bandlar elde edilmiş (Şekil 4.15), ancak Adana izolatları (LBVV-3,
LBVV-4)'ndan sonuç alınamamıştır. Ticari antiserumu bulunmayan LBVV
çalışmada sadece RT-PCR yöntemi kullanılarak teşhis edilebilmiştir.
M
A
B
C
500
D
E
F
469 bç MiLBVV
250
50
Şekil 4.16. MiLBVV’ye spesifik primer çifti kullanılarak yapılan Mersin, Adana,
Hatay illerine ait marul izolatlarının RT-PCR sonuçları (M; 50 bç DNA
ladder, A;MiLBVV-1, B;MiLBVV-2, C;MiLBVV-3, D;MiLBVV-4,
E;MiLBVV-5, F;MiLBVV-6)
77
Bilge ALAN
MiLBVV için VP 286 ve VP 287 kodlu primer çifti kullanılması sonucunda
maruldan izole edilen Mersin (MiLBVV-1, MiLBVV-2), Adana (MiLBVV-3,
MiLBVV-4), ve Hatay (MiLBVV-5, MiLBVV-6) izolatlarına ait 469 bç ‘lik bandlar
elde edilmiştir (Şekil 4.16) Bu sonuçlar Navarro ve ark. (2004)’nın yapmış olduğu
çalışma ile benzerlik göstermiştir. Aynı araştırıcılar, yukarıda kodu verilen primerleri
kullanılarak sırasıyla, LBVV2’ye ait 296 bç ve MiLBVV’e ait 469 bç’lik bandlar
elde etmişlerdir.
M
A
B
C
D
E
F
1000
800 bç LMV
500
250
50
Şekil 4.17. LMV ye ait primer çiftleri ve Mersin, Adana, Hatay illerine ait
marul’izolatları ile yapılan RT-PCR sonuçları (M; 50 bç DNA ladder,
A-B;LMV-1, C-D;LMV-2, E-F;LMV-3)
LMV için 1196 ve 1087 primer çiftinin kullanılması sonucunda, Mersin
(LMV-1, LMV-2) Adana (LMV-3, LMV-4) ve Hatay (LMV-5, LMV-6) illerine ait
marul izolatlardan 800 bç’lik band elde edilmiştir (Şekil 4.17). Bu sonuç KrauseSakate ve ark. (2001)’nın yaptıkları çalışma sonucu ile benzerlik göstermiştir. Aynı
araştırıcılar, marul bitkisinden elde ettikleri LMV izolatlarını saptamak amacıyla,
1196 ve 1087 kodlu primer çiftini kullanmışlar ve 800 bç büyüklüğe sahip band
gözlemişlerdir.
78
M
Bilge ALAN
A B…… M
C
D
E
F
G
1000
650 bç
CMV
750
500
250
1000
750
650 bç CMV
500
250
276 bç TSWV
Şekil 4.18. CMV ve TSWV’ye ait primer çiftleri ile CMV-turp, CMV-ıspanak, CMV
marul ve TSWV-marul izolatları için yapılan RT-PCR sonuçları (M;1kb
DNA ladder, A;CMV-T1, B;CMV-T2, C;CMV-I D;CMV-M, E;TSWV1, F;TSWV-2, G;TSWV-3)
CMV için RW8 ve RV11 kodlu primer çifti kullanılmış ve CMV’nin
Osmaniye’den alınan turp izolatları (CMV-T1, CMV-T2) Adana’dan alınan ıspanak
izolatı (CMV-I), marul izolatı (CMV-M)’na ait 650 bç’‘lik bandlar elde edilmiştir
(Şekil 4.18). Bu sonuç, Sialer ve ark (1999)’nın yapmış oldukları çalışma sonucu ile
paralel bir sonuç göstermiştir. Aynı araştırıcılar yaptıkları çalışmada, 650 bç lik band
elde etmişlerdir.
TSWV için L1 TSWVR ve L2 TSWVF kodlu primer çiftinin kullanılması
sonucunda, Adana marul izolatlarına (TSWV-1, TSWV-2, TSWV-3) ait 276 bç’lik
band elde edilmiştir (Şekil 4.18). Bu sonuç, Adkins ve ark. (2005), yaptıkları çalışma
ile uygunluk göstermektedir. Aynı araştırıcılar, yaptıkları çalışmada 276 bç’lik band
elde etmişlerdir.
79
M
Bilge ALAN
A
B
C
700
500
383bç CaMV
D
E
F
615bç TuMV
250
250bç BWYV
50
Şekil 4.19. CaMV, TuMV ve BWYV’e ait primer çiftleri ile yapılan RT-PCR
sonuçları (M; 50bç DKA ladder, A;CaMV, B;TuMV-T, C;TuMV-L
izolatı, D;BWYV-M, E;BWYV-T, F;BWYV-I)
CaMV için CaMV1 ve CaMV2 kodlu primerlerin kullanılması sonucunda
CaMV ile infekteli karnabahar izolatından (CaMV-1) 383 bç’lik band elde edilmiştir
(Şekil 4.19). Bu sonuç, Wolf ve ark. (1999),’nın yaptıkları çalışma sonucu ile
benzerlik göstermiştir. Aynı araştırıcılar yaptıkları çalışmada 383 bç büyüklüğünde
band elde ettiklerini bildirmişlerdir.
TuMV için Tu-8207F ve Tu-8822R kodlu primer çiftinin kullanılması
sonucunda TuMV ile infekteli Osmaniye’den turp izolatı (TuMV-T) ve Adana’dan
lahana izolatına (TuMV-L) ait 615 bç lik band elde edilmiştir (Şekil 4.19). Bu
sonuç, Suehiro, ve ark. (2005), yaptıkları çalışma sonucu ile benzerlik göstermiştir.
Aynı araştırıcılar çalışmalarında 615 bç büyüklüğünde band elde etmişlerdir.
BWYV için LewP0+ ve -SP1- kodlu primer çiftinin kullanılması ile BWYV
ile infekteli olduğu saptanmış Adana’dan marul izolatı (BWYV-M), Osmaniye’den
turp (BWYV-T) ve ıspanak (BWYV-I) izolatlarına ait 250 bç’lik band elde edilmiştir
(Şekil 4.19). Bu sonuç, Beuve ve ark. (2008)’nın yaptıkları çalışma sonucu ile
benzerlik göstermiştir. Aynı araştırıcılar çalışmasında 250 bç büyüklüğünde band
elde etmişlerdir.
80
Bilge ALAN
4.6. Dizi Belirleme ve Filogenetik Sınıflandırma Çalışmaları
DNA dizi belirleme ya da sekanslama, DNA’nın birincil yapılarının tayininde
ve nükleotid baz dizilimlerinin belirlenmesinde kullanılan yöntemdir. DNA dizi
belirleme, gen yapısı ve genetik kontrol mekanizmaları hakkında birçok bilgi
edinilmesini sağlamıştır.
PCR çalışmalarında elde edilen PCR ürünlerine ait nükleotid dizileri, iontek
(www.iontek.com.tr) firması tarafından ticari olarak belirlenmiş ve bu çalışmada
kullanılan virüs izolatlarına ait sekans bilgileri dünyada kayıtlı diğer izolatlarla
nükleotid düzeyinde karşılaştırılarak filogenetik analizleri yapılmıştır.
4.6.1. Hıyar Mozaik Virüsü (CMV) Dizi Analizi Çalışması
CMV dizi belirleme çalışmalarında ile CMV infekteli ıspanak bitkisinden
izole edilen CMV-I izolatı kullanılmıştır. CMV-I izolatının 650 bç büyüklüğündeki
RNA-Polimeraz geni, Japonya izolatları AB079890.1, D16406.1, D86613.1,
D00355.1, D12538.1, D10209.1, Çin izolatı EF202596.1, Güney Kore izolatları,
U59740.1, GU327367.1, Macaristan izolatları AJ511989.1, AJ517801.1, Polonya
izolatı EU294145.1, Avusturalya izolatı HQ916353.1, İspanya izolatı AM183118.1
ve Amerika izolatı AB096214.1 ile %44 oranında benzerlik göstermiştir (Çizelge
4.5).
Geniş bir konukçu aralığına sahip olan CMV, birçok ülkede oldukça fazla
sayıda izolatı bulunan bir virüstür. Bu çalışmada, CMV-I ıspanak izolatı filogenetik
soy ağacında, Japonya’dan AB079890.1, D16406.1, D86613.1 Güney Kore’den,
U59740.1, ve Çin’den EF202596.1 izolatları ile aynı grupta yer almıştır (Şekil 4.20).
Hareesh ve ark. (2005), Hindistan’da Piper betle L. ve Piper longum L.
bitkilerinde doğal infeksiyon yapan CMV izolatlarının aralarında hem nükleik asit
hem de aminoasit dizilimleri bakımından %100 benzerlik göstermiş olduğunu
belirlemişler ve dünyadan seçilmiş diğer CMV izolatları ile dizi benzerliklerini
karşılaştırmışlardır. Her iki izolatta gen bankasında kayıtlı diğer dünya izolatlarıyla
%93-97 nükleik asit, %95-99 aminoasit benzerliği göstermiştir. Bu izolatların
81
Bilge ALAN
Hindistan da subogrup 1 ve 2 içinde yer aldığını bildirilmişlerdir. Yüksek oranda
benzerlik gösteren izolatlar subgrup 1, diğerleri subgrup 2 içinde kümelenmiş ve
coğrafi dağılıma göre sıralanmıştır.
AB079890.1-Japonya
99
EF202596.1-Çin-Domates
65
U59740.1-G.Kore-Börülce
91
D16406.1-Japonya-Börülce
95
88
D86613.1-Japonya-Börülce
CMV-I Ispanak
22
AM183118.1-İspanya-Domates
35
AB096214.1-ABD-Biber
17
D00355.1-Japonya
96
AJ517801.1-Macaristan-Turp
D12538.1-Japonya
TRICHOTOMY
80
22
HQ916353.1-Avusturalya-Kabak Çekirdeği
AJ511989.1-Macaristan-Tütün
D10209.1-Japonya
100
30 GU327367.1-G.Kore-Kabak
EU294145.1- Polonya-Hıyar
Şekil 4.20. CMV’nin izolatının farklı üretim bölgelerinden (Japonya, Çin, Güney
Kore, Macaristan, Polonya, Avusturalya, İspanya, Amerika) CMV
tekrarlamalı)
82
Bilge ALAN
83
Bilge ALAN
4.6.2. Domates Lekeli Solgunluk Virüsü (TSWV) Dizi Analizi Çalışması
TSWV dizi belirleme çalışmalarında TSWV infekteli marul bitkisinden izole
edilen TSWV-1 izolatı kullanılmıştır. TSWV-1 izolatının 276 bç büyüklüğündeki
RNA-Polimeraz geni, Yunanistan izolatı AM940436.1 ile %94, Sırbistan izolatları
HQ246452.1, GO279732.1, GQ279731.1, FJ189393.1, FJ189392.1, ve GO132190.1
ile sırasıyla %94, %92, %94, %94, %94, Güney Kore izolatları AB190813.1,
HM581937.1 ve HM581934.1 ile sırasıyla %91, %91, %94, Endonezya izolatı
FJ177301.1 ile .% 92, Fransa izolatı AY070218.1 ile %92, Çin izolatı JF960237.1 ile
%93, Hollanda izolatı D10066.1 ile %91 oranında benzerlik göstermiştir (Çizelge
4.6).
TSWV izolatlarına ait filogenetik soy ağacında TSWV-1 marul izolatı,
Sırbistan izolatları ve Yunanistan izolatı ile aynı grupta yer almıştır. TSWV-1’in bu
izolatlar ile benzerlik oranı diğer izolatlara göre daha yüksektir (Şekil 4.21).
Kim ve ark. (2004), Korea Yesan’da kırmızı biber (Capsicum annuum var.
grossum) bitkisinde en elde edilen TSWV-KP için yapılan dizi analizi çalışmalarında
TSWV-KP’nin N proteini gen bankasında farklı TSWV izolatları ile kıyaslandığında
sırasıyla %96.5-97.2 nükleotid ve %97.7-98.5 aminoasit benzerliği gösterdiğini
saptamışlardır.
Stankoviç ve ark. (2011), Sırbistan’da Gerbera hybrida bitkilerinin yaklaşık
%30’unda çeşitli simptomlar (meşe yaprağı deseni, nekroz, deformasyon)
gözlemişler ve mekanik inokulasyon ve ELISA çalışmaları sonucunda 20 bitkinin
18’inde TSWV’yi saptamışlardır. RT-PCR çalışmaları sonucunda, 276 bç
büyüklüğünde band elde etmişler ve seçmiş oldukları iki izolatı gen bankasında
HQ246452.1 ve HQ246453.1 olarak kaydetmişlerdir. Bu iki izolat, dizi belirleme
çalışmalarında AM940436.1, GQ279732.1, GQ132190.1, FJ189392.1, FJ189393.1
izolatları ile %90.6-99,6 oranında benzerlik göstermiştir. En yüksek benzerlik oranı
ise GQ373174 Sırbistan izolatında saptanmıştır. Bu çalışma ile Sırbistan’da TSWV
Gerbera bitkisinde ilk olarak rapor edilmiştir.
84
Bilge ALAN
TSWV1-Marul
7
GQ279731.1-Sırbistan-Tütün
10
FJ189392.1-Sırbistan-Tütün
12
FJ189393.1-Sırbistan-Tütün
11
GQ279732.1-Sırbistan-Domates
24
GQ132190.1-Sırbistan-Impatiens
41
AM940436.1-Yunanistan-Enginar
D10066.1-Hollanda
48
JF960237.1 Çin-Domates
8
HQ246452.1-Sırbistan-Gerbera
TRICHOTOMY
9
FJ177301.-Endonezya-Domates
23
HM581934.1-G.Kore-Domates
31
AY070218.1-Fransa
HM581937.1-G.Kore-Biber
100
AB190813.1-G.Kore
Şekil 4.21. TSWV-1 izolatının farklı üretim bölgelerinden (Yunanistan, Sırbistan,
Güney Kore, Endonezya, Fransa, Çin, Hollanda) TSWV izolatlarıyla
filogenetik ilişkisini gösteren soyağacı (Boostrap 100 tekrarlamalı)
85
Bilge ALAN
86
Bilge ALAN
4.6.3. Şalgam Mozaik Virüsü (TuMV) Dizi Analizi Çalışması
TuMV dizi belirleme çalışmalarında TuMV infekteli turp bitkisinden izole
edilen TuMV-T izolatı kullanılmıştır. TuMV-T izolatının 615 bç büyüklüğündeki
RNA-Polimeraz geni, Japonya izolatları AB252100.1, AB093626.1, AB362513.1,
D83184.1, L12396.1 ile sırasıyla %83, %82, %82, %81, %82, Vietnam izolatı
DQ925460.1 ile %82, Çin izolatları AB093601.1, AB093603.1, AJ293279.1,
AJ310204.1, AJ307039.1 ile sırasıyla %84, %83, %80, %80, %84, %83, İngiltere
izolatı EU861593.1 ile %80, Yeni Zelanda izolatı AY995214.2 ile %80, Tayvan
izolatı AF530056.1 ile %82 oranında benzerlik göstermiştir (Çizelge 4.7)
TuMV’ne ait filogenetik soy ağacında TuMV-T turp izolatı en çok benzerlik
göstermiş olduğu AB093601 ve AB093603 Japon izolatları ile aynı grupta yer
almıştır. Soy ağacında bulunan TuMV izolatları genel olarak Japonya, Çin, Tayvan,
Viyetnam izolatlarından meydana gelmiştir. EU862593 kodlu İngiltere izolatı da bu
çalışmada yapılan soy ağacında Japon izolatları ile aynı kümede yer almıştır (Şekil
4.22).
87
Bilge ALAN
AB093626.1-Japonya
100
AF530056.1-Tayvan
100
DQ925460.1-Vietnam-Hardal
92
97
6
AB252100.1-Japonya
100
AJ310204.1-Çin-Turp
AJ307039.1-Çin-Turp
|AB362513.1-Japonya
AJ293279.1-Çin-Hardal
27
EU861593.1-İngiltere-Lahana
TRICHOTOMY
100
D83184.1-Japonya
45
100
L12396.1-Japonya
AY995214.2-YeniZelanda
AB093601.1-Çin
96
92
|AB093603.1-Çin
TuMV-T-Turp
Şekil 4.22. TuMV-T izolatının farklı üretim bölgelerinden (Japonya, Vietnam, Çin,
İngiltere, YeniZelanda, Tayvan) TuMV izolatlarıyla filogenetik ilişkisini
gösteren soyağacı (Boostrap 100 tekrarlamalı)
88
Bilge ALAN
89
Bilge ALAN
Sa´nchez ve ark. (2003), 60 TuMV izolatının genetik dizilerinin
sınıflandırılmasında iki ana genetik küme (MB; çoğunluğu lahana izolatı ve MR;
çoğunluğu turp izolatı) olduğunu belirlemişlerdir. MB kümesi içinde 18 dizi, MR
kümesi içinde ise 5 dizi bulunmaktadır. MB kümesi içinde nükleotid benzerliği %
95.10-/99.88, MR kümesi içinde nükleotid benzerliği %96.15-98.72 her iki küme
arasındaki nükletid benzerliği ise %88.34-91.96 oranlarında değişmektedir. Yedi dizi
ise, bu iki kümenin içinde yer almamaktadır. Bu 7 izolattan 3 tanesi (AF226847,
X83968 ve Y09144) MR ve MB ile en az %91.7 nükleotid benzerliği göstermekte ve
(Intermediate between Brassica and Radish) IBR olarak isimlendirilmektedir. Diğer
4 izolat (AF185963, AF226846, ESC8 and Y09114) en fazla %90.43 oranında MB
veya MR ile benzerlik göstermekte ve (Outside of Brassica and Radish clusters)
OBR olarak isimlendirilmektedir.
Dünyada yaygın olarak görülen TuMV’nin çoğunluğu lahana ve turp
bitkilerinden oluşan 76 izolatı bulunmaktadır. Ancak lahanagillerden olmayan birçok
türde de mevcuttur. Ohshima ve ark. (2002), yapmış oldukları bir çalışmada,
konukçu bitkiye göre izolatları isimlendirmişler ve dört kümede toplanmışlardır.
Basal B kümesi; 8B patotip içermektedir ve çoğunluğu değişebilme özelliği
göstermektedir. Avrasya’nın merkez ve güney batısında lahanagillerden ve lahanagil
olayan türlerden meydana gelmiştir. Basal BR, 8BR patotipi kapsamakta ve Avrasya
izolatlarından oluşmaktadır. Üçüncü ve en az değişebilme özelliğine sahip Asya BR
grup, 22 BR patotip çoğunluğu turp bitkisinden meydana gelen lahanagillerden
oluşmaktadır. Asya BR grubunda Güney Asya’dan genelde Japon izolatları
bulunmaktadır. Dördüncü grup World B; 36 izolat büyük kısmı lahanadan meydana
gelmekte ve Avrupa ile dünyanın diğer kısımlarından izolatları içermektedir.
Korkmaz ve ark. (2008) Marmara bölgesinde yapmış olduğu survey
çalışmaları sonrasında ELISA ile 142 örneği TuMV ile infekteli olarak saptamışlar
ve TuMV’nin lahanagillerde görülme oranını %13.4 olarak hesaplamışlardır. Türkiye
izolatları ile filogenetik analiz çalışmasında, Tur1 ve Tur 9 izolatlarının sırası ile
World B (world Brassica) ve Asya BR (Asian-Brassica /Raphanus) grubuna ait
olduğunu belirlemiştir.
90
Bilge ALAN
Bu çalışmada kullanılan TuMV-T izolatının en çok benzerlik göstermiş
olduğu AB093601 ve AB093603 Çin izolatları, Basal BR grubu içinde yer
almaktadır.
4.6.4 Marul Mozaik Virüsü (LMV) Dizi Analizi Çalışması
LMV dizi belirleme çalışmalarında LMV ile infekteli marul bitkisinden
izole edilen LMV-4 (Adana) izolatı kullanılmıştır. LMV-4 izolatının 800 bç
büyüklüğündeki KP (kapsid protein) geni, Amerika izolatları U24663.1, U24664.1,
U24665.1 U24666.1 U24667.1 U24669.1, U24670.1’le ile sırasıyla %99, %95,%97,
%98, %98, %98, %42, Fransa izolatları Z78233.1, Z78232.1, Z78228.1, AF368962.1
ile sırasıyla % 41, %41, %41 %42, Brezilya izolatı AJ278855.1 ile %96, Çin izolatı
AJ488153.1 ile %91, İsrail izolatı AF395804.1 ile %42 oranında benzerlik
göstermiştir (Çizelge 4.8).
Yapılan filogenetik soy ağacında, bu çalışmada kullanılan LMV-4 marul
izolatı, en fazla benzerlik gösterdiği Amerika izolatları ile aynı grupta yer almıştır.
Koyungözü (Gazania spp) bitkisinden izole edilen ve LMV-4 izolatıyla %95
oranında benzerlik gösteren Amerika izolatı U24664.1 ise, farklı kümede yer
almıştır. Bu izolat dışındaki diğer Amerika izolatları marul bitkisinden elde edilmiştir
(Şekil 4.23).
91
Bilge ALAN
Z78233.1-Fransa-Marul
14
67
AF395804.1-İsrail-Marul
60
100
U24670.1- Amerika-Marul
100
AJ278855.1-Brezilya-Marul
100
92
AJ488153.1-Çin-Marul
100
AF368962.1-Fransa-Marul
U24664.1-Amerika-Koyungözü
U24663.1-Amerika-Marul
56
TRICHOTOMY
84
LMV-4-Marul
81
97
|U24667.1-Amerika-Marul
Şekil 4.23. LMV izolatının farklı üretim bölgelerinden (Amerika, Fransa, Brezilya,
Çin, İsrail) LMV izolatlarıyla filogenetik ilişkisini gösteren soyağacı
(Boostrap 100 tekrarlamalı)
92
Bilge ALAN
93
Bilge ALAN
Krause-Sakate ve ark. (2002)’nın yapmış olduğu dizi belirleme çalışmasında,
dünya izolatları ile kıyaslamada 3 ana küme ortaya çıkarılmıştır. Bu üç önemli küme
önceden LMV-Yar, LMV-Greek, and LMV-RoW olarak teşhis edilmiştir. LMV-Yar
kümesinde eski ve tek üyesi olan YAR izolatı bulunmaktadır. LMV-Greek
kümesinde Yunanistan’dan izole edilmiş olan 7 Yunanistan izolatı ve LMV-ROW
kümesi içinde ise 22 tane (LMV-WE–C) Batı Avrupa ve Kaliforniya orjinli izolatlar
bulunduğu bildirilmiştir. Yapılan bu çalışma ile bu grubun dünyanın farklı
yerlerinden (Batı ve Kuzey Afrika, Kuzey ve Güney Amerika, Asya, Avusturalya ve
Avrupa)
daha
farklı
izolatlar
içermekte
olduğu
saptanmış
ve
yeniden
isimlendirilmiştir. Bu kümelerden LMV-Greek üyelerinin daha şiddetli siptomlar
gösterdiği ve mo11 veya mo12 genlerine karşı direnç kırma özelliğine sahip olduğu
ve tohumla diğer alanlara taşınmadığı ve Yunanistan sınırları içinde bulunduğu
belirlenmiştir. LMV-ROW kümesi ise, biyolojik özelliklerine göre, 2 gruba (LMVCommon ve LMV-Most) ayrılmıştır. LMV-Common kümesi üyeleri mo11 veya
mo12, genleri üstesinden gelemezken, tohumla taşınma durumunun karışık olduğu,
LMV-Most’un ise mo11 ve mo12 genlerinin üstesinden gelmekte ve tohumla
taşınmakta olduğu belirlenmiştir. LMV-ROW grubu, üyesi olan izolatlardan da
anlaşılacağı gibi tohumla uzak alanlara yayılabilmekte ve LMV epidemisi
oluşmasında önemli yere sahip bir grup olarak bildirilmiştir.
Yapılan çalışmada LMV-4 marul izolatının soy ağacında %95 oranında en
fazla benzerlik göstermiş olduğu AJ488153.1 Çin-marul izolatı, LMV-ROW kümesi
içinde yer almaktadır..
4.6.5. Marul İri Damar Virüsü (MiLBVV) Dizi Analizi Çalışması
MiLBVV dizi belirleme çalışmalarında MiLBVV ile infekteli marul
bitkisinden izole edilen MiLBVV-4 izolatı kullanılmıştır. MiLBVV-4 izolatının 469
bç büyüklüğündeki KP (kapsid protein) geni, Avusturalya’dan GU139119.1,
GU139120.1, GU139117.1, GU139124.1, GU139123.1, GU139125.1, GU139116.1,
GU139114.1, GU139121.1, GU139126.1, İspanya’dan AY581700.1, Almanya’dan
AY581697.1 izolatları ile ile %43-44 arasında değişen düşük oranlarda benzerlik
94
Bilge ALAN
gösterirken, Hollanda izolatı AF525935.1 ile %98 oranında benzerlik göstermiştir
(Çizelge 4.9 ).
Bu çalışmada yapılan dizi analizinde, MiLBVV izolatları arasında %43-98
arasında değişmekte olan bir benzerlik bulunduğu belirlenmiştir. MiLBVV-4 izolatı,
filogenetik soy ağacında en çok benzerlik göstermiş olduğu Hollanda izolatı
(AF525935.1) ile aynı grup içinde yer almıştır (Şekil 4.24)
Sanches ve ark., 2008 yılında yapmış oldukları çalışmada, maruldan izole
etmiş oldukları LBVaV’nın Brezilya izolatlarının KP genine dayalı analizleri
sonucunda, bu izolatların diğer LBVaV izolatları ile benzerlik oranlarının en az %93
olduğunu göstermişlerdir. Bunun yanında, LBVaV ile MLBVV arasındaki aminoasit
dizilimindeki benzerliği %91-100 arasında değişmekte olduğunu saptamışlardır.
95
Bilge ALAN
AY581700.1-İspanya-Marul
99
GU139126.1-Avusturalya-Marul
97
AF525935.1-Hollanda-Marul
100
97
MiLBVV-4-Marul
AY581697.1-Almanya-Marul
51
99
43
31
32
35
66
39
TRICHOTOMY
Şekil 4.24. MiLBV-4 izolatının farklı üretim bölgelerinden (Avusturalya, İspanya,
Almanya, Hollanda) MiLBVV izolatlarıyla filogenetik ilişkisini gösteren
soyağacı (Boostrap 100 tekrarlamalı)
96
Bilge ALAN
97
Bilge ALAN
4.6.6. Marul İri Damar Virüsü (LBVV) Dizi Analizi Çalışması
LBVV dizi belirleme çalışmalarında LBVV ile infekteli marul bitkisinden
izole edilen LBVV-2 Mersin izolatı kullanılmıştır. LBVV-2 izolatının 296 bç
büyüklüğündeki KP (kapsid protein) geni, İspanya’dan AY581688.1, AY366413.1
AY581689.1, AY581690.1, izolatları ile %94, AY581691.1 izolatı ile %95 oranında
benzerlik göstermiştir. Japonya izolatları AB190528.1, AB050272.1 ile sırasıyla
%93, %92, Brezilya izolatları DQ530352.1, DQ530354.1, DQ530353.1 ile sırasıyla
%95, %94, %93, Avusturalya izolatları GU220725.1, GU220724.1, GU220721.1
GU220722.1, GU220723.1 ile sırasıyla %95, %94, %94, %95, %95 oranında
benzerlik göstermiştir (Çizelge 4.10).
LBVV-2 marul izolatının filogenetik soy ağacında, izolatlar arasında
benzerlik oranı %92-96 arasında değişmektedir ve izolatlar ülkeye göre
kümelenmiştir. Genel olarak gen bankasından elde edilmiş olan LBVV izolatları
arasında benzerlik oranının birbirine yakın olduğu görülmektedir (Şekil 4.25).
Sasaya ve ark. (2005), yapmış oldukları çalışmada, LBVV ‘nin Japon ve
İspanyol izolatları arasında % 97.2 ve 98.7 oranında benzerlik olduğunu ve ülkeye
göre kümelendiğini belirlemişlerdir.
98
Bilge ALAN
86
GU220721.1-Avusturalya
100
97
85
36
AB190528.1-Japonya
100
AB050272.1-Japonya
24
DQ530352.1-Brezilya
91
DQ530354.1-Brezilya
79
DQ530353.1-Brezilya
AY581688.1-İspanya
TRICHOTOMY
45
AY366413.1-İspanya
98
AY581689.1-İspanya
25
AY581690.1-İngiltere
AY581691.1-İspanya
91
LBVV-2
Şekil 4.25. LBVV-2 izolatının farklı üretim bölgelerinden (Avusturalya, Japonya,
Brezilya, İspanya, İngiltere) LBVV izolatlarıyla filogenetik ilişkisini
gösteren soyağacı (Boostrap 100 tekrarlamalı)
99
Bilge ALAN
100
Bilge ALAN
4.6.7. Karnabahar Mozaik Virüsü (CaMV) Dizi Analizi Çalışması
CaMV dizi belirleme çalışmalarında CaMV ile infekteli marul bitkisinden
izole
edilen
CaMV-1
izolatı
kullanılmıştır.
CaMV-1
izolatının
383
bç
büyüklüğündeki tamamlayıcı geni, Çin izolatları AF140604.1 ve D00335.1 ile
sırasıyla %95, %80, Fransa izolatları X79465.1 ve X53860.1 ‘nın her ikisi ile % 80
oranında benzerlik göstermiştir (Çizelge 4.11).
CaMV-1 izolatı ile yapılan filogenetik soy ağacında, CaMV-1, %95 benzerlik
göstermiş olduğu AF140604.1 Çin izolatı ile aynı grupta yer almıştır. %80 benzerlik
göstermiş olduğu X53860.1ve X79465.1 Fransa izolatları ve %81 benzerlik
gösterdiği şalgam bitkisinden elde edilen D00335.1 izolatları ile ayrı gruplanmıştır
(Şekil 4.26).
Farzadfar ve ark., 2007 yılında İran’da yapmış oldukları dizi analizi
çalışmalarında gen bankasında bulunan diğer izolatlarla yapılan kıyaslamada
Macaristan izolatlarının aralarında %99.1 ve %96.7 oranında ile benzerlik
bulunduğunu ve İran izolatlarının aynı dalda kümelendiğini, bunun yanında, Kuzey
ABD izolatları ile ayrı kümede gruplandığını bildirmişlerdir.
101
Bilge ALAN
AF140604.1-Çin
43
CaMV-1
43
X79465.1-Fransa
95
TRICHOTOMY
X53860.1-Fransa
D00335.1
Şekil 4.26 CaMV-1 izolatının farklı üretim bölgelerinden (Çin, Fransa) CaMV
tekrarlamalı)
AF140604.1
6.
1
.1
Y1
85
5
X5
38
6
D0
03
35
0.
1
5.
1
X7
94
6
Ca
M
V1
AF
%
14
06
04
.1
Çizelge 4.11. NCBI Blast: Nükleotid Dizi programına girilen kılıf protein gen
dizisine göre CaMV-1 izolatının dünya izolatları ile benzerlik oranları
100
CaMV-1
95
100
X79465.1
93
80
100
X53860.1
88
80
97
100
D00335.1
84
81
86
85
100
Y18556.1
63
80
65
81
76
102
100
Bilge ALAN
4.6.8. Şekerpancarı Batı Sarılık Virüsü (BWYV) Dizi Analizi Çalışması
BWYV dizi belirleme çalışmalarında ile BWYV infekteli turp bitkisinden
izole edilen BWYV-T izolatı kullanılmıştır. BWYV-T izolatının 250 bç
büyüklüğündeki tamamlayıcı geni, Çin izolatları HM804471.1, HM804472.1,
EU636991.1 ve EU636990.1 ile sırasıyla %87, %86, %78, %78, Fransa izolatı
AF473561.1 ile % 89 oranında benzerlik göstermiştir (Çizelge 4.12 )
BWYV’ne ait filogenetik soy ağacında genel olarak Çin izolatları
bulunmakta ve BWYV-T izolatı benzerlik oranları yüksek olan Çin izolatları ile aynı
grupta yer almıştır (Şekil 4.27).
Xiang ve ark. (2010), Çin’de Inner Mongolia (BWYV-IM-EU636991.1) ve
Gansu (BWYV-GS-EU636990.1) daha önceden rapor edilmiş olan BWYV’nin iki
izolatının tamamlayıcı genomik RNA dizisi üç pancar polerovirüs (BMYV, BChV ve
BWYV-US) ile benzerlik oranları karşılaştırılmıştır. İki Çin izolatının genom
uzunluğu 5,668 nt olarak belirlenmiş ve BWYV-IM diğer izolatlarla benzerlik oranı
sırasıyla BWYV-GS %97.4, BWYV-US %86.6, BChV %64.4 ve BMYV % 70.8
olarak saptanmıştır. Sonuçta BWYV Çin izolatlarının en fazla BWYV-US izolatı ile
benzerlik göstermekte olduğu rapor edilmiştir.
Fortass ve ark. (1997) Fas'ta luteovirus infekteli bir nohut bitkisinden elde
edilen izolatın yüksek oranda BWYV ile benzerlik gösterdiğini (%96), diğer
luteovirüsler ile daha düşük oranda bir
belirlemişlerdir.
103
benzerlik (%50-60) gösterdiğini
Bilge ALAN
HM804471.1-Çin-Şeker Pancarı
100
HM804472.1-Çin-Şeker Pancarı
100
BWYV-T-Turp
EU636990.1-Çin-Şeker Pancarı
TRICHOTOMY
100
EU636991.1-Çin-Şeker Pancarı
AF473561.1-Fransa
Şekil 4.27. BWYV-T izolatının farklı üretim bölgelerinden (Çin, Fransa) BWYV
tekrarlamalı)
Çizelge 4.12. NCBI Blast: Nükleotid Dizi programına girilen tamamlayıcı gen
dizisine göre BWYV-Tizolatının dünya izolatları ile benzerlik
oranları
%
HM
80
7
44
1 .1
HM
80
7
44
2 .1
BW
Y
T
V-
AF
47
6
35
1.1
EU
63
9
69
0 .1
EU
HM804471.1
100
HM804472.1
94
100
BWYV-T
87
86
100
AF473561.1
83
81
89
100
EU636990.1
79
79
78
87
100
EU636991.1
79
79
78
87
97
104
63
9
69
1 .1
100
5. SONUÇLAR VE ÖNERİLER
Bilge ALAN
Bu çalışmada elde edilen sonuçlar aşağıdaki şekilde özetlenmiştir.
1. Arazi çıkışlarında simptomatolojik olarak, CMV, TSWV, TuMV, BWYV,
LMV, LBVV, CaMV, RaMV, LIYV, BtMV ve BCTV’ ile infekteli olduğundan
şüphelenilen 808 marul, 330 lahana, 225 ıspanak, ve 137 karnabahar 65 turp
bitkisinden oluşan toplam 1595 bitki örneği ELISA testi ile testlenmiştir.
2. Toplanan arazi örneklerinden yapılan ELISA testleri sonucunda;
808 marul bitkisinden 380 bitkide (%47) MiLBVV, 82 bitkide (%10,1), LMV
3 bitkide (% 0,37) TSWV, 3 bitkide CMV (%0,37) ve 3 bitkide BWYV (%0,37),
255 ıspanak bitkisinden 90 bitkide BWYV (% 35,2) ve 3 bitkide CMV (%
1,17) saptanırken,
330 lahana bitkisinden 10 bitkinin TuMV (% 3),
65 turp bitkisinden 11 bitkinin BWYV (%16,9 ), 6 bitkinin CMV (%9,2) ve 3
bitkinin TuMV (% 4,6 ),
137 karnabahar bitkisinden ise, bir bitkinin CaMV (%0,7) ile infekteli olduğu
ortaya konulmuştur.
3. ELISA çalışmalarında testlenen bitkilerin hiçbirinde RaMV infeksiyonu
saptanmamıştır.
4. Testlenen 1595 arazi örneğinden 595 tanesinde bir veya daha fazla virüs
saptanmış ve infeksiyon oranı % 37.3 olarak hesaplanmıştır.
5. Toplam 1565 arazi örneği içerisinde 26 örnekte (22 marul, 4 turp) %1,46
oranında karışık infeksiyon saptanmıştır. Marulda (21 bitki) %2,59 oranında
MiLBVV+LMV
ve
(1
bitki)
%0,12
oranında
MiLBVV+CMV
karışık
infeksiyonlarına karşılık, turpta (1 bitki) %1,53 oranında CMV+BWYV ve (3 bitki)
%4,6 TuMV+BWYV karışık infeksiyonları ortaya konulmuştur.
6. ELISA sonucunda infekteli olduğu saptanan örneklerden absorbans
değerinin yüksekliği, alındığı bitki ve survey alanının yeri dikkate alınarak virüs
izolatları seçilmiş ve mekanik inokulasyon, RT-PCR, dizi belirleme ve dizi analizi
çalışmalarında kullanılmıştır.
105
Bilge ALAN
7. Yapılan mekanik inokulasyon çalışmaları sonucunda aşağıda verilen
bulgular elde edilmiştir.
LMV bulaştırılan marul yapraklarında mozaik simptomu ortaya çıkarken, C.
amaranticolor yapaklarında ileri dönemlerde nekrotiğe dönüşen klorotik lokal
lezyonlar gözlenmiştir
Mekanik olarak MiLBVV aşılanan marul yapraklarında damar bandlaşması,
mozaik, sararma ve daralma meydana gelmiştir
Lahanadan elde edilen TuMV izolatı, C. amaranticolor bitkilerinde klorotik
lokal lezyonlar meydana getirmiştir.
Karnabahardan izole edilen CaMV izolatı ise, lahana ve karnabahar
bitkilerinde mozaik ve şekil bozukluğu meydana getirmiştir. İndikatör bitkiler
üzerinde beklenen simptomların çıkışı yaklaşık 30 gün sürmüştür.
Maruldan izole edilen CMV, N. tabacum L. cv. ‘Samsun’ ve N. rustica
yapraklarında mozaik, N. tabacum L. cv. Xanthi nc yapraklarında şekil bozukluğu
meydana getirmiştir. Ispanaktan izole edilen CMV, C. amaranticolor da klorotik
lokal lezyon, N. bentamiana ‘da sararma, N. tabacum L. cv. Xanthi nc ve N. rustica
yapraklarında mozaik simptom meydana getirmiş ve her iki izolat ile aşılanan
indikatör bitkilerde simptomlar inokulasyondan bir hafta sonra gözlenmiştir. Turptan
elde edilen CMV izolatı ise, C. amaranticolor yapraklarında klorotik lokal lezyon, N.
bentamiana yapraklarında sararma, N. tabacum L. cv. ‘Samsun’, N. glutinosa ve N.
tabacum L. cv. Xanthi yapraklarında mozaik,
N. glutinosa yapraklarında şekil
bozukluğuna sebep olmuş ve simptomlar inokulasyondan sonraki dördüncü günden
itibaren gözlenmeye başlamıştır. Bu izolatın aşılandığı kabak bitkisi üzerinde ise,
mozaik, şekil bozukluğu ve sararma simptomları ortaya çıkmıştır.
Maruldan izole edilen TSWV, N. tabacum L. cv. ‘Samsun’ yapraklarında
nekrotik lokal lezyonlar, halkalı lekeler ve şekil bozukluğu, N. tabacum L. cv. Xanthi
nc yapraklarında, şekil bozukluğu, nekrotik lokal lezyonlar, N. tabacum L. cv. Xanthi
bitkisinde, şekil bozukluğu, nekrotik lokal lezyonlar ve meşe yaprağı deseni, C.
quinoa’ da klorotik lokal lezyonlar, marul yapraklarında daralma, solgunluk ve
geriye doğru ölüm simptomları ortaya çıkmıştır. İndikatör bitkilerde simptomlar
inokulasyondan sonra 7-10 gün içinde gözlenmiştir
106
Bilge ALAN
Mekanik inokulasyon çalışmaları sonucunda, indikatör bitkiler üzerinde
LMV, LBVV, MiLBVV, TSWV, CaMV, TuMV ve CMV ‘ye spesifik simptomlar
gözlenmiştir.
8. İzolatlara ait toplam nükleik asitler elde edilmiş ve agaroz jel elektroforez
de görüntülenmiştir. Bu karışımlar, RT-PCR ve PCR ile testlenmiş böylece, bu
çalışma ile son yıllarda yapılan birçok çalışmada rutin olarak kullanılan moleküler
bir yöntem, bölgemizde de TSWV, CMV, LMV, MiLBVV, LBVV, BWYV, TuMV,
infeksiyonunu saptamak için başarılı bir şekilde kullanılmıştır.
8. RT PCR çalışmaları sonucunda,
LBVV……………………………….….....296 bç
MiLBVV…………………………….…….469 bç
LMV…………………………………….... 800 bç
TuMV…………………………………..… 615 bç
BWYV………………………………….... 250 bç
CMV……………………………………… 650 bç
TSWV…………………………….………...276 bç
PCR çalışmaları sonucunda ise,
CaMV…………………………………….383 bç büyüklükte bandlar elde
edilmiştir.
BCTV, BtMV, LIYV ve LBVV’nin antiserumu bulunmaması nedeniyle
şüpheli örneklere BtMV, LIYV ve LBVV için RT-PCR yöntemi, BCTV için PCR
yöntemi uygulanmış ve bu virüslerden sadece marul bitkisinde LBVV’nin varlığı
beklenen band büyüklükleri gözlemlenerek saptanmıştır.
9. RT-PCR ile saptanmış olan, TSWV, LMV, MiLBVV, BWYV, TuMV,
LBVV, CMV ve PCR ile saptanmış CaMV’ nin dizi belirleme ve filogenetik
çalışmalar sonucu dünyadaki diğer izolatlarla karşılaştırılması yapılmış ve dizi
analizleri sonucunda bu izolatlarla olan benzerlik oranları belirlenmiştir. Bu
sonuçlara göre;
•
LMV, %99 Amerika
•
MiLBVV, % 98 Hollanda
107
Bilge ALAN
•
CaMV, %95 Çin
•
TuMV, %84 Çin
•
LBVV, % 95 İspanya
•
CMV, % 44 G. KoreJaponya, İÇin
•
TSWV, % 96 Yunanistan, Sırbistan, G. Kore
•
BWYV,%89 Çin izolatları ile benzerlik göstermiştir.
Sonuç olarak, bu çalışmada, kışlık sebzelerin yetiştiriciliğini sınırlayan ve etkin
mücadele yöntemi bulunmayan virüs hastalıklarının saptanması ve tanılanması
amacıyla, biyolojik, serolojik ve moleküler yöntemler başarı ile uygulanmıştır.
Bunların yanı sıra, bu virüs hastalıklarının toplanan örneklerde infeksiyon oranları da
belirlenmiştir.
Çalışmanın yapıldığı Adana Mersin, Osmaniye, Hatay ve Kahramanmaraş
illeri ile çevresi, kışın sebze yetiştiriciliği yapmak için uygun iklim koşullarına ve
ekonomik yapıya sahiptir. Ürün çeşidinin çok geniş olduğu bu bölgelerde birçok
zararlı ve hastalık etmeni büyük kayıplara yol açmaktadır. Bu hastalık etmenleri
içerisinde virüsler, gerek kimyasal mücadele yöntemlerinin bulunmaması, gerekse
vektörler yardımıyla çok uzak ve geniş alanlara kolayca yayılabilmeleri yüzünden
ayrı bir öneme sahiptirler. Bunlara ilaveten, vektör böcekler ile yapılan kimyasal
mücadelenin de virüslerin yayılmasını engellemede çok etkili olmaması, bu hastalık
etmenlerinin önemini daha da arttırmaktadır.
Kışlık sebzelere zarar veren virüs hastalıkları içerisinde CMV, TSWV,
TuMV, LMV, MiLBVV, LBVV, CaMV, RaMV, BWYV, LIYV, BtMV ve BCTV
önem arz eden virüslerdir. Bu virüs hastalıklarından özellikle CMV, TSWV, TuMV,
BWYV, LMV, LBVV hastalıklarının oranları bölgemizde gün geçtikçe problem
haline gelmektedir.
Özellikle marul bitkilerinde, ekonomik anlamda büyük kayıplara neden olan
LMV, MiLBVV, LBVV, TSWV, CMV’ ye karşı mücadele edebilmek için çeşitli
kültürel önlemler alınmalıdır. Bu virüs etmenlerinin çıkışı ve yayılmasının (mekanik
108
Bilge ALAN
yollarla, vektörler aracılığıyla, tohumla) engellenmesine yönelik olarak alınabilecek
bu önlemlerin belirlenmesi gerekmektedir.
Son yıllarda bitkilerde zararlı virüs hastalıklarının saptanması ve tanılanması
amacıyla yapılan çalışmalarda, çok yoğun olarak kullanılan moleküler yöntemler de
uygulanarak yürütülen bu doktora tezi sonuçlarının, özellikle bundan sonra yapılacak
olan kültürel mücadele yöntemleri içerisinde yer alan dayanıklılık çalışmalarında
dikkate alınması gereklidir. Zira, elde edilen sonuçlar, çalışma konusu virüslerin
birden fazla izolatının bulunduğunu, bu virüs izolatlarının dünyanın diğer izolatları
ile az veya çok benzerlik ve farklılıklar gösterdiğini ortaya koymuştur. Çalışma
konusu virüslerin izolat düzeyinde var olan farklılıklarının göz önünde tutularak,
özelikle yurtdışından büyük miktarlarda ithal edilen sebze çeşitlerinin bu virüs
izolatlarına gösterebilecekleri tepkilerin belirlenmesi ve olumsuz sonuçlara karşı
önlem alınması gerekmektedir. Bu amaç doğrultusunda, gerekirse tohumların
ülkemizde bulunan virüs izolatlarına karşı reaksiyonları test edilmeden ve büyük
ekonomik sorunlar yaşanmadan ülkeye getirilmesi ve çiftçiye satışı engellenmelidir.
109
Bilge ALAN
110
KAYNAKLAR
ADKİNS, S., ZİTTER, T., and MOMOL T., 2005. Tospoviruses (Family
Bunyaviridae, Genus Tospovirus). Fact Sheet PP-212, One of a Series of
The Plant Patology Department, Florida Cooparative Extension Services
Institute of Food And Agricultural Sciences, University of Florida.
AL-SALEH, M.A., AL-SHAHWAN, I.M., AMER M.A. and ABDALLA O.A.,
2009. Etiology of a Mosaic Disease of Radish and Lettuce and Sequencing of
the Coat Protein Gene of the Causal Agent in Saudi Arabia International
Journal of Virology, 5: 131-142.
ANONYMOUS, 1990. Tarımsal Yapı ve Üretim. T.C. Başbakanlık TİE Ankara.
ANTİGNUS, Y., M. LAPİDOT, N. GANAİM, J. COHEN, O. LACHMAN, M.
PEARLSMAN, B. RACCAH and GERA, A., 1997. Biological and Molecular
Characterization of Tomato spotted wilt virus İn Israel. Phytoparasitica, 25:
319–330
ARAYA, C., PENA, E., SALAZAR, E., ROMÁN, L., MEDİNA, C., ROXANA
MORA, R., ALJARO, A. and ROSALES, I.M., 2011. Symptom Severıty and
Vıral Proteın Or Rna Accumulatıon In Lettuce Affected By Bıg-Veın
Dısease. Chılean Journal of Agrıcultural Research, 71(1): 63-72
ARLİ-SÖKMEN, M., MENNAN, H., SEVİK, M.A., ECEVİT, O. 2005. Occurence
of viruses in field-grown pepper crops and some of their reservoir weed hosts
in Samsun, Turkey. Phytoparasitica 33: 347-358.
ASTRUC, N., MARCOS, J.F., MACQUARIE, G., CandRESSE, G.T. and VICENT,
P., 1996. Studies on the Diagnosis of Hop stunt viroid in Fruit Trees:
İdentification of New Host and Application of a Nucleic Acid Extraction
Procedure Based on Non-Organik Solvents. European Journal of Plant
Pathology, 102: 837-846.
AZERİ, T., 1981. Preminary Report of Tomato spotted wilt virüs and İts Epidemy on
Tobacco in the Çanakkale Region of Turkey. J Turkish Phytopathology, 10 (23):79-87.
111
______, T., 1994. Detection of Tomato Spotted Wilt Virüs in Tabacco and Tomato
Cultivars
by
Enzyme
Linked
Imminosorbent
Assay.
J.
Turkish
Phytopathology, 23(1): 37-46.
BALİJİ, S., BLACK, M. C., FRENCH, R., STENGER, D. C. and SUNTER, G.
2004. Spinach curly top virus: A newly described Curtovirus species from
southwest Texas with incongruent gene phylogenies. Phytopathology, 94:
772-779.
BALL, 1909. Bull. U.S. Dept. Agric. Bur. Entomol., 66: 33.
BARBA, M. and RICCIONI, L., 1993. Improvement of Diognostic Methods to
Detect Plum Pox Virus in Apricot Plants. Agriculture, 139- 141.
BARCALA TABARROZZİ, A.E., PEÑA, E.J., DAL BO, E., ROBLES LUNA, G.,
REYES C.A. and GARCİA, M.L., 2010. Identification of Mirafiori lettuce
big-vein virus and Lettuce big-vein associated virus infecting Lactuca sativa
with symptoms of lettuce big-vein disease in Argentina New Disease Reports,
20: 38.
BENNETT C.W. and TANRISEVER A., 1957. Sugar Beet curly top disease in
Turkey. Plant Disease Reporter 41: 721–725.
BEUVE, M., STEVENS, M., LİU, H.Y., WİNTERMANTEL, W. M., HAUSER, S.,
and LEMAİRE, O. 2008. Biological and Molecular Characterization of an
American Sugar Beet-İnfecting Beet western yellows virus İsolate. Plant Dis.
92: 51-60.
BOSWELL, K., 1985. ´Beet curly top virus´ Viruses of Plants, 205-207.
______, K., 1985. Beet curly top hybrigeminivirus. Plant
virüs online
http://www.agls.uidaho.edu/ebi/vdie//descr081.htm
BOZDOĞAN, V., 2009. Antalya ilinde domates, biber ve marul yetiştirilen alanlarda
Domates lekeli solgunluk virüsü (Tomato spotted wılt vırus, TSWV)’ nün
saptanması. Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma Ana Bilimdalı
Yüksek Lisans Tezi ADANA. 65 s.
BRİTTLEBANK, C.C.,1919. J. Agric. Victoria, Aust.,17: 213.
BROWN, J.K. and STANGHELLİNİ, M.E., 1988. Lettuce infectious yellows virus in
hydroponically grown lettuce in Pennsylvania. Plant Disease 72, 453.
112
______, J.K.; NELSON, M.R., 1986. Whitefly-borne viruses of melons and lettuce in
Arizona. Phytopathology 76, 236-239.
BRUNT, A.A., CRABTREE, K., DALLWİTZ, M.J., GİBBS, A.J. and WATSON,
L., 1996. Viruses of Plants. Descriptions and Lists from The WIDE Database.
CAB International, Wallingford.
CABI and EPPO Data Sheets On Quarantine Pests Lettuce infectious yellows
'closterovirus
CAMBELL, R.N., 1988. ‘Radish mosaic virus’ Viruses of Plants (edited by A.
Brunt, K. Crabtree, M. Dallwitz, A. Gibbs and Watson L.) pp. 1052-1055.
University Press, Cambridge.
______, R.N. and R.C. GROGAN. 1963. Big-vein virus of lettuce and its
transmission by Olpidium brassicae. Phytopathology 53: 252-259
CHAMBERLAİN E.E., 1936. Turnip mosaic. A virus disease of crucifers. New
Zealand Journal of Agriculture, 53: 321–330.
CHEN, C. C., CHAO, C. H., CHEN, C. C., YEH, S. D., TSAİ, H. T., and CHANG,
C. A. 2003. Identification Of Turnip mosaic virus İsolates Causing Yellow
Stripe And Spot On Calla Lily. Plant Dis. 87: 901-905.
CHİVASA, S., EKPO, E.J.A. and HİCKS, R.G.T., 2001. New Hosts of Turnip
mosaic virus in Zimbabwe New Disease Reports 4, 5. ISSN 2044-0588
CHO, J.J., MAU, R.F.L., GERMAN, T.L., HARTMANN, R.W., YUDİN, L.S.,
GONSALVES, D. and PROUVİDENTİ, R., 1989. A Multidisciplinary
Approach to Management of Tomato spotted wilt virus. in Hawaii. Plant
Disease, 73: 375-383.
______, J.J., MITCHEL, W.C., MAU, R.F. L. and SAKIMURA, K., 1987.
Epidemiology of Tomato spotted wilt virüs Disease on Crisphead Lettuce in
Hawaii. Plant Disease, 71: 505- 508.
CHOUEIRI, E., DIGIARO, M., MINAFRA, A. and SAVINO, V., 1993. A Survey of
Peach Viruses in Apulia. Adv.Hort. Sci. 7: 61-64.
______, E., YOUNIS. H., SAAD. A., ISSA. S., HANNA. L., HAJJ . S., HASSAN
and TAKACH. T.E., 2001. Occurrence and Distribution of Sugar Beet
Viruses in Lebanon, 40: 260-264
113
CHROMAS (www.technelysium.com.au/chromas.html)
CILLO, F., FINETTI-SIALER, M. M., PAPANICE, M. A. and GALLITELLI, D.,
2004. Analysis of mechanisms involved in the Cucumber mosaic viruses
satellite RNA-mediated transgenic resistance in tomato plants. Molecular
Plant-Microbe Interactions Vol. 17 (1), pp. 98-108.
CLARK, M.F. and ADAMS, A.N., 1977. Characteristics of the Microplate Method
of Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Detection of Plant Viruses.
Journal of General Virology 34: 475-483.
COLARICCIO, A., EIRAS, M., CHAVES, A.L.R., HARAKAVA, R., CHAGAS,
C.M., 2005. In Sao Paulo, SP, Brazil. Instituto Biologico, Av. Conselheiro
Rodrigues Alves, 1252: 04014-002.
______, A., CHAVES A.L.R., EİRAS, M., CHAGAS C.M., LENZİ and R.,
ROGGERO, P., 2003. Presence of Lettuce Big-Vein Disease and Associated
Virusesin A Subtropical Area of Brazil. Plant Pathology, 52: 792.
complete nucleotide sequence, genome organization, and specific detection
CORONA, O.F.M., LEBAS, B.S.M., ELLİOTT, D.R., TANG, J.Z. and
ALEXANDER, B.J.R., 2007. New Host Records and New Host Family
Range for Turnip mosaicvirus in New Zealand Australasian Plant Disease
Notes, 2: 127–130
CREAMER, R., CARPENTER,J., and RASCON, J., 2003. Incidence of the Beet
Leafhopper,Circulifer tenellus (Homoptera:Cicadellidae),in New Mexico
Chile. Southwestern Entomologist, Sept., 28(3), 177-182.
DESBIEZ, C. and WIPF-SCHEIBEL, C., 1996. Biological and Molecular Variability
of Zucchini yellow mosaic virus on The Island Of Martinique. Plant Dis., 80:
203-207.
______, C. and WIPF-SCHEIBEL, C., 1996. Biological and Molecular Variability of
Zucchini yellow mosaic virus on the Island of Martinique.Plant Disease,
80:203-207.
DİNANT, S. and LOT, H., 1992. Lettuce Mosaic Virus. Plant Pathol, 41: 528–54.
114
DÖKEN, M.T., AÇIKGÖZ, S., DEMİRCİ, E., 1993. Big-Vein Virus Disease of
Lettuce in Erzurum, Turkey Journal of Turkish Phytopathology,Vol: 22, (1)
41-43.
DUFFUS, J.E. and JOHNSTONE, G.R., 1983. Plant Viruses Online. Beet western
yellows luteovirus. Descriptions and Lists from the VIDE Database
______, J.E. and MOLYNEUX, S.,1986. ‘Lettuce infection yellow virus’ Viruses of
Plants(edited by A. Brunt, K. Crabtree, M. Dallwitz, A. Gibbs and L. Watson)
717-719. University Press, Cambridge.
______, J.E., 1960. Radish Yellows, A Disease of Radish, Sugar Beet, and Other
Crops. Phytopathology 50: 389-394.
______, J.E., 1961. Economic Significance of Beet western yellows (Radish
Yellows) on Sugar. Phytopathology, 51: 605-607.
______, J.E., FLOCK, R.A., 1982. Whitefly-Transmitted Disease Complex of The
Desert Southwest. California Agriculture, 36: 4-6.
______, J.E., MAYHEW, D.E. AND FLOCK, R.A., 1982. Phytopathology 72: 963.
ECKEL, C.S., C.H.O, K., WALGENBACH, J.F., KENNEDY, G.G. and MOYER,
J.W., 1996. Variation in Thrips Species Composition in Field Crops and
İmplications for Tomato spotted wilt Epidemiology in North Carolina.
Entomol.exp, 78: 19-29.
EİRAS, M. CHAVES, A.L.R., COLARİCCİO A., CHAGAS, C. M., 2007. First
Report of Turnip mosaic virus in Horseradish in Brazil Fitopatol. Bras., 32
(2): 165
ERKAN, S., ESIYOK, D. and ESER, B., 1990. A New Viral Agent Affecting
Cauliflower and Cabbage Plants InTurkey. J.Turk.Phytopath., 19(2): 95-97.
FARZADFAR, S. and POURRAHIM, R., 2004. Occurrence of Radish mosaic virus
on Cauliflower and Turnip Crops in Iran. Vol; 88 (8): 909.1– 909
______, S., AHOONMANESH. A., MOSAHEBİ, G.H., OHSHİMA, K., KOOHİHABİBİ, M., POURRAHİM, R., and GOLNARAGHİ, A.R., 2007. Partial
Biological and Molecular Characterization of Cauliflower mosaic virus
Isolates in Iran . Plant Pathology Journal, 6: 291-298.
115
______, S., POURRAHİM, R., GOLNARAGHİ, A.R. and AHOONMANESH A.,
2005. Occurrence of Cauliflower Mosaic Virus in Different Cruciferous
Plants in Iran Plant Pathology, 54 : 810-810
______,
S.,
TOMİTAKA,
Y.,
IKEMATSU
M.,
GOLNARAGHİ
A.R.,
POURRAHİM R., OHSHİMA K., 2009. Molecular characterisation of
Turnip mosaic virus isolates from Brassicaceae weeds J Plant Pathol 124: 4555
FINETTI-SIALER, M.M., CILLO, F., BARBAROSSA, L. and GALLITELLI, D.,
1999. Differentiation of Cucumber mosaic virus Subgroups by RT-PCR
RFLP. Journal of Plant Pathology, 81 (2), 145-148.
FİDAN, Ü., ve TÜRKOĞLU, T., 1988. Ege Bölgesi Marul Bitkilerinde Görülen
Virüs Hastalıkları Üzerinde Ön Çalışmalar. Bitki Koruma Bülteni, 28 (1-2):
43-56
FLETCHER, J., 2008. Lettuce viruses in New Zealand Crop and Food Research,
Lincoln, 1-10
FORTASS M., VAN DER WİLK, F., HEUVEL, J.F., VAN DEN J.M. and
GOLDBACH R.W.,1997. Molecular Evidence For The Occurrence of Beet
western yellows virus On Chickpea İn Morocco European Journal of Plant
Pathology 103: 481–484
FRANCKİ, R.I.B. and HABİLİ, N., 1987.’Cucumber mosaic virus’ Viruses of Plants
(edited by A. Brunt, K. Crabtree, M. Dallwitz, A. Gibbs and L. Watson) 477482. University Press, Cambridge.
GALLITELLI, D., and MINAFRA, A., 1994. Electroforesis. Course on Plant Virus
Diagnosis, 15-30 October 1994. Adana-Turkey. Page: 89-99.
GARRETT, R.G.1982 ‘Cauliflover mosaic virus’ Viruses of Plants (edited by A.
Brunt, K. Crabtree, M. Dallwitz, A. Gibbs and L. Watson) pp. 352-356.
GERAYELİ, N., JAFARPOUR, B., FALAHATİ RASTEGAR M., ZABİHNİA
MOGHADDAM A., 2010. The Study of Infection and Distribution of Beet
mosaic virus in Khorasan Razavi Province’s Fields. Journal of Plant
Protection 24(2): 17
116
GERMAN, T.L., ULLMAN, D.E. and MOYER, J.W., 1992. Tospoviruses:
Diagnosis, Molecular Biology, Phylogeny and Vector Relationships. Ann.
Rev. Phytopathol. 30: 315-348.
GİBBS, A.J., 1983. ‘Tomato spotted wilt virus´ Viruses of Plants, (edited by A.
Brunt, K. Crabtree, M. Dallwitz, A. Gibbs and L. Watson). 1312-1315.
GÜLDÜR, M.E. 1997. Şanlıurfa ili için yeni bir virüs: Domates lekeli solgunluk
virüsü (Tomato spotted wilt virus). HRÜ. Ziraat Fakültesi Dergisi. 1 (3): 7176.
______, M.E., 1995. Güneydoğu Anadolu Projesi (GAP) Alanına Giren Şanlıurfa,
Diyarbakır, ve Mardin İllerinde Yetiştirilen Domateslerde Zararlı Virüsler.
Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma Ana Bilim Dalı. Doktora Tezi
ADANA.120 s.
______, M.E., MARCHOUKS, M.G.M., YURTMEN, E., and YILMAZ, M.A.,
1995. Mersin ve Çevresinde Yetiştirilen Domateslerde Zararlı Yeni Bir Virüs
Tomato Spotted Wilt Virus. VII. Türkiye Fitopatoloji Kongresi, 26-29 Eylül
1995, Adana. Bildiriler, 303-306.
HABİLİ, N. and FRANCKİ, R.I.B.,1974. Virology 57: 392
HAREESH P.S., MADHUBALA, R. and BHAT A.I., 2005. Characterization of
Cucumber mosaic virus İnfecting Indian. Long PEPER (Piper longum) and
Betel Vine (Piper betle L.) İn India. Indian Journal Of Biotechnology Vol. 5:
89-93
HAUSER, S., STEVENS, M., MOUGEL, C., SMİTH, H.G., FRİTSCH, C.,
HERRBACH,E. and LEMAİRE, O., 2000. Biological, Serological, and
Molecular Variabilit suggest Three Distinct Polerovirus S Pecies İnfecting
Beet or Rape. Phytopathology 90: 460-466.
HAYES, R.J. and RYDER, E.J., 2007. Introgression of novel alleles for partial
resistance to big vein disease from Lactuca virosa into cultivated lettuce.
Hortscience 42: 35-39.
______, R.J., RYDER, E.J., and WİNTERMANTEL, W.M. 2007. Genetic variation
for big vein disease symptom expression and Mirafiori lettuce big vein virus
117
incidence in Lactuca virosa L.¸ a wild relative of cultivated lettuce. (in
preparation).
HEATHCOTE G.D. and WOODS, R.D., 1982.’Beet mosaic virus’ Viruses of Plants
(edited by A. Brunt, K. Crabtree, M. Dallwitz, A. Gibbs and L. Watson) 211214.
HEİDARİ, F., KOOHİ-HABİBİ, M., MOSAHEBİ, G.H. 2010 Identification and
Partial Characterization of Viral Agent of Lettuce Big Vein in Tehran
Province. Iranian Journal of Virology 4(1): 17-22
HELGUERA, P.R., DOCAMPO, D.M., NOME, S.F. and DUCASSE, D.A., 2002.
Enhanced Detection of Prune Dwarf Virus in Peach Leaves by
İmmunocapture- Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction with
Nested
Polymerase
Chain
Reaction
(IC-RT-PCR
Nested
PCR).
J.Phytopathology 150, 94-96. Blackwell Wissenschafts-Verlag, Berlin.
HORVATH, J. 1980. Viruses of Lettuce. II. Hostranges of lettuce mosaic virus and
Cucumber mosaic virus. Acta Argon. Scient. Hungaricae 29: 333-352.
http://bilgi.sitesi.web.tr
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
http://mac.softpedia.com/get/Math-Scientific/ClustalX.shtml
http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/rod.html
http://www.gencziraat.com/Bahce-Bitkileri/Ispanak-Yetistiriciligi
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
IE, T. S. (1970) Tomato spotted wilt virus. CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses,
(59): 4
ISHİKAWA-SUEHİRO, N., 2007. The Molecular and Biological Characterization of
Pathogenicity Determinants Of Turnip mosaic virus and A Simplified Method
For Virus Detection. J Gen Plant Pathol, DOI 10.1007/s 10327-007-0052-6
IWANOVSKİ, D.,1892. Izv. İmp. Akad. Nauk.,35: 67.
JAGGER, I.C. and CHANDLER. N., 1934. Big-Vein, A Disease of Lettuce.
Phytopathology, 24: 1253-1256.
118
______, I.C., 1921. A Transmissible Mosaic Disease of Lettuce. J. Agric. Res. (U.S.)
20: 737-741.
JAİN, R.K., S.S., PAPPU, H.R., CULBREATH, A.K. and TOOD, J.W., 1998.
Molecular Diagnosis of Tomato spotted wilt tospovirus Infection of Peanut
and Other Field and Greenhouse Crops. Plant Disease, 82: 900-904.
KAMBEROGLU, M.A. and ALAN, B., 2011. Occurrence of Tomato spotted wilt
virus in Lettuce in Cukurova Region of Turkey. Int. J. Agric.Biol., 13: 431–
434
KAPER, J.M. and WATERWORTH, H.E., 1981. Cucumoviruses, in Handbook of
Plant Virus Infectious and Comparative Diagnosis (Kurtsak. E., ed.),
Biomedical, North Holland, pp. 258-332.
KİM, J-H., CHOİ, G-S., KİM J.S. and JANG-KYUNG CHOİ, J-K., 2004.
Characterization of Tomato spotted wilt virus from Paprika in Korea. The
Plant Pathology Journal The Korean Society of Plant Pathol. J. 20(4): 297301
KORKMAZ, S., ÖNDER, S., TOMİTAKA, Y. and OHSHİMA K., 2007. First report
of Turnip mosaic virus on Brassicaceae Crops in Turkey. Plant patology, 56:
719.
______, S., TOMİTAK, Y., ONDER, S. and OHSHİMA, K., 2008. Occurrence and
molecular characterization of Turkish isolates of Turnip mosaic virus Plant
Pathology57, 1155–1162
KOZUBEK, E., IRZYKOWSKİ, W., LEHMANN P., 2007. Genetic and molecular
variability of a Turnip mosaic virus population from horseradish (Cochlearia
armoracia L.) J Appl Genet. 48(3): 295-306.
KRAUSE-SAKATE, R., FAKHFAKH, H., PEYPELUT, M., PAVAN, M.A.,
ZERBİNİ F.M., MARRAKCHİ, M., CandRESSE T. and LE GALL. O.,
2004. A Naturally Occurring Recombinant İsolate of Lettuce Mosaic Virus.
Arch Virol, 149: 191–19.7
______, R., MELLO, R.N., PAVAN, M.A., ZAMBOLIM, E.M., CARVALHO,
M.G., LE GALL, O. and ZERBINI, F.M., 2001. Molecular Characterization
119
of Two Brazilian İsolates of Lettuce Mosaic Virus With Distinct Biological
Properties. Fitopatologia Brasileira, 26: 153-157.
KUVATA, 1991. ‘Lettuce mosaic virus viruses of Plants (edited by A. Brunt, K.
CRABTREE, M. DALLWİTZ, A. GİBBS and L. WATSON), 715-717.
LARSEN, R. C. and MİKLAS, P. N., 2004. Generation and Molecular Mapping of A
Dizi Characterized Amplified Region Marker Linked With the Bct Gene for
Resistance to Beet curly top virus in Common Bean. Phytopathology 94: 320325.
LİN, C.C. and LİAN, L.S.,1983. Comparative Cruciferous Host Simptoms of Turnip
mosaic virus Isolated İn Taiwan. Jour.agric. res. China 32 (4): 367-372
LOT H., CAMPBELL RN., SOUCHE S,. MİLNE R.G., and ROGGERO P., 2001.
Mirafiori lettuce virus and Lettuce big-vein virus, and Their Roles in Lettuce
Big-Vein Etiology
MANDAL, B., PAPPU, H.R.,and CULBREATH, A.K., 2001. Factors Affecting
Mechanical Transmission of Tomato spotted wilt virus to Peanut (Arachis
hypogea). Plant Disease, 85: 1259-1263
MANOUSSOPOULOS. I.N., CHATZİVASSİLİOU. E.K., SMYRNİOUDİS, I.N.
and KATİS, N.I., 1999. Two Diseases Of Dimorphotheca Caused by Lettuce
mosaic potyvirus and Tomato spotted wilt virus. Phytoparasitica, 27(3): XxXxx.
MAVRIC PLESKO, I., VIRSCEK MARN, M. and ZERJAV, M., 2009.
Identification of Lettuce Big-Vein Associated Virus And Mirafiori Lettuce
Big-Vein Virus Associated with Lettuce Big-Vein Disease in Slovenia. Plant
disease Vol. 93(5): 549
megep.meb.gov.tr/mte_program_modul/modul.../622B00145.pdf
MESSİAEN, M.C. and LAFON, R., 1965. Les Maladies Des Plantesmaraicheres,
Vol; II, IRA, 272-276.
MİLNE, R.G., MASENGA, V., LENZİ, R. and LOVİSOLO, O., 1980. Phytopathol.
Medit., 19: 145.
120
MORENO, A., DE BLAS C., BIURRUN, R., NEBREDA, M., PALACIOS, I.,
DUQUE M. and FERERES, A., 2004. The İncidence and Distribution of
Viruses İnfecting Lettuce, Cultivated Brassica And Associated Natural
Vegetation in Spain. Ann. Appl. Biol., 144: 339-346
NAMETH, S.T., LAEMMLEN, F.F., DODDS, J.A., 1985. Viruses cause heavy
melon losses in desert valleys. California Agriculture, 39: 28-29.
NAVARRO, J. A., BOTELLA, F., A MARUHENDA, SASTRE, P., SÁNCHEZPİNA, M. A. and PALLAS, V., 2004. Comparative infection progress
analysis of Lettuce big-vein virus and Mirafiori lettuce virus in lettuce crops
by developed molecular diagnosis techniques. Phytopathology, 94: 470-477.
NEMCHİNOV, L.G., HAMMOND, J., JORDAN, R., HAMMOND, R.W. 2004. The
NG, J.C.K., TİAN, T. and FALK, B.F.,2004. Quantitative parameters determining
whitefly (Bemisia tabaci) transmission of Lettuce infectious yellows virus and
an engineered defective RNA Journal of General Virology, 85: 2697–2707
of Beet mosaic virus. Archives of Virology. 149(6): 1201-14.
OHSHİMA, K., YAMAGUCHİ, Y., HİROTA, R., HAMAMOTO, T., TOMİMURA,
K., TAN, Z., SANO, T., AZUHATA, F., WALSH, J.A., FLETCHER. J.,
CHEN, J., GERA, A., GİBBS, A., 2002. Molecular Evolution of Turnip
mosaic virus: Evidence of Host Adaptation, Genetic Recombination and
Geographical Spread. Journal of General Virology 83: 1511-1521.
POLAT, E., SÖNMEZ, S., DEMİR, H. VE KAPLAN, M. 2001. Farklı Organik
Gübre Uygulamalarının Marulda Verim, Kalite ve Bitki Besin Maddeleri
Alımına Etkileri. Türkiye 2. Ekolojik Tarım Sempozyumu, 14-16 Kasım
2001, Antalya, s. 69-77.
PRICE, W.C., 1934. Phytopathology, 24: 743.
PRIETO, H., BRUNA, A., HINRICHSEN, P. and MUNOZ, C., 2001. Isolation and
Molecular Characterization of a Chilean Isolate of Zucchini yellow mosaic
Virus. Plant Disease, 85:644-648.
PROVVİDENTİ, R .,1981.’ Turnip mosaic virus of Plants (edited by A. Brunt, K.
Crabtree, M. Dallwitz, A. Gibbs and L. Watson) pp.1340-1343. University
Press, Cambridge.
121
______, R., 1978. Pl. Dis. Reptr, 62: 482
______, R., 1996. Turnip mosaic potyvirus. In: Brunt, A.A., Crabtree, K., Dallwitz,
M.J., Gibbs, A.J., Watson, L., eds. Viruses of Plants. Wallingford, UK:
CABI, 1340–1343.
RAYBOULD, A.F., MASKELL, L.C., EDWARDS, M-L., COOPER, J.I. and
GRAY, A. J. 1999. The Prevalence and Spatial Distribution of Viruses İn
Natural Populations of Brassica oleracea New Phytol. 141; 265-275
REVERS. F., LOT. H., SOUCHE. S., LE GALL, O., CandRESSE, T., and DUNEZ,
J.1997. Biological And Molecular Variability of Lettuce mosaic virus
İsolates. Phytopathology, 87: 397- 403.
ROGGERO, P., CIUFFO, VAIRA, A.M., ACCOTTO, G.P., MASENGA, V. And
MILNE, R.G., 2000. An Ophiovirus isolated from lettuce with big-vein
symptoms. Archives of Virology 145: 2629-2642.
RUBİO, L., SOONG, J., KAO, J. and FALK B.W. 1999. Geographic Distribution
And
Molecular
Variation
of
Isolates
Of
Three
Whitefly-Borne
Closteroviruses of Cucurbits: Lettuce ınfectious yellows virus, Cucurbit
yellow stunting disorder virus and Beet pseudo-yellows virus The American
Phytopathological Society, 89(8)
RUSSELL, G.E., 1971. CMI/AAB Descr. Pl. Viruses, 53: 3
SANCHES, M.M., KRAUSE-SAKATE, R., PAVAN, M.A., 2008. Dizi Diversity in
The Kılıf Protein Gene of Lettuce big-vein associated virus and Mirafiori
lettuce big-vein virus İnfecting Lettuce İn Brazil. Summa Phytopathologica,
34(2): 175-177
SANCHEZ, F., RODRI´GUEZ-MATEOS, M., TOURİN˜O, A., FRESNO J.,
GO´MEZ-CAMPO, C., JENNER, C. E., WALSH, J. A. and PONZ, F., 2007.
Identification of New İsolates of Turnip mosaic virus That Cluster With Less
Common Viral Strains. Arch. Virol., 152: 1061–1068.
______, F., WANG, X., JENNER, C.E.,. WALSH, J.A, PONZ, A F. 2003 Strains of
Turnip mosaic potyvirus as defined by the molecular analysis of the kılıf
protein gene of the virus. Elsevier Science B.V. All rights reserved.
122
SASAYA, T., ISHIKAWA, K., KUWATA S. and KOGANEZAWA, H., 2005.
Molecular analysis of coat protein coding region of Tobacco stunt virus
shows that it is a strain of Lettuce big-vein virus in the genus Varicosavirus
Archives of Virology, 150 (5): 1013-1021.
SCHNEİDER, F. and MUNDR, K.W., 1956. Z. Naturf., 11: 393.
SCHULTZ, E.S., 1921. J. Agric. Res. 22: 123.
SCHULTZ, J., 1921. J.Agric. Res. 22: 173. Phytopathology, 21: 122.
Sevinç SAYGILI, S., 2005. Beyaz ve Kırmızı Baş Lahana Yetiştiriciliği. Samsun
Valiliği İl Tarım Müdürlüğü, (18)
SHAHRAEEN, N., FARZADFAR, S.H., LESEMANN, D.E., 2003. Incidence of
Viruses İnfecting Winter Oilseed Rape (Brassica napus Ssp. oleifera) in Iran.
Journal Of Phytopathology 151; 614-616.
SHEPHERD A.J., WAKEMAN R.J., ROMANKO R.R., 1968. DNA in Cauliflower
mosaic virus. Virology 36: 150-152.
SZETO, W. W., HAMER, O. H., CARLSON, P. S. and THOMAS, C. A., 1977.
Cloning of Cauliflower mosaic virus (CaMV) DNA in Escherichia coll.
Science 196, 210-214.
SIDEK, Z., TOKUMASU, T. and SAKO, N. 1999. Biological Properties and Kılıf
protein Dizi Comparison of Two Isolates of Zucchini yellow mosaic potyvirus
in Malaysia. Proceedings MARRS Fifth International Conference on Plant
Protection in the Tropics. 415-418p.
SOLEİMANİ P, MOSSAHEBİ GH, KOOHİ-HABİBİ M, ZAD J, HOSSEİNİFARHANGİ S. 2004. Biological And Molecular Characterization of Lettuce
mosaic virus From Tehran Province in Iran. Commun Agric Appl Biol Sci.;
69(4): 519-24.
______, P., MOSSAHEBİ, G.H., KOOHİ-HABİBİ, M., 2011. Identification of Some
Viruses Causing Mosaic on Lettuce and Characterization of Lettuce mosaic
virus From Tehran Province İn Iran African Journal of Agricultural Research
6(13); 3029-3035
123
______, P., MOSSAHEBİ, G.H., KOOHİ-HABİBİ, M., ZAD, J., HOSSEİNİFARHANGİ, S., 2004. Occurrence and distribution of lettuce mosaic disease
in Tehran province from Iran. Commun Agric Appl Biol Sci., 69(4): 513-7.
SPAK, J. and KUBELKOVA, D., 2000. Serological Variability Among European
İsolates of Radish mosaic virus. Plant Pathology 49: 295–301.
SPENCE, N.J., PHİRİ, N.A., HUGHES, S. L. ,WANİKİ,
A.M., SİMONS, S.,
ODUOR, G., CHACHA, D., KURİA, A., NDİRANGU, S., KİBATA, G.N.
and MARRİS, G.C., 2007. Economic İmpact of Turnip mosaic virus,
Cauliflower mosaic virus and Beet mosaic virus in Three Kenyan Vegetables.
Plant Pathology, 56: 317–323
STANGARLIN, O.S., 1997.Variabilidade do vírus do mosaico da alface e
comportamento de cultivares tolerantes de alface (Lactuca sativa L.) (Tese de
Doutorado). Botucatu. Faculdade de Ciências Agronômicas.
STANKOVİC, I., BULAJİC, A., VUČUROVİC, A. and RİSTİC, D., 2011. First
Report of Tomato spotted wilt virus on Gerbera hybrida in Serbia Plant
Disease, 95 (2), 226-226.
STANLEY, W.M.,1935. Science, 81: 644.
STRAUSBAUGH, C.A., WİNTERMANTEL, W.M., GİLLEN, A. M., and
EUJAYL, I. A. 2008. Curly Top Survey in the Western United States.
Phytopathology 98: 1212-1217.
SUEHİRO, N., MATSUDA, K., OKUDA, S., NATSUAKİ, T., 2005.A Simplified
Method For Obtaining Plant Viral RNA for RT-PCR. Journal of Virological
Methods 125: 67-73.
SZETO, W.W., HAMER, D.H., CARLSON, P. S. and THOMAS, C. A. (1977).
Cloning of Cauliflower mosaic virus (CLMV) DNA in Escherichia coli.
Science, 196: 210-212.
TAKESHITA, M. and TAKANAMI Y., 2000. Defective Long-Distance Transport of
Cucumber mosaic virus in Radish is Efficiently Complemented by Turnip
Mosaic Virus’ J. Gen. Plant Pathol., 66: 254-257.
THOMAS, P.E., 1990. Resistance to Beet Western Yellows Virus Among Forage
Brassicas Plant Dis. 74: 327-330.
124
THOMPSON J.D., HİGGİNS D.G., GİBSON T.J., 1994. CLUSTALW: improving
the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence
weighting, positionsspecific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic
Acids Research, 22: 4673-4680.
THOMSON A.D. and PROCTER C.H., 1966. Cucumber mosaic virus in lettuce,
New Zealand Journal of Agricultural Research, 9:1, 142-144
THURSTON, M. I., PALLETT, D. W., CORTINA-BORJA, M., EDWARDS, M.L.,
RAYBOULD, A. F., COOPER, J. I., 2001. The incidence of viruses in wild
Brassica nigra in Dorset (UK) Annals of Applied Biology, 139(3): 277–284
TİMMERMAN, E. L., D'ARCY, C. J. and SPLİTTSTOESSER, W. E. 1985. Beet
western yellows virus İn Illinois Vegetable Crops and Weeds. Plant Disease
69: 933-936.
TOK, S. ve ERKAN, S., 2006. Bursa ve Çanakkale İllerinde Bazı Yörelerde
Yetiştirilen Şeker Pancarı Bitkilerindeki Virüs Hastalıklarının Saptanması.
Ege Üniv. Ziraat Fak. Derg., 43(1): 45-53
TOMLİNSON, J.A., 1982. ‘Lettuce mosaic virus’ Viruses of Plants (edited by A.
Brunt, K. Crabtree, M. Dallwitz, A. Gibbs and L. Watson) pp. 719-721.
TOMLİNSON, L.A., 1970. Lettuce mosaic virus, LMV. CMI/AAB Descriptions of
Plant Viruses, (9)
TOMPKİNS, C.M., 1937. J. Agric. Res., 55: 33.
______, C.M., 1939. A mosaic disease of radish in California. Journal of
Agricultural Research, 58, 119.
TOMPKİNS, J. Agric. Res. 58: 119, 1939.
tr.wikipedia.org/wiki/Ispanak
tr.wikipedia.org/wiki/Ispanak
TUZLALI, H.T. ve KORKMAZ, S., 2011. Çanakkale ilinde karnabahar mozaik
virüsü (Cauliflower mosaic virüs, CAMV)’nün serolojik ve moleküler
yöntemlerle
tanılanması.
Türkiye
Kahramanmaraş, 396.
Türkiye İstatistik Kurumu, TÜİK., 2004.
125
IV.
Bitki
Koruma
Kongresi
Türkiye İstatistik Kurumu, TÜİK., 2005
ULLMAN, D.E., Cho, J.J., MAU, R.F.L., WESTCOT, D.M., and CUSTER, D.M.,
1992. A midgut barrier to Tomato spotted wilt virus acguistion by adult
western flower thrips. Phytopathology, 82: 1333-1342.
UZUNOĞULLARI. N. ve BEŞİRLİ G., 2011.Yedikule Marul (L.S.L.var.
Longifolia) Çeşidinde Zarar Yapan Bazı Viral Etmenlerin Tanılanması.
Türkiye IV. B.K.K. Bildirileri. S:416
WANG, H.Y., Lİ, X.D., LİU, Y.Y., WANG, B. and ZHU, X.P., 2007. First Report
of Beet Mosaic Virus İnfecting Lettuce, İn China. New Disease Reports, 16:
2.
WESTERLUND, F.V., R.N. CAMPBELL, R.G. GROGAN,and J.M. DUNİWAY.
1978B.
Soil
factors
affect-ing
the
reproduction
and
survival
of
Olpid/umbrassicae and its transmission of big-vein agentto lettuce.
Phytopathology. 68: 927-935.
______, F.V., R.N. CAMPBELL, and R.G. GRO-GAN. 1978A. Effect of
temperature on trans-mission, transloeation, and persistence of thelettuce bigvein agent and big-vein symptomexpression. Phytopathology. 68: 921-926.
WİLSON, A.D. and HALLİWELL, R.S., 1985. Characterization and Field Studies
Of A Cucumber mosaic virus İsolate From Spinach in the Winter Garden
Area of Texas. Plant Disease, 69: 751-754.
WOLF, C., SCHERZINGER, M., WURZ, A., PAULI, U., HÜBNER, P. and
LÜTHY, J., Detection of Cauliflower mosaic virus by the polymerase chain
reaction: testing of food components for false-positive 35S-promoter
screening results European Food Research and Technology Vol., 210 (5),
367-372
www.gencziraat.com
www.iontek.com.tr
www.publish.csiro.au/journals/apdn
126
XIANG, H.Y., DONG, S.W., ZHANG, H.Z., WANG, W.L., LI, M.Q., HAN, C.G.,
LI, D.W., YU, J.L., 2010. Molecular characterization of two Chinese isolates
of Beet western yellows virus infecting sugar beet. Virus Genes. Aug.,
41(1):105-10.
YAMAOKA N., MORITA T., FURUSAWA M., YAMAMOTO 1982. Effect of
Temperature on the Multiplication of Cauliflower mosaic virus J. gen. Virol,
61: 283-287.
YARDIMCI, N. and ÇULAL-KILIÇ, H., 2009. Tomato spotted wilt virus in
vegetable growing areas in the west mediterranean region of Turkey. African
Journal of Biotechnology Vol., 8 (18): 4539-4541
YILMAZ, M.A., BALOĞLU, S., ÖZASLAN, M. ve GÜLDÜR, M.E., 1995. GAP
Bölgesinde Kültür Bitkilerinde Belirlenen Virüsler. GAP Bitki Koruma
Sorunları ve Çözüm Önerileri Sempozyumu, 27-29 Nisan, Şanlıurfa, 241250.
YUDİN L.S., TABASHNİK, B.E., CHO, J. AND MİTCHELL, W.C., 1990. Disease
prediction and economic models for managing Tomato spotted wilt virus
disease in lettuce. Plant Disease 74, 211-216.
127
128
ÖZGEÇMİŞ
1980 yılında Adıyaman’ın Gölbaşı ilçesinde doğdu. İlk, orta ve lise
öğrenimini Adana’nın Ceyhan ilçesinde tamamladı. 2004 yılında Çukurova
Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü’nden ziraat mühendisi olarak
mezun oldu. Aynı yıl Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma
Anabilim dalına kaydoldu. 2004-2006 yılları arasında Çukurova Üniversitesi Ziraat
Fakültesi Bitki Koruma Bölümü’nde Fitopatoloji Anabilim Dalında Yüksek
Lisans’ını tamamladı. 2006 yılında başlayan doktora tez öğrenimini, yapmış olduğu
bu tez çalışmasının sona ermesi ile tamamlamış bulunmaktadır.
129
EKLER
130
131
Ek 1
ELISA Testinde Kullanılan Tampon Çözeltiler
1. Fosfat tampon çözeltisi (Phosphate Buffered Saline, PBS) pH 7.4
8.0 gr
NaCl
0.2 gr
KH2PO4
2.9 gr
Na2HPO4.12H2O veya
2.3 gr Na2HPO4.7H2O
1.44. gr Na2HPO4. 2H2O
1.15 gr Na2HPO4 (anhdrous)
0.2 gr KCl
0.2 gr NaN3
Yukarıda miktarları verilen kimyasallar 1 litre saf suda eritilip pH’sı 0.1 N
NaOH veya 0.1 N HCl ile ayarlanmış ve 4 0C’de saklanmıştır.
2. Kaplama tampon çözeltisi (Coating buffer) pH 9.6
1.59 gr Na2CO3
2.93 gr NaHCO3
0.2 gr NaN3
Yukarıda miktarı verilen kimyasallar 1 litre saf suda eritilip pH’sı ayarlanmış
0
ve 4 C’de saklanmıştır.
3. Yıkama tampon çözeltisi (Washing Buffer)
Bir litre PBS tamponu 0.5 ml Tween-20 ilave edilerek hazırlanmıştır.
4. Örnek tampon çözeltisi (Sample Extraction Buffer)
Bir litre yıkama tamponu çözeltisi içine 20 gr Polyvinylpyrolidone (PVP-40)
ilave edilerek hazırlanmıştır
5. Konjugat tampon çözeltisi (Enzyme Conjugate Buffer)
Bir litre örnek tampon çözeltisine 2 gr ovalbumin (egg albumin) ilave
edilerek hazırlanmıştır.
6. Substrat tampon çözeltisi (Substrat Buffer) pH 9.8 ()
97 ml Diethanolamine 800 ml saf su içine ilave edildikten sonra 0.2 gr NaN3
konmuş ve HCl ile pH 9.8’e ayarlanarak 1 litreye tamamlanmıştır.
132
Ek 2
Toplam Nükleik Asit Ekstraksiyonunda Kullanılan Solüsyonlar
1. Ezme Tampon Çözeltisi (Ekstraksiyon buffer) (100mM Tris-HCI
pH.8.0, 50mM EDTA pH. 7.0, 500 NaCI, 10mM 2. mercapto-ethanol (1/1000))
Tris-HCI
2.4228 gr
EDTA
3.7224 gr
NaCI
5.844 gr
Yukardaki miktarlar 150 ml distile su içerisinde sırasıyla çözülmüş pH
ayarlamasıyapılmış ve toplam hacim 200 ml’ye tamamlamıştır. Daha sonra 1/1000
oranında 2-Mercaptoethanol ilave edilmiştir.
2. Sodyum dodesul sülfat (% 20) (Sodium Dodecyl Sülfate, SDS)
20 gr sodium dodecyl sülfate 80 ml distile su içerisinde çözülmüş
ve hacim 100 ml’ye tamamlanmıştır.
3. Potasyum Asetat (Potasium asetate CH3COOK) (5M)
49.075 gr potasium asetate 60 ml su içerisinde çözülmüş ve hacim 100 ml’ye
tamamlanmıştır.
4. Sodyum asetat (Sodium asetate CH3COONa) (3M)
40.824 gr sodium asetate 60 ml su içerisinde çözülmüş ve hacim 100 ml’ye
tamamlanmıştır.
5. Etanol (% 70’lik) (Ethanol)
70 ml %99’ luk ethanol ile 29 ml su karıştırılarak % 70’lik ethanol
hazırlanmıştır.
133
Ek 3
Moleküler Çalışmalarda Kullanılan Tampon Çözeltiler
1. TBE buffer ( 89 mM Tris, 89 mM borik asit, 2 mM EDTA) (pH: 8,3)
1X TBE buffer hazırlamak için 10.777 gr Tris-Base, 5.502 gr boric asit ve
0.744 gr EDTA 900 ml saf su içerisinde eritilmiştir. Çözeltinin pH’sı 8,3 olarak
ayarlandıktan sonra son hacim 1000 ml’ye tamamlanmıştır.
2. TAE buffer (10mM Tris, 5mM Sodium acetate, 0,5 mM EDTA (pH: 8.3)
1X TAE buffer hazırlamak için 1.211 gr Tris-Base, 0.680 gr sodyum asetat
ve 0.186 gr EDTA 900 ml saf su içerisinde eritilmiştir. Çözeltinin pH’sı 8,3 olarak
ayarlandıktan sonra son hacim 1000 ml’ye tamamlanmıştır.
3. Farklı konsatrasyonlarda agaroz jel hazırlamak için;
% 1,2’lik agaroz jel için 360 mg agaroz 30 ml 1x TBE yada TAE içerisinde
% 2’lik agaroz jel için 600 mg agaroz 30 ml 1x TBE yada TAE içerisinde
% 1,5’lik agaroz jel için 450mg agaroz 30 ml 1x TBE yada TAE içerisinde
eritilmiştir.
4. Etidyum bromid
10 mg etidyum bromid 1 ml saf su içerisinde ependorf tüpünde eritilmiştir.
Daha sonra bu ana stoktan 30 µl alınarak 100 ml saf su içerisine ilave edilmiştir.
134

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ

Transcription

Similar documents

Türkiye Beslenme ve Sağlık Araştırması 2010

indir - Bornova Veteriner Kontrol Enstitüsü

Die BUCHSTAVIER - Das Dosierte Leben

ankara üniversitesi fen bilimleri enstitüsü yüksek lisans tezi akut

ÇUKUROVA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ