“Impacto da topografia de implantes de titânio sobre a extensão do

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO - PERIODONTIA
Carlos Eduardo Datte
“Impacto da topografia de implantes de titânio
sobre a extensão do coágulo sanguíneo”
Guarulhos
2009
ii
CARLOS EDUARDO DATTE
“Impacto da topografia de implantes de titânio
sobre a extensão do coágulo sanguíneo”
Tese apresentada à Universidade Guarulhos para a defesa de
dissertação e obtenção do título de Mestre em Odontologia,
Área de concentração em Periodontia.
Orientadora: Profa. Dra. Claudia Ota Tsuzuki
Co-Orientadordor: Prof. Dr. Jamil Awad Shibli
Guarulhos
2009
iii
“Nada é impossível para aquele que persiste”
(Alexandre, O Grande)
iv
“A alegria está na luta, na tentativa, no sofrimento envolvido e
não na vitória propriamente dita.”
(Mahatma Gandhi)
v
“A verdadeira medida de um homem não é como ele se comporta em momentos de
conforto e conveniência, mas como ele se mantêm em tempos de controvérsia e desafio.”
(Martin Luther King)
vi
DEDICATÓRIA
Dedico esse momento especial inteiramente aos meus pais, Antonio Carlos e
Norma Torres (in memorian), meus grandes orientadores da vida. À minha esposa
Fabiana e aos meus filhos: Lucas e Murillo que não mediram esforços para que
essa conquista se tornasse possível e que foram os incentivadores diretos na
minha luta, onde fiquei muitas vezes ausente e não podendo compartilhar seus
crescimentos.
vii
AGRADECIMENTOS
Tenho a certeza que, a respeito de todo o meu empenho e dedicação, e
os resultados e o aprendizado que obtive com a produção deste trabalho jamais
seriam possíveis sem o incentivo e solidariedade que recebi de diversas pessoas e
em diferentes momentos. Não daria, neste curto espaço, para citar todas e as
circunstâncias em que todas colaboraram, mas é imprescindível citar algumas.
Antes e acima de qualquer pessoa agradeço à Deus por tantas
oportunidades e caminho, e pela coragem para acreditar e seguir Sua Vontade.
Aos meus pais, Antonio Carlos Datte, pelo motivo maior de seguir
também a carreira acadêmica e pelo grande incentivo e apoio; pela minha mãe
Norma Torres Datte (in memorian) pela educação e amor, e a coragem de vencer
todas as barreiras (que esteve presente em sua vida). Ambos ensinaram-me,
principalmente, a importância da construção e coerência dos meus próprios valores
ensinado-me a necessidade de ter paciência e persistência para atingir meus
objetivos.
Ao meu irmão, Alessandro, que mesmo distante sempre torce pelas
minhas vitórias.
A minha querida sogra Tereza pelo carinho que sempre recebi.
A minha amada esposa Fabiana, pela compreensão, que mesmo por
momentos difíceis esteve sempre me apoiando e encorajando para não desistir.
Aos filhos Lucas e Murillo pelo amor e carinho que os tenho, que me fez
lutar sempre nas maiores adversidades.
À UnG, a ilustríssima professora Dra. Magda Feres, que conduz estes
estudos com ética, competência, transparência e humildade, agradeço pela
oportunidade.
À inha orientadora neste trabalho, a ilustríssima professora Dra. Claudia
Ota Tsuzuki, por me ensinar a encarar os desafios, acreditar em minha capacidade,
passando-me ensinamentos que extrapolam o universo acadêmico.
Ao meu co-orientador professor Dr. Jamil Awad Shibli exemplo de
profissionalismo e caráter, amizade e de sinceridade.
viii
Aos demais professores de periodontia e dentística, que me ensinaram
com prazer e dedicação Aos amigos de turma : Eduardo e o Marcelinho, Juliana,
Kelly, Vanessa, Geisla, Josefa, Marcelão, e Joyce.
Meu sincero muito obrigado.
ix
“Os pingos da chuva fazem um buraco na pedra não pela violência, mas por
cair com freqüência”
(Lucretius)
x
RESUMO
O padrão perfilométrico das rugosidades, obtidas pelos diferentes tipos de
tratamento da superfície de titânio, pode também fornecer uma melhor condição
para estabilização do coágulo, facilitando a cicatrização óssea sobre a superfície do
implante. O objetivo deste estudo foi avaliar a area de adesão dos elementos
sanguíneos sobre 3 tipos de superfície de titânio: superfície A: lisa e sem
tratamento (n=10), superfície B: jateada com partículas de óxido de alumínio
(100µm) e lavadas em solução de ácido nítrico (n=10) e superfície C: jateada com
partículas de óxido de titânio (50µm à 100µm) e lavadas em solução de ácido
maleico (n=10). As superfícies foram caracterizadas utilizando microscopia de força
atômica (MFA) e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Para o experimento,
10 ml de tecido sanguíneo obtido através de punção com auxílio de seringa e
agulha descartável da vascularização periférica de um paciente jovem, não fumante
foram depositados sobre todas as amostras que, após processamento laboratorial,
foram submetidas à MFA e MEV. A análise de imagem obtida por MFA mostrou
topografias diferentes nos três grupos analisados: Grupo A exibe irregularidades
correspondentes aos sulcos de usinagem da peça somente enquanto a topografia
do Grupo B exibe picos mais altos (6,4 µm e Ra:0,945ηm) e vales mais extensos
que os demais grupos. Já o Grupo C apresenta picos intermediários com altura
intermediária (3,4µm e Ra:0,593ηm). Foi observada uma extensão estatisticamente
maior na superfície do Grupo B (mean=71,53%) em relação aos demais grupos,
enquanto que entre os Grupo A (mean=26,17%) e C (mean=22,67%) foram
estatisticamente semelhantes (p>0,05). Com base nos dados obtidos, conclui-se
que a superfície do Grupo B permitiu a formação uma maior extensão de coágulo
que os demais grupos analisados.
Palavras-Chaves: Implantes osseointegráveis, topografia de implantes, extensão
do coágulo sanguíneo.
xi
ABSTRACT
The topography profile produced by different types of titanium surface
treatments might improve the conditions for a better clot stabilization what could, as
consequence, facilitate the bone healing. The aim of this study was to evaluate the
blood clot extension on 3 types of titanium implant surfaces: Surface A: smooth and
without any treatment (n=10), surface B: blasted with 100µm aluminum oxide and
washed with nitric acid (n=10) and surface C: blasted with 50µm-100µm oxide
titanium and washed with maleic acid. The surface characterization was performed
using scanning atomic force microscopy (AFM) and scanning electron microscopy
(SEM). For the experiment, 10ml of peripheral venous blood from a young no
smoker patient, were dropped on each specimen surfaces which, after laboratorial
processing, were analyzed by SEM and backscattering electrons microscopy. AFM
images revealed three different surfaces profiles: Group A: exhibited irregularities
corresponding to grooves of machine only; Group B: exhibited higher peaks and
wider valleys (6.4 µm e Ra:0.945ηm); Group C: exhibited intermediate peaks (3,4µm
e Ra:0.593ηm). The results presented a statistically wider of clot extension adhered
to the surface of Group B (X= 71,53%) when compared to the other two groups,
while between Group A (X=26,17%) and Group C (X=22,67%) it was not observed
differences statistically significant (Kruskall Wallis Test, p>0.05). Within the data
evaluated, the Group B surface allowed a wider blood clot formation than the other
2 surfaces analyzed.
key words: implants, osseointegration, surface topography, blood clot adhesion.
xii
SUMÁRIO
Página
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................. 13
2. PROPOSIÇÃO.................................................................................................. 23
3. REFERÊNCIAS ................................................................................................ 24
4. ANEXO – ARTIGO A SER SUBMETIDO À
JOURNAL OF ORAL IMPLANTOLOGY ........................................... 28
TITLE ......................................................................................................... 29
ABSTRACT ................................................................................................ 30
INTRODUCTION........................................................................................ 31
MATERIAL E METHODS ........................................................................... 33
IMPLANT SURFACE ............................................................................ 33
TREATMENTS OF TITANIUM SURFACES ................................ 33
TOPOGRAPHY ANALYSIS........................................................ 33
QUANTITATIVE EVALUATION OF FIBRIN CLOT
EXTENSION ............................................................................... 33
IMAGE ANALYSIS ...................................................................... 33
STATISTICAL ANALYSIS ........................................................... 34
RESULTS................................................................................................... 35
DISCUSSION ............................................................................................. 36
CONCLUSION ........................................................................................... 38
xiii
ACKNOWLEDGEMENTS........................................................................... 39
REFERENCES........................................................................................... 39
TABLES AND FIGURES ............................................................................ 42
13
1 INTRODUÇÃO
O primeiro tecido a entrar em contato com o implante é o sangue, cujo
volume a envolver o mesmo varia em função da geometria da peça e do loja
cirúrgica. O coágulo sofrerá uma série de alterações biológicas que resultarão na
formação de tecido ósseo ao redor do implante. A superfície deste entrará em
contato com percentagens variáveis de osso cortical, osso trabecular e medula
óssea; algumas áreas estarão comprimindo o tecido ósseo, enquanto outras
estarão em contato com sangue e uma variedade de outras células (Masuda et al.,
1997).
O processo de coagulação sanguínea sobre a superfície do implante
inicia-se com a formação de uma fina camada de fibrina (D’Hoedt 1985; Meyer et
al., 1988; Wen, Wang e Zhang, 1996; Davies 1998; Zechner et al., 2003). A seguir,
ocorre uma série coordenada de eventos biológicos, provavelmente influenciada
pelas propriedades das superfícies de implantes osseointegrados, desde a
adsorção de proteínas e proliferação celular até, por fim, a deposição de tecido
ósseo. Cumpre salientar ainda que o padrão perfilométrico das rugosidades
obtidas pelos diferentes tipos de tratamento da superfície do titânio pode também
fornecer uma melhor condição para estabilização do coágulo, facilitando a
cicatrização óssea sobre a superfície do implante (Shibli et al., 2003).
O titânio é um metal leve, assim como o alumínio e o magnésio,
bastante reativo e quando em contato com parte por milhão (ppm) de O2 ou água,
pode formar os óxidos de titânio: monóxido de titânio (TiO), trióxido de titânio
(Ti2O3) ou o mais comum deles: dióxido de titânio (TiO2). O TiO2 pode apresentar
diferentes estruturas cristalográficas, tais como: rutilo (tetragonal de hábito
14
prismático) e anatásio (tetragonal de hábito octaédrico), podendo também ser
amorfo (disforme).
A primeira aplicação do titânio foi no início da década de 50, na
indústria aeroespacial. Para essa aplicação, a alta resistência mecânica e baixa
densidade (55% da densidade do aço) foi um fator atraente. Embora a indústria
aeronáutica ainda continue a utilizar titânio e suas ligas, a excelente resistência à
corrosão em diversos meios, incluindo os meios oxidantes ricos em cloretos têm
motivado a sua aplicação em outras áreas como: a medicina e odontologia, nestes
casos para a confecção de próteses e implantes endósseos osteointegrados.
A resistência à corrosão, característica do titânio, é baseada na
formação superficial de um filme de óxido aderente e estável que protege o interior
do material do meio circunvizinho (DAVIS, 1990). Esta camada de óxido aderente
confere ao titânio uma alta constante dielétrica quando comparada à de outros
óxidos. Segundo Kasemo e Lausmaa (1988) esta alta constante dielétrica do TiO2,
proporciona à este material a propriedade de biocompatibilidade, já que as
interações entre os óxidos e as biomoléculas são elétricas e o TiO é catalítico
para diversas reações orgânicas e inorgânicas.
As
qualidades
biológicas
do
implante
dental
dependem
das
propriedades químicas, físicas, mecânicas e topográficas da superfície - essas
diferentes propriedades interagem entre si, influenciando a atividade celular ao
redor da superfície de implante (Matsuo et al., 1999; Protivinsky et al., 2007;
Schweikl et al., 2007).
O titânio é considerado como um material bioinerte, isto é, não induz
resposta imunológica. Contudo, vários autores (Kim et al., 1996; Kitsugi et al.,
15
1996) têm demonstrado que modificações de superfície alteram a bioatividade do
titânio.
Assim, várias pesquisas têm investigado diferentes superfícies de
implante, obtidas por meio de técnicas de adição (recobertas com plasma de
titânio, hidroxiapatita, etc.) ou subtração (jateamento com diferentes tipos de
materiais como óxido de titânio ou alumínio, tratadas com ácidos, e preparadas
com laser) (Wong et al., 1995; Kim et al., 2003) quanto às propriedade de
biocompatibilidade .
Os três principais métodos de modificação das superfícies dos
implantes são, de acordo com Kawahara e Takano (1995):
•
Tratamento mecânico por jateamento ou usinagem: os implantes sem
recobrimento são submetidos a tratamentos mecânicos que visam
aumentar a superfície de contato para a aposição mecânica do tecido
ósseo à superfície do implante. Geralmente tal objetivo é alcançado
através da criação de detalhes usinados na superfície dos implantes ou
através do aumento da rugosidade das superfícies. Os detalhes usinados
podem ser desde superfícies rosqueadas até a criação de furos ou
reentrâncias para que o osso cresça por entre esses entalhes. O aumento
da rugosidade das superfícies é feito geralmente com o jateamento com
partículas duras de óxido,como: Al2O3, SiO2 e TiO2. Após o jateamento, é
recomendado
um
tratamento
com
ácido
para
retirar
possíveis
incrustações de partículas de óxido e também para uniformizar a
rugosidade criada pelo processo de jateamento.
16
•
Aplicação de recobrimentos por diferentes métodos. As superficies
recobertas são geralmente obtidas com a utilização de material bioativo,
principalmente hidroxiapatita. Nesses substratos, a precipitação de
fosfatos de cálcio ocorre por adsorção de íons fosfato hidratados que
liberam prótons dos íons fosfato e adsorvem o cálcio. O TiO2 não pode se
recompor em meio anidro, causando a corrosão do metal. Este processo
também tem como objetivo a prevenção da liberação de íons, o
eliminação das contaminações das superfícies causadas pelos processos
de fabricação e a produção de uma supefície rugosa e porosa.
•
Tratamentos químicos com ácidos, anodização ou implantação iônica:
os objetivos principais deste tratamento são limpeza da superfície, criação
de rugosidade e ativação da superfície através da alteração estrutural da
camada de óxido. Os principais tratamentos químicos são:
o
Ataque ácido: os ácidos mais utilizados são HF e HNO3. Após o
ataque ácido, é feita imersão em solução HF + H2O2. A função principal
do H2O2 é a formação de uma camada estável de óxido, após a
exposição do metal ao ácido. Também são aplicados para a limpeza
de superfície.
o
Anodização: esse tratamento é feito através da utilização de um
anodo de titânio e um catodo de platina, prata, aço inoxidável, etc. É
feita a reação eletroquímica em um meio eletrolítico e obtêm-se
superfícies com diferentes colorações. Em estudo recente, Ishizawa et
al. (1995) utilizaram uma solução de acetato de cálcio e β-fosfato de
glicerol. Após um tratamento hidrotérmico, em atmosfera de vapor sob
alta
pressão, foi formada uma
camada
de
hidroxiapatita de
17
aproximadamente 1µm de espessura. Observou-se que essa camada é
bastante efetiva na promoção da osteocondutividade, principalmente
em implantes rugosos.
Estudos têm mostrado que a topografia da superfície do implante pode
afetar não somente a expressão gênica do osteoblasto, mas também o processo
de diferenciação das células em osteoblastos (Zechner et al., 2003; Schneirder et
al., 2004; Larsson et al., 1996). Estes autores sugerem ainda que a interação das
células com os componentes da matriz extracelular e a organização do
citoesqueleto associada à topografia do implante podem influenciar a expressão
genética celular, e conseqüentemente, aumentar a formação de uma matriz óssea
em íntimo contacto com a superfície do implante.
As características das superfícies determinarão quais moléculas irão
adsorver, ao passo que a natureza e orientação dessas biomoléculas terão
conseqüências diretas no recrutamento, ancoragem, proliferação e diferenciação
das células. A ancoragem das células requerem a presença de proteínas de
ligação específicas, enquanto a proliferação e diferenciação requerem que fatores
de crescimento e citocinas estejam presentes (Boyan et al., 1996).
A modificação ou texturização da superfície de implante pode facilitar a
cicatrização ao aumentar a porcentagem da superfície de contato osso-implante
em áreas de tecido ósseo pobre (Quirynen et al., 1991; Jaffin e Berman., 1991;
Friberg et al.,1991). Estudos clínicos (Lekholm, 1999; Rocci et al., 2003) e
histológicos (Ivanoff et al., 2001, Trisi et al., 2003) mostram que superfícies
tratadas ou texturizadas, podem receber carga mastigatória em um intervalo de
tempo menor do que o preconizado anteriormente por Adell et al. (1981) e
Albrektsson et al. (1981)
18
Alguns autores sugerem que a rugosidade aumentada poderia
influenciar as células ósseas que migram e proliferam da loja cirúrgica do implante
durante a inserção, resultando melhores taxas de contato osso-implante, devido
ao aumento da área de contato da superfície do mesmo (Kim et al., 2003;
Wennerberg et al., 1995; Wong et al., 1995; Matsuo et al., 1999; Cochran et al.,
1998; Placko et al., 2000). Complementarmente, essa rugosidade de superfície
fornece uma configuração que melhora a retenção do coágulo sangüíneo,
estimula e facilita o processo de ósseointegração e conseqüentemente permite
que estes implantes dentais osseointegráveis possam ser submetidos à carga
protética após um tempo de reparo menor (Trisi et al., 2003, Lazarra et al. 1998,
Lazarra et al., 1999).
Zhu et al., em 2004, mostraram em seu estudo que a inserção celular e
a proliferação destas células, não dependem somente da relação rugosidade e da
morfologia das superfícies dos implantes, mas também é altamente influenciada
pela composição química nestas superfícies. Foi observado por Protivinsky et al
(2007) que superfícies igualmente rugosas, mas que receberam diferentes
tratamentos: Ti-AE (ataque/ácido - altamente hidrofóbico) e Ti-AAE (ataque
alcalino/ OH – altamente hidrofílico), mostraram diferentes desempenhos quanto
inserção celular, sendo esta maior nas superfícies Ti-AAE, quando comparadas
com as superfícies Ti-AE.
Grassi et al. (2007) compararam duas superfícies morfologicamente
distintas (topografia): 1) lisa e 2) jateadas com TiO2 e com ataque/ácido. Eles
usaram micro-implantes com 2,5mm de diâmetro e 6,0mm de comprimento, este
estudo in vivo em 14 pacientes (oito mulheres e seis homens) edêntulos e os
resultados histológicos mostraram que nas superfícies tratadas ocorria uma
19
neoformação óssea e uma possível osteogênese em contato direto. Os autores
sugerem por este motivo que os implantes superfície rugosa podem aumentar o
processo de osteointegração.
Um estudo prévio de Abron et al. (2001) que avaliou as superfícies, em
tíbia de ratos, mostrou que as superfícies modificadas possuíam uma relação de
contato osso/implante aumentada. Além disso, foi demonstrado em estudos in
vitro e in vivo, que as superfícies dos implantes podem modular expressões
fenotípicas e metabólicas das células osteoblásticas, expressões estas que são
reguladas por diversos fatores, tais como: os hormônios e fatores de crescimento.
Prostiglione et al. (2003) mostraram que a diferenciação celular SaOS-2 é
regulada pelo fator côlono-estimulantes de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), os
resultados mostraram a existência de uma correlação inversa entre proliferação e
diferenciação celular e que as SaOS-2 agem melhor nas superfícies lisas,
enquanto que em superfícies rugosas promovem diferenciação em relação aos
fenótipos osteoblásticos. Assim, os autores demonstraram que a topografia e a
composição das superfícies dos implantes de titânio influenciam os resultados
clínicos.
Di Iorio et al. (2005) avaliaram in vitro a extensão do coágulo de fibrina
em diferentes superfícies de implantes. Neste estudo foram avaliados 3 tipos de
superfície: (1) superfície lisa; (2) DPS (deep profile structure), jateamento com
óxido de alumínio, seguido pelo procedimento ataque/ácido e (3) Plus, jateamento
com óxido de alumínio, mas com ataque ácido em alta temperatura com processo
controlado por computador. Os autores concluíram que quanto maior a microtextura da superfície maior extensão do coágulo de fibrina formado.
20
Sabe-se que o primeiro tecido a ter contato com o implante endosseo é
o tecido sangüíneo, o coágulo sangüíneo a ser formado ao redor do implante após
a sua introdução na loja cirúrgica (Davies, 1996; Park e Davies, 2000, 2001).
Observações experimentais da interface tecido ósseo-Ti mostram um contato
íntimo osso-implante.
A coagulação é o primeiro passo na cicatrização do tecido ósseo, sendo
o fibrinogênio, o precussor sangüíneo solúvel do coágulo (Smith et al., 2000). A
fibrina é formada no ato da injúria promovendo uma matriz temporária para
suportar a resposta celular endotelial (Kawase et al.,2003). Então o plasma em
contato com a superfície do implante, inicia a cascata de coagulação, que se inicia
com a formação da rede de fibrina e a ativação do sistema complemento.
Segundo Park et al.(2001), através deste coágulo inserido na superfície
do implante, células do tecido conjuntivo migram, promovem modificações por
meio de mecanismos de trocas de íons e proteínas, assim como atividades
celulares sanguíneas, componentes celulares e humoral do sangue (plaquetas e
fibrinogênio), que interagem com o implante após células osteogênicas invadirem
o local da ferida cirúrgica. Os autores ainda salientam que estas células
osteogênicas interagem quando existe um modificador sangüíneo presente na
superfície do implante como o óxido de titânio. Link et al. (1998) observaram uma
maior diferenciação de células osteoblásticas em implantes com superfícies
rugosas quando comparadas às superfícies lisas.
Na interface medula óssea/superfície do implante, a resolução do
coágulo sanguíneo e a infiltração de glóbulos brancos serão seguidas pela
invasão do sítio cirúrgico, através de uma rede tridimensional de fibrina e colágeno
do tipo III (matriz tridimensional), de células endoósseas de fenótipo osteogênico e
21
células mesenquimais indiferenciadas com capacidade para se diferenciarem em
células osteogênicas, o que será concomitante com à formação da nova
vascularização (Davies, 1996). Essas células são pluripotentes e podem
diferencia-se em osteoblastos, condroblastos, células musculares ou células de
gordura. A via de diferenciação dependerá de fatores sistêmicos e locais
(Redeppening, 1996).
As células interagem com o meio através de proteínas específicas de
adesão. As células mesenquimais tendem a usar fibronectina para ancorá-las ao
colágeno de sua matriz extracelular. A fibronectina é sintetizada pelas células de
origem mesenquimal e está presente no soro do local do trauma cirúrgico. A
energia de superfície do material pode selecionar o tipo de proteína que será
aderida, mas o potencial para a proteína sofrer um rearranjo estrutural também é
uma variável importante. À medida que a orientação da ligação dos íons, minerais,
água, proteínas e outras moléculas sofrem alterações, por conseqüência ocorre
uma mudança na ancoragem de células à superfície via adesão de moléculas
celulares, resultando em uma mudança na morfologia e, finalmente, no
comportamento das células (Redeppening, 1996). A arquitetura cortical vascular
será destruída pelo trauma cirúrgico independentemente da geometria do
implante. No córtex, ocorrerá a princípio a necrose do tecido ósseo. Somente
através de remodelamento ósseo ocorrerá posteriormente uma substituição do
osso peri-implante com a possibilidade de formação de novo tecido ósseo na
superfície do implante (Davies, 1996).
O mecanismo da coagulação ocorre em 3 etapas: (1) em resposta ao
trauma ocorre uma cascata de reações químicas no sangue envolvendo os 12
fatores de coagulação sanguínea que resulta em uma formação de complexos de
22
substâncias ativadas, chamadas de ativadores de protrombina. (2) O ativador de
protrombina catalisa a conversão de protrombina em trombina. (3) A trombina age
como uma enzima que converte o fibrinogênio em fibras de fibrina, e estas envolve
as plaquetas, os glóbulos sanguíneos e o plasma para formar o coágulo.
Portanto, as interações sangue/implante, podem influenciar a formação
do coágulo, a migração, diferenciação das células osteogênicas, envolvidas no
processo de cicatrização. Visto que a migração é um sinal de osteocondução,
tanto na formação de fibrina como ativação de células sangüíneas na cascata da
cicatrização osso/implante (Davies, 1998).
Haja vista a importância da formação do coágulo sanguíneo para o
processo de cicatrização óssea ao redor do implante e, sendo esta iniciada com a
formação da rede de fibrina, outros estudos analisando a influência da topografia
da superfície do implante sobre a adesão de elementos sanguíneos se fazem
necessários.
23
2 PROPOSIÇÃO
O objetivo do presente estudo foi avaliar in vitro a influência do padrão
perfilométrico das superfícies de titânio sobre a extensão (área) do coágulo
sanguíneo formado sobre estas superfícies.
24
3 Referências Bibliográficas
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28
4 ANEXO
Artigo a ser submetido à Revista:
Journal of Oral Implants
29
Influence of titanium surface treatments on the blood clot extension formed
Claudia Ota-Tsuzuki, DDS, PhD∗; Carlos Eduardo Datte, DDS, MSc*; Kedma
Amorim Nomura, Dentistry Undergraduate Student§; Luciana A. Gouvea Cardoso,
DDS*; Jamil Awad Shibli DDS, PhD*
Corresponding author:
Claudia Ota-Tsuzuki (PhD)
Centro de Pós-Graduação e Pesquisa
Praça Tereza Cristina, 229
07023-070 – Guarulhos, SP - Brazil
e-mail: ctsuzuki@prof.ung.br or clauotat@gmail.com
Department of Periodontology, Dental Research Division, Guarulhos University, Guarulhos, SP,
Brazil.
§
Faculty of Dentistry, Guarulhos University, Guarulhos, SP, Brazil.
∗
30
Abstract
The aim of this in vitro study was to evaluate the influence of three different implant
surface treatments (M, TG1 and TG2) on the extension of human blood clot
extension formed. For this purpose, the three types of surfaces obtained were
evaluated regarding topography and blood clot extensions formed. Data suggest
that different treatments applied on implant surfaces might confer different
mechanical and chemical properties, and that TG1 exhibited the widest blood clot
extension (p<0,001).
Key-Words: Implant, topography, surface treatment, blood clot extension.
31
Introduction
Peri-implant healing begins immediately after implant insertion by initial blood clot
formation in the peri-implant gaps and the development of a layer of fibrins.1-4 The
contact of blood with the implant surface triggers a cascade of outcomes, which
begin with the adsorption of plasma or serum proteins and continues through to the
recruitment and activation of cells.
The cellular elements, such as polymorphonuclear granulocytes, take place about
10 minutes later of blood contact.5 Contact with the blood itself not only stimulates
healing by platelet activation, but also provides a transitory biological matrix
through which osteogenic cells can migrate to the implant surface topography.6
This transitory matrix may harbor connective tissue cells that initiate wound
contraction around the fifth day.7 The proliferation and differentiation of bone cells
have been reported to be enhanced by the roughness of implant surface
topography. In addition, a series of coordinated events, including protein
adsorption, proliferation, and deposition of bone tissue, are probably affected by
the different topography surfaces.
Different implant surface topographies may influence not only the adhesion of
proteins and cells but also the cellular metabolism, such as cell differentiation,
proliferation and extra cellular matrix formation. The chemical and physical
characteristics of implant surface topography, roughness, energy and chemistry
are also responsible for adjusting the cell growth and function.
Several studies have demonstrated higher removal torque values and percentage
of bone-to-implant contact (BIC%) for micrometer scale surface roughness of
dental implants when compared with as-machined surfaces8. The main issue of
these studies triggered the search of “ideal” implant surface characteristics.
32
Several implant surface preparations have been developed, such as grit blasting,
titanium plasma spraying, acid-etching, anodic oxidation, laser preparation or
combinations of these. The dental implant quality depends on the chemical,
physical, mechanical, and topographic properties of the surface. These different
properties interact among them and determine the activity of the cells close to the
dental implant surface.
The sandblasted acid-etched implant surface topography is obtained by treating
the commercially pure titanium implant with a spray of air and abrasive materials
(aluminum oxide- Al2O3 or titanium oxide-TiO2) for a certain period of time and
under controlled pressure. After that, this modified surface is attacked with acid
solutions at different temperatures and for periods of time in order to remove any
residue and to condition the blasted surface.
Thus the ability of the implant surface to retain the fibrin net plays an important role
in the osseointegration process. Therefore, the aim of this in vitro study was to
evaluate the influence of different surface treatments on human blood clot
extension.
33
Material and Methods
Implant surface topographies
In this study, 30 titanium discs measuring 5.0mm in diameter and 3.0mm long
made of grade-4 titanium were obtained using 3 different treatments: as-machine
(Control Group – M); Test Group 1 (TG1): titanium discs blasted with aluminum
oxide (Al2O3) particles (100µm) and washed with nitric acid (HNO3) solution; Test
Group 2 (TG2) titanium discs blasted with titanium oxide (TiO2) particles (50µm 100µm) and washed with maleic acid (HO2CCH2CHOHCO2H).
Atomic force microscopy (PicoSPM I plus 2100 PicoScan Controller (AFM) was
used for the surface topography analysis, in contact mode. The AFM scanned
areas of 60µm X 60µm of each specimen. Imaging and roughness analysis were
performed before addition of the human blood.
The measured parameters, such as the arithmetic average of all profile point
absolute values (Ra), the root-mean-square of all point values (Rq), and the
average absolute height values of the five highest peaks and the depths of the five
deepest valleys (Rz) were measured for each group.
Evaluation of fibrin clot extension
The specimens were identified in a blind manner and each specimen was
positioned on the bottom of a well in a 24-well cell culture plate. Whole venous
blood (10.0 ml) from a healthy, non-smoker, female volunteer was collected with
the use of a syringe and 50 µL were immediately dropped onto the flat surface of
the specimens. Since no type of anticoagulant was used, the first drop from the
syringe was discarded. The plate was kept in a humidifying chamber for 20
34
minutes at room temperature3 and after that, the specimens were washed with
phosphate buffered saline (PBS) three times for five minutes. Then the specimens
were fixed in 1% formaldehyde phosphate buffered saline for fifteen minutes, and
after 3 washes of 5 minutes in PBS, were incubated for 10 minutes in PBS
containing 0.02M glycine followed by three washes in PBS. The specimens were
dehydrated by immersing them for 10 minutes in each of the serially diluted (25%,
50%, 75%, 95% and 100%) ethanol solutions.
The specimens were placed on coded metallic stubs and kept in a desiccator
chamber with dehydrated silica gel inside it, at room temperature for three days.
For scanning electronic microscopy (Philips XL (20kV)) (SEM) the specimens were
gold sputtered (Bal-Tec SCD-050) for 120 seconds and analyzed using a
microscope equipped with energy-dispersive spectrometer (EDS). For the clot
extension analysis, backscattering microscopic images (40X) were selected.
Image analysis
Images were analyzed using the specific software (Image J 1.4o/java 1.6.0_07 software Wayne Rasband National Institutes of Health, USA http://rsb.info.nih.gov/ij).
The human Blood
clot was delimited using backscattering. The images were calibrated using the pixel
as unit, and thereafter the delimited areas were adjust to the threshold and the
measuring tool allowed the percentage of clot area extension on the specimen
surface to be determined. The software automatically measured and summarized
the area of the black points. A blinded examiner performed all analysis twice.
35
Statistical analysis
The surface topography and clot extension values were measured per sample and
averaged per group. The statistical analyses were performed using the KruskalWallis (α=0,001) test, and Dunn’s test was applied for the pair-wise comparisons
as post-test.
Results
Implant surface topographies
Although the SEM images of specimens revealed clear differences of M
specimens, when compared with TG1 and TG2 specimens that exhibited irregular
surfaces (Figure 1), AFM showed substantial differences between these last
groups. The AFM allowed the analysis of surface roughness of specimens at
micrometer scale (Figure 2).
The as-machined surface (M) exhibited only grooves produced by the
manufacturing instruments with peaks of about 1.3µm and roughness of 0.188 µm.
The specimens of TG1 exhibited a surface characterized by defined (clear)
grooves, in which peaks reached 6.5µm, valleys with1µm and roughness of
0.945nm. The specimens of TG2 exhibited surfaces with irregularities as well, but
AFM revealed peaks with height of about 3.5µm and roughness of about 0.593nm
(Table 1).
Blood Clot Extension
The distribution of the clot extension adhered to the titanium surface is shown in
Figure 4. Statistical analysis showed differences in TG1, which differed different
36
from both Groups M and TG2, but no differences were observed between M and
TG2 (p<0.001).
After exposure to blood, SEM images revealed blood elements such as fibrin,
platelets and erythrocytes.
Discussion
This study evaluated the human blood clot extension on several implant surface
topographies. The modified surface topography presents a geometric property that
function as a mechanical restriction of the cytoskeletal cell components that are
involved in spreading and locomotion.10
Fibrin is originated from the reaction of thrombin and fibrinogen released into the
healing site and in dermal wound healing this process is followed by concomitant
connective tissue cell migration and wound contraction. In the same way, this can
occur at the peri-implant bony site, possibly causing retraction of the transitory
fibrin scaffold away from the implant surface11. Thus, it appears that the wider the
extension of clot retained on implant surface, the better is the healing process and
consequently, the osseointegration process.
Mechanical, chemical and combined mechanical-chemical techniques are used to
modify the surface roughness of materials. Grit-blasting or abrasive blasting are
frequently used techniques for increasing the surface roughness of implant
surfaces.12 The mechanical treatments can originate surface roughness at three
types of levels namely macro-, micro- and nano.
Blood contact with proteins and, in our study, with different implant surface
topographies, leads to the initiation of clotting cascade via the intrinsic and extrinsic
pathways, resulting blood coagulation on the implant surface. Therefore, the
37
activation of coagulation system and platelets may have effects on cell and bone
growth.4,13 Complementary, several cytokines such as interleukin-1 (IL-1), plateletderived growth factor (PDGF), insulin-like growth factors (IGF), vascular
endothelial growth factor (VEGF) are released from local cellular elements in the
inflammatory phase and should enhance the wound healing at implant site.
In this study, the combined mechanical-chemical approach was used to obtain the
rough surfaces: M specimens was used as control and the specimens were only
machined/turned, TG1 specimens were subjected to airborne aluminum oxide
particle abrasion (100µm) and washed with nitric acid (HNO3) solution; TG2
specimens were subjected to airborne titanium oxide particle abrasion (50µm 100µm) and washed with maleic (C4H4O4).
Moreover, differences were observed concerning the height (Rz) and number of
irregularities produced; this variability might be due the difference in size (TG1:
100µm; TG2: 50µm - 100µm) and nature (TG1: Al2O3; TG2: TiO2) of the material
particles used for airborne particle abrasion and the different nature of each acid
used to wash the specimens (TG1: HNO3 acid; TG2: maleic acid). These chemical
treatments of can produce micropits with different sizes ranging from 0.5 to 0.2µm
in diameter.
Complementary, it was observed that the TG2 surfaces exhibited a higher
wettability when compared with those of TG1. In other words, when the blood was
dropped onto the surface of TG2 specimens, it spread almost immediately, while
on surface TG1 specimens the blood formed bubbles throughout almost all time of
the experiment (data not shown).
38
These wettability differences may also be due the different acids used to
manufacturing the specimen. Specimens of TG2 exhibited lower peaks and it
appears that its wettability was more evident.
The surfaces analyzed posses different topographies which could lead to different
biological responses such as mechanical interlocking in bone, cell adhesion, and
cell morphology and orientation12, bone neoformation14, enhancement of blood
clotting15 and cell differentiation.
The results demonstrated a wider extension of blood clot on the surfaces of TG1,
which exhibited higher peaks and wider valleys when compared with TG2 and CG.
Park and Davies16 also observed a higher agglomeration of blood elements on a
micro-roughened surface when compared with a machined surface, which was
also responsible for enhancing the platelet aggregation.
Although topography appears to be the main trait responsible for the clot extension
adhered to the surface, another issue that must be pointed out with regard to the
different acids used during specimen processing. The different acids used might
have generated different types of oxide layers, which could influence the adhesion
of clot extension to the surface. In TG2 specimens were washed with maleic acid,
a compound with hydrophobic traits, which might influence on the blood clot
extension formation.
Within the limits of this in vitro study, the data suggest that different treatments
might generate surfaces with different mechanical and chemical traits, which will
exert an important role on blood clot extension formed.
39
Acknowledgments
The authors thank Titanium Fix® and De Bortoli® for supplying the titanium discs
used in this study.
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42
Table 1. Mean+standard deviation of the as-machined (M), titanium discs blasted
with aluminum oxide particles and washed with nitric acid solution (TG1) and
titanium discs blasted with titanium oxide particles and washed with maleic acid
(TG2) profilometry. Kruskall-Wallis test (p<0.05).
Implant Surface Topography*
Ra (µ
µm)
Rq (µ
µm)
Rz (µ
µm)
M
0.14 ± 0.02 0.16 ± 0.01
1.61 ± 0.10
TG1
0.74 ± 0.07 0.95 ± 0.06
3.08 ± 0.94
TG2
0.48 ± 0.12 0.59 ± 0.21
2.09 ± 0.89
* Statistically significant between the implant surface topographies (p=0.0001),
M<TG2<TG1; Ra - arithmetic average of the absolute values of all profile points;
Rq - the root-mean-square of the values of all points; Rz - the average value of the
absolute heights of the five highest peaks and the depths of the five deepest
valleys.
43
Figure 1: Scanning electron microphographies (SEM) of a) as-machined surface,
b) titanium discs blasted with aluminum oxide (Al2O3) particles (100µm) and
washed with nitric acid (HNO3) solution; c) titanium discs blasted with titanium
oxide (TiO2) particles (50µm - 100µm) and washed with maleic acid
(HO2CCH2CHOHCO2H).
Figure 2: Atomic force microscope analysis of a) as-machined surface, b) titanium
discs blasted with aluminum oxide (Al2O3) particles (100µm) and washed with nitric
acid (HNO3) solution; c) titanium discs blasted with titanium oxide (TiO2) particles
(50µm - 100µm) and washed with maleic acid (HO2CCH2CHOHCO2H).
44
3a
3b
3c
Figure 3: a) Scanning electron microphographies (SEM) of as-machined surface
after 20 minutes of blood exposure. Fibrin filaments with trapped blood cells cover
a small area of implant surface; b) Dense fibrin and red blood cells on TG1 group
covering all implant surface; c) Fibrin scaffold is thin in TG2 surface. There are
some implant surfaces exposed after blood exposure.
Figure 4: Box-plot of whole blood extension (% area) of all evaluated surfaces.
Kruskall-Wallis test (p<0.001).