Der Einfluss exogener und endogener Parameter auf den

Transcription

Bezirksfischereiverband
Bezirksfischereiverband
Oberfranken
V.
Oberfranken e.
e.V.
Bezirk Oberfranken
Fachberatung für Fischerei
Landesfischereiverband
Landesfischereiverband
Bayern
Bayern e.
e.V.V.
Der Einfluss exogener und endogener Parameter
auf den Erbrütungserfolg bei Salmoniden
Eine integrative Untersuchung von Problemen bei der Vermehrung von
Bachforelle, Bachsaibling und Seesaibling
Dr. Dennis M. Kallert
gefördert aus Mitteln der Fischereiabgabe
Mai 2009
Herausgeber
Bezirk Oberfranken
Fachberatung für Fischerei
Ludwigstraße 20
95444 Bayreuth
Telefon: (09 21) 60 4-14 69
Fax: (09 21) 60 4-1667
Email: fischerei@bezirk-oberfranken.de
http://www.bezirk-oberfranken.de
Fotos
Titelfoto
Manfred Popp, Fachberatung für Fischerei, Bezirk Oberfranken
Unbefruchtete Eier
Johannes Schnell, Landesfischereiverband Bayern
alle übrigen Fotos
Dr. Dennis M. Kallert, Verfasser
Umschlaggestaltung
Nicole Fleischer
Bayreuth, Mai 2009
Bezirk Oberfranken, Fachberatung für Fischerei
Abschlussbericht
Projektbezeichnung:
Einfluss exogener und endogener Parameter auf den
Erbrütungserfolg bei Salmoniden
Kurztitel „Fertilisationsproblematik bei Salmoniden“
Projektträger:
Bezirk Oberfranken, vertreten durch Herrn Bezirkstagspräsidenten Dr. Günther Denzler,
Bayreuth
weitere Projektpartner:
Landesfischereiverband Bayern, München
Bezirksfischereiverband Oberfranken, Bayreuth
Projektleitung:
Dr. Robert Klupp, Ltd. Fischereidirektor,
Fachberatung für Fischerei des Bezirks Oberfranken, Bayreuth
Auftragnehmer:
Dr. Dennis M. Kallert, Zoologe, München
Finanzierung:
Landesfischereiverband Bayern, München
Projektdauer:
01.09.2006 - 31.03.2009
Verfasser:
Dr. Dennis M. Kallert, Zoologe, München
Vorwort
Eine funktionierende Fortpflanzung ist die wesentlichste Voraussetzung für den Erhalt der heimischen Fischbestände. Dies gilt sowohl für die Fischpopulationen in den
freien Gewässern als auch für die Fischbestände in den Fischzuchtbetrieben.
In den letzten Jahren haben die Fischarten in den freien Gewässern zum Teil erhebliche Einbrüche erlitten. Auch die heimischen Salmonidenzuchtbetriebe hatten
Schwierigkeiten die benötigten Augenpunkteier bereitzustellen. Die Folge davon war
bzw. ist, dass die Fischzuchtbetriebe die Haltung von Laichfischen aus wirtschaftlichen Gründen aufgaben und sich die benötigten Augenpunkteier aus dem Ausland
beschafft haben. Dies kann im Interesse der Erhaltung der heimischen Fischbestände, die an die hiesigen Bedingungen sowohl genetisch als auch ökologisch angepasst sind, nicht auf Dauer hingenommen werden.
Die Fachberatung für Fischerei des Bezirks Oberfranken hat sich zusammen mit dem
Bezirksfischereiverband Oberfranken und dem Landesfischereiverbandes Bayern
dieses Problems angenommen. Über den Bezirksfischereiverband Oberfranken wurden beim Landesfischereiverband Bayern Mittel aus der Fischereiabgabe zur Untersuchung der Einflüsse auf Eier und Sperma, sowie der Erbrütung von befruchteten
Eiern beantragt. Die Untersuchungen wurden in der Lehranstalt für Fischerei Aufseß
durchgeführt. Die vorliegende Arbeit ist als Grundlage zu sehen, wie zukünftig die
Vermehrung von Salmoniden in den hiesigen Fischzuchtbetrieben wieder erfolgreich
betrieben werden kann. Ich hoffe, dass die für Salmoniden aufgezeigte Vorgehensweise auch Hinweise für die Vermehrung von Rutte, Nase und anderen Arten liefert.
Mein Dank gilt dem Landesfischereiverband Bayern für die finanzielle Unterstützung
aus Mitteln der Fischereiabgabe. Danken möchte ich an dieser Stelle auch Herrn
Dr. Dennis Kallert für die praxisorientierte und qualifizierte Durchführung der Untersuchung. Ich bin sicher, der Bezirk Oberfranken hat damit einen Beitrag geleistet, damit
die Salmonidenzuchtbetriebe wieder in die Lage versetzt werden, geeignete Jungfische, sowohl für die freien Gewässer als auch für die Teichwirte zur Verfügung
zu stellen.
Bayreuth, im Mai 2009
Dr. Günther Denzler
Präsident
des Bezirkstages von Oberfranken
Fertilisationserfolg bei Salmoniden
-Inhaltsverzeichnis-
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS
1
ABKÜRZUNGEN
5
1
6
EINLEITUNG
1.1 Problematik
6
1.2 Gametenqualität und Fertilisationsparameter: Synopsis
9
1.3 Zielsetzung
15
2
17
MATERIAL & METHODEN
2.1 Verwendete Fische
17
2.1.1 Fischarten und Herkunft
17
2.1.2 Haltungsbedingungen
17
2.1.3 Fertilisation und Erbrütung
18
2.2 Genereller Versuchsaufbau
20
2.2.1 Gametengewinnung
20
2.2.2 Befruchtung
21
2.2.3 Erbrütung und Monitoring
21
2.3 Färbeversuche
23
2.4 Spermaqualität
24
2.4.1 Spermienkonzentration
24
2.4.2 Mikrofotographie
24
2.4.3 Motilitätsanalyse
25
Schwimmdauer
25
Anteil motiler Spermien
25
2.5 Eiqualität
26
2.5.1 Visuelle Beurteilung
26
2.5.2 Histologie
26
2.5.3 Befruchtungsraten und Eientwicklung
27
2.6 Befruchtungs- und Erbrütungsversuche
27
2.6.1 Befruchtungsmethode
27
1
2.6.2 Reproduzierbarkeit
28
2.6.3 Eigewichtszunahme
28
2.6.4 Selektion der Eier
28
2.6.5 Einfluss der Betäubung
29
2.6.6 Befruchtungstemperatur
29
2.6.7 Einzelpaarungen
30
2.6.8 Laichfischalter
31
2.6.9 Futter
31
Versuche mit Zebrabärblingen
31
Versuche mit Salmoniden
32
33
2.6.11 Spermienkonkurrenz
33
2.6.12 Haltungsbedingungen und Stress
33
2.6.13 Wasser
34
2.6.14 Kreuzungsversuche mit Bachforellen
34
2.7 Physikalische Messgrößen
35
2.7.1 Wasserparameter
35
Temperatur
35
Härtegrad
36
Leitfähigkeit
36
2.7.2 Ovarial- und Seminalplasma
36
Osmolalität
36
2.8 Biologische Analysen
37
2.8.1 Parasitologie
37
2.8.2 Bakteriologie/Virologie
37
2.8.3 Toxikologie
37
2.8.4 Genetische Untersuchung an Bachforellen
38
2.9 Chemikalien
38
2.10
38
3
Statistische Methoden
ERGEBNISSE
40
3.1 Allgemeine Ergebnisse
40
3.1.1 Versuche und Analysen im normalen Brutbetrieb
40
3.1.2 Allgemeine Beobachtungen aus Versuchen
44
3.2 Spermaqualität
44
44
2
Bachforellen (Herkunft A)
45
Bachforellen (Herkunft K)
45
Bachforellen (Herkunft S)
47
Bachsaiblinge
47
Seesaiblinge
48
49
3.2.3 Schwimmdauer
50
3.2.4 Anteil motiler Spermien
52
3.2.5 Seminalplasma
55
3.3 Eiqualität
56
3.3.1 Ovarialplasma
56
3.3.2 Histologie
57
57
3.3.4 Visuelle Beurteilungen
59
3.4 Färbeversuche
60
3.5 Befruchtungs- und Erbrütungsversuche
63
63
Tests verschiedener Methoden
63
Reproduzierbarkeit
63
64
64
3.5.4 Betäubung
65
65
68
3.5.7 Futterversuche
69
Zebrabärblinge
69
Salmoniden
69
71
71
72
3.5.11 Wasser
73
73
3.6 Wasserparameter
76
3.7 Biologische Untersuchungen
78
3.7.1 Parasitologie
78
3.7.2 Toxikologie
78
79
3
3.7.4 Genetische Analyse von Bachforellen
4
79
DISKUSSION
82
4.1 Ergebnisdiskussion und Literaturvergleich
83
4.1.1 Fertilisationserfolg und Entwicklung
83
4.1.2 Fertilisationspraxis
87
4.1.3 Ermittlung der Befruchtungsrate
89
4.1.4 Gametenqualität
90
4.1.5 Ernährung
98
4.1.6 Wasser und Pathogene
100
4.1.7 Kreuzungsversuche und Genetik
104
4.2 Ursachenbewertung
111
5. Empfehlungen
115
5.1 Aquakultur von Salmoniden
115
5.2 Satzfischproduktion und ökologische Schlussfolgerung
118
6
ZUSAMMENFASSUNG
121
7
DANKSAGUNG
123
8
LITERATUR
125
9
APPENDIX
136
10
STELLUNGNAHME
144
4
-Abkürzungen-
Abkürzungen
AMOVA
Analysis of molecular variance
ANOVA
Varianzanalyse
AP
Augenpunkt (-stadium)
BF
Bachforelle
BFA
Bachforellen Herkunft Aufseß (Fischzucht)
BFAw
Bachforellen Herkunft Aufseß wild (Fluß)
BFK
Bachforellen Herkunft Keidel
BFS
Bachforellen Herkunft Salgen
bp
Basenpaar
BR
Befruchtungsrate
BS
Bachsaibling
CASA
Computer Assisted Sperm Analysis
H&E
Haematoxylin/Eosin Färbung
HWE
Hardy-Weinberg-Equilibrium
IHN
Infektiöse hämatopoetische Nekrose
IPN
Infektiöse Pankreasnekrose
KW
Kruskal-Wallis Test
min
Minute(n)
MW
Mittelwert
MWU
Mann-Whitney-U Test
nt
Nucleotid
PBS
Phosphatpuffer (Phosphate buffered saline)
PCR
Polymerase Kettenreaktion
s
Sekunde(n)
SEM
Standardfehler des Mittelwertes
SR
Schlupfrate
SS
Seesaibling
VE
Voll entionisiertes/destilliertes Wasser
VHS
Virale hämorrhagische Septikämie
w/w
Gewicht pro Gewicht
5
-1. Einleitung-
1 Einleitung
1.1
Problematik
Süßwasserfische aus Aquakultur gewinnen in der Ernährung stark an Bedeutung, ihre
sozioökonomische Rolle steigt in Europa stetig. Die Fischerei in Bayern vertritt neben
der Binnen- und Angelfischerei zum einen die extensive wie intensive Teichwirtschaft,
hat jedoch auch die Aufgabe der Bestandserhaltung, Renaturierung und Pflege der
Gewässer. Hierbei spielen Salmoniden, vor allem ursprünglich heimische Arten wie
Bachforelle und Seesaibling, eine wichtige Rolle. Seit nahezu einem Jahrzehnt
verzeichnen zahlreiche Betriebe und Institute in Bayern zunehmend Schwierigkeiten
bei der künstlichen Vermehrung verschiedener Salmonidenarten und dabei speziell
bei der erfolgreichen Befruchtung und Erbrütung der Eigelege. Auch bei der Aufzucht
von Fischen für die Verwendung als Besatz für freie Gewässer durch die jeweiligen
Fischereiberechtigten
Entwicklung
vom
zeigten
sich
befruchteten
Ei
teils
zum
gravierende
Embryo.
Probleme
Dies
betraf
während
der
verschiedene
Salmonidenarten unterschiedlicher lokaler Herkunft. Die Problematik trat auf
Nachforschungen hin seit längerem nicht nur in einigen kommerziellen Fischzuchten
(z.T. Kleinbetrieben), sondern auch in Instituten (auch in anderen Bundesländern und
im europäischen Ausland) wie auch im Betrieb der Lehranstalt für Fischerei in Aufseß
(Fachberatung für Fischerei des Bezirks Oberfranken) auf. Innerhalb der vergangenen
12 Jahre verschlechterten sich die Erbrütungsergebnisse dort ebenfalls zunehmend.
Zugrunde liegen dem entweder Befruchtungsprobleme oder Entwicklungsstörungen
großer Teile der potentiellen Nachkommenschaft, wobei Verluste über 80% keine
Seltenheit sind. Zahlreiche Eier scheinen dabei während der Entwicklung entweder
abzusterben oder nach und nach zu desintegrieren. Das sogenannte „Weißwerden“
oder „Blindwerden“ (Abb. 1), mit dem die Koagulierung der innerhalb der
Dottermembran lokalisierten Globuline gemeint ist, führt in Folge zu schweren
Verpilzungen. Dieses Mykosenwachstum greift vor allem in Erbrütungseinrichtungen
mit hohen Eidichten sehr schnell auf die umliegenden Eier über und beschädigt stets
zahlreiche intakte Teile der Gelege. Die in der Lehranstalt beobachtete Mortalität zog
sich über den gesamten Entwicklungszeitraum der Erbrütung hinweg, es waren auch
hohe Verluste nach dem sog. Augenpunktstadium (AP, Beginn der retinalen
Pigmentierung) zu verzeichnen. Es schienen auch befruchtete Eier betroffen zu sein,
6
-1. Einleitung-
da massive Embryonen- und Brütlingssterblichkeit auftrat. Derartige Beobachtungen
wurden auch seitens anderer Fischzüchter bestätigt. Verschiedene Ursachen kommen
für hohe Verluste an befruchteten Eiern in Frage:

Virale, parasitäre und bakterielle Infektionen (der Adultfische und Gameten)

Gametenqualität („Befruchtungsvermögen“ z.B. Mobilitätsrate der Spermien)

Genetische Gründe (z.B. inkompatible Herkünfte, Inzuchtphänomene)

Physiologische Dysfunktion der Laichfische (z.B. ernährungsbedingte Mängel)

Alter der Laichfische, Reifegrad der Eier

Wasserparameter während der Erbrütung (Verunreinigung, Temperatur)

Stress der Laichfische (Massenhälterung)

Falsches Handling der Gameten (Aktivierung, Befruchtungsmethodik)
Abb. 1. Die Problematik: In Brutgläsern aufgelegter Rogen von Seesaibling (links) und Bachforellen
(rechts) mit zahlreichen abgestorbenen Eiern (weiß).
Die autarke Erhaltung der Bestandsdichte vieler Fischarten in den Flüssen und Seen
Bayerns ist seit vielen Jahren nicht mehr gewährleistet. Beunruhigend ist vor allem
die rückläufige eigenständige Vermehrung heimischer Salmoniden in den freien
Gewässern.
Autochthone
Bestände
sind
zum Teil
komplett
verschwunden.
Umfangreiche Besatzmaßnahmen gefährdeter einheimischer Arten vermochten die
Bestandserhaltung der Tiere i.d.R. nicht auf Dauer sicherzustellen. Bislang ist unklar,
welche biologischen Hintergründe für diese Beobachtungen verantwortlich sind.
7
-1. Einleitung-
Innerhalb der Fischerei gibt es daher zahlreiche Spekulationen um Futtermittel,
Krankheiten, Wassergüte und mangelhafte genetische Disposition der Tiere, obgleich
empirische
Daten
nur
spärlich
vorhanden
sind.
Eine fundierte
biologische
Untersuchung wurde und wird von Interessensverbänden oft zugunsten von
Besatzmaßnahmen vernachlässigt.
Viele Fischzüchter traten zudem an die Fachberatung mit der Bitte um Information zu
derlei Problematiken heran. Zahlreiche Betriebe sind ob der immer wiederkehrenden
Probleme nicht zuletzt wegen finanzieller Einbußen davon abgekommen, selbst
Laichfische zu halten und eine eigene Zucht zu betreiben. Da der Zukauf von
kommerziellem Eimaterial auf Dauer nicht nur unökonomisch ist, sondern auch das
Aussterben von autochthonen Ökotypen und Zuchtlinien, die aus langjähriger
Zuchtarbeit hervorgingen, begünstigt und Krankheiten Vorschub leistet, sollte eine
Lösung dieser Probleme oberstes Ziel und im Interesse fischereilicher Institutionen
sein.
Es
ist
ein
wichtiges
Anliegen
der
Fachberatungen
und
der
Teichgenossenschaften, die Zucht lokaler Herkünfte zu fördern und Teichwirte zu
ermutigen, die Schwierigkeiten der Nachzucht auf sich zu nehmen, um auch in
Zukunft
geeignete
Fische
mit
hoher
ökologischer
und
genetischer
Anpassungsfähigkeit und reproduktiver wie physiologischer Fitness unabhängig von
Importen zu erzeugen. Dies betrifft letztlich auch die Satzfischzüchter, die
hochwertigen Besatz für die freien Gewässer mit lokal gut angepassten Herkünften
produzieren sollten. Die Optimierung der Reproduktionsleistungen einheimischer
Zuchtfische ist dabei von höchstem fischereilichen Interesse. Die aus insuffizienter
Reproduktion resultierenden ökologischen und ökonomischen Einbußen waren in den
vergangenen Jahren bereits erheblich, weshalb es dringend einer umfassenden
Untersuchung der aktuellen Problematik und verschiedener Zusammenhänge bei der
Fertilisation und Erbrütung bedurfte. Angesichts der Relevanz dieser Thematik stellte
sich der Bezirk Oberfranken zusammen mit dem Landesfischereiverband der
Problematik und
zeigte
mit
der
Initiierung
dieses
Untersuchungsvorhabens
Verantwortung für die Etablierung eines fachübergreifenden Kompetenztransfers
zwischen Wissenschaft und Fischerei.
8
1.2
-1. Einleitung-
Gametenqualität und Fertilisationsparameter: Synopsis
Die externe Befruchtung bei Fischen macht den Fertilisationserfolg weitgehend vom
Paarungsverhalten und der Gametenqualität abhängig. In der Aquakultur kommt der
praktische Umgang mit den Laichtieren und den Geschlechtsprodukten hinzu. Im
Folgenden soll ein kurzer Überblick des derzeitigen Wissens über die Gameten von
Salmoniden und die Befruchtungspraxis gegeben werden.
Fischspermien sind von einfacherem Bau als Säugerspermien (kein Akrosom) und für
gewöhnlich unbeweglich bis zur Abgabe im Wasser. Sie erhalten die Fähigkeit zur
Aktivierung durch einen Anstieg an Bikarbonat und dem pH bei der Passage des
Samenleiters (Morisawa & Morisawa, 1988). Ein entnommenes Ejakulat ist durch die
niedrige Metabolismusrate bei bis zu 4°C mehrere Tage haltbar (Kime et al. 1996).
Fischspermien verbrauchen auch im unbeweglichen Zustand große Mengen
Sauerstoff, worauf auch bei kurzzeitiger Lagerung geachtet werden muss.
Temperatur
und
Verdünnungsrate
spielen
eine
wichtige
Rolle
bei
der
Bewegungsaktivierung von Salmonidenspermien (Alavi & Cosson 2006). KaliumIonen (als Inhibitor) sind zusammen mit einer Osmolalitäts- und pH-Änderung der
Schlüssel zur Aktivierung von Salmonidenspermien (Alavi & Cosson, 2006). Hohe
Osmolalitätswerte um 400 mosm/kg inhibieren die Spermienbewegung, ebenso wie
das im Seminalplasma enthaltene Androgamon I (Friedrich 1984). Sie wird gestartet
bei einer K+-Konzentrationen unter 5 mM (Cosson et al. 1995) vermittelt über
intrazellulären Ca2+-Flux (Tanimoto et al. 1994). Na+-Ionen und Faktoren im
Ovarialplasma (dem sog. „Fruchtwasser“ oder „Bauchhöhlenflüssigkeit“) fördern die
Bewegung. Sie werden im Bereich der Micropyle durch stimulierende Signale
zusätzlich gerichtet aktiviert (Yanagimachi et al. 1992). Bei Salmoniden beträgt die
Bewegungsdauer i.d.R. < 30 s (Rurangwa et al. 2004, Perchec et al. 1996) bei einer
Schwimmgeschwindigkeit von 100-120 µm/s (bei Regenbogenforellen, Lahnsteiner et
al. 1998). Einmal aktivierte Spermien sind also nicht in der Lage, während der Dauer
der Aktivität ein Ei mittlerer Größe auch nur halb zu umschwimmen. Dabei nimmt die
Schlagfrequenz des Spermienflagellums stetig ab und kommt schließlich zum
Erliegen.
9
-1. Einleitung-
Der letztendlich entscheidende Gradmesser der Spermaqualität ist ein hohes
Befruchtungsvermögen. Ein Standard für die Qualitätsbestimmung von Spermien bei
Fischen vor der Befruchtung ist aber nicht vorhanden (Fitzpatrick et al. 2005). Hierbei
kann auch die Morphologie der Spermien über gewisse Eigenschaften der Spermien
Aufschluss geben. Rurangwa et al. (2004) raten dazu, bei der Qualitätsbeurteilung
nicht nur einen Parameter zu betrachten und nennen als nützliche Biomarker den
Spermatokrit, die Konzentration im Ejakulat, Osmolalität und pH des Seminalplasmas,
verschiedene
Enzymaktivitäten,
die
ATP-Konzentration,
Motilitätskriterien,
Morphologie der Spermien, deren Ultrastruktur, und schließlich die Befruchtungsrate
(BR). Faktoren im Seminalplasma, welche die Motilität einer Spermienprobe
beeinflussen können, fassten Alavi & Cosson (2006) zusammen. Diese seien v.a. die
Na+/K+-Konzentration, der osmotische Druck und der pH-Wert. Ein Seminalplasma
pH-Wert unter 7,5 inhibiert laut Billard & Cosson (1992) die Befruchtung bei
Regenbogenforelleneiern, als optimal gilt ein Wert von 8,2 (Baynes et al. 1981). Nach
Billard (1988) ist die Motilität eines der besten Merkmale qualitativ guter
Spermaproben. In speziellen Aktivierungslösungen konnten 20% der Spermien von
Regenbogenforellen bis zu 30 min motil gehalten werden (Lahnsteiner et al. 1999a).
Bei Regenbogenforellen wurden von Lahnsteiner et al. (1998) folgende korrelierende
Biomarker bestimmt: pH-Wert, Lipidgehalt und ß-D-Glucuronidase-Aktivität des
Seminalplasmas,
Malat-Dehydrogenase-,
Aspartat-Aminotransferase-
und
die
Respirationsaktivität der Spermatozoen sowie der Anteil motiler Spermien und deren
Schwimmgeschwindigkeit. In der Fischzucht-Praxis anwendbar sind der Anteil motiler
Spermien (> 75%), Sicherstellung des optimalen pH-Wertes des Seminalplasmas (8,08,2), und evtl. die Messung der Respirationsaktivität der Spermien-Faktoren, welche
laut den Autoren die hohe Varianz der BR meist erklären.
Salmonideneier besitzen einen einfachen Aufbau, müssen aber dennoch alles Nötige
für die erfolgreiche Entwicklung enthalten und Schutz vor den externen Bedingungen
bieten. Die äußere Eischale (Chorion mit Zona pellucida) besteht aus Glykoprotein
und einer aufliegenden Mucoidschicht. Sie ist porös und Wasser kann so in den
perivitellinen Raum zwischen Chorion und Dottermembran eindringen. Die Mikropyle
ist eine trichterförmige Öffnung für den Spermieneintritt welche sich nach kurzer Zeit in
Wasser bereits verschließt. Eier von Salmoniden sind daher nach etwa 2 min in
Wasser zu 100% nicht mehr befruchtbar (Greenberg, 1960). Die Keimscheibe sitzt der
10
-1. Einleitung-
empfindlichen proteinösen Dottermembran auf, Öltröpfchen am apikalen Pol unter der
Dottermembran richten sie stets nach oben. Der Dotter besteht v.a. aus Lipiden und
Globulinen
mit
Lipovitellinen
(Lipoproteine),
Phosphovitin
und
anderen
Phosphoproteinen. Die Proteine im Dotter werden aus Vitellogenin synthetisiert.
Große Teile der hormonellen Ausstattung sind ebenfalls im Ei enthalten, da der
Embryo diese nicht synthetisieren kann. Dazu kommen noch maternale Ribosomen
und Stoffe zur intensiven RNA-Synthese. Das Ovarialplasma enthält bei BS
Proteasehemmer, die vermutlich dem Schutz der Eihülle dienen (Coffmann & Goetz
1998, Bobe & Goetz 2001).
Wildfische verzeichnen oft eine bessere Eiqualität und niedrigere Verluste als solche
aus Zuchtanlagen. Spekulationen laut Brooks et al. (1997) gehen dahin, dass Nahrung
(v.a. deren Gehalt an freien Radikalfängern) und physiochemische Konditionen des
Wassers (pH, Osmolalität, Leitfähigkeit, Temperatur) hierfür verantwortlich sind.
Speziell die Ernährung der Laichfische ist nach Angaben einiger Autoren wichtig für
Gametenqualität (z.B. Izquierdo et al. 2001). Andere behaupten dagegen, nur wenige
Inhaltsstoffe hätten überhaupt einen Einfluss auf die Qualität bzw. Befruchtungs- und
Entwicklungsfähigkeit (siehe Washburn et al. 1990, Watanabe 1991a, b, Harel et al.
1994). Tests auf den Einfluss verschiedener Lipide ergaben kontroverse Ergebnisse
(zusammengefasst in Brooks et al. 1997). Demnach spielen z.B. Carotinoide nicht die
ihnen oft nachgesagte große Rolle bei der Eiqualität (Craik 1985). Kohlenhydrat-freie
Kost resultierte jedenfalls in reduzierten Schlupfraten (SR) (Washburn et al. 1990).
Laut Brooks et al. (1997) sind folgende Faktoren wichtig für Eiqualität oder werden
diskutiert: Der endokrine Status des Rogners während der Oogenese, der Reifegrad
der Gameten, Stress durch Handling, Belastung durch Bakterienwachstum, die
Nahrung, Menge und Art der Deposition von Stoffen im Ei, Wasserparameter und die
Haltungsbedingungen der Laicher.
Reduzierte Überlebensraten wegen Überreife des Rogens sind bei Zuchtfischen lange
bekannt (Zusammenfassung siehe De Gaudemar & Beall 1998). Überreife der Eier
kann zu starken Verlusten und schlechten BR bei Salmoniden führen (Nomura et al.
1974, Mansour et al. 2007, 2008, Aegerter & Jalabert 2004, Aegerter et al. 2005). Bei
Regenbogenforellen besteht laut Bromage et al. (1994) ein Zeitfenster von einer
Woche nach Ovulation für den Erhalt vitaler Eier. De Gaudemar & Beall (1998) stellten
fest, dass bei Lachsen die Mortalität der Eier, Infertilität und Zahl der Missbildungen
mit der Anzahl der Tage nach der Ovulation zunahm (Erhöhung der Mortalität um
11
-1. Einleitung-
8,7% nach einer Woche). Regenbogenforellen-Gelege, die sich 14 und 16 Tage nach
Ovulation noch im Coelom befanden zeigten eine SR von nur noch 36% (Azuma et al.
2003), nach anderen Autoren eine Überlebensrate von 37% (Bonnet et al. 2007). Es
wurden in den Studien letztgenannter Autoren auch große Anteile deformierter
Brütlinge (v.a. Zyklopie) gefunden. Veränderte mRNA-Transkription in Eiern
verschiedenen Alters nach der Ovulation ist offensichtlich ein weiteres Anzeichen für
die Entwicklungskompetenz der Eier eines Rogners (Aegerter et al. 2005). Aber auch
„Unreife“ von Eiern als qualitätsmindernde Eigenschaft wäre möglich, da kurz nach
der Ovulation die Meiose nicht vollständig abgeschlossen ist (Brooks et al. 1997).
Für die Beurteilung „guter“ und „schlechter“ Eichargen vor der Befruchtung bestehen
nur wenige Anhaltspunkte. Bromage et al. (1994) hält die Verteilung der Öltröpfchen
und die Transparenz des Eis für wichtige Qualitätskriterien. Diskutiert wurden u.a. in
diesem Zusammenhang die Form der Eier und die Struktur der Zona pellucida. Bei der
Seeforelle wurden Verteilung der Lipidtröpfchen, Eigewichtszunahme, Transparenz
der Eier und Ovarialplasma pH als Qualitätsparameter ermittelt (Lahnsteiner et al.
1999b). Die Zusammensetzung des Ovarialplasmas kann bei Salmoniden laut
verschiedener Berichte die Qualitätseigenschaften der Eier widerspiegeln oder
beeinflussen. Lahnsteiner et al (1999a) ermittelten als optimalen pH-Wert des
Ovarialplasmas von Seeforellen Werte zwischen 8,44 und 8,57. Der Proteingehalt pro
100 ml Plasma sollte 235 mg nicht überschreiten, mit ihm hängt der pH-Wert direkt
zusammen. Diese Faktoren zusammen mit verschiedenen Enzymaktivitäten, einigen
metabolischen Parametern und dem Eigewicht waren signifikant korreliert mit einer
Rate an Eiern im AP-Stadium von > 80%. Der geeignete pH-Bereich des
Ovarialplasmas bei Coho-Lachsen lag zwischen 7 und 8,4 (Wilcox et al. 1984).
Der Anteil motiler Spermien korreliert mit dem pH-Wert des Ovarialplasmas bei
Regenbogenforellen, dabei sollte dieser höher als der des Seminalplasmas sein und
stets über 8,2 liegen (Wojtczak et al. 2004). Diese Autoren fanden zudem, dass
Eichargen mit geringer Fertilisierbarkeit Wassertrübung hervorrufen, während solche
ohne diesen Effekt gute BR erzielten. Dies sei auf die Koagulierung von im
Ovarialplasma enthaltenen Eiproteinen zurückzuführen, da in deren Ovarialplasma
höhere Konzentrationen an Lipid und Protein zu finden waren. Beschädigte Eier
verändern den pH-Wert des Ovarialplasmas, erzeugen Trübung desselben und
vermindern die Spermienmotilität (Dietrich et al. 2007a). Gehalte an Eisen und Vitamin
B2 korrelierten laut Hirao et al. (1954, 1955) mit der SR. Craik & Harvey (1984)
12
-1. Einleitung-
konnten eine Korrelation der SR mit den Parametern Eigewicht, Eihüllengewicht,
Lipid- und Proteingehalt, sowie den Gehalten an Phosphor, Eisen und Calcium nicht
bestätigen. Das Eigewicht war laut diesen Autoren aber zusammen mit einem
geringeren Lipidgehalt und hohen Gehalten an o.g. Komponenten kennzeichnend für
Eiproben mit einer SR > 50% beim Vergleich mit solchen, bei denen der Schlupf
gänzlich ausblieb. Die Autoren kamen zu dem Schluss, dass das Nassgewicht der
Eier und der Gehalt an Phosphoprotein die besten Determinanten für eine hohe
Eiqualität wären. Einige Proteinlevel im Ei waren mit der Überlebensrate von
Bachforellenembryonen signifikant korreliert (Lahnsteiner et al. 2007).
Die Eihüllenstabilität stellt kein Qualitätskriterium dar, da diese selbst innerhalb eines
Rogners stark variiert (Tombek, 1998). Lahnsteiner et al. (2001) maßen die BR von
verschiedenen heimischen Cypriniden und fanden keine Korrelation mit dem Gehalt
an bestimmten Proteinen, Peptiden, Zuckern, DNA/RNA und Fettsäuren. Positive
Korrelation beobachteten die Autoren jedoch bei dem Ovarialplasma-pH, der
Proteinkonzentration und bestimmten Enzymaktivitäten. Als unerheblich eingestuft
wurde von Brooks et al. (1997) die Größe der Eier von Regenbogenforellen, während
einige Autoren größeren Eiern bessere Befruchtungs- oder Überlebensraten
zurechnen (Lahnsteiner et al. 1999b, 2001, Gall 1974). Kein signifikanter
Zusammenhang zwischen Größe von Eiern und deren Überlebensraten wurde
gefunden für SS (Jonsson et al. 2000), Regenbogenforellen (Bromage et al. 1992,
Brooks et al. 1997) und BS (Reiter, 2006). Craik & Harvey (1984) fanden ebenfalls
keine
Korrelation
von
Trocken-/Nassgewicht
von
Eiern
und
der
SR
von
Regenbogenforellen. Laut Mansour et al. (2008) besaßen besonders große und
schwere Eier sogar eine eher schlechte Eiqualität. Auch Aegerter & Jalabert (2004)
stellten fest, dass die Eigröße bei Belassen im Bauchraum mit der Zeit nach der
Ovulation wuchs.
Die Techniken bei der Vermehrung von Fischen in der Teichwirtschaft beruhen
größtenteils auf alten Erfahrungswerten. Es gibt nur wenige Studien zu deren
Optimierung und auch nur einige experimentelle Untersuchungen bezüglich der
Parameter die hierfür von Bedeutung sind. Zuchtbetriebe geben ihr Wissen über die
Zusammenhänge oftmals nicht preis. Daher existiert eine Vielzahl von Meinungen
und anekdotischem Wissen bezüglich Praktiken, Handling und Zuchtparametern für
verschiedene Salmonidenarten. Die Vermehrung von Salmoniden geschieht während
der meist 6-8-wöchigen Laichzeit durch Abstreifen der Gameten und anschließende
13
-1. Einleitung-
Befruchtung. Allgemein wird empfohlen, die Rogner während der Laichperiode
wöchentlich auf ihren Reifestatus zu überprüfen. Man ist sich dabei einig, dass kurz
nach der Ovulation die Eientnahme stattfinden sollte. Die Eizahl der SalmonidenRogner (Fekundität) hängt gemeinhin von der Fütterung ab, die Eigröße wiederum
von der des Rogners (Klupp, 1998). Die Verwendung von sogenannten Erstlaichern
als Laichfischen wird meist vermieden, ältere Fische bringen zumeist Eier höherer
Qualität und SR. Fallen Eier ohne viel Druck aus der Bauchhöhle und ist die
Geschlechtspapille deutlich sichtbar, hat die Ovulation stattgefunden und der Fisch
kann gestreift werden. Wood & Dunn (1948) und Greenberg (1960) sehen die
Methode des „Streifens“ durch Druck skeptisch und plädieren dafür, nur die leicht aus
der Bauchhöhle fallenden Eier zu verwenden. Hierdurch sei die Fertilisationsrate
wesentlich höher (bis 98,5%). Rosenberg (1983) und Munkittrick et al. (1992)
berichteten, das Salmonideneier in Salzlösung bei 0-4°C keinen Schaden nehmen. Es
ist i.d.R. nicht zweckmäßig große Eimengen zu sammeln und auf einmal zu
befruchten, da eine gute Durchmischung nicht mehr gewährleistet werden kann. Auch
kann überreifes Material und Verunreinigung mit Blut oder Kot den Befruchtungserfolg
beeinträchtigen.
Als Richtwert galt bis dato, die Eier von 3-5 Rognern mit Spermien von 2-3 Milchnern
zu befruchten (Schmidt, 1998). Die Befruchtung erfolgt stets durch schnelles
Durchmischen der Gameten mit oder ohne Ovarialplasma unter Wasserzugabe.
Wasser und Ovarialplasma werden bisweilen durch sog. Befruchtungslösungen
ersetzt,
meist
gepufferte
physiologische
Kochsalzlösungen.
Der
pH-Wert
verschiedener Aktivierungslösungen ist laut Krise et al. (1995) gleichgültig, wenn diese
osmotisch
richtig
ausbalanciert
ist.
Zugabe
von
Bikarbonat
unterstützt
die
Spermienaktivierung (Wennemuth 2004). Die angewandten Methoden in der
Fertilisationsprozedur sind je nach Betrieb und Fischart sehr verschieden. Die
„trockene“ Methode (Spermienzugabe zu Eiern ohne Ovarialplasma) hat sich in der
Praxis jedoch größtenteils nicht durchgesetzt (Schmidt 1998). In Versuchen konnte
nachgewiesen werden, dass bei Regenbogenforellen bereits nach 5 s BR von über
80% erreicht werden (Liley et al. 2002). Nach Wasserzugabe quellen die Eier, das
Chorion verhärtet sich und sie erhalten so ihre feste Form. Die Größenzunahme durch
die Quellung beträgt ca. 15-20% (Schmidt, 1998). Fertig gequollene Eier werden als
„grüne“ Eier bezeichnet und sind nun für 24-36 h transportfähig (Hayes, 1949), danach
sollte man sie ruhen lassen. Zur Erbrütung werden die befruchteten Gelege in
14
Zugergläser,
Brutschränke
oder
-1. Einleitung-
Unterstromkästen
verbracht,
in
denen
die
Durchströmung der Gelege von unten gewährleistet ist. Vor dem Schlupf erfolgt die
Sezernierung von choriolytischen Enzymen zum Aufbruch der Eischale. Das
schlüpfende Jungtier verlässt für gewöhnlich mit dem Schwanz zuerst die Eihülle und
verbringt die Zeit bis zum Aufbrauchen der Dottersackreserven zumeist am Boden
liegend, bevor es dann aufschwimmt und aktiv Futter aufnimmt.
Eine als gut zu beurteilende BR für Forellenartige liegt bei > 80% (Lahnsteiner et al.
1998). Verschiedene Befruchtungsmethoden und Handling der Laichfische resultierten
in der Vergangenheit oft in unbefriedigenden BR. Ein eindeutiger Trend lässt sich
hierbei jedoch nicht feststellen. Asynchrone Ovulation und Probleme der Eireifung
können bei in Aquakultur gehaltenen Fischen aus fehlenden Signalen zur hormonellen
Stimulation herrühren. Das Verbringen der Tiere in Innenanlagen vor der Ovulation
kann ebenfalls heterogene Eiqualität bedingen (Jansen, 1993). Die maximale
Mortalität erfolgt laut Greenberg (1960) zwischen dem 5. und 9. Tag der Erbrütung,
Billard (1976) fand dem entgegen eine hohe Gefahr für Verluste bei unvorsichtigem
Handling innerhalb von 30 min nach der Befruchtung. Laut Bailey und Evans (1971)
existieren bei Salmonideneiern Perioden mit erhöhter Temperaturempfindlichkeit.
Diese sind der Beginn der Erbrütung und die letzte Phase vor dem Schlupf und
wurden von den Autoren auf die Beeinflussung genetischer Regulationsmechanismen
zurückgeführt.
Bakterielle
Kolonisierung
und
Wasserverschmutzungen
(Zusammenfassung siehe Brooks 1997), sowie kurz vor dem Schlupf auch
Sauerstoffmangel (speziell bei höheren Temperaturen) können ebenfalls Verluste
hervorrufen. Der Embryo wird beim Absterben des Eis zuerst opak, das Ei wird später
oft komplett weiß, sobald die Dottermembran desintegriert und die enthaltenen
Proteine koagulieren.
1.3
Zielsetzung
Das Hauptaugenmerk dieser Studie lag auf der aktuell unzureichenden SR von
Salmonideneiern in vielen Betrieben. Die daraus resultierenden ökonomischen
Einbußen sind teils erheblich, weshalb es dringend einer Untersuchung der kritischen
Bereiche und deren Verbesserung bedarf. Das Institut für Fischerei der Landesanstalt
für Landwirtschaft und die Fachberatung für Fischerei des Bezirks Oberfranken
stellten sich der Herausforderung und ergriffen 2004/2005 Maßnahmen in Form der
15
Beantragung
eines
ersten
-1. Einleitung-
Forschungsprojekts
zu
dieser
Thematik.
In
Zusammenarbeit mit spezialisierten Wissenschaftlern wurden in der hier vorgestellten
Studie anhand verschiedener Charakteristika von Laichfischen, Rogen und Sperma
sowie praktischer Aspekte bei der Durchführung der künstlichen Befruchtung die
Zusammenhänge mit der BR und der embryonalen Entwicklung untersucht. Ziel war
die Bestimmung von Parametern, die die Entwicklungs- und Befruchtungsfähigkeit der
Gameten von Salmoniden beeinflussen bzw. einschränken und die Ermittlung
etwaiger Fehler bei dem Prozess der Vermehrung von Zucht- und Satzfischen.
Die Erkenntnisse sollten auch wertvolle Informationen zu möglichen Problemen im
natürlichen Habitat der Fische abseits der Aquakultur liefern. Die selbständige
Vermehrung vieler Fischarten in Flüssen und Seen Bayerns bereitet oftmals
Probleme. Die Fischereiberechtigten wie die Behörden versuchen dieser Situation
durch Besatzmaßnahmen entgegen zu wirken. Aus fischereiökologischer Sicht gilt es
jedoch darauf hinzuwirken, dass sich die Fischbestände in den freien Gewässern
selbständig durch Eigenvermehrung erhalten. Die Fortpflanzungssituation der
Fischarten in freien Gewässern hat große Bedeutung für die Erhaltung regionaler
Genreserven.
Es war daher im Rahmen dieses Projektes vorgesehen, Gründe für die hohen
Eiverluste zu identifizieren und diese durch Veränderungen der Parameter bei der
Vermehrung von Bachforelle, Bachsaibling und Seesaibling in der Zucht wie im
Freiland zu reduzieren. Es wird davon ausgegangen, dass die erarbeiteten
Ergebnisse im Wesentlichen auf andere Fischarten übertragen werden können. Die
Erkenntnisse sollen dazu beitragen, die derzeit herrschenden Unklarheiten in der
Praxis zu reduzieren und es sollte ein fundierter Wissensgewinn erbracht werden, um
derartigen Problemen entgegenzuwirken. Es ist beabsichtigt, konkrete Vorschläge zur
Problemlösung,
dem
Befruchtungsprozesses
praktischen
in
Ablauf
und
der
Salmonidenzuchtbetrieben
zu
Optimierung
erstellen
und
des
diese
gesondert zu publizieren. Eine ökonomische und nachhaltige Bewirtschaftung seitens
der bayerischen Teichwirtschaft kann von diesem Wissen und daraus resultierenden
Lösungsansätzen
profitieren.
Regionale
Züchter
sollen
hierdurch
langfristig
unabhängiger von Importen und Zukäufen werden und der Erhalt regionaler
Genreserven sowohl in der Teichwirtschaft als auch in freien Gewässern
sichergestellt
werden.
Darüber
hinaus
sollen
auch
Impulse
zu
Forschungsarbeiten gegeben werden.
16
neuen
-2. Material & Methoden-
2 Material & Methoden
2.1 Verwendete Fische
2.1.1 Fischarten und Herkunft
Die untersuchten Fischarten waren Bachsaiblinge Salvelinus fontinalis (BS),
Seesaiblinge Salvelinus alpinus (SS) sowie Bachforellen Salmo trutta (forma fario)
(BF). Hierbei handelte es sich um langjährige Zuchtlinien aus dem Zuchtbetrieb der
Lehranstalt für Fischerei des Bezirks Oberfranken (91347 Aufseß). Der Bestand an
Bachforellen stellte eine vornehmlich aus der Umgebung (Maineinzugsgebiet)
stammende Mischpopulation von Tieren dar, die zur Weiterzucht verwendet wurden.
Des Weiteren wurden Bachforellen als Vergleichstiere z.B. für Kreuzungsversuche
aus anderen
Betrieben
oder
dem Freiland
(Elektrobefischung der
Aufseß)
herangezogen. Verwendet wurden Laichtiere aus der Fischzucht Keidel (Forellenzucht
Lothar Keidel 35115 Ehrenberg-Wüstensachsen) und aus dem Schwäbischen
Fischereihof des Bezirks Schwaben (87775 Salgen). Für die Eifärbeversuche wurden
zum Teil Gelege von Salvelinus namaycush verwendet, welcher ebenfalls als
Zuchtstamm im Aufsesser Betrieb existiert. Alle zur Gametengewinnung verwendeten
Laichfische waren zwischen 3 und 6 Jahren alt sofern nicht anders vermerkt.
Zebrabärblinge (Danio rerio), die für Futterexperimente verwendet wurden stammten
aus dem Aquarienfachhandel.
2.1.2 Haltungsbedingungen
Sofern nicht anders beschrieben, wurden die verwendeten Tiere gemischten
Laichfischteichen (Größe 290 m3, Durchfluss 3-5 l/s Quellwasser) entnommen. Alle
Laichfische erhielten, soweit nicht anders in der Versuchsbeschreibung vermerkt,
handelsübliches Laichfischfutter der Marken BioMar, DanaFeed und Coppens. Die
Tiere wurden zur betreffenden Zeit 1-2 Mal wöchentlich durch leichten Druck auf den
Bauch auf die Eireife bzw. erfolgte Ovulation hin geprüft. Bald laichbereite Tiere
wurden bis zum Abstreifen i.d.R. in separaten abgedeckten Becken gehältert.
17
2.1.3 Fertilisation und Erbrütung
In der Lehranstalt für Fischerei des Bezirks Oberfranken wurden zur Laichzeit alle
Fischarten routinemäßig vermehrt. Es wurde nach folgender Methodik verfahren:
Fische wurden narkotisiert (MS-222, Tricain-Methansulfonat, Konz. 0,1 g/l), nach der
“trockenen” Methode (unter Abnahme und Verwerfen des Ovarialplasmas) gestreift
und mit Sperma von 4-5 Milchnern direkt befruchtet. Die Eier wurden i.d.R. wenige
Minuten danach mit Quellwasser gewaschen und Fremdstoffe entfernt. Daraufhin
erfolgte das Quellen der Eier für 30 min bis 1 h, dann wurden sie mit Actomar K 30
(0,6%) desinfiziert und in Rinnen (Unterstrom-Kasteneinsätze) oder Brutgläsern
aufgelegt (Abb. 2). Wöchentliche Behandlung des Wassers und der Erbrütungsgefäße
mit Wasserstoffperoxid sollten Pilzwachstum unterbinden. Nach Erreichen des
Augenpunktstadiums (AP) wurden die „weißen“ (koagulierten) Eier per Hand oder mit
einer Eiauslesemaschine (Winsorter, Impex A.D. Winther, Type WB 8) aussortiert. In
Unterstromkästen konnten diese bereits vorher abgelesen werden. Alle Eichargen
wurden gewogen und der Verlust zum AP-Stadium und nach dem Schlupf ermittelt.
18
Abb. 2. Der Brutbetrieb in der Lehranstalt Aufseß. Streifen eines Bachsaiblings (oben links), Auflegen
der Gelege in Rinnen mit Unterstromkästen (oben rechts), Zugergläser (unten).
19
2.2
Genereller Versuchsaufbau
2.2.1 Gametengewinnung
Der Streifvorgang sollte unter größtmöglicher Stressvermeidung stattfinden, deshalb
wurden die Tiere vor dem Abstreifen betäubt. Hierzu diente Tricain-Methansulfonat
(MS-222, Konz. 0,1 g/l), welches bei den Tieren zur kurzzeitigen Sedierung
hervorragend geeignet ist und Verletzungen an Tieren und Eiern vermeiden hilft. Die
Tiere wurden in der Afterregion getrocknet und Rogen oder Sperma durch leichten
lateralen Druck in separaten Behältern aufgefangen und sofort eisgekühlt.
Verschmutzungen durch Urin und Darminhalt waren hierbei zu vermeiden, weshalb
Spermienproben erst nach erstmaligem Druck und Säubern der Aftergegend
gewonnen wurden. Die Eier wurden falls nötig auf Auffälligkeiten (siehe Punkt 2.5.1)
hin untersucht, Chargen mit sichtbaren Beschädigungen oder Verunreinigungen
wurden verworfen.
Nach Abzählen der grünen Eier ohne Ovarialflüssigkeit in Plastikschälchen (6 x 10 x
4,7 cm, Bellaplast Polarcup, Art. 505) wurden diese bis zur Verwendung (max. 2 h) auf
Eis gelagert. Es erfolgte eine kurze visuelle Überprüfung der Aktivierbarkeit der
einzelnen Spermaproben mittels eisgekühlten Wassers unter dem Mikroskop. Die
avisierte Spermienkonzentration pro Ei betrug soweit nicht anders vermerkt 600 000
pro Ei. Spermienkonzentrationen der Einzelmilchner wurden hierfür computergestützt
mittels einer Zählkammer (Bürker) und einem digitalen Imaging-System (Motic B 3
Professional Stereomikroskop mit Moticam 2000 Digitalkamera und Analyse-Software)
unter Phasenkontrast-Optik gemessen. Ausgewertet wurden pro Milchner 4 x 0,004 µl
einer 1:500 Verdünnung des nativen Ejakulats. Zur Verdünnung wurde der
entsprechende Teil des Ejakulats mit einer Inhibierungslösung (125 mmol/l NaCl, 2
mmol/l KCl, 1.5 mmol/l CaCl2, 0,8 mmol/l MgSO4, 20 mmol/l Tris, pH 7,8) versetzt.
Soweit nicht anders angegeben wurden Spermienaliquots von je 3 Milchnern der
gleichen
Spermienanzahl
vermischt
und
mit
der
oben
beschriebenen
Inhibierungslösung auf 500 µl aufgefüllt.
20
2.2.2 Befruchtung
Allgemein
wurde
die
Befruchtung
durch
schnelle
Addition
von
Ejakulat,
Aktivierungslösung und Wasser herbeigeführt. Wenn nicht anders vermerkt wurden
pro Paarung 100 Eier mit 10 µl Spermien-Mastermix (600 000 Spermien pro Ei)
befruchtet. Die Befruchtung erfolgte in den Plastikschälchen während der Zugabe von
8 ml Aktivierungslösung (60 mmol/l NaHCO3, 50 mmol/l Tris, pH 8,5, 7,5°C, nach
Lahnsteiner et al. (1999a)), um die Spermienbewegung zu starten. Gleich darauf
wurden 10 ml gekühltes Quellwasser (7-8°C) hinzugegeben, um das Quellen und
Aushärten der Eier zu ermöglichen. Die Gameten wurden sodann durch Schwenken
der Behälter vermengt.
2.2.3 Erbrütung und Monitoring
Nach der Befruchtung wurden die Gelege für ca. 1 h auf Eis gelagert bis der
Quellvorgang abgeschlossen war. Die befruchteten Portionen wurden in speziell
konstruierten Einzeleinheiten aus Plexiglas ohne Verbindung zueinander aufgelegt
(Abb. 3). Alle Einheiten verfügten über eine separate Wasserzufuhr, Temperatur und
Leitfähigkeit des Ablaufwassers wurden routinemäßig gemessen. Alternativ wurden
bei zwei Versuchen abgeteilte Unterstromkästen (in Durchlaufrinnen mit Quellwasser,
Temperatur Ø 8,5°C) verwendet. Koagulierte Eier in den Einheiten wurden mindestens
4-mal pro Woche abgelesen und deren Anzahl notiert. Teilweise wurden diese fixiert
(Roti Histofix pH 7,5, Roth) oder nach Klärung mittels 0,9% NaCl-Lösung deren
Befruchtungsgrad festgestellt. Bei Erreichen des Augenpunktstadiums wurden sich
nicht entwickelnde bzw. unbefruchtete Eier gezählt und entfernt. Hauptzielgröße
waren in den jeweiligen Versuchen entweder die BR oder die SR. Nach 13-20 Tagen
erfolgte daher bei manchen Einheiten die Ermittlung der BR mittels Auswertung
anhand sichtbarer embryonaler Entwicklungsstadien. Bei solchen Ansätzen, bei denen
die Rate der gesamten Entwicklung von Interesse war, wurden die Gelege bis zum
Schlupf in den Einheiten belassen und die Zahl der geschlüpften Brütlinge ausgezählt.
Beim Schlupf verendete Brütlinge wurden als Verlust gewertet.
21
Abb. 3. Experimentelle Einzelerbrütung in Unterstromeinheiten. Konstruktion der Erbrütungseinheiten
(Material Plexiglas). Eier liegen dem Lochgitter auf und werden von unten mit Wasser durchspült. Alle
Größenangaben in mm.
22
2.3
Färbeversuche
Um eine möglichst frühe und einfache Erfassung der BR innerhalb der ersten 10 Tage
nach dem Streifen in der Praxis zu ermöglichen wäre es sinnvoll, möglichst frühe
Entwicklungsstadien befruchteter Eier selektiv anzufärben, da diese durch die opake
Eihülle und bedingt durch die Größe der Salmonideneier auf den Lipideinschlüssen
nur sehr schwierig erkennbar sind. Daher erfolgten Tests mit verschiedenen
Farbstoffen, bei denen Aussicht auf eine solche diskriminative Anfärbung bestand.
Verwendet wurden die Farbstoffe (der Firmen Omikron, Roth und Sigma):
Acridinorange (Fluoreszenzfarbstoff, färbt DNA und saure Kompartimente)
Alcianblau AB-8 (kationischer Farbstoff für Zuckerstrukturen)
Neutralrot (Phenazin-Farbstoff, der sich in Zellen anreichert)
Methylgrün (DNA-Farbstoff, zytologisches Mittel zur Kernfärbung)
Nilblau (Fluoreszenzfarbstoff, Farbumschlag in saurem Milieu)
Patentblau V (Lebensmittelfarbstoff, färbt Kohlenhydrate)
Cochenillerot A (E 124, synthetischer Lebensmittelfarbstoff)
Hoechst 33342 (Bisbenzimide, Fluoreszenzfarbstoff, färbt DNA)
Bouin`sche Lösung (Fixiergemisch mit Pikrinsäure, alkoholisch)
Fluoreszenzfarbstoffe sollten auf einem breitbandig ausgelegten UV-Durchlichttisch
(NU 72, Benda Wiesloch) oder einer gängigen UV-Handlampe (Camag Typ 29230)
detektiert werden, da andere Fluoreszenzanwendungen in der Praxis einen zu hohen
apparativen Aufwand bedeuten würden. Fluoreszenzgefärbte Eier wurden unter
Vermeidung von Lichteinfluss gehandhabt, die Detektion bei den geforderten
Wellenlängenbereichen wurde durch wechselnde Röhrenbestückung erreicht. Als
Positivkontrollen zur Fluoreszenzfärbung dienten in Wasserproben vorhandene
Kleinstorganismen. Des Weiteren wurde zur Klärung der Eihülle und Koagulierung
sich entwickelnder Zellen bzw. des Integuments der Embryonen 8%ige Essigsäure als
Indikator verwendet und bisweilen mit Farbstoffen kombiniert. Je nach Farbstoff
wurden verschiedene Verdünnungen verwendet (10 µg/ml bis gesättigte Lösung) und
unterschiedlich lange inkubiert (10 min bis 3 h). Gewaschen wurde jeweils 4 x 30 min
bis übernacht mit Eipuffer (10x Stammlösung 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM
Na2HPO4(x2H2O), 1,7 mM KH2PO4) oder 0,9% NaCl (zur Vermeidung von
23
Präzipitation durch Phosphat) um unspezifische Färbung zu unterbinden. Falls für die
einzelnen Farbstoffe nötig, wurde der pH-Wert mit 0,1 M HCl oder 0,01 M NaOH
eingestellt. Als Proben wurden v.a. native, Essigsäure-behandelte (Inkubation in 8%
Essigsäure für 10-20 min) und Formalin-fixierte S. namaycush- und S. fontinalis-Eier
(4,5% in PBS, z.T. dechorionisiert) bis zu einem Zeitpunkt von 30 Tagen nach der
Befruchtung verwendet. Ebenso wurden vorab koagulierte, mit 0,9% NaCl geklärte
Eier untersucht, als Kontrollen fungierten unbefruchtete Chargen gleichen Alters.
2.4
Spermaqualität
Die Spermaqualität ist sicher einer der am intuitiv wichtigsten Faktoren während des
Befruchtungsgeschehens.
Spermien
wurden
auch
während
des
regulären
(betrieblichen) Arbeitsablaufs beim Streifen zum Teil auf deren Aktivierbarkeit hin
überprüft, da diese bei Milchnern außerhalb der Kernlaichzeit stark schwanken kann.
Die Analyse des pH-Werts verschiedener Seminalplasma-Proben geschah wie unter
2.7.1 angegeben.
Daten aus der unter 2.2.1 beschriebenen Messung der Spermienkonzentration
wurden von Milchnern aller behandelten Spezies zusammengetragen, auf die
Konzentration im nativen Ejakulat rückgerechnet, und deskriptiv analysiert. Die
Entnahme erfolgte stets zur Hauptlaichzeit, die Ejakulate von Milchnern mit sehr
geringer Menge oder sichtbar schwach konzentrierter Milch finden in der Regel keine
Verwendung
bei
der
künstlichen
Befruchtung
und
wurden
deshalb
nicht
miteinbezogen.
Spermaproben aller Arten wurden fixiert (Roti Histofix) und mikroskopisch auf
eventuell auffällige morphologische Aberrationen hin untersucht. Für die digitalen
Aufnahmen wurde sowohl Phasenkontrastoptik als auch Nomarski-Interferenz
Filteroptik bei 1000-facher Vergrößerung unter Ölimmersion angewendet.
24
2.4.3 Motilitätsanalyse
Die Schwimmleistung von Salmonidenspermien ist angesichts der kurzen Aktivitätszeit
einer der wichtigsten Faktoren bei der Qualitäts-Beurteilung von Spermienchargen.
Die entscheidenden Parameter sind hierbei die Dauer der Bewegungen unter
optimalen Bedingungen und die Anzahl aktivierbarer Spermien in dem betreffenden
Ejakulat. Hierzu wurden Milchnern der untersuchten Arten Proben entnommen,
welche nach entsprechender Verdünnung mit Inhibierungslösung für die Versuche zur
Verfügung standen.
Schwimmdauer
Zur Ermittlung der Schwimmdauer dienten einerseits Filmaufnahmen (aufgenommen
mit den unter 2.2.1 beschriebenen Geräten), zum anderen wurde die Zeit von der
Aktivierung bis zum Abfall der Zahl schwimmender Individuen im Mikroskop direkt
gemessen (3 x pro Milchner). Dabei wurden 0,6 µl Ejakulat auf einen Objektträger
gegeben Durch einmaliges Auf- und Abpipettieren wurden 50 µl Aktivierungslösung
mit den Spermien vermengt und die Probe mit einem Deckglas (24 x 24 mm)
abgedeckt. Alle Lösungen und Proben waren eisgekühlt, die Messung fand bei einer
Temperatur von 15-17°C statt. Die Filme (Format .avi, 640x480 dpi, Startpunkt
zeitgleich mit der Aktivierung) wurden später ebenfalls visuell ausgewertet, indem das
Zeitintervall von der Aktivierung bis zum Abfall der Aktivität unter 10% gemessen
wurde.
Anteil motiler Spermien
Als Grundlage für die Messung des Anteils aktiver Spermien wurden zeitgleich mit der
Aktivierung beginnende Filmsequenzen verwendet. Eisgekühlte Spermienproben (5 µl
Ejakulat) wurden zu 750 µl Aktivierungslösung in ein 2 ml Zentrifugenröhrchen
pipettiert (Zeitnahme), dieses 3 x geschüttelt, und danach in einer Makler SpermienZählkammer sofort wie bereits beschrieben gefilmt (Mikroskop Olympus BH-1,
Vergrößerung 200x, ohne Verwendung von Phasenkontrastoptik). Sequenzen von 5 s
bis 15 s nach der Aktivierung wurden angefertigt, binarisiert und dienten der
25
Auswertung durch das CASA Plugin der Software ImageJ (Java) nach Wilson-Leedy &
Ingermann (2006) via eines Makros mit folgenden Grundparametern:
run("CASA ", "a,=2 b,=40 c,=20 d,=2000 e,=5 f,=5 g,=5 h,=1 i,=99 j,=99 k,=2 l,=2
m,=80 n,=80.000000000 o,=50.000000000 p,=60.000000000 q,=6.8 r,=128 s,=0
t,=0");
Die Werte wurden falls nötig geringfügig angepasst um Hintergrund zu beseitigen oder
Lichtverhältnisse auszugleichen. Pro Milchner erfolgten 3 Messungen, je 6 Milchner
von BF (Herkunft Aufseß, A), BF (Herkunft Salgen, S) und BS wurden verwendet. Alle
Vergleichsmessungen erfolgten am selben Tag unter gleichen Bedingungen. Reife
Tiere der anderen Herkünfte standen zu diesem Zeitpunkt leider nicht zur Verfügung.
2.5
Eiqualität
2.5.1 Visuelle Beurteilung
Eiproben aus den Versuchen (sowohl „weiße“, also koagulierte, als auch intakte)
wurden während der Erbrütung entnommen und auf deren Befruchtungserfolg hin
analysiert. Klärung des ausgefallenen Globulins wurde durch Verbringen in 0,9% NaCl
für 30-45 min erreicht. Zur Klärung opaker Eihüllen und Kontrastierung von der
Dottermembran aufsitzenden Entwicklungsstadien wurde 8%ige Essigsäure (in VEWasser) verwandt. Es erfolgte zudem die Formalinfixierung von Proben zum Zwecke
der Aufbewahrung für spätere Analysen (Roti Histofix).
2.5.2 Histologie
Stellvertretend für alle Arten wurden BS-Eier aus Bruteinheiten mit hohen und solchen
mit niedrigen Verlusten (aus Versuch 2.6.7) nach 8 Tagen für die Histologie
entnommen, um eventuelle ultrastrukturelle Unterschiede zu erkennen. Für die
Histologie verwendet wurde ein Fixans aus 2% Paraformaldehyd und 1%
Glutaraldehyd in Eipuffer. Die Proben wurden 48 h nach der Fixierung mit Eipuffer
gewaschen, entwässert und in Paraffin eingebettet (Tissue-Tek VIP, Sakura Bayer
26
Diagnostics). Die Schnitte mit einer Dicke von 3-4 µm (1140 Autocut, Reichert-Jung)
wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Für die Kunststoffeinbettung wurden die
gewaschenen Proben mit 1%igem Osmiumtetroxid nachfixiert, erneut gewaschen und
über eine aufsteigende Acetonreihe entwässert. Die Einbettung erfolgte in Epon-Harz.
Semidünnschnitte wurden mit einem Reichert-Jung Ultracut Mikrotom geschnitten und
mit Toluidinblau gefärbt.
2.5.3 Befruchtungsraten und Eientwicklung
Generell wurde zu verschiedenen Zeitpunkten anhand von Proben aus den regulären
Erbrütungschargen und den Versuchen unter 2.6.7 die BR der Eier festgestellt. Dies
geschah durch Sortierung auf dem Durchlichttisch oder unter der Stereolupe
frühestens um den Zeitpunkt der Gastrulation (vor Schluss des Blastoporus) ab dem
8. bis 10. Tag der Erbrütung (je nach Art und Temperatur).
2.6
Befruchtungs- und Erbrütungsversuche
Sofern nicht anders vermerkt folgten alle Versuche dem unter 2.2 beschriebenen
Protokoll zur Gametengewinnung, Befruchtung und Erbrütung. Angaben zum
Vergleich von BR oder SR befinden sich im jeweiligen Ergebnisteil.
In diesem Versuch wurden mittels Gameten von SS verschiedene gebräuchliche
Befruchtungstechniken verglichen. Verwendet wurden 6 SS-Rogner und je 20 µl
Sperma-Mix von 3 Milchnern. Die Spermienmenge pro Ei wurde in diesem Fall nicht
durch Abzählen vorher festgelegt, da dies mit nativem Ejakulat nicht möglich ist. Die
im Nachhinein ermittelte Spermienkonzentration betrug 684 700 pro Ei. Die erste
Methode (M1) war die unter 2.2.2 beschriebene („trockene“) Methode unter
Verwendung
von
Aktivierungs-
und
Inaktivierungslösungen
(mit
angepassten
Mengenverhältnissen), welche in diesem Projekt routinemäßig angewendet wurde.
Die zweite Methode (M2) orientierte sich an derjenigen die im großen Maßstab im
Betrieb angewendet wird. Das Sperma wurde als natives Ejakulat auf die Eier
gegeben (ohne Ovarialflüssigkeit) und nach 5 s mit diesen vermengt. Daraufhin wurde
27
mit 18 ml Wasser aufgegossen und diese Mischung bis zum Quellen stehen gelassen.
Bei Methode 3 (M3) wurden die Eier unter Ovarialplasma (8 ml Mix zu gleichen Teilen
von den 6 Rognern) mit ebenfalls nativem Ejakulat befruchtet. Nach Spermienzugabe
wurde die Mixtur durch Schwenken gut vermengt und nach 30 min mit 10 ml Wasser
aufgefüllt. Danach wurden alle Ansätze behandelt wie bereits beschrieben.
2.6.2 Reproduzierbarkeit
Um die in den folgenden Versuchen angewandte Befruchtungsmethode (siehe 2.2.2)
auf ihre Reproduzierbarkeit und inerte Schwankungsbreite hin zu testen, wurde mit
identischen Spermien- und Eialiquots in mehreren Versuchen nach der beschriebenen
Methode wiederholt verfahren. Die Tests erfolgten mit Gameten von nur einem SSRogner und einem SS-Milchner (Alter 4 Jahre).
Einige
Autoren
beschrieben
als
ein
signifikantes
Qualitätsmerkmal
von
Salmonideneiern die Zunahme des Gewichts nach dem Quellen in Wasser (siehe
Einleitung). Stärkere Gewichtszunahme korreliert laut deren Aussage mit der SR. Im
Zuge des unter 2.6.11 beschriebenen Versuchs (Spermienkonkurrenz) wurden
deshalb aus zur Befruchtung stehenden SS-Eichargen Proben (je 10 Stck. pro
Rogner) genommen und auf einer Feinwaage gewogen, was 18 h nach der
Befruchtung wiederholt wurde.
Die Frage ob die Befruchtungsfähigkeit frisch gestreifter Salmonideneier angesichts
der Problematik selbst bei Einzelrognern schwankt, die Eier Auffälligkeiten aufweisen
oder nach visuell erfassbaren Qualitätskriterien beurteilt werden können sollte im
Rahmen des Projektes ebenfalls diskutiert werden. Nach Greenberg (1960) sollten
z.B. nur die ersten, leicht entnehmbaren Eier zur Befruchtung verwendet werden.
Nach der üblichen Methode wurden während des Streifens Eier von einzelnen BSRognern in zuerst und zuletzt entnommene aufgeteilt. Dies gibt Aufschluss darüber,
ob die cranial in der Bauchhöhle gelegenen Gameten andere SR aufweisen als die
28
caudal gelegenen. Andere Tests wurden im Rahmen des regulären Brutbetriebs
durchgeführt. Neben der unter 2.1.3 beschriebenen Methodik wurde während des
Abstreifens dazu übergegangen, Eier von Rognern mit Anzeichen von Überreife
rigoros auszusortieren. Gestreifter Rogen wurde auf dem Durchlichttisch auf kleinste
Anzeichen für Überreife (granuläre Einschlüsse, inhomogene Verteilung der Proteinund Lipidvesikel), Verunreinigungen (Kot, Blut, Eischalen) und Beschädigungen
(geplatzte Eier) hin überprüft. Dabei waren z.T. nur einige wenige solcher Eier in den
betreffenden Gelegen enthalten. Die jeweils aussortierten Portionen wurden simultan
mit denselben Spermien (-mengen) befruchtet und getrennt aufgelegt. Die so
gewonnenen Beobachtungen entsprechen nicht wissenschaftlich auswertbaren
Versuchen, sie dienten lediglich als Vorversuch bzw. der Überprüfung von praktischen
Aspekten.
2.6.5 Einfluss der Betäubung
Da sämtliche Laichfische routinemäßig kurz vor dem Streifen mit MS-222 betäubt
wurden, einige Fischzüchter demgegenüber jedoch Vorbehalte haben, wurde der
Einfluss der Betäubung auf den Befruchtungserfolg getestet. Von 2 Gruppen aus je 6
Rognern und 3 Milchnern (Spermamix) von BS wurde eine ohne Betäubung gestreift.
Ansonsten wurde nach der üblichen Methode verfahren.
Speziell SS zeigen was Ihre Reproduktion angeht am wenigsten Temperaturtoleranz
(siehe Diskussion 4.1.6). Ein Versuch zur Erbrütung der Eier dieser Fischart wurde
bereits an der Lehranstalt in Aufseß durchgeführt, zeigte jedoch bei niedrigeren
Temperaturen keine signifikante Erhöhung der SR. Hier wurde geprüft, ob den
schlechten BR evtl. durch die Temperatur bei der Befruchtung zu begegnen ist. Es
wurden Eier von SS (Eimix aus 8 Rognern) bei einer der Jahreszeit entsprechenden
Wassertemperatur von 8,4°C mit gleich temperiertem Wasser und zuvor kaltgestellte
Eier (0,8°C) mit 3,6°C kühlem Wasser (anstatt Aktivierungslösung) befruchtet. Die
Lufttemperatur betrug zur SS-Laichzeit 10°C. Befruchtet wurde mit einem Spermamix
aus nativem Ejakulat von 5 Milchnern (Konzentration betrug 227 000 Spermien pro
Ei),
da
hier
nicht
mit
Inaktivierungslösungen
bzw.
Aktivierungslösungen
29
gearbeitet werden konnte. Die Spermienproben waren genauso temperiert wie die
Eier. Alles Weitere entsprach der sonst angewendeten Methode.
Um die Variationsbreite der Fertilität der untersuchten Fischpopulation näher zu
beleuchten, ist es nötig die Reproduktionsleistung der Einzeltiere zu erfassen. Dies
wurde mit zwei der beteiligten Fischarten durchgeführt. Der Ansatz sollte helfen, im
direkten
Vergleich
die
Unterschiede
zwischen
den
einzelnen
Laichfischen
aufzuzeigen, und den Einfluss der maternalen und paternalen Seite auf die Fertilität zu
messen.
Zunächst wurden Eier von 10 BS-Rognern in der üblichen Weise mit einem
Spermienmix (3 Milchner) befruchtet um die Variationsbreite bei den Versuchen
einschätzen zu können und einen Vergleich zu den Zahlen aus den diversen
Befruchtungsexperimenten zu erhalten. Zum einen wurde dann die BR der Eiproben
von 12 verschiedenen SS-Rognern durch Befruchtung mit Spermien von nur einem
Milchner gemessen. Des Weiteren wurde analog mit Eiproben von 13 BS verfahren,
sowie umgekehrt Eier eines Rogners aufgeteilt und jeweils mit Milch von 16
verschiedenen Milchnern befruchtet. Die Ansätze des ersten Teils (verschiedene BSRogner) wurden jeweils in 3-facher Menge ausgeführt. Grund hierfür war einerseits die
Ermittlung der BR durch Entnahme von 50 Eiern je Ansatz 13 Tage nach der
Befruchtung, andererseits die Entnahme von Proben (20 Eier aus einigen Ansätzen)
für die histologische Untersuchung (2.5.2). Daneben folgte eine Gruppe, bei der das
durchschnittliche Ergebnis der verwendeten Gameten geprüft werden sollte. Dazu
wurden 6 Ansätze mit je 10 Eiern aller verwendeten Rogner mit einem Spermienmix
von 6 Milchnern befruchtet (Mengen wurden entsprechend angepasst). Außerdem
wurden bei diesem Versuch Messungen sowohl von Seminalplasma als auch dem
Ovarialplasma-pH und -Osmolalität der Einzeltiere vorgenommen. Ziel war hier,
eventuell vorhandene Korrelationen dieser Parameter mit der SR aufzudecken.
Letzteres
könnte
Rückschlüsse
über
verschiedene
Reifegrade
oder
physiologischen Zustand der Laichtiere erlauben.
30
den
Seit
langem ist
bekannt,
das
Laichfische
verschiedenen
Alters
z.T.
sehr
unterschiedliche Fertilität zeigen können. Im Allgemeinen wird davon ausgegangen,
dass sog. Erstlaicher schlechtere Ergebnisse erzielen als ältere Laichfische. Um dies
zu bestätigen, und das Vorhandensein wie den Grad einer solchen Fertilitätsreduktion
in der vorliegenden Population zu analysieren, wurden die SR von 2 und 3 Jahre alten
BS nach der Standardmethode miteinander verglichen.
2.6.9 Futter
Es konnte in der Vergangenheit gezeigt werden, dass Regenbogenforellen unter
Mangelernährung wesentliche Defizite bei der Bildung funktionierender Keimzellen
aufweisen können (siehe Einleitung). Solche und ähnliche Defizite sollten durch
kontrollierte Langzeitgabe verschiedener Nahrungsergänzungsstoffe an einem Teil
der Laichfische zusätzlich überprüft werden. Generell sollte durch die Futterversuche
in dieser Untersuchung geklärt werden, ob die Fütterung die Rate an sich
entwickelnden Eiern beeinflusst.
Versuche mit Zebrabärblingen
Um schnellere Ergebnisse zu erhalten, als das mit Salmoniden möglich ist, wurden
zunächst Versuche mit Zebrabärblingen durchgeführt. Diese legen täglich eine
Vielzahl durchsichtiger Eier, welche sich zudem äußerst schnell entwickeln. Dies
ermöglicht die Durchführung mehrerer Durchgänge in vergleichsweise kurzer Zeit und
die Beobachtungen der im Ei stattfindenden Prozesse.
Im ersten Versuchsdurchgang sollte der Einfluss der Fütterung von normalem Futter
getestet werden, welches in der Forellenmast verwendet wird. Die Tiere wurden in 2
Gruppen von je 45 Fischen aufgeteilt und in innengefilterten Becken (30 l) bei 28°C
unter 24 h-Lichtrhythmus gehalten. Die Becken wurden 2x pro Woche gereinigt unter
Teilwasserwechsel mit 1/3 VE. Zusätzlich wurde ein mineralischer Ammoniakentferner
(AquaClear 50 AM RID), sowie ein Huminsäurepräparat (Hobby) zur Stimulanz
verwendet. Das Zierfisch-Flockenfutter TetraMin (Tetra) diente als Basis der Fische im
31
Kontrollbecken, zusätzlich wurden wöchentlich 2x gefrorene Drosophila verabreicht.
Die
Tiere im Testbecken
erhielten
nur
das
Testfutter
(MF
=
Mastfutter,
Zusammensetzung in Anhang A). Beide Gruppen wurden so 14 Tage gehalten, dann
erfolgte die erste Eientnahme. Ein herausnehmbares Gitter am Boden sowie
versenkte Laichkästen dienten dazu die Eier zu sammeln und vor Fraß zu schützen.
Die Eier wurden aus den Laichkästen oder per Schlauch vom Boden gesammelt, je
nach Menge wurden 45-80 Stück (pro Gruppe, stets gleiche Menge beider Gruppen)
in eine Petrischale mit 45 ml Aquarienwasser verbracht und nach 24 h Erbrüten bei
ca. 25°C ausgewertet. Es wurden abgestorbene und intakte Eier notiert. Nach
Umstellung der Fütterung im Testbecken zurück auf normales Futter wurde ebenfalls
getestet ob ein gefundener Effekt reversibel ist. Um zu überprüfen, ob im Futter
wasserlösliche Stoffe enthalten sind, welche sich nachteilig auf die Eientwicklung
auswirken, wurde 1 g des Futters zermahlen, in 100 ml Aquarienwasser gelöst und
durch einen Papierfilter gegeben. Als Kontrolle wurde dieselbe Menge Flockenfutter
ebenfalls in Wasser gelöst. In 4 Durchgängen wurden daraufhin Eier (ab dem 4-ZellStadium) in diesen Lösungen 24 h bebrütet. Im zweiten Versuchsdurchgang (neue
Fischpopulation) wurde wie beschrieben verfahren, nur dass das Testfutter in diesem
Fall aus modernem Laichfischfutter für Salmoniden bestand (LFF = Laichfischfutter,
Zusammensetzung in Anhang B).
Versuche mit Salmoniden
Die Hypothese, dass die Fütterung auch den Fertilisationserfolg von Salmoniden
beeinflusst, sollte anhand eines einfachen Experiments überprüft werden. Man geht
hierbei davon aus, dass das Verabreichen künstlich hergestellten Extrudatfutters die
Produktion qualitativ hochwertiger Gameten negativ beeinflussen könnte. Daher
wurde in zwei benachbarten Alu-Tiefbecken (Tiefe 1,30 m, Volumen 4,68 m3) einem
Teil einer Bachsaiblingspopulation (Alter 3 Jahre) natürliches Futter, einem zweiten
handelsübliches Laichfischfutter (Inhaltsstoffe in Anhang A) 9 Monate bis zur Beginn
der Laichperiode verabreicht. Eine dritte Gruppe erhielt eine 25:75 Mischung
(Trockenfutter: Naturfutter, w/w) beider Futter. Das Naturfutter bestand aus einer
Mischung aus 50% zerkleinertem Weißfisch (gefroren), 25% Schweine- und
Rinderleber, 25% getrockneten Bachflohkrebsen, getrockneten Garnelen und
Trockenfisch (Rebie). Die Mischung wurde frisch zubereitet und gut vermengt.
32
Gefüttert wurde ad libidum von Hand, ab August erfolgte nur noch Fütterung der
halben Menge.
Um den Effekt unterschiedlicher Spermienkonzentrationen auf den Befruchtungserfolg
zu untersuchen, wurde ein Eimix von 20 BS-Rognern in Portionen zu 100 Stück
aufgeteilt. Je 4 der Aliquots wurden mit 6000, 60 000, 600 000 Spermien (von 3
Milchnern) pro Ei, sowie mit einer hohen Überkonzentration (3 x 1 ml Ejakulat
verdünnt in 15 ml Inaktivierungslösung, 200 µl pro Ansatz) befruchtet. Aufgelegt
wurden diese Eier in einer Rinne in abgeteilten Unterstromkästen.
Einige Autoren sind der Ansicht, dass bei Wirbeltieren möglicherweise nur wenige
Spermien befruchtungsfähig sind (Baker & Bellis 1988, Parker 1990). Die Mehrzahl
der Spermien soll demnach die Spermien anderer Individuen inaktivieren. Daher
sollte aus praktischer Sicht überprüft werden, ob sich die Befruchtung einer Eicharge
mit mehreren Milchnern nachteilig auf den Befruchtungserfolg auswirkt. Um solche
Effekte zu überprüfen, und auch um individuelle Fertilitätsunterschiede zu
untersuchen wurden die Eier mehrerer Rogner aufgeteilt und die einzelnen
Stichproben mit Spermien einer verschiedenen Zahl an Milchnern besamt. Dazu
wurden je 100 Eier von 6 SS-Rognern mit der gleichen Menge Spermien von 1, 3 und
6 Milchnern befruchtet, wobei die Gameten jedes zusätzlichen Milchners zu gleicher
Zahl in den jeweiligen Spermienmix mit eingingen. Ausgewertet wurde hier die BR
nach 13 Tagen Erbrütung.
Gestresste Laichfische liefern laut mancher Aussagen schlechtere Keimzellen (siehe
Diskussion). Daher war vorgesehen, die SR von länger separat gehaltenen
Laichfischen
mit
denen
aus
der
normalen
Haltung
zu
vergleichen.
Die
Versuchsgruppen wurden anstatt in den Laichfischteichen in Alu-Tiefbecken gehalten
(siehe 2.6.9), wobei eines 3-4x pro Woche zu Reinigungszwecken abgelassen werden
33
musste. Die Fische (BS) waren während der Prozedur von ca. 6-7 min nur noch knapp
mit Wasser bedeckt. Dadurch waren die Fische der Testgruppe Tiere über einen
Zeitraum von 8 Monaten einem höheren Stress als die Kontrollgruppe ausgesetzt. Die
Versuchsdurchführung war sonst analog der Standardmethode.
2.6.13 Wasser
Es gab Spekulationen, ob sich im Quellwasser evtl. Substanzen befinden könnten,
welche sich negativ auf die Eientwicklung auswirken könnten. Neben der
toxikologischen Analyse von Eiproben (2.8.3) wurden deshalb Eier von einzelnen BSRognern nach der Befruchtung in 2 gleich große Portionen aufgeteilt und getrennt
aufgelegt. Eine Gruppe wurde unter Quellwasser erbrütet, die andere unter
Leitungswasser, da dies weitgehend frei von erhöhten Werten toxischer Substanzen
sein sollte. Das Leitungswasser stammte aus kupferfreien Leitungen und wurde
ähnlich dem Quellwasser über eine Sprinklerdüse und eine dahinter geschaltete
Rieselanlage gut belüftet.
In Fischbeständen aus Aquakultur treten nicht selten durch unvermeidliche Inzucht
Fruchtbarkeits- oder Entwicklungsprobleme auf. Um diesen Effekt im vorliegenden
Fall zu erkennen, wurden sowohl BF-Rogner als auch BF-Milchner anderer Herkunft
(siehe genetische Analyse unter 2.7.4) in den Versuchen verwendet, welche keine
bekannten Probleme bei der Erbrütung aufwiesen. Diese Verfahren sollten, wenn
Inzucht
eine
Rolle
spielt,
erheblich
geringere
Erbrütungsverluste
durch
Heterosiseffekte zur Folge haben. Die Aussage der Ergebnisse, namentlich der
Bruterfolg (SR), hat demnach durchaus allgemeingültigen Charakter und kann m. E.
auf die durch Satzfische geprägte Fauna freier Gewässer übertragen werden. In
diesem Zusammenhang konnte zusätzlich wieder der maternale Einfluss auf den
Befruchtungs-
und
Entwicklungserfolg
mit
beleuchtet
werden,
da
Kreuzhybridisierungen stattfanden.
BF der Fischzucht Keidel wurden kurz vor Beginn der Ovulationsphase nach Aufseß
transportiert und dort in Hälterungsbecken verwahrt. In einem ersten Versuch wurden
BF der Herkunft Aufseß (A) mit den BF der Fischzucht Keidel (K) gekreuzt, wobei
34
jeweils Spermien und Eier der anderen Herkunft verwendet wurden. Beide Herkünfte
wurden auch untereinander gekreuzt, um etwaige Heterosiseffekte sichtbar zu
machen. Alle Eiproben wurden am selben Tag nach der Standardmethode befruchtet.
Leider konnten im Falle der A-Rogner nur 6, im Falle der K-Tiere nur 5 Paarungen
durchgeführt werden, da gleichaltrige Fische verwendet werden mussten und nicht
mehr geeignete Tiere zur Verfügung standen. Daraufhin wurde derselbe Versuch
nochmals durchgeführt, wobei diesmal direkt in der benachbarten Aufseß gefangene
Fische (Aw) verwendet wurden. Dort wird seit vielen Jahren mit dem A-Zuchtstamm
besetzt und die Tiere wurden regelmäßig zum Zwecke der Vermehrung und
Satzfischproduktion entnommen und eingekreuzt. Dabei wurde darauf geachtet, die
Verwendung von Erstlaichern zu vermeiden. Als letztes wurden Fische der dritten
Herkunft „Salgen“ (S) eingeführt und im selben Verfahren mit den Aw-Tieren
gekreuzt.
2.7
Physikalische Messgrößen
2.7.1 Wasserparameter
Die Messungen von Sauerstoffsättigung, SBV und pH und CO2 auf der Anlage zu 4
Terminen wurde von Herrn Kuhlen von der Fischereifachberatung Oberfranken mit
den FFB-eigenen Geräten vorgenommen.
Temperatur
Zur Verwendung kam ein Feinthermometer (Typ Impac Tastotherm MP 2001), mit
welchem während der gesamten Zeit der Erbrütung die Wassertemperatur der
Bruteinheiten gemessen wurde.
pH-Wert
Der pH-Wert des Wassers spielt eine große Rolle bei der Befruchtung und Erbrütung.
Zur Messung verwendet wurde eine Einstabmesskette (Ingold Elektrode, Knick Typ
511), die täglich geeicht wurde. Wasserproben wurden vor der Messung 15 min
abstehen lassen (außer bei den Messungen im Teich).
35
Härtegrad
Die Wasserhärte ist ein wichtiger Parameter für die physiologischen Bedingungen
denen die Fische und Eier ausgesetzt sind. Die Messung der Karbonathärte wurde
vorgenommen mit einem Kit der Fa. Merck. Die Gesamthärte konnte mit
Schnellteststreifen (Aquadur) und dem Titrations-Messbesteck der Fa. Roth ermittelt
werden. Der SBV-Wert (wie auch Sättigungswerte an O2 und CO2) wurde seitens der
Fischereifachberatung Oberfranken elektrometrisch routinemäßig gemessen.
Leitfähigkeit
Werte für Leitfähigkeit wurden gemessen mit einem Hanna Instruments TDS DiST 5Handmessgerät nach 10-minütiger Temperaturanpassung an die jeweilige Lösung.
Die Temperaturkompensation der Messung erfolgte automatisch.
2.7.2 Ovarial- und Seminalplasma
pH-Wert
PH-Werte von Ovarial- und Seminalplasmaproben wurden mit den unter 2.7.1
genannten Geräten ermittelt. Letztere wurden vor der Messung bei 2600g für 5 min
bei RT abzentrifugiert, woraufhin sofort im Überstand gemessen wurde. Bei mehreren
SS-Rognern wurde der pH im Ovarialplasma zur Ovulation gemessen und dies nach
17 Tagen wiederholt.
Osmolalität
Die Osmolalität von Ovarialplasma-Proben aus dem Versuch 2.6.7 wurde in
Duplikaten mittels eines Gefrierpunkterniedrigungs-Osmometers am Institut für
Entwicklungsbiologie der FAU Erlangen von Frau C. Loy ermittelt (Knauer Typ
Halbmikroosmometer Digital).
36
2.8
Biologische Analysen
2.8.1 Parasitologie
Zur Feststellung parasitärer Belastungen der Laichfische wurden in allen 3
Laichperioden des Projekts Proben von zu schlachtenden Laichfischen auf
Ektoparasiten untersucht. Laichfische aus dem Brutbetrieb und einem Teich mit
Verbindung zur Aufseß wurden nach Homogenisierung von Bindegewebe, Kiemen,
Kopfknorpel und Niere auf Myxozoa-Infektionen untersucht. Ektoparasitäre Infektionen
wurden durch Haut- und Kiemenabstriche mikroskopisch festgestellt und deren
Schweregrad beurteilt. Bauchhöhle, Organe und Darm wurden nach Endoparasiten
abgesucht. Vom Darm wurden zusätzlich Abstriche angefertigt.
Bakterielle Infektionen von Fischen stellen eine im aquatischen Milieu ubiquitäre
Bedrohung dar. Bakteriosen und Viruserkrankungen könnten die Gametogenese der
Fische negativ beeinflussen und Tiere in der Laichzeit stark schwächen oder töten. Da
Viruserkrankungen von Salmoniden auch vertikal weitergegeben werden können, und
hier eine potentielle Beeinträchtigung der Gelege bestand, wurden auch Eiproben auf
das Vorhandensein von IHN, VHS und IPN untersucht. Virologische Untersuchungen
wurden am Bayerischen Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit in
Erlangen, sowie durch den Fischgesundheitsdienst Bayern e.V. durchgeführt.
Bakteriologische Tests wurden von denselben Einrichtungen vorgenommen und
zusätzlich wurden Organe von Laichfischen aus Versuchen an der Klinik für Fische
und Reptilien der LMU München bakteriologisch getestet.
2.8.3 Toxikologie
Toxische oder endokrin wirksame Substanzen aus dem Wasser reichern sich in
Tieren v.a. in stark lipidhaltigen Geweben an, wozu bei Rognern auch die Eier zählen.
Dies kann Schädigungen durch Vergiftung oder Entwicklungsstörungen zur Folge
haben. Die Analyse lipophiler Rückstände anhand einer gemischten Eiprobe von
Bachsaiblingen wurde am Amt für Wasserwirtschaft in München (von Herrn R. Gast)
37
durchgeführt. Hierzu wurden die Proben nach trockenem Verreiben mittels eines nHexan/Aceton-Gemisches und DIONEX ASE extrahiert. Die Analyse geschah per
Gaschromatographie-Massenspektrometrie
(Agilent
Kapillar-GC-MS)
unter
Verwendung der NISTR 2005 Bibliothek und einer institutseigenen Datenbank für
Umweltchemikalien.
2.8.4 Genetische Untersuchung an Bachforellen
Die
Analyse
der
genetischen
Distanz
diente
der
Veranschaulichung
des
Verwandtschaftsgrades der untersuchten BF-Herkünfte. Die deskriptive Analyse gibt
auch Aufschluss über die Homogenität der Populationen, wobei für eine valide
Analyse wesentlich mehr Stichproben notwendig wären. Die Ergebnisse sind jedoch
wichtig, um die Resultate der Kreuzungsversuche besser interpretieren zu können.
Die Berechnung von Inzuchtfaktoren und dem Heterozygotiegrad war ebenfalls
möglich. Als Proben für die Mikrosatellitenanalyse dienten Finclips von je 12 Rognern
der BF-Herkünfte A, K und S. Die Analyse wurde z.T. am Veterinary Medical
Research Institute der Hungarian Academy of Sciences (Budapest, Ungarn) von Frau
Dr. E. Eszterbauer als Auftragsarbeit durchgeführt. Die angewendete Methodik zur
DNA-Extraktion und Mikrosatelliten-PCR Amplifikation ist dem Anhang (C, D) zu
entnehmen. Als Analysewerkzeuge dienten die Software-Pakete Genepop v. 3.4
(Raymond & Rousset 1995), GenAlEx 6.2 und Arlequin 3.1.
2.9
Chemikalien
Alle verwendeten Chemikalien (exklusive der Farbstoffe) stammten von den Firmen
Sigma, Fluka und Roth.
2.10 Statistische Methoden
Zur deskriptiven und analytischen statistischen Auswertung wurden die Programme
SPSS (11.05), WinStat (2007.1) und GraphPad Prism (5.00) verwendet. Um die
Genauigkeit der Messungen zu erfassen, sind z.T. zusätzliche Größen außer
Standardfehler des Mittelwerts (SEM) oder SD (Standardabweichung) angegeben.
Eine Zufallsvariable mit großem Mittelwert weist im Allgemeinen eine größere Varianz
38
auf als eine mit einem kleinen Mittelwert. Da die Varianz und damit die Wurzel daraus,
die Standardabweichung, nicht normiert sind, kann im Allgemeinen nicht beurteilt
werden, ob eine Varianz groß oder klein ist. Der bisweilen angegebene
Variationskoeffizient ist die relative Standardabweichung. Da ein steigender Mittelwert
oft Hand in Hand mit steigender Standardabweichung geht, erlaubt der relative
Variationskoeffizient direkte Vergleichsmöglichkeiten. Der relative Variationskoeffizient
wird als Prozent des maximal möglichen Wertes berechnet.
In keinen Fällen bestand signifikante Abweichung von der Normalverteilung
(Kolmogorov-Smirnov-Test, bei nicht kontinuierlichen Variablen der Chi-Quadrat-Test
für diskrete Variable), wo diese gefordert war. Für multiple Vergleiche dienten multiple
t-Tests (Tukey, LSD) nach Validierung durch einseitige Varianzanalyse (ANOVA) und
Test auf Homogenität und Varianzgleichheit (Levene-Prozedur, Bartlett-Test). Bei
Vergleichen von nur 2 Gruppen wurde Student`s t-Test gewählt. Als parameterfreier
multipler Test diente der Mann-Whitney-U Test, in Einzelfällen der Dunn`s Test nach
Kruskal-Wallis-Prozedur. Letzerer Rangmitteltest diente der Prüfung ob die Gruppen
einer Grundgesamtheit entstammten, um einen Post-Hoc Vergleich rechtzufertigen.
Gepaarte Stichproben wurden mit dem t-Test für verbundene Stichproben auf
signifikante
Unterschiede
getestet.
Standen
multiple
Datenreihen
gepaarter
Stichproben ohne Normalverteilung oder Varianzgleichheit zur Analyse wurde
zusätzlich zu einzelnen „paired“ t-Tests der Friedman-Test ausgeführt. Zum Nachweis
einer linearen Abhängigkeit wurde Pearson`s Korrelationskoeffizient berechnet. Die
speziellen in der genetischen Analyse verwendeten Tests sind dem Abschnitt 3.7.4 zu
entnehmen.
39
-3. Ergebnisse-
3 Ergebnisse
3.1
Allgemeine Ergebnisse
3.1.1 Versuche und Analysen im normalen Brutbetrieb
Auch im normalen Streif- und Brutgeschehen des Betriebs wurden verschiedene
Untersuchungen durchgeführt, um die Problematik besser zu verstehen. Ein Versuch,
die frisch befruchteten SS-Gelege statt nach 5 min erst nach einer Stunde zu waschen
um die BR zu erhöhen brachte lediglich eine 5% höhere BR. Es wurden weiterhin
regelmäßig Eichargen direkt aus dem Brutbetrieb auf ihre BR hin überprüft. Bei
zahlreichen Untersuchungen der Gelege der 3 Arten konnten viele gemeinsame
Auffälligkeiten festgestellt werden. Hierbei wurde v.a. darauf geachtet, ob die
Entwicklung erkennbar zu einem früheren Zeitpunkt gestoppt hatte und die Eier
daraufhin abstarben.
Typische SR der untersuchten Arten waren z.B.: BF (Herkunft Aw): 39,7%, SS: 37,0%,
BS: 29,8%. Massive Verluste (bis zu 98,3%) erlitten BF des Aufsesser Zuchtstamms
aus dem Betrieb bereits während der Brutphase in den Jahren 2006 und 2007. BF der
Herkunft K zeigten hingegen eine sehr niedrige Verlustrate von 14,5% (1,7% bis zum
AP-Stadium). Von 118 untersuchten SS-Eiern (Befruchtung nach der üblichen
„trockenen“ Betriebs-Methode) im AP-Stadium waren am 11.11.08 45,7% nicht
befruchtet, 18,6% zeigten Augenpunkte und 35,6% waren weiß geworden und
enthielten keine erkennbaren Embryonen. Im gleichen Jahr konnten bei einer Charge
SS-Eier lediglich 18,4% befruchtete Eier gezählt werden (212 äußerlich intakte Eier
ausgewertet). Dem gegenüber waren in manchen SS-Chargen über 80% der Eier
befruchtet. Sehr auffällig war jedoch in 2 Laichperioden das massenhafte Absterben
bereits sehr weit entwickelter, beäugter SS-Eier, wobei diese z. T. aufplatzten und
eine typische „Kopfschlüpfer“-Problematik zeigten. Es gab auch vereinzelt Gelege von
Rognern,
die
ausschließlich
als
„Kopfschlüpfer“
verendeten.
Eine
Analyse
maschinenausgelesener, zuvor weiß gewordener Eier (Elsäßer Hybriden im APStadium) zeigte, dass in faktisch keinem dieser Eier erkennbare Anzeichen
enthaltener Embryonen vorhanden waren. Im selben Stadium zeigten von 158 zuvor
weiß gewordenen BS-Eiern gleichen Alters auch lediglich 5 enthaltene Embryonen,
40
-3. Ergebnisse-
von denen sich 2 erst in einem früheren Stadium befanden (ausgebildete
Längsachse). Dies deutet darauf hin, dass die Embryonen bereits zu einem früheren
Zeitpunkt abgestorben waren oder degenerierten. Eine weitere Auswertung von
koagulierten BS-Eiern am 17.12.08 (zum Zeitpunkt des AP-Stadiums) erbrachte eine
Rate von 4,7% an embryonierten Eiern (134 ausgewertet). Diese wenigen Befunde
sind lediglich ein Auszug aus vielen weiteren Ermittlungen der BR bei koagulierten
und intakten Gelegen aus dem regulären Brutbetrieb. Sie waren jedoch repräsentativ
und
zeichnen
trotz
teils
starker
Schwankungen
ein
schlechtes
Bild
der
Befruchtungssituation.
Augenscheinlich gab es aber neben dem Befruchtungsproblem große Defizite bei der
Entwicklung der Embryonen aller untersuchten Arten, denn auch zu späteren
Zeitpunkten waren starke Verluste in befruchteten Eiern offensichtlich (Abb. 4). Diese
starben entweder ab (toter Embryo auf intaktem Dottersack), platzten auf (kein
Schlupfversuch feststellbar wie bei den sog. „Kopfschlüpfern“siehe Abb. 5 A) oder
wurden schlicht weiß, da die Dottermembran beschädigt war. In unterschiedlichem
Maße wurden Missbildungen (bei BF vor allem Probleme bei Ausbildung der
Längsachse,
z.B.
Duplikation
cranialer
wie
abdominaler
Bereiche
oder
Verkrümmungen, siehe Abb. 5 B) und extrem schwache Embryonen (teils lebend, teils
bereits verendet) beobachtet (Abb. 5 D und C & E). Letzteres Phänomen war bei allen
Arten ab dem Augenpunktstadium gut beobachtbar, bei Saiblingen jedoch am
ausgeprägtesten. Die betroffenen Embryonen waren meist spärlich pigmentiert, hatten
dünne Körper und schwach ausgebildete Augen. Sie zeigten oft anastomose
Missbildungen der Blutgefäße und Verkrümmungen der Wirbelsäule. In einigen Fällen
waren in geklärten koagulierten Eiern Embryonen erkennbar, die ebenfalls oft
Missbildungen zeigten (Abb. 5 F). Der Anteil der Fehlentwicklungen am Gesamtverlust
betrug nach verschiedenen Erhebungen zwischen 15 und 30%, ohne die Probleme
beim Schlupf zu berücksichtigen.
41
-3. Ergebnisse-
Abb. 4. A. Massives Absterben von Bachforellen-Gelegen nach Erreichen des Augenpunktstadiums.
B. Bachforellen: Schlupfprobleme und Absterben bereits im Ei. C. Bachsaibling: Aufplatzen der Eier und
Präzipitation der Proteine nach Beschädigung der Dottermembran.
42
-3. Ergebnisse-
Abb. 5. Probleme bei der Erbrütung von Salmoniden in Aufseß. A. Seesaibling: Verkümmerter
Schlüpfer
(links)
und
“Kopfschlüpfer“
(rechts)
B.
Bachsaibling:
Craniale
Mutation
im
Ei
C. & E: Bachsaibling: Normalentwickelte Augenpunktlarven im Ei (C), gleichalte verkümmerte Larven
derselben Population (E). D. Bachsaibling: Direkter Vergleich schwacher (links) und normaler (rechts)
Augenpunktlarven desselben Rogners. F. Bachforelle: Koagulierte abgestorbene Eier nach Klärung in
Salzlösung. Unbefruchtetes Ei (links), befruchtetes Ei mit abgestorbenem Embryo (rechts); in beiden
Fällen ist die Dottermembran kollabiert.
43
-3. Ergebnisse-
3.1.2 Allgemeine Beobachtungen aus Versuchen
Auch hier ist zunächst anzumerken, dass trotz Anwendung einer anderen
Befruchtungsmethode als im normalen Brutbetrieb fehlende Befruchtung und
Entwicklungsstörungen ursächlich für einen großen Teil der mitunter hohen Verluste
zu sein schienen. Bei einem Vorabversuch zur Ermittlung der SR von BS-Paarungen
unter den normalen Versuchsbedingungen (Spermienmix) zeigte sich beispielsweise
eine unerwartet niedrige mittlere SR von lediglich 28,69% ± 4,64 (niedrigste SR
10,87%, höchste SR 49,50%, 10 Stichproben). Der Umstand, dass wie in diesem
Ansatz auch in vielen weiteren Fällen nur SR von unter 50% erzielt werden konnten,
verdeutlicht eindringlich die Problematik. Zudem spiegeln die Daten die hohe
Variabilität des Reproduktionserfolgs zwischen den Tieren wider.
Bei Untersuchungen der koagulierten Eier aus den Versuchen bis zum AP-Stadium
waren zwischen 85 und 96% der abgestorbenen Eier ohne eindeutige Anzeichen für
eine erfolgreiche Befruchtung. In einem Versuch wurden nach Auslese (15 Tage nach
Befruchtung) der unbefruchteten Eier die verbliebenen Befruchteten nach deren
Absterben und Koagulierung daraufhin untersucht, ob die erfolgte Befruchtung bzw.
ein Embryo sichtbar war. Dies war zu 70% nicht der Fall, was bedeutet, dass viele der
bis zum AP-Stadium koagulierten Eier nicht eindeutig als befruchtet oder unbefruchtet
klassifiziert werden können. Daher müssen Daten zur BR von koagulierten Eiern
zunächst als fragwürdig angesehen werden.
3.2
Spermaqualität
Die Spermienkonzentration der behandelten Fischarten bzw. deren Herkünfte ist ein
wichtiger Faktor für die Fekundität der betreffenden Milchner und spiegelt daher direkt
die zu erwartende Befruchtungsleistung der Zuchttiere wider. Im Folgenden seien im
Laufe des Projekts gemessene Spermiendichten von einzelnen Tieren gezeigt und
einer vergleichenden Betrachtung unterzogen. Um die Genauigkeit der Messungen zu
erfassen, sind hierbei zusätzliche Größen angegeben. Der Variationskoeffizient
entspricht der relativen Standardabweichung. Da ein steigender Mittelwert oft Hand in
Hand mit steigender Standardabweichung geht, erlaubt der Variationskoeffizient
44
-3. Ergebnisse-
bessere Vergleichsmöglichkeiten. Alle Daten waren normalverteilt, Unterschiede
zwischen den Gruppen wurden hier jedoch aufgrund fehlender Varianzgleichheit über
nichparametrische
Verfahren
ermittelt.
Beim Vergleich
aller
Gruppen
traten
signifikante Unterschiede auf (P < 0,0001, KW).
Bachforellen (Herkunft A)
Die Spermienkonzentration von BF-Milchnern der Herkunft A ist in Tabelle 1
zusammengefasst. Die Mehrzahl der Milchner liegt demnach bei einem Mittelwert von
gut über einer Mio. Spermien pro 0,1 µl, wobei sich dieser Wert bei Einzeltieren
durchaus um eine Mio. nach oben und unten bewegt. Damit ergab sich eine enorme
Schwankungsbreite (über 2 Mio.), was deutlich anhand der hohen SD des Mittelwerts
ablesbar ist. Der relative Variationskoeffizient (%) der Messungen der Einzeltiere
zeigte gute Genauigkeit der Einzelmessungen.
Bachforellen (Herkunft K)
Die durchweg hohen Spermienkonzentrationen dieser Herkunft unterschieden sich
signifikant von denen der SS, sowie von denen der BS (P = < 0,001, MWU). Aber
auch im Vergleich mit denen der BF der Herkunft A waren sie deutlich höher
angesiedelt (P = 0,07, MWU).
45
-3. Ergebnisse-
Tabelle 1. Absolute Spermienzahlen pro 0,1 µl nativem Ejakulat von einzelnen Bachforellen-Milchnern
(Herkunft Aufseß, Alter 3-4 Jahre). Gezählt in Quadruplikaten unter 500-facher Verdünnung. SEM =
Standardfehler des Mittelwertes, SD = Standardabweichung.
Fisch Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
Mittl. Anzahl
2.131.250
2.040.625
875.000
2.296.875
1.565.625
762.500
1.956.250
1.300.000
1.034.375
1.006.250
1.343.750
1.393.750
1.037.500
1.065.625
2.159.375
1.162.500
2.484.375
668.750
1.015.625
1.865.625
465.625
2.396.875
1.312.500
SEM
79.468
57.367
45.357
62.370
38.316
49.739
105.759
58.852
16.437
18.042
23.105
36.975
28.413
20.010
87.258
43.601
71.512
46.351
36.219
43.113
47.701
68.537
26.517
Analyse
Rel. Var.-Koeff. %
3,73
2,81
5,18
2,72
2,45
6,52
5,41
4,53
1,59
1,79
1,72
2,65
2,74
1,88
4,04
3,75
2,88
6,93
3,57
2,31
10,24
2,86
2,02
Mittelwert
1.449.592
SEM (total)
124.472
SD
596.948
Var.-Koeffizient
0,41
Minimum
465.625
Maximum
2.484.375
Median
1.312.500
Tabelle 2. Absolute Spermienzahlen pro 0,1 µl nativem Ejakulat von Bachforellen-Milchnern (Herkunft
Keidel, 3-4 Jahre). Gezählt in Quadruplikaten unter 500-facher Verdünnung. SEM = Standardfehler des
Mittelwertes, SD = Standardabweichung.
Fisch Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Mittl. Anzahl/µl
1.290.625
1.700.000
1.675.000
2.362.500
2.078.125
2.784.375
2.150.000
1.537.500
1.512.500
1.131.250
1.784.375
1.887.500
SEM
13.858
54.006
149.304
135.976
56.221
111.847
68.655
61.450
58.852
29.092
35.124
43.899
Analyse
Rel. Var.-Koeff. %
1,07
3,18
8,91
5,76
2,71
4,02
3,19
4,00
3,89
2,57
1,97
2,33
Mittelwert
1.824.479
SEM (total)
309.326
SD
464.155
Var.-Koeffizient
0,25
Minimum
1.131.250
Maximum
2.784.375
Median
1.934.375
46
-3. Ergebnisse-
Bachforellen (Herkunft S)
Milchner dieser Herkunft zeigten im Durchschnitt ähnliche Werte wie die der Herkunft
K,
sie
lieferten
sogar
die
höchsten
in
dieser
Untersuchung
gemessenen
Konzentrationswerte an Spermien (Tab. 3). Wie bei Herkunft K hatte kein Milchner
weniger als 1,1 Mio. Spermien pro 100 nl nativem Ejakulat, und fast die Hälfte der
Tiere lag bei Werten über 2 Mio. Dies unterscheidet diese Herkunft (wie auch die BF
Herkunft K) von Milchnern der oberfränkischen Herkunft A, die einen niedrigeren
Durchschnittswert aufweist, und bei der auch Tiere mit weit weniger als 1 Mio.
Spermien/100nl zu finden waren.
Tabelle 3. Absolute Spermienzahlen pro 0,1 µl nativem Ejakulat von Bachforellen-Milchnern (Herkunft
Salgen, 3-4 Jahre). Gezählt in Quadruplikaten unter 500-facher Verdünnung. SEM = Standardfehler des
Fisch Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Mittl. Anzahl
1.887.500
1.150.000
2.093.750
2.406.250
1.415.625
1.484.375
1.937.500
2.012.500
1.556.250
2.162.500
2.246.875
2.256.250
1.553.125
2.393.750
1.931.250
1.678.125
SEM
43.899
20.412
47.462
94.855
105.743
69.480
95.743
36.443
24.206
61.450
44.305
39.693
31.198
82.680
59.183
31.198
Analyse
Rel. Var.-Koeff. %
1,77
2,27
3,94
7,47
4,68
4,94
1,81
1,56
2,84
1,97
1,76
2,01
3,45
3,06
1,86
1,77
Mittelwert
1.885.352
SEM (total)
309.326
SD
376.218
Var.-Koeffizient
0,20
Minimum
1.150.000
Maximum
2.406.250
Median
1.934.375
Bachsaiblinge
Hier schwankten die Werte zwischen den Einzeltieren stark (Tab. 4). Mit knapp 1,2
Mio. als Durchschnittswert blieben die BS hinter den BF zurück. Die Spermiendichte
der Aufsesser BS war signifikant niedriger als die der BF-Herkünfte K und S (P <
47
-3. Ergebnisse-
0,001, MWU), die Spannweite zeigte immense Unterschiede von bis zu 2,1 Mio. pro
100 nl Ejakulat.
Tabelle 4. Absolute Spermienzahlen pro 0,1 µl nativem Ejakulat von Bachsaiblings-Milchnern (3 Jahre).
Gezählt in Quadruplikaten unter 500-facher Verdünnung. SEM = Standardfehler des Mittelwertes, SD =
Standardabweichung.
Fisch Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Mittl. Anzahl
1.256.250
853.125
1.937.500
756.250
1.234.375
1.303.125
862.500
1.109.375
1.531.250
1.359.375
975.000
1.121.875
1.371.875
634.375
828.125
1.050.000
1.303.125
575.000
1.728.125
806.250
946.875
946.875
668.750
1.234.375
2.200.000
1.409.375
2.693.750
SEM
Analyse
Rel. Var.-Koeff. %
42.543
21.271
43.601
49.608
36.219
41.575
55.199
42.197
62.187
46.875
34.233
47.701
82.186
21.875
86.659
26.517
80.262
18.400
61.104
54.127
10.674
64.625
29.092
55.287
13.502
104.00
156.99
3,39
2,49
2,25
6,56
2,93
3,19
6,40
3,80
4,06
3,45
3,51
4,25
5,99
3,45
10,46
2,53
6,16
3,20
3,54
6,71
1,13
0,61
7,38
5,83
6,83
4,35
4,48
Mittelwert
1.210.995
SEM (total)
94.122
SD
489.072
Var.-Koeffizient
0,40
Minimum
575.000
Maximum
2.693.750
Median
1.121.875
Seesaiblinge
Von allen untersuchten Arten wiesen SS mit unter 1 Mio./100nl die geringste mittlere
Spermienkonzentration auf (Tab. 5). Weniger als die Hälfte der Milchner hatte Werte
über 1 Mio. Ein geradezu wässriges Erscheinungsbild des Ejakulats war auch
während der Kernlaichzeit regelmäßig mit bloßem Auge erkennbar und auch die
Menge war oft vergleichsweise niedrig.
48
-3. Ergebnisse-
Tabelle 5. Absolute Spermienzahlen pro 0,1 µl nativem Ejakulat von Seesaiblings-Milchnern (3-5
Jahre). Gezählt in Quadruplikaten unter 500-facher Verdünnung. SEM = Standardfehler des
Fisch Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Mittl. Anzahl
1.078.125
1.031.250
1.190.625
518.750
821.875
1.306.250
1.250.000
1.059.375
846.875
800.000
825.000
953.125
412.500
SEM
78.789
18.750
51.885
41.615
26.208
67.796
47.048
46.034
28.584
7.217
86.150
11.831
29.315
Analyse
Rel. Var.-Koeff. %
7,30
1,81
4,35
8,02
3,18
5,19
3,76
4,34
3,37
0,90
10,44
1,24
7,10
Mittelwert
930.288
SEM (total)
73.589
SD
265.331
Var.-Koeffizient
0,28
Minimum
412.500
Maximum
1.306.250
Median
953.125
Spermien der 3 untersuchten Fischarten wurden routinemäßig fixiert und auf etwaige
morphologische Auffälligkeiten untersucht. Geachtet wurde insbesondere auf Form
und Länge von Kopfstück und Flagellum. In mehreren Untersuchungen konnten keine
abnormen Habitusveränderungen von Kopf und Flagellum beobachtet werden (Abb.
6).
49
-3. Ergebnisse-
Abb. 6. Aufnahmen fixierter Spermien zur morphologischen Beurteilung. Nomarski-Interferenz-Optik. A.
Seesaibling B. Bachsaibling C.& D. Bachforelle Herkunft A. Balken = .10.µm.
3.2.3 Schwimmdauer
Die Dauer der Spermienbewegung ist ein weiteres wichtiges Qualitätskriterium für die
Beurteilung der Befruchtungsfähigkeit des Ejakulats von Milchnern. Hier wurde die
Aktivitätsdauer von mindestens 90% der Spermien von BS und BF visuell gemessen.
BS zeigten dabei Motilitätsphasen von bis zu 50 s nach Aktivierung, kein Tier blieb
dabei unter 30 s (Tab. 6). Die Werte waren beim jeweiligen Milchner in einem
akzeptablen Rahmen reproduzierbar.
50
-3. Ergebnisse-
Tabelle 6. Mikroskopisch ermittelte Aktivitätsdauer (Bewegung bis unter 10% in s) von BachsaiblingsMilchnern (3 Jahre) nach Aktivierung. Gezählt in Triplikaten. SEM = Standardfehler des Mittelwertes;
SD = Standardabweichung.
Fisch Nr.
Mittl. Dauer (s)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
32,54
47,16
46,53
32,37
50,71
47,59
50,38
41,60
45,64
48,06
36,59
39,91
SEM
2,75
2,59
0,20
1,63
3,96
7,61
6,53
1,95
5,19
5,48
8,53
2,34
Rel. Var.-Koeff. (%)
6,38
4,12
0,34
3,81
5,90
12,77
10,08
4,00
9,03
8,55
17,77
5,04
Analyse
Mittelwert
SEM (total)
SD
Var.-Koeffizient
Maximum
Minimum
Median
43,56
5,66
6,54
0,15
50,71
32,37
46,53
Milchner von BF wiesen eine viel deutlichere Variabilität als die BS auf, hatten aber
z.T. auch sehr viel längere Aktivitätsphasen als diese. Dies galt auch für die
Variabilität der Einzelmessungen am selben Tier, was eine genaue Messung
erschwerte (Tab 7, siehe hohe Variationskoeffizienten). Daher erschien hier eine
Angabe der einzelnen gemessenen Maximalwerte (in Klammern) sinnvoll. Deren
Auswertung ergab einen MW von 62,30 s (± 10,05) mit einem Maximum von 142,85 s.
Tabelle 7. Mikroskopisch ermittelte Aktivitätsdauer (Bewegung bis unter 10% in s; Maximalwerte in
Klammern) von Bachforellen-Milchnern (Herkunft Aufseß, 3-4 Jahre) nach Aktivierung. Gezählt in
Triplikaten. n.a. = nicht aktivierbar; SEM = Standardfehler des Mittelwertes; SD = Standardabweichung.
Fisch Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Mittl. Dauer (s)
59,10
35,16
39,45
35,79
31,19
116,3
38,67
56,84
55,12
62,73
35,06
38,18
n.a.
(60,50)
(35,92)
(45,82)
(38,67)
(34,45)
(142,85)
(42,89)
(114,68)
(76,67)
(75,57)
(36,84)
(42,70)
-
SEM
Rel. Var.-Koeff. (%)
0,74
0,39
3,38
1,53
1,64
14,15
2,11
28,93
10,91
7,31
1,73
2,29
-
1,25
1,11
8,56
4,26
5,27
12,17
5,46
50,89
19,79
11,65
4,93
6,00
-
Analyse
Mittelwert
SEM (total)
SD
Var.-Koeffizient
Maximum
Minimum
Median
50,30
6,79
23,53
0,47
116,31
31,19
39,05
51
-3. Ergebnisse-
Bei einem Tier der Messreihe konnten nur einzelne Spermien überhaupt aktiviert
werden, obwohl das Sperma ansonsten unauffällig war und eine Verunreinigung mit
Wasser oder Urin ausgeschlossen werden konnte.
3.2.4 Anteil motiler Spermien
Die Aktivierbarkeitsrate von Ejakulatproben von BF (Herkunft A), BF (Herkunft S) und
BS wurde bei jeweils 6 Fischen in Triplikaten per Video aufgezeichnet und per CASA
analysiert. Wegen des hohen experimentellen und analytischen Aufwands wurden
lediglich 6 willkürlich gewählte Milchner pro Gruppe zur Analyse herangezogen. Dies
ist ausreichend, um eine Beurteilung der Variabilität der Spermienmotilität innerhalb
der jeweiligen Population zu ermöglichen. Die Analyse der Videosequenzen wurde
anhand von Pfadaufzeichnungen der Spermien überprüft (Abb. 7). Es wurden je
Milchner 3x zwischen 40 und 96 Spermien pro Replikat/Filmsequenz ausgewertet.
Bei einigen Milchnern konnten deutlich geringere Aktivierbarkeitsraten festgestellt
werden. Tabelle 8 zeigt die Anteile motiler Spermien von BF-Milchnern der Herkunft A.
Reproduzierbar
(P
=
0,015,
KW)
hatten
einzelne
Milchner
schlechtere
Aktivierungsraten, andere lagen gut über 50% motiler Spermien. Die Gameten eines
Milchners ließen sich jedoch gar nicht aktivieren.
Tabelle 8. Mittlerer Anteil aktivierbarer Spermien von Bachforellen-Milchnern (Herkunft A). VCL = mittl.
Geschwindigkeit (kurvilinear). SEM = Standardfehler des Mittelwerts; MW = Mittelwert; n.a. = nicht
aktivierbar; No. SP = mittl. Anzahl analysierter Spermien pro Durchgang und Filmsequenz.
Fisch No.
motil (%)
SEM (%)
VCL (µm/s)
1
21,26
4,36
32,05
12,06
64,67
2
38,66
3,36
26,86
4,00
72,67
3
60,34
3,84
32,07
6,07
62,33
4
35,45
2,31
26,04
2,96
85,00
5
58,36
6,66
38,37
5,03
79,33
6
n.a.
-
-
-
-
MW
42,81
4,11
31,08
6,03
72,8
SEM
No. SP
52
-3. Ergebnisse-
Abb. 7. Binäre Darstellung (8 bit) der aus Videoaufzeichnung analysierten Spemienbewegungs-Pfade
von zwei Bachforellen-Milchnern (Herkunft A) während eines Intervalls von 5 s. Gepunktete Linien
entsprechen Pfad eines Spermiums. A. Milchner mit geringem Anteil aktivierbarer Spermien B. Milchner
mit hohem Anteil aktivierbarer Spermien
53
-3. Ergebnisse-
BF der S-Herkunft zeigten die besten Aktivierbarkeitsraten mit Werten bis über 70%.
Hier wurde eine geringere Differenz zwischen Einzelindividuen deutlich (KWRangmitteltest P = 0,35), wobei die Anzahl aktivierter Spermien nur in einem Falle
unter 30% lag (Tab. 9).
Tabelle 9. Mittlerer Anteil aktivierbarer Spermien von Bachforellen-Milchnern (Herkunft S). VCL = mittl.
Fisch No.
motil (%)
SEM (%)
VCL (µm/s)
SEM
No. SP
1
27,26
10,52
41,80
9,02
69,67
2
51,88
9,92
37,40
6,61
73,00
3
71,04
13,79
28,36
1,38
90,67
4
72,80
15,40
32,93
6,33
86,33
5
37,17
5,68
23,46
1,84
86,33
6
39,14
3,25
33,17
2,01
96,00
MW
49,88
0,10
32,86
4,53
83,67
BS zeigten mit einem um das 2,3-fache höheren Variationskoeffizient deutlich stärkere
Fluktuation zwischen den einzelnen Milchnern (P = 0,010, KW) bezüglich des Anteils
aktivierbarer Spermien als die beiden Vergleichsgruppen (Tab. 10). Die Hälfte der 6
Individuen zeigte eine desaströse Motilitätsrate von weit unter 10%.
Die mittleren Geschwindigkeiten der Spermien entlang der Schwimmbahn waren bei
den Gruppen in etwa gleich (P = 0,50, ANOVA), wobei auch hier die BS-Milchner
deutliche Unterschiede untereinander aufwiesen (Tab. 10). Langsam schwimmende
Spermien traten nicht nur bei den Milchnern mit geringen Motilitätsraten auf.
Untereinander verglichen waren die Motilitätsraten aller drei Gruppen jedoch knapp
nicht signifikant voneinander verschieden (P = 0,084, ANOVA). Dies lag einerseits an
dem kleinen Stichprobenumfang, sowie an der allgemein großen Variabilität der
Einzeltiere.
54
-3. Ergebnisse-
Tabelle 10. Mittlerer Anteil aktivierbarer Spermien von Bachsaiblings-Milchnern. VCL = mittl.
Fisch No.
VCL (µm/s)
motil (%)
SEM (%)
SEM
No. SP
1
6,19
0,25
11,11
2,56
40,67
2
52,25
2,17
34,26
6,65
41,00
3
6,44
0,57
14,98
3,87
64,00
4
47,36
2,85
39,21
7,55
41,67
5
24,29
4,32
28,21
4,37
54,33
6
5,48
0,67
35,08
1,28
48,33
MW
23,67
1,80
27,14
4,38
48,33
3.2.5 Seminalplasma
Der pH im Überstand nach Abzentrifugieren der Spermatozyten wies im Vergleich
aller behandelten Arten Unterschiede auf (Tab. 11). Er lag bei BF im Mittel um 8, bei
Saiblingen etwas höher und konnte eine Spanne von 7,5 bis 8,6 einnehmen. Daher
stellt sich die Frage, inwiefern sich diese Unterschiede in der Fertilität der Milchner
niederschlagen (siehe 3.5.5, Einzelpaarungen).
Tabelle 11 pH-Werte von Seminalplasmaproben der untersuchten Fischarten/-Herkünfte. SEM =
Standardfehler des Mittelwerts.
Probenumfang
BFA
BFK
BS
SS
9
6
39
22
Mittelwert
7,99
8,06
8,17
8,23
SEM
0,08
0,06
0,02
0,05
Minimum
7,49
7,91
7,81
7,82
Maximum
8,25
8,25
8,43
8,61
rel. Var.-koeffizient (%)
0,94
0,73
0,27
0,62
55
3.3
-3. Ergebnisse-
Eiqualität
3.3.1 Ovarialplasma
Gehalte an organischen Substanzen und Elektrolyten im Ovarialplasma könnten ein
Indikator für die Eiqualität (z.B. Überreife, physiologischer Status) der Gameten
einzelner Rogner sein. Unter 3.5.5 wurden Analysen einer etwaigen Korrelation dieser
Größen mit der BR und der SR durchgeführt. In Tabelle 12 findet sich eine
Zusammenstellung der erhaltenen Messwerte von Ovarialplasma-pH von Rognern
aller untersuchten Arten. BS und SS hatten mit 8,6 die höchsten Maximalwerte, BF
der Herkunft K hatten mit einem Durchschnitt von 8,08 die geringsten Werte.
Bei einer pH-Messung von Ovarialplasma dreier markierter SS-Rogner bei der
Ovulation, sowie 17 Tage danach (Fische hatten bis dato nicht verlaicht), konnte
beobachtet werden, dass dieser sich von jeweils über 8,6 auf 8,16-8,35 verändert
hatte. Derartige Werte müssten also Überreife anzeigen. Demnach waren unter den
Rognern aus Tabelle 12 trotz Prüfung auf Ovulation i.d.R. alle 5 Tage auch deutlich
überreife Individuen vorhanden.
Tabelle 12. pH-Werte von Ovarialplasmaproben der untersuchten Fischarten/-Herkünfte. SEM =
BFA
BFS
BFK
BS
SS
12
6
9
13
11
Mittelwert
8,25
8,29
8,08
8,41
8,46
SEM
0,04
0,02
0,05
0,04
0,05
Minimum
7,96
8,24
7,91
8,10
8,11
Maximum
8,45
8,35
8,30
8,60
8,61
rel. V.koeffizient(%)
0,47
0,20
0,59
0,43
0,59
Zahl Rogner
56
-3. Ergebnisse-
3.3.2 Histologie
Probleme hinsichtlich einer bereits kurz nach der Befruchtung erfolgenden
Koagulierung problematischer Eier könnten aus Strukturanomalien wie z.B. einer
schlecht ausgebildeten Dottermembran resultieren. Es wurden Proben von Eichargen
mit auffällig hoher Verlustrate mit solchen ohne derartige Verluste verglichen, um
etwaige Strukturauffälligkeiten zu erkennen. Beispiele für die histologischen Schnitte
der bereits 8 Tage aufgelegten BS-Eier sind in Abb. 8 dargestellt. Gut ist die verdickte
Dottermembran zu erkennen, welche unterhalb des Embryos die Keimscheibe formt.
Sie war stark durchsetzt mit speziellen Versorgungseinschlüssen und in beiden
Gruppen gut ausgeprägt. Die Dichte des Dotters und die Verteilung der Lipidtropfen
waren in beiden Fällen homogen. Letztere waren bei allen untersuchten Eiern
zahlreich vorhanden und wiesen keine Größenunterschiede zwischen den Eiern der
verschiedenen Gruppen auf. In Anschnitten sichtbare Zellen des frühen Embryos
ließen keinerlei Anomalitäten erkennen.
Die mittlere prozentuale Eigewichtszunahme der einzelnen SS-Rogner aus dem
Spermienkonkurrenz-Versuch (2.6.11) betrug 15,89%, 16,16%, 18,19%, 16,48%,
22,69%, und 20,0%. Der erste Rogner mit nur knapp 16% Zunahme an Eigewicht
zeigte die beste BR (bis 96%), Rogner Nr. 6 konnte trotz hoher Zunahme mit ca. 12%
BR den schlechtesten Wert erzielen. Dies macht deutlich, dass dieser Parameter für
eine Qualitätsbeurteilung eher fragwürdig ist.
57
-3. Ergebnisse-
Abb. 8. Histologische Paraffin- und Epon Semi-Dünnschnitte durch die apikale Region von bebrüteten
(dechorionisierten) Bachsaiblings-Eiern 8 Tage nach der Befruchtung (Färbung B: Toluidinblau, sonst H
& E) a: Dotter b: Dottermembran (proteinös), c: Lipidtropfen, d: Lipid und Lipoprotein-Tropfen, e:
Versorgungsvesikel, f: Embryonale Zellen g: äußere Hülle der Dottermembran. A. Übersicht der
Keimscheibenregion mit der darunter liegenden lipidreichen Tröpfchenansammlung und innenliegenden
Embryonalzellen. Balken: 400 µm. B. Region unterhalb der Keimscheibe mit zahlreichen Lipidtröpfchen.
58
-3. Ergebnisse-
Balken: 400 µm C. Verdickte Region der Dottermembran lateral der Blastodisk mit vielen
Versorgungseinschlüssen. Balken: 40 µm. D. Längsschnitt durch zelluläre Keimregion mit embryonalem
Gewebe (Zellkerne dunkel). Balken: 40 µm. E. Übersicht zur Beurteilung der Größe und Verteilung der
Lipidtröpfchen unterhalb der Keimscheibenregion. Zu erkennen die fibröse Struktur der proteinösen
Hüllschicht. Balken: 400 µm. F. Grenzregion zum Rand des Dotterkörpers mit Anschnitt der
Dottermembran. Balken: 200 µm. G. Flächiger Schnitt durch die verdickte Region der Dottermembran
mit zahlreichen, speziellen Lipid- und Proteineinschlüssen. Balken: 40 µm.
3.3.4 Visuelle Beurteilungen
Bei dem als „gut“ eingestuften, in Versuchen verwendeten frisch gewonnenem Rogen,
konnte im Verlauf des Projekts bis auf farbliche Aspekte (Abhängig von Futtermittel
und Art) und Größenverhältnisse bei Rognern gleicher Herkunft/gleichen Alters
zunächst keine augenscheinlichen Auffälligkeiten in Merkmalen wie Verteilung der
Lipideinschlüsse, Homogenität des Dotters oder Beschaffenheit der Eischale oder der
Dottermembran ausgemacht werden (siehe auch 3.3.2, Histologie). Die Aufteilung der
auf einem Durchlichttisch begutachteten Gelege (aller Arten) in qualitativ gute und
solche mit Anzeichen für Beschädigungen oder Überreife gestaltet sich oft nicht ganz
einfach, da solche Merkmale nicht nur sehr schwach ausgebildet sein können,
sondern anfangs nur in einer geringen Zahl der Eier eines Rogners zu finden sind. So
kamen auf mehrere hundert Eier zum Teil oft nur 5-8 mit derartigen Anzeichen.
Untrügliches Anzeichen für Überreife bzw. schlechte Eiqualität waren kleine,
flockenförmige Einschlüsse im Dotter, Trübung und stark inhomogene Lipidverteilung.
Diese konnten oft nur auf dem Durchlichttisch einwandfrei erkannt werden. Viele
Rogner zeigten auch andere Auffälligkeiten bezüglich ihrer Gameten wie blutiges
Ovarialplasma, Eischalen degenerierter Eier aus dem Vorjahr, stark unterschiedliche
Eigröße, einzelne bereits koagulierte Eier und solche umgeben mit Teilen der
Versorgungsgefäße des Ovariums. Ergebnisse zur Selektion der Eier nach solchen
Kriterien (Überreife etc.) und der resultierenden Befruchtungsergebnisse sind unter
3.5.3 zu finden.
59
3.4
-3. Ergebnisse-
Färbeversuche
Eine Inkubation von aufgelegten Eiern mit dem kationischen Kohlenhydrat-Farbstoff
Alcianblau zeigte nach 30 min nur eine leichte Färbung der Hülle, was sich auch nach
Vorinkubation mit 8%iger Essigsäure nicht veränderte. Fixierte Proben waren nur
schwach gefärbt. Dieser Farbstoff scheint das Chorion nur schlecht passieren zu
können. Die Farbstoffe Patentblau und Nilblau färbten die gesamten Eibestandteile
sehr kräftig, was eine Detektion von Zellen auf der Keimscheibe unmöglich machte.
Auch langwieriges Waschen konnte diesen Umstand nicht aufheben. Anschließende
Formalinfixierung und Dechorionisierung zeigte eine starke Färbung auch der
Dottermembran. Eine Fluoreszenz von Nilblau im Bereich der embryonalen
Keimscheibe war daher nicht sichtbar.
Generell brachten alle Fluoreszenzfarbstoffe keine befriedigenden Ergebnisse. Die
verwendeten UV/Weißlicht-Röhren lagen mit Ihren Wellenlängen-Maxima nicht exakt
bei den Anregungswellenlängen der einzelnen Fluorochrome. Jedoch überlappen die
jeweiligen Emissionsbereiche der Lichtquellen weitgehend mit den Absorptions- bzw.
Anregungsbereichen der zu testenden Farbstoffe. Tests mit Kontrollorganismen
konnten, vor allem bei Acridinorange, deutliche Fluoreszenz erkennen lassen. Obwohl
Hoechst 33342 Membranen passieren kann, waren evtl. gefärbte (Nukleinsäure)
Strukturen mit den beschriebenen Methoden nicht erkennbar. Methylgrün färbte
ebenfalls
die
gesamten
Mitochondrienfarbstoff
Eibestandteile,
verwendet
wird.
Eine
obwohl
dieses
unkontrollierte
als
Kern-und
Dissoziation
der
Methylgruppe könnte hierfür Ursache sein. Bouin`sche Lösung, eigentlich ein
altbekanntes Fixans, färbt unspezifisch organische Strukturen in verschiedener
Intensität. Auch hier war letztendlich die irreversible Färbung der Eihülle mit
zusätzlicher
Eintrübung
problematisch,
es
konnte
keine
Aussage
zum
Befruchtungsstatus getroffen werden.
Als einziger Farbstoff färbte Neutralrot in einer Konzentration zwischen 1 und 3mg/ml
die Embryonalanlagen sichtbar stärker, und ließ sich zudem weitgehend aus den
umliegenden Strukturen auswaschen (3-maliger Wechsel bei 4°C). Zelluläre
Aggregate waren deutlich dunkler gefärbt als Membranen und Dotter (Abb. 9).
Verstärkt werden konnte der Färbungseffekt durch eine 5-7 minütige Inkubation der
Eier in 8%iger Essigsäure. Frühe Keimscheibenstadien waren dennoch nicht immer so
60
-3. Ergebnisse-
gut zu sehen wie in Abb. 9 A. Doch konnten die bereits nach 4-5 Tagen vergrößerten
Keimscheiben gut von den zentral gelegenen Lipideinschlüssen am apikalen Pol
differenziert werden (Abb.9 B), und die Eischale wurde klarer zu durchschauen. Eine
Bestimmung der BR zu einem Zeitpunkt von ca. 5-6 Tagen nach der Befruchtung ist
unter Verwendung schwacher optischer Vergrößerung auf dem Durchlichttisch
möglich, obwohl die Umwachsung der Dottermembran (Epibolie) nicht vollständig
eingeleitet ist und der Embryo noch sehr klein ist. Ab dem 9. bis 12. Tag nach der
Befruchtung ist die Beurteilung durch das Längswachstum des Embryos auch für den
Laien allein durch Verwendung der Essigsäure möglich (beschrieben auch in
Greenberg 1960), da dieser nun weißlich erscheint (Blastoporenlippe ebenfalls gut
sichtbar). Jedoch geling mit Neutralrot eine Verstärkung dieser sich im Laufe etwa 1 h
durch Zerfall abschwächenden Reaktion (Abb. 9 C & D). Das Neutralrot macht in
diesem Stadium den Embryo und den Rand des Blastoderms noch deutlicher sichtbar,
so dass diese auch ohne Durchlichttisch sehr gut erkennbar sind. Die Färbung ist in
der Praxis einfach durchzuführen und bringt innerhalb kurzer Zeit gute Ergebnisse bei
der Analyse von ab 5 Tage alten Eiern. Als gut geeignet erwies sich die 10-minütige
Inkubation in einer 6%igen Essigsäure-Lösung in 0,9% NaCl, gefolgt von Färbung
durch eine Neutralrot-Lösung (1,5 mg/ml in 0,9% NaCl und 4% Essigsäure,
Färbedauer ca. 40 min). Danach erfolgt das Waschen durch reichlich 0,9%ige
Kochsalzlösung, welche 4 x im Abstand von 20 min zu wechseln ist. Diese Prozedur
kann jedoch je nach Eireifegrad und Trübung der Eihülle beliebig vereinfacht werden.
61
-3. Ergebnisse-
Abb. 9. Bachsaiblingseier verschiedenen Alters, gefärbt mit Neutralrot nach Essigsäure-Behandlung
wie
unter
5.
Links
jeweils
unbefruchtete,
rechts
befruchtete
Individuen.
A.
Frühes
Keimscheibenstadium, 2 Tage. B. Keimscheibenstadium, Epibolie noch nicht eingeleitet, Präparat fixiert
(Abhebung der Dottermembran sichtbar). 5½ Tage. C. Somitenstadium, beginnende Cephalisation,
Blastoporus fast geschlossen, 11 Tage. D. Cepahlisation fortgeschritten, beginnende Ablösung der
Schwanzes, 15 Tage. Angaben Tage nach Befruchtung.
62
3.5
-3. Ergebnisse-
Befruchtungs- und Erbrütungsversuche
Tests verschiedener Methoden
Gemessen wurde in diesem Versuch die BR nach Verwendung unterschiedlicher
Methoden zur Befruchtung. Die Methoden konnten leider nur die bei SS oft
beobachteten, eher geringen BR erzielen. Zwischen den Gruppen waren die
gemessenen Unterschiede knapp nicht signifikant (P = 0,09, ANOVA). Dennoch
lieferte M3 ein um ca. 10% besseres Ergebnis als M1 (Tab. 13). Bei Auswertung als
gepaarte Stichproben, wie sie in diesem Fall vorlagen, konnte ebenfalls ein knapp
nicht signifikanter Unterschied gemessen werden (0,069, Friedman-Test). Die mittlere
Verlustrate lag in diesem Versuch bei 30% ± 1,5% bei allen 3 Gruppen. Obwohl die
bei Versuchen in diesem Projekt angewendete Methode (M1) damit die geringste BR
lieferte, wurde diese aufgrund deren besserer Reproduzierbarkeit (siehe unten) und
der geringsten Varianz (M1: 29,9, M2: 109,0, M3: 44,5) für die Versuche beibehalten.
Tabelle
13.
Mittlere
Befruchtungsraten
bei
unterschiedlichen
Befruchtungsmethoden
von
Seesaiblingseiern (Anzahl 100, 684 700 Spermien/Ei) (6 Replikate).
Methode
BR [%]
Min/Max
SEM
M1
40,38
34,62/50,0
±2,23
M2
43,46
23,47/51,51
±4,26
M3
50,73
40,82/61,00
±2,72
Reproduzierbarkeit
Eine Methode zur Befruchtung mit geringer Schwankungsbreite bildete die Basis für
die in diesem Projekt durchgeführten Experimente. Diese wurde anhand wiederholter
Befruchtung eines SS-Pärchens untersucht. Im Ergebnis zeigte die Methode
hervorragende Reproduzierbarkeit um den Mittelwert 66,88% mit einer Spannweite
von nur 7% (Tab. 14) und geringer SD bei Wiederholung. Die Daten waren
normalverteilt, die Varianz mit 4,7 sehr gering. Die Methode kann daher als gut
reproduzierbar angesehen werden und sollte zuverlässige Ergebnisse liefern.
63
-3. Ergebnisse-
Tabelle 14. Analyse der Befruchtungsrate nach replizierter Befruchtung der Gameten einer SS-Paarung
nach standardisierter Methode (Anzahl Eier 100, 600 000 Spermien/Ei) (8 Replikate).
Parameter
Wert
Mittelwert
66,88%
SEM
0,77%
Varianz
4,70
SD
2,17%
Variationskoeffizient
0,03
rel. V.koeffizient (%)
1,15%
Schiefe
-1,88
Kurtosis
2,71
Minimum
62%
Maximum
69%
Spannweite
7%
95% Konfidenzintervall
1,81
Kolmogorov-Smirnov P
0,59
2
0,22
 für diskrete Variable
Die Befruchtung der SS-Eier bei unterschiedlichen Temperaturen ergab keinen
signifikanten Unterschied (P = 0,5, t-Test, MW kalt befruchtet: 75,16% ± 4,46, MW
warm befruchtet 78,38 % ± 1,49, 10 Replikate). Allerdings lag der relative
Variationskoeffizient bei der kalten Methode mehr als dreimal so hoch wie der der
Vergleichsgruppe.
Zunächst wurde überprüft, ob die nach der Ovulation cranial in der Bauchhöhle
gelegenen Gameten von BS-Rognern andere SR aufweisen als die caudal gelegenen.
Nach Befruchtung mit gleichen Spermienproben wurde deutlich, dass keine
signifikanten Unterschiede bestanden (zuerst 40,63% ±8,56, zuletzt 49,74 ±3,89, 6
Fälle). Dies galt sowohl für die abhängige als auch für die unabhängige Analyse (P =
0,25 und 0,35 respektive, abhängiger/unabhängiger t-Test).
64
-3. Ergebnisse-
In einem anderen Ansatz wurden Eichargen während des normalen Brutbetriebs auf
einem Durchlichttisch nach Anzeichen von Überreife aussortiert (siehe 3.3.4). Die
jeweilig aussortierten Portionen wurden simultan mit denselben Spermien befruchtet
und getrennt aufgelegt. Optisch als schlecht eingestufte Chargen zeigten allein bis
zum AP-Stadium schon Ausfälle bis über 40%, bei einer BF-Charge waren diese zu
fast 100% unbefruchtet. Verluste bis zum AP-Stadium beliefen sich bei allen Arten
nach zusätzlicher Einführung rigoroser Auswahltechniken und Veränderung der
Befruchtungsmethode 2008 (siehe Diskussion) zum Teil lediglich auf bis zu 27%. SS
etwa, gestreift ohne Sortierung, waren praktisch ein Totalausfall, aber in Folge der
Umstellung lag die BR und die SR bis zum AP-Stadium in manchen Chargen nun über
80%.
3.5.4 Betäubung
Bei dem Vergleich der BR der vor dem Abstreifen betäubten und der nicht betäubten
BS-Gruppen ergab sich kein signifikanter Unterschied (betäubt: 63,30% ± 5,3, nicht
betäubt: 58,27% ± 5,51, P = 0,50, t-Test, 6 Stichproben). Im Gegensatz zur Erwartung
war die BR damit bei betäubten Fischen sogar etwas besser.
Die Reproduktionsleistungen einzelner Tiere im direkten Vergleich unter gleichen
Bedingungen waren im Zuge dieser Untersuchung von besonderem Interesse. Bei
den Einzelpaarungen von SS-Rognern mit Spermien von einem Milchner ergab sich
eine
mittlere
SR
von
nur
31,0%
(±
5,02)
mit
einem
relativ
hohen
Variationskoeffizienten von 16,18 (SD 15,86). Dies lag u. a. auch an einem Rogner mit
Totalausfall, wo fast alle Eier noch vor Beginn der Aussortierung unbefruchteter
abgestorben waren. Andere Rogner erbrachten SR von 16,5 % bis 52,04%, in den
Proben fanden sich bis zu 50% der unter 3.1.1 beschriebenen, nur schwach
entwickelten Embryonen, welche bis zum Schlupftermin meist abstarben. Selbst die
höchsten SR in diesem Versuch sind als nicht befriedigend zu beurteilen. Die große
Spannweite in den Resultaten verschiedener Rogner legt die Vermutung nahe, dass
hier maternale Effekte zugrunde liegen.
65
-3. Ergebnisse-
Um diese Frage weiter zu klären, wurden diverse BS-Rogner einzeln mit Spermien nur
eines Milchners befruchtet und um den paternalen Einfluss zu erkennen wurden Eier
eines Rogners mit Spermien (gleiche Menge und Konzentration) verschiedener
Milchner befruchtet. Die an 50 Eiern ermittelte BR der einzelnen BS-Rogner bei
gleicher Befruchtung mit Spermien von nur einem Milchner waren deutlich
verschieden (Tab. 15, relativer Variationskoeffizient 7,64%, SD 16,99). Die SR
(relativer Variationskoeffizient 11,12%, SD 18,99) konnte diese Werte in zwei Fällen
sogar knapp übertreffen, beide Größen (BR und SR) korrelierten erwartungsgemäß
stark (Pearson K 0,63, P = 0,013). Die BR zeigten eine Spannweite von 58% bei
einem Maximalwert von 96%, die SR variierte gar um 63,4% bei einem Maximalwert
von 79,39% (interessanterweise nicht bei dem Rogner mit der höchsten BR).
Überraschenderweise war auch bei Verwendung verschiedener Milchner zur
Befruchtung identischer Eiproben eine enorme Variabilität offensichtlich (Tab. 16,
relativer Variationskoeffizient 13,34%, SD 24,89). Die SR von Eiern eines BS-Rogners
nach Verwendung gleicher Mengen an Spermien verschiedener Milchner zeigte eine
Spannweite von 81% bei einem MW von 60,30%. Die Varianz war im Vergleich zu den
Einzelrognern doppelt so hoch, durch die Eckwerte von 10% und 91% klar
demonstriert. BR wurden hier nicht ermittelt. Ob bestimmte Milchner mit den Eiern
genau dieses Rogners inkompatibel waren und mit Gelegen anderer Rogner gute
Ergebnisse geliefert hätten muss hier offen bleiben. In der Eimix-Gruppe (6 x Mix aus
Eiern aller Rogner, befruchtet mit Spermienmix von 6 Milchnern) konnte eine
vergleichsweise hohe mittlere SR von 82,68% (± 1,63) erreicht werden. Die
Spannweite der SR betrug lediglich 8,51%. Die Replikationen des Eimix-Ansatzes
zeigte abermals die Reproduzierbarkeit der verwendeten Methode (SD 4,00, relativer
Variationskoeffizient 1,98, siehe auch 3.5.1).
66
-3. Ergebnisse-
Tabelle 15. Befruchtungs- und Schlupfraten von BS- Rognern bei Befruchtung mit gleichen
Spermienproben von einem Milchner. Werte von Ovarial- und Seminalplasmaproben der betreffenden
Einzeltiere nebenstehend. MW = Mittelwert ± SEM = Standardfehler des Mittelwerts. OP =
Ovarialplasma, Osm = Osmolalität in mOsm/kg.
Rogner
BR [%]
SR [%]
pH OP
Osm OP
1
64
57,21
8,31
334,5
2
38
31,60
8,54
335
3
56
44,17
8,32
333,5
4
42
47,39
8,31
333,5
5
82
50,00
8,36
327,5
6
76
77,24
8,55
314,5
7
60
29,87
8,44
328
8
54
16,02
8,49
324,5
9
76
57,85
8,39
335
10
74
79,39
8,4
329
11
96
63,11
8,45
339,5
12
54
38,02
8,11
335,5
MW
64,33 ± 4,90
49,32 ± 5,48
8,39 ± 0,03
330,83 ± 1,92
Tabelle 16. Schlupfraten von BS-Eiern eines Rogners bei Befruchtung mit gleichen Spermienmengen
verschiedener Milchner. Werte von Seminalplasmaproben der betreffenden Einzeltiere nebenstehend.
MW = Mittelwert ±SEM = Standardfehler des Mittelwerts. pH SP = pH des Seminalplasmas.
Milchner
SR [%]
pH SP
1
44,21
8,24
2
44,68
8,28
3
57,29
8,26
4
86,84
8,23
5
54,26
8,09
6
91,92
8,05
7
10,87
8,17
8
73,33
8,35
9
79,55
7,95
10
89,58
8,22
11
36,11
7,94
12
55,00
7,81
MW
60,30 ± 7,13
8,13 ±0,05
67
-3. Ergebnisse-
Mögliche Korrelationen von BR und SR mit pH sowie Osmolalität des Ovarialplasmas
wurden anhand von 12 Fällen untersucht. Osmolalität und pH des Ovarialplasmas
zeigten deutliche Korrelation zueinander (Pearson K -0,47, P = 0,06). Der pH-Wert
des Ovarialplasmas zeigte nur sehr schwachen Bezug zur BR (nicht signifikant,
Pearson K 0,15, P = 0,32). Die Reliabilität dieser Methode bei den untersuchten
Populationen muss also zunächst offen bleiben (siehe Diskussion). Beim Test ob die
zu erwartende BR anhand der Osmolalität des Ovarialplasmas ablesbar ist, konnte
ebenfalls keine Korrelation nachgewiesen werden (Pearson K -0,086, einseitige
Signifikanz P = 0,39). Die SR konnte auch nicht mit dem Seminalplasma-pH der
einzelnen Milchner in Verbindung gebracht werden (Pearson K -0,049, P = 0,44).
Die Reproduktionsfähigkeit von Laichfischen verschiedenen Alters selbst aus der
gleichen Population kann sich stark unterscheiden. Verglichen wurden in diesem
Versuch die SR von BS-Erstlaichern (Alter 2 Jahre) mit einer Gruppe BS, die schon
eine Laichperiode hinter sich hatten (Alter 3 Jahre). Die Erstlaicher-Gruppe zeigte
bereits während der Anfangsphase der Erbrütung massive Verluste (Präzipitation). Die
Eier dieser Gruppe waren nicht nur kleiner (Ø 2-2,5 mm kleiner als die der
Vergleichsgruppe), sondern auch heller gefärbt und mit einem wesentlich weniger
opaken Chorion. Eine Untersuchung der koagulierten Eier ergab keinerlei Anzeichen
auf eine erfolgte Befruchtung bzw. sichtbare Embryonenentwicklung (48 Eier
untersucht). Die Vitellinmembran der Eier war bei den koagulierten Eiern in fast allen
Fällen vollständig kollabiert. Die SR der Gruppen unterschieden sich im Mittel jedoch
nicht signifikant (mittlere SR 2 Jahre: 20,92% ± 6,11, 3 Jahre: 25,83% ± 3,76, 12
Stichproben, P = 0,50, t-Test). Auffällig war aber eine sehr viel höhere Varianz bei den
jungen Laichfischen im Vergleich zu den 3-jährigen Laichern (rel. Variationskoeffizient
2 Jahre: 29,23, 3Jahre: 14,56), was bei ersteren zu mehr Totalausfällen bis auf 0% SR
führte (6 Paarungen mit SR < 7%). Bei der älteren Gruppe lag lediglich eine Paarung
unter 15% SR. Die Spannweite war bei beiden Gruppen jedoch relativ hoch, was auf
eine äußerst variable Eiqualität der einzelnen Rogner schließen lässt. Es muss
erwähnt werden, dass alle in diesem Versuch verwendeten Fische kein spezielles
Laichfischfutter erhielten, was evtl. die generell niedrigen Durchschnittswerte der SR
erklärt.
68
-3. Ergebnisse-
3.5.7 Futterversuche
Die Wirkung der Fütterung moderner Industriefuttermittel auf den Fortpflanzungserfolg
bzw. die Gametenqualität sollte anhand des Modellorganismus Zebrabärbling, sowie
anhand der untersuchten Salmoniden selbst erörtert werden.
Zebrabärblinge
Im Test von Mastfutter (MF) gegen normales Zierfischfutter zeigte sich eine signifikant
niedrigere Überlebensrate der Zebrabärblingseier (P = 0,0015, t-Test, 6 Replikate, 327
Eier ausgewertet pro Gruppe). Die durchschnittliche Überlebensrate betrug für MF nur
43,5% (± 7,0%), für normale Fütterung dagegen 77,2% (± 3,5%). Im Falle der
Fütterung mit LFF konnte dieses negative Ergebnis nicht bestätigt werden. Hier trat
nur ein geringer Unterschied zwischen den Futtergruppen zutage (LFF 70,1%,
normale Fütterung 78,5%, P = 0,31, t-Test, 11 Replikate, 539 (LFF) und 564 (normale
Fütterung) Eier ausgewertet).
Salmoniden
Die
Temperatur
in
den
Haltungseinheiten
lag
im
Mittel
bei
8,1°C,
die
Sauerstoffsättigung zum Zeitpunkt der Messungen am Ablauf bei ca. 90%. Die
Fütterung mit Naturfutter war naturgemäß mit stärkerer Wasserverschmutzung
verbunden. Während der gemessene Ammoniumwert mit 0,3-0,4 mg/l in der N und PGruppe gleich war, war der Nitratwert in der Naturfuttergruppe sogar niedriger (N: 0,10
mg/ml, P: 0,17 mg/ml, gemessen 2 h nach Fütterung). Milchner die mit Pelletfutter
gefüttert wurden hatten gegenüber solchen denen Naturfutter verabreicht wurde keine
signifikant unterschiedlichen Spermienkonzentrationen (Mittelwerte N 1.129.688/0,1
µl, P 1.191.319/0,1 µl, P = 0,67, t-Test). Auffällig war auch das signifikant stärkere
Wachstum der Milchner der M-Gruppe im Gegensatz zu den beiden andern (Tab. 17,
P < 0,05 bez. Länge und Gewicht der Milchner, ANOVA/LSD t-Test). Bei den Rognern
waren die Tiere der P-Gruppe die schwersten (P < 0,05, P♀ vs. N♀, ANOVA/LSD tTest) und längsten (P < 0,05, P♀ vs. N♀, ANOVA/LSD t-Test). Ihr Gewicht lag
signifikant über dem der Vergleichsgruppen (P < 0,05, ANOVA/LSD t-Test), erreichte
69
-3. Ergebnisse-
jedoch nicht das sehr viel höhere Gewicht der M-Milchner. Rogner der N-Gruppe
produzierten im Mittel leichtere Eier als diejenigen der P-Gruppe (P: 4,30 g, N: 3,74 g
pro 100 Eier).
Tabelle 17. Mittlere Längen- und Gewichte der Fütterungsgruppen (± SEM, min 10 Individuen).
Pelletfutter (P)
Länge ♂
34,81 cm
± 0,69
Länge ♀
36,38 cm
± 1,22
Gewicht ♂
507,85 g
± 30,00
Gewicht ♀
527,25 g
± 23,89
Länge ♂
38,67 cm
± 0,51
Länge ♀
33,25 cm
± 3,45
Gewicht ♂
709,33 g
± 33,95
Gewicht ♀
402,50 g
± 36,56
Länge ♂
34,52 cm
± 0,42
Länge ♀
31,52 cm
± 0,60
Gewicht ♂
474,10 g
± 21,30
Gewicht ♀
325,78 g
± 20,20
Mischfutter (M)
Naturfutter (N)
Die mittleren SR der Gruppen P und N unterschieden sich bei Paarung untereinander
nicht (N: 58,9% ± 8,74, P: 55,2%, ± 7,20, 10 Replikate, P = 0,74, t-Test). Die relativen
Variationskoeffizienten der beiden Gruppen lagen mit 14,8 (N) und 13,1 (P)
vergleichbar hoch. Die niedrigsten SR betrugen 16,8% (N) und 26% (P), die
Maximalwerte waren 98,9% (N) und 96,9% (P). Dies verdeutlichte abermals die
enormen Unterschiede zwischen den Einzeltieren, offenbar den verwendeten Rognern
(da jeweils gleiche Spermienmixe pro Gruppe verwendet wurden). Paarungen der MGruppe konnten nicht ausgewertet werden, da die Anzahl der laichbereiten Rogner zu
diesem Zeitpunkt nicht ausreichte.
70
-3. Ergebnisse-
Die durchschnittliche Verlustrate bis zum Auszählen nach 13 Tagen war in diesem
Versuch äußerst gering (1,29-2,59%). Außer den beiden höchsten Konzentrationen
(600 000 und Überschuss) waren alle BR in diesem Versuch signifikant verschieden
voneinander (Tab. 18, P < 0,05, ANOVA/Tukey t-Test). Dies bedeutet, dass erst ab
einem Wert von etwa 600 000 Spermien pro Ei die befruchtungsfähigen Eier mit der
verwendeten Methode größtenteils auch befruchtet werden können und dass die
Spermienkonzentration
je
nach
Methode
entscheidend
zur
Befruchtungswahrscheinlichkeit beiträgt.
Tabelle 18. Mittlere Befruchtungsraten von Bachsaiblingseiern (Anzahl 100, Mix aus 20 Rognern) bei
Verwendung verschiedener Spermienkonzentrationen (4 Replikate).
Spermienkonzentration pro Ei
BR [%]
SEM
6000
21,96
±1,81
60 000
79,07
±2,56
600 000
96,69
±1,28
Überschuss
97,71
±0,47
Ob die Befruchtung durch mehrere Milchner abgesehen von einer höheren
Spermienmenge Vorteile bringt, sollte durch diesen Versuch erörtert werden. Alle
verwendeten Spermienproben zeigten in der mikroskopischen Kontrolle eine
durchweg gute Aktivierbarkeitsrate von über 75%. Die BR der einzelnen Rogner
waren sehr unterschiedlich. Zur Verdeutlichung sind in Tabelle 19 die jeweiligen BR
der 6 Rogner aufgelistet. Anhand der Größenordnung der BR jedes Einzeltiers ist gut
sichtbar,
wie
unterschiedlich
die
einzelnen
Rogner
hinsichtlich
Befruchtungsfähigkeit ihrer Eier sind.
71
der
-3. Ergebnisse-
Tabelle 19. Befruchtungsraten [%] von Eiproben einzelner Seesaiblinge (Anzahl 100, 600 000 Spermien
pro Ei) bei Befruchtung mit Spermien von einem oder mehreren Milchnern. Gleiche Rogner
nebeneinander.
1 Milchner
3 Milchner
6 Milchner
77,00
63,64
59,00
44,66
65,00
12,00
90,91
80,00
73,47
64,00
76,77
11,00
96,00
71,28
72,64
59,00
91,00
17,98
Die Werte ließen sich durch Verwendung mehrerer Milchner durchweg verbessern,
wobei hierzu in der Hälfte der Fälle schon die Verwendung von 3 statt einem Milchner
ausreichte. Dies bestätigen auch die Mittelwertsvergleiche (Tab. 20), da die BR beider
Gruppen mit mehreren Milchnern gegenüber der mit nur einem signifikant verschieden
ist (P < 0,01, paired t-Test). Mehrere Milchner gleichzeitig zu verwenden scheint daher
von Vorteil zu sein.
Tabelle 20. Mittlere Befruchtungsrate von Seesaiblingseiern (Anzahl 100, 600 000 Spermien pro Ei) bei
Befruchtung mit Spermien von einem oder mehreren Milchnern (6 Stichproben).
Spermienkonzentration pro Ei
BR [%]
SEM
1 Milchner
53,55
±9,34
3 Milchner
66,02
±11,57
6 Milchner
67,98
±11,44
Die vergleichende Erbrütung der Nachkommen einer Gruppe von BS die während
ihrer gesamten Gametogenese erhöhtem Stress ausgesetzt war mit einer Gruppe, die
nur äußerst selten durch Handling beeinträchtigt wurde, zeigte bezüglich der SR keine
nennenswerten Unterschiede (mittlere SR gestresst: 78,75% ± 4,85, nicht gestresst:
74,88% ± 3,79, 9 Stichproben, P = 0,54, t-Test). Beide Gruppen zeigten teils
unerwartet hohe SR bis über 90%. Die Varianz beider Gruppen war dabei
vergleichbar, die niedrigsten SR lagen bei knapp 58%. Die Milchner der stärker
gestressten Gruppe hatten z.T. sogar höhere Spermienkonzentrationen als die der
nicht gestressten Gruppe.
72
-3. Ergebnisse-
3.5.11 Wasser
Der Frage, ob etwaige Noxen im Quellwasser negativen Einfluss auf den Bruterfolg
haben könnten, wurde in diesem Versuch nachgegangen. Die erhaltenen Daten waren
im Hinblick auf einzelne Wasserparameter nicht vollkommen direkt vergleichbar.
Leitungswasser hatte z.B. zur Zeit der Erbrütung im Durchschnitt niedrigere
Temperaturen als das Quellwasser (LW: 7,4°C, QW: 8,5°C). Jedoch konnten ob der
Tatsache, dass dieselben, bereits befruchteten Eichargen einzelner BS-Rogner bei
beiden Bedingungen verglichen wurden, vergleichbare Resultate erwartet werden. Bei
Erbrütung in Leitungswasser war keine Verbesserung der SR zu verzeichnen.
Überraschenderweise wiesen die in Quellwasser erbrüteten Gelege signifikant höhere
SR auf als die in Leitungswasser aufgelegten (LW: 46,65% ± 2,89, QW: 55,58% ±
3,53, P = 0,013, paired t-Test, 10 Fälle).
Im ersten Versuch der Kreuzung von A- und K-BF konnten leider keine statistisch allzu
aussagekräftigen Zahlen für die Paarungen aufgebracht werden (siehe 2.6.14).
Dennoch kam es zu einem klaren Ergebnis, da beide Gruppen, bei denen BF der
Herkunft A als Rogner dienten (AA und AK), einen Totalausfall bei der SR
verzeichneten. Lediglich bei je einem der 6 Fälle kamen einige wenige Eier zum
Schlupf (Kreuzung A/K: 7/100, A/A: 5/100). Dabei konnte nicht festgestellt werden, ob
es sich um ein Problem mit der Befruchtung oder der Entwicklung handelte, da ein
großer Teil bereits früh während der Entwicklung abstarb (siehe Diskussion). Dagegen
war die mittlere SR bei Benutzung des A-Spermas mit K-Rogen als normal zu
bezeichnen. Sie bewegte sich in etwa in Höhe derer, die mit K-Spermien erreicht
wurde. Demzufolge war die Milch von Laichern der Herkunft A nicht für die miserable
Ausbeute der AA- und AK- Kreuzung verantwortlich. Die SR korrelierten in etwa
zwischen den beiden Gruppen, was erneut die generelle Fertilitäts-Variabilität
zwischen den Rognern widerspiegelt (siehe z.B. Rogner Nr. 1 und 3, Tab. 21). Die
Varianz war dagegen augenfällig sehr hoch. Auch hier waren die Stichproben gepaart,
d.h. gleiche Eiproben einzelner K-Rogner wurden sowohl mit Spermien des K- als
73
-3. Ergebnisse-
auch der A-Herkunft befruchtet. Es war kein signifikanter Unterschied zwischen den
beiden Gruppen nachweisbar (P = 0,67, paired t-Test).
Tabelle 21. Einzelne und mittlere Schlupfraten bei Kreuzung von Bachforellen-Rognern der Herkunft
Keidel (K) mit Aufsesser Milchnern (A) und K-Milchnern (Anzahl Eier 100, 600 000 Spermien/Ei).
Rogner No.
SR KK [%]
SR KA [%]
1
66,00
63,64
2
65,00
56,12
3
27,84
39,39
4
47,87
57,14
5
70,71
46,46
6
66,00
63,64
MW
55,48
52,55
SEM
7,92
4,28
Bei der zweiten Kreuzung von K-Laichern mit im Fluß gefangenen „Aufsesser“ BF
(Aw) wurden Totalausfälle wie im ersten Versuch nicht beobachtet. Die Aw-Gruppe
lieferte bis auf 2 Paarungen sehr gute SR, was deren Unterschied zur A-Herkunft
verdeutlicht (Tab 22). Überraschenderweise lieferte die Befruchtung von K-Rognern
mit A-Milch diesmal bessere SR als mit den eigenen Milchnern. Demzufolge konnte
bei 6 K-Rognern ein leichter Heterosiseffekt bei Kreuzung mit Aw-Milchnern
beobachtet werden (signifikant mit parameterfreiem Test). Bei Befruchtung von Eiern
der A-Gruppe mit K-Milchnern war die SR bei 5 der 7 Paarungen niedriger als bei
Verwendung des Spermas der eigenen Herkunft. Dies könnte daraus resultieren, dass
Aw-Milchner
bei
gleichen
Spermienzahlen
bessere
Spermaqualität
(z.B.
Motilitätsdauer oder Schwimmfähigkeit) besaßen. Obwohl die Varianzgleichheit in
diesem Fall grenzwertig war (P = 0,091, Bartlett-Test), verlief die Varianzanalyse aller
Gruppen eindeutig. Es war kein signifikanter Unterschied zwischen allen Gruppen
vorhanden (P = 0,69, ANOVA), demnach wurde weder eine Depression der SR noch
ein ausgewiesener Heterosis-Effekt statistisch bestätigt.
Wieder
zeigten
die
Paarungen
die
enorme
Schwankungsbreite
(rel.
Variationskoeffizienten AA 18,64, AK 17,98, KA 11,20, KK 6,91), die aufgrund
ähnlicher Werte bei der Kreuzung mit der jeweils anderen Gruppe und der
Verwendung gleicher Spermienmixe innerhalb einer Gruppe eindeutig den Rognern
zuzuschreiben waren. Auch waren seitens der K-Rogner diesmal 2 Ausreißer
vorhanden, die extrem schlechte SR erbrachten und bei der Statistik hier
74
-3. Ergebnisse-
vernachlässigt wurden (KA 12,36 und 1,02 %, KK 7,78 und 0,00%, respektive). Ein
Miteinbeziehen dieser beiden Tiere änderte die Irrtumswahrscheinlichkeit beim
Vergleich aller Gruppen jedoch nicht (P = 0,62, ANOVA).
Tabelle 22. Einzelne und mittlere (MW) Schlupfraten bei Kreuzung der Bachforellenherkünfte Aufseß
wild (Aw) und Keidel (K) (Anzahl 100, 600 000 Spermien/Ei). Erster Buchstabe jeweils Rogner.
Paarung No.
SR AwAw (%)
SR AwK (%)
SR KAw (%)
SR KK (%)
1
97,96
92,55
99,08
49,25
2
73,74
81,82
44,58
43,81
3
73,20
69,00
93,20
70,75
4
100,00
81,63
84,00
59,62
5
60,00
48,48
39,53
43,69
6
20,21
15,69
78,43
64,22
7
25,49
32,65
53,00
53,54
8
-
-
77,00
71,00
MW
64,37
60,26
71,10
56,98
SEM
12,00
10,83
7,97
3,94
Im dritten Versuch wurden zu einer neuen Population Aw-Laicher anstatt Fischen der
Herkunft K die der Salgener (S)-Herkunft eingekreuzt. Die mittleren SR waren in
diesem Versuch hervorragend, etliche Tiere hatten SR weit über 90%, keine lag im
gesamten Versuch unter 50% (Tab. 23). Die SR waren im Vergleich aller Gruppen
nicht signifikant verschieden (P = 0,3, ANOVA), lediglich die Kreuzung SA zeigte
gegenüber SS eine signifikant niedrigere Rate in der paarweisen Auswertung (P =
0,030, paired t-Test), wobei hier lediglich 5,5% Unterschied bestanden.
75
-3. Ergebnisse-
Tabelle 23. Einzelne und mittlere (MW) Schlupfraten bei Kreuzung der Bachforellenherkünfte Aufseß
wild (Aw) und Salgen (S) (Anzahl 100,600 000 Spermien/Ei). Erster Buchstabe jeweils Rogner.
Paarung No.
SR AwAw [%]
SR AwS [%]
SR SAw [%]
SR SS [%]
1
62,50
63,37
89,80
95,92
2
85,00
94,95
95,92
96,00
3
59,80
74,76
67,00
78,79
4
72,45
92,08
95,96
93,00
5
96,97
96,00
91,00
96,00
6
97,00
98,97
95,88
99,00
7
96,81
98,99
50,00
91,00
8
93,94
98,00
65,00
80,00
9
79,57
81,19
80,81
95,96
10
85,86
93,94
85,00
91,00
11
82,00
71,00
-
-
12
96,94
95,00
-
-
MW
84,07
88,19
87,67
93,21
SEM
3,87
3,56
5,02
2,19
3.6
Wasserparameter
Salmoniden und deren Gelege besitzen physiologisch bedingte Optima bez.
geeigneter Wasserparameter, die auch die Fortpflanzung beeinflussen können. In
Tab. 24 sind die während der Erbrütungszeit gemessenen Werte aufgelistet. Sie
dienen zur Orientierung und stellen keine exakten Durchschnittswerte da (Messungen
erfolgten in der Peripherie der Anlage nicht regelmäßig). Es sei darauf hingewiesen,
dass v.a. Regeneintrag diese Werte starken Schwankungen unterwerfen kann.
76
-3. Ergebnisse-
Tabelle 24. Gemittelte Wasserwerte gemessen an verschiedenen Stellen. MW = Mittelwert, SEM =
Messstelle
mg O2
%O2
T °C
pH
MW
10,3
88,25
8,35
7,10
Minimum
10,2
87
8,3
7,03
Maximum
10,5
90
8,5
7,15
SEM
0,07
0,64
0,05
0,03
MW
11,48
97,5
8,27
7,42
Minimum
11,4
96
7,4
7,05
Maximum
11,6
99
9,1
7,8
SEM
0,05
0,65
0,05
0,17
MW
9,59
80,44
8,30
7,61
Minimum
8,2
70
6,1
7,3
Maximum
10,9
89
9,6
7,83
SEM
0,28
1,96
0,24
0,16
Sedimentationsbecken*
Bruthaus Versuchsrinne
Teiche Außenanlage (Nr.5)
*direkt gespeist über die Quelle
Als weitere Werte wurden nur im zur experimentellen Erbrütung verwendeten Wasser
(Bruthausleitung) ermittelt:
SBV
6,76 mmol/l
± 0,09 mmol/l
CO2
66,07 mg/l
± 6,0 mg/ml
Leitfähigkeit
543 µS
± 12,46 µS
Karbonathärte
20 °dH
-
Gesamthärte
>26 °dH
-
77
-3. Ergebnisse-
Der SBV-Wert unterlag Schwankungen von bis zu 20 mmol/l. In den Aussenteichen
lag er um 6,5. Die Entgasung des Quellwassers sorgte für massive Präzipitation von
Karbonat und somit einer Verringerung des SBV. Die Titration mit den Messlösungen
von Merck ergab eine Karbonathärte von 20 °dH, was einem SBV von 7,15 entspricht.
Die Gesamthärte war mit dem zur Verfügung stehenden Titrierbesteck kaum noch
messbar und muss als sehr hoch eingestuft werden. Die Werte für Leitfähigkeit
erreichten Werte von 430 bis 596 µS (rel. Variationskoeffizient 2,3%).
3.7
Biologische Untersuchungen
3.7.1 Parasitologie
Bei der Untersuchung auf Parasiten wurden bei den in der Anlage (in Quell/Rückführwasser) gehaltenen Laichfischen nur wenige Ektoparasiten detektiert.
Vereinzelt wurde Trichodina gefunden, sowie einige kommensalisch lebende Ciliaten.
Es wurde bei einigen Fischen (5 von 10) eine geringe bis mittlere Belastung mit
Ichthyophtirius multifiliis festgestellt. Laichfische (BS, SS) die im sog Krebsteich
(Verbindung mit der Aufseß) gehalten wurden zeigten zusätzlich geringen Befall mit
Monogenea (Dactylogyrus), der Ichthyophtirius-Befall war etwas stärker ausgeprägt.
Diese Tiere zeigten auch leichten Befall mit Myxobolus cerebralis und Henneguya
nuesslini. Eine parasitologische Untersuchung der Fische aus dem Futterversuch die
auch zur Virologie verwandt wurde ergab lediglich mittleren Befall mit Monogenea,
sowie geringen Befall mit I. multifiliis. Darmparasiten waren gänzlich absent,
Kiemenabstriche von Fischen aus der Anlage bis auf wenige Ausnahmen ohne
besonderen Befund. Im Fazit ist zu sagen, dass die Tiere eher geringgradig mit
potentiell gefährlichen Parasiten belastet sind.
3.7.2 Toxikologie
Im GC-Massenspektrum konnten keine Hinweise auf Umweltchemikalien oder
fischgiftige Verbindungen nachgewiesen werden.
78
-3. Ergebnisse-
Eine chronische Aeromonas salmonicida-Infektion ist in der Anlage seit längerem
latent vorhanden und führt bisweilen zu erhöhten Ausfällen bei Sömmerlingen wie
vereinzelt bei Adulti („umkippen“ der Tiere, Exophthalmus, Formation großer Beulen
mit Exudat). Der Erreger wurde sowohl 2006 als auch 2007 nachgewiesen, ein
Resistenztest diente zur Planung der Bekämpfung mit Medizinalfutter. Im Zuge dieser
Diagnosen wurden alle Fische mit Symptomen gekeult und wiederholt Proben durch
die zuständigen Ämter Ende 2007 und 2008 durchgeführt. Diese verliefen in Bezug
auf virale Erreger negativ. Ab 2008 wurden nur vereinzelt Tiere mit Anzeichen der
Furunkulose beobachtet.
BS aus dem Futterversuch (3 Rogner, 3 Milchner) wurden über das Landesamt für
Gesundheit und Lebensmittelsicherheit routinemäßig untersucht. Körper und Organe
erwiesen sich als unauffällig, Leber und Niere waren frei von spezifischen
Krankheitserregern. Kiemen und Darm zeigten Befall mit Aeromonas hydrophila und
Vibrio alginolyticus. A. salmonicida wurde indes bei keinem der untersuchten Tiere
aus den Futterversuchen nachgewiesen. Eine Probe von Leber und Niere zeigte das
Vorhandensein von Vibrio metschnikovii. Desweiteren wurde eine Infektion mit IPN
festgestellt, eine Viruserkrankung welche auch die Gameten infizierter Laichtiere
betreffen kann. Auch in einer weiteren Untersuchung von Tieren aus der Anlage, die
nicht für die hier beschriebenen Versuche verwendet wurden, konnte das Virus
nachgewiesen werden. In Eiproben konnte das IPN-Virus dagegen nicht festgestellt
werden. Es ist notwendig diese Problematik in Zukunft verstärkt zu beobachten.
3.7.4 Genetische Analyse von Bachforellen
Die bearbeiteten Mikrosatelliten-Loci sind in separaten Linkage-Gruppen angesiedelt,
was eine genetische Kopplung ausschließt (Gharbi et al. 2006, Str-543 war hier nicht
aufgeführt). Die Allelfrequenzen der Loci pro Herkunft befinden sich in Anhang E,
Genotyp-Daten der Einzeltiere in Anhang F. Betrachtet man die Genotypen an den 8
ausgewählten Loci, so ist zu beobachten, dass die 6 Tiere der Herkunft K jeweils an 4
Loci, 3, 1, 5, 2 und 4 Loci, die der Herkunft Aw an 2, 4, 3, 1, 1 und 4 und jene der
Herkunft S an 4, 4, 3, 1, 4 und 4 Loci homozygot sind. Schon dies verdeutlicht, dass
79
zwischen
den
Tieren
der
-3. Ergebnisse-
Einzelpopulationen
sehr
unterschiedlich
hohe
Heterozygotiegrade zu erwarten sind. Der F-Wert misst die genetische Struktur einer
Population, Fis ist der Anteil der Varianz eines Individuums in einer Subpopulation.
Hohe Fis-Werte (bis 1) stehen für eine Abweichung genotypischer Frequenzen von
panmiktischen Gegebenheiten und bedeuten einen hohen Grad an Inzucht. Die
erwarteten Homo- und Heterozygotiefrequenzen, sowie Fis (Inzuchtkoeffizient)
wurden mittels der Methode von Weir & Cockerham (1984) (W&C) sowie bei Analyse
über einzelne Loci nach Robertson & Hill (1984) (R&H), unter Verwendung der
Levene-Korrektur, berechnet. Die wichtigsten Daten aus der Analyse der bearbeiteten
Loci für die jeweiligen Herkünfte wurden zusammengefasst, die Markov-Chain
Parameter betrugen jeweils: Dememorization: 1000, Batches: 100, Iterations per
batch: 1000. Die Analyse der Fis-Werte für die einzelnen Loci der 3 Herkünfte sind im
Folgenden
dargestellt
Homozygotie,
HetExp
(HomExp
=
=
erwartete
Homozygotie,
HomObs
=
beobachtete
HetObs
=
beobachtete
Heterozygotie,
Heterozygotie):
Herkunft K
Fis (total)
Locus
HomExp
HomObs
HetExp
HetObs
Str-15
2.1818
3
3.8182
3
+0.2308
+0.1873
Str-60
2.4545
3
3.5455
3
+0.1667
+0.1393
Str-543
1.0000
2
5.0000
4
+0.2157
+0.2833
SsoSL-417
0.3636
0
5.6364
6
-0.0714
-0.0571
SSoSL438
0.8182
3
5.1818
3
+0.4444
+0.5583
Ssa-85
2.2727
5
3.7273
1
+0.7500
+0.5400
Ssa-197
1.7273
1
4.2727
5
-0.1905
-0.1444
OKI-10
0.6364
2
5.3636
4
+0.2727
+0.1000
Herkunft Aw
W&C
R&H
Fis (total)
Locus
HomExp
HomObs
HetExp
HetObs
W&C
R&H
Str-15
2.7273
4
3.2727
2
+0.4118
+0.4667
Str-60
2.8182
2
3.1818
4
-0.2903
-0.1750
Str-543
1.0000
1
5.0000
5
-0.0000
-0.0100
SsoSL-417
0.7273
3
5.2727
3
+0.4545
+0.4667
SSoSL438
1.4545
2
4.5455
4
+0.1304
+0.0725
Ssa-85
1.5455
2
4.4545
4
+0.1111
+0.0083
Ssa-197
0.3636
1
5.6364
5
+0.1228
+0.1000
OKI-10
0.3636
0
5.6364
6
-0.0714
-0.0375
80
-3. Ergebnisse-
Herkunft S
Fis (total)
Locus
HomExp
HomObs
HetExp
HetObs
W&C
R&H
Str-15
1.7273
3
4.2727
3
+0.3182
+0.2650
Str-60
2.4545
2
3.5455
4
-0.1429
-0.1357
Str-543
1.0000
4
5.0000
2
+0.6226
+0.5583
SsoSL-417
3.3636
3
2.6364
3
-0.1538
-0.0833
SSoSL438
2.0000
2
4.0000
4
-0.0000
+0.0083
Ssa-85
2.4545
4
3.5455
2
+0.4595
+0.2964
Ssa-197
2.4545
2
3.5455
4
-0.1429
-0.1357
OKI-10
0.8182
0
5.1818
6
-0.1765
-0.0833
Aus den Daten ergeben sich folgende mittlere Inzuchtkoeffizienten (W & C):
K:
0,2749 ± 0,0843
Aw: 0,1086 ± 0,0861
S:
0,0980 ± 0,1132
Die Fis-Werte der Herkunft S zeigten also im Mittel die schwächsten Abweichungen
von der erwarteten Heterozygotie, die Gruppe K kann als die vermutlich am stärksten
ingezüchtete
Population
betrachtet
werden.
Über
alle
Loci
waren
die
Wahrscheinlichkeiten der genotypischen Differenzierung für Populationspaare für S
und K sowie S und Aw hochsignifikant verschieden (P < 0,00001, Fisher´s Methode),
waren für Aw und K dagegen nicht signifikant (P = 0,36). Die globale F-Statistik nach
Weir & Cockerham (1984) ergab folgende Matrix für Analyse aller Loci: Aw & K 0,016,
Aw & S 0,23 (P < 0,005), S & K 0,22 (P < 0,005). Dies deutet auf eine eher hohe
genetische Distanz der Herkunft S zu beiden anderen Herkünften und eine relativ
nahe Verwandtschaft der Herkünfte Aw und K hin. Die PhiPTDist-Werte aus einer
weiteren Analyse mit der Software GenAlEx bestätigten das Ergebnis aus der
Berechnung in Genepop. Keine Abweichung vom HWE wäre für die Berechnung der
Fst-Werte zwar Voraussetzung, eine Berechnung wurde wegen der geringen
Probenzahl aber nicht durchgeführt und hypothetisch angenommen. Die AMOVA nach
Weir & Cockerham (1984), Excoffier et al. (1992) und Weir (1996) ergab, dass die
genetische Variabilität zwischen den Herkünften 17,62 % und die innerhalb der
Herkünfte 82,37 % an der insgesamt beobachteten genetischen Variabilität beträgt.
Das bedeutet, dass der größte Anteil an genetischer Variabilität innerhalb der 3
Gruppen zu finden ist.
81
-4. Diskussion-
4 Diskussion
Im Rahmen des vorliegenden Projekts konnten zahlreiche Erkenntnisse gewonnen
werden, die zur Klärung der konkreten Probleme bei der Erzeugung von Nachkommen
der untersuchten Arten beitragen. Viele der Resultate haben darüber hinaus
allgemeingültigen Charakter und sind zum Teil auf andere Salmonidenarten
übertragbar. Dabei müssen jedoch lokale und herkunftspezifische Gegebenheiten mit
berücksichtigt werden. Sicher können in einem solchen Rahmen nicht alle
möglicherweise wirkenden Faktoren in ausreichender Weise beleuchtet werden, es
wurde jedoch Wert auf eine möglichst umfassende Ausrichtung der Untersuchung
gelegt, um die Problematik sicherer eingrenzen zu können.
Bei den jeweiligen Experimenten wurde generell mit Fischen gearbeitet, welche die
defizitären Reproduktionsphänomene zeigten. Dabei wurde zum Teil exemplarisch mit
den 3 in Aufseß gehaltenen Salmonidenarten gearbeitet, wobei die für die jeweiligen
Versuche geeignete Art nach praktischen Kriterien und der Aussagekraft der jeweils
zu erwartenden Resultate ausgewählt wurde. So wurden für Kreuzungsversuche
bewusst BF ausgewählt, um genetische Komponenten, die auch bei Wildfischen zum
Tragen
kommen
(Personalbedarf,
könnten,
zu
bearbeiten.
Verfügbarkeit
reifer
Auch
aus
Laichfische,
praktischen
erforderlicher
Gründen
Platz
in
Erbrütungseinheiten) konnten nicht alle Untersuchungen mit allen Fischarten
durchgeführt werden. Die zeitgleiche Erfassung von Motilitätsparametern von SS war
z.B.
nicht
möglich.
Daten
von
den
verwendeten
SS
müssen
in
diesem
Zusammenhang besonders kritisch betrachtet werden, da diese laut vorangegangener
Untersuchungen im Auftrag der Fischereifachberatung Oberfranken keine reinerbigen
SS darstellen, sondern einen geringen Anteil von BS-Erbanlagen tragen.
In den Versuchen wurde Wert auf die Reproduzierbarkeit gelegt, die hierfür gesondert
geprüft wurde. Daten zu Einzelrognern beispielsweise können so als gesichert gelten.
Wichtig war die Verwendung einheitlicher Spermienkonzentrationen anstatt Volumina.
In Versuchen zum Vergleich von Milchnern ist es wissenschaftlich nicht korrekt die
gleichen Volumina an Ejakulat zu verwenden, da sich die Spermienkonzentrationen
stark unterscheiden können (Rurangwa et al. 2004). Des Weiteren wurde durch eine
Konzentrationsreihe
Versuchsaufbau
der
getestet.
Effekt
In
der
Spermienkonzentration
Experimenten
war
ein
eher
im
verwendeten
geringes,
82
eben
-4. Diskussion-
ausreichendes Spermien/Ei-Verhältnis zu verwenden, da Überkonzentration Effekte
bei der Befruchtung verschleiern können (Suquet et al. 1995). Die bei Versuchen
verwendete experimentelle Befruchtungsmethode war daher nicht darauf ausgelegt,
maximale BR zu erzielen, was sich im direkten Vergleich bestätigte (3.5.1). Grund
hierfür ist sicher die unmittelbar erfolgende, relativ hohe Verdünnung der
Spermiensuspension bei der Zugabe zu den Eiern. Vielmehr ergab sie ähnliche BR
beim Vergleich mit verschiedenen Methoden die in der Praxis verwendet werden, und
lieferte im kleinen Maßstab deutlich besser reproduzierbare Werte.
Angesichts der stark ausgeprägten Problematik mit teils hohen Verlustraten wurde
generell davon ausgegangen, dass ein potentiell zu erzielender experimenteller Effekt
deutlich sichtbar sein sollte. Die Versuche waren daher so angelegt, um eine
biologische Wirksamkeit von mindestens Δ = 0,3-0,4 nachzuweisen.
4.1
Ergebnisdiskussion und Literaturvergleich
4.1.1 Fertilisationserfolg und Entwicklung
Oft konnten im normalen Brutbetrieb nur in Ausnahmefällen SR von über 50% erzielt
werden. Es ist dabei davon auszugehen, dass eine höhere BR i.d.R. auch eine höhere
SR bedeutet. Überraschenderweise gab es gelegentlich auch ganze Chargen im
Brutbetrieb (v.a. bei Elsäßer Hybriden und BF), die hervorragende BR und SR über
80% zeigten. Es ist zu vermuten, dass diese Ausnahmen zustande kamen, indem
bestimmte Gruppen von Rognern, welche gleichzeitig ovulierten, aber zeitlich
abgegrenzt von anderen Subpopulationen eine reproduktiv bessere Disposition boten
als das Gros der Laichtiere. In Aufseß werden Laichfische verschiedenen Alters,
Artzugehörigkeit und Herkunft zusammen gehalten, was bisweilen in der Laichperiode
problematisch sein kann.
Nach den Beobachtungen im Rahmen der Untersuchung koagulierten die bebrüteten
Eier während der gesamten Entwicklungsdauer. Es waren zumindest bis zum APStadium keine Zeiträume vorhanden, in denen bei allen Eichargen sichtlich höhere
Verluste auftraten als in anderen. Es war zunächst wichtig zu erfahren, ob die BR in
etwa der Entwicklungsrate entspricht, da meist nicht klar erkennbar ist, ob koagulierte
Eier bereits einen entwickelten Embryo enthalten (und damit befruchtet waren) oder
unbefruchtet waren. In fast allen Versuchen wurde ein Großteil der abgesammelten
83
-4. Diskussion-
(koagulierten) Eier geklärt und untersucht. Die hieraus gewonnenen Resultate sind
dem Bericht nicht nur aufgrund des Umfangs, sondern auch ob deren Aussagewert
nicht beigefügt und seien im Folgenden nur kurz umrissen. Ähnlich wie bei den im
Brutbetrieb analysierten koagulierten Eiern, waren hier nur bei wenigen sicher Reste
von Zellwachstum detektierbar. In vielen Fällen traten hohe Verluste bereits in den
ersten 10 Tagen der Entwicklung auf, Reste der Keimscheibe waren aufgrund nicht
mehr löslicher Präzipitate kaum erkennbar, die innere Struktur der Eier war meist
aufgrund
von
Ruptur
der
Dottermembran
kollabiert.
Auch
verschiedene
Färbeversuche brachten hier keinen Erfolg. Zudem war nicht ersichtlich, ob ein bereits
teilweise zersetzter Embryo enthalten war, die Eier jedoch über Wochen nicht
koaguliert waren. Versuche mit toten Eiern und sicher befruchteten zeigten, dass bis
zu ca. 70% sicher befruchteter BS-Eier schon ca. 2 Tage nach deren Koagulierung bei
Klärung des Präzipitats nicht mehr als solche erkennbar waren. Dies bedeutet, dass
die Angaben über die BR bereits koagulierter Eier äußerst kritisch betrachtet werden
müssen und evtl. doch mehr Eier befruchtet waren als zunächst vermutet. Erschwert
wird die Analyse dadurch, dass geschädigte und tote Embryonen nicht immer als
solche erkennbar sind. Eier werden nicht immer „weiß“ aufgrund eines Absterbens des
Embryos, sie können sogar wochenlang keinerlei Anzeichen zeigen und dennoch
bereits tot sein (Stoddard et al. 2005). Demnach war keine eindeutige Aussage zum
Befruchtungsstatus bei der Mehrzahl der koagulierten und geklärten Eier aller
untersuchten Arten möglich. Ab der gut sichtbaren Ausbildung der Längsachse und
fortgeschrittener Cephalisation (Zeitpunkt abhängig von der Fischart und der
Temperatur) können bessere Aussagen getroffen werden. Dies ist jedoch i.d.R.
nutzlos, da zu diesem Zeitpunkt oft bereits ein großer Teil der Verluste stattgefunden
hat.
Eine große Zahl der aufgelegten Eier war demnach vermutlich nicht befruchtet und die
Dottermembran wurde sodann durch biologische Desintegration oder physikalische
Umstände zu einem beliebigen Zeitpunkt beschädigt. Des Weiteren sind Effekte von
fortschreitender Verpilzung auch vitaler Eier von in Brutgläsern aufgelegten Chargen
durch einzelne abgestorbene ungünstig für die Gesamtbilanz. Letzeres verdeutlicht
die Notwendigkeit, eine möglichst frühzeitig anwendbare Methode zur Bestimmung
der BR zur Hand zu haben. Ob unbefruchtete Eier überhaupt befruchtbar gewesen
wären, könnte nur über Versuche mit hohem Spermien-Ei-Verhältnis an Einzeltieren
überprüft werden. Möglicherweise kann der schlechten BR durch ein hohes Spermien84
-4. Diskussion-
Ei-Verhältnis, sowie durch Entnahme von Milch vieler Milchner gegengesteuert
werden (siehe Abschnitt 4.1.2).
In einem Großteil der in diesem Bericht beschriebenen Experimente waren deutliche
Unterschiede der einzelnen Paarungen/Stichproben festgestellt worden. Diese hohen
Schwankungen können nicht durch methodische Ungenauigkeit erklärt werden, zumal
die Reproduzierbarkeit der angewandten Fertilisationsmethode bei den Einzelproben
stets gegeben war. Die Gameten der betroffenen Versuchstiere wiesen keinerlei
Auffälligkeiten auf, welche die gefundenen Unterschiede erklären könnten. Auch ein
Zusammenhang
zwischen
empirischen
Parametern
war
nicht
auszumachen.
Wiederholt berichteten Autoren von stark variierenden Erbrütungserfolgen innerhalb
einer Population von Fischen. Der Reproduktionserfolg schwankt dabei auch bei
Salmoniden stark, ohne dass klare Gründe hierfür gefunden werden konnten
(Bromage et al. 1992, Su et al. 1997). Manche Autoren sehen Salmoniden-Rogner mit
weniger als 80% lebensfähigen Embryonen bereits als subfertil an (Stoddard et al.
2005). Bei vielen Fischarten produzieren manche Rogner nicht lebensfähige Eier
(Craik & Harvey, 1984, Nagler et al. 1999), sogar innerhalb der Eicharge eines Tieres
können bestimmte Anteile nicht befruchtbar sein (Bromage & Cumaranatunga 1988,
Kjorsvik 1994, Trippel 1988, Nagler et al. 2000, Kjorsvik et al. 2003, Lahnsteiner &
Patarnello 2004). Betrachtet man andere Arten, so schwankten beispielsweise BR der
Äsche zwischen 30 und 80% (Plomann 1997), bei Lachsen erreichten Aas et al.
(1991) BR von 67-87%. Bei marinen Fischen kann diese Zahl noch sehr viel niedriger
liegen, wobei hier noch Forschungsbedarf besteht um die Parameter der
angewandten Methoden zu verbessern.
Saiblinge
zeigten
auch
in
Untersuchungen
anderer
Autoren
schlechte
Überlebensraten von um die 45- 60%, (Dumas et al. 1992, Reiter 2006). Bascinar &
Okumus (2004) erhielten eine mittlere SR von 56,5% bei BS, die zwischen den
individuellen Rognern ebenso stark schwankte. Die SR bei BF aus Aufseß variierten
auch in der Vergangenheit bereits sehr stark (31-99%, Ø 82,9%, Tombek 1998),
wobei die Produktion schlechter Eier von Einzeltieren durchaus von Jahr zu Jahr
reproduzierbar war. Um die während diesen Untersuchungen des Öfteren festgestellte
hohe
Variabilität
der
Einzeltiere
besser
einschätzen
zu
können,
wurden
Einzelpaarungen durchgeführt. SS-Rogner, im Versuch mit sehr niedrigen SR von
maximal 52%, zeigten eine Spannweite von 35% bei der SR, bei BS variierte diese
85
-4. Diskussion-
sogar um über 63%. Interessant war in diesem Zusammenhang, dass die Variabilität
der Rogner von SS auch bei Verwendung unterschiedlich vieler Milchner (siehe 3.5.9)
annähernd erkennbar blieb. Dies verdeutlicht den maternalen Einfluss auf den
Reproduktionserfolg und kann bei ungünstiger Auswahl dramatische Verlustraten
erzeugen, je nachdem, wieviele negativ behaftete Gameten in die jeweilige Charge
eingebracht werden. Jedoch war auch der paternale Einfluss zumindest bei BS enorm
mit einer Spannweite von 81% bei den SR. Beide Effekte können sowohl durch
praktische bzw. beeinflussbare Gametenqualität (Reifegrad) oder durch genetische
Prädisposition hervorgerufen werden.
Es wurde demzufolge deutlich, dass die verwendeten Einzeltiere entscheidenden
Einfluss auf den Bruterfolg innehaben. Milchner und Rogner für sich genommen liefern
einheitliche Gameten mit in einem gewissen Rahmen reproduzierbaren Werten für SR
und BR. Das Gesamtergebnis einer Befruchtung mit mehreren derart variablen
Laichtieren beruht demnach zu großen Teilen auf zufälligen Paarungen „guter“ und
„schlechter“ Einzeltiere, was die beobachtete Problematik in gewissen Teilen erklären
könnte.
Inkompatibilitäten
zwischen
den
Einzeltieren
aufgrund
der
Abstammungshistorie könnten den Zustand ebenfalls erklären.
Eier im AP-Stadium haben normalerweise eine hohe Überlebenswahrscheinlichkeit
(Springate et al. 1984). Letale Fehlentwicklungen oder die Ausbildung äußerst
schwach entwickelter Larven (die im späteren Verlauf meist abstarben) waren aber bei
allen Arten in wechselndem Maße beobachtet worden. Hohe Ausfälle waren v.a. bei
SS zu verzeichnen, die oft auch sehr niedrige BR und SR zeigten. Anteile der
befruchteten, aber nach dem AP-Stadium absterbenden Eier lagen zwischen 10 und
25%, in Ausnahmefällen (wie in der Saison 2008/2009) starben große Mengen an
Brütlingen erst nach dem Schlupf. Dies stellt evtl. eine Verlagerung der Problematik
wenig vitaler Nachkommen (evtl. aufgrund genetischer oder physiologischer Defizite)
auf die Brütlingsphase dar. Schlupfprobleme bedeuten allerdings nicht zwingend
Entwicklungsprobleme, sie könnten durch physikalische Faktoren bedingt sein.
Dementsprechend ist die SR nicht mit einer erfolgreichen Entwicklung gleichzusetzen,
die in solchem Falle höher wäre. In der Literatur wurde wiederholt die Sterblichkeit von
Salmoniden während der Brutphase erörtert. Stoddard et al. (2005) stellten einen
Großteil der Embryonensterblichkeit lediglich einen halben Tag nach Befruchtung fest.
Sie bekamen ebenfalls sehr variable Ergebnisse, da bei manchen Paarungen die
86
-4. Diskussion-
Überlebensrate der Embryonen bis auf 4% sank. Washburn et al. (1990) fanden
reduzierte
Überlebensraten
bis
zum
Augenpunktstadium
bei
defizitärem
Zuckerstoffwechsel. Entwicklungsprobleme könnten sich auch aus dem Reifegrad der
verwendeten Eier ergeben. Zu früh gestreifte Eier könnten sich in schlechten
Fertilisationsraten oder gestörter Entwicklung niederschlagen (Bromage et al. 1992).
Die Entwicklung der Eier ist trotz dem Umstand, sie manuell aus der Bauchhöhle
drücken zu können, u.U. noch nicht abgeschlossen, nach der Ovulation müssen noch
die letzten Meiosephasen beendet werden. Bei Regenbogenforellen konnte ein durch
die maternalen mRNA-Level bestimmter Stop der Entwicklung nachgewiesen werden
(Aegerter et al. 2005). Hayes (1939) beobachtete 3 Wochen vor dem Schlupf eine
hohe Mortalität der Embryonen, wobei diese teilweise opak wurden, jedoch z.T.
verkümmerten, aber noch am Leben waren (Herzschlag). Diese Beobachtungen
ähneln den im vorliegenden Projekt gefundenen unterentwickelten Embryonen, die bei
einzelnen Paarungen aller Arten gefunden wurden. Ob dieses Phänomen genetische
Gründe hat, ist unbekannt. Das sog. Kopfschlüpfer-Problem könnte durch Faktoren
der Eischale bedingt sein, da diese u.U. aufgrund des pH-Wertes des Wassers nicht
mehr vom Brütling angedaut werden kann (Kügel et al. 1990). In den respektiven
Experimenten des Autors waren jedoch z.T. extreme pH-Werte von bis weit unter 6
verwendet worden. Dagegen spricht auch, dass solche Schlüpfer zumeist zeitlich vor
allen anderen, normal schlüpfenden, und gehäuft bei Gelegen bestimmter Rogner
auftreten (eigene Beobachtungen).
4.1.2 Fertilisationspraxis
Die weitläufig angewandten Methoden zur Befruchtung bei Salmoniden sind zwar
ähnlich, unterscheiden sich aber in gewissen Details. Die Befruchtung von Eiern mit
Ovarialflüssigkeit war der trockenen Methode im direkten Vergleich überlegen (siehe
3.5.1). Wenn die Gametenkonzentration und die zeitlichen Parameter der Zugabe von
Sperma optimiert sind, spielt jedoch die verwendete Methode eine untergeordnete
Rolle (Seyfried, unveröffentlicht). Obgleich Liley et al. (2002) bereits 5 s nach Zugabe
von Spermien über 80% BR erreichen konnten, zeigte in dieser Untersuchung das
Waschen erst nach 1 h eine Steigerung der BR von 15%. Bei Mehrfachbefruchtungen
stellte
sich
heraus,
dass
oft
1
Milchner
unverhältnismäßig
stark
in
die
Nachkommenschaft eingeht. Campton (2004) schob dies auf die Vitalitäts- und
87
-4. Diskussion-
Motilitätsunterschiede der Spermien der verschiedenen Milchner. Nach der KamikazeSpermien-Hypothese (Baker & Bellis 1988, Parker 1990) sind bei vielen Tieren auch
nur bestimmte Spermien zur Befruchtung befähigt, während die restlichen als
„Soldaten-Spermien“ solche anderer Milchner inaktivieren sollen. Dies sollte im
Versuch
zur
Spermienkonkurrenz
untersucht
werden.
Bei
gleichen
Spermienkonzentrationen war die BR von SS bei Verwendung mehrerer Milchner
jedoch höher als bei Verwendung nur eines Milchners. Ein besserer Ansatz ist es also,
gleichzeitig Spermien möglichst mehrerer Milchner zu verwenden. Hierbei können die
negativen Eigenschaften des Ejakulats eines Milchners durch Milch von anderen
wieder aufgehoben werden.
SS zeigten bei allen Versuchen stark schwankende und meist auch generell niedrige
BR. Die Befruchtungstemperatur könnte bei SS einen kritischen Faktor darstellen,
der genaue Wert scheint aber für die BR in dem Bereich unter 8°C keine große Rolle
zu spielen. Die Hypothese, dass evtl. die Befruchtung von SS-Eiern bei niedrigeren
Temperaturoptima besser verlaufen müsste, erwies sich nach den Ergebnissen unter
3.5.2 als nicht haltbar.
Auch das Laichfischalter kann die SR beeinflussen. Junge Tiere haben oft eine
höhere Spermienkonzentration im Ejakulat, wobei die Motilitätscharakteristika ähnlich
zu sein scheinen (Liley et al. 2002). Die Spermaqualität sinkt dabei nach Campton
(2004) mit dem Alter der Laichfische. Dagegen waren die Überlebensraten von
Gelegen zweijähriger Regenbogenforellen in einer Untersuchung von Bromage &
Cumaratunga (1988) gegenüber jenen von dreijährigen Tieren jedoch um 17%
erniedrigt, was auf einen positiven maternalen Effekt hindeutet. Dannewitz et al.
(2004) berichteten von einer positiven Korrelation des Bruterfolgs mit der Größe von
BF-Rognern. Ältere BF-Rogner produzieren außerdem größere Eier (Tombek 1998,
Schubert 2001). Junge BS-Laicher zeigten in dem hier beschriebenen Versuch im
Mittel zwar keine geringere SR als die ein Jahr älteren Tiere, ihre SR war jedoch von
Tier zu Tier viel unterschiedlicher als dies bei älteren Laichern der Fall war. Der Grund
hierfür kann hormoneller Natur sein, oder durch die Produktion von Eiern mit
unzureichender Ausstattung zustande kommen.
Stress reduziert die Fertilisationsrate bei verschiedenen Fischarten (u.a. Kjesbu 1989,
Morgan
et
al.
1999).
In
unserem
Versuch
konnte
keine
stressbedingte
Beeinträchtigung der SR von BS gefunden werden. Allerdings bleibt ein Vergleich von
direkt vor der Laichzeit z.B. durch vermehrtes Handling, Verbringung in kleinere
88
-4. Diskussion-
Innenbecken oder Betäubung mit in dieser Periode in Teichen verbliebenen Laichern
offen. Wiederholter Stress über einen längeren Zeitraum wie im Versuch kann zu
schneller Adaptation führen, was die Unterschiede wiederum minimiert haben könnte.
Betäubung verkürzt die Motilitätsdauer von Regenbogenforellen-Spermien (Wagner
2002). Die Betäubung der zu streifenden Tiere hatte, nicht wie oft vermutet, keinen
negativen Effekt auf die BR von BS. Der sogar besseren BR der betäubten Tiere
könnte die leichtere Eientnahme unter Vermeidung zu starken Drucks zugrunde
liegen.
4.1.3 Ermittlung der Befruchtungsrate
Für den Züchter wäre das frühe Wissen um die BR seiner einzelnen Eichargen von
enormem Vorteil, da hierdurch die maximale Ausbeute besser abzuschätzen ist und
der Bedarf beurteilt werden kann, der für den Betrieb erforderlich ist. Auch ein
Verwerfen einer nur schwach befruchteten Charge kann dem Personal viel Arbeit
ersparen. Verschiedene Farbstoffe und Fluoreszenz-Chromophoren brachten bei
Salmonideneiern aber keine praktikablen Erfolge, obwohl z.B. Acridinorange seit
langem für Zell-Vitalitätstests verwendet wird (Hathaway et al. 1964). Um die BR zum
Zwecke der Vorsortierung möglichst frühzeitig festzustellen, hat sich die unter 3.4
beschriebene Färbung mit Neutralrot bewährt. Omnes et al. (2000) hatten ebenso
erfolgreich Neutralrot angewendet, nach deren Angaben vitale Zellen den Farbstoff
aktiv in die Lysosomen aufnehmen. Der Nachteil vieler biologischer Farbstoffe sind
ihre giftigen/carcinogenen Eigenschaften. Neutralrot ist auch in verdünnten Lösungen
giftig
und
daher
mit
Vorsicht
zu
verwenden
(Romeis,
1928).
In
diesem
Zusammenhang sei auf das Buch von Keller & Chiego (1949) verwiesen, die z.B.
erfolgreich Vitalfärbungen nach Ehrlich und Unna anwendeten. Befruchtete Eier ab
dem 20. Tag der Erbrütung sind dagegen leicht nach Zugabe von Essigsäure
(verschieden je nach Temperatur) identifizierbar. Es hat sich sehr bewährt, diese
Beurteilung unter Zuhilfenahme eines Durchlichttisches durchzuführen.
89
-4. Diskussion-
4.1.4 Gametenqualität
Es existiert viel anekdotisches „Wissen“ aus Fallbeschreibungen zu diesem Thema,
wissenschaftliche Beweise für viele Behauptungen waren in der Vergangenheit eher
die Ausnahme (Brooks et al. 1997). Daher sind die meisten Faktoren, welche die Eiund Spermaqualität beeinflussen immer noch unbekannt. Dennoch gilt die Eiqualität
als wichtigstes Kriterium für eine erfolgreiche Zucht. Lahnsteiner et al. (2001) fanden
keine Korrelation der BR mit dem Gehalt an bestimmten Proteinen, Peptiden, Zuckern,
Nuklein- und Fettsäuren bei Cypriniden. Positive Korrelation beobachteten die Autoren
aber zwischen mit dem Ovarialplasma-pH, der Proteinkonzentration und bestimmten
Enzymaktivitäten. Laut Gillet (1994) kann die Manipulation der Photoperiode durch
Verzögerung der Ovulation bei SS Eier besserer Qualität hervorbringen. Fazit scheint
zu sein, dass die biochemische Zusammensetzung der Eier eine untergeordnete Rolle
spielt, zumal z.B. Energiereserven irrelevant für die BR sind, jedoch in der Entwicklung
eine wichtige Rolle spielen könnten. Zudem ist anzumerken, dass die meisten mit
minderer
Eiqualität/BR/SR
korrelierenden
biochemischen
Parameter
des
Ovarialplasmas eher als Ergebnis einer schlechten Eiqualität angesehen werden
müssen, und nicht deren Ursache darstellen. Daher können Messungen einzelner
Werte leicht zu falschen Aussagen führen.
Eine sehr wichtige Rolle spielt der Status der Eireife, die bis heute einen der wenigen
gesicherten Faktoren für unterschiedliche SR bei Salmoniden darstellt (Bromage et al.
1992). Zu früh gewonnene Eier sind möglicherweise nicht voll entwicklungsfähig.
Bromage et al. (1992) fanden 4-10 Tage nach Ovulation gleichbleibend gute BR (bei
10°C) von Forelleneiern verschiedener Größe. Schon Nomura et al. (1974)
beschrieben detailiert Probleme mit überreifen Eiern von Regenbogenforellen. Das
Streifen von überreifen Eiern in einen Eipool kann den Befruchtungserfolg massiv
beeinträchtigen, da die Milch teilweise koaguliert (Greenberg, 1960) und die
Spermienbewegung
inhibiert
wird
(Dietrich
et
al.
2007a).
Homogene
Lipidtröpfchenverteilung und einheitliche Größe können als Qualitätsparameter für SSEier verwendet werden (Mansour et al. 2008) und spiegeln wahrscheinlich den
Eireifegrad
wider.
Koaleszierte
Öltropfen
stellen
demnach
ein
schlechtes
Qualitätsmerkmal dar, da selbst geringe Anzeichen derartiger Ansammlungen die BR
um über 55% erniedrigten. Nach diesen Merkmalen als schlecht eingestufte SS-Eier
90
-4. Diskussion-
nzeigten eine BR gegen Null, was den in dieser Untersuchung gemachten
Beobachtungen entspricht (3.5.3). Auch eine höhere Gewichtszunahme nach dem
Aushärten und ein niedrigerer pH-Wert des Ovarialplasmas (unter pH 8,3 bis 7,6)
unterschied laut den Autoren signifikant gute von schlechten SS-Gelegen (siehe
weiter unten). Dieselben Erkenntnisse wurden von den Autoren bereits vorher für
Gelege von BF beschrieben (Mansour et al. 2007), wobei auch Ausnahmen dieser
Zusammenhänge eingeräumt wurden, da auch optisch gute Eichargen immer wieder
sehr schlechte SR zeigten. Zwischen Eiern, die zuerst die Bauchhöhle verlassen, und
solchen die zuletzt „ausgestreift“ werden, gab es bei BS keine Unterschiede in der SR.
Die Qualität bzw. Reife der Eier von einzelnen Rognern wird demnach nicht durch die
Lage im Bauchraum bestimmt, was bei der sich über viele Stunden bis Tage
hinziehenden Ovulation durchaus möglich wäre.
Histologische Untersuchungen von BS-Eiern demonstrierten die apikalen Strukturen in
der Region der Keimscheibe. Die dünne Vitellinmembran (= „Dotterhaut“) umgibt den
Dotter und ist am apikalen Pol verdickt (Gray 1932). Sie formt hierdurch die
Keimscheibe und enthält spezielle Öltröpfchen und dient als trophische Zone zur
nutriellen
Versorgung
des
Embryos.
Sie
verhindert
durch
ihre
Wasserundurchlässigkeit Exosmose und stabilisiert so die internen physiologischen
Gegebenheiten im Ei. Anomalien der Dottermembran (Struktur, Dicke), welche ein
leichtes Koagulieren der (Lipo-) Proteineinschlüsse erklären könnten waren in der
histologischen Untersuchung nicht zu erkennen. Der histologische Vergleich von
Eichargen mit hohen und solchen mit niedrigen Verlusten brachte keine Auffälligkeiten
z.B. der Lipidtröpfchenverteilung oder Integrität der Dottermembran. Auch sonst waren
zumindest beim BS zwischen Eichargen mit niedrigen und hohen Verlusten strukturell
keine Auffälligkeiten erkennbar. Im Versuch zeigte sich auch die Eigewichtszunahme
nicht als verwendbarer Qualitätsfaktor.
Zur Ermittlung der Spermaqualität bei Salmoniden existieren zahlreiche Arbeiten mit
unterschiedlichsten Ansätzen. Bei Saiblingen ist die Spermaqualität bei Arthybriden
generell schlechter, die Überlebensrate nach dem AP-Stadium ist geringer als bei
Reinzuchten oder Rückkreuzungen (Dumas et al. 1996). Die Spermienkonzentration
könnte ein Anhaltspunkt für die Spermaqualität sein und Unterschiede in den
Fertilisationserfolgen verschiedener Milchner erklären. Sie beträgt bei Salmoniden in
etwa 10 Mrd./ml (Schmidt 1998). Krise et al. (1995) ermittelten Konzentrationen von
91
-4. Diskussion-
105-106 Spermien/mm3 bei 2-jährigen Lachsen. Extreme Schwankungen der
Spermienzahlen waren auffällig bei BF der Herkunft A, welche im Mittel
vergleichsweise gute Spermienzahlen von 14,5 Mrd. Spermien pro ml Ejakulat
zeigten.
Die
BF-Milchner
der
Herkunft
K
verzeichneten
etwas
höhere
Durchschnittswerte (18,2 Mrd. pro ml) mit geringerer Schwankungsbreite, die der
Herkunft S war sogar noch etwas höher. Die Spermienzahlen der BF entsprechen
generell den Anforderungen an qualitativ gutes Sperma. Bei BS war die
Spermakonzentration im Mittel geringer (12,1 Mrd. pro ml) und zeigte enorme
Schwankungen zwischen einzelnen Milchnern von bis zu 21,2 Mrd. Spermien
Differenz pro ml. Eine ähnliche Situation lag bei SS vor, die mit 0,9 Mrd. Spermien pro
ml die geringsten Spermienzahlen zeigten. Inwiefern geringe Werte auch die Fertilität
eines Milchners widerspiegeln ist noch ungeklärt, hierzu bedürfte es weiterer
Versuchsreihen. In dem Versuch 3.5.5 zur Variabilität der BS-Milchner konnte ein
solcher Zusammenhang zumindest nicht gefunden werden. Hoch konzentriertes
Sperma bringt im Übrigen nach Erkenntnissen verschiedener Autoren nicht immer die
besten BR (Geffen & Evans, 2000, Williot et al. 2000).
Dass aber die Konzentration der Spermien gegenüber der Eizahl bei der Befruchtung
einen profunden Einfluss auf die BR hat, konnte bestätigt werden. Mit der
experimentellen Methode zur Befruchtung zeigte sich eine um 17% niedrigere BR bei
Verwendung von nur 60 000 Spermien pro BS-Ei als mit 600 000. Bedacht werden
müssen hier natürlich die Volumenverhältnisse zwischen Spermienlösung und
Eimenge. Hier sollte ein im Einzelfall zu bestimmendes kritisches Verhältnis nicht
unterschritten werden. Aber selbst Versuchstiere mit geringer Spermienkonzentration
zeigten teils sehr gute BR, in den Versuchen wurde die Konzentration ohnehin immer
gleich eingestellt und konnte hier keine Rolle spielen. Hieraus ergibt sich, abgesehen
von einer gewissen natürlichen Schwankungsbreite und bisweilen niedrigerer Werte,
kein
problematischer
Zustand.
Sicher
spielt
in
der
Praxis
nicht
nur
die
Spermienkonzentration, sondern auch die Ejakulatmenge eine Rolle. Bei SS wurde
meist eine wesentlich geringere Ejakulatmenge festgestellt.
Manche Autoren postulierten morphologische Eigenschaften von Spermien wie deren
Schwanzlänge als Gradmesser für deren Fitness unter bestimmten Bedingungen
(Vladic et al. 2002). Morphologisch konnte bei den Spermien aller Arten in dieser
Untersuchung keine aberranten Strukturveränderungen ausgemacht werden, soweit
dies im Lichtmikroskop erkennbar ist.
92
Bewegungsparameter
aktivierter
-4. Diskussion-
Spermien
werden
gemeinhin
als
geeignete
Qualitätsfaktoren angesehen. Trotz hoher Motilität kann es sich bei einer
Spermaprobe aber dennoch um Gameten ohne die Fähigkeit zur Fertilisation handeln
(Liley et al. 2002). Dem entgegen stellen nach Aas et al. (1991) qualitativ stark
variierende Gameten einzelner Milchner einen Hauptgrund für die Schwankung der
Fertilisationsrate dar. Eine positive Korrelation zwischen hoher Motilität und BR bei
Salmoniden fanden z.B. Lahnsteiner et al. (1998) und Gage et al. (2004), das
Gegenteil resultierte aus Studien von Hoysack & Liley (2001) und Linhart et al. (2005).
Dem entgegen steht die Aussage von Truscott & Idler (1969), dass sogar
unbewegliche Spermien in der Lage sind, Eier zu befruchten. Nach einer weiteren
Studie beeinflusst Betäubung mit Propiscin die Spermienbeweglichkeit nicht (Dietrich
et al. 2005).
Powell (2002) beurteilte Motilitätsraten von Fischspermien unter 80% bereits als
schlecht. Lahnsteiner et al. (2005) maßen Motilitätsraten von lediglich ca. 66% für
Spermien von Regenbogenforellen. Aas et al. (1991) fanden Motilitätsraten zwischen
35
und
95%
bei
Regenbogenforellen-Spermien,
stellten
also
eine
hohe
Schwankungsbreite fest wie sie sich auch in der vorliegenden Untersuchung zeigte.
Die Motilitätsrate lag aber trotz Maxima von 60 (BFA), 72 (BFS) und 52 (BS) % laut
CASA teils unter den gängigen Literaturangaben. Bei allen 3 Gruppen waren auch
mehrere Milchner mit signifikant niedrigeren Werten für den Anteil aktivierbarer
Spermien gefunden worden (speziell bei BS), was für die Fertilisationsrate durchaus
entscheidend sein könnte. Je nach Testdesign steht hier aber weniger ein absoluter
als ein individueller Vergleich der Einzelmilchner im Vordergrund. Die eher geringen
Motilitätsraten könnten durch die Gegebenheiten der Analyse in der Makler-Kammer
und der im Versuch noch zu geringen Verdünnung des Ejakulats bedingt gewesen
sein.
Die
Ergebnisse
zeigen
aber
die
Wichtigkeit
einer
Kontrolle
der
Spermienaktivierbarkeit einzelner Milchner vor deren Verwendung und lassen darauf
schließen, dass gleiche Ejakulatmengen u.U. nicht gleiche Ergebnisse liefern.
Letzteres impliziert die Verwendung eher hoher Spermienkonzentrationen, um
eventuell auftretende Aktivierungsschwierigkeiten abzufedern. Die Motilitätsrate muss
aber nicht zwangsläufig mit der Fertilität korrelieren, der zusätzlich vorhandene, starke
maternale Einfluss kann hier falsche Rückschlüsse erzeugen.
93
-4. Diskussion-
Nicht nur bezüglich der Ermittlung der Geschwindigkeit der Spermienbewegung ist die
Auswertung durch CASA der subjektiven visuellen Auswertung überlegen (Kime et al.
2001). Mit steigender Temperatur nimmt die Schwimmgeschwindigkeit für gewöhnlich
zu, die Dauer der Bewegung aber ab. Die Schwimmgeschwindigkeit von BFSpermien, ermittelt durch CASA von Dietrich et al. (2007b), betrug 141 µm/s bei einer
Motilitätsrate von > 80%. Lahnsteiner et al. (1998) maßen als gut einzustufende
Schwimmgeschwindigkeit von Spermien der Regenbogenforelle 100-120 µm/s, in
einer späteren Arbeit betrug sie im Mittel 116,7 µm/s (Lahnsteiner et al. 1999a).
Dagegen waren die in dieser Untersuchung ermittelten Werte deutlich geringer. Grund
hierfür war wahrscheinlich die Tatsache, dass die Messung nicht zu Beginn der
Aktivierung erfolgte, sondern 10 s danach. Spermien werden nach der Aktivierung
stetig langsamer, der Verlauf ist dabei verschieden je nach Temperatur. Außerdem
mittelt die Analysesoftware die Werte aller als motil eingestufter Spermien, weswegen
es subjektiv festzulegen gilt, welche Spermien nun als aktiv eingestuft werden und
welche nicht. Da sich in den Proben oft solche mit viel geringerer Bewegungsintensität
und Schwimmgeschwindigkeit zeigten als andere könnte dies die Ursache für die
geringen Werte sein. Dennoch erlaubt die Messung den direkten Vergleich von
Milchnern auch aufgrund der Schwimmgeschwindigkeit der Spermien.
Die Motilitätsdauer von Spermien erhöht nach Meinung einiger Autoren die BR
(Cieresko & Dabrowski 1994, Lahnsteiner et al. 1998), andere behaupten schlicht, das
Gegenteil sei der Fall (Hoysack & Liley 2000, Liley et al. 2002). Nach Rurangwa et al.
(2004) beträgt die Bewegungsdauer von Salmonidenspermien < 30 s, für die
amerikanische Cutthroat-Forelle maßen Wagner & Arndt (2003) bis zu 44 s, wobei
eine hohe Variabilität unter den Milchnern festgestellt wurde. Es ist zu vermuten, dass
die Verdünnung hier eine entscheidende Rolle spielt und bei höherer Verdünnung der
Spermien hohe Motilität vorteilhaft ist. Die optimale Verdünnung des Ejakulats um
möglichst viele Spermien zu aktivieren und eine genügend konzentrierte Lösung zu
erhalten ist nach Powell (2002) 1:1000, wobei 1-3 ml Ejakulat pro Liter Eier
ausreichen. Die Motilitätsdauer in größeren Volumina (500 µl) ist etwa 3x so lang wie
in der vielfach verwendeten Makler-Kammer, und kann durch Gabe von Pyruvat und
Coenzym A (Zugabe schon bei Aufbewahrung) noch deutlich erhöht werden
(Lahnsteiner et al. 1999a). Nach diesen Aussagen war die in der Motilitätsanalyse
dieser Untersuchung verwendete Verdünnung der Spermien vergleichsweise gering
(150
x),
was
wiederum
die
Motilitätsdauer
bzw.
die
bereits
erwähnte
94
-4. Diskussion-
Schwimmgeschwindigkeit beeinflusst haben könnte. Die Motilitätsanalyse ergab
durchweg gute Werte für die Dauer der Spermienbewegung (nur BS und BF), die
mitunter sogar höher als manche Literaturwerte ausfielen. Hier waren die BF-Milchner
untereinander am verschiedensten, die Gameten eines Tieres waren nicht aktivierbar.
Beides
war
auch
bei
der
Messung
der
Motilitätsrate
der
Fall,
die
Schwimmgeschwindigkeit war jedoch relativ einheitlich. BF hatten aber, gemessen an
den Maximalwerten, die weitaus am längsten aktiven Spermien von im Mittel über 1
min. Natürlich ist dies eine teils subjektive Bewertung, da die Zeit bis zum Abfall auf
geschätzte 10% sich bewegender Spermien eine gewisse Ungenauigkeit mit sich
bringt. Es existiert auch ein Zusammenhang zwischen der Motilitätsdauer der
Spermien und der Zusammensetzung des Seminalplasmas (Alavi & Cosson 2006).
Die Motilitätsraten von Regenbogenforellen korrelieren mit einem Ovarialplasma-pHWert, der höher als der des Seminalplasmas und stets über 8,2 liegt (Wojtczak et al.
2004). Unterschiede im pH des Seminalplasmas waren bei allen Arten apparent und
zeigten Spannweiten von 7,49 bis 8,61. Bei BF der Herkunft K traten nur Werte von
7,9 bis 8,25 auf, bei denen der Herkunft A war der niedrigste Wert 7,49. Es konnte
also vorkommen, dass der pH des Seminalplasmas über dem des Ovarialplasmas der
Eier gelegen hat, was die Fertilisation erschwert haben könnte. Eine Korrelation des
Befruchtungserfolgs mit dem pH-Wert des Seminalplasmas einzelner BS-Milchner war
aus dem Versuch 3.5.5 aber nicht zu ersehen.
Die Aktivierung der Spermienmotilität durch Ovarialplasma verglich Powell (2002) mit
der „…Reaktion eines Feldarbeiters auf den Klang des Öffnens eines kalten Bieres“.
Es herrscht Übereinstimmung in der Literatur, dass Ovarialplasma von Salmoniden die
Geschwindigkeit, gerichtetes Schwimmen und die Dauer der Aktivität von Spermien
begünstigt. Auch der Befruchtungserfolg und die Überlebensrate wird positiv
beeinflusst (Hugunin et al. 2008). Die Spekulationen mancher Autoren gehen soweit,
dass bestimmte Rogner in freier Wildbahn mittels des Ovarialplasmas ausgewählte
Milchner stimulieren (Urbach 2005). Laut Lahnsteiner et al. (2002) kann die
Verwendung von Ovarialplasma die Spermienmotilität sogar auf über 5 min und die
Befruchtbarkeit von Eiern auf bis zu 10 min erhöhen. Es konnten dadurch signifikant
höhere BR als bei Verwendung von Wasser erreicht werden. Dieser stabilisierende
Effekt wurde in ähnlicher Weise auch mit physiologischen Elektrolytlösungen erzielt,
wobei bereits eine 1:1 Verdünnung des Ovarialplasmas den Effekt deutlich
95
-4. Diskussion-
verringerte. Die Aktivierung mittels Ovarialplasma ist auch zur Überprüfung der
Spermienmotilität von großem Nutzen. Unterschiede im pH-Wert des Ovarialplasmas
sehen auch van Heerden et al. (1993) als Grund für die beobachteten
Fertilitätsunterschiede bei Regenbogenforellen. Bei SS waren in den Eigenschaften
des Ovarialplasmas große Unterschiede zwischen Rognern festgestellt worden
(Wojtczak et al. 2007). Die pH-Werte schwankten hier zwischen 7,2 und 8,5. Diese
Autoren fanden durch Messungen mittels CASA eine stark positive Korrelation von
Geschwindigkeit und Anteil aktivierter Spermien mit dem pH-Wert des Ovarialplasmas
(je alkalischer, desto höher die Stimulation). Die Reliabilität dieser Methode muss aber
zunächst offen bleiben. Bei den pH-Messungen des Ovarialplasmas der verwendeten
Arten (inklusive aller drei BF-Herkünfte) zum Zeitpunkt der Feststellung der Ovulation
ergaben sich Werte zwischen 7,91 und 8,61. BF der Herkunft K hatten dabei den
geringsten, SS den höchsten Durchschnittswert. Selten lagen die Werte unter 8, was
darauf schließen lässt, dass eine etwaige Qualitätsunterscheidung pH-Werte zwischen
8 und ca. 8,5 beträfe. Überreife SS-Rogner zeigten dementsprechend auch einen
Abfall von über 8,6 auf Werte unter 8,3. Trotzdem schien der pH-Wert des
Ovarialplasmas laut den hier gewonnenen Ergebnissen keine bedeutende Rolle für
die BR und SR von BS-Eiproben gespielt zu haben (siehe Versuch 3.5.5), es wurde
nur ein geringgradiger Zusammenhang gefunden. Es kann also angenommen werden,
dass die in diesem Versuch verwendeten Rogner bez. deren Ovarialplasmas noch
nicht in kritischen pH-Bereichen waren (im Mittel bei 8,4, niedrigster Wert 8,1) und
folglich die beobachtete Variabilität der SR anderen Ursprungs sein muss. Die
beschriebenen Effekte des Ovarialplasma-pHs vieler Autoren könnte aber auch von
dem Seminalplasma-pH abhängen, da ein möglichst hoher Unterschied während der
Aktivierung entscheidend zu sein scheint (siehe oben). Ebenfalls keine Abhängigkeit
der BR konnte mit der Osmolalität des Ovarialplasmas festgestellt werden, wie schon
Mansour et al. (2008) bestätigten. In den vorliegenden Versuchen wurde aufgrund der
Schwankungen der Zusammensetzung des Ovarialplasmas folglich auf dessen
Verwendung zur Aktivierung verzichtet. Die Verwendung in der Praxis scheint jedoch
sinnvoll.
Visuelle Faktoren zur Ermittlung der Eiqualität sind in der Literatur äußerst divers
(siehe 1.2). In der praktischen Zuchtarbeit ist man auf Anzeichen von Überreife,
Farbe, Verteilung der Öltröpfchen und Verunreinigungen beschränkt. Generell zeigten
96
-4. Diskussion-
die begutachteten Eier während der Bearbeitung des Projektes wenige auffällige
Merkmale, lediglich schwache bis deutliche Anzeichen von Überreife, sowie Blut und
vergrößerte (fusionierte) Lipideinschlüsse wurden bei rigoroser Sortierung bestimmter
Rogner gefunden. Auch geringe Mengen Blut können eine Spermienpenetration der
Mikropyle und die Schwimmbewegungen behindern, was ein Größenvergleich deutlich
macht (Abb. 10). Es wurde in Folge damit begonnen, Eichargen selbst mit einem
geringen Prozentsatz an Eiern mit solchen negativen Merkmalen komplett
auszusondern, was sich in guten Erfolgen bei der BR äußerte. Die ebenfalls
befruchteten aussortierten Chargen zeigten deutlich schlechtere BR und SR bis hin zu
Totalausfällen. Es war so nachvollziehbar, dass das Untermengen überreifer Gameten
(und deren Ovarialflüssigkeit) in der Tat die BR der gesamten Charge negativ
beeinflusst. Dies bedeutet, dass ein Teil der Problematik auf einer Beeinträchtigung
der Fertilisierbarkeit aufgrund Überreife und/oder schlechter Eiqualität beruht. Trotz
teils
verbesserter
BR
wurde
neben
einer
immer
noch
vorhandenen
Schwankungsbreite im Bruterfolg so die Problematik bei der Entwicklung der
Embryonen deutlicher sichtbar (siehe 4.1.1).
Abb. 10. Größenvergleich von Erythrozyten und Spermien von Bachforellen. Phasenkontrast-Optik.
97
-4. Diskussion-
4.1.5 Ernährung
Alle großen Futtermittelfirmen in der Aquakultur bieten spezielle Laichfischfuttermittel
an. Ob diese allerdings tatsächlich bessere BR und SR bedingen, wurde von
unabhängiger Seite kaum untersucht. Im Gegenteil stand zu Projektbeginn die
Vermutung im Raum, dass die aus hochtemperiertem Extrudat hergestellten
Futtermittel evtl. schädigend für die Gametenqualität sein könnten. Exzessive
Vitaminbeimischung zu Futtermitteln steht z.B. im Verdacht, zum sog. „rainbow trout
fry syndrome“, eines plötzlich und ohne erkennbaren Grund auftretenden Verlustes
von bis über 50% bei europäischer Forellenbrut beizutragen. Nachweise, dass die
Fütterung Einfluss auf die Fertilität besitzt sind überraschend rar und angesichts der in
einschlägigen Studien verwandten Messmethoden und Zeitpunkte oft als fraglich
einzustufen. Izquierdo et al. (2001) halten die Zusammensetzung von Lipiden und
Fettsäuren
für
den
wichtigsten
Faktor
für
den
Reproduktionserfolg.
Die
Lipidzusammensetzung verändert z.B. die Eigenschaften der Plasmamembran von
Salmonidenspermien (Labbé et al. 1995). Pickova & Brännes (2006) stellten große
Unterschiede im Fettsäure-Spektrum der Nahrung und den Eiern von SS aus dem
Freiland und der Zucht fest und führten hohe Verluste bei letzteren darauf zurück. Die
Autoren sind der Ansicht, das SS aufgrund ihrer Physiologie ein anderes
Fettsäurespektrum benötigen als andere Salmoniden. Sie empfahlen generell die
Substitution essentieller Fettsäuren (v.a. der n-6 Typen) im Laichfischfutter um
niedrige SR zu vermeiden. Dagegen ergaben andere Untersuchungen keinen Effekt
von
mehrfach
ungesättigten
Fettsäuren
in
der
Nahrung
auf
das
Befruchtungsvermögen von Regebogenforellen (Labbé et al. 1993). Essentielle
Fettsäuren können im Übrigen von Fischen aus der Nahrung aufgenommen und
gespeichert werden, weshalb der Bedarf relativ gering ist. Bei Guppys etwa spielen
Carotinoide zumindest keine Rolle für die Spermaqualität (Skinner & Watt 2007), bei
Salmoniden ist dies bisher wenig untersucht worden.
Handelsübliches Futter für Salmoniden unterscheidet sich aber nicht nur im
Fettsäurespektrum von Naturnahrung. Futter basierend auf marinen Lipid- und
Proteinquellen
und
pflanzlicher
Rohstoffe
weist
eine
gänzlich
andere
Zusammensetzung vieler Komponenten auf. Im Focus stehen hierbei vor allem der
Lipidanteil und dessen Zusammensetzung, sowie der Gehalt an Carotinoiden und
98
-4. Diskussion-
Vitaminen. Bei Regenbogenforellen wirkte sich Vitamin-C Defizienz in der Ernährung
negativ auf die Motilität und Spermienkonzentration aus (Cieresko & Dabrowski 1995).
Auch ein Vitamin E-Defizit äußert sich laut den Autoren in schlechten SR, Vitamin A
und E sind des Weiteren unerlässlich für die Embryonalentwicklung (Palace & Werner
2006), da die Tiere diese nicht selbst synthetisieren können. Experimente mit
verschiedenen Proteingehalten ergaben bisweilen widersprüchliche Ergebnisse
(Bromage et al. 1992).
Die Verwendung pflanzlicher Substitute als Proteinquellen im Mastfutter hat sich teils
als problematisch erwiesen. Mit ihnen einher gehen kann eine stark erhöhte
Verschmutzung des Wassers durch unverdauliche Anteile. Bei Lachsen konnten
entzündliche Reaktionen (Enteritis) durch in Sojamelasse enthaltene Saponine
nachgewiesen werden (Knudsen et al. 2007). Auch die Reduktion der Fütterung vor
der Laichperiode, oft noch während der Vitellogenese, ist umstritten. Eine
Futterrestriktion, oft aus praktischen Gründen durchgeführt (Verhinderung von
Verschmutzung der Gameten mit Kot), kann zur Verhinderung oder Verzögerung der
Gonadenreife bei Lachsen und anderen Fischen führen (Berglund 1995).
In den letzten Jahren nahm die Interaktion von Forschung an Zebrabärblingen und der
Forschung
in
der
Aquakultur
stetig
zu.
Speziell
die
Gebiete
Ernährung,
Wachstumsfaktoren, Stress, Entwicklung und Krankheitsresistenz werden mittlerweile
interagierend behandelt. In Versuchen mit Zebrabärblingen konnten keine negativen
Effekte bei Fütterung hochwertigen Laichfischfutters gefunden werden. Mastfutter
sorgte allerdings für eine deutlich verminderte Überlebensrate der Danio-Embryonen.
Eine Inkubation der Eier in Filtrat aus gelöstem Futter hatte keinen Effekt auf die SR
der Eier. Die Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit, in der Salmonidenzucht
hochwertiges Laichfischfutter zu verwenden und deuten darauf hin, dass die Fütterung
modernen Extrudatfutters keinen negativen Effekt auf die Fertilität der Zebrabärblinge
mit
sich
bringt.
Mastfutter
ernährungsphysiologischen
scheint
Qualität
oder
demnach
aber
entweder
aufgrund
wegen
der
schädlicher
oder
minderwertiger Komponenten die Gameten der Tiere oder deren Entwicklung zu
schädigen. Sicher sind diese Ergebnisse nur bedingt auf Salmoniden übertragbar,
jedoch zeigt der Versuch zumindest, dass gutes Laichfischfutter trotz moderner
Extrudierverfahren keine unmittelbar auf die Gameten von Zebrabärblingen wirkenden
schädlichen Agenzien birgt.
99
-4. Diskussion-
Da im Versuchsbetrieb alle Laichfische das gleiche Futter erhielten, ist die schlechte
Fertilität eines Teils der Tiere mit hoher Sicherheit nicht auf das Futter zurückzuführen.
Im Versuch mit BS brachte eine naturnahe Fütterung über den Zeitraum der
Oogenese keinen höheren Bruterfolg als die Fütterung mit Laichfischfutter. Anhand
der M-Gruppe hätte, abseits der bedarfsgerechten Ernährung, ein durch negativ
wirkende Substanzen im Futter hervorgerufener Effekt verdeutlicht werden können,
was angesichts des Ergebnisses aber ohnehin hinfällig war. Auffällig war eine deutlich
geringere Tendenz der Tiere mit Naturfütterung zu Verpilzung während der
Laichperiode, was allerdings nur auf Beobachtung beruht. Um jedoch Langzeiteffekte
industrieller Futtermittel zu messen, müssten Laichfische von Anfang an mit
natürlichem Futter gefüttert werden, da Lipideinlagerung und die Anlage der Keimbahn
bereits in der Juvenilphase stattfinden. Bei derartigen Versuchen besteht stets die
Gefahr der Krankheitseinschleppung, weshalb solche Versuche wohl geplant sein
müssen um Vergleichbarkeit zu gewährleisten.
4.1.6 Wasser und Pathogene
Fischeier sind durch ihr stabiles Chorion zwar vor allerlei Noxen des umgebenden
Mediums gut geschützt. Fischeier und –larven werden aber nicht zuletzt aufgrund ihrer
besonderen Empfindlichkeit für schädliche Einflüsse bei zahlreichen toxikologischen
Tests eingesetzt. Viele Umweltchemikalien können Störungen der Entwicklung von
Gameten und Embryonen von Fischen hervorrufen (siehe Einleitung). Abwässer
beeinflussen Spermaqualität und BR bei Rotaugen negativ (Jobling et al. 2002).
Endokrin wirksame Stoffe wie Alkylphenole können Sterilität hervorrufen oder
Gameten schädigen (Lahnsteiner et al. 2005). Die Autoren fanden nach Exposition
von Regenbogenforellen mit 4-Nonylphenol, einem beinahe ubiquitären Rückstand
aus Reinigungsmitteln, niedrigere Spermienkonzentration, niedrigere SR und APRaten.
Seit
über
20
Dichlordiphenyltrichlorethan
Jahren
(DDT)
ist
bekannt,
östrogene
dass
das
Wirkungen
Insektizid
auf
die
Reproduktionsfähigkeit von Organismen haben kann (Rathner & Sonneborn 1979;
McLachlan 1980, Fry & Toone 1981). Embryonen von BF zeigten hohe Mortalität und
Entwicklungsretardierung in einem durch subletale Mengen Ammoniak, Nitrit und
polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen verunreinigten Fließgewässer
(Luckenbach et al. 1999). Einen Anstieg der Mortalität und Fehlbildungen bei
100
-4. Diskussion-
Giftstoffbelastung im Wasser berichtete auch von Westernhagen (1988). Viele
Umweltchemikalien sind lipophilen Charakters (Ungerer & Thomas 1995), wodurch
während der Oogenese Akkumulation im Ei und Entwicklungsretardierung während
der Erbrütung von Fischen stattfinden kann (Miller 1993). Es besteht die Möglichkeit,
dass eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Umweltchemikalien nur zu bestimmten
Zeitpunkten in der frühen Entwicklung wirksam wird. Endokrine Disruptoren
(Xenobiotika) sind in der Lage, die Embryonalentwicklung empfindlich zu stören.
Fehlentwicklungen wurden z.B. durch Insektizide (van Leeuwen 1986) oder Biphenyle
(Smith & Cole 1973, Matsui et al. 1992) hervorgerufen. Belastung mit Schwermetallen
kann auch die Spermienmorphologie verändern (z.B. Schwanzverkürzung von
Spermien) (McAllister & Kime 2003).
Atrazin ist ein Herbizid, das die Photosynthese unterbindet, durch Veränderung der
Mikrofauna stark in Ökosysteme eingreift und bei Tieren zu vielen Organschädigungen
führen kann. Der Grenzwert gemäß der Trinkwasserverordnung liegt bei 0,1 µg/l. Die
Atrazin-Konzentrationen in Gewässern weltweit bewegten sich bis 1997 von 0,3-250
µg/l, der NOEC-Wert (höchste Konzentration ohne Effekt) liegt je nach System
zwischen 5 und 40 µg/l (Fent 1998), bei 80 µg/l für Zebrabärblinge. Eine erhöhte
Mortalität von frisch besamten Regenbogenforellen-Eiern ist ab 500 µg/l Atrazin zu
beobachten, in der Schlupfphase tritt diese bereits ab 150 µg/l auf (Pluta 1989).
Negele & Hoffmann (1991) ermittelten dagegen als niedrigsten wirksamen Atrazinwert
nur 5 µg/l. Eldridge et al. (2008) stellten fest, dass Atrazin in hohen Konzentrationen
ein schwacher Östrogen-Rezeptor Antagonist ist, was jedoch nach Aussagen der
Autoren in der Umwelt keine Rolle spielen dürfte. Trotz neueren Befunden, dass
Atrazin bei Junglachsen zu Störungen des endokrinen Systems, Wachstumsstörungen
und ionoregulatorischen Problemen führt (Nieves-Puigdoller et al. 2007) gilt es als
nicht stark akkumulierend im Ökosystem. Die Reproduktionsleistung von Elritzen war
nach Atrazinexposition der Elterntiere mit bis zu 50 µg/l nicht signifikant schlechter
(Bringolf et al. 2004), obwohl ein negativer Trend erkennbar gewesen sei. Nach
heutigem
Kenntnisstand
ist
die
These,
dass
in
der
Umwelt
auftretende
Atrazinkonzentrationen die Reproduktion oder die Entwicklung von Amphibien,
Reptilien und Fischen stören nicht haltbar, da hierfür bis dato keine gewichtigen
Beweise vorliegen (Solomon et al. 2008).
Das Vorkommen erhöhter Atrazinwerte in der Quelle des Betriebs und der Aufseß ist
seit längerem bekannt. In den Jahren 1994 bis 2004 lagen die Werte unter 0,5 µg/l, für
101
-4. Diskussion-
Desethylatrazin unter 0,6 µg/l (Messungen des Wasserwirtschaftsamts Bayreuth für
die Aufseß oberhalb von Drosendorf). In der Quelle der Lehranstalt für Fischerei
waren die Werte von 1994 bis 2005 etwas höher (bis zu 2,25 µg/l Atrazin und 2,0 µg/l
Desethylatrazin im Jahr 1994 laut Negele & Schwaiger (1997)) mit rückläufigen
Werten in den Jahren 2006 und 2007 (< 0,25 µg/l). Des Weiteren konnten zwischen
2003 und 2007 außer Atrazin keine erhöhten Werte an diversen Umweltchemikalien
(Azine etc.) nachgewiesen werden. 2008 lag der Wert von Atrazin lediglich bei 0,22
µg/l, von Desethylatrazin bei 0,19 µg/l. Die Werte von Atrazin und dessen
Abbauprodukt Desethylatrazin sind dabei jeweils in der Summe zu betrachten. Weder
in der hier durchgeführten toxikologischen Analyse, noch beim Versuch der Erbrütung
von
Eiern
in
Trinkwasser
gab
es
Anzeichen
für
eine
Einwirkung
von
Umweltchemikalien. Dies schließt nicht aus, dass die Laichtiere aufgrund andauernder
Exposition bereits Schädigungen der Keimbahn erfahren haben, was sich in
schlechter Gametenqualität und Entwicklungsstörungen äußern könnte. Dies sollte
aber bei allen Tieren der Fall sein und erklärt nicht die beobachtete Variabilität der
Elterntiere.
Die Temperatur kann während der Embryonalentwicklung profunden Einfluss auf
genetische Expressionsmuster ausüben. Als optimale Erbrütungstemperatur für BS
wurden 3-8°C (Marten 1992) bzw. 2-12°C (Butz 1985) genannt. SS bevorzugen
deutlich kälteres Wasser als viele andere Salmoniden. Deren Gonadenreifung verläuft
ideal bei 2-4°C (Mayer 2003), vor der Laichzeit sollte die Wassertemperatur nicht über
6°C betragen, da sonst schlechte Eiqualität zu erwarten ist (Jobling et al. 1995).
Wasser über 5°C resultiert in starken Verlusten bei der Nachkommenschaft von SS
(Critzava 2002). In Gefangenschaft aufgezogene SS besaßen laut einer weiteren
Studie
eine
schlechtere
Eiqualität
als
Wildfänge,
was
zunächst
auf
die
unterschiedliche Ernährung zurückgeführt wurde. Die Eiqualität der in Gefangenschaft
gehaltenen SS glich sich jedoch der der Wildfänge an, wurden sie bei Temperaturen
unter 6°C gehalten. Pickova & Brännes (2006) dagegen sprechen von vielerorts
festgestellten Verlusten bei der Zucht von SS, die keine Temperaturabhängigkeit
zeigten. In der Anlage herrschten während der Laichzeit Wassertemperaturen von 7,48,27°C. So lag die Temperatur zumindest für SS über den angegebenen
Optimalwerten. Auch hier gilt, dass dieser Parameter, falls er einen Einfluss auf das
Brutgeschehen im Betrieb hat, alle Tiere betreffen sollte und eher eine generell
verminderte SR erzeugen müsste.
102
-4. Diskussion-
Verschiedene Wasserwerte können Einfluss auf die Physiologie von adulten
Salmoniden und deren Nachwuchs haben. Das Spermienflagellum wird z.B. durch
hohe Werte an Karbonat geschädigt, was charakteristische, schnell auftretende
osmotische Aufblähung von Teilen der Geißel hervorruft (u.a. eigene Beobachtungen).
Oberflächenwasser
ist
durch
Verunreinigungen,
Leitungswasser
durch
evtl.
enthaltenes Chlor nicht zur Erbrütung geeignet. Die Wasserhärte und die gelösten
Ionen wirken durch den osmotischen Druck direkt auf Funktionen der Zelle und damit
auf die Physiologie von Fischen und deren Larven ein. Mineralreiches Wasser ist laut
Klupp (1998) für die Erbrütung bis zum AP-Stadium ungünstig. Niedrige Eisen- und
Manganwerte sind bei der Erbrütung ebenfalls wichtig (Schmidt 1998) (letzterer < 0,3
mg/l, siehe Bohl 1999). Weiter ist ein Sauerstoffgehalt von mindestens 6 mg/l ratsam,
Bohl (1999) gab jedoch einen Wert von 9-11,5 mg/l an. Der pH-Wert spielt laut
Schmidt (1998) eine untergeordnete Rolle, sollte jedoch nicht unter 6 fallen (in der
Anlage 7-7,8), da sonst Schlupfprobleme auftreten (siehe Tombek 1998). Bei
Regenbogenforellen
aus
Aufseß
konnte
in
der
Vergangenheit
die
sog.
Weichschaligkeit festgestellt werden, wobei im Zuge einer Untersuchung die
Beteiligung des dortigen Wassers ausgeschlossen werden konnte (Tombek 1998). Die
gemessenen Wasserwerte in den verschiedenen Teilen der Anlage brachten keine
Hinweise auf physikalische Beeinträchtigung der Laichfische und Eier. Die
Leitfähigkeit gemessen in den Versuchseinheiten nahm Werte zwischen 430 und 596
µS an. Der Sauerstoffgehalt in den Erbrütungseinheiten lag bei > 97%, in den Teichen
bei ca. 80%.
Biologische Pathogene können das Immunsystem und die Gesamtkondition von
Laichfischen schwächen und so Verluste verursachen. Parasiten konnten zunächst als
Ursache für reduzierte Fitness ausgeschlossen werden, hier waren nur geringgradige
Befallsraten beobachtet worden. Die Verpilzung abgestorbener Eier durch Saprolegnia
spp. trägt zum Absterben intakter embryonierter Eier bei. Je nach dem Verhältnis
befruchtet/unbefruchtet
überlagert
dieser
Effekt
zum
Teil
den
eigentlichen
Befruchtungsstatus bzw. eine möglicherweise höhere erzielbare SR. Die Infektion mit
A. salmonicida war im Betrieb mitunter ein Problem. Speziell schnellwüchsige BSStämme sind empfindlich gegenüber Furunkulose (Chevassus 1979). Die Laichfische
waren von diesem Erreger augenscheinlich kaum betroffen, möglicherweise bestand
bei einem Großteil des Laichfischbestands bereits weitreichende Immunität.
103
-4. Diskussion-
Eine Infektion mit IPN könnte den Fortpflanzungserfolg potentiell gefährden, ist diese
Infektion doch meist inapparent und wird erst bei erhöhter Mortalität bemerkt. IPNViren
sind
beispielsweise
in
der
Lage,
sich
an
Spermienzellen
von
Regenbogenforellen zu heften (Rodriguez et al. 1993). Dieses Virus konnte in der
Anlage in manchen Proben nachgewiesen werden, weshalb eine Schädigung der
Reproduktionsleistung nicht kategorisch ausgeschlossen werden kann. Die Infektion
ist von daher problematisch, weil sich die Nachkommen womöglich bereits im
Elterntier infizieren. Es ist bekannt, dass Eier Virusträger sein können und große
Brutverluste im Zuge einer Infektion auftreten (charakteristische Blutungen im
Dottersack und Verkrüppelungen wurden häufig beobachtet). Eine Beeinträchtigung
der Befruchtungsfähigkeit des Rogens ist nicht auszuschließen. Der genaue Effekt der
Erkrankung auf die Fertilität ist indes unklar, sämtliche untersuchten Eiproben waren
jedoch negativ. Die Bedeutung der IPN für die behandelte Problematik ist somit
schwer abzuschätzen, zumal keine Behandlung möglich ist und viele ältere Tiere
latent infiziert sind. Es gilt diesen Umstand im Auge zu behalten, und die Tiere
sorgfältig zu kontrollieren, um evtl. eine Verbindung mit schlechterer Fertilität
rechtzeitig zu bemerken.
4.1.7 Kreuzungsversuche und Genetik
Unumstritten
haben
genetische
Gegebenheiten
großen
Einfluss
auf
den
Fortpflanzungserfolg von Salmoniden. Im Gegensatz zur Futterverwertung oder dem
Wachstum von Zuchttieren ist die reproduktive Fitness in höchstem Maße von
Inzuchtdepression betroffen. Eine kleine Populationsgröße birgt die Gefahr der
Inzucht, was im Resultat eine reduzierte Fitness bedeutet (Hedrick & Kalinowski
2000). Inzucht resultiert in höheren Verlusten bei Eiern und Brütlingen (Aulstad &
Kittelsen 1971), heterozygote Tiere sind stets vitaler als Inzuchttiere (Klupp 1998). Sie
verursacht laut verschiedenen Autoren erhöhte Eisterblichkeit (Aulstad et al. 1972,
Gjerde et al. 1983, Kincaid 1983), wohingegen Heterosiseffekte die SR begünstigen
(Gall 1975). Gründe für auftretende Inzucht sind meist die Auswahl einiger weniger als
geeignet erscheinender Individuen zur Vermehrung, die Auswahl von Laichfischen nur
während kurzer Abschnitte der Laichperiode und der generelle Gebrauch weniger
Laichtiere aufgrund genügend hoher Eimenge. Daher sollte ein Zuchtstamm aus
mindestens 10 Familien bestehen (Gjedrem 1992).
104
-4. Diskussion-
Hansen et al. (2001) konnten keinen genetischen Effekt durch Freiland-Besatz von BF
feststellen, was auf einen schlechten Reproduktionserfolg der Zuchtfische schließen
lässt. Eine Zunahme von Deformationen beim Nachwuchs von Regenbogenforellen ist
bereits bei einem F-Wert von 0,25 beobachtbar (Aulstad & Kittelsen 1971). Die
Eimortalität steigt laut diesen Autoren um 2,5% pro 10% Inzucht. Alm (1955)
beschrieb schwere Verluste bei SS/BS Hybrid-Rückkreuzungen. Brooks et al. (1997)
führen an, dass laut deren Beobachtungen einzelne Regenbogenforellen-Rogner in
aufeinanderfolgenden
Jahren
Gameten
mit
ähnlichen
Qualitätseigenschaften
produzierten. Dies weist auf eine genetisch determinierte Komponente der
Reproduktion hin, wofür die genauen Faktoren jedoch unbekannt sind. Die Autoren
postulierten einen starken Einfluss genetischer Faktoren auf Fekundität und Eiqualität.
DeMarch (1991) berichtete von starken maternalen Effekten beim Erbrütungserfolg
von SS, ein solcher existiert wohl auch bei der Vermehrung der Äsche (Gum 2007).
Eine ungleiche Befruchtungsfähigkeit von Teilen der Gameten bei Zuchtfischen kann
so zur Anhäufung von unerwünschten Merkmalen in der Population führen. Natürliche
Selektion bzw. der Tod ingezüchteter Nachkommen hilft natürlicherweise bei
Begrenzung der Inzuchtdepression (Anderson & Woods, 1979). Die Fitness der
Gesamtpopulation kann sich demnach durch Inzucht auch erhöhen, da die natürliche
Selektion in diesem Falle stärker greift (Meuwissen & Woolliams 1994).
Der beobachtete Heterozygotiegrad (Hobs) der Individuen einer Population kann als
Maß der genetischen Diversität der Individuen betrachtet werden und zugleich auch
Hinweise auf die Modalitäten der Reproduktion geben. Negative Effekte können
jedoch
auch
durch
Outbreeding
auftreten,
wenn
Fische
aus
anderen
Herkünften/Populationen eingekreuzt werden. Dies kann zur Folge haben, dass
bestimmte lokale Anpassungen an die Umweltgegebenheiten oder genetische
Mechanismen (positive Epistasis) gestört werden, was in niedrigerer Fitness der
Nachkommen resultiert. Derartige Störungen können selbstverständlich auch in der
Frühentwicklung auftreten, was allerdings erst nach einigen Tochtergenerationen zu
Tage tritt. Eine durch einen Überschuss an heterozygoten Individuen verursachte
Abweichung vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht tritt bei Zuchtherkünften sehr leicht
auf. Die erhöhte Zahl heterozygoter Individuen kann auf die Anpaarung von
Elterntieren mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund zurückgeführt werden
(offene Laichfischhaltung). Diese Kreuzungsmethode ist eine gängige Praxis in der
Forellenzucht, da so versucht wird, Heterosiseffekte auszunutzen (siehe z.B. Dobosz
105
-4. Diskussion-
et al. 1992). Es sollte in diesem Zusammenhang bedacht werden, dass bei
Salmonidenarten durchaus Variationen der Chromosomenzahlen auftreten können
(Colihueque 2001), was bei Kreuzung von Tieren verschiedener Ploidie zu Problemen
führen kann.
Erwünschte morphologische Merkmale wie Wachstum und Fleischqualität stehen oft
in züchterischem Widerspruch zu reproduktiven Eigenschaften, da erstere eher durch
einen hohen Grad an Inzucht (Reinzucht) begünstigt werden. Kreuzungen zwischen
verschiedenen Salmonidenarten bringen, wie im Fall des Elsäßer Saiblings, häufig
bessere Wachstumseigenschaften, resultierten aber dafür in hoher Mortalität der
Nachkommen mit Überlebensraten von teils weit unter 50% (Alm 1955). Dies betrifft
nach einhelligen Berichten auch die Eier selbst in frühen Stadien, Rückkreuzungen
können sogar noch höhere Verluste mit sich bringen. Ursache sind vermutlich
Probleme der Chromosomenbalance in der Metaphase und eine Störung der
Genregulation. Gjedrem (1992) steht der Kreuzung von Reinzuchtstämmen und
ingezüchteten Linien von Regenbogenforellen skeptisch gegenüber und beurteilt dies
als wenig erfolgversprechend. Er schlägt vor, nur bei hohen Heterosiswerten zu
kreuzen, die jedoch vorab bekannt sein müssen. Nach anderen Berichten brachten
Reinzuchten um 2,5% bessere SR als Kreuzungen (Hörstgen-Schwark et al. 1986).
Um die Heritabilität von Merkmalen festzustellen zu können, müssten große
Stückzahlen an Laichfischen gehalten werden, wodurch die gezielte Zucht unrentabel
wird. Eigenschaften der Reproduktion zeigen aber im Allgemeinen eine eher niedrige
Heritabilität (Klupp
1998), hier wären
jedoch in der jeweiligen
Population
Selektionsexperimente erforderlich.
BF zeigten in der Vergangenheit nicht nur im Betrieb der Lehranstalt besonders
schlechte Reproduktionsraten. Die Art ist als heimischer Leitfisch der Forellenregion
gefährdet und verzeichnet auch im Freiland geringe Nachkommenzahlen. In
Kreuzungsversuchen sollte ermittelt werden, inwieweit sich Heterosiseffekte nach
Paarung verschiedener BF-Herkünfte direkt auf die SR auswirken. Dies gäbe Hinweis
auf
durch
einen
genetischen
Flaschenhals-Effekt
hervorgerufene
direkte
Fertilitätsstörungen, da bei Zunahme der Heterozygotie theoretisch Zygoten höherer
Fitness erzeugt werden müssten. Es wurden hierfür jeweils Spermien und Eier der
jeweiligen BF-Vergleichsherkünfte verwendet. Obgleich Eier der Herkunft K bei
Befruchtung mit Spermien der Herkunft A aus der Zuchtanlage vergleichbar hohe SR
106
-4. Diskussion-
wie bei Verwendung von K-Milchnern erzeugten, erbrachten alle Proben bei denen ARogen verwendet wurde äußerst schlechte SR oder sogar keine Nachkommen. Aber
auch sich bereits entwickelnde Embryonen starben in vielen Fällen ab. Die
Bedingungen bei Befruchtung und Aufzucht waren in jedem Fall identisch mit denen
der Vergleichsgruppen aus K-Rognern, fertilisiert wurde jeweils an gleichen Tagen.
Dies weißt auf eine durch den Rogen determinierte, äußerst schlechte Eiqualität hin.
Es ist möglich, dass durch genetische Verarmung die Produktion qualitativ guter
Gameten durch die BF bereits nicht mehr im vollen Maße gewährleistet ist. In diesem
Fall könnten durch Kreuzungsversuche keine Verbesserungen bei der SR beobachtet
werden, da das Ausgangsmaterial den Schlupferfolg bedingt. Auch OutbreedingEffekte könnten durch zu massives Einkreuzen über Jahre die beobachtete Variabilität
der Fertilität und Entwicklung verursacht haben. Deutlich besser, obgleich wiederum
variabel im Ergebnis der Einzelrogner (2 Tiere zeigten SR von unter 30%), waren die
SR von den aus der Aufseß gefangenen Wildfischen (Aw). Aw-Milchner konnten bei
Kreuzung mit K-Rognern sogar für einen leichten Heterosiseffekt bei der SR sorgen
(14% höhere SR im Mittel), Aw-Rogen zeigte hingegen bei Verwendung von KSpermien geringfügig schlechtere SR als die Reinzucht. Dies galt auch für die
Einkreuzung von BF aus Salgen, wo durchweg sehr gute SR erreicht werden konnten,
und die sogar eine weniger ausgeprägte Variabilität als bei den zuvor getesteten AwTieren zeigten.
Es ist in der Gesamtsicht offensichtlich, das selbst durch Einkreuzen anderer Stämme
kaum bessere Ergebnisse möglich gewesen wären. Die hierbei verwendeten AwLaicher waren eine in der betreffenden Laichperiode neu durch Elektrobefischung
erhaltene Gruppe, weshalb kein direkter Vergleich möglich ist. Alle wild gefangenen
BF zeigten zum Zeitpunkt der Entnahme noch keine Zeichen für erfolgte Ovulation
und wurden bis dahin in Quarantänebecken verbracht. Warum genau die Aw-Tiere
bessere SR lieferten als ihre Abstammungslinie aus der betrieblichen Zucht ist nicht
bekannt. Es besteht die Möglichkeit der zwischenzeitlichen Zuwanderung von Tieren
anderer Herkunft von stromabwärts, da eine Durchgängigkeit durch Fischtreppen
gegeben war. Zusätzlich wurden die Tiere für die Kreuzung mit BF der Herkunft S
bereits ca. 3 Wochen früher gefangen als in der vorangegangenen Saison und diese
wurden auch sehr viel früher laichreif. Da es sich hierbei um meist größere Exemplare
handelte (das Abstreifen kleiner Tiere zu Versuchszwecken wurde wegen dem
„Erstlaichereffekt“ vermieden), könnte es sich auch um eine quasi im Freiland
107
-4. Diskussion-
selektierte Auswahl von Tieren von höherer Fitness und Fekundität gehandelt haben.
Es kann davon ausgegangen werden, dass in dem Befischungsgebiet so gut wie
ausschließlich Tiere aus der Aufsesser Zucht zu finden sind, da kein Besatz anderer
Herkunft stattfand. Es ist aber anzumerken, dass die betriebliche Zuchtlinie seit ca. 10
Jahren zur Erhaltung der genetischen Variabilität immer wieder mit Tieren
verschiedener lokaler Herkunft vermengt wurde, so dass kein homogener Pool
herkunftspezifischer Merkmale zu erwarten ist. Ein Großteil dieser Nachkommen aus
Kreuzungen wurde jedoch nicht explizit als Laichfische herangezogen. So könnte sich
durch Outbreeding, selektive Auswahl und natürliche Selektion eine ungünstige
genetische Gesamtsituation ergeben haben, in welcher der Nettogehalt an stärker
homozygoten Individuen stets stieg. Hierfür spricht die Beobachtung der sich stetig
verschlechternden SR bei BF der letzten Jahre. Aufgrund der Daten aus den
Kreuzungsversuchen konnte ein maternaler Effekt deshalb nicht wiederholt bestätigt
werden. Allerdings lieferten die relativ hohen SR der Population Aw auch nicht die
benötigte Grundlage für diesen Teil der Untersuchung. Nach Abschaffung des „alten“
Zuchtstammes BFA konnte mit diesem Modell leider nicht mehr gearbeitet werden um
die Problematik der schlechten Fertilisationsergebnisse zu untersuchen. Da zudem
wie beschrieben ein Mix von Tieren diverser Herkunft in der Anlage verwandt wird, ist
die Schwankungsbreite stark gestiegen (was zunächst auch eine Verringerung der
Problematik nach sich zieht), was ein experimentelles Arbeiten mit der Population
erschwert. Fortführende Studien dieser Art wären somit angezeigt.
Seit
einiger
Zeit
ist
man
dazu
übergegangen,
auch
in
der
Fischzucht
molekulargenetische Methoden zu verwenden (Liu et al. 1998; Young et al. 1998).
Trautner (2000) hat AFLP für die Genotypisierung von Regenbogenforellen optimiert
und das analytische Potential erörtert. Stehen nur wenige Individuen zur Verfügung
und sind keine Subpopulationen vorhanden, besitzt die AFLP-Analyse bei der
Beschreibung
von
genetischer
Diversität
Vorteile
gegenüber
der
Mikrosatellitenanalyse. Sogenannte "Marker Assisted Selection" wird bereits in der
Fischzucht angewendet (Poopuang & Hallerman 1996). Hierbei wird versucht, mit
Hilfe von molekulargenetischen Markern unterschiedliche Genotypen voneinander zu
unterscheiden und speziell solche Marker zu finden, die eng an wirtschaftlich
interessante Merkmale gekoppelt sind.
108
-4. Diskussion-
Im Rahmen der vorliegenden Untersuchung wurde versucht, anhand einiger
Mikrosatellitenmarker eine genetische Beschreibung zumindest der vom diesem
Standpunkt her am interessantesten erscheinenden BF-Populationen aus den
Kreuzungsexperimenten durchzuführen. Die in der Anlage vorhandenen SS wurden
bereits als keine reine Art (SS/BS Posthybriden) identifiziert (Unterlagen der
Fachberatung für Fischerei des Bezirks Oberfranken). Die BS-Population aus Aufseß
kann laut vorhandener Daten dagegen als reine Art gelten. BF aus Aufseß hatten laut
vorangegangener Untersuchungen eine unterdurchschnittliche Allelanzahl und zeigten
in ihrer Hobs Anzeichen für Auszucht. Die hier durchgeführte genotypische Analyse
sollte als Test für die verwendete Methodik dienen, die in den Versuchen verwendeten
BF-Populationen ansatzweise zu charakterisieren und erste Hinweise über zu
erwartende Ergebnisse bei Fortführung genetischer Arbeiten mit den Laichgruppen
geben. Für eine statistische Absicherung der Ergebnisse aus Mikrosatellitenanalysen
sind freilich ausreichend hohe Probenzahlen erforderlich. Will man auch seltene Allele
mit einer Häufigkeit < 5 % erfassen, so müssen pro Population mindestens 50
Individuen untersucht werden. Bei Zuchtpopulationen ist dagegen eine niedrigere
Probenzahl möglich, da alle Tiere meist von einem sehr beschränkten Laicherstamm
von um die 20-40 Tieren abstammten und damit die Zahl der Allele von vornherein
nicht so hoch ist.
Die im Freiland gefangene Aw-Population konnte mittels der vorliegenden Daten als
wahrscheinlich von der K-Population genetisch nicht sehr different eingestuft werden
und zeigte wie die anderen Zuchtherkünfte auch sehr heterogene Homozygotiegrade
zwischen den Einzeltieren. Gruppe K war laut den vorliegenden Daten gegenüber Aw
nicht deutlich genetisch differenziert, während S eine zu beiden Vergleichsgruppen
deutlich differenzierte Population darstellt (Fst-Werte). Dies mag daran liegen, dass
letztere nicht wie die Populationen Aw und K dem Maineinzugsgebiet, sondern dem
Einzugsgebiet der Donau zuzurechnen sind. Die BF-Herkunft K war von den Gruppen
S und Aw sehr verschieden was den beobachteten Inzuchtgrad über die noch sehr
geringe Zahl von 6 Stichproben betrifft. Die beobachteten Inzuchtkoeffizienten zeigten
bei den Herkünften S und Aw einen relativ geringen Wert um 0,1, Tiere der Gruppe K
waren deutlich stärker ingezüchtet (0,27). Gruppe K zeigte insgesamt 19 homozygote
Allele, Gruppe S 20 und Gruppe Aw hatte den geringsten Wert von nur 15
Homozygotien über alle Tiere und Marker. Dies ist im Einklang mit den Ergebnissen
aus den Kreuzungsversuchen, wonach die letzte Aw-Gruppe (Kreuzung mit S) keine
109
-4. Diskussion-
schlechten SR zeigte. Obwohl die Gruppe K die höchste Inzuchtrate besaß, waren
deren Bruterfolge eher hoch angesiedelt. Im Rückschluss würden also bei einer
inzuchtbedingten Ursache der Problematik Inzuchtkoeffizienten bis 0,27 bei BF noch
keine ausgeprägte Fertilitätsproblematik erklären. Die AMOVA für die Mikrosatelliten Daten zeigte eine Aufteilung der insgesamt beobachteten genetischen Variabilität in
einen Anteil von 17,62% genetischer Variabilität zwischen den Gruppen und einen
Anteil von 82,37% innerhalb der einzelnen Populationen. Somit wurde deutlich, dass
der größte Anteil der Variabilität innerhalb der Populationen zu finden ist. Die
Ergebnisse stimmen mit denen von Untersuchungen an Regenbogenforellen überein,
welche besagen, dass die genetischen Unterschiede innerhalb von Populationen den
größten Anteil an der genetischen Variabilität ausmachen, zumal der in der
vorliegenden Untersuchung festgestellte Wert nahe dem von Allendorf & Phelps
(1981) ermittelten Wert von 85 % liegt. Inwiefern diese Variabilität sich auch in der
Fertilität niederschlägt, wäre zu erörtern.
Die getesteten Herkünfte zeigten im Versuch insgesamt leider nicht die stark
ausgeprägte Problematik schlechter SR wie der Zuchtherkunft A. Von hoher
Variabilität der SR waren sie jedoch zum Teil durchaus betroffen. Einzelne Tiere
wiesen höhere Heterozygotiewerte auf als andere, was die beobachtete Variabilität
zwischen den Laichern zu erklären vermag. Wegen der vergleichsweise erfolgreichen
Reproduktion in den Experimenten mit den Aw-Tieren konnten ob eines genetischen
Faktors zur Determinierung der Fertilität keine gesicherten Aussagen gemacht
werden. Auch aufgrund der sich nicht stark unterscheidenden Heterozygotieverteilung
innerhalb der Herkünfte bleibt die Frage nach einer genetischen Komponente bei der
Problematik zunächst unbeantwortet. Hier müssten ausgiebige Tests zur Evaluierung
der selektiven Reproduktionsleistung von stark und weniger stark ingezüchteten
Elterntieren erfolgen. Die Indizien sprechen aber dafür, dass selbst in BFPopulationen ohne problematische Verluste in der Erbrütungsphase die Genotypen
der Einzeltiere sehr unterschiedlich sein können. Wichtig wäre zu wissen, wie solche
Daten für Tiere mit stark verminderter Fertilität im Vergleich mit unproblematischen
Individuen aussehen, was á priori hier beabsichtigt war. Dies konnte jedoch im
Rahmen des Projektes in Bezug auf den Erbrütungserfolg des mangelhaften
Aufsesser BF-Zuchtstamms (A) nicht mehr durchgeführt werden. Sinnvoll wäre es
außerdem, trotz der teils guten Ergebnisse der im freien Gewässer gefangenen BF,
110
mittels
optimierter
Methoden
-4. Diskussion-
die
Reproduktion
wilder
bzw.
ausgewilderter
Populationen in Bezug auf den Inzuchtgrad der Elterntiere zu untersuchen. Dies
würde einen großen Zugewinn an grundsätzlicher Information bedeuten, inwieweit die
Reproduktion solcher Tiere gewährleistet ist und ob dies an Faktoren der genetischen
Diversität geknüpft ist.
4.2
Ursachenbewertung
Nach Fazit des Auftragnehmers konnte die gestellte Aufgabe zur Untersuchung der
auslösenden
Faktoren
der
Problematik
und
die
Bewertung
genereller
Zusammenhänge von oft diskutierten Parametern, die bei der Fertilisation der
untersuchten Salmoniden eine Rolle spielen, im Rahmen des Vorhabens umfassend
erörtert werden.
Die Befruchtungsmethode ließ in einigen Details Verbesserungen zu, die durch
entsprechende Experimente untermauert wurden. Die Befruchtungsmethode im
Brutbetrieb wurde nun z.B. unter Verwendung des Ovarialplasmas durchgeführt,
vorher wurde der Rogen in ein Sieb gestreift. Details hierzu sind auch Abschnitt 4.3 zu
entnehmen.
Die allgemeine Beurteilung der Gametenqualität ergab zum Teil Auffälligkeiten in
den Eiproben einiger Rogner, die auf Überreife oder schlechte Qualität schließen
ließen. Hier wurden unter den Einzeltieren zwar immer wieder Proben mit negativ zu
bewertenden Kriterien ausgemacht, die aber die hohe Variabilität im Bruterfolg nicht
erklären konnten. Die Variabilität konnte auch in qualitätsbezogenen Analysen des
Ovarialplasmas bestätigt werden, Korrelationen zur BR/SR waren hierdurch jedoch
nicht gegeben. Im Gesamtbild konnten an den für Versuche verwendeten Eiern kaum
relevante Beeinträchtigungen der Qualität beobachtet werden, weswegen die
Eiqualität als gut eingestuft werden kann. Insbesondere die Spermaqualität scheint
ebenso, je nach verwendetem Milchner, starken Schwankungen zu unterliegen, die
bei Spermien anhand besserer Qualitätsparameter einfacher zu beurteilen ist. Es
zeigten
sich
bei
verschiedenen
Arten
teils
große
Schwankungen
in
der
Spermienkonzentration, pH des Seminalplasmas und den Motilitätsparametern. Diese
Schwankungsbreite war sowohl bei Saiblingen wie bei Forellen augenscheinlich und
111
-4. Diskussion-
trägt möglicherweise zu einer erhöhten Variabilität im Fortpflanzungserfolg der
Laichtiere bei. Die Ursachen für die beobachtete Variation der Spermaqualität sind
dabei unklar.
Ebenso wichtig wie die Ursachenforschung war in dieser Untersuchung der
Ausschluss einiger vermuteter Zusammenhänge, die einen möglichen Einfluss auf den
Reproduktionserfolg und die hohen Verluste haben konnten. Faktoren die sich bei der
behandelten Problematik nach den neuen Erkenntnissen als nicht ausschlaggebend
für niedrige BR oder SR der behandelten Populationen erwiesen, waren die
Befruchtungstemperatur (bei SS), die Fütterung, Wasserparameter, Betäubung beim
Streifvorgang mit MS-222 und Stress während der Oogenese. Die ausgeschlossenen
Parameter gelten streng genommen nur für die im jeweiligen Versuch verwendeten
Tiere. Es ist jedoch nicht wahrscheinlich, dass bei den untersuchten Arten
verschiedene Ursachen für dieselbe Problematik vorliegen.
Eher unwahrscheinlich nach Einschätzung der vorliegenden Ergebnisse (jedoch mit
einer möglichen Einwirkung) sind Ursachen bedingt durch Krankheiten und
Umweltchemikalien. Die IPN stellt dabei ein Risiko dar, obwohl die Erkrankung in den
Populationen
Substanzen
nicht
aus
augenscheinlich
der
Landwirtschaft
hervortrat.
und
Einwirkung
Abwässern
durch
konnten
chemische
zwar
durch
Erbrütungsversuche und ein toxikologisches Gutachten von Eiproben nicht gefunden
werden, eine Beteiligung des vor Ort erhöhten Gehalts an Atrazin kann jedoch nicht
gänzlich ausgeschlossen werden.
Klare Ursache von Verlusten war zum einen die fehlende Befruchtung, zum anderen
eine erhöhte Embryonensterblichkeit. Auschlaggebende Faktoren sind als Ergebnis
dieser Untersuchung demnach eine unzureichende Kontrolle der Gameten vor deren
Verwendung
zur
Befruchtung,
eine
stark
ausgeprägte
Variabilität
in
der
Fertilisierbarkeit und Entwicklungsfähigkeit auch des ansonsten unauffälligen Rogens
und ferner hohe Schwankungen in Qualitätsparametern der Spermien. Letztere äußert
sich jedoch sicher nur in Abhängigkeit der verwendeten Menge pro Ei und den
Umständen bei der Aktivierung sowie Lagerung, Anzahl der verwendeten Milchner,
Verdünnung, Geschwindigkeit bei Zugabe und Vermengen, Vorhandensein und
Zusammensetzung von Ovarialplasma etc. Zum Teil konnten diese Umstände durch
112
-4. Diskussion-
Verbesserung der Selektionskriterien der verwendeten Gameten mittels geeigneter
Kriterien, sowie der Vermeidung von Verunreinigungen durch Blut und Ovarialplasma
schlechter Qualität verbessert werden. Tatsache ist, das in der untersuchten
Population Laichtiere mit extrem variabler Fertilität zu sein scheinen, was einen nicht
unerheblichen Teil der Problematik hervorruft. Als eine mögliche Ursache der starken
Variabilität der funktionellen Gametenqualität ist die Verwendung junger Laichfische
zu nennen, die zu frühen Verlusten führen kann. In den meisten Fällen wurden
Erstlaicher im normalen Betrieb außen vor gelassen und die Zucht mehrheitlich mit 34-jährigen Tieren betrieben.
All diese Beobachtungen zeichnen das Bild von einer sich in reproduktiven
Charakteristika äußernden Variabilität der Fertilität der drei Arten, welche, in Summe
mit unzureichender Selektivität bei Auswahl von Gameten, die beobachtete
Fertilisationsproblematik hervorruft. Ein Effekt maternaler Parameter (wie durch
genetic imprinting) ist nicht auszuschließen, in welcher der Rogen einen kritischen
Faktor der Variabilität darstellt (siehe Kreuzungsversuch und Einzelpaarungen). Aber
auch
Milchner
zeigten
im
direkten
Vergleich
extrem
unterschiedliche
Fortpflanzungserfolge, was auf einen genetischen Hintergrund hindeutet, der Teile der
gesamten Populationen betrifft. Ungünstige Paarungen können so zufällig schlechte
und gute Fortpflanzungserfolge erzielen, was die Ursachenforschung erschwert.
Outbreeding-Effekte, speziell bei BF, könnten durch planloses Einkreuzen entstanden
sein und für Probleme bei der Fertilität der Laicher und Entwicklung von Eiern hier in
Frage kommen. Dagegen spricht, dass auch BS, bei denen dies nicht erfolgte, stark
betroffen sind. Inzuchtdepression in Teilen der betroffenen Salmonidenpopulationen
kann als wahrscheinlicher für die Schwierigkeiten bei der Vermehrung angesehen
werden.
Eine
Verschlechterung
Reaktionsmechanismen
sowie
der
der
Eiqualität,
der
Entwicklungsfähigkeit aufgrund
Spermien-Eigenetischer
Ursachen muss generell in Betracht gezogen werden, wobei dies dann unter allen in
Aufseß gehaltenen Arten evtl. aber in unterschiedlicher Ausprägung der Fall sein
müsste.
Ein solcher Zusammenhang wird von vielen Fischereiexperten seit langem diskutiert
und ist in der wissenschaftlichen Literatur oft belegt worden. Der zweifelsfreie
Nachweis von durch Inzucht oder genetischer Inkompatibilität hervorgerufenen
negativen Effekten auf die Gametenqualität bzw. Fertilität gestaltet sich jedoch sehr
schwierig, da ohne molekularbiologische Analyse in Verbindung mit experimentellen
113
-4. Diskussion-
Ansätzen allenfalls Hinweise, jedoch keine kausalen Zusammenhänge nachgewiesen
werden
können.
Die
Theorie,
dass
eine
Homozygotiezunahme
Gametenqualität bzw.
ähnliche
Entwicklungsprobleme bei
schlechtere
BF oder
anderen
Salmoniden bedingt, wäre im vorliegenden Fall wie auch generell eingehend zu
überprüfen. Um dem auf den Grund zu gehen, sollte der Inzuchtstatus der Tiere
ausführlicher untersucht werden um zu sehen, ob sich deren Reproduktionsleistung
durch genetische Gegebenheiten erklären ließe. In der Literatur existieren hierzu nur
spärliche Informationen, da meist Fitnessparameter der Nachkommen lediglich unter
Angabe evtl. schlechterer Eiqualität oder höheren Verlusten bei ingezüchteten Linien
beschrieben wurden. Dies ist auch auf die nötigen umfangreichen Arbeiten sowie die
diffizilen molekularbiologischen Methoden zurückzuführen. Das Wissen über die
Auswirkungen auf die Produktion von BF als Besatz würde von derlei Information
sicher stark profitieren. Ein Mangel an Reproduktionsfähigkeit hätte im Freiland sehr
viel negativere Folgen als in der Zucht, da dort ohnehin nur ein Bruchteil der Jungtiere
mit hoher Fitness überlebt.
114
-5. Empfehlungen-
5. Empfehlungen
5.1 Aquakultur von Salmoniden
Es konnten
einige
wichtige
und
allgemein
zu
beachtende
Parameter
zur
Fertilisationspraxis von Salmoniden anhand der hier untersuchten Fischarten/Herkünfte eingegrenzt werden. Dies soll jedoch keinesfalls dazu veranlassen, den
Einfluss weiterer, lokal
vorhandener
Faktoren
bei der Zucht
und
Haltung
verschiedener Salmoniden unterzubewerten. Um Probleme zu vermeiden oder zu
erkennen, kann jeder Züchter praktische Leitlinien anwenden.
Folgende Empfehlungen können in verschiedenen Bereichen der Fertilisationspraxis
gegeben werden:
Rogner
erst
ca.
2-3
Tage
nach
der
Ovulation
(weicher
Bauch,
hervortretende Geschlechtsöffnung) abstreifen, da die Eier u.U. noch nicht
voll befruchtungsfähig sind.
Zu frühes Abstreifen ist ebenfalls zu vermeiden, wenn Eier nicht leicht aus
der Bauchhöhle fallen.
Überreife unbedingt durch häufige Kontrolle vermeiden; ein Zeitfenster bis 1
Woche nach Ovulation sollte eingehalten werden (verschieden je nach
Herkunft und Fischart).
Begutachtung der
Qualitätskontrolle,
Eier
v.a.
jedes Rogners im Rahmen
Kontrolle
auf
Einschlüsse
und
einer
strikten
inhomogene
Lipidverteilung in den Eiern. Zugabe schlechter Eier gefährdet den
Befruchtungserfolg.
Bewährt
hat
sich
die
Verwendung
eines
Durchlichttisches.
Vermengen von Eichargen verschiedener Populationen und Herkunft
unterbinden.
Erstlaicher nicht verwenden oder separat abstreifen.
Fische ohne Fütterung mit Laichfischfutter nicht verwenden oder separat
abstreifen.
115
-5. Empfehlungen-
Streifen und Befruchtung unter Verwendung von Ovarialplasma. Lagerung
von Eiern in Ovarialplasma für einige Stunden (gekühlt) möglich.
Ausreichende Sauerstoffzufuhr für Spermien bei der Lagerung.
Vor Gebrauch Aktivierbarkeit von Spermien jedes Ejakulats kurz überprüfen
(Zugabe von Wasser oder Ovarialplasma im Mikroskop).
Milch möglichst vieler Milchner verwenden, um BR zu optimieren und
genetische Vielfalt zu sichern.
Spermienzugabe mehrerer Ejakulate möglichst gleichzeitig (Verwendung
von Röhrchen etc.).
Erhöhung des Spermien-Ei-Verhältnisses bei unzureichender BR.
Alkalische Pufferung des Wassers bzw. der Befruchtungslösung (pH um
8,5) kann helfen, Variabilitäten der Ovarialplasmata auszugleichen und für
eine gute und möglichst lang anhaltende Spermienaktivierung sorgen.
Hierzu ist Natriumhydrogencarbonat (Soda, Natron) gut geeignet.
Überprüfung der BR möglichst frühzeitig (10-15 Tage nach Befruchtung) zur
besseren
Planung
(Durchlichttisch),
evtl.
Verwendung
verdünnter
Essigsäure oder einer geeigneten Färbung.
Eingehende Dokumentation aller Daten der Befruchtungscharge (hierzu
befindet sich der Entwurf eines Formblatts unter Anhang G) zur
Erfolgsanalyse.
Die meisten Betriebe verfolgen bei Haltung von Laichfischen und der Nachzucht
unterschiedliche Strategien. Auch bei Anwendung strenger Zuchtrichtlinien liegt der
Focus der Auslese aber nur selten auf der Selektion von Laichern mit hohen BR/SR
bzw. maximaler Ausbeute an entwicklungsfähigen Eiern zugunsten von Merkmalen
wie Habitus, Krankheitsresistenz und Wachstum. So wird heute in vielen Betrieben in
hohem Maße abgestorbenes Eimaterial aussortiert, um aus der großen Menge
anfänglich abgestreifter Salmonideneier genug Nachwuchs zu gewinnen. Oft kann die
Ursache für aufkommende Verluste nicht erkannt werden. Hier sollen Züchtern einige
Hinweise gegeben werden, die kondensiert aus dieser Studie und Recherche
hervorgingen.
116
-5. Empfehlungen-
Folgende Empfehlungen können für die Haltung von Laichfischen gegeben werden:
Temperaturoptima für Haltung und Erbrütung der jeweiligen Art und
Herkunft beachten (Literatur, Züchter konsultieren).
Laichfischfutter
verwenden,
mischen
der
Produkte
verschiedener
Hersteller und ggf. Zufüttern von Naturnahrung zur allgemeinen
Steigerung der Fitness.
Gefahr von krankheitsbedingter Immunsuppression und Schädigung von
Gameten z.B. durch IPN stets eliminieren.
Fische
mit
schlechter
Eiqualität
nach
o.g.
Kriterien
markieren
(Tätowieren, Flossenschnitte, Tags), und /oder im Folgejahr separat
streifen, um schlechte Eiqualität aus dem Brutbetrieb zu eliminieren.
Trennung von Kreuzungs- und Zuchttieren als oberstes Gebot (siehe
Klupp 1998) – evtl. Markierung.
Inzuchtvermeidung: Große willkürlich gepaarte Bestände verwenden und
systematisch Kreuzungen nahe verwandter Tiere vermeiden (manche
Züchter verwenden Laicher nur einmal, dann nie wieder (Greenberg
1960, Kincaid 1983)).
Beim Einkreuzen vorher die Kompatibilität überprüfen durch Aufzucht von
1-2 Generationen um negative (Outbreeding-) Effekte zu vermeiden.
Die im Zuge der Diskussion in dieser Studie aufgeworfenen Fragen sollten im Sinne
fischereilichen
Interesses
in
weiterführenden
Studien
aufgegriffen
werden.
Ergänzende Arbeiten sind nötig, um ein möglichst umfassendes Bild wichtiger
reproduktiver Faktoren in der Salmonidenzucht zu erhalten. Stehen etwa genetische
Ursachen einer reproduktiven Problematik zur Diskussion, so ist generell eine Option
die, Laichfische und Eier von gleichen Rognern in einem Zuchtbetrieb ohne derartige
Probleme zu halten bzw. zu Erbrüten (evtl. in Form eines Ringversuchs). Dadurch
käme
der
genetische
Anteil
an
der
Problematik
zum
Vorschein,
Haltungsbedingungen des Stammbetriebes weitgehend wegfallen.
117
da
-5. Empfehlungen-
Folgende Empfehlungen können des Weiteren für fortführende Untersuchungen
gegeben werden:
Untersuchung ernährungsbedingter Probleme im Langzeitversuch vom
Juvenilstadium an bis zur wiederholten Laichreife. Fütterung jeweils mit
kommerziellem Laichfischfutter und zum Vergleich mit natürlicher
Nahrung unter sonst gleichen Gegebenheiten.
Experimentelle
Erfassung
(chronischer)
Pathogene
Umweltchemikalien
Reproduktionserfolg
in
der
evtl.
(nur
Effekte
und
verschiedener
bislang
subletalen
möglich
wenig
Konzentrationen
unter
verbreiteter
erforschter
auf
Tierversuchs-
den
und
Quarantänebedingungen).
Untersuchung der Reinerbigkeit der betroffenen Populationen mit hoher
Stichprobenzahl, Detektion von Problemen durch Posthybride und
Analyse herkunftspezifischer Marker.
Analyse
der
Populationsstruktur
sowie
Inzuchtkoeffizienten
einer
gegebenen Population mit variablen Reproduktionsergebnissen mittels
Genotypisierung möglichst vieler Einzelindividuen und Vergleich des
Reproduktionserfolgs
der
einzelnen
Individuen,
Gruppen
und
Kreuzungspaarungen. Zusätzlich ist die Verwendung einer möglichst
ideal reproduzierenden Außengruppe ratsam.
5.2 Satzfischproduktion und ökologische Schlussfolgerung
Zum Erhalt der Diversität unserer heimischen Fischarten ist ein breiteres Wissen
nötig, da ohne dieses kein sinnvoller Artenschutz bei Fischen möglich ist. Die
Vermehrung vieler Fischarten in Flüssen und Seen Bayerns ist in vielen Fällen nicht
mehr zu einer autarken Bestandserhaltung in der Lage. Die Gründe hierfür sind
weitgehend unbekannt. In der Diskussion sind hierfür viele Ursachen wie
Gewässerbelastung und Veränderung des Lebensraums. Wehre und schlecht
angelegte Fischtreppen können potentiell die Überreife der Gameten bei laichbereiten
Wildfischen fördern (De Gaudemar & Beall 1998), was immense Auswirkungen auf die
Fortpflanzungsrate mit sich bringt. Die Priorität sollte zwar primär auf der
118
-5. Empfehlungen-
Renaturierung und Unterstützung autochthoner Bestände liegen, ohne gezielte
Besatzmaßnahmen wären jedoch viele Fischarten aus den Flüssen und Seen Bayerns
heute verschwunden. Seitens der Fischereiorganisationen werden hohe Summen
verwandt, dieser Situation durch solche Besatzmaßnahmen entgegen zu wirken.
Dieser Entwicklung, die sich innerhalb der letzten Dekade mehr oder minder
unbemerkt angebahnt haben könnte, gilt es durch die Fischereiverwaltung und von
wissenschaftlicher Seite entschieden entgegenzutreten.
Die Frage ob und wie gut sich Zuchtfische als Besatzfische für freie Gewässer eignen,
beruht letztendlich auf der Wirkung auf die Gesamtpopulation der Zoonose und dem
Reproduktionserfolg der besetzten Tiere (Dannewitz et al. 2004). Vermeidung von
Inzucht durch nicht rein morphologische Auslese und planloses Einkreuzen ohne
Prüfung der Kompatibilität (Fertilisationserfolg, Zeitpunkt der Laichperiode, Resistenz
gegen lokale Erreger etc.) durch Testkreuzungen ist in der Satzfischzucht oberstes
Gebot. Wichtig für die Satzfischzucht ist die Anpassungsfähigkeit und ein natürliches
Verhalten des verwendeten Stammes (Klupp 1998). Dies ist in der Salmonidenzucht
jedoch nur schwer zu erreichen. Eine wichtige Rolle hat die erfolgreiche Vermehrung,
da durch sie schneller adaptierte Nachkommen mit hoher Fitness in der Biozönose
entstehen. Es existieren jedoch Anzeichen dafür, dass Besatzfische aus einem
teilweise degenerierten Genpool in Bayern Anteil an der mehr als mangelhaften
autarken
Vermehrung
in
den
freien
Gewässern
haben
könnten.
Reproduktionsschwache Satzfische aus Zuchtbetrieben könnten im Feld, wo
naturgemäß nur ein äußerst geringer Prozentsatz des Nachwuchses überlebt,
aufgrund der genannten Zusammenhänge zu einer de facto Vermehrung jedoch nicht
mehr fähig sein. Eine Unterstützung der Fischbestände gilt es mit lokal angepassten
und hochfertilen Tieren durchzuführen. Welche Gametenqualität und Entwicklungsrate
ingezüchtete Fische bestimmten Grades erbringen können ist bislang unklar und
könnte nur in experimentellen Langzeitstudien erarbeitet werden. Eine Evaluierung
von zu erwartenden Reproduktionsleistungen einer gegebenen Population mittels
aktueller genetischer Methoden wäre somit vor allem für die Satzfischzucht ein
innovativer Schritt zur besseren Bestandspflege. Hierzu sind wissenschaftliche Daten
vonnöten,
welche
den Einfluss der
genotypischen Charakteristika
wie
des
Heterozygotiegrads einer Population mit der reproduktiven Leistung verknüpfen und
so die Diskriminierung bestehender Herkünfte nach deren Eignung als Besatz sowie
119
eine
reproduktiv
ausgerichtete
-5. Empfehlungen-
Bestandsanalyse
erlauben.
Eine
durchdachte
Vorgehensweise bei der Erzeugung von Nachkommen für den Besatz ist als äusserst
wichtig zu erachten. Empfohlen wird hierzu die Matrix-Vorgehensweise nach Compton
(2004), bei der Eimixe verschiedener Rogner auf die Zahl an Milchnern aufgeteilt und
dann einzeln von der Milch letzterer befruchtet werden. Hierdurch wird eine maximale
Durchmischung des vorhandenen Genmaterials und damit die genetische Diversität
der Nachkommen sichergestellt.
120
-6. Zusammenfassung-
6 Zusammenfassung
Aufgrund massiver Probleme bei der Befruchtung und Erbrütung von Salmoniden bei
zahlreichen Betrieben in Bayern sollten im Rahmen dieser Studie zum einen
experimentell der Einfluss verschiedener Faktoren auf den Reproduktionserfolg von
Bachforellen, Bach- und Seesaiblingen gemessen, sowie durch analytische Methoden
potentiell problematische Eigenschaften von Gameten und kritische Parameter für das
Brutgeschehen benannt werden. Die Arbeit sollte so eine möglichst umfassende
Beschreibung der Situation, Ursachenforschung zur Problematik und Übertragung der
Ergebnisse auf reproduktive Leistungen heimischer Salmoniden im Freiland ergeben.
Eier und Spermien wurden anhand verschiedener deskriptiver Qualitätsanalysen
näher untersucht. Sie zeichneten sich durch hohe Variabilität in diversen Parametern
aus, darunter Motilitätskriterien (bei Spermien) und Plasmaeigenschaften. Resultate
aus
Tests
verschiedener
Befruchtungsmethoden,
Spermienkonzentrationen,
Färbemethoden zur frühen Ermittlung der BR und Qualitätsselektion von Eichargen
wurden exemplarisch gewonnen und dienten der Optimierung der Fertilisation. Es
konnte festgestellt werden, dass ein Teil der Verluste dadurch begründet ist, dass Eier
jeweils zu verschiedenen Anteilen unbefruchtet blieben. Neben teils niedriger
Befruchtungsrate verzeichneten die Gelege verbreitet eine vom Elterntier abhängige
Störung der Entwicklungsfähigkeit zum schlüpfenden Tier.
Im Ergebnis konnte der Einfluss einiger fraglicher Faktoren auf Befruchtungs- und
Schlupfrate experimentell als nicht ausschlaggebend eingestuft werden. So waren
Stress,
Fütterung,
Betäubung
und
im
Falle
von
Seesaiblingen
die
Befruchtungstemperatur ohne Einfluss auf die Reproduktionsleistung. Auch der
Einfluss einiger Charakteristika der Gameten konnte nicht nachgewiesen werden.
Unwahrscheinlich ist weiterhin nach eingehender Untersuchung eine Beteiligung von
Umweltchemikalien, Pathogenen und Wasserparametern, wobei diese Faktoren nicht
endgültig ausgeschlossen werden konnten. Es handelte sich hierbei somit um kein
reines Befruchtungsproblem, wie auch kein reines Eiqualitätsproblem, welches allein
durch einfach erfassbare Qualitätskriterien wie Eimorphologie, Überreife und
Kontaminationen erklärbar war. Gründe der massiven Probleme sind nach
Einschätzung der Resultate eine unzureichende Selektion der Gameten aufgrund
verschiedener Qualitätscharakteristika und eine eventuell genetisch bedingte hohe
Variabilität der Gametenqualität eines Teils der Populationen. Die Arbeit enthält eine
121
-6. Zusammenfassung-
kritische Diskussion und Vergleich von Ergebnissen und Literatur und gibt praktische
Empfehlungen für Aquakultur, Satzfischzucht sowie einen Überblick über in diesem
Zusammenhang weiterzuführende Untersuchungsansätze.
122
-7. Danksagung-
7 Danksagung
Der Verfasser bedankt sich bei Herrn Bezirkstagspräsidenten Dr. Günther Denzler
für die Schaffung der notwendigen Voraussetzungen zur Durchführung der
Untersuchung in der Lehranstalt für Fischerei Aufseß. Weiter danke ich dem
Präsidenten des Landesfischereiverbandes Bayern, Herrn Eberhard Roese und dem
Präsidenten
des
Bezirksfischereiverbandes
Oberfranken,
Herrn
Friedrich
Schmauser, für die Finanzierung des Vorhabens. Mein Dank gilt auch dem
Ehrenpräsident der Bezirksfischereiverbandes Oberfranken Herrn Albert Schütze für
die Unterstützung des Projektes.
Die Realisierung des Vorhabens ist maßgeblich Herrn Dr. Robert Klupp und Herrn
Manfred Popp, Fachberatung für Fischerei des Bezirks Oberfranken, zuzuschreiben,
ohne die diese Studie nicht stattgefunden hätte. Herr Kay Kuhlen half bei der
Bestimmung von Wasserwerten und war immer zur Stelle, wenn er gebraucht wurde.
Frau Heidemarie Miklis verlor nie den Überblick bei der oft komplizierten Abwicklung
aller nötigen verwaltungstechnischen Aspekte. Mein besonderer Dank gilt Herrn
Ronny Seyfried, dem örtlichen Leiter der Lehranstalt für Fischerei Aufseß, für die
unkomplizierte Hilfe und Bereitstellung der kompletten Infrastruktur der Lehranstalt für
Fischerei Aufseß. Auch seinen Mitarbeitern Herrn Günther Taschner und Herrn
Friedhold Schürer sei an dieser Stelle für die Unterstützung gedankt. Sie erbrachten
durch ihre äußerst kollegiale Zusammenarbeit einen großen Beitrag zum Gelingen der
Arbeit. Dank auch an Herrn Dieter Gottschling für fruchtbare Diskussionen und
praktische Hilfe bei der Versuchsdurchführung. Den Lehrlingen der Lehranstalt für
Fischerei in Aufseß Herrn Simon Stäblein, Herrn Alexander Stenglein, Herrn Simon
Abt, Herrn Julian Abt, Herrn Jonas Heinlein und Frau Daniela Gundelsheimer
danke ich für ihre tatkräftige Unterstützung.
Herrn Dr. Helmut Wedekind, Institut für Fischerei der Bayerischen Landesanstalt
für Landwirtschaft, gilt mein Dank für die freundliche Unterstützung bei der Planung
und Durchführung des Vorhabens. Herr Prof. Dr. Mansour El-Matbouli von der Klinik
für Fische und Reptilien der Ludwig-Maximilian-Universität München ermöglichte es,
dieses Projekt in dem gestellten zeitlichen Rahmen neben anderen Verpflichtungen
durchzuführen. Herrn Prof. Dr. Wilfried Haas danke ich für die Beratung und
Bereitstellung von Geräten. Frau Dr. Edit Eszterbauer vom Veterinary Medical
Research Institute der Hungarian Academy of Sciences in Budapest konnte mit ihrer
123
-7. Danksagung-
molekularbiologischen Expertise die genetischen Aspekte der Studie zur vollen
Zufriedenheit bearbeiten. Danken möchte ich Herrn Guido Neumann vom
Schwäbischen Fischereihof Salgen des Bezirks Schwaben und Herrn Lothar Keidel,
Fischzucht Keidel, Wüstensachsen, für die unkomplizierte Bereitstellung von
Laichfischen. Herr Dipl. Biol. Daniel Grabner von der Klinik für Fische und Reptilien
der Ludwig-Maximilian-Universität München gilt Dank für vielfältige technische Hilfe,
Durchsicht des Manuskripts und Durchführung von histologischen Arbeiten. Frau Dipl.
Biol. Suzanne van de Graaff und Herr Reinhard Gast sorgten unbürokratisch für die
chemisch-toxikologische
Analyse.
Frau
Christina
Loy
von
der
Sektion
Entwicklungsbiologie der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg führte die
Osmolalitätsmessungen durch und unterstützte die Arbeit mit praktischen Hinweisen.
Dank gebührt auch Herrn Dr. Ralph Rübsam von der Sektion Entwicklungsbiologie
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg für Beratung, Mikroskopie und
praktische Versuchstätigkeiten.
Herr Dr. Gunnar Dembek von der Klinik für Fische und Reptilien der LudwigMaximilian-Universität München unterstütze die Arbeit in den Bereichen Histologie und
Ultrastruktur. Nicht zuletzt danke ich der Firma Coppens für die Unterstützung bei
futtermitteltechnischen Aspekten, sowie Herrn Günther Wuhrer für Informationen und
Beschaffung von Futtermitteln. Lieber Dank gebührt nicht zuletzt meinen mich stets
unterstützenden Eltern Suna und Siegfried Kallert, und meiner Verlobten
Jacqueline Biermann v.a. für Geduld während Abwesenheit, Schreibarbeiten und
Durchführung des Projektes.
124
-8. Literatur-
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-9. Appendix-
9 Appendix
A. Zusammensetzung der Futtermittel im Versuch mit Zebrabärblingen (Angaben
laut Hersteller)
MF: 40% Fischmehl, 38,6% Weizen, 20% Sojaschrot dampferhitzt, 1,4% Fischöl
Inhaltsstoffe: (Angaben laut Hersteller)
Rohprotein
45%
Rohfett
7%
Rohfaser
3%
Rohasche
8%
Phosphor
1,3%
Vitamin A
16000 IU/kg
Vitamin D3
800 IU/kg
Vitamin E
160 mg/kg
Antioxidant
(Ethoxyquin)
100 mg/kg
Bruttoenergie
4516 Kcal/kg
18, 9 Mj/kg
LFF: Fischmehl, Sojaschrot dampferhitzt, Weizen, Maiskleber, Fischöl, Premix
Rohprotein
48%
Rohfett
10%
Rohfaser
2,5%
Rohasche
10%
Phosphor
1,4%
Vitamin A
27000 IU/kg
Vitamin D3
3000 IU/kg
Vitamin E
240 mg/kg
Vitamin C
360 mg/kg
Kupfer
5 mg/kg
Astaxanthin
40 mg/kg
Antioxidant
E321
Farbstoffe
E161J
Spezielle Zusatzstoffe
Immunstimulant
136
-9. Appendix-
B. Zusammensetzung des Futtermittels im Versuch mit Bachsaiblingen
42,65%Fischmehl, 23% Sojaschrot dampferhitzt, 12% Weizen, 9% Weizenkleber,
9,99% Fischöl, 2,34% Soja dampferhitzt, 1,11% Premix
Rohprotein
49%
Rohfett
15%
Rohfaser
2,38%
Rohasche
9,58%
Phosphor
1,27%
Vitamin A
1,2 IU/g
Vitamin D3
0,18 IU/g
Vitamin E
308 mg/kg
Vitamin C
360 mg/kg
Kupfer
8 mg/kg
Astaxanthin
50 mg/kg
Spezielle Zusatzstoffe
BHT
122 mg/kg
C. Primersequenzen zur Mikrosatellitenanalyse der Bachforellen-Herkünfte
Str-15 (Estoup et al. 1993)
Str15FAM
5'-TGCAGGCAGACGGATCAGGC-3
Str15R
5'-AATCCTCTACGTAAGGGATTTGC-3'
Str-60 (Estoup et al. 1993)
Str60FAM
5'-CGGTGTGCTTGTCAGGTTTC-3'
Str60R
5'-GTCAAGTCAGCAAGCCTCAC-3'
Str-543 (Presa & Guyomard 1996)
Str543FAM
5'-ATTCTTCGGCTTTCTCTTGC-3'
Str543R
5'-ATCTGGTCAGTTTCTTTATG-3'
SsoSL-417 (Slettan et al. 1995)
SsoSL417FAM
5'-TTGTTCAGTGTATATGTGTCCCAT-3'
SsoSL417R
5'-GATCTTCACTGCCACCTTATGACC-3'
SsoSL-438 (Slettan et al. 1995)
SsoSL438FAM
5'-GACAACACACAACCAAGGCAC-3'
SsoSL438R
5'-TTATGCTAGGTCTTTATGCATTGT-3'
Ssa-85 (O'Reilly et al. 1996)
Ssa85FAM
Ssa85R
5'-AGGTGGGTCCTCCAAGCTAC-3'
5'-ACCCGCTCCTCACTTAATC-3'
137
-9. Appendix-
Ssa-197 (O'Reilly et al. 1996)
Ssa197FAM
5'-GGGTTGAGTAGGGAGGCTTG-3'
Ssa197R
5'-TGGCAGGGATTTGACATAAC-3'
OKI-10 (Smith et al. 1998)
forward 5'FAM
Str15FAM
TGCAGGCAGACGGATCAGGC
Str60FAM
CGGTGTGCTTGTCAGGTTTC
Str543FAM
ATTCTTCGGCTTTCTCTTGC
SsoSL417FAM
TTGTTCAGTGTATATGTGTCCCAT
SsoSL438FAM
GACAACACACAACCAAGGCAC
Ssa85FAM
AGGTGGGTCCTCCAAGCTAC
Ssa197FAM
GGGTTGAGTAGGGAGGCTTG
reverse
Str15R
AATCCTCTACGTAAGGGATTTGC
Str60R
GTCAAGTCAGCAAGCCTCAC
Str543R
ATCTGGTCAGTTTCTTTATG
SsoSL417R
GATCTTCACTGCCACCTTATGACC
SsoSL438R
TTATGCTAGGTCTTTATGCATTGT
Ssa85R
Ssa197R
ACCCGCTCCTCACTTAATC
TGGCAGGGATTTGACATAAC
D. Protokoll für Mikrosatelliten-Analyse
DNA Extraktion
Gewebe: 2 mm2 Flossenschnitt
500 µl 10% Chelex 100 Lösung (BioRad Chelex 100 Resin/100-200 mesh), vorgewärmt auf 60˚C
unter Rühren.
Zugabe von 15 µl Proteinase K (10 mg/ml stock)
Inkubation 1-2 h bei 55˚C unter Schütteln
15 min bei 100˚C
Aufbewahrung des Extrakts bei +4 oder -20˚C.
Vor Gebrauch: Aufschütteln und für 10 s bei 10000 g zentrifugieren.
10% (w/v) Chelex Lösung:
10 g Biorad Chelex 100 Resin/100-200 mesh in 100 ml sterile Aqua dest.
138
-9. Appendix-
Mikrosatelliten PCR
Fermentas Taq-Polymerase, 25 µl Endvolumen
Vorwärts-Primer: FAM-markiertes 5’ Ende, Revers-Primer: unmarkiert (Stock: 100 µM, WS: 25 µM)
PCR Mastermix:
Str15;
Ssa85;
Str543;
SsoSL417
Str60;
Ssa197;
OKI10;SsoSL438
DNA
0.5
0.5
10x Taq Puffer
2.5
2.5
MgCl2 (25 mM):
1.5
1.5
dNTP (10 mM):
0.5
0.5
Primer (25 µM):
0.5-0.5
0.25-0.25
Fermentas Taq (5u/µl):
0.25
0.25
ddH2O
18.75
19.25
25
25
Locus
AnnealingT (˚C)
Größenbereich
Repeat
(nt)
Str-15
60
193-225
CT
Str-60
60
87-111
GT
Str-543
55
119-169
CT
SsoSL-417
52
161-197
GT
SsoSL-438
54 bis 48*
103-115
GT
Ssa-85
60
104-120
GT
Ssa-197
60
107-177
GTGA (+GT)
OKI-10
55
100-170
(CTGT)29
SsoSL-311
?
?
?
*”Touchdown” PCR
5 x 54˚C bis 48˚C in 1˚C Intervallen
PCR Programm:
3 min 94˚C
30 s 94˚C
30 s
˚C
35 Zyklen
30 s 72˚C
3 min 72˚C
139
-9. Appendix-
E. Allelfrequenzen
Allelfrequenzen für Populationen Aw, K und S nach Loci
Locus
Str-15
Allel
1
2
3
4
5
7
K
0,083
0,250
0,583
0,083
0,000
0,000
Aw
0,500
0,000
0,500
0,000
0,000
0,000
S
0,250
0,000
0,000
0,000
0,417
0,333
Locus
Str-60
Allel
1
2
3
4
5
6
K
0,333
0,083
0,583
0,000
0,000
0,000
Aw
0,667
0,000
0,250
0,000
0,000
0,083
S
0,000
0,000
0,583
0,083
0,333
0,000
Locus
Str-543
Allel
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
K
0,000
0,083
0,167
0,250
0,000
0,000
0,000
0,167
0,333
0,000
0,000
Aw
0,083
0,083
0,083
0,000
0,167
0,000
0,083
0,083
0,417
0,000
0,000
S
0,000
0,000
0,167
0,000
0,000
0,167
0,000
0,083
0,000
0,250
0,333
Locus
SsoSL-417
Allel
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
K
0,167
0,167
0,083
0,000
0,167
0,083
0,000
0,167
0,083
0,083
0,000
0,000
Aw
0,250
0,000
0,250
0,167
0,000
0,083
0,000
0,167
0,083
0,000
0,000
0,000
S
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,083
0,000
0,000
0,000
0,750
0,167
Locus
SSoSL438
Allel
1
2
3
4
K
0,167
0,250
0,167
0,000
Aw
0,083
0,417
0,000
0,083
S
0,000
0,000
0,000
0,167
140
-9. Appendix-
5
6
7
0,167
0,250
0,000
0,083
0,333
0,000
0,333
0,000
0,500
Locus
Ssa-85
Allel
1
2
3
4
5
6
7
K
0,000
0,000
0,000
0,417
0,500
0,083
0,000
Aw
0,083
0,000
0,167
0,500
0,167
0,083
0,000
S
0,000
0,083
0,000
0,000
0,000
0,583
0,333
Locus
Ssa-197
Allel
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
K
0,000
0,500
0,167
0,000
0,250
0,000
0,000
0,083
0,000
0,000
0,000
Aw
0,083
0,083
0,250
0,083
0,167
0,000
0,083
0,083
0,000
0,083
0,083
S
0,000
0,000
0,000
0,583
0,000
0,333
0,000
0,000
0,083
0,000
0,000
Locus
OKI-10
Allel
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
K
0,000
0,333
0,083
0,083
0,000
0,083
0,083
0,000
0,000
0,167
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,083
0,083
0,000
0,000
Aw
0,083
0,083
0,000
0,000
0,083
0,083
0,167
0,000
0,083
0,000
0,083
0,250
0,083
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
S
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,333
0,083
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,083
0,083
0,083
0,000
0,083
0,250
141
-9. Appendix-
F. Genotyp-Daten (als Allelnummern) der Einzeltiere der Herkünfte K, Aw und S
für die Msat-Loci Str-15, Str-60, Str-543, SsoSL-417, SSoSL438, Ssa-85, Ssa197, OKI-10 (v.l.n.r.).
K1,
0303 0303 0303 0110 0106 0404 0305 0616
K2,
0203 0203 0404 0108 0206 0505 0205 0202
K3,
0304 0103 0409 0305 0106 0404 0205 0410
K4,
0303 0303 0809 0208 0202 0505 0202 0310
K5,
0103 0103 0209 0205 0303 0406 0203 0202
K6,
0202 0101 0809 0609 0505 0505 0208 0717
Aw1,
0103 0101 0709 0309 0106 0404 0110 0102
Aw2,
0103 0106 0809 0808 0606 0404 0505 0712
Aw3,
0101 0101 0103 0101 0206 0104 0311 1213
Aw4,
0303 0103 0205 0103 0204 0305 0403 0712
Aw5,
0303 0103 0509 0306 0205 0406 0308 0511
Aw6,
0101 0103 0909 0404 0202 0305 0207 0609
S1,
0106 0303 1010 1112 0407 0606 0404 0814
S2,
0106 0305 0606 1111 0707 0606 0406 0716
S3,
0505 0303 0310 1112 0507 0707 0406 1819
S4,
0606 0405 0308 0711 0407 0207 0609 0715
S5,
0505 0305 1111 1111 0507 0606 0406 0719
S6,
0105 0305 1111 1111 0505 0607 0404 0719
142
-9. Appendix-
G. Vorlage zur Dokumentation der Fertilisationsparameter
Fachberatung für Fischerei - Lehranstalt für Fischerei Aufseß
Dokumentation - Formblatt BefruchtungDatum……….......Streifender………………………….Protokolland…………………
Fischart………………………..
Kreuzung…………………….x…………………….)
Herkunft ♂………………..♀…………………Alter………….....Gewicht……………..
Zuletzt gecheckt am…………………..Ovulation am………………….…………….
Anzeichen für Überreife O ja O nein
Methode
Betäubung O ja O nein
O nass O feucht O trocken
Beschreibung………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
…….……………………………………………………………………………………………
Gewaschen nach ……………min nach Befruchtung
Quellzeit……..min
Konzentrationen: ………….(g) Eier plus………..ml Sperma von ……..Milchnern
Aufgelegt in O Brutglas O Einsatz (Rinne)
Desinfiziert?.......................
Beschriftung:……………………………………………………………………………….
Notitzen/Bemerkungen:…………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………
Ergebnis der Erbrütung
Datum……………………………..
Ausgelesen am………………….
Schlupfrate………………………..
AP-Stadium………………………….
Verluste bis AP-Stadium…………%
Fazit:………………………………………………………………………………………..
© D. Kallert 2009
143
-10. Stellungnahme-
10 Stellungnahme
Während dieser Arbeit wurden nur Tiere im Rahmen der betrieblichen Arbeiten
verwendet. Keine Tiere wurden rein für Versuchszwecke entnommen, getötet oder
denselben zusätzliche Leiden zugefügt. Brütlinge und bebrütete Eier wurden
annähernd vollständig nach deren Beobachtung und Beurteilung dem üblichen
Brutbetrieb wieder zugeführt.
Alle Daten wurden selbstständig erhoben, nur die angegebenen Quellen fanden
Verwendung in diesem Bericht.
Der Inhalt dieses Berichtes ist in Auszügen zur zukünftigen Veröffentlichung bestimmt.
Weitergabe sowie Kopie obliegt alleinig dem Auftraggeber in Absprache mit dem
Verfasser. Der Inhalt ist bis zur endgültigen Veröffentlichung vertraulich zu behandeln.
München, den 30.3.2009,
Dr. D. M. Kallert
144

Der Einfluss exogener und endogener Parameter auf den

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