PARTIE I : BK ET REIN - thèse - Université Toulouse III

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THÈSE
En vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE
Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier
Discipline ou spécialité : Physiopathologie expérimentale
Présentée et soutenue par Marie Buléon
Le 24 avril 2008
Titre : Physiologie rénale du récepteur B2 de la bradykinine : de la
néphropathie diabétique au choc septique
JURY
Mr François Alhenc-Gelas (DR1 INSERM UMRS 872, Paris), Rapporteur
Mr Christos Chatziantoniou (DR1 INSERM U702, Paris), Rapporteur
Mr Jean-Jacques Helwig (DR1 INSERM UMRS 727, Strasbourg) Examinateur
Mme Hélène Hannaire (PU-PH, Toulouse), Examinateur
Mr Jean-Pierre Girolami (DR1 INSERM U858, Toulouse), Co-directeur de thèse
Mr Ivan Tack (PU-PH, Toulouse), Co-directeur de thèse
Ecole doctorale : Biologie - Santé - Biotechnologies
Unité de recherche : Laboratoire de Physiologie et INSERM U858
Directeur(s) de Thèse : Dr Jean-Pierre Girolami et Pr Ivan Tack
Rapporteurs : Mr François Alhenc-Gelas et Mr Christos Chatziantoniou
UNIVERSITE PAUL SABATIER – TOULOUSE III
Ecole Doctorale Biologie - Santé - Biotechnologie
THESE
Présentée et soutenue en vue de l’obtention du grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE TOULOUSE III
Discipline : Physiopathologie expérimentale
par
Marie BULEON
Physiopathologie rénale du récepteur B2 de la bradykinine : de
la néphropathie diabétique au choc septique
Directeurs de thèse : Dr Jean-Pierre Girolami et Pr Ivan Tack
Soutenue le : 24 avril 2008
Devant le jury composé de :
Mr François Alhenc-Gelas,
DR1 INSERM UMRS 872, Paris
Rapporteur
Mr Christos Chatziantoniou
DR1 INSERM U702, Paris
Rapporteur
Mr Jean-Jacques Helwig
DR1 INSERM UMRS 727, Strasbourg
Examinateur
Mme Hélène Hannaire
Professeur, Toulouse
Examinateur
Mr Jean-Pierre Girolami
DR1 INSERM U858, Toulouse
Co-directeur de thèse
Mr Ivan Tack
PU-PH, Toulouse
Co-directeur de thèse
1
Remerciements
Tout d’abord, je tiens à remercier les membres du jury, les Dr François AlhencGelas, Christos Chatziantoniou et Jean-Jacques Helwig, pour l’intérêt qu’ils ont porté à
mon travail, le temps qu’ils ont consacré à l’examiner et pour les remarques et suggestions
qu’ils m’ont apportées.
Je souhaite remercier avec beaucoup de reconnaissance mes 2 directeurs de thèse
pour m’avoir permis de réaliser ce travail.
Pr Ivan Tack qui m’a accueilli dans son équipe et m’a accordé sa confiance il y a
déjà plus de 5 ans et qui m’a permis d’arriver jusque là. Merci pour toutes les connaissances
que tu m’as apportées, pour ton soutien et ta confiance.
Dr Jean-Pierre Girolami qui m’a soutenue depuis le DEA, pour tout ce qu ‘il m’a
appris sur les kinines. Merci de ton aide et de ta disponibilité au cours de ces années et
particulier pour la rédaction de la thèse et la préparation de la soutenance.
Ce travail a été réalisé principalement dans le Laboratoire de Physiologie de la
Faculté de Médecine, je remercie le Pr Jean-Louis Ader d’avoir accepter de m’y accueillir.
Je remercie les membres de l’équipe sans qui ce travail n’aurait pas été possible et
qui ont partagé mon quotidien au labo pendant ces 5 années
Françoise Praddaude pour tout ce qu’elle m’a appris, pour son aide et sa gentillesse.
Merci de ton soutien qui m’a été précieux tout le long de mon séjour au labo et surtout à
certains moments difficiles. J’ai apprécié les longues discussions autour des repas de midi
partagés au labo.
Julien Allard qui est arrivé dans le labo en même temps que moi, avec qui j’ai
partagé plusieurs années de manip. Merci pour ton aide, tes conseils et tes encouragements,
j’ai beaucoup apprécié de travailler avec toi.
Aux autres personnes qui font le quotidien du Laboratoire de Physiologie, Maïtée
Ranera, Mohamed Khetta, Marie-Pierre Groussous, Marie-José Fouque, Marie-Claire
Mbongo, vous avez tous participé d’une façon ou d’une autre à mon travail. Merci de votre
aide, de votre bonne humeur et pour tous les bons moments passés ensemble.
Acil Jaafar pour le travail sur l’Irbésartan que j’ai apprécié de partagé avec toi. Bon
courage pour ta thèse et la suite.
Thierry Seguin pour tout le travail sur le choc septique.
Même si on se voit moins souvent, je n’oublie pas Christiane Pecher pour sa
disponibilité, son aide et les dépannages en tout genre pour les manip ; et Nelly Blaes arrivée
récemment dans l’équipe, merci pour ton soutien et tes conseils pendant les dernières étapes
de la thèse.
2
A tous les étudiants passés au laboratoire pendant que j’y étais et en particulier
Séverine qui a passé plus d’un an avec nous. Merci pour les bons moments, et bonne chance
pour la suite.
A toutes les personnes de l’ INSERM pour leur sympathie et les coups de mains qu’ils
m’ont donné..
Enfin, merci à tous ceux qui partagent ma vie.
Ma famille, qui m’entoure et me soutient (merci à mes parents de m’avoir permis de
faire de si longues études).
Mes amis pour tous les bons moments qui permettent de décompresser et se changer
les idées.
A Matthieu, simplement pour être là, merci pour ton soutien et ton écoute, ces années
ont été beaucoup plus faciles en étant à tes côtés.
Et bien sûr à Maël, qui a pointé son petit nez pendant ma thèse, pour l’immense
bonheur qu’il m’apporte.
3
Table des matières
Table des matières
INTRODUCTION................................................................................................................................. 10
PARTIE I : BRADYKININE ET REIN.............................................................................................. 14
I.
ORGANISATION DU SYSTEME KALLICREINE-KININE................................................................... 15
I.1.
Composants de la cascade paracrine ............................................................................. 15
I.1.a.
Composants du système kallicréine-kinine.................................................................................. 15
I.1.b.
Interactions entre le système rénine-angiotensine et le système kallicréine-kinine ..................... 16
I.2.
II.
Des récepteurs des kinines aux actions physiologiques.................................................. 18
I.2.a.
Récepteurs B1 et B2 .................................................................................................................... 18
I.2.b.
Localisation et régulation des récepteurs B1 et B2...................................................................... 19
I.2.c.
Signalisation et effets................................................................................................................... 20
UNE VISION FONCTIONNELLE ET INTEGREE DU SYSTEME KALLICREINE-KININE ........................ 22
II.1.
Régulation de la pression artérielle................................................................................ 23
II.2.
Inflammation et douleur.................................................................................................. 24
II.3.
Physiopathologie cardiovasculaire................................................................................. 25
II.4.
Effets sur la prolifération et la fibrose............................................................................ 25
III.
SYSTEME KALLICREINE-KININE : DE LA PHYSIOLOGIE A LA PATHOLOGIE RENALE ..................... 27
III.1.
Localisation et actions physiologiques de la bradykinine............................................... 27
III.1.a.
Localisation rénale des composants du système kallicréine-kinine........................................... 27
III.1.b.
Actions rénales de la bradykinine ............................................................................................. 28
III.2.
Modifications expérimentales du système kallicréine-kinine .......................................... 29
III.2.a.
Transfert du gène de la kallicréine ............................................................................................ 29
III.2.b.
Invalidation du gène de la kallicréine ....................................................................................... 31
III.2.c.
Surexpression/invalidation génétique du récepteur B2 ............................................................. 31
III.2.d.
Invalidation du récepteur B1..................................................................................................... 33
III.2.e.
Invalidation des récepteurs B1 et B2........................................................................................ 33
III.2.f.
Inhibition pharmacologique du système kallicréine-kinine ....................................................... 34
III.3.
Contribution personnelle : Profil fonctionnel rénal chez les souris KOB2, évidence d’un
rôle tonique du Récepteur B1 surexprimé ................................................................................................... 35
4
Table des matières
III.4.
Place de la bradykinine dans les effets du blocage du système rénine-angiotensine...... 38
III.4.a.
Inhibiteurs de l’Enzyme de Conversion .................................................................................... 38
III.4.b.
Antagonistes du récepteur AT1 de l’angiotensine II (ARA2) ................................................... 41
IV.
CONCLUSION ........................................................................................................................ 43
PARTIE II – NEPHROPATHIE DIABETIQUE ET SYSTEME KALLICREINE-KININE ....... 44
I.
UN CHALLENGE SANITAIRE ....................................................................................................... 44
II.
DE LA PHYSIOPATHOLOGIE A LA THERAPEUTIQUE .................................................................... 45
II.1.
Les médiateurs à l’échelon cellulaire ............................................................................. 46
II.1.a.
Rôle de l’hyperglycémie / AGE ................................................................................................. 46
II.1.b.
Rôle du stress oxydant ............................................................................................................... 48
II.1.c.
Facteurs de croissance ................................................................................................................ 48
II.2.
Intérêt et apport des modèles animaux ........................................................................... 52
II.3.
Thérapeutiques actuelles et perspectives ........................................................................ 56
III.
II.3.a.
Définir une stratégie ................................................................................................................... 56
II.3.b.
La fibrose rénale est-elle réversible ?......................................................................................... 57
II.3.c.
Les approches pharmacologiques............................................................................................... 58
II.3.d.
Autres cibles thérapeutiques potentielles ................................................................................... 60
II.3.e.
De l’approche protéomique à la thérapie génique / cellulaire..................................................... 61
TRAITEMENTS ET PROTECTION RENALE : DU BLOCAGE DU SRA A LA MISE EN JEU DU SKK...... 63
III.1.
Blocage du système rénine-angiotensine ........................................................................ 63
III.2.
Effets collatéraux du blocage du SRA : mise en jeu du SKK et autres............................ 63
III.3.
Activation du récepteur B2 : une nouvelle perspective de néphroprotection.................. 65
III.3.a.
Arguments pour le rôle protecteur de la bradykinine ................................................................ 65
III.3.b.
Mécanismes potentiels de l’effet néphroprotecteur................................................................... 67
III.4.
IV.
Quelle place pour le récepteur B1 ? ............................................................................... 71
CONTRIBUTION PERSONNELLE : PLACE DU RECEPTEUR B2 DANS LES EFFETS DU BLOCAGE DU
SRA AU COURS DE LA NEPHROPATHIE DIABETIQUE EXPERIMENTALE ............................................................... 72
PARTIE III – CHOC ENDOTOXINIQUE ET SYSTEME KALLICREINE-KININE................. 84
I.
COMPRENDRE POUR AMELIORER LE PRONOSTIC ........................................................................ 84
I.1.
Epidémiologie ................................................................................................................. 84
5
Table des matières
I.2.
Mécanismes généraux..................................................................................................... 85
I.3.
Options thérapeutiques actuelles .................................................................................... 88
II.
QUELLE EST LA PLACE DU SYSTEME KALLICREINE-KININE ? ..................................................... 90
II.1.
Rôle du recepteur B1 ...................................................................................................... 91
II.2.
Rôle du recepteur B2 ...................................................................................................... 93
II.3.
Différences entre les actions des deux récepteurs .......................................................... 94
III.
SYSTEME KALLICREINE-KININE ET HEMODYNAMIQUE RENALE AU COURS DU CHOC
ENDOTOXINIQUE. .............................................................................................................................................. 95
IV.
CONTRIBUTION PERSONELLE : IMPLICATION DES RECEPTEURS B1 ET B2 DANS
L’HEMODYNAMIQUE SYSTEMIQUE ET RENALE AU COURS DU CHOC ENDOTOXINIQUE EXPERIMENTAL ............... 97
V.
SYSTEME KALLICREINE-KININE ET CHOC SEPTIQUE, NOUVEAU MODELE, NOUVEAUX OUTILS ET
NOUVELLES PERSPECTIVES ................................................................................................................................ 98
CONCLUSIONS - PERSPECTIVES.................................................................................................. 99
REFERENCES.................................................................................................................................... 104
6
Table des figures et tableaux
Table des figures et tableaux
FIGURE 1 : ORGANISATION DES SYSTEMES RENINE-ANGIOTENSINE ET KALLICREINE-KININE ................................. 17
FIGURE 2 : EFFETS SUR LES PARAMETRES GENERAUX ............................................................................................ 36
FIGURE 3 : PARAMETRES FONCTIONNELS RENAUX................................................................................................. 37
FIGURE 4 : POSSIBILITES D’ACTIVATION DU RB2 DURANT UN TRAITEMENT PAR UN IEC OU UN ARA2 ............... 41
FIGURE 5 : EVOLUTION DE LA GLOMERULOSCLEROSE. GLOMERULES HUMAINS EN MICROSCOPIE OPTIQUE A
DIFFERENTS STADES DE NEPHROPATHIE DIABETIQUE
.......................................................................... 45
FIGURE 6 : EVOLUTION DE LA NEPHROPATHIE DIABETIQUE CHEZ L’HOMME .......................................................... 46
FIGURE 7 : PRINCIPAUX MECANISMES PHYSIOPATHOLOGIQUES DE LA NEPHROPATHIE DIABETIQUE ..................... 51
FIGURE 8 : EXEMPLES DE MODELES EXPERIMENTAUX DE DIABETE CHEZ LE RAT ET LA SOURIS ............................. 52
FIGURE 9 : DIFFERENTS MECANISMES POSSIBLES DE NEPHROPROTECTION ASSOCIES A L’ACTIVATION DU
RECEPTEUR DE LA BRADYKININE
......................................................................................................... 70
FIGURE 10 : DEFAILLANCE RENALE AU COURS DU SEPSIS ...................................................................................... 88
TABLEAU 1: PRINCIPAUX TRAVAUX IN VITRO SUR L'EFFET PROLIFERATIF OU ANTIPROLIFERATIF DE LA BK ......... 26
TABLEAU 2 : APPORT DES QUELQUES MODELES GENETIQUEMENT MODIFIES DANS LA CONNAISSANCE DE LA
GLOMERULOSCLEROSE DIABETIQUE .................................................................................................
55
TABLEAU 3 : AGONISTES EXISTANTS DU RECEPTEURS B2 DE LA BRADYKININE ET UTILISATION ......................... 100
7
Abréviations utilisées
AGE
Advanced Glycation End-Product
AMPc
Adénosine Mono-Phosphate cyclique
APC
Activated Protein C
ARA2
Antagonistes des Récepteurs AT1 de l’Angiotensine II
AT1
Récepteur de type I de l’Angiotensine II
AT2
Récepteur de type II de l’Angiotensine II
BK
Bradykinine
BMP7
Bone Morphogenic Protein 7
CTGF
Connective Tissue Growth Factor
DAG
Diacylglycérol
DFG
Débit de Filtration Glomérulaire
DID
Diabète Insulino-Dépendant
DNID
Diabète Non Insulino-Dépendant
ECA
Enzyme de Conversion de l’Angiotensine
ECA 2
Enzyme de Conversion 2 de l’Angiotensine 2
EGF
Epithelial Growth Factor
ENaC
Epithelial Na2+ Channel
FGF
Fibroblast Growth Factor
GMPc
Guanosine Mono-Phosphate cyclique
HGF
Hepatocyte Growth Factor
HDAC
Histone Desacethylases
HIF
Hypoxia Inducible Factor
HOPE
Heart Outcomes Prevention Evaluation
IEC
Inhibiteurs de l’Enzyme de Conversion
IGF1
Insulin Growth Factor 1
IL
Interleukine
IP3
Inositol 1,4,5-triphosphate
JNK
Jun-N-terminal Kinase
KOB1
Souris invalidées pour le récepteur B1 de la bradykinine
KOB2
Souris invalidées pour le récepteur B2 de la bradykinine
L-NAME
N(G)-nitro-l-Arginine Methyl Ester, inhibiteur de la NOS
LPS
Lipopolysaccharide
MAPK
Mitogen Activated Protein Kinases
ND
Néphropathie Diabétique
8
NFκB
Nuclear Factor κB
NOD
Non Obese Diabetic
NO
Monoxyde d’azote
NOSe
NO-Synthase endothéliale
NOSi
NO-Synthase inductible
NOSn
NO-Synthase neuronale
p27kip1
Inhibiteur des Cyclin Dependant Kinases
PAF
Platelet-Activating Factor
PAI-1
Plasminogen Activator Inhibitor-1
PDGF
Platelet-Derivated Growth factor
PGE2
Prostaglandine E2
PIP2
Phosphatidylinositol 4,5-biphosphate
PKC
Protéine Kinase C
PLA2
Phospholipase A2
PLC
Phospholipase C
RAGE
Receptor for Advanced Glycation End-Product
RB1
Récepteur B1 de la bradykinine
RB2
Récepteur B2 de la bradykinine
RCPG
Récepteur Couplé aux Protéines G
REIN
The Ramipril Efficacy In Nephropathy
RLO
Radicaux Libres Oxygénés
SDKP
Peptide N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline
SHR-SP
Stroke-prone spontaneously hypertensive rats
SKK
Système Kallicréine-Kinine
SOD
Super Oxyde Dismutase
SRA
Système Rénine Angiotensine
STZ
Streptozotocine
TGFβ
Transforming Growth Factor β
TGFβ RII
Récepteur de type II du TGFβ
TNF
Tumor Necrosis Factor
TZD
Thiazolidinediones
VEGF
Vascular Endothelial Growth Factor
9
Introduction
INTRODUCTION
Le diabète, de type I comme de type II, se complique fréquemment d’une atteinte
rénale (prévalence ≥ 15 %), caractérisée principalement par une atteinte glomérulaire avec
une protéinurie qui évolue vers l’insuffisance rénale. En dépit des efforts de contrôle de la
glycémie, 50 % des diabétiques de type I développent une néphropathie après 20 ans de
maladie. Ce problème est encore plus critique au cours du diabète de type II puisque, même si
la durée de la maladie est souvent inférieure, il est pratiquement impossible d’obtenir un
équilibre glycémique optimal. L’espérance de vie croissante dans ce cas explique l’incidence
croissante des néphropathies diabétiques (ND) au cours du diabète de type II. Aujourd’hui,
seul le blocage du Système Rénine Angiotensine (SRA) par les Inhibiteurs de l’Enzyme de
Conversion (IEC) ou par les antagonistes du récepteur AT1 de l’angiotensine II, a montré une
efficacité clinique pour ralentir la progression de la néphropathie diabétique. L’effet
protecteur des IEC a longtemps été attribué exclusivement au blocage de la synthèse
d’angiotensine II. Toutefois, un nombre croissant d’arguments expérimentaux suggère que la
mise en jeu du Système Kallicréine-Kinine (SKK) contribue aussi à l’action bénéfique des
IEC. La bradykinine (principale molécule du SKK) est un nonapeptide qui agit sur deux
récepteurs couplés aux protéines G : les récepteurs B1 et B2. Le rôle du récepteur B2 (RB2) a
été le plus étudié et sa contribution aux mécanismes d’action des IEC semble la plus
importante. Bien avant la mise en évidence de son action trophique au cours des
néphropathies chroniques, la BK a été impliquée dans des dysfonctionnements aigus du rein,
10
Introduction
comme le choc septique dont l’incidence est d’ailleurs augmentée par la présence d’un
diabète. Le système kallicréine-kinine occupe une place notable dans la physiopathologie du
choc endotoxinique. Cependant son impact global, délétère ou protecteur, ainsi que les actions
respectives des récepteurs B1 et B2 sont encore mal déterminés.
Nos travaux avaient pour but de préciser le rôle du récepteur B2 de la bradykinine au
cours de l’insuffisance rénale chronique (néphropathie diabétique) ou aiguë (choc
endotoxinique). L’idée principale était de rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques
potentielles pour protéger le rein dans ces deux pathologies.
Initialement, nous avons étudié l’effet du blocage du RB2 sur l’expression et
l’activation de plusieurs facteurs de croissance au cours d’un traitement par un IEC chez le rat
diabétique (Streptozotocine) (Allard J, Buléon M, Cellier E, Renaud I, Pecher C, Praddaude F, Conti
M, Tack I and JP Girolami.ACE inhibitor reduces growth factor receptor expression and signalling but
also albuminuria through B2-kinin glomerular receptor activation in diabetic rats. Am J Physiol Renal
Physiol. 2007 ; 293(4) : F1083-92). Ensuite, nous avons développé dans le Laboratoire le modèle
des souris obèses et diabétiques de type II, C57BlKs db/db, qui développent des lésions
rénales plus progressives et plus proches de celles observées chez l’Homme que le rat.
Comme la néphropathie diabétique est avant tout une glomérulopathie, la première étape a
consisté en l’adaptation chez la souris d’une méthode d’isolement glomérulaire par tri
magnétique sélectif. Ce travail a fait l’objet d’une communication internationale (Buleon M,
Allard J, Praddaude F, Ader JL, Tack I: Glomerular expression and activation of IGF-I pathway in type I
and type II diabetes in mice. (poster) ASN 37th Annual Meeting & Scientific Exposition, St Louis,
Missouri, october 2004) et le manuscrit, en préparation, sera soumis prochainement à la revue
European Journal of Physiology. Nous avons ensuite étudié le rôle du récepteur B2 de la
bradykinine (RB2) dans l’effet des IEC au cours de la néphropathie diabétique chez la souris
db/db. (Marie Buléon, Julien Allard, Acil Jaafar, Françoise Praddaude, Marie-Thérèse Ranera,
11
Introduction
Christiane Pecher, Jean-Pierre Girolami and Ivan Tack. Pharmacological blockade of B2-kinin receptor
reduces renal protective effect of Angiotensin-Converting Enzyme Inhibition in db/db mice model. Am J
Physiol Renal Physiol. 2008). Enfin, nous avons étudié dans le même modèle, l’effet du blocage
du RB2 au cours d’un traitement cette fois par un antagoniste du récepteur AT1 de
l’angiotensine II (ARA2) (Acil Jaafar, manuscrit en cours de rédaction).
L’extrême sensibilité des animaux diabétiques à l’action des IEC et au blocage du
RB2 nous a amené à nous interroger sur les actions rénales du RB2 en conditions
physiologiques et au cours du diabète. L’invalidation du RB2 a pour principale conséquence
une diminution du débit de filtration glomérulaire. Nous avons surtout été frappés par le fait
que les souris invalidées pour le RB2 surexpriment sensiblement le RB1 (la réciproque pour
le KOB1 étant aussi exacte). Les conséquences observées dans le modèle KOB2 pourraient
aussi résulter de la surexpression du RB1. L’utilisation d’antagonistes du RB1 et du RB2 dans
les deux modèles de KO est en cours et fera prochainement l’objet d’une publication.
Le choc endotoxinique est une circonstance dramatique mais malheureusement assez
fréquente (entre autre chez le diabétique), au cours de laquelle l’altération des fonctions
rénales détermine largement le pronostic global du patient. Nous avons étudié les
conséquences fonctionnelles rénales d’un choc endotoxinique induit par le lipopolysaccharide
(LPS) chez des souris sauvages, KOB1 ou KOB2. (Seguin T, Buleon M, Destrube M, Ranera MT,
Couture R, Girolami JP, Tack I. Hemodynamic and renal involvement of B(1) and B(2) kinin receptors
during the acute phase of endotoxin shock in mice. Int Immunopharmacol. 2008 ; 8(2) : 217-21). Des
travaux complémentaires sont en cours dans un modèle expérimental de choc septique par
ponction caecale. Ceux-ci concernent l’implication des récepteurs de la bradykinine dans
l’augmentation de la perméabilité capillaire, qui contribue à altérer le pronostic du choc
septique.
12
Introduction
La synthèse des résultats de nos travaux montre que le blocage du récepteur B2 de la
bradykinine détermine une perte sensible d’efficacité des IEC. Plus encore, cela nous a permis
d’étayer avec des arguments de plus en plus directs le concept de l’effet néphroprotecteur de
l’activation du RB2. Cette réflexion a fait l’objet d’une revue faisant le point sur l’état des
connaissances actuelles concernant le rôle potentiellement néphroprotecteur du RB2
(Bradykinine et néphroprotection, Pourquoi ? Comment ? Perspectives. Marie Buléon, Marion
Merhenberger, Christiane Pécher, Françoise Praddaude, Réjean Couture, Ivan Tack, Jean-Pierre
Girolami. MEDECINE/SCIENCES 2007 ; 23 : 1141-7). Finalement, il reste à vérifier cette
hypothèse par l’étude des effets directs d’un agoniste stable de la bradykinine. Nous
disposons d’un des premiers agonistes non peptidiques (donc résistant à la dégradation
endogène) de la bradykinine utilisable in vivo. Nous avons commencé à tester l’effet de cet
agoniste, en priorité dans le modèle de la néphropathie diabétique.
13
Partie I : bradykinine et rein
PARTIE I : BRADYKININE ET REIN
Les kinines sont des médiateurs paracrines appartenant à une famille de peptides
endogènes constitués de 9 à 11 acides aminés. Ce sont les peptides actifs du système
kallicréine-kinine (SKK), dont le plus connu est la bradykinine (BK). Le SKK est un système
protéique impliqué dans de nombreuses fonctions physiologiques telles que la régulation
locale et systémique de la pression artérielle, la volémie, la perméabilité vasculaire, les
réponses inflammatoires, la médiation de la douleur et le phénomène de coagulation. Le
système comprend des substrats (les kininogènes), des enzymes (les kallicréines) et des
peptides vasoactifs (les kinines), qui agissent sur deux récepteurs à sept domaines
transmembranaires (les récepteurs B1 et B2), associés à l’activation d’un réseau de
signalisation complexe.
La reconnaissance de ce système remonte aux travaux d’Abelous et Bardier (1909) [1]
qui ont observé que l’injection intraveineuse d’urine humaine chez le chien provoquait une
importante chute de la pression artérielle. Plus tard, en 1930 le groupe de E. Werle isola cette
substance hypotensive, à partir d’extraits de pancréas et la désigna du nom de « kallicréine »
[2]. La bradykinine a, quant à elle, été découverte 20 ans plus tard par le groupe de Rocha e
Silva.
L’organisation du système kallicréine-kinine est à la fois complexe et classique pour
un système de communication paracrine relativement ubiquitaire : un propeptide, une enzyme
activatrice, 2 récepteurs de type RCPG et un catabolisme enzymatique très particulier.
14
I.
ORGANISATION DU SYSTEME KALLICREINE-KININE
I.1.
COMPOSANTS DE LA CASCADE PARACRINE
I.1.a.
Composants du système kallicréine-kinine
Les kinines sont libérées lors de l’hydrolyse enzymatique des kininogènes (substrats
hépatiques circulants) par des sérine-protéases : les kallicréines. Il existe au moins deux types
d’enzymes kallicréines : la kallicréine plasmatique et la kallicréine tissulaire. Elles diffèrent
par leurs propriétés physico-chimiques et fonctionnelles, leurs substrats et leurs localisations
[3]. Les deux hydrolysent, avec des affinités différentes, les kininogènes de haut et de bas
poids moléculaire. La kallicréine plasmatique (PM : 60 kDa) est codée par un seul gène, elle
est synthétisée au niveau du foie sous la forme d’un précurseur inactif, la prékallicréine, qui
est la forme circulante. Après activation, elle hydrolyse essentiellement le kininogène de haut
poids moléculaire (glycoprotéine synthétisée au niveau du foie) pour former la bradykinine.
Les kallicréines tissulaires, codées par plusieurs gènes localisés chez l’Homme sur le
chromosome 19 (PM entre 24 et 48 kDa), sont synthétisées dans de nombreux tissus,
principalement le pancréas, le rein, l’intestin et le cerveau. Leur substrat préférentiel est le
kininogène de bas poids moléculaire, à partir duquel elles vont libérer selon les espèces la
bradykinine (Rat et Souris) ou la lys-bradykinine (ou kallidine chez l’Homme).
Les kininogènes de haut et de bas poids moléculaire sont produits dans le foie, ils
résultent de l’épissage alternatif d’un seul gène [4]. Ils présentent des variations de séquence
en fonctions des espèces, il existe en conséquence des différences entre espèces dans la
séquence peptidique des kinines. La principale kinine, la bradykinine, est un nonapeptide de
séquence : arg–pro–pro–gly–phe–ser–pro–phe–arg. Chez l’Homme, il existe deux autres
15
principales kinines : la kallidine ou lys-bradykinine (Lys-BK) qui est un décapeptide, et un
nonapeptide, la des-Arg10-kallidine. Chez le Rat, il existe uniquement la BK et la des-Arg9BK ainsi qu’une kinine spécifique du rat : la T-kinine (ou Ile-Ser-BK), libérée essentiellement
par l’action de la trypsine [5]. Toutes ces kinines agissent sur deux récepteurs couplés aux
protéines G, nommés B1 et B2.
I.1.b.
Interactions entre le système rénine-angiotensine et le système
kallicréine-kinine
In vivo, la BK est rapidement inactivée par deux voies enzymatiques principales
impliquant les kininases I et II. Sa demi-vie plasmatique est estimée à moins de 30 secondes.
La kininase I, également connue sous le nom de carboxypeptidase N (CPN) dans le plasma ou
carboxypeptidase M (CPM) sur la membrane plasmique des cellules vasculaires, génère la
des-Arg9-BK. Celle-ci, agoniste préférentiel du récepteur B1, est responsable d’effets
biologiques bien distincts de ceux de la BK. La kininase II, plus connue sous le nom
d’Enzyme de Conversion de l’Angiotensine II (ECA), est la cible des Inhibiteurs de l’Enzyme
de Conversion (IEC). C’est une métalloprotéase à doigts de zinc capable, d’une part de
générer l’angiotensine II à partir d’angiotensine I et, d’autre part, de dégrader la BK en
fragments BK1-5 et BK1-7 inactifs. L’ECA présente une plus grande affinité pour la BK que
pour l’angiotensine I [6]. Ce double rôle de l’enzyme de conversion, synthèse de
l’angiotensine II et dégradation de la bradykinine, constitue un lien étroit entre ces 2 puissants
systèmes vasomoteurs (Systèmes Rénine-Angiotensine, et SKK). L’organisation et
l’intersection de ces deux systèmes sont représentées sur la Figure 1.
16
La bradykinine peut également être dégradée en BK1-7 par l’endopeptidase neutre. Les
inhibiteurs de vasopeptidases inhibent à la fois l’endopeptidase neutre et l’enzyme de
conversion.
La très courte durée de vie de la BK laisse supposer qu’elle aurait plutôt une action
locale, de type autocrine ou paracrine. En effet, les concentrations de BK tissulaires sont plus
élevées que les concentrations plasmatiques [7]. De plus, les différents éléments nécessaires à
la synthèse de BK sont présents dans la paroi de certaines artères [8, 9].
Figure 1 : Organisation des systèmes rénine-angiotensine et kallicréine-kinine
IEC : inhibiteurs de l’enzyme de conversion, ARA2 : antagonistes du récepteur AT1 de l’angiotensine
II et IVP : inhibiteurs des vasopeptidases
17
I.2.
DES RECEPTEURS DES KININES AUX ACTIONS PHYSIOLOGIQUES
I.2.a.
Récepteurs B1 et B2
Les kinines agissent sur 2 récepteurs à 7 domaines transmembranaires (appartenant à
la famille des récepteurs couplés aux protéines G), les récepteurs B1 et B2. Le récepteur B2
(RB2) a été cloné en 1991 par le groupe de Jarnagin [10], et le récepteur B1 l’a été quelques
années plus tard [11]. La structure de ces 2 récepteurs est typique des récepteurs couplés aux
protéines G, avec 7 domaines transmembranaires, un domaine N-terminal extracellulaire et un
domaine C-terminal intracellulaire. Chez l’Homme, les gènes de ces deux récepteurs,
localisés sur le chromosome 14 sont séparés par seulement 12 kb [12]. L’homologie de
structure entre les récepteurs B1 et B2 n’est que de 36% chez l’Homme, et de 30% chez la
Souris.
Initialement ces deux récepteurs ont été distingués et classés selon leurs propriétés
pharmacologiques, en particulier selon leur affinité pour 2 différents ligands : la des-Arg9 BK
et la BK [13].
Le RB1 est activé préférentiellement par la des-Arg9-BK et la des-arg10-lys-BK,
métabolites endogènes de la bradykinine et de la lys-bradykinine respectivement après action
de la kininase I. Il peut également être activé par la BK avec une moindre efficacité. Le
récepteur B2 (RB2), responsable de la majorité des effets physiologiques décrits de la BK [3],
est quand à lui activé exclusivement par la BK et la lys-BK [14].
18
I.2.b.
Localisation et régulation des récepteurs B1 et B2
Le récepteur B2 (RB2) est constitutivement exprimé à la surface de nombreux types
cellulaires, notamment les cellules endothéliales et musculaires lisses [15], les fibroblastes, les
cellules mésangiales et épithéliales. Après liaison de la BK avec le récepteur et activation de
la protéine G, le ligand est dissocié et le complexe récepteur/protéine G est rapidement
internalisé. Ce processus implique la phosphorylation de plusieurs résidus sérine et thréonine
dans le domaine C-terminal du récepteur [16]. Ce phénomène de désensibilisation permet
d’éviter la suractivation des récepteurs B2 qui pourrait avoir des conséquences délétères au
cours de la réponse inflammatoire, de la douleur ou bien pour le contrôle de la pression
sanguine artérielle. De plus ce mécanisme d’endocytose permet secondairement le recyclage
des RB2 à la membrane.
Contrairement au RB2, le RB1 est un récepteur essentiellement inductible. De ce fait,
il est peu détectable dans les conditions physiologiques mais fortement exprimé au cours de
certaines situations pathologiques [17]. Son expression est induite en cas de lésions
tissulaires, en présence d’endotoxines bactériennes [18], et au cours de certaines pathologies
comme le diabète. Cette induction se fait au niveau transcriptionnel et implique des cytokines
inflammatoires telles que l’interleukine-1β et le TNFα [19, 20], ou encore l’activation des
MAP-kinases, la mise en jeu du facteur de transcription nucléaire NFκB et la protéine kinase
p38 [21-23].
A la différence du RB2, le RB1 est associé à une lente dissociation du ligand, il n’est
ni désensibilisé ni internalisé [24, 25].
19
I.2.c.
Signalisation et effets
Les récepteurs B1 et B2 sont associés à de multiples systèmes de signalisation
complexes.
Ainsi, le RB2 active les voies de signalisation classiquement associées aux RCPG,
impliquant le recrutement des protéines Gαq et Gαi, l’activation des phospholipases C et A2
et la formation des seconds messagers correspondants. Ces cascades de signalisation diffèrent
suivant le type cellulaire concerné. La phospholipase C hydrolyse le phosphatidylinositol 4,5biphosphate (PIP2) pour former les seconds messagers inositol 1,4,5-triphosphate (IP3) et
diacylglycérol (DAG). L’IP3 provoque une augmentation rapide des concentrations
intracellulaires en Ca2+, et est par exemple responsable de l’activation de la NO-synthase
endothéliale et donc de la synthèse et de la libération de monoxyde d’azote (NO) [26]. Le NO
ainsi produit diffuse jusqu’aux cellules cibles où il détermine la formation de guanosine
monophosphate cyclase (GMPc). De nombreux travaux montrent que le NO et le GMPc sont
les facteurs vasodilatateurs responsables des effets des kinines sur le tonus vasculaire. Tout
d’abord, une accumulation de GMPc dépendante du NO a été montrée dans les cellules du
muscle lisse vasculaire [27]. L’administration d’un antagoniste non peptidique du récepteur
B2 (HOE-140 ou Icatibant) provoque une réduction des taux de GMPc dans le liquide
interstitiel rénal [28]. L’inhibition de la NO-synthase par le L-NAME induit une
augmentation de pression artérielle plus faible chez les souris KOB2 que chez les souris
contrôles [29]. Enfin, les souris transgéniques surexprimant le RB2 présentent une élévation
des concentrations rénales et urinaires d’adénosine monophosphate cyclase (AMPc) et de
GMPc ainsi qu’une augmentation des taux urinaires de NO [30], alors que les souris
n’exprimant plus le RB2 excrètent moins de nitrites et ont une concentration urinaire de
20
GMPc plus faible [31]. Tous ces arguments plaident en faveur d’un effet vasodilatateur de la
bradykinine via la production de NO et de GMPc. L’activation du RB2 peut également
stimuler la phospholipase A2 (PLA2) et induire la synthèse d’acide arachidonique, précurseur
de la prostacycline [32]. Celle-ci stimule la production d’AMPc, un autre puissant
vasodilatateur.
La BK est également capable d’activer des voies de signalisation moins classiques. En
effet, une interaction directe a été démontrée entre le RB2 et des enzymes telles que la
phospholipase Cγ, la NO-synthase neuronale (NOSn), la NO-synthase endothéliale (NOSe)
[33]. Cette interaction entre le RB2 et la NOSe permet le recrutement de la protéine kinase
Akt et permet ainsi le contrôle de la phosphorylation de la NOSe et de la production de NO.
Le RB2 pourrait également interagir avec la tyrosine phosphatase SHP2 [34], cette interaction
serait impliquée dans l’effet antiprolifératif de la BK. Cette complexité des voies de
signalisation activées par la BK fournit une explication à ses effets parfois contradictoires au
cours des phénomènes de prolifération cellulaire et de fibrose. En effet, selon les conditions,
la BK pourrait avoir une action proliférative ou anti-proliférative (Tableau 1 p26). Dans la
cellule mésangiale, par exemple, la BK serait capable de stimuler ou d’inhiber la
phosphorylation des MAP-kinases ERK1 et 2 en fonction de l’état d’activation cellulaire en
réponse à divers facteurs de croissance [35].
Le RB1 interagit aussi directement avec les protéines Gq et Gi [36] et active la plupart
des voies de signalisation mises en jeu par le RB2, dont l’hydrolyse de PIP2, l’augmentation
de Ca2+ intracellulaire, la libération d’acide arachidonique et l’activation de la NOSe. Le RB1
exerce un rôle important dans les processus d’inflammation. A l’instar du RB2, l’activation
du RB1 peut entraîner des effets prolifératifs [37] ou anti-prolifératifs [38]. L’effet prolifératif
impliquerait une activation des MAP-kinases. Inversement, Dixon et al [38] ont montré que
21
un effet anti-prolifératif du RB1 dans les cellules musculaires lisses. Il serait dû à l’activation
prolongée des MAP-kinases qui activeraient secondairement l’inhibiteur de cycle cellulaire
p27kip1.
Les deux récepteurs empruntent donc des voies de signalisation similaires pour induire
des effets différents en fonction des tissus et de leur régulation à court terme (internalisation,
désensibilisation). Puisque ces récepteurs activent de façon générale le même ensemble de
voies de signalisation, ils ne peuvent être distingués sur la base de leurs effets biologiques.
Par contre, leur blocage par des antagonistes pharmacologiques spécifiques permet de bien
distinguer les effets B1 des effets B2.
II.
UNE VISION FONCTIONNELLE ET INTEGREE DU SYSTEME
KALLICREINE-KININE
Les rôles biologiques des kinines sont nombreux et comprennent : 1) la contraction ou
relaxation des muscles lisses des tractus intestinal, urogénital et respiratoire ; 2) la régulation
des transports ioniques épithéliaux, de l’hémodynamique systémique et de la pression
artérielle [39] ; 3) un rôle de neurotransmetteur dans le système nerveux central et 4) un rôle
modulateur de certaines fonctions cellulaires, telles que la prolifération (mitogénèse) et, plus
récemment, des phénomènes de fibrose [40-43]. En pratique, leurs rôles prédominants
semblent, dans l’état actuel des connaissances, la médiation de l’inflammation et de la douleur
ainsi que le contrôle de la pression artérielle [44].
22
II.1.
REGULATION DE LA PRESSION ARTERIELLE
La bradykinine, via la libération de NO et de GMPc, est un puissant vasodilatateur.
Des travaux effectués chez l’Homme et dans plusieurs modèles expérimentaux, suggèrent
qu’une diminution de la synthèse de BK favoriserait le développement de l’hypertension
artérielle. Des études épidémiologiques [45, 46] ont montré une relation inverse entre les taux
urinaire et rénal de kallicréine et la sévérité de l’hypertension. De même, les études
expérimentales ont rapporté une réduction de l’excrétion urinaire de kallicréine chez des rats
hypertendus [47]. Ces observations supportent l’idée d’une relation entre le SKK et la
régulation de la pression artérielle. Cependant la BK n’apparaît pas comme un déterminant
important de la pression artérielle en conditions physiologiques. Elle jouerait plutôt un rôle
protecteur contre les facteurs qui tendent à la modifier, en particulier à l’augmenter. En effet
les souris invalidées pour le RB2 ne semblent pas spontanément hypertendues [48, 49], bien
que quelques travaux [29, 50-52] du groupe de Maddedu indiquent que les souris KOB2
développent une augmentation modérée de la pression artérielle. Cependant ces résultats n'ont
pas été confirmés par les travaux d’autres groupes. Par contre, ces souris déficientes en RB2
présentent une hypersensibilité à certains facteurs tenseurs, en particulier un régime
hypersodé [29, 53, 54]. Cela suggère que l’activation du RB2 participerait essentiellement à la
régulation de la pression artérielle en condition de « stress ». La BK pourrait donc jouer un
rôle protecteur en maintenant normale la pression artérielle en cas de surcharge sodée,
certainement par son effet vasodilatateur NO-dépendant, mais peut être aussi via son effet
natriurétique. Lorsque l’hypertension artérielle se développe tout de même, la BK pourrait
également limiter ses complications : hypertrophie cardiaque, lésions rénales…
23
II.2.
INFLAMMATION ET DOULEUR
Contrairement aux situations précédemment évoquées, une surproduction de
bradykinine est observée au cours des états inflammatoires. Dans ce cas, le blocage de ses
récepteurs permettrait de réduire l’intensité de la réaction inflammatoire et de la douleur [5561]. Les kinines sont des puissants agents vasoactifs. En condition inflammatoire ou lors de
lésions tissulaires, elles sont responsables d’une vasodilatation artériolaire mais aussi d’une
extravasation plasmatique par augmentation de la perméabilité plasmatique [39]. Les deux
récepteurs, B1 et B2, ont été impliqués dans le développement de réponses inflammatoires
locales dans des modèles d’arthrites aiguës et chroniques chez le rat [62-65]. Le récepteur B1,
ainsi que son ligand endogène, sont produits de novo sur les sites d’inflammation ou de
lésions tissulaires. Ce récepteur a été impliqué dans de nombreuses pathologies
inflammatoires chroniques dont certaines formes d’hyperalgésie chronique [66].
Les kinines sont également capables de stimuler directement les terminaisons
nerveuses sensorielles et ainsi de générer la douleur et l’inflammation neurogène [66, 67]. De
plus, les composantes du SKK sont exprimées au niveau du système nerveux central. Le RB2
jouerait, à ce niveau là, un rôle dans la modulation de la douleur [68, 69].
Les deux récepteurs des kinines jouent donc un rôle important dans le développement
des réponses inflammatoires et de la douleur, avec toutefois des effets bien distincts : le RB2
interviendrait plutôt dans les phases aiguës de l’inflammation et de la douleur, tandis que le
RB1 serait plutôt mis en jeu dans leurs phases chroniques.
24
II.3.
Les
PHYSIOPATHOLOGIE CARDIOVASCULAIRE
kinines
exercent
également
un
rôle
important
en
physiopathologie
cardiovasculaire. La bradykinine, via le RB2, aurait une action cardioprotectrice,
indépendante de son effet vasodilatateur. En effet, les animaux surexprimant la kallicréine
sont plus résistants à l’ischémie-reperfusion cardiaque [70]. Dans la même situation, les souris
invalidées pour le RB2 développent des lésions myocardiques et des arythmies plus sévères
[71]. L’effet anti-hypertrophique du RB2 a également été décrit au cours d’une étude clinique
chez l’Homme [72].
II.4.
EFFETS SUR LA PROLIFERATION ET LA FIBROSE
La littérature récente propose de « nouveaux effets » de la bradykinine, en particulier
dans le contrôle de la prolifération cellulaire et la synthèse de protéines matricielles. Ces
effets, parfois contradictoires, pourraient mettre en jeu l’activation de voies de signalisations
différentes des voies classiques et n’impliquant pas le recrutement d’une protéine G.
Il a été rapporté à la fois des effets mitotiques et des effets anti-mitotiques de la
bradykinine. En effet, la BK, via l’activation de la PKC a un effet inducteur de la prolifération
de faible intensité sur de nombreux types cellulaires [73-77]. A l’inverse, d’autres travaux
montrent une inhibition de la prolifération de cellules cancéreuses mammaires [78] et des
cellules musculaires lisses [79]. Ces effets apparemment contradictoires suggèrent l’existence
d’une double voie de signalisation. En fait, l’effet prolifératif ou anti-prolifératif de la BK
semble dépendre de l’état d’activation préalable des cellules par les facteurs de croissance. Le
Tableau 1 regroupe plusieurs travaux qui montrent que les effets prolifératifs sont observés
25
sur les cellules quiescentes alors que les effets anti-prolifératifs l’ont été sur des cellules en
prolifération.
Tableau 1: Principaux travaux in vitro sur l'effet prolifératif ou antiprolifératif de la BK
Type
cellulaire
Mésangial
Muscle lisse
Epithélial
Mésangial
Endothélial
Muscle lisse
Epithélial
Fibroblaste
Etat
d’activation
Quiescent
Quiescent
Quiescent
IGF-1
Glucose
PDGF
EGF, IGF-1
EGF, PDGF
Type de
récepteur BK
B2
B2
B2
B2
B2
B2
B2
B2
Effet
Prolifération
Prolifération
Prolifération
Anti-prolifératif
Anti-prolifératif
Anti-prolifératif
Anti-prolifératif
Anti-prolifératif
Référence
[73, 74]
[75]
[76, 77]
[35]
[80]
[38, 79]
[78]
[81]
De la même façon, la bradykinine pourrait exercer, selon les types cellulaires, des
effets fibrosants ou anti-fibrosants. En effet, in vitro, l’activation du RB1 stimule la synthèse
de collagène par les fibroblastes pulmonaires [82]. A l’inverse, la BK réduit la synthèse de
fibronectine et de collagène par les fibroblastes cardiaques [83]. In vivo, la BK aurait plutôt un
rôle anti-fibrosant, en inhibant l’accumulation cardiaque de collagène après un infarctus chez
le rat [84]. La surexpression de la kallicréine chez le rat, permet également de réduire la
fibrose consécutive à une hypertrophie cardiaque [85], un effet dépendant du RB2. Enfin,
après obstruction urétérale, les souris invalidées pour le RB2 présentent une fibrose rénale
tubulo-interstitielle deux fois plus sévère [42]. De plus, l’effet anti-fibrosant des IEC sur les
cellules mésangiales humaines semble être dépendant au moins en partie du RB2 [86]. Cet
effet anti-fibrosant de la BK reposerait sur la mise en jeu de la stimulation des activateurs du
plasminogène, ce qui provoquerait une activation des métalloprotéases responsables de la
dégradation de la matrice extracellulaire [42].
26
III.
SYSTEME KALLICREINE-KININE : DE LA PHYSIOLOGIE A
LA PATHOLOGIE RENALE
III.1.
LOCALISATION
ET
ACTIONS
PHYSIOLOGIQUES
DE
LA
BRADYKININE
III.1.a.
Localisation rénale des composants du système kallicréinekinine
Tous les éléments du système kallicréine-kinine sont exprimés au niveau du rein. Un
premier travail a montré l’existence de sites de liaison pour 3H-BK le long du néphron [87].
Ensuite, l’utilisation de la technique de microdissection couplée à des tests fonctionnels
(calcium, sécrétion de prostaglandines) a permis de décrire la localisation très précise des
récepteurs B1 et B2 le long du néphron [88, 89]. Les récepteurs B1 et B2 ont été étudiés au
niveau glomérulaire tant in vivo [73] que sur des cellules mésangiales en culture [90, 91].
L’ARN messager de la kallicréine a été détecté au niveau glomérulaire et au niveau du
tubule contourné distal [92]. Le kininogène de bas poids moléculaire, substrat utilisé par la
kallicréine rénale, a d’abord été localisé dans le rein par immunofluorescence au niveau du
tubule contourné distal et du canal collecteur chez l’Homme et le Rat [93]. Depuis, chez
l’Homme, l’expression de l’ARN messager du kininogène de bas poids moléculaire et du
récepteur B2 ont été détectés dans les cellules juxtaglomerulaires, les cellules mésangiales,
l’épithélium de la capsule de Bowman, les tubules proximaux et distaux, l’anse de Henlé, le
canal collecteur et au niveau des cellules endothéliales des vaisseaux sanguins [94].
27
L’expression, au niveau rénal, de tous les composants du SKK suggère une production
locale de BK et l’implication du système dans la physiologie rénale et les phénomènes
d’homéostasie afférents.
III.1.b.
Actions rénales de la bradykinine
Les premiers travaux sur les actions de la bradykinine au niveau rénal ont décrit ses
effets vasodilatateurs, diurétiques et natriurétiques. En plus de ses actions vasodilatatrices
déjà détaillées, la BK exerce, principalement via le RB2, d’autres effets indépendants, en
particulier diurétiques et natriurétiques qui impliquent soit l’inhibition de la synthèse d’AMPc
[95, 96] soit la synthèse de NO [96-98].
Ces études suggèrent que l’inactivation du SKK favorise l’hypertension artérielle et le
développement de ses complications rénales. Le SKK est donc rapidement apparu comme un
système de défense contre le SRA vasoconstricteur.
De nombreux arguments suggèrent que la BK exerce un rôle néphroprotecteur,
indépendant de son effet sur l’hypertension. Ainsi, la perfusion de kallicréine chez le rat Dahl
hypertendu, à une dose qui n’a pas d’effet sur la pression artérielle systémique, réduit la
protéinurie, augmente le débit de filtration glomérulaire, et prévient le développement de la
fibrose glomérulaire et tubulaire [99, 100]. Ces effets bénéfiques sont accompagnés d’une
augmentation de l’excrétion urinaire de BK et de GMPc, ce qui confirme que l’effet de
l’administration de kallicréine agit via l’augmentation de la synthèse de bradykinine [100]. De
plus, ces effets étaient dépendants de l’activation de son récepteur B2 puisqu’ils étaient
supprimés par la co-administration d’HOE-140 (antagoniste du RB2) [99]. Plus récemment,
un travail utilisant le même modèle, a montré que l’administration directe de BK protège de
l’atteinte rénale induite par un excès de sel [40]. Ce traitement a permis en effet de limiter la
28
protéinurie, la glomérulosclérose et la dilatation tubulaire, mais aussi de réduire
l’accumulation de collagène, l’inflammation et l’apoptose dans le rein. Ces effets de la
perfusion de BK étaient associés à une augmentation de la synthèse de NO, ainsi qu’à une
diminution du stress oxydant, de l’expression du TGFβ et de l’activation des MAP-kinases.
Actuellement, de nombreuses études suggèrent un rôle néphroprotecteur de la BK.
D’une part, elle occupe une place sensible dans l’effet protecteur rénal des IEC. D’autre part,
sa capacité à réduire le développement de la fibrose suggère qu’elle pourrait avoir une action
bénéfique directe au cours des pathologies rénales fibrosantes. Le développement de modèles
de souris transgéniques pour les différents constituants du SKK, en particulier les souris
invalidées pour le RB2, a permis d’apporter des preuves expérimentales très fortes en faveur
du rôle néphroprotecteur de la BK dans différentes situations pathologiques.
III.2.
MODIFICATIONS EXPERIMENTALES DU SYSTEME KALLICREINEKININE
III.2.a.
Transfert du gène de la kallicréine
La kallicréine, enzyme nécessaire à la synthèse des kinines, occupe une place
essentielle dans le SKK. De façon intéressante, le débit d’excrétion urinaire de kallicréine
urinaire chez l’homme est inversement corrélé à la sévérité des pathologies rénales [101].
Agir sur la disponibilité rénale de la kallicréine représente donc un moyen d’étudier les effets
potentiellement néphroprotecteurs de la BK.
Le groupe de Chao a fait de nombreux travaux de thérapie génique expérimentale en
transférant dans plusieurs modèles de néphropathie chez le rat, le gène de la kallicréine
tissulaire humaine. Tout d’abord, dans un modèle de néphropathie induite par la gentamycine
29
[102], le transfert du gène de la kallicréine apportait un bénéfice fonctionnel (moindre
diminution du DFG), et structural (ralentissement des lésions tubulaires et de la nécrose
cellulaire épithéliale). Dans un modèle de néphrectomie 5/6 [103], ce même traitement
réduisait la protéinurie et l’albuminurie et prévenait aussi le développement de lésions de
sclérose glomérulaire et tubulaire. Cette méthode de thérapie génique par le gène de la
kallicréine a montré les mêmes effets bénéfiques dans différents modèles de rats hypertendus
développant des dommages cardio-vasculaires et rénaux [104-106]. Cet effet protecteur était
accompagné d’une augmentation de la synthèse de NO et de GMPc, d’une diminution
d’expression du TGFβ, de p27kip1, de la phosphorylation de la JNK et de ERK, mais aussi de
la production d’ion superoxide. La kallicréine tissulaire protège donc du développement des
complications rénales chez le rat hypertendu via une augmentation de la biodisponibilité du
NO, la réduction du stress oxydant et de l’expression du TGFβ. Dans un travail récent, le
même groupe a montré que le traitement par le gène de la kallicréine était capable non
seulement de prévenir mais également de reverser la fibrose rénale en restaurant la production
de NO et en inhibant celle d’ion superoxide [107, 108]. Il est intéressant de noter que, de
façon inattendue et presque paradoxale, l’administration prolongée de kallicréine ne semble
pas induire d’effets hypotenseurs.
30
III.2.b.
Invalidation du gène de la kallicréine
L’invalidation du gène de la kallicréine glandulaire a été réalisée par le groupe de F.
Alhenc-Gelas [109-111]. Chez ces animaux, la BK n’est plus détectable, ce qui indique que la
kallicréine glandulaire est indispensable pour la synthèse de BK circulante. Ces souris sont
normotendues et présentent une hémodynamique cardiaque et rénale normales [109]. Au
niveau rénal, l’invalidation de la kallicréine tissulaire provoque une diminution de la
réabsorption tubulaire du calcium [112], qui n’est pas retrouvée chez les souris invalidées
pour le RB2, même en présence d’un antagoniste du RB1. Cela suggère un effet indépendant
des kinines. Plus récemment, le même groupe a montré que les souris déficientes en
kallicréine présentent un défaut d’activité du canal ENaC [113], suggérant un effet antinatriurétique potentiel de la kallicréine via l’activation de ce canal sodé du néphron distal.
III.2.c.
Surexpression/invalidation génétique du récepteur B2
Les souris transgéniques surexprimant le RB2 sont hypotendues [114], et présentent
une augmentation du débit de filtration glomérulaire associée à une activation de la voie NOGMPc/AMPc [30].
Par contraste, les souris déficientes en RB2 (KOB2), elles, ne sont pas hypertendues,
et leur fonction rénale est normale [48]. D’autres travaux, contradictoires, ont montré que le
KOB2 serait associé à une augmentation de la pression artérielle et de la fréquence cardiaque
[29, 50-52]. Toutefois, cette observation n’a pas été confirmée par les travaux plus récents, il
pourrait s’agir d’une simple variation des conditions expérimentales. Par contre l’absence de
RB2 a un impact sensible dans certaines conditions pathologiques, ce qui étaye son rôle
« protecteur » en terme d’équilibre homéostatique et d’hémodynamique rénale dans de telles
situations pathologiques. Par exemple, les souris KOB2 présentent une hypersensibilité aux
31
régimes hypersodés [29, 53, 54]. En effet, un apport excessif de NaCl ainsi qu’un excès de
minéralocorticoïdes [115] provoque une hypertension plus importante chez les souris KOB2
que chez des souris sauvages. Dans un autre cadre pathologique, les souris n’exprimant plus
le RB2 développent une néphropathie diabétique plus sévère que la souche sauvage [116].
Cette observation est à rapprocher de l’observation selon laquelle les souris exprimant des
copies multiples de l’enzyme de conversion (état associé à une forte dégradation de la BK et
ainsi à une très faible activation du RB2) développent également une néphropathie diabétique
plus sévère [117]. Enfin, la fibrose interstitielle après obstruction urétérale semble aggravée
chez la souris n’exprimant plus le RB2 [42]. Ces résultats montrent que l’absence
d’expression du RB2 ou sa faible activation aggrave le développement de lésions rénales.
Cependant, l’utilisation de modèles de souris KO pour l’un des récepteurs de la BK présente
une limite. En effet, plusieurs travaux ont montré que le récepteur non invalidé (RB1 chez les
animaux KOB2 et inversement) est surexprimé [118, 119]. Cette surexpression pourrait
correspondre à une adaptation physiologique destinée à compenser l’absence de l’autre
récepteur. Duka et al [118] ont montré cette surexpression du RB1 chez les souris KOB2, le
RB1 pouvant alors compenser la perte du RB2 en exerçant à sa place des effets
vasodilatateurs.
32
III.2.d.
Invalidation du récepteur B1
Les souris invalidées pour le RB1 sont normotendues [120]. L’effet de l’invalidation
du RB1 a été étudié au niveau cardiaque [120, 121], dans les phénomènes de douleur [122,
123] et au cours du choc septique (cf Partie III) mais aucun effet sur les fonctions et la
structure du rein n’a à ce jour été rapporté.
III.2.e.
Invalidation des récepteurs B1 et B2
Le groupe de O. Smithies a développé un modèle de souris déficientes pour les 2
récepteurs des kinines, et a étudié leur susceptibilité à l’ischémie-reperfusion rénale [124]. Ils
ont observé que les souris invalidées pour le RB2 (KOB2) présentaient des lésions
consécutives à l’ischémie-reperfusion (lésions histologiques, apoptose, insuffisance rénale)
plus importantes que les souris sauvages. De plus, les souris invalidées pour les 2 récepteurs
(KOB1B2) développent des lésions encore plus importantes, ce qui suggère un rôle également
protecteur du RB1. Le stress oxydant, ainsi que l’expression des ARNm du TGFβ, du CTGF
et de l’endothéline 1, trois gènes impliqués dans le développement des lésions consécutives à
l’ischémie-reperfusion, ont été recrutés de façon concomitante avec des amplitudes variables :
WT < KOB2 < KOB1B2. Le développement de ce double KO a permis de montrer que les
deux récepteurs des kinines peuvent exerçer un rôle néphroprotecteur dans le modèle
d’ischémie-reperfusion [124]. Cependant, une autre équipe qui a également développé ce
double KO ne confirme pas les effets aggravants de l’absence conjointe du RB1 et du RB2,
du moins dans un autre modèle expérimental, celui du choc septique [125].
33
III.2.f.
Inhibition pharmacologique du système kallicréine-kinine
Comme l’invalidation génétique du RB2, le blocage pharmacologique du SKK, par
l’aprotinine qui inhibe la kallicréine, ou par un antagoniste du RB2, ne modifie pas la pression
sanguine que ce soit chez l’Homme ou chez le Rat [126, 127]. Par contre, elle augmente les
effets vasopresseurs de la deoxycorticostérone et de l’angiotensine II [128-130]. Chez le rat
SHR-SP, spontanément hypertendu, le RB1 est fortement induit [131]. L’inhibition
pharmacologique du RB1 provoque une augmentation de la pression sanguine artérielle et de
l’excrétion urinaire d’albumine, parallèlement à une augmentation de l’expression du TGFβ et
du collagène de type II. L’induction du RB1 au cours de l’hypertension dans ce modèle
permettrait donc, via ses effets vasodilatateurs et anti-fibrosants, de protéger le rein des
conséquences délétères de cette hypertension. Par contre, l’induction du RB1 lors du choc
septique a un effet presseur qui pourrait limiter l’hypotension dans la phase aiguë [132, 133].
Ces observations doivent être prises en considération avant d’envisager le blocage
pharmacologique systématique du RB1 comme perspective thérapeutique.
34
III.3.
CONTRIBUTION PERSONNELLE : PROFIL FONCTIONNEL RENAL
CHEZ LES SOURIS KOB2, EVIDENCE D’UN ROLE TONIQUE DU
RECEPTEUR B1 SUREXPRIME
Comme nous l’avons détaillé plus haut, les souris invalidées pour le RB2 surexpriment
le RB1. Bien que cette surexpression ait été rapportée par plusieurs autres groupes, les
conséquences fonctionnelles et physiopathologiques de ces observations n’ont jamais été
envisagées. Les conséquences observées chez les animaux KOB2 pourraient donc ne pas
résulter uniquement de l’absence du RB2 mais également de la surexpression du RB1.
L’expression du RB1 est toujours associée à des situations de stress, et n’a jamais été
rapportée en situation physiologique. Le modèle de la souris invalidée pour le RB2 permet
l’étude des effets de l’expression spontanée du RB1 en situation physiologique en absence de
stress.
Afin d’étudier l’implication potentielle de la surexpression du RB1 sur la fonction
rénale chez les souris KOB2, nous avons exploré les fonctions rénales de 5 groupes de souris :
1) souris C57 Bl6 sauvages (WT) ; 2) souris C57 Bl6 sauvages traitées par un antagoniste du
RB2 (WT HOE) ; 3) souris C57 Bl6 invalidées pour le RB2 (KOB2) et 4) souris KOB2
traitées par un antagoniste du RB1. Les animaux du groupe 2 ont reçu une injection souscutanée quotidienne de 250 µg/kg/jour d’HOE-140 pendant les 4 jours précédent l’exploration
des fonctions rénales. L’antagoniste du RB1 (SSR2406120 Sanofi-Aventis) a été administré
quotidiennement par gavage, à la dose de 10 mg/kg pendant les 4 jours précédent
l’exploration des fonctions rénales.
35
Phénotype des animaux (Figure 2)
0.35
30
Poids des reins (g)
25
20
15
10
5
0
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
B
1
O
B
2K
O
W
T
B
100
2.0
PSA (mmHg)
1.5
1.0
0.5
0.0
75
50
25
B
1
O
g
nt
a
O
A
A
nt
ag
B
2K
B
2
T
W
T
B
1
A
nt
ag
B
2K
O
B
2K
O
W
T
A
nt
ag
B
2
W
T
0
W
Glycémie (g/L)
2.5
A
nt
ag
A
nt
ag
A
2K
O
T
W
B
2K
W
T
B
1
nt
ag
B
2K
O
A
nt
ag
W
T
B
2
0.00
B
2K
Poids corporel (g)
35
B
2
•
Figure 2 : Phénotype des animaux
PSA : Pression sanguine artérielle ; WT : souris sauvages ; Antag B2 : antagoniste du RB2
(HOE-140) ; Antag B1 antagoniste du RB1 (SSR2406120) ; B2KO : souris invalidées pour le
RB2.
L’invalidation ou le blocage pharmacologique du RB2 n’ont pas d’effets significatifs
sur le poids corporel, le poids des reins, la glycémie et la pression sanguine artérielle. La
glycémie tend à être légèrement réduite chez les souris KOB2 et réaugmentée en présence de
l’antagoniste du RB1, mais ce résultat n’est pas significatif.
36
Effets sur les paramètres fonctionnels rénaux (Figure 3)
*
*
1500
DPR (µl/min/65cm2)
200
100
*
1000
500
B
g
2K
O
B
2K
W
T
B
2K
O
A
A
nt
a
B
nt
a
A
A
O
2
T
g
W
B
1
O
2K
B
nt
ag
B
2
W
T
W
T
1
0
0
B
DFG (µl/min/65cm2)
300
nt
ag
•
**
B
1
O
nt
ag
2K
O
A
A
nt
a
A
B
2K
O
T
W
0
B
1
g
B
2K
O
B
A
nt
ag
B
W
T
2
0
25
2K
5
B
10
50
2
15
75
B
20
W
T
FF (%)
25
100
nt
ag
RVR (mmHg/ml/min/cm2)
***
*
30
W
T
35
Figure 3 : Paramètres fonctionnels rénaux
DFG : Débit de Filtration Glomérulaire ; DPR : Débit Plasmatique Rénal ; FF : Fraction
Filtrée ; RVR : Résistances Vasculaires Rénales.
L’invalidation du RB2 a pour principale conséquence une réduction du Débit de
Filtration Glomérulaire (DFG), avec un Débit Plasmatique Rénal inchangé (DPR), et par
conséquent une réduction de la Fraction Filtrée (FF). Ces effets ne sont pas observés chez les
souris traitées par l’antagoniste du RB2 (qui n’expriment pas le B1), et sont annulés chez les
souris KOB2 traitées par l’antagoniste du RB1, suggérant qu’ils résultent de la surexpression
du RB1.
Le même travail est en cours chez les animaux invalidés pour le RB1 et traités ou non
par un antagoniste du RB2. Deux groupes supplémentaires de souris sauvages sont en cours
d’étude : l’un traité par l’antagoniste du RB1, et l’autre traité simultanément par les deux
antagonistes (RB1 et RB2).
37
III.4.
PLACE DE LA BRADYKININE DANS LES EFFETS DU BLOCAGE DU
SYSTEME RENINE-ANGIOTENSINE
Les premiers arguments en faveur du rôle néphroprotecteur de la BK sont indirects et
reposent sur les effets bénéfiques du blocage du système rénine-angiotensine au cours des
néphropathies hypertensives et diabétiques. Ces deux néphropathies se caractérisent par une
atteinte
glomérulaire
précoce
avec
accumulation
de
matrice
mésangiale,
une
glomérulosclérose progressive et des lésions de fibrose tubulo-interstitielle qui évoluent vers
l’IRC. En effet, ces pathologies sont souvent associées à des complications au niveau rénal,
caractérisées par une hyperplasie, une hypertrophie cellulaire et une accumulation de matrice
extracellulaire initialement localisée dans le glomérule. Elles aboutissent à la fibrose du
glomérule (ou glomérulosclérose), à la fibrose interstitielle et à l’insuffisance rénale.
Actuellement, le blocage du système rénine-angiotensine (SRA) par les inhibiteurs de
l’enzyme de conversion (IEC) ou par les antagonistes du récepteur AT1 de l’angiotensine II
(ARA2) s’avère la meilleure stratégie thérapeutique [134] pour ralentir l’évolution et la
sévérité de la glomérulosclérose.
III.4.a.
Inhibiteurs de l’Enzyme de Conversion
L’effet protecteur cardiovasculaire et rénal des IEC a été démontré dans plusieurs
grandes études cliniques. Par exemple, l’étude REIN (The Ramipril Efficacy In Nephropathy,
[135] a montré que le traitement de patients protéinuriques par un IEC (ramipril), permet
malgré une pression artérielle identique, de ralentir le déclin du débit de filtration
glomérulaire, et de réduire le risque de développer une insuffisance rénale terminale. L’effet
protecteur rénal des IEC serait supérieur à celui des autres molécules anti-hypertensives.
L’étude HOPE (Heart Outcomes Prevention Evaluation [136]) a montré que le traitement par
38
le ramipril est associé à une réduction de la mortalité et de la morbidité cardio-vasculaire chez
les patients à haut risque cardio-vasculaire. Ce bénéfice est encore plus grand chez les patients
présentant des pathologies rénales, ce qui suggère un effet spécifique des IEC sur la
protéinurie, indépendamment de leur effet hypotenseur [137].
Les IEC agissent à la fois sur le SRA vasoconstricteur et le SKK vasodilatateur. Leurs
effets bénéfiques ont longtemps été rapportés uniquement à l’inhibition du système rénineangiotensine. Pourtant, actuellement de plus en plus d’arguments suggèrent que
l’accumulation de BK joue un rôle aussi important. Tout d’abord, la biodisponibilité
d’angiotensine II n’est pas toujours modifiée lors d’un traitement par des IEC [138, 139],
probablement en raison de la possibilité d’une synthèse d’angiotensine II indépendante de
l’ECA, par exemple via les chymases [140]. La concentration d’angiotensine II est également
dépendante de sa dégradation par l’enzyme de conversion 2 de l’angiotensine II (ECA 2). Ce
résultat suggère que le blocage de la synthèse d’angiotensine II n’est pas à lui seul
responsable de tous les effets des IEC. L’utilisation d’antagonistes du récepteur B2 a permis
d’apporter des preuves expérimentales en faveur du rôle de ce récepteur dans l’action
protectrice des IEC. Les effets bénéfiques des IEC sont en effet souvent atténués par le
blocage du RB2. Les IEC exercent leur effet anti-fibrosant d’une part en inhibant la synthèse
de composants de la matrice extracellulaire (collagène et fibronectine) et d’autre part en
stimulant sa dégradation (via l’inhibition de l’expression de la protéine PAI-1 (Plasminogen
Activator Inhibitor-1). Ces deux actions des IEC sont supprimées par l’administration d’un
antagoniste du RB2 [86, 141]. L’effet anti-fibrosant des IEC est donc largement dépendant de
la bradykinine et de la mise en jeu de son récepteur B2. De la même façon, l’effet antiprotéinurique des IEC au cours de néphropathies expérimentales chez le rat, est en partie
dépendant des kinines [142, 143].
39
L’activation du RB2 par les IEC peut se faire par plusieurs mécanismes intriqués et
additionnels (Figure 4). Le premier d’entre eux est, bien sûr, l’inhibition de la dégradation de
la BK, mais de nouveaux mécanismes ont été proposés. Tout d’abord, l’enzyme de conversion
de l’angiotensine (ECA) et le RB2 pourraient former un complexe (complexe ECA/RB2), qui
augmenterait la sensibilité du RB2 pour la bradykinine [144]. Par ailleurs, l’inhibition de
l’ECA entraîne l’accumulation d’angiotensine I, qui est dégradée en angiotensine 1-7 par
plusieurs enzymes dont l’ECA2 (Figure 4). L’angiotensine 1-7 agit en activant un récepteur
spécifique encore imparfaitement identifié [145, 146], mais qui pourrait être associé à
l’oncogène Mas [147]. Les effets de l’angiotensine 1-7, hypotenseurs et vasodilatateurs, sont
opposés à ceux de l’angiotensine II. Par ailleurs, certains de ces effets sont inhibés par les
antagonistes du RB2 [148, 149]. L’angiotensine 1-7, peut se comporter comme un inhibiteur
de l’ECA et donc augmenter la biodisponibilité de la BK mais également agir sur le complexe
ECA/RB2 et diminuer la désensibilisation du RB2 [150]. Bien que tous les mécanismes
d’action de l’angiotensine 1-7 ne soient pas encore identifiés, les voies de formation associées
à la stimulation potentielle du RB2 peuvent permettre de définir de nouvelles voies
thérapeutiques.
40
Figure 4 : Possibilités d’activation du RB2 durant un traitement par un IEC ou un ARA2
ECA : enzyme de conversion de l’angiotensine II ; IEC : inhibiteurs de l’enzyme de conversion ; ARA2 :
antagonistes du récepteur AT1 de l’angiotensine II ; ECA2 : enzyme de conversion de l’angiotensine II de type
2 ; EPN : endopeptidase neutre ; PCP : prolyl carboxypeptidase ; PEP : prolyl endopeptidase.
Au cours d’un traitement par les IEC : (a) l’IEC bloque la formation d’angiotensine II et inhibe la dégradation de
la bradykinine favorisant ainsi l’activation du RB2, (b) certains IEC pourraient avoir une action directe sur
l’activation du RB2 en formant un complexe. En l’absence de formation d’angiotensine II, il y a formation
directe d’angiotensine 1-7 qui peut diminuer la dégradation de bradykinine (c), mais aussi stimuler directement
le RB2 (d). Au cours d’un traitement par un ARA2, le blocage du récepteur AT1 va révéler l’action de
l’angiotensine II sur le récepteur AT2, dont l’activation est associée à celle de la kallicréine, entraînant la
formation de bradykinine. Suite à l’accumulation d’angiotensine II (dont la formation n’est pas bloquée comme
c’est le cas en présence d’un IEC), on va observer une formation accrue d’angiotensine 1-7 qui va aussi renforcer
la stimulation du RB2 (c et d).
III.4.b.
Antagonistes du récepteur AT1 de l’angiotensine II (ARA2)
L’activité du système rénine-angiotensine peut aussi être bloquée par l’administration
d’ARA2. Leur bénéfice au niveau du rein a été montré dans plusieurs études [151-156]. Là
encore, des travaux suggèrent des interactions possibles entre les ARA2 et la BK [157]. En
effet, alors que les IEC inhibent la formation d’angiotensine II et la dégradation de la BK, les
ARA2 bloquent l’action de l’angiotensine II sur le récepteur AT1 laissant persister les effets
du récepteur AT2 (Figure 4). Si on a longtemps pensé que l’angiotensine II était uniquement
41
vasoconstrictrice, des travaux récents montrent que l’activation du récepteur AT2 par
l’angiotensine II induit des effets vasodilatateurs en mettant en jeu une signalisation
impliquant une synthèse accrue de BK et une activation du RB2 [158]. Cette relation entre
l’activation du récepteur AT2 et la production de BK a été confirmée chez la souris surexprimant le récepteur AT2, la stimulation du récepteur AT2 activerait la kallicréine (et ainsi
la production de BK) via une diminution du pH intracellulaire [159]. Il a été démontré dans
plusieurs modèles que les antagonistes du RB2 réduisaient fortement la vasodilatation
dépendante de l’endothélium, induite par l’angiotensine II [160]. De même, la surexpression
du récepteur AT2 réduit la fibrose périvasculaire cardiaque induite par la perfusion
d’angiotensine II. Cet effet est également dépendant du RB2 [161]. L’activation du récepteur
AT2 est donc capable de s’opposer à certains effets de l’AT1 probablement en stimulant la
production de GMPc, via un mécanisme partiellement dépendant des kinines et du RB2. Cette
activité anti-fibrosante du récepteur AT2 ne repose toutefois pas exclusivement sur
l’activation du RB2 car une stimulation de la formation de NO par le récepteur AT2 a été
démontrée chez les souris n’exprimant pas le RB2 [162].
42
IV.
CONCLUSION
La bradykinine ne semble donc pas occuper une place prépondérante dans les
phénomènes d’homéostasie rénale en situation physiologique, par contre, elle agirait comme
un mécanisme de défense en cas d’agression rénale (excès de sodium, hypertension,
néphropathies…). Elle permettrait alors, grâce à ses effets vasodilatateurs, anti-fibrosants et
natriurétiques de maintenir les fonctions d’homéostasie rénale et de prévenir le
développement de lésions de sclérose glomérulaire et tubulaire. Le SKK agirait donc comme
un système protecteur permanent, important dans les phénomènes d’adaptation en cas
d’agression. Son inactivation, en induisant une perte de protection fragilise le rein et réduit les
capacités d’adaptation. Le RB2 est responsable de la majorié des effets protecteurs des
kinines, cependant, dans les situations où il est induit, le RB1 peut aussi exercer un rôle
vasodilatateur et protecteur ; son rôle protecteur a d’ailleurs été montré par l’utilisation de
souris déficientes pour les 2 récepteurs [124].
L’ensemble de ces résultats suggère une action bénéfique, « néphroprotectrice », de la
BK et encourage la recherche et le développement d’agonistes des récepteurs de la BK en
particulier du B2. De telles substances pourraient avoir une implication thérapeutique, en
particulier pour la protection rénale au cours de diverses pathologies [163, 164]. Récemment,
un agoniste du RB2 a été testé in vivo, dans le traitement de l’hypertension pulmonaire et a
mis en évidence un effet bénéfique sur la fibrose cardiaque [165].
43
Partie II : néphropathie diabétique et système kallicréine-kinine
PARTIE II – NEPHROPATHIE DIABETIQUE ET
SYSTEME KALLICREINE-KININE
I.
UN CHALLENGE SANITAIRE
La néphropathie diabétique (ND) représente une des complications à long terme les
plus graves du diabète. La néphropathie associée au diabète de type II est actuellement la
cause la plus fréquente d'insuffisance rénale terminale en Europe, mais aussi celle dont
l’incidence augmente le plus [154, 166, 167]. En effet, la multiplication des cas d’obésité liée
au mode de vie occidental, ainsi que le vieillissement de la population dans ces même pays,
s’accompagnent d’une augmentation majeure de l’incidence du diabète de type II. De plus,
l’allongement de la survie - notamment cardiovasculaire – permet à la néphropathie
diabétique de s’exprimer cliniquement. Aux Etats-Unis, les diabétiques représentent plus de la
moitié des nouveaux dialysés, et parmi eux, plus de la moitié sont des diabétiques de type II
[168]. En Europe, la tendance est similaire avec une ou deux décennies de retard [169]. On
estime à 2 millions le nombre de personnes diabétiques en France, dont 85 % sont des
diabétiques de type II. Cette pathologie constitue donc un problème majeur de santé publique
(par exemple le coût annuel des dépenses de santé liées à la ND aux Etats-Unis est estimé à
20 milliards de dollars [168]) ce qui justifie d’y consacrer un effort de recherche important.
44
II.
DE LA PHYSIOPATHOLOGIE A LA THERAPEUTIQUE
L’atteinte rénale du diabète, qu'il s'agisse de la forme insulino-dépendante (DID) ou
non insulino-dépendante (DNID), est caractérisée par des altérations fonctionnelles et
morphologiques qui évoluent en deux phases (Figure 6). L’étape initiale, réversible, est
caractérisée par une hypertrophie des reins et des glomérules associée à une hyperfiltration
glomérulaire et une augmentation de l’excrétion urinaire d’albumine. Plus tard, se développe
une sclérose glomérulaire caractérisée par un épaississement des membranes basales et une
expansion mésangiale avec accumulation de protéines de la matrice extracellulaire (collagène
de type I et IV) (Figure 5). Cette glomérulosclérose est accompagnée d’une fibrose
interstitielle. Ces lésions, associées à une protéinurie abondante, s’accompagnent d’un déclin
de la fonction de filtration glomérulaire évoluant vers une insuffisance rénale progressive et
irréversible.
ND précoce
ND avancée
ND terminale
Figure 5 : Evolution de la glomérulosclérose. Glomérules humains en microscopie optique à différents
stades de néphropathie diabétique (coloration à l’acide périodique de Schiff, PAS, Grossissement x400)
45
Figure 6 : Evolution de la néphropathie diabétique chez l’Homme
II.1.
LES MEDIATEURS A L’ECHELON CELLULAIRE
II.1.a.
Rôle de l’hyperglycémie / AGE
Les études cliniques ont montré une relation étroite entre la glycémie et les
complications microvasculaires du diabète [170]. L’hyperglycémie chronique induit des
altérations protéiques, lipidiques et nucléiques qui seraient à l’origine de la cascade
d’évènements responsable d’une augmentation du stress oxydant et conduisant au
développement de la ND [171, 172].
Une conséquence importante de l’hyperglycémie chronique est la formation de
produits avancés de glycation (AGEs, Advanced Glycation End Product), qui résultent d’une
réaction non-enzymatique entre le glucose sanguin et les protéines. Les protéines glyquées
(AGE) circulantes interagissent avec des récepteurs spécifiques, les récepteurs RAGE
46
(appartenant à la famille des immunoglobulines), pour induire une cascade d’effets nocifs
[173]. En particulier, l’activation des récepteurs des AGEs provoque une forte augmentation
de la production intracellulaire de Radicaux Libres Oxygénés (RLO), en particulier suite à
l’activation de la NADPH-oxydase [174]. A leur tour, ces radicaux déclenchent des cascades
d'effets cellulaires conduisant à la stimulation de facteurs de transcription tel que NFκB et à la
synthèse de cytokines et de facteurs de croissance, dont l’effet global profibrosant contribue
largement au développement de la glomérulopathie diabétique [175, 176]. L’accumulation
d’AGEs, au niveau rénal au cours de la ND, a été montrée par plusieurs équipes [177-180]. Le
rôle central joué par ces composants dans le développement de la ND en font une cible
attractive pour la néphroprotection. Un traitement par des composants inhibant la formation
des AGEs [181, 182], par un anticorps anti-RAGE [183] ou plus subtilement par un RAGE
recombinant soluble [184] protège contre le développement de la néphropathie diabétique.
Les molécules capables de dégrader les AGE préformés (comme l’alagebrium), réduisent
l’expression du TGFβ, l’activation de la PKC et l’accumulation de collagène de type IV
[185]. L’effet protecteur de ces molécules a été montré dans le modèle de la souris invalidée
pour l’apolipoprotéine E traitée par la streptozotocine (STZ) [181], et chez la souris db/db
[186]. Dans le modèle de la souris db/db, les auteurs ont montré que l’alagebrium était
capable de prévenir mais également de réverser l’évolution de la ND. Cette substance a déjà
été testée en clinique [187] dans le cadre de pathologies cardiovasculaires mais pas encore
dans celui de pathologies rénales.
En plus de la formation des AGEs, le glucose exerce un effet intracellulaire direct. En
effet, le glucose sanguin étant transporté à l’intérieur des cellules par les transporteurs GLUT,
l’hyperglycémie est responsable d’une augmentation de la concentration intracellulaire de
glucose. Ce glucose intracellulaire exerce plusieurs effets : activation de la voie de l’aldose
réductase (voie des polyols), activation de la PKC (protéine kinase C), et de la voie des
47
hexosamines [170]. L’activation de ces différentes voies est à l’origine d’une augmentation de
la production de RLO et de la formation intracellulaire d’AGE.
II.1.b.
Rôle du stress oxydant
Le rôle du stress oxydant dans le développement de la glomérulosclérose diabétique
fait l’objet d’une attention croissante [188]. Celui-ci semble jouer un rôle majeur dans
l’expansion mésangiale observée dans le rein diabétique. En effet, la synthèse de collagène
par les cellules mésangiales en situation hyperglycémique, est inhibée par les anti-oxydants
[189, 190]. Les souris transgéniques surexprimant la Cu2+/Zn2+ SOD (Super Oxyde
Dismutase), une des enzymes permettant de réduire l’accumulation de RLO, rendues
diabétiques par la streptozotocine développent une microalbuminurie, une hypertrophie
glomérulaire, une accumulation de collagène et un volume mésangial fractionnel moins
importants que les souris sauvages [191]. Les résultats de l’utilisation expérimentale
d’antioxydants a montré des effets protecteurs prometteurs [191, 192]. Toutefois, les résultats
des études cliniques portant sur des traitements chroniques par des vitamines antioxydantes
chez l’Homme ne confirment pas les résultats expérimentaux [193].
II.1.c.
Facteurs de croissance
L’accumulation d’AGEs et l’augmentation du stress oxydant déclenchent une cascade
de signalisation aboutissant à la synthèse de cytokines et de facteurs de croissance, participant
à l’évolution de la ND.
Parmi eux, le TGFβ, par son action pro-fibrosante [194, 195] est désormais considéré
comme un facteur délétère majeur. Il a été récemment mis en évidence, dans le modèle des
souris db/db, une surexpression glomérulaire et tubulaire des ARNm et des protéines TGFβ1
48
et du TGFβ RII [196], alors que celle-ci n’avait pas été retrouvée dans une étude antérieure
effectuée à partir du cortex rénal [197, 198]. Cependant, le TGFβ n’apparaît pas comme un
médiateur précoce mais semble correspondre à une réponse en aval de plusieurs cascades de
signalisation préalables. Dès lors, il est évident que le blocage de TGFβ peut être efficace
pour réduire la néphropathie diabétique. Plusieurs approches expérimentales utilisant des
inhibiteurs, des anticorps neutralisants ou des récepteurs solubles ont montré que le blocage
du TGFβ prévenait le développement de la fibrose rénale. Par exemple, l’administration d’un
anticorps monoclonal anti-TGFβ, chez la souris diabétique db/db (obèse et diabétique de type
II), permet de prévenir à long terme l’expansion mésangiale et l’insuffisance rénale [199].
Cependant, chez l’Homme, l’inhibition chronique de l’action d’un facteur de croissance
pourrait avoir des effets délétères. Il serait peut être plus intéressant d’agir sur des cibles en
aval du TGFβ. Parmi ces cibles potentielles, la protéine BMP-7 (Bone Morphogenic Protein
7) qui inhibe l’action pro-fibrosante du TGFβ, pourrait être recrutée et exercer un effet
protecteur au cours de la ND. Cette hypothèse est étayée par plusieurs travaux expérimentaux
[200-202].
L’IGF-1 est un facteur de croissance local particulièrement actif au niveau du rein,
où il est principalement exprimé dans les cellules mésangiales [203]. Les cellules mésangiales
de souris diabétiques NOD présentent une activation de la voie de l’IGF-1 [204]. L’IGF-1
participerait au développement de la ND par plusieurs mécanismes. Tout d’abord, l’IGF-1
stimule l’expression du transporteur GLUT-1 par les cellules mésangiales, augmentant ainsi
l’uptake de glucose [205]. In vitro, l’IGF-1 stimule la synthèse de matrice extracellulaire tout
en altérant les capacités de résorption de la matrice [203, 206, 207]. Par ailleurs, le blocage du
récepteur de l’IGF-1 in vivo, au cours du diabète expérimental chez le rat, prévient
l’hypertrophie rénale et l’hyperfiltration glomérulaire [208]. Son impact délétère à long terme
demeure toutefois l’objet d’un débat.
49
Parmi les facteurs de croissance, le PDGF et le FGF ont également été mis en cause
au cours du développement de la glomérulosclérose. Le PDGF est synthétisé au niveau
glomérulaire où il exerce un effet mitogène puissant sur les cellules mésangiales [209]. Il
serait également impliqué dans l’accumulation de collagène IV et de fibronectine induite par
le TGFβ [210]. Le FGF a lui aussi un effet prolifératif sur les cellules mésangiales [211, 212].
Le VEGF est un facteur angiogénique qui augmente la perméabilité vasculaire
[213]. Au niveau du glomérule, il est exprimé par les podocytes ; l’induction d’un diabète
expérimental s’accompagne d’une augmentation de son expression et de celle de son
récepteur de type II [214], peut-être via l’activation du RAGE. De même, la synthèse de
VEGF par des podocytes en culture est induite par un milieu riche en glucose ou contenant du
TGFβ1 [215]. Cette induction de l’expression du VEGF dans les situations d’hyperglycémie
semble impliquée de façon ambiguë dans le développement de la ND. En effet, l’utilisation
d’un anticorps neutralisant anti-VEGF au cours du diabète de type I, chez le rat, [216] et du
diabète de type II, chez la souris db/db, [217] permet de réduire de façon importante la
microalbuminurie. Par contre, l’induction du VEGF peut aussi apparaître comme un facteur
de survie pour les cellules endothéliales [218] sous contrôle du facteur de transduction activé
par l’hypoxie (HIF).
Bien que de très nombreux travaux concernent les mécanismes impliqués dans la ND,
il reste difficile de proposer un mécanisme univoque. En effet, les dysfonctions d’un grand
nombre de systèmes s’associent progressivement pour aboutir à l’instauration de la sclérose
du glomérule. La plupart des travaux ont initialement désigné la cellule mésangiale comme
« cellule cible initiale ». Ce concept est en train d’évoluer avec l’observation de transitions
phénotypiques [219]. Une des perturbations très précoces de la ND est l’hyperfiltration
glomérulaire et l’apparition d’une microalbuminurie. Ces deux caractéristiques de la ND ont
50
attiré l’attention sur un autre type cellulaire : les podocytes. La Figure 7 tente de résumer
l’état actuel des connaissances sur les principaux mécanismes physiopathologiques impliqués
dans le développement de la ND.
Figure 7 : Principaux mécanismes physiopathologiques impliqués dans le développement de
l’atteinte glomérulaire au cours de la néphropathie diabétique
51
II.2.
INTERET ET APPORT DES MODELES ANIMAUX
Il existe de nombreux modèles de diabète expérimental de type I ou de type II chez le
rat et la souris (Figure 8). Certains d’entre eux sont des modèles de diabète spontané
développés par certaines souches, d’autres sont induits par une substance chimique comme la
streptozotocine, par une alimentation riche en graisses et/ou en sucre, ou encore par une
modification génétique. La difficulté est de trouver un modèle qui développe une réelle ND,
reproduisant le plus fidèlement possible la pathologie humaine.
DIABETE
Type I :
Type II :
MODELES ANIMAUX
Induit
Spontané
Souris NOD
Non obese diabetic
Souche Ltj [220]
Par destruction des cellules
sécrétrices d’insuline :
- substances chimiques [222]
(alloxane ou streptozotocine)
- pancréatectomie,
- inoculation de virus [223]
(virus Encephalomyocarditis)
Rat Wistar Bio Breeding [221]
Par modification génétique :
gène insuline (Souris Akita)
[224]
Spontané
Souris db/db (mutation du
récepteur de la leptine) [225]
Souris ob/ob
(d
déficientes en leptine) [226]
Rats Zuckers
Rats fa/fa (Wistar fatty) [227]
Rats GK (Goto & Kakizaki)
[228]
Induit
Par modification génétique
(ex : KO GLUT-4) [229]
Par l’alimentation
(régime hyperglucidique
et/ou hyperlipidique) [230]
Figure 8 : Exemples de modèles expérimentaux de diabète chez le rat et la souris
52
Dans le laboratoire nous utilisons en particulier 2 modèles de diabète chez la souris :
un modèle de diabète de type I qui est induit par la streptozotocine dans la souche C57BL6, et
un modèle de diabète de type II, la souris db/db. La streptozotocine pénètre dans les cellules
β-pancréatiques par le transporteur de glucose GLUT-2, elle exerce dans ces cellules un effet
cytotoxique en particulier via une alkylation de l’ADN et une induction du stress oxydant
[231-233]. Ce modèle a l’avantage d’être facile à utiliser et reproductible. Cependant, la STZ
peut exercer une toxicité non spécifique, en particulier au niveau rénal.
De plus, de nombreux modèles de souris transgéniques ont été développés à partir de
la souche C57Bl6. Ces modèles d’invalidation génétique ont permis le démembrement des
mécanismes physiopathologiques impliqués dans le développement de la ND. Par contre, le
choix de la souche C57Bl6 représente un facteur limitant expérimental puisque cette souche
est connue pour sa résistance à la glomérulosclérose [234, 235]. Un grand nombre de ces
modèles sont résumés dans le Tableau 2.
Le diabète de type II est aujourd’hui celui qui concerne le plus de patients et
représente l’enjeu sanitaire le plus important, ce qui nous a incité à utiliser un modèle de
diabète de type II. Nous disposons et avons acquis l’expérience d’un modèle murin de diabète
de type II avec obésité, la souche C57 BLKs db. La mutation spontanée db provoque une
délétion de la partie cytoplasmique du récepteur B de la leptine [188, 225]. Les souris
C57BLKs homozygotes pour cette mutation (db/db) deviennent insensibles à la leptine et
développent un hyperinsulinisme et une obésité dès la cinq/sixième semaine de vie, et un
diabète insulino-résistant une semaine plus tard environ [226]. Les souris hétérozygotes pour
la mutation db ne sont ni obèses ni diabétiques et fournissent la population contrôle naturelle.
Le diabète développé par les souris db/db mime en de nombreux points le diabète de type II
humain. En effet, son évolution se complique, comme chez l’humain, d’une cataracte, de
53
lésions de microangiopathie rétinienne, et surtout d’une néphropathie. Au niveau rénal, ce
modèle présente l’avantage de développer d’importantes modifications structurales
glomérulaires, incluant un épaississement des membranes basales et une expansion
mésangiale proches de celles observées chez l’homme, après seulement 2 mois d’évolution
diabétique [236, 237].
Cependant, nous ne disposons pas de l’association de KO pour les éléments du SKK
(en particulier pour les récepteurs B1 et B2 de la bradykinine) et de la mutation db. Pour cette
raison, nous avons choisi de recourir au blocage pharmacologique du RB2 dans le modèle
db/db et d’étudier les conséquences de l’invalidation du RB1 et du RB2 sur le développement
de l’atteinte rénale du diabète en utilisant le modèle de type I induit par la STZ (travail en
cours).
54
Tableau 2 : Apport des quelques modèles génétiquement modifiés dans la connaissance de la
glomérulosclérose diabétique
Gravité de
la ND
Ref
GH (Growth Hormone)
↓
[238]
PPARα (Peroxysome
proliferator-activated
receptor α)
SMAD 3
↓
[240]
Récepteur AT1
PKC-β (Protein kinase C)
↓
[242]
PKC-α (Protein kinase C)
↓
[243]
P27(Kip1)
↓
[245]
PAI-1 (Plasminogen Activator
Inhibitor-1)
ICAM-1 (intercellular adhesion
molecule-1)
↓
[247]
↓
[249]
TSP-1 (Thrombospondine-1)
↓
[251]
P66hc
↓
SPARC (Secreted Protein Acid
and Rich Cysteine)
SR-A (Macrophage Scavenger
receptor)
Cible invalidée
Gravité de
la ND
Ref
↑
[239]
Effet modeste ?
[241]
Récepteur B2 de la
bradykinine
Récepteur B2 de la
bradykinine
ACE-2 (Angiotensin
converting enzyme 2)
PGD2 (Prostaglandine D2) synthase
SOD (Super oxide
dismutase)
eNOS (NO-synthase
endothéliale)
↑
[116]
↓
[244]
↑
[246]
↑
[248]
↑
[250]
↑
[252]
[253]
Galectin-3/AGE receptor 3
↑
[254]
↓
[255]
ApoE (Apolipoprotéine E)
↑
[181]
↓
[256]
ENTPD1 (CD39)
↑
[257]
[258]
Integrin Alpha-1
↑
[259]
Midkine
↑
↑
[260]
↓ légèrement
ERα (Œstrogen Receptor alpha) chez la femelle
uniquement
Decorin
↑
[261]
Cible invalidée
Récepteur de la Vitamine D
[262]
55
II.3.
THERAPEUTIQUES ACTUELLES ET PERSPECTIVES
II.3.a.
Définir une stratégie
Les études cliniques ont montré une relation étroite entre la glycémie et les
complications micro-vasculaires du diabète [170]. Ainsi, un contrôle strict de la glycémie
préviendrait ou au moins ralentirait la progression de la ND. Une étude clinique (The Diabetes
Control and Complications Trial Research Group, [263]) a montré qu’un traitement intensif
par de l’insuline (3 injections par jour) améliorait l’équilibre glycémique. Dans cette étude, les
patients présentaient un taux d’hémoglobine glyquée et une excrétion urinaire d’albumine
inférieurs à ceux des patients suivant un traitement standard. Cependant malgré les efforts
pour maintenir un équilibre glycémique correct chez les patients diabétiques, plus de 40%
d’entre eux (DID et DNID confondus), développent une néphropathie après 25 ans de diabète
[264]. Les progrès réalisés dans les techniques d’insulinothérapie devraient permettre de
réduire l’incidence de la ND chez les patients diabétiques de type 1. En effet, de nouvelles
techniques telles que la mise en place des pompes à insuline ou même de pancréas artificiels
permettent un meilleur contrôle glycémique et devraient donc limiter le développement des
complications.
Cependant, le problème subsiste pour les diabétiques de types II, qui représentent
actuellement 85% des diabétiques et chez qui, contrairement au diabète de type I, la
normalisation glycémique n'est pratiquement jamais obtenue en raison de l'insulino-résistance.
Il existe différents traitements hypoglycémiants, ces traitements ne permettent souvent
pas toujours de normaliser totalement le profil glycémique. Le seul recours est alors la
prévention du développement des complications micro-vasculaires, en particulier de la
56
glomérulopathie, avec des traitements agissant sur des mécanismes indépendants de la
glycémie.
La majorité des pathologies chroniques rénales sont associées à une accumulation
excessive de matrice extra-cellulaire, avec pour conséquence pratiquement inéluctable le
développement d’une fibrose rénale [265]. La fibrose rénale qu’elle soit interstitielle ou
glomérulaire, résulte de mécanismes physiopathologiques complexes, parfois distincts dont
les impacts respectifs convergent pour aboutir finalement à une insuffisance rénale terminale.
Le contrôle de cette évolution progressive vers la fibrose devient un enjeu thérapeutique
majeur, car les stratégies thérapeutiques disponibles à ce jour n’ont qu’une efficacité modeste.
II.3.b.
La fibrose rénale est-elle réversible ?
La réversibilité de cette évolution reste une question importante et non résolue. Un
ensemble de travaux récents indique que la fibrose rénale pourrait régresser, au moins dans
des modèles expérimentaux [266-268]. Tout d’abord, la fibrose rénale induite par le blocage
de la voie du NO, chez le rat, peut être prévenue par inhibition de l’activité tyrosine kinase du
récepteur de l’EGF [269]. Une régression de la fibrose rénale a ensuite été montrée lors du
blocage du SRA, dans deux modèles. Chez des rats hypertendus déficients en NO [270], un
traitement par des ARA2 débuté après l’apparition de la glomérulosclérose et le déclin de la
fonction rénale, a permis de normaliser les paramètres fonctionnels et morphologiques. Le
traitement détermine une réduction des expressions du collagène de type I et IV et du TGFβ,
mais ne réduit pas l’activation des métalloprotéinases, contribuant ainsi à dégrader l’excès de
matrice extra-cellulaire. Dans le modèle de néphrectomie subtotale chez le rat, une autre
équipe a montré qu’un traitement par un IEC, permettait de réduire les lésions préexistantes
de fibrose glomérulaire et tubulo-interstitielle [271]. Plus récemment, il a été montré que les
lésions rénales consécutives à une hypertension induite par l’inhibition de la synthèse de NO,
57
pouvaient régresser après l’arrêt de cette inhibition [272]. Enfin, l’équipe de J. Chao a montré
une régression de la glomérulosclérose chez le rat hypertendu grâce au transfert du gène de la
kallicréine [108].
Chez l’Homme, la réversibilité de la fibrose rénale a été étudiée essentiellement dans
le diabète de type I, au cours duquel la transplantation de pancréas est apparement associée à
la régression des lésions tubulaires [273] et glomérulaires [274] sur des biopsies de contrôles.
II.3.c.
Les approches pharmacologiques
Le blocage du système rénine-angiotensine est à ce jour, le traitement le plus utilisé
car il a fait preuve d’une efficacité clinique sensible au cours du DID, mais aussi du DNID
[275, 276]. Les principales molécules utilisées pour bloquer le SRA sont :
-
les inhibiteurs de l'enzyme de conversion (IEC). Leur efficacité a été montrée au cours
du diabète. Utilisés couramment en pratique clinique [276], ils sont capables de ralentir la
progression de la ND par un mécanisme indépendant de leur effet hypotenseur [277],
-
les antagonistes du récepteur AT1 de l’angiotensine II (ARA2). Plusieurs études
cliniques [155, 156, 278] ont établi qu’ils étaient également capables de prévenir ou ralentir la
progression de la néphropathie au cours du diabète de type II.
Le blocage de la PKCβ est envisagé comme outil thérapeutique néphroprotecteur
puisque cette protéine, en particulier l’isoforme β, est induite et fortement activée par
l’hyperglycémie et participe au développement de la ND [279]. L’invalidation de la PKC
limite la microalbuminurie et l’expression de plusieurs facteurs de croissance pro-fibrosants
[243, 280]. Un inhibiteur spécifique de la PKCβ (Ruboxistaurine LY333531), a été testé
cliniquement [281] et s’avère bénéfique en limitant la perte de réponse vasodilatatrice
dépendante de l’endothélium, chez des sujets sains exposés à une hyperglycémie. Cet
58
inhibiteur est en phase d’études cliniques depuis 4 ans avec une bonne tolérance, les résultats
ne montrent pas d’effets secondaires différents de ceux du traitement placebo [282].
Les thiazolidinediones (TZD) sont des agonistes de PPARγ déjà utilisées en clinique
pour leur action sur la sensibilité à l’insuline. Il a récemment été montré lors d’une étude chez
des patients diabétiques de type II, que ces molécules réduisaient également la
microalbuminurie et pouvaient ralentir l’évolution de la ND [283, 284].
Le facteur de croissance hépatocytaire (HGF) est un facteur de croissance endogène
qui protège le rein contre le développement de fibrose en inhibant l’action délétère du TGFβ.
Au niveau du rein, l’HGF inhibe la surproduction de matrice extra-cellulaire et l’apoptose, il
active la dégradation de matrice et peut moduler la prolifération et la différenciation cellulaire
[285]. L’administration intraveineuse d’HGF améliore la ND diabétique chez la souris [286,
287], en s’opposant aux effets fibrosants du TGFβ [286, 288]. Le transfert de gène de l’HGF
réduit également la sévérité de la ND chez le rat [289]. L’administration d’HGF exogène
pourrait donc constituer un outil thérapeutique interessant.
Les Inhibiteurs des Histone desacethylases (HDAC), dont l’utilisation anticancéreuse est en cours d’étude clinique, exerceraient également un rôle antifibrosant et
pourraient donc être considérés comme des agents thérapeutiques potentiels au cours de la ND
[290]. Le traitement par un inhibiteur de HDAC empêche l’expression de collagène I par des
cellules épithéliales rénales humaines, exposées au TGFβ. Il supprime également la transition
épithelio-mésenchymateuse qui est une des étapes importantes dans l’évolution vers la fibrose
[291]. Par ailleurs, ces inhibiteurs permettraient la sélection des cellules endogènes à fort
pouvoir de restauration (cellules SP : Side Population) [292].
59
II.3.d.
Autres cibles thérapeutiques potentielles
Le maintien de l’intégrité des podocytes pourrait aussi être déterminant dans la
protection contre le développement de la ND. En effet, la ND s’accompagne d’une altération
et d’une perte de podocytes, responsables d’une dégradation du filtre glomérulaire et de
l’apparition d’une protéinurie, et participant à l’évolution de la glomérulosclérose [293].
Certaines protéines, en particulier la néphrine, sont importantes pour assurer la cohésion des
podocytes et maintenir l’intégrité fonctionnelle de la barrière glomérulaire [294].
L’expression de la néphrine est réduite au cours du diabète et inhibée par l’angiotensine II
[295, 296], ce qui pourrait contribuer à la perte des podocytes. La survie podocytaire pourrait
par conséquent constituer un nouvel objectif thérapeutique.
L’activation de la protéine C (APC : Activated Protein C) est une nouvelle cible
très prometteuse qui pourrait être impliquée dans la survie des podocytes. Cette protéine antiapoptotique est inhibée par l’hyperglycémie. Cette inhibition pourrait être responsable de
l’augmentation de l’apoptose des podocytes et des cellules endothéliales glomérulaires au
cours de la ND. Isermann et al [297, 298] ont étudié différents paramètres de la ND dans 2
modèles de souris transgéniques : l’un déficient en protéine C activée et l’autre surexprimant
la protéine C activée. Ils ont observé que les souris déficientes en APC développaient une ND
plus sévère, et inversement, que les souris surexprimant l’APC étaient protégées. Cet effet
protecteur de l’activation de la protéine C est associé à une réduction de l’apoptose des
podocytes et des cellules endothéliales glomérulaires.
60
II.3.e.
De l’approche protéomique à la thérapie génique / cellulaire
L’identification de marqueurs physiopathologiques pertinents est essentielle pour le
diagnostic, le pronostic et le suivi de la ND. L’application des nouvelles techniques de
protéomique est trop récente pour fournir déjà des informations pertinentes dans le domaine
de la ND. En fait, le protéome urinaire actuellement identifié concerne plus de 1500 protéines
[299]. Or, au cours de la ND, un grand nombre de protéines spécifiques résultent de
modifications post-traductionnelles (notamment suite à des réactions de glycation). Le travail
d’identification à accomplir reste donc très important. Les résultats actuels fournis par les
études de protéomique ont identifié des protéines dont l’implication avait déjà été montrée par
des approches protéomiques ciblées utilisant des modèles expérimentaux : constituants de
systèmes fibrosants (élastase, [300]), du stress oxydant, des AGEs, et des systèmes sensibles à
l’hypoxie (expression de la protéine HIF) [301].
Les approches de thérapie génique ont été envisagées d’abord au niveau rénal dans
le cadre des situations ischémiques. Le rôle protecteur de transfert du gène de l’hème oxydase
1 a ainsi été mis en évidence [302]. Les situations d’ischémie-reperfusion sont certainement
celles qui font l’objet des études les plus nombreuses, tant par les approches de thérapie
génique, que maintenant, par des approches de thérapie cellulaire. Certaines tentatives
d’infusion de cellules souches mésenchymateuses montrent des résultats néphroprotecteurs
intéressants bien que modestes [303]. Ces cellules sont rapidement détectées dans le rein, au
niveau vasculaire ou glomérulaire, avec des effets bénéfiques significatifs tels que la
stabilisation de la protéinurie et une amélioration des fonctions rénales [303] ou encore une
réduction de l’apoptose des cellules vasculaires [304]. Cependant, ces cellules soit
disparaissent rapidement [304], soit se différencient en adipocytes [303].
61
Des approches de thérapie cellulaires sont en cours de développement.
L’amélioration de l’insuffisance rénale aiguë, chez la souris, a été aussi obtenue après
injection de cellules souches mésenchymateuses [305]. L’existence de cellules progénitrices
mésangiales issues de moelle osseuse a en effet été montrée, rendant possible une telle
application. Ces cellules, issues de souris diabétiques (type II) pouvaient transmettre un
phénotype de ND (albuminurie et glomérulosclérose) à des souris normales, sans qu’il y ait
pour autant apparition de diabète [306]. Le même groupe a aussi montré que les lésions
glomérulaires de la ND pouvaient ainsi être perpétuées et aggravées par des progéniteurs
ayant le phénotype pathologique [307]. Ainsi, l’existence de ces progéniteurs à fort potentiel
pathogène peut être un obstacle important à un tel type de traitement. Ce phénomène est donc
à prendre en compte dans le développement des approches de thérapie cellulaire et/ou génique
contre la ND. Des travaux concernant la recherche et l’amélioration des cellules souches ont
récemment été publiés. Ainsi, l’inhibition des histones déacéthylases semble activer
l’expression de gènes néphroprotecteurs (BMP-7 et HGF) dans certaines populations de
cellules rénales, dont l’identification plus précise est en cours [292]. Des cellules
embryonnaires rénales humaines, à fort potentiel de restauration, ont été récemment isolées
[308]. Ces cellules sont capables de restaurer des lésions tubulaires dans un modèle
d’insuffisance rénale aiguë et ne présentent pas d’effet de tumorigénicité.
62
III.
TRAITEMENTS ET PROTECTION RENALE : DU BLOCAGE DU
SRA A LA MISE EN JEU DU SKK
III.1.
BLOCAGE DU SYSTEME RENINE-ANGIOTENSINE
Les deux agents pharmacologiques IEC et ARA2 agissent à la fois par des
mécanismes communs et complémentaires, qui ont permis d’identifier des interactions
importantes entre les récepteurs de l’angiotensine II et ceux de la BK. Ces interactions sont
représentées sur la Figure 4. Comme les études cliniques, les travaux expérimentaux dans des
modèles de rat ou de souris diabétiques montrent un effet néphroprotecteur des IEC. Les IEC
augmentent la sensibilité à l’insuline [309-312], et inhibent in vivo la formation d’AGE [313,
314]. Plusieurs travaux, dans des modèles de diabète chez le rat [315-317], ont rapporté que
les IEC réduisaient la protéinurie ainsi que la sclérose glomérulaire et tubulo-interstitielle.
III.2.
EFFETS COLLATERAUX DU BLOCAGE DU SRA : MISE EN JEU DU
SKK ET AUTRES
La BK semble occuper une place importante dans les effets néphroprotecteurs des IEC
et des ARA 2 au cours de la néphropathie diabétique. En effet, les IEC ont un effet antiprotéinurique qui est partiellement supprimé par un antagoniste du RB2 et donc en partie
dépendant de la bradykinine [143]. De plus, il a été montré que les IEC amélioraient la
sensibilité à l’insuline chez des rats spontanément hypertendus ; cet effet bénéfique étant
supprimé par un antagoniste du RB2 (HOE-140). Enfin, la perfusion de BK est capable de
reproduire les mêmes effets que les IEC [309]. Cette amélioration de la sensibilité à l’insuline
a été également étudiée par plusieurs équipes, chez le rat Zucker obèse et insulino-résistant
63
[318-320]. Ces études ont établi qu’un traitement par l’omapatrilat, inhibant simultanément
l’enzyme de conversion et l’endopeptidase neutre, permet une amélioration de la sensibilité à
l’insuline plus efficace que l’inhibition de l’ECA seule [318-320]. Cet effet de l’omapatrilat
est bloqué par un antagoniste du B2R ou un inhibiteur de la NO-synthase, ce qui suggère
l’implication du RB2 et de la production de NO. Ce traitement réduit également l’albuminurie
ainsi que les lésions glomérulaires et tubulo-interstitielles, chez les rats Zucker ; cet effet étant
également en partie médié par l’activation du RB2. [321]. Nos travaux sont en accords avec
ces résultats puisque nous avons observé que le blocage du RB2 annulait les effets bénéfiques
des IEC sur l’expression et l’activation de plusieurs facteurs de croissance chez le rat [322], et
sur la glomérulosclérose et l’albuminurie chez la souris db/db (Manuscrit n°4). La
suppression des effets protecteurs des IEC par un antagoniste du RB2 est un argument
important en faveur d’un rôle néphroprotecteur de l’activation du RB2.
En plus de l’inhibition de la dégradation de la BK, une autre conséquence d’un
traitement par les IEC est l’accumulation d’angiotensine I. Sous l’action de plusieurs
enzymes, l’angiotensine I est dégradée en angiotensine 1-7 qui induit des effets hypotenseurs
et vasodilatateurs qui s’opposent à ceux de l’angiotensine II. Certains des effets de
l’angiotensine 1-7 sont inhibés par des antagonistes du RB2. Ils impliquent donc l’activation
du RB2 [148]. L’angiotensine 1-7, peut se comporter comme un inhibiteur de l’ECA et donc
augmenter la biodisponibilité de la BK mais également agir sur le complexe ECA/RB2 et
ainsi diminuer la désensibilisation du RB2 [150]. Ces voies de formation de l’angiotensine 17, associées à la stimulation potentielle du RB2, peuvent permettre de définir de nouvelles
voies thérapeutiques.
Un nouveau mécanisme, qui pourrait expliquer les effets anti-fibrosants des IEC,
impliquant le tétrapeptide Ac-SDKP (N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline) a été proposé. Ce
64
tétrapeptide, inhibiteur endogène des cellules hématopoïétiques, est hydrolysé exclusivement
par l’ACE ; sa concentration plasmatique est par conséquent fortement augmentée par un
traitement par les IEC [323]. Il a été montré que le SDKP inhibe les expressions de la protéine
PAI-1 et du collagène de type I induites par le TGFβ [324], via la suppression de l’activation
de Smad 7. Un traitement de souris db/db par le SDKP prévient l’accumulation de matrice
extracellulaire, l’hypertrophie glomérulaire et l’augmentation de la créatininémie, cependant
sans réduire de façon significative l’albuminurie [325]. L’effet bénéfique anti-fibrosant du
SDKP a été montré dans plusieurs modèles de fibrose rénale [326] et cardiaque [327-329],
suggérant l’utilisation thérapeutique possible de ce peptide au cours des pathologies
caractérisées par un excès de fibrose telle que la ND.
III.3.
ACTIVATION DU RECEPTEUR B2 : UNE NOUVELLE PERSPECTIVE
DE NEPHROPROTECTION
III.3.a.
Arguments pour le rôle protecteur de la bradykinine
Outre l’implication de la BK dans les effets protecteurs des IEC, de nombreux autres
arguments expérimentaux suggèrent un rôle protecteur de la BK au cours de la ND. Chez les
rats rendus diabétiques par la STZ, l’excrétion urinaire de BK ainsi que l’expression rénale
des kininogènes et du B2R sont augmentés, alors qu’au contraire, l’expression des kininases
est réduite [330]. Le diabète est donc associé à une activation globale du SKK, peut être
comme mécanisme d’adaptation pour maintenir la filtration glomérulaire malgré l’atteinte
rénale. Dans ce même modèle, un traitement par transfert du gène de la kallicréine permet de
réduire la glycémie, un effet dépendant de l’activation du RB2 [331], mais également de
diminuer l’albuminurie et d’améliorer la filtration glomérulaire [332].
65
Les souris génétiquement modifiées ont apporté des arguments supplémentaires quant
au rôle bénéfique de la BK au cours de la ND. En effet, les souris exprimant plusieurs copies
de l’enzyme de conversion, donc capables de dégrader de façon accrue la BK [117], ainsi que
les souris invalidées pour le RB2 [116], présentent une aggravation de la ND. Dans le premier
modèle, les auteurs ont observé que les souris exprimant 3 copies du gène de l’ECA
développent une protéinurie plus importante, quand on induit un diabète avec de la STZ, que
les souris n’exprimant qu’une ou 2 copies de ce gène. La seconde équipe a étudié l’impact sur
le développement de la néphropathie diabétique, de la délétion du gène du RB2 chez des
souris diabétiques Akita. Ils ont observé une très forte augmentation de l’albuminurie, ainsi
qu’une aggravation des lésions de glomérulosclérose.
Ce concept de l’effet protecteur de l’activation du RB2 reste toutefois controversé par
une équipe qui a en effet décrit que la BK, via l’activation du RB2 et la voie des MAPkinases, stimulerait l’expression de certains facteurs de croissances et cytokines (CTGF,
TGFβ) ainsi que la synthèse de collagène de type I [333] et contribuerait ainsi à l’aggravation
de la ND. Plus tard, la même équipe a observé, chez les souris invalidées pour le RB2, une
diminution de l’excrétion urinaire d’albumine et une réduction de la sclérose glomérulaire et
tubulo-interstitielle, par rapport à des souris sauvages [244]. Ils en ont déduit que l’activation
RB2 participerait au développement de la néphropathie diabétique. Cependant, ces travaux
sont en contradiction avec ceux de nombreux groupes, dont les notres, qui montrent un effet
protecteur de la BK et en particulier de son récepteur B2 dans différents modèles de
néphropathie diabétique.
66
III.3.b.
Mécanismes potentiels de l’effet néphroprotecteur
Les différents mécanismes possibles de l’effet néphroprotecteur associé à l’activation
du RB2 sont représentés sur la Figure 9.
Un premier mécanisme reposerait sur une action directe de la BK sur la régulation de
la glycémie, par ce biais, la BK serait capable de prévenir ou au moins ralentir l’évolution des
complications liées à l’hyperglycémie, en particulier la ND. En effet, la BK est capable de
stimuler la translocation du transporteur de glucose GLUT-4 et donc d’améliorer l’utilisation
du glucose [310-312]. La sensibilité à l’insuline des rats déficients en kininogène [334] ainsi
que celle des souris KOB2 [335] sont moins bonnes que celles de leurs contrôles respectifs.
De la même façon, la sensibilité à l’insuline, est réduite par l’administration d’un antagoniste
du RB2 [336], par un mécanisme indépendant du NO et des prostaglandines. De plus, la BK
serait capable de stimuler la libération d’insuline par le pancréas [71, 337].
La BK réduit également la quantité plasmatique d’AGE, ce qui peut être associé à
l’amélioration de l’action de l’insuline sur le transport de glucose dans le muscle squelettique
[338, 339].
En plus de cette action sur le contrôle de la glycémie, la BK exercerait également une
action protectrice directe et indépendante de la glycémie contre le développement de la ND.
Cet effet néphroprotecteur pourrait faire intervenir différents mécanismes :
- Tout d’abord, la BK réduirait le stress oxydant consécutif à l’hyperglycémie [170].
En effet, l’administration de BK chez des rats STZ, réduit la formation de certains paramètres
du stress oxydant (peroxyde d’hydrogène et malondialdéhyde), et augmente l’activité
d’enzymes anti-oxydantes (Super Oxyde Dismutase, catalase et glutathion peroxydase) [340].
67
Une réduction de la formation de radical super oxyde et des concentrations sériques en
triglycérides et cholestérol a été démontrée après transfert du gène de la kallicréine [105, 108,
331]. Inversement, une majoration du profil du stress oxydant a été décrite chez les souris
n’exprimant pas le RB2 [341]. Enfin, chez le rat diabétique, notre groupe a décrit une
augmentation de l’accumulation de protéines complexées à des dérivés 4-HNE (index de la
peroxidation lipidique) lors du blocage du RB2 [342]. L’activation du RB2 pourrait donc
contrôler en partie le stress oxydant, vraisemblablement par la production de NO.
- La BK exerce également un rôle anti-fibrosant via l’activation du RB2. Elle diminue
la synthèse d’inhibiteur-1 des activateurs du plasminogène (PAI-1), ce qui a pour
conséquence une augmentation d’activité des métalloprotéases, et favorise donc la
dégradation de la matrice [141]. De plus, la BK module l’expression et la signalisation des
récepteurs des cytokines et des facteurs de croissance. Sur la cellule mésangiale,
l’administration de BK réduit l’autophosphorylation du récepteur de l’EGF [343]. Chez le rat
diabétique, l’expression glomérulaire des récepteurs de certaines cytokines (IGF-1, TGF-β)
est augmentée lors du blocage du RB2 [342]. L’activation du RB2, sur des glomérules isolés
de rats, inhibe l’activation des MAP-kinases induite par les facteurs de croissance (IGF-1,
PDGF, VEGF, FGF), et par l’hyperglycémie [35, 342, 344]. Ces travaux sont par ailleurs en
accord avec une observation récente indiquant que la surexpression du récepteur du TGF- β
est augmentée chez les souris n’exprimant plus le RB2 [341].
- L’effet protecteur de la BK pourrait également impliquer son effet anti-prolifératif.
En effet, en fonction de l’état d’activation cellulaire, la BK peut activer ou inhiber la
prolifération et l’hypertrophie cellulaire, probablement via le recrutement de voies de
signalisation distinctes (Tableau 1). L’effet prolifératif semble faire intervenir les activations
de la phospholipase C et de la protéine kinase C (PKC). Plusieurs mécanismes ont été
68
évoqués pour expliquer l’effet anti-prolifératif : une augmentation de la production de PGE2
dans des fibroblastes [343], l’activation d’une tyrosine phosphatase capable de
déphosphoryler les MAP kinases Erk1/2 dans les cellules mésangiales [345], l’activation de la
phosphatase PTP responsable de la trans-inactivation du récepteur de l’EGF dans des cellules
épithéliales et enfin la désensibilisation du récepteur de l’EGF par un mécanisme impliquant
la PKC [346].
- La néphrine et la megsine sont deux protéines importantes pour la stabilité du filtre
glomérulaire. Elles pourraient intervenir dans l’effet protecteur du RB2. L’invalidation du
RB2 est en effet associée à une augmentation importante de l’expression de ces deux
protéines lors de l’apparition du diabète [116]. Une augmentation de l’expression de la
néphrine a aussi été démontrée lors de l’instauration d’un diabète de type I chez le rat [347].
La néphrine mutée est associée à un détachement des podocytes pouvant conduire à une
altération précoce du filtre glomérulaire [348, 349]. La megsine est un inhibiteur de
métalloprotéases et donc de la dégradation de protéines matricielles. L’accumulation de
megsine en absence du RB2 pourrait aboutir à l’accumulation de matrice, et être ainsi en
partie responsable de l’instauration de la fibrose glomérulaire [350].
69
Figure 9 : Différents mécanismes possibles de néphroprotection associés à l’activation du
récepteur de la bradykinine
70
III.4.
QUELLE PLACE POUR LE RECEPTEUR B1 ?
L’expression du récepteur B1 est induite au cours du diabète dans plusieurs organes
tels que les vaisseaux rétiniens [351], le rein [352-355] et la moelle épinière [356-359]. Par
contre, le RB1 n’est pas détectable dans le myocarde [360] alors que la fibrose cardiaque
associée à la cardiomyopathie diabétique est réduite par l’activation du RB2. Toutefois, l’effet
de l’activation du RB1 au cours de la néphropathie diabétique reste incertain. Un seul travail
est en faveur d’un rôle néphroprotecteur du RB1, montrant que le blocage pharmacologique
de ce récepteur aggrave la fibrose rénale dans un modèle d’hypertension [131]. Le RB1 peut
aussi avoir des effets anti-prolifératifs car il réduit l’hyperplasie de la média lors de lésions de
la carotide chez le rat [361]. Cependant, l’hypothèse actuelle privilégie plutôt le potentiel
délétère de son activation et place le blocage du RB1 comme une perspective thérapeutique,
comme cela à été observé avec bénéfice dans les syndromes douloureux, en particulier au
cours de la neuropathie diabétique [60, 362-364].
Le concept d’un rôle protecteur de l’activation du RB2 par la BK émerge donc des
travaux de plusieurs groupes indépendants. L’utilisation d’agonistes du RB2 devrait nous
permettre de vérifier l’hypothèse de l’effet protecteur de l’activation du RB2, au cours de la
néphropathie diabétique, et d’envisager l’usage du SKK comme outil thérapeutique.
71
IV.
CONTRIBUTION PERSONNELLE : PLACE DU RECEPTEUR B2
DANS LES EFFETS DU BLOCAGE DU SRA AU COURS DE LA
NEPHROPATHIE DIABETIQUE EXPERIMENTALE
Avec l’idée de rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour
protéger le rein contre le développement de l’insuffisance rénale chronique (néphropathie
diabétique) ou aiguë (choc endotoxinique), nos travaux avaient pour but de préciser le rôle du
récepteur B2 de la bradykinine au cours de ces deux pathologies.
Dans un premier travail (Allard J, Buléon M, Cellier E, Renaud I, Pecher C, Praddaude F, Conti M,
Tack I and JP Girolami. ACE inhibitor reduces growth factor receptor expression and signalling but also
albuminuria through B2-kinin glomerular receptor activation in diabetic rats. Am J Physiol Renal Physiol.
2007 ; 293(4) : F1083-92), nous avons étudié, chez le rat rendu diabétique par la streptozotocine,
l’effet du blocage du récepteur B2 sur l’expression et l’activation des récepteurs du TGFβ et
de 2 facteurs de croissance (IGF1 et PDGF) lors d’un traitement par un IEC. Dans cette
situation, le blocage du RB2 annule les effets inhibiteurs bénéfiques de l’IEC sur ces voies de
signalisation. Cette observation apporte un argument indirect pour considérer que l’activation
du RB2 est bénéfique en inhibant l’expression et l’activation de facteurs de croissance et de
cytokines impliqués dans le développement de la glomérulosclérose diabétique. Toutefois, ce
modèle de diabète chez le rat correspond à une situation catabolique extrême, fort éloignée de
celle des patients diabétiques. De plus, les lésions rénales observées dans ce modèle sont
modérées et pas tout à fait caractéristiques de la néphropathie diabétique (ND) humaine.
Suite à ce travail, et afin d’étudier directement les conséquences des traitements
pharmacologiques dans un modèle plus proche de la situation humaine, nous avons développé
le nouveau modèle de diabète des souris obèses diabétiques C57BlKs db/db. Ces animaux
72
développent des lésions rénales plus progressives et plus proches de celles observées chez
l’Homme que le modèle précédent.
La néphropathie diabétique touchant d’abord les glomérules, la première étape a été
d’adapter chez la souris et de valider une méthode d’isolement glomérulaire par tri
magnétique sélectif. Cette méthode dérivée de celle décrite par Cook et Pickering (1958) chez
le lapin, a été largement modifiée pour devenir utilisable chez la souris. Nous l’avons ensuite
validée par l’étude, au niveau glomérulaire, de la voie de l’IGF1 (impliquée dans la phase
précoce de développement de la néphropathie diabétique) dans 3 modèles de diabète chez la
souris : la souris NOD (diabète de type I spontané), le diabète induit par la streptozotocine
chez la souris C57 (diabète de type I), et la souris C57 BLKs db/db (diabète de type II). Ce
travail a fait l’objet d’une communication internationale (Buleon M, Allard J, Praddaude F, Ader
JL, Tack I: Glomerular expression and activation of IGF-I pathway in type I and type II diabetes in mice.
(poster) ASN 37th Annual Meeting & Scientific Exposition, St Louis, Missouri, october 2004) et le
manuscrit, en préparation, sera soumis prochainement à la revue European Journal of
Physiology.
Nous avons ensuite étudié le rôle du récepteur B2 de la bradykinine (RB2) dans l’effet
des IEC au cours de la néphropathie diabétique et ce dans le modèle de diabète de type II avec
obésité (la souris db/db). Des souris db/db ont été soumises pendant 20 semaines à un
traitement par du ramipril, seul ou associé à un antagoniste du récepteur B2 de la bradykinine.
A la fin du traitement, nous avons étudié les paramètres fonctionnels (microalbuminurie, débit
de filtration glomérulaire…) et structuraux (volume glomérulaire et glomérulosclérose par
histomorphométrie), caractérisant la néphropathie diabétique. L’impact des différents
traitements sur certaines voies de signalisation (IGF1, TGFβ, RAGE, stress oxydant), connues
pour être impliquées dans le développement de la néphropathie diabétique, a également été
73
étudié à l’échelon glomérulaire. Comme on pouvait s’y attendre, nous avons observé un
bénéfice structural important ainsi qu’une réduction de l’excrétion urinaire d’albumine chez
les souris traitées par les IEC. Mais surtout, cet effet néphroprotecteur des IEC était en grande
partie aboli par la co-administration de l’antagoniste du RB2. L’effet protecteur des IEC passe
donc largement par l’action directe de la bradykinine sur le RB2. Le manuscrit a été accepté à
l’American Journal of Physiology : Pharmacological blockade of B2-kinin receptor reduces renal
protective effect of Angiotensin-Converting Enzyme Inhibition in db/db mice model. Marie Buléon, Julien
Allard, Acil Jaafar, Françoise Praddaude, Marie-Thérèse Ranera, Christiane Pecher, Jean-Pierre
Girolami and Ivan Tack.
Suite à ce travail, nous avons étudié dans le même modèle, l’effet du blocage du RB2
au cours d’un traitement cette fois par un antagoniste du récepteur AT1 de l’angiotensine II
(ARA2). Des souris db/db ont donc été soumises à un traitement par un ARA2 (Irbésartan),
seul ou associé à un antagoniste du récepteur B2 de la bradykinine (HOE-140). Les mêmes
paramètres ont été étudiés. Nous avons observé un bénéfice structural des ARA2, cependant
moins important que celui observé lors du traitement par les IEC. Les ARA2 n’avaient pas
d’action anti-protéinurique mais amélioraient discrètement l’équilibre glycémique. Les
bénéfices structuraux et métaboliques apportés par les ARA2 impliquaient largement
l’activation du RB2.
74
Manuscrit n°1
ACE inhibitor reduces growth factor receptor expression and signaling but
also albuminuria through B2-kinin glomerular receptor activation in
diabetic rats.
Allard J, Buléon M, Cellier E, Renaud I, Pecher C, Praddaude F, Conti M, Tack
I, Girolami JP.
Am J Physiol Renal Physiol. 2007 Oct;293(4):F1083-92. Epub 2007 Jun 27.
75
Am J Physiol Renal Physiol 293: F1083–F1092, 2007.
First published June 27, 2007; doi:10.1152/ajprenal.00401.2006.
ACE inhibitor reduces growth factor receptor expression and signaling but
also albuminuria through B2-kinin glomerular receptor activation in
diabetic rats
Julien Allard,1 Marie Buléon,1 Eric Cellier,1 Isabelle Renaud,2 Christiane Pecher,1 Françoise Praddaude,1
Marc Conti,2 Ivan Tack,1 and Jean-Pierre Girolami1
1
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U858 eq 5 and Physiology Department, Louis Bugnard Institute,
Toulouse Cedex 4; and 2Laboratoire de Biochimie 1, CHU de Bicêtre, Le Kremlin-Bicêtre, France
Submitted 11 October 2006; accepted in final form 24 June 2007
Allard J, Buléon M, Cellier E, Renaud I, Pecher C, Praddaude
F, Conti M, Tack I, Girolami J-P. ACE inhibitor reduces growth
factor receptor expression and signaling but also albuminuria through
B2-kinin glomerular receptor activation in diabetic rats. Am J Physiol
Renal Physiol 293: F1083–F1092, 2007. First published June 27,
2007; doi:10.1152/ajprenal.00401.2006.—Diabetic nephropathy (DN)
is associated with increased oxidative stress, overexpression and
activation of growth factor receptors, including those for transforming
growth factor-␤1 (TGF-␤-RII), platelet-derived growth factor (PDGFR), and insulin-like growth factor (IGF1-R). These pathways are
believed to represent pathophysiological determinants of DN. Beyond
perfect glycemic control, angiotensin-converting enzyme inhibitors
(ACEI) are the most efficient treatment to delay glomerulosclerosis.
Since their mechanisms of action remain uncertain, we investigated
the effect of ACEI on the glomerular expression of these growth
factor pathways in a model of streptozotocin-induced diabetes in rats.
The early phase of diabetes was found to be associated with an
increase in glomerular expression of IGF1-R, PDGF-R, and TGF-␤RII and activation of IRS1, Erk 1/2, and Smad 2/3. These changes
were significantly reduced by ACEI treatment. Furthermore, ACEI
stimulated glutathione peroxidase activity, suggesting a protective
role against oxidative stress. ACEI decreased ANG II production but
also increased bradykinin bioavailability by reducing its degradation.
Thus the involvement of the bradykinin pathway was investigated
using coadministration of HOE-140, a highly specific nonpeptidic
B2-kinin receptor antagonist. Almost all the previously described
effects of ACEI were abolished by HOE-140, as was the increase in
glutathione peroxidase activity. Moreover, the well-established ability
of ACEI to reduce albuminuria was also prevented by HOE-140.
Taken together, these data demonstrate that, in the early phase of
diabetes, ACEI reverse glomerular overexpression and activation of
some critical growth factor pathways and increase protection against
oxidative stress and that these effects involve B2-kinin receptor
activation.
DIABETIC NEPHROPATHY (DN) causes the majority of end-stage
renal diseases throughout the world (54). It was initially
believed that elevated blood glucose was the major cause of
renal damage in both type 1 and 2 diabetes. However, several
clinical studies have demonstrated that strict glycemic control
is not sufficient to prevent the progression of renal dysfunction
and the development of glomerular lesions. The mechanisms
underlying the progression of diabetic kidney disease are
intricate and still not completely understood. Among the many
pathophysiological mechanisms possible, several growth factors and cytokines have been put forward to account for the
onset of DN. This is particularly the case for the paracrine
expression of insulin-like growth factor-1 (IGF-1), transforming growth factor-␤ (TGF-␤) (20), and platelet-derived growth
factor (PDGF) that are involved in the early onset of diabetesinduced renal changes. In addition to the upregulation and
activation of growth factor and cytokine receptors, the activation of the renal renin-angiotensin system (RAS) and oxidative
stress have been identified as critical events that largely contribute to worsening DN (7). These observations are consistent
with the importance of blood pressure (BP) reduction and the
efficiency of the blockade of the RAS (2, 38) in preserving
renal functions in diabetic states. Consistently, blockade of the
RAS with angiotensin-converting enzyme inhibitor (ACEI) or
ANG II type I receptor blockers (ATB) has become one of the
most successful therapeutic approaches to prevent diabetic
kidney disease. However, the efficiency of the RAS blockers
may not rely on the blockade of angiotensin receptors only,
since discrepancies in the level of activation of the RAS and in
the efficacy of RAS blockers have been reported suggesting
additional mechanisms. In fact, ACE exhibits at least a dual
activity; in addition to the generation of the potent vasoconstrictor peptide ANG II, ACE is also able to hydrolyze the
COOH-terminus dipeptide of the nonapeptide bradykinin (BK)
leading to inactive BK fragments. Therefore, ACE inhibitors
not only decrease ANG II synthesis, they also increase the
bioavailability of BK. Several recent reports suggest that activation of the B2-kinin receptors (B2R) could reduce the proliferative effect of several growth factors in cultured cell lines
(15, 45, 50) and in mesangial cells (1, 18). B2-kinin receptor is
involved in the antihypertrophic effect of BK documented in
cultured cardiomyocytes (30, 52, 53, 55) but also in vivo,
mainly in the heart (24, 25, 40, 56). Moreover, the antihypertrophic effect of BK in vivo on the renal vasculature in mice
has been also reported (67). Therefore, the present study was
designed to investigate the effect ACEI as well as the involvement of B2-kinin receptor inhibition on the expression of
several growth factor receptors involved in the development of
diabetic glomerulosclerosis (20).
Address for reprint requests and other correspondence: J. P. Girolami,
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U388 Louis Bugnard
Institute, BP 84225, 31432 Toulouse Cedex 4, France (e-mail: girolami
@toulouse.inserm.fr).
The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment
of page charges. The article must therefore be hereby marked “advertisement”
in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.
angiotensin-converting enzyme inhibitor; oxidative stress; glutathione
peroxidase activity; diabetes
http://www.ajprenal.org
0363-6127/07 $8.00 Copyright © 2007 the American Physiological Society
F1083
F1084
BRADYKININ AND GROWTH FACTOR IN DIABETIC GLOMERULI
The experimental protocol consisted of a prolonged treatment of streptozotocin-induced diabetic rats with ACEI alone
or combined with a B2R nonpeptide antagonist. We investigated the effect of this treatment on glomerular expressions of
IGF-1, PDGF B, and TGF-␤1 receptors. In addition, we also
assessed whether ACE inhibition induced changes in the major
activated signaling pathways of these receptors and in the
activity of several anti-oxidant enzymes in parallel with microalbuminuria.
MATERIALS AND METHODS
Drugs and compounds. Rabbit polyclonal IgG anti-PDGF receptor
type B, rabbit-purified IgG anti-IRS-1, and antiphospho-Smad 2 were
purchased from Upstate Biotechnology (Euromedex Munddolsheim
France). Goat-purified IgG anti-Smad 2/3, rabbit-purified IgG antiTGF-␤ receptor II, and rabbit-purified IgG anti-total form of Erk 2
were from Santa Cruz Biotechnology (Tebu, Le Perray, France).
Rabbit-purified IgG anti-phospho-Erk 1 and 2 were purchased from
Promega (Madison, WI). The commercial sources of products were
otherwise as follows: orthovanadate, NG-nitro-L-arginine methyl ester
(L-NAME), ouabain, EGTA, SDS, glycerol, PMSF, soybean trypsin
inhibitor (SBTI), aprotinin, leupeptin, ␤-mercaptoethanol, bacitracine,
BSA, genistein, DTT, TCA, ammonium molybdate, isobutanol, and
toluene were from Sigma (St. Quentin Fallavier, France). NaCl, RPMI
1640, and bromophenol blue were from Merck Eurolab (Strasbourg,
France). Tris and glycine were from GIBCO BRL (Cergy-Pontoise,
France). PBS was from Biochrom (Berlin, Germany), EDTA was
from ICN, and Zanozar (streptozotocin) was from Pharmacia and
Upjohn (St. Quentin Yvelines, France). Ramipril and HOE-140 were
generously provided by Aventis Pharma (Frankfurt, Germany).
Animal and study design. Male Sprague-Dawley rats (12 wk old,
Harlan) were housed under controlled conditions in a room with a
12:12-h light-dark cycle and standard rat chow and tap water available
ad libitum. Experimental procedures and protocols were conducted in
compliance with the guiding principles for animal research (US) and
has been approved by the IFR31 Institutional Animal Care and Use
Committee as recently described (3). Diabetes was induced by an
intravenous injection of 65 mg/kg streptozotocin (Zanosar, freshly
reconstituted in sterile water). Age-matched control rats received the
vehicle only. Once diabetes was established (4 –5 days afterward),
diabetic rats were randomly divided into five groups (n ⫽ 12 each).
Animals of the first group received no other treatment. Subcutaneous
insulin implants delivering 2 U/24 h (Linshin, Scarborough, ON,
Canada) were given to the rats in the second group. Rats from group
3 received 1 mg 䡠 kg⫺1 䡠 day⫺1 of the ACE inhibitor ramipril in their
drinking water. Rats from group 4 received ramipril and in addition
were subcutaneously injected daily with 0.25 mg/kg of the B2Rselective antagonist HOE-140. Rats from group 5 received 0.25
mg/kg of HOE-140 only. The selected doses of ramipril (1
mg 䡠 kg⫺1 䡠 day⫺1) had been previously demonstrated to reverse many
functional and morphological events of DN. The dose of HOE-140
used (0.25 mg/kg) was twofold that of a dose sufficient to inhibit the
hypotensive effects of 100 nM BK.
Biological parameters. Conscious systemic BP was measured by
the tail-cuff method (Power lab 400, Phymed, Paris, France). Three
days before the end of the study, the rats were housed in metabolic
cages, and 24-h urine samples were collected. Aliquots were frozen at
⫺20°C until measurements. Microalbuminuria was determined using
the Cayman EIA kit and expressed by the ratio albuminuria to
creatininuria. Glomerular filtration rate was estimated by using the
creatinine clearance method. At the end of the study, i.e., 14 days after
the initiation of the treatments, the glycemia was measured with a
Euro Flash LifeScan glycometer (Issy-les Moulineaux, France). The
rats were anesthetized intraperitoneally with 65 mg/kg pentobarbital
sodium (Sanofi, Montpellier, France). After complete exsanguination,
AJP-Renal Physiol • VOL
the kidneys were quickly removed and the glomeruli were isolated as
routinely performed in the laboratory by graded sieving (3). Briefly,
the cortex was forced through three consecutive steel sieves with
decreasing mesh sizes (180, 125, and 75 ␮m) to harvest ⬃12,000
glomeruli/kidney. Under light microscopy, ⬎90% of the glomeruli
appeared to be decapsulated and free of surrounding tubules and
arterioles. The suspension was centrifuged (15,000 rpm, 4°C, 2 min),
and the supernatant was discarded. The pellet containing the glomeruli
was resuspended in 100 ␮l of lysis buffer (10 mM Tris, 150 mM
NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2 mM orthovanadate, 0.36 mg/ml
PMSF, 10 ␮g/ml SBTI, 1 ␮g/ml aprotinin, 1 ␮g/ml leupeptin, 0.1%
SDS, pH 7.5), sonicated for 10 s, and centrifuged (15,000 rpm, 4°C,
15 min). Insoluble material was discarded, and the proteins of the
soluble extract were boiled in Laemmli buffer (32 mM Tris, 1% SDS,
5% glycerol, 0.05% bromophenol blue, 2.5% ␤-mercaptoethanol, pH
6.8) for 6 min and stored frozen until SDS-PAGE. Protein concentration was determined by the Bradford protein assay.
Western blotting. Equal amounts of proteins (25 ␮g) were separated by SDS-PAGE in Tris-glycine buffer under a 150-V, 30-mA
current in a Bio-Rad miniature transfer gel apparatus (Mini-Protean,
Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) on a 10% SDS-polyacrylamide gel as routinely performed in the laboratory and recently
described (3). Proteins were then transferred to a nitrocellulose membrane (Amersham, Orsay, France) in Tris-glycine-methanol buffer
under a 100-V, 300-mA current in a Bio-Rad miniature transfer gel
apparatus (Mini-Protean, Bio-Rad Laboratories). The membrane was
blotted with the appropriate antibody. Proteins were visualized using
a horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit immunoglobulin
(Amersham) and an enhanced chemiluminescence (ECL) kit (Amersham).
Oxidative stress parameters. Small fragments of cortical tissue
(250 mg) were rinsed with 0.15 M NaCl containing 1 mM EDTA,
frozen, and stored in liquid nitrogen. The tissues were homogenized in
an ice-bath for 30 s with 0.3 M perchloric acid (HClO4) using an Ultra
Turax homogenizer (Janken Kunkel Ika-Werk, Staufen, Germany).
The homogenate was centrifuged at 2,300 g for 15 min at 4°C. After
neutralization with trioctylamine (0.2 vol) and trichlorofluoromethane
(0.8 vol), the supernatant was used for determination of malonydialdehyde (MDA) after its conjugation to thiobarbituric acid (TBA) and
determination of the antioxidant activities of Cu/Zn- and Mn-SOD
(super oxide dismutase), catalase, and GPx (glutathione peroxidase);
MDA was also measured directly in plasma sample as recently
described in detail (6).
Tissue kallikrein-kinin system parameters. The expression of B2
receptor in glomerular extract was evaluated by Western blot as
previously described (19). The activity of kallikrein in cortical extracts was measured by radioimmunoassay of generated BK after
incubation as described below for tissue BK content. To measure BK
tissue content, fragments of cortical tissue were rapidly removed and
rinsed in PBS containing 0.3 mM orthophenanthroline and 0.3 mM
EDTA as kininase inhibitors. They were homogenized in the smallest
possible volume of extraction buffer (0.5 ml/100 ␮g). Then, the
homogenates were stored frozen at ⫺80°C until measurement. BK
concentration was measured using a radioimmunoassay as previously
described in our laboratory (19). The experimental conditions allowed
the minimal detection of 1.5 fmol BK with less than 10% crossreactivity with either Des-Arg9-BK or kininogen. Results are expressed as femtomoles per milligram of protein. ACE activity was
measured as previously described and currently performed in laboratory (42).
Statistical analysis. Data are expressed as means ⫾ SE of at least
five independent experiments. Body weight, glycemia, and tyrosine
phosphatase activity results were analyzed using one-way ANOVA
followed by either Student’s t-test for paired data or Dunnett’s test for
multiple comparisons. A Kruskal-Wallis test and post hoc WilcoxonMann-Whitney U-test were used for Western blot densitometric
293 • OCTOBER 2007 •
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Table 1. Characteristics of control and STZ-diabetic rats without and with treatment by Ins, ACEI, ACEI ⫹ HOE, HOE,
Ins ⫹ ACEI, or Ins ⫹ ACEI ⫹ HOE
Diabetic
Parameters
Control
No Treatment
Ins
ACEI
ACEI ⫹ HOE
HOE
Ins ⫹ ACEI
Ins ⫹ ACEI ⫹ HOE
Body wt, g
Glucose, mmol/l
Urine volume, ml/24 h
Creatinine clearance, ml/min
Blood pressure, mmHg
354⫾22
5.3⫾0.2
12.8⫾1.6
2.53⫾0.13
132⫾6
238⫾29*
30⫾6.8*
150⫾31.2*
1.32⫾0.27*
141⫾7
292⫾22*
5.2⫾0.4
13.6⫾3.4
2.68⫾0.28
128⫾5
229⫾37*
26.8⫾8.8*
116.7⫾31*
1.29⫾0.25*
125⫾9
241⫾34*
22.1⫾8.1*
166⫾21*†
1.50⫾0.26*
144⫾14
232⫾33*
22.9⫾5.2*
137⫾22*
1.70⫾0.41*
142⫾11
242⫾28*
4.9⫾0.6
11.4⫾4.1
2.72⫾0.22
125⫾6
247⫾22*
5.3⫾0.4
13.2⫾2.7
2.61⫾0.26
129⫾5
Values are means ⫾ SE of at least 8 independent experiments. GFR, glomerular filtration rate; STZ, streptozotocin; Ins, insulin; ACEI, angiotensin-converting
enzyme inhibitor; ACEI⫹HOE, ACEI combined with B2-kinin receptor antagonist HOE-140; HOE, HOE-140 alone; Ins⫹ACEI, Ins combined with ACEI;
Ins⫹ACEI⫹HOE, Ins combined with ACEI and HOE. *P ⬍ 0.05 when compared with nondiabetic control rats. †P ⬍ 0.05 when compared with ACEI-treated
rats.
analysis. P ⬍ 0.05 was considered to be significant. All analyses were
performed with Prism 3 software (Graphpad).
RESULTS
Induction of diabetes and effect of treatments. Table 1 and
Fig. 1 summarize several physiological parameters of the
experimental groups. A single administration of STZ induced
significant hyperglycemia, detected 5 days after injection,
which was normalized by insulin only but remained unchanged
during the other treatments. Induction of diabetes was associated with a large increase in diuresis (150 ⫾ 31.2 vs. 12.8 ⫾
1.6 ml/24 h for diabetic untreated rats) which was slightly
reduced by ACEI treatment via activation of the B2 receptor.
Using the tail-cuff method, BP did not significantly vary
between the groups. The diabetic untreated group showed a
marked reduction of glomerular filtration rate, which was
prevented by insulin treatment only. Urinary albumine excretion, shown in Fig. 1, increased significantly from 11.1 ⫾ 1
(control group) to 31.8 ⫾ 3.7 mg/100 mg creatinine (diabetic
group); this increase was reversed by insulin or by the ACEI
treatment. Interestingly, this effect of the ACEI was abolished
when the B2R antagonist HOE-140 was coadministered.
Fig. 1. Urinary albumin excretion from diabetic rats (filled bars) treated with
insulin (Ins), angiotensin-converting enzyme inhibitor (ACEI), ACEI and the
B2-kinin receptor antagonist HOE-140, HOE-140 alone (HOE), Ins combined
with ACEI (Ins ⫹ ACEI), or Ins combined with ACEI and HOE
(Ins ⫹ ACEI ⫹ HOE). Values are means ⫾ SE of at least 6 independent experiments. *P ⬍ 0.05, compared with nondiabetic control rats (open bar). †P ⬍ 0.05
compared with untreated diabetic rats (D).
Interestingly, the B2R antagonist alone had no effect per se
on any of the parameters tested. Moreover, combining either
insulin⫹ACEI or insulin⫹ACEI⫹HOE had no further effect compared with insulin or ACEI given alone.
Effect of treatment with ACEI and B2R antagonist on the
glomerular expression of IGF-1, PDGF-B, and TGF-␤1 receptors. As shown in Fig. 2, glomerular expression of PDGF-R,
IGF1-R, and TGF-␤ RII was increased in untreated diabetic
rats. Treatment with insulin (given after the onset of diabetes)
resulted in normalization of glycemia within 3 days but also
prevented overexpression of the growth factor receptors. More
interestingly, ACEI treatment exhibited similar preventive action despite its lack of effect on hyperglycemia. This effect of
ACEI treatment was abolished by coadministration of the B2R
antagonist HOE-140. Administration of HOE-140 alone had no
significant effect. Moreover, combining either insulin⫹ACEI
or insulin⫹ACEI⫹HOE had no further effect compared with
insulin or ACEI given alone.
Effect of treatments with ACEI and B2R antagonist on
glomerular signaling pathways. Induction of diabetes not only
increased some growth factor and cytokine receptors expression, but it also resulted in activation of several signaling
pathways as demonstrated by increased phosphorylation of
IRS-1, Erk1/2, and Smad 2/3 shown in Fig. 3. Normalization of
hyperglycemia with insulin treatment resulted in decreased
phosphorylation of these signaling molecules. Treatment with
ACEI for 2 wk also partly prevented phosphorylation of IRS-1,
Erk1/2, and Smad 2/3. Finaly, the ACEI-induced reduction of
phosphorylation was blunted by coadministration of the B2R
antagonist HOE-140 that did not exhibit any significant effects
alone. Moreover, combining either insulin⫹ACEI or
insulin⫹ACEI⫹HOE had no further effect compared with
insulin or ACEI given alone.
Effect of treatment with ACEI and B2R antagonist on enzymatic antioxidant defense. In a previous report (3), we showed
that ACEI reduced lipid peroxidation suggesting a decrease in
oxidative stress. Thus, here, we investigated the effect of the
various treatments on the enzymatic activities involved in
antioxidative defense. Serum MDA was found increased in
diabetic rats. This effect was corrected as expected by insulin
administration but also by ACEI, an effect that was abolished
by HOE. No changes in activities of catalase, SOD Cu/Zn, or
SOD were detected in any of the experimental groups (Table
2). In contrast, a significant increase in glutathione peroxidase
activity (GPx) was observed in diabetic rats (Fig. 4). Interest-
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Fig. 2. Top: representative Western blot analysis of glomerular expression of platelet-derived growth factor (PDGF), insulin-like
growth factor (IGF-1), and transforming
growth factor-␤ (TGF-␤) receptors. Protein
extracts of freshly isolated glomeruli from
control (C) and diabetic rats (D) were incubated with specific antibodies as described
in detail in MATERIALS AND METHODS. Diabetic rats were either untreated (D) or
treated with Ins, ACEI, ACEI combined
with B2-kinin receptor antagonist HOE-140
(ACEI ⫹ HOE), HOE-140 alone (HOE), Ins
combined with ACEI (Ins ⫹ ACEI), or Ins
combined with ACEI and HOE (Ins ⫹
ACEI ⫹ HOE). Bottom: relative densitometric values of glomerular protein expression
factored for the total form of ␤-actine.
A: PDGF R. B: IGF1 R. C: TGF-␤-RII. Control lane (open bars) were obtained with glomerular extracts from nondiabetic rats. Filled
bars: values from diabetic rats of the different
groups described above. Values are means ⫾
SE of at least 5 independent experiments.
*P ⬍ 0.05; **P ⬍ 0.01, compared with controls. †P ⬍ 0.05; ††P ⬍ 0.01, for the indicated
comparison.
ingly, ACEI treatment was associated with an additional increase in GPx activity that was completely prevented by
coadministration of the B2R antagonist HOE-140 suggesting
that activation of the B2R mediates the stimulation of GPx
during ACEI treatment.
Effect of treatment with ACEI and B2R antagonist on tissue
kinin content, tissue kallikrein, and ACE activities. As shown
in Fig. 5, the cortical BK content was significantly reduced in
diabetic rats. Normalization of ACEI administration partly
prevented the decrease in renal cortex BK content which,
nevertheless, remained lower than that of control. Coadministration of the B2R antagonist alone or with ACEI was not
associated with any specific effects. Moreover, combining
either insulin⫹ACEI or insulin⫹ACEI⫹HOE had no further
effect compared with insulin or ACEI given alone. Glomerular
expression of the B2-kinin receptor assessed by Western blot,
shown in Fig. 5A, remained unchanged in diabetic rats and was
not affected whatever the treatment. Conversely, a significant
reduction of tissue kallikrein activity was observed in cortical
extracts of diabetic rats, an effect that was prevented in all the
groups receiving insulin, but that was insensitive to any other
treatment. ACE activity was significantly reduced in diabetic
rats, an effect that was also prevented by insulin. Treatment
with ACEI resulted in complete inhibition of ACE activity.
Interestingly, no kallikrein and ACE activities could be detected in glomerular extracts.
DISCUSSION
The aim of the present study was to clarify the role of
B2-kinin receptor activation in the renoprotective effect of
ACEI treatment in a type 1 diabetic rat. For this purpose,
glomerular activation of some growth factors pathways critically involved in the development of DN was screened. Indeed,
an increasing number of reports support the involvement of
cytokines and growth factors in the onset and progression of
DN (20, 37, 59, 60). Recruitment of these cytokines leads to
overexpression of their receptors and activation of their corre-
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Fig. 3. Top: representative Western blot analysis of glomerular expression of the phosphorylated (P⫺) and the total form of IRS,
Smad 2, and Erk 1/2. Protein extracts of
freshly isolated glomeruli from control (C)
and diabetic rats (D) were incubated with
specific antibodies as described in detail in
MATERIALS AND METHODS. Diabetic rats were
either untreated (D) or treated with Ins,
ACEI, ACEI ⫹ HOE, HOE, Ins ⫹ ACEI, or
Ins ⫹ ACEI ⫹ HOE. Bottom: relative densitometric values of glomerular protein expression of the phosphorylated form factored to
the total form of the protein of interest shown
above. A: P-IRS-1. B: P-Smad. C: P-Erk. The
ratio of control group was used as 100%
value. Values are means ⫾ SE of at least 5
independent experiments. *P ⬍ 0.05; **P ⬍
0.01, compared with controls. †P ⬍ 0.05;
††P ⬍ 0.01, for the indicated comparison.
sponding signaling pathways, such as phosphorylation of
IRS-1 and Erk1/2 for IGF-1 and of Smad for TGF-␤1. These
phenomena are paralleled by the progression of glomerulosclerosis strongly suggesting a link of causality that is sustained by
the beneficial effects of their blockades (20, 60, 69). Reducing
hyperglycemia with insulin not only reverses both receptor
overexpression and activation of these signaling pathways, but
it also delays formation of renal lesions. Unfortunately, perAJP-Renal Physiol • VOL
manent normoglycemia is hard, if not impossible, to achieve in
most diabetic patients. This provides a rationale to resort to a
long-term renoprotective treatment independent of glycemic
equilibrium. Until now, blockade of the RAS (using ACEI or
AT1 receptor antagonists) is the only therapy whose benefit has
been clearly demonstrated in humans. The certainty of their
protective effects contrasts with the vagueness of their intimate
mechanisms of action. It is now clear that the blockade of the
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Table 2. Oxidative stress parameters in control and STZ-diabetic rats without and with treatment by Ins, ACEI, ACEI ⫹
HOE, HOE, Ins ⫹ ACEI, or Ins ⫹ ACEI ⫹ HOE
Diabetic
Parameters
Control
No Treatment
Ins
ACEI
ACEI ⫹ HOE
HOE
Ins ⫹ ACEI
Ins ⫹ ACEI ⫹ HOE
Catalase, U/mg protein
SOD Cu/Zn, U/mg protein
SOD Mn, U/mg protein
Tissue MDA, U/mg protein
39⫾6.2
13.8⫾2.0
4.1⫾0,6
0.74⫾0.10
38⫾7.3
14⫾2.2
3.9⫾0.6
0.73⫾0.14
39⫾4.5
14.2⫾2.4
4.4⫾0.4
0.68⫾0.11
38⫾7.0
15⫾2.4
3.8⫾0.5
0.67⫾0.07
42⫾5.5
14.8⫾2.3
4.7⫾0.5
0.72⫾0.11
40⫾5,0
13.9⫾2.2
4⫾0.8
0.69⫾0.12
37⫾3.3
12.2⫾2.7
3.9⫾0.4
0.71⫾0.20
41⫾2.9
13.2⫾2.5
4.1⫾0.3
0.69⫾0.40
Values are means ⫾ SE of at least 6 independent experiments. SOD Cu/Zn, Cu/Zn-superoxide dismutase; Mn SOD, Mn-superoxide dismutase; MDA,
Malondialdehyde.
angiotensin pathway by itself is not the only mechanism
involved in ACEI-related vascular and renal protection. Downregulation of some critical cytokines, growth factor pathways,
and reduction of oxidative stress appear as additional, but
main, actions of ACEI treatment (46). The deleterious effects
of these cytokines and growth factors on the kidney result from
Fig. 4. A: plasma malondialdehyde (MDA) levels. B: glutathione peroxidase
activity in glomerular extracts of freshly isolated glomeruli from diabetic rats
(filled bars) treated with Ins, ACEI, ACEI ⫹ HOE, HOE, Ins ⫹ ACEI, or
Ins ⫹ ACEI ⫹ HOE. Values are means ⫾ SE of at least 6 independent
experiments. *P ⬍ 0.05; **P ⬍ 0.01, compared with nondiabetic control rats
(open bar). †P ⬍ 0.05 compared with D.
multiple interactions and the identification of a common early
step controlling their activation may provide a breakthrough
toward a more efficient way to interrupt the cellular mechanisms of glomerular fibrogenesis.
The present study established that, at the critical level of the
glomerulus, the renal protective effect of chronic ACEI treatment during diabetes is in fact associated with the downregulation of the glomerular expression of IGF-1, PDGF, and
TGF-␤1 receptors as well as inhibition of some of their
signalings. Although we failed to identify directly the cellular
localization of these receptors, it can be suggested that mesangial cells are critically involved in these changes. This
suggestion is consistent with numerous previous studies reporting the expression of B2R in cultured mesangial cells (1, 18,
63), whereas the presence of B2R elsewhere in the glomerulus
is poorly documented. Less expectedly, our results indicate that
these changes critically involve B2R activation since they are
largely abolished by coadministration of HOE-140, a specific
B2R antagonist.
Among the several growth factors involved in the progression of diabetic glomerulosclerosis, IGF-1 was one of the first
and most extensively studied. Several works from Striker’s
group (16, 17, 41, 62) indicate that diabetes could be responsible for prolonged activation of the glomerular IGF-1 pathway
accounting for the accumulation of extracellular matrix, as a
result of an increase in collagen synthesis alongside decreased
degradation. An increasing number of reports indicate that
blockade of the IGF-1/GH axis is able to prevent or attenuate
nephropathy in various experimental models of diabetes. Activation of IGF-1 receptor is likely involved in diabetesinduced glomerular hypertrophy since an IGF-1 receptor antagonist inhibits early renal growth in diabetes (27). Furthermore, somatostatin analogs, which prevent renal IGF-I
accumulation, protect the kidney in both type I and type II
experimental models of diabetes (26). Finally, the involvement
of IGF-1 in the worsening of DN is well accepted but the
effects of chronic ACEI treatment on glomerular expression of
IGF1-R protein and IGF-1 pathway have not yet been studied.
TGF-␤1, which couples the functions of growth factor and
inflammatory cytokine, has emerged as a major mediator of
renal fibrogenesis (70) playing a central role in the deleterious
renal effects of chronic hyperglycemia. In mesangial cells
cultured in a high-glucose medium, inhibition of the JAK/
STAT signaling pathway, which mediates several TGF-␤1
cellular actions, also reduces TGF-␤ and fibronectin synthesis
(70). A new therapeutic approach to control the fibrotic process
is based on the inhibition of either the expression or the action
of the renal TGF-␤ pathway (5, 23, 59, 69). Neutralization of
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Fig. 5. Status of the main components of
renal kallikrein kinin system. A: representative
Western blot analysis of glomerular expression of B2 receptor. B: relative densitometric
values of glomrular protein expression factored for the total form of ␤-actine. C: bradykinin concentration in cortical extracts. D: kallikrein activity from cortical extract. E: ACE
activity from cortical extract from diabetic rats
(filled bars) treated with Ins, ACEI,
ACEI ⫹ HOE, HOE, Ins ⫹ ACEI, or Ins ⫹
ACEI ⫹ HOE. Bradykinin concentration, kallikrein activity, and ACE activity were determined as described in detail in MATERIALS AND
METHODS. Values are means ⫾ SE of at least 6
independent extracts. *P ⬍ 0.05; **P ⬍ 0.01,
compared with nondiabetic control rats (open
bars).
secreted TGF-␤ with specific antibodies prevents glomerulosclerosis and renal failure in a model of type 2 diabetes (db/db
mice) (5, 70). Interestingly, ACEI treatment decreases renal
TGF-␤ synthesis in several experimental models of diabetes
(28) but also in diabetic patients (61).
The pathophysiological role of PDGF-B in the progression
of DN is less clear but is under recent evaluation. It has been
known for a long time that PDGF is a necessary factor for the
normal development of mesangial cells and that knockout mice
for PDGF-B receptor lack mesangial cells (39). During diabetes, hyperglycemia is associated with glomerular upregulation
of PDGF-B receptor (22, 35) and its activation is likely
involved in the progressive development of fibrosis via activation of the TGF-␤1 pathway (22).
Reversing established diabetic glomerulopathy remains a
fascinating but unsolved therapeutic challenge. With respect to
all these previous strategies designed to separately reduce the
activation of proliferative and hypertrophic pathways of
growth factors, treatment with ACEI shows a considerable
advantage because it acts efficiently on all the upstream cytokine/growth factor receptors and pathways suggesting an action on a common very early step, which remains to be
identified. It is also interesting to note that ACEI demonstrates
an effect similar to that of insulin on the reduction of growth
factor expression and signaling activation. However, in contrast to insulin, ACEI has no significant effect on hyperglycemia. Therefore, ACEI acts at a different level than insulin but
close to an early effect of hyerglycemia. Early effects of
hyperglycemia are 1) activation of protein kinase C and 2)
production of glucoxidative products such as Amadori and
advance glycated end products (21) that lead to formation of
reactive oxygen species (ROS). The accumulation of ROS in
renal tissue in turn activates several signaling pathways associated with fibrogenesis (36).
An increasing number of reports now indicate that ACEI
also induce antioxidative effects. The attenuation of oxidative
stress by ACEI is mainly interpreted as resulting from the
inhibition of the RAS (14). It is true that ANG II is a potent
stimulus for superoxide production by activating NAD(P)H
oxidases, but surprisingly, the effect of antagonists of ANG II
receptor has not yet been as widely tested as ACEI. Based on
the current findings, ACEI may act as a “Magic Bullet” against
oxidative stress (49) through an additional but unknown mechanism that is independent of their action on BP. Interestingly,
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F1090
the activation of B2R has never been evoked to account for the
antioxidative effect of ACEI. Clearly, in the present study, the
effect of ACEI is dependent on activation of the B2-kinin
receptor. Although the precise mechanism remains to be elucidated, our report proposes a hypothesis based on an association between activation of the B2R and reduction of oxidative
stress. Treatment with ACEI enhanced GPx activity, a wellestablished anti-oxidant enzymatic system. Moreover, the
ACEI-induced increase in GPx activity is significantly blunted
by coadministration of the B2R antagonist. Such stimulation or
protection of anti-oxidant systems by ACEI inhibitors has been
previously documented in various tissues in aging mice and
rats (9, 11, 13), in hemodialysis patients (10), and in diabetic
rats (12).
How can BK reduce oxidative stress? Activation of B2R
results in the formation of nitric oxide (NO), a potent scavenger molecule, which could reduce the accumulation of ROS.
However, such a combination of NO and ROS will, in turn,
result in a fall in NO availability which may end up in an
elevation of BP (51) not observed in our study. We also
recently demonstrated that B2R knockout mice exhibit a reduced glomerular capillary surface area and reduced urinary
excretion of NO, indicating a tonic effect of B2R in the control
of glomerular morphology (57). Finally, a direct effect of BK
reducing the oxidative state of rats with acute hyperglycemia
(47) has also been reported but to our knowledge no precise
mechanism has been demonstrated.
A second interesting observation in our experiment is that
ACEI-induced reduction of albuminuria is also mediated by
activation of the B2R. Until now, only one study has suggested
the involvement of BK in the antiproteinuric effect of ACEI in
DN (65), whereas absence of B2R is associated with higher
microalbuminuria in diabetes mice (34). It has been demonstrated that DN is markedly enhanced in mice expressing high
ACE activity, a situation associated with low levels of kinin
and thereby low B2R activation (29). Similar observations
have been reported in mice lacking the B2R (34). We also
showed that renal fibrosis is increased in B2R null mice in
response to unilateral obstruction (58). These three recent
reports indicate that absence of B2R worsen DN, thereby
suggesting that BK, through activation of the B2R, could exert
potent nephroprotective effects. Several BK-dependent mechanisms could account for a reduction of albuminuria. First, it
could be through a hemodynamic effect leading to reduction of
filtration pressure. It has been reported (34) that induction of
diabetes in mice lacking the B2R is associated with increased
nephrin and megsin expressions and thereby glomerular hypertrophy. Therefore, BK could protect the steady expression
of glomerular proteins such as nephrin, an essential component
of the slit diaphragms necessary to maintain selective glomerular filtration, and megsin an inhibitor of matrix protein degradation. Expression of nephrin is increased in early stages of
DN and favors loss of functional podocytes. Increasing the
level of megsin, an inhibitor of matrix protein degradation, will
result in extracellular matrix accumulation.
Whereas the role of the B2R has been poorly studied, the
changes in the kallikrein-kinin system (KKS) have been extensively investigated during diabetes, both in humans and in
rats. Initial works suggested that renal KKS function is abnormal during diabetes mellitus in patients, an effect related to
poor glycemic control (43). Later on, regulation of the renal
KKS was extensively investigated in STZ diabetic rats. We
found that, whereas B2R renal expression remains stable during diabetes in our model, renal cortex tissue kallikrein activity
decreases. This observation is consistent with the fact that in
severely hyperglycemic diabetic animals, urinary excretion of
kallikrein is reduced, a phenomenon that worsens with time
(44). As a consequence, one could predict that during diabetes,
renal kinin production in the cortex will be decreased, what we
actually documented in renal cortex extract. The observation
that tissue kinin content is increased by ACEI is explained by
a decrease in kinin degradation rather by an increase in kinin
synthesis since we found that ACEI had no effect of tissue
kallikrein activity. It was then further suggested that insulin
treatment modulates renal kallikrein production, activation,
and secretion (31). Several other works from the same group
put forward the hypothesis that increased renal production of
kinins contributes to diabetes-induced glomerular hyperfiltration (32). More recently, the same group suggested that BK
could promote glomerular injury in diabetes (63), an hypothesis which at first could appear opposite to our results but also
to those observed in B2R knockout mice (34). However, the
conclusion that BK can promote glomerular injury in diabetes
was established on the fact that TGF-␤1 mRNA, TGF-␤ RII,
CTGF, and B2R expression and levels in renal cortex of
diabetic rats increased simultaneously. However, this observation does not establish any causal relationships between these
changes. To achieve this point, it should have been interesting
to assess the effect of B2R blockade on TGF-␤1 mRNA,
TGF-␤ RII, and CTGF. Our present work adds new information indicating that B2-kinin receptor can also exert beneficial
effects during the course of DN. We established that a large
part of the effects of ACEI, both on the reduction of growth
factor receptor expression and signaling but also on albuminuria, is mediated via activation of the B2R receptor because 1)
specific pharmacological inhibition of the B2R reduces the
effects of ACEI and 2) ACEI largely restored BK generation in
cortical tissue. One may question why 50 to 75% restoration of
renal cortical BK content during ACEI could be enough to
achieve effects similar to those observed normally in rats. In
fact, since ACEI clearly blocks ANG II generation, the beneficial action of BK is no longer counterbalanced by the deleterious effects of ANG II. Thus it can be hypothesized that less
BK could achieve similar effects to those observed in normal
animals with intact ANG II formation capability.
With respect to the beneficial effects of the KKS, it has also
been shown that diabetes suppresses kallikrein and renin
mRNA gene expression and that these abnormalities are reversed by insulin or IGF-I (33). More recently, the role of the
KKS in the physiopathological mechanism of diabetic complications, either nephropathy or cardiomyopathy, has been revisited and new direct mechanisms have been suggested. In this
context, BK has been found to be involved in the antiproteinuric effect of ACE inhibition (64).
Finally, kallikrein gene delivery in the rat (48, 60) protects
against experimental diabetic cardiopathy. Besides the cardioprotective effect of kinins, the hypothesis of a nephroprotective
action of BK via activation of the B2R is also emerging from
several works also discussed in this paper. It has been reported
that B9972, a new B2R agonist, demonstrates the capacity to
reduce both severe pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy but can also induce apoptosis of hyperprolif-
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erative cells in precapillary pulmonary arterioles (64). Finally,
it has been very recently shown (4) that kinin infusion prevents
renal inflammation, apoptosis, and fibrosis via inhibition of
oxidative stress and mitogen-activated protein kinase activity
in high salt-induced renal lesion in rats.
In summary, we describe a new chronic and potentially
beneficial effect of ACEI resulting in the inhibition of glomerular expression of some growth factor receptors and their
signaling during the early steps of type 1 diabetes. A critical
observation is that almost all the benefits of ACEI are blunted
by concomitant and specific B2R blockage. Thus it is likely
that BK mediates these effects through B2R activation. The
potential protective role of B2-kinin receptor activation during
diabetes has been recently reviewed (8) and it is suggested that
B2R-specific agonists now merit consideration as a possible
new therapeutic approach to protect against DN, an idea
consistent with the works of different groups and not solely
those involved in the field of DN. The present work suggests that
the protective mechanism of B2R activation could be partly
mediated by the stimulation of antioxidant defense and by maintaining steady expression of glomerular structural proteins. Moreover, downregulation of several deleterious growth factor pathways is also dependant on B2R activation. These observations and
our results finally strengthen the concept of developing B2R
agonists to protect the kidney during diabetes and support the
evaluation of the renoprotective effect of B2R activation during
diabetes, using a specific agonist, independently of ACEI blockade.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank Dr. P. Winterton for reviewing the manuscript.
GRANTS
This work was supported by funds from Institut National de la Santé et de
la Recherche Médicale. The authors thank Sanofi Aventis Laboratories for the
generous gift of ramipril and HOE-140. E. Cellier was a postdoctoral fellow
supported by funding from Fonds de la Recherche en Santé du Québec.
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Manuscrit n°2 (en cours de rédaction)
Rapid large scale isolation of glomeruli in mice applied to the study of IGF1 system in three experimental models of diabetes.
Marie Buléon, Julien Allard, Françoise Praddaude, Marie-Thérèse Ranera, JeanPierre Girolami, and Ivan Tack
76
1
Glomerular IGF1 and diabetic nephropathy
Rapid large scale isolation of glomeruli in mice applied to the study of IGF1 system in three experimental models of diabetes
Marie Buléon,
1,2,3
Julien Allard,
1,2,3
Françoise Praddaude,
1,2,3
Marie-Thérèse Ranera,
1,2,3
Jean-Pierre Girolami,2,3 and Ivan Tack1,2,3
From the
1
Laboratoire de Physiologie, Faculté de Médecine Rangueil, Toulouse, France;
2
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), U858, Toulouse,
France
3
Université Toulouse III Paul-Sabatier, Institut de Médecine Moléculaire de Rangueil, Equipe
n°5, IFR31, Toulouse, France
Address for correspondence: Ivan Tack, INSERM U 858 Equipe 5 BP 84, Institut Louis
Bugnard,
BP 84225, 31432 Toulouse Cedex 4
e-mail: tack.i@chu-toulouse.fr
2
Summary
To investigate the signalling pathways at the glomerular protein level, we developed a rapid,
simple and costless method of large scale glomeruli isolation in mice. Mice kidneys perfused
with an iron oxide solution and after graded sieving, glomeruli were separated by
magnetization. This provided a pure suspension of 7200 ±1600 glomeruli from the 2 kidneys,
allowing protein extraction of 302 ± 12 µg. Isolated glomeruli showed intact structure and
ultrastructure and were able to produce NO-dependant cGMP. Combining such methodology
to western blot analysis allowed us to compare the glomerular expression of insulin like
receptor (IGF-1R), insulin receptor substrate (IRS1) and their phosphorylated forms. In
preparations obtained from 3 different models of diabetic mice: streptozotocine-induced
diabetes, NOD mice and db/db mice. The expression of IGF1-1R and IRS1 was significantly
increased in all diabetic models. However, using the NOD mice model, activation of IGF-1R
was only detected during the onset of diabetes whereas expression of the total form remains
steadily increased. Interestingly, IGF-1R could still be stimulated by exogenously given IGF1. In this model, data sustain the hypothesis of an early but transient role of IGF-1 in the onset
of DN, but does not rule out its later re-activation. Interestingly, such new information could
only be obtained by investigating activation of this system at the glomerular protein level
emphasizing the benefit of the methodology developed here.
3
Diabetic nephropathy (DN) is a major complication of diabetes characterized by the
development of glomerulosclerosis (GS) associated with progression of both type 1 and type 2
diabetes. The major features of DN include an initial transient phase of hyperfiltration
followed by a progressive reduction of glomerular filtration, onset of albuminuria, and
development of renal injuries leading to an irreversible pathological state defined as GS.
However before reaching the irreversible state of GS, glomerular changes are associated with
the up-regulation of several vasoactive, cytokine and growth factor systems that are believed
to be responsible for the pathogenesis of DN. Because a strict glycemic control is not always
reachable, and despite the powerful renal protective effect of renin angiotensin system
blockade, at least 20% of diabetic patient will develop a DN. This provides the rational to go
into the pathophysiological mechanisms of DN. Among the possible early mechanisms,
activation of the glomerular Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1) pathway has been involved
in renal hypertrophy and glomerular hyperfiltration and thereby could participate in the onset
of diabetic nephropathy [1]. The mains arguments for such an hypothesis are: 1) In the
kidney, its receptor is expressed in the glomerulus, mainly in the mesangial cells [2]; 2) in
vitro it stimulates the synthesis of extra-cellular matrix by the mesangial cells and, in parallel,
reduces their proteolytic activity [3]; 3) transgenic mice that over-express the growth hormone
and have a high plasmatic concentration of IGF-1 develop, in the absence of any
hyperglycemia, a glomerulosclerosis similar to that of the diabetic nephropathy [4]. Diabetes
is accompanied by an initial, but temporary, activation of the somatotropic axis whereas the
renal bioavailability of IGF-1 and of mRNA encoding for its receptor (IGF-1 R) are durably
increased. These abnormalities play an important role in the renal hypertrophy and glomerular
hyperfiltration observed at the beginning of the disease [5]. Later, the persistence of an in vivo
activation of the glomerular pathway of IGF-1 and its harmful role remains to be
demonstrated. However, Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1) is above all the main peripheral
mediator of the somatotropic axis. Thus studying its local growth factor involvement during
DN requires to specifically focus on the glomerular components of this growth factor. In most
of the previous studies, glomerular IGF-1 pathway has been investigated either at the mRNA
level or, in vivo, by blocking the somatotropic axis or by directly blocking IGF1 receptor
using the pharmacological antagonist JB3 [1]. For these reasons, only few data are available
regarding glomerular expression and activation of the IGF-1 pathway in vivo, at the protein
level [6]. Because overall glomerular volume is less than 5 % of cortical volume, a major
challenge for studying glomerular signaling pathways at the protein level is the availability of
4
a large number of pure isolated glomeruli, especially when small animal models, such as
mice, are used.
We have modified and optimized a method previously described for glomerular extraction in
rabbit (ref) in order to make it usable for mice. This simple method of glomerular isolation is
based on selective magnetic sorting of ferrous oxide loaded glomeruli. After validation of the
isolation protocol, it was applied to compare the expression and activation state of the IGF-1
glomerular signaling pathway at the protein level, in 3 different experimental models of
diabetes in mice.
Research Design and Methods
Experimental animals
All procedures involving experimental animals were performed in accordance with the
recommendations of the French Accreditation of Laboratory Animal Care. Three different
models of diabetes in mice have been used: NOD/LTJ and C57/BLKs-db/db mice were
purchased from Jackson Laboratories and C57 BL/6 from Charles River Laboratories. All
mice were kept in a temperature-controlled room on a 12 hours light-dark cycle. Animals
were allowed free access to standard laboratory mouse diet (Global Rodent Breeding, Harlan,
United Kingdom) and tap water.
Insulin-dependent models of diabetes: 1) NOD/Ltj (Non-Obese Diabetic) develop
spontaneously an insulin-dependent diabetes. The incidence of diabetes is over 80 % in
female mice between 12 and 20 weeks of life. Six weeks only after the onset of diabetes,
NOD
mice
exhibit
typical
lesions
of
diabetic
nephropathy
with
progressive
glomerulosclerosis very similar to that found in humans. Normoglycemic age-matched female
NOD mice were used as controls (diabetic, n=11; controls, n=12); 2) Pharmacological insulindependent diabetes was induced in C57BL/6 female mice (n=10), at the age of 8 weeks, by
intraperitoneal injection of 80 mg/kg/day streptozotocine, diluted in citrate buffer (0.05 M, pH
4.5), during 3 days. Age-matched non-diabetic control mice (n=13) were injected with an
equal volume of vehicle. Conversely to the previous model, these mice only develop light to
mild lesions of diabetic nephropathy.
Non-Insulin-dependent model of diabetes: C57/BLKs-db mice spontaneously lack type B
leptin receptor. At 6 weeks of life, homozygotes db/db mice develop obesity and severe type 2
diabetes (glycemia: 0.6-0.9 g/dL). After 3 months of hyperglycemia, they exhibit mild to
severe glomerular lesions. Heterozygote db/m mice are asymptomatic and provided the
control.
5
Isolation of glomeruli
Isolation of glomeruli was based on the selective magnetic sorting method described in rabbit
by Cook and Pickering [4]. Due to structural characteristics of glomeruli, perfusion of
colloidal iron oxide (FeOx) allows saturation of capillaries with magnetic particles. After this,
the renal cortex was dissected and mechanically broken up. Then, the glomeruli were isolated
from other renal structures (mainly renal tubules) by magnetic isolation.
Colloidal iron oxide mixture: solution A (2.6 g NaOH, 20 g KNO3, made up to 100 mL with
water) was mixed with solution B (9 g FeSO4 made up to 100 mL with water) to form a black
iron oxide precipitate. This precipitate was boiled, decanted, washed and dried to obtain a
thick paste. Before injection, this FeOx paste was diluted in PBS with 3% of Gum Arabic in
order to obtain a stable colloidal suspension.
Operative procedure for FeOx injection and glomerular isolation. Mice were anaesthetized
with thiobutabarbital (150 mg/kg). After laparotomy, aorta and vena cava were ligated above
the iliac artery with nylon tread (Ethilon 5-0); a catheter (22G) was introduced into the aorta
below the renal arteries. Abdominal aorta was ligated above the renal artery. The vena cava
was partly sectioned under the renal artery to allow exit for perfusion fluid. Infusion of 10 mL
PBS was performed at a flow rate of 5 mM/min immediately followed by the perfusion of
colloidal FeOx. Both kidneys were excised after the perfusion period and quickly
decapsulated, then the cortex was manually dissected and sliced into 4 to 5 mm3 fragments.
2
Cortical tissue was mechanically disrupted by passing through a metal sieve (125 µm mesh)
and washed with cold PBS. Glomerular capsule was removed by passing the suspension
through a 27-gauges needle. After 45 min of decantation, the supernatant was removed and
pelleted glomeruli were resuspended in PBS. The suspension was magnetized with a neodym
magnetic ring (Magnet, France) to separate structures containing iron oxide (glomeruli) from
other (non-magnetic) structures (mainly renal tubules). Glomeruli fraction was washed with
PBS and again magnetized three additional times to obtain an almost pure population of
glomeruli. The remaining sediment was resuspended in 60 to 120 µL of lysis buffer (10%
glycerol, 20 mM Tris, 140 mM NaCl, 10 mM Sodium Pyrophosphate, 10 mM Sodium
Fluoride, 2 mM Sodium Orthovanadate, 3 mM EDTA, 10 µg/mL Aprotinin, 1.5 µM
Benzamidine, 50 µM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 10 µg/mL Leupeptin, 1 %
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2® (Sigma, Missouri, USA) and 1% Triton X-100). All
procedures were performed at 4°C.
6
Intra-aortic perfusion pressure control. Because a high perfusion pressure, above the autoregulation range, could induce severe structural damages, intra aortic pressure was
continuously measured during the infusion (flow rate: 5 ml/min) of both the PBS and the
colloidal iron oxide. A catheter was introduced in the thoracic aorta and connected to a
pressure sensor (Statham, P10 EZ, USA) and a recorder (TA 4000 Gould, Gould Electronics,
Arizona, USA). Perfusion pressure was recorded during five independent experiments using 8
weeks old C57BL/6 mice.
Light Microscopy. Three independent assays were performed. 1) Sagittal sections of iron
oxide infused kidneys were studied by trans-illumination. 2) Suspensions of isolated
glomeruli were examined by light microscopy with and without methylene blue (0.01%) to
check the disruption of glomeruli capsule. 3) a histological study was performed. Kidneys
were successively perfused with 10 mL of PBS and 10 mL of paraformaldehyde (at 10%).
Sagittal kidney sections were embedded in methyl-methacrylate. Sections of 3 µm were
stained with periodic acid Schiff (PAS) for histological analyze.
Electron Microscopy. For scanning electron microscopy (SEM), isolated glomeruli were fixed
in 2% glutaraldehyde in Sorensen buffer (0.1 M, pH 7.4) for 4 hours. After 2 washes in the
same buffer, the glomeruli were removed, dehydrated in a graded ethanol series, dried by
critical point drying with Emscope CPD 750 and coated with gold-palladium for 3 min at 100
Å.min-1, and observed with a S450 scanning electron microscope (Hitachi, Japan) at an
accelerating voltage of 15 kV.
For transmission electron microscopy (TEM), glomeruli were fixed in 2 % glutaraldehyde in
Sorensen buffer (0.1 M, pH 7.4) for 1 hour, and washed with the same buffer for 12 hours.
Then, they were postfixed in 1% of OsO4 in Sorensen buffer 0.05 M and saccharose 0.25 M
for 1 hour. The samples were dehydrated and embedded in an Epon-araldite resin (Epon 812,
Electron Microscopy Sciences, USA). Thin sections of 0.5 µm (Ultracut Reichert Jung) of the
resin-embedded glomeruli were stained with 3% uranyl acetate and with 8.5% lead citrate and
observed under a HU12A transmission electron microscope (Hitachi, Japan) at an accelerating
voltage 75 kV.
Protein extraction
The suspension of glomeruli (in lysis buffer) was sonicated for 1 min and centrifuged (15 000
rpm for 45 min, 4°C). The supernatant was completed at 20 % with Laemmli Blue solution
(0.16 M Tris-HCl, 5% Lauryl Sulfate (SDS), 25% Glycerol, 0.025% Bromophenol Blue) with
13% of β-mercapto-ethanol. This solution of proteins was heated at 100°C for 5 min, and
stored at -80°C until western blot analysis. Protein concentration was determined by a
7
colorimetric method on microplates (Bio-rad DC Protein Assay®, Richmond, USA). Optic
density was measured by a microplates reader (Multiskan EX, Thermo Labsystem, Finland).
Bovine albumin was used for standard.
Stimulation of mouse isolated glomeruli by IGF-1 and immunoprecipitation
For each experimental condition, glomeruli from pooled kidneys of 4 mice were isolated,
collected in PBS, and incubated at 37°C for 10 min. IGF-1 (100 nM) was added in the tubes
and incubated for 2 minutes. Then glomeruli were quickly magnetized and the supernatant
was removed. Glomeruli were resuspended in 200 µL of lysis buffer and proteins were
extracted as described above.
Protein samples were incubated with anti-IGF-1 antibody (10 µL/mL) diluted in an
immunoprecipitation (IP) buffer (Tris 10 mM, 150 mM NaCl, 0.2 mM Na Orthovanadate, 1
mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.5 mM PMSF, 0.2% Phosphatase Inhibitor Cocktail 2® (Sigma),
1% Triton X100, 0.5% Nonidet P-40, pH=7.4) for twelve hours at 4°C. Then, 20 µL of a
sepharose-protein-A suspension were added to each sample and they were incubated for 5
hours at 4°C. After centrifugation (1000 g, 5 min), the pellet was successively washed with IP
buffer and centrifuged 3 times. Supernatant was removed and 50 µL of Tris buffer (50 mM
Tris, pH 6.7) and 12.5 µL of Laemmli Blue with 13% of β-mercapto-ethanol were added to
the pellet. The samples were boiled for 5 minutes and stored at –80°C.
Western blot analysis
Proteins (20 to 25 µg) were separated by electrophoresis in polyacrylamid gels (6% or 10%)
and electro-transferred on nitrocellulose membranes (Hybond-ECL®, Amersham, USA).
After 1h incubation at room temperature in Tris-buffered saline, 5% milk, or 1% milk plus 1%
BSA, and 0.05% Tween-20, the blots were exposed to antibodies recognizing either IGF-IRβ,
IRS-1, ERK-1/2, phospho-ERK-1/2, and β-actin. The primary antibodies were revealed using
the corresponding rabbit or donkey peroxidase–conjugated secondary antibodies for 1 h at
room temperature. Peroxidase activity was detected using a Pierce chemiluminescence
substrate (Super Signal® West Pico Chemiluminescence Substrate, Pierce, USA) and Kodak
Biomax Light Film. Primary and secondary antibodies were purchased from Santa Cruz
Laboratories (Santa Cruz Biotechnology, USA), except anti-β-Actin (Sigma, USA).
8
Results
Perfusion pressure recording
To ensure that the kidney was kept in perfusion pressure (pp)in the autoregulation range, the
intra-aortic pressure was monitored through out the whole period of perfusion and reached
92.6 ± 19.5 mmHg during PBS administration and 197 ± 27 mmHg at the end of FeOx
injection. Injection of FeOx diluted in PBS alone, without Arabic Gum, leads to pp > 300
mmHg which damages the glomerular tuft (data not shown).
Characteristics of the isolated glomeruli
The observation of a trans-illuminated sagittal section of kidney after FeOx perfusion showed
that FeOx accumulate electively in glomeruli that appear as dark gray dots in renal cortex. In
optic microscopy, FeOx was principally deposited in capillary loops and was present neither
in tubular lumen nor in the Bowman space. (Fig 1A&B).
After magnetic sorting, a suspension containing 93.0 ± 1.3 % of glomeruli, 5.3 ± 1.4 % of
tubular fragments, and 1.7 ± 0.4 % of arterioles was obtained (mean ± SEM of 6 independent
experiments). More than 95 % of the glomeruli were completely decapsulated (Fig 1C&D).
When glomerular suspension was not passed through a 27-gauges needle, more than 40 % of
glomeruli were not decapsulated. Observation of glomeruli at higher magnification (x 400,
Fig 1D) showed that glomerular structure remained intact after FeOx perfusion.
Ultra structure of glomerular filtration membrane
The integrity of glomerular ultrastructure after perfusion has been also studied using
electronic microscopy (Fig 2). As observed in transmission electronic microscopy, the
components of glomerular filtration membrane (fenestrated endothelial lining of the capillary
loop, basement membrane and pedicels) remained intact after FeOx injection (Fig 3). FeOx
perfusion did not induce any lesion or desquamation of the endothelium and there was no leak
of FeOx outside of the capillary. FeOx particles size ranged between 25 and 100 Å (Fig 3D).
Functional integrity of glomeruli
In order to determine if the process of magnetic sorting isolation of glomeruli was detrimental
for endothelial cells functional integrity, we studied glomerular production of cyclic-GMP
following stimulation of the endothelial nitric oxide-synthase. As shown in Fig 4, in isolated
glomeruli from control mice, calcium ionophore A23187 was able to stimulate cGMP
accumulation in a NO-dependant way (as inhibited by L-NAME), from 6.0 ± 0.5 fmol/μg of
proteins to 16.5 ± 2.6 fmol/μg of proteins (P< 0.01).
9
Glomerular and proteic yield
In our experimental conditions, we were able to collect 7200 ± 1600 glomeruli (n= 6) using
the 2 kidneys from the same mice, as estimated using a Nageotte cell. The average protein
content after extraction by a Tris-glycine buffer reached 301 ± 12 µg, giving an average ratio
of 1 µg / 24 glomeruli. No difference was found between glomeruli from diabetic and non
diabetic mice regarding the quality and the rendition of isolation.
Effect of Diabetes on glomerular IFG-1 signaling pathway
In the 3 experimental models of diabetes, expression of IGF-1 Rβ and IRS-1 was strongly
increased when compared to the corresponding non diabetic control mice. Expression of
MAP-kinases ERK1/2 was not changed in diabetic animals, however, their tyrosinephosphorylated forms were increased (Fig 5). For practical reason, further experiments
regarding activation of the IGF-1 pathway was focused in the NOD/Ltj mice. In this model,
over-expression of IGF1-Rβ was already observed since the 3rd day of diabetes and remained
increased until the end of the study. Phosphorylated IGF1-Rβ was not detected in non diabetic
mice whereas it was present 3 days after the onset of diabetes, and remained detectable for 2
weeks progressively decreasing thereafter (Fig 6a). Phosphorylated form of IGF1-R was not
detectable anymore after 3 and 6 weeks of diabetes whereas expression of the total protein
remains steadily increased. Nevertheless, stimulation by exogenous IGF-1 at 3 days, but also
at 14 days, led to an increased in IGF-1 Rβ and IRS-1 phosphorylation in glomeruli from
diabetic mice (Fig 6b), suggesting that IGF-1 pathway could be re-activated after the first 2
weeks of diabetes.
Discussion
The onset of diabetic nephropathy is mainly a glomerular disease. Because of the large
availability of genetic modified strains, the mice models start being widely used to investigate
the potential physiological role of various systems in the onset and progression of diabetic
nephropathy. Therefore, studying pathophysiological events at the glomerular protein level in
mouse models requires the availability of large preparations of intact and functional
glomeruli. Several methods have been previously reported. Microscopic dissection of the
renal cortex allows a few dozen glomeruli to be isolated within a few hours [5], a yield that
does not provide enough tissue for protein extraction and subsequent investigations. Another
method, based on graded sieving [7], has been successfully used in rat but is disappointing
when applied to mice because the purity of the tissue extract is too low (≈ 50%). Indeed
glomeruli and tubules exhibit very close sizes which does not allow separation by a graded
10
sieving method only. Although, the method of magnetic sorting described by Cook and
Pickering had already been applied to mice [8, 9], it has only been used to isolate and
characterize glomerular basement membrane, and to screen mRNA expression [10].
Furthermore, whereas the functional integrity of glomeruli was investigates in the work of
Cook and Pickering, later papers only focused on purification yield and did not used their
preparation for further purpose. To our knowledge, the functional characteristics of isolated
mice glomeruli have never been reported until now. In the present work, we characterized our
preparation both at the structural and functional level by using electronic microscopy and by
measuring NO-dependant cGMP production in isolated glomeruli. Moreover, we were able to
use these preparations to study the activation of IGF1 pathway at the glomerular level during
experimental diabetes. All these experiments provide convergent data indicating that isolated
glomeruli are similar to their native structure with intact functional properties.
In fact, the efficiency and yield of glomerular isolation largely depends on small but critical
technical details:
1- The use of Arabic Gum in the FeOx suspension (to obtain a colloidal rather than a
crystalloid suspension) avoids reaching high perfusion pressures which would cause structural
damages.
2- Passing the glomerular suspension through a 22G needle to remove glomerular
capsule is critical for the purity of the preparation (particularly since epithelial cells of mouse
Bowman’s capsule are cuboidal and can represent up to 40% of the cell volume of a nondecapsulated glomerulus).
When rigorously applied, the present method gives an almost pure suspension of decapsulated
and structurally intact glomeruli with a reproducible yield of 25 to 30 %. This corresponds,
after extraction, to a protein yield of approximately 300 µg per mouse. This allows to perform
5 to 10 Western-Blots or one immunoprecipitation. Therefore, this method can be used to
study glomerular signaling pathways at the protein level.
Diabetes and glomerular IFG-1 signaling pathway: The role of IGF-1 in the development of
diabetic nephropathy has long been suspected since it has been shown that disruption of the
GH-IGF-1 pathway can delay the progression of diabetic nephropathy (ref). Based on in vivo
studies, very early activation of renal IGF-1 pathway during diabetes is now emerging as an
evidence [1]. Several initial works from Stricker’s group (16, 17, 41, 62) indicate that, during
diabetes, activation of IGF-1 pathways could be responsible for the accumulation of
extracellular matrix resulting from both increased synthesis and blunted degradation.
11
Consistently, blockade of IGF-1 pathway either with a receptor antagonist [1] or with
inhibitor such as somatostatin analog [11] is able to attenuate nephropathy in various models
of diabetes. Although there is some evidence for the involvement of IGF-1 in the development
of DN, its detrimental impact remains under controversy. Indeed, as some changes the status
of IGF-1 pathway status change may occur during the progression of diabetes and may vary
depending on the model of diabetes. These remarks provide the rationale of our study to
document i) the status of the glomerular IGF-1 in 3 different models of diabetes ii) the time
course status of the system in the NOD model mice. Several previous works tend to indicate
that inhibition of IGF-1 pathway result in salutary effects on DN markers. However, some
recent works raised a query about this hypothesis. It has been recently reported in obese db/db
mice that circulating IGF-1 is decreased whereas renal immunostainable IGF-1 did not
significantly vary. This decrease in circulating IGF-1 is associated with an increased
expression of IGF-1 binding proteins. Finally these changes mostly suggest that it could result
in a decreased activation of IGF-1R [12]. These last data finally suggest that inhibition of
IGF-1R would not be contributive to prevent or care DN. However, a more direct
demonstration at the receptor level is still lacking.
In the three models of diabetes that we have studied, the expressions of the main components
of the IGF-1 signaling pathway (IGF1-R and its substrate, IRS-1) are precociously and
strongly increased from the 3rd day of diabetes and until at least 10 weeks. Furthermore, the
phosphorylated forms of ERK1/2 MAP-kinases were also increased at the same time. In order
to determine whether IGF-1R over-expression was associated with its activation, we
secondary focused on the type 1 diabetes in NOD mice only since it provided a model of
rapidly progressive nephropathy (ref). In this strain of mice, we were able to demonstrate that
IGF-1R was activated very early but transiently (between the 3rd and the14th day) after the
onset of diabetes. Later on, whereas over-expression of glomerular IGF1 pathway components
was persisting, their activation, assessed by protein phosphorylation was not anymore
detectable, even is still stimulable.
Interestingly, even when the upstream events of IGF-1R pathway activation were not anymore
detectable in glomeruli, MAP-kinases remained activated at 21 days (Fig 5) and up to at least
42 days (not shown). It is likely that at that time, MAP-kinases activation resulted from other
mechanisms that could involve polyols, PKC and TGFβ pathways.
Experimental diabetes of type 1 or type 2 results in an early and prolonged overexpression of
the glomerular IGF-1 pathway. Nevertheless, the activation of this pathway, if early, is just
transient. Our results sustain the involvement of glomerular IGF-1 pathway in the early renal
12
events during diabetes but the present work does not sustain the hypothesis of a permanent
and prolonged activation in the late progression of diabetic nephropathy, i.e. in the
development of glomerulosclerosis. However, exogenous administration of IGF-1 or any
circumstance that will increases its renal availability can re-activate the still over-expressed
glomerular IGF-1 pathway and potentially aggravate the glomerular disease.
Acknowledgments
Marie Buleon was supported by a MRT grant. This work was also supported by funds from
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, and from Toulouse Paul Sabatier
University.
References
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13
a
b
C
M
c
d
Gid
A
Figure 1. a) Sagittal section of a kidney after injection of FeOx in vivo; Glomeruli saturated with
FeOx (G), appear like dark gray dots in renal cortex (C). Renal medulla (M) does not contain FeOx.
(Trans-illumination, x1). b) Renal cortex after injection of FeOx; (G) Glomerulus; FeOx deposits
(arrows) in glomerular capillary loops and in an arteriole (A). FeOx was present neither in tubular
lumen (T) nor in the Bowman space. (O.M. PAS staining, x 250). c) Isolated and decapsulated
glomeruli suspension. Purity of glomerular suspension is 93 % (there is no tubular fragments on the
picture). Less than 5 % of the glomeruli are not completely decapsulated (Gid). (O.M. x 100). d)
Isolated glomerulus. The Bowman capsule is removed and glomerular structure is intact. Half of
impurities of preparation are fragments of peri-glomerular arterioles (A) connected to the glomerular
basis. (O.M, methylene blue, x 400).
14
Figure 2. Isolated glomerulus. The capillar network of a mouse glomerulus isolated by magnetic
sorting is intact after injection of iron oxide and decapsulation. B.E.M., x 1100.
a
c
Fe
Ox
Ca
b
d
P
BM
E
Figure 3. Ultra structure of glomerular filtration membrane. a) Normal appearance of capillaries (Ca)
after perfusion of PBS; b) Distinct and intact components of the glomerular filtration membrane:
fenestrated endothelial lining of the capillary loop (E), basement membrane (BM) and pedicels (P); c
and d) FeOx perfusion did not induce any lesion or desquamation of the endothelium. The other
components of the glomerular filter were intact. There was no leak of FeOx outside of the capillary.
Particle size was 25-100 Å. T.E.M., x 6000 (A, B) x 80 000 (C, D)).
15
**
*
2000
cGMP release
1500
1000
500
M
E
C
+A
23
18
+L
-N
A
C
+A
23
18
C
0
Figure 4. cyclic-GMP production by isolated glomeruli following stimulation of the endothelial nitric
oxide-synthase. A23187 : calcium ionophore ; L-NAME : endothelial nitric oxide-synthase inhibitor.
IGF-1 Rβ
Standard
C
0.5 1 1.5 2
IRS-1
C
D kDa
ERK 1/2
D
C
kDa
D
pERK 1/2
C
kDa
D
kDa
100
150
44
42
44
42
NOD/Ltj
100
150
44
42
44
42
C57BL/Ks db
100
150
44
42
44
42
1
0
**
*
1
0
db
/m
db
/d
b
0
Densitometric analysis
1
2
2
C
57
C C
57
D
N
O
D
N C
O
D
D
*
db
/m
db
/d
b
2
3
C
C
57
D
N
O
D
N C
O
D
D
db
/m
db
/d
b
0
*
*
**
C
57
*
1
3
db
/m
db
/d
b
2
**
C
57
C C
57
D
N
O
D
N C
O
D
D
3
C
57
C C
57
D
N
O
D
N C
O
D
D
C57
Figure 5. Western blot analysis of different proteins of IGF1 glomerular signaling pathway at 3 weeks
of diabetes. Glomerular extracts from NOD/Ltj; C57 BL/6 and C57 BL/Ks db mice. β subunit of IGF1
receptor (IGF1-R β), Insulin Receptor Substrate-1 (IRS-1), MAP-Kinases ERK1, ERK2 and their
tyrosine phosphorylated forms pERK1 and pERK2. C: non-diabetic control mice; D: diabetic mice.
Representative Western-Blot and densitometric analysis. The ratio of standard 1µg was used as 100%
value. Results represent mean ± SEM of at least five separate experiments. * P<0.05; ** P<0.01 for
the indicated comparison.
16
b.
IGF-1Rβ
a.
C
D
IGF-1
-
+
pIGF-1Rβ
C
pIGF-1Rβ
D
D3
D3
100 kDa
pIRS1
D7
IGF-1
D14
+
pIGF-1Rβ
D14
D21
pIRS1
D42
Figure 6. IGF1 receptor phosphorylation. a) Time-course from day 3 to day 42. b) After stimulation
of isolated glomeruli with exogenous IGF1. Glomerular extracts from NOD/Ltj mice were incubated
with an anti-IGF1-Rβ or anti-IRS1 antibodies. Precipitation products were separated by Western Blot,
and exposed to an antibody against phosphotyrosine residue (PY20). C: control mice; D: diabetic
mice.
Manuscrit n° 3
Pharmacological blockade of B2-kinin receptor reduces renal protective
effect of Angiotensin-Converting Enzyme Inhibition in db/db mice model.
Marie Buléon, Julien Allard, Acil Jaafar, Françoise Praddaude, Marie-Thérèse
Ranera, Christiane Pecher, Jean-Pierre Girolami and Ivan Tack.
Am J Physiol Renal Physiol. 2008 Mar 26
77
Am J Physiol Renal Physiol 294: F1249–F1256, 2008.
First published March 26, 2008; doi:10.1152/ajprenal.00501.2007.
Pharmacological blockade of B2-kinin receptor reduces renal protective effect
of angiotensin-converting enzyme inhibition in db/db mice model
Marie Buléon,1,2,3 Julien Allard,1,2,3 Acil Jaafar,1,2,3 Françoise Praddaude,1,2,3 Zara Dickson,1,3
Marie-Thérèse Ranera,1,2,3 Christiane Pecher,2,3 Jean-Pierre Girolami,2,3 and Ivan Tack1,2,3
1
Laboratoire de Physiologie, Faculté de Médecine Rangueil, Toulouse; 2Institut National de la Santé et de la Recherche
Médicale, Unité 858, Toulouse; and 3Université Toulouse III Paul-Sabatier, Institut de Médecine Moléculaire de Rangueil,
Equipe 5, IFR31, Toulouse, France
Submitted 25 October 2007; accepted in final form 12 March 2008
Buléon M, Allard J, Jaafar A, Praddaude F, Dickson Z, Ranera
M-T, Pecher C, Girolami J-P, Tack I. Pharmacological blockade of
B2-kinin receptor reduces renal protective effect of angiotensinconverting enzyme inhibition in db/db mice model. Am J Physiol
Renal Physiol 294: F1249–F1256, 2008. First published March 26,
2008; doi:10.1152/ajprenal.00501.2007.—Diabetic nephropathy (DN)
can be delayed by the use of angiotensin-converting enzyme inhibitors
(ACEi). The mechanisms of ACEi renal protection are not univocal.
To investigate the impact of bradykinin B2 receptor (B2R) activation
during ACE inhibition, type II diabetic mice (C57BLKS db/db)
received for 20 wk: 1) ACEi (ramipril) alone, 2) ACEi ⫹ HOE-140 (a
specific B2R antagonist), 3) HOE-140 alone, or 4) no treatment. The
development of DN, defined by an increase in albuminuria and
glomerulosclerosis, was largely prevented by ACEi treatment (albuminuria: 980 ⫾ 130 vs. 2,160 ⫾ 330 mg/g creatinine; mesangial area:
22.5 ⫾ 0.5 vs. 27.6 ⫾ 0.3%). The protective effect of ramipril was
markedly attenuated by B2R blockade (albuminuria: 2,790 ⫾ 680
mg/g creatinine; mesangial area: 30.4 ⫾ 1.1%), whereas HOE-140
alone significantly increased albuminuria. Despite such benefits, glomerular filtration rate remained unchanged, probably because of the
combination of the hypotensive effect of diabetes in this model and
the renal hemodynamic action of ramipril. Finally, the renal protective
effect of ACEi was associated with a marked decrease in glomerular
overexpression of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and transforming growth factor-␤ pathways, but also in advanced glycation end
product receptors and lipid peroxidation assessed by 4-hydroxy-2nonenal (4-HNE) adducts. Concomitant blockade of B2R partly restored glomerular overexpression of IGF-1 receptor ␤ and 4-HNE
complexes. These results support the critical role of B2R activation in
the mediation of ACEi renal protection against DN and provide the
rationale to examine the benefit of B2R activation by itself as a new
therapeutic approach for DN.
(DN) is a major complication associated
with the progression of both type 1 and type 2 diabetes.
Optimization of glycemic control helps to reduce its onset.
However, despite such efforts, DN is present in more than 40%
of patients in both types of diabetes after 25 years of evolution
(20). In type 2 diabetes, the future appears even worse, since
the prevalence of the disease is still growing and the faint hope
of reaching euglycemia is far less than in type 1 diabetes. For
these reasons the research of new therapeutic strategies to
protect against the development of DN is essential. Until now,
the blockade of the renin angiotensin system, mainly with
angiotensin-converting enzyme inhibitors (ACEi) but also with
antagonists of the AT1 receptor for angiotensin II, was the only
efficient treatment able to slow down the progression of DN
(12, 25). It is usually considered that both families of drugs act
through either inhibition of angiotensin II generation or blockade of its receptor (30, 31). Indeed, angiotensin II is a potent
vasoconstrictor that promotes the synthesis of the highly fibrotic cytokine transforming growth factor-␤ (TGF-␤) and
stimulates the production of reactive oxygen species (8), leading to a globally profibrotic effect. However, some works
suggest that this might not be their only mechanism of action.
Indeed, in addition to the blockade of angiotensin II synthesis,
ACEi also inhibit degradation of bradykinin (BK) by the ACE.
As a result, bradykinin bioavailability increases, enabling the
activation of its receptors. BK acts via two distinct G proteincoupled receptors named B1-kinin (B1R) and B2-kinin receptors (B2R). (11). Activation of the B2R induces powerful
physiological actions that, on the whole, oppose those of
angiotensin II. This raises the question of a potential direct
renal protective effect of BK during ACEi treatment (11, 14).
Most of the recent data obtained with genetically modified
mice sustain such a hypothesis. Diabetic nephropathy is markedly enhanced in mice lacking the B2R (23) and in mice with
genetically increased angiotensin I-converting enzyme expression (22), where B2R activation by endogenous kinin is abolished, suggesting that this receptor is involved in the renal
protective effect of BK during DN. As further support of this
hypothesis, our group has shown that in vivo, B2R activation
reduces renal fibrosis following unilateral ureteral obstruction
in mice, an effect associated with increased matrix degradation
and increased synthesis of plasminogen activators (34). We
also recently observed that in a model of streptozotocin (STZ)induced diabetes in rats, the blockade of B2R blunted the
beneficial effect of ACEi treatment on albuminuria (2). In
contrast, a recent publication has provided contradictory information suggesting that B2R knockout in mice protects against
the development of diabetic nephropathy (40). Thus it appears
critical 1) to establish the contribution of B2R activation in the
renal protective action of ACEi treatment during diabetic
nephropathy and 2) to clarify the pathophysiological mechanisms affected.
The aim of the present study was to investigate, using the
db/db mouse model of type 2 diabetes, the consequences of the
chronic blockade of B2R during ACEi treatment of diabetic
Address for reprint requests and other correspondence: I. Tack, INSERM
U858 eq 5 BP 84, Institut Louis Bugnard, BP 84225, 31432 Toulouse Cedex
4, France (e-mail: tack.i@chu-toulouse.fr).
The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment
of page charges. The article must therefore be hereby marked “advertisement”
in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.
angiotensin-converting enzyme inhibitors; bradykinin; glomerulopathy
DIABETIC NEPHROPATHY
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0363-6127/08 $8.00 Copyright © 2008 the American Physiological Society
F1249
F1250
INHIBITION OF B2-KININ RECEPTOR AND DIABETIC NEPHROPATHY
nephropathy. To achieve this goal, diabetic mice received
treatment with ramipril, a molecule that has shown its efficacy
in this circumstance (2, 29), either alone or in association with
HOE-140, a specific and poorly reversible B2R antagonist
(43). The consequences of this treatment on the development
of DN (i.e., albuminuria, renal failure, and glomerulosclerosis)
and on some of the main pathogenic mechanisms of diabetic
glomerulopathy were studied after 20 wk of treatment. We
found that the pharmacological blockade of the B2R markedly
reduces the renal protective action of ACEi in this model of
diabetic nephropathy. Furthermore, some of the crossover
signaling pathways between B2R and ACEi renal protective
effects were identified.
METHODS
Animal model. Obese diabetic C57BLKS db/db mice and heterozygote C57BLKS db/m mice were purchased from the Jackson Laboratories and kept in a temperature-controlled room on a 12:12-h
light-dark cycle. To avoid a sex-related discrepancy in the results,
only female mice were used. Animals were allowed free access to
standard diet and tap water. Experiments were performed using
7-wk-old mice randomly assigned to four groups: either 1) untreated,
or treated for 20 wk with 2) ACEi (ramipril, Aventis Pharma Germany; 1 mg 䡠 kg⫺1 䡠 day⫺1 in drinking water), 3) ACEi and B2R
selective antagonist HOE-140 (Icatibant HOE-140, Aventis Pharma
Germany; 250 ␮g 䡠 kg⫺1 䡠 48 h⫺1 subcutaneously), or 4) HOE-140
alone (250 ␮g 䡠 kg⫺1 䡠 48 h⫺1 subcutaneously). This dose was able to
prevent the hypotensive effect of a single 100-␮l intravenous bolus of
2 ⫻ 10⫺5 M BK (see RESULTS). Based on pilot experiments, this
protocol of administration avoided the implantation of minipumps in
these diabetic and obese mice, which are sensitive to infections and
healing complications. In each group, age-matched heterozygote
C57BLKS db/m mice were used as nondiabetic controls. Every other
week, the mice were weighed and blood samples were collected from
the tail in 12-h fasted mice to measure glucose concentration using
Glucose RTU (BioMérieux, France). The mice were placed in metabolic cages to collect 24-h urine, and urinary albumin excretion was
determined with a specific ELISA (Bethyl). Renal function, histology,
and glomerular protein extraction were performed 20 wk later. Serum
fructosamine, an index of glucose exposure, was dosed by a colorimetric method based on the reduction of nitrotetrazolium blue by
ketoamines. All procedures involving experimental animals were
approved by the French Accreditation of Laboratory Animal Care and
performed in accordance with the guiding principles for animal
research.
Renal function studies. For surgical procedures, mice were anesthetized with an intraperitoneal injection of 30 mg/kg of Etomidate
Lipuro (Braun Medical). After tracheotomy, the left jugular vein was
cannulated to perfuse inulin, and the left femoral artery was cannulated to monitor arterial blood pressure and to obtain blood samples.
Urine was collected through an intravesical catheter. After surgery,
mice were allowed to recover for 30 min. Renal function was
evaluated for a 60-min clearance period. Glomerular filtration rate
(GFR) was assessed by inulin clearance and expressed per gram of
kidney weight. At the end of the study, a catheter was introduced into
the abdominal aorta. The left kidney was excised and weighed. The
right kidney was washed with 10 ml of PBS, fixed by an infusion of
10 ml of 10% formalin (pH 7.40), removed, and stored in formalin.
Glomerular histology and morphology. Formalin-fixed right kidneys were embedded in methyl methacrylate. Sections of 3-␮m
thickness were stained with periodic acid Schiff (PAS). Pictures were
captured using a digital camera Nikon D1 (Nikon, Japan) connected to
a light microscope. For each animal, pictures from 50 randomly
chosen glomeruli were taken at magnification ⫻400 and analyzed
using Photoshop software (Adobe System, San Jose, CA) and a public
domain NIH Image program (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/).
Briefly, the total cortical area was examined. A total of 50 glomerular
images were randomly recorded by moving the slide from the outer to
the inner cortex to obtain noncrossing sample fields. Images were
processed using Photoshop software. Glomerular tufts (including all
the cellular and interstitial components of the glomerulus, including
podocytes and capillaries) were encircled, and the enclosed area was
copied to create a new picture (5). The number of pixels (independent
of their individual density) of this picture gave the surface area density
of the tuft. According to DeHoff’s equation for the measurement of
spheroids of differing size, the harmonic mean of glomerular areas
(Svm) was used to calculate the mean glomerular volume (GlmVm)
for each animal, using the formula GlmVm ⫽ 4/3(Svm)(3/2). From
the glomerular picture, the entire amount of PAS-positive material,
except for the peripheral basement membranes, was selected automatically using the properties of color recognition of the software and was
manually completed by the inclusion of nuclei. The number of pixels
in this area was considered to represent the mesangial area (i.e.,
mesangial cells and extracellular matrix areas) and was expressed as
a fraction of the tuft surface area (5).
Glomerular isolation by magnetic sorting. Colloidal iron oxide
suspension was prepared as described by Cook and Pickering (9) for
rabbits and modified in our laboratory. Briefly, mice from the different
experimental groups described above were anesthetized by intraperitoneal injection of 150 mg/kg Inactin. Ten milliliters of colloidal iron
oxide suspension were injected through the abdominal aorta following
a 10-ml PBS rinse. Kidneys were removed, and renal cortex was
sliced and pressed through a 125-␮m2 graded sieve. The glomeruli
were then magnetized and washed three times in PBS to obtain a 93%
purity suspension. Proteins were extracted using a lysis buffer [10%
glycerol, 20 mM Tris, 140 mM NaCl, 10 mM sodium pyrophosphate,
10 mM sodium fluoride, 2 mM sodium orthovanadate, 3 mM EDTA,
10 ␮g/ml aprotinin, 1.5 ␮M benzamidine, 50 ␮M PMSF, 10 ␮g/ml
leupeptin, 1% phosphatase inhibitor cocktail 2 (Sigma), and 1%
Triton X-100] added to the last sediment of glomeruli. All procedures
were performed at 4°C. The suspension of glomeruli was sonicated for
1 min and centrifuged (15,000 rpm for 45 min at 4°C). The supernatant was stored at ⫺80°C until Western blot analysis was performed.
Protein concentration was determined using a colorimetric method
(Bio-Rad DC protein assay).
Western blot analysis. Proteins (20 –25 ␮g) were separated by
electrophoresis in polyacrylamide gels (NuPage 4 –12% Bis-Tris precast gels; Invitrogen) and electrophoretically transferred to nitrocellulose membranes (Hybond-ECL; Amersham). After 1-h incubation at
room temperature in Tris-buffered saline, 5% milk, or 1% milk plus
1% BSA and 0.05% Tween-20, the blots were exposed to antibodies
recognizing either insulin-like growth factor-1 receptor (IGF-1R␤),
insulin receptor substrate-1 (IRS-1), ERK1/2, phospho-ERK1/2, AGE
receptor (RAGE), TGF-␤ type II receptor (TGF-␤RII), B2R, and
4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE) for 1 night at 4°C. The primary antibodies were revealed using the corresponding rabbit or donkey peroxidase-conjugated secondary antibodies for 1 h at room temperature.
Peroxidase activity was detected using a chemiluminescence substrate
(Super Signal West Pico chemiluminescence substrate; Pierce) and
Kodak Biomax Light film. Primary and secondary antibodies were all
purchased from Santa Cruz Biotechnology, except for anti-RAGE
(Chemicon International), anti-B2R (BD Transduction Laboratory),
and anti-␤-actin (Sigma).
Statistical analysis. Since the number of animals did not always
allow us to assume a Gaussian distribution, comparisons among
experimental groups were performed using the nonparametric
Kruskal-Wallis test. When this test indicated a significant difference,
a post hoc test (Dunn’s multiple comparison test) was performed
using GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software). P ⬍ 0.05 was
considered statistically significant.
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RESULTS
Efficiency of B2R blockade in vivo. The first step was to
determine the time course of HOE-140 administration that
allowed in vivo blockade of B2 receptors. The efficiency of
this treatment with the B2R antagonist was studied by blood
pressure responsiveness to an intravenous bolus of BK (2 ⫻
10⫺5 M, 100 ␮l). In db/db mice treated with HOE-140 alone at
the dose of 250 ␮g䡠kg⫺1 䡠48 h⫺1 for 1 wk, the hypotensive
response to BK was almost completely blunted (Fig. 1). The
maximum decrease of mean arterial blood pressure (MABP)
following the bolus of BK was 36.0 ⫾ 13.4 mmHg (n ⫽ 6) for
control db/db mice and 13.3 ⫾ 7.0 mmHg for db/db mice
treated with HOE-140 (n ⫽ 5, P ⬍ 0.05). In HOE-treated mice,
BK induced a transient hypertensive effect that may result from
the consequences of prolonged B2R blockade of vasoconstrictor tone.
General characteristics. The characteristics of the five groups
of mice at the end of the experimental period are presented in
Table 1. The body and kidneys of db/db mice were significantly heavier (P ⬍ 0.05) than those of db/m mice. All the
db/db mice showed substantial hyperglycemia (P ⬍ 0.001) and
a significant increase in the fructosamine level (P ⬍ 0.05)
compared with db/m mice. Treatment with ACEi had no effect
on the increases in body and kidney weight or on blood glucose
and fructosamine levels at the end of the experimental period.
MABP in db/db mice was significantly (P ⬍ 0.05) decreased
compared with nondiabetic db/m mice, MABP was slightly but
significantly (P ⬍ 0.05) lower in ACEi-treated mice than in
untreated diabetic mice. This effect of ACEi was completely
reversed in the presence of HOE-140.
Urinary albumin excretion. As shown in Fig. 2A, urinary
albumin excretion at the end of the study was significantly
higher in db/db mice than in db/m mice. ACEi treatment
Fig. 1. Effect of B2-kinin receptor (B2R) blockade by HOE-140 on the acute
hypotensive effect of bradykinin (BK). Db/db mice were treated with a
subcutaneous injection of HOE-140 (250 ␮g 䡠 kg⫺1 䡠 48 h⫺1), mean arterial
blood pressure was measured 48 h after the last injection with HOE-40.
Control db/db mice (n ⫽ 6) and db/db mice treated by HOE-140 (n ⫽ 5)
received an intravenous bolus of 100 ␮l of saline followed by 2 boluses of BK
(2 ⫻ 10⫺5 M, 100 ␮l), and mean arterial blood pressure was measured
intrafemorally.
F1251
prevented this increase, and coadministration of HOE-140
blunted the benefit of ACEi on urinary albumin excretion.
Unexpectedly, db/db mice that received HOE-140 alone exhibited a significant increase in urinary albumin excretion
compared with untreated db/db mice.
Glomerular filtration. In diabetic db/db untreated mice, GFR
was significantly (P ⬍ 0.05) lower than in the nondiabetic
db/m mice (Fig. 2B). GFR was not significantly different
among the three groups of db/db mice despite a tendency to be
slightly higher in ACEi ⫹HOE-140-treated mice.
Glomerular histology and morphology. As illustrated in Fig. 3,
all db/db mice presented a significant increase in glomerular
volume (P ⬍ 0.001) compared with the nondiabetic db/m mice.
Treatment with ACEi, the B2R antagonist alone, or both drugs
failed to induce any significant changes in glomerular volume.
Glomerulosclerosis was assessed by the determination of mesangial volume. In db/db control mice, mesangial volume was
significantly higher (P ⬍ 0.05) than in the nondiabetic db/m
mice. Interestingly, treatment with ACEi significantly prevented (P ⬍ 0.05) this increase in mesangial volume, leading
to a volume similar to that of the nondiabetic mice. Concomitant treatment with HOE-140 abolished (P ⬍ 0.01) the effect
of ACEi treatment, whereas HOE-140 alone had no significant
effect on mesangial expansion.
Glomerular protein expression. The B2R was spontaneously
expressed in the glomeruli of both db/m and db/db mice (Fig. 4A).
Although the statistical difference was not significant, B2R
tended to increase in diabetic mice and remained closer to that
of the db/m group in the glomeruli of animals treated with
ACEi alone or with HOE-140 (Fig. 4A). Glomerular protein
expression of IGF-1R␤, IRS-1, RAGE, and TGF-␤RII were
increased in diabetic db/db mice compared with nondiabetic
db/m mice (Fig. 4, B, C, E, and F). Treatment with ACEi
reduced overexpression of all these signaling proteins, particularly for TGF-␤RII. The changes associated with ACEi treatment on IGF-1R␤ expression were attenuated by coadministration of HOE-140. Although diabetes had no significant
impact on total ERK1/2 glomerular expression, activated forms
of these MAP kinases, assessed by the expression of their
tyrosine phosphorylated forms, were strongly increased in
diabetes (Fig. 4D). The band corresponding in particular to
phospho-ERK1 was reduced when db/db mice were treated
with ACEi alone or in combination with HOE-140. Figure 4G
shows glomerular expression of 4-HNE adducts, an index of
protein peroxidation. Formation of 4-HNE occurs endogenously during lipid peroxidation of polyunsaturated fatty
acids that can act as a “toxic second mediator” exhibiting a
wide range of biological activities. Compared with the pattern
observed in db/m mice, 4-HNE-protein conjugates were significantly increased in db/db C mice, showing major bands at
250, 100, 75, 70, and 45 kDa. In the diabetic ACEi-treated
group, the 4-HNE-protein profile was noticeably modified,
especially the 100- and 70-kDa bands. These bands were
suppressed, exhibiting a pattern very close to that of nondiabetic db/m mice, except for a more pronounced accumulation
of 4-HNE on the same proteins. Interestingly, this restoration
of a near-normal glomerular pattern of 4-HNE-protein conjugates was partly prevented when HOE-140 was coadministered
with ACEi, thus going back to a profile close to that of diabetic
mice untreated or treated with HOE-140 alone (not shown).
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F1252
Table 1. Characteristics of experimental groups of mice
Body weight, g
Kidney weight, mg
Blood glucose, g/l
Fructosamine, ␮mol/l
Blood pressure, mmHg
db/m C
db/db C
db/db ACEi
db/db ACEi⫹HOE
db/db HOE
29.1⫾1.5
305⫾21
2.05⫾0.11
211⫾8
89.9⫾3.3
39.0⫾2.9a
401⫾26a
9.64⫾0.83c
280⫾16b
78.0⫾2.0b
37.7⫾3.8a
389⫾8a
8.55⫾0.71c
306⫾24b
64.8⫾2.9c,d
41.9⫾2.1b
412⫾16b
8.10⫾0.44c
279⫾15b
78.8⫾3.4a,e
50.8⫾3.6b
416⫾20b
7.69⫾0.62b
282⫾12b
74.7⫾2.6b
Values are means ⫾ SE. db/m C, nondiabetic control db/m mice; db/db C, diabetic control mice; db/db ACEi, diabetic db/db mice treated with
angiotensin-converting enzyme inhibitors; db/db ACEi⫹HOE, diabetic db/db mice treated with ACEi and B2R antagonist HOE-140; db/db HOE, diabetic db/db
mice treated with HOE-140 alone. a P ⬍ 0.05; b P ⬍ 0.01; c P ⬍ 0.001 vs. db/m C. d P ⬍ 0.05 vs. db/db C. e P ⬍ 0.05 vs. db/db ACEi. When results were not
significant for any comparison, no symbol was added.
DISCUSSION
Until now, the most efficient approach delaying the progression of DN relied on the blockade of the renin angiotensin
system, particularly with ACE inhibitors. This pharmacological strategy is multifaceted, since it includes control of blood
pressure, decrease in proteinuria, inhibition of fibrosing cytokines, vasopeptidase inhibition, and oxidative stress modulation. Which of these events occurs first and is the most
important remains an unanswered question. It also creates a
space for optimization of the therapeutic approach of blocking
or even reversing diabetic nephropathy. The dual action of
ACEi, namely, angiotensin II synthesis inhibition and BK
Fig. 2. Urinary albumin excretion (mg albumin/g creatinine; A) and glomerular filtration rate (GFR; ␮l 䡠 min⫺1 䡠 g kidney⫺1; B) measured in nondiabetic
control db/m mice (dbm C; n ⫽ 12), diabetic control mice (dbdb C; n ⫽ 8),
diabetic db/db mice treated with angiotensin-converting enzyme inhibitors
(dbdb ACEi; n ⫽ 9), diabetic db/db mice treated with ACEi and B2R
antagonist HOE-140 (dbdb ACEi/HOE; n ⫽ 12), and diabetic db/db mice
treated with HOE-140 alone (dbdb HOE; n ⫽ 8). Values are means ⫾ SE.
*P ⬍ 0.05; **P ⬍ 0.01 (pairwise comparison of the groups).
degradation prevention, already leads to unanswered questions
about the mechanism(s) of their renal protective effect. As
recently reviewed (11, 14), BK by itself exerts some renal
protective effects that involve activation of the type 2 receptor
(B2R). Two of the most convincing arguments are that 1) B2R
knockout in mice is associated with the worsening of renal
lesions in various models of nephropathy, including DN (23,
33), and 2) direct B2R activation using kinin infusion prevents
renal inflammation and glomerulosclerosis via inhibition of
oxidative stress in Dahl salt-sensitive rat (7). In a recent study
(2), we observed that the blockade of the B2R in a model of
STZ-induced diabetes in rats blunted the beneficial effects of
ACEi treatment on urinary albumin excretion. However, another recent publication (40) provides a contradictory conclusion regarding the protective action of B2R activation in
diabetes, thus reopening the debate on this critical point. In this
study, B2R⫺/⫺ knockout mice were protected against the
increase in urinary albumin excretion and glomerular lesions
resulting from STZ-induced diabetes. This discrepancy could
be explained by the fact that, compared with B2R⫹/⫹ animals,
B2R⫺/⫺ mice also exhibit spontaneous upregulation of the
B1R (15) that was even reinforced by diabetes. This is the
reason why we chose the pharmacological blockade of the B2R
rather than its genetic knockout model. Furthermore, we focused on the renal effects of direct inhibition of the B2R in
db/db mice, a model of spontaneous type 2 diabetes that
exhibits delayed glomerulosclerosis far closer to the human
disease than the rapidly evolving nephropathy observed in the
acutely catabolic STZ-induced type 1 diabetes. Finally, in the
report by Tan et al. (40), the lack of the B2R during diabetes
was rather protective. Such a result is in contradiction with
those of Smithies’s group and many others (7, 22, 23, 27) and
with the present study, in which blockade of the B2R induced
some deleterious effects such as increased albuminuria. However, when the B2R was recruited by ACEi treatment, it then
led to a marked protective effect against glomerulosclerosis.
This suggests that there is a tonic and protective activation of
the B2R in DN that is significantly enhanced by ACEi-treatment. Tan et al. were not able to study this effect, since their
mice did not express the B2R. The concomitant involvement of
the B1R cannot be ruled out even if its role in DN remains
uncertain. Expression of the B1R has been reported to be
increased in various tissues of diabetic models but has not yet
been reported in db/db mice. A recent study (1) investigated
the expression of the B1R in ob/ob obese diabetic mice, a
model close to the db/db model. Although the expression of the
B1R in the kidney was not shown, the overall expression of the
B1R in other tissues was much weaker than that of the B2R,
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Fig. 3. Pathological changes in the kidneys of the experimental groups. A: representative photomicrographs (magnification ⫻400) of periodic acid Schiff
(PAS)-stained kidney sections. The glomeruli of db/db mice treated with HOE are not shown, since they were similar to those of control db/db mice.
B: quantitative analysis of the histomorphological parameters mean glomerular volume (B1) and relative mesangial volume (B2) measured in dbm C (n ⫽ 6),
dbdb C (n ⫽ 6), dbdb ACEi (n ⫽ 6), dbdb ACEi/HOE (n ⫽ 60), and dbdb HOE (n ⫽ 6). Values are means ⫾ SE. ns, Nonsignificant. *P ⬍ 0.05; **P ⬍ 0.01;
***P ⬍ 0.001 (pairwise comparison of the groups).
which is consistent with some of our preliminary results
(Buléon M, personnel communication; not shown). However,
because B2R blockade demonstrated very significant effects
compared with those of ACEi, we focused in this study on the
role of the B2R only.
The reduction of glomerulosclerosis by ACEi has been well
demonstrated by several independent groups (4, 37). However,
until now, most of the conclusions suggested that ACEi acts
via suppression of angiotensin II generation, tending to disprove any noticeable role for BK. Using a model of STZinduced diabetes in rats, Allen et al. (3) showed that HOE-140
treatment had no effect on albuminuria or glomerulosclerosis
in ACEi -treated animals. In contrast, we found that direct B2R
blockade severely reduced the protective effect of ACEi on
morphological renal changes, which strongly supports the
critical involvement of the BK pathway. One difference could
well be reduced intrarenal ACE activity associated with high
ACE2 expression in db/db mice (45). Another possible difference is that B2R glomerular expression tends to increase in
db/db mice (Fig. 4), leading to an increased sensitivity to BK.
ACEi exert important systemic and renal hemodynamic effects. The decrease in systemic blood pressure (Table 1), which
is believed to partly mediate the renal protective effect of ACEi
(10), is completely prevented by concomitant HOE-140 treatment in our model. A critical difference between the db/db
model and human type 2 diabetes is that the former develops a
decrease in blood pressure, whereas the latter is commonly
associated with hypertension. The low blood pressure observed
in db/db mice could be explained by the low ACE activity and
increased ACE2 expression (45). Such a pattern results in low
angiotensin II availability, possibly associated with angiotensin
1–7 generation and thereby with B2R activation (35, 41).
Although this increased sensitivity of db/db mice to BK has not
been investigated per se, this point is consistent with 1) the
lower MABP of db/db mice, 2) the correction of the ACEi
hypotensive effect by HOE, and 3) the effect of HOE alone,
especially on microalbuminuria. This difference could explain
the prominent impact of BK during ACEi treatment in our
model, whereas the role of angiotensin II in its human counterpart is probably more prominent.
Another difference between humans and db/db mice is the
apparent lack of improvement of the GFR in anesthetized
animals under the influence of ACEi. It is likely that the
hypersensitivity of db/db mice to BK accounts for such a
result, comparable in a way to the temporary worsening of
chronic renal failure in some patients after the introduction of
ACEi (19).
Our study provides more information regarding the mechanisms of the renoprotective effect of B2R activation during
ACEi treatment. In addition to its beneficial effect on the
diabetic kidney structure, certain critical signaling pathways
involved in the pathophysiology of DN are also affected. On
the basis of previous results (2, 6, 26, 27, 36), B2R activation
could contribute to the reduction of growth factor/cytokine
glomerular pathways recruitment and a reduction of oxidative
stress indexes. It is beyond the scope of this report to review
the involvement of these numerous factors in the pathogenesis
of DN. On the basis of a previous study (2), we chose to focus
on IGF-1, TGF-␤, and RAGE pathways, whose contributions
to DN appear to be modulated by B2R activation. The role of
the renal IGF-1 pathway during the early phase of DN has been
suggested (16, 21, 39). More recently, TGF-␤ has emerged as
a major deleterious cytokine that largely contributes to the
progression of DN, since long-term prevention of mesangial
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Fig. 4. A–G, left: representative Western blots of glomerular protein expression of B2R (A), ␤-subunit of insulin-like growth factor-1 receptor (IGF-1R␤; B),
and insulin receptor substrate-1 (IRS-1; C), MAP kinases ERK1 and ERK2 and tyrosine-phosphorylated forms pERK1 and ERK2 (D), transforming growth
factor-␤ type II receptor (TGF-␤RII; E), AGE receptor (RAGE; F), and 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE; G). A–F, right: densitometric analysis of glomerular
protein expression of B2R (A), IFG-1R␤ (B), IRS-1 (C), pERK (D), TGF-␤RII (E), and RAGE (F). Values are factored to the total form of ERK for pERK and
to ␤-actin expression for B2R, IGF-1R␤, IRS-1, TGF-␤RII, and RAGE. The ratio of control db/m group was used as 100% value. Results are means ⫾ SE of
at least 5 separate experiments. *P ⬍ 0.05; **P ⬍ 0.01 compared with db/m mice. †P ⬍ 0.05; ††P ⬍ 0.01 for the indicated comparison. Group identification
is similar to that of Fig. 3.
matrix expansion and renal insufficiency can be achieved by
the administration of a monoclonal anti-TGF-␤ antibody in
db/db diabetic mice (46). Not surprisingly, protein glomerular
expression of IGF-1R␤, IRS-1, and TGF-␤RII as well as
ERK1/2 activation were significantly increased in untreated
diabetic mice. ACEi treatment partly prevented the increase in
TGF-␤RII, IGF-1R␤, and the activation of ERK1/2 MAP
kinases. The decrease in IRS-1 overexpression could result not
only from a decreased recruitment of IGF-1 pathway but also
from the improvement of insulin sensitivity. In this respect, it
is well documented that ACEi improve insulin resistance (11,
17, 25, 30, 31, 36, 37). As expected, ACEi-treated mice
showed a reduced expression of both IGF-1R␤ and IRS-1.
Furthermore, cotreatment with HOE-140 blunted the beneficial
effect of ACEi treatment regarding IGF-1 receptor expression.
Oxidative stress is a major contributor to the development of
DN. Among the mechanisms that induce an increase in cellular
oxidative stress, the involvement of AGE/RAGE pathway
plays a pivotal role in diabetes, since it is highly stimulated
(32). RAGE-overexpressing mice are partly protected against
DN (44), but conversely, the administration of anti-RAGE
antibodies was able to prevent upregulation of the TGF-␤
pathway and to attenuate DN (13). It has been shown in vitro
that ACEi stimulate the expression of soluble RAGE and
thereby prevent AGE accumulation in experimental diabetes
(17, 18). In our work, ACEi treatment largely prevented the
upregulation of RAGE glomerular expression, an effect that
appears to be independent of B2 receptor activation. However,
AGE/RAGE is not the only pathway involved in increase
oxidative stress in diabetes. Since one of the final effects of
oxidation can be biochemical modification of proteins, we
chose to focus on the glomerular accumulation of HNE-protein
complexes that reflect lipid peroxidation. HNE-protein complexes are relatively stable molecules that can pass among
subcellular compartments (42) and have the capacity to interact
with many cell proteins and thereby impair their functions. It is
now widely recognized that 4-HNE adducts are major cytotoxic products playing a role in the progression of atherogenesis (24), ischemic acute renal failure (28), and human diabetic
nephropathy (38). Therefore, controlling 4-HNE adduct accumulation could contribute to renal protection in diabetes. Our
results indicate that in the db/db model as well, 4-HNE adducts
were increased at the glomerular level. Most of these changes
were prevented by ACEi treatment. This benefit was mostly
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dependent on B2R activation, since the 4-HNE profile almost
returned to that of diabetic untreated mice when HOE-140 was
coadministered with ACEi. This strongly suggests that BK
contributes to protecting against cellular oxidative stress in
diabetes, an observation that fits with previous studies by
ourselves and others (2, 6, 23). Further investigation into the
mechanisms of BK-mediated reduction of oxidative stress in
diabetes is needed.
In conclusion, ACEi (i.e., ramipril) are able to attenuate the
development of diabetic nephropathy in this model of spontaneous type 2 diabetes in mice and are associated with a
beneficial impact on several critical glomerular signaling pathways such as those involving IGF-1, TGF-␤, and RAGE but
also oxidative stress. This effect is partly mediated by B2R
activation. Through in vivo B2R blockade, the present study
finally provide a critical but not exclusive contradiction to the
common belief that ACEi renal protective effect is mostly
mediated by their ability to decrease angiotensin II production.
This now provides the rationale to examine whether B2R
activation by itself could represent a new and complementary
therapeutic approach for diabetic nephropathy.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank Jerini Laboratories for the generous gift of ramipril and HOE-140.
GRANTS
Marie Buléon was supported by a Ministère Recherche et Technologies
grant. This work was also supported by funds from the Institut National de la
Santé et de la Recherche Médicale.
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Travail en cours
Effets néphroprotecteurs de l’Irbésartan au cours du diabète expérimental
de type II : rôle du récepteur B2 de la bradykinine
En collaboration avec Acil Jaafar pendant son Master 2 (2006-2007)
78
INTRODUCTION
Les interactions existant entre le métabolisme des kinines et l’enzyme de conversion ont
généré un grand nombre de travaux afin de préciser le rôle de l’activation des récepteurs de la
bradykinine, tant le récepteur B1 que le récepteur B2, lors d’un traitement par un inhibiteur de
l’enzyme de conversion. Il a été suggéré que certains effets secondaires délétères tels que la
toux et le micro-angiodèmes soient associés à la potentialisation des effets des kinines. Afin
de limiter les effets bradykinine-dépendants, le développement d’antagonistes du récepteur
AT1 de l’angiotensine a été entrepris. Si pendant de nombreuses années on a pensé que les
mécanismes d’actions des IEC et des antagonistes du récepteur AT1 étaient différents, des
travaux récents (REFERENCES) indiquent que ces mécanismes reposent sur l’activation de
voies de signalisation assez redondantes qui peuvent impliquer l’activation du RB2 de la
bradykinine. Nous avons donc étudié l’effet néphroprotecteur potentiel d’un antagoniste du
récepteur AT1 de l’angiotensine II (ARA2) au cours de la néphropathie diabétique chez la
souris db/db, ainsi que la le rôle éventuel du RB2 dans ces effets.
MATERIEL et METHODES
Les souris C57 BLKs db/db ont été séparées en 4 groupes : 1) contrôle (dbC), 2) traité (10
semaines) par l’Irbésartan 4 mg/kg incorporé dans l’alimentation (dbLI), 3) traité (10
semaines) par l’Irbésartan 10 mg/kg incorporé dans l’alimentation (dbHI), cette dose de 10
mg, 4) traité (10 semaines) par Irbésartan 10 mg/kg et un antagoniste du récepteur B2 de la
bradykinine HOE-140 (Icatibant, Aventis Pharma Deutshland) 250 µg/kg, en injections souscutanées, 3 fois par semaine (dbHI+HOE). Les souris hétérozygotes db/m ont été utilisées
comme contrôles non diabétiques (mC).
79
La glycémie et la microalbuminurie ont été mesurées régulièrement pendant la durée du
traitement. A l’issue du traitement, des explorations fonctionnelles rénales ont été réalisées
chez la souris anesthésiée. La glomérulosclérose a été évaluée par une analyse
histomorphométrique. Les techniques utilisées dans ce travail ont été décrites pour le
protocole précédent (Buleon M et al, Pharmacological blockade of B2-kinin receptor reduces renal
protective effect of Angiotensin-Converting Enzyme Inhibition in db/db mice model. Am J Physiol Renal
Physiol. 2008 Mar 26)
RESULTATS
Equilibre glycémique
Les souris db/db présentent une hyperglycémie très importante (7,9 ± 0,3 g/L pour les db/db
non traitées versus 1,7 ± 0,1 g/L pour les db/m). Les différents traitements n’ont pas d’effet
significatif sur l’équilibre glycémique.
Alb/Creat urine (µg/mg)
Microalbuminurie
3000
†
††
†
2000
†
1000
E
I+
H
O
I
db
H
db
H
db
LI
db
C
m
C
0
L’excrétion urinaire d’albumine est augmentée chez les souris db/db (1390 ± 204 µg/mg de
créatinine pour les db/db, versus 452 ± 55 µg/mg de créatinine pour les db/m), mais n’est pas
modifiée par les traitements.
80
Fonction rénale
La pression sanguine artérielle n’est pas significativement différente entre les groupes.
*
1000
†
†
200
†
100
DPR (µl/min/65cm2)
**
750
†††
500
250
H
I+
H
O
E
H
I
db
/d
b
db
/d
b
C
LI
db
/d
b
db
/d
b
H
I+
H
O
E
H
I
db
/d
b
db
/d
b
C
LI
db
/d
b
db
/d
b
C
db
/m
C
0
0
db
/m
DFG (µl/min/65cm2)
300
Le Débit de Filtration Glomérulaire (DFG) et le Débit Plasmatique Rénal (DPR) sont
diminués chez les souris db/db par rapport aux souris db/m. Le traitement par la faible dose
d’Irbésartan n’a pas d’effet sur ces deux paramètres, par contre, la forte dose d’Irbésartan a
provoqué une réduction encore plus marquée du DFG et du DPR. Cet effet de l’Irbésartan à
forte dose semble atténué par le blocage du RB2 mais ce résultat n’est pas significatif.
81
3.0
0.6
Poids des reins (g)
†
†
††
2.5
†
2.0
1.5
1.0
††
0.4
0.2
O
E
H
I
I+
H
/d
b
db
db
/d
/d
b
H
db
/d
b
LI
C
db
b
db
/d
db
/m
C
I+
H
O
E
b
H
db
/d
b
/d
b
H
I
LI
C
db
C
/m
db
*
40
*
*
Aire mésangiale (%)
†††
†††
†††
0.0
db
/d
b
Volume glomérulaire (106 µm3)
Etude histo-morphométrique
†††
†††
35
††
†
30
25
db
/d
b
H
I+
H
O
E
H
I
db
/d
b
LI
db
/d
b
C
db
/d
b
db
/m
C
20
Les souris db/db non traitées présentent une hypertrophie rénale et glomérulaire, ainsi qu’une
augmentation de l’aire mésangiale relative par rapport aux souris non diabétiques db/m. Ces
animaux ont donc développé une glomérulosclérose.
L’Irbésartan ne modifie ni le poids des reins, ni le volume glomérulaire, mais permet de
réduire l’aire mésangiale relative, aux deux doses testées. Cet effet sur l’aire mésangiale est
supprimé par l’antagoniste du RB2.
82
CONCLUSION / DISCUSSION
L’Irbésartan n’a pas permis de réduire la microalbuminurie, ni d’améliorer le DFG dans notre
modèle. Cependant, ce traitement exerce un effet protecteur contre le développement de la
glomérulosclérose en réduisant l’aire mésangiale relative. Cet effet semble dépendant du RB2
puisqu’il est supprimé par le blocage de ce récepteur. De plus, ce bénéfice structural a été
observé même à la dose la plus faible utilisée (4 mg/kg), dose qui n’a pas d’effet
hémodynamique, cette observation suggère que les effets néphroprotecteurs de l’Irbésartan
sur la glomérulosclérose sont indépendants de leur effet hémodynamique.
83
Partie III : choc endotoxinique et système kallicréine-kinine
PARTIE III – CHOC ENDOTOXINIQUE ET
SYSTEME KALLICREINE-KININE
Le choc septique est une réaction inflammatoire majeure en réponse à une infection
bactérienne. Il s’accompagne d’une hypotension sévère dont l’impact met en jeu des
dysfonctionnements d’organes vitaux. Le dysfonctionnement rénal est un des plus précoces et
celui pour lequel la valeur pronostique est la plus mauvaise. L’association d’un choc septique et
d’une défaillance rénale aiguë augmente considérablement la mortalité des patients.
I.
COMPRENDRE POUR AMELIORER LE PRONOSTIC
I.1.
EPIDEMIOLOGIE
Malgré les progrès des antibiothérapies et des techniques de soins intensifs, le choc
septique reste une pathologique fréquente et associée à un fort taux de mortalité (environ 50
%). Le choc septique représente 8.2 % des admissions dans les services de réanimation en
France avec un risque de mortalité multiplié par 3,9 par rapport aux autres causes d’admission
en réanimation. [365, 366].
Aux Etats-Unis, on compte entre 50 et 95 cas de choc septique pour 100 000 habitants
chaque année [367]. Ce chiffre augmente de 9% par an, ce phénomène étant expliqué par
l’augmentation de l’utilisation de techniques invasives, des médicaments immunodépresseurs,
84
de la chimiothérapie et de la transplantation, l’émergence du virus HIV et l’augmentation de
résistances microbiennes. Dans ce pays le choc septique représente un coût annuel de 17
milliards de dollars [367].
La mortalité du choc septique est d’environ 50 %, et augmente considérablement (70
% à 80 %) lorsque celui-ci est associé à une défaillance rénale. La fréquence et la gravité du
choc septique en font donc un problème majeur de santé publique qui justifie les efforts de
recherche physiopathologique importants mis en oeuvre.
I.2.
MECANISMES GENERAUX
Le sepsis se définit comme un syndrome de réponse inflammatoire systémique
résultant de l'action d’agents infectieux. Ceux-ci vont entraîner des troubles de la
microcirculation caractérisés par une vasodilatation artérielle et veineuse et une augmentation
de la perméabilité plasmatique (lésions de l’endothélium). On parle de sepsis grave lorsque le
syndrome de réponse inflammatoire systémique est associé à une anomalie de perfusion
tissulaire [368]. Ce trouble de la distribution sanguine dans les tissus et les organes
s’accompagne d’une perturbation des échanges gazeux provoquant une hypoxie cellulaire, et
peut aboutir à un dysfonctionnement d’organes. Un sepsis grave peut évoluer vers une
défaillance circulatoire aiguë : le choc septique, caractérisé par une hypotension sévère et
persistante malgré une correction volémique adéquate. Cette hypotension est associée à une
hypovolémie par fuite de liquide plasmatique. Le choc septique est responsable de désordres
hémodynamiques, métaboliques et viscéraux.
Cette cascade d'événements peut être initiée aussi bien par des bactéries à Gram positif
ou des éléments fungiques que par les endotoxines (par exemple le lipopolysaccharide ou
LPS) libérées par les bactéries à Gram négatif. Le LPS est un des composants majeurs de la
85
membrane externe de la paroi des bactéries à Gram négatif, libéré lors de la lyse bactérienne.
Ces agents infectieux vont provoquer l’activation de cascades d’évènements impliquant des
cellules immunitaires, la sécrétion de cytokines (TNF, interleukine-1), la sécrétion de
prostaglandines et de NO et l’activation de cascades humorales. Le sepsis est associé à la
migration de leucocytes activés depuis la circulation sanguine jusqu’aux tissus
inflammatoires, mais aussi à une production accrue de leucocytes par la moelle osseuse [369].
Les leucocytes libèrent de nombreuses protéases essentielles pour lutter contre l’infection
[365].
Les cytokines pro-inflammatoires, dont les plus importantes semblent être le TNFα et
l’interleukine-1 sont libérées en grande quantité au cours du sepsis [370]. L’induction de
l’expression de ces cytokines est régulée par le facteur de transcription NFκB [371]. Ces
cytokines contribuent à la synthèse d’eicosanoïdes (prostaglandines et leucotriènes) et de
Platelet-Activating Factor (PAF), qui en plus de leur effet inflammatoire, diminuent le tonus
vasculaire et augmentent le flux sanguin et la perméabilité vasculaire.
La libération massive du monoxyde d’azote (NO) par la NO-synthase inductible
(NOSi) joue probablement un rôle essentiel dans la physiopathologie du sepsis [372, 373]. La
NOSi est synthétisée en réponse à différents médiateurs inflammatoires en particulier le
TNFα, l'interféron-γ et l'interleukine-1β. La production de NO par la NOSi est plus massive et
prolongée que celle de la NOSe [374]. Le NO exerce un effet vasodilatateur puissant qui
provoque une hyporéactivité aux agents vasoconstricteurs, entraînant donc une hypotension
majeure [375-377]. Le NO produit par la NOSi participe aux atteintes micro-vasculaires et
tissulaires du choc septique [372, 378, 379].
Des cytokines anti-inflammatoires (les interleukines-10, 4, 6 et 13, le TGFβ, et
l’interferon-γ, sont aussi sécrétées en grande quantité lors du sepsis [365]. Ces cytokines
86
contribuent à limiter la production de cytokines pro-inflammatoires et à atténuer l’amplitude
de la réponse inflammatoire du sepsis.
Au cours du choc septique, l’organisme met en place un ensemble de mécanismes
visant à maintenir la circulation artérielle : activation du système nerveux sympathique, du
système rénine-angiotensine-aldostérone, libération de vasopressine et augmentation du débit
cardiaque. Ces mécanismes sont essentiels pour tenter de maintenir une hémodynamique
systémique correcte ; cependant ils contribuent aussi au développement de la défaillance
rénale [380, 381].
La physiopathologie du sepsis est donc complexe et fait intervenir de nombreux
médiateurs. La compréhension des processus biologiques responsables du choc septique a
cependant permis d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles.
87
Figure 10 : Défaillance rénale au cours du sepsis [374]
I.3.
OPTIONS THERAPEUTIQUES ACTUELLES
Le traitement du choc septique repose d’une part sur le traitement de l’infection et
d’autre part sur la restauration d’un état hémodynamique satisfaisant. L’infection doit être
éradiquée le plus précocément possible, elle est traitée par une antibiothérapie associée à la
recherche d’un foyer infectieux pouvant nécessiter une élimination chirurgicale. Le traitement
de la défaillance cardio-circulatoire repose tout d’abord sur un remplissage vasculaire, pour
corriger l’hypovolémie et l’hypotension. La restauration d’une volémie efficace permet
d’augmenter le débit cardiaque, d’optimiser le transfert d’oxygène et d’améliorer la micro88
circulation. Le remplissage vasculaire peut être associé, s’il ne suffit pas à restaurer un état
hémodynamique satisfaisant, à l’utilisation de catécholamines afin de rétablir un tonus
vasomoteur correct. L’administration de vasopressine peut également aider à maintenir une
pression artérielle satisfaisante [382, 383]. En plus de son effet vasoconstricteur propre, la
vasopressine inhibe la synthèse de NO en réduisant l’expression de la NOSi [384].
L’utilisation d’anticorps dirigés contre le LPS a été testé cliniquement, mais leur
efficacité n’a pas été démontrée [385-387]. D’autres stratégies ciblant le LPS ont été
envisagées. L’utilisation d’un peptide synthétique contenant un domaine de liaison au LPS et
une immunoglobuline a montré un effet protecteur dans un modèle de ponction coecale [388].
Un analogue synthétique du lipide A, composant du LPS, bloque les effets du LPS chez
l’Homme [389]. Les lipoprotéines HDL (High density lipoproteins) exercent un effet antiinflammatoire (en neutralisant le LPS et en inhibant l’expression des molécules d’adhésion et
la libération des cytokines pro-inflammatoires) et constituent donc un outil thérapeutique
potentiel [390]. Des anticorps anti-CD14 pourraient également exercer un effet protecteur en
inhibant la production de cytokines pro-inflammatoires, leur efficacité clinique reste à
démontrer [391].
Une seconde possibilité est de bloquer l’un des médiateurs de la cascade
inflammatoire. Parmi eux, le TNF est un médiateur crucial impliqué précocement au cours du
choc endotoxinique, ce qui en fait une cible thérapeutique attractive. Plusieurs stratégies ont
été utilisées pour bloquer l’activité du TNF, parmi elles, seule l’utilisation d’anticorps
neutralisants a montré une efficacité clinique [392-394]. Cependant, la réduction de la
mortalité par ce traitement était faible. De la même façon, l’inhibition de l’interleukine-1
permet une réduction peu importante de la mortalité [392].
89
Le NO étant également un médiateur essentiel au cours du sepsis, l’inhibition de la
NO-synthase comme outil thérapeutique a également été envisagée. Cependant l’inhibition
non sélective des NO-synthases provoque, en fait, une augmentation de la mortalité [395] car
les NO-synthases constitutives sont essentielles au maintien de l’hémodynamique
microcirculatoire. L’inhibition sélective de la NO-synthase inductible dont l’expression est
induite au cours du sepsis et l’activité restreinte aux tissus inflammatoires, serait plus
appropriée. Des souris invalidées pour la NO-synthase inductible ont été développées et leur
susceptibilité au sepsis a été étudiée [375, 396-398]. Ces travaux ont montré une réduction de
la sévérité du choc septique chez les animaux invalidés pour la NOSi, mais les résultats
semblent variables selon la souche de souris utilisée ainsi que le pathogène administré.
D’autres outils thérapeutiques potentiels (injection d’immunoglobulines, interféron-γ,
stimulation des macrophages, inhibition de la coagulation…) ont été testés sans montrer de
véritable efficacité clinique [392].
II.
QUELLE EST LA PLACE DU SYSTEME KALLICREINEKININE ?
En plus de la libération de nombreux médiateurs inflammatoires, les endotoxines
activent le système kallicréine-kinine stimulant ainsi la synthèse de kinines [399, 400]. Tous
les composants du SKK semblent en effet être fortement exprimés dans les tissus
inflammatoires. Les cytokines pro-inflammatoires augmentent la quantité de kininogène de
bas poids moléculaire [401], et la production de kallicréine tissulaire est induite en situation
d’inflammation [402]. Celle-ci est d’ailleurs sécrétée par les leucocytes [17, 403].
L’expression de la des-Arg9-BK, ligand endogène du RB1 est également augmentée au cours
du sepsis [404, 405].
90
Cette surexpression des éléments du SKK au cours des processus inflammatoires
suggère que le système occupe une place importante dans la physiopathologie du sepsis. En
fait, les kinines occupent une place particulièrement notable dans la physiopathologie du
sepsis quand le pathogène est une endotoxine [406].
II.1.
ROLE DU RECEPTEUR B1
Le récepteur B1 est un récepteur inductible, peu exprimé en situation physiologique.
Son expression est fortement induite au cours de l’inflammation, sous l’action du LPS et des
cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF et l’IL1β [19, 20]. Cette induction semble être
régulée par le facteur de transcription NFκB [371, 407]. L’expression du RB1 pourrait
également être induite par son propre agoniste, via la PKC et le NFκB [408]. Il parait en fait
exister une synergie entre le ligand du récepteur B1 (des-Arg9-BK), et l’interleukine-1β pour
augmenter l’expression du RB1 [409]. L’activation du RB2 peut également induire
l’expression du RB1 probablement via les cytokines et le NFκB [408, 409]. Cependant,
l’existence d’un tel mécanisme d’autorégulation entre le RB1 et le RB2 n’est pas admise de
façon consensuelle.
La forte induction de l’expression du RB1 dans les situations d’inflammation suggère
qu’il puisse jouer un rôle important au cours du choc septique. Ce récepteur semble en effet
impliqué dans la plupart des processus associés à l’évolution du sepsis. Une réponse
hypotensive médiée par le B1 a été montrée dans plusieurs modèles d’endotoxémie [18, 410].
Le RB1 est impliqué dans la vasodilatation, l’augmentation du flux sanguin [411] et
l’extravasation plasmatique [62, 412], mais également dans la composante cellulaire de la
réponse inflammatoire. En effet, le RB1 participerait au recrutement et à l’activation des
leucocytes [399, 412-414]. Le RB1 est exprimé à la surface des neutrophiles où il participerait
91
à la libération d’élastase et donc à l’augmentation de la perméabilité vasculaire [415]. Il est
également exprimé sur les lymphocytes T [416, 417] et participe à leur migration [416]. De
plus le RB1 intervient dans la libération de plusieurs interleukines, de peptides chemoattractants et de leucotriènes par les macrophages [418, 419] et les fibroblastes pulmonaires
[420].
Par contre, l’effet de l’inhibition pharmacologique du RB1 au cours du choc
endotoxinique reste mal évalué. McLean et al. ont montré qu’un antagoniste du RB1 réduisait
légèrement l’hypotension induite par le LPS chez le rat [421]. Chez le cochon d’Inde, Siebeck
et al. ont montré que le blocage du RB2 limitait la mortalité induite par le LPS, mais que le
blocage supplémentaire du RB1 supprimait cet effet bénéfique [422]. Dans ce travail, le
blocage du RB1 seul n’a pas été étudié. Peu de travaux ont été effectués sur le choc septique
dans le modèle d’invalidation génétique du RB1. L’équipe de JB Pesquero a observé que
l’administration de LPS chez des souris déficientes en RB2 induisait une hypotension moins
sévère que chez les souris sauvages [61, 125], ainsi qu’une accumulation moins massive de
leucocytes dans les tissus inflammatoires. La même équipe a observé que les souris invalidées
pour les 2 récepteurs étaient totalement protégées de l’hypotension induite par le LPS [125]
sans pour autant réduire la mortalité à 3h après l’administration de LPS. Nos résultats, chez la
souris invalidée pour le RB1, sont en contradiction avec ceux de Pesquero et al. En effet, nous
avons observé, dans ce modèle, une hypotension plus sévère et une mortalité plus importante
par rapport aux souris sauvages. Ainsi, l’activation du RB1 serait plutôt protectrice contre
l’hypotension précoce induite par le LPS. Ces résultats contradictoires pourraient être
expliqués par d’importantes différences dans les conditions expérimentales, le groupe de
Pesquero n’a mesuré l’hypotension que 35 min après une injection intraveineuse de LPS,
tandis que dans notre travail, le LPS a été administré par voie intrapéritonéale et la pression
artérielle mesurée 24h après. Cependant nos résultats sont cohérents avec le travail de Siebeck
92
et al [422], qui avaient montré que le blocage concomitant du RB1 annulait les effets
protecteurs du blocage du RB2. Ils avaient alors suggéré que l’induction de l’expression du
RB1 était un mécanisme de défense et que ce récepteur n’avait pas du tout le même rôle que
le RB2. De la même façon, le groupe de Smithies a montré que la double invalidation des
récepteurs de la bradykinine était délétère [124].
II.2.
ROLE DU RECEPTEUR B2
Le RB2 est impliqué dans la plupart des conséquences de l’inflammation, notamment
l’augmentation de la perméabilité vasculaire, la veinoconstriction, la dilatation artérielle et la
douleur. Par contre, le RB2 semble avoir un rôle limité dans la composante cellulaire de la
réponse inflammatoire [423].
Plusieurs travaux ont montré que le blocage du RB2 au cours du choc septique était
bénéfique. Le premier d’entre eux a montré qu’un antagoniste du RB2 permettait de réduire
de 50 % la mortalité consécutive à l’administration de LPS chez le rat [400]. Cet effet
bénéfique du blocage pharmacologique du RB2 a ensuite été confirmé par d’autres travaux.
Le blocage du RB1 au cours du choc endotoxinique chez le porc réduit la mortalité [422]. Une
autre équipe a montré chez le rat que l’invalidation génétique du kininogène ou le blocage
pharmacologique du RB2 (par l’HOE-140) réduisait l’hypotension et l’augmentation de la
perméabilité vasculaire induites par le LPS [424, 425]. Cependant une équipe n’a pas retrouvé
d’effet protecteur du blocage pharmacologique du RB2 dans certaines des espèces (lapin et
souris) qu’ils ont étudié [426].
Nous avons étudié l’effet de l’administration de LPS chez des souris invalidées pour le
RB2. Nous avons observé que l’hypotension induite par le LPS était légèrement moins
importante que chez les souris sauvages, pourtant l’invalidation du RB2 était associée à une
93
mortalité plus importante. Cette observation rappelle ce qui fut observé lors du blocage non
spécifique des NO-synthases au cours du choc septique.
II.3.
DIFFERENCES ENTRE LES ACTIONS DES DEUX RECEPTEURS
L’injection d’endotoxine provoque un état de choc en 2 phases successives : une phase
précoce et brève purement hypotensive suivie d’une phase prolongée au cours de laquelle
apparaissent les autres signes cliniques. La phase initiale serait sensible au blocage du RB2 et
non du RB1 [400, 427]. L’hypotension de la phase chronique, en grande partie dépendante de
la production de NO par la NOSi [428], est partiellement reversée par des antagonistes du
RB1 [421]. Le RB2 serait donc plutôt impliqué dans la phase aiguë du sepsis, alors que le
RB1 interviendrait plutôt au cours de la phase chronique [66, 69]. Ce phénomène serait
cohérent avec la différence de régulation des 2 récepteurs. L’activation du RB2 est en effet
contrôlée par des mécanismes rapides de dissociation du ligand, de désensibilisation et
d’internalisation du récepteur. Celle du RB1 est au contraire associée à une très lente
dissociation du ligand et une internalisation très limitée. De plus, l’expression du RB1 est
augmentée suite à une exposition prolongée à son agoniste [24, 36, 429]. L’activation
chronique des RB1 semble être amplifiée par l’accumulation de des-Arg9-BK sur le site de
l’inflammation, en effet, la demi-vie de la des-Arg9-BK est 4 à 12 fois plus longue que celle
de la BK [17]. L’ensemble de ces mécanismes explique que le RB1 entraîne une réponse plus
persistante que le RB2.
94
III.
SYSTEME
KALLICREINE-KININE
ET
HEMODYNAMIQUE
RENALE AU COURS DU CHOC ENDOTOXINIQUE.
La défaillance rénale aiguë est une complication fréquente de l’endotoxémie. Les
mécanismes mis en place par l’organisme pour maintenir la pression artérielle (activation du
SRA, libération de vasopressine, activation du système nerveux sympathique) sont bien sûr
essentiels mais ils contribuent sans doute aussi à l’apparition de la défaillance rénale en
provoquant une vasoconstriction au niveau rénal.
Le LPS induit la synthèse de TNF par les cellules mésangiales, cette induction est
inhibée par la prostaglandine PGE2 [430]. Le TNFα peut également participer à l’atteinte
rénale via le recrutement de leucocytes, l’accumulation de fibrine, la stimulation de lyse
cellulaire, la stimulation de libération de substances vasoconstrictrices telles que l’endothéline
[431, 432]. L’endothéline est un puissant vasoconstricteur, sa libération, très augmentée au
cours du sepsis, semble être en partie responsable de l’hypertension glomérulaire parfois
observée lors du choc septique [431, 433, 434] et contribue un temps au maintien de la
filtration glomérulaire. Plusieurs travaux ont montré que le blocage pharmacologique des
récepteurs de l’endothéline protége contre les lésions rénales associées au choc septique [435437].
La libération de NO par la NO-synthase inductible participe à l’altération de
l’hémodynamique systémique. Cependant, au niveau rénal, le NO produit par la NOSi
(stimulée au cours du sepsis) inhibe l’expression de la NOSe et la libération de NO
« constitutif », et surtout régulé, au niveau rénal [438]. Cependant, l’administration
d’endotoxine chez des souris invalidées pour la NOSi provoque quand même une réduction
du DFG [439]. Cela suggère que ce phénomène n’est pas seul responsable de la
95
vasoconstriction à l’origine de la défaillance rénale. Le sepsis s’accompagne de lésions
endothéliales qui peuvent réduire la capacité de la NOSe à contrecarrer les effets des agents
vasoconstricteurs tels que la noradrénaline, l’endothéline ou l’angiotensine II. L’ensemble de
ces observations démontre le rôle plutôt bénéfique de la NOSe au niveau rénal au cours du
sepsis. Cette hypothèse a été confirmée par l’utilisation de souris transgéniques invalidées
pour la NOSe. Dans ce modèle, une faible dose d’endotoxine, sans effet sur la fonction rénale
de souris contrôles, provoque une diminution importante du DFG [440].
L’endotoxémie affecte les phénomènes de coagulation en provoquant un état
procoagulant aggravé par le déficit d’activité de la eNOS. Cet état procoagulant au niveau
glomérulaire, souvent associé à des microthromboses, participe à l’insuffisance rénale [441,
442].
Le sepsis s’accompagne également d’une augmentation du stress oxydant qui pourrait
participer à la phase vasoconstrictrice de la défaillance rénale. En effet, bien que les taux
d’enzymes anti-oxydantes endogènes ne varient pas ou même diminuent, l’apport d’antioxydants exogènes protège de la défaillance rénale et réduit la mortalité dans des modèles
d’endotoxémie chez la souris [374].
96
IV.
CONTRIBUTION
RECEPTEURS
B1
SYSTEMIQUE
ET
PERSONELLE :
ET
B2
RENALE
DANS
AU
IMPLICATION
DES
L’HEMODYNAMIQUE
COURS
DU
CHOC
ENDOTOXINIQUE EXPERIMENTAL
Manuscrit n°4
Hemodynamic and renal involvement of B1 and B2 kinin receptors during
the acute phase of endotoxin shock in mice.
Seguin T, Buleon M, Destrube M, Ranera MT, Couture R, Girolami JP, Tack I.
Int Immunopharmacol. 2008 Feb;8(2):217-21. Epub 2007 Aug 31.
Le choc endotoxinique est une circonstance dramatique mais fréquente, surtout chez le
diabétique, au cours de laquelle l’altération des fonctions rénales détermine largement le
pronostic global du patient. Nous avons étudié les conséquences fonctionnelles rénales d’un
choc endotoxinique induit par le lipopolysaccharide (LPS) chez des souris sauvages ainsi que
des souris KOB1 ou KOB2. Chez les souris KOB1, l’hypotension, l’hypoglycémie, la
diminution du débit de filtration glomérulaire ainsi que la mortalité consécutives à
l’administration de LPS sont aggravées par rapport aux souris sauvages. L’induction de
l’expression du RB1 au cours du choc endotoxinique aurait donc probablement un rôle
bénéfique, du moins pendant les premières heures. Par ailleurs, nous n’avons pas mis en
évidence de rôle protecteur du RB2 au cours du choc endotoxinique induit par le LPS,
contrairement à ce que certains auteurs avaient proposé.
97
Hemodynamic and renal involvement of B1 and B2
kinin receptors during the acute phase of
endotoxin shock in mice
Th. Seguin a,b,1 , M. Buleon a,b,1 , M. Destrube a , M.T. Ranera a,b ,
R. Couture c , J.P. Girolami b,⁎, I. Tack a,b
a
Laboratoire de Physiologie, Faculté de Médecine, Rangueil, Toulouse, France
INSERM U858, BP 84225, 313432 Toulouse Cedex 4, France
c
Département de Physiologie, Faculté de Médecine, Université de Montréal, Montréal, Québec, Canada H3CJ
b
Received 29 June 2007; received in revised form 9 August 2007; accepted 12 August 2007
KEYWORDS
Septic shock;
B1 kinin receptor;
B1-kinin receptor
null mice;
Kidney function
Abstract
B1 kinin receptor (B1R) is up-regulated by endotoxins and thus may represent a therapeutic
target in sepsis. We investigated the expression and role of B1R and B2R in the acute phase of
lipopolysaccharide (LPS)-induced endotoxin shock in C57BL/6 mice (WT) and B1R and B2R knock
out mice (B1KO, B2KO). B1R mRNA was enhanced from 6 to 48 h after LPS while B2R mRNA was
further increased in B1KO. Maximal hypotension was found 24 h after LPS, and was more
pronounced in B1KO, but was reduced in B2KO. Glomerular filtration rate was more reduced by
LPS in B1KO than in WT and B2KO. Glycemia was reduced by LPS and particularly in B1KO and
B2KO mice. Mortality was increased by LPS in B1KO. These data suggest that the up-regulated
B1R plays, at least transiently, a significant beneficial role in acute LPS-induced hypotension.
Conversely, supra activation of B2R could be also involved in the increased mortality observed in
B1KO mice.
© 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.
Sepsis is a major inflammatory reaction associated with a
severe hypotension which is often responsible of acute renal
failure [1]. Combination of sepsis and acute renal failure
results in increase in mortality, reaching 70 to 80%. Therefore
management of sepsis is a major clinical challenge in human
diseases.
Although the precise mechanism is still under investigation, it is well established that endotoxin production plays a
⁎ Corresponding author.
E-mail address: girolami@toulouse.inserm.fr (J.P. Girolami).
1
Both authors contribute equally to this work.
1567-5769/$ - see front matter © 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.intimp.2007.08.008
crucial role in the onset of sepsis. The hemodynamic
hallmark of septic shock is a generalized arterial vasodilatation and a decreased perfusion pressure resulting in a
detrimental drop in tissue perfusion. The arterial vasodilatation that characterizes sepsis results at least in part from the
induction of nitric oxide synthase (iNOS) and thereby to the
massive synthesis of nitric oxide. The hypotension leads to
baroreceptor activation, increase in sympathetic outflow,
release of arginine vasopressin and activation of the
vasoconstrictor renin angiotensin system [2].
Although, these events are essential in maintaining the
arterial perfusion pressure, they can exceed the initial target
218
Th. Seguin et al.
a TA4000 Gould recorder), and to obtain blood samples. Urine was
collected via an intra-vesical catheter. After surgery, a 30-min
stabilization period was observed followed by a 60-min clearance
period. Glomerular filtration rate (GFR) was measured by the inulin
clearance and normalized for the body surface area, i.e.: 65 cm2
(Buleon personal communication). Effective renal plasma flow (RPF)
was assessed by the PAH clearance.
1.4. Renal expression of B1 and B2 receptors
Figure 1 Mortality 24 h after LPS injection in WT (n = 10), B1KO
(n = 9) and B2KO (n = 9) mice. ⁎P b 0.05 versus wild-type group.
and the resulting exaggerated distal vasoconstriction paradoxically favors acute renal failure.
Another effect of endotoxins such as lipopolysaccharide
(LPS) or interleukin-1β, is activation of the kallikrein–kinin
system [3]. In this respect, it has been reported that
blockade of B1 receptor [4] or the absence of B1 receptor
[3,5] could attenuate LPS-induced hypotension. From these
previous studies it can be hypothesized that the lack of B1
receptor activation may reduce hypotension and its consequences on renal functions during sepsis.
Therefore, the aim of the present study was to investigate
the role of B1 receptor during the early phase of LPS-induced
endotoxin shock in a mice model. To achieve this goal, we
have compared the decrease in blood pressure and the
impact on renal function in wild type and B1- or B2-kinin
receptor knock-out mice, following intra-peritoneal LPS
administration.
Renal tissue samples were taken under sterile condition, immediately stored at − 20 °C in appropriate buffer (RNAlater, QUIAGEN, S.
A). mRNA were extracted using RNeasy kit (QUIAGEN) and further
quantified by real time RT-PCR (Tacquam 7200 Applied Biosystem) as
routinely processed in the laboratory [6], 18s RNA were used as
internal control. Results are expressed as arbitrary units compared
to values obtained with the wild type group.
2. Results
2.1. Mortality
Twenty four hours after induction of endotoxin shock, mortality was
14.3% in B2KO mice (not significantly different from control) and
1. Materials and methods
1.1. Animals
Male mice C57BL/6J, B1-kinin receptor null mice (B1KO), B2-kinin
receptor null mice (B2KO) from Jackson Laboratories (USA) were
used and housed in a temperature-controlled room on a 12 hour
light–dark cycle. All procedures involving experimental animals
were performed in accordance with the guiding principles for animal
research. 18-week old mice were divided in three groups: 1) wild
type strain (WT); 2) B1KO; 3) B2KO. Each group was divided in 2 subgroups: with and without an endotoxin shock, induced by a single i.p.
administration of LPS (lipopolysaccharide E Coli type 0127B8; 1 mg/
kg body weight in saline). Blood pressure and renal expression of B1
and B2 receptors were determined at different intervals of time (6,
12, 24 and 48 h) after LPS administration, yet renal functions were
studied at 24 h.
1.2. Mortality study
Mice received an intraperitoneal injection of 10 mg/kg LPS. The
number of death mice was determined 24 h after LPS injection.
1.3. Blood pressure and renal function
Mean arterial blood pressure (MABP) and renal functions were
measured under anesthesia (Inactin 150 mg/kg i.p.). Mice were
tracheotomized, the jugular vein and the femoral artery were
catheterized to ensure perfusion (Para-amino-hippuric acid 10 mg/
mL and Inutest 250 mg/mL in saline, at a flow rate of 0.1 ml/h), to
monitor arterial blood pressure (via a Statham transducer coupled to
Figure 2 Renal expression of B1 and B2 receptors. A) Time
course expression of B1R mRNA after LPS administration in WT
mice; B) expression of B2R mRNA 12 h after LPS administration
(grey bars: without LPS, black bars: 12 h after LPS injection).
Bars correspond to means ± SEM. Pair wise comparison of the
groups (Bonferroni): ⁎P b 0.05 versus wild-type mice, †P b 0.05
versus same group before LPS administration, nd not detectable.
Hemodynamic and renal involvement of B1 and B2 kinin receptors
219
induced a significantly more severe hypotension in B1KO than in WT
(62.3 ± 1.7 mmHg versus 68.5 ± 2.2 mmHg, P b 0.05). Interestingly,
LPS administration in B2KO mice had only a slight effect on blood
pressure, leading to a significantly higher blood pressure than in WT
mice with LPS (Fig. 3B).
2.4. Hematocrit and glycemia
Hematocrit was not significantly different between the 3 groups
(42.2 ± 2.1%) and not significantly impacted by LPS administration
(Fig. 4A). At baseline, glycemia was significantly lower in B1KO mice
than in WT mice (Fig. 4B). LPS administration induced a significant
decrease in glycemia in all groups. This hypoglycemia was further
reduced in B1KO (0.44 ± 0.04 g/L) and B2KO (0.83 ± 0.06 g/L) mice
when compared to WT mice (1.35 ± 0.04 g/L).
2.5. Renal hemodynamic
Figure 3 Blood pressure after LPS administration. A) Time
course evolution of Mean arterial blood pressure in WT mice
(n = 5); B) Mean arterial blood pressure in WT (n = 6), B1KO
(n = 6) and B2KO (n = 6) mice 24 h after LPS administration.
Bars correspond to means ± SEM. Pair wise comparison of the
groups (Bonferroni): ⁎P b 0.05, ⁎⁎P b 0.01 versus wild-type mice;
†P b 0.05, ††P b 0.01 versus same group before LPS administration. There was no difference between the different
genotypes for blood pressure before LPS administration
(ANOVA= ns).
There was not significant difference between WT, B1KO and B2KO
mice for the GFR and the RPF. In WT mice, LPS induced a significant
decrease in GFR (133.4 ± 18.3 versus 229 ± 18 μL/min/65 cm2 in
control, P b 0.05), RPF (616.8 ±128.7 versus 928 ± 84 μL/min/65 cm2
in WT, P b 0.05), and FF (17.8 ± 1.5 versus 22.1 ± 0.7% in WT, P b 0.05)
(Fig. 5). However, in B1KO, the decrease in GFR after LPS was
significantly greater (75.2 ± 10.7 μL/min/65 cm2) than in WT mice,
whereas the decrease in RPF and FF was similar. B2KO mice showed
a similar decrease in GFR and RPF than that of WT mice. At
baseline, FF was slightly lower in B2KO than in the 2 other groups
reached 44.4% in B1KO mice compared to WT group which did not
show any lethality at the dose of LPS used (Fig. 1).
2.2. Renal expression of B1 and B2 receptors
In WT mice, renal expression of B1R mRNA increased as soon as 6 h
after LPS administration, reached a maximum (2.5 times basal level)
at 12 h and remained at this level up to 48 h (Fig. 2A). LPS
administration also induced an increase in B2R mRNA expression in
WT and B1KO mice which was proportionally higher than that of the
B1R. Invalidation of B1R resulted in a spontaneous over-expression of
B2R mRNA under basal conditions and subsequently showed a
stronger increase in B2R mRNA during endotoxin shock than in WT
(Fig. 2B).
2.3. Blood pressure
Without LPS, MABP in B1KO and B2KO mice was not significantly
different from WT (85.4 ± 2.2 mmHg, data not shown). In WT mice,
MABP decreased from 12 to 24 h after LPS administration (64.1 ± 2.9
versus 79.0 ± 3.3 mmHg) (Fig. 3A). Indeed MABP has been measured
at 6, 12, 24 and 48 h for all genotype but we observed that the more
pronounced difference versus respective controls was found 24 h
after LPS in all groups, as shown in Fig. 3B. Administration of LPS
Figure 4 Hematocrit and glycemia 24 h after LPS administration in WT (n = 6), B1KO (n = 6) and B2KO (n = 6) mice. A)
Hematocrit; B) glycemia. Grey bars: without LPS; black bars:
24 h after LPS administration. Bars correspond to means ± SEM.
Pair wise comparison of the groups (Bonferroni): ⁎P b 0.05,
⁎⁎P b 0.01 versus wild-type mice; †P b 0.05, ††P b 0.01 versus
same group before LPS administration.
220
Figure 5 Renal functions and hemodynamic parameters after
LPS administration WT (n = 6), B1KO (n = 6) and B2KO (n = 6). A)
Glomerular filtration rate; B) renal plasmatic flow; C) filtration
fraction. Grey bars: without LPS; black bars: 24 h after LPS
administration. Bars correspond to means ± SEM. Pair wise
comparison of the groups (Bonferroni): ⁎P b 0.05, ⁎⁎P b 0.01
versus wild-type mice; †P b 0.05, ††P b 0.01 versus same group
before LPS administration. There was no difference for GFR and
RPF between the different genotypes before LPS administration,
but there was a slight difference between WT and B2KO mice for
the filtration fraction (ANOVA and post-hoc test P b 0.01).
(21.2 ± 0.7% versus 25.2 ± 0.9% in WT, P b 0.05) whereas after LPS it
appeared significantly higher (27.9 ± 3.1% versus 17.8 ± 1.5% in WT
after LPS, P b 0.01).
3. Conclusions
Several genes encoding for cytokines, cell adhesion molecules and also kinin receptors are quickly up-regulated
during sepsis [7]. However the functional relevance of this
up-regulation in the physiopathological mechanism of sepsis
remains to be clarified. Whether blockade or activation of
kinin B1R and/or B2R can modulate the severity of LPSinduced septic shock in relation with effects on renal
functions remains unclear.
Th. Seguin et al.
Our results clearly show that B1R is strongly up-regulated
by LPS in WT mice, an effect associated with a decrease in
blood pressure. Because the B1R is strongly up-regulated in
inflammatory processes and after LPS administration, it has
been suggested that blockade of B1R may exert protective
effect in the treatment of the septic shock [5]. Indeed, the
same group observed that the initial hypotension following
LPS was reduced in mice lacking the B1R [8]. However, this
observation was contradicted by a recent study [9] showing a
worsening of LPS-induced hypotension in the same model.
Finally, our results support the hypothesis that B1R activation
is associated initially with a protective effect against LPSinduced hypotension. Such discrepancy can be explained by
important differences in experimental conditions. The group
of Pesquero had observed a reduction in LPS-induced
hypotension in B1R deficient mice only 35 min after a bolus
of LPS given intravenously whereas our observation was
performed 24 h after intraperitoneous injection of LPS.
Recently the group of Pesquero [8] has revisited this point by
using mice deficient for both kinin receptors and they still
concluded that these mice were protected from endotoxin
hypotension. Indeed other previous works using only WT mice
have suggested that up-regulation of B1R during LPS shock
may be an important mechanism of host defense and may not
serve the same purpose as the B2R [10]. Therefore, if the B1R
protects against acute hypotension, that conclusion suggests
that B1R activation is associated with vasoconstriction, at
least during the initial phase. In this respect, it was reported
that BK-induced vasoconstriction was increased in lungs after
LPS exposure [11] and that effect was blunted by cyclooxygenase inhibitor and B2R antagonist. Nevertheless, investigating the respective role of B1R and B2R using genetically
modified animals must be interpreted with caution since it
does not simply reflect the absence of a given receptor. From
our work, it is obvious that the B2R is up-regulated in B1KO
mice. Thus the functional effects that we observed result
from both the absence of B1R and the over-expression of the
B2R. This could provides an additional explanation for the
worsening of renal failure and hypoglycemia in the B1KO
group after LPS.
Finally, the renal hemodynamic impact of LPS in B1KO and
B2KO mice need some comments. The decrease in GFR was
worsened in B1KO mice compared to WT. In a previous report
in rats [12,13] we have demonstrated that LPS-induced B1R
expression in afferent and efferent arterioles and along the
nephron could influence renal hemodynamic. In this respect,
it has been reported that B1R activation causes renal
vasoconstriction [14,15] potentially decreasing the GFR.
Thus, one could have expected the lack of B1R to be rather
protective against renal failure. However, the deeper
decrease in MABP observed in B1KO mice is sufficient to
explain the worsening of renal failure in B1KO mice after LPS.
In B2KO mice, LPS only tend to decrease the GFR despite a
significant decrease in RPF, leading to an increase in FF. This
effect could be explained by both the lack of B2R
vasodilatory effect on efferent arterioles and an increase
in efferent vascular tone as a result of B1R overexpression,
an effect consistent with the increase in FF observed in this
group.
In conclusion, the present work underlines that, in the
model of LPS-induced endotoxin shock, the absence of B1R is
associated with a marked hypotension and a subsequent
Hemodynamic and renal involvement of B1 and B2 kinin receptors
worsening of renal failure, hypoglycemia and mortality. This
claims against the blockade of B1R at the early phase of the
septic shock.
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V.
SYSTEME
KALLICREINE-KININE
ET
CHOC
SEPTIQUE,
NOUVEAU MODELE, NOUVEAUX OUTILS ET NOUVELLES
PERSPECTIVES
Le LPS est une endotoxine libérée par les bactéries à Gram négatif. L’administration
de LPS chez la souris correspond donc à un modèle de choc endotoxinique. Or les pathogènes
les plus fréquemment à l’origine de chocs septiques chez l’homme sont en fait souvent les
bactéries à Gram positif (celles-ci sont à l’origine d’environ 52 % des chocs septiques contre
36% pour les bactéries à Gram négatif) [367]. De plus, l’absence de virulence bactérienne ne
correspond pas à la situation réelle du choc septique. C’est pourquoi nous développons
actuellement dans le laboratoire le modèle de choc septique par ponction cæcale qui se
rapproche plus de la situation observée chez l’homme.
L’utilisation d’antagonistes, et d’agonistes des récepteurs B1 et B2, conjointement aux
modèles d’invalidation génétique de l’un ou l’autre des récepteurs, devrait permettre
d’approfondir l’étude de l’implication du SKK dans la défaillance rénale associée au sepsis.
L’implication des récepteurs de la bradykinine dans l’hyperperméabilité capillaire, qui
altère le pronostic du choc septique, sera étudiée par l’utilisation du bleu d’Evan dans le
modèle du choc septique par ponction caecale.
98
Conclusions - Perspectives
CONCLUSIONS - PERSPECTIVES
La synthèse des résultats de nos travaux montre que le blocage du récepteur B2 de la
bradykinine réduit sensiblement les effets protecteurs des IEC au cours de la néphropathie
diabétique expérimentale. Ces résultats et ceux de la littérature apportent des arguments de
plus en plus convaincants en faveur d’un effet néphroprotecteur de l’activation du RB2. Cette
réflexion a fait l’objet d’une revue plus approfondie faisant le point sur l’état des
connaissances actuelles concernant le rôle potentiellement néphroprotecteur du RB2
(Manuscrit n°5, [164]). Cependant, l’hypothèse d’un rôle néphroprotecteur du RB2 repose
essentiellement, à ce jour, sur l’observation d’une aggravation lors de l’absence du RB2 ou de
son blocage pharmacologique. Il est donc nécessaire de démontrer directement que
l’activation du RB2 peut avoir les effets bénéfiques supposés.
Plusieurs agonistes du RB2 ont été développés. Ces agonistes et les indications pour
lesquelles ils ont été testés sont résumés dans le Tableau 3. Certains d’entre eux, en
particulier le RMP-7 ont déjà fait l’objet d’études approfondies. Cette molécule est utilisée en
clinique (Cereport), co-administrée avec des agents anti-cancéreux, elle facilite leur passage
de la barrière hémato-encéphalique et donc leur action au niveau du cerveau [443, 444].
99
Tableau 3 : Agonistes existants du récepteurs B2 de la bradykinine et utilisation
Agoniste
Indications testées
Références
RMP-7 (Cereport)
Aide à la chimiothérapie des gliomes
[443, 444]
B9870
Agoniste partiel B1/B2 :
anticancéreux ?
[445, 446]
FR 190 997
Caractérisation in vitro
Peu efficace in vivo
[447]
LF 15-0943
Caractérisation in vitro
Pas testé in vivo
[448]
B9972
Hypertension pulmonaire,
hypertrophie cardiaque
[165]
Phe8-Ψ(CH2-NH)-Arg9-BK
En cours de test ……
Agoniste B2 : effets bénéfiques, effets délétères ?
Actuellement, l’utilisation d’agoniste B2 comme agent thérapeutique au cours de la
néphropathie diabétique n’a pas encore été testée. Cependant, un travail récent [40] a montré
que l’administration chronique de BK réduit la fibrose rénale dans un modèle d’hypertension
artérielle chez le rat Dahl sensible au sel.
Des accords avec un groupe de chimistes peptidiques nous ont permis d’obtenir un des
premiers agonistes non peptidiques (donc résistant à la dégradation endogène) de la
bradykinine utilisable in vivo : la Phe8-Ψ(CH2-NH)-Arg9-BK. Nous avons prévu de tester cet
agoniste dans le cadre de la néphropathie diabétique expérimentale que développe la souris
db/db. Du fait des propriétés physiologiques de la bradykinine, l’administration d’un agoniste
de son récepteur B2 pourrait être responsable des effets secondaires tels qu’une vasodilatation
systémique prolongée, une hyperalgie, voire même la perturbation de l’état d’oxydo-réduction
avec des effets pro-oxydants [449-451]. Ces effets sont en cours d’évaluation dans le
100
laboratoire avant d’envisager l’utilisation de cet agoniste pour un traitement chronique au
cours de la néphropathie diabétique chez la souris db/db.
Ce modèle présente toutefois une vaso-réactivité persistante inhabituelle au cours du
diabète chez l’Homme. Afin de s’affranchir de l’impact hémodynamique potentiel du RB2 et
de vérifier l’effet anti-fibrosant direct de son agoniste, il sera intéressant de pouvoir étudier
son efficacité finale dans des modèles présentant une perte des capacités de vaso-relaxation
identiques au diabète humain.
Une autre possibilité d’activation de ce système pourrait être envisagée en utilisant
l’angiotensine 1-7 qui induit des effets opposés à ceux de l’angiotensine II (Figure 4). Bien
que les voies de signalisation de l’angiotensine 1-7 soient encore mal identifiées [145, 146], la
participation du RB2 est bien établie car plusieurs effets de l’angiotensine 1-7 sont abolis par
l’antagoniste du RB2 [148, 149]. L’importance de la prévention des effets bénéfiques du
traitement par les IEC par le blocage du RB2 chez la souris db/db, suggère une forte réactivité
de ce modèle à la bradykinine. On peut donc s’interroger quant à l’origine de cette possible
augmentation de réactivité à la bradykinine dans les tissus diabétiques et en particulier au
niveau rénal. Il reste à savoir si cet effet est spécifique du modèle de la souris db/db qui
présente une faible activité de l’ECA et une forte activité de l’ECA2 [452] ou s’il est
généralisable. Cette possibilité mérite d’être explorée car elle pourrait bien sûr avoir des
conséquences cliniques importantes.
Des études récentes ont révélé l’existence chez l’Homme d’un polymorphisme du
RB2. Ce polymorphisme dit BE1 [453] est associé avec la présence (+9) ou l’absence (-9)
d’une séquence de 9 pb. Ce polymorphisme apparaît associé à l’importance de la
vasodilatation en réponse à la bradykinine mais non à des agonistes non spécifiques du RB2
[454]. Le phénotype BE1 +9/+9 est associé à une augmentation des résistances vasculaires et
101
des risques cardiovasculaires [455]. Par contre, le phénotype BE1 +9/-9 augmente la réponse
vasodilatatrice médiée par le RB2. La survenue d’un phénotype diabétique sur un terrain
génétique comportant un tel polymorphisme pourrait constituer une circonstance favorable en
déterminant une plus grande susceptibilité des sujets à l’effet néphroprotecteur de la
bradykinine.
102
Manuscrit n° 5
Bradykinine et néphroprotection : pourquoi, comment,
perspectives.
Marie Buléon, Marion Mehrenberger, Christiane Pécher, Réjean Couture, Ivan
Tack et Jean-Pierre Girolami.
Med Sci (Paris). 2007 Dec;23(12):1141-7. Review. French.
De nombreuses maladies comme l’hypertension artérielle, le diabète et l’obésité
aboutissent à des complications rénales généralement irréversibles soulignant l’intérêt
d’améliorer les stratégies de néphroprotection disponibles. En plus du contrôle de la glycémie
chez le patient diabétique, seul le blocage du système rénine angiotensine (SRA) s’avère
capable de retarder l’aggravation de la glomérulosclérose et l’évolution vers l’insuffisance
rénale terminale. L’inhibition du SRA repose sur l’utilisation d’inhibiteurs de l’enzyme de
conversion de l’angiotensine II (IEC) et d’antagonistes du récepteur AT1 de l’angiotensine II
(ARA2). Pendant très longtemps, les effets de ces deux classes de médicaments ont été
attribués principalement au blocage de la synthèse ou des effets de l’angiotensine II. Un grand
nombre de travaux récents tant in vitro que in vivo s’accordent pour attribuer également une
part de leurs effets néphroprotecteurs à l’activation du récepteur B2 de la bradykinine (RB2).
Un argument convaincant est le développement d’une glomérulosclérose plus sévère chez les
souris n’exprimant plus le RB2. Ces effets néphroprotecteurs du RB2 pourraient résulter
d’une réduction de la protéinurie, de la fibrose initialement glomérulaire puis interstitielle, de
la prolifération cellulaire ainsi que du stress oxydant par plusieurs mécanismes déjà bien
documentés. Ces données suggèrent que l’activation directe et/ou indirecte du RB2 peut
désormais représenter un nouveau concept thérapeutique dans le traitement des
néphropathies.
103
MEDECINE/SCIENCES 2007 ; 23 : •••-•••
Bradykinine
et néphroprotection
Pourquoi ? Comment ?
Perspectives
Les lésions rénales sont souvent associées à la progression de maladies comme l’hypertension artérielle ou le
diabète. Elles sont caractérisées par une hyperplasie,
une hypertrophie cellulaire et une accumulation de
matrice extracellulaire initialement localisée dans
le glomérule. Ces lésions aboutissent à la fibrose du
glomérule ou glomérulosclérose, la fibrose interstiM/S n° 12, vol. 23, décembre 2007
REVUES
Marie Buléon, Marion Mehrenberger, Christiane Pécher,
Françoise Praddaude, Réjean Couture, Ivan Tack,
Jean-Pierre Girolami
M. Buléon, M. Mehrenberger,
C. Pécher, F. Praddaude, I. Tack,
J.P. Girolami : Inserm, U858/I2MR,
Remodelage rénal et cardiaque,
1, avenue Jean Poulhes,
BP 84225, 31432 Toulouse
Cedex 4, France.
Université de Toulouse III
Paul Sabatier, Institut
de Médecine Moléculaire
de Rangueil,
31000 Toulouse, France.
Jean-Pierre.Girolami@
toulouse.inserm.fr
R. Couture : Département
de Physiologie, Faculté
de médecine, Université
de Montréal, CP 6128, Succursale
Centre-ville, Montréal, Québec,
H3C 3J7 Canada.
SYNTHÈSE
> De nombreuses maladies comme l’hypertension
artérielle, le diabète et l’obésité aboutissent à des
complications rénales généralement irréversibles
soulignant l’intérêt d’améliorer les stratégies de
néphroprotection disponibles. Outre le contrôle
de la glycémie chez le patient diabétique, seul le
blocage du système rénine angiotensine (SRA)
s’avère capable de retarder l’aggravation de la
glomérulosclérose et l’évolution vers l’insuffisance
rénale terminale. L’inhibition du SRA repose sur
l’utilisation d’inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine II (IEC) et d’antagonistes du récepteur AT1 de l’angiotensine II (ARA2).
Pendant très longtemps, les effets de ces deux
classes de médicaments ont été attribués principalement au blocage de la synthèse ou des effets
de l’angiotensine II. Un grand nombre de travaux
récents tant in vitro qu’in vivo s’accordent pour
attribuer également une part de leurs effets néphroprotecteurs à l’activation du récepteur B2 de la
bradykinine (RB2). Un argument convaincant est
le développement d’une glomérulosclérose plus
sévère chez les souris n’exprimant plus le RB2. Ces
effets néphroprotecteurs du RB2 pourraient résulter d’une réduction de la protéinurie, de la fibrose
initialement glomérulaire puis interstitielle, de la
prolifération cellulaire ainsi que du stress oxydant
par plusieurs mécanismes déjà bien documentés.
Ces données suggèrent que l’activation directe
et/ou indirecte du RB2 peut désormais représenter
un nouveau concept thérapeutique dans le traitement des néphropathies. <
tielle et l’insuffisance
rénale. Le blocage du
système rénine-angiotensine (SRA) par les
inhibiteurs de l’enzyme
de conversion (IEC) ou
par les antagonistes du
récepteur AT1 de l’angiotensine II (ARA2)
s’avère la meilleure stratégie thérapeutique [1] pour
ralentir l’évolution et la sévérité de la glomérulosclérose. Cette revue analyse les dernières données relatives aux mécanismes de ces effets protecteurs ainsi que
de nouvelles interconnexions entre le SRA et le système
kallicréine-kinines (SKK), afin de mieux situer un rôle
du SKK en physiopathologie rénale.
Pourquoi les kinines
seraient-elles néphroprotectrices ?
Les travaux initiaux décrivant les actions vasodilatatrice,
diurétique et natriurétique de la bradykinine (BK) ont
suggéré que l’inactivation du SKK favoriserait l’hypertension artérielle. Le SKK est donc apparu comme un système
de défense contre le SRA dont l’activation reconnue est à
l’origine de nombreuses maladies rénales et vasculaires.
Toutefois, la démonstration d’un rôle pathogénique et
surtout le concept d’une stratégie thérapeutique s’appuyant sur le SKK ont mis du temps à s’établir.
1
de substrats hépatiques circulants, les kininogènes, par des sérine protéases, les kalliKininogènes
Angiotensinogène
créines tissulaires. La synthèse de kallicréine
tissulaire a été démontrée dans la paroi de
Kallicréines
Rénine
certaines artères. In vivo, la BK est rapideIVP
ment inactivée par deux voies enzymatiques
Angiotensine I
Bradykinine 1-9
Endopeptidase neutre
principales, impliquant les kininases I et II.
Enzyme de conversion
La kininase I génère la des-Arg9-BK qui est
Kininase I
l’agoniste sélectif du récepteur B1 (RB1),
IEC
alors que la BK est l’agoniste préférentiel
Angiotensine II
Bradykinine 1-8
(des-Arg9-BK)
du récepteur B2 (RB2). Les deux récepteurs
Bradykinine 1-7
ARA2
sont des récepteurs à sept domaines transinactive
membranaires, couplés à une protéine G et
vasoconstriction
AT1
AT2
associés à l’activation d’un réseau de signaB2
B1
lisation complexe [2]. La kininase II, plus
vasodilatation
connue sous le nom d’enzyme de conversion
de l’angiotensine II, et sur laquelle vont agir
prolifération, apoptose, trophicité, perméabilité
les IEC, est une métalloprotéase à doigts de
maladies cardiaques, vasculaires, et rénales
zinc capable d’engendrer l’angiotensine II
inflammation, douleur
et/ou de dégrader la BK. L’implication de la
BK dans l’effet des IEC reste une source de
Figure 1. Organisation des systèmes rénine-angiotensine et kallicréine-kinines. Les principales cibles
débats contradictoires, souvent explicables
d’actions pharmacologiques des inhibiteurs de l’enzyme de conversion (IEC), des antagonistes du réceppar les méthodologies de mesure de la BK,
teurs AT1 de l’angiotensine II (ARA2) et des inhibiteurs des vasopeptidases (IVP) sont indiquées.
celles des prélèvements sanguins, ainsi que
par les conditions physiopathologiques et
expérimentales (âge, régimes alimentaires, imprégnation
Rôle de la bradykinine dans le mécanisme d’action des IEC
hormonale, hypertension) qui induisent un niveau d’activité
Les premiers arguments en faveur du rôle néphroprotecteur de la BK sont variable du SKK.
indirects et reposent sur les effets bénéfiques des traitements par les IEC Un nouveau mécanisme additionnel d’action des IEC
dans l’hypertension artérielle et la néphropathie diabétique. Les IEC agissent reposerait sur la formation d’un complexe membranaire
à la fois sur le SRA vasoconstricteur et le SKK vasodilatateur. L’organisation entre l’enzyme de conversion de l’nangiotensine (ECA)
de ces systèmes est représentée dans la Figure 1. L’inhibition de l’enzyme de et le RB2 (complexe ECA/RB2) qui augmenterait la senconversion a pour conséquences d’inhiber la production d’angiotensine II sibilité du RB2 pour la bradykinine [3].
vasoconstrictrice mais également de réduire la dégradation de BK vasodila- Par ailleurs, le traitement par les IEC entraîne l’accumutatrice (Figure 1). La BK est un nonapeptide issu de l’hydrolyse enzymatique lation d’angiotensine I dégradée en angiotensine 1-7 par
plusieurs enzymes. L’angiotensine 1-7 induit
des effets hypotenseurs et vasodilatateurs
Type
État
Type de
Effet
Références
cellulaire d’activation récepteur BK
qui s’opposent à ceux de l’angiotensine II
par des mécanismes inhibés par des antagoMésangial
Quiescence
B2
prolifération
[65-67]
nistes du RB2, impliquant donc l’activation
Muscle lisse
Quiescence
B2
prolifération
[68]
du RB2 [4]. L’angiotensine 1-7 peut se comporter comme un inhibiteur de l’ECA et donc
Épithelial
Quiescence
B2
prolifération
[69,70]
augmenter la biodisponibilité de la BK mais
Mésangial
IGF
B2
anti-prolifératif
[71]
également agir sur le complexe ECA/RB2 et
diminuer la désensibilisation du RB2 [5].
Endothelial
Glucose
B2
anti-prolifératif
[72]
Ces voies de formation de l’angiotensine
Muscle lisse
PDGF
B2
anti-prolifératif
[73,74]
1-7, associées à la stimulation potentielle
du RB2, peuvent permettre de définir de
Épithélial
EGF, IGF-I
B2
anti-prolifératif
[75]
nouvelles voies thérapeutiques (Figure 2).
Fibroblaste
EGF, PDGF
B2
anti-prolifératif
[37]
Bien que le mécanisme d’action des IEC soit
Tableau I. Principaux travaux in vitro sur l’effet prolifératif ou antiprolifératif de la bradykinine. complexe, l’implication des récepteurs de
IGF : insulin growth factor ; PDGF : platelet derived growth factor ; EGF : epidermal growth factor la BK ne peut plus être mise en doute. Les
2
M/S n° 12, vol. 23, décembre 2007
Alors que l’on savait que la BK pouvait intervenir dans le
mécanisme d’action des IEC, les ARA2 apparaissaient comme
une alternative s’affranchissant d’effets dépendants de
la BK. Cette affirmation n’est plus absolue car des travaux
démontrent des interactions possibles et suggèrent de fortes
similitudes entre leurs mécanismes d’action (Figure 2). En
effet, alors que les IEC inhibent la formation d’angiotensine
II et la dégradation de la BK, favorisant ainsi l’activation
du RB2, les ARA2 bloquent l’action de l’angiotensine II sur
le récepteur AT1 et révèlent les effets du récepteur AT2. Si
Possibilités d’activation du RB2 durant un traitement par un IEC ou un ARA2
Angiotensinogène
Kininogènes
Angiotensine I
EPN,PEP
ECA
IEC
Angiotensine II
ARA2
a
Bradykinine
e
c
AT1
AT2
b
PCP,PEP,ECA2
Angiotensine 1-7
d
B2
B2
Figure 2. Possibilités d’interactions entre les récepteurs de l’angiotensine II et l’activation du RB2.
1. Durant un traitement par un IEC : (A) l’IEC bloque la formation d’angiotensine II et inhibe la dégradation de la BK favorisant l’activation du RB2, (B) certains IEC pourraient avoir une action directe sur l’activation du RB2 en formant un complexe. En l’absence de formation d’angiotensine II, il y a formation
directe d’angiotensine 1-7 qui peut diminuer la dégradation de la bradykinine (C), mais aussi stimuler
directement le RB2 (D). 2. Durant un traitement par un ARA2. Le blocage du récepteur AT1 va révéler
l’action de l’angiotensine II sur le récepteur AT2 dont l’activation est associée à celle de la kallicréine
(E) entraînant la formation de bradykinine et l’activation du RB2. Suite à l’accumulation d’angiotensine II dont la formation n’est pas bloquée comme c’est le cas en présence d’un IEC, on va observer une
formation accrue d’angiotensine 1-7 qui va aussi renforcer la stimulation du RB2 (C et D).
REVUES
Rôle de la BK dans le mécanisme
d’action des antagonistes
du récepteur AT1 de l’angiotensine :
relations entre récepteur AT2 et BK
l’on a longtemps pensé que l’angiotensine II était uniquement vasoconstrictrice, des travaux récents montrent que l’activation du récepteur AT2
par l’angiotensine II induit des effets vasodilatateurs en mettant en jeu une
signalisation impliquant une synthèse accrue de BK et une activation du RB2
[7]. La relation entre l’activation du récepteur AT2 et la production de BK
a été confirmée chez la souris surexprimant le récepteur AT2. L’activation
du récepteur AT2 entraîne une diminution du pH intracellulaire qui active la
kallicréine, induisant ainsi une production accrue de bradykinine aboutissant
à la stimulation du RB2 [8]. Enfin, le récepteur AT2 peut être aussi stimulé
par l’angiotensine 1-7 [9]. Il a été démontré dans plusieurs modèles que la
vasodilatation, dépendante de l’endothélium et induite par l’angiotensine II
est fortement réduite par un antagoniste du RB2 [10]. De même, la surexpression du récepteur AT2 réduit la fibrose périvasculaire cardiaque induite
par la perfusion d’angiotensine II, un effet dépendant du RB2 supprimé par
un antagoniste du RB2 [11]. L’activité anti-fibrosante du récepteur AT2 ne
repose toutefois pas exclusivement sur l’activation du RB2 car une stimulation de la formation de NO par le récepteur AT2 a été démontrée chez les
souris n’exprimant pas le RB2 [12]. L’activation du récepteur AT2 est capable
de s’opposer à certains effets de l’AT1 en stimulant la production de GMP
cyclique via un mécanisme partiellement dépendant des kinines. A l’instar
des IEC, les ARA2 peuvent donc activer également le RB2. Ces interactions
sont schématisées dans la Figure 2.
SYNTHÈSE
effets bénéfiques des IEC sont souvent atténués par le blocage du RB2 par des antagonistes [6]. L’activation du RB2
par les IEC peut se faire par plusieurs mécanismes intriqués
et additionnels : inhibition de la dégradation de la BK, mais
également formation d’angiotensine 1-7 et formation d’un
complexe protéique ECA/RB2.
Bradykinine et néphro-protection :
des arguments récents
encore plus convaincants
Des preuves expérimentales très fortes en
faveur d’un rôle néphroprotecteur de la
BK ont été apportées par des études faites
chez des souris génétiquement modifiées.
Les souris exprimant de multiples copies de
l’ECA, c’est-à-dire capables de dégrader
de façon accrue la BK et d’aboutir ainsi
à une très faible activation du RB2 [13],
ainsi que les souris n’exprimant plus le RB2
[14], développent une néphropathie diabétique plus sévère que la souche sauvage.
De même, la fibrose interstitielle se développant après une obstruction urétérale
est aggravée chez la souris n’exprimant
plus le RB2 [15]. Ces résultats suggèrent
que l’absence d’expression du RB2 favorise l’aggravation des lésions rénales. La
démonstration définitive d’un effet néphroprotecteur de la BK devra établir que le
blocage pharmacologique du RB2 aggrave
la néphropathie diabétique et, inversement, que l’activation du RB2 est capable
de réduire l’évolution de cette pathologie. Nous avons récemment documenté
le premier aspect chez la souris NOD (non
3
obese diabetic) qui développe une glomérulosclérose accélérée au cours
du vieillissement (Marie Buléon, communication personnelle). Dans cette
A
étude, la glomérulosclérose est prévenue par un traitement
chronique de 3 mois avec un IEC, impliquant l’activation du
RB2 (Figure 3). Ces résultats sur le blocage
pharmacologique du RB2 sont parfaitement
cohérents avec ceux obtenus chez les
Effet du blocage du récepteur B2 sur la glomérulosclérose de la souris NOD
souris qui n’expriment plus le RB2.
23 semaines
8 semaines
Comment la BK pourrait-elle exercer
des effets néphroprotecteurs ?
Principalement via le récepteur B2 ?
23 semaines + IEC
23 semaines + IEC + antag B2
B
*
Volume mésangial
( % du volume glomérulaire)
*
*
14
10
IEC
Antag
B2
8
23
23
23 âge (semaines)
-
-
+
+
-
-
-
+
Figure 3. Effet du blocage du récepteur B2 dans l’apparition de la glomérulosclérose (GS) diabétique chez la souris NOD. Cette glomérulosclérose est évaluée par l’augmentation de l’aire
mésangiale révélée par la coloration à l’acide périodique de Schiff (A) et quantifiée par analyse de surface (B). Par rapport aux souris NOD jeunes, âgées de 8 semaines (1), le volume du
mésangium est plus abondant chez les souris adultes de 23 semaines (2). Chez les souris adultes
traitées depuis l’âge de 8 semaines par un inhibiteur de l’enzyme de conversion (IEC), le volume
mésangial reste sensiblement identique à celui des souris jeunes (3). En revanche, le traitement
simultané IEC + antagoniste du récepteur B2 empêche l’inhibition de l’expansion mésangiale par
l’IEC (4). La GS apparaît chez la souris adulte de 23 semaines. Elle est très significativement
ralentie par un traitement chronique entre la 8è et la 23è semaine avec un IEC. L’action bénéfique
de l’IEC est très significativement réduite en présence d’antagoniste du RB2 indiquant que l’action du RB2 est très impliquée dans l’effet anti-GS de l’IEC.
4
La BK participerait
à la réduction de la protéinurie
L’apparition de traces d’albumine (microalbuminurie) dans les urines est un signe
précoce d’altération de la filtration glomérulaire. La réduction de cette micro-albuminurie est considérée comme un index
d’efficacité de traitements néphroprotecteurs. Les IEC réduisent la protéinurie dans
plusieurs situations. Bien que les premiers
travaux dans un modèle de néphrose toxique aient montré une absence de participation de la BK, chez le rat diabétique, la
réduction de la protéinurie par un IEC est
atténuée par le blocage pharmacologique du RB2 [16]. Comment la protéinurie
pourrait-elle être réduite par la BK ? Le
polymorphisme du gène de RB2 apparaît
comme un marqueur de susceptibilité de
progression de la néphropathie diabétique ; le polymorphisme +/+ de l’exon 1
du RB2 serait associé à une faible excrétion d’albumine, alors qu’une élévation du
rapport albumine/créatinine est observée
dans le polymorphisme +/- [17]. L’absence
d’expression du RB2 est associée à une
augmentation importante de l’expression
de la néphrine et de la megsine lors de
l’apparition du diabète [14]. L’expression de ces deux protéines est importante
pour la stabilité du filtre glomérulaire. Une
modification de l’expression de la néphrine
est observée dans le syndrome néphrotique
finlandais caractérisé par une très forte
protéinurie en rapport avec une mutation
homozygote du gène NPHS1. La néphrine
mutée est associée à un détachement des
podocytes pouvant conduire à une altération précoce du filtre glomérulaire. Par
ailleurs, une augmentation de la néphrine a
été aussi démontrée lors de l’instauration
La BK active ou inhibe la prolifération
et l’hypertrophie cellulaire
Les premiers travaux effectués sur plusieurs types cellulaires cultivés en l’absence de facteurs de croissance ont montré un effet prolifératif de la BK. Des
travaux plus récents, réalisés cette fois
sur des cellules proliférantes, ont démontré un effet inverse. Les principaux résultats, résumés dans le Tableau I, ne sont
nullement contradictoires, mais indiquent
qu’en fonction de l’état d’activation
cellulaire, la BK peut exercer des effets
opposés. Cela suggère le recrutement
de voies de signalisation distinctes. Les
activations de la phospholipase C et de
la protéine kinase C (PKC) semblent associées à l’effet prolifératif. En revanche,
plusieurs mécanismes ont été évoqués
pour expliquer l’effet anti-prolifératif :
une augmentation de la production de
PGE2 (prostaglandin E2) dans des fibroblastes [21], l’activation d’une tyrosine
phosphatase capable de déphosphoryler
les MAP kinases Erk1/2 dans les cellules
mésangiales [22], et l’activation de la
phosphatase PTP responsable de la transinactivation du récepteur de l’EGF (epidermal growth factor) dans des cellules
épithéliales. Par ailleurs, le récepteur EGF
peut être désensibilisé par l’activation de
plusieurs récepteurs, dont le RB2, par un
autre mécanisme impliquant la PKC [23].
REVUES
Outre son effet anti-prolifératif, la BK peut exercer des effets anti- hypertrophiques dans le cœur et les reins [24]. La BK est capable d’inhiber
l’hypertrophie de cardiomyocytes induite par l’angiotensine II. Cet effet
nécessite la présence de cellules endothéliales et implique la production
de NO et de GMP cyclique [25].
La BK module l’expression et la signalisation
des récepteurs des cytokines et des facteurs de croissance
Plusieurs travaux indiquent que l’activation du RB2 peut moduler de façon
positive ou négative l’activation des récepteurs des cytokines et des facteurs de croissance. Les premiers travaux ont montré que l’activation du
RB2 restaure la sensibilité musculaire à l’insuline en stimulant à la fois
la phosphorylation du résidu tyrosine du récepteur de l’insuline et celle
de son substrat IRS-1 [30]. La BK est capable d’améliorer l’insulinorésistance dans les muscles en induisant la translocation du transporteur insulino-dépendant GLUT-4 via le RB2 [27]. Cet effet est d’ailleurs
confirmé chez la souris invalidée pour le gène du RB2 qui présente un état
d’insulino-résistance. Cette participation du RB2 au contrôle de la glycémie, via la stimulation de l’utilisation musculaire du glucose, peut aussi
contribuer aux effets néphroprotecteurs. Par ailleurs, la BK est capable
SYNTHÈSE
d’un diabète de type I chez le rat [18]. La megsine est un
inhibiteur de métalloprotéases et donc de la dégradation
de protéines matricielles. L’accumulation de megsine en
l’absence du RB2 pourrait aboutir à l’accumulation de
matrice, et être ainsi en partie responsable de l’instauration de la fibrose glomérulaire [19].
La BK inhibe l’inhibiteur-1 des activateurs du plasminogène (PAI-1) et active la dégradation de la matrice
Un grand nombre d’observations cliniques et expérimentales démontrent une atténuation de la fibrose
rénale par les IEC et les ARA2. Cependant, la réduction
de l’expression du PAI-1 (plasminogen activator inhibitor-1), comme mécanisme de l’effet anti-fibrosant des
IEC, via l’activation du RB2, n’a été évoquée que récemment [20]. La diminution de la synthèse de PAI-1 a
pour conséquence une moindre inhibition des métalloprotéases, ce qui favorise la dégradation de la matrice
dans un modèle de fibrose interstitielle.
Différents mécanismes de néphroprotection possibles,
associés àl’activation du RB2
IEC, ARA2
Bradykinine
des-Arg9Bradykinine
Récepteur B2
Récepteur B1
angio1-7
agoniste B2
↑ PKC
Translocation
Translocation
GLUT4
GLUT4
↓ protéinurie
↑ NO
↓ PAI-1
↑ activité
phosphatase
↓ stress
stress
oxydant
oxydant
↑ activité
activité
métalloprotéase
métalloprotéase
↓ insulino-
Anti-prolifération
Anti-apoptose
résistance
↑ PLC, PLA2
↓ activité
activitéfacteurs
facteurs
de
de croissance
croissance
Anti-fibrosant
Figure 4. Différents mécanismes possibles de néphroprotection associés à l’activation du récepteur de la bradykinine. Les effets potentiellement néphroprotecteurs peuvent résulter de l’activation de plusieurs voies de signalisations telles que : les phospholipases C et A2, la protéine
kinase C mais aussi des voies moins classiques comme la tyrosine phosphate SHP2, l’inhibition
des inhibiteurs d’activateurs du plasminogène (PAI), la formation de monoxyde d’azote NO.
L’activation de ces voies peut induire plusieurs réponses telles que : l’augmentation d’activité
des métalloprotéases, la diminution du stress oxydant et de l’activité de plusieurs facteurs de
croissance, ou encore la translocation de GLUT 4 dans certains types cellulaires. L’ensemble de
ces actions va être associée à une diminution des mécanismes de fibrose, d’apoptose, de prolifération et de la protéinurie.
5
de réduire l’auto-phosphorylation du récepteur de l’EGF sur la cellule
mésangiale [23]. Nous avons montré, chez le rat diabétique, que l’expression des récepteurs glomérulaires de certaines cytokines (IGF-1, insulin
growth factor -1, TGF-β, transforming growth factor) est augmentée lors
du blocage du RB2 [28]. Ces travaux sont par ailleurs en accord avec une
observation récente indiquant que la surexpression du récepteur du TGF- β
est augmentée chez les souris n’exprimant plus le RB2 [29].
La BK pourrait limiter
le stress-oxydant et améliorer le profil lipidique
Il est maintenant bien établi que l’état d’hyperglycémie chronique entraîne
la formation de produits avancés de glycation (AGE) fortement toxiques
pour la cellule [30]. Plusieurs travaux montrent une diminution de la
formation des AGE par les IEC et les ARA2, si bien qu’une réduction du
stress oxydant semble un dénominateur commun aux mécanismes d’action
de ces médicaments. Si la suppression des propriétés pro-oxydantes de
l’angiotensine II est responsable d’une grande partie de ces effets, une
action « anti-oxydante » supplémentaire pourrait résulter du recrutement
du RB2. Un des premiers travaux rapporte la réduction de certains paramètres du stress oxydant par la BK chez le rat diabétique de type 1 [31].
Une réduction de la formation de radical superoxyde et des concentrations
sériques en triglycérides et cholestérol a été démontrée après transfert du
gène de la kallicréine [32-34]. Inversement, une aggravation du profil du
stress oxydant a été décrite chez les souris n’exprimant pas le RB2 [29].
Enfin, chez le rat diabétique, notre groupe a décrit une augmentation de
l’accumulation de protéines complexées à des dérivés 4-HNE (index de la
peroxidation lipidique) lors du blocage du RB2 [28]. L’activation du RB2
pourrait donc contrôler en partie le stress oxydant, vraisemblablement par
la production tonique de NO.
Et le récepteur B1 ?
Un seul travail est en faveur d’un rôle néphroprotecteur du RB1, montrant
que le blocage pharmacologique de ce récepteur aggrave la fibrose rénale
[35]. Le RB1 peut aussi avoir des effets anti-prolifératifs car il réduit
l’hyperplasie de la média lors de lésions de la carotide chez le rat [36].
Cependant, l’hypothèse actuelle est celle d’un effet délétère de l’activation du RB1 avec le blocage du RB1 comme perspective thérapeutique, ce
qui s’avère bénéfique dans les syndromes douloureux, en particulier dans
les neuropathies diabétiques [37].
Perspectives
Bien que l’idée qu’une stimulation du RB2 de la BK puisse induire des effets
thérapeutiques bénéfiques reste encore novatrice, ce concept émerge
finalements des travaux de plusieurs groupes indépendants [28, 29, 3234]. Plusieurs agonistes non peptidiques sont disponibles et ont été testés
dans des modèles différents [38-40]. Par ailleurs, si l’on peut imaginer
que les propriétés pro-inflammatoires de la BK constituent une limitation à l’administration d’agonistes B2, on peut aussi émettre quelques
hypothèses pour limiter ces effets secondaires prévisibles : (1) la réponse
vasodilatatrice de la BK pourrait être réduite chez un animal diabétique
6
comme c’est déjà documenté pour l’acétylcholine ; (2) certaines voies de signalisation du RB2 ne seraient stimulables qu’en
situation pathologique ou en fonction de l’état d’activation
cellulaire, ce qui pourrait expliquer le paradoxe effet prolifératif/anti-prolifératif ; (3) l’état du récepteur est variable selon
la maladie. Un travail récent montre que le traitement avec un
agoniste du RB2 réduit l’hypertension pulmonaire et l’hypertrophie ventriculaire dans un modèle d’hypertension pulmonaire
chez le rat, sans modification de la pression sanguine artérielle
systémique [40]. Tout récemment, un travail très démonstratif
montre que l’infusion directe de bradykinine empêche l’inflammation et la fibrose rénale chez le rat Dahl soumis à une
surcharge sodée, en inhibant la stimulation du stress oxydant
et l’activation des MAP-kinases [41]. Une autre approche
d’activation du SKK repose sur le traitement par injection de
gènes codant pour la kallicréine avec comme résultat attendu
l’augmentation de synthèse de BK et donc l’activation du RB2.
Le transfert du gène de la kallicréine réduit la glycémie, restaure le profil lipidique et protège la fonction cardiaque chez le
rat diabétique de type I [32]. Cette approche montre aussi des
effets bénéfiques en améliorant la fibrose rénale chez le rat
hypertendu [33, 34].
La manipulation pharmacologique du SSK apparaît complexe
car elle ne peut obéir à un schéma général directeur mais doit
être évaluée en fonction des maladies (hypertension, diabète,
inflammation…) et des organes cibles. Les résultats obtenus
dans plusieurs modèles expérimentaux, dont les animaux
génétiquement modifiés, montrent, sans trop de doute, que
l’activation directe (agonistes) et/ou indirecte (via angiotensine 1-7, récepteur AT2, IEC) du RB2 de la BK peut désormais
représenter un nouveau concept thérapeutique dans le traitement de la néphropathie diabétique ou d’autre origine. ‡
SUMMARY
New perspectives for bradykinin B2
receptor in nephroprotection
Various diseases such as arterial hypertension, diabetes and
obesity result in renal diseases which are often irreversible and
resistant to currently available therapies. Beside the control of
glycaemia in diabetic patients, only the blockade of the reninangiotensin system is effective in reducing the occurrence of
glomerulosclerosis and its development towards terminal renal
failure. Inhibition of this system is based on the use of angiotensin-1 converting enzyme inhibitors (ACEI) and angiotensin
AT1 receptor antagonists. For many years, the beneficial effects
of these two classes of drugs were attributed mainly to their
interference with angiotensin II. However, recent in vitro and
in vivo evidences strongly suggest that bradykinin B2 receptor
is also involved in the nephroprotective effects of these drugs.
A compelling evidence is the finding that the development of
glomerulosclerosis is more severe in knock-out B2 receptor
mice. The nephroprotective effect of B2 receptor could be the
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SYNTHÈSE
consequence of a reduction of proteinuria, glomerular and
interstitial fibrosis, cell proliferation and of the oxidative
stress through the contribution of several well identified mechanisms. It is proposed that B2 receptor agonists
can offer a novel therapeutic avenue in the treatment of
nephropathies associated with diabetes or other vascular
diseases. ‡
TIRÉS À PART
M. Buléon
7
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TITLE: Renal pathophysiology of bradykinin B2-receptor: from diabetic
nephropathy to endotoxin shock
ABSTRACT
Nephroprotection has become a critical challenge during chronic or acute renal disease
management. In order to enlight new therapeutic targets, we have documented the role of
bradykinin B1 and B2 receptors (B1R, B2R) during diabetic nephropathy and endotoxin
shock. During diabetic nephropathy, renin-angiotensin system blockade slows the progression
of the disease. Using two models of diabetes in rat and mice, we have observed that B2R
activation is largely involved in this protective effect. We next investigated the role of B1R
and B2R in the development of renal failure during lipopolysaccharide (LPS)-induced
endotoxin shock in wild-type or mice deficient for either the B1R or the B2R. Even if further
investigations are needed, B2R activation contributes to the initial decrease in blood pressure,
whereas the inactivation of B1R appears detrimental. Our results support the hypothesis of a
protective role of B2R activation, particularly in chronic situation.
136
AUTEUR : Marie Buléon
TITRE : Physiopathologie rénale du récepteur B2 de la bradykinine : de la néphropathie
diabétique au choc septique
DIRECTEUR DE THESE : Dr Jean-Pierre Girolami et Pr Ivan Tack
LIEU ET DATE DE SOUTENANCE : le 24 avril 2008 à Toulouse
RESUME
La néphroprotection devient un enjeu majeur dans le cadre des maladies rénales chroniques
et aiguës. Nos travaux ont étudié le rôle du récepteur B2 de la bradykinine (RB2) au cours de la
néphropathie diabétique (ND) et du choc endotoxinique, dans l’optique de définir de nouvelles cibles
thérapeutiques. Le blocage du système rénine angiotensine présente une efficacité clinique pour
ralentir la progression de la ND. Nous montrons que le RB2 contribue de façon importante à cet effet
protecteur chez le rat et la souris diabétiques. De même, au cours du choc septique, les récepteurs
de la BK (RB1 et RB2) jouent un rôle important dans le dysfonctionnement rénal. Le mécanisme de
cet effet, qui reste mal connu, a donc été étudié pendant un choc endotoxinique chez des souris
sauvages ou invalidées pour RB1 et RB2. Nos résultats étayent l’hypothèse d’un effet
néphroprotecteur de l’activation du RB2, en particulier en situation chronique.
MOTS-CLES : bradykinine, glomerulosclérose, néphroprotection, fonction rénale, diabète, choc
endotoxinique.
DISCIPLINE ADMINISTRATIVE : Physiopathologie expérimentale
_
INTITULE ET ADRESSE DU LABORATOIRE : Laboratoire de Physiologie (Faculté de Médecine
Rangueil) et INSERM U858, Equipe n°5, Institut Louis Bugnard, BP 84225, 31432 Toulouse Cedex 4

PARTIE I : BK ET REIN - thèse - Université Toulouse III

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