Técnicas Genéticas aplicadas a las ciencias forenses - Victor

Técnicas genéticas aplicadas a las ciencias forenses
Víctor Acuña Alonzo Licenciatura de Antropología Física
Escuela Nacional de Antropología e Historia
‘every contact leaves a trace’
Edmond
Locard
Conceptos
Identificación individual y parentesco
Características de ?
Bases de datos poblacionales
Ejemplos
Conceptos
El ADN como evidencia •
Prueba de rutina para identificación humana y disputas de paternidad
•
PCR de alta sensibilidad → obtención de evidencia a partir de escaso material biológico •
Bases de datos de perfiles genéticos → búsqueda ágil de coincidencia de perfiles genéticos (total o parcial) → posibilidad de resolver casos no resueltos (cold cases)
→ asignación de un valor estadístico a la identificación
Jobling MA y Gill P. 2004. Encoded evidence: DNA in forensic analysis. Nature Reviews Genetics. 5: 739­752.
Conceptos
El ADN como evidencia La evidencia genética debe considerarse en el marco de otros datos, el papel del genetista no es hacer presunciones de inocencia o culpabilidad, sino proveer información objetiva al juez o jurado
Jobling MA y Gill P. 2004. Encoded evidence: DNA in forensic analysis. Nature Reviews Genetics. 5: 739­752.
Conceptos
•
En la actualidad se usan PCR multiplex para microsatélites autosómicos (amplificación simultánea de varios loci) •
Otros marcadores para usos específicos: SNPs autosómicos
Marcadores del cromosoma Y (crY)
Marcadores del ADN mitocondrial (mtDNA)
•
Además de la determinación de perfiles genéticos para identificación y disputas de paternidad, otras posibles aplicaciones de la genética son:
Deducción del origen (ancestría)
Información fenotípica
Análisis de otras especies
Jobling MA y Gill P. 2004. Encoded evidence: DNA in forensic analysis. Nature Reviews Genetics. 5: 739­752.
Conceptos
Genoma humano
Brown TA. 2002. Genomes. Garland Science.
23 Pares de Cromosomas + mtDNA
Conceptos
Núcleo de la célula
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/ Autosomas
2 copias por célula
mtDNA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
ADN nuclear
Mitocondria (múltiples copias)
3,200 millones bp
Cromosomas
sexuales
Butler JM. 2005. Forensic DNA Typing, 2nd Edition. Elsevier Academic Press
16,569 bp
ADN mitocondrial
Varias copias por célula
• STRs autosómicos (microsatélites)
Conceptos
Fuente de variación:
Herencia independiente, recombinación y mutación
Ventajas:
Poder de discriminación extremadamente alto
Desventajas:
Difícil de tipificar en muestras degradadas
> 20 mil STRs
• SNPs autosómicos
Conceptos
Fuente de variación:
Herencia independiente, recombinación y mutación
Ventajas:
Se pueden tipificar en muestras degradadas
Desventajas:
Poder de discriminación relativamente bajo (bialélicos)
> 3 millones de SNPs
Frazer KA, et al 2009. Human genetic variation and its contribution to complex traits. Nature Reviews Genetics 10, 241­251
• STRs crY
Conceptos
Fuente de variación:
Sólo mutación
Ventajas:
Específico de varones, útil en mezcla de muestras de mujer y varón
Distribución filogeográfica bien definida
Desventajas:
Poder de discriminación relativamente bajo, se comparte por vía paterna, posibles problemas de estructura de poblaciones
• SNPs del ADN mitocondrial
Conceptos
Fuente de variación:
Sólo mutación
Ventajas:
Mayores probabilidades integridad Distribución filogeográfica bien definida
Desventajas:
Heteroplasmia, Poder de discriminación relativamente bajo, se comparte por vía materna, posibles problemas de estructura de poblaciones
Región
Haplogrupos
África
L0, L1, L2, L3.
Europa
H, I, J, N1b, T, U, V, W, X
Asia
A, B, C, D, G, Y, Z
América
A, B, C, D, X
Variación en el genoma humano Conceptos
­ Nuestras secuencias son idénticas en un 99.9% (especie “joven”). ­ En el genoma humano hay más de 10 millones de SNPs y decenas de miles de STRs entre otros polimorfismos
­ Esta variación se estructura en bloques cromosómicos (haplotipos) de 5 a 200K bp
­ 85 a 90% de la variación genética neutral se atribuye a diferencias entre individuos dentro de las poblaciones
­ El restante 10 a 15% se distribuye entre grupos
Esta variación es modesta pero influencia las diferencias que existen entre las poblaciones respecto a características fenotípicas
PCR
Conceptos
1920s­1950s otros polimorfismos de grupos sanguíneos y proteínas (MNSs, Rhesus, Lewis, Kell, haptoglobinas ...)
1900
1920
Primer polimorfismo genético, ABO (Landsteiner)
Pm
Primer kit forense comercial HLA­DQA1
1984
Uso de mtDNA y Y­STRs en UK National casos forenses DNA Database
1988 1991 1992 1993 1995 1997
Multilocus DNA fingerprint, minisatélites (Jeffreys)
Primeros STRs para identificación humana
Primer caso de desastre masivo (Waco Texas)
Determinación de perfiles genéticos a partir del contacto con objetos
< 10­13
∼ 0.01­0.001 pocos loci
poco polimórficos
alta probabilidad de coincidencia
Primer kit comercial de STRs forenses
muchos loci
muy polimórficos
muy baja probabilidad de coincidencia
Jobling MA y Gill P. 2004. Encoded evidence: DNA in forensic analysis. Nature Reviews Genetics. 5: 739­752.
Conceptos
Identificación individual y parentesco
Características de X
Bases de datos poblacionales
Ejemplos
Sistema de identificación más usado:
ó
n
Identificaci
Combined DNA Index System
STRbase http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/
ó
n
Identificaci
THO1
Multiplex de 2 individuos
ó
n
Identificaci
STRbase http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/
Características de los STRs seleccionados para id
Identificaci
•
•
ó
n
•
•
•
•
•
•
•
•
Alta tasa de mutación
Gran número de alelos en cada población
Alta heterocigosidad
Herencia independiente (no ligados)
Buenos marcadores individuales, no suelen ser marcadores de ancestría
Neutrales en su mayoría
Tetranucleótidos, fáciles de amplificar
Alto poder de discriminación
Probabilidad muy baja de coincidencia aleatoria (match)
¡Muchas bases de datos!
STRbase http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
ó
n
Identificaci
Fuentes de evidencia
Sangre
Semen
Saliva
Orina
Cabello
Diente
Hueso
Tejido
Uñas
Objetos x contacto
J.M. Butler. 2005. Forensic DNA Typing, 2nd Edition. Elsevier Academic Press
Prueba de identificación
Identificaci
?
Muestra de escena del delito o investigación de paternidad (dubitada)
ó
n
Extracción
ADN
Biología
Cuantificación del ADN
Amplificación de múltiples marcadores
Tecnología
Separación y detección de los productos de PCR
Determinación de los genotipos de la muestra
Genética
Comparación del perfil genético con otros resultados (muestras de referencia, indubitadas)
Generación de un reporte de caso con la probabilidad de coincidencia al azar (match)
Si se da una coincidencia, comparación con bases de datos poblacionales J.M. Butler. 2005. Forensic DNA Typing, 2nd Edition. Elsevier Academic Press
• Match – Los perfiles genéticos coinciden. Se reporta la significancia estadística.
ó
n
Identificaci
Resultados posibles de la prueba
• Exclusión (Non­match) – La comparación de genotipos muestran diferencias en el perfil genético.
• No concluyente – Los datos no permiten llegar a una conclusión (desacuerdo entre los expertos, falta de datos, etc). J.M. Butler. 2005. Forensic DNA Typing, 2nd Edition. Elsevier Academic Press
• La probabilidad de que dos individuos no relacionados compartan un perfil de DNA
• Se calcula con la regla del producto para la probabilidad conjunta de que ocurra un perfil genético determinado en una población determinada
• Puede aumentar en los siguientes casos:
– Perfil de ADN parcial por degradación y reducción del número de loci informativos
– Si el sospechoso y el culpable real tienen parentesco o si
se originan de la misma subpoblación
ó
n
Identificaci
Probabilidad de match (Pm)
Para una correcta valoración estadística de la prueba de ADN es necesario disponer de una base de datos lo más extensa posible (N > 200) que sea representativa de la población a la que pertenecen los individuos que se han analizado. ó
n
Identificaci
Bases de datos poblacionales
En el caso de que existan subgrupos de población claramente diferenciados es importante que estén incluidos en la base de datos
Generar datos de la población o las poblaciones deseadas (en caso de poblaciones multiétnicas) N>100
•
Determinar las frecuencias alélicas para cada locus
ó
n
Identificaci
•
•
Usar la frecuencia alélica para estimar la rareza de un perfil genético particular
Homocigotos (p2), Heterocigotos (2pq)
–
Usar la regla del producto combinada en varios loci
–
J.M. Butler. 2005. Forensic DNA Typing, 2nd Edition. Elsevier Academic Press
Tablas de frecuencias alélicas
Butler et al. (2003) JFS 48(4):908­911
D3S1358
Caucasian
Allele 11
African American
Caucasian
N= 7,636
African American
N=258
N= 7,602
­­
0.0003*
0.0017*
0.0009
Allele 11
12
0.0017*
0.0007
12
­­
0.0045
13
­­ 0.0031
13
0.0019*
0.0077
14
0.1027
0.1240
14
0.0892
0.0905
15
0.2616
­­
0.2690
­­
15
0.3023
0.2920
15.2
0.0019*
0.0010
16
0.2533
0.2430
16
0.3353
0.3300
17
0.2152
0.2000
17
0.2054
0.2070
18
0.15232
0.1460
18
0.0601
0.0630
19
0.01160
0.0125
19
0.0039*
0.0048
20
0.0017*
0.0001*
15.2
N= 302
Einum et al. (2004) JFS 49(6)
20
Butler J.M. 2005. Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
Frecuencia del perfil genético con los 13 loci STR CODIS AmpFlSTR® Identifiler™ (Applied Biosystems)
Perfil 16,17
17,18
21,22
12,14
28,30
14,16
12,13
11,14 9,9
9,11
6,6
8,8
10,10
TH01
D19 D3 D8
AMEL
D5
Locus D3S1358 allele 16
VWA
D21
value 0.2533 TPOX
D13
D7
D16
FGA
allele 17 CSF
D18
value 0.2152 1 in
9.17
VWA 17 0.2815 18
0.2003 8.87
FGA 21
0.1854
22
0.2185
12.35
D8S1179 12
0.1854 14
0.1656 16.29
D21S11 D18S51 D5S818 D13S317 D7S820 D16S539 THO1 TPOX CSF1PO 28 14
12
11
9
9
6
8
10
0.1589 0.1374 0.3841
0.3394 0.1772
0.1126 0.2318 0.5348 0.2169 30 16
13
14
0.2782 0.1391 0.1407 0.0480 11 0.3212 11.31
26.18
9.25
30.69
31.85
13.8
18.62
3.50
21.28
D2
Combined
9.17 P
81 R
O
D
16,364 U
185,073 C
4,845,217 T
1005
44,818,259
1.38 x 109
4.38 x 1010
6.05 x 1011
1.13 x 1013
3.94 x 1013
8.37 x 1014
Probabilidad de coincidencia al azar para este perfil en la población eurodescendiente e EUA: 1 en 837 trillones
R
U
L
E
Aplicaciones del genotipado para identificación
ó
n
Identificaci
o Casos forenses
o Bases de datos de ADN
o Desastres masivos
o Desaparecidos
o Pruebas de parentesco
o Genealogías y casos históricos
o Identidad de líneas celulares humanas
o Detección de quimeras genéticas
o Monitoreo de trasplantes
o Detección de tumores
o Mapeo de enfermedades o Estudio de la diversidad humana
Otros
• Identificación de especies (conservación)
• Identificación de animales domésticos
STRbase http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/
o Cantidad e integridad del material genético
o Contaminación (mezcla de perfiles genéticos, inhibición PCR)
o Bases de datos de referencia (→ estimación probabilística)
o Muestras de referencia para el caso (familiares, sospechosos...)
o $
ó
n
Identificaci
Límites de las técnicas genéticas
Aspectos básicos
o Toma de muestra adecuada
o Cadena de custodia
o Extracción exitosa del material genético
o Control de calidad de todos los procesos del laboratorio → Laboratorios certificados
Conceptos
Identificación individual y parentesco
Características de ?
Bases de datos poblacionales
Ejemplos
• Cuando el perfil genético de una escena del crimen no coincide con ningún perfil de las bases de datos, cualquier información que se pueda obtener será útil:
ísticas
Caracter
Características
• Deducción del origen (ancestría)
STRs de uso forense no son marcadores de ancestría individual
Por el contrario, mtDNA y crY han sido excelentes marcadores de filogeografía, sin embargo su uso sería problemático en poblaciones mestizas
• Información fenotípica
STRs de uso forense no aportan ninguna información fenotípica.
¿USAR OTRAS VARIABLES GENÉTICAS?
Marcadores para estimar ancestría
Caracter
Ancestry Informative Markers
ísticas
Los AIMs se seleccionan para maximizar las diferencias absolutas en las frecuencias alélicas entre dos poblaciones ancestrales. El AIM ideal está fijado en una población y es muy abundante en otra (>60%). Permiten realizar estimaciones de ancestría individual
Sólo el 2% de los SNPs autosómicos tiene valores > 60% entre las 3 grandes agrupaciones continentales.
VL Martinez­Marignac, et al 2007. Admixture in Mexico City: implications for admixture mapping of type 2 diabetes genetic risk factors. Hum Genet, 120(6): 807­19. El caso excepcional de D9S1120 9AR en amerindios
Wang S, et al. 2007. Genetic Variation and Population Structure in Native Americans. PLoS Genet 3(11): e185.
ísticas
Caracter
ísticas
Caracter
Marcadores asociados a variaciones fenotípicas
No se habían descrito polimorfismos inequívocamente asociados para la gran mayoría de las características fenotípicas que podrían ser de interés para describir al culpable de un crimen (estatura, color de piel...)
Recientemente se han identificado alelos asociados a fenotipos que eventualmente podrían ser usados estimar algunas características.
www.hapmap.org
Conceptos
Identificación individual y parentesco
Características de X
Bases de datos poblacionales
Ejemplos
Jobling MA y Gill P. 2004. Encoded evidence: DNA in forensic analysis. Nature Reviews Genetics. 5: 739­752.
Bases de datos
Bases de datos poblacionales
ENFSI DNA WG Population Database
European Network of Forensic Science Institutes
http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/
STRBase Short Tandem Repeat DNA Internet DataBase
Created by John M. Butler and Dennis J. Reeder (NIST Biochemical Science Division) http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/
Revistas especializadas: Forensic Science International Genetics
Journal of Forensic Sciences
Tsar Nicholas II profile
Bases de datos
Bases de datos
Bases de datos
Autosomal SNPs
•70 Loci (Vallone et al. 2005 Forensic Sci. Int. 149: 279­286.)
• U.S. Caucasian (N=74)
• African American (N=71)
• U.S. Hispanic (N=44)
ASTM and American Academy of Forensic Sciences
Elsevier Science
Springer­Verlag
Elsevier Science
J.M. Butler. 2005. Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
Conceptos
Identificación individual y parentesco
Características de X
Bases de datos poblacionales
Ejemplos
Ejemplos
http://www.innocenceproject.org/
¿Qué datos están disponibles en México?
Ejemplos
American Journal of Human Biology
Volume 20, Issue 5, Date: September/October 2008, Pages: 605­613 In the early morning hours of July 17, 1918 the royal family and their staff were led to the cellar of the Ipatiev House where they were being held and executed.
In the late 1970s, a local geologist, Dr. Alexander Avdonin was able to locate the mass grave containing the remains of five of the seven members of the royal family and their four servants.
In the summer of 2007, a group of amateur archeologists discovered a few bone fragments approximately 70 meters from the first grave. Following an official archeological excavation conducted by Dr. Sergei Pogorelov, Deputy Director of the Sverdlovsk Region's Archaeological Institute, a set of 44 bone fragments and teeth were carefully recovered from the site. (..) the LR of the hypothesis (H1) that samples 146.1 and 147 are the children of Tsar Nicholas II and Tsarina Alexandra (and siblings of the three princesses from grave one) compared to the alternative hypothesis that these samples are individuals completely unrelated to the Romanov family (H2), we found that the DNA evidence is 4.36 trillion times more likely if sample 147 is a daughter of Tsar Nicholas II and Tsarina Alexandra, and over 80 trillion times more likely if sample 146.1 is a son of Tsar Nicholas II and Tsarina Alexandra than if these samples were from two unrelated individuals. ‘the little things are infinitely the most
important’
Sherlock Holmes