MILENA SOBRAL ESPÍNDOLA Aspectos imunológicos e

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada
MILENA SOBRAL ESPÍNDOLA
Aspectos imunológicos e epigenéticos que
caracterizam a disfunção sistêmica induzida pelo
vírus da imunodeficiência humana
RIBEIRÃO PRETO
2015
MILENA SOBRAL ESPÍNDOLA
Aspectos imunológicos e epigenéticos que caracterizam a
disfunção sistêmica induzida pelo vírus da
imunodeficiência humana
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
para obtenção do título de Doutora em Ciências.
Área de Concentração: Imunologia Básica e
Aplicada
Orientadora: Profa. Dra. Fabiani Gai Frantz
RIBEIRÃO PRETO
2015
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Catalogação da publicação
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Universidade de São Paulo
Espíndola, Milena Sobral
Aspectos imunológicos e epigenéticos que caracterizam a
disfunção sistêmica induzida pelo vírus da imunodeficiência
humana. Ribeirão Preto, 2015.
Número de paginas p. 119: il.; 30cm
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Imunologia Básica
e Aplicada.
Orientadora: Frantz, Fabiani Gai
1. HIV; 2. Inflamação crônica; 3. Bioassinatura imunológica; 4.
Monócitos; 5. Alterações epigenéticas
ESPÍNDOLA, M. S. Aspectos imunológicos e epigenéticos que caracterizam a
disfunção sistêmica induzida pelo vírus da imunodeficiência humana. Tese de
Doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São
Paulo para obtenção de título de Mestre em Ciências.
Aprovado em: ___/___/____
Banca Examinadora
Prof.Dr.__________________________________Instituição___________________
Julgamento: _____________________Assinatura:___________________________
Dedico este trabalho à minha mãe Inês e à minha avó materna Margarida Mãe e avó. Acima de tudo mulheres. Mulheres fortes. Independentes. Que contra todas as adversidades proporcionadas pela vida, foram e continuam sábias e plenas em seus respectivos papéis. São inspiração de luta e dedicação, paciência e coragem, força e sabedoria. Como filha e neta, a essência do que sou, devo a vocês. Todos os dias, vocês me inspiram um pouco mais a ser alguém melhor! Agradecimentos
À minha orientadora e amiga, Prof. Dra. Fabiani Gai Frantz, sobretudo pela confiança depositada em mim. Tenho muito orgulho de ter sido parte da fundação de seu grupo de pesquisa. Tenho imensa gratidão por acreditar em meu potencial e trabalho. Sou grata pela oportunidade, liberdade e por todos os desafios que vencemos juntas! Muito do que me tornei profissionalmente devo a você. Eu vou, mas nossa parceria fica! À Prof. Dra. Lúcia Faccioli, que abriu as portas para minha carreira acadêmica e desde o mestrado acompanha o meu trabalho. Agradeço pela disponibilidade, atenção e ensinamentos durante todo o período que trabalhamos juntas! À minha mãe, meus irmãos Marília e Pedro e Wanderley, minha família. À minha mãe por ser o ser humano mais dedicado aos filhos que conheço. Por me apoiar em todas as minhas escolhas, por ter me dado a oportunidade de estar onde estou hoje e forças em todos os momentos difíceis. À Marília, por ser essa irmã maravilhosa, atenciosa e cheia de amor. A Pedro, por ser uma pessoa tão serena, que sempre nos ensina com seu caráter. Segundo nossa mãe, ele tem muito do nosso pai. Obrigada por através de você, fazê-‐lo sempre presente em nossas vidas. Obrigada aos quatro por vibrarem comigo em cada conquista, todas as minhas vitórias são de vocês também! Aos membros da Família Sobral e Família Espíndola. Todos vocês, avós, tios, tias, primos, madrinhas e padrinho, significam muito pra mim e mostram todos os dias que uma família unida vence tudo. Sua força e união são inspiradoras! Aos amigos do LIME e LIIP. Aos que permanecem até hoje e aos que já partiram pra novas aventuras. Muito além de dividirmos um espaço de trabalho, somos colaboradores e todos os dias aprendemos um pouco com o outro. Agradeço a oportunidade de aprender com vocês. Não precisarei citar nomes pra demonstrar a importância de vocês durante esses 4 anos. Cada um, com seu jeito me deixou ensinamentos valiosos. Desde discussões científicas, experimentos, noites no laboratório, manhãs no HC, discussões não científicas, risadas no café, almoços, encontros extra lab, até as badaladas festas da garrafa. Espero que mesmo com meu jeitinho singelo (chata), tenha contribuído de alguma forma com o aprendizado de vocês também! Estarei sempre disposta a ajudar quando precisarem e torcendo pelo sucesso de cada um. Agradeço especialmente à Patrícia, minha amiga desde quando pisei nessa cidade. Seu companheirismo e parceria em todos os aspectos foram fundamentais pra minha formação profissional e pessoal! Claudia, que foi quase uma mãe pra todo mundo. Sempre tinha uma palavra amiga e um convite gastronômico que renderam muitas alegrias! Karina, agradeço por estar tão presente nessa reta final. Obrigada por torcer e vibrar junto comigo em todos os momentos. Aos amigos que a vida me deu em Ribeirão, Luiza, Aline e Hudson. Mais que convivência, vocês foram peças essenciais nesses anos! Infinitos fins de semana, almoços, conversas, temakis que fizeram meus dias mais felizes e completos. Vocês foram minha família aqui e continuarão sendo! Agradeço todos os momentos compartilhados e os que ainda estão por vir! Aos amigos de Recife, Messias, Diogo, Dáfila, Monique, Wyron. Suilane. Mais que amigos, vocês são meus amores, a família que escolhi pra mim! Agradeço por todos os momentos, por estarem tão presentes, mesmo tão distantes fisicamente. Todos os facetimes, ligações, torcida, acolhimento e amor preenchem os momentos que não pudemos estar juntos! Aos professores que colaboraram com este trabalho. Prof. Olindo Martins-‐Filho, que foi acolhedor e essencial com as análises. Sou fã do seu trabalho! Prof. Valdes Bollela, que esteve sempre tão disponível e viabilizou nosso contato com os pacientes. Prof. Cleni Machado, que disponibilizou seu laboratório sempre que precisamos. Prof. Célio Lopes Silva e sua equipe, Aninha, Iza e Wendy por serem sempre tão solícitos e disponíveis para ajudar em todos os experimentos na nossa amada P3. À equipe técnica do laboratório, Caroline Fontanari, Aline Galvão, Carlos Sorgi e Fabiana Morais por todo o apoio e suporte técnico e administrativo que foram essenciais para o funcionamento do laboratório e realização deste trabalho. À toda equipe da UETDI do Hospital das Clínicas, aos médicos, que sempre foram solícitos ao nos dar as informações que precisávamos e aos funcionários que sempre nos receberam tão bem, em especial ao Chico. Aos pacientes HIV+ e em especial aos que se dispuseram a participar da nossa pesquisa. Mesmo com o contato rápido aprendi muito sobre respeito, simplicidade e esperança. Essas pessoas travam uma luta diária contra uma doença ainda sem cura. Vivem na esperança de uma notícia que possa novamente mudar o rumo de suas vidas. Espero que mesmo com o pouco que disponibilizo com meu estudo, possa de alguma forma contribuir cientificamente para a melhoria de vida de cada um. Aos doadores de sangue do Hemocentro, que com um gesto gratuito, doam sangue para salvar vidas e para viabilizar pesquisas como a nossa. À Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e à Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto pela infraestrutura. Ao programa de Pós-‐
Graduação em Imunologia Básica e Aplicada, todos os professores, alunos e funcionários pela troca de conhecimento e formação acadêmica. Espero que cada aluno que passe pelo programa não seja apenas mais um número, mas que deixe também sua marca de construção e manutenção do programa. Que tenham sempre a consciência de ser mais justos e éticos com todos que, de todas as partes do Brasil, decidem se juntar a vocês em busca de conhecimento. À FAPESP pelo auxílio financeiro (Processos no 2011/12512-‐0 e no 2011/12199-‐0), fundamental para a realização do deste trabalho. "A mente que se abre a uma nova ideia, jamais voltará ao seu tamanho original." (Albert Einstein) ESPÍNDOLA, M.S. RESUMO
ESPÍNDOLA, MS. Aspectos imunológicos e epigenéticos que caracterizam a
disfunção sistêmica induzida pelo vírus da imunodeficiência humana. 2015.
119f. Tese (Doutorado) Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de
São Paulo, Ribeirão Preto, 2015.
O vírus da imunodeficiência humana (HIV) é o agente causador de uma das mais
importantes doenças infecciosas da atualidade, atingindo a marca de 78 milhões de
pessoas infectadas e 39 milhões de mortes desde seu surgimento na década de
1980. A disfunção imunológica, típica da doença, inicia-se com a infecção e
depleção de linfócitos T CD4+, os principais alvos virais. A terapia antirretroviral
(TARV) alterou o desfecho da doença em todo o mundo, uma vez que a completa
supressão da viremia melhora a saúde e prolonga a expectativa de vida de
pacientes HIV+. No entanto, em alguns casos o quadro de inflamação crônica
persiste, mesmo em pacientes tratados, e é associado à quebra da homeostase das
barreiras epiteliais intestinais que causam translocação microbiana e induzem
efeitos sistêmicos através da estimulação de células da resposta imune inata, como
os monócitos. Dessa forma, a identificação de novos biomarcadores imunológicos e
epigenéticos em células chave na imunopatogênese da doença podem dar origem a
uma nova perspectiva em intervenções terapêuticas na era TARV. Portanto o
objetivo do deste trabalho foi correlacionar alterações imunológicas sistêmicas em
pacientes HIV+, em tratamento ou não, com alterações funcionais e epigenéticas de
monócitos. Após caracterização da bioassinatura imunológica de pacientes HIV+
virgens de tratamento e em uso de diferentes regimes de TARV através da
quantificação de biomarcadores plasmáticos, demonstramos por análises de biologia
dos sistemas que o tratamento empregado direciona o hospedeiro à geração de
perfis imunológicos distintos. Pacientes que faziam uso da primeira linha de
tratamento há mais de 6 meses, apresentaram um perfil de bioassinatura
semelhante ao de indivíduos não infectados, enquanto pacientes que faziam uso de
medicamentos da segunda linha de tratamento permaneciam em um estado de
inflamação moderada, que se aproximou do padrão de pacientes HIV+ virgens de
tratamento. Demonstramos ainda que as interações entre IP-10, TNF-α, IL-6, IFN-α
e IL-10 são essenciais na caracterização da doença e que IP-10>TNF-α>IFN-α,
x
ESPÍNDOLA, M.S. respectivamente, são os melhores biomarcadores de segregação de pacientes em
diferentes regimes terapêuticos. Monócitos de pacientes HIV+ apresentaram
disfunções na capacidade de fagocitose e atividade microbicida, demonstrando
alterações na produção de citocinas e espécies reativas de oxigênio frente a
estímulo com M. tuberculosis in vitro. Além disso, pudemos observar que a dinâmica
de expressão de enzimas responsáveis por alterações epigenéticas estava alterada
em pacientes identificados como progressores rápidos da doença, caracterizando
um estado de ativação celular prévio em monócitos que se associa com o estado de
hiperativação sistêmica encontrada em pacientes HIV+.
Palavras chave: HIV; inflamação crônica; bioassinatura imunológica; monócitos;
alterações epigenéticas
xi
ESPÍNDOLA, M.S. ABSTRACT
ESPÍNDOLA, MS. Immunological and epigenetic aspects that characterize
systemic dysfunction induced by human immunodeficiency virus. 2015. 119f.
Tese (Doutorado) Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São
Paulo, Ribeirão Preto, 2015.
The human immunodeficiency virus (HIV) is the agent of one of the most important
infectious diseases nowadays, reaching the mark of 78 million people infected and
39 million deaths since its advent in the 1980s. The typical immune dysfunction starts
with the infection and depletion of T CD4+ lymphocytes, the main viral targets. Antiretroviral therapy (HAART) has altered the outcome of the disease worldwide, since
the complete suppression of viremia improves health and prolongs the life
expectancy of HIV patients. However, in some cases chronic inflammation persists,
even in treated patients and is associated with the breakdown of intestinal epithelial
barriers homeostasis causing microbial translocations and inducing systemic effects
through stimulation of innate immune response cells such as monocytes. Thus, the
identification of new immunological and epigenetic biomarkers in key cells associated
with the disease immunopathogenesis may give rise to a new perspective in
therapeutic interventions in the HAART era. Therefore the aim of this study was to
correlate systemic immunological changes in HIV patients, undergoing treatment or
not, with functional and epigenetic changes in monocytes. After characterization of
immune biosignature from HIV untreated or treated patients under distinct HAART
through quantification of plasma biomarkers, by using systems biology approaches,
we demonstrated that the choice of treatment drives the host to the generation of
distinct immunological profiles. Patients under the first-line HAART presented a
similar pattern to non-infected individuals, while patients under the second-line
HAART remained in a moderate inflammatory state, which approximates to untreated
HIV pattern. We also demonstrated that interactions between IP-10, TNF-α, IL-6,
IFN-α and IL-10 were primordial in disease characterization and that IP-10>TNFα>IFN-α, respectively, are the best biomarkers for segregation of patients in different
therapeutic regimes. Monocytes from HIV patients showed dysfunctional ability of
phagocytosis and killing, presenting changes in cytokines and reactive oxygen
species production after stimulus with M. tuberculosis in vitro. In addition, we showed
xii
ESPÍNDOLA, M.S. that the dynamics of enzymes expression responsible for epigenetic changes was
altered in patients identified as disease rapid progressors, highlighting a previous
activation state in monocytes, which associates with the systemic hyperactivation
state found in HIV patients.
Key
words:
HIV; chronic inflammation; immunological biosignature;
monocytes; epigenetic alterations
xiii
ESPÍNDOLA, M.S. LISTA DE ABREVIATURAS
AIDS
ATF2
AZT
CARM1
CCR5
cDNA
CD4
CD14
CD163
CpG
CXCR4
DNA
DNMTs
ELISA
FDA
GM-CSF
HATs
HDACs
HDMs
HIV
HKs
HMTs
H3K4
H3K27
IFN-α
IFN-γ
IL-1β
IL-4
IL-5
IL-6
IL-10
IL-12(p70)
IL-15
IL-17
IL-22
IL-23
IP
IP-10
ITRN
ITRNt
ITRNN
KAT
KDM5B/6B
KMT 2C/2E
LPS
Acquired Immune Deficiency Syndrome
Activating Transcription Factor 2
Azidotimidina (ou Zidovudina)
Coactivator-Associated Arginine Methyltranferase
C-C Recetor chemokine 5
complementary Deoxyribonucleic Acid
Cluster differentiation 4
C phosphate G
C-X-C chemokine receptor 4
Deoxyribonucleic Acid
DNA methyltransferases
Enzyme-linked immunosorbent assay
US Food and Drug Administration
Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Fator
Histone Acetyltransferases
Histone Deacetylases
Histone Demethylases
Human Immunodeficiency Virus
Histone Kinases
Histone Methyltransferases
Histone 3 Lysine 4
Histone 3 Lysine 27
Interferon-alfa
Interferon-gama
Interleucina 1 beta
Interleucina 4
Interleucina 5
Interleucina 6
Interleucina 10
Interleucina 12, subunidades p35 e p40
Interleucina 15
Interleucina 17
Interleucina 22
Interleucina 23
Inibidor de protease
Interferon gamma-induced protein 10
Inibidores da Transcriptase Reversa Análogos de Nucleosídeos
Inibidores da Transcriptase Reversa Análogos de Nucleotídeos
Inibidores da Transcriptase Reversa não Análogos de Nucleosídeos
K (lysine) Acetyltransfrase
K (lysine) demethylase 5B/6B
K (lysine) Methyltransferase 2C/2E
Lipopolissacarídeo
xiv
ESPÍNDOLA, M.S. MBDs
MECP2
MIP-1
MCP-1
MOI
Mtb
mRNA
NADPH
NI
PBMC
PBS
PCR
PMA
PRMT5
RANTES
RNA
ROS
sCD14
sCD163
SETD1B
Sin3A
SIV
SMYD3
SUV39H1
TARV
Th1
TLRs
TNF-α
Methyl-CpG binding domain proteins
Methyl-CpG binding protein 2
Macrophage inflammatory protein - 1
Monocyte chemotactic protein-1
Multiplicity of infection
Mycobacterium tuberculosis
messenger Ribonucleic Acid
Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
Indivíduos não infectados
Periferic Blood Mononuclear Cells
Phosphate buffered saline
Polymerase Chain Reaction
Phorbol myristate acetate
Protein arginine methyltranferase 5
Regulated on activation, normal T cell expressed and secreted
Ribonucleic Acid
Reactive Oxygen Species
Soluble CD14
Soluble CD163
SET Domain Containing 1B
SIN3 transcription regulator Family member A
Simian immunodeficiency virus
SET and MYND domain containing 3
Histone-lysine N-methyltransferase
Terapia antirretroviral
Type 1 T helper cell
Toll-like receptor
Tumor necrosis factor-alpha
xv
ESPÍNDOLA, M.S. ÍNDICE
Agradecimentos ................................................................................................................... vi
Epígrafe ............................................................................................................................... ix
RESUMO .............................................................................................................................. x
ABSTRACT ........................................................................................................................ xii
LISTA DE ABREVIATURAS .............................................................................................. xiv
ÍNDICE .............................................................................................................................. xvi
1. Introdução .........................................................................................................................18
1.1 HIV/AIDS - Aspectos Gerais: história, epidemiologia, transmissão e patogênese .......19
1.2 A terapia antirretroviral (TARV) e a nova era da infecção por HIV como doença
inflamatória crônica ............................................................................................................21
1.3 A evolução dos Biomarcadores na infecção por HIV ...................................................25
1.4 O monócito como peça-chave na disfunção imune durante a infecção por HIV ..........26
1.5 Regulação epigenética e sua importância nas doenças ..............................................28
2. Objetivos ...........................................................................................................................31
2.1 Objetivo Geral: ..............................................................................................................32
3. Material e Métodos ..........................................................................................................33
3.1 Casuística .....................................................................................................................34
3.2 Determinação da concentração de biomarcadores plasmáticos ..................................37
3.3 Isolamento de monócitos do sangue periférico ............................................................38
3.4 Análise das subpopulações de monócitos no sangue periférico ..................................38
3.5 Obtenção de Mycobacterium tuberculosis ...................................................................39
3.6 Avaliação da função fagocítica e microbicida de monócitos ........................................40
3.7 Quantificação de citocinas no sobrenadante de cultura de monócitos ........................41
3.8 Determinação da produção de Espécies Reativas de Oxigênio pelos monócitos .......41
3.9 Determinação do padrão de metilação global do DNA cromossômico ........................41
3.10 PCR Array para as enzimas que regulam as alterações epigenéticas ......................42
3.11 Análise dos Dados ......................................................................................................43
3.11.1 Análise Estatística Convencional ............................................................................44
3.11.2 Análise da Bioassinatura de Biomarcadores Plasmáticos e Epigenéticos ..............44
3.11.3 Rede de Correlações entre Biomarcadores ............................................................45
3.11.4 HeatMap e Árvore de Decisão ................................................................................45
4. Resultados........................................................................................................................46
Parte I - Perfil Imunológico de Pacientes HIV+ não tratados ou em uso de diferentes tipos
de TARV: Uma visão de biologia dos sistemas ..................................................................46
4.1 Perfil imunológico global de pacientes HIV+ , virgens de tratamento ..........................47
4.2 Perfil de biomarcadores plasmáticos e marcadores imunológicos em pacientes HIV+
sob diferentes tratamentos antirretrovirais. ........................................................................49
4.3 Análise da Bioassinatura Imunológica de pacientes HIV+, virgens de tratamento ou em
uso de diferentes regimes terapêuticos ..............................................................................53
4.4 Análise da Bioassinatura Imunológica de pacientes de acordo com biomarcadores de
progressão ..........................................................................................................................58
xvi
ESPÍNDOLA, M.S. 4.5 Análise das Correlações entre os Biomarcadores Imunológicos, uma visão de biologia
dos sistemas. ......................................................................................................................64
4.6 Geração de Heatmaps para a identificação dos melhores biomarcadores imunológicos
e sua correlação com os diferentes grupos clínicos. ..........................................................66
4.7 Geração de árvore de decisão levando em consideração os principais biomarcadores
encontrados na infecção por HIV .......................................................................................68
Parte II- Associação entre a disfunção imune de monócitos e alterações epigenéticas
induzidas pela infecção por HIV .........................................................................................70
4.8 Avaliação da capacidade fagocítica e microbicida de monócitos de pacientes HIV+ ..71
4.9 Avaliação da produção de citocinas e quimiocinas em sobrenadante de cultura ........75
4.10 Avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) ...............................77
4.11 Análise das subpopulações de monócitos no sangue periférico ................................79
4.12 Análise da Metilação Global do DNA .........................................................................81
4.13 Análise da frequência de enzimas que promovem alterações epigenéticas ..............83
4.14 Correlações entre os Fatores Epigenéticos, Imunológicos e Progressão da doença 86
5. Discussão .............................................................................................................. 93
6. Conclusão ........................................................................................................... 105
7. Referências Bibliográficas ................................................................................... 107
Anexos ................................................................................................................................120
Anexo I - Manuscritos submetidos referentes ao projeto de Doutorado ..........................121
Anexo II - Manuscritos publicados ou aceitos para publicação realizados em colaboração
durante o período de doutorado .......................................................................................187
Anexo III – Liberação do Comitê de Ética em Pesquisa para início do estudo ................191
Anexo IV – Termo de Consentimento de Indivíduos Controles ........................................192
Anexo IV – Termo de Consentimento de Pacientes HIV+................................................194
xvii
ESPÍNDOLA, M.S. 1. Introdução
18
ESPÍNDOLA, M.S. Introdução 1.1 HIV/AIDS - Aspectos Gerais: história, epidemiologia, transmissão e
patogênese
Nas últimas três décadas presenciamos o aparecimento de uma das
doenças infecciosas mais temidas e devastantes da atualidade, a AIDS, síndrome
da imunodeficiência adquirida, associada à infecção pelo vírus da imunodeficiência
humana, o HIV. Este vírus, passou pelo status de um patógeno até então
desconhecido, a se tornar o causador de uma pandemia de importantes proporções,
atingindo a marca de 78 milhões de pessoas infectadas e 39 milhões de mortes
desde a década de 1980 até os dias atuais [1]. Ao longo dos anos, a AIDS, tornouse mundialmente conhecida por diferentes aspectos, desde o estigma social,
discriminação e negação política a esforços de cientistas e grandes descobertas.
Apesar do empenho e significativos avanços, a cura da doença ainda não existe. No
entanto, hoje, o tratamento com antirretrovirais vem mudando a perspectiva da
doença e inicia uma era na qual os pilares “prevenção” e “eliminação da
transmissão” são os principais caminhos para se chegar ao tão esperado fim da
AIDS como epidemia.
O HIV é um retrovírus do gênero Lentivirus, que surgiu na espécie humana
como consequência de infecções entre espécies a partir de lentivirus derivados de
diferentes primatas africanos [2] e acredita-se que o primeiro grupo de pessoas
infectadas foram caçadores de animais selvagens [3]. Existem dois tipos atualmente
descritos, o HIV-1 e HIV-2, os quais possuem origens distintas. Enquanto o HIV-1
possui similaridades com o SIVcpz, advindo de chimpanzés [4]; o HIV-2 tem relação
próxima ao SIVsmm, proveniente de macacos mangabeis fuliginosos [5].
A AIDS foi reconhecida como uma nova patologia em 1981 pelo Centro de
Controle e Prevenção de Doenças (CDC), após relatos de médicos americanos
apontando um crescente número de mortes de jovens homossexuais do sexo
masculino devido a infecções oportunistas e a ocorrência de sarcoma de Kaposi [69]. A identificação e isolamento do HIV ocorreu primeiramente em 1983 pelo grupo
liderado por Luc Montagnier e um ano mais tarde, o vírus foi confirmado como o
agente causador da AIDS, sendo caracterizado de forma biológica e molecular por
Robert Gallo [10-12].
De acordo com o Programa das Nações Unidas em HIV/AIDS (UNIAIDS),
estimou-se que no ano de 2013, 35 milhões de pessoas estariam infectadas com
HIV no mundo, e destas, 70% habitavam a região subsaariana da África. O número
19
ESPÍNDOLA, M.S. Introdução de mortes relacionadas à AIDS vem decrescendo ao longo dos anos devido ao
aumento do acessibilidade ao tratamento, assim como o atendimento e suporte aos
portadores do vírus. No entanto, em 2013, 1,5 milhões de pessoas morreram em
decorrência da doença. Na América Latina a população infectada atualmente é de
1,4 milhões de indivíduos, dos quais 718 mil são brasileiros [1, 13] .
A transmissão do vírus ocorre pelas rotas sexual, percutânea, intravenosa e
perinatal. Há dados de que mais de 80% dos adultos infectados adquiriram o HIV-1
através da exposição de mucosas, o que caracteriza a AIDS como sendo
primariamente uma doença sexualmente transmissível [14, 15]. Entre as outras
formas de contágio, destacam-se o compartilhamento de seringas contaminadas
entre usuários de drogas injetáveis, a exposição a fluidos corporais ou instrumentos
contaminados, a transfusão de sangue infectado com o vírus e a transmissão
vertical [16]. O risco de infecção associada às diferentes vias de exposição varia,
mas independente da rota, o tempo para o aparecimento de marcadores virais no
hospedeiro é geralmente uniforme e segue um padrão ordenado [15, 17].
Durante a infecção no homem, os principais alvos do HIV são os linfócitos T
CD4+ ativados. Outras células que possuem o receptor CD4 e os correceptores
CCR5 ou CXCR4 também podem ser infectadas, incluindo células T CD4+ não
ativadas, alguns subtipos de monócitos, células dendríticas e macrófagos [18]. Estes
últimos são designados como os principais reservatórios virais. O ciclo viral se inicia
quando a proteína gp120, presente no envelope viral, interage com a molécula CD4
presente nessas células, permitindo que a porção proximal do envelope, a
subunidade gp41, se ligue ao correceptor CCR5 ou CXCR4 na membrana das
células alvo, desencadeando a fusão do envelope viral à membrana plasmática
celular. Uma vez endocitado, o vírus pode ser liberado dentro do citosol através da
fusão da membrana viral com a endossomal ou pode ser destruído quando há a
formação dos fagolisossomos. Quando o core viral é liberado dentro do citosol, o
RNA viral é convertido em DNA pela transcriptase reversa e é levado ao núcleo para
que haja integração ao DNA da célula hospedeira pela ação das integrases. Dessa
forma, as proteínas virais são formadas a partir da maquinaria celular, e o vírus,
quando completo, é liberado e está pronto para infectar outras células [19].
Aproximadamente dez dias após a transmissão, o RNA viral passa a ser detectado
no plasma e em seguida, os vírus ou células infectadas alcançam os linfonodos
drenantes, onde podem infectar outras células T CD4+. Nesse processo, partículas
20
ESPÍNDOLA, M.S. Introdução virais se ligam a células apresentadoras de antígeno, como células dendríticas,
macrófagos e linfócitos B, as quais aumentam a disseminação viral após contato
com as células T ativadas, fenômeno conhecido como trans-infecção [20, 21],
permitindo a replicação e disseminação dos órgãos linfóides secundários ao
organismo [22]. Entre 21 a 28 dias após a infecção, observa-se maior carga viral no
sangue, e simultaneamente é observada redução significativa das células T CD4+
da mucosa [23]. A partir de então ocorre diminuição progressiva de células T CD4+.
Estudos recentes revelaram que a morte por apoptose, anteriormente tida como
principal causa de eliminação dos linfócitos T CD4+ ocorre em apenas 5% das
células, associada à ativação celular e infecção viral produtiva. Por outro lado, os
outros 95% das células T CD4+ morrem devido à piroptose, processo desencadeado
por infecção viral abortiva. Este modelo de morte celular programada corresponde a
uma intensa forma de inflamação no qual os conteúdos citoplasmáticos e
inflamatórios são liberados, contribuindo para o estado de inflamação crônica
observado na imunopatogênese da doença [24]. Essa perda é em sua maioria
irreversível na ausência de intervenção por antirretrovirais e induz profundas
consequências imunológicas. A falha em montar a resposta imune eficaz, inclusive
por células que dependem de sinais enviados pelas células T CD4+, como os
macrófagos, culmina na progressão para AIDS [25], e muito frequentemente no
desenvolvimento de infecções oportunistas, principais responsáveis pela morbidade
e mortalidade dos pacientes HIV+.
1.2 A terapia antirretroviral (TARV) e a nova era da infecção por HIV
como doença inflamatória crônica
Em 1985, após o sequenciamento do genoma do HIV [26], três enzimas
virais foram facilmente identificadas – a transcriptase reversa, a protease e a
integrase, as quais se tornaram alvos para o desenvolvimento de terapias. Em 1987,
o AZT, inicialmente utilizado contra câncer, tornou-se a primeira droga anti-HIV por
sua propriedade de inibir a transcriptase reversa. Por problemas de eficácia e
aumento da resistência ao AZT, surgiu a necessidade do desenvolvimento de novas
classes de drogas e do tratamento combinado, conhecido como coquetel,
introduzido em 1995, permanecendo até os dias atuais, no qual é utilizada uma
combinação de três diferentes drogas [27]. Mais de 25 drogas licenciadas, as quais
21
ESPÍNDOLA, M.S. Introdução bloqueiam a replicação viral em diferentes níveis, estão disponíveis para tratamento
[28] (Tabela 1).
Tabela 1. Antirretrovirais aprovados pelo FDA, separados por classes
Abreviação
Nome sérico
Nome Comercial
Data de aprovação
pelo FDA
Inibidores da transcriptase reversa análogos de nucleosídeos/nucleotídeos
(ITRN/ITRNt)
3TC
lamivudina
Epivir
17/11/95
ABC
abacavir
Ziagen
17/12/98
AZT or ZDV
zidovudina
Retrovir
19/03/87
d4T
estavudina
Zerit
24/06/94
ddI
didanosina
Videx EC
31/10/00
FTC
emtricitabina
Emtriva
02/07/03
TDF
tenofovir
Viread
26/10/01
Inibidores da transcriptase reversa não análogos de nucleosídeos (ITRNN)
DLV
delavirdina
Rescriptor
04/04/97
EFV
efavirenz
Sustiva (EUA) ou
Stocrin (Europa)
17/10/98
ETR
etravirina
Intelence
18/01/08
NVP
nevirapina
Viramune
21/06/96
RPV
rilpivirina
Edurant
20/05/11
APV
amprenavir
Agenerase
15/04/99
FOS-APV
fosamprenavir
Lexiva (EUA) ou
Telzir (Europa)
20/10/03
ATV
atazanavir
Reyataz
20/06/03
DRV
darunavir
Prezista
23/06/06
IDV
indinavir
Crixivan
13/03/96
LPV/RTV
lopinavir + ritonavir
Kaletra ou Aluvia
15/09/00
NFV
nelfinavir
Viracept
14/03/97
RTV
ritonavir
Norvir
01/03/96
SQV
saquinavir
Invirase
06/12/95
TPV
tipranavir
Aptivus
22/06/05
T-20
enfuvirtida
Fuzeon
13/03/03
MVC
maraviroc
Celsentri (Europa) ou
Selzentry (EUA)
18/09/07
raltegravir
Isentress
12/10/07
Inibidores de Protease (IP)
Inibidores de fusão
Inibidores de Integrase
RAL
Fonte: www.avert.org
22
ESPÍNDOLA, M.S. Introdução Os regimes de tratamento utilizados atualmente incluem inibidores da
transcriptase reversa análogos de nucleosídeos (ITRN), inibidores da transcriptase
reversa análogos de nucleotídeos (ITRNt) e inibidores da transcriptase reversa não
análogos de nucleosídeos (ITRNN), os quais bloqueiam a transcrição reversa, e
ainda os inibidores de protease (IP), encarregados de prevenir a clivagem das
proteínas gag-pol, impedindo a produção de proteínas maduras. Adicionalmente,
existem os inibidores de fusão e os inibidores da integrase, que podem ser utilizados
no tratamento [18].
A primeira linha de tratamento inclui as combinações de três antirretrovirais,
sendo dois ITRN/ITRNt associados a um ITRNN. De acordo com a regra, no
esquema de terapia inicial deve-se utilizar TDF + 3TC + EFV. Como alternativa ao
uso do TDF, podem ser utilizados AZT, ABC, ddl, respectivamente, se houver
contraindicações das drogas anteriores. A escolha pela segunda linha de tratamento
acontece em situações que o uso do EFV ou NVP esteja impossibilitado ou em caso
de falha na supressão virológica com o tratamento de primeira linha. Dessa forma,
deve-se proceder à substituição por um inibidor de protease, de modo que o
esquema de tratamento fique estruturado da seguinte forma: 2 ITRN + 1 IP/r. O LPV
com booster de RTV (LPV/r) é a opção preferencial na classe dos inibidores de
protease. Como alternativa ao uso do LPV, podem ser utilizados ATV/r ou FPV/r
como substituição, respectivamente. Há ainda a possibilidade de utilização de uma
terceira linha de tratamento, considerada apenas sob os critérios de falha de
supressão virológica e resistência a, pelo menos, um antirretroviral de cada uma das
três classes (ITRN, ITRNN e IP), detectada em genotipagem realizada há menos de
12 meses. Neste caso, DRV, TPV, RAL, ETR, T-20 ou MVC podem ser incluídos no
regime de tratamento [16].
As recomendações para início de terapia antirretroviral em pessoas vivendo
com HIV/AIDS vêm sendo amplamente estudadas e melhoradas ao longo dos anos.
Atualmente, no Brasil, tendo em vista a possibilidade de reconstituição do número de
células T CD4+ e a ampla redução da transmissão, aconselha-se o início precoce da
TARV para qualquer indivíduo diagnosticado com HIV, independente do número de
células T CD4+[16]. No Brasil, das 718 mil pessoas vivendo com HIV, 44% estão
atualmente recebendo terapia antirretroviral [13]. No entanto, pouco se sabe sobre o
impacto de cada regime de tratamento no sistema imunológico do indivíduo tratado.
23
ESPÍNDOLA, M.S. Introdução O conhecimento sobre os mecanismos que estão por trás da patogênese do
HIV evoluiu massivamente nos últimos anos e o vírus deixou de ser visto apenas
como uma “máquina” desenfreada de eliminação de células T CD4+, característica
que lhe garantiu por algum tempo uma aura um tanto invencível, e atualmente é
considerado um patógeno controlável, porém responsável por um estado de
hiperatividade imunológica crônica [29]. A ideia do HIV como uma doença crônica
surgiu do resultado de avanços no tratamento nas últimas três décadas. A adesão à
TARV melhora a saúde, prolonga a vida e reduz substancialmente o risco de
transmissão do HIV. Este fato é refletido tanto em países com alta e baixa renda,
nos quais a expectativa de vida de pacientes infectados com o HIV com acesso à
TARV é agora estimada em décadas e se equipara a de populações não infectadas
[30, 31]. Quando utilizada corretamente, a terapia antirretroviral resulta em rápido
controle da replicação do HIV e restauração parcial do número de células T CD4+,
levando à prevenção de várias complicações que definem a AIDS. No entanto, o
tratamento não restaura totalmente a saúde. Resultados de estudos realizados em
países de alta renda mostram que adultos infectados pelo HIV que fazem uso de
TARV, com completa inibição da replicação viral, estão em risco de desenvolvimento
de diversas doenças não relacionadas à AIDS, incluindo doenças cardiovasculares e
da coagulação, câncer, doença renal, doença hepática, osteopenia ou osteoporose e
doenças neurocognitivas. Coletivamente, as múltiplas doenças são referidas como
“eventos graves não relacionados à AIDS” [32].
O estado inflamatório crônico induzido pelo HIV e as consequentes doenças
não relacionadas à AIDS em indivíduos com boa adesão terapêutica possui causa
multifatorial. Dentre elas, a translocação microbiana é caracterizada como o fator
chave na ativação imune crônica durante a infecção pelo HIV. O vírus induz
acentuada depleção de células T CD4+ na mucosa intestinal, preferencialmente as
produtoras de IL-17 e IL-22, críticas na manutenção da homeostase e integridade
epitelial [33, 34]. A consequente desestabilização imunológica e estrutural, com
quebra da barreira epitelial, leva à translocação microbiana e intensa liberação de
PAMPs (padrões moleculares associados a patógenos) derivados de bactérias e
fungos, incluindo os produtos pró-inflamatórios LPS, peptidoglicanas, ácido
lipoteicóico, flagelina, DNA ribossomal e DNA contendo CpG não-metilado. Estes
produtos causam inflamação local e após passagem pelo fígado, induzem efeitos
sistêmicos
através
da
estimulação
de
células
da
resposta
imune
inata
24
ESPÍNDOLA, M.S. Introdução (particularmente monócitos, macrófagos e células dendríticas), e de células não
imunes, incluindo células endoteliais do sistema cardiovascular [35, 36]. Além disso,
a replicação viral associada ao excesso de copatógenos, como citomegalovírus e o
vírus da hepatite C, comuns nos pacientes soropositivos [37-39]; a toxicidade
causada pelo uso da TARV; a alta prevalência de fatores de risco tradicionais (tais
como abuso de drogas, obesidade e hipertensão); e a disfunção do sistema
imunológico, contribuem para um estado de inflamação persistente [40]. Nestes
pacientes, tratados ou não, a as células T que permanecem vivas encontram-se
frequentemente ativadas, e a frequência de monócitos inflamatórios e citocinas próinflamatórias é maior em comparação a indivíduos não infectados da mesma idade
[41-44].
1.3 A evolução dos Biomarcadores na infecção por HIV
Os biomarcadores mais utilizados na prática clínica são a contagem de
células T CD4+ no sangue e a viremia durante infecção primária, crônica ou
avançada, sendo fortes indicadores de subsequente progressão da doença em
pacientes
não
tratados.
Adicionalmente,
são
fatores
indispensáveis
no
direcionamento e avaliação da eficácia do tratamento antirretroviral [45, 46].
A inflamação imune sistêmica é característica da infecção por HIV. Durante
a infecção aguda, há liberação rápida e intensa de uma variedade de citocinas,
incluindo IFN-α, IFN-γ, IP-10, TNF-α, IL-6, IL-10 e IL-15, que coincidem com o pico
de viremia [47]. Dentre elas, alta concentração plasmática de IP-10 nesta fase é
forte indicativa de progressão da doença [48]. A frequência de células T ativadas
também aumenta significativamente durante a fase aguda da infecção [49]. Dessa
forma, há alguns anos iniciaram-se estudos que sugerem agrupar a contagem de
células T CD4+ e carga viral a medidas de proliferação e ativação de células T
durante infecção aguda ou crônica, a fim de refinar o poder preditivo de progressão
[50-52]. No entanto, esta proposição perde validade com a inclusão do tratamento
antirretroviral, onde a contagem de células T CD4+ é parcialmente restaurada e a
viremia decai a níveis indetectáveis. Neste caso, um número crescente de estudos
implicam a inflamação relacionada a monócitos e macrófagos como os principais
preditores de progressão da doença [40].
Após a fase aguda, apesar de atenuados, marcadores de inflamação e
coagulação permanecem frequentemente elevados em pacientes não tratados [53].
25
ESPÍNDOLA, M.S. Introdução De fato, a ativação imune persistente ligada à inflamação e coagulação, emergiram
como fortes indicadores de morbidade e mortalidade no contexto da infecção por
HIV. Em estudos recentes, os biomarcadores IL-6, proteína C-reativa e os
marcadores de coagulação D-dímero, fibrinogênio e o fator tecidual destacaram-se
como fortes preditores de aumento da mortalidade e eventos cardiovasculares,
mesmo em indivíduos tratados, comparados a indivíduos não infectados de idade
avançada [54-56].
Levando em consideração a liberação de produtos microbianos como parte
integrante da imunopatologia causada pelo HIV, e seu poder de ativação de células
imunes, marcadores de ativação específicos de monócitos e macrófagos, sobretudo
a forma solúvel do CD14 (sCD14) e do CD163 (sCD163), têm se mostrado
especialmente importantes na infecção por HIV. Diferentes autores demonstraram
que ambos estão elevados no plasma antes e após o uso de antirretrovirais e que
podem ser utilizados como preditores de morbidade e mortalidade na doença [44,
57-59]. O CD14 é o correceptor para LPS, juntamente com o TLR4. Após a ligação
do LPS, há a clivagem da âncora de GPI do CD14 na superfície da célula, e ainda a
produção de uma forma não ligada ao GPI, sendo ambos liberados na circulação na
forma de sCD14. O sCD14 pode ainda se ligar ao LPS e facilitar a ativação de
diferentes tipos celulares, como as células endoteliais vasculares. Por outro lado, o
CD163 é um scavenger receptor para hemoglobina, expresso na superfície de
macrófagos e monócitos inflamatórios (CD14dimCD16+). A ligação de LPS ao TLR4
[14, 15], ligação cruzada com o receptor Fcγ [21] ou mediadores de stress oxidativos
[22] podem resultar na clivagem de CD163 para sua forma solúvel (sCD163). Uma
vez que o CD163 pode funcionar como receptor imune para bactérias [18], acreditase que sua clivagem possa ser um mecanismo de regulação da ativação aguda e
acentuada em monócitos [57]. Estes biomarcadores também são comumente
encontrados em outras doenças inflamatórias crônicas e autoimunes, causadas
primariamente por ativação de macrófagos, como sepse e doenças hepáticas.
1.4 O monócito como peça-chave na disfunção imune durante a
infecção por HIV
Os monócitos são células mononucleares circulantes da linhagem mielóide
que possuem papel central na homeostase tecidual e na imunidade, sendo
indispensáveis durante os processos de inflamação e controle de patógenos [60].
26
ESPÍNDOLA, M.S. Introdução Diferentes subtipos de monócitos são descritos de acordo com a expressão de
CD14 e CD16. Em indivíduos saudáveis, 80-90% dos monócitos circulantes são
CD14highCD16-, conhecidos como monócitos clássicos. Os monócitos restantes
expressam CD16 e são subdivididos em intermediários, CD14highCD16+; ou não
clássicos ou inflamatórios, CD14dimCD16+ [61].
Como descrito anteriormente, ao longo dos últimos anos, diferentes
trabalhos vêm mostrando o papel dos monócitos na patogênese relacionada ao HIV,
uma vez que eles são centrais no desenvolvimento da inflamação sistêmica que, em
estado final, leva a falência de múltiplos órgãos e morbidade [40]. A maioria dos
efeitos da infecção por HIV nos monócitos tendem a ser indiretos e causados pelo
excesso de estimulação por produtos microbianos. Menos de 0,1% dos monócitos
podem ser infectados pelo HIV [62], dentre eles, os que expressam CD16 tendem a
ser mais permissivos ao HIV-1 in vivo [63] e possuem frequencia aumentada na
doença, o que pode refletir diferentes sintomas associados à AIDS, incluindo danos
neurológicos [64, 65]. Especificamente, os monócitos intermediários possuem forte
correlação com biomarcadores de inflamação no plasma e podem predizer
morbidade e mortalidade [66].
A função imunológica dos monócitos também é alterada em múltiplos
aspectos durante a infecção por HIV. Estudos reportaram aumento na expressão de
TLR em pacientes HIV-1+ virêmicos e cronicamente infectados [67, 68], o que induz
maior responsividade a estímulos patogênicos. Como consequência, estas células
possuem produção aberrante de citocinas em situações distintas. A produção de IP10 por monócitos, através da estimulação das vias de TLR7/9 é aumentada in vitro
após estímulo viral [69]; além disso, a produção de TNF-α por uma subpopulação
específica de monócitos M-DC8 CD14+CD16high de pacientes HIV+ também é
aumentada em resposta ao LPS [70]. Da mesma forma, quando monócitos CD16+
isolados de pacientes HIV-1+ não tratados foram estimulados in vitro com
Escherichia coli, houve aumento significativo da produção de IL-23 por essas
células. No entanto, quanto à produção de interferons por monócitos, o IFN-γ e os
IFNs do tipo 1 possuem produção reduzida após estímulo ex vivo com CpG ODN
durante infecção viral [71, 72].
Outra característica dos monócitos que tem sido extensivamente avaliada,
mas que ainda rende algumas controvérsias é a disfunção relacionada à fagocitose
de patógenos oportunistas. Esta função prejudicada é comumente acompanhada de
27
ESPÍNDOLA, M.S. redução da capacidade microbicida
Introdução assim como da modulação da resposta
apoptótica de monócitos e de macrófagos derivados de monócitos humanos
(hMDM), que em geral pode depender do patógeno e do curso da doença. [73-83].
Em conjunto, os eventos que acontecem especificamente em monócitos
podem contribuir para a disfunção imune sistêmica caracterizada por ativação imune
excessiva em indivíduos infectados com HIV-1, fato que se correlaciona diretamente
com patogênese e progressão da doença. Ensaios clínicos visando a atenuação da
inflamação crônica e dos efeitos da terapia antirretroviral em pacientes HIV+ têm
sido amplamente realizados. Terapias focadas em reduzir a translocação microbiana
[84-87]; o excesso de copatógenos [88]; a inflamação sistêmica e o estado de
hipercoagulação [89-93] permanecem em testes. Entretanto, dada a complexidade e
os múltiplos fatores associados à infecção pelo HIV, o uso de certas terapias
poderiam reduzir a capacidade imunológica de controlar o vírus ou ativar vias
compensatórias [40]. Portanto, faz-se necessária a busca por novas estratégias,
visando intervenções específicas e que reduzam cada vez mais os efeitos colaterais
e compensatórios do sistema imune.
1.5 Regulação epigenética e sua importância nas doenças
A regulação epigenética tem sido cada vez mais estudada por ser potente
ferramenta da regulação da expressão gênica. A modificação epigenética é, por
definição, a alteração do fenótipo celular sem alteração genotípica, na qual o
fenótipo da célula é alterado em consequência da inibição ou ativação da transcrição
gênica [94]. Esses mecanismos podem incluir modificações químicas do DNA e/ou
na cauda de histonas associadas que resultam na alteração da acessibilidade física
do DNA a fatores de transcrição [95]. A regulação epigenética dos produtos gênicos
ocorre através de inúmeros mecanismos, mas pode ser generalizada como ativador
transcricional ou silenciador gênico.
Dentre as modificações químicas que afetam o DNA, a metilação direta do
DNA é uma modificação enzimática na qual há a inserção de um grupamento metil
a resíduos de citosina na posição 5C em locais do DNA chamados de Ilhas CpG,
sendo realizada por enzimas da família das DNA-metiltransferases (DNMTs) ou por
Proteínas de ligação a Metil-CpG (MBDs). A adição do grupo metil não afeta o
emparelhamento das bases em si, mas pode interferir nas interações DNA-proteína
e sua função é associada ao silenciamento gênico [96]. Por outro lado, as
28
ESPÍNDOLA, M.S. Introdução modificações na cauda das histonas são importantes para a regulação da função da
cromatina e permitem o recrutamento de fatores nucleares específicos, os quais
promovem diferentes funções celulares. Existem mais de 100 sítios de modificações
pós-traducionais encontrados em histonas como resultado de acetilação, metilação,
fosforilação ou ubiquitinação de diferentes lisinas, argininas, serinas ou outros
aminoácidos [97], as quais podem promover ativação ou repressão gênica, e
dependem majoritariamente da natureza química e da localização da modificação
[98]. Tais alterações são executadas por diferentes famílias de enzimas,
caracterizadas de acordo com o tipo de modificação química realizada. Dessa forma,
as histona-acetiltransferases (HATs) realizam a acetilação de resíduos específicos
de lisina, as histona-metiltransferases (HMTs) são responsáveis pela metilação de
lisina e resíduos de arginina, e as histona-quinases (HKS) fazem a fosforilação de
grupos específicos de serina, entre outras [99]. Além disso, as enzimas
responsáveis pela clivagem de algumas dessas modificações, tais como histonadesacetilases (HDACs), histona-fosfatases (PPs), ubiquitina-hidrolases (Ubps) e
poli-(ADP-ribose)-glicohidrolases (PARGs) também já foram identificadas [99-102].
Alterações epigenéticas, sejam elas por aumento da frequência de enzimas ou pelo
aumento de sua atividade enzimática, já foram descritas em diversas doenças como
câncer, doenças neuro-degenerativas, autoimunes e infecciosas [103]. Na sepse,
por exemplo, alterações epigenéticas foram associadas a funções alteradas de
células imunes [98, 104], adicionalmente estudos recentes mostraram ainda que tais
modificações estão envolvidas na escolha do fenótipo de macrófagos [105, 106] ou
na função de células dendríticas [107, 108]. No que diz respeito a doenças virais,
estudos ao longo dos anos caracterizaram mecanismos de evasão ao sistema imune
e latência e dentre eles, a habilidade de alguns vírus em desenvolver mecanismos
epigenéticos capazes de modificar a resposta imune do hospedeiro. No caso do HIV,
duas enzimas de regulação epigenética, MBD2 e HDAC2 estão envolvidas na
regulação da latência viral [109], enquanto que durante a replicação viral, a proteína
Tat é capaz de interagir com HATs e HDACs para promover a transcrição do vírus
[110]. Sendo assim, terapias visando a modulação das enzimas epigenéticas são
estratégias inovadoras e racionais na regulação da expressão dos genes e
consequentemente, da produção de proteínas. Estão em andamento ensaios
clínicos contra diversos tipos de câncer [111] e doenças inflamatórias [112]. Já na
29
ESPÍNDOLA, M.S. Introdução infecção por HIV, terapias com objetivo de eliminar a latência viral, utilizando o
Vorinostat, um inibidor de HDACs também estão em fase de teste [113].
No entanto, apesar de já se entender como o HIV modula enzimas
epigenéticas a seu favor, induzindo latência, pouco se sabe sobre como alterações
epigenéticas induzidas na doença podem interferir com a resposta das células
imunes, sobretudo de monócitos, que são chave no desenvolvimento da
imunopatogênese da doença. Uma vez elucidados, biomarcadores epigenéticos
poderiam ser utilizados como alvos no desenvolvimento de terapias gênicas,
capazes de reduzir o quadro de ativação imune sistêmica e portanto, o problema
central das causas de morbidade e mortalidade de pacientes HIV+ na era TARV.
30
ESPÍNDOLA, M.S. 2. Objetivos 31
ESPÍNDOLA, M.S. Objetivos 2.1 Objetivo Geral:
ü Correlacionar alterações imunológicas sistêmicas em pacientes HIV+, em
tratamento ou não, com alterações funcionais e epigenéticas de monócitos.
Para alcançar o objetivo, foram utilizadas as seguintes estratégias:
Parte I :
1) Caracterização de biomarcadores imunológicos e de progressão da doença em
pacientes HIV+ não tratados, ou em diferentes regimes de terapia antirretroviral
2) Determinação, por análise dos dados utilizando biologia dos sistemas, dos
principais biomarcadores imunológicos utilizados para segregar os diferentes
grupos clínicos.
Parte II:
3) Avaliação funcional de monócitos de pacientes HIV+ não tratados, ou em terapia
antirretroviral e de indivíduos saudáveis na infecção in vitro por M. tuberculosis.
4) Avaliação das alterações na frequência de enzimas que promovem as alterações
epigenéticas e sua associação com progressão da doença.
32
ESPÍNDOLA, M.S. 3. Material e Métodos
33
ESPÍNDOLA, M.S. Material e Métodos 3.1 Casuística
A seleção e contato com pacientes, coleta de células e acompanhamento
clínico foram realizados em colaboração com o departamento de Clínica Médica, na
UETDI do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRP-USP), através do apoio do Dr. Valdes Roberto Bollela, onde foram
selecionados pacientes HIV+ virgens de tratamento ou em terapia antirretroviral há
mais de 6 meses.
Nos experimentos referentes à Parte I do trabalho, foram selecionadas
amostras de sangue de pacientes HIV-1+ virgens de tratamento (HIV) (n=46), HIV+
tratados com medicamentos de primeira linha (TARV 1) (n=15) e HIV+ tratados com
medicamentos de segunda linha (TARV 2) (n=15), de ambos os sexos e idade entre
18 e 65 anos. Como critério de inclusão, todos os pacientes em tratamento
possuíam carga viral indetectável. A combinação dos antirretrovirais utilizados pelos
pacientes em cada regime de tratamento está detalhada na Tabela 2. Indivíduos não
infectados (NI) (n=66) foram doadores de sangue recrutados do Hemocentro de
Ribeirão Preto, sem qualquer histórico de doenças crônicas ou uso de drogas. As
características gerais dos indivíduos saudáveis e pacientes HIV+ incluídos nesta
parte do estudo estão descritas na Tabela 3.
Nos experimentos referentes à Parte II do trabalho, foram selecionadas
amostras de sangue de pacientes HIV-1+ virgens de tratamento (HIV) (n=17), HIV+
em terapia antirretroviral sem distinção de tratamento (TARV) (n=21), de ambos os
sexos e idade entre 18 e 65 anos. Indivíduos não infectados (NI) (n=26) foram
doadores de sangue recrutados do Hemocentro de Ribeirão Preto, sem qualquer
histórico de doenças crônicas ou uso de drogas. As características gerais dos
indivíduos saudáveis e pacientes HIV+ incluídos nesta parte do estudo estão
descritas na Tabela 4.
A Parte I do estudo, incluiu amostras de plasma derivadas da junção de
pacientes incluídos em outros projetos do laboratório, mas com objetivos distintos do
presente trabalho, os quais foram aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital das
Clínicas de Ribeirão Preto e FMRP-USP (Protocolos #11399/2012; #9817/2012;
#9818/2012) e do CEP/FCFRP-USP (Protocolo #276/2012). A Parte II do trabalho
está incluída no Protocolo #11399/2012, aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital
das Clínicas de Ribeirão Preto e FMRP-USP (Anexo III). Os pacientes foram
abordados no momento da rotina de consultas e foram convidados a participar
34
ESPÍNDOLA, M.S. Material e Métodos voluntariamente do estudo, registrando a sua autorização através da assinatura do
termo de consentimento livre e esclarecido de acordo com as regras estabelecidas
pela resolução 003/2011/CONEP do Conselho Nacional de Saúde (Anexo IV).
As amostras de sangue foram coletadas (40 mL/indivíduo) através de
punção venosa em tubo contendo o anticoagulante Heparina (BD Biosciences, San
Diego, CA), identificadas e posteriormente processadas e analisadas.
Tabela 2. Detalhamento do regime de tratamento de pacientes HIV-1+,
incluídos na Parte I do estudo.
Combinação de antirretrovirais
(n)
Tratamento de primeira linha (TARV 1)
AZT + 3TC + EFV
10
TDF + 3TC + EFV
5
Tratamento de segunda linha (TARV 2)
TDF + 3TC + LPV/r
5
TDF + 3TC + ATV/r
4
AZT + 3TC + LPV/r
3
AZT + 3TC + IDV
1
AZT + ATV/r
1
TDF + 3TC + FOS-APV
1
AZT: zidovudina; 3TC: lamivudina; TDF: tenofovir; EFV: efavirenz; LPV/r: lopinavir + ritonavir; ATV/r:
atazanavir + ritonavir; IDV: indinavir; FOS-APV: fosamprenavir; TARV: Terapia antirretroviral
35
ESPÍNDOLA, M.S. Material e Métodos Tabela 3. Características gerais de indivíduos controles não infectados e pacientes
HIV+ virgens de tratamento ou tratados com diferentes esquemas terapêuticos,
incluídos na Parte I do estudo
Valores
Características
Controles
Gerais
HIV
(NI)
Não tratados
TARV 1
TARV 2
Indivíduos (n)
66
46
15
15
Feminino [no. (%)]
33(50)
14 (30)
4 (27)
4 (27)
Masculino [no. (%)]
33 (50)
32 (70)
11 (73)
11 (73)
Idade [anos (IIQ)]
35,2 (25-45)
37 (31-44)
42 (32-47)
44 (37-54)
CD4/mL (IIQ)
NA
465 (248-611)
672 (343-843)
529 (359-690)
HIV RNA/mL
NA
4,041
<50
<50
[log (IIQ)]
(3,41-4,76)
Os dados estão expressos como Média (%) ou Média (Intervalo Interquartil), como indicado.
IIQ: Intervalo Interquartil.
Tabela 4. Características gerais de indivíduos controles não infectados e pacientes
HIV+ virgens de tratamento ou em terapia antirretroviral, incluídos na Parte II do
estudo
Características
Gerais
Valores
Controles
HIV
(NI)
Não tratados
TARV
Indivíduos (n)
26
17
21
Feminino [no. (%)]
11 (42)
5 (29)
9 (43)
Masculino [no. (%)]
15 (58)
12 (71)
12 (57)
Idade [anos (IIQ)]
35 (26-46)
39 (31-47)
43 (36-53)
CD4/mL (IIQ)
NA
533 (323-692)
776 (495-978)
HIV RNA/mL
NA
4,225
<50
[log (IIQ)]
(3,47-4,90)
Os dados estão expressos como Média (%) ou Média (Intervalo Interquartil), como indicado.
IIQ: Intervalo Interquartil.
36
ESPÍNDOLA, M.S. Material e Métodos 3.2 Determinação da concentração de biomarcadores plasmáticos
Após coleta das amostras de sangue periférico, o plasma foi separado através
de centrifugação a 400xg por 10 minutos à temperatura ambiente e estocado à
temperatura de -20°C até o momento da dosagem. Corporation, Austin, Texas, USA)
foi utilizado para a leitura das plascas multiplex.
As citocinas e quimiocinas (IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, IFN-α2,
TNF-α, IFN-ɣ, IP-10, RANTES, MCP-1) presentes nas amostras de plasma foram
quantificadas utilizando uma plataforma multiplex customizada (MILLIPLEX MAP
magnetic bead-based multi-analyte panels, Merck Millipore®) e analisada em leitor
de placas próprio (Luminex Multiplexing Instrument - EMD Millipore, Luminex
Corporation, Austin, TX, USA). Conforme a metodologia do fabricante, as amostras
foram adicionadas às placas específicas para o ensaio e diluídas em tampão
fornecido pelo kit e, após a incubação com microesferas magnéticas fluorescentes
recobertas por anticorpos de captura específicos para as citocinas listadas, realizouse a leitura das amostras no equipamento. Os dados adquiridos foram analisados
através do software Milliplex Analyst v3.5 (Millipore; VigeneTech Inc., Boston, EUA)
utilizando uma curva logística de três parâmetros.
As concentrações plasmáticas de sCD14 e sCD163 foram mensuradas
através da técnica de ELISA, utilizando o kit DuoSet ELISA (R&D Systems,
Minneapolis, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Para tanto, 100
µL/poço do anticorpo de captura anti-CD163 ou anti-CD14 humano (2µg/mL) foram
adicionados às respectivas placas de 96 poços e as placas incubadas overnight à
temperatura ambiente. Após lavagem com PBS contendo 0,05% de Tween 20,
foram adicionados 100 µL de cada amostra (diluídas a 1:100 em PBS pH 7,2) ou a
curva padrão contendo concentrações conhecidas de sCD163 e de sCD14 foram
adicionados às placas, que passaram por outra incubação durante 2 h à temperatura
ambiente. As placas foram lavadas, e 100 µL do anticorpo de detecção anti-CD163 e
anti-CD14 humano (1µg/mL) foram adicionados em cada um dos poços. Após
incubação por 2 h e lavagem das placas com PBS contendo 0,05% de Tween 20,
100 µL de estreptoavidina-HRP foram adicionados em cada poço. As placas foram
lavadas novamente, e a revelação da reação foi realizada com adição de substrato
(H2O2 e TMB vol/vol) por 20 minutos. A reação foi então interrompida pela adição de
2N H2SO4. A absorbância das amostras e curva padrão foram lidas em
espectofotômetro de placa a 450 nm (µQuant, Biotek Instruments Inc) e as
37
ESPÍNDOLA, M.S. Material e Métodos concentrações de CD163 e CD14 solúveis foram determinadas através da curva de
regressão linear obtida.
A contagem de células T CD4+ de pacientes HIV+ foi realizada através de
citometria de fluxo, utilizando o FACS Calibur flow (Becton-Dickinson, EUA). Os
níveis de RNA viral no plasma (carga viral) foram determinadas através do kit para
PCR em Tempo Real para HIV-1 (Abbott Molecular, Illinois, EUA).
3.3 Isolamento de monócitos do sangue periférico
Para obtenção de monócitos purificados, as amostras de sangue foram
diluídas em tampão fosfato (PBS) (1:2) pH 7,4 após separação do plasma e
aplicadas cuidadosamente sobre o Ficoll-PaqueTM PLUS, d=1,078 g/mL (GE
Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suécia). Em seguida, foram centrifugadas a
637xg por 30 minutos à temperatura ambiente para separação da camada de células
mononucleares. As células presentes na interfase do gradiente de separação foram
cuidadosamente coletadas, transferidas para um novo tubo e lavadas duas vezes
em PBS para obtenção do precipitado celular. Em seguida, as células
mononucleares isoladas na etapa anterior foram purificadas por seleção
imunomagnética positiva com kit específico (Milteny Biotec, Aubum, CA, EUA). Com
o auxílio desta ferramenta, as células da fração mononuclear foram adicionadas à
beads magnéticas complexadas a anticorpos monoclonais anti-CD14 e a solução foi
aplicada à coluna de separação magnética. Após eluição das células aderidas à
coluna, apenas os monócitos (fração CD14+) foram obtidos para a realização dos
demais experimentos.
3.4 Análise das subpopulações de monócitos no sangue periférico
A fim de caracterizar as subpopulações de monócitos presentes no sangue
periférico de cada paciente, as células mononucleares obtidas após separação por
gradiente de densidade utilizando Ficoll-PaqueTM PLUS d=1,078 g/mL (GE
Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suécia) foram quantificadas em câmera de
Neubauer e ajustadas para 5x105 células por tubo. Em seguida, foram adicionados
anticorpos específicos anti-CD14-PerCP (BD, New Jersey, EUA) e anti-CD16-PE
(BD, New Jersey, EUA). Após 30 minutos de incubação a 4ºC no escuro, as células
foram lavadas com 2 mL de PBS acrescido de 2% de soro bovino fetal (SBF),
centrifugadas a 400xg por 10 minutos e ressuspendidas em PBS contendo 1% de
38
ESPÍNDOLA, M.S. Material e Métodos formaldeído. As análises foram realizadas levando-se em consideração a
porcentagem de células positivas para cada marcador de acordo com os subtipos de
monócitos previamente descritos [61]. As células CD14highCD16- são classificadas
como
monócitos
clássicos;
as
células
CD14highCD16+
como
monócitos
intermediários e as células CD14dimCD16+ como monócitos não clássicos ou
inflamatórios. Todas as amostras foram analisadas em citômetro de fluxo
FACSCantoTM (BD, New Jersey, EUA) com auxílio do software FACSDiva (BD, New
Jersey, EUA). O manuseio do aparelho e as análises de compensação foram
realizadas pela Especialista em Laboratório Fabiana Rosseto de Morais no
Laboratório Multiusuário de Citometria de Fluxo da FCFRP-USP.
3.5 Obtenção de Mycobacterium tuberculosis
Todo
o
trabalho
envolvendo
Mycobacterium
tuberculosis
(Mtb)
foi
desenvolvido em colaboração com a equipe do laboratório do Prof. Dr. Célio Lopes
Silva, na FMRP e os experimentos realizados na sala de segurança biológica nível
3.
As cepas de Mtb H37Rv (ATCC-27294), previamente armazenadas a -70°C,
foram repicadas em meio líquido Midlebrook 7H9 enriquecido com 10% de ácido
oleico, albumina, dextrose e catalase (OADC – DifcoTM, Detroit, EUA) e incubadas a
37°C por 11 dias até o crescimento bacteriano. A suspensão micobacteriana foi
centrifugada a 2300xg por 20 minutos e o sedimento ressuspendido em tubo de
vidro estéril contendo salina e pérolas de vidro estéreis. A suspensão foi ajustada
para 1x107 bacilos/mL com auxílio da escala nefelométrica de Mc Farland. Para
avaliação da viabilidade do inóculo, 100 µL desta suspensão foi adicionado à 100 µL
de diacetato de fluoresceína (2 µg/mL) e 100 µL de brometo de etídeo (10 mg/mL)
[114]. As micobactérias foram incubadas a 37°C por 10 minutos e a viabilidade
determinada em microscopia de fluorescência (Leica, Alemanha). As amostras que
apresentaram viabilidade superior a 90% foram utilizadas para infecção. A
suspensão de bactérias foi novamente centrifugada a 2300xg por 20 minutos para
ressuspensão em meio de cultura RPMI sem antibióticos.
39
ESPÍNDOLA, M.S. Material e Métodos 3.6 Avaliação da função fagocítica e microbicida de monócitos
Para avaliação da fagocitose e da atividade microbicida de monócitos, a
suspensão de monócitos CD14+ foi ajustada em meio de cultura RPMI 1640 (Gibco,
Grand Island, EUA) com antibióticos, de modo a adicionar 1x105 células por poço em
placas de 96 poços. Após incubação à 37°C e 5% de CO2 por 12 horas para
aderência, o sobrenadante de células foi retirado e o Mtb foi adicionado na
concentração de 5 bactérias/célula (MOI 5) nas placas referentes à avaliação da
fagocitose e atividade microbicida. Após 2 horas, tempo referente à fagocitose, o
sobrenadante foi coletado e ambas as placas foram lavadas duas vezes com RPMII à temperatura ambiente para remoção das bactérias não fagocitadas. Em seguida,
na placa de Fagocitose, adicionou-se solução de saponina (0,05%) para lise dos
monócitos e liberação das bactérias fagocitadas no sobrenadante. Posteriormente, a
resazurina (1 mg/mL) foi adicionada e a placa incubada a 37°C e 5% de CO2 por 24
horas.
Para avaliação da atividade microbicida, após remoção das bactérias não
fagocitadas, novo meio RPMI foi adicionado à cultura, acrescido de 5% de SBF e as
células foram incubadas por mais 22 horas, tempo necessário para atividade
microbicida de monócitos frente ao Mtb. Ao final deste período, o meio foi removido
e foi adicionada solução de saponina (0,05%) para lise dos monócitos e liberação
das bactérias que permaneceram vivas após fagocitose. Posteriormente, a
resazurina (1 mg/mL) foi adicionada e a placa incubada a 37°C e 5% de CO2 por 24
horas.
A quantidade de bactérias presentes nos momentos de fagocitose (2 horas
após infecção) e atividade microbicida (24 horas após infecção) foi indiretamente
quantificada através da metabolização da resazurina em resofurina pelas
micobactérias viáveis. A leitura foi realizada em espectrofluorímetro (SpectraMax
Paradigm, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA) com excitação em 560 nm e
emissão em 590 nm. A atividade microbicida foi obtida descontando-se a
fluorescência resultante da placa de 24 horas (correspondente às bactérias que
sobreviveram
à
atividade
microbicida
dos
monócitos)
da
fluorescência
correspondente à placa de 2 horas (correspondente à quantidade de bactérias
fagocitadas).
40
ESPÍNDOLA, M.S. Material e Métodos 3.7 Quantificação de citocinas no sobrenadante de cultura de monócitos
A fim de determinar a concentração de citocinas produzidas por monócitos
após estímulo com Mtb, 1x105 células por poço foram plaqueadas em meio RPMI
com antibióticos. Após incubação à 37°C e 5% de CO2 por 12 horas para aderência,
o sobrenadante de células foi retirado e o Mtb foi adicionado na concentração de 5
bactérias/célula (MOI 5). Após 24 horas de estímulo, o sobrenadante foi coletado e
centrifugado a 2300xg por 20 minutos para retirar as bactérias. O sobrenadante de
cultura foi estocado a -20°C até o momento da dosagem das citocinas MCP-1,
RANTES, IP-10, IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-12, IFN-α, IFN-γ, IL-4, IL-5 e IL-10, MIP-1α e
MIP-1β foram quantificadas de acordo com o item 3.2.
3.8 Determinação da produção de Espécies Reativas de Oxigênio pelos
monócitos
A fim de avaliar a capacidade de produção de espécies reativas de oxigênio
(ROS)
por
monócitos
previamente
isolados,
utilizamos
a
técnica
de
quimioluminescência amplificada por Luminol.
Para tanto, 1x105 monócitos/tubo foram distribuídos em três tubos. Avaliamos
a produção de ROS nas condições de produção espontânea, sem adição de
estímulos; após estímulo com 5x105 Mtb, previamente mortos por calor, ou após
estímulo com Phorbol 12-mystrate 13-acetate (PMA - Sigma Aldrich, St. Louis, EUA)
na concentração de 10-7M como controle positivo. A detecção de ROS foi realizada
através da utilização de Luminol (Sigma Aldrich, St. Louis, EUA), o qual reage com
ROS gerado e acarreta a excitação de elétrons, permitindo a detecção de
quimioluminescência através da formação de fótons. A cinética de produção de ROS
teve duração de 2 horas e leitura foi realizada em luminômetro (AutoLumat LB 953
Multi-Tub Luminometer from Berthold) no laboratório de Imunologia e Citologia de
Fluídos Biológicos da FCFRP sob colaboração da Prof. Dra. Cleni Mara Marzocchi
Machado. Os resultados foram obtidos por cinética com duração de 2 horas e os
dados foram expressos como área sob a curva, calculada no GraphPad Prism 5.0.
3.9 Determinação do padrão de metilação global do DNA cromossômico
O DNA genômico foi extraído de monócitos previamente isolados utilizandose o “PureLink Genomic DNA kit” (Life Technologies, New York, EUA), segundo
instruções do fabricante. Em seguida, o DNA foi quantificado no fluorímetro Qubit 2.0
41
ESPÍNDOLA, M.S. Material e Métodos (Life Technologies, New York, EUA) e 50 ng de DNA foram utilizados para as
análises. O perfil de metilação global relativa foi avaliado utilizando-se o “Imprint
Methylated DNA Quantification kit” (Sigma Aldrich,
St. Louis, EUA), conforme
instruções do fabricante.
3.10 PCR Array para as enzimas que regulam as alterações epigenéticas
Monócitos previamente isolados foram aliquotados para extração do RNA
total utilizando-se o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, EUA),
segundo
instruções do fabricante. O RNA extraído foi tratado com “Turbo DNase” (Life
Technologies, New York, EUA) para eliminar qualquer contaminação com DNA
genômico, segundo o instruções do fabricante e posteriormente quantificado no
fluorímetro Qubit 2.0 e estocado a -80ºC. O cDNA foi sintetizado utilizando-se o
“High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit” (Applied Biosystems, Foster City,
EUA) e posteriormente utilizado para quantificação gênica utilizando a reação em
cadeia da polimerase (PCR) em tempo real.
Com o objetivo de identificar o perfil de expressõa gênica das enzimas
modificadoras de histonas, utilizamos o kit de PCR Array para enzimas que induzem
repressão da transcrição gênica “TaqMan® Array Human DNA Methylation &
Transcriptional Repression” (Applied Biosystems, Foster City, EUA) e o kit
customizado de PCR Array para enzimas que promovem a ativação da transcrição
gênica baseado no “RT2 ProfilerTM PCR Array PAHS-085Z” (Qiagen/SA Biosciences,
Venlo, Holanda). Em ambos os casos, 30 ng de amostra de cDNA foi utilizada para
cada gene testado. A Tabela 5 detalha a lista de genes analisados que codificam
enzimas responsáveis pela repressão da transcrição gênica e a Tabela 6 detalha a
lista de genes analisados que codificam enzimas responsáveis pela ativação da
transcrição gênica e seus respectivos genes constitutivos, utilizados como controles
endógenos (housekeepings).
Para normalizar os valores de Ct, de forma a considerar diferenças
causadas por quantidades distintas de cDNA utilizadas nas reações, o Ct
determinado para uma amostra será subtraído da média dos Cts dos genes
constitutivos da mesma amostra, gerando assim o ∆Ct. Para cada gene, o cálculo
relativo do RNA mensageiro será realizado comparativamente em relação à amostra
controle, neste caso, a média geométrica dos indivíduos não infectados, através do
cálculo de Fold change (2-ΔΔCt).
42
ESPÍNDOLA, M.S. Material e Métodos Tabela 5: Lista de genes analisados que codificam enzimas responsáveis pela
repressão da transcrição gênica
Genes
Controles
Endógenos
Genes Alvo
DNMT1
MBD3
HDAC4
HDAC9
SIN3A
RBBP7
GAPDH
DNMT3A
MECP2
HDAC5
HDAC10
RPLP0
HPRT1
DNMT3B
HDAC1
HDAC6
HDAC11
HMBS
B2M
TRDMT1
HDAC2
HDAC7
SAP18
CHD4
ACTB
MBD2
HDAC3
HDAC8
SAP30
RBBP4
GUSB
Tabela 6: Lista de genes analisados que codificam enzimas responsáveis pela
ativação da transcrição gênica
Genes
Controles
Endógenos
Genes Alvo
ASH1L
HAT1
KDM5B
KMT2E
SMYD3
GAPDH
ATF2
KAT2B
KDM6B
PRMT5
SUV39H1
ACTB
CARM1
KAT5
KMT2C
SETD1B
3.11 Análise dos Dados
Este foi um estudo descritivo transversal que aplicou diferentes abordagens
de análise de dados para investigação observacional do perfil imunológico de
pacientes HIV+ em condições clínicas distintas, como detalhado abaixo: (1) Análise
estatística convencional; (2) Análise de bioassinatura de biomarcadores; (3) Rede de
correlações entre biomarcadores; (4) Análise da segregação de grupos por Heat
maps e (5) Geração de árvore de decisão de biomarcadores. Essas abordagens
foram apontadas como relevantes por detectar, com alta sensibilidade, pequenas
alterações nos perfis imunológicos que não são detectáveis por abordagens
estatísticas convencionais.
43
ESPÍNDOLA, M.S. Material e Métodos 3.11.1 Análise Estatística Convencional
Inicialmente testamos se os dados seguiam uma distribuição normal.
Considerando a natureza não-paramétrica do conjunto de dados, análises
estatísticas entre NI e HIV foram realizadas através do teste de Mann-Whitney.
Análises adicionais entre subgrupos de HIV foram realizadas utilizando o teste de
Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunn. O Software
GraphPad Prism 5.0 (San Diego, CA, EUA) foi utilizado para o cálculo de análises
estatísticas e as diferenças foram consideradas significativas quando P < 0,05.
3.11.2 Análise da Bioassinatura de Biomarcadores Plasmáticos e
Epigenéticos
O perfil de citocinas foi primeiramente avaliado para identificar o padrão de
produção de citocinas de cada indivíduo, como previamente demonstrado [115, 116].
Nesta análise, todo o universo de dados de cada biomarcador foi utilizado para
calcular o valor de mediana global, empregado como o ponto de corte para
classificar os pacientes em “Altos Produtores” ou “Baixos Produtores” de um
determinado biomarcador. Os valores de corte são detalhados na Figura 3.
Para avaliar os biomarcadores epigenéticos utilizamos o cálculo de Fold
Change em relação aos indivíduos não infectados. Dessa forma, a expressão
relativa do grupo NI foi normalizada para o valor relativo de 1 e os indivíduos que se
encontravam com fold change acima de 1 foram considerados upregulados e os que
tiveram fold change abaixo de 1 foram considerados downregulados.
A partir de então, selecionamos os Altos e Baixos Produtores de cada
biomarcador e utilizamos os dados para gerar diagramas em preto e branco com a
finalidade de calcular a frequência de Altos Produtores para cada grupo clínico.
Ao considerar o status de progressão da doença, o ponto de corte para cada
biomarcador de progressão: carga Viral, contagem de células T CD4, sCD163 e
sCD14 no caso das citocinas, e sCD163 na análise as enzimas epigenéticas, foi
calculado através da mediana global do grupo de HIV-1 não tratado, relativo ao
grupo amostral em cada parte do trabalho, e os pacientes classificados como
"Possíveis Progressores Lentos" ou "Possíveis Progressores Rápidos" como
detalhado na Figura 5 e Figura 17. Então, os dados relevantes (frequência >50%)
foram destacados em negrito. Gráficos de radar foram construídos para caracterizar
a frequência global de Altos Produtores de um determinado biomarcador
44
ESPÍNDOLA, M.S. Material e Métodos imunológico.
3.11.3 Rede de Correlações entre Biomarcadores
O teste de correlação de Spearman foi realizado para avaliar a associação
entre a produção de biomarcadores imunológicos em cada grupo clínico. Em todos
os casos, a significância foi considerada em P < 0,05. Os testes de correlação foram
realizados no GraphPad Prism versão 5.0 (San Diego, CA, EUA). Correlações
significativas, que representam a interação entre biomarcadores testados, foram
compiladas no software Cytoscape (versão 2.8; http://www.cytoscape.org), como
relatado anteriormente [117]. As redes de biomarcadores foram construídas usando
o layout de círculo e as conexões entre os biomarcadores designadas como linhas,
com espessura de acordo com o índice de correlação (r), em que a correlação pode
ser negativa (𝑟 < 0), fraca (𝑟 ≤0,35), moderada (0,36 ≥ 𝑟 ≤ 0,67) e forte (𝑟 ≥ 0,68), de
acordo com estudos prévios [118].
3.11.4 HeatMap e Árvore de Decisão
A análise de Heatmap foi realizada usando a função heatmap.2 no R
(Projeto para computação estatística versão 3.0.1) e “gplots package” com os
parâmetros de clusterização padrão. O score Z para cada biomarcador foi gerado.
Todas as análises foram realizadas usando funções personalizadas disponíveis em
“Bioconductor packages”. Após a análise do conjunto de dados, uma árvore de
decisão foi gerada para a partir do heatmap. O algoritmo C4.5 [119] foi utilizado para
construir a árvore de decisão do no software WEKA (Waikato Environment for
Knowledge Analysis, version 3.6.11, University of Waikato, New Zealand), usando os
parâmetros J48 padrões [120]. As árvores de decisão foram usadas para selecionar
um conjunto mínimo de características fenotípicas capazes de segregar grupos
eficientemente. Esse método analisa todos os atributos fenotípicos de um conjunto e
seleciona o atributo mais relevante e segue na classificação de atributos adicionais
para segregação de grupos. 45
ESPÍNDOLA, M.S. 4. Resultados Parte I Perfil Imunológico de Pacientes HIV+ não tratados ou em uso de diferentes tipos de TARV: Uma visão de biologia dos sistemas 46
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte I Neste bloco de resultados iremos descrever o perfil imunológico de
pacientes HIV+ não tratados e tradados com diferentes terapias antirretrovirais
através de dosagens séricas de citocinas e biomarcadores solúveis, enfatizando as
diferenças entre os tratamentos e suas semelhanças com os grupos de indivíduos
não infectados e HIV+ não tratados.
4.1 Perfil imunológico global de pacientes HIV+ , virgens de tratamento
Utilizamos o plasma de indivíduos não infectados (NI) e de pacientes HIV+,
virgens de tratamento (HIV), para a quantificação de citocinas e quimiocinas.
Empregamos a tecnologia de detecção por Multiplex para quantificar as seguintes
citocinas e quimiocinas: MCP-1, RANTES, IP-10, IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-12, IFN-α,
IFN-γ, IL-4, IL-5 e IL-10.
Nossos resultados demonstraram maior concentração plasmática de todas
as citocinas e quimiocinas mensuradas em pacientes HIV+, exceto MCP-1, em
relação aos indivíduos não infectados, indicando um estado de ativação imune
diferenciada nesses indivíduos (Figuras 1A).
Além disso, após observação da elevação da citocina anti-inflamatória IL-10
em pacientes HIV+, calculamos a razão da concentração de três principais citocinas
inflamatórias, IP-10, TNF-α ou IFN-γ pela concentração de IL-10. Observamos que a
razão IP-10/IL-10 foi maior em pacientes HIV+, por outro lado, as razões TNF-α/IL10 e IFN-γ/IL-10 encontravam-se reduzidas em pacientes HIV+ quando comparados
aos indivíduos não infectados. (Figura 1B).
47
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte I A
MCP-1
500
10,000
250
0
RANTES
NI
HIV
IL-1β
0
NI
HIV
IL-6
8
Níveis Séricos (pg/mL)
HIV
IL-12
16
0
NI
HIV
TNF-α
24
***
12
4
NI
***
**
*
2
IP-10
2,200
1,100
5,000
4
0
*
0
NI
HIV
IFN-α
60
0
NI
HIV
IFN-γ
24
***
***
***
8
0
30
NI
HIV
IL-4
50
0
12
NI
HIV
IL-5
2
0
NI
IL-10
16
***
***
*
1
5
0
HIV
0
NI
HIV
8
NI
HIV
0
NI
HIV
Grupos Clínicos
Razão entre Biomarcadores
B
TNF-α/IL-10
IP-10/IL-10
700
*
8
IFN-γ/IL-10
4
350
*
4
0
NI
HIV
0
*
2
NI
HIV
0
NI
HIV
Grupos Clínicos
Figura 1. Ativação imunológica e inflamação sistêmica em pacientes HIV+ virgens de
tratamento. O plasma foi separado através de centrifugação do sangue total, congelado e estocado.
No momento da quantificação, o plasma foi submetido a centrifugação e o sobrenadante utilizado no
ensaio. O perfil global de marcadores imunológicos foi obtido através da quantificação das citocinas
MCP-1, RANTES, IP-10, IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-12, IFN-α, IFN-γ, IL-4, IL-5 e IL-10, utilizando-se beads
magnéticas MILLIPLEX® MAP Human Cytokine/Chemokine (Millipore) e o equipamento MagPix
(Luminex) para leitura e análise dos dados. Os resultados estão expressos em Mediana + Intervalo
Interquartil. *** p<0,001; **<0,01; *p<0,05 vs NI. NI: Indivíduos Não Infectados. HIV: Pacientes HIV+
virgens de tratamento antirretroviral.
48
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte I 4.2 Perfil de biomarcadores plasmáticos e marcadores imunológicos em
pacientes HIV+ sob diferentes tratamentos antirretrovirais.
Como demonstrado na Figura 1, há acentuada inflamação sistêmica
induzida pela infecção por HIV, associada à completa desregulação imunológica do
indivíduo infectado. A fim de avaliar a resposta imune de indivíduos sob diferentes
regimes de tratamento, segregamos os indivíduos tratados em dois grupos principais
de acordo com as classes de antirretrovirais utilizadas por eles. Na primeira linha de
tratamento, utiliza-se a combinação de 2 ITRNs + 1 ITRNN, sendo os indivíduos que
fazem uso desse regime referidos neste trabalho como TARV 1. Na segunda linha
de tratamento, utiliza-se 2 ITRNs + 1 IP/r, sendo os indivíduos que fazem uso desse
regime referidos neste trabalho como TARV 2.
Quanto à classificação de progressão da doença, utilizamos os principais
parâmetros utilizados na clínica, a quantificação da carga viral e as contagens de
linfócitos T CD4+ no plasma e os biomarcadores solúveis sCD14 e sCD163, os
quais vêm sendo caracterizados como biomarcadores de progressão em pacientes
HIV+, independente de tratamento. Quanto à carga viral, observamos níveis
indetectáveis de cópias virais no plasma em ambos os tratamentos. Pacientes HIV+,
virgens de tratamento ou em uso de TARV possuíam contagem de células T CD4+
diminuída em relação a indivíduos saudáveis, no entanto, pacientes em qualquer
dos tratamentos mostraram recuperação significativa de células T CD4+ em relação
aos virgens de tratamento. Os biomarcadores de progressão sCD163 e sCD14
estavam mais elevados em todos os pacientes infectados, independente do
tratamento, embora pacientes em uso de TARV 1 tenham apresentado níveis
séricos reduzidos de sCD163 em relação aos HIV+, virgens de tratamento. (Figura
2A).
A utilização de terapia antirretroviral, independente do regime terapêutico,
reduziu de forma significativa a concentração dos biomarcadores imunológicos
RANTES, IP-10, IL-1β, IFN-γ, IL-4 e IL-10 no plasma. Os níveis séricos de IL-6 e
TNF-α encontravam-se reduzidos apenas em pacientes que utilizaram o regime
TARV 1 em relação a pacientes HIV+ sem tratamento.
Entre os dois regimes de tratamento, observamos diferenças significativas
na concentração sérica de IP-10, IL-6 e TNF-α, principais marcadores imunológicos
associados à progressão e susceptibilidade na infecção por HIV. Verificamos que
indivíduos em uso de TARV 2 possuíam concentração plasmática significativamente
49
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte I mais elevada das três citocinas em relação aos indivíduos que faziam uso do
tratamento de primeira escolha.
Adicionalmente, as razões entre os biomarcadores IP-10/IL-10 e TNF-α/IL10 dos grupos HIV e TARV 2 estavam aumentadas em relação a indivíduos não
infectados, entretanto, não observamos diferenças nas razões dos indivíduos que
faziam uso de TARV 1.
Nossos resultados demonstraram ainda que indivíduos que utilizaram a
TARV 1 possuíam níveis séricos das principais citocinas e quimiocinas similares a
indivíduos não infectados, exceto pela produção de IFN-α (Figura 2B).
50
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte I A
Células T CD4+
Carga Viral
sCD163
1,500
10 8
sCD14
1.5 ×10 6
6.0 ×10 6
*
*
750
pg/mL
Células/mm
Cópias/mm
10 4
*
*
*
*
*
*
pg/mL
3
3
*
10 6
7.5 ×10 5
3.0 ×10 6
TARV 2
TARV 1
HIV
TARV 2
HIV
TARV 1
0
0
TARV 2
TARV 1
HIV
0
TARV 2
HIV
TARV 1
10 2
B
RANTES
MCP-1
500
*
IP-10
12,000
2,400
*
*
250
6,000
1,200
1,000
IP-10/IL-10
*
*
*
IFN- γ
TARV 2
HIV
24
*
*
8
40
12
HIV
IL-10
16
TARV 2
3.0
0
TARV 1
IL-5
TARV 2
HIV
TARV 1
50
TARV 2
TARV 1
HIV
IL-4
0
TARV 2
*
6
0
*
IFN- γ/IL-10
4
0
TARV 1
TNF- α/IL-10
12
TARV 2
*
0
TARV 1
80
IFN- α
TARV 2
0
HIV
IL-12
12
TARV 1
16
TARV 2
HIV
0.0
TARV 1
3
*
2
*
TARV 2
TARV 1
TARV 2
TARV 1
0
HIV
0
TARV 2
0.0
TARV 1
0
HIV
8
TARV 2
1.5
TARV 1
5
HIV
*
*
*
HIV
1.5
Razão entre Biomarcadores
0
*
*
TARV 1
TARV 2
HIV
*
TNF- α
HIV
*
24
*
500
HIV
*
IL-6
0
TARV 1
6
TARV 2
IL-1β
TARV 1
0
HIV
TARV 2
3.0
TARV 1
0
HIV
*
Grupos Clínicos
51
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte I Figura 2. Perfil global de biomarcadores séricos e marcadores imunológicos em pacientes
HIV+ sob diferentes tratamentos antirretrovirais. O plasma foi separado através de centrifugação
do sangue total, congelado e estocado. No momento da quantificação, o plasma foi submetido a
centrifugação e o sobrenadante utilizado no ensaio. O perfil global de biomarcadores plasmáticos e
marcadores imunológicos foi obtido através da quantificação da carga viral, contagem de células T
CD4+ e dos níveis plasmáticos de sCD14 e sCD163, As citocinas MCP-1, RANTES, IP-10, IL-1β, IL6, TNF-α, IL-12, IFN-α, IFN-γ, IL-4, IL-5 e IL-10 foram quantificadas utilizando-se beads magnéticas
dos kits MILLIPLEX® MAP Human Cytokine/Chemokine (Millipore) e o equipamento MagPix
(Luminex) para leitura e análise dos dados. Os resultados estão expressos em Mediana + Intervalo
Interquartil. * p<0,05 vs NI; p<0,05 entre os grupos indicados. O Intervalo Interquartil dos indivíduos
NI está expresso como retângulo cinza sob as barras.
52
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte I 4.3 Análise da Bioassinatura Imunológica de pacientes HIV+, virgens de
tratamento ou em uso de diferentes regimes terapêuticos
A fim de compreender melhor e caracterizar a relação entre os diferentes
grupos clínicos na infecção por HIV e sua bioassinatura imunológica, lançamos mão
de estratégias de análises categóricas, nas quais a assinatura de cada biomarcador
é obtida a partir da frequência de altos produtores de cada citocina sérica.
Para tanto, empregamos todo o universo de dados (NI + HIV + TARV 1 +
TARV 2) para a determinação da mediana global de cada biomarcador. Este valor foi
utilizado como ponto de corte para categorizar baixos e altos produtores (Figura 3).
A partir de então, um diagrama de bioassinatura foi gerado, no qual cada
indivíduo foi categorizado e marcado como alto (
) ou baixo (
) produtor para
determinação da frequência de altos produtores nos diferentes grupos clínicos.
Nossos dados demonstraram que enquanto indivíduos não infectados (NI), em sua
maioria, foram qualificados como baixos produtores, pacientes HIV+ virgens de
tratamento (HIV) foram caracterizados por elevada produção de citocinas. Por outro
lado, o perfil dos pacientes HIV+ que receberam tratamento mostrou-se balanceado,
porém pacientes sob o regime de TARV 1 possuíam predomínio de baixos
produtores, enquanto que entre pacientes que utilizavam TARV 2 havia predomínio
de altos produtores dos biomarcadores estudados (Figura 4A).
Utilizando gráficos de radar como estratégia de comparação entre os grupos
clínicos, pudemos observar diferenças expressivas quanto ao perfil global de altos
produtores dos biomarcadores. Para análise, consideramos um biomarcador
relevante quando a frequência de altos produtores foi maior que 50%. Dessa forma,
observamos que indivíduos NI apresentaram frequência de altos produtores menor
que 50% em todos os biomarcadores estudados. Em contrapartida, a infecção por
HIV induziu aumento na frequência de todos os biomarcadores, exceto por MCP-1.
Pacientes infectados que receberam o esquema terapêutico TARV 1 apresentaram
redução aparente no perfil global de produção de citocinas, no qual apenas IFN-α
permaneceu com frequência de altos produtores acima de 50%. Já entre os
pacientes que faziam uso do esquema terapêutico TARV 2, as citocinas IP-10, IL-6,
TNF-α, IL-12, IFN-α e IL-5 permaneceram com frequência de altos produtores
elevada (Figura 4B).
Em resumo, nossos resultados corroboram com prévios relatos de
inflamação sistêmica induzida pela infecção por HIV e trazem à tona novos aspectos
53
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte I dos diferentes regimes de terapia antirretroviral, na qual observamos diferenças
relevantes no perfil imunológico dos pacientes tratados nos diferentes regimes. Até o
momento, nossos dados indicam que o perfil imunológico de pacientes que faziam
uso de TARV 1 se assemelhou ao de indivíduos NI, enquanto que o perfil de
pacientes em uso de TARV 2, se aproximou ao apresentado por pacientes virgens
de tratamento.
54
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte I RANTES
9,200
13,000
12.0
243
477.0
6,153
0.7
Baixos Níveis
Altos Níveis
1,050
0
ALL
0.0
0
ALL
0.0
IL-12
TNF-α
ALL
IFN-α
45.0
60.0
150.0
1.2
7.2
4.2
12.6
Altos Níveis
20.0
Baixos Níveis
IL-6
ALL
0.0
ALL
0.0
IFN-γ
0.0
ALL
ALL
IL-4
IL-5
0.0
ALL
IL-10
200.0
8.0
120.0
3.8
0.9
0.9
2.0
Baixos Níveis
Altos Níveis
70.0
0.0
ALL
0.0
ALL
0.0
0.0
ALL
Mediana Global
IL-1β
Mediana Global
IP-10
Mediana Global
MCP-1
ALL
(NI + HIV + TARV 1 + TARV 2)
Figura 3. Determinação dos pontos de corte para categorizar indivíduos como baixos ou altos
produtores de biomarcadores séricos. A mediana global foi calculada a partir de todo o universo
de dados de cada citocina (NI + HIV + TARV 1 + TARV2). Indivíduos localizados acima do ponto de
corte são considerados altos produtores e indivíduos localizados abaixo do ponto de corte, baixos
produtores.
55
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte I TARV#1#
IL-10
IL-5
IL-4
IFN-γ
IFN-α
TNF-α
IL-12
IL-6
IL-1β
RANTES
MCP-1
IP-10
IL-10
IL-5
IL-4
IFN-γ
HIV#
IFN-α
TNF-α
IL-12
IL-6
IL-1β
RANTES
MCP-1
NI#
IP-10
IL-10
IL-5
IL-4
IFN-γ
IFN-α
IL-12
TNF-α
IL-6
IL-1β
RANTES
IP-10
MCP-1
3"
47 40 40 40 33 33 47 60 40 40 47 40
IL-10
IL-5
IL-4
IFN-γ
IFN-α
IL-12
TNF-α
IL-6
IL-1β
RANTES
50 89 63 63 70 87 65 63 76 57 67 76
IP-10
TARV#2#
MCP-1
A
60 73 13 33 73 73 53 60 47 47 53 33
47 18 42 47 35 23 38 36 35 47 33 38
56
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte I B
NI&
HIV&
MCP$1&
IL$10&
IL#10*'
IL$10&
IP$10&
IL$5&
RANTES&
IL$4&
IL$1β&
IFN$γ&
IL$6&
IFN$α&
RANTES*'
RANTES&
IL#4*'
IL$4&
IL#1β*'
IL$1β&
IL#6*'
IL$6&
IFN$γ&
IFN#γ*'
TNF$α&
IFN$α&
IFN#α*'
Frequência&de&Indivíduos&com&
Altos&Níveis&Plasmã=cos&(%)&
100&
50&
0&
TNF$α&
TNF#α*'
IL$12&
IL#12*'
TARV&1&
TARV&2&
MCP$1&
MCP#1*'
MCP$1&
IL$10&
IP$10&
IL$5&
IL$4&
IL$1β&
IFN$γ&
IL$6&
TNF$α&
IL$12&
IP#10*'
IP$10&
IL$10&
RANTES&
IFN$α&
IFN#α*'
IP#10*'
IP$10&
IL#5*'
IL$5&
IL$12&
Escala&
MCP$1&
IL#5*'
IL$5&
RANTES&
IL$4&
IL$1β&
IL#6*'
IL$6&
IFN$γ&
TNF#α*'
TNF$α&
IFN$α&
IFN#α*'
IL$12&
IL#12*'
Figura 4. Bioassinatura imunológica de pacientes HIV+ não tratados ou em diferentes
tratamentos antirretrovirais. A concentração plasmática das citocinas MCP-1, RANTES, IP-10, IL1β, IL-6, TNF-α, IL-12, IFN-α, IFN-γ, IL-4, IL-5 e IL-10 foi utilizada para a análise categórica dos
indivíduos dos grupos NI, HIV, TARV 1 e TARV 2 entre altos e baixos produtores dos biomarcadores
imunológicos. A) Diagramas em preto e branco representam altos (
) e baixos (
) produtores
de cada citocina. Cada coluna representa uma citocina e cada bloco representa o padrão de
produção de cada indivíduo. Os números abaixo de cada coluna representam a frequência de altos
produtores de cada citocina avaliada. B) Gráficos em radar sumarizam a porcentagem de altos
produtores de cada grupo clínico estudado. Quando a frequência de altos produtores foi maior que
50% (em uma escala de 0-100%), o resultado foi marcado em negrito e com um asterisco.
57
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte I 4.4 Análise da Bioassinatura Imunológica de pacientes de acordo com
biomarcadores de progressão
Diferentes trabalhos classificam a terapia antirretroviral, independente do
regime utilizado, como uma estratégia de recuperação parcial da saúde e do sistema
imunológico pela eliminação da carga viral circulante e recuperação de células T
CD4+. No entanto, recentes estudos destacam a persistência de ativação
imunológica crônica mesmo em pacientes que utilizam TARV por longos períodos [24], associando-a a progressão da doença e aumento de morbidade e mortalidade
[5,6]. Neste sentido, levando em consideração os diferentes perfis imunológicos de
pacientes sob regimes de tratamento distintos observados em nosso trabalho, nos
propusemos a avaliar a correlação entre perfil imune desenvolvido e o status de
progressão da doença nos diferentes grupos clínicos. Para tanto, utilizamos como
fatores de categorização os biomarcadores de progressão já estabelecidos: carga
viral e contagem de células T CD4+, além dos valores de sCD163 e sCD14 séricos.
Neste momento, utilizamos como grupo amostral os valores dos biomarcadores de
progressão correspondentes aos indivíduos HIV+ virgens de tratamento para
obtenção da mediana global e posterior segregação entre possíveis progressores
rápidos ou lentos (Figura 5A).
Posteriormente, correlacionamos os biomarcadores de progressão entre si a
fim de identificar a concordância entre eles, ou seja, calculamos a porcentagem de
acordo entre os biomarcadores na classificação dos possíveis progressores rápidos
e lentos. Entre os pacientes HIV+ virgens de tratamento, verificamos 78% de acordo
entre a contagem de células T CD4+ e a concentração sérica de sCD14, seguida de
70% de concordância entre sCD14 e sCD163, 69% entre sCD14 e carga viral, 65%
entre a contagem de células T CD4+ e carga viral , 61% entre sCD163 e carga viral
e por fim, 60% entre sCD163 e a contagem de células T CD4+ (Figura 5B).
A Figura 6A mostra o perfil dos pacientes HIV+ virgens de tratamento
quanto à alta produção de biomarcadores categorizados pelos parâmetros carga
viral e contagem de células T CD4+. Observamos que os progressores rápidos
(Carga Viral > 3x105 cópias/mL e contagem de CD4+ < 400/mm3), possuíam um
perfil de inflamação exacerbado, caracterizado pela intensidade da frequência de
altos produtores, acima de 75% em maioria, e pelo número de biomarcadores
alterados. Por outro lado, os progressores lentos (Carga Viral < 3x105 cópias/mL e
contagem de CD4+ > 400/mm3) possuíam perfil inflamatório moderado na qual 8 das
58
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte I 12 citocinas estudadas estavam com frequência acima de 50%, porém com
intensidade menor em relação aos progressores rápidos.
Uma vez que os parâmetros tradicionais contagem de células T CD4+ e
carga viral são influenciados pelo tratamento antirretroviral, utilizamos apenas os
parâmetros sCD163 e sCD14 para a categorização dos grupos clínicos sob
tratamento. Utilizando a categorização de progressores quanto aos níveis séricos de
sCD163, observamos que pacientes HIV+ virgens de tratamento possuíam perfil
semelhante ao visto nos critérios carga viral e contagem de células T CD4+. Quanto
ao tratamento, pacientes classificados como progressores rápidos (sCD163 > 5x105
pg/mL) que faziam uso de TARV 1 e TARV 2 possuíam perfil de inflamação
moderada, com 7 e 9 citocinas com frequência acima de 50%, respectivamente. Por
outro lado, observamos diferenças visíveis entre os tratamentos nos pacientes
classificados como progressores lentos (sCD163 < 5x105 pg/mL), nos quais
pacientes que utilizaram TARV 1 possuíam perfil semelhante a indivíduos não
infectados (Figura 4B), nos quais nenhuma citocina possuía frequência acima de
50% e pacientes que usavam TARV 2 permaneceram em um estado de inflamação
moderada (Figura 6B).
Já utilizando o biomarcador sCD14 para categorização dos progressores,
percebemos que pacientes virgens de tratamento mais uma vez demonstraram perfil
semelhante ao observado em outros biomarcadores de progressão. Entretanto,
entre os tratamentos, progressores rápidos (sCD14 >3x106 pg/mL) que usavam
TARV 2 demonstram padrão de inflamação moderado, onde 6 de 12 citocinas
estavam acima de 50% de frequência, enquanto os que usavam TARV 1 possuíam
apenas 2 citocinas com frequência de altos produtores acima de 50%. Entre os
progressores lentos, assim como verificado no critério de separação para sCD163,
pacientes que utilizavam TARV 1 também não demonstraram qualquer perfil
inflamatório, ao contrário dos indivíduos sob o tratamento TARV 2, os quais
mostraram perfil global de inflamação moderada, com 6 das 12 citocinas com
frequência de altos produtores acima de 50% dos indivíduos (Figura 6C).
Em conjunto e levando-se em consideração o parâmetro progressão da
doença, observamos que a bioassinatura imunológica de pacientes HIV+ virgens de
tratamento se caracterizou por inflamação exacerbada entre os progressores rápidos
e inflamação moderada entre os progressores lentos. Em contrapartida, utilizando
como parâmetros sCD163 e sCD14, a terapia antirretroviral reduziu a inflamação
59
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte I exacerbada, mesmo nos progressores rápidos, porém entre elas, com o uso de
TARV 1, a bioassinatura imunológica desses pacientes se aproximou a de indivíduos
não infectados principalmente entre os progressores lentos, enquanto o padrão de
bioassinatura de pacientes que usavam TARV 2 foi de inflamação moderada nos
progressores rápidos, a qual permaneceu nos progressores lentos, o que os torna
mais distantes do perfil imunológico de indivíduos não infectados.
60
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte I Possíveis Progressores Lentos
A"
Possíveis Progressores Rápidos
Células
T CD4+
CD4+ T-cells
3x10 5
10 4
10 3
pg/mL
Cópias/mL
Baixos Níveis
Células/mm3
Altos Níveis
10 5
Mediana Global
sCD163
sCD163
400
0
HIV
sCD14
sCD14
6.0
6 ××
10
10066
1.0
10066
1 ××10
800
pg/mL
Carga
Viral
Viral Load
10 6
5x10 5
00
0
HIV
3x10 6
HIV
HIV
HIV
( Pacientes HIV+ não tratados)
B"
65%
61%
69%
6.0 ×10 6
37%
0
10 3
5.0x10 5
28%
10 4
10 5
10 6
sCD14
400
28%
33%
1.0 ×10 6
sCD163
Células T CD4+
1,000
28%
0
10 3
10 4
10 7
10 5
10 6
3.0 ×10 6
41%
0
10 3
10 4
10 7
10 5
10 6
10 7
Carga Viral
60%
sCD14
sCD163
1.0 ×10
78%
6.0 ×10 6
30%
6
5.0x10 5
3.0 ×10 6
30%
0
0
1,000
400
30%
48%
0
0
400
1,000
CD4+ T-cells
70%
6.0 ×10 6
sCD14
33%
3.0 ×10 6
37%
0
0
5.0x10 5
1.0 ×10 6
sCD163
Figura 5. Determinação dos pontos de corte e concordância de biomarcadores de progressão
utilizados para categorizar pacientes HIV+ entre possíveis progressores lentos ou rápidos. A)
A mediana global dos valores de carga viral, contagem de células T CD4+, sCD163 e sCD14
plasmáticos foi calculada a partir do universo de dados dos pacientes HIV+ não tratados. Indivíduos
localizados acima do ponto de corte são considerados progressores rápidos, enquanto indivíduos
localizados abaixo do ponto de corte, progressores lentos. B) Porcentagem de concordância entre os
biomarcadores de progressão carga viral, contagem de células T CD4+, sCD163 e sCD14
plasmáticos. Gráficos correlacionando os biomarcadores entre si foram montados utilizando o ponto
de corte para cada biomarcador. Os quadrantes relativos à presença dos dois biomarcadores,
classificando progressores rápidos e lentos foram marcados em cinza e a porcentagem de
concordância final calculada pela soma das frequências dos indivíduos pertencentes aos quadrantes
de progressão rápida e lenta.
61
B
Alto&
Baixo&
62
IFN$α&
IFN$γ&
IL$4&
IL$5&
IL$10&
IFN$α&
IFN$γ&
IL$4&
IL$5&
IL$10&
IL$10&
IL$12&
MCP$1&
IL$12&
TNF$α&
IL$6&
IL$1β&
RANTES&
IP$10&
TNF$α&
IL$6&
IL$1β&
RANTES&
IFN$α&
IFN$γ&
IL$4&
IL$5&
IL$10&
IFN$α&
IFN$γ&
IL$4&
IL$5&
IL$12&
MCP$1&
IL$12&
IL$10&
IFN$α&
IFN$γ&
TNF$α&
IL$6&
IFN$α&
IFN$γ&
IL$1β& IL$4&
RANTES& IL$5&
IP$10&
TNF$α&
IL$6&
IL$1β& IL$4&
RANTES& IL$5&
IL$12&
MCP$1&
IL$12&
TNF$α&
IL$6&
IL$1β&
RANTES&
IP$10&
TNF$α&
IL$6&
IL$1β&
RANTES&
IP$10&
MCP$1&
IP$10&
MCP$1&
MCP$1&
TNF$α&
IL$6&
IL$1β&
RANTES&
IP$10&
TNF$α&
TARV2&
IL$10&
IL$12&
MCP$1&
IL$12&
IL$6&
IL$1β&
RANTES&
IP$10&
TARV&1&
IP$10&
IFN$α&
IFN$γ&
IL$4&
IL$5&
IL$10&
IFN$α&
IFN$γ&
IL$4&
IL$5&
IL$10&
MCP$1&
HIV&
Carga&Viral&&
HIV&
sCD163&
Alto&
Baixo&
Baixo&
C
Alto&
Alto&
Baixo&
A
IFN$α&
IFN$γ&
IL$4&
IL$5&
IL$10&
IFN$α&
IFN$γ&
IL$4&
IL$5&
IL$10&
IFN$α&
IFN$γ&
IL$4&
IL$5&
IL$10&
IFN$α&
IFN$γ&
IL$4&
IL$5&
IL$10&
IL$12&
TNF$α&
IL$6&
IFN$α&
IFN$γ&
IL$1β& IL$4&
RANTES& IL$5&
IL$12&
TNF$α&
IL$6&
IFN$α&
IFN$γ&
IL$1β& IL$4&
RANTES& IL$5&
IL$10&
IL$12&
MCP$1&
IP$10&
MCP$1&
IL$10&
MCP$1&
IFN$α&
IFN$γ&
IL$12&
IP$10&
IL$6&
TNF$α&
MCP$1&
IL$12&
IFN$α&
IFN$γ&
IL$1β& IL$4&
RANTES& IL$5&
IL$10&
0&
50&
100&
Escala&
TNF$α&
IL$6&
IL$1β&
RANTES&
IP$10&
TNF$α&
IL$6&
IL$1β&
RANTES&
IP$10&
TARV&2&
Frequência&de&Indivíduos&com&
Altos&Níveis&Plasmã=cos&(%)&
IL$12&
TNF$α&
IL$6&
IL$1β& IL$4&
RANTES& IL$5&
IP$10&
MCP$1&
IL$10&
MCP$1&
sCD14&
TARV&1&
IP$10&
TNF$α&
IL$6&
IL$1β&
RANTES&
IP$10&
TNF$α&
IL$6&
IL$1β&
RANTES&
IP$10&
HIV&
IL$12&
MCP$1&
IL$12&
MCP$1&
HIV&
Células&T&CD4+&
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte I ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte I Figura 6. Bioassinatura imunológica de pacientes HIV+ não tratados ou em diferentes
tratamentos antirretrovirais de acordo com biomarcadores de progressão. A concentração
plasmática das citocinas MCP-1, RANTES, IP-10, IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-12, IFN-α, IFN-γ, IL-4, IL-5 e
IL-10 foi utilizada para a análise categórica dos indivíduos dos grupos HIV, TARV 1 e TARV 2 entre
progressores rápidos e lentos. Gráficos em radar sumarizam a porcentagem de altos produtores de
cada grupo clínico estudado. A) Categorização de pacientes HIV+ virgens de tratamento utilizando os
biomarcadores Carga Viral e contagem de células T CD4+. B) Categorização de pacientes HIV+ não
tratados ou em uso de TARV 1 ou TARV 2, segundo os níveis de sCD163 plasmáticos. C)
Categorização de pacientes HIV+ não tratados ou em uso de TARV 1 ou TARV 2, segundo os níveis
de sCD14 plasmáticos. Considera-se alterado o biomarcador que possuir frequência de altos
produtores maior que 50% (em uma escala de 0-100%).
63
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte I 4.5 Análise das Correlações entre os Biomarcadores Imunológicos,
uma visão de biologia dos sistemas.
Para realizarmos uma análise exploratória e elucidarmos as conexões entre
os biomarcadores, utilizamos redes de correlações entre os biomarcadores
imunológicos estudados, as quais podem ser positivas ou negativas e subcategorizadas de acordo com a “força” da correlação relativa ao valor de r, calculado
utilizando a análise de Spearman.
Indivíduos NI foram caracterizados por uma rede rica em conexões, nas
quais as citocinas IL-1β, IL-6, IFN-α, IL-4 e IL-10 se correlacionaram com as demais
através de interações fortes. Observamos correlações fortes e moderadas partindo
de IL-12; correlações fracas originadas de TNF-α e apenas uma correlação negativa
referente à IP-10. Comparadas à rede de NI, a infecção por HIV induziu
modificações nas conexões imunológicas, observadas através da perda de força em
interações envolvendo IL-6, IFN-α e IL-10; e ganho de força em interações
originadas a partir de TNF-α e IP-10. Por outro lado, as redes de interações em
pacientes HIV+ que utilizavam TARV 1 foram caracterizadas por um novo perfil de
interações referentes às citocinas IL-12 e IFN-γ, as quais ganharam força com o
tratamento e a MCP-1 que perdeu todas as interações com outras citocinas. E,
sobretudo, observamos a recuperação de padrões que foram modificados na
infecção, como os das citocinas IP-10, IL-6 e IL-10 em pacientes que faziam uso de
TARV 1 para um perfil semelhante ao de indivíduos NI. Notavelmente, o uso de
TARV 2 foi associado à relevante perda de conexões, gerando um perfil distinto de
todos os outros grupos clínicos. Citocinas como IL-6, IL-10, MCP-1 e RANTES estão
entre as que mais sofreram perdas de interações, enquanto interações originadas de
IL-1β e IFN-α se mostraram preservadas quando comparadas a indivíduos NI
(Figura 7).
Utilizando esse tipo de análise, que leva em consideração todo o universo
de dados, é possível ressaltar os biomarcadores mais relevantes na infecção por
HIV e nos diferentes tratamentos. Destacamos, portanto, IP-10, IL-6, TNF-α, IFN-α,
IL-10 e MCP-1 como os principais alvos imunológicos até o momento no presente
estudo.
64
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte I NI#
TARV#1#
HIV#
TARV#2#
“Pontuação*das*Correlações”*
Nega.va#(r#<#0)#
Fraca#(r#≤#0,35)#
Morderada#(0,36#≥#r#≤#0,67)#
Forte#(r#≥#0,68)#
Figura 7. A rede de interações entre biomarcadores imunológicos é modificada durante a
infecção por HIV e pelo regime de tratamento. A análise de rede mostra correlações significativas
(p<0,05) entre todas as variáveis, calculadas através da correlação de Spearman entre cada par de
biomarcadores e são representadas por linhas nos diferentes grupos clínicos estudados. A força de
correlação foi determinada pelo valor de "r" e é ilustrada como negativa (r < 0), fraca (r ≤ 0,35);
moderada (0,36 ≤ r ≤ 0,67); ou forte (r ≥ 0,68). As setas indicam os principais biomarcadores
modificados durante a infecção pelo HIV.
65
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte I 4.6 Geração de Heatmaps para a identificação dos melhores
biomarcadores imunológicos e sua correlação com os diferentes grupos
clínicos.
Até este ponto de análise, utilizando a estratégia de categorização dos
indivíduos em “Altos produtores”, nossos resultados indicam que pacientes HIV+ que
usavam TARV 1 são imunologicamente mais semelhantes a indivíduos não
infectados, enquanto pacientes que utilizavam o regime TARV 2 se aproximam do
perfil imune de pacientes HIV+ virgens de tratamento (Figuras 4 e 6).
Adicionalmente, utilizando a análise de redes de interações, verificamos novamente
semelhanças entre os grupos clínicos NI e TARV 1. Além disso, pudemos destacar
os principais biomarcadores relacionados à doença (Figura 7).
Dessa forma,
lançamos mão de uma terceira forma de análise, utilizando o score Z como forma de
classificar os principais biomarcadores relacionando-os aos indivíduos de cada
grupo.
Utilizando os biomarcadores destacados anteriormente, IP-10, IL-6, TNF-α,
IFN-α, IL-10 e MCP-1, calculamos o score Z de todos os indivíduos incluídos no
estudo e geramos o heatmap conforme observado na Figura 8.
Notamos que o biomarcador que melhor segregou indivíduos não infectados
dos pacientes HIV+, independente do tratamento, foi IP-10, seguido de TNF-α e IFNα. Além disso, percebemos que o agrupamento dos pacientes HIV+ que recebiam
TARV 1 estava localizado em sua maioria entre os indivíduos NI. Por outro lado,
pacientes HIV+ que usavam TARV 2 estavam incluídos entre os pacientes HIV+
virgens de tratamento.
Os presentes dados reafirmam os achados em análises anteriores e
demonstram mais uma vez que os diferentes perfis imunológicos gerados em
pacientes sob os diferentes tratamentos pode ter um impacto na saúde e expectativa
de vida desses pacientes.
66
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte I NI
HIV
TARV 1
TARV 2
Figura 8. O padrão de expressão dos principais biomarcadores imunológicos definem um
perfil de segregação após infecção e entre diferentes grupos tratados. Os valores de IP-10, IL-6,
TNF-α, IFN-α, IL-10 e MCP-1 foram usados para calcular o Score Z para cada citocina produzida
individualmente para a geração um heatmap. A escala de Score Z variou de -6 a +6 e é ilustrada com
as cores verde, preta e vermelha de acordo com a intensidade de produção da citocina.
67
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte I 4.7 Geração de árvore de decisão levando em consideração os
principais biomarcadores encontrados na infecção por HIV
Utilizando os biomarcadores selecionados anteriormente, lançamos mão da
construção de uma árvore de decisão a fim de ressaltar quais dos biomarcadores
seriam mais importantes na segregação dos grupos clínicos.
Como nossos resultados demonstraram padrão imunológico similar entre os
grupos NI e TARV 1, nós os incluímos em um único e maior grupo. O mesmo foi
feito para os grupos clínicos de pacientes HIV+ não tratados e em uso de TARV 2.
Quando utilizados todos os 142 registros na construção da árvore de
decisão, a estrutura gerada obteve média de acurácia de 90,84%, classificando
corretamente 129 e errando apenas 13 registros. Os atributos mais importantes para
a árvore de decisão foram “IP-10”, seguido por “TNF-α”. É importante salientar que
somente estes dois atributos classificaram 83 dos 142 (58,45%) registros da base,
com taxa de classificação de 96,38%, classificando 63 como “NI ou TARV 1” errando
3 e classificando 20 como “HIV ou TARV 2”, não errando nenhum registro (Figura
9).
68
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte I IP#10&
<=540,9&
>540,9&
TNF#α&
<=8,27&
TNF#α&
>8,27&
NI#ou#TARV#1#(63.0/3.0)#
<=15,2&
IP#10&
<=327,11&
NI#ou#TARV#1#(6.0)#
>15,2&
HIV&ou&TARV&2&(20.0)&
IFN#α&
>327,11&
HIV&ou&TARV&2&(13.0/3.0)&
<=7,69&
HIV&ou&TARV&2&(9.0)&
>7,69&
IFN#α&
<=18,61&
NI#ou#TARV#1#(15.0/5.0)#
>18,61&
HIV&ou&TARV&2&(16.0/2.0)&
Figura 9. Árvore de decisão revela os principais biomarcadores que caracterizam a segregação
entre os indivíduos não infectados e infectados; e entre os tratamentos de primeira e segunda
linha. Os valores de IP-10, IL-6, TNF-α, IFN-α, IL-10 e MCP-1 foram utilizados para a construção do
conjunto de dados. Árvore de decisão foi gerada considerando a clusterização de NI e HAART 1
como um grupo; e o HAART2 e o HIV, como um outro grupo. Os números ao lado do nome dos
grupos indicam o ranking dos registros corretos/incorretos.
69
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados Parte II Associação entre a disfunção imune de monócitos e alterações epigenéticas induzidas pela infecção por HIV 70
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte II Nesta etapa dos resultados iremos descrever as diferenças funcionais de
monócitos de indivíduos não infectados e pacientes HIV+ virgens de tratamento ou
em uso de TARV, enfatizando sua capacidade fagocítica, microbicida e produção de
mediadores imunológicos, quando infectados in vitro pelo Mtb, bacilo responsável
pelo alto índice de coinfecções HIV/TB, associando-as a alterações epigenéticas
induzidas pela infecção por HIV.
4.8 Avaliação da capacidade fagocítica e microbicida de monócitos de
pacientes HIV+
A capacidade fagocítica e microbicida de monócitos de indivíduos não
infectados e de pacientes HIV+ virgens ou não de tratamento foi quantificada através
da metabolização da resazurina pelo Mtb intracelular.
Na Figura 10A observamos a quantificação indireta de Mtb intracelular, em
RFU, após 2 e 24 horas de infecção, períodos referentes, respectivamente, à
fagocitose e capacidade microbicida dos monócitos em contato com o Mtb in vitro.
Inicialmente, ao analisarmos os dados agrupados, observamos redução significativa
na quantidade de Mtb intracelular entre 2 e 24 horas de infecção das células dos
indivíduos controle. Contudo, não observamos diferença significativa entre 2 e 24
horas nos pacientes HIV+ virgens de tratamento ou HIV+ em uso de TARV. No que
diz respeito à fagocitose, em relação aos monócitos de indivíduos não infectados,
observamos redução na capacidade fagocítica do Mtb pelos monócitos de pacientes
HIV+ virgens de tratamento, que parece ser recuperada em pacientes que fazem
uso de TARV (Figura 10B). O fenômeno pode ser melhor observado quando
calculado o índice fagocítico dos grupos clínicos infectados em relação ao grupo NI
(Figura 10C).
Quanto à atividade microbicida de monócitos frente ao Mtb, observamos
que pacientes HIV+ virgens de tratamento possuem disfunção na capacidade de
matar e de controlar o crescimento bacteriano, uma vez que a mediana da
porcentagem de atividade microbicida do grupo possui valor abaixo de zero, o que
indica crescimento do bacilo em detrimento a sua contenção. Por outro lado,
monócitos de pacientes HIV+ em uso de TARV demonstraram capacidade
microbicida similar a de indivíduos NI (Figura 11A). Levando em consideração a
heterogeneidade dos grupos clínicos estudados, analisamos individualmente a
capacidade de eliminação do Mtb pelos monócitos e classificamos os indivíduos de
71
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte II acordo o grau de atividade microbicida, em acima 50%; entre 0 – 50% e abaixo de
zero (Figura 11B). Dessa forma, verificamos que entre os indivíduos NI, 47%
possuíam atividade microbicida acima de 50%; 33% entre 0 – 50% e apenas 20%
dos indivíduos deste grupo não eram capazes de controlar o crescimento do bacilo
da tuberculose. Por outro lado, dentre os pacientes HIV+ não tratados, observamos
que apenas 18% dos indivíduos eram capazes de matar mais que 50% das
bactérias; 18% se encontravam entre 0 – 50% e 64% dos indivíduos deste grupo
conseguiram controlar o crescimento do Mtb. Já entre os pacientes que faziam uso
de TARV, 33% se encontravam acima dos 50% de atividade microbicida, 33% entre
0 - 50% e 33% abaixo de zero (Figura 11C).
72
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte II 2"horas"(Fagocitose)
24"horas"(A2vidade"microbicida)
Mtb intracelular (RFU)
A
5×107
***
2×107
1×107
0
7
% Índice Fagocítico
(relativo ao controle)
2.0×10
1.5×10 7
1.0×10
7
TARV
HIV
5.0×10 6
0.0
HIV
C
*
2.5×10 7
NI
Fagocitose de Mtb (RFU)
B
NI
TARV
100
*
50
0
NI
HIV
TARV
Figura 10. Capacidade fagocítica de monócitos após infecção por Mycobacterium tuberculosis
in vitro. Os grupos foram divididos em indivíduos não infectados (NI), pacientes HIV+ virgens
de tratamento (HIV) e infectados mas em terapia antirretroviral (TARV) A) Intensidade de
fluorescência do Mtb intracelular após 2 horas (Fagocitose) e 24 horas de infecção (Atividade
microbicida). B) Intensidade de fluorescência do Mtb intracelular após 2 horas de fagocitose.
C) Porcentagem do índice fagocítico dos grupos HIV e TARV relativos ao controle. Monócitos
CD14+ foram separados através de beads magnéticas imunomarcadas, e em seguida infectados com
M. tuberculosis (MOI 5). A fagocitose, avaliada após 2 horas de infecção e a atividade microbicida
das células, avaliada após 24 horas de infecção, foram realizadas por teste de redução da resazurina
após 24 horas de metabolização posteriores aos tempos de infecção e analisados em fluorímetro.
Nos gráficos A e B as linhas representam a mediana do grupo e os dados estão expressos em RFU
(unidades relativas de fluorescência). *p<0,05; ***p<0,001 versus controle NI.
73
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte II A
Fagocitose
A+vidade.microbicida
% Atividade microbicida
(relativo à fagocitose)
100
*
50
0
-50
Fagocitose
B
NI
HIV
TARV
C
*
100
% Atividade Microbicida
(Frequência de indivíduos %)
% Atividade microbicida
(relativo à fagocitose)
100
50
0
-50
TARV
HIV
-150
NI
-100
50
47%
> 50%
0 - 50%
<0
33%
18%
0
33%
18%
20%
33%
64%
33%
-50
-100
NI
HIV
TARV
Figura 11. Atividade microbicida de monócitos após infecção por Mycobacterium tuberculosis
in vitro. Os grupos foram divididos em indivíduos não infectados (NI), pacientes HIV+ virgens
de tratamento (HIV) e infectados mas em terapia antirretroviral (TARV). A) Porcentagem de
atividade microbicida em relação à fagocitose. B) Porcentagem da atividade microbicida
segregada quanto ao grau de eliminação do bacilo. C) Frequência de indivíduos segregada
quanto ao grau de eliminação do bacilo. Monócitos CD14+ foram separados através de beads
magnéticas imunomarcadas, e em seguida infectados com M. tuberculosis (MOI 5). A atividade
microbicida foi avaliada após 24 horas de infecção e realizada por teste de redução da resazurina
após 24 horas de metabolização posteriores ao tempo de infecção e analisada em fluorímetro. No
gráfico A os resultados estão expressos como mediana + Intervalo Interquartil. *p<0,05.
74
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte II 4.9 Avaliação da produção de citocinas e quimiocinas em sobrenadante
de cultura
Após verificar disfunção fagocítica e microbicida em monócitos de pacientes
HIV+, questionamos se a produção de citocinas e quimiocinas também se
encontrava alterada após estímulo in vitro com Mtb.
Dentre as principais citocinas e quimiocinas produzidas por monócitos,
observamos que IL-6, IL-1β, MIP-1α, MIP-1β e MCP-1 foram diferencialmente
produzidas por monócitos provenientes de pacientes HIV+ virgens de tratamento
sob estímulo do bacilo da tuberculose em relação a indivíduos não infectados. A
produção de TNF-α também apresentou o mesmo perfil, apesar de não ter sido
observada diferença estatística. A produção de IL-1β estava aumentada em
monócitos de pacientes HIV+ em uso de TARV, comparada a de indivíduos NI. Por
outro lado, a produção de MCP-1 se mostrou reduzida nos pacientes em terapia
antirretroviral, comparada a pacientes virgens de tratamento. Apesar de não
apresentar diferenças estatísticas a produção de TNF-α e MIP-1α parecem seguir
perfil de produção similar ao de pacientes virgens de tratamento, enquanto os níveis
de IL-6 e MIP-1β se mostram similar ao perfil de produção de indivíduos NI (Figura
12).
Como demonstrado na Parte I dos resultados, pacientes HIV+ virgens de
tratamento
possuem
padrão
de
inflamação
sistêmica
exacerbado
quando
comparados a indivíduos NI, este perfil se repete ao analisarmos a resposta de
monócitos isolados destes indivíduos, quando submetidos a estímulo in vitro. Estes
dados reforçam a importância dessas células na patogênese da doença, uma vez
que elas podem ser um dos principais focos da ativação descontrolada do sistema
imune na infecção pelo HIV.
75
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte II TNF-α
IL-6
3000
2000
2000
1000
Sem$es&mulo
Mtb
*
500
1000
250
0
NI
HIV
TARV
0
NI
pg/mL
*
300
TARV
MIP-1α
IL-1β
400
HIV
12000
*
*
9000
6000
200
3000
100
0
NI
HIV
TARV
0
NI
MIP-1β
HIV
MCP-1
1800
900
*
*
1200
600
600
300
0
TARV
NI
HIV
TARV
0
#
NI
HIV
TARV
Figura 12. Citocinas e quimiocinas quantificadas no sobrenadante de cultura de monócitos
após 24 horas de infecção pelo M. tuberculosis. Os monócitos foram obtidos do sangue periférico
de indivíduos não infectados (NI), pacientes HIV+ virgens de tratamento (HIV) e infectados mas em
terapia antirretroviral (TARV). A partir do sobrenadante de cultura dos monócitos infectados com Mtb
(MOI 5) as citocinas TNF-α, IL-6, IL-1β, MIP-1α, MIP-1β e MCP-1 foram quantificadas utilizando-se
beads magnéticas dos kits MILLIPLEX® MAP Human Cytokine/Chemokine (Millipore) e o
equipamento MagPix (Luminex) para leitura e análise dos dados. O resultado é expresso em média +
SEM da produção de citocinas das células sem estímulo ou estimuladas com Mtb. * p<0,05 versus NI;
# p<0,05 versus HIV.
76
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte II 4.10 Avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS)
As espécies reativas de oxigênio estão entre os principais metabólitos
microbicidas produzidos pelos monócitos e macrófagos e podem ser importantes
marcadores da função microbicida ou de ativação destas células. Dessa forma, além
da produção de citocinas, nos propusemos a avaliar a capacidade destas células em
produzir ROS espontaneamente, após estímulo com Mtb mortas por calor (“heat
killed”) ou com o PMA, considerado estímulo positivo na produção de ROS.
Observamos aumento na produção espontânea de ROS por células não
estimuladas de pacientes HIV+ virgens de tratamento, comparadas aos indivíduos
não infectados. O uso de TARV, por sua vez, reduziu a produção de ROS aos níveis
dos indivíduos não infectados. Por outro lado, após estimulo com Mtb, observamos
aumento da produção de ROS pelos monócitos dos três grupos avaliados em
relação às células sem estímulo, porém sem diferenças estatísticas entre os grupos,
apesar dos indivíduos HIV+ demonstrarem tendência à maior produção de ROS.
Observamos ainda que após estímulo com PMA, houve a maior produção de
ROS de maneira geral, e assim, não observamos alterações significativas entre os
grupos estudados. (Figura 13).
77
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte II ROS
Quimioluminescência
(área sob a curva)
6×106
Produção espontânea
*
4×106
2×106
0
NI
ROS
(área sob a curva)
TARV
Mtb
8×107
6×107
4×107
2×107
0
NI
HIV
TARV
PMA
1.5×108
ROS
(área sob a curva)
HIV
1.0×108
5.0×107
0.0
NI
HIV
TARV
Figura 13. Quantificação de espécies reativas de oxigênio de monócitos de indivíduos controle
ou HIV+ virgens de tratamento (HIV) ou em terapia antirretroviral (TARV) de células não
5
estimuladas, após estímulo com M. tuberculosis ou PMA. Após separação magnética, 1x10
monócitos CD14+, foram distribuídos em tubos e a eles foram adicionados luminol e os estímulos M.
-7
tuberculosis “heat killed” (MOI 5) e PMA (10 M). Imediatamente após estimulação, os tubos foram
submetidos à leitura de quimioluminescência em luminômetro. Os resultados são expressos em área
sob a curva de quimioluminescência do luminol em monócitos após 2 horas de cinética. *p<0,05 vs
NI.
78
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte II 4.11 Análise das subpopulações de monócitos no sangue periférico
Após verificarmos disfunção imunológica nos monócitos de pacientes HIV+,
que até então apresentaram um perfil de ativação imune exacerbada, com redução
da habilidade microbicida, nos questionamos se estes resultados estariam
correlacionados a alterações nas subpopulações de monócitos, uma vez que a
frequência destas células no sangue periférico pode ser modulada por infecções,
como HIV e pode adicionalmente ser um dos fatores responsáveis pela modificação
no perfil de ativação imunológica crônica nesses pacientes.
Dessa forma, analisamos a frequência das três subpopulações de
monócitos, os clássicos, que expressam CD14+; os intermediários, CD14highCD16+
e os não clássicos CD14dimCD16+ na população de células mononucleares do
sangue periférico dos indivíduos por citometria de fluxo. Verificamos redução
significativa na porcentagem de monócitos clássicos nos pacientes HIV+ virgens de
tratamento, mas não nos pacientes em uso de TARV. Em contrapartida, observamos
que nestes pacientes a frequência de monócitos intermediários e não clássicos foi
significativamente maior (Figura 14). Dessa forma, a infecção por HIV foi capaz de
alterar o fenótipo de monócitos circulantes, fato que pode estar correlacionado com
a função imune alterada nestas células.
79
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte II Monócitos clássicos
100
CD14+ (%)
#
75
*
50
25
0
NI
HIV
TARV
Monócitos Intermediários
CD14hi CD16+ (%)
30
*
20
#
10
0
NI
HIV
TARV
Monócitos não-clássicos
CD14dim CD16+ (%)
15
*
10
#
5
0
NI
HIV
TARV
Figura 14. Análise da frequência dos subtipos de monócitos na população de células
mononucleares do sangue periférico de indivíduos não infectados (NI), pacientes HIV+ virgens
de tratamento (HIV) ou em terapia antirretroviral (TARV). As células mononucleares do sangue
periférico foram marcadas com anticorpos específicos anti-CD14-PerCP e anti-CD16-PE e adquiridas
em citômetro de fluxo. A frequência das subpopulações refere-se à porcentagem de cada
subpopulação dentro da gate de monócitos. *p<0,05 versus NI; # p<0,05 versus HIV.
80
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte II Análises Epigenéticas
Uma vez que caracterizamos as alterações funcionais dos monócitos
de pacientes HIV+, o próximo passo do trabalho foi avaliar se a disfunção imune
destas células estaria correlacionada com alterações epigenéticas, ou seja,
alterações na dinâmica de acessibilidade ao DNA e transcrição gênica. Avaliamos
estes aspectos através da análise de metilação global do DNA e da frequência de
enzimas responsáveis pela ativação ou repressão da transcrição gênica.
4.12 Análise da Metilação Global do DNA
Dentre as alterações epigenéticas que alteram a transcrição gênica, a
metilação de áreas do DNA, conhecidas como ilhas CpG, são importantes
alterações que implicam em inibição da transcrição gênica. Em indivíduos
saudáveis, estas modificações fazem parte da dinâmica de expressão gênica para a
manutenção da homeostase. No entanto, infecções são capazes de modificar o perfil
de metilação do DNA. Em nosso trabalho, nos questionamos se a infecção por HIV
estaria modulando o perfil de metilação global do DNA, dessa forma influenciando
na transcrição gênica, de forma global.
Observamos que em indivíduos NI, o padrão de metilação global do DNA foi
de aproximadamente 17%. Em contrapartida, pacientes HIV+ virgens de tratamento,
apresentaram redução significativa da metilação DNA quando comparados a
indivíduos NI, com média em torno de 9%. Com o uso de TARV, o padrão de
metilação parece ter sido restaurado ao perfil de indivíduos NI (Figura 15).
81
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte II Metilação Global do DNA (%)
100
50
20
#
*
10
0
100%
NI
HIV
TARV
Figura 15. Porcentagem de metilação global do DNA genômico de monócitos isolados de
indivíduos não infectados (NI), pacientes HIV+ virgens de tratamento (HIV) ou em terapia
antirretroviral (TARV). Monócitos CD14+ foram separados através de beads magnéticas e o DNA
genômico foi extraído. A determinação da metilação global do DNA foi realizada através do kit
“Imprinting Methylated DNA Quantification” (Sigma Aldrich). Os dados estão expressos como média
da porcentagem relativa ao controle 100% metilado fornecido pelo kit. *p<0,05 versus NI; # p<0,05
versus HIV.
82
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte II 4.13 Análise da frequência de enzimas que promovem alterações
epigenéticas
As modificações epigenéticas no DNA, como a metilação de Ilhas CpG, e as
alterações que ocorrem na cauda das histonas, como acetilação, metilação,
fosforilação, dentre outras, são essencialmente controladas por enzimas que atuam
através da inserção ou remoção destes grupamentos químicos em regiões
específicas, que por sua vez, controlam a acessibilidade de fatores de transcrição
aos promotores gênicos.
A fim de investigarmos se a infecção por HIV ou o tratamento destes
indivíduos induz alterações na dinâmica de expressão das enzimas que promovem
as alterações epigenéticas, analisamos a frequência das enzimas, principalmente as
relacionadas às alterações de metilação e acetilação. Analisamos a expressão
gênica de 26 enzimas e proteínas relacionadas à repressão e 14 enzimas e
proteínas associadas à ativação da transcrição em indivíduos saudáveis e pacientes
HIV+ virgens de tratamento ou em uso de TARV.
Como análise global inicial, empregamos a análise da bioassinatura
epigenética, a partir da frequência de indivíduos com genes upregulados em relação
a indivíduos não infectados. A expressão relativa do grupo NI foi normalizada para o
valor 1 e os indivíduos que se encontravam com fold change acima de 1 foram
considerados upregulados e os que tiveram fold change abaixo de 1 foram
considerados downregulados. Em relação às DNA-Metil-Transferases, analisamos
DNMT1, DNMT2, DNMT3A e DNMT3B. Comparados aos indivíduos NI, dentre os
pacientes HIV+ virgens de tratamento, observamos aumento da frequência de
indivíduos com alta expressão de DNMT3A e DNMT3B, enquanto DNMT1 e DNMT2
encontravam-se downregulados. Em relação às Proteínas de ligação Metil-CpG,
verificamos que os genes MBD3 e MECP2 estavam upregulados na maioria dos
pacientes HIV+ (Figura 16). Analisamos ainda as Histonas Deacetilases de classe I,
IIA, IIB e IV e observamos um padrão semelhante de expressão gênica das HDAC3,
HDAC4, HDAC5 e HDAC7, HDAC6, HDAC10 e HDAC11 as quais apresentaram
frequência maior que 50% de indivíduos com padrão de upregulação (Figura 16).
Sabendo que as enzimas atuam formando complexos com outras proteínas,
aqui chamadas de proteínas acessórias, observamos também o padrão de
expressão de RBB4 e RBB7, SAP18, SAP30, SIN3A, RPLP0, HMBS e CHC4.
83
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte II Verificamos que SIN3A e HMBS também encontravam-se upregulados na maioria
dos pacientes HIV+ (Figura 16).
Quando comparados a indivíduos HIV+ virgens de tratamento, aqueles sob
uso de TARV apresentaram similar padrão de frequência de indivíduos com genes
upregulados, e ainda apresentaram upregulação dos genes HDAC1 e HDAC8 e
downmodulação dos genes HDAC6, SIN3A e HMBS não vistos no primeiro grupo.
Por outro lado, quando analisamos a expressão gênica de enzimas
responsáveis pela ativação da transcrição, observamos que a infecção por HIV
induziu aumento na frequência de indivíduos com alta expressão de CARM1, KAT5,
KDM6B, SET1B e SMYD3. Após o uso de TARV, observou-se redução na
expressão de KDM6B e SMYD3, quando comparados aos pacientes HIV+ virgens
de tratamento (Figura 16).
84
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte II KAT2B&
KDM5B&
KDM6B&
KMT2C&
KMT2E&
SUV39H1&
HAT1&
SAP18&
MECP2&
RBBP7&
HDAC&1&
HAT1&
PRMT5&
KAT2B&
HDAC&3&
HDAC&10&
HDAC&6&
HDAC&9&
HDAC&7&
CARM1&
SETD1B&
HDAC&2&
HDAC&11&
ATF2&
SMYD3&
MBD3&
RBBP4&
SMYD3&
CARM1&
SUV39H1&
MBD2&
SAP30&
SETD1B&
ATF2&
ASH1L&
DNMT2&
DNMT3A&
DNMT3B&
Sin3A&
PRMT5&
ASH1L&
CHC4&
HMBS&
RPLP0&
KAT5&
CHC4&
25& 37,5& 87,5% 62,5% 50&
HMBS&
50&
RPLP0&
75%
SIN3A&
25& 100% 25&
SAP30&
25&
SAP18&
RBBP4&
75%
RBBP7&
HDAC&11&
25&
HDAC&6&
25&
DNMT1&
HDAC&9&
50& 12,5& 12,5& 12,5& 62,5% 12,5& 62,5% 50&
HDAC&7&
75%
HDAC&5&
50& 87,5% 100% 75% 37,5& 87,5% 75%
HDAC&4&
HDAC&10&
12,5& 12,5& 87,5% 87,5% 12,5& 100% 87,5% 50& 12,5& 75%
HDAC&8&
HDAC&3&
HDAC&2&
HDAC&1&
MECP2&
MBD3&
MBD2&
DNMT3B&
DNMT3A&
DNMT2&
DNMT1&
HIV
KMT2E&
HDAC&8&
HDAC&4&
HDAC&5&
KAT5&
KMT2C&
KDM5B&
KDM6B&
RBBP7&
SAP18&
SAP30&
SIN3A&
RPLP0&
HMBS&
CHC4&
ASH1L&
ATF2&
CARM1&
HAT1&
KAT2B&
KAT5&
KDM5B&
KDM6B&
KMT2C&
KMT2E&
PRMT5&
SMYD3&
SUV39H1&
90% 100% 90%
50&
60%
90%
90%
60%
20&
10&
0&
40&
10&
40&
40&
20&
10&
70%
10&
10&
90%
10&
30&
40&
10&
10& 100% 30&
10&
CHC4&
HMBS&
RPLP0&
DNMT1&
Sin3A&
SAP30&
SUV39H1&
ATF2&
SMYD3&
CARM1&
MBD3&
SAP18&
MECP2&
RBBP7&
HDAC&1&
RBBP4&
HDAC&2&
HDAC&11&
HDAC&10&
HDAC&6&
HDAC&9&
ASH1L&
DNMT2&
DNMT3A&
DNMT3B&
MBD2&
SETD1B&
RBBP4&
10& 100% 80%
HDAC&11&
HDAC&2&
60%
HDAC&10&
HDAC&1&
70%
HDAC&6&
MECP2&
80%
HDAC&9&
MBD3&
20&
HDAC&7&
MBD2&
90%
HDAC&5&
DNMT3B&
70%
HDAC&4&
DNMT3A&
0&
HDAC&8&
DNMT2&
0&
HDAC&3&
DNMT1&
TARV
HDAC&3&
HDAC&7&
HDAC&8&
HDAC&4&
HDAC&5&
SETD1B&
HAT1&
PRMT5&
KAT2B&
KMT2E&
KAT5&
KMT2C&
KDM5B&
KDM6B&
Figura 16. Bioassinatura epigenética de monócitos de pacientes HIV+ não tratados ou em
tratamento antirretroviral. A análise da expressão gênica das enzimas responsáveis por repressão
ou ativação da transcrição foi realizada por PCR Array a partir de RNAm isolado de monócitos. Foi
realizada uma análise categórica dos indivíduos dos grupos HIV e TARV entre aqueles que
apresentavam genes upregulados ou downregulados em relação aos indivíduos NI, utilizando o Fold
Change. Diagramas em preto e branco representam genes upregulados (
) e downregulados
(
). Cada coluna representa um gene e cada bloco representa o padrão de regulação em relação
a indivíduos NI. Os números abaixo de cada coluna representam a frequência de altos produtores de
cada enzima avaliada. B) Gráficos em radar sumarizam a porcentagem de altos produtores de cada
grupo clínico estudado. Quando a frequência de altos produtores foi maior que 50% (em uma escala
de 0-100%), o resultado foi marcado em negrito.
85
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte II 4.14 Correlações entre os Fatores Epigenéticos, Imunológicos e
Progressão da doença
Novas abordagens sobre a progressão do HIV introduzem o uso de
diferentes biomarcadores plasmáticos, como o sCD163 e o sCD14, biomarcadores
de ativação de monócitos no plasma [57], como moléculas importantes na análise e
busca de biomarcadores celulares em pacientes em diferentes estágios da doença,
como já descrito anteriormente em nosso estudo.
Quando analisamos os níveis plasmáticos de sCD163, no conjunto de
pacientes estudado nesta parte do trabalho, observamos elevação significativa do
biomarcador em pacientes HIV+, independente do uso de TARV, como mostrado
anteriormente na Parte I do trabalho. Utilizamos o conjunto de dados referente à
parte II para calcular o ponto de corte em que possamos segregar os pacientes em
altos e baixos produtores de sCD163, de acordo com a progressão da doença. A
mediana dos valores de sCD163 dos pacientes HIV+ virgens de tratamento foi
utilizada para a categorização dos pacientes. Portanto, neste conjunto de indivíduos,
os pacientes que se encontravam com valores de sCD163 abaixo de 6,95x105 são
considerados possíveis progressores lentos e os pacientes com valores acima da
mediana são considerados possíveis progressores rápidos (Figura 17).
A partir de então realizamos novas análises de modulação epigenética
durante a infecção por HIV levando em consideração possíveis progressores rápidos
e lentos. As análises desta parte do trabalho estarão restritas aos pacientes
pertencentes ao grupo HIV+ virgens de tratamento, uma vez que entre as amostras
submetidas à análise da expressão gênica, não haviam progressores rápidos no
grupo que fazia uso de TARV.
Agrupados dessa forma, pudemos observar inicialmente que a metilação
global do DNA, que já se encontrava reduzida em pacientes HIV+ (Figura 15), se
mostrou com porcentagem ainda menor entre os pacientes HIV+ classificados como
progressores rápidos (Figura 18).
Quando analisamos a correlação entre progressão da doença e expressão
de enzimas de repressão, observamos que os possíveis progressores lentos
apresentam expressão aumentada dos genes DNMT3B, MBD3, HDAC4, HDAC5,
HDAC7, HDAC10 e HDAC11 em relação aos progressores rápidos (Figura 19). E de
maneira oposta, os progressores rápidos possuíam maior expressão das enzimas
relacionadas ao aumento da transcrição gênica
ASH1L, ATF2, CARM1, HAT1,
86
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte II KAT2B, KAT5, KDM5B, KMT2C, KTM2E, PRMT5, SETD1B, SMYD3 e SUV39H1,
em relação aos progressores lentos (Figura 20).
Em resumo, estes dados mostram que à nível epigenético, a dinâmica das
enzimas de ativação e inibição é diretamente influenciada pela progressão da
doença, uma vez que pacientes com rápida progressão possuem elevação das
enzimas de ativação, enquanto os progressores lentos, possuem elevação de um
perfil de repressão gênica mesmo em relação a indivíduos NI.
Ao perceber as diferenças no perfil de expressão de enzimas epigenéticas,
nos questionamos se os parâmetros imunológicos proteicos também se mostravam
alterados quando levada em consideração a progressão da doença nos pacientes
HIV+ virgens de tratamento.
Portanto, avaliamos a produção dos principais mediadores imunológicos
produzidos em resposta ao Mtb in vitro, e observamos que pacientes classificados
como progressores rápidos possuíam elevação significativa da produção de TNF-α,
IL-6, IL-1β e MCP-1 (Figura 21).
O prévio estado de ativação da célula, demonstrado pela expressão elevada
de enzimas de ativação em progressores rápidos, confirma mais uma vez o efeito de
desregulação induzido pelo HIV em monócitos e demonstra a importância dessas
células em contribuir para o estado de hiperativação sistêmica encontrada em
pacientes HIV+, principalmente nos progressores rápidos, como observado na Parte
I do nosso trabalho.
87
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte II sCD163 plasmático
2×106
*
(pg/mL)
(pg/mL)
2×106
1×106
*
1×106
6,95x105
6,95x105
0
NI
Possíveis(Progressores(Lentos
Possíveis(Progressores(Rápidos
#
NI
HIV/TARV
0
NI
HIV
TARV
Figura 17. Níveis plasmáticos de CD163 solúvel para segregação entre possíveis progressores
lentos e rápidos. O plasma foi separado por centrifugação e posteriormente utilizado para dosagem
de CD163 solúvel, quantificado por ELISA. A mediana do grupo HIV foi utilizada como ponto de corte
entre possíveis progressores rápidos e possíveis progressores lentos. *p<0,05 versus NI; # p<0,05
versus HIV.
88
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte II Metilação Global do DNA (%)
100
NI
50
20
10
0
*
100%
NI
HIV+
Figura 18. Porcentagem de metilação global do DNA genômico de indivíduos não infectados
(NI), pacientes HIV+ virgens de tratamento segregados entre possíveis progressores lentos e
possíveis progressores rápidos. Monócitos CD14+ foram separados através de beads magnéticas
e o DNA genômico foi extraído. A determinação da metilação global do DNA foi realizada através do
kit “Imprinting Methylated DNA Quantification” (Sigma Aldrich). Os dados estão expressos como
média da porcentagem relativa ao controle 100% metilado fornecido pelo kit. *p<0,05 versus NI.
89
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte II 20
5
2
2
*
5
2
1
1
1
0
0
0
2
1
0
*
4
3
2
1
0
HDAC 10
*
60
Fold change
20
HDAC 7
Fold change
40
NI
10
*
10
HDAC 5
Fold change
HDAC 4
Fold change
*
Fold change
Fold change
10
MBD 3
30
2
HDAC 11
*
10
Fold change
DNMT 3B
*
5
2
1
1
0
0
Figura 19. Expressão gênica de enzimas epigenéticas associadas à repressão da transcrição
dos genes de indivíduos não infectados (NI) e pacientes HIV+ virgens de tratamento
segregados entre possíveis progressores lentos e possíveis progressores rápidos. Monócitos
CD14+ foram separados através de beads magnéticas e o RNA foi extraído. A análise da expressão
gênica foi realizada através de PCR Array com o kit “TaqMan® Array, Human DNA Methylation &
Transcriptional Repression (Applied Biosystems)”. A determinação da expressão gênica de cada
-ΔΔCt
enzima foi realizada através do cálculo de Fold Change (2
) em relação aos indivíduos NI.
*p<0,05.
90
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte II 10
2
0
HAT 1
35
2
24
0
0
150
*
Fold change
Fold change
0
KAT 5
*
50
3
2
75
2
1
0
8
1
0
40
20
2
1
0
*
4
2
20
2
1
0
0
SMYD 3
*
160
80
3
2
1
0
*
10
1
SETD 1B
*
KMT 2C
KDM 5B
*
25
PRMT 5
KMT 2E
1
0
2
1
2
2
1
12
1
3
3
KAT 2B
*
Fold change
Fold change
70
25
Fold change
0
*
SUV39H 1
*
120
Fold change
1
NI
Fold change
1
50
Fold change
2
*
Fold change
12
20
CARM 1
Fold change
*
Fold change
Fold change
24
ATF 2
Fold change
ASH1L
*
60
2
1
0
Figura 20. Expressão gênica de enzimas epigenéticas associadas à ativação da transcrição
dos genes de indivíduos não infectados (NI) e pacientes HIV+ virgens de tratamento
segregados entre possíveis progressores lentos e possíveis progressores rápidos. Monócitos
CD14+ foram separados através de beads magnéticas e o RNA foi extraído. A análise da expressão
2
TM
gênica foi realizada através de PCR Array com o kit “RT Profiler PCR Array customizado pela
Qiagen (Qiagen/SA Biosciences)”. A determinação da expressão gênica de cada enzima foi realizada
-ΔΔCt
através do cálculo de Fold Change (2
) em relação aos indivíduos NI. *p<0,05.
91
ESPÍNDOLA, M.S. Resultados – Parte II TNF-α
IL-6
*
5000
2500
6000
*
NI
Possíveis-Progressores-Lentos
Possíveis-Progressores-Rápidos
3000
0
pg/mL
0
NI
NI
HIV+
IL-1β
MCP-1
*
800
HIV+
400
*
1500
750
0
0
NI
HIV+
NI
HIV+
Figura 21. Citocinas e quimiocinas produzidas por monócitos de indivíduos não infectados
(NI) e pacientes HIV+ virgens de tratamento (HIV) segregados entre possíveis progressores
lentos e possíveis progressores rápidos. As células foram mantidas em cultura por 24 horas após
infecção pelo M. tuberculosis (MOI 5) e o sobrenadante de cultura dos monócitos foi avaliado quanto
a presença das citocinas TNF-α, IL-6, IL-1β e MCP-1 utilizando-se beads magnéticas dos kits
MILLIPLEX® MAP Human Cytokine/Chemokine (Millipore) e o equipamento MagPix (Luminex) para
leitura e análise dos dados. O resultado é expresso em média + SEM da produção de citocinas das
células estimuladas com Mtb. * p<0,05. 92
ESPÍNDOLA, M.S. 5. Discussão 93
ESPÍNDOLA, M.S. Discussão A inflamação sistêmica crônica no HIV regularmente progride à estimulação
persistente do sistema imune e imunopatologia progressiva. Esta condição clínica
tem estimulado a busca de novas abordagens terapêuticas a fim de contrapor a
evolução da doença [121]. Com o advento da terapia antirretroviral, é indiscutível a
melhoria da qualidade de vida e, acima de tudo, a prevenção da síndrome da
imunodeficiência adquirida (AIDS), reduzindo drasticamente a mortalidade em
indivíduos infectados pelo HIV. No entanto, concomitante à expansão do acesso ao
tratamento, emergiram casos de resistência às drogas e a preocupação com a
terapia antirretroviral no futuro. O aumento do número de estudos relacionados à
resposta imune nos pacientes tratados estão dando origem a uma nova era
relacionada ao HIV, mas pouco se sabe sobre o desfecho imunológico de diferentes
regimes de tratamento ou como esse conhecimento contribuirá para melhores
terapias. Neste sentido, os nossos dados revelam novos aspectos relacionados a
diferentes esquemas de terapia antirretroviral, em que observamos alterações
significativas no perfil imunológico de pacientes tratados em dois regimes distintos.
O ambiente inflamatório crônico induzido na infecção pelo HIV é responsável
por causar fibrose em tecidos linfóides, que por sua vez contribui para a falha na
regeneração de células T e, por conseguinte, em redução global na função dos
sistema imune adaptativo e inato. Em nosso trabalho, nós detectamos uma clara
ativação imune descompensada, evidenciada pelo aumento global da concentração
de citocinas plasmáticas em pacientes HIV+ não tratados, independentemente do
padrão adaptativo ou inato (Figura 1). Mesmo IL-10, uma citocina reguladora,
mostrou-se elevada em nossos pacientes, provavelmente como uma tentativa de
compensar o excesso de resposta pró-inflamatória. As citocinas avaliadas por nós
são descritas como sendo marcadamente produzidas na infecção aguda e algumas
delas, como INF-γ, RANTES, IP-10 e IL-12 foram destacadas previamente como
biomarcadores precoces de ativação imune, que podem ajudar a predizer o set-point
viral e o prognóstico da doença [122].
O acesso à TARV possibilitou uma supressão viral estável e que pode
perdurar por toda a vida do indivíduo infectado, no entanto, a recuperação
imunológica é frequentemente incompleta [123-125]. Portanto, uma análise
detalhada de como diferentes regimes de tratamento antirretroviral estão
relacionados a uma série de biomarcadores pode ajudar a compreender ou mesmo
predizer a origem de doenças não ligadas à AIDS.
94
ESPÍNDOLA, M.S. Discussão Avaliando este cenário, e considerando o crescente número de estudos que
associam biomarcadores de inflamação e ativação de monócitos e macrófagos como
fortes indicadores de progressão da doença, avaliamos o sCD163 e sCD14,
considerados marcadores de translocação microbiana [44, 57, 58, 126]. Como não
encontramos diferenças significantes nas concentrações plasmáticas de sCD163 e
sCD14 entre os grupos clínicos tratados, consideramos que ambos os TARV 1 e
TARV 2 estavam em um estado de progressão similar da doença. O ponto crítico,
neste caso, é que algum evento ainda desconhecido, relacionado ao tipo de
tratamento, poderia estar modulando a resposta imune nesses pacientes. É evidente
que nós não podemos assegurar que o status da doença no momento anterior ao
início do tratamento não seja um aspecto influente. No entanto, como demonstrado
que os marcadores de progressão estudados se mostraram similares entre os
tratamentos (Figura 2A), nós podemos especular que o tipo de regime terapêutico
possui um impacto direto no status imunológico do paciente.
Uma vez que propusemos determinar o bioassinatura imunológica de
pacientes sob os regimes terapêuticos TARV 1 e TARV 2, notamos claramente dois
padrões distintos. Um padrão, composto pelos grupos,
NI e TARV 1, que
apresentaram a mesma configuração de rede, observada no gráfico de radar de
biomarcadores. E, de forma oposta, pacientes HIV+ não tratados e no regime de
tratamento de TARV 2 compõem outro padrão com o perfil gráfico bastante
comparáveis entre si (Figura 4B).
Considerando, portanto, que o pacientes sob tratamento de segunda linha
apresentaram perfil imunológico alterado em relação aos que faziam uso da terapia
de primeira linha, buscamos identificar na literatura os aspectos que pudessem
contribuir para tal efeito. No que diz respeito à supressão da carga viral e ao
aumento de células T CD4+, os nossos dados se assemelham a um grande estudo
na África do Sul, relatando que os pacientes HIV+ que foram iniciados na segunda
linha de tratamento (TARV 2) tiveram altas taxas de recuperação de células T CD4+
e sucesso na supressão virológica, com consequente redução das taxas de
mortalidade durante o primeiro ano em tratamento [127], portanto, quanto ao papel
primordial do tratamento, que é supressão virológica, a resposta ao TARV 2 foi
adequada.
Quanto aos aspectos imunológicos, diferentes trabalhos corroboram com a
hipótese de que terapias baseadas em inibidores de protease (TARV 2) induzem
95
ESPÍNDOLA, M.S. Discussão alterações na resposta imune, as quais podem estar relacionadas com pior
prognóstico. Estudos prévios mostraram que terapias baseadas em inibidores de
protease podem induzir modulação extra virológica de vias imunes, bloqueio de
apoptose e inibição da atividade de metaloproteinases [128-130]. Além disso, estes
fármacos têm a capacidade de alterar a resposta imune inata, relacionada à
modulação da sinalização para dsRNA em células epiteliais orais, induzindo
consequente aumento da produção de IL-8 e TNF-α, além da ativação de NF-kB
[131]. Em um estudo comparativo recente, também foi observado que a escolha do
regime de tratamento influenciou os níveis dos marcadores IP-10 e MIG, quimiocinas
induzidas por IFN-γ. Ambas estavam reduzidas após a terapia antirretroviral, no
entanto, o declínio foi significativamente menor quando utilizado ATV/r (PI) em
relação ao EFV (NNTRI), enquanto não houve diferença significativa entre LPV/r (PI)
e EFV ou entre outros medicamentos de primeira linha [132]. De forma semelhante
ao que encontramos em nossos pacientes, pacientes em terapia baseada no LPV/r
(TARV 2), após 6 anos em tratamento, apresentaram níveis de IFN-α e MCP-1
semelhante aos níveis séricos do momento de início do tratamento [41], indicando
falha parcial em diminuir a ativação de células imunes. Neste sentido, nossos
resultados demonstram que pacientes sob o regime TARV 2 apresentaram um
padrão de bioassinatura inflamatório que foi destacado quando os pacientes foram
segregados de acordo com a progressão da doença. Mesmo os progressores lentos
persistiram em um estado de ativação imune que não foi observado em pacientes
que receberam TARV 1 (Figura 6B e 6C). De fato, pacientes que receberam TARV
2 foram capazes de gerar uma rede de conexões entre biomarcadores imunológicos
completamente distinta dos outros grupos clínicos (Figura 7), que pode ser
explicada pela habilidade dos inibidores de protease LPV/r e ATV em modular
diretamente a produção de citocinas e a ativação de fatores de transcrição, como
visto anteriormente [133].
Em nosso estudo, IP-10, TNF-α, IFN-α, IL-6 e IL-10 foram a caracterizados
como os melhores biomarcadores imunológicos, uma vez que pudemos observar os
perfis imunes distintos gerados em pacientes sob tratamentos diferentes (Figura 8).
Neste sentido, confirmamos que através da seleção correta de biomarcadores,
torna-se possível afirmar que enquanto pacientes tratados com medicamentos de
primeira linha (TARV 1) são capazes de recuperar a função imune para um perfil
próximo ao de indivíduos não infectados, pacientes que utilizam a combinação de
96
ESPÍNDOLA, M.S. Discussão medicamentos referente à TARV 2 apresentaram um padrão de bioassinatura
imunológica aproximada de pacientes não tratados.
Adicionalmente, demonstramos que os três primeiros biomarcadores: IP-10
> TNF-α > IFN-α foram decisivos na segregação dos grupos clínicos (Figura 9).
Estes biomarcadores selecionados têm importância já descrita na infecção por HIV.
IP-10, uma quimiocina da classe CXC (CXCL-10) também conhecida como a
proteína induzida por IFN-γ, tem como principais alvos os linfócitos, especialmente
células T ativadas. Além disso, podem agir em macrófagos e estão envolvidos na
migração de células T durante as respostas imunes dependentes de célula T [134].
Altos níveis de IP-10 na infecção por HIV estão criticamente relacionados com
ativação imunológica [135], fato que faz desta quimiocina altamente preditiva da
rápida progressão da doença [48]. Interferons do tipo I (IFN-α e IFN-β) são
considerados essenciais no controle de infecções por vírus em geral. No entanto,
durante as infecções virais persistentes, como na infecção por HIV, a atividade
prolongada de IFN-α pode contribuir diretamente para o aumento da ativação imune
e exaustão de monócitos, linfócitos T e B. Além disso, estudos prévios constataram
uma associação do aumento da produção de IFN-α com o desenvolvimento de
desordens não relacionados com a AIDS em pacientes HIV+[41]. Por outro lado,
como a ativação de monócitos é um evento chave na inflamação sistêmica durante o
curso da infecção da HIV, citocinas produzidas por estas células, tais como IL-6,
TNF-α, bem como sTNFR-1, um receptor solúvel de TNF, estão fortemente
associados com a progressão da doença na era TARV [55, 136-138].
Finalmente, uma vez que a disponibilidade de terapia antirretroviral cresce e
traz novas perspectivas para pacientes infectados pelo HIV, o nosso estudo,
semelhante a outros [139] vem reforçar a importância de estabelecer novos
biomarcadores imunológicos, além dos virológicos já estabelecidos, e em suma,
evidenciar possíveis problemas associados à terapia corrente. Os novos desafios a
partir de agora são projetar ensaios que avaliem a ativação imune. Determinar uma
bioassinatura, utilizando os biomarcadores aqui mostrados pode trazer uma
perspectiva para novas análises de evolução da doença e pesquisas científicas,
considerando que os pacientes em uso de diferentes regimes de tratamento formam
um grupo heterogêneo. No entanto, tendo consciência da amplitude e complexidade
do assunto, sabemos que ainda existem diversos aspectos no campo imunológico
desses pacientes que poderiam ser melhor explorados e incorporados a este estudo.
97
ESPÍNDOLA, M.S. Discussão Considerando que o status de progressão na infecção por HIV está
fortemente associado ao estado de ativação de monócitos, fez-se necessário
entender melhor como o vírus direta ou indiretamente é capaz de modificar a função
destas células e como a função alterada pode repercutir no curso da infecção. Sabese que monócitos são células essenciais na formação das respostas imunes inatas e
adaptativas uma vez que eles possuem a habilidade de diferenciar-se em
macrófagos e células dendríticas [140]. Esta habilidade de diferenciação, assim
como a habilidade de apresentação de antígenos, migração, quimiotaxia, fagocitose
e atividade microbicida reafirmam seu papel crucial na patogênese do HIV e no
combate a patógenos oportunistas. Optamos por estudar a resposta funcional de
monócitos contra o M. tuberculosis devido a importância da coinfecção HIV/TB.
Estima-se que 25% dos pacientes HIV+ estejam coinfectados com tuberculose,
sendo que juntamente com as hepatites virais, estas doenças são as principais
causas de óbito entre os soropositivos no mundo [16]. Em nosso trabalho
demonstramos que monócitos de pacientes HIV+ virgens de tratamento possuem
redução da capacidade de fagocitar o Mtb in vitro, quando comparados a monócitos
de indivíduos saudáveis. Mostramos também que a terapia antirretroviral parece
influenciar na recuperação da capacidade de fagociítica (Figura 10). Trabalhos
prévios associaram as proteínas virais acessórias Nef e Tat com a downregulação
da expressão do receptor de manose na superfícies das células, que é um
importante receptor na fagocitose de patógenos não opsonizados por macrófagos
[141, 142]. Utilizando um modelo de fagocitose de patógenos não opsonizados,
semelhante ao nosso trabalho, estudos com Aspergillus spp [143] e Pneumocystis
jirovecii [144] demonstraram redução na capacidade fagocítica de monócitos de
indivíduos HIV+ associados com a downregulação do receptor de manose,
polimerização alterada de F-actina e redução da ativação de Cdc42 and RhoB [145].
Quanto ao uso de TARV, estudos demonstraram que defeitos na atividade
fagocítica de monócitos foram restaurados após 6 meses de terapia antirretroviral.
Para tanto, foi utilizado como modelo a fagocitose de eritrócitos não opsonizados e
parasitados com Plasmodium falciparum [146]. Defeitos na fagocitose de partículas
opsonizadas também foram previamente relatados [147, 148] e estão relacionados a
alterações na sinalização via FcR, com redução na fosforilação das tirosina kinases
HcK e Syk, envolvidas na sinalização de FcγR [149, 150], e no aumento de AMPcíclico intracelular que reduz a fagocitose mediada por complemento em culturas de
98
ESPÍNDOLA, M.S. Discussão hMDM infectadas com HIV-1 [151], defeito que parece ser acentuado em pacientes
com carga viral elevada [73].
Em suma, direta ou indiretamente, como mostrado acima, a infecção por HIV
é capaz de alterar vias celulares que influenciam na atividade fagocítica de
monócitos. Quanto à capacidade de controle e morte de patógenos, diferentes
estudos demonstram redução na habilidade microbicida de monócitos ou hMDM
quando são desafiados contra patógenos oportunistas [74-76, 83]. Nosso trabalho
também observou redução da atividade microbicida frente infecção in vitro com Mtb
em pacientes HIV+, e mais, nestes pacientes 64% dos indivíduos não era capaz de
controlar o crescimento do Mtb, de forma que observamos crescimento bacteriano,
ao invés de morte (Figura 11). De acordo com o que demonstramos, um estudo que
investigou os efeitos da infecção in vitro com HIV-1 no controle de diferentes
espécies de micobactérias, mostrou que culturas coinfectadas apresentaram maior
carga bacteriana para todas as espécies testadas, e que a coinfecção induziu, de
maneira singular, um crescimento acelerado do M. tuberculosis num período de
tempo reduzido [152]. Mecanismos adicionais pelos quais o HIV pode impedir a
atividade microbicida de macrófagos incluem a inibição da fusão do fagolisossoma
mediada por gp120 [153] e dos estágios finais de autofagia mediada por Nef [154].
Quanto às citocinas, observamos aumento da produção de IL-6, IL-1β e das
quimiocinas MCP-1, MIP-1α e MIP-1β quando monócitos de pacientes HIV+ virgens
de tratamento foram estimulados com in vitro Mtb (Figura 12). Portanto, apesar de
reduzida capacidade na eliminação e controle do bacilo, estes monócitos possuem
um estado de ativação celular exacerbado em relação aos indivíduos não infectados,
que não está correlacionado ao aumento
da atividade microbicida. De maneira
similar, frente ao Mtb, hMDMs coinfectados com HIV-1 apresentaram aumento na
concentração de IL-1β, IL-6 e IL-8 quando comparados a culturas não infetadas
[152].
Detectamos ainda aumento na produção espontânea de ROS por monócitos
de pacientes HIV+ virgens de tratamento, demonstrando mais uma vez o potencial
de ativação prévia de monócitos nestes pacientes (Figura 13). Elbim e
colaboradores (1999) observaram o mesmo efeito quando estudaram a capacidade
de produção H2O2 em monócitos de pacientes infectados pelo HIV. A produção
espontânea e após estímulo bacteriano no referido trabalho mostrou correlação
direta com carga viral dos pacientes, enquanto que sob condições de estimulação da
99
ESPÍNDOLA, M.S. Discussão produção máxima, a produção de ROS se mostrou similar entre os grupos [155].
Adicionalmente, estudos de transcriptoma revelaram upregulação dos genes que
codificam proteínas envolvidas com o estresse oxidativo, como SPHK1/NADPH
oxidase, em pacientes virêmicos [156]. A proteína viral Nef também foi associada
com a ativação da sinalização de VAV-RAC-PAC (p21), que induzem aumento
significativo da resposta de NADPH oxidase [157]. Além disso, evidências
crescentes sugerem que os indivíduos HIV+ sofrem alterações imunológicas
semelhantes a idosos não infectados, e desta forma sugere-se que a progressão da
doença também está associada com a senescência do sistema imunológico [158,
159]. Dentre estes sinais, os danos provocados pela disfunção mitocondrial e o
aumento do estresse oxidativo estão entre os fatores determinantes na senescência
[160].
Quanto às subpopulações de monócitos, observamos em nosso trabalho que
indivíduos HIV+ apresentam redução da população de monócitos clássicos (CD16-)
e aumento dos outros dois subtipos de monócitos já descritos, que possuem
expressão de CD16 (Figura 14). Classicamente, monócitos CD4+CD16- são
responsáveis por fagocitose, produção de ROS e de citocinas em resposta ao LPS
de forma dependente da ativação clássica da via MyD88-p38-NF-kB. Cros e
colaboradores (2010) demonstraram que o subtipo de monócitos CD14dimCD16+
possuia a característica de monócitos “patrulheiros” do endotélio. Estas células
possuiam reduzida capacidade de fagocitar e não produziam ROS em resposta a
TLR de membrana. Ao invés disso, eles seletivamente produziam TNF-α e IL-1β e
CCL3 em resposta a vírus e complexos imunes que continham ácidos nucléicos
através da via de TLR7-TLR8-MyD88-MEK. Dessa forma, estes monócitos são tidos
como vigilantes inatos dos tecidos e são ainda importantes na imunopatogênese de
doenças autoimunes [161]. Durante a infecção por HIV, acredita-se que a
translocação de LPS do trato gastrointestinal possa expandir a subpopulação
CD14dimCD16hi. A expansão de monócitos CD16+, que coexpressam o CD163,
correlaciona-se positivamente com carga viral e inversamente com a contagem de
células T CD4+ [162]. O aumento desta subpopulação de monócitos CD16+ já foi
demonstrada em modelo de SIV em macacos infectados e também correlaciona-se
com viremia [163], embora sugere-se que seu aumento esteja mais relacionado à
translocação microbiana observada na patogênese a doença [164].
100
ESPÍNDOLA, M.S. Discussão Quando investigamos as bases epigenéticas por trás da infecção por HIV em
monócitos, observamos a formação de determinado padrão de metilação do DNA e
de expressão gênica de enzimas que regulam as alterações epigenéticas e como
consequência, a transcrição gênica. Inicialmente, verificamos que o padrão de
metilação global do DNA, alteração responsável pela regulação da transcrição
gênica, estava reduzido em indivíduos HIV+ (Figura 15), fato que se associa com o
aumento da atividade funcional dos monócitos visto ao longo do nosso trabalho. As
enzimas que coordenam a metilação do DNA se dividem em DNA-Metiltransferases
e nas proteínas de ligação Metil-CpG. Em nosso trabalho, observamos que a
expressão de DNMT1 e DNMT2 estavam downreguladas na grande maioria dos
pacientes HIV+ virgens de tratamento analisados, enquanto DNMT3A e DNMT3B
estavam upregulados, ambos em relação a indivíduos NI (Figura 16). O padrão
entre as MBDs parece seguir o mesmo perfil das DNMTs, onde a downregulação de
MBD2 é contrabalanceada pela upregulação de MBD3 e MECP2 nos pacientes
HIV+. Nestes pacientes, o balanço entre downregulação e upregulação das
diferentes DNMTs e Proteínas de ligação Metil-CpGs pode significar uma tentativa
de manutenção do padrão de metilação celular, por outro lado, pode ainda ser o
motivo pelo qual há uma redução no padrão de metilação global, como mostrado
anteriormente.
Apesar de poucos estudos nesta área, um trabalho pioneiro relatou que o
perfil de metilação reduzido encontrado no fluido cérebro-espinhal em pacientes
HIV+ poderia estar relacionado à hipometilação no sistema nervoso central e a
lesões neurológicas nestes pacientes [165]. Por outro lado, em células T, já foi
relatado que a infecção aguda pelo HIV-1 promoveu aumento da expressão e
atividade de DNA metiltransferases, com aumento da metilação de novo no promotor
do gene do IFN-γ, e subsequente de redução da expressão desta citocina [166].
Nestes trabalhos não fica claro o subtipo de DNA metiltransferase responsável por
cada alteração, entretanto já se sabe que DNMT1 é responsável pela manutenção
da atividade metiltransferase, enquanto DNMT3A/DNMT3B pelo aumento da
atividade de novo de metiltransferases, ambas requeridas para o estabelecimento e
manutenção da metilação genômica em estado de homeostase [167].
Quanto às alterações que ocorrem na cauda das histonas, diferentes famílias
de enzimas são responsáveis pela regulação das alterações, dessa forma, HATs e
HDACs são responsáveis pelo controle dos níveis de acetilação, no qual as HATs
101
ESPÍNDOLA, M.S. Discussão promovem acetilação e as HDACs promovem a desacetilação de histonas [168]. Em
nossas análise, observamos elevada frequência de monócitos de pacientes HIV+
com upregulação de diferentes HDACs, com ênfase na HDAC4, HDAC5 e HDAC6,
todas com frequência maior ou igual a 87,5% no grupo de pacientes infectados e
virgens de tratamento. Por outro lado, em relação às HATs, apenas a KAT5 se
mostrou com frequência aumentada. Esta enzima, no entanto se mostrou
upregulada em todos as amostras de monócitos de pacientes HIV+ estudados.
Relatos da literatura já demonstram sua importância na doença, uma vez que ela foi
originalmente isolada como uma proteína de interação com Tat, a proteína
transativadora da transcrição do HIV-1 [169].
Quanto às enzimas responsáveis pela metilação de resíduos de lisina e
arginina em histonas, estão as histonas metiltransferases, que se contrapõem às
demetilases, fazendo o papel de remover resíduos metil. Nas amostras de nossos
pacientes, observamos aumento importante da frequência de células com
upregulação de SETD1B e KDM6B, responsáveis pela metilação de H3K4,
modificação de ativação da transcrição e demetilação de H3K27, alteração que
promove repressão de transcrição. Dessa forma podemos concluir que, em ambos
os casos, o aumento da expressão gênica dessas enzimas se associa ao aumento
da ativação celular observada nos monócitos de pacientes HIV+ virgens de
tratamento. O uso de TARV, nesse caso, nos apontou um perfil interessante no qual
há a permanência de diversos genes de repressão upregulados, com aumento da
frequência de outras HDACs, e redução da frequência de algumas enzimas de
ativação como KDM6B e SMYD3, o que confere um perfil menos ativado aos
monócitos desses indivíduos. Até esse ponto, portanto, definimos de forma inédita o
perfil de expressão de enzimas responsáveis por alterações epigenéticas em
monócitos de pacientes HIV+ não tratados ou em uso de TARV, as quais podem ser
utilizadas para compor uma bioassinatura epigenética de maneira global como
característica da doença.
No entanto, uma vez que utilizamos o fator “progressão” nos pacientes HIV+
não tratados, através dos níveis do biomarcador de progressão sCD163 (Figura 17),
pudemos observar redução ainda maior da metilação global do DNA de monócitos
nos progressores rápidos e selecionar 7 enzimas de repressão que estavam
diferencialmente expressas nos monócitos de progressores lentos e 13 enzimas de
ativação, diferencialmente expressas nos monócitos de progressores rápidos
102
ESPÍNDOLA, M.S. Discussão (Figuras 19 e 20). Dessa forma, além de definir uma bioassinatura na doença,
sugerimos
que
tais
enzimas
possam
ser
utilizadas
como
biomarcadores
epigenéticos associadas à progressão da doença. Uma vez que a expressão dessas
enzimas se associa a um perfil de produção de citocinas exacerbado quando os
monócitos são estimulados in vitro com Mtb (Figura 21), torna-se ainda mais
importante a possibilidade de utilização das enzimas por nós determinadas como
alvos terapêuticos, na tentativa de reduzir o perfil de ativação aberrante de
monócitos e suas consequências na imunopatogênese da doença, assim como em
sua função celular.
Apesar de na infecção por HIV ainda não existirem evidências suficientes
para demonstrar a importância da regulação epigenética em células imunes como os
monócitos, importantes na patogênese da doença, estudos com câncer já
evidenciam a clara regulação epigenética envolvendo a produção de citocinas e
quimiocinas como TNF-α, IL-1, IL-6 e IFN-γ, produzidos por células tumorais e/ou
leucócitos associados ao tumor, com o desenvolvimento de malignidade [170]. E
recentes estudos que incluem diferentes inibidores epigenéticos iniciam um novo
caminho para o potencial tratamento de neoplasias malignas relacionadas à AIDS
[171].
Do ponto de vista clínico, uma das características mais importantes das
modificações epigenéticas é que eles podem ser revertidas utilizando-se
tratamentos enzimáticos, tais como inibidores de HDACs e DNMTs já disponíveis no
mercado.
Algumas
dessas
drogas
(5-azacitidina,
decitabina,
Vorinostat
e
Romidepsin) já foram aprovadas pelo FDA para o tratamento de doenças
hematológicas [172] e diferentes
ensaios clínicos de fase II e III estão em
desenvolvimento. Embora ainda não existam estudos extensos, dados preliminares
sugerem que o tratamento com modificadores epigenéticos em combinação com
terapias imunossupressoras já utilizadas prolonga a sobrevivência do enxerto em
modelos animais de transplante cardíaco e renal [173-175]. Em humanos, a
curcumina (um inibidor HAT) em combinação com ciclosporina A pode suprimir a
indução de citocinas Th1 em linfócitos do sangue periférico ex vivo de pacientes
transplantados [176].
Em conclusão, a epigenômica já é uma área de investigação crescente no
campo da imunologia que pode não apenas inspirar um novo aspecto de
monitoramento das respostas imunes como também abrir os caminhos para
103
ESPÍNDOLA, M.S. Discussão possíveis estratégias de cura de diferentes doenças. No caso do HIV e sua
imunopatogênese, no qual o estado de inflamação crônica permanece como fator
determinante de progressão da doença, estudos adicionais serão necessários a fim
de classificarmos os melhores alvos epigenéticos e finalmente validá-los como
possíveis armas contra os principais efeitos deletérios da doença.
104
ESPÍNDOLA, M.S. 6. Conclusão 105
ESPÍNDOLA, M.S. Conclusão No presente trabalho demonstramos que a infecção por HIV induz perfil
inflamatório sistêmico exacerbado em pacientes HIV+, e cada tratamento culmina
com um desfecho imunológico distinto. Enquanto pacientes tratados com
medicamentos de primeira linha (TARV 1) são capazes de recuperar a função imune
para um perfil próximo ao de indivíduos não infectados, pacientes que utilizam a
combinação de medicamentos referente à segunda linha de tratamento (TARV 2)
apresentaram um padrão de bioassinatura imunológica aproximada de pacientes
não tratados.
Adicionalmente, concluímos que a infecção por HIV promove disfunção
imunológica de monócitos, os quais apresentam redução da função fagocítica e
microbicida, alteração no fenótipo celular e produção exacerbada de mediadores
inflamatórios. As alterações na produção de citocinas por monócitos foram
associadas à alterações epigenéticas nestas células em pacientes virgens de
tratamento, classificados como progressores rápidos.
106
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119
ESPÍNDOLA, M.S. Anexos
120
ESPÍNDOLA, M.S. Anexo I - Manuscritos submetidos referentes ao projeto de Doutorado
121
ESPÍNDOLA, M.S. DYSREGULATED IMMUNE ACTIVATION IN SECOND-‐LINE HAART HIV+ PATIENTS IS COMPARABLE TO UNTREATED PATIENTS BIOSIGNATURE Milena S. ESPÍNDOLA1, Leonardo J.G. LIMA1, Luana S. SOARES1, Maira C. CACEMIRO1, Fabiana A. ZAMBUZI1, Matheus DE SOUZA GOMES2, Laurence R. AMARAL2, Valdes R. BOLLELA3, Olindo A. MARTINS-‐FILHO4, Fabiani G. FRANTZ1§
1-‐ Faculdade de Ciencias Farmaceuticas de Ribeirao Preto, Universidade de Sao Paulo, Ribeirao Preto, SP, Brazil; 2-‐ Laboratorio de Bioinformatica e Analises Moleculares – INGEB / FACOM, Universidade Federal de Uberlandia, Patos de Minas, MG, Brazil; 3-‐ Faculdade de Medicina de Ribeirao Preto, Universidade de Sao Paulo, Ribeirao Preto, SP, Brazil; 4-‐ Laboratorio de Biomarcadores para Diagnostico e Monitoramento, Centro de Pesquisas Rene Rachou, FIOCRUZ, Belo Horizonte, MG, Brazil §
Corresponding author: Fabiani G. Frantz, DACTB, Faculdade de Ciencias Farmaceuticas de Ribeirao Preto -‐ FCFRP, Universidade de Sao Paulo, Brazil. ZIP Code: 14041-‐903. Tel: +55 1633150241; email: frantz@usp.br Key words: antiretroviral therapy; biological biomarkers; progression; cellular factors/cytokines; chemokines; systems biology MSE – msespindola@usp.br; LJGL – glavaolima@usp.br; LSS – luanasisoares@usp.br; MCC – mairacacemiro@usp.br; FAZ – fabianazambuzi@usp.br; MDSG -‐ matheus@ingeb.ufu.br; LRA – laurence@ufu.br; VRB – bollela@gmail.com; OAM – oamfilho@cpqrr.fiocruz.br; FGF – frantz@usp.br 122
ESPÍNDOLA, M.S. Abstract Objective: Successful highly active antiretroviral therapy (HAART) has changed the outcome of AIDS worldwide, since the complete suppression of viremia improves health and prolongs life expectancy of HIV-‐1+ patients. Few highlights are currently given to immunological profile of patients under distinct HAART regimens. This work aims to clarify the differences in the immune pattern of Brazilian HIV-‐1+ patients under the first-‐ or second-‐line HAART. Methods: CD4+ T cell counts, Viral load and plasma concentration of sCD14, sCD163, MCP-‐1, RANTES, IP-‐10, IL-‐1β, IL-‐6, TNF-‐α, IL-‐12, IFN-‐α, IFN-‐γ, IL-‐4, IL-‐5 and IL-‐10 were assessed for immunological characterization of the following clinical groups: Non-‐
infected individuals (NI; n=66), HIV-‐1+ untreated (HIV)(n=46), HIV-‐1+ treated with first-‐line HAART (HAART 1; n=15) or second-‐line HAART (HAART 2; n=15). Results: We found that the immunological biosignature of HAART 1 presents a similar pattern to NI individuals especially in slow progressors, while patients under HAART 2 remains in a moderate inflammatory state, which approximates to untreated HIV pattern. Network correlations showed that differences in IP-‐10, TNF-‐α, IL-‐6, IFN-‐α and IL-‐10 interactions were primordial in HIV disease and treatment. Heat map and decision tree analysis pointed that IP-‐10>TNF-‐α>IFN-‐α, respectively, were the best HAART segregation biomarkers. Conclusion: We demonstrated that immune response in HIV+ patients under second-‐
line therapy approximates to HIV+ untreated immune profile, while first-‐line therapy is able to recover immune response to a non-‐infected pattern. These findings can be of great value in patient’s prognosis, giving rise to a novel perspective into disease outcome and new developing therapies, considering HAART patients as a heterogeneous group. 123
ESPÍNDOLA, M.S. Introduction Systemic inflammation plays a central role in HIV pathogenesis of untreated patients and correlates with progression and morbity (1, 2). Clinically, CD4 T cells counts and the viral load are together the main parameters of status disease evaluation (3, 4). The inclusion of highly active antiretroviral therapy (HAART) has historically changed the perspective of HIV infection worldwide. The complete suppression of viral load and partial restoration of CD4+ T cells improves health and prolongs the life expectancy of infected patients (5, 6). In parallel with the new context of HIV as a chronic disease, an expansive numbers of new plasma biomarkers, as the soluble monocyte and macrophage activation biomarkers, sCD14 and sCD163, inflammatory cytokines, chemokines and coagulation factors are described as important indicators of immune activation and correlating with susceptibility, disease progression, as well as morbity and mortality even in treated patients (7-‐12). HIV treatment is life-‐long and need an optimal adherence to delay the emergence of drug resistance. The majority of patients initiates and remains on the first-‐line therapy that combines two nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NRTIs) and one non-‐nucleoside reverse transcriptase inhibitor (NNRTI). Early in treatment is observed positive clinical, virological and immunological outcomes (13-‐17). However there are increasing numbers of patients failing first-‐line therapy as the access to treatment expands. Nevertheless, a broad range of reports regarding the immunological profile of HIV+ patients does not take into account treatment regimen, and consider HAART patients as a closed and unified group. Given the fact that few highlights are driven to this area, this work aims to clarify the variances in the immune pattern and the potential disease outcome of HIV+ patients under the first-‐ and second-‐line HAART regimens. By using a systems biology approach, here we shown that the immunological biosignature of HIV patients treated with distinct HAART regimens is very peculiar to the therapy and it can be considered on the elucidation of the patient clinical status. Methods Ethical Aspects The study had approval by the Ethics Committee from the Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto and FMRP-‐USP (Protocols #11399/2012; #9817/2012; #9818/2012) 124
ESPÍNDOLA, M.S. and from CEP/FCFRP-‐USP (Protocol #276/2012). All patients signed an informed written consent form in accordance to the guidelines established by 003/2011/CONEP resolution of the Brazilian National Health Council. Study Population For enrollment in this study, non-‐infected individuals (n=66), untreated HIV-‐1-‐infected patients (n=46), HIV+ patients under first-‐line treatment (HAART 1; n=15) and HIV+ patients under second-‐line treatment (HAART 2; n=15) from both genders and aged between 18 and 65 years, were recruited from Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto, FMRP-‐USP. The characteristics of regimens and patients are listed in the Supplementary Tables 1 and 2. Biomarkers measurement Viral load; CD4+ T cell number; MCP-‐1, RANTES, IP-‐10, IL-‐1β, IL-‐6, TNF-‐α, IL-‐12, IFN-‐α, IFN-‐γ, IL-‐4, IL-‐5 and IL-‐10, CD14 and sCD163 were measured accordingly with Supplementary Methods. Data Analysis This was a descriptive transversal study that applied three data analysis approaches for observational investigation of the immunological profile associated with distinct HIV-‐1+ treatment regimens to as (1) conventional statistical analysis, (2) biomarker signature analysis, (3) biomarkers network (4) heat maps groups segregation analysis and (5) Decision tree analysis. These approaches have been shown as relevant to detect, with high sensitivity, putative minor changes in the immunological profiles that are not detectable by conventional statistical approaches. The approach is detailed as Supplementary Methods. Results Untreated HIV patients present a systemic elevation of immune biomarkers compared to non-‐infected individuals The level of 12 plasma cytokines and chemokines were assessed in order to characterize the overall immune profile of untreated HIV+ patients. Our results showed increased plasma concentration of all immune biomarkers evaluated, except for MCP-‐1, 125
ESPÍNDOLA, M.S. in the plasma of untreated HIV+ patients compared to non-‐infected individuals (NI), indicating a distinctive immune activation state in these patients (Figure 1A). Among them, inflammatory, adaptive and anti-‐inflammatory cytokines were simultaneously elevated in HIV+ patients. Thereby, we observed that IP-‐10/IL-‐10 ratios were increased, but TNF-‐α/IL-‐10 and IFN-‐γ/IL-‐10 reduced in HIV+ infected individuals (Figure 1B). HIV+ patients under different HAART regimens display similar progression biomarkers levels, but with immunological plasma variances We used the classical parameters CD4+ T-‐cell counts and viral load to classify disease progression in untreated patients and additionally, serum levels of sCD14 and sCD163 as the main parameters for untreated and treated patients over first-‐line or second-‐line treatment, used here as HAART 1 and HAART 2, respectively. Undetectable levels of viral copies were observed in plasma from both HAART regimens, confirming the efficacy of viral load suppression on our tested cohort. Untreated or treated HIV+ patients had reduced CD4+ T cells counts compared to healthy individuals, however, patients under both HAART regimens showed a significant recovery of CD4+ T cells. The progression biomarkers sCD163 and sCD14 were higher in all HIV+ patients, although patients on HAART 1 had reduced serum levels of sCD163 when compared to untreated patients. (Figure 1C). The use of antiretroviral therapy, regardless treatment regimen, significantly reduced serum levels of immunological biomarkers RANTES, IP-‐10, IL-‐1β, IFN-‐γ, IL-‐4 and IL-‐10. Serum levels of IL-‐6 and TNF-‐α were reduced only in patients using HAART 1 scheme compared to untreated HIV+ patients. Among the two treatment regimens, significant differences were observed in the levels of IP-‐10, IL-‐6 and TNF-‐α, key immunological markers associated with the progression and susceptibility to HIV infection. We found that individuals under HAART 2 had significantly higher serum concentration of the three cytokines compared to individuals who used first-‐line therapy. In addition, the ratios of IP-‐10/IL-‐10 and TNF-‐α/IL-‐10 from untreated HIV and HAART 2 were increased compared to non-‐infected individuals, while no differences where observed in the ratios from patients using HAART 1. Our results also demonstrate that the immunological biomarkers levels of HAART 1 group are similar to NI individuals, except for the production of IFN-‐α (Figure 1D). 126
ESPÍNDOLA, M.S. A"
C"
Overall Serum Biomarker Levels in HIV+ Patients
MCP-1
500
10,000
RANTES
*
IP-10
2,200
Progression Biomarkers in HIV+ Patients upon HAART
***
CD4 + T-cells
Viral Load
sCD163
1,500
10 8
sCD14
1.5 ×10 6
6.0 ×10 6
*
*
0
0
0
-1
-1
IFN-α
60
RANTES
*
-1
IFN-γ
250
*
TNF- α
-1
0
-1
-1
*
IFN- γ
HAART 2
24
*
HAART 1
IFN- α
0
HIV
HIV
80
HAART 2
*
HAART 1
IL-12
HAART 2
16
0
*
*
8
6
0
40
12
IFN- γ/IL-10
0
-1
-1
-1
0.0
0
-1
Clinical Groups
HIV
0
HAART 2
HAART 1
0
HAART 2
0
*
2
*
8
HAART 1
2
IL-10
*
1.5
HAART 2
4
HIV
HAART 2
HIV
HAART 1
0
16
5
HIV
*
HAART 1
-1
IL-5
*
*
-1
0
3.0
*
4
HAART 2
0
IL-4
HIV
8
350
HIV
*
50
HAART 1
Biomarker Ratio
700
0
IFN-γ/IL-10
HAART 2
TNF-α/IL-10
IP-10/IL-10
HIV
Serum Biomarkers Balance in HIV+ Patients
HAART 1
4
B"
HAART 2
HIV
HIV
*
*
HAART 2
-1
Clinical Groups
TNF- α/IL-10
HAART 2
-1
0.0
Biomarker Ratio
0
-1
*
12
12
HIV
***
8
1
3
HAART 1
***
*
0
*
1.5
HAART 1
-1
IL-10
16
Serum Level (pg/mL)
IL-5
2
5
HAART 1
HAART 2
24
HIV
IL-6
HAART 2
HIV
HIV
*
HAART 1
6
HIV
-1
IL-1β
HAART 1
-1
*
500
HAART 1
-1
0
0
HAART 1
0
HAART 2
*
0
0
IL-4
50
IP-10/IL-10
*
12
3.0
-1
1,000
1,200
*
30
-1
pg/mL
*
6,000
0
0
HAART 2
2,400
***
8
HIV
IP-10
12,000
*
***
0
0
HAART 1
0
Overall Serum Biomarker Levels and Balance in HIV+ Patients upon HAART
MCP-1
500
24
pg/mL
3
3
D"
***
3.0 ×10 6
10 2
***
-1
*
*
*
HAART 2
12
IL-12
10 4
HAART 1
Serum Level (pg/mL)
4
16
TNF-α
24
2
-1
-1
**
*
-1
-1
*
7.5 ×10 5
HAART 2
IL-6
8
0
HAART 1
-1
Cells/mm
-1
*
HIV
IL-1β
4
0
*
*
750
HAART 2
-1
HAART 1
-1
10 6
HIV
0
1,100
5,000
Copies/mm
250
Clinical Groups
Figure 1. Immunological and progression biomarkers overall profile of untreated or treated HIV+ patients under different antiretroviral regimens. A) Overall immunological profile of untreated HIV+ patients; B) Biomarkers ratio of untreated HIV+ patients; C) Progression biomarkers in HIV+ patients upon HAART; D) Overall immunological profile of HIV+ patients upon HAART. Plasma progression biomarkers and immunological biomarkers were obtained by quantification of viremia, CD4+ T cells counts, sCD14, sCD163 and MCP-‐1, RANTES, IP-‐10, IL-‐1β, IL-‐6, TNF-‐α, IL-‐12, IFN-‐α, IFN-‐
γ, IL-‐4, IL-‐5 and IL-‐10 in plasma. Results are expressed as median + interquartile range. ***p<0.001; **p<0.01; *p<0.05 vs. NI; p<0.05 between indicated groups. The interquartile range of NI group is expressed as a gray rectangle under the bars. NI: Non-‐
infected individuals. HIV: untreated HIV+ patients. 127
ESPÍNDOLA, M.S. HAART 2 patients display an increased inflammatory biosignature compared to patients under HAART 1 regimen In order to better understand and characterize the relationship between different HIV clinical groups and their respective immune biosignature, we used categorical analysis strategies, accordingly with Supplementary methods. Initially, the number of subjects with “High” cytokine levels was compiled in a black-‐and-‐white scale diagrams to determine the frequency of High producers in each clinical group (Figure 2A). Our data showed that while NI group is in majority composited by low producers, untreated HIV+ patients exhibited an opposite profile, characterized by elevated frequency of high producers of most cytokines. On the other hand, the profile of patients under treatment was balanced, but those who received HAART 1 had a predominance of low producers, while patients under HAART 2 showed a predominance of high producers of the biomarkers studied (Figure 2A). Using radar charts as a comparison strategy between clinical groups, we observed significant differences in the overall biomarkers profile of high producers. We considered a biomarker relevant when the frequency of high producers was greater than 50% (18, 19). Therefore, we noted that NI subjects had less than 50% frequency of high cytokine producers in all biomarkers studied here. In contrast, HIV infection induced an increase in the frequency of all biomarkers except for MCP-‐1. HIV+ patients who received HAART 1 regimen showed an apparent decrease in the overall profile of cytokines production, in which only IFN-‐α remained with high producers frequency above 50%. Furthermore, patients under HAART 2 displayed increased frequency of IP-‐
10, IL-‐6, TNF-‐α, IL-‐12, IFN-‐α and IL-‐5 (Figure 2B). So far, our data indicate that the immune profile of patients receiving HAART 1 resembles NI profile, while HAART 2 displays a profile closer to the one presented by untreated HIV patients. 128
ESPÍNDOLA, M.S. Overall&Serum&Biomarker&Levels&in&&Untreated&and&Treated&HIV+&PaLents&
HAART&1&
IL-10
IL-5
IL-4
TNF-α
IFN-γ
IFN-α
IL-12
IL-6
MCP-1
IL-1β
RANTES
IP-10
IL-10
IL-5
IL-4
TNF-α
HIV&
IFN-γ
IFN-α
IL-12
IL-6
MCP-1
IL-1β
RANTES
IP-10
NI&
IL-10
IL-5
IL-4
IFN-γ
IFN-α
IL-12
TNF-α
IL-6
IL-1β
RANTES
IP-10
MCP-1
3"
47 40 40 40 33 33 47 60 40 40 47 40
IL-10
IL-5
IL-4
IFN-γ
IFN-α
IL-12
TNF-α
IL-6
IL-1β
RANTES
IP-10
50 89 63 63 70 87 65 63 76 57 67 76
MCP-1
HAART&2&
60 73 13 33 73 73 53 60 47 47 53 33
47 18 42 47 35 23 38 36 35 47 33 38
NI&
HIV&
MCP$1&
MCP$1&
IL$10&
IL#10*'
IL$10&
IP$10&
IL$5&
RANTES&
IL$4&
IL$1β&
IFN$γ&
IL$6&
IFN$α&
IP#10*'
IP$10&
IL#5*'
IL$5&
RANTES*'
RANTES&
IL#4*'
IL$4&
IL#1β*'
IL$1β&
IL#6*'
IL$6&
IFN$γ&
IFN#γ*'
IFN$α&
IFN#α*'
TNF$α&
TNF$α&
TNF$α&
TNF#α*'
IL$12&
IL#12*'
IL$12&
HAART&2&
HAART&1&
MCP#1*'
MCP$1&
Frequency&of&Subjects&with&
High&Serum&Levels&(%)&
MCP$1&
IL$10&
Scale&
100&
50&
0&
IP$10&
IL$5&
RANTES&
IL$4&
IL$1β&
IFN$γ&
IL$6&
IFN$α&
IFN#α*'
TNF$α&
IL$12&
IP#10*'
IP$10&
IL$10&
IL#5*'
IL$5&
RANTES&
IL$4&
IL$1β&
IL#6*'
IL$6&
IFN$γ&
TNF#α*'
TNF$α&
IFN$α&
IFN#α*'
IL$12&
IL#12*'
Figure 2. Immunological biosignature of NI, untreated and different antiretroviral treated HIV+ patients. Plasma concentration of MCP-‐1, RANTES, IP-‐10, IL-‐1β, IL-‐6, TNF-‐α, IL-‐12, IFN-‐α, IFN-‐γ, IL-‐4, IL-‐5 and IL-‐10 was used for categorical analysis of NI, HIV, HAART 1 and HAART 2 clinical groups between high and low producers of a specific immunological biomarker. A) Black and white diagrams represent high and low producers of each cytokine, respectively. Each lane represents a cytokine and each block represents the pattern of cytokine production of each patient. The numbers bellow each lane represent the frequency of high producers of the cytokine tested. B) Radar charts summarize the percentage of high producers of each clinical group studied. When the frequency of high producers was greater than 50% (on a scale of 0-‐100%), the result was highlighted. 129
ESPÍNDOLA, M.S. Segregation according to disease progression revealed that HAART 2 patients could not restore immune biosignature to a NI pattern Considering the distinct immune profiles of patients under different treatment regimens, we aimed to evaluate the correlation between immunological biosignature and disease progression in the studied clinical groups. For that, we used Viral Load and CD4+ T cell counts, in addition to sCD163 and sCD14 levels as categorization factors for disease progression (Supplementary Figure 2) and calculated the agreement percentage among each two of them (Supplementary Figure 3). Figure 3A shows untreated HIV profile according to biomarkers high producers categorized by Viral Load and CD4+ T cell counts parameters. We observed that rapid progressors displayed an exacerbated inflammation, characterized by increased frequency of high producers, over 75% in most cases, and by the number of altered biomarkers. Moreover, slow progressors showed a moderate inflammatory status in which eight of the twelve cytokines have frequency of high producers above 50%, but with lower intensity compared to rapid progressors. Since the traditional parameters CD4+ T cell counts and viral load are influenced by antiretroviral treatment, we used sCD163 and sCD14 levels for categorizing disease progression on treated groups. Using sCD163 parameter, rapid progressors under both treatment displayed moderate inflammation, in which frequency of high producers were above 50% in seven and nine biomarkers on HAART 1 and HAART 2 clinical groups, respectively. On the other hand, evident differences were observed among treatments in slow progressors patients. HAART 1 patients showed similar profile to NI individuals, where none of the biomarkers had high producers frequency superior to 50%, while all patients under HAART 2 remained in a state of moderate inflammation (Figure 3B). By using sCD14 for progression categorization, rapid progressors from HAART 2 clinical group displayed moderate inflammation, in which 6 of 12 cytokines had high producers frequency above 50%, while among HAART 1 patients only 2 cytokines appeared above 50%. Slow progressors from HAART 1, as seen before, did not show any inflammatory profile, oppositely from patients undergoing HAART 2, which showed an overall profile of moderate inflammation, as 6 of 12 cytokines had frequency of high producers above 50% (Figure 3C). Thus, we found that antiretroviral therapy reduces inflammatory exacerbation even in rapid progressors. Nevertheless, immunological biosignature from HAART 1 130
ESPÍNDOLA, M.S. displayed a similar pattern to NI especially among slow progressors. Conversely, HAART 2 biosignature showed moderate inflammation in rapid progressors that persisted in the slow progressors, which approximates HAART2 pattern to untreated HIV. A&
Overall&Immunological&&PaNerns&in&&HIV+&PaOents&According&to&Disease&Progression&Biomarkers&&
Viral&Load&
HIV&
MCP$1&
MCP$1&
IL$10&
IP$10&
RANTES&
IL$1β&
IL$4&
IL$1β&
IFN$γ&
IL$6&
IFN$α&
RANTES&
IL$6&
IFN$α&
TNF$α&
MCP$1&
MCP$1&
IL$10&
IL$4&
IL$1β&
IFN$γ&
IL$6&
RANTES&
IL$4&
IL$1β&
IFN$γ&
IL$6&
IFN$α&
TNF$α&
sCD163&
HAART&1&
RANTES&
IL$4&
IL$1β&
IFN$γ&
IL$6&
IFN$α&
TNF$α&
IL$5&
IL$4&
IFN$γ&
Low&
IL$5&
RANTES&
IL$4&
IL$1β&
IFN$γ&
IL$6&
IFN$α&
TNF$α&
IL$12&
IL$1β& IL$4&
IL$1β&
TNF$α&
IFN$γ&
IL$10&
IL$4&
IFN$γ&
MCP$1&
RANTES&
IL$1β& IL$4&
IL$1β&
TNF$α&
IL$12&
IFN$γ&
IL$6&
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HIV&
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Figure 3. Immunological biosignature of untreated or treated HIV+ patients under different antiretroviral regimens according to disease progression. Progression biomarkers viral load, CD4+ T cell counts, sCD163 and sCD14 classified HIV+ patients in rapid (upper charts) and slow progressors (inferior charts). Plasma concentration of MCP-‐1, RANTES, IP-‐10, IL-‐1β, IL-‐6, TNF-‐α, IL-‐12, IFN-‐α, IFN-‐γ, IL-‐4, IL-‐5 and IL-‐10 was used for characterize immunological biosignature of HIV+ patients. Radar charts summarize the percentage of high producers of each clinical group studied. A) Biosignature of untreated HIV patients according to viral load and CD4 count categorization. B) Biosignature of untreated HIV, HAART 1 and HAART 2 patients according to the levels of plasma sCD163. C) Biosignature of untreated HIV, HAART 1 and HAART 2 patients according to the levels of plasma sCD14. Significant changes in 131
ESPÍNDOLA, M.S. biomarker production are considered when the frequency of high producers was greater than 50% (on a scale of 0-‐100%). The type of HAART regimen interferes in the biomarkers network organization of HIV+ patients In an attempt to perform an exploratory analysis we evaluated the correlation network among immunological biomarkers (Figure 4). We observed that NI individuals are characterized by a rich network connections, in which the cytokines IL-‐1β, IL-‐6, IFN-‐
α, IL-‐4 and IL-‐10 correlate with each other through strong interactions. We also observed strong and moderate correlations from IL-‐12, weak correlations originating from TNF-‐α, and one negative correlation from IP-‐10. Compared to NI network, HIV infection induces changes in immune connections, observed through the loss of interactions power involving IL-‐6, IFN-‐α and IL-‐10; and in the increased power in connections originating from TNF-‐α and IP-‐10. On the other hand, in networks from HIV+ patients under HAART 1, IL-‐12 and IFN-‐γ gained strength and MCP-‐1 lost all interactions with other cytokines. Notably, we observed the recovery of patterns, modified during infection, such as the IP-‐10, IL-‐6 and IL-‐10 to a similar NI profile. Oppositely, HAART 2 treatment was associated with a significant loss of connections, generating a distinctive immune network. Interactions from IL-‐6, IL-‐10, MCP-‐1 and RANTES are among the main biomarkers that lost important connections, while interactions from IL-‐1β and IFN-‐α were preserved when compared to NI individuals (Figure 4). Therefore, using this approach we observed that differences in IP-‐10, TNF-‐α, IL-‐6, IFN-‐α and IL-‐10 interactions were primordial in HIV disease and are a hallmark between different treatments. 132
ESPÍNDOLA, M.S. Serum#Biomarkers#Network#Levels#in#Untreated#and#Treated#HIV+#Pa@ents#
NI#
HIV#
HAART#1#
HAART#2#
“Correla(on*Scores”*
Nega@ve#(r#<#0)#
Weak#(r#≤#0.35)#
Moderate#(0.36#≥#r#≤#0.67)#
Strong#(r#≥#0.68)#
Figure 4. Systemic immunological biomarkers interactions network is modified in the intercourse of HIV disease and treatment regimen. The network analysis shows significant correlations (p<0.05) among all the variables measured after calculation of Spearman correlation ranks between each pair of biomarkers and are represented by lines for NI, HIV, HAART 1 and HAART 2 clinical groups. The strength of the correlation was given by “r” value and is illustrated as negative (r<0), weak (r ≤ 0.35); moderate (0.36 ≤ r ≤ 0.67); or strong (r ≥ 0.68). Arrows indicate the main biomarkers modified during HIV infection. 133
ESPÍNDOLA, M.S. Heat maps analysis showed immunological biomarkers segregation of HAART clinical groups After emphasizing the major disease related biomarkers using network connections, we aimed to use a third form of analysis related to Z score as a way to classify the main biomarkers, associating them to each clinical group. The expression profile of the biomarkers highlighted before, IP-‐10, IL-‐6, TNF-‐α, IFN-‐α, IL-‐10 and MCP-‐1, was calculated to each patient and plotted in a heat map as shown in Figure 5A. Based on this analysis, we noted that the biomarker that best segregated uninfected individuals from HIV+ patients, regardless of treatment, was IP-‐10, followed by TNF-‐α and IFN-‐α. Furthermore, HIV patients under HAART 1 were located mostly among NI individuals. Conversely, patients under HAART 2 were included among untreated HIV+ patients. These results demonstrated once again and reinforce the distinctive immunological profiles generated in patients under different treatments and the possible impact on health and life expectancy of these patients. Decision tree analysis highlighted IP-‐10, TNF-‐α and IFN-‐α as the main segregation immunological biomarkers among treatments. Using the biomarkers selected previously, we constructed a decision tree in order to point out which of the biomarkers would be decisive in clinical groups segregation. As our results shown that the immunological pattern of NI and HAART 1 individuals is similar, we clustered them in one larger group, and did the same for untreated HIV and HAART 2, classifying them as one clinical profile. Using all 142 records in the construction of the decision tree, the generated structure had an average accuracy of 90.84%, ranking 129 correctly and missing only 13 records. The most important attributes for the decision tree were "IP-‐10", followed by "TNF-‐α". It is important to note that only these two biomarkers ranked 83 of 142 (58.45%) database records, with a classification rate of 96.38%, ranking 63 as "NI or HAART 1", missing 3; and classifying 20 as "HIV or HAART 2 ", not missing any records (Figure 5B). 134
ESPÍNDOLA, M.S. A"
NI
HIV
HAART 1
HAART 2
B"
Figure 5. The expression patterns of the main immunological biomarkers define a segregated profile upon infection and among different treated HIV groups. A) The values of IP-‐10, IL-‐6, TNF-‐α, IFN-‐α, IL-‐10 e MCP-‐1 were used to calculate of the Z-‐score for each cytokine produced by subjects individually for further generation of a heat map. Row Z-‐score scaled from -‐6 to +6 and is illustrated as green, black and red colors. B) The values of IP-‐10, IL-‐6, TNF-‐α, IFN-‐α, IL-‐10 e MCP-‐1 were used for the Decision Tree dataset construction. Decision tree was generated considering clustering of NI and HAART 1 as one group; and HAART2 and HIV as another. The numbers beside the groups name indicate the correct/incorrect ranking of the records 135
ESPÍNDOLA, M.S. Discussion Systemic chronic inflammation in HIV regularly progress to persistent immune stimulation and progressive immunopathology. This status has drove the search for new approaches for managing the disease outcome (20). Increased number of studies related to immune response in treated patients are giving rise to this new era of HIV, but few is known about the outcome of different HAART regimens, the immunological impact of each drug classes and how this knowledge would contribute to better therapies. In this sense, our data bring to light new aspects of different antiretroviral therapy regimens, in which we observed significant differences in the immune profile of patients treated under distinct regimens. Immune activation in HIV course initiates during acute infection characterized by rapid spread of the virus throughout the gut-‐associated lymphoid tissue, damaging mucosal integrity and leading to a continuous loss of HIV-‐susceptible, CCR5-‐expressing CD4+ T cells (21-‐23). In our work, we clearly detected this uncompensated immune activation, evidenced by the global increased cytokines production in untreated patients, independently of adaptive or innate pattern (Figure 1A). Even IL-‐10, a regulatory cytokine was elevated in our patients, probably as an attempt to counterbalance the excess of proinflammatory response. The cytokines evaluated by us are described as being markedly produced in acute HIV infection and some of them, e.g. INF-‐γ, RANTES, IP-‐10 and IL-‐12 were highlighted before by other authors as early biomarkers of immune activation that may help to predict viral set point variation and disease progression (9). The access to HAART made possible a durable and perhaps life-‐long viral suppression, but immune reconstitution is often partially recovered (24-‐26). Once under the right treatment, the almost complete inhibition of HIV replication promotes over the time an improved immune function and the near elimination of any risk for developing complications that define AIDS. Instead, the risk for developing several non-‐AIDS disorders is increased in HIV-‐infected individuals, particularly in the setting of late initiation of HAART. The most common disorders include but are not limited to cardiovascular disease, cancer, kidney disease, liver disease, osteopenia or osteoporosis, and neurocognitive disease, collectively referred to as serious non-‐AIDS events (27-‐29). The determinants of these outcomes are not fully understood, but different studies are associating death in the HAART era to plasma markers of coagulation and inflammation 136
ESPÍNDOLA, M.S. (30, 31). Moreover, a growing number of studies have implicated monocyte-‐ and macrophage-‐related inflammatory biomarkers, sCD163 and sCD14, that are also markers of microbial translocation, as predictors and presumable cause of disease progression (7, 12, 32, 33). Therefore, a close analysis on how different HAART regimens are related to a set of biomarkers can help to understand or predict the origin of non-‐AIDS disorders. Considering this scenario, we did not find significant differences on the level of sCD163 and sCD14 between the distinct treatments; therefore, we consider that both HAART 1 and HAART 2 were under similar disease progression status. The point here is that some yet unknown event related to the type of treatment might be modulating immune response in these patients. It is obvious that we cannot assure that the status of disease before the initiation of treatment isn’t an influent aspect, but once progression biomarkers look similar among treated groups (Figure 1C), we can speculate that the regimen has a direct impact on immunological status. In our cohort, once we start to determine the immune biosignature of patients under HAART 1 and HAART 2, we clearly noted two distinct patterns. One pattern, composed by two groups, the NI and HAART 1, which present the same net profile (Figure 2B). Together, untreated HIV patients and HAART 2 compose another pattern with similar net profile. Even when we set apart slow and rapid progressors, according to sCD163 and sCD14 (Figure 3B and 3C), the differences between these two patterns are very clear. Previous studies have shown that protease inhibitor based therapies for HIV might induce extravirologic modulation of immune pathways, blocking apoptosis and inhibiting matrix metalloproteinase activity (34-‐36). Moreover, these drugs are related to alter innate immune response signaling to dsRNA in oral epithelial cells, with increased production of IL-‐8, TNF and NF-‐κB activation (37). In a recent comparative study, it was also observed that the choice of treatment regimen influenced the levels of the immunological biomarkers IP-‐10 and MIG, both chemokines induced by interferon-‐γ. Both were reduced after treatment, however their decline was significantly smaller with ATV/r (PI) than with EFV (NNTRI), while no significant difference was found between LPV/r (PI) and EFV or between other first-‐line drugs (38). Similarly to what we found in our cohort, patients in an LPV/r based therapy, after 6 years under treatment presented IFN-‐α and MCP-‐1 levels similar to the baseline (39), indicating a partial failure in decreasing immune cells activation. 137
ESPÍNDOLA, M.S. Slow progressors patients under HAART 2 persisted in an immune activation status that was not observed in patients that received HAART 1 (Figure 3). The complete distinct immunological biomarkers network generated by HAART 2 patients in our work (Figure 4) can be explained by the ability of LPV/r and ATV treatments in directly modulate cytokines response and transcription factors expression, as seen before (40). In our cohort, IP-‐10, TNF-‐α, IFN-‐α, IL-‐6, and IL-‐10 were characterized as best immune biomarkers in which we could observe the distinctive immunological profiles generated in patients under different treatments (Figure 5A). In this sense, here we confirmed that by selecting the right biomarkers, it becomes reasonable to say that while first-‐line therapy (HAART 1) is able to recover immune function to an almost non-‐
infected profile, patients under HAART 2 presented an inflammatory biosignature profile very close to untreated patients. In fact, we found that the first three of them: IP-‐10>TNF-‐α>IFN-‐α were decisive in clinical groups segregation (Figure 5B). These selected biomarkers have an evident importance in HIV, as previous described. IP-‐10, a C-‐X-‐C motif chemokine 10 (CXCL-‐10) also known as Interferon gamma-‐induced protein 10 specifically target lymphocytes, particularly activated T cells, as well as macrophages, and are involved in T cell migration during T-‐cell-‐dependent immune responses (41). High IP-‐10 levels in HIV are critically related to immunological activation (42) and recognized as strongly predictive of rapid HIV disease progression (10). Type I interferons are well known to their anti-‐
viral functions, considered essential in controlling viral infections. However, during persistent viral infections, such what occurs in HIV infection, prolonged IFN-‐α activity directly contributes to increased immune activation and dysfunctional activity of monocytes, T-‐cells and B-‐lymphocytes. Moreover, there is an association of increased IFN-‐α activity and the development of non-‐AIDS-‐related events (43). As monocytes activation is a key event in systemic inflammation during HIV, cytokines produced by these cells such as IL-‐6, TNF-‐α, as well as sTNFR-‐1, the soluble receptor 1 for TNF, are strongly associated with disease progression in the HAART era (30, 31, 44, 45). Finally, once antiretroviral therapy spreads and brings new perspectives to HIV-‐
infected patients, our study, similar to other (46) comes to reinforce the importance of establishing new immunological biomarkers besides the virological ones, but further evidence some problems associated to drug therapies. The new challenges from now on are to design trials that reduce immune activation. Promising biomarkers such as the 138
ESPÍNDOLA, M.S. ones shown here are relatively easy to standardize from measurements in plasma and could give rise to a novel perspective into disease outcome and scientific analysis, considering HAART patients as a heterogeneous group. Though, there are several aspects in the immunological outcomes from these patients that still need further and profound investigation. Conclusion By using different systems biology approaches we demonstrated that immune response in HIV+ patients under second-‐line therapy approximates to HIV+ untreated immune profile, while first-‐line therapy is able to recover immune response to a non-‐infected pattern. These findings can be of great value in patient’s prognosis, giving rise to a novel perspective into disease outcome and new developing therapies, considering HAART patients as a heterogeneous group. Competing interests Authors declare that they have no competing interests. Acknowledgments and Fundings This work was supported by São Paulo Research Foundation (FAPESP, grants #2011/12199-‐0; #2011/12512-‐0; #2011/24026-‐3; #2012/02799-‐3). The authors are grateful to Caroline Fontanari and Thaisa da Silva Araujo for their technical support. Authors Contribution MSE, FGF, VRB, OAM: Conceived and designed the study; MSE, LJGL, LSS, MCC, FAZ: Conducted the experiments; MSE, MDSG, LRA, OAM: Conduced the analysis; MSE, FGF: Contributed to writing the sdudy manuscript. References 1. UNAIDS. World AIDS Day Report http://www.unaids.org/en/resources/campaigns/World-‐AIDS-‐Day-‐Report-‐
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ESPÍNDOLA, M.S. Cut-off Edges of Used to Segregate Subjects as They Present Low or High Levels of Serum Biomarkers
RANTES
243
477.0
6,153
0.7
Low Levels
High Levels
12.0
0
ALL
0.0
0
ALL
0.0
IL-12
TNF-α
ALL
IFN-α
45.0
60.0
150.0
1.2
7.2
4.2
12.6
High Levels
20.0
Low Levels
Serum Levels (pg/mL)
IL-6
ALL
0.0
ALL
0.0
IFN-γ
0.0
ALL
ALL
IL-4
IL-5
0.0
ALL
IL-10
200.0
8.0
120.0
3.8
0.9
0.9
2.0
Low Levels
High Levels
70.0
0.0
ALL
0.0
ALL
0.0
Global Median
IL-1β
13,000
Global Median
IP-10
9,200
0.0
ALL
All Data Universe (NI + HIV + HAART 1 + HAART 2)
Global Median
MCP-1
1,050
ALL
Supplementary Figure 1 151
ESPÍNDOLA, M.S. Cut-off Edges of Biomarkers Used to Segregate HIV+ Patients into Putative Slow and Rapid Progressors
Putative Slow Progressors
Putative Rapid Progressors
+
Viral
Load
Viral Load
sCD163
CD4CD4+T-cells
T-cells
sCD14
sCD14
sCD163
Cut-off
Edges of Biomarkers800
Used to Segregate HIV+ Patients
into Putative Slow and
Progressors
×10
10 6
6 ×Rapid
6.0
10066
1.0
1××10
10066
High Levels
Putative Slow Progressors
Putative Rapid Progressors
5x10 5
pg/mL
5x10 5
3x10 6
pg/mL
pg/mL
400
sCD14
sCD14
sCD163
pg/mL
Cell/mm3
400
Cell/mm3
Copies/mL
sCD163
CD4CD4+T-cells
T-cells
800
3x10 5
Copies/mL
High
Levels
Low
Levels
10 6
3x10 6
6 ××10
6.0
10066
1.0
1××10
10066
10 4
10 5
Global Median
Low Levels
Viral
Load
Viral Load
10 5
Global Median
+
3x10 5
10 3
10
HIV
0
4
HIV
0
HIV
0
HIV
All Data Universe (Untreated HIV+ patients)
Supplementary Figure 2 Agreement of Biomarkers Used to Segregate HIV+ Patients into Putative Slow and Rapid Progressors
10
0
0
0
HIV
HIV
HIV
HIV
All
Data
Universe
(Untreated
HIV+
patients)
65%
61%
69%
1,000
6.0 ×10
37%
33%
1.0 ×10
28%
3
6
33%
1.0 ×10 6
10 6
10 7
10 6
sCD163
10 5
28%
10 5
10 6
10 7
Viral Load
60%
6.0 ×10 6
28%
0
10 3
10 7
10 4
10 5
10 6
0
10 3
10 4
10 5
10 6
10 7
41%
0
10 3
10 4
10 5
10 6
10 7
3.0 ×10 6
78%
30%
10 7
Viral Load
60%
5.0x10 5
3.0 ×10 6
30%
0
0
78%
6.0 ×10 6
30%
1.0 ×10 6
sCD163
5.0x10
10 4
5
30%
28%
1.0 ×10 6
10 4
0
10 3
69%
6.0 ×10 6
41%
sCD14
10 5
3.0 ×10 6
28%
400
0
10 3
61%
28%
10 4
sCD14
37%
5.0x10 5
sCD14
0
10 3
65%
1,000
400
sCD14
400
1,000
sCD163
Agreement of Biomarkers Used to Segregate HIV+ Patients into Putative Slow and Rapid Progressors
sCD163
CD4+ T-cellsCD4+ T-cells
6
30%
48%
0
0
400
0
400
1,000
3.0 ×10
CD4+ T-cells
5.0x10 5
6
70%
6.0 ×10 6
0
0
30%
1,000
sCD14
400
48%
33%0
1,000
CD4+ T-cells
3.0 ×10 6
70%
6.0 ×10 6
sCD14
33%
37%
0
0
5.0x10 5
37%
0
0
5.0x10 5
sCD163
Supplementary Figure 3 1.0 ×10 6
sCD163
3.0 ×10 6
1.0 ×10 6
152
ESPÍNDOLA, M.S. Supplementary Table 1. Treated patients regimen details Supplementary Table 1. Treated patients regimen details Drug Combination (n) First-‐line regimen (HAART 1) AZT + 3TC + EFV 10 TDF + 3TC + EFV 5 Second-‐line regimen (HAART 2) TDF + 3TC + LPV/r 5 TDF + 3TC + ATV/r 4 AZT + 3TC + LPV/r 3 AZT + 3TC + IDV 1 AZT + ATV/r 1 TDF + 3TC + FOS-‐APV 1 AZT: zidovudine; 3TC: lamivudine; TDF: tenofovir; EFV: efavirenz; LPV/r: lopinavir + ritonavir; ATV/r: atazanavir + ritonavir; IDV: indinavir; FOS-‐APV: fosamprenavir; HAART: highly active antiretroviral therapy 153
ESPÍNDOLA, M.S. Supplemetary Table 2. Basic characteristics of HIV-‐1-‐infected individuals and healthy donor Value Baseline Healthy HIV control Untreated HAART1 HAART2 66 46 15 15 Female [no. (%)] 33(50) 14 (30) 4 (27) 4 (27) Male [no. (%)] 33 (50) 32 (70) 11 (73) 11 (73) Age [yr (range)] 35,2 (25-‐45) 37 (31-‐44) 42 (32-‐47) 44 (37-‐54) characteristic Subjects (n) CD4/mL (range) NA 465 (248-‐611) 672 (343-‐843) 529 (359-‐690) HIV RNA/mL 4,041 <50 [log (range)] NA <50 (3,41-‐4,76) Healthy controls (n=66) were volunteer blood donors from Hemotherapy Center of Ribeirão Preto, seronegative for HIV-‐1 and without any reported history of chronic illness or intravenous drug use. 154
ESPÍNDOLA, M.S. Supplementary Methods Biomarkers measurement Blood specimens were collected using Heparin blood collection tubes (BD Biosciences, San Diego, CA). Plasma separation was performed strictly according to the manufacturer's protocol. A customized multiplex kit was used to measure MCP-‐1, RANTES, IP-‐10, IL-‐1β, IL-‐6, TNF-‐α, IL-‐12, IFN-‐α, IFN-‐γ, IL-‐4, IL-‐5 and IL-‐10 (12-‐plex, EMD Millipore Corporation, Billerica, Massachusetts, USA). A fluorescent bead-‐based instrument (Luminex® MAGPIX® System; Luminex Corporation, Austin, Texas, USA) was used to read each multiplex plate. Luminex bead-‐based data were analyzed using Milliplex Analyst software v3.5 (Millipore; VigeneTech Inc., Boston, Massachusetts, USA) and a three-‐parameter logistic curve fit. Soluble CD14 and sCD163 concentration were measured in plasma using the DuoSet ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, Minn), according to the manufacturer's instructions. CD4+ T-‐cell counts for HIV-‐1+ patients were measured with a FACS Calibur flow cytometer (Becton-‐Dickinson, USA). HIV-‐1 RNA levels in plasma (viral load) were determined by Real Time PCR for HIV-‐1 (Abbott Molecular). Conventional Statistical Analysis Differences between groups were first evaluated to test the normality. Considering the nonparametric nature of all data sets, statistical analyses between NI and HIV were performed by the Mann-‐Whitney test. Additional analyses among HIV subgroups were performed by the Kruskal-‐Wallis test, followed by Dunns’ multiple comparison test. GraphPad Prism 5.0 software (Graph-‐Pad Software, San Diego, CA, USA) was used to calculation of statistical analyses and differences were considered significant at P < 0.05. Biomarker Signature Analysis The cytokine profile was first assessed to identify the cytokine production pattern of each individual, as previously demonstrated (1, 2). In this data analysis, initially, the whole universe of data of each biomarker was used to calculate the global median value used as the cut-‐off to classify patients as a “low” or “high” producer of a given biomarker. The cut-‐offs values are detailed in Supplementary Figure 1. Once the cut-‐off for each biomarker was established, we selected the high producers of each biomarker and 155
ESPÍNDOLA, M.S. assembled the data using black-‐and-‐white scale diagrams to calculate the frequency of those for each clinical group. When considering disease progression status, the cut-‐off for each of the progression biomarkers: Viral load, CD4+ T cells count, sCD163 and sCD14 was calculated as the global median value from untreated HIV-‐1+ group, and patients classified as “Putative Slow Progressors” or “Putative Rapid Progressors” as detailed in Supplementary Figure 2. Relevant data (> 50%) were then highlighted in bold/underline format. Radar charts were constructed to characterize the overall frequency of patients with high levels of a given immunological biomarker. Biomarker Network Spearman rank correlation test was performed to assess the association between immunological biomarkers production in each clinical group. In all cases, significance was considered at P<0.05. All tests were provided by GraphPad Prism version 5.0 (San Diego, CA). Significant correlations representing the interaction between biomarkers tested were compiled using the open source software Cytoscape (version 2.8; http://www.cytoscape.org), as previously reported (3). Biomarker networks were constructed using circle layout. Connecting edges display the underscore of correlation index (r) as negative (𝑟 < 0), weak (𝑟 ≤0.35), moderate (0.36 ≥ 𝑟 ≤ 0.67), and strong (𝑟 ≥ 0.68), as proposed previously (4). Heat Map and Decision Tree The heatmap analysis was carried out using the heatmap.2 function in the R (Project for Statistical Computing Version 3.0.1) and gplots package with the default clustering parameters. All analyses were performed using customized functions available from Bioconductor packages. After dataset analysis, a decision tree was generated for each heat map. The C4.5 algorithm (5) was used to build the decision tree from WEKA implementation software (Waikato Environment for Knowledge Analysis, version 3.6.11, University of Waikato, New Zealand), using default J48 parameters (6). The decision trees, the most widely used machine learning algorithms, were used to select the minimal set of phenotypic features that efficiently segregated groups. This method analyzes all the phenotypic attributes in the training set and selects the most relevant attribute that maximizes the information gain as the root node. Following, the method continues searching for additional attributes for group segregation. In order to estimate 156
ESPÍNDOLA, M.S. the classification accuracy of the decision tree models on new data with unknown class labels, a 10-‐fold cross validation methodology available in the WEKA software. References of Supplementary Methods 1. Guimaraes AG, da Costa AG, Martins-‐Filho OA, Pimentel JP, Zauli DA, Peruhype-‐
Magalhaes V, et al. CD11c+CD123Low dendritic cell subset and the triad TNF-‐
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ESPÍNDOLA, M.S. Innate immune cells in focus at the setting of HIV infection Milena S Espíndola1,2, Luana S Soares1,2, Fabiana A Zambuzi1, Leonardo J G Lima1,2, Maira C Cacemiro1, Verônica S Brauer1, Fabiani G Frantz1 1 Departamento de Análises Clinicas, Toxicologicas e Bromatologicas, Faculdade de Ciencias Farmaceuticas de Ribeirao Preto, Universidade de Sao Paulo, Av. do Cafe s/n, 14040-‐903, Ribeirao Preto, Sao Paulo, Brazil 2 Imunologia Basica e Aplicada – FMRP, USP Summary Sentence This review addresses how HIV influences the frequency, phenotype and function of innate immune cells during infection and their involvement in disease progression. Short running title Innate immunity in the context of HIV Corresponding author: Fabiani Gai Frantz Email: frantz@fcfrp.usp.br Address: Departamento de Analises Clinicas, Toxicologicas e Bromatologicas, Faculdade de Ciencias Farmaceuticas de Ribeirao Preto, Universidade de Sao Paulo, Av. do Cafe s/n, 14040-‐903, Ribeirao Preto, Sao Paulo, Brazil. Telephone: +55 16 3315 0241 Key Words: Pathogenesis, Innate Cell Mediated Immunity, AIDS, Cell Dysfunction 158
ESPÍNDOLA, M.S. Abbreviations AIDS – Acquired Immunodeficiency Syndrome APCs – Antigen Presenting Cells BMDMs -‐ Bone Marrow-‐Derived Macrophages CNS -‐ Central Nervous System CPG ODN -‐ CpG Oligodeoxynucleotides DCs – Dendritic Cells HAART -‐ Highly Active Antiretroviral Therapy HIV -‐ Human Immunodeficiency Virus HLA – Human leukocyte antigen hMDM – human Monocyte-‐Derived Macrophage HSC -‐ Hematopoietic Stem Cells LPS – Lipopolysaccharide M-‐Tropic – Macrophage Tropic MHC -‐ Major Histocompatibility Complex NET -‐ Neutrophil Extracellular Traps NK – Natural Killer NKT – Natural Killer T pDCs – plasmocytoid Dendritic Cells ROS -‐ Reactive Oxygen Species TCR -‐ T Cell Receptor TLR – Toll Like Receptor TNFR – TNF Receptor 159
ESPÍNDOLA, M.S. Abstract Innate immune cells play a critical role during the onset of HIV infection, and remain active until the final events that characterize AIDS. The viral impact on innate immune cell response may be a result of direct infection or indirect modulation and each cell type responds in a specific manner to HIV. During HIV infection, the immune system works in a dynamic way, where innate and adaptive cells contribute with each other stimulating their function and modulating phenotypes and consequently the infection resolution. Understanding the alterations in the cell populations induced by the virus is pivotal and can help to combat HIV at the time of infection and above all, to prevent the establishment of viral reservoirs. We have reviewed the literature regarding frequency of infected and affected cells in blood, as well as the phenotype and function of monocytes, DCs, neutrophils, eosinophils, mast cells/basophils, NK cells, NKT cells and γδT cells. Our aim was to consolidate the existing knowledge of how HIV and some cells of our innate immune system interact by offering an overview on how these cells further influence disease progression. Introduction It is critical to understand both the innate and adaptive arms of the immune system in order to explore the pathogenesis of HIV infection. Once in contact with the sites of infection or circulating in the blood, HIV is detected or captured by immune cells, which express the necessary receptors and co-‐receptors needed for infection. When the host comes in contact with the viral particle, among the first cells to be infected are mucosal DCs, tissue macrophages, mucosal resident T cells, expressing the co-‐receptors CXCR4 or CCR5, key molecules in the fusion of the virus with the cell membrane are infected (1-‐3). The initial interaction between the viral protein gp120 and the CD4 receptor induces conformational changes in the viral protein, exposing a region capable of interacting with a co-‐receptor (CCR5 or CXCR4). Next, the gp41 viral fusion peptide is inserted into the membrane, which allows the virus particle into the cell. Then, partial cleavage of the viral capsid occurs, resulting in the release of viral genetic material and proteins in the cytoplasm of infected cells (4). At the beginning of infection, the tissue resident cells elicit innate immune responses and release cytokines and chemokines, which result in the recruitment of new 160
ESPÍNDOLA, M.S. cells to the tissue, such as neutrophils and NK cells. Resident DCs and newly-‐recruited infected cells migrate to the draining lymph nodes and interact with CD4+CCR5+ T lymphocytes, thus spreading the infection. Therefore, despite starting the adaptive immune response against the newly installed infection, APCs promote viral spread in the secondary lymphoid organs and contribute directly to the establishment of systemic infection. The free circulating virus may also be captured or directly infect circulating cells such as eosinophils, γδT cells, monocytes and neutrophils. It may even reach the bone marrow and infect progenitor cells, establishing new viral reservoirs. Due to the increased viral load in the plasma, as well as the establishment of a viral reservoir and sustained activation of the immune response, the spread of infection is characterized by an increased number of newly infected cells and the progressive reduction in the number of CD4+ T cells present in the peripheral blood and mucosa (5). This review sheds light on the characteristics of most innate immune cells during HIV infection and disease progression. We focused on how monocytes, DCs, eosinophils, neutrophils, basophils, NK cells, NKT cells and γδT cells participate in primary infection and/or disease progression. We are attempt that other innate cells are relevant to infection and disease progression, as the very well known role of macrophages, CD34+ progenitor cells, innate T cells, among others. However we limited our discussion at eight cell types, which allows a more thorough discussion of the chosen cells. Monocytes – key cells in HIV pathogenesis Monocytes are circulating mononuclear cells from the myeloid lineage that play a crucial role in tissue homeostasis and immunity. In humans, they represent approximately 10% of nucleated cells in the blood and are also numerous in the spleen and lungs (6, 7). Different monocyte subsets are described according to their expression of CD14 and CD16. In healthy subjects, 80-‐90% of circulating monocytes are CD14highCD16-‐, known as classical monocytes. The remaining monocytes express CD16 and are subdivided into intermediate monocytes (CD14highCD16+) and non-‐classic or patrolling monocytes (CD14dimCD16+) (8). Part of the mononuclear phagocyte system, these cells are strategic players during inflammation and pathogen challenge (9). Monocytes are key cells in HIV pathogenesis, since their activation is fundamental to the systemic inflammation that leads to end-‐organ damage and multimorbidity. Nevertheless, the effects of HIV on monocytes are mostly indirect, since 161
ESPÍNDOLA, M.S. these cells are not frequently infected. Instead, they suffer the effects of immune overstimulation caused by the typical intestinal bacterial translocation that occurs during viral infections (10). Less than 0.1% of blood monocytes harbor HIV (11); however, specific cell subsets increase in the blood, and this event may be related to the AIDS-‐associated symptoms, including neurological disorders (12, 13). In fact, an increased monocyte turnover in the bone marrow was correlated with disease severity and progression in macaque models (12, 14). Between the identified subsets of monocytes, the CD16+ population, which is characterized as a transitional stage between monocytes and macrophages (15, 16) or DCs (17-‐20), seems to be more permissive and preferentially harbors HIV-‐1 in vivo (21). This subset is elevated in untreated and treated HIV-‐infected patients (22, 23), and the intermediary subset has a strong correlation with plasma inflammatory biomarkers that predict morbidity and mortality (24). The monocyte surface molecules have also been implicated in HIV pathogenesis. The co-‐receptor CD14, which recognizes LPS along with TLR4, and CD163, the monocyte-‐ and macrophage-‐specific scavenger receptor for hemoglobin, are frequently shed in their soluble forms sCD14 and sCD163 during monocyte activation. Both are important biomarkers of microbial translocation and immune activation in HIV infection, and are associated with disease progression, morbidity and mortality (25-‐27). Furthermore, CD53 and CD81, membrane-‐organizing proteins from the tetraspanin family, have been implicated in HIV permissivity on CD14+CD16+ cells (28-‐30). In addition to the role played by monocyte surface protein expression in the pathogenesis of AIDS, cellular function is also altered in multiple ways during HIV infection. TLR expression is increased in chronic viraemic HIV-‐1 (29, 30), which induces higher responsiveness to pathogenic stimuli. As a consequence, these cells display aberrant cytokine production in different ways. IP-‐10 production by monocytes via TLR7/9-‐dependent pathways is strongly enhanced in vitro after virus stimulation (31); also, TNF-‐α production by a specific CD14+CD16high M-‐DC8 monocyte population is increased in response to LPS (32). When CD16+ monocytes isolated from untreated HIV-‐
1 infected patients are stimulated in vitro with commensal enteric Escherichia coli, IL-‐23 levels are significantly increased (33). However, IFN-‐γ and type-‐1 IFN responses are impaired after ex vivo CpG ODN stimulation of monocytes during viral infection (34, 35). Another characteristic of monocytes that has been extensively evaluated but has yielded 162
ESPÍNDOLA, M.S. some controversial data is the frequently observed dysfunction in phagocytosis of opportunistic pathogens, such as T. gondii, Candida pseudotropicalis, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum, C. neoformans and S. aureus (36-‐45). This impaired function is also accompanied by reduced microbicidal capacity (46), as well as the modulation of the apoptotic response (47) of monocytes and hMDM, which in general may depend on the pathogen and on the disease course. Altogether, these events may contribute to the immune dysfunction which may induce and perpetuate the systemic immune activation that underlies HIV pathogenesis and disease progression. Dendritic Cells – a strategic reservoir for the virus As well as monocytes, dendritic cells originate from the common granulocyte–
monocyte progenitors. But once in periphery, DCs work as professional APCs where they capture and process antigens, mature and then migrate to T cell-‐rich areas of lymphoid organs, which results in the activation of naïve and resting T cells, thus initiating the adaptive immune response (48). DCs are present in most tissues, but their presence in the skin, in the blood, and particularly in the mucosal surfaces, guarantees that these cells have the earliest contact with pathogens (including viruses) during infection (49). Thus, DCs play an important role in HIV infection because they are the cells that are initially infected during sexual transmission of the virus (50). These cells, especially follicular DCs, seem to act as long-‐term reservoirs, as they are able to trap and maintain large quantities of HIV on their surface for prolonged periods (51-‐53). In addition to their role in sexual infection by HIV-‐1, circulating blood CD11c+ myeloid and CD11c− plasmacytoid DCs are more permissive to ex-‐vivo infection than CD16+ or CD14+ monocytes or resting CD4+ T cells (54). Furthermore, DCs in blood and mucosa has been described as important virus carriers, which allows the virus to reach T cells harbored in the lymph nodes (55). This leap of HIV from DCs to T cells basically depends on one of two mechanisms: trans-‐
infection or cis-‐infection. HIV trans-‐infection is mediated by DCs that are not infected themselves but transfer captured viruses through infectious synapses mediated by DC-‐
SIGN receptors or exosomes, while cis-‐infection occurs when infected DCs transfer progeny viruses and involves de novo HIV replication (3). 163
ESPÍNDOLA, M.S. DCs express significant levels of HIV entry receptors that allow gp120 binding and attachment of virions (e.g., high amounts of chemokine receptors CCR5 and CXCR4 and low levels of CD4), which are considered the primary HIV receptors. However, some DC subsets express other receptors that also recognize gp120, facilitating HIV binding and infection. For example, Langerhans cells, a DC subtype, express C-‐type lectin receptors such as Langerin (CD207), DC-‐SIGN and DCIR (56). The expression of these receptors depends on the state of cell maturation; upon DC maturation, CCR5 levels are downregulated and CXCR4 is upregulated (54). Thus, the binding of HIV depends on the DC subtype, the state of cell maturation, the type of receptor involved in recognition and the interaction with other cells. The fact that the virus preferentially infects DCs has consequences for both innate and adaptive immunity, since DC infection alters maturation events and induces an imbalanced immune response. A common observation is that patients infected with HIV have a reduced number of peripheral blood DCs when compared to healthy individuals (57-‐60) at any stage of infection, but mainly during primary infection (59, 60), and this frequency is inversely correlated with plasma viral load (61). A previous study has also shown that HAART can restore pDCs, which is associated with a diminished viral load, indicating control of the infection (60). This reduction in the frequency of DCs may be caused by their homing to lymphoid organs (62); alternatively, they may be destroyed in the periphery by the virus, by CD8+ T cells or via other mechanisms, such as decreased DC production in bone marrow or blood monocyte precursors (60). DC phenotype also undergoes alterations when these cells are exposed to HIV. The interaction of DCs with the virus leads to increased expression of CD80, CD86, and CD40, costimulatory surface molecules, and HLA class II molecules, despite a reduction of HLA class I molecules and the appearance of the DC maturation marker CD83 (63). In addition to frequency and phenotype changes, HIV infection impairs the function of these cells, which has been reported by many research groups. For example, cytokine and chemokine production is reduced, as shown by decreased TNF-‐α, CCL3, CCL4, CCL5 and mainly IL-‐12 production upon TLR7/8 stimulation, which may result in impaired differentiation of Th1 cells (63-‐65). Despite reducing the production of pro-‐
inflammatory cytokines, type I IFNs such as IFN-‐α, are increased, especially in the early 164
ESPÍNDOLA, M.S. stages of infection. This production is mediated by pDCs from infected patients, which is also hyperactivated when stimulated with TLR7/8 ligands ex vivo (61, 66, 67). A study conducted in the 1990s using Mixed Lymphocyte Reaction assays showed no significant difference in the stimulation ability of DCs from infected patients and those of controls (68). These findings remain controversial, and recent studies have shown a dramatic reduction in the allogeneic stimulation capacity of DCs, which can be considered another important dysfunction of these cells (69-‐72). Together, these alterations in DC biology indicate that these cells are in a state of semi-‐maturation, which is characterized by increased expression of surface molecules, impaired cytokine production and reduced ability to stimulate acquired immune response (63, 73, 74). Therefore, as suggested by Fantuzzi (2004), it is crucial to identify strategies that interfere with the interaction between HIV and DCs to develop ways of activating the protective immune response instead of facilitating virus spread (63). Neutrophils – a controversial role during HIV infection Comprising around 50% to 70% of all circulating leukocytes in the human body, neutrophils are polymorphonuclear leukocytes generated in the bone marrow from the same precursors of monocytes and DCs. Once neutrophils are in the circulation they have a half-‐live of only a few hours. Acting as the first line of defense against some classes of microorganisms, neutrophils can ingest pathogens and kill them by releasing the content of the cytoplasmic granules or by the action of ROS released into the intracellular space. Another important mechanism driven by these cells to restrict infection and eliminate pathogens is NET formation, in which cellular DNA, histones, cytoplasmic granules and other proteins, such as myeloperoxidase and elastase, are released into the extracellular space and lead to microorganism death (75). Several factors have been associated with the breakdown of neutrophil hemostasis. It is well established that as a consequence of HIV infection and AIDS progression, about 35 -‐ 75% of patients present neutropenia with multifactorial etiology. One explanation for this is that the virus infects or infiltrates the bone marrow, which decreases the number of neutrophil progenitors. Moreover, neutrophil apoptosis is markedly accelerated in HIV patients. Furthermore, the drugs used in HIV treatment are myelosuppressive, which could also explain the neutropenia in treated patients (75). 165
ESPÍNDOLA, M.S. Concerning HIV infection, neutrophils have the ability to bind and enclose the virus. When it happens, cellular function is altered, resulting in increased host susceptibility to bacterial and fungal infections (76). HIV causes downregulation of cell adhesion molecules and reduces actin polymerization (77), cytokine production (78), chemotaxis (79-‐81), as well as leukotriene release (82). Patients with HIV have reduced ROS production, as well as low phagocytosis and bacterial killing (especially when CD4+ T cell levels are <200 cells/µl) (44, 76, 83, 84). However, other authors showed that ROS production is increased in HIV patients and may participate in oxidative injury, which has been implicated in the pathophysiology of the disease (77, 85, 86). When ROS production is induced by the virus through the recognition by TLR7/8 on the neutrophil membrane, it triggers NET formation to capture and kill the virus by a mechanism dependent on myeloperoxidase and α-‐defensin action. However, as an escape mechanism, the virus can induce dendritic cells to produce IL-‐10, which suppresses ROS and consequently interrupts NET (87). Neutrophils express unconventional CD4 molecules and also CXCR4 on their cell surface, allowing gp120 to bind and select for X4-‐tropic strains. Furthermore, HIV can bind CD4-‐negative neutrophils independently of gp120 ligation (88, 89). Interestingly, another study showed that inflammatory stimuli of concomitant unrelated infections induces neutrophil activation, which increases HIV binding and facilitates the propagation of infection (76). Neutrophils exert direct and indirect effects that affect T cell function. Human neutrophils constitutively express arginase, but during HIV infection, when the patient presents low CD4+ T cell counts, the expression of this compound is increased. Arginase excess in the system enhances L-‐arginine catabolism, which results in depletion of L-‐
arginine from the blood. Since L-‐arginine is essential for efficient T cell activation, the decrease in L-‐arginine results in impaired T cell responses (90). Recent data reveal that blood neutrophils from HIV-‐1-‐infected individuals express high levels of inhibitory PD-‐
L1 molecule that once recognized by T cells directly suppress their function via PD-‐
L1/PD-‐1 pathways (91). Considering that neutrophils are described as directly infected by HIV, their functions are clearly disrupted, but it remains to be established if these cells become more or less activated depending on the time course of infection, as this may predispose patients to opportunistic infections. 166
ESPÍNDOLA, M.S. Eosinophils – a cell to be more explored during HIV infection Under the signal of cytokines IL-‐3, IL-‐5, and GM-‐CSF, the common granulocyte–
monocyte progenitors differentiate in eosinophils (92). Eosinophils are granule-‐
containing cells that circulate in the blood with a half-‐life of approximately 18 hours. Under normal conditions, the eosinophil blood count is about 250 per mm3. However, during altered states, such as allergies, asthma and parasitic infections, the count may rise from a normal range of 0.3%-‐10% of total blood cells to >30% of total blood cells (93). Although eosinophilia was detected in some patients independent of other diseases or allergic processes (94), there are many cases of enhanced eosinophil counts occurring together with parasitic infections in HIV patients (95). It is important to note that HIV and parasite infections are co-‐endemic in developing countries, increasing the probability of co-‐infections (96). Further, eosinophilia has already been reported in HIV infection, mainly in patients with low CD4+ T cells, in this specific study, the increased eosinophil counts was associated with cutaneous disease and pruritus without parasite association (97). Another research identified that patients on HAART, despite having control of opportunistic infection, are commonly infected with intestinal parasites, which was associated with increased eosinophils (98). Human eosinophils express CD4 and CXCR4 receptors, making them susceptible to HIV infection (99, 100). Moreover, many individuals develop eosinophilia concomitant with the progression of clinically latent HIV infection to AIDS, as eosinophil counts increase by approximately eight fold (101). Therefore, there is a strong association between HIV progression and tissue damage and increased eosinophil counts, and this association warrants further study. Basophils/Mast cells – a possible reservoir for HIV Mast cells are important innate cells that act as sentinels. They have a strong ability to detect pathogens and signs of danger underneath epithelial and mucosal surfaces and to communicate within the tissue and with distant sites through the release of proinflammatory mediators (102). Furthermore, equally to eosinophils, they are key cells in pathological conditions including asthma and parasitic infections, through the 167
ESPÍNDOLA, M.S. binding of IgE to its high-‐affinity IgE surface receptor, FcεRI, which induces extensive degranulation (103). HIV-‐infected patients with elevated IgE have a worse prognosis (104, 105). Moreover, gp120 from HIV acts as a superantigen, interacting with the VH3 region of IgE (106) and inducing the release of histamine, IL-‐4 and IL-‐13 from human basophils and mast cells (107-‐109). By interacting with CCR3, the HIV Tat protein is a potent chemoattractant for human basophils and lung mast cells and induces upregulation of CCR3 receptors on these cells (110, 111). Furthermore, basophil/mast cells are also associated with increased allergic and adverse reactions to drugs in HIV-‐treated patients (112, 113). These reactions have been correlated with an imbalance in the Th1 and Th2 responses in HIV patients (114, 115). Although there is evidence for an important role for mast cells during HIV infection, there is no evidence of altered mast cell counts. Progenitor and mature basophil/mast cells that express CD4, CCR3, CCR5, and CXCR4 are susceptible to infection by an M-‐tropic HIV-‐1 isolate (116, 117). Recently, some studies provided in vivo evidence that tissue mast cells developed from infected circulating progenitors became a long-‐lived inducible reservoir of persistent HIV in infected patients even after HAART and are involved to the re-‐initiation of HIV-‐1 replication during latent infection (118, 119). Despite of crescent evidences proving the involvement of mast cells as reservoir (120), Nelson et al. (2009) failed to detect active virus replication in mast cells at tissue sites from HIV patients (121). Natural Killer Cells – a promising target to immunotherapy So far we have discussed about some cells of myeloid origin, which are generated from a common precursor in bone marrow. From this point, we will emphasize NK and T cells (specifically, NKT and γδ T cells), which have a common lymphoid origin in bone marrow. The clonogenic common lymphoid progenitor (CLP) originates ILCs (Innate lymphoid cells), B and T lymphocytes, accordingly to the transcriptional factors stimulated (122, 123). ILCs are a set of cells that share the characteristic to be essential in the combat of virus and tumor cells. This cell family is formed by cytotoxic and helper ILCs, that are respectively NK cells and ILC1, ILC2 and ILC3 (124) and in this review we limited our discussion to the NK cells. 168
ESPÍNDOLA, M.S. NK cells play a pivotal function in the innate immune system and are also involved in the regulation of adaptive immunity by promoting the maturation of DCs and Th1 cell polarization (125). These innate lymphoid cells constitute nearly 10% of peripheral blood lymphocytes in healthy individuals (126). However, in HIV infection, some studies described alterations in the function and count of this cell population, according to the stage of disease (127, 128). The NK cell subsets are defined according to the expression of the surface markers CD56 and CD16 (129) and in HIV infection, differences are observed in the proportion of these two surface markers. During the acute phase of HIV infection, before the development of adaptive immunity, NK cell numbers increase, and this appears to be associated with the initial reduction in the viral load. This increase is mainly due to the early expansion of the CD56dimCD16+ cell subset that represents the majority of NK cells encountered in the blood, nearly 90% of all NK cells. On the other hand, the minor population of NK cells (i.e., CD56brightCD16-‐ cells) is slightly decreased during this initial phase (127). As the infection progresses to the chronic phase, the CD56dimCD16+ NK cell population decreases and a non-‐functional NK cell subset characterized as CD56-‐CD16+ greatly increases (130, 131). This is most commonly seen among patients who do not receive HAART. It has been suggested that HAART can help recover NK cells, although the non-‐functional subset remains elevated (127). Viremic patients, whether or not they are progressors, display a similar amount of NK cells. However, elite controllers, who do not display significant detected viremia, present amounts of NK cells comparable to those observed in healthy donors (132). It is not known whether the phenotypic and functional changes seen in the NK cell population during HIV infection are due to the direct infection of these cells or if they are a consequence of the disease in general. In addition to CXCR4 and CCR5 co-‐
receptors, NK cells may express the CD4 molecule, providing ample opportunities for viral infection (133). Whether directly or indirectly, HIV infection induces functional alterations in NK cells. One of the first studies analyzing NK cell phenotype during HIV infection described that the decrease in CD16 expression might disturb the cytotoxic function of NK cells (130). In addition, the persistent viremia has been associated to aberrant expression of NK cell receptors, such as a decrease of natural cytotoxicity receptors, including NKp30, NKp46 and NKp44. Also, some inhibitory receptors such as KIR2DL2/p58.2, KIR2DL1/p58.1 and KIR3DL1/p70 are increased during infection. 169
ESPÍNDOLA, M.S. Although alterations may differ between studies, mainly because of the disease state of the patient and the subset of NK cells analyzed, no changes have been reported in the expression of the following molecules: NKp80, 2B4 and NTB-‐A (134). Altogether, we may imply that increased expression of inhibitory receptors in parallel with a decrease of activating receptors renders NK cells unresponsive and dysfunctional during HIV infection. Chronic immune activation is an important feature of HIV infection and is strongly associated with disease progression (10). A recent study highlighted the association between NK cell activation and HIV disease progression (128) and found an increase of cell activation markers CD38 and HLA-‐DR, especially those from the CD56dimCD16+ subset, which correlated positively with plasma viral load and negatively with CD4+ T cell counts. In contrast, another study showed that NK cell activation was not correlated with the improvement of immunological parameters and that the NK cell subset CD56dimCD16+ remained activated even in patients with reduced viral loads (135). Despite the NK cell activation seen in patients with progressive disease, these cells remain nonfunctional, as their cytotoxic activity is decreased and the production of some cytokines is impaired. The detection of some cytokines such as IFN-‐γ and TNF-‐α produced by NK cells were reduced in viremic patients and this hampers the killing of infected cells and/or c an disturb the migration and maturation of DCs, thus promoting virus replication (131, 134). In addition, NK cells increase IL-‐10 production, which is associated with an increase in the number of inhibitory receptors on these cells (136, 137). A key pathway for NK suppression of HIV replication is through the production of chemokines CCL3, CCL4 and CCL5, which are ligands for CCR5. These chemokines block the entry of R5 viruses into target cells by competitive inhibition of receptor binding. This finding is confirmed by the fact that the production of these chemokines by NK cells is largely reduced in viremic patients compared to aviremic ones (138). Interestingly, some authors have suggested that the modifications induced by the virus involving NK cells can contribute to the CD4+ T cell loss that is characteristic of HIV infection. A highly conserved motif of the viral protein gp41 induces the expression of the NKp44 ligand on CD4+ T cells during infection, and this promotes the recognition 170
ESPÍNDOLA, M.S. and killing of CD4+ T cells by NK cells. Therefore, the expression of NKp44L has been correlated to CD4+ T cell depletion and increased viral load (139, 140). In some patients, relatively better control of viral replication has been associated with the expression of certain NK cell receptors and some HLA molecules. The expansion of NK cells expressing KIR3DS1 and KIR3DL1 in patients who express HLA-‐
Bw4-‐80I is related to the suppression of virus replication as well as a more efficient control of the infection (141). This observation highlights the influence of genotype on the control of HIV viremia and disease progression. Another important function associated to NK cells and to CD16+ cells in general is the ADCC of infected cells expressing HIV antigens on its surface. The increased levels of ADCC inducing antibodies have been correlated to slow progression of disease (142). Recently, the Thai RV144 vaccine trial showed a modest protection mainly because of ADCC (143). Besides this, it is interesting to investigate NK cell alterations after vaccine regimens as this innate cell has also demonstrated memory features (144) that could be targeted in order to prevent and also treat HIV infection. Innate T lymphocytes During T cells ontogeny there are two strains of T cells that originate in the thymus. These cells arise from a common lymphoid precursor and they are uniquely defined by the expression of different TCRs, which can be composed by αβ or γδ chains. Conventional αβ cells constitutes the adaptive immunity and cover the majority of T lymphocytes, which express polyclonal TCR on its surface to recognize a range of peptide antigens associated with MHC I or II. Other small subpopulations of αβ or γδ T cells are characterized as innate lymphocytes and are described here. NKT – a key immunoregulatory cell subset Natural killer T cells (NKT) are defined as a small subpopulation of innate-‐like αβ T lymphocyte that co-‐express natural killer (NK) receptors together with αβ T cell receptors (TCR). NKT develop from double positive lymphocytes (CD4+CD8+) that interact with endogenous ligands presented by CD1d+ cells from thymus. In humans, the majority of NKT cells express a semi-‐invariant αβ TCR composed of a Vα24-‐Jα18 TCRα chain that is preferentially coupled with a Vβ11 TCRβ chain. These cells are mainly 171
ESPÍNDOLA, M.S. involved in the innate immunity recognition of glycolipid antigens presented by the MHC class I-‐related glycoprotein CD1d and may secrete cytokines of both the Th1 and Th2 phenotypes. After thymic emigration, NKT cells represent 0.003 to 0.78% of peripheral blood lymphocytes, but are found in greater numbers in the liver, ranging from 5 to 25% of total lymphoid population in this tissue (145, 146) A subset of NKT cells express the CD4 molecule, which renders it susceptible to HIV-‐1 infection (mainly the R5-‐tropic strain) (147). Therefore, most CD4+ NKT cells are depleted during acute HIV-‐1 infection, contributing to the establishment of persistent and chronic infection (148). The reduction in CD4+ NKT cells has been correlated to higher viremia in infected individuals (149). Moreover, NKT cell function is impaired by decreased activation of dendritic cells that down-‐regulate CD1d expression when infected by HIV-‐1 (150). Antiretroviral treatment partially restore NKT cell numbers, but the restoration of NKT CD4+ subset requires more than a year to be complete. As consequence, it is observed a disproportionate balance, with a large number of NKT CD4-‐negative subset, characterized by a tolerogenic/atopic profile, which is believed to contribute to the inappropriate immune activation state that lead to the development of opportunistic infections in HIV-‐1 infected patients (151). Given that NKT cells play an important role in avoiding autoimmune diseases and in anti-‐tumor responses, it is believed that the loss of NKT CD4+ cells in HIV-‐1 infected individuals strongly impacts these patients immune response. This loss also contributes to the onset of autoimmune diseases and increases the incidence of tumors such as Kaposi’s sarcoma and non-‐Hodgkin’s lymphoma in AIDS patients (152). γδ T cells Gamma-‐delta T cells are considered innate immune cells because they participate in the initiation of the immune response and are able to respond quickly following stimulation without clonal expansion (153). Among innate immune cells, γδ T cells play a critical role in the host response against infectious diseases. They can link innate and acquired responses (154, 155), mainly in the presence of non-‐protein molecules such as glycolipids and phosphoantigens, without the need for antigen-‐presenting cells (156, 157). The major γδ T cell subset (60-‐90%) expresses the Vγ9 variable segment associated with the δ2, 172
ESPÍNDOLA, M.S. and these cells, which play a key role in early HIV infection, are known as Vγ9Vδ2 T cells. Normally, Vδ2 subsets predominate, with a Vδ1/ Vδ2 ratio of 0.35 for healthy donors (158). However, in HIV patients, a Vδ1/Vδ2 inversion was observed in peripheral blood mononuclear cells when compared with non-‐infected individuals. (159). This inverted profile is due to a loss of Vγ9Vδ2 T cells by apoptosis (160), which is induced by the direct binding of HIV to CCR5 and integrin α4β7, molecules found on the surface of γδ T cells (161). These cells were also found to be reduced in the mucosa (162). There is a direct correlation between Vγ9Vδ2 T cell number and CD4+ T cell counts in HIV progression, which was inversely related to the viral load (163). Moreover, after HIV infection, the remaining Vγ9Vδ2 T cells entered into anergy and were unable to expand or perform their effector functions, with a reduced production of cytokines such as IFN-‐γ and TNF-‐α after TCR stimulation (159). The anergy of γδ T cells, which precedes changes in CD4+ T cell numbers, was one of the immune evasion mechanisms described in HIV infection (164). The reduced γδ T cells function may be caused by decreased CD3ζ co-‐receptor expression, which was recently observed in HIV patients (165). The greatly reduced number of Vγ9Vδ2 T cells during HIV infection may also contribute to NK cell defects, once the interaction of NK and Vγ9Vδ2 T cells via CD137 stimulates NK cytotoxicity (166). Less functional NK cells lead to the accumulation of mature dendritic cells and an increased potential for chronic inflammation, which is characteristic of HIV disease (167, 168). The Vγ9Vδ2 T cell numbers and their impaired function are directly dependent on acute HIV replication, and could be partially recovered after HAART and the control of virus replication (169). Moreover, the lower levels of γδ T cells have been associated with shorter life expectancy in AIDS patients (170). Concluding Remarks In this review of the literature, we addressed the important role of innate immune cells in the context of HIV infection. Understanding innate cell alterations in a disease that is classically marked by the loss of adaptive response can help to explain the pathogenesis. The Figure 1 summarizes the findings outlined in this manuscript to expose an overview of the innate immune system in the setting of HIV infection. Furthermore, the improvement of the antiretroviral therapy protocols currently used around the world could be based on the knowledge of the role of innate immune cells in 173
ESPÍNDOLA, M.S. the disease, and these therapies should aim to completely eliminate the viral reservoirs and reverse the cellular alterations induced by the virus. Authorship Frantz, FG conceived, wrote and revised the manuscript, Espíndola MS wrote a text and assembled the final manuscript and figure, Soares LS revised the final manuscript and wrote a text, Lima LJG, Zambuzi FA, Cacemiro MC, and Brauer VS wrote a text. Acknowledgments This work was supported by São Paulo Research Foundation (FAPESP, grants #2011/12199-‐0; #2011/12512-‐0; #2011/24026-‐3; #2012/02799-‐3). The authors are grateful to Caroline Fontanari for her technical support. Conflict of Interest Disclosure The authors declare that they have no competing interests. References 1. Shattock RJ, Moore JP. Inhibiting sexual transmission of HIV-‐1 infection. Nature reviews Microbiology. 2003;1(1):25-‐34. 2. Zhang Z, Schuler T, Zupancic M, Wietgrefe S, Staskus KA, Reimann KA, et al. Sexual transmission and propagation of SIV and HIV in resting and activated CD4+ T cells. Science. 1999;286(5443):1353-‐7. 3. Wu L, KewalRamani VN. Dendritic-‐cell interactions with HIV: infection and viral dissemination. Nature reviews Immunology. 2006;6(11):859-‐68. 4. Engelman A, Cherepanov P. The structural biology of HIV-‐1: mechanistic and therapeutic insights. Nature reviews Microbiology. 2012;10(4):279-‐90. 5. Geijtenbeek TB, Kwon DS, Torensma R, van Vliet SJ, van Duijnhoven GC, Middel J, et al. DC-‐SIGN, a dendritic cell-‐specific HIV-‐1-‐binding protein that enhances trans-‐
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ESPÍNDOLA, M.S. Figure Legend Figure 1. Schematic representation of HIV infection effects and action on innate immune system. Each innate immune cell reacts in a unique manner following HIV infection, early or late in pathogenesis. Here, we described differences in cell frequency, showing whether cell types are increased or reduced, and whether there are alterations in specific cell subsets. We also pointed the main altered functions of each innate cell and their role in HIV pathogenesis, indicating their major contribution to the disease progression. N.R.: Not reported. 186
ESPÍNDOLA, M.S. Anexo II - Manuscritos publicados ou aceitos para publicação realizados
em colaboração durante o período de doutorado
187
ESPÍNDOLA, M.S. 188
ESPÍNDOLA, M.S. Anexo III – Liberação do Comitê de Ética em Pesquisa para início do
estudo
191
ESPÍNDOLA, M.S. Anexo IV – Termo de Consentimento de Indivíduos Controles
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO - Campus Universitário Monte Alegre
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
NOME
imunológicas
DA
de
PESQUISA:
“Avaliação
macrófagos
de
de
pacientes
alterações
epigenéticas
infectados
pelo
vírus
e
da
imunodeficiência humana em resposta ao Mycobacterium tuberculosis”.
PESQUISADORES RESPONSÁVEIS:
Milena Sobral Espíndola
Prof. Dra. Fabiani Gai Frantz
Gostaríamos de convidá-lo a participar deste projeto de pesquisa. Este projeto faz parte de uma linha
de pesquisa que é desenvolvida pela Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da USP de Ribeirão
Preto em conjunto com os pesquisadores do Hemocentro e do Hospital das Clínicas, com o objetivo
de avaliar as alterações de função existentes em monócitos, que são células do sangue periférico, de
pacientes infectados ou não com o HIV. A sua participação é voluntária. Para participar, é
necessário ler atentamente este documento e ouvir nossas explicações em caso de dúvidas. Se
estiver interessado em participar, solicitaremos que assine este documento. Caso não queira
participar, o seu atendimento no Hemocentro continuará o mesmo, sem prejuízo nenhum.
O que são monócitos?
Os monócitos são células de defesa do corpo importantes para combater doenças oportunistas.
Como iremos avaliar suas células?
Utilizaremos as células do seu sangue, os monócitos, e iremos avaliar as principais funções dessa
célula, todas relacionadas à proteção. Por exemplo, queremos saber o quanto sua célula consegue
capturar e matar uma bactéria, neste caso, o bacilo da tuberculose. Além disso, queremos saber a
capacidade de seus monócitos de produzir citocinas, que são proteínas que ajudam na resposta
contra todos os tipos de microorganismos. Por último, vamos avaliar o DNA das suas células, para
utilizá-lo como controle de modificações em partes do seu DNA, que chamamos de alterações
epigenéticas. O estudo dessas alterações é muito importante para entendermos como o HIV atua no
nosso sistema imune e como podemos melhorar futuramente o tratamento dos pacientes infectados.
Como você, doador de sangue, vai participar da pesquisa?
A pessoa que participar desta pesquisa deverá doar 40 mL de sangue, que corresponde a 3 colheres
de sopa. Esta quantidade de sangue retirada não será prejudicial à saúde. A coleta de sangue será
realizada no braço, no processo de doação de sangue, juntamente com as amostras usualmente
coleadas. Os riscos para você, ao participar da pesquisa, são mínimos, e poderão ser decorrentes da
192
ESPÍNDOLA, M.S. picada da agulha na coleta de sangue, pois você poderá sentir um desconforto ou dor no local, e
poderá aparecer uma mancha roxa (hematoma) no local.
Por que esta pesquisa está sendo feita?
Esta pesquisa trará benefícios para o entendimento de como as células de defesa de um indivíduo
saudável ou infectado com HIV reagem em resposta a uma infecção oportunista, que é gerada por
microorganismos que causam doenças em pessoas com o sistema imune debilitado. Nesse caso,
iremos testar suas células em resposta ao Mycobacterium tuberculosis, agente causador da
tuberculose, doença frequentemente encontrada em pacientes HIV+. O teste será realizado em
laboratório com os monócitos dos pacientes, separados do sangue periférico. Sendo assim, os
participantes desta pesquisa não sofrerão nenhum risco de contaminação.
Para a realização deste trabalho, precisamos da colheita de sangue de pessoas que NÃO estejam
contaminadas com o vírus HIV e que também não estejam infectados por fungos ou bactérias
oportunistas, incluindo o bacilo da tuberculose.
Sua participação será importante para integrar o grupo controle negativo desta pesquisa. Não
haverá nenhuma despesa e nenhum ganho em dinheiro. Afirmamos que os dados obtidos serão
guardados de maneira sigilosa e que os nomes dos participantes não serão divulgados em nenhum
momento, e os mesmos serão informados dos resultados finais da pesquisa. Esta pesquisa não trará
benefício direto ao sujeito envolvido, ficando a critério do mesmo a desistência em participar da
pesquisa a qualquer momento, sem nenhum prejuízo ao seu seguimento hospitalar.
Qualquer dúvida sobre esta pesquisa, entrar em contato com Milena ou Dra. Fabiani pelo
telefone (16) 3602 0241.
Eu, ____________________________________________________________________
RG n°: ____________________________, autorizo a retirada de 40 ml do meu sangue da veia do
braço para a realização de pesquisa. Fui informado (a) sobre o procedimento e que o volume
retirado não causará dano a minha saúde. Fui informado (a) também que a finalidade dessa
pesquisa é de entender como o vírus se comporta e promove o aparecimento das infecções.
Ribeirão Preto, _____ de _________________ de 20___.
_______________________________
Assinatura do paciente – Registro
_______________________________________
Milena S. Espíndola/ Prof. Dra. Fabiani Frantz
Pesquisadores Responsáveis
193
ESPÍNDOLA, M.S. Anexo IV – Termo de Consentimento de Pacientes HIV+
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO - Campus Universitário Monte Alegre
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
NOME
imunológicas
DA
de
PESQUISA:
“Avaliação
macrófagos
de
de
pacientes
alterações
epigenéticas
infectados
pelo
vírus
e
da
imunodeficiência humana em resposta ao Mycobacterium tuberculosis”.
PESQUISADORES RESPONSÁVEIS:
Milena Sobral Espíndola
Prof. Dra. Fabiani Gai Frantz
Gostaríamos de convidá-lo a participar deste projeto de pesquisa. Este projeto faz parte de uma linha
de pesquisa que é desenvolvida pela Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da USP de Ribeirão
Preto em conjunto com os pesquisadores do Hemocentro e do Hospital das Clínicas, com o objetivo
de avaliar as alterações de função existentes em monócitos, que são células do sangue periférico, de
pacientes infectados ou não com o HIV. A sua participação é voluntária. Para participar, é
necessário ler atentamente este documento e ouvir nossas explicações em caso de dúvidas. Se
estiver interessado em participar, solicitaremos que assine este documento. Caso não queira
participar, o seu seguimento no ambulatório continuará o mesmo, sem prejuízo nenhum para o seu
tratamento.
O que são monócitos?
Os monócitos são células de defesa do corpo importantes para combater doenças oportunistas.
Como iremos avaliar suas células?
Utilizaremos as células do seu sangue, os monócitos, e iremos avaliar as principais funções dessa
célula, todas relacionadas à proteção. Por exemplo, queremos saber o quanto sua célula consegue
capturar e matar uma bactéria, neste caso, o bacilo da tuberculose. Além disso, queremos saber a
capacidade de seus monócitos de produzir citocinas, que são proteínas que ajudam na resposta
contra todos os tipos de microorganismos. Por último, vamos avaliar o DNA das suas células, pra
saber se o HIV induz alguma modificação em partes do seu DNA, que chamamos de alterações
epigenéticas. O estudo dessas alterações é muito importante para entendermos como o vírus atua no
nosso sistema imune e como podemos melhorar futuramente o tratamento dos pacientes infectados.
Como você, paciente, vai participar da pesquisa?
A pessoa que participar desta pesquisa deverá doar 40 mL de sangue, que corresponde a 3 colheres
de sopa. Esta quantidade de sangue retirada não será prejudicial à saúde. A coleta de sangue será
realizada no braço, com seringas e agulhas descartáveis por um profissional capacitado. Os riscos
para você, ao participar da pesquisa, são mínimos, e poderão ser decorrentes da picada da agulha na
194
ESPÍNDOLA, M.S. coleta de sangue, pois você poderá sentir um desconforto ou dor no local, e poderá aparecer uma
mancha roxa (hematoma) no local.
Por que esta pesquisa está sendo feita?
Esta pesquisa trará benefícios para o entendimento de como as células de defesa de um indivíduo
saudável ou infectado com HIV reagem em resposta a uma infecção oportunista, que é gerada por
microorganismos que causam doenças em pessoas com o sistema imune debilitado. Nesse caso,
iremos testar suas células em resposta ao Mycobacterium tuberculosis, agente causador da
tuberculose, doença frequentemente encontrada em pacientes HIV+. O teste será realizado em
laboratório com os monócitos dos pacientes, separados do sangue periférico. Sendo assim, os
participantes desta pesquisa não sofrerão nenhum risco de contaminação. A coleta de sangue deverá
ser feita em indivíduos HIV+ que não estejam infectados por fungos ou bactérias oportunistas.
Não haverá nenhuma despesa e nenhum ganho em dinheiro. Afirmamos que os dados
obtidos serão guardados de maneira sigilosa e que os nomes dos participantes não serão
divulgados em nenhum momento, e os mesmos serão informados dos resultados finais da pesquisa.
Esta pesquisa não trará benefício direto ao sujeito envolvido, ficando a critério do mesmo a
desistência em participar da pesquisa a qualquer momento, sem nenhum prejuízo ao seu
seguimento hospitalar.
Qualquer dúvida sobre esta pesquisa, entrar em contato com Milena ou Dra. Fabiani pelo
telefone (16) 3602 0241.
Eu, ____________________________________________________________________
RG n°: ____________________________, autorizo a retirada de 40 ml do meu sangue da veia do
braço para a realização de pesquisa. Fui informado (a) sobre o procedimento e que o volume
retirado não causará dano a minha saúde. Fui informado (a) também que a finalidade dessa
pesquisa é de entender como o vírus se comporta e promove o aparecimento das infecções.
Ribeirão Preto, _____ de _________________ de 20___.
_______________________________
Assinatura do paciente – Registro
_______________________________________
Milena S. Espíndola/ Prof. Dra. Fabiani G. Frantz
Pesquisadores Responsáveis
195

MILENA SOBRAL ESPÍNDOLA Aspectos imunológicos e

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