THESE Décembre 2007 Edition Impression Finale

Transcription

THESE
Présentée devant
L’INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE TOULOUSE
en vue de l’obtention du
DOCTORAT
Spécialité : Microbiologie et Biocatalyse industrielle
par
Olivier GUERRINI
Ingénieur INSA
Étude des relations structure-fonction de la
Glycéraldéhyde 3-phosphate oxydoréductase
et
Ingénierie métabolique de Clostridium
acetobutylicum pour la production de
Biohydrogène
Soutenue le 16 novembre 2007 devant la commission d’examen :
M. A. MAGALON
M. JM. MOULIS
M. N. LINDLEY
M. B. GUIGLIARELLI
M. L. BONIFACE
Mme. L. GIRBAL
M. SOUCAILLE
Chargé de Recherche CNRS, Marseille
Directeur de Recherche CEA, Grenoble
Directeur de Recherche CNRS, Toulouse
Professeur Université Aix-Marseille I
Ingénieur ADEME, Angers
Chargée de Recherche CNRS, INSA Toulouse
Professeur, INSA Toulouse
Rapporteur
Rapporteur
Examinateur
Examinateur
Invité
Co-Directrice
Directeur
Thèse préparée au Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, UMRCNRS 5504, UR-INRA du département de Génie biochimique de l’INSA de Toulouse.
Nom : GUERRINI
TITRE:
Etude
des
Prénom : Olivier
relations
structure-fonction
de
la
Glycéraldéhyde
3-phosphate
oxydoréductase et Ingénierie métabolique de Clostridium acetobutylicum pour la
production de Biohydrogène
Thèse de Doctorat, Spécialité : Microbiologie et Biocatalyse industrielle, soutenue le 16 novembre 2007 à
l’INSA de Toulouse, 257 pages.
N° d’ordre : 895
RESUME :
La bactérie Clostridium acetobutylicum est l’un des meilleurs microorganismes producteurs d’hydrogène.
Elle nécessite toutefois une amélioration de son rendement de conversion du glucose en hydrogène avant de
pouvoir être utilisée dans un bioprocédé industriel économiquement viable. Il est possible de lever ce verrou
métabolique en déviant une partie supplémentaire du flux électronique de la glycolyse vers la formation
d’hydrogène par l’introduction dans le métabolisme central de la bactérie d’une Glycéraldéhyde 3-phosphate
oxydoréductase (GAPOR), une tungsto-enzyme atypique issue d’archaea hyperthermophiles.
La création de cette nouvelle chaîne de transfert électronique implique l’interaction de trois protéines
clés: la GAPOR; un transporteur d’électrons: la Ferrédoxine, et l’accepteur final responsable de la production
d’hydrogène: l’Hydrogénase. Des améliorations significatives ont ainsi été apportées au système d’expression
hétérologue de la GAPOR afin d’obtenir une enzyme stable et fonctionnelle. Le rôle essentiel de l’import du
tungstène dans la cellule hôte a été souligné, ainsi que la synthèse et l’incorporation des différents cofacteurs
dans la protéine.
La ferrédoxine étant l’intermédiaire de cette nouvelle chaîne, il est indispensable qu’elle soit capable
d’interagir efficacement avec la GAPOR mais également avec l’hydrogénase à fer native de C. acetobutylicum.
Une analyse comparative des activités de réduction de plusieurs ferrédoxines clostridiales et d’archaea par
l’hydrogénase a permis de confirmer la flexibilité naturelle de cette enzyme vis-à-vis de ce type de partenaire
redox et de mettre en évidence la ferrédoxine CAC0303 comme étant potentiellement le meilleur candidat dans
le cadre de l’approche d’ingénierie métabolique envisagée. L’influence des différents facteurs biochimiques et
biophysiques qui gouvernent le transfert électronique lors de l’interaction entre ces deux protéines a été étudié et
a notamment fait l’objet d’une discussion approfondie.
MOTS CLES :
hydrogène, biohydrogène, clostridium acetobutylicum, ingénierie métabolique, GAPOR, glycéraldéhyde
3-phosphate oxydoréductase, ferrédoxine, GAPDH.
Cette thèse a été préparée au Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés (UMR CNRS
5504, UMR INRA 792) de l’l'INSA de Toulouse.
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TITLE: Structure-fonction study of Glyceraldehyde 3-phosphate oxidoreductase and metabolic
engineering of Clostridium acetobutylicum for Biohydrogen production.
ABSTRACT:
Clostridium acetobutylicum is one of the most efficient reported micro-organism for hydrogen
production. However, it requires the improvement of its hydrogen production yield from glucose before being
used in an industrial bioprocess economically attractive. It is possible to remove this metabolic restriction by
diverting an additional part electronic flow of glycolysis to the formation of hydrogen by the introduction in the
central metabolism a 3-phosphate Glyceraldehyde oxidoreductase (GAPOR), an atypical tungsto-enzyme present
in some hyperthermophilic archea.
The creation of this new electronic chain involves the interaction between three key proteins: a GAPOR, a
specific electron carrier: Ferredoxin, and a Hydrogenase enzyme, the final electron acceptor and the catalyst of
the hydrogen synthesis.
Significant improvements have been achieved to the heterologous system expression of GAPOR in order to
obtain a stable and a functional enzyme. The essential contribution of tungsten import into the host cell,
cofactors synthesis and incorporation into the protein was demonstrated.
The shuttle protein ferredoxin should be able to efficiently interact with both GAPOR and
C. acetobutylicum hydrogenase. We have selected several ferredoxins naturally present in the in vivo
surrounding of either GAPOR or hydrogenase, and compare their reduction rates by the C. acetobutylicum iron
hydrogenase. Although the observed rates confirmed the natural substrate flexibility of iron hydrogenase, the
ferredoxin CAC0303 was identified as a potential best partner than the others for the selected metabolic
engineering strategy. The influence of different biochemical and biophysical factors that govern the electronic
transfer between these two proteins has been particularly studied and discussed.
KEY WORDS :
hydrogen, biohydrogen, clostridium acetobutylicum, metabolic ingineering, GAPOR, glyceraldéhyde
3-phosphate oxydoreductase, ferredoxin, GAPDH.
This work has been prepared in the biological engineering and process laboratory (UMR CNRS 5504, UMR
INRA 792) in the INSA Toulouse.
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« L'imprévisible est dans la nature même de l'entreprise scientifique.
Si ce qu'on va trouver est vraiment nouveau, alors c'est par définition
quelque chose d'inconnu à l'avance. »
François Jacob
Le jeu des possibles, 1981.
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A mes chers parents,
pour leur soutien et leur affection indéfectibles
indéfectibles durant ces longues études,
Je dédie tout particulièrement cette thèse à mon Père, pour m’avoir
communiqué très tôt le goût des sciences et les fondements de l’esprit
scientifique.
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A Emmanuelle,
Pour ta présence,
présence, ta patience sans faille et pour avoir partagé chaque
moment de ces quatre années de thèse avec moi.
moi.
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Remerciements
Ma thèse se termine, c’est une page qui se tourne, j’aimerais ici trouver le ton juste
pour remercier tous ceux qui m’ont formé, soutenu et qui ont croisé mon chemin tout au long
de cette aventure.
L’ensemble des travaux présentés dans ce mémoire a été réalisé au laboratoire
d’ingénierie des systèmes biologiques et des procédés de l’INSA de Toulouse. Je tiens donc
tout d’abord à remercier Mr. Nic LINDLEY, directeur du LISBP de m’avoir accueilli au sein de
son laboratoire et de m’avoir fait l’honneur de présider mon jury de thèse.
Je suis très sensible à l’honneur que m’ont fait Mr Jean-Marc MOULIS et Mr Axel
MAGALON en acceptant d’être les rapporteurs de ce travail de thèse. Je les remercie
vivement pour les échanges passionnants que nous avons eus le jour de la soutenance ainsi
que pour la qualité de leurs remarques sur le manuscrit.
Je remercie également le CNRS et l’ADEME pour avoir financé ce travail ainsi que son
représentant Léonard BONIFACE pour avoir suivi cette thèse et participé au jury.
Je remercie mon directeur de thèse Philippe SOUCAILLE pour m’avoir accueilli dans
son équipe et pour m’avoir proposé cet ambitieux sujet de thèse.
J’exprime toute ma gratitude à Laurence GIRBAL, ma co-directrice de thèse, pour sa
contribution scientifique et technique sans laquelle il n’aurait pas été possible d’atteindre les
objectifs de cette thèse de manière satisfaisante ainsi que pour ses qualités humaines si
précieuses dans les moments difficiles inhérents à tout travail de recherche.
Je vous remercie pour vos compétences, votre soutien et votre attention constants à mon
égard.
Je remercie le Professeur Bruno GUIGLIARELLI pour sa participation au jury et pour
m’avoir accueilli dans son équipe durant ces quelques jours de collaboration. Je le remercie
vivement pour avoir mis à ma disposition sans retenue les compétences scientifiques de ses
équipes du BIP de Marseille. Je n’oublie pas de remercier Melle Bénédicte BURLAT pour sa
générosité, ses compétences et pour tout ce qu’elle a pu m’apporter durant cette
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collaboration scientifique fructueuse, ainsi que Christophe LEGER pour la qualité, la
pertinence et l’originalité de son travail.
Je remercie M. Jacques MEYER du CEA de Grenoble pour ses conseils et pour avoir
suivi ce travail.
J’ai une pensée toute particulière pour Claude MARANGES qui m’a suivi, soutenu et si
bien conseillé durant mes années d’élève ingénieur et offert par la suite la possibilité
d’assurer des travaux pratiques et dirigés, et ainsi connaître les plaisirs de l’enseignement,
pour finalement y prendre goût.
J’exprime toute ma gratitude aux Professeurs Pierre MONSAN et Frédéric BARRAS
qui ont marqué mes études par la qualité de leurs enseignements et pour avoir contribué à
entretenir la flamme de la recherche dans mon esprit.
Je remercie également les personnes qui ont jalonné ma formation de chercheur et
particulièrement M. Didier ZERBIB pour la qualité de son encadrement et pour tout ce qu’il a
pu m’apprendre durant ces six mois de collaboration. Je le remercie également pour les
discussions scientifiques nombreuses et passionnantes que nous avons eues ainsi que pour
son professionnalisme et sa rigueur scientifique qui m’ont montré le chemin à suivre.
J’espère que nous aurons un jour le plaisir de retravailler ensemble.
Je n’oublie pas de remercier les personnes de l’équipe et du laboratoire qui ont
contribué de près ou de loin à ce travail et dont certaines sont devenues des amis : Fabien,
Stéphane, Florence, Marie, Maria, Clément, Mylène, Sophie, Julien, les Mathieu. La liste est
encore longue, alors j’espère n’en oublier aucun : Alain, Christian, Peco, Valérie, Michel
Rossignol, Isabelle A, Isabelle M, Marie-Ange, Adilia, Olivier, Hervé, Grégory, Vincent,
Romain et Céline.
Je remercie enfin M. Philippe MEUNIER pour sa confiance et pour son soutien durant
ces longs mois de rédaction du manuscrit en parallèle de mes activités de recherche au sein
du groupe Gaz de France. Je n’oublie pas mes nouveaux collaborateurs et amis pour le
soutien et l’amitié qu’ils m’ont témoignés durant cette année de transition.
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Table des Matières
CHAPITRE I.
Présentation du projet de Recherche .............. 28
1.Introduction........................................................................................... 28
2.Objectifs et programme scientifique ...................................................... 30
3.Objectifs et enjeux de la filière .............................................................. 32
CHAPITRE II.
Le Biohydrogène, un vecteur d’énergie durable
………………………………………………….36
1.Introduction........................................................................................... 36
2.Contexte et enjeux................................................................................. 36
2.1
Enjeux environnementaux ......................................................................37
2.2
Enjeux énergétiques ................................................................................38
3.Les procédés de production d’hydrogène............................................... 40
3.1
Statut de la production d’hydrogène dans le monde en 2006 ................40
3.2
Procédés de production conventionnels..................................................40
3.3
Procédés thermochimiques......................................................................41
3.4
Procédés biotechnologiques.....................................................................41
CHAPITRE III.
Production d’hydrogène par Clostridium
acetobutylicum ...................................................... 44
1.Présentation de la bactérie C. acetobutylicum........................................ 44
2.Physiologie de C. acetobutylicum.......................................................... 45
3.Voies et gènes du métabolisme primaire de C.acetobutylicum : ............ 45
3.1
La production des acides (acétate et butyrate).......................................47
3.2
La production des solvants......................................................................47
3.3
Métabolisme énergétique.........................................................................48
4.Ingénierie métabolique de C. acetobutylicum : ...................................... 51
5.Les hydrogénases : ................................................................................ 52
5.1
Rôle des hydrogénases.............................................................................52
5.2
Localisation des hydrogénases ................................................................53
5.3
Classification des hydrogénases ..............................................................54
5.4
Les hydrogénases à fer ............................................................................54
6.Les Ferrédoxines : ................................................................................. 68
CHAPITRE IV.
La Glycéraldéhyde 3-phosphate
oxydoréductase : une AOR à tungstène ............ 80
1.Généralités sur les tungstoenzymes : ..................................................... 80
2.Rôle Biologique du tungstène................................................................ 80
3.La famille des aldéhydes oxydoréductases ............................................ 82
3.1
Rôle physiologique et propriétés catalytiques ........................................84
3.2
Structure et mécanisme biochimique......................................................89
3.3
Données biophysiques : ...........................................................................94
3.4
Interaction des AOR avec leur partenaire physiologique : la
Ferrédoxine .........................................................................................................95
4.Transport du tunsgtène et maturation des AOR : ................................... 97
4.1
Synthèse et régulation du cofacteur tungstoptérine ...............................98
4.2
Transport du tungstène ...........................................................................99
4.3
Spécificité du métal................................................................................102
CHAPITRE V.
Matériel et Méthodes : .................................... 106
1.Souches et plasmides utilisés............................................................... 106
2.Conservation des souches d’E. coli ..................................................... 108
3.Conservation de C. acetobutylicum ..................................................... 108
4.Milieux de culture et conditions de croissance..................................... 108
16
4.1
C. acetobutylicum ...................................................................................108
4.2
Escherichia coli ......................................................................................110
5.Préparation des extraits cellulaires aérobie .......................................... 112
6.Préparation des extraits cellulaires anaérobie ...................................... 112
7.Techniques de génie génétique ............................................................ 113
7.1
Isolement et manipulation des acides nucléiques .................................113
7.2
Techniques d’analyse des acides nucléiques .........................................116
8.Techniques de purification des protéines ............................................. 121
8.1
Cassage cellulaire ..................................................................................121
8.2
Purification sur colonne échangeuse d’ions..........................................122
8.3
Purification par gel filtration ................................................................122
8.4
Purification d’affinité sur colonne Streptactin™ .................................122
8.5
Purification des Ferrédoxines ...............................................................123
9.Techniques de chimie de reconstitution............................................... 124
9.1
Protocole de reconstitution....................................................................125
10.Techniques analytiques ..................................................................... 125
10.1
Dosages du glycéraldéhyde 3-phosphate...............................................125
10.2
Dosages des activités enzymatiques.......................................................126
10.3
Analyses en gels SDS-PAGE des protéines ...........................................130
10.4
Western Blot des protéines....................................................................133
CHAPITRE VI.
Etude de la Glycéraldéhyde 3-phosphate
oxydoréductase ................................................... 138
1.Introduction......................................................................................... 138
2.Données de séquence et modélisation moléculaire de la GAPOR de
M. jannaschii.......................................................................................... 139
3.Expression / Purification de la GAPOR de M. jannaschii.................... 146
3.1
Clonage du gène Mj gor .........................................................................146
3.2
Optimisation de l’expression hétérologue de la GAPOR .....................148
17
3.3
Optimisation et mise au point des conditions de purification de la
GAPOR .............................................................................................................149
4.Caractérisation biochimique de la GAPOR ......................................... 154
4.1
Activité sur extraits bruts......................................................................154
4.2
Activité de l’enzyme purifiée.................................................................154
4.3
Discussion...............................................................................................158
5.Problématique de l’expression hétérologue ......................................... 160
5.1
Etude de l’activité inattendue « hydrogenase-like » de la GAPOR de M.
jannaschii...........................................................................................................160
5.2
Expression/Purification de la GAPOR de P. furiosus chez
C. acetobutylicum...............................................................................................164
5.3
Optimisation de l’insertion des cofacteurs dans la GAPOR ................166
5.4
Caractérisation de la GAPOR du mésophile Methanococcus maripaludis
…………………………………………………………………………………..178
6.Discussion et conclusion ..................................................................... 185
CHAPITRE VII.
Etude de l’interaction entre l’hydrogénase
[FeFe] de C. acetobutylicum et les ferrédoxines :
………………………………………………...190
1.Introduction et objectifs de l’étude ...................................................... 190
2.Analyses bioinformatiques et choix des ferrédoxines .......................... 190
3.Production hétérologue des ferrédoxines CAC0303 / CAC3527 de
C. acetobutylicum et Mjwt et Mj∆ de M. jannaschii.................................. 196
3.1
Constructions plasmidiques ..................................................................196
3.2
Production des ferrédoxines chez E. coli ..............................................197
3.3
Solubilisation des corps d’inclusion ......................................................202
3.4
Reconstitution des centres [4Fe-4S] ......................................................203
4.Analyses biophysiques des ferrédoxines reconstituées ........................ 210
4.2
Interprétation et discussion...................................................................222
18
5.Comparaison de l’interaction biochimique entre les ferrédoxines
clostridiales et les ferrédoxines de M. jannaschii avec l’hydrogénase [FeFe]
de C. acetobutylicum .............................................................................. 223
5.1
Analyse biochimique comparative de la réduction des ferrédoxines
reconstituées de M. jannaschii et C.acetobutylicum par l’hydrogénase..........223
6.Discussion et conclusion ..................................................................... 231
CHAPITRE VIII.
Conclusion et perspectives .............................. 234
CHAPITRE IX.
Références Bibliographiques .......................... 242
CHAPITRE X.
Annexes et Publications .................................. 257
19
Liste des illustrations
Figure 1 : Chaîne métabolique responsable de la production d’hydrogène chez C. acetobutylicum....................29
Figure 2 : Comparaison des voies métaboliques de transformation du glycéraldéhyde 3 phosphate chez ...........30
Figure 3 : Insertion de la GAPOR en remplacement de la GAPDH dans le métabolisme de C. acetobutylicum..31
Figure 4:
A. Concentration en CO2 sur terre de – 450000 ans à nos jours. ......................................................37
Figure 5 : Voies métaboliques et enzymes impliquées dans la conversion du pyruvate en acides et en solvants
chez C. acetobutylicum (Dans le cas où les gènes codant pour ces enzymes ont été clonés et séquencés, le nom
du gène est indiqué entre parenthèses). .................................................................................................................46
Figure 6 : Flux d’électrons en acidogenèse et en solvantogenèse. ........................................................................49
Figure 7 : Modèle de structure de l’hydrogénase à fer HydA1 de C. reinhardtii. .................................................56
Figure 8 : Structure cristallographique de l’hydrogénase à fer I monomérique de C. pasteurianum à 1,8Å de
résolution (Peters et al., 1998). Les centres [Fe-S] sont représentés en jaune et vert...........................................57
Figure 9 : A. Site actif des [FeFe]-hydrogénases CpI et DdH de C. pasteurianum (Peters et al., 1998) B. Site
actif de l’[FeFe]-hydrogénases de D. desulfuricans (Nicolet et al., 1999)............................................................58
Figure 10 : Trajectoire de la diffusion moléculaire des protons et de l’hydrogène dans la [FeFe]- hydrogénase I
de C. pasteurianum (Cohen et al., 2005) et chemin de transfert des électrons en provenance des partenaires
physiologiques : Ferrédoxine et Flavodoxine. .......................................................................................................60
Figure 11 : Trajectoires de la diffusion moléculaire simultanée de 1000 copies de O2 invisibles à partir du site
actif de l’hydrogénase CpI (A) une superposition de toutes les positions de O2 et de leurs trajectoires sur 2.3 ns
et (B) trajectoires instantanées de O2 après 20 ps (Cohen et al., 2005). ...............................................................61
Figure 12 : Complexe d’interaction obtenu par modélisation moléculaire numérique entre la structure de la
ferrédoxine de C. acidurici (en noir) et l’hydrogénase de C. pasteurianum (en gris). ..........................................65
Figure 13 : Structure tridimensionnelle de la ferrédoxine CpI de C. pasteurianum (structure PDB : 1CLF) ......70
Figure 14 : Structure tridimensionnelle des différents types de centres [Fe-S] rencontrés dans les ferrédoxines.
...............................................................................................................................................................................71
Figure 15 : Alignement de séquence entre les ferrédoxines de C. pasteurianum, C. acidurici et P.
asaccharolyticus. ...................................................................................................................................................72
Figure 16 : Représentation schématique des structures secondaires présentes dans les séquences en acides
aminés des ferrédoxines 2x[4Fe-4S] de C. acidurici (A) et C. pasteurianum (B)..................................................73
Figure 17 : Spectre UV-visible de la ferredoxine 2x[4Fe-4S] de Clostridium thermoaceticum (Yang et al.,
1977b). ...................................................................................................................................................................74
Figure 18 : Spectre RPE de la ferrédoxine de éx[4Fe-4S] de C. pasteurianum (Quinkal, 1995)..........................75
Figure 19 : Schéma décrivant le principe de lecture d’un voltampérogramme. L’exemple présenté est celui de la
ferrédoxine de C. pasteurianum (Armstrong et al., 1997). ....................................................................................76
Figure 20 : Voltampérogrammes des ferrédoxines CpI de C. pasteurianum et la CvI de Chromatium vinosum
(Kyritsis et al., 1998)..............................................................................................................................................77
Figure 21 : Famille des AOR représentée en Dendrogramme (liste non exhaustive)............................................83
Figure 22 : Couplage entre la synthèse d’hydrogène et la synthèse d’ATP chez P. furiosus. (Sapra et al., 2003)
...............................................................................................................................................................................86
Figure 23 : Structure cristallographique de l’AOR de P. furiosus : résolution 2,3 Å. ..........................................89
Figure 24 : A. Monomère d’une Ptérine avec ses deux fonctions dithiolène libres (entourées en orange). B.
Tungstoptérine complète de type MPT présente chez les AOR, FOR et probablement chez la GAPOR. C.
Visualisation 3D de la molécule de Tungstoptérine de type MPT. D. Centre [4Fe-4S]. .......................................90
Figure 25 : Structure d’un tétramère et d’une sous-unité de FOR de P. furiosus avec une résolution de 1,85Å et
zoom sur une sous-unité avec ses cofacteurs : le centre [4Fe-4S] et la tunsgtoptérine.........................................91
Figure 26 : Alignement des séquences en acides aminés de la FOR et AOR de P. furiosus et de la FOR de
Thermococcus littoralis. Les 3 domaines d’identité décroissante sont distingués par les encadrements. Les
résidus impliqués dans la constitution du centre [4Fe-4S] sont encadrés et fléchés en bleu. Les résidus
directement impliqués dans le site actif à proximité du W sont encadrés et fléchés en noir. Les résidus en
interaction avec la bis-ptérine sont encadrés en vert.............................................................................................93
Figure 27 : Modélisation de la cavité du site actif de la FOR de P. furiosus ........................................................94
Figure 28 : Signal RPE caractéristique du W de la GAPOR de P. furiosus. (Van der Oost, 1998)......................95
Figure 29 : Structure du complexe FOR-Ferrédoxine de P. furiosus à une résolution de 2,15 Å.........................96
Figure 30 : Voie de synthèse de la ptérine et d’importation du Mo chez E. coli (source : Vergnes, 2004)...........98
Figure 31 : Opéron tup et moeA d’Eubacterium acidaminophilum dédié à l’import du W et à son
l’incorporation. ....................................................................................................................................................100
Figure 32: Organismes contenant une séquence génomique putative de la famille des AOR (Bevers, 2006).....101
Figure 33 : Affinité des systèmes Wtp, Tup et Mod pour le W / Mo (Source Bervers, 2006)...............................102
Figure 34 : Dosage biochimique du GAP à la GAPDH. .....................................................................................126
Figure 35 : Dendrogramme des séquences protéiques du groupe des GAPOR à l’AOR et la FOR de P. furiosus.
.............................................................................................................................................................................139
Figure 36 : Alignement de séquences entre la GAPOR de M. jannaschii (G Mj), et les GAPOR de P. furiosus (G
Pf), P. abyssi (G Pa) et P. horikoshi (G Ph). (algorithme d’alignement multiples et matrice Blosum62). Les
résidus présumés comme impliqués dans la constitution du centre [4Fe-4S] sont encadrés en bleu. Les résidus
directement impliqués dans le site actif à proximité du W sont encadrés et fléchés en fuchsia. Les résidus en
interaction avec la bis-ptérine sont encadrés en vert...........................................................................................140
Figure 37 : Alignement de séquences entre la GAPOR de M. jannaschii et l’AOR et la FOR de P. furiosus. ....142
Figure 38 : Modèle de la GAPOR de M. jannaschii obtenu par « Homology modeling » à partir des structures
de l’AOR et de la FOR de P. furiosus sur une station Silicon Graphics et à l’aide du logiciel Dyscovery
d’Accelrys. (4400 itérations de minimisation de l’énergie de Gibbs). A. Représentation des structures
secondaires prédites. B. Représentation des trois domaines. C. Visualisation du domaine n°III et du
positionnement des cofacteurs. ............................................................................................................................143
Figure 39 : Modélisation de la GAPOR de M. jannaschii : A. modélisation de la surface de la protéine au niveau
du domaine n°III et de l’entrée du canal de communication au site actif (flèche jaune). B. modélisation des
cavités internes à la protéine. C. et D. Zoom sur la cavité interne du site actif de la GAPOR de M. jannaschii et
sur l’espace occupé par les cofacteurs biochimiques : W-ptérine et centre [4Fe-4S].........................................145
22
Figure 40 : Plan de clonage de la GAPOR de M. jannaschii dans le vecteur d’expression navette pPHCtag ...147
Figure 41 : Gel SDS-PAGE de contrôle de l’expression et de la purification de la GAPOR par le système
StrepTag II., .........................................................................................................................................................150
Figure 42 : Contrôle de l’expression et de la purification de la GAPOR via le vecteur pPHMjGAPORCtag chez
C. acetobutylicum. Gels SDS-PAGE 12 %...........................................................................................................151
Figure 43 : Contrôle de l’expression et de la purification de la GAPOR via le vecteur pTRC99AMjGAPORCtag
chez E. col DH5α (Codon-plus). Gels SDS-PAGE 12 %, ....................................................................................153
Figure 44 : Gels natifs d’une fraction d’élution purifiée de la Mj GAPOR produite chez E. coli (BL21,
pTRC99AGAPORCtag) et chez C. acetobutylicum ATCC 824 (pPHMjGAPORCtag). A : révélation au bleu de
coomassie. B : révélation de l’activité de réduction du benzyl viologène, la bande est difficilement visible sur une
photo numérique elle est donc signalée par une flèche........................................................................................161
Figure 45 : Western-Blot : expression/purification de la GAPOR de P. furiosus. Marqueur : précoloré SDSPAGE Fermentas™ , révélation par de la streptactin-HRP conjugated (IBA™). Piste S : surnageant de cassage.
Pistes E2 – E3 : Fractions d’élution. La bande correspondant à la GAPOR est signalée par une flèche noire. 165
Figure 46 : Modélisation moléculaire tridimensionnelle de la Bis W-ptérine : A : Forme MGD B : Forme MPT
.............................................................................................................................................................................171
Figure 47 : Etude bioinformatique des gènes de synthèse de la ptérine chez C. acetobutylicum. .......................173
Figure 48 : Spectre de détection en MALDI-TOF d’un échantillon de Mj GAPOR purifiée...............................175
chez E. coli T5 (hypF- mobab-, Codon-plus) . Gels SDS-PAGE 12 %,.................................................................181
Figure 50 : Spectre en résonnance paramagnétique électronique du centre [4Fe-4S] de la GAPOR de
M. maripaludis. (Etat réduit). ..............................................................................................................................184
Figure 51 : Alignement des 4 séquences de ferrédoxines annotées dans le génome de M. jannaschii. ...............191
Figure 52 : Alignement de la ferrédoxine de M. jannaschii 0722 avec la ferrédoxine de C. pasteurianum........192
Figure 53 : Alignement des 5 séquences de ferrédoxines décelées dans le génome de C. acetobutylicum avec la
ferrédoxine de C. pasteurianum...........................................................................................................................193
Figure 54 : Alignement des ferrédoxines retenues pour cette étude. ...................................................................195
Figure 55 : Carte du vecteur d’expression retenu pour l’expression de la ferrédoxine Mjwt. .............................197
Figure 56 : Expression de la ferrédoxine Mjwt chez E. coli BL21 (DE3) (pCodon-plus).....................................198
Figure 57 : Purification par chromatographie d’affinité de la ferrédoxine CAC0303 chez E. coli BL21 (DE3)
(pCodonplus)........................................................................................................................................................199
Figure 58 : Expression de la ferrédoxine CAC3527 chez E. coli BL21 (DE3) (pCodon-plus). ...........................201
Figure 59 : Resolubilisation de la ferrédoxine de Mjwt........................................................................................203
Figure 60 : Dernières étapes de resolubilisation, dialyse et purification par chromatographie d’affinité de la
ferrédoxine Mjwt ...................................................................................................................................................205
Figure 61 : Gels de comparaison des différentes ferrédoxines reconstituées et purifiées au cours de cette étude.
.............................................................................................................................................................................206
Figure 62 : Spectre d’absorption des ferrédoxines Mjwt (courbe rouge) et Mj∆ (courbe noire). .........................207
23
Figure 63 : Exemple de titration potentiométrique de la ferrédoxine de Mjwt A : Evolution du spectre
d’absorption de la solution de ferrédoxine pendant la réduction des centres [4Fe-4S] et suivi de l’absorbance à
420nm B : Courbe de suivi du potentiel d’oxydoréduction de la solution de ferrédoxine (fonction de type
Nersnt). ................................................................................................................................................................211
Figure 64: Spectres RPE des échantillons de ferrédoxines A : CAC0303 B : CAC3527. Conditions :
Température 10 K , Fréquence micro-ondes 9 Ghz, Puissance micro-ondes Mw 1 mW. ....................................212
Figure 65 : Spectres RPE des échantillons de ferrédoxines A : Mjwt B : Mj∆. Conditions RPE : 10 K , X Band 9
Ghz, Mw 1 mW. ....................................................................................................................................................214
Figure 66 : Récapitulatif et mise à l’échelle des spectres RPE (état réduit maximal) des ferrédoxines utilisées au
cours de cette étude..............................................................................................................................................215
Figure 67 : Voltampérogrammes obtenus sur des échantillons de ferrédoxine CAC0303 et effet de la variation
du pH....................................................................................................................................................................217
du pH....................................................................................................................................................................218
Figure 69 : Voltampérogrammes obtenus sur des échantillons de ferrédoxines Mjwt (A) et Mj∆ (B)...................219
Figure 70 : Contrôle de purification de l’hydrogénase HydA de C. acetobutylicum...........................................224
Figure 71 : Graphe de comparaison des activités spécifiques de réduction des ferrédoxines par l’hydrogénase à
fer de C. acetobutylicum à différents pH..............................................................................................................225
Figure 72 : Schéma résumant l’ensemble les différentes situations de charge globale de chacune des
ferrédoxines testées au cours de cette étude. .......................................................................................................227
Figure 73 : Graphe de comparaison des activités spécifiques de réduction des ferrédoxines à pH 6.6 et 9.6. ...228
Figure 74 : Graphe de comparaison du gain d’activité spécifique pour chaque ferrédoxine par le passage d’un
pH de 6.6 à 9.6 lors de la réduction des ferrédoxines par l’hydrogénase. Le gain d’activité est exprimé en
pourcentage par rapport à l’activité à pH 9.6 (100%). .......................................................................................229
24
Liste des tableaux
Liste des Tableaux
Tableau 1: Réserves des combustibles fossiles actuellement exploitées, en regard de la consommation (en
milliards de tonnes équivalent-pétrole, ou Gigatep). Source : Association Française pour l’Hydrogène (AFH2)39
Tableau 2 : Inactivations de gènes réalisés chez C. acetobutylicum. ....................................................................51
Tableau 3 : Activités spécifiques de la [FeFe]-hydrogénase HydA de C. acetobutylicum ATCC824. ..................66
Tableau 4 : Propriétés moléculaires des tungstoenzymes caractérisées................................................................80
Tableau 5 : Distribution du W et du Mo dans différents biotopes terrestres (source : Kletzin and Adams, 1996).
...............................................................................................................................................................................82
Tableau 6 : Souches utilisées au cours de cette étude..........................................................................................106
Tableau 7 : Plasmides utilisés lors de cette étude................................................................................................108
Tableau 8 : Oligonucléotides utilisés au court de cette étude..............................................................................120
Tableau 9: Dosage par ICPMS du W et du Mo contenu dans les échantillons de GAPOR de M. jannaschii
purifiée et produite chez E. coli T5 (hypF– mobab –, Codon-plus, pTRC99AMjGAPORCtag) et
C.
acetobutylicum. ....................................................................................................................................................169
Tableau 10 : Dosage par ICPMS du Fer contenu dans les échantillons de GAPOR de M. jannaschii purifiée et
produite chez E. coli T5 (hypF – mobab– , pTRC99AMjGAPORCtag, pCodonplus) et C. acetobutylicum, avec
1 mM de W. ..........................................................................................................................................................177
Tableau 11 : Mesure des absorbances à 280 nm et 390 nm des échantillons de GAPOR purifiés. .....................178
Tableau 12 : Tableau récapitulatif des principales AOR mises en évidence dans les banques de données
internationales. ....................................................................................................................................................179
Tableau 13 : Comparaison de séquences protéiques entre la GAPOR de M. maripaludis et les GAPOR de
M. jannaschii et P. furiosus..................................................................................................................................180
Tableau 14 : Dosage par ICPMS du W et du Mo contenu dans les échantillons de GAPOR de M. maripaludis et
M. jannaschii purifiées et produites chez E. coli T5 (hypF – mobab– , pTRC99AMjGAPORCtag, pCodonplus).
.............................................................................................................................................................................182
Tableau 15 : Dosage par ICPMS du Fer contenu dans des échantillons de GAPOR de M. maripaludis et de
M. jannaschii purifiées et produites chez E. coli T5 (hypF – mobab– , pTRC99AMjGAPORCtag, pCodonplus) et
mesure de l’absorbance à 280 nm et 390 nm.......................................................................................................183
Tableau 16 : Caractéristiques principales des ferrédoxines de C.acetobutylicum, de M. jannaschii et de
plusieurs microorganismes classées selon leur degré d’homologie avec la ferrédoxine CAC0303. ...................194
Tableau 17 : Analyse de la dénaturation à haute température des ferrédoxines de M. jannaschii reconstituées
par suivi de l’absorbance à 390nm. .....................................................................................................................208
Tableau 18 : Récapitulatif des résultats de la purification/reconstitution des ferrédoxines utilisées au cours de
cette étude : Mjwt, Mj∆ et CAC3527 et CAC0303. ................................................................................................210
wt
∆
Tableau 19 : Potentiels d’oxydoréduction mesurés par titrage optique des ferrédoxines Mj et Mj reconstituées.
.............................................................................................................................................................................211
Liste des tableaux
Tableau 20 : Dosage élémentaire par ICPMS du Fe contenu dans les échantillons de ferrédoxines Mjwt, Mj∆,
CAC3527 et CAC0303. ........................................................................................................................................221
Tableau 21 : Comparaison des activités spécifiques de réduction des ferrédoxines par l’hydrogénase à fer de
C. acetobutylicum à pH 6.6..................................................................................................................................224
26
Chapitre I
Présentation du projet de
Recherche
Chapitre I
Présentation du projet de recherche
Chapitre I
Présentation du projet de Recherche
1. Introduction
L’hydrogène est devenu l’une des alternatives à l’exploitation des sources d’énergies
fossiles parmi les plus prometteuses. La quasi totalité de l’hydrogène produit sur Terre
actuellement est généré par reformage de gaz naturel. Toutefois, l’appauvrissement prochain
des ressources pétrolières et gazières mondiales et la problématique grandissante de l’effet de
serre nécessitent de découvrir des voies de production alternatives viables et compatibles avec
un développement durable des activités humaines sur la planète.
La production par voie biologique d’hydrogène s’annonce comme l’une des solutions
présentant un fort potentiel. Cette approche biologique, propose de très nombreux modes de
production, dont la plupart sont actuellement difficiles à mettre en œuvre à l’échelle
industrielle. Le micro-organisme idéal pour la production industrielle de bio-hydrogène doit
satisfaire à plusieurs exigences : il doit être capable de croître sur des substrats peu onéreux et
doit produire d’importantes quantités d’H2 par un procédé robuste et simple à mettre en
œuvre.
Clostridium acetobutylicum est, à ce jour, l’une des bactéries organochimiohétérotrophe productrice d’H2 des plus performantes puisqu’elle peut générer, en chémostat,
jusqu’à 27,5 mmoles d’H2 par gramme de cellule et par heure, soit une production de 2,4
litres d’H2 par litre de fermenteur et par heure (Claassen et al., 1999; Soni et al., 1987). C’est
une bactérie anaérobie qui tire son énergie de la dégradation de substrats carbonés (Desvaux
et al., 2001a; Desvaux et al., 2001b; Desvaux & Petitdemange, 2001; Mitchell, 1998). Elle
possède un catabolisme très efficace, ainsi que les gènes codant pour l’équipement
enzymatique nécessaire à la dégradation de l’amidon, des peptides et des hémicelluloses en
glucides incorporables (Desvaux et al., 2000; Desvaux et al., 2001b; Nolling et al., 2001;
Sabathe et al., 2002).
Elle se révèle donc parfaitement capable de se développer sur des substrats complexes de
faible coût industriel tels que certains rejets organiques de l’industrie agro-alimentaire
28
Chapitre I
(mélasses issues de l’industrie sucrière, déchets organiques…). Elle croît dans une gamme de
températures de 25 à 41°C avec un optimum à 35°C.
La forte productivité en hydrogène de C. acetobutylicum est associée à un rendement de
seulement 2 moles d’H2 produit par mole d’hexose catabolisé (Mitchell, 1998). Afin de
pouvoir utiliser C. acetobutylicum dans un bioprocédé de production d’hydrogène
industriellement rentable, il est nécessaire de doubler ce rendement afin d’approcher son
rendement maximal théorique de 4 moles d’H2 par mole d’hexose consommé (Benemann,
1996; Lay, 2001).
Dans l’optique d’atteindre un tel rendement de conversion, il est nécessaire de dévier le flux
d’électrons glycolytique vers la chaîne métabolique menant à la formation de l’hydrogène
chez C. acetobutylicum (figure 1).
NADH
(2)
(3)
NAD(P)H
(1)
(2)
NAD(P)+
(3)
Ethanol
Butanol
Butyrate
Acetone
Acetate
Figure 1 : Chaîne métabolique responsable de la production d’hydrogène chez C. acetobutylicum.
(1) Pyruvate ferrédoxine oxydoréductase
(3) NAD(P)H ferrédoxine oxydoréductase
(2) Hydrogénase
29
Chapitre I
Cette chaîne s’articule principalement autour de deux enzymes clé. La pyruvate ferrédoxine
oxydoréductase (PFOR) qui est l’enzyme principalement responsable de la réduction d’un
cofacteur appelé la ferrédoxine. Cette ferrédoxine réduite est ensuite utilisée par la seconde
enzyme, l’hydrogénase, afin de former de l’hydrogène.
2. Objectifs et programme scientifique
Le projet, dans le lequel ce travail de thèse s’inscrit, a pour objectif de doubler le
rendement de production d’hydrogène de C. acetobutylicum en introduisant dans son
métabolisme naturel une nouvelle étape de réduction additionnelle de la ferrédoxine. L’étape
de réduction du NAD+ de la glycolyse (catalysée par la GAPDH : glycéraldéhyde 3-phosphate
déshydrogénase, (figures 2 et 3) pourrait être remplacée par une étape de réduction de la
ferrédoxine.
L’un des buts de ce projet de thèse est de substituer la GAPDH par une Glycéraldéhyde
ferrédoxine 3-phosphate oxydoréductase ou GAPOR capable d’utiliser la ferrédoxine (Fd)
comme cofacteur à la place du NAD+ (figure 2). La GAPOR fonctionne dans le sens de la
glycolyse et remplace les réactions catalysées à la fois par la GAPDH et par la
Phosphoglycérate kinase (PGK ; EC 2.7.2.3) dans la glycolyse standard.
Voie d’Embden -Meyerhof :
Glycolyse standard
Methanococcus. Jannaschii, Pyrococcus furiosus…
C. acetobutylicum
Glycéraldéhyde 3 Phosphate
NAD
Glycéraldéhyde 3 Phosphate
Pi
Fd
GAPDH
GAPOR
NADH
1.3 bisphosphoglycérate
FdH 2
ADP
3 phosphoglycérate
PGK
ATP
3 phosphoglycérate
Figure 2 : Comparaison des voies métaboliques de transformation du glycéraldéhyde 3 phosphate chez
M. jannaschii et P. .furiosus vis-à-vis de la glycolyse standard.
30
Chapitre I
La GAPOR est une enzyme atypique possédant un cofacteur tungstoptérine et un centre
[4Fe-4S]. Elle a initialement été isolée et caractérisée chez l’archaeon hyperthermophile
Pyrococcus furiosus. Notre choix s’est porté dans un premier temps sur la GAPOR de
l’archaeon Methanococcus jannaschii car c’est à ce jour le microorganisme possédant une
GAPOR qui présente la plage de température de croissance la plus basse de 48°C à 90°C
(contre 75 à 105°C pour P. furiosus). Cet argument est déterminant dans le cadre d’une
approche d’ingénierie métabolique où l’enzyme d’intérêt sera insérée et devra être
fonctionnelle chez un hôte mésophile.
Figure 3 : Insertion de la GAPOR en remplacement de la GAPDH dans le métabolisme de C. acetobutylicum.
31
Chapitre I
L’optimisation et la stabilisation du nouveau système enzymatique en interaction avec
des nouveaux partenaires issus de son nouvel hôte permettront l’augmentation du flux
d’électrons vers la synthèse de ferrédoxine réduite et donc en direction de l’hydrogénase, ce
qui procurera, en théorie, un gain net de 2 moles d’H2 par mole d’hexose consommée
(figure 3).
La seconde partie de ce travail porte sur l’optimisation de l’interaction entre les trois
partenaires du système : la GAPOR, la ferrédoxine et l’hydrogénase. En effet, la ferrédoxine
étant l’intermédiaire dans cette nouvelle chaine de transport des électrons il est nécessaire
qu’elle soit capable d’interagir efficacement à la fois avec la GAPOR mais aussi avec
l’hydrogénase native de C. acetobutylicum. Nous avons donc également entrepris une étude
biochimique visant à déterminer les paramètres qui gouvernent de manièrent prépondérante le
transfert d’électrons lors de l’interaction entre l’hydrogénase de C. acetobutylicum et la
ferrédoxine, à travers une étude impliquant plusieurs ferrédoxines de provenances différentes.
L’un des objectifs étant de déterminer quelle serait la meilleure ferrédoxine dans une optique
d’ingénierie métabolique de C. acetobutylicum, afin d’optimiser la déviation du flux
électronique de la GAPOR vers l’hydrogénase.
L’implémentation métabolique d’un système biochimiquement optimisé par une
approche appliquée d’ingénierie génétique de C. acetobutylicum devrait permettre d’atteindre
le rendement de conversion du glucose en hydrogène de 4 moles d’H2 produites par mole
d’hexose consommé. Ce travail constitue une étape préalable nécessaire au développement à
l’échelle industrielle d’une solution de production d’hydrogène économiquement compétitive.
Le travail présenté dans ce mémoire traite de la démarche scientifique et de différents aspects
conceptuels et techniques relatifs à sa réalisation.
3. Objectifs et enjeux de la filière
La mise au point d’une souche de C. acetobutylicum au rendement de production
d’hydrogène amélioré représente une étape importante vers la mise au point d’un organisme
producteur d’hydrogène optimal. L’approche scientifique suivie dans le cadre de cette étude
constitue également une véritable avancée. En effet, l’ingénierie métabolique d’une souche
mésophile par insertion d’une enzyme provenant d’un organisme très éloigné dans la
32
Chapitre I
phylogénie du vivant (avec un archaeon hyperthermophile puis mésophile) soulève une
problématique scientifique délicate mais aussi particulièrement captivante.
Approfondir la compréhension biochimique de ces enzymes atypiques catalysant deux
réactions bien connues de la glycolyse mais montrant une séquence et un mécanisme
catalytique complètement différents des classiques GAPDH + PGK, présente un intérêt
fondamental certain. L’existence présumée d’un cofacteur rare de type tungstoptérine au sein
du site actif de la GAPOR renforce l’originalité et l’intérêt scientifique de ce travail de thèse.
Il a été ainsi nécessaire de recourir à un large éventail de techniques biochimiques et
biophysiques, notamment au travers d’une collaboration avec l’équipe du Professeur Bruno
Guigliarelli du laboratoire de Bioénergétique et d’ingénierie des protéines1 du CNRS de
Marseille afin de pouvoir aborder ce sujet dans son ensemble.
L’étude de l’hydrogénase de C. acetobutylicum et de son comportement dans ce
contexte d’ingénierie métabolique offre également un intérêt fondamental. Les hydrogénases
à fer clostridiales ont en effet la particularité d’être parmi les enzymes les plus efficaces
découvertes à ce jour pour la production d’hydrogène. Elles font actuellement l’objet de
nombreux travaux et présentent un intérêt industriel à moyen et long termes pour la
constitution de catalyseurs biomimétiques à haut rendement et à bas coût.
1
http://bip.cnrs-mrs.fr/ - UPR9036 Du CNRS Institut de Biologie Structurale et De Microbiologie (IFR88)
31 chemin Joseph Aiguier 13402 Marseille Cedex
33
Chapitre II
Le Biohydrogène, un vecteur
d’énergie durable
Chapitre II
Chapitre II
1. Introduction
La production microbiologique d’hydrogène est un phénomène naturel connu et présent
chez de nombreux micro-organismes anaérobes, micro-aérophiles et photosynthétiques
capables de produire de l’hydrogène et divers métabolites à partir de substrats organiques, ou
bien à partir de dioxyde de carbone et de lumière.
Malgré la richesse des solutions de production biologiques à notre disposition, aucune n’est
suffisamment mature pour être utilisée à l’échelle industrielle. En effet, l’hydrogène est
actuellement très majoritairement produit à partir de ressources fossiles telles que le gaz
naturel, le charbon et le naphta. Bien qu’efficace et économiquement intéressant, ce mode de
production présente le désavantage d’être basé sur des ressources non renouvelables et pose la
question de l’implémentation de l’hydrogène comme vecteur d’énergie durable.
Ce chapitre présente le contexte actuel et prospectif du marché mondial de l’hydrogèneénergie et fait un état de l’art sur les technologies de production dédiées.
2. Contexte et enjeux
L’hydrogène est passé depuis quelques années du statut de composé chimique industriel
intermédiaire à celui de vecteur énergétique d’avenir. Cet élément, ainsi que d’autres
composés tels que l’éthanol et les esters d’huiles, sont entrés dans les politiques énergétiques
de recherche et de développement durable de nombreux pays industrialisés tels que les EtatsUnis, les pays européens et le Japon. L’émergence de ce nouveau vecteur énergétique est dûe
à une mutation sans précédent du contexte économique et écologique mondial lié aux modes
de consommation de l’énergie dans nos sociétés. Le présent chapitre a ainsi pour objet de
poser les bases du contexte énergétique mondial actuel et les futurs enjeux environnementaux
et économiques associés à l’hydrogène-énergie.
36
Chapitre II
2.1 Enjeux environnementaux
Le contexte énergétique mondial a considérablement évolué ces dernières années avec
l’annonce d’une prochaine raréfaction des ressources fossiles et les premiers effets du
réchauffement climatique. Les premières perturbations climatiques ainsi que les nombreuses
études scientifiques publiées ces dernières années ont progressivement amené l’humanité à
une prise de conscience collective sur la problématique de notre futur énergétique et du
développement durable de nos sociétés.
Les experts du Groupement International sur l’Evolution du Climat2 (GIEC) s’accordent
aujourd’hui, sur le fait que les gaz à effet de serre, et notamment le dioxyde de carbone (CO2)
produits par les activités humaines sont la cause principale des désordres climatiques auxquels
nous commençons à assister. En effet, les dernières statistiques publiées sur le réchauffement
global montrent que la teneur en CO2, dans l’atmosphère est passée de 285 ppm en 1885 (ère
pré-industrielle) à 379 ppm en 2004 (figure 4.A.), principalement à cause du recours croissant
et massif à la combustion de carburants fossiles comme source d’énergie dans les sociétés
industrialisées (figure 4.B.).
A
B
Figure 4:
A. Concentration en CO2 sur terre de – 450000 ans à nos jours.
B. Estimations du dégagement en CO2 lié aux activités humaines. Source IEA
Les prévisions en 2030 montrent une augmentation inéluctable de la concentration en
CO2 dans l’atmosphère allant jusqu’à 700 ppm si l’évolution des activités humaines suit un
2
http://www.ipcc.ch/
37
Chapitre II
degré de croissance constant. Les climatologues prédisent qu’une telle concentration en CO2
dans l’atmosphère conduirait à des changements majeurs du climat, mettant en péril la survie
de l’humanité dans certaines zones du monde.
Devant un tel constat, les instances gouvernementales internationales (ONU) ont
décidé de prendre des mesures afin de réduire nos émissions de gaz à effet de serre et de
promouvoir l’efficacité énergétique et le recours aux énergies renouvelables. Ces mesures se
sont concrétisées en 1998 par le protocole de Kyoto ratifié par 156 pays avec pour objectif de
stabiliser les concentrations de gaz à effet de serre dans l’atmosphère à un niveau qui empêche
toute perturbation anthropique dangereuse du système climatique terrestre. Les pays
signataires, dont la France, se sont collectivement engagés à publier des inventaires de leurs
émissions et à réduire leurs émissions de CO2 de 5,2% avant 2012.
Plusieurs programmes nationaux ambitieux ont également été lancés afin de réduire les
émissions globales de CO2 et de promouvoir les énergies renouvelables telles que l’énergie
éolienne, le solaire, la géothermie, les biocarburants et l’hydrogène (ex : le Programme
national de lutte contre le changement climatique et le Programme national de recherche sur
les Bioénergies : PNRB). L’objectif est de substituer le plus rapidement possible à l’utilisation
des combustibles fossiles des sources d’énergie renouvelables non génératrices de gaz à effet
de serre.
2.2 Enjeux énergétiques
2.2.1 Raréfaction des ressources fossiles
A cette préoccupation environnementale, il faut ajouter celle posée par le niveau des
réserves mondiales de combustibles fossiles. Bien qu’ils soient présents sur Terre en grande
quantité, les hydrocarbures fossiles sont une ressource épuisable. En ce qui concerne le
pétrole, le rapport réserves/consommation a baissé pour la première fois passant de 48 années
fin 1991, à 40,5 années à la fin 20043 (tableau 1, page suivante). Les statistiques concernant le
gaz naturel semblent suivre la même tendance, bien qu’il reste sans doute une grande quantité
de gisements inconnus. Seul le charbon semble échapper à court terme à cette perspective
3
Energy Handbook 2005, CEA (France)
38
Chapitre II
d’épuisement puisque les réserves terrestres dépassent à ce jour plus de 200 ans de
consommation annuelle mondiale en énergie.
Charbon
Pétrole
Gaz naturel
Réserves
(Gtep)
Réserves prouvées
2004
(Gtep – milliards de GJ)
(/consommation
2004
(années)
2,8
3,9
2,4
≈ 600
≈ 140
≈ 140
2044
40,5
66,7
Approvisionnement
Type de
combustible total mondial 2000
Tableau 1: Réserves des combustibles fossiles actuellement exploitées, en regard de la consommation (en
milliards de tonnes équivalent-pétrole, ou Gigatep). Source : Association Française pour l’Hydrogène (AFH2)
Une des conséquences de la raréfaction des ressources est la difficulté croissante à
accéder à de nouveaux gisements. Ces difficultés se répercutent sur les coûts d’exploitation et
sur le prix du baril de pétrole qui ne cesse d’augmenter depuis les années 1970 pour atteindre
environ 100$ (Janvier 2008). Cette hausse constante du prix du pétrole et du gaz favorise
l’émergence de nouveaux vecteurs énergétiques tels que l’hydrogène qui combinent efficacité,
avantages environnementaux et indépendance énergétique.
2.2.2
Place de l’hydrogène sur le marché énergétique mondial
Si l’hydrogène demeure peu utilisé dans le domaine de l’énergie, il constitue un
composé incontournable de l’industrie chimique et pétrochimique. Il entre notamment dans la
production d’ammoniac et de méthanol, le raffinage du pétrole. Il est également employé dans
les secteurs de la métallurgie, de l’électronique, de la pharmacologie ainsi que dans le
conditionnement de produits alimentaires. Pour couvrir ces besoins, 65 millions de tonnes
d’hydrogène sont déjà produites chaque année5 (données 2001). Toutefois, dans l’hypothèse
où cette quantité devrait servir à la production d’énergie, elle ne représenterait que 1,5 % de la
demande mondiale d’énergie primaire. Utiliser l’hydrogène comme vecteur énergétique
suppose donc d’augmenter radicalement sa production. Mais cette production devra pouvoir
être réalisée à partir d’énergies renouvelables afin de conserver les avantages
environnementaux de l’hydrogène sur l’ensemble de la filière, ce qui est loin d’être le cas
actuellement comme cela est décrit dans les chapitres suivants.
4
5
Ratio de l’ensemble des minéraux solides : charbon, bitumineux et lignite
Association française pour l’hydrogène. Etude 2001
39
Chapitre II
3. Les procédés de production d’hydrogène
3.1 Statut de la production d’hydrogène dans le monde
en 2006
Si l’utilisation de l’hydrogène comme vecteur énergétique n’est encore aujourd’hui
qu’au stade des démonstrations, sa production et sa consommation dans l’industrie
représentent, de longue date, des quantités notables, tout particulièrement dans le raffinage
des hydrocarbures et dans les industries chimiques et pétrochimiques.
L’hydrogène est une des matières de base des industries chimiques et pétrochimiques. Il
est :
- soit fabriqué spécifiquement dans des unités dédiées (« steam methane reformers »,
oxydeurs partiels ou reformeurs autothermes d’hydrocarbures, électrolyseurs…)
- soit co-produit dans des fabrications d’autres produits chimiques, tels que l’éthylène ou le
chlore.
Sa valorisation en tant que matière première étant très supérieure à sa valeur calorifique,
les « coproductions » d’hydrogène sont généralement regroupées dans un « Réseau
hydrogène» et utilisées dans les divers procédés du site de production. Sur le plan quantitatif,
les volumes d’hydrogène liés à la fabrication d’un produit chimique varient dans des
proportions importantes : ammoniac (45%), autres produits (25%), industrie pétrochimique
(30%). Actuellement, 550 milliards de Nm3 (normo m3 : 273,15 K et 0,1 MPa soit 0°C et
Patm) soit 6,5 ExaJ) d’hydrogène sont produits annuellement et représentent 1,5 % de la
production mondiale d’énergie primaire.
3.2 Procédés de production conventionnels
Actuellement, la grande majorité de l’hydrogène est produite essentiellement par
reformage de combustibles fossiles (95%), le reste étant produit par électrolyse de l’eau
(hydrogène ultra-pur). Le reformage du gaz naturel utilise différentes techniques : le SMR
principalement (steam methane reforming), le reformage auto-thermique et l’oxydation
partielle afin de produire de l’hydrogène à partir de combustibles fossiles. Ces méthodes sont
basées sur des réactions catalytiques à haute température dissociant les hydrocarbures en H2,
CO puis CO2 par des réactions de vapogazéification à l’eau. L’H2 est ensuite purifié par des
techniques conventionnelles de PSA (pressure swing adsorption).
40
Chapitre II
L’hydrolyse de l’eau est une technique basée sur la dissociation chimique de l’eau en H2
et O2 par circulation d’un courant électrique à fort ampérage. Cette technique est très coûteuse
et peu rentable du fait de l’utilisation de courant électrique mais permet d’obtenir un gaz à fort
degré de pureté (applications médicale et spatiale, microélectronique).
3.3 Procédés thermochimiques
Les procédés thermochimiques rassemblent des techniques de pyrolyse/gazéification de
biomasse ou de charbon et permettent de produire un gaz de synthèse fortement concentré en
hydrogène (30 à 50 %), CO (25 à 35%), CO2 (10 à 20%), 5 à 15% de méthane et 1 à 5%
d’autres composés traces de type goudrons. L’hydrogène peut ensuite être purifié par des
techniques standard de PSA ou de filtration sur membranes.
L’un des avantages des procédés thermochimiques est leur capacité à transformer en une
étape unique de la biomasse hétérogène ou tout autre type d’hydrocarbure en un gaz riche en
hydrogène. Il reste néanmoins nécessaire d’apporter une quantité d’énergie importante au
système pour le porter à la température de gazéification (soit environ 1000°C). Le traitement
du gaz à haute température pose actuellement de nombreux problèmes et il s’agit de l’un des
verrous technologiques qu’il reste à lever avant que les procédés de gazéification de biomasse
puissent être commercialisés sur le marché de l’énergie verte.
3.4 Procédés biotechnologiques
La production d’hydrogène par voie biotechnologique est basée sur la mise en culture
contrôlée de microorganismes atteignant de hauts rendements de production à partir de
substrats issus de l’agriculture (pailles et autres substrats ligno-cellulosiques) ou de l’industrie
agroalimentaire (mélasses...). Ce mode de production présente plusieurs avantages par rapport
aux voies classiques en permettant notamment une autonomie totale de cette filière
énergétique vis-à-vis des combustibles fossiles et donne ainsi pleinement à l’hydrogène son
titre d’énergie renouvelable.
De nombreux microorganismes sont capables de produire de l’hydrogène grâce à des
réactions liées à leur métabolisme énergétique. Plusieurs modes de production d'hydrogène
par voie microbienne sont à l’étude à l’heure actuelle:
41
Chapitre II
3.4.1 Les procédés fermentaires
La fermentation dite « obscure » de la biomasse est réalisée par des micro-organismes
Archea ou par des bactéries (hyper)thermophiles ou mésophiles. Certaines bactéries
hyperthermophiles (par exemple la bactérie Thermotoga maritima) ont la capacité d’atteindre
83-100% du rendement théorique maximal de conversion des hexoses en hydrogène (4 moles
H2/mole glucose). Cependant elles présentent une productivité faible (maximum 10 mmoles
d’H2.l-1.h-1), conséquence de leur faible croissance cellulaire. A contrario, les bactéries
mésophiles, anaérobies strictes (Clostridium) et anaérobies facultatives (Enterobacter)
présentent une productivité en hydrogène beaucoup plus élevée (plus de 100 mmoles
d’H2.l-1.h-1 pour Clostridium acetobutylicum (Soni, 1987) et 58 mmoles d’H2.l-1.h-1 pour
Enterobacter aerogenes (Reith & Wijffels, 2003)). Elles possèdent en contrepartie un
rendement global de production d’hydrogène limité à 2 moles d’H2 produites par mole
d’hexose consommé.
3.4.2 Les procédés photobiologiques
Les procédés photobiologiques utilisent des algues (en particulier l’algue verte
Chlamydomonas reinhardtii) ou des cyanobactéries, et produisent de l’hydrogène soit par
photolyse directe de l’eau, soit par photofermentation de substrats organiques. La première
approche est plutôt privilégiée aux Etats-Unis alors que le Japon prête plus d'attention à la
deuxième. Cependant, pour que la photoproduction d'hydrogène devienne une alternative
pertinente, des améliorations d’efficacité de conversion de l’énergie lumineuse en énergie
hydrogène sont encore nécessaires; pour exemple, cette efficacité est comprise sur la base du
spectre total de la lumière entre 1,5% pour une production d’hydrogène par photolyse et 10%
(valeur maximale théorique) pour une production par photofermentation. De récentes données
issues de la littérature font état d’une productivité en hydrogène de 0,08 à 0,1 mmoles
d’H2.l-1.h-1 par l’algue verte C. reinhardtii (Melis & Happe, 2001).
Dans le cas de la photolyse de l’eau, cette faible efficacité étant due principalement à
l'inhibition du catalyseur hydrogénase par l'oxygène, la découverte d’une parade à cette
inhibition est devenue un enjeu d’envergure. Par ailleurs, des efforts pour optimiser la collecte
de la lumière et la conception des bioréacteurs sont également nécessaires.
42
Chapitre III
Production d’hydrogène par
Clostridium acetobutylicum
43
Chapitre III
Production de Biohydrogène Clostridium acetobutylicum
Chapitre III
Production d’hydrogène par Clostridium
acetobutylicum
1. Présentation de la bactérie C. acetobutylicum
Les micro-organismes du genre Clostridium sont des bactéries anaérobies strictes
répondant positivement au test de Gram et générant des spores capables de résister à des
conditions extrêmes sur de longues périodes. Les cellules végétatives ont la forme de
bâtonnets aux extrémités arrondies et sont assorties de flagelles.
Certaines espèces sont capables de sécréter des toxines puissantes responsables de maladies
telles que la gangrène, le botulisme, le tétanos (respectivement Clostridium difficile et
Clostridium perfringens, Clostridium botulinium, Clostridium tetani). D’autres espèces qui ne
présentent pas de caractère pathogène ont la particularité de produire des composés d’intérêt
industriel tels que le butanol et l’acétone à partir d’un large spectre de substrats carbonés
grâce à une grande flexibilité de leur métabolisme. C’est le cas de Clostridium beijerinckii,
Clostridium
butylicum,
Clostridium
aurantibutyricum,
Clostridium
tetanomorphum,
Clostridium butyricum, Clostridium pasteurianum et C. acetobutylicum. Cette dernière est
présente dans la nature au niveau de certains sols, vases et eaux et dans de nombreux végétaux
(racines, pelures de tubercules), graines (maïs, fève, avoine) et mélasses de sucreries.
La souche type dénommée C. acetobutylicum ATCC 824 a été isolée du sol en 1924
dans le Connecticut (Weyer et Rettger, 1927) pour ses propriétés solvantogènes.
La carte physique et génétique du chromosome de C. acetobutylicum ATCC 824 a été
construite par Cornillot et coll, en 1997. La carte génétique de C. acetobutylicum a été
comparée à celle de Bacillus subtilis, Clostridium beijerinckii et Clostridium perfringens.
Paradoxalement, elle montre une plus grande similitude avec celle de B. subtilis (40,3%
d’identité entre leurs protéines orthologues).
44
Chapitre III
La séquence complète du génome de C. acetobutylicum ATCC 824 a été publiée (Nölling,
2001). Ce génome est composé d’un chromosome de 3,94Mb et d’un mégaplasmide de 192kb
(appelé pSOL1) qui contient une majorité de gènes responsables de la production de solvants
(Cornillot, 1997) Le génome de C. acetobutylicum présente la particularité de contenir une
faible teneur en bases G-C (31%) (Nölling, 2001). Cette faible teneur influe profondément sur
l’usage des codons. Pour un acide aminé donné, le micro-organisme privilégie généralement
le codon où les bases A-T prédominent.
2. Physiologie de C. acetobutylicum
C. acetobutylicum est capable de métaboliser de nombreuses sources carbonées telles que
le glucose, le saccharose, le xylose, le pyruvate, le gluconate, le mannitol, l’arabinose (Lee,
1985a ; Janati-Idrissi, 1989 ; Junelles, 1987) et même l’insuline, la pectine, mais cette bactérie
n’est pas capable de réduire le sulfate ni de métaboliser la cellulose cristalline (Avicel) (Lee,
1985b). Deux composés sont nécessaires à sa croissance sur un milieu synthétique : l’acide
para-aminobenzoïque et la biotine (Oxford, 1940, Lampen et Peterson, 1943). Sa température
optimale de croissance est d’environ 35°C.
C. acetobutylicum est capable de réaliser la fermentation acétonobutylique grâce à un
métabolisme biphasique où sont produits majoritairement soit des acides (acidogenèse) tels
que l’acétate, le butyrate, et l’hydrogène moléculaire, ou soit des solvants neutres
(solvantogenèse) comme l’acétone, le butanol, et l’éthanol.
3. Voies et gènes du métabolisme primaire de
C.acetobutylicum :
Chez C. acetobutylicum, les voies métaboliques conduisant à la production des différents
acides et solvants sont bien connues (Doelle, 1966; Papoutsakis et al., 1987; Rogers &
Palosaari, 1987).
Les hexoses (mono-, di-, tri- et polysaccharides) sont dégradés par la voie d’EmbdenMeyerhorf-Parnas (voie de la glycolyse). Une mole d’hexose est convertie en deux moles de
pyruvate avec production de deux moles d’ATP et deux moles de NADH (Thauer, 1977). Les
pentoses sont dégradés par la voie des pentoses-phosphate. Les sucres sont d’abord
transformés en pentoses 5-phosphate puis convertis, via une transaldolase et une
45
Chapitre III
transcétolase, en fructose 6-phophate et glycéraldéhyde 3-phosphate qui vont entrer dans la
glycolyse. Trois moles de pentoses sont converties en 5 moles de pyruvate avec production de
5 moles d’ATP et 5 moles de NADH (Rogers, 1987).
Le pyruvate issu de la glycolyse subit une décarboxylation oxydative par la pyruvateferrédoxine oxydoréductase pour donner de l’acétyl-CoA, de la ferrédoxine réduite et du
dioxyde de carbone. L’acétyl-CoA est le point charnière sur lequel vont se brancher les voies
fermentaires conduisant à la production d’acides et de solvants (Figure 5).
Dans la voie centrale, l’acétyl-CoA est converti en acétoacétyl-CoA, puis en butyryl-CoA.
Pyruvate
Pyruvate-Fd
oxydoréductase
Acétyl-CoA
Phosphotransacétylase (pta)
2H+
Fdréd
H2
Hydrogénase
(hydA)
Aldéhyde déshydrogénase
Acétaldéhyde
Acétyl-phoshate
Acétate kinase (ak)
Fdox
Thiolase
(thl)
Alcool déshydrogénase
Acétate
Ethanol
Acétoacétyl-CoA
CoA transférase (ctfAB)
Acétoacétate
Acétoacétate décarboxylase (adc)
Butyryl-CoA
Phosphotransbutyrylase (ptb)
Butyryl-phosphate
Butyrate kinase (butk)
Acétone
Aldéhyde déshydrogénase
Butyraldéhyde
Alcool déshydrogénase
(buk)
Butyrate
Butanol
Figure 5 : Voies métaboliques et enzymes impliquées dans la conversion du pyruvate en acides et en solvants
chez C. acetobutylicum (Dans le cas où les gènes codant pour ces enzymes ont été clonés et séquencés, le nom
du gène est indiqué entre parenthèses).
La thiolase (ou acétyl-CoA-acétyltransférase) catalyse la condensation de deux
molécules d’acétyl-CoA pour former une molécule d’acétoacétyl-CoA, le précurseur des
46
Chapitre III
produits à plus de deux carbones. Cette réaction joue un rôle important dans la détermination
du rapport entre les produits à deux (acétate, éthanol), trois (acétone) ou quatre (butyrate,
butanol) carbones. La thiolase de C. acetobutylicum ATCC 824 a été purifiée et son gène (thl)
a été cloné et séquencé (Petersen & Bennett, 1991), et il a été suggéré que son activité serait
régulée in vivo par le rapport Coenzyme-A : acétyl-CoA. Deux gènes codant pour les
thiolases ont été clonés chez C. acetobutylicum DSM794 thlA, correspondant à thl chez C.
acetobutylicum ATCC 824, et thlB (Winzer et al., 2000).
En trois étapes consécutives, l’acétoacétyl-CoA est réduit en butyryl-CoA par la βhydroxybutyryl-CoA déshydrogénase, la crotonase et la butyryl-CoA déshydrogénase. Deux
moles de NADH sont consommées par mole de butyryl-CoA formée. De ces trois enzymes,
seule la crotonase a été purifiée chez C. acetobutylicum (Waterson et al., 1972). Les gènes crt,
bcd et hbd (codant pour la crotonase, la butyryl-CoA déshydrogénase, et la β-hydroxybutyrylCoA déshydrogénase respectivement) sont situés sur un seul opéron, appelé l’opéron bcs pour
« butyryl-CoA synthesis » (Bennett & Rudolph, 1995)
3.1 La production des acides (acétate et butyrate)
L’acétyl-CoA est converti en acétate et ATP par la phosphotransacétylase et l’acétate
kinase. Les gènes pta et ack qui codent pour ces deux enzymes sont organisés en opéron
(Boynton et al., 1996).
Le butyryl-CoA est converti en butyrate par la phosphotransbutyrylase et butyrate kinase, et
les deux gènes codant ces enzymes, ptb et buk sont aussi organisés en opéron (Walter et al.,
1993).
3.2 La production des solvants
3.2.1 Voie de synthèse de l’acétone :
La formation d’acétone provenant de l’acétoacétyl-CoA implique une CoA-transférase
et une acétoacétate décarboxylase. La CoA-transférase de C. acetobutylicum ATCC 824 a été
purifiée (Wiesenborn et al., 1988) et contient deux sous-unités différentes (Cary et al., 1990).
Ces sous-unités sont codées par les gènes ctfA et ctfB, qui font partie de l’opéron sol (Fischer
et al., 1993; Petersen et al., 1993). L’acétoacétate décarboxylase a été purifiée et son gène adc
47
Chapitre III
a été cloné et séquencé à partir des souches C. acetobutylicum ATCC 824 et DSM 792
(Gerischer & Durre, 1990; Petersen & Bennett, 1990). Ce gène, adjacent à l’opéron sol, est
transcrit en sens opposé sous le contrôle de son propre promoteur (Durre et al., 1995; Petersen
et al., 1993).
3.2.2 Voie de synthèse des alcools : éthanol et butanol
L’éthanol et le butanol sont produits à partir de l’acétyl-CoA et du butyryl-CoA
respectivement, en deux étapes réductrices catalysées par des aldéhyde et alcool
déshydrogénases. Une aldéhyde-alcool déshydrogénase bifonctionnelle codée par les gènes
aad (ou adhE) et adhE2 chez C. acetobutylicum ATCC 824 (Fontaine et al., 2002; Nair et al.,
1994) et le gène adhE chez C. acetobutylicum DSM 792 (Fischer et al., 1993), a été
identifiée. Ces gènes sont tous situés sur le mégaplasmide pSOL1, mais seuls aad et adhE
font partie de l’opéron sol. Cette enzyme est principalement impliquée dans la formation de
butanol (Durre et al., 1995; Green & Bennett, 1996; Nair & Papoutsakis, 1994).
Deux butanol déshydrogénases NADH dépendantes (BDH I et BDH II) ont été purifiées et
leurs gènes (bdhA et bdhB) ont été clonés (Petersen et al., 1991; Welch et al., 1989). Ces
gènes sont adjacents, mais chacun est transcrit avec son propre promoteur (Walter et al.,
1992). BDH I et BDH II diffèrent dans leur spécificité de substrat : BDH II est 50 fois plus
active avec le butyraldéhyde qu’avec l’acétaldéhyde, alors que BDH I ne l’est que d’un
facteur 2 (Welch et al., 1989). Pendant la purification de BDH I et BDH II et le clonage de
leurs gènes, la présence de butanol déshydrogénase NADPH-dépendantes a été révélée.
Le mégaplasmide porte l’opéron sol et les gènes adc et adhE2, mais pas les gènes bdhA et
bdhB, qui sont situés sur le chromosome (Cornillot et al., 1997a). La perte du mégaplasmide
mène à l’abolition totale des productions de butanol et d’acétone (Cornillot et al., 1997a;
Cornillot et al., 1997b).
3.3 Métabolisme énergétique
3.3.1 Les enzymes du flux électronique
Le basculement du flux carboné des acides vers les solvants est associé à une
modification du flux électronique. Ce dernier est directement lié aux activités enzymatiques.
Les enzymes clé de la distribution du flux électronique sont les hydrogénases et les
ferrédoxine-NAD(P)+ oxydoréductases (Figure 6).
48
Chapitre III
Chez C. acetobutylicum, trois hydrogénases fonctionnelles sont présentes. Deux hydrogénases
à fer HydA (64kDa) et HydB (53kDa) ont été isolées, elles sont codées par les gènes hydA
(Gorwa et al., 1996) et hydB (King et al., 2006; Vignais et al., 2001), et une hydrogénase
nickel-fer a été mise en évidence lors du séquençage du génome de C. acetobutylicum
(Nolling et al., 2001) et clonée (L. Fontaine résultat non-publié de sa thèse, 2002).
Solvantogenèse (2)
Acidogenèse (1)
H2
H2
Pyruvate
HSCoA
2
NADP+
3
2e
-
2
4 NADH
NADPH
2e
5
-
NAD+
NADP+
5
Fd-red
2H+
Fd-ox
1
NADPH
NADH
NAD+
CO2
Fd-ox
Fd-red
Acétyl-CoA
2H+
Figure 6 : Flux d’électrons en acidogenèse et en solvantogenèse.
1. Pyruvate-ferrédoxine oxydoréductase ; 2. Hydrogénase ; 3. Ferrédoxine-NAD+ réductase ; 4. NADHferrédoxine réductase ; 5. Ferrédoxine-NADP+ réductase. (D’après Jones et Wood, 1986 et Girbal et al., 1995).
Au moment de la décarboxylation oxydative du pyruvate en acétyl-CoA par la
pyruvate-ferrédoxine oxydoréductase il y a un transfert d’électrons vers la ferrédoxine. La
pyruvate-ferrédoxine oxydoréductase a été purifiée chez C. acetobutylicum DSM 1731
(Meinecke et al., 1989).
1. En acidogenèse, une partie seulement du NADH produit lors de la glycolyse est
consommée pour la production du butyrate. Une NADH-ferrédoxine réductase
intervient en parallèle de la pyruvate-ferrédoxine oxydoréductase, dans la réduction de
la ferrédoxine en consommant l’excès de NADH provenant de la glycolyse. La
ferrédoxine oxydée est régénérée par l’hydrogénase capable d’utiliser des protons
comme accepteurs finaux d’électrons, avec production d’hydrogène (Adams et al.,
1980). La consommation des protons permet de plus une désacidification du cytoplasme
(Girbal & Soucaille, 1994).
49
Chapitre III
2. En solvantogenèse, les voies de production de l’éthanol et du butanol consomment
plus de NAD(P)H que ne peut en fournir la glycolyse. L’oxydation de la ferrédoxine
réduite (produite par le clivage phosphoroclastique du pyruvate) par les ferrédoxineNAD(P)+ réductases, va alors permettre de produire le NAD(P)H nécessaire au
détriment de la production d’hydrogène.
3.3.2 Protéines transporteurs d’électrons :
La ferrédoxine a un rôle pivot dans la distribution du flux électronique (Figure 6).
-
La présence de ferrédoxine est une caractéristique de toutes les clostridia. C’est une
protéine à centres fer-soufre qui transporte deux électrons par molécule par
l’intermédiaire de ses deux groupements [4Fe-4S] (Bruschi & Guerlesquin, 1988;
Valentine, 1964). Chez C. acetobutylicum, une ferrédoxine a été seulement
partiellement isolée (Marczak et al., 1985).
-
En addition de la ferrédoxine, la rubrédoxine est présente chez C. acetobutylicum
(Petitdemange et al., 1981). Il s’agit également d’une protéine fer-soufre, qui n’est
capable de transporter qu’un seul électron par molécule. Contrairement à la ferrédoxine
qui est produite de manière constitutive, la présence de rubrédoxine serait induite à
faible pH et/ou en présence de fortes concentrations d’acides (Marczak et al., 1983;
Marczak et al., 1985).
-
La flavodoxine appartient à une famille de transporteurs ne possédant pas de fer,
mais contenant un cofacteur, la flavine mono-nucléotide. Elle est produite lors d’une
carence en fer dans le milieu de culture (Knight et al., 1966). Un gène codant pour une
flavodoxine a été cloné chez C. acetobutylicum P 262 (Santangelo et al., 1991).
Il existe des transporteurs artificiels d’électrons comme le bleu de méthylène, le méthyl
viologène, le benzyl viologène ou le rouge neutre qui sont utilisés en culture ou in vitro lors
de tests d’activité pour remplacer des transporteurs physiologiques.
50
Chapitre III
4. Ingénierie métabolique de C. acetobutylicum :
La mise au point de vecteurs d’expression stables a permis de développer l’ingénierie
métabolique de C. acetobutylicum et de réaliser avec succès par l’insertion de voies de
synthèse homologues et hétérologues, telles que la voie de synthèse « vitamin B12 free » du
1,3 propanediol de C. butyricum (Gonzalez-Pajuelo et al., 2005).
L’inactivation de gènes a été réalisée à plusieurs reprises (tableau 2) mais aucune stratégie
d’ingénierie génétique par inactivation successive n’a pu être suivie en raison de
l’accumulation des marqueurs de résistance aux antibiotiques.
Souche
Génotype
Référence
R
SKO1
PJC4BK
PJC4PTA
PJC4AAD
∆spoA, MLS
buk-, MLSR
pta-, MLSR
aad-, MLSR
ATCC 824 buk
∆SpoIIE, buk-, CatP
(Harris et al., 2002)
(Green & Bennett, 1996b)
(Green & Bennett, 1996a)
(Green & Bennett, 1996d)
WO 2006/007530
Tableau 2 : Inactivations de gènes réalisés chez C. acetobutylicum.
La recombinaison homologue est la technique la plus utilisée afin de réaliser ces
modifications génétiques (Datsenko & Wanner, 2000; Fabret et al., 2002). C. acetobutylicum
n’est pas une bactérie naturellement transformable. Elle produit un grand nombre de DNases
extracellulaires qui dégradent les produits plasmidiques ou PCR avant leur entrée dans la
cellule et rend par conséquent très difficile toute modification par la technique de
recombinaison homologue.
Plusieurs travaux sont actuellement en cours afin de déterminer les conditions de
transformation optimales chez C. acetobutylicum. Deux méthodologies de modification
génétique successive de C. acetobutylicum sont actuellement disponibles et fonctionnelle
(PCT/EP2006/0669976, Clostron, Minton, et coll7).
6
7
C. Croux and P. Soucaille, Laboratoire des Biotechnologies Bioprocédés, INSA Toulouse.
Nigel P. Minton , Institute of infection, Immunity & inflammation, University of Nottingham
51
Chapitre III
5. Les hydrogénases :
Les hydrogénases sont un groupe d’enzymes qui connaît un regain d’intérêt avec
l’émergence de l’hydrogène comme futur vecteur énergétique de nos sociétés. Ces enzymes
sont les bio-catalyseurs responsables de la production de l’hydrogène chez de nombreuses
espèces de micro-organismes. La connaissance des mécanismes biochimiques à l’origine de
leur activité fait actuellement l’objet d’une recherche très active en particulier sur leur grande
sensibilité à l’oxygène, un inhibiteur puissant et irréversible de leur activité qui représente un
verrou technologique important pour de futures applications industrielles. Les mécanismes de
transferts de gaz, de protons et d’électrons à l’intérieur de la protéine sont actuellement au
centre d’enjeux scientifiques et industriels d’envergure.
L’activité hydrogénase a été mise en évidence en 1931 par Stephenson et Stickland. Les
hydrogénases sont définies comme des métalloenzymes capables de catalyser le clivage
hétérolytique de la molécule d’hydrogène ou inversement sa synthèse à partir de protons et
d’électrons selon la réaction réversible suivante (Adams, 1990):
2H+ + 2e-
H2
La quasi-totalité des hydrogénases peuvent catalyser cette réaction dans les deux sens in vitro,
mais elles réalisent in vivo la production ou l’oxydation de l’hydrogène en fonction des
besoins métaboliques du micro-organisme.
Les premières hydrogénases ont été isolées chez des procaryotes notamment chez des
bactéries et des archea. Elles ont ensuite été identifiées chez certains eucaryotes et plus
particulièrement
dans
les
compartiments
subcellulaires
de
protozoaires
nommés
hydrogénosomes ainsi que dans les chloroplastes de nombreuses algues vertes.
5.1 Rôle des hydrogénases
Les hydrogénases présentent une grande variabilité fonctionnelle au sein des microorganismes qui les hébergent mais on peut les regrouper en 3 catégories principales :
-
Les bactéries qui utilisent les hydrogénases pour catalyser la production
d’hydrogène, ou la réduction des protons, au cours d’un processus fermentatif
52
Chapitre III
couplé à l’oxydation de substrats carbonés. Ce processus a lieu chez les bactéries
anaérobies strictes, telles que les Clostridia, en leur permettant de disposer d’un
excès de pouvoir réducteur éliminé avec les protons comme seuls accepteurs
d’électrons (Adams et al., 1981).
-
Chez de nombreuses bactéries aérobies ou anaérobies, l’oxydation de l’hydrogène
est une source d’électrons et peut être couplée à des réactions productrices d’énergie
telles que la phosphorylation oxydative de l’hydrogène au cours d’un processus
respiratoire. Des molécules ou ions tels que l’oxygène, le nitrate, le fumarate, le
sulfate et le dioxyde de carbone peuvent être utilisés comme accepteurs terminaux
d’électrons. Ces réactions sont responsables de la formation du méthane, de la
corrosion du fer par les bactéries sulfo-réductrices, et de la fixation des nitrates.
-
La réduction cytoplasmique des protons induit l’alcalinisation du cytoplasme par
rapport au périplasme. Ce processus contribue à générer un gradient de protons dont
la dissipation va permettre la synthèse d'ATP. La diffusion des protons à travers des
complexes protéiques appelés ATPosomes crée une force protomotrice apte à
entraîner la synthèse d'ATP. Ce couplage osmo-chimique est appelé phosphorylation
oxydative. Il a été montré que l’hydrogénase était directement impliquée dans la
génération d’un gradient de protons chez C. acetobutylicum (Girbal et al., 1994).
Les hydrogénases peuvent interagir avec des systèmes de transport d’électrons, insérés dans
les membranes pour maintenir l’équilibre d’oxydo-réduction (chez les microorganismes
photosynthétiques comme les cyanobactéries). Les hydrogénases impliquées dans les
processus fermentatifs, jouent un rôle biologique important dans la conservation de l’énergie
et dans la génération de la force protomotrice.
5.2 Localisation des hydrogénases
Ces différentes fonctions sont souvent associées à des compartiments cellulaires variés.
La production d’hydrogène est généralement une fonction associée au cytosol tandis que la
consommation d’hydrogène est le plus souvent périplasmique ou associée aux membranes.
Les hydrogénases bidirectionnelles sont généralement localisées dans le cytoplasme.
Certaines bactéries possèdent plusieurs hydrogénases situées dans des compartiments
cellulaires distincts. La multiplicité des hydrogénases chez certains organismes reflète
53
Chapitre III
l’importance du rôle de l’hydrogène dans leur métabolisme et assure une réponse rapide et
efficace aux variations des besoins énergétiques lors de changements des conditions de
croissance.
5.3 Classification des hydrogénases
Plus d’une centaine d’hydrogénases ont été caractérisées génétiquement et/ou
biochimiquement. Par comparaison de leur site catalytique et de leur teneur en métaux, trois
classes phylogénétiquement distinctes d’hydrogénases peuvent être mises en évidence
(Vignais et al., 2001 ; Vignais et Colbeau, 2004) :
Le groupe des [NiFe]-hydrogénases, est majoritairement représenté dans la famille des
hydrogénases. Elles présentent un atome de nickel et de fer au sein de leur site actif. Certaines
d’entre elles contiennent un atome de nickel chélaté par un atome de sélénium sous la forme
d’une sélénocystéine (He et al., 1989). Elles fonctionnent principalement dans le sens de
consommation d’hydrogène.
-
Les [FeFe]-hydrogénases, leur site actif ne contient pas de nickel mais seulement du
fer. Elles sont en général présentes chez les micro-organismes fermentatifs
anaérobies stricts produisant de l’hydrogène tels que C. acetobutylicum.
-
Les hydrogénases anciennement « sans métaux » (Berkessel et Thauer, 1995), et
maintenant plus justement nommées hydrogénases sans centre fer-soufre (EC
1.12.99.4) sont minoritaires. Elles possèdent un cofacteur organique contenant un
atome de fer en guise de site catalytique (Lyon et al., 2004a).
5.4 Les hydrogénases à fer
Les [FeFe]-hydrogénases contiennent seulement des atomes de fer au niveau du site
actif de la protéine, et ne contiennent pas de nickel. In vivo, elles catalysent préférentiellement
la réaction de production d’hydrogène. La ferrédoxine, la flavodoxine et le cytochrome
réduits sont les donneurs d’électrons physiologiques des [FeFe]-hydrogénases.
Contrairement aux [NiFe]-hydrogénases, les [FeFe]-hydrogénases sont le plus souvent
monomériques et leur poids moléculaire est approximativement de 60kDa. Elles sont
constituées seulement d’une unité catalytique mais contiennent souvent des domaines
54
Chapitre III
accessoires qui logent des centres fer-soufre. Elles sont extrêmement sensibles à l’inactivation
par l’oxygène.
Les [FeFe]-hydrogénases sont retrouvées moins fréquemment que les [NiFe]hydrogénases dans le monde du vivant. Elles ont été identifiées chez quelques bactéries
anaérobies et eucaryotes mais jamais à notre connaissance chez les archea. Ces enzymes ont
été purifiées chez des micro-organismes fermentatifs anaérobies stricts (Clostridia,
Megasphaera elsdenii), chez certaines bactéries hyperthermophiles telles que T. maritima, ou
des bactéries réductrices de sulfate telles que Desulfovibrio, ainsi que chez des eucaryotes tels
que les algues vertes (C. reinhardtii) et chez le protozoaire Trichomonas vaginalis (Adams et
al., 1990, 2000).
Les [FeFe]-hydrogénases d’eucaryotes sont localisées dans des organelles délimitées par des
membranes comme les chloroplastes ou les hydrogénosomes.
Les hydrogénases à fer des bactéries anaérobies (C. acetobutylicum (HydA et HydB), C.
pasteurianum (CpI), M. elsdenii, S. obliquus, C. reinhardtii (HydA1, HydA2)) sont
monomériques et cytoplasmiques. A contrario, celles des bactéries réductrices de sulfate
Desulfovibrio vulgaris Hildenborough (DvH), Desulfovibrio desulfuricans (DdH), D.
fructosovorans sont dimériques et périplasmiques.
5.4.1 Génétique
Les hydrogénases à fer monomériques de C. acetobutylicum, C. pasteurianum, M.
elsdenii, C. reinhardtii ont été clonées respectivement par Gorwa et al., 1996 ; King et al.,
2006 ; Meyer et Gagnon, 1991 ; Atta et Meyer, 2000 et Happe et Naber, 1993.
La [FeFe]-hydrogénase HydA de C. acetobutylicum possède 71% d’identité avec la [FeFe]hydrogénase I de C. pasteurianum.
L’hydrogénase à fer de D. vulgaris Hildenborough (DvH) a été clonée par Voordouw et al.,
(1985) et séquencée par Voordouw et Brenner, (1985). Les autres séquences d’hydrogénases à
fer de l’espèce Desulfovibrio ont été étudiées par Voordouw, (1990 et 1992).
Les séquences protéiques des petites et grandes sous-unités de la [FeFe]-hydrogénase D.
desulfuricans ATCC7757 sont exactement les mêmes que celles de la [FeFe]-hydrogénase de
D. vulgaris Hildenborough (Hatchikian et al., 1992, 1999).
55
Chapitre III
Les gènes des hydrogénases à fer monomériques sont organisés en opéron monocistronique
tandis que les gènes des hydrogénases à fer dimériques sont plutôt organisés en opéron
multicistronique. L’opéron d’une hydrogénase à fer dimérique est constitué des deux gènes
qui codent respectivement pour la petite et la grande sous-unité de l’enzyme.
5.4.2 Structure globale
La plupart des [FeFe]-hydrogénases sont monomériques. Cette unité catalytique est
composée au moins du domaine très conservé d’environ 350 résidus contenant le site actif,
appelé centre H.
Les plus petites [FeFe]-hydrogénases ne sont constituées que du domaine du centre H.
Elles sont retrouvées chez les algues vertes telles que S. obliquus (44,5 kDa), C. fusca (45
kDa), C. reinhardtii (53,1 kDa). Deux [FeFe]-hydrogénases fonctionnelles chez C. reinhardtii
ont été rapportées : HydA1 et HydA2 (Happe et al., 2002 ; Forestier et al., 2003). Leur
donneur d’électron physiologique est la ferrédoxine PetF, elle relie l’hydrogénase
chloroplastique à la chaîne de transport d’électrons photosynthétique (Florin et al., 2001 ;
Happe et al., 2002 ; Winkler et al., 2002). Le modèle structural de la [FeFe]-hydrogénase
HydA1 de C. reinhardtii est représenté sur la figure 7.
Centre H
Figure 7 : Modèle de structure de l’hydrogénase à fer HydA1 de C. reinhardtii.
En plus du centre H, l’unité catalytique peut également contenir des domaines additionnels et
accessoires comprenant des centres fer-soufre.
56
Chapitre III
Ainsi basée sur la même forme de centre H, la [FeFe]-hydrogénase I monomérique de
C. pasteurianum contient un domaine additionnel et deux domaines accessoires. Sa structure
tridimensionnelle a été déterminée à une résolution de 1,8 Å par cristallographie par Peters et
al., en 1998 (Figure 8).
Site actif
Centre H
FS4 (A-C)
Centres [4Fe-4S]
FS2
Centre [2Fe-2S]
Figure 8 : Structure cristallographique de l’hydrogénase à fer I monomérique de C. pasteurianum à 1,8Å de
résolution (Peters et al., 1998). Les centres [Fe-S] sont représentés en jaune et vert.
Elle possède le domaine contenant le site actif (centre H), le domaine additionnel (centre F)
comprenant les deux centres [4Fe-4S] (FS4B et FS4A) profondément enfouis au cœur de la
protéine, et les deux domaines accessoires, qui sont composés d’un centre [4Fe-4S] (FS4C) et
d’un centre [2Fe-2S] (FS2) situés en surface de la protéine. Cette structure est comparable à
un champignon, où le chapeau correspondrait à la structure de l’hydrogénase HydA1 de C.
reinhardtii.
57
Chapitre III
5.4.3 Le domaine catalytique
Les premières séquences des [FeFe]-hydrogénases ont mis en évidence une très bonne
conservation de la partie C-terminale de l’unité catalytique où est situé le site actif.
Les deux structures tridimensionnelles des [FeFe]-hydrogénases de C. pasteurianum CpI et D.
desulfuricans DdH ont révélé la structuration protéique unique du domaine du centre H
(Figure 9). Le site actif est constitué d’un centre ferrique binucléaire [FeFe] relié à un centre
[4Fe-4S] fixé par des liaisons thiolates aux cystéines de la protéine (Nicolet et al., 1999;
Peters et al., 1998).
A
B
Figure 9 : A. Site actif des [FeFe]-hydrogénases CpI et DdH de C. pasteurianum (Peters et al., 1998) B. Site
actif de l’[FeFe]-hydrogénases de D. desulfuricans (Nicolet et al., 1999).
La structure du site actif de l’hydrogénase I de C. pasteurianum suggère la présence de deux
ligands diatomiques CO et deux ligands diatomiques CN- liés aux deux atomes de fer et une
molécule d’eau liée à l’atome de fer Fe2. Ce site catalytique apparaît être dans une forme
aérobie oxydée « H-oxydé » (Pierik et al., 1998). Le spectre IR de l’enzyme aérobie inactive
de D. vulgaris suggère que le centre binucléaire contient les mêmes ligands diatomiques, deux
CO et deux CN-, liés aux deux atomes de fer, et un ligand CO pontant les deux atomes de fer
(Nicolet et al., 2001 ; Pierik et al., 1998). L’état redox de ce site catalytique est appelé « Hinactif ». Les différences ainsi observées au niveau du site bimétallique peuvent être attribués
aux différences d’états d’oxydation des atomes de fer et ceci pourrait être en accord avec un
mécanisme d’oxydation réversible de l’hydrogène impliquant un déplacement de la molécule
d’eau lié à l’atome de fer Fe2 de l’enzyme.
58
Chapitre III
5.4.4 Maturation des [FeFe]-hydrogénases
L’assemblage et l’insertion du centre bimétallique dans une métalloprotéine nécessitent
souvent des protéines accessoires spécifiques (Casalot et Rousset, 2001 ; Vignais et Colbeau,
2001, 2004) et la formation du site actif des [FeFe]-hydrogénases semblait provenir d’un
processus de maturation différent de celui des [NiFe]-hydrogénases.
Des gènes ont été identifiés chez C. reinhardtii par Posewitz et al., en 2004, comme
étant essentiels pour la formation du site actif des [FeFe]-hydrogénases : les gènes hydEF et
hydG.
- Le gène hydEF code pour la protéine HydEF constituée de deux domaines. Le domaine Nterminal de HydEF est homologue à la superfamille des protéines à radical Sadénosylméthionine (enzymes radical SAM) et contient le motif C-X3-C-X2-C qui est la
signature de cette famille de protéines. Le domaine C-terminal contient un site de fixation du
GTP, qui prédit une activité GTPase, et un motif de fixation des centres fer-soufre C-X-HX45-H-C-X2-C.
- Le gène hydG est adjacent à hydEF. Il est arrangé de telle façon qu’il peut produire trois
protéines différentes à partir du même promoteur. Ces trois protéines sont homologues aux
protéines à radical SAM car elles contiennent le motif C-X3-C-X2-C, et elles contiennent aussi
un motif de fixation des centres fer-soufre.
Ces gènes sont très conservés parmi les organismes séquencés possédant une [FeFe]hydrogénase. Chez certains organismes tels que C. acetobutylicum, le gène hydEF est dissocié
en deux gènes distincts hydE et hydF codant pour les deux protéines HydE et HydF.
L’organisation des gènes peut varier selon les organismes en opéron multicistronique
contenant ou non le gène structural de l’hydrogénase à fer.
5.4.5 Transport intra-moléculaire substrat/produit :
Les [FeFe]-hydrogénases sont des catalyseurs très efficaces de la production
d’hydrogène. Cette réaction de catalyse se situe au niveau du site actif de l’enzyme. Les
différents éléments nécessaires à la réaction : les électrons, les protons et l’hydrogène (dans le
cas de la réaction inverse), doivent donc entrer dans la protéine et interagir avec le site actif.
Des chemins préférentiels de ces différentes molécules ont été mis à jour.
59
Chapitre III
Un canal hydrophobe dans lequel peut être transporté des protons relie la surface de la
molécule au centre bimétallique du site actif de l’enzyme. Toutes les cystéines et quelques
acides aminés entourant ce canal sont strictement conservés. L’existence d’un chemin de
transfert des protons qui relie le site actif profondément enfoui à la surface de la protéine a été
démontré récemment (Cohen et al., 2005). Les structures cristallographiques des [FeFe]hydrogénases I de C. pasteurianum (CpI) et de D. desulfuricans (DdH) (Nicolet et al., 1999;
Peters et al., 1998) ont également révélé plusieurs groupes donneurs ou accepteurs de protons
proche du site actif de l’enzyme.
Un canal hydrophobe de transfert gazeux relie la surface de la molécule au centre
bimétallique du site actif de l’enzyme. La molécule d’hydrogène est une petite molécule qui
semble pouvoir diffuser à travers la protéine sous de multiples chemins dynamiques grâce aux
fluctuations de la conformation de la protéine. Les analyses cristallographiques et les calculs
de dynamiques moléculaires ont fortement suggéré que l’hydrogène pourrait utiliser une
cavité hydrophobe et un réseau de canaux observés dans les [NiFe]-hydrogénases pour
naviguer du site actif à la surface de la protéine (Montet et al., 1997).
Par simulation de dynamique moléculaire, la diffusion d’hydrogène dans la [FeFe]hydrogénase I de C. pasteurianum a été étudiée par Cohen et al., 2005 (figure 10).
Ferrédoxine /
Flavodoxine
Figure 10 : Trajectoire de la diffusion moléculaire des protons et de l’hydrogène dans la [FeFe]- hydrogénase I
de C. pasteurianum (Cohen et al., 2005) et chemin de transfert des électrons en provenance des partenaires
physiologiques : Ferrédoxine et Flavodoxine.
60
Chapitre III
En dépit du fait que ces expériences de diffusion du deutérium montrent que la majorité
des molécules d’hydrogène lourd (deutérium) migrent vers une série de cavités hydrophobes
conservées, ou canal à hydrogène (Nicolet et al., 2002), les molécules d’hydrogène léger sont
quant à elles capables de diffuser en même temps par de nombreux passages alternatifs (figure
11).
La diffusion de l’oxygène dans la protéine est une question qui suscite actuellement
beaucoup d’intérêt. Dans le but de diminuer, voir d’ôter complètement la sensibilité des
[FeFe]-hydrogénases à l’oxygène, beaucoup d’études de diffusion de gaz couplées ou non à
de la mutagenèse dirigée ont été réalisées. La délétion de tous les domaines accessoires de
l’hydrogénase à fer de C. acetobutylicum a montré par exemple que les domaines accessoires
servent de protection du site actif vis-à-vis de l’oxygène (Cohen et al., 2005).
Une trajectoire de diffusion de l’oxygène plus définie que celle de diffusion de
l’hydrogène a été déterminée par simulation de dynamique moléculaire (figure 11).
Contrairement à l’hydrogène les molécules d’oxygène sont contraintes du fait de leur taille
plus importante de passer par les canaux principaux, elles ne se dispersent pas dans les
passages secondaires que l’hydrogène est capable d’emprunter.
Site actif
A
B
Figure 11 : Trajectoires de la diffusion moléculaire simultanée de 1000 copies de O2 invisibles à partir du site
actif de l’hydrogénase CpI (A) une superposition de toutes les positions de O2 et de leurs trajectoires sur 2.3 ns et
(B) trajectoires instantanées de O2 après 20 ps (Cohen et al., 2005).
Cette constatation laisse entrevoir la possibilité de modifier la sensibilité de l’hydrogénase de
manière indépendante de la diffusion de l’hydrogène indispensable à la réaction. Le degré de
sensibilité des hydrogénases à fer d’algues vertes ou de bactéries, semble également
61
Chapitre III
largement influencé par la nature des acides aminés qui tapissent le chemin de diffusion.
Certains travaux récents (Rousset, 2007, non publié) sur les hydrogénases Ni-Fe semblent
également aller dans ce sens.
La diffusion des gaz dans la protéine semble donc gouvernée principalement par les
propriétés chimiques du gaz et ses interactions avec les résidus présents au sein du site actif et
des canaux de diffusion.
5.4.6 Transfert d’électrons intra-moléculaire
La condition nécessaire à un transfert d’électrons entre deux centres fer-soufre est une
distance optimale entre les centres de 12 Å. Les hydrogénase [FeFe] Clostridiales comportent
5 centres [FeS] (figure 10) (4 [4Fe-4S] et 1 [2Fe-2S]) éloignées de 8 à 11 Å, sauf pour les
deux centres distaux éloignés de 17 Å. La position relative de chacun des centres [FeS] met
en évidence un passage potentiel de transfert d’électrons à l’intérieur de la structure.
Le centre FS2, ainsi que le centre FS4C, se situent près de la surface de la protéine. Ils
peuvent tous deux transférer des électrons du centre FS4B vers un accepteur d’électrons
externe, mais ne peuvent pas transférer des électrons de l’un à l’autre car ils sont trop éloignés
(17 Å). Ces deux centres FS2 et FS4C sont tous les deux des centres de transfert d’électrons
potentiels dans le transfert inter-moléculaire d’électrons, mais aucune indication n’est
apportée sur la préférence d’un centre par rapport à l’autre dans l’interaction avec différents
partenaires (Peters et al., 1998).
Lorsque l’unité catalytique des hydrogénases n’est constituée que du domaine conservé du
centre H comme chez les [FeFe]-hydrogénases des algues vertes, la distance entre le centre H
et la surface de la protéine est significativement réduite, de même que le transfert intramoléculaire des électrons.
5.4.7 Transfert d’électrons inter-moléculaire
Le centre bimétallique des hydrogénases à fer est relié à la surface par une suite de
centres [Fe-S] pour échanger des électrons avec un partenaire d’oxydo-réduction externe,
constituant un chemin de transfert électronique intra- puis inter-moléculaire.
62
Chapitre III
Les
partenaires
d’oxydo-réduction
physiologiques
des
[FeFe]-hydrogénases
Clostridiales sont les ferrédoxines de type 2[4Fe-4S] et les flavodoxines (Fitzgerald et al.,
1980).
Les hydrogénases semblent relativement flexibles quand à leur partenaire d’oxydoréduction
(Fitzgerald et al., 1980) mais les différents mécanismes intervenant dans l’interaction et dans
le transfert électronique n’ont pas encore tous été identifiés. Nous nous intéresserons plus
particulièrement à l’interaction entre l’hydrogénase à fer et la ferrédoxine qui fait l’objet
d’une partie des travaux expérimentaux présentés dans ce mémoire.
Interaction [FeFe]-hydrogénase – ferrédoxine
Le rôle des forces électrostatiques dans l’interaction entre les ferrédoxines 2[4Fe-4S] et
la [FeFe]-hydrogénase de C. pasteurianum a été étudié par mutagenèse dirigée (Moulis et
Davasse, 1995). Malgré la présence de plus de 6 acides carboxyliques (glutamate, aspartate)
très conservés à la surface de cette ferrédoxine, leur implication dans l’interaction
ferrédoxine/[FeFe]-hydrogénase semble mineure. La substitution de plus de 4 de ces acides
aminés chargés négativement (glutamate, aspartate) par des résidus neutres induit un
changement important des propriétés électrostatiques de la ferrédoxine, en modifiant la charge
globale et la distribution des charges en surface de la protéine, cependant très peu de
modifications sont observées au niveau de la structure et du potentiel redox de la protéine
(Brereton et al., 1999). Seuls les variants dont l’environnement immédiat des centres fersoufre est perturbé montrent une variation d’un facteur 2 de leur efficacité catalytique avec
l’hydrogénase (Moulis et Davasse, 1995). Ainsi, le transfert d’électrons ne semble pas être
directement relié à la présence de un ou deux résidus spécifiques chargés de surface de la
ferrédoxine et par conséquence à des interactions purement électrostatiques. Le potentiel
redox du système semble avoir une influence importante au niveau du ce transfert
électronique.
Il est intéressant de constater que la simple mutation de substitution de chacune des prolines
P19 et P48 adjacentes à la dernière cystéine liée du motif de fixation des centres [4Fe-4S] (CX2-C-X2-C-X3-C-P), induit des modifications des potentiels redox des centres de la
ferrédoxine et changements des propriétés structurels de la ferrédoxine de C. pasteurianum,
mais ne provoque pas de différences importantes du turnover enzymatique avec l’hydrogénase
63
Chapitre III
de C. pasteurianum, excepté pour la substitution de la proline en lysine (Quinkal et al., 1994).
Ainsi ces deux prolines stabilisent fortement les centres fer-soufre de la ferrédoxine, mais ne
jouent pas de rôle essentiel dans le mécanisme de transfert d’électrons.
Cependant, un changement significatif dans le transfert d’électrons entre la ferrédoxine et
l’hydrogénase a été observé lorsque la structure de la chaîne polypeptidique entourant un des
centres fer-soufre a été modifiée. Notamment pour la mutation de la proline P19 en lysine qui
induit un changement important de la constante apparente de Michaelis dans la réaction avec
l’hydrogénase, tandis que la substitution de la proline P48 en lysine n’a aucun effet (Quinkal
et al., 1994)
Toutes ces données suggèrent que le complexe ferrédoxine/[FeFe]-hydrogénase n’est pas lié à
un nombre limité d’interactions localisées impliquant un petit nombre de résidus, mais plutôt
utilise une forme de complémentarité stérique entre l’ensemble des molécules avec un
transfert électronique régit par le potentiel d’oxydoréduction. Lorsque ces conditions sont
rassemblées le transfert d’électrons est alors possible. Des expériences de modélisation
moléculaire de « docking » ferrédoxine/hydrogénase ont été réalisées entre la C. acidurici et
la [FeFe]-hydrogénase de C. pasteurianum (Kümmerle et al., 2000) (figure 12). Ce complexe
a été généré en ne considérant que les 209 premiers résidus N-terminaux de l’hydrogénase. La
zone d’interaction a été confirmée par des calculs en haute résolution (2,5 Å). La région
exposée de la ferrédoxine se situe au niveau des résidus 16-21 et 33-46, entourant un centre
fer-soufre. La zone d’interaction de l’hydrogénase est, elle, au niveau des résidus 20-25, 3538, 103-111, 152-160, 195-200. Dans ce complexe, le centre fer-soufre de la ferrédoxine
coordonné aux cystéines 18, 37, 40, 43, se trouve à moins de 15 Å des deux centres fer-soufre
FS2 et FS4C et du centre FS4B, la plus grande distance étant celle avec le site catalytique.
Cette géométrie est en accord avec un transfert d’électrons efficace à travers ces groupes
prosthétiques.
64
Chapitre III
Ferrédoxine
Hydrogénase
Figure 12 : Complexe d’interaction obtenu par modélisation moléculaire numérique entre la structure de la
ferrédoxine de C. acidurici (en noir) et l’hydrogénase de C. pasteurianum (en gris).
Le domaine N-terminal de l’hydrogénase est en gris avec ses centres fer-soufre [4Fe-4S] (sphères grises). La
ferrédoxine est représentée en noir, avec ses centres fer-soufre (sphères noires) (Kümmerle et al., 2000).
La géométrie des ferrédoxines 2x[4Fe-4S] bactériennes semble donc d’une importance
capitale au niveau de l’interaction avec ses partenaires. Bien que les interactions
électrostatiques apparaissent de faible importance dans certains travaux, il convient de
s’interroger sur la faible amplitude de variation de la charge prodiguée par une, deux ou
quatre mutations dirigées qui peuvent de plus modifier la structure de la protéine et perturber
la reconnaissance protéine/protéine. Il est en effet difficile de moduler expérimentalement la
charge de surface de ces ferrédoxines de manière significative sans affecter leur structure
globale. Leur petite taille (50 à 60 acides aminés pour les ferrédoxines de type clostridiales)
implique que chaque acide aminé peut à la fois avoir un rôle structural et un rôle dans le
transfert d’électrons. Une partie des travaux développés au cours de cette thèse a permis de
compléter ces observations par une approche plus radicale (voir chapitre VII).
65
Chapitre III
5.4.8 Caractérisation biochimique
Les [NiFe]-hydrogénases catalysent généralement in vivo préférentiellement la réaction
d’oxydation de l’hydrogène alors que les [FeFe]-hydrogénases catalysent plutôt la production
d’hydrogène. De plus, l’activité catalytique des [FeFe]-hydrogénases est 10 à 100 fois plus
élevée que celle des [NiFe]-hydrogénases, (Albracht, 1994 ; Frey, 2002) et les [FeFe]hydrogénases possèdent une constante d’affinité pour l’hydrogène deux fois plus élevée que
celle des [NiFe]-hydrogénases. Les [FeFe]-hydrogénases sont donc les catalyseurs de la
production d’hydrogène biologique les plus efficaces connus à ce jour.
La bactérie anaérobie C. acetobutylicum ATCC 824 contient deux [FeFe]-hydrogénases
(HydA et HydB) monomériques et cytoplasmiques, extrêmement sensibles à l’oxygène. La
purification de la [FeFe]-hydrogénase HydA de C. acetobutylicum ATCC 824 sous forme de
protéine de fusion avec l’étiquette Strep-tag a déjà été effectuée et les activités spécifiques
correspondantes (tableau 3) ont été rapportées par deux groupes, après une expression
homologue (Girbal et al., 2005) et après une expression hétérologue chez E. coli (co-exprimé
avec les trois protéines de maturation) (King et al., 2006). Dans les deux cas, les résultats
montrent de faibles activités in vitro de production de l’hydrogène, au moins 50 fois
inférieure à 4 000 mol/min.mg, rapportée pour la [FeFe]-hydrogénase I de C. pasteurianum
(Adams et Mortenson, 1984).
[FeFe]-hydrogénase HydA
de C. acetobutylicum
Ferrédoxine
Vmax
Km
Vmax
Méthyl
Production d’H2
Consommation d’H2
51
160
6 10
-6
10
Km
0,3 10
Vmax
75,2
23 10-6
10 057
-3
128 10-3
viologène
-
Tableau 3 : Activités spécifiques de la [FeFe]-hydrogénase HydA de C. acetobutylicum ATCC824.
(Vmax exprimés en µmol d’H2.min-1.mg-1, Km exprimés en M) source: (Girbal, 2005), (King, 2006), (Happe et
Naber, 1993).
66
Chapitre III
Il a été montré pour l’hydrogénase à fer I de C. pasteurianum qu’elle pouvait interagir avec
un large spectre de substrats de type « electrons carrier » in vitro (Fitzgerald et al., 1980).
Ces substrats possèdent tous des groupements caractéristiques tels que les domaines de type
2x[4Fe-4S] des ferrédoxines bactériennes, les domaines [2Fe-2S] des ferrédoxines de plantes
et les domaines de type FMN et flavine caractéristiques des flavodoxines.
67
Chapitre III
6. Les Ferrédoxines :
6.1.1 Généralités
Les ferrédoxines sont les premières protéines Fer-Soufre (Fe-S) à avoir été découvertes
au début des années 1960 (Mortenson et al., 1962; Tagawa & Arnon, 1962). Cette
dénomination a été choisie car la protéine de couleur brune en solution, fortement retenue sur
une colonne chromatographique échangeuse d’ions contenait du fer.
Elles sont parmi les plus petites (50 à 120 acides aminés) métalloprotéines connues dans le
règne du vivant. Un grand nombre de ferrédoxines ont été découvert et étudié chez les
procaryotes, eucaryotes et archea (Bruschi et Guerlesquin, 1988). Elles ont la particularité de
posséder un ou deux centres [Fe-S] de différente nature ([4Fe-4S], [2Fe-2S], [3Fe-4S]...)
(figure 13 et 14) en leur sein qui agissent comme des relais d’oxydoréduction en captant puis
en transférant les électrons d’une protéine à une autre.
Leur rôle de transporteur d’électrons a été identifié très tôt grâce aux travaux de
Mortenson et coll. (1962) sur la réaction phosphoroclastique à partir d’extrait bruts de
C. pasteurianum. La ferrédoxine, aisément séparable du reste des protéines sur colonne
échangeuse d’anions, présentait la capacité d’activer certaines réactions comme la réduction
du nitrite en ammonium en se comportant comme un médiateur de type méthyl viologène.
Ces propriétés ont été confirmées depuis, par les nombreuses études dont à fait l’objet la
ferrédoxine de C. pasteurianum, qui est devenue depuis, une protéine Fe-S de référence pour
la communauté scientifique.
Le rôle des ferrédoxines dans le métabolisme est axé sur le transport d’électrons entre
différentes protéines d’oxydoréduction avec lesquelles elles sont capables d’interagir
brièvement. Elles jouent à la fois le rôle d’accepteur d’électrons à haut potentiel d’une large
gamme de protéines d’oxydoréduction et en particulier de certaines enzymes appartenant au
métabolisme central
(Pyruvate ferrédoxine oxydoréductase, glycéraldéhyde 3-phosphate
ferrédoxine oxydoréductase) et sont capables de transmettre ces électrons à d’autres protéines
telles que les hydrogénases afin de les éliminer sous forme de dihydrogène (Brereton et al.,
1999 ; Quinkal et al., 1994).
68
Chapitre III
Chez C. acetobutylicum la ferrédoxine capte les électrons issus de la Pyruvate
ferrédoxine oxydoréductase (PFOR) et les transmet à l’hydrogénase afin de les éliminer en
réduisant deux protons sous la forme de dihydrogène. Une autre protéine : la flavodoxine est
capable de se substituer à la ferrédoxine dans le métabolisme et d’interagir avec
l’hydrogénase et la PFOR en cas de carence en fer chez C. pasteurianum (Ragsdale &
Ljungdahl, 1984; Schönheit et al., 1979).
Il a été établi chez Pyrococcus furiosus que la ferrédoxine était le partenaire de la GAPOR au
cours de la réaction d’oxydoréduction menant à la transformation du glycéraldéhyde
3-phosphate en 3-phosphoglycérate. Ces ferrédoxines apparaissent donc comme étant les
partenaires respectifs des enzymes qui nous intéressent au cours de cette étude.
6.1.2 Rôle dans le métabolisme de C. acetobutylicum
La ferrédoxine clostridiale 2x[4Fe-4S] joue un rôle majeur dans le métabolisme de C.
acetobutylicum. Elle capte les électrons issus principalement de la transformation du pyruvate
en acétyl-CoA par la Pyruvate-ferrédoxine oxydoréductase (PFOR), puis les transfère
principalement à l’hydrogénase qui les élimine sous la forme de dihydrogène mais également
à plusieurs enzymes telles que les NADPH-ferrédoxine oxydoréductase (NPFO) et NADHferrédoxine oxydoréductase (NFO) (figure 2).
La voie de transfert de deux électrons de la PFOR à l’hydrogénase via la ferrédoxine permet
l’élimination de la majeure partie des équivalents réducteurs excédentaires du métabolisme de
la bactérie. La ferrédoxine intervient également dans la régulation des concentrations
intracellulaires en NADH et NAD+ en tant que substrat de la NFO. Cette régulation permet
d’adapter le métabolisme de la bactérie en fonction des conditions de croissance en modulant
le rapport NADH/NAD+ selon les besoins. De la même façon elle intervient dans la régulation
des concentrations intracellulaires en NADP et NADPH+ en modulant leur rapport en fonction
des besoins (Vasconcelos et al., 1994).
69
Chapitre III
6.1.3 Structure des ferrédoxines
Les ferrédoxines sont parmi les plus petites (5 à 15 Kd) métalloprotéines connues. Elles
sont formées d’une chaîne polypeptidique (50 à 150 acides aminés) enroulée autour d’un ou
de plusieurs centres Fe-S (figure 13).
Centres
[4Fe-4S]
Figure 13 : Structure tridimensionnelle de la ferrédoxine CpI de C. pasteurianum (structure PDB : 1CLF)
Les ferrédoxines peuvent contenir un ou plusieurs centres Fe-S de nature variée. Ces centres
de type [2Fe-2S], [3Fe-4S] ou [4Fe-4S] confèrent aux ferrédoxines leur capacité à transférer
un ou plusieurs électrons (voir figure 14).
Les ferrédoxines [2Fe-2S] ont été découvertes dans les chloroplastes des plantes
(Tagawa & Arnon, 1962), mais sont aussi présentes chez les cyanobactéries où elles
interviennent dans la dernière étape de transfert d’électron de la photosynthèse en servant de
médiateur entre le Photosystème I et la ferrédoxine NADP+ réductase, grâce à leur très bas
potentiel (-400mV). Certaines ferrédoxines de bactéries ont été placées dans cette catégorie du
fait de leur forte homologie de séquence (Cusanovich et al., 1988). On retrouve également les
ferrédoxines de Rieske (Rieske, 1964) qui sont des ferrédoxines à haut potentiel (+100 à
+300 mV) présentes dans les systèmes membranaires de transfert d’électron telles que le
complexe III de la chaîne respiratoire mitochondriale.
Les ferrédoxines possédant un centre de type [3Fe-4S] sont assez rares. La représentante
la plus étudiée est la ferrédoxine II de Desulfovibrio gigas (Kissinger et al., 1989).
70
Chapitre III
Une ferrédoxine atypique mais fonctionnelle possédant un centre [3Fe-4S] et un centre [4Fe4S] a été isolée chez Azotobacter vinelandii (Howard et al., 1983).
(A)
(C)
(B)
Figure 14 : Structure tridimensionnelle des différents types de centres [Fe-S] rencontrés dans les ferrédoxines.
(A) : Centre [2Fe-2S]
(B) : Centre [3Fe-4S]
(C) : Centre [4Fe-4S]
Il est intéressant de constater que la ferrédoxine de Pyrococus furiosus qui a été isolée
puis co-cristallisée avec la FOR possède un seul centre [4Fe-4S] (Heltzel et al., 1994; Zhou &
Adams, 1997).
Les ferrédoxines à deux centres [4Fe-4S] sont retrouvées chez de très nombreux
microorganismes du genre archaea, bacteria et eucarya. La ferrédoxine de C. pasteurianum
(figure 13) est la représentante de cette catégorie et l’une des plus étudiées.
6.1.4 Les ferrédoxines 2x[4Fe-4S]
La structure de la ferrédoxine de C. pasteurianum a été résolue (Bertini et al., 1995)
ainsi que celles de plusieurs ferrédoxines 2x[4Fe-4S] provenant de Clostridium acidurici
(Duee et al., 1994) et de Peptostreptococcus asaccharolyticus (Adman et al., 1973). Ces
71
Chapitre III
ferrédoxines comportent deux centres [4Fe-4S] de structure identique distants de d’environ 12
Å l’un de l’autre et reliés à la chaîne polypeptidique par huit cystéines. Ces résidus sont très
conservés parmi les homologues à la ferrédoxine de C. pasteurianum, ils sont répartis sur la
séquence selon le motif suivant :
Cys – X1 – X – Cys – Gly – Ala – Cys – X – X – X2 – Cys - Pro
X1 étant généralement un acide amine à chaîne latérale aliphatique : Ile ou Val
X2 étant généralement une Glu
Ce motif très conservé se retrouve en double sur la séquence espacé par seize à dix-sept
résidus (figure 15).
(1)
Fdx P. asaccharolyticus (1)
Fdx C. pasteurianum (1)
Fdx C. acidurici (1)
1
10
20
30
40
57
-AYVINDSCIACGACKPECPVNCIQEG-SIYAIDADSCIDCGSCASVCPVGAPNPED
MAYKIADSCVSCGACASECPVNAISQGDSIFVIDADTCIDCGNCANVCPVGAPVQE-AYVINEACISCGACEPECPVNAISSGDDRYVIDADTCIDCGACAGVCPVDAPVQA-
Figure 15 : Alignement de séquence entre les ferrédoxines de C. pasteurianum, C. acidurici et P.
asaccharolyticus.
Les clusters de cystéines impliqués dans la liaison avec les deux centres [4Fe-4S] sont fléchés en noir.
On observe une symétrie interne très prononcée entre les deux moitiés de la séquence
des ferrédoxines 2x[4Fe-4S] ainsi qu’au niveau de la structure globale. Cette caractéristique
provient probablement de la duplication d’un gène ancestral. Compte-tenu de la très petite
taille de la protéine, les structures secondaires sont très limitées avec un feuillet antiparallèle
au niveau des résidus 22 et 32 et parfois deux pseudo-hélices α au niveau des résidus 17 et 42
(Figure 16).
72
Chapitre III
Hélices α
Feuillets β antiparallèle
Figure 16 : Représentation schématique des structures secondaires présentes dans les séquences en acides
aminés des ferrédoxines 2x[4Fe-4S] de C. acidurici (A) et C. pasteurianum (B).
6.1.5 Caractéristiques biophysiques des ferrédoxines 2x[4Fe-4S]
Les propriétés biophysiques des ferrédoxines ont été étudiées par différentes techniques de
spectroscopie qui ont évolué au fil du temps et des progrès de la technologie.
6.1.5.1 La spectroscopie UV-visible
La spectrométrie UV-visible permet de détecter les centres [Fe-S] réduits des
ferrédoxines à une longueur d’onde comprise entre 390 et 420 nm. Un pic d’amplitude
maximale est obtenu à ces longueurs d’ondes lorsque la ferrédoxine est complètement réduite
(figure 17).
73
Chapitre III
Figure 17 : Spectre UV-visible de la ferredoxine 2x[4Fe-4S] de Clostridium thermoaceticum (Yang et al.,
1977b).
En ligne continue : spectre de la ferredoxine native. En pointillés : spectre de la ferrédoxine complètement
réduite par de l’hydrosulfite de sodium («dithionite»).
6.1.5.2 La résonnance paramagnétique electronique (RPE)
La spectroscopie RPE a joué un rôle déterminant dans la découverte des protéines Fe-S
au début des années 1960. A cette époque plusieurs équipes travaillant sur des sujets très
différents avaient mis en évidence la présence de fer non héminique dans des facteurs
protéiques (Ke et al., 1973). C’est l’analyse des spectres RPE de ces facteurs protéiques qui a
alors permis d’unifier les différents faisceaux de résultats indépendants, et ont contribué à la
naissance de la notion de protéine Fe-S.
L’obtention d’un signal en RPE est conditionnée par la présence au minimum d’un
électron non apparié dans la molécule étudiée. Les métaux paramagnétiques présents dans les
protéines tels que le cuivre, le molybdène, le tungstène, le nickel, le cobalt, le manganèse, le
vanadium et le fer, sont responsables de l’obtention d’un signal en RPE. Dans le cas des
ferrédoxines 2x[4Fe-4S] (telle que la CpI de C. pasteurianum) la présence de centres Fe-S
réduits permet de détecter un signal en RPE :
-
A l’état oxydé, le centre est sous la forme [4Fe-4S]2+, il est constitué de deux ions
ferreux Fe2+. Cependant, la spectroscopie Mössbauer qui permet d’observer les
74
Chapitre III
transitions nucléaires du noyau
57
Fe ne montre qu’un seul signal pour les centres [4Fe-
4S]2+ (Mullinger et al., 1975), ce qui signifie que les ions métalliques du cluster sont
équivalents. On est ainsi en présence de deux paires d’ions au niveau à valence mixte
Fe2,5+ qui sont couplées antiferromagnétiquement au sein du cluster, pour donner un spin
total nul. Lorsque le cluster est oxydé on ne détecte aucun signal en spectroscopie RPE.
-
A l’état réduit, le cluster gagne un électron et se présente sous la forme [4Fe-4S]+, par
couplage entre trois ions Fe2+ et un ion Fe3+. Dans ce cas les quatre ions se répartissent
en deux paires d’ions non équivalentes, une paire d’ions à valence mixte Fe2,5+ et une
paire d’ions Fe2+. Le spin électronique résultant est le plus souvent de ½ ce qui permet
d’observer un signal net en RPE (figure 18).
-
Figure 18 : Spectre RPE de la ferrédoxine de éx[4Fe-4S] de C. pasteurianum (Quinkal, 1995).
a : spectre RPE de la protéine partiellement réduite (≈ 20% de l’échantillon)
b : spectre RPE de la protéine totalement réduite
Conditions d’enregistrement : température 6°K, radio-fréquence 9,15 Ghz, fréquence de modulation 100 khz,
amplitude de modulation 0.8 mT et puissance de l’onde hyperfréquence de 10 µW.
Les ferrédoxines 2x[4Fe-4S] donnent à l’état réduit des spectres RPE complexes avec un
nombre de composantes plus élevé que les trois espèces orthorhombiques attendues à spin ½.
Cette complexité diminue lorsque la ferrédoxine est partiellement réduite (environ 20%), on
enregistre alors un signal RPE révélateur d’une symétrie orthorhombique du tenseur g, très
proche de celui observé pour les ferrédoxines à un seul centre [4Fe-4S]. Dans ce cas précis
chaque molécule ne porte statistiquement qu’un seul électron. Le spectre obtenu correspond
alors à la contribution d’un seul centre [4Fe-4S]+ de spin ½.
75
Chapitre III
Lorsque la ferrédoxine est totalement réduite les deux centres [4Fe-4S]+ sont en interaction
magnétique, ce qui provoque un éclatement des pics des spectres monoréduits et donne un
spectre résultant complexe possédant au moins sept composantes. De plus, l’environnement
protéique modifie également l’allure des spectres en influençant les propriétés
spectroscopiques des centres Fe-S.
La spectroscopie RPE a été l’un des premiers outils de caractérisation des centres Fe-S et
constitue toujours de nos jours une technique qui fournit de précieuses informations sur la
structure et les propriétés électroniques du centre métallique. Le travail présenté dans ce
mémoire y fait appel lors de la caractérisation des ferrédoxines de C. acetobutylicum (chapitre
VII).
6.1.5.3 La voltampérométrie (ou PFV : protein film voltametry)
Cette technique moderne permet d’étudier les protéines redox de manière passive
(études réalisées sur les ferrédoxines) ou en cinétique catalytique (Armstrong et al., 1997;
Camba & Armstrong, 2000; Léger et al., 2003; Soc & Trans, 2002). L’adsorption des
ferrédoxines sur une électrode au graphite pyrolytique sous la forme d’un film permet
d’imposer un potentiel d’oxydoréduction donné aux centres [4Fe-4S] et d’observer un signal
correspondant sous la forme de voltampérogrammes cycliques. La petite taille des
ferrédoxines facilite le transfert des électrons entre l’électrode et la solution tampon via les
centres métalliques. Un logiciel enregistre ensuite le courant cyclique qui passe à travers la
protéine et traduit les variations mesurées sous la forme d’un voltampérogramme (figure 19)
Figure 19 : Schéma décrivant le principe de lecture d’un voltampérogramme. L’exemple présenté est celui de la
ferrédoxine de C. pasteurianum (Armstrong et al., 1997).
76
Chapitre III
Certaines ferrédoxines 2x[4Fe-4S] ont été étudiées par voltampérométrie telles que les
ferrédoxines CpI de C. pasteurianum et la CvI de Chromatium vinosum (Kyritsis et al., 1998;
Kyritsis et al., 1999) (figure 20).
Ferrédoxine CpI
Ferrédoxine CvI
Figure 20 : Voltampérogrammes des ferrédoxines CpI de C. pasteurianum et la CvI de Chromatium vinosum
(Kyritsis et al., 1998).
Cette technique permet de mesurer le potentiel d’oxydoréduction de chacun des deux centres
Fe-S d’une même molécule de ferrédoxine. Par exemple, la ferrédoxine CpI de
C. pasteurianum présente une équivalence parfaite du potentiel de ses deux centres [4Fe-4S]
(-369 mV), au contraire de la ferrédoxine de CvI de Chromatium vinosum qui possède deux
centres [4Fe-4S] de potentiel très différents (-492 mV et -663 mV). Cette différence de
potentiel d’oxydoréduction est mise en évidence sur le voltampérogramme (figure 20) par la
présence de deux pics distincts tandis que le voltampérogramme de la ferrédoxine CpI ne
présente qu’un seul pic d’amplitude plus importante.
Il est également possible de mettre en évidence par voltampérométrie la présence naturelle de
centres [3Fe-4S] dans les ferrédoxines où issus de la dégradation d’un centre [4Fe-4S] (Tilley
et al., 2001).
La voltampérométrie représente une technique rapide et efficace de caractérisation des centres
Fe-S des ferrédoxines. C’est donc naturellement que nous avons eut recours à cette méthode
77
Chapitre III
au cours de notre étude en complément des spectroscopies RPE et UV-visible afin de réaliser
la caractérisation de plusieurs ferrédoxines.
6.1.6
Rôle dans le métabolisme de C. acetobutylicum
La ferrédoxine clostridiale 2x[4Fe-4S] joue un rôle majeur dans le métabolisme de
C. acetobutylicum. Elle capte les électrons issus principalement de la transformation du
pyruvate en acétyl-CoA par la Pyruvate-ferrédoxine oxydoréductase (PFOR), puis les
transfère majoritairement à l’hydrogénase qui les élimine sous la forme de dihydrogène mais
également à plusieurs autres enzymes telles que les NADPH-ferrédoxine oxydoréductase
(NPFO) et NADH-ferrédoxine oxydoréductase (NFO) (figures 1 page 29 et figure 6 page 49).
La voie de transfert de deux électrons de la PFOR à l’hydrogénase via la ferrédoxine permet
l’élimination de la majeure partie des équivalents réducteurs excédentaires du métabolisme de
la bactérie. La ferrédoxine intervient également dans la régulation des concentrations
intracellulaires en NADH et NAD+ en tant que substrat de la NFO. Cette régulation permet
d’adapter le métabolisme de la bactérie en fonction des conditions de croissance en modulant
le rapport NADH/NAD+ selon les besoins. De la même façon elle intervient dans la régulation
des concentrations intracellulaires en NADP et NADPH+ en modulant leur rapport en fonction
des besoins (Vasconcelos et al., 1994).
78
Chapitre IV
La Glycéraldéhyde 3phosphate oxydoréductase :
Une AOR à tungstène
79
Chapitre IV
La Glycéraldéhyde 3-phosphate oxydoréductase : une AOR à tungstène
Chapitre IV
La Glycéraldéhyde 3-phosphate oxydoréductase :
une AOR à tungstène
1. Généralités sur les tungstoenzymes :
Dans les années 1970, l’effet stimulant du tungstène (W) sur la croissance de certains
micro-organismes a été démontré (Ljungdahl & Andreesen, 1975). A la suite de cette
découverte, la première tungstoenzyme a été purifiée et caractérisée, à partir d’une bactérie
acétogène nommée Clostridium thermoaceticum (Andreesen et al., 1973; Yamamoto et al.,
1983). A ce jour, plus d’une vingtaine de tungstoenzymes ont été caractérisées (tableau 4).
Enzyme
Microorganisme
Holoenzyme Nombre de sous(kDa)
unitées (kda)
Cofacteur(s)
Atomes
de W
nombre et type de
centre [FeS]
Référence
Famille AOR
AOR
Pyrococcus furiosus
FOR
Pyrococcus furiosus
GAPOR
Pyrococcus furiosus
CAR (I)
Clostridium thermoaceticum
CAR (II)
CAR
Clostridium formiaceticum
AOR
Thermococcus litoralis
FOR
Thermococcus litoralis
AOR
Eubacterium acidaminophilum
ADH
Desulfovibrio gigas
136
280
73
86
300
134
67
69
72
132
α2 (67)
α4 (69)
α (73)
αβ (64,14))
α3β3 (64,14,43)
α2 (67)
α2 (67)
α4 (69)
α (72)
α2 (62)
Bis-Wptérine
Bis-Wptérine
Bis-Wptérine
Wptérine
Wptérine
Wptérine
Bis-Wptérine
Bis-Wptérine
Bis-Wptérine
Wptérine
2
4
1
1
3
2
2
4
1
2
2[4Fe-4S] + 1Fe
4[4Fe-4S]
1[4Fe-4S]
Non déterminé
Non déterminé
Non déterminé
2[4Fe-4S]
4[4Fe-4S]
1[4Fe-4S]
2[4Fe-4S]
Adams
Munkund
Adams
White
White
White
Kletzin
Kletzin
Hensgens
-
Famille FDH
FDH
FMDH
Methanothermobacter wolfei
340
130
α2β2 (96,76)
αβγ (64,51,35)
Wptérine
Wpterine
2
1
2Se
2-5Fe
Yamamoto
Schmitz
Famille AH
Pa AH
Pelobacter acetylenicus
73
α (73)
Bis-Wptérine
1
1[4Fe-4S]
Rosner
Tableau 4 : Propriétés moléculaires des tungstoenzymes caractérisées.
2. Rôle Biologique du tungstène
Avec un numéro atomique de 74, le W est l’élément chimique le plus lourd qui a été
mis en évidence dans les systèmes biologiques. En effet, la plupart des éléments chimiques
qui composent les molécules du vivant (protéines, acides nucléiques, lipides...) dépassent
80
Chapitre IV
rarement le numéro atomique 35. Il existe quelques exceptions qui sont représentées par des
éléments rares et intégrés à des systèmes catalytiques très particuliers : il s’agit
principalement du molybdène (Mo) (42), de l’iode (53), du bore (56), du tantale (73) et du W
(74) (Silva & Williams, 2001).
L’effet biologique du W a très tôt été comparé au Mo sur des cultures de
microorganismes (Cardenas & Mortenson, 1975; Ljungdahl & Andreesen, 1975). Ces deux
éléments sont très proches au niveau de leur valence, de leur électronégativité et de leurs
propriétés de coordination chimique. Bien avant la découverte des tungstoenzymes, la
similitude de ces deux éléments a donné lieu à de nombreuses hypothèses (Dennard et al.,
1966) sur la capacité du W à remplacer le Mo au niveau des processus catalytiques
biologiques. Cependant, bien que molybdène ait pu être retrouvé de manière ubiquitaire dans
la vaste majorité des organismes biologiques (Stiefel et al., 1993), le tungstène n’a été mis en
évidence, à notre connaissance, que dans un peu plus d’une vingtaine d’organismes vivants.
Cette différence fondamentale peut être en partie expliquée par une distribution géographique
et une accessibilité beaucoup plus défavorables au W qu’au Mo. En effet, bien qu’étant tous
deux présents en quantité égale dans la croûte terrestre (tableau 5 page suivante), leur
répartition est sensiblement différente. Le molybdène est 1000 à 10000 fois plus concentré
que le tungstène dans les eaux douces, et 500000 fois plus concentré dans l’eau de mer (Rubin
& Hudson, 1994), ce qui peut suffire à expliquer la propension des organismes vivants à
utiliser le Mo plutôt que le W malgré leur proximité chimique.
Cependant, il existe des biotopes très particuliers où ce rapport tend à s’inverser, comme par
exemple les sources hydrothermales des volcans sous-marins. Les microorganismes
hyperthermophiles qui ont colonisé cet habitat extrême (la famille des Archaea Pyrococcales
et certaines Methannococcales) semblent au contraire avoir préférentiellement incorporé le
W, beaucoup plus abondant dans cette zone, (105 fois plus) que le Mo.
81
Chapitre IV
Tableau 5 : Distribution du W et du Mo dans différents biotopes terrestres (source : Kletzin and Adams, 1996).
Les flèches de couleur indiquent les concentrations en W et Mo présents dans les biotopes communénment
fréquentés par les microoganismes terrestres. Le cadre bleu indique les concentrations présentes dans des
envirronements extrêmophiles caractéristiques des microorganismes hyperthermophiles tels que P. furiosus.
L’étude de ces microorganismes a mis en évidence que certaines de leurs enzymes
incorporaient dans leur site actif un atome de W directement impliqué dans la réaction
catalytique (Kisker et al., 1997; Kletzin et al., 1995). C’est le cas des aldéhydeoxydoréductases qui ont été découvertes chez l’hyperthermophile P. furiosus et qui présentent
en leur sein un cofacteur de type tungstoptérine.
3. La famille des aldéhydes oxydoréductases
Les aldéhydes oxydoréductases (AOR) (EC 1.2.99.6) représentent une famille dans le
groupe des enzymes à tungstène et molybdène. Contrairement aux enzymes de la famille
diméthyl sulfoxide oxydoréductases (DMSOR), les AOR présentent la caractéristique d’avoir
un atome de tungstène systématiquement présent à l'emplacement du site actif enzymatique et
relié à deux cofacteurs de type pyranoptérine (Gutzke et al., 2001; Vorholt & Thauer, 2002).
Cette particularité distingue la famille d'AOR de celle des Xanthine oxydases
(molybdoenzymes) qui contiennent un atome de Mo lié à une seule ptérine et un groupe
caractéristique de type sulfide (Romao et al., 2002). La famille des AOR est subdivisée en 4
sous-groupes : les AOR : aldéhyde oxydoréductases (Heider et al., 1995; Hensgens et al.,
82
Chapitre IV
1995; Mukund & Adams, 1990; Mukund & Adams, 1991; Mukund & Adams, 1993; Strobl et
al., 1992), les FOR : Formaldéhyde oxydoréductases (Mukund & Adams, 1993; Roy et al.,
1999), les GAPOR : Glycéraldéhyde 3-phosphate oxydoréductases (Mukund & Adams,
1995) et les CAR : Carboxylic acid reductases (White, 1989; White, 1991). Ces enzymes
ont principalement été isolées chez les archaea hyperthermophiles P. furiosus et
Thermococcus litoralis et chez les bactéries acétogènes Clostridium thermoaceticum et
formicoaceticum.
La famille des AOR (figure 21) est le groupe de tungstoenzymes le plus étudié et le plus
étendu à ce jour. Les principales protéines caractérisées de ce groupe sont issues de
l’hyperthermophile P. furiosus, il s’agit de l’aldéhyde oxydoréductase (AOR), la
formaldéhyde oxydoréductase (FOR), la glycéraldéhyde oxydoréductase (GAPOR) et deux
oxydoréductases à tungstène (WOR4 et WOR5) dont la fonction est encore inconnue. Ces
cinq enzymes catalysent la transformation d’aldéhydes en carboxylates et présentent une
similarité de séquences élevée avec 40% d’identité entre la FOR et l’AOR et 23% d’identité
entre la GAPOR et l’AOR ou la FOR (Roy et al., 1999). Aucune de ces enzymes n’a montré
de similarité de séquence significative avec des molybdoenzymes connues, ce qui démontre
leur distinction phylogénétique.
Figure 21 : Famille des AOR représentée en Dendrogramme (liste non exhaustive).
Les enzymes fléchées en vert ont été caractérisées. Les groupe des GAPOR identifiées est encadré en rouge. Les
enzymes fléchées en bleu font l’objet de ce travail de thèse.
83
GAPORs
AOR C.acetobutylicum (0.3715)
GAPOR Methanococcus Jannaschii (0.2096)
GAPOR Méthanococcus Maripaludis (0.2166)
GAPOR P. abyssi (0.0605)
Gapor P. horikoshi (0.0651)
GAPOR P. furiosus (0.0946)
GAPOR Pyrobaculum aerophilum (0.3251)
WOR 5 Pfuriosus (0.3654)
AOR Eubact acidamino (0.2162)
AOR P. furiossus (0.2041)
FOR P. furiosus (0.0600)
FOR thermococcus (0.0644)
AOR coli (0.4043)
WOR 4 Pfuriosus (0.3224)
Chapitre IV
Les GAPOR constituent un groupe à part entière dans la phylogénie des AOR avec une
identité de séquences nettement inférieure au reste de la famille. Le groupe des GAPOR
marque également sa différence au niveau fonctionnel avec une grande spécificité pour le
glycéraldéhyde 3-phosphate tandis que le reste des AOR conservent une large flexibilité et
une spécificité « relative » pour certains aldéhydes.
La plupart des AOR ont été retrouvées chez des Archaea hyperthermophiles, mais
récemment une AOR à W a été découverte chez un microorganisme mésophile anaérobie:
Eubacterium acidaminophilum (Rauh et al., 2004) qui dégrade les acides aminés par des
réactions de Stickland (Gordon et al., 1954). Cette AOR est très proche de l’AOR de P.
furiosus avec un taux d’identité de plus de 57% et une homologie de séquence de près de
70%.
Une séquence d’AOR a également été retrouvée chez E. coli et présente 37% de
similarité et 25% d’identité avec l’AOR de P. furiosus. Cependant, le faible degré de
conservation des résidus impliqués dans la liaison de la ptérine et du centre [4Fe-4S] fait
douter de sa fonctionnalité.
Deux nouvelles AOR ont été découvertes chez P. furiosus et nommées WOR4 et
WOR5 (Bevers et al., 2005; Roy & Adams, 2002). La conservation de leur séquence et des
motifs structuraux impliqués dans la liaison à la W-ptérine et au centre [4Fe-4S] (sauf une
cystéine pour la WOR5) ainsi que leur capacité à utiliser une large gamme d’aldéhydes a
conduit à faire l’hypothèse de leur implication dans le catabolisme des acides aminés au
même titre que l’AOR et la FOR. La WOR4 et 5 présentent la même régulation génétique que
les autres AOR. Leur activité biochimique semble également très complémentaire des autres
AOR connues chez P. furiosus et procure à ce microorganisme la capacité de cataboliser une
très large gamme d’aldéhydes.
3.1 Rôle physiologique et propriétés catalytiques
3.1.1 Les AOR
Les AOR catalysent l’oxydation d’un grand nombre d’aldéhydes en l’acide qui leur
correspond, suivant l’équation (1).
84
Chapitre IV
RCHO + H2O + 2Fd(ox) → RCOOH + 2H+ + 2Fd(red)
(1)
Cette oxydation résulte d’une réaction impliquant le transfert de 2 électrons vers un
accepteur physiologique : la ferrédoxine (Fd) (voir chapitre III section 6). La réaction
catalysée par les AOR (1) présente la particularité rare d’avoir un potentiel d’oxydoréduction
extrêmement
bas
ce
qui
la
rend,
du
point
de
vue
théorique,
défavorable
thermodynamiquement. La purification de l’AOR de P. furiosus (Mukund & Adams, 1990;
Mukund & Adams, 1991) a démontré que l’enzyme présentait la meilleure affinité pour des
substrats
issus
de
l’oxydation
d’amino-acides
(acetaldéhyde,
phénylacetaldéhyde,
indolacétaldéhyde et isovalerylaldéhyde) (Heider et al., 1995). Cette observation a conduit à
l’hypothèse que les AOR seraient directement impliquées dans le catabolisme des acides
aminés et des carbohydrates en produisant des composés intermédiaires clé.
Ce rôle a été confirmé depuis par différentes études fondamentales sur le métabolisme des
hyperthermophiles (Sakuraba & Ohshima, 2002). Ces derniers composés sont toxiques pour
la cellule et sont oxydés en leur forme acide par l’AOR. En dépit de l’absence initiale de
structure cristallographique de l’AOR la présence du W avait été prouvée ainsi que son
caractère hétérogène (Heider et al., 1995) mais le mécanisme catalytique restait inconnu.
3.1.2 Les GAPOR
3.1.2.1 Rôle physiologique
La GAPOR de P. furiosus intervient dans la glycolyse et confère à cette archaea une
voie d’oxydation du glucose alternative à la voie d’Embden-Meyerhof-Parnas classiquement
rencontrée dans les règnes Bacteria et Eucarya. Dans ces deux règnes le glycéraldéhyde 3phosphate (GAP) est transformé en 1-3 bis-phosphoglycérate puis en en 3-phosphoglycérate
(3PG) par une réaction en deux étapes catalysées chacune par une enzyme : la glycéraldéhyde
déshydrogénase (GAPDH) et la 3-phosphoglycérate kinase (PGK). Ces deux enzymes
glycolytiques sont également présentes chez les archaea mais auraient plutôt un rôle dans la
néoglucogenèse (figure 29). Chez P. furiosus, la GAPOR catalyse la conversion du GAP en
3-phosphoglycérate sans génération d’ATP (Mukund & Adams, 1995) (figure 18).
85
Chapitre IV
La présence de la GAPOR, d’une GAPDH et d’une PGK chez P. furiosus introduit un
degré de régulation supplémentaire au niveau de la voie d’Embden Meyerhof par rapport à
une glycolyse standard. La présence d’une deuxième étape de réduction leur permet d’avoir
un rendement de production d’hydrogène deux fois plus important que celui des bactéries
mésophiles de type Clostridium avec 4 mol d’H2/mol de glucose consommé.
La perte de deux ATP au niveau de la glycolyse est compensée par la création d’un gradient
de protons couplé à la synthèse d’hydrogène au niveau d’une hydrogénase membranaire
(Sapra et al., 2003) (figure 22). Ce gradient de protons est ensuite utilisé par une ATP
synthase pour former de l’ATP.
Ce système agit comme une chaine respiratoire primitive et permet au microorganisme
d’atteindre des rendements de croissance élevés.
Figure 22 : Couplage entre la synthèse d’hydrogène et la synthèse d’ATP chez P. furiosus. (Sapra et al., 2003)
86
Chapitre IV
La GAPOR de P. furiosus est codée par le gène gor de 1959 paires de bases (pb). La
séquence de la protéine présente une grande identité de séquence avec les enzymes de la
famille des AOR et en particulier avec l’AOR et la FOR du même organisme. La recherche de
séquences homologues dans les banques génomiques internationales a conduit à la découverte
de plusieurs séquences très homologues qui sont annotées comme des GAPOR putatives et
présentes dans les archaea Methanococcus jannaschii, Methanococcus maripaludis,
Pyrobaculum aerophilum, Pyrococcus horikoshi et Pyrococcus abyssi. Des activités GAPOR
ont également été détectées chez Thermococcus littoralis et Desulforococcus amylolyticus.
Le groupe des GAPOR présente un degré d’homologie intra-groupe (56% de similarité et
42% d’identité entre la Pf GAPOR et celle de M. jannaschii et bien davantage entre GAPOR
de Pyrococcales) bien supérieur à celui constaté entre GAPOR et AOR/FOR (31% de
similarité et seulement 21% d’identité entre la Pf GAPOR et la Pf AOR). Les GAPOR
putatives découvertes chez d’autres organismes semblent donc bien conservées et la
différenciation de leur caractéristiques génétiques par rapport aux AOR se maintient très
nettement quelque soit l’organisme choisi.
3.1.2.2 Propriétés catalytiques
Tandis que les AOR et les FOR catalysent l’oxydation d’une large gamme d’aldéhydes
à courte ou longue chaîne, d’aldéhydes aliphatiques et aromatiques, la GAPOR se distingue
par une gamme de substrats catabolisables restreinte quasi exclusivement à l’oxydation du
glycéraldéhyde 3-phosphate (Mukund & Adams, 1995; Roy et al., 2001). Cette enzyme
initialement découverte chez P. furiosus n’a été identifiée que chez des Archaea telles que
Pyrococcus abyssi, Pyrococcus horikoshi, Thermococcus littoralis, Pyrobaculum aerophilum,
Methanococcus jannaschii ainsi que chez l’archaeon mésophile Methanococcus maripaludis.
La GAPOR de P. furiosus est l’unique représentante de ce groupe ayant été
purifiée et caractérisée biochimiquement (Mukund & Adams, 1995; van der Oost et al.,
1998). Elle présente la capacité d’oxyder le GAP à 70°C en utilisant le benzyl viologène
comme accepteur d’électrons. L’enzyme possède probablement une température optimale de
fonctionnement proche de la température physiologique standard du microorganisme autour
de 100°C. Il n’a cependant pas été possible de tester l’enzyme à cette température compte87
Chapitre IV
tenu de la thermosensibilité importante du GAP, celui-ci ne possédant qu’une demi-vie de 5
min à 80°C.
En utilisant le GAP à des concentrations variant de 0,01 à 0,5 mM (benzyl viologène (bv) à 3
mM) le Km obtenu pour le GAP est de 30µM et le Vmax de 350 U/mg. Une inhibition
significative a été rencontrée pour des concentrations en GAP supérieures à 0,5 mM. En
utilisant des concentrations en benzyl viologène comprises entre 0,01 et 5,0 mM (GAP fixé à
0,4 mM), le Km obtenu pour le bv est de 0,43 mM et le Vmax de 310 U/mg.
La GAPOR de P. furiosus ne présente aucune activité si l’on remplace le bv par du
NAD+ ou du NADP+. A contrario, elle fonctionne parfaitement avec la ferrédoxine de P.
furiosus. En utilisant une gamme de concentrations de 0,1 à 50 µM de ferrédoxine et 0,4 mM
de GAP, le Km obtenu pour la ferrédoxine est de 6 µM et le Vmax de 90 U/mg.
La forte affinité constatée avec la ferrédoxine suggère qu’il s’agit de son partenaire
physiologique naturel et confirme le rôle proposé de la GAPOR dans le métabolisme
glycolytique de P. furiosus.
Aucune oxydation (mesurée à 70°C à des concentrations de 1,0 à 10 mM) de substrats
tels que l’acétaldéhyde, le crotonaldéhyde, le formaldéhyde, le propionaldéhyde, le
butyraldéhyde, le benzaldéhyde, le glycéraldéhyde (mesuré à 40°C), le glucose, glucose 6phosphate, DHAP, glycérol 3-phosphate et avec le glyoxalate ont pu être observés. La
présence de certains de ces composés ajoutés à du GAP semble diminuer l’efficacité de
l’enzyme de manière significative (de 25 à 100%).
La présence de sels de type K+ à une concentration de 200mM semble stimuler l’activité
GAPOR de 3,5 fois. Le Na+ et l’arsenate (AsO43−) semblent avoir le même effet.
Par homologie avec la GAPDH et du fait de la présence d’une PGK dans le génome de
P. furiosus l’hypothèse de la production de 1-3 bisphosphoglycérate par la GAPOR a été
formulée. Plusieurs essais enzymatiques n’ont pas permis de mettre en évidence ce composé
et seul le 3-phosphoglycérate à pu être détecté. Cependant, ce résultat ne permet pas de
conclure, compte-tenu de l’extrême instabilité du 1-3 bisphosphoglycérate qui se transforme
naturellement en 3-phosphoglycérate avec un phosphate inorganique libre, il est possible que
cet intermédiaire soit formé mais reste indétectable par des moyens de mesure
conventionnels. Le mécanisme réactionnel des GAPOR n’est donc pour l’instant pas
complètement élucidé.
88
Chapitre IV
3.2 Structure et mécanisme biochimique
L’AOR et la FOR de P. furiosus sont à ce jour les seules enzymes de la famille des
AOR dont la structure a été résolue (respectivement codes PDB : AOR1, 1B25). (Chan et al.,
1995; Hu et al., 1999; Roy et al., 1999)
L’AOR de P. furiosus
La structure cristallographique de l’AOR de P. furiosus a été résolue avec une
résolution de 2,3 Å et montre que l’enzyme native est sous la forme d’un homodimère dont
chaque sous-unité contient un atome de W à proximité d’un centre [4Fe-4S] (figure 23).
Tungstoptérine
1 Fe
Figure 23 : Structure cristallographique de l’AOR de P. furiosus : résolution 2,3 Å.
Un atome de fer est positionné à l’interface entre les sous-unités. Il est éloigné de plus
de 20Å du site actif contenant l’atome de W n’a probablement qu’une fonction structurale.
Chaque sous-unité est structurée en trois domaines regroupés autour du cofacteur
tungstoptérine et du centre [4Fe-4S] (figure 24 C et D). L’atome de W est coordonné par les
groupements dithiolènes de la bis-molybdoptérine (Figure 24. A et B). Ce dérivé
bis(carboxyamidomethyl) a été identifié la première fois (Johnson et al., 1980) à partir d’une
89
Chapitre IV
préparation de molybdoenzymes. Le dérivé correspond à un produit de dégradation du Moco
après extraction de la molybdoenzyme et oxydation, ce dérivé est fluorescent et son spectre
est identique et commun à tous les organismes vivants permet de montrer la présence du
Moco ou Wco dans une préparation.
La structure de l’AOR a confirmé en partie la formule chimique proposée en 1982 mais
a apporté de nombreuses informations supplémentaires relatives à sa forme globale
tricyclique et non planaire (figure 24 C).
B
A
Tungstène ( W )
C
S
Mg++
Fe
D
Figure 24 : A. Monomère d’une Ptérine avec ses deux fonctions dithiolène libres (entourées en orange). B.
Tungstoptérine complète de type MPT présente chez les AOR, FOR et probablement chez la GAPOR. C.
Visualisation 3D de la molécule de Tungstoptérine de type MPT. D. Centre [4Fe-4S].
De nombreux cofacteurs bis-W/Mo-ptérine ont depuis été identifiés (Kisker et al., 1997)
et ont confirmé la structure atypique de ce cofacteur. La forme bisptérine implique également
un atome de magnésium (Mg) lié par coordination aux groupements phosphate terminaux de
chaque unité ptérine.
90
Chapitre IV
La tungstoptérine est insérée profondément dans la protéine à environ 10 Å du centre [4Fe4S] lui-même lié à la protéine par les groupements thiol de quatre cystéines.
Il est cependant difficile d’établir avec précision les différents ligands impliqués dans la
liaison du cofacteur ptérine compte-tenu de la résolution modeste du cristal de l’AOR de P.
furiosus (2,3 Å).
La FOR de P. furiosus
La FOR de P. furiosus et celle de T. litoralis sont constituées de quatre sous-unités
d’environ 70 kd. Chaque sous unité comporte environ 1 atome de W et 4 atomes de Fe avec
un cofacteur ptérine qui est présent sous sa forme non nucléotidique (Johnson J.L., 1993).
La résolution de la structure de la FOR de P. furiosus à haute résolution (1,85 Å) en
1999 (Hu et al., 1999) a permis d’obtenir plusieurs informations inaccessibles à partir du
cristal de l’AOR (figure 25).
Tungstoptérine
Centre
4Fe-4S
Figure 25 : Structure d’un tétramère et d’une sous-unité de FOR de P. furiosus avec une résolution de 1,85Å et
zoom sur une sous-unité avec ses cofacteurs : le centre [4Fe-4S] et la tunsgtoptérine.
Les 3 domaines de la FOR de la sous-unité sont représentés par des couleurs différentes.
Une sous-unité de FOR présente 3 domaines qui se distinguent par une identité de
séquence protéique décroissante (I : 54%, II : 31,4%, III : 26%) et qui englobent en leur sein
91
Chapitre IV
la tungstoptérine. La grande similarité de séquences avec l’AOR du même microorganisme se
traduit également par une superposition presque parfaite des deux structures et une
conservation des motifs de liaison aux cofacteurs tungstoptérine et [4Fe-4S].
L’alignement des séquences en acides aminés de la FOR et l’AOR de P. furiosus et de la FOR
de T. littoralis (figure 26) met en évidence la conservation de plusieurs motifs liés à la liaison
de la tungstoptérine ainsi que plusieurs résidus présents au niveau du site actif à proximité de
l’atome de W. Le mécanisme catalytique n’étant pas encore complètement élucidé il est
difficile de prédire la fonction de ces résidus conservés. Cependant le mécanisme réactionnel
de la FOR semble proche de celui des enzymes à Mo-ptérines et W-ptérines avec un système
de transfert de groupement oxo couplé à un transfert d’électron (Wilson et al., 1996). La
modélisation du site actif semble montrer que plusieurs autres résidus pourraient être
impliqués dans les catalyses telles que les Arg481 et 492 (figure 27). L’insertion d’un résidu
supplémentaire par rapport à la Pf AOR entre l’Ile480 et la Gly483 de la Pf FOR réduit le
volume de la cavité en déplaçant les chaînes latérales de ces résidus dans la cavité. Associées
à quelques substitutions, ces variations pourraient contribuer à la différence de spécificité de
substrat entre ces deux enzymes.
Les cystéines impliquées dans la liaison avec le centre [4Fe-4S] sont également très
conservées entre ces trois protéines de la famille des AOR.
92
Chapitre IV
Identité
Domaine I
Domaine II
Domaine III
54%
31,4%
26%
Figure 26 : Alignement des séquences en acides aminés de la FOR et AOR de P. furiosus et de la FOR de
Thermococcus littoralis. Les 3 domaines d’identité décroissante sont distingués par les encadrements. Les
résidus impliqués dans la constitution du centre [4Fe-4S] sont encadrés et fléchés en bleu. Les résidus
directement impliqués dans le site actif à proximité du W sont encadrés et fléchés en noir. Les résidus en
interaction avec la bis-ptérine sont encadrés en vert.
93
Chapitre IV
La précision élevée de la structure de la FOR de P. furiosus a permis d’évaluer le
volume de la cavité du site actif avec le logiciel VOIDOO (Kleywegt & Jones, 1995) qui
s’élève à 1500 Å3 (figure 27). La cavité est formée de deux chambres distinctes : La première
est formée par un canal qui mène à la surface de la protéine et est probablement impliqué dans
le transport du substrat et des produits au niveau de la deuxième chambre qui est proprement
parlé le site actif. Cette deuxième chambre est à proximité de l’atome de W et elle est tapissée
par les chaines latérales de nombreux acides aminés chargés (Thr240, Glu308, His437,
Arg481, Arg492) et polaires (Thr240, Tyr307, Tyr416).
W
W-ptérine
Figure 27 : Modélisation de la cavité du site actif de la FOR de P. furiosus
Le canal menant à la surface de la protéine est tapissé de nombreux acides aminés
hydrophobes (Phe234, Trp235, Ala242, Ala243, Pro451...) et se termine par une partie
désorganisée au niveau des chaines polypeptidiques latérales (résidus Gly454 à Glu461).
3.3 Données biophysiques :
Lorsque la GAPOR de P. furiosus est incubée à 80°C avec son substrat
physiologique pendant plusieurs minutes : le GAP, les groupements prothétiques se réduisent
et il est alors possible d’observer un signal typique du W en résonnance paramagnétique
électronique (figure 28).
94
Chapitre IV
Figure 28 : Signal RPE caractéristique du W de la GAPOR de P. furiosus. (Van der Oost, 1998)
10mM GAP, incubation 3 min à 80°C, paramètres RPE : 9395MHz, 8mW, 100khz, 0,5mT, 45K.
Le signal obtenu en RPE est formé de deux signatures liées à la présence du W sous plusieurs
formes. L’espèce W51+ est un intermédiaire dans le cycle catalytique avec deux potentiels
moyens : Em(W6+/5+)= -507mV et Em(W5+/4+)= -491mV. La forme W5+2 représente une espèce
inactivée avec un potentiel moyen de Em(W6+/5+)= -329mV (Hagedoorn et al., 1999a).
Le centre [4Fe-4S] est lui aussi observable par RPE lorsque qu’il se trouve dans un état
partiellement ou totalement réduit. Le cubane Fe-S montre à la fois des signaux de spin S=3/2
et S=½ avec le même potentiel moyen de Em([4Fe-4S]2+/1+)= -335mV.
Des expériences de voltamétrie catalytique ont également démontré dans un système
GAP/GAPOR/ferrédoxine les électrons cheminaient du centre catalytique contenant le W vers
le centre [4Fe-4S] de la GAPOR puis vers celui de la ferrédoxine (Hagedoorn et al., 1999a).
La réduction préalable du centre [4Fe-4S] de la GAPOR par l’hydrosulfite de sodium ne
modifiant rien au sens de fonctionnement de la chaine de transfert électronique. Aucun signal
d’implication des radicaux ptérine dans le transfert électronique n’a pu être identifié.
3.4 Interaction des AOR avec leur partenaire
physiologique : la Ferrédoxine
La FOR, l’AOR, la GAPOR de P. furiosus, l’AOR d’E. acidaminophilum et la FOR de
T. littoralis qui ont été purifiées utilisent toutes la ferrédoxine comme transporteur d’électron
physiologique (Heider et al., 1995; Mukund & Adams, 1993).
95
Chapitre IV
L’AOR d’E. acidaminophilum est capable de fonctionner en présence de ferrédoxine 2x[4Fe4S] et d’accepteurs électroniques artificiels de même potentiel.
La ferrédoxine de P. furiosus est une protéine de 66 acides aminés contenant un seul
centre [4Fe-4S] lié à la protéine par trois cystéines et un ligand atypique de type acide
aspartique (Busse, 1992). Avec un Km apparent de 100 µM (Roy et al., 1999), son interaction
avec la FOR de P. furiosus n’apparaît pas aussi forte que celle présente avec l’AOR ou la
GAPOR du même microorganisme avec des valeurs de Km inférieures à 10 µM.
Les zones d’interactions entre la FOR et la ferrédoxine sont clairement identifiées sur
le complexe Pf FOR-Ferrédoxine (figure 29). La surface d’interaction de la ferrédoxine est
beaucoup moins précise du fait de la grande flexibilité de la structure tandis que celle de la
FOR est bien définie. Cette dernière est formée d’une faible dépression formée au centre par
les résidus Tyr286 et Cys287 et plusieurs autres résidus dont la Cys291 qui est aussi
impliquée dans la liaison avec le centre [4Fe-4S].
W-ptérine
Centres
[4Fe-4S]
Pf Ferrédoxine
Pf FOR
Figure 29 : Structure du complexe FOR-Ferrédoxine de P. furiosus à une résolution de 2,15 Å.
En vert : sens de transfert des électrons du site actif de la FOR vers son centre [4Fe-4S] puis vers le centre
[4Fe-4S] de la ferrédoxine, soit environ 25 Å au total.
La zone de surface qui interagit avec la ferrédoxine a une tendance hydrophobe et ne
contient aucun résidu conservé dans la famille des AOR. La faible surface d’interaction
96
Chapitre IV
FOR/Ferrédoxine avec environ 350 Å2 ainsi que l’absence de résidu chargé à sa surface
semblent contribuer à la faible force d’interaction entre ces deux protéines. La distance la plus
faible possible entre les deux centres [4Fe-4S] une fois les deux protéines en interaction est
d’environ 15 Å, ce qui est parfaitement compatible avec le transfert des électrons entre les
deux enzymes.
4. Transport du tunsgtène et maturation des AOR :
Les AOR sont des enzymes complexes qui présentent la particularité de posséder en
leur sein un atome de W relié à une bis-ptérine ainsi qu’un centre [4Fe-4S] (voir figure 24 D
et 25). La synthèse et l’incorporation de ces cofacteurs sont réalisées par des voies de
synthèse et de maturation codées par un ensemble de gènes indépendamment de la séquence
de l’enzyme.
Les mécanismes synthèse et d’incorporation des centres Fe-S sont des systèmes
ubiquitaires très conservés dans le monde du vivant avec quelques spécificités selon les
protéines cibles et les organismes concernés (Flint, 1996; Johnson et al., 2005). Des travaux
réalisés chez la bactérie Azotobacter vinelandii, ont permis d’identifier deux loci différents
impliqués dans ce mécanisme. Le premier appelé nif code pour des protéines permettant la
mise en place de centres Fe-S spécifiquement sur la nitrogénase. Le second baptisé isc (iron
sulfur cluster) comprend huit gènes (iscRSUA-hscBA-fdx-ORF3) codant pour des protéines
impliquées dans la mise en place de centres Fe-S sur les métalloprotéines, autre que la
nitrogénase (Dos Santos et al., 2007; Johnson et al., 2006). In vivo, il apparait qu’un ensemble
de protéines chaperonnes soit nécessaire à la synthèse et à l’incorporation de ces centres Fe-S,
mais il est cependant possible in vitro, en conditions réductrices, d’assembler spontanément
des centres Fe-S dans une protéine grâce à un apport de fer et de soufre (voir chapitre V
section 9).
Le groupement tungsto-bis-ptérine nécessite par contre une voie de synthèse complexe
de la ptérine couplée à une voie d’importation du W et parfois à une autre voie
d’incorporation dans la protéine. Cette voie de synthèse a été étudiée et résolue chez E. coli
(Johnson et al., 1993; Rajagopalan et al., 1993; Wuebbens & Rajagopalan, 2003).
97
Chapitre IV
4.1 Synthèse et régulation du cofacteur tungstoptérine
La voie de synthèse du cofacteur ptérine (aussi appelé cofacteur « Moco » du fait de sa
première mise en évidence chez certaines molybdoenzymes) a été résolue récemment chez
E. coli (Vergnes et al., 2004; Wuebbens & Rajagopalan, 2003). Aucune étude ne s’est pour le
moment intéressée à la synthèse de ce cofacteur chez les archaea hyperthermophiles telles que
P. furiosus. Il est en effet possible d’identifier certaines protéines putatives de cette voie chez
les archaea par comparaison de séquence mais aucune étude n’a jusqu’à aujourd’hui pu
résoudre cette voie de synthèse et sa régulation. Aucun système de maturation spécifique des
AOR n’a également pu être identifié chez leurs hôtes.
Figure 30 : Voie de synthèse de la ptérine et d’importation du Mo chez E. coli (source : Vergnes, 2004)
98
Chapitre IV
Le GTP est la molécule précurseur de la voie de synthèse de la ptérine. De nombreuses
enzymes interviennent ensuite dans la synthèse des intermédiaires (précurseur Z, ptérine
MPT, Mo MPT) pour arriver à la molécule finale : la ptérine guanine dinucléotide (MGD)
(figure 30).
Plusieurs groupes de gènes disséminés sur le génome codent pour ces enzymes : les
opérons moa, moe, mog, mod et mob. L’opéron mod intervient indirectement dans cette voie
en regroupant les enzymes responsables du transport du molybdène avec notamment la
perméase de type ABC transporteur ModA. Les éléments génétiques moa, moe, mog codent
pour des enzymes (MoaA est une cyclohydrolase) impliquées dans la biosynthèse de la
molécule. Il est intéressant de constater que la forme finale de la ptérine synthétisée chez
E. coli et que l’on retrouve généralement dans ses propres molybdoenzymes telles que la
nitrate réductase (Magalon et al., 1998) est de type MGD alors que la forme finale de la
ptérine retrouvée dans les AOR (structure de la FOR et de l’AOR de P. furiosus) est plutot de
type MPT. Cette forme MPT n’est qu’un intermédiaire de la voie de synthèse transformé par
MobA et MobB en ptérine de type MGD chez E. coli. Il semble, cependant, que dans
certaines conditions E. coli soit capable de produire des protéines possédant un cofacteur
ptérine sous la forme MPT : telles que la sulfite oxydase YedY (Brokx et al., 2005).
L’ensemble de la voie est régulée génétiquement par le senseur ModE capable de
chélater le molybdène ou le tungstène (Anderson et al., 2000). Il réprime l’opéron moa en cas
d’excès de molybdate mais pas de tungstate. En effet, ModE est capable de chélater cet
élément aussi bien que le molybdène, mais ne semble plus être en mesure d’exercer sa
fonction de répresseur génétique. La culture en présence de tungstate d’E. coli a donc pour
effet de ne pas réprimer la voie de synthèse de la ptérine.
Il apparaît également que l’anaérobiose est l’un des facteurs activant l’expression de ces
opérons via son régulateur ModE (Anderson et al., 2000).
4.2 Transport du tungstène
L’incorporation du Mo dans les protéines d’E. coli est préférentielle grâce au système
de transport ModABC qui possède une meilleure affinité pour ce métal que pour le W, le
phosphate ou le sulfate (Imperial et al., 1998). La capacité de discrimination W/Mo d’E. coli
dépend néanmoins du rapport entre ces deux éléments. Un excès de 1 pour 1000 de l’un par
99
Chapitre IV
rapport à l’autre peut modifier complètement le comportement du transport intracellulaire
(Kletzin & Adams, 1996).
Plusieurs systèmes analogues de transport de W et/ou de Mo ont été mis en évidence
chez d’autres bactéries et archaea. Il s’agit du système Tup découvert à l’origine chez
E. acidaminophilum et du système Wtp récemment mis en évidence chez P. furiosus (Bevers
et al., 2006).
Le système biochimique appelé système Tup est formé d’un ABC transporteur composé
d’une protéine extra-cytoplasmique TupA de 30 kd qui possède une très haute affinité pour le
W (Km de 0,5 µM), d’une perméase TupB et d’une « ATP-binding protein » TupC (Makdessi
et al., 2001) (figure 31). Un effet de compétition du molybdène n’est constaté que pour un
excès de 1 pour 1000 de molybdène dans le milieu. Le système présente une homologie
significative avec ModABC d’E. coli plus spécifique du Mo. La transcription des gènes tup
est en partie couplée à celle des gènes moeA responsables chez E. coli de la synthèse de la
ptérine (Nichols & Rajagopalan, 2005).
Figure 31 : Opéron tup et moeA d’Eubacterium acidaminophilum dédié à l’import du W et à son l’incorporation.
(Source : Markdessi, 2001)
Le système de transport ABC Wtp vient clarifier le transport du W et du Mo chez les
archaea notamment, et chez certaines bactéries pour lesquelles il n’avait pas été possible de
mettre en évidence le système Mod ni le système Tup (figure 31 A). Les archaea semblent
posséder majoritairement le système Wtp avec quelques exceptions comme Methanococcus
maripaludis qui possède le système Mod en plus du Wtp, ou bien Pyrobaculum aerophilum
qui ne possède que le système Tup. En comparaison le système Wtp est très peu représenté
100
Chapitre IV
chez les bactéries qui possèdent très majoritairement le système Mod et/ou Tup. Le système
Wtp présente une très faible similarité avec les systèmes Mod et Tup, et en particulier au
niveau de la protéine Wtp A qui ne présent que 11% d’identité avec à ModA et aucune
homologie significative avec TupA. Les autres protéines du système WtpB et WtpC
présentent des similarités plus importantes avec Mod/TupB et Mod/TupC avec en moyenne
52% d’homologie entre leurs séquences protéiques. L’arbre phylogénétique (figure 32 B)
reliant les trois systèmes de transports de W/Mo chez différences espèces d’archaea et de
bactéries montre très nettement la divergence évolutive de ces systèmes à partir d’un ancêtre
commun.
A
B
Figure 32: Organismes contenant une séquence génomique putative de la famille des AOR (Bevers, 2006).
Le système de transport Wtp est capable de transporter le W et le Mo. La protéine
WtpA possède une très grande affinité pour W avec une constante de dissociation KD de
17 pM et une affinité moyenne pour le molybdène avec un KD de 11 nM (figure 33). Ces
101
Chapitre IV
valeurs signifient que le système de transport Wtp présente une affinité supérieure pour le W
que le système Tup et une affinité pour le Mo comparable à celle du système Mod.
Figure 33 : Affinité des systèmes Wtp, Tup et Mod pour le W / Mo (Source Bervers, 2006).
Certains microorganismes tels que Rodospirullum rubrum (figure 32 A) contiennent une
enzyme putative de la famille des AOR mais aucun système de transport de type Wtp, Tup ou
Mod n’a pu être mis en évidence dans leur génome par comparaison de séquences. Cela laisse
à penser qu’il pourrait exister un autre système de transport W/Mo encore non identifié.
4.3 Spécificité du métal
Plusieurs travaux ont étudié l’influence du rapport Mo/W présent dans le milieu de
culture sur les microorganismes (Mukund & Adams, 1996). Chez P. furiosus il a été démontré
qu’un excès (environ 400 fois) de Mo ou de Vanadium (V) (propriétés chimiques très proche
du Mo et du W) dans le milieu de culture permettait de produire des AOR contenant
respectivement une Mo bis-ptérine ou une V bis-ptérine. Le Mo et le V semblent capables à
haute concentration (>1µM) d’outrepasser la spécificité du système Wtp pour le W ou
d’emprunter d’autres systèmes de transport non spécifiques comme cela a été démontré chez
d’autres espèces (Buc, 1999). Ces isoformes d’AOR (MoAOR et VAOR) présentent des
activités très faibles voire quasi nulles comme c’est le cas pour la GAPOR. Ces travaux
viennent confirmer la nécessité du W au niveau du site actif pour la fonctionnalité des AOR,
FOR et tout particulièrement celle de la GAPOR.
Il a été démontré, principalement chez E. coli, qu’il était possible de forcer l’import du
W par des systèmes de perméation non spécifiques pour des concentrations 105 à 107 fois
supérieures par rapport à celle du Mo dans le milieu de culture. Le W importé peut alors se
retrouver incorporé dans certaines molybdoenzymes, telles que les nitrogénases (Cardenas &
Mortenson, 1975; Siemann et al., 2003) ou la Triméthyl amine N-oxyde réductase (TMAO)
102
Chapitre IV
(Buc et al., 1999; Pollock et al., 2002), avec une efficacité plus ou moins variable selon le
type d’enzyme et la nature de la ptérine. Certaines des isoformes à W sont inactives telles la
nitrate réductase (Vergnes et al., 2004) tandis que d’autres présentent peu ou pas de
modification de leur activité comme c’est le cas de la TMAO réductase. Le mécanisme
d’inactivation de la nitrate réductase a en partie été identifié et repose sur l’impossibilité des
chaperonnes spécifiques NarJ d’incorporer le cofacteur de type W-ptérine au niveau du site
actif de l’apo-nitrate réductase (Rothery et al., 1999; Vergnes et al., 2004).
103
104
Chapitre V
Matériel et Méthodes
105
Chapitre V
Chapitre V
Matériel et Méthodes :
1. Souches et plasmides utilisés
Les souches et plasmides utilisés et développés au cours de cette étude sont répertoriés dans le
tableau suivant :
Souches
Caractéristiques
Références
C. acetobutylicum ATCC 824
Souche sauvage
ATCC Rockville
C. acetobutylicum ∆CAC
souche délétées d'un système de
restriction
Croux, non publiée
[sup E44 ∆lac U169 (∆80 lacZ ∆M15)
hsd R7 rec A1 endA1 gyrA96 thi-1 rel
A1]
Invitrogen
Souches de Clostridium
Souches d'Escherichia
coli
DH5α
–
BL21 (DE3)
BL21 (DE3) codon+
–
–
+
F ompT hsdS(rB mB ) dcm Tetr gal
(DE3) endA Hte
F– ompT hsdS(rB– mB–) dcm+ Tetr gal
(DE3) endA Hte [plasmide codon+
R
ClR ]
Stratagène
Stratagène
JM110
F’ tra 36proAB lacIqZM15/rpsL (StrR)
thr leu endA thi-1 lacY galK galT ara
tonA tsx dam dcm dupE44 (lac-proAB)
(mcrC-mrr)102::Tn10 (TetR)
Invitrogen
ER2275 (PAN1)
Plasmide de méthylation PAN1
(Girbal & Soucaille, 1994)
TP1000
[mobAB]
(Rothery et al., 1998)
-
MG1655 F
[hypF ]
Bock, 1996
TP5
[mobAB][hypF-]
Cette étude
Tableau 6 : Souches utilisées au cours de cette étude
106
Chapitre V
Plasmides
Caractéristiques
Références
Vecteurs dédiés à E. coli
R
pUC19(2,7 kpb)
Amp , origine ColE1
pET21c (5,5 kpb)
AmpR, PrT7, lacI, origine ColE1
Pr T7,gène de la ferrédoxine CAC0303 de C.
acetobutylicum, streptag
Pr T7,gène de la ferrédoxine sauvage de de
C. acetobutylicum, streptag
fusion traductionnelle entre la Gluthatione Stransférase avec le gène de la Fdx CAC0303
de C. acetobutylicum, streptag
pET21cCAC0303
pET21cCAC3527
pET21cFdxMJwt
pET21cFdxMJ∆
pGEX6P3CAC0303
pTRC99A
pTRC99AgaporMJCtag
pTRC99AgaporMMCtag
AmpR, origine Col1, Pr tph, lacI
Pr tph, gène de la gapor de M. jannaschii,
streptag
Pr tph, gène de la gapor de M. maripaludis,
streptag
Yannisch-Perron et al.
(1985)
Novagen
Cette étude
Cette étude
Cette étude
Cette étude
Cette étude
Cette étude
Cette étude
Cette étude
Vecteurs Navettes
E.coli/Clostridium
pTSH1 (7,67 kpb)
AmpR, MLS, pr thlA + hydA (gène de
l'hydrogénase de C. acetobutylicum avec un
Streptag en C-Terminal, gène repL, origine
ColE1
pPHhydACtag
Amp , MLS, pr hydA (Promoteur et gène
hydA1 de l'hydrogénase de
C. acetobutylicum avec un Streptag en CTerminal), gène repL, origine ColE1
Girbal, AEM 2003
pPHgaporMjCtag
AmpR, MLS, pr hydA (Promoteur du gène de
l'hydrogénase de C. acetobutylicum), gène
gor de M. jannaschii avec un Streptag en CTerminal, , gène repL, origine ColE1
Cette étude
pPHgaporMMCtag
AmpR, MLS, pr hyd (Promoteur du gène de
l'hydrogénase de C. acetobutylicum), gène
gor de M. maripaludis avec un Streptag en CTerminal, gène repL, origine ColE1
Cette étude
Girbal, AEM 2003
R
pTSH1fdxMJwt Ctag
pTSH1fdxMJ∆ Ctag
pPHfdxMJwt Ctag
pr thlA, gène de la ferrédoxine de
M. jannaschii sauvage
pr thlA, gène de la ferrédoxine de
M. jannaschii tronqué du domaine C-terminal
pr hyd, gène de la ferrédoxine de
M. jannaschii sauvage
107
Cette étude
Cette étude
Cette étude
Chapitre V
pPHfdxMJ∆ Ctag
pr hyd, gène de la ferrédoxine de
M. jannaschii tronqué du domaine C-terminal
Cette étude
Tableau 7 : Plasmides utilisés lors de cette étude
2. Conservation des souches d’E. coli
Les souches sont conservées dans une solution de glycérol à 20% (concentration finale v/v) à
-80°C en tubes cryogéniques.
3. Conservation de C. acetobutylicum
L'ensemble des souches est conservé sous forme de spores à -20°C. La sporulation est
obtenue après une culture de 4 à 5 jours en milieu synthétique (MS) liquide à 37°C. La
présence de spores est vérifiée par observation en microscopie optique.
4. Milieux de culture et conditions de croissance
4.1 C. acetobutylicum
4.1.1 Conditions de croissance
C. acetobutylicum est une bactérie anaérobie stricte, le maintien de conditions
anaérobies sévères est un prérequis à la croissance. Les cultures discontinues en milieu liquide
sont réalisées dans des bouteilles serties dont le milieu a préalablement été dégazé à chaud
avec de l'azote (pendant 15 à 30'), afin de vérifier qu'il n'y a pas de traces d'oxygène, de la
résazurine (1 mg.l-1) est ajouté au milieu de culture avant d'ajuster le pH. Les fioles sont
autoclavées 20 minutes à 120 °C puis de la cystéine (0,5 g.l-1) est rajoutée en conditions
anaérobies afin de réduire le milieu et d'abaisser le potentiel redox. L'anaérobiose est
contrôlée grâce à un détecteur numérique en continu (catharomètre) indiquant la concentration
en O2 et en H2 en temps réel et des indicateurs papier.
Les inocula sont préparés par ensemencement, avec une solution stock de spores (10%
v/v). Un choc thermique (80°C, 15 à 20 min selon le volume) permet d'éliminer les formes
végétatives et de synchroniser la germination des spores. L’antibiotique (érythromycine 200
µg/ml, chloramphénicol 50 µg/ml) est ensuite ajouté.
108
Chapitre V
4.1.2 Milieux de culture
Le milieu synthétique de base (Vasconcelos et al., 1994) est utilisé pour les cultures en fioles
serties (préparation des inocula, sporulation des souches, ...).
Composition du milieu synthétique (MS) à base de glucose :
Glucose
60 g/l
KH2PO4
0,5 g/l
K2HPO4
0,5 g/l
MgSO4, 7H2O
0,2 g/l
FeSO4, 7H2O
0,01 g/l
CH3COOH
2,2 g/l
Acide para-aminobenzoïque
8 mg/l
Biotine
0,04 mg/l
Le pH du milieu est ajusté à 6,3 avec de l'ammoniaque concentré.
Le milieu 2 YTG est utilisé lors de la préparation d'ADN chromosomique de C.
acetobutylicum, ainsi que pour la croissance de la souche.
Composition du milieu 2 YTG :
Bactotryptone
16 g/l
Extrait de levure
10 g/l
NaCl
4 g/l
Glucose
5 g/l
Le pH est ajusté à 5,2 avec une solution d'acide chlorhydrique.
Le milieu CGM est un milieu riche utilisé pour les cultures de production de protéines chez C.
acetobutylicum.
Composition du CGM :
YE
6,25 g/l
KH2PO4
0,9375 g/l
109
Chapitre V
K2HPO4
0,9375 g/l
MgSO4, 7H2O
0,5 g/l
MnSO4,7H2O
12,5 mg/l
FeSO4,7H2O
3 mg/l
NaCl
1,25 g/l
Asparagine
2,5 g/l
(NH4)2SO4 2,5 g/l
Le pH est fixé à 6,6 avec ajout d’ammoniaque concentré
Le glucose est ensuite ajouté à 20 g/l final
Le milieu RCA est utilisé pour la culture de C. acetobutylicum sur boite
RCA
RCA
38 g/l
Agar
15 g/l
Le pH est fixé à 5,8 avec de l’acide Chlorhydrique concentré.
4.2 Escherichia coli
4.2.1 Conditions de croissance
Le milieu LB est couramment utilisé pour la culture des souches d'E. coli. Il est
supplémenté avec des antibiotiques (ampicilline à 100 µg.ml-1, érythromycine à 200 µg.ml-1,
chloramphénicol à 35 µg.ml-1, kanamycine à 25 µg.ml-1) lors de la culture de souches
transformées par des plasmides portant le gène de résistance à ces antibiotiques.
Les cultures sont réalisées généralement à 37°C, sauf dans le cas de production spécifiques de
protéines où il est alors parfois nécessaire d’abaisser la température à 25°C ou 30°C.
4.2.2 Milieux de culture
Composition du milieu LB (Sambrook et al., 1989):
Bactotryptone
10 g/l
110
Chapitre V
Extrait de levure
5 g/l
NaCl
10 g/l
Le milieu liquide SOC est utilisé pour la culture des cellules E. coli DH5α, TOP10,
BL21(DE3) et TP1000 lors de la préparation de cellules compétentes selon le protocole établi
par Inoue (Inoue et al., 1990).
Composition du milieu SOC :
Bactotryptone
20 g/l
Extrait de levure
5 g/l
NaCl
10 mM
Glucose
20 mM
KCl
2,5 mM
MgCl2, 6H2O
10 mM
MgSO4, 7H2O
10 mM
Le milieu MAC est adapté à la culture d'E. coli DH5α en " anaérobiose ", ce milieu est utilisé
pour la culture de cellules recombinantes en vue de dosages enzymatiques.
Composition du milieu MAC :
Glycérol
20 g/l
Tryptone
10 g/l
Extrait de levure
5 g/l
HEPES
23 g/l
FeSO4
50 mg/l
NTA
200 mg/l
K2HPO4
0,5 g/l
NaCl
2 g/l
Le pH est ajusté à 7,3 avec une solution concentrée d'ammoniaque.
Le milieu est alors réparti sans dégazage préalable à l'azote et les fioles sont serties avant
d'être autoclavées. Dans ces conditions, E. coli utilise l'oxygène présent pour débuter sa
111
Chapitre V
croissance puis évolue vers une croissance et une expression protéique en condition
d'anaérobie.
L'antibiotique adéquat est ajouté en fonction de la souche recombinante à cultiver ainsi que du
nitrate de sodium (85 mg.l-1) qui favorise la croissance d'E. coli dans un milieu limité en
oxygène.
4.2.3 Cultures en Bioréacteur de type Batch
Système Polybatch™
Les bioréacteurs Polybatch™ sont des réacteurs de 2 litres de capacité permettant de
cultiver des microorganismes en mode batch en contrôlant les différents paramètres de la
fermentation de manière automatisée.
Le pH est régulé par ajout automatique d’une base ou d’un acide selon le mode de culture. La
température et l’agitation sont également régulées de manière automatique. Le réacteur est
une enceinte étanche qui permet de contrôler et de modifier la composition de l’atmosphère
pendant la culture. Ce dispositif permet de réaliser des cultures de C. acetobutylicum et E. coli
en mode anaérobie ou non.
5. Préparation des extraits cellulaires aérobie
Les cultures en erlenmayer (volume de 200 ml à 1 litre) ou en réacteur polybatch
(volume de 1,5 litres) sont centrifugées à 7000g à 4°C sur deux cycles de 10 minutes puis
lavées deux fois dans un tampon Tris-HCl à 50 mM pH 8,0, 10% glycérol et finalement
concentrées 30 fois dans ce même tampon avant utilisation directe en purification ou
congélation à -80°C.
6. Préparation des extraits cellulaires anaérobie
Les cultures en fioles sont entrées dans la boîte à gants puis transférées dans des tubes à
centrifugation. La centrifugation est effectuée à 7000rpm pendant deux fois 10 minutes puis
les cellules sont lavées avec du tampon Tris-HCl 50mM pH 8,0, 10% glycérol dégazé à
l’azote et réduit par du DTT à 2 mM. Les cellules sont ensuite reprises dans ce même tampon
et concentrées 30 fois avant utilisation immédiate ou stockage à -80°C.
112
Chapitre V
Les cultures issues d’un bioréacteur de 1,5 l sont transférées dans une bouteille Shott de 2 l
avec un dispositif qui permet de maintenir un flux permanent d’azote. Une fois récoltée, la
culture est transférée dans des pots de centrifugation étanches dans la boîte à gants. Les
cellules sont centrifugées deux fois à 7000 rpm puis lavées avec du tampon Tris-HCl 50mM à
pH 8,0, 10% glycérol dégazé à l’azote et réduit par 2 mM de DTT. Les cellules sont ensuite
concentrées 30 fois dans ce même tampon puis congelées à -80°C en fioles étanches ou
utilisées immédiatement.
7. Techniques de génie génétique
7.1 Isolement et manipulation des acides nucléiques
7.1.1 Transformation d’E. coli
Les cellules compétentes sont des cellules dont la transformation par des plasmides est
facilitée par divers traitements chimiques, thermiques ou électriques.
- E. coli DH5α, TOP10 et BL21, TP1000 compétente par la méthode SEM (Inoue et al.,
1990)
Ce protocole est efficace avec des souches ayant un temps de génération de l'ordre 40
minutes, comme les souches recA - du type DH5α. Les manipulations se font dans la glace, de
façon à ne pas rompre la chaîne du froid.
Milieux
Tampons
SOC ou LB
TB : 10 mM PIPES
15 mM CaCl2
250 mM KCl
pH ajusté à 6,5 avec KOH
55 mM MnCl2
Protocole
A partir d'une culture d'E. coli en milieu SOC ou LB à 18°C (~48h) :
- Refroidir la culture ayant atteint une DO600nm de 0,6, dans la glace pendant 10 minutes.
- Centrifuger les cellules 10 minutes à 2500 g
- Eliminer le surnageant
- Reprendre le culot dans un volume de TB (glacé) égal au tiers du volume de culture initial
113
Chapitre V
- Incuber les cellules 10 minutes dans la glace
- Centrifuger 10 minutes à 2500 g
- Eliminer le surnageant
- Reprendre le culot dans du TB (8 ml pour 100 ml de culture)
- Rajouter du DMSO à une concentration finale de 7%
- Aliquoter par 200 µl, congeler les cellules dans de l'azote liquide
- Conserver les cellules compétentes à -80°C
Transformation par choc thermique :
- Ajouter l'ADN à 100 µl de cellules compétentes
- Incuber 20 minutes dans la glace
- Choc thermique à 42°C pendant 45 secondes
- Remettre immédiatement les cellules dans la glace pendant 5 minutes
- Ajouter 900 µl de LB ou de SOC
- Incuber 1h à 37°C
- Etaler les cellules sur milieu de culture sélectif
7.1.2 Transduction d’ADN génomique par le phage P1
La technique de transduction par le phage P1 permet de transférer une mutation
sélective (insertion de cassette de résistance à un antibiotique) d’une souche donneuse
d’E. coli à une souche receveuse.
Protocole :
Création du lysat de phage P1 à partir de la souche donneuse
- A partir d’une culture sur la nuit à 37 °C de la souche donneuse, inoculer avec 0,1 ml de la
culture overnight 10 ml de LB + 0,2 % de Glucose et 5 mM de CaCl2. Croissance pendant 30
min à 37°C.
- Ajout de 100 µl de lysat de virus P1 puis incubation de 3 h à 37°C
- Ajout de 0,1 ml de Chloroforme pur + agitation
- Centrifuger à 4500g pendant 10 min puis transférer le surnageant dans un tube stérile.
- Ajout de 100 µl de Chloroforme + agitation
114
Chapitre V
- Conserver le lysat P1 de la souche donneuse à 4°C en attendant la transduction
Infection de la souche receveuse
- Réaliser une culture de la souche donneuse sur la nuit dans 10 ml de milieu LB
- Centrifuger la culture pendant 10 min
- Reprendre le culot dans 2,5 ml d’une solution de MgSO4 à 10 mM avec 5 mM de CaCl2.
- Infection de la souche donneuse par le phage P1 (5 tubes de concentration en P1
croissante) :
Culture overnight
Lysat de phage P1
1
0,1 ml
-
2
0,1 ml
10 µl
3
0,1 ml
50 µl
4
0,1 ml
100 µl
5
-
100 µl
Laisser incuber 30 min à 30°C
- Ajout de 100 µl de Citrate de Sodium (arrête la transduction)
- Ajout de 600µl de LB puis incubation 45 min à 37°C
- Etaler 300µl sur des boites LB agar
7.1.3 Préparations d'ADN plasmidique d'E. coli
Les mini-préparations d'ADN plasmidique sont réalisées sur 1 à 2 ml d'une culture sur
la nuit en milieu LB additionné d'antibiotique(s) par la méthode de la lyse alcaline (Sambrook
et al., 1989) ou à l'aide de mini-colonnes du kit QIAprep (Qiagen™). Les mini-colonnes sont
utilisées pour obtenir une préparation d'ADN très propre, destinée à être manipulée (digestion,
ligation, ...) ou à être incorporée chez E. coli par transformation.
Les midi-préparations d'ADN plasmidique sont réalisées à l'aide de midi-colonnes Qiagen™ à
partir de 50 ml de culture. Elles sont utilisées pour obtenir une grande quantité de matériel
plasmidique.
115
Chapitre V
7.1.4 Préparation d’ADN plasmidique chez C. acetobutylicum
L'ADN plasmidique est extrait à partir de 6 ml de culture sur milieu CGM ayant atteint
une DO600nm d'environ 0,5. Les cellules sont collectées par centrifugation (10 min, 6000 rpm,
4°C), lavées avec 5 ml de tampon KCl (0,5M KCl, 0,1M EDTA, 0,05M Tris-HCl pH 8) puis
par 5 ml de tampon SET (25% saccharose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl pH 8) et repris
finalement dans 450 µl de tampon SET avec 20 mg/ml de lyzozyme. Le mélange est incubé
45 min à 37°C puis conservé dans la glace ou congelé.
Le culot est mélangé avec 350 µl de tampon SES (200 mM NaOH, 10 mM EDTA, 50 µl de
0,5M, 1% de SDS, H20 qsp 2,5 ml) puis 350 µl de tampon KAC 5M (5M acétate de
potassium 60ml, acide acétique glacial 11,5 ml, H2O 28,5ml) et incubé 40 min dans la glace.
Après une centrifugation à 12000 rpm à 4°C, le surnageant est prélevé et deux extractions
phénol-chloroforme (vol/vol) sont ensuite réalisées. Les ADN sont ensuite précipités avec de
l’isopropanol (0,1 vol d’acétate de sodium 3 M à pH 5,2 et 0,7 vol d’isopropanol) et
centrifugés à 13500 rpm pendant 10 min. Le culot constitué par les ADN plasmidiques
précipités est ensuite lavé avec 500 µl d’éthanol à 70%. Une nouvelle centrifugation est
effectuée à 13500 rpm pendant 5 min puis le culot est séché au Speedvac et finalement repris
dans 50 µl de TE 1X avec 1 µl de RNase commerciale (Sigma).
7.1.5 Enzymes
Les endonucléases de restriction ainsi que les enzymes de modification de l’ADN
(ligases, phosphatase alcaline) utilisées proviennent de chez New England Biolabs™,
Sigma™ et Fermentas™. Elles ont été utilisées selon les indications des fournisseurs.
7.2 Techniques d’analyse des acides nucléiques
Les techniques de digestion, et de clonage (ligation, traitement des extrémités de
fragments) sur l'ADN (chromosomique ou plasmidique) sont réalisées selon les procédures
standards (Sambrook et al., 1989) à l'aide d'un excès d'enzyme(s) de restriction, ADN ligase
de phage T4, fragment de Klenow de l'ADN polymérase I d'E. coli, phosphatase alcaline de
116
Chapitre V
crevette, et selon les recommandations des fournisseurs (New England Biolabs™ ou
GIBCO/BRL™).
7.2.1 Electrophorèse en gel d’agarose
La séparation et l'analyse des tailles de fragments d'ADN sont réalisées par
électrophorèse sur gel d'agarose (de 0,8 à 2% d'agarose selon la taille des fragments, dans un
tampon TAE 0,5X). Les fragments d'ADN sont purifiés à partir de gels d'agarose avec les kits
de purification sur gel QIAquick (Qiagen™). Du tampon de charge (1X final) est ajouté aux
échantillons avant dépôt. Le marquer de taille 1 kb (GIBCO/BRL™) est couramment
employé. L'ADN est visualisé aux ultraviolets (DO = 254 ou 312 nm) après coloration du gel
dans une solution de bromure d'éthydium (BET) à 0,5 µg.ml-1.
TAE 0,5X :
Tris acétate
0,02 M
EDTA
0,5 mM
Composition du tampon de charge (6X) :
Bleu de bromophénol
0,25%
Xylène cyanol FF
0,25%
Glycérol dans l'eau
30%
7.2.2 Amplification de fragments d'ADN
L'amplification de fragments d'ADN est réalisée au moyen de la technique
d'amplification de chaîne (PCR). L'ADN à amplifier (10 à 100 ng pour de l'ADN génomique,
1 à 10 ng pour de l'ADN plasmidique) est mis en présence des amorces, des dNTPs, de
magnésium, de sérum d'albumine bovine, de l'enzyme et de son tampon. La réaction s'effectue
dans un volume de 50 µl ou de 100 µl. Vingt-cinq à trente cycles PCR sont réalisés. Chaque
cycle comprend une dénaturation (à 92-94°C et pendant 30 secondes), un appariement des
amorces à l'ADN cible (30 secondes, température variable), et une élongation à 72°C (durée
variable).
117
Chapitre V
Taq Polymérase (Biolabs™)
Dépourvue d’activité de correction sur épreuve, cette polymérase réalise environ une
erreur sur 1000 bases amplifiées. Elle n’est donc utilisée que pour les vérifications par PCR
de la présence d’un gène d’intérêt sur des plasmides ou sur de l’ADN génomique.
Polymérase pFusion et Pfu (Biolabs™)
Polymérase très fidèle, elle est utilisée pour l’amplification de fragments d’ADN
destinés au clonage dans des plasmides. Le protocole utilisé respecte les spécifications éditées
par Biolabs™.
Le kit Pwo DNA polymerase (Roche Molecular Biochemicals™) est aussi utilisé, il
présente les mêmes propriétés que le kit précédemment décrit, avec une fidélité supérieure,
mais une efficacité d'amplification moindre.
Expand Long Template PCR System et Pwo DNA polymerase (Roche™)
Les amplifications PCR longues sont réalisées avec le kit Expand Long Template PCR
System (Roche Molecular Biochemicals™) selon les recommandations données par le
fabriquant. Ce système permet d'amplifier efficacement des fragments de grande taille
(jusqu'à 20 kpb), en minimisant le taux d'erreurs du fait de la combinaison de deux ADN
polymérases.
Le choix est fait entre les différents kits selon la taille du fragment à amplifier et la difficulté
de l'amplification.
118
Chapitre V
7.2.3 Table des oligonucléotides
Nom
Séquence 3' - 5'
Utilisation
Clonage du gène gor de M. jannaschii
dBam-gor-GEX6P3
TTTTTTTTTTGGATCCATGAAAAATGCTTTAATAAATG
C
Clonage Mj gor dans pGEX6P3
(direct)
rXho-gor-GEX6P3
AATTTAAATTTGGCCTCGAGTTATTTTTCAAATTGAG
GATGTG
Clonage Mj gor dans pGEX6P4
(reverse)
dBam-gor-pPhCtag
TTGGATCCTACATTTTGGGAGGATAAACATGAAAAAT
GCTTTAATAAATGCAACGTG
Clonage Mj gor dans pPHCtag
(direct)
rXma-gor-pPhCtag
TCCCCCCGGGACTAATTCTCCAATCAATACCCAATAA Clonage Mj gor dans pPHCtag
CTC
(reverse)
dPrhyd-pPhCtag
CCTCCTTATAAAATTAGTATAATTATAGC
Clonage pr hydrogénase
C. acetobutylicum (direct)
rPrhyd-pPhCtag
GGATCCAATTAAAATATATTAATAAACTTCGTTAAAAA
ATT
Clonage pr hydrogénase C.
acetobutylicum (reverse)
dBspH1-gorMmpTRC99A
TTTCACCTCATGAACATTTTGATTGATGGATCAAG
Clonage Mj gor dans pTR99A
(direct)
rXma1-gorMm-pTRC99A
TCCCCCCGGGTTATTTTTCAAATTGAGGATGTGACC
ATTATTCTTTTAATTTCCAGTCAATTTCTAACT
Clonage Mj gor dans pTR99A
(reverse) (contient le Streptag II)
Clonage du gène gor M. maripaludis
dBam-gorMm-pPhCtag
TTGGATCCTACATTTTGGGAGGATAAACATGAACATT
TTGATTGATGGATCAAG
Clonage Mm gor dans pPHCtag
(direct)
rXma-gorMm-pPhCtag
TCCCCCCGGGTTATTCTTTTAATTTCCAGTCAATTTC
TAACAATTCGCTGT
Clonage Mm gor dans pPHCtag
(reverse)
dBspH1-gorMmpTRC99A
TTTTTTTTTCATGAACATTTTGATTGATGGATCAAGAC
Clonage Mm gor dans pTR99A
(direct)
rXma1-gorMm-pTRC99A
TTTTTTCCCCCCGGGTTATTTTTCAAATTGAGGATGT
GACCATTCTTTTAATTTCCAGTCAATTTCTAACAATTC
Clonage Mm gor dans pTR99A
(reverse) (contient le Streptag II)
Clonage du gène gor P. furiosus
dBam-gorPf-pPhCtag
Clonage Pf gor dans pPHCtag
(direct)
rXma-gorPf-pPhCtag
Clonage Pf gor dans pPHCtag
(reverse)
119
Chapitre V
Clonage des ferrédoxines de C. acetobutylicum et M. jannaschii
PeTNdefdCA03
TTTGGTTCCATATGGCATATAAAATAACAGACGCTTG
TG
Clonage Fdx CAC0303 dans
pET21c (direct)
PeTEcoFdCA03
CCGGAATTCTTATTTTTCAAATTGAGGATGTGACCAC
TCTTGAACTGGAGCTCCTACTGG
pET21c (indirect)
pGXBamFdCA03
CGGGGATCCATGGCATATAAAATAACAGACGCTTGT
G
pGEX6P3 (direct)
pGXXhoFdCA03
GGCCTCGAGTTACTCTTGAACTGGAGCTCCTACTGG
pGEX6P3 (indirect)
PeTNdefdCA27
TTTGGTTCCATATGCCTAGAAGAATTAATAAATTAGA
TTGTGTTGG
pET21c (direct)
PeTEcoFdCA27
CCGGAATTCTTATTTTTCAAATTGAGGATGTGACCAA
TGTTCGGATATGCATTTCTTAGGGC
pET21c (indirect)
PeTNde1FdMJ
TTTGGGAATTCCATATGGCGGTTGAGATAATTGTAGA Clonage Fdx Mjwt et Mj ∆ dans
TAGG
pET21c (direct)
PeTEcoR1FdMJ∆
CCGGAATTCTTATTTTTCAAATTGAGGATGTGACCAA
ACCACTTTAATTAATATTGCATTTGT
Clonage Fdx Mj∆ dans pET21c
(indirect)
PETEcoR1fdMJwt
CCGGAATTCTTATTTTTCAAATTGAGGATGTGACCAC
TTTTTATTTTTATTTTCATCTTTCTTTTTTG
Clonage Fdx Mj∆ dans pET21c
(indirect)
dMobAB
CACCAGACACGTTAGCAGGGTCAATCCCACAATAAA
AG
contrôle délétion opéron E. coli
mobab (direct)
rMobAB
GGATGCGACGCTGGCGCGTCTTATCCAGCCTACTCT contrôle délétion opéron E. coli
TG
mobab (indirect)
dHypF
GCGCAGAAAAACGCCGCCGTACGGCGCTG
contrôle délétion gène E. coli
hypF (direct)
rHypF
GGCGTTTACGCCGCATCCGGCAATGGTGTC
contrôle délétion gène E. coli
hypF (indirect)
Oligos de contrôle
Tableau 8 : Oligonucléotides utilisés au court de cette étude.
7.2.4 Synthèse d'oligonucléotides :
Les oligonucléotides ont été synthétisés par les sociétés Sigma™ (France) et
Eurogentec™ (Belgique).
120
Chapitre V
7.2.5 Analyse informatique des séquences :
Les Logiciels suivant ont été utilisés pour la construction des plasmides et la gestion des
banques de séquence et des alignements multiples : VectorNTI (Informax/Invitrogen),
Infobiogen (www.infobiogen.fr).
8. Techniques de purification des protéines
8.1 Cassage cellulaire
8.1.1 Conditions aérobies :
Les cellules sont décongelées puis reprises dans deux fois le volume initial de tampon
Tris-HCl 100 mM pH8,0. Les cellules sont ensuite cassées par 4 cycles de 30 secondes de
sonication puis centrifugées deux fois à 13500 rpm pendant 10 min. Le surnageant est
récupéré dans des tubes neufs et centrifugé à nouveau deux fois 10 min à 13500 rpm. Le
surnageant est extrait et filtré sur des filtres 0,22 µm et conservé à 4°C avant la purification.
Dans certains cas particuliers des conditions de cassage plus drastiques ont été utilisées et
seront décrites dans le chapitre correspondant.
8.1.2 Conditions anaérobies :
L’ensemble du protocole est réalisé dans une boîte à gants afin de respecter une
anaérobiose stricte. Les cellules sont décongelées puis reprises dans deux fois le volume
initial de tampon Tris-HCl 100 mM pH 8,0 dégazé à l’azote et réduit par 2 mM de DTT. Dans
le cas de C. acetobutylicum le cassage des cellules débute par une incubation avec du
lyzozyme à 1 mg/ml et de DNase I à 1 µl/ml (Fermentas) pendant 20 min avec une agitation
par inversion régulière. Le cassage se poursuit par 4 cycles de 30 secondes de sonication puis
les cellules sont centrifugées deux fois à 13500 rpm pendant 10 min.
Le surnageant est récupéré dans des tubes neufs et centrifugé à nouveau deux fois 10 min à
13500 rpm. Le surnageant est extrait et filtré sur des filtres 0,22 µm et conservé à 4°C avant la
purification.
121
Chapitre V
8.2 Purification sur colonne échangeuse d’ions
Cette technique n’ayant été utilisée que pour la purification de la GAPOR (M.
jannaschii et M. maripaludis) en condition anaérobie, elle est donc réalisée entièrement dans
une boîte à gants en conditions d’anaérobiose stricte.
Le surnageant de cassage peut être prépurifié sur une colonne échangeuse de cations avant
passage sur les colonnes d’affinité. Cette technique permet de clarifier le surnageant de
cassage en éliminant la majorité des protéines cellulaires tout en conservant le maximum de
protéine d’intérêt avant passage en purification d’affinité.
Le gel est équilibré avec un tampon B (Tris-HCl pH 7,4 dégazé à l’azote et avec 2 mM de
DTT). Le surnageant de cassage est dilué 5 fois dans du tampon B puis chargé sur environ 10
ml de gel de type SP-sépharose (Amersham-Pharmacia™). Trois lavages sont réalisés avec 10
ml de tampon B puis la protéine d’intérêt est éluée avec 10 ml de tampon B contenant 0,5M
NaCl. L’éluat est ensuite conservé à 4°C.
8.3 Purification par gel filtration
Les colonnes Superose 12 et Sephacryl ont utilisées pour les expériences de gel filtration.
8.4 Purification d’affinité sur colonne Streptactin™
Le surnageant est dilué dans deux volumes de tampon Tris-HCl 50mM pH 8,0, DTT
2 mM, puis traité avec de l’avidine à 0,16 g/l afin de bloquer la biotine. Après une incubation
de 30 min à 4°C, l’extrait est filtré (filtres Sartorius de 5 µm) et centrifugé une nouvelle fois à
12000 rpm. L’extrait est ensuite chargé sur une colonne d’affinité StrepTactin–Superflow
pre-équilibrée avec du tampon Tris-HCl 50 mM pH 8.0 DTT, 2mM. Les protéines retenues
sur la colonne sont ensuite lavées par 10 ml de tampon Tris-HCl 50 mM pH 8.0 DTT, 2mM et
enfin éluées avec 2,5 mM de desthiobiotine dans ce même tampon. Dans certains cas il est
nécessaire que l’éluat ne contienne pas de DTT. Le tampon d’élution utilisé dans ce cas est
une solution de Tris-HCl 50 mM pH 8,0 avec 2,5 mM de desthiobiotine et dégazé à l’azote
puis à l’hydrogène.
122
Chapitre V
8.5 Purification des Ferrédoxines
La purification des ferrédoxines se fait en plusieurs étapes est diffèrent selon la
solubilité de ces dernières après la phase d’expression.
8.5.1 Purification directe des ferrédoxines solubles par chromatographie
d’affinité
Les ferrédoxines, produites à partir des constructions vectorielles pET21c, qui sont
présentes sous une forme soluble dans le surnageant de cassage peuvent être purifiées
directement par chromatographie d’affinité StrepTactin. Le protocole de cassage diffère sur
quelques points du protocole général présenté au chapitre 8.1.
8.5.1.1 Cassage cellulaire
Les cellules sont centrifugées à 6000g puis lavées deux fois par une solution de TrisHCl 50 mM pH 8,0. Les cellules sont ensuite resuspendues dans ce même tampon additionné
de lysozyme à 0,5 mg/ml et de DNase I (Fermentas) à 100 unités/ ml et incubés 30 minutes à
37°C sous agitation douce. Le cassage est ensuite achevé par une sonication (4 cycles de 30 s
espacés chacune par une période de repos de 2 min à 4°C). L’extrait cellulaire soniqué est
ensuite centrifugé deux fois de suite pendant 10 min. Dans le cas, de la purification de
protéines contenues produisant des corps d’inclusion le culot est conservé tandis dans le cas
de protéines solubles ce dernier est éliminé et le surnageant est conservé à 4°C en attendant
les étapes de purification ultérieures.
8.5.1.2 Purification directe par chromatographie d’affinité
Le surnageant de cassage est incubé pendant 30 min à 4°C avec de l’avidine (0.16 g/l)
puis filtré (filtres Sartorius de 5 µm) et dilué dans un volume de tampon Tris-HCl 50 mM pH
8,0 réduit par 2 mM de DTT. Le surnageant est ensuite chargé sur une colonne d’affinité
StrepTactin–Superflow (IBA, GmbH) pré-équilibrée avec du tampon Tris-HCl 50 mM pH 8.0
DTT, 2mM. Les protéines étiquetées retenues sur la colonne sont ensuite lavées par 10 ml de
tampon Tris-HCl 50 mM pH 8.0 DTT, 2mM et enfin éluées avec 2,5 mM de desthiobiotine
dans ce même tampon. Dans certains cas il est nécessaire que l’éluat ne contienne pas de
123
Chapitre V
DTT. Dans ce cas précis le tampon d’élution est une solution de Tris-HCl 50 mM pH 8,0 avec
2,5 mM de desthiobiotine et dégazé à l’azote puis à l’hydrogène.
8.5.2 Techniques de solubilisation des corps d’inclusion
Dans le cas où les protéines produites forment des corps d’inclusion insolubles il est
possible de purifier ces dernières à partir du culot de cassage. Le protocole énoncé dans ce
paragraphe prend suite directement après le cassage cellulaire décrit au chapitre 8.4.1.1 à
partir du culot de cassage.
Le culot de cassage contenant les protéines insolubles et mélangées aux débris cellulaires est
resuspendu deux fois dans un tampon Tris-HCl 0.1 M, pH 7.5 avec 1 M urée, 0.25 M NaCl, et
0.1% Tween suivi par une centrifugation 10 min à 12000g. Le culot est ensuite lavé deux fois
par un tampon Tris-HCl 0.1 M, pH 8 suivi d’une centrifugation à 12000g. Le culot est ensuite
solubilisé sous agitation douce pendant 1 heure dans un tampon Tris-HCl 0.1 M, pH 8,0
contenant 8 M d’urée.
8.5.3 Purification post-reconstitution
La purification post-reconstitution des ferrédoxines est basée sur le protocole de
purification par affinité énoncé au chapitre 8.4.1.2. L’extrait de ferrédoxines reconstituées
contient parfois des impuretés et dépôts macroscopiques liés au protocole de reconstitution
qu’il est nécessaire d’éliminer avant passage sur la colonne d’affinité. Il est donc parfois
nécessaire de filtrer plusieurs fois l’extrait (filtres Sartorius de 0,22 µm) et de le centrifuger à
plus de 12000g avant chargement sur la colonne de StrepTactin–Superflow (IBA, GmbH). La
suite du protocole se conforme au protocole décrit au chapitre 8.4.1.2.
9. Techniques de chimie de reconstitution
Les ferrédoxines sont parfois produites sous une forme particulière (corps d’inclusion...)
et/ou purifiées dans certaines conditions (milieu aérobie) qui nécessitent une reconstitution
des centres [4Fe-4S] afin d’obtenir une protéine biochimiquement active. Les différentes
expériences de reconstitution sont réalisées en boîte à gants sous une atmosphère anaérobie
(90% azote et 10% hydrogène).
124
Chapitre V
9.1 Protocole de reconstitution
La solution de ferrédoxine doit être complètement dénaturée avant d’entamer le
protocole de reconstitution. Ce dernier peut donc être directement appliqué sur une solution
de ferrédoxine resolubilisée (voir chapitre 8.4.2) ou sur une solution de ferrédoxine purifiée et
dénaturée dans une solution de Tris-HCl 0.1 M, pH 8,0 et contenant 8 M final d’urée.
La solution de ferrédoxine dénaturée est ensuite diluée dans un volume de tampon Tris-HCl
0.1 M, pH 8,0 dégazé et pré-réduit par 10 mM de DTT et 0.1 M de β-mercaptoéthanol
pendant 1 heure. Cette solution est ensuite incubée dans une fiole close pendant environ
1 heure sous agitation douce. La concentration en apo-ferrédoxine est ajustée à 125 µM et la
reconstitution des centres Fe-S est réalisée avec des solutions concentrées de FeCl3 et de Na2S
en respectant un rapport final : [Fe]-[S]/[apo-ferrédoxine] d’environ 20. La solution de FeCl3
est ajoutée en premier lentement puis celle de Na2S sous agitation douce. La fiole est ensuite
fermée et le mélange de reconstitution est incubé pendant 2 heures sous agitation douce. Il
s’en suit une dialyse sur la nuit à 20°C contre 100 volumes de tampon Tris-HCl 50 mM, pH
8.0 contenant 10 mM de DTT. Le dialysat est ensuite récupéré puis filtré (Sartorius, 0.22 µm)
avant que les ferrédoxines soient purifiées par une dernière étape de chromatographie
d’affinité.
10. Techniques analytiques
10.1 Dosages du glycéraldéhyde 3-phosphate
Le dosage du GAP est effectué à l’aide de la Glycéraldéhyde 3-phosphate
déshydrogénase (GAPDH) (Voir réaction figure 30 A) dans un tampon Tris HCl 500mM, en
présence de NAD à 5 mM, d’arsenate à 40 mM, de cystéine à 5 mM et de la solution de GAP
à doser. La formation de NADH au cours du temps est suivie sur le fluoromètre à λ = 340 nm
(voir figure 30 B) et la concentration en GAP est déterminée par la mesure moyennée sauts de
formation de NADH.
125
Chapitre V
NAD+
A
NADH
3-phosphoglycérate
GAP
GAPDH
B
Figure 34 : Dosage biochimique du GAP à la GAPDH.
A : réaction catalysée par la Glycéraldéhyde - phosphate déshydrogénase utilisée pour le dosage du GAP. B :
Courbe de dosage du glycéraldéhyde 3-phophate (GAP) effectué selon la réaction ci-dessus. Suivi de
l’absorbance du NADH formé au cours de la réaction. Déclenchement de la réaction par injection de GAP.
Réalisation de 4 sauts de NADH par injection dans le milieu réactionnel : 1. 10µl 2. 20µl 3. 10µl 4. 40µl.
réaction à 25 °C, Tris HCl 500mM.
10.2 Dosages des activités enzymatiques
10.2.1 Dosage des protéines totales
10.2.1.1 Dosage de Bradford
Les protéines sont dosées selon la méthode très sensible de Bradford (1976). L'extrait
acellulaire (0,8 ml) dilué est mélangé à 0,2 ml de réactif concentré Biorad composé de
méthanol
et
d'acide
phosphorique.
Après
5
minutes,
l’absorbance
à
595
nm
(spectrophotomètre Kontron Uvikon 810). La courbe étalon est réalisée à l'aide d’une solution
d'albumine bovine.
Le dosage des ferrédoxines necessite une correction par aminoquant (voir chapitre 10.2.1.3).
126
Chapitre V
10.2.1.2 Dosage Micro-biuret
La réaction du biuret forme un complexe pourpre entre la liaison peptidique et un réactif
contenant du cuivre en milieu alcalin. Le complexe de coordination résultant absorbe
fortement dans le bleu.
Les protéines sont mises en présence d’une quantité de réactif
puis sont incubées à
l’obscurité pendant 30 min. L’absorbance est ensuite mesurée à 540 nm.
Remarque : on observe de nombreuses interférences réactionnelles
avec des composés
aminés (Tris, urée...), du saccharose et du glycérol.
Composition du réactif de Cornall :
CuSO4, 5H2O : 1,5 g
Tartrate NaK :
6g
NaOH :
30 g
Eau qsp
1L
10.2.1.3 Dosage en Aminoquant
Le dosage de la concentration en ferrédoxine totale nécessite une correction par aminoquant :
Protocole d’hydrolyse acide
Les protéines sont totalement hydrolysées en acides aminées par un traitement acide et
thermique.
- Solution d’hydrolyse : HCl 12 N + phénol 1% : 100 µl : 100 µl
- Echantillon (ferrédoxine, BSA ou étalon acide aminé pur) : 100 µl
L’ensemble est déposé dans une ampoule en verre (volume 5ml) étanche (scellée à la flamme)
et disposé dans un bain thermostaté à 105 °C pendant 22 h.
Le mélange est ensuite neutralisé par du NaOH à 6 N (50µl échantillon + 50 µ NaOH)
pendant quelques minutes et est ensuite analysé par dosage en HPLC Aminoquant.
Protocole de dosage des acides aminés en HPLC Aminoquant (méthode de calibration et
d’exclusion des acides aminés parasites) :
127
Chapitre V
Certains acides aminés sont détruits partiellement ou totalement par l’hydrolyse acide ou ont
été transformés en un autre acide aminé :
Thr / Ser : détruits partiellement par l’hydrolyse acide
Met : oxydée partiellement
Asn / Gln : transformés en Aap et Glu ce qui fausse également le dosage de ces derniers
Trp / Cys : totalement détruits par l’hydrolyse acide
Seul le dosage des acides aminés suivants a été retenu : His, Ala, Tyr, Val, Ile, Leu, Pro. La
séquence des protéines dosées étant connue, il est possible d’estimer précisément leur
concentration par la moyenne des dosages unitaires de leurs acides aminés.
10.2.2 Préparation des extraits cellulaires aérobie
Le volume de la culture à DO600nm 2 - 2,5 est prélevé stérilement dans un tube de
centrifugation. Une fois les tubes ou les cultures en fiole sertie, transférés dans l'enceinte
anaérobie, les cellules sont centrifugées à 6000 g durant 15 minutes à 4°C.
Le culot cellulaire est repris dans un tampon Tris-HCl (100 mM pH 7,0), DTT 2 mM puis une
centrifugation à 6000 g permet de laver les cellules. Le cassage cellulaire est effectué dans le
même tampon au moyen d'un désintégrateur à ultrasons (désintégrateur Vibracell 72434,
Bioblock) à 4°C selon 4 cycles de 30 secondes d'ultrasons suivies de 2 minutes de repos. Les
débris cellulaires sont éliminés par centrifugation à 13000 x g pendant 5 minutes. Pour la
purification des protéines recombinantes (Strep-Tag), l'extrait cellulaire est traité à l'avidine 1
mg.ml-1 pendant 30 minutes à 4°C.
10.2.3 Préparation des extraits cellulaires anaérobie
Le volume de la culture à DO600nm 2-2,5 est prélevé stérilement dans un tube de
centrifugation. Une fois les tubes ou les cultures en fiole sertie, transférés dans l'enceinte
anaérobie, les cellules sont centrifugées à 6000 g durant 15 minutes à 4°C.
128
Chapitre V
Le culot cellulaire est repris dans un tampon Tris-HCl (100 mM pH 7,0), DTT 2 mM puis une
centrifugation à 6000 g permet de laver les cellules. Le cassage cellulaire est effectué dans le
même tampon au moyen d'un désintégrateur à ultrasons (désintégrateur Vibracell 72434,
Bioblock) à 4°C selon 4 cycles de 30 secondes d'ultrasons suivies de 2 minutes de repos. Les
débris cellulaires sont éliminés par centrifugation à 13000 g pendant 5 minutes. Pour la
purification des protéines recombinantes (Strep-Tag), l'extrait cellulaire est traité à l'avidine
1 mg.ml-1 pendant 30 minutes à 4°C.
10.2.4 Dosage des activités
Les dosages enzymatiques suivant sont effectués en anaérobiose. Une unité d'activité
enzymatique est définie comme étant la quantité d'enzyme qui catalyse la conversion de
1 µmol de substrat par minute. Un spectrophotomètre HP8453A UV/Visible (HewlettPackard), équipé d'un enregistreur a été utilisé pour les dosages enzymatiques dans l'enceinte
anaérobie.
10.2.4.1 Activité d’oxydation de l’H2 par l’hydrogénase
En extraits bruts : Les tests sont menés sur un volume total de 1 ml, dans des cuves
spectrométriques en quartz. La solution tampon est du Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, DTT 2 mM
préchauffée à 37°C. Avant le démarrage du test, de l’hydrogène pur est injecté et dissous dans
la solution tampon par bullage directement dans la cuve en quartz. Les tests sont réalisés avec
20 mM final de Méthyl viologène ou 10 mM final de Benzyl Viologène et déclenchés par
ajout de l’extrait cellulaire brut.
Sur protéine purifiée : Les tests d’activité hydrogénase sur protéine purifiée et concentrée
sont généralement réalisés dans une solution tampon phosphate 10 mM, pH 7,5, 20 mM de
DTT et 20 mM de méthyl Viologène. Le test d’activité est déclenché par l’ajout d l’enzyme
préalablement diluée si nécessaire afin d’obtenir une activité enzymatique dont la valeur brute
est comprise entre 0,1 et 1 DO/min.
Sur gel Natif : Lorsque la migration sur gel est terminée (3 h à 75 V), Incuber ce dernier dans
un tampon Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 pendant 1 h. A jouter du benzyl viologène à 1 mg/ml
129
Chapitre V
final dans le bain et laisser incuber 30 min. Les zones présentant une activité hydrogénases se
colorent en bleu. Afin de fixer le colorant dans le gel incuber 15 min avec du RT (10 mg/ml).
Rincer le gel à l’eau par plusieurs lavages successifs.
Pour les besoins d’une étude enzymatique particulière telle que celle traitée dans le
chapitre VII de ce document les essais hydrogénase peuvent être conduits dans un tampon de
nature et de pH variés. Les différentes déclinaisons seront alors décrites dans les chapitres
concernés.
10.2.4.2 Activité GAPOR
Les tests sont réalisés en anaérobiose dans la boîte à gants dans des cuves
spectrométriques à 50°C dans un tampon Tris-HCl à 50 mM pH 7.5 ou 8,0, en présence de
0,05 à 1 mM de GAP et de 10 à 150 mM de benzyl viologène ainsi qu’en présence d’un
volume variable d’une fraction d’élution de la GAPOR. La longueur d’onde du
spectrophotomètre est de 580 nm et la réaction est déclenchée par injection du GAP dans la
cuve.
10.3 Analyses en gels SDS-PAGE des protéines
10.3.1 En conditions dénaturantes
Les protéines sont séparées sur un gel de polyacrylamide contenant du SDS. Un gel de
concentration (à 4%) précède le gel de séparation (à 8 ou 12%).
Composition du gel de concentration :
/10 ml
Mélange acrylamide/bisacrylamide, 40% (37,5:1)
4%
1 ml
Tampon Tris-HCl, 1M (pH 6,8)
0,25 M
2,5 ml
SDS (20%)
0,1%
50 µl
APS (10%)
0,05%
50 µl
TEMED
0,05%
10 µl
H2O
qsp 10 ml
Composition du gel de séparation :
/20 ml
Mélange acrylamide/bisacrylamide 40% (37,5 :1)
130
12%
6 ml
Chapitre V
Tampon Tris-HCl, 1,5 M (pH 8,8)
0,375 M
5 ml
SDS (20%)
0,1%
0,1 ml
APS (10%)
0,05%
0,1 ml
TEMED
0,05%
10 µl
H2O
qsp 20 ml
L'APS et le TEMED (N-N-N'-N'-tétraméthylènediamine) sont ajoutés juste avant de couler les
gels.
La migration est réalisée de 100V/20 mA à 150V/20-30 mA
Composition du tampon de migration (5X):
Tris base pH 8,3
15,1 g
Glycine
74 g
SDS 20%
25 ml
H20
qsp 1 l
Composition du tampon de transfert :
Tris base pH 8,3
3g
Glycine
14,4 g
Méthanol
200 ml
H20
qsp 1 l
Les échantillons et le marqueur de taille, mélangés au tampon de dépôt 1X, sont incubés à
100°C, pendant 5 minutes avant le dépôt sur gel. Le marqueur de taille utilisé est le marqueur
LMW de Pharmacia ou le marqueur précoloré de Biorad (prestained SDS-PAGE standard
Low Range).
Composition du tampon de dépôt (5X) :
Tampon Tris-HCl (pH 6,8)
0,3 M
Glycérol
50%
SDS
10%
Bleu de bromophénol
0,05%
131
Chapitre V
10 µl de DTT 1 M et 10 µl de ß-mercaptoéthanol sont ajoutés pour 100 µl de tampon avant
utilisation ou conservation à -20°C.
Migration et coloration
Après migration le gel est coloré (2h) dans une solution d'acide acétique (10%), de méthanol
(30%) et de bleu de Coomassie (0,3%). La décoloration est réalisée par plusieurs lavages dans
une solution d'acide acétique (10%), éthanol (30%).
Pour les colorations à l'argent le kit Silver Stain Plus (Bio-Rad) a été utilisé.
Après coloration, les gels sont traités 10 minutes dans une solution d'éthanol 70% / glycérol
3%, puis 15 minutes dans une solution de glycérol 3% avant d'être séchés sous vide entre
deux feuilles de cellophane (Sigma) pendant environ 2 heures à 80°C.
10.3.2 En conditions natives
La migration des protéines en conditions non dénaturantes est réalisée sur un gel de
polyacrylamide à 8 % (voir réalisation chapitre 10.3.1) sans ajout de SDS. Le tampon de
migration est également un tampon glycine standard mais dénué de SDS. Le tampon de
charge est constitué uniquement de Tris-HCl (pH 6,8) et de 0,3 M de glycérol 50%. Le
marqueur de taille spécifique ne contenant pas de DTT ni de SDS (Invitrogen™ Native
Mark).
10.3.3 Quantification des bandes de protéines :
La quantification des bandes de protéines a été réalisée à l’aide du logiciel « Image J »
développé
par
Wayne
Rasband
(NIH)
et
disponible
à
l’adresse
suivante :
http://rsb.info.nih.gov/ij/docs/intro.html. Ce logiciel permet d’intégrer l’intensité des bandes
de protéines sur l’ensemble d’une piste et d’évaluer le pourcentage que représente chaque
bande par rapport à l’ensemble de la piste. On obtient au final une estimation approximative
de la pureté d’un mélange de protéines déposé sur gel (coloration coomassie ou à l’argent).
Afin d’améliorer la précision, la mesure est moyennée sur plusieurs dilutions déposées sur gel
afin d’éliminer les problèmes de saturation de coloration.
132
Chapitre V
10.4 Western Blot des protéines
10.4.1 Streptactin anti-Strep-Tag
La présence des protéines de fusion avec l'étiquette Strep-Tag dans les fractions
cellulaires ou purifiées a été testée par immuno-empreinte, après dépôt sur gel
d'électrophorèse SDS-polyacrylamide de 8 à 12% et transfert électrique des protéines sur
membrane pendant 1 heure à 100 volts. La membrane est alors saturée par une solution de
BSA 3% dans un tampon PBS pendant une nuit, puis le tampon PBS est utilisé pour éliminer
l'excès de BSA. La streptactin anti-Strep-Tag Strep-Tactin HPR (IBA GmbH™) est dilué a
1:830 dans le tampon PBS - tween 0,3% et la révélation par la Péroxydase (Horse Radish) est
réalisée grâce à la solution révélatrice suivante :
- 2 ml d'une tablette 4C1N (4-chloro-1-naphtol, Sigma) dissoute dans 10 ml de méthanol
- 10 ml d'une solution saline (pour 1 l) : 7,5 g NaCl + 2,8 ml de triéthanolamine + 17 ml d'HCl
0,1 M
- 5 µl de péroxyde d'hydrogène à 30%
Composition du tampon PBS 1X :
KH2PO4, pH7,4
0,24 g
Na2HPO4, pH7,4
1,44 g
NaCl
8g
KCl
0,2 g
H2O
qsp 1 l
10.4.2 Technique de spectroscopie optique :
Les tests enzymatiques et les mesures d’absorbance sont réalisés sur un
spectrophotomètre Hewlett-Packard et visualisés sur ordinateur grâce au logiciel HP™
ChemStation.
10.4.3 Titrage potentiométrique suivi par spectroscopie optique
Le titrage potentiométrique d’une solution de protéine a été réalisé dans une cellule de
mesure spectrophotométrique anaérobique balayée par un flux d’argon continu. La solution de
133
Chapitre V
ferrédoxine (2,1 mL à environ 20µM en protéine dans tampon 50mM TRIS pH 8) est
contenue dans une partie parcourue par un faisceau lumineux du spectrophotomètre
(Uvikon™ 2000). Une électrode combinée (Ag/AgCl/KCl 3 M) de mesure du potentiel est
introduite dans la solution afin de suivre le potentiel d’oxydoréduction de la solution.
La solution (volume 2ml) de ferrédoxine contient :
-
La protéine concentrée dans son Tampon Tris pH 8.0 50mM sous agitation douce
- Un cocktail de médiateurs de bas potentiel (dont la concentration finale est de 2 µM) servant
de navettes électroniques entre le centre rédox de la protéine et l’électrode:
Nom
Potentiel
•
Indigo disulfonate carmine
- 125 mV
•
Phénosafranine
- 252 mV
•
Rouge Neutre
- 325 mV
•
Méthyl viologène
- 450 mV
L’ajout de petits volumes (quelques dizaines de microlitres) de l’hydrosulfite de sodium
(«dithionite») concentrée (10mM) permet de diminuer progressivement le potentiel de la
solution et des spectres optiques de la solution titrée sont enregistrés pour chaque potentiel.
10.4.4 Technique de spectroscopie par Résonance paramagnétique (RPE) :
Les expériences de RPE on été réalisées sur un spectrophotomètre Bruker ELEXYS
500E relié à un cryostat Oxford instrument ESR900 sous flux d’hélium. Les échantillons sont
tamponnés par du Tris à 50 mM pH 8,0. Les titrations potentiométriques ont été réalisées dans
une cuve anaérobie sous atmosphère d’argon à 23°C. Une solution contenant un mélange de
médiateurs de bas potentiel a été ajoutée à la solution de protéine (carmin indigodisulfonate,
phenosafranine, rouge neutre, méthyl viologène) à une concentration finale de 8 µM chacun.
Les potentiels d’oxydoréduction ont été atteints par l’ajout progressif d’hydrosulfite de
sodium (10 µM) puis 160 µl d’échantillon ont été prélevés à ce moment et transférés dans un
tube en quartz avant d’être rapidement congelés.
134
Chapitre V
10.4.5 Technique d’électrochimie directe des protéines (voltampérométrie)
L’équipement d’électrochimie utilisé a été décrit dans la référence (Leger et al., 2004).
Dans le cas de la ferrédoxine CAC0303, la protéine a été adsorbée sur une électrode de
graphite pyrolytique fraichement polie (surface 0.1 cm2) avec un traitement de surface à la
polymyxine 20 mg/ml dans de l’eau (SIGMA) puis par dépôt de 0,5 µl de protéine.
Le film a été suffisamment stable par la suite pour transférer la protéine dans des solutions
tampons où le signal électrochimique de la protéine reste bien visible. Dans le cas de la
ferrédoxine CAC3527, il n’a été possible d’observer un signal que dans le cas où la protéine a
été adsorbée sur l’électrode sans adjuvant d’adsorption.
Le tampon utilisé dans toutes les études de voltamétrie est de composition suivante : MES,
HEPES, sodium acétate, TAPS, CHES (Sigma, 5mM de chaque composés) et 0,1 M de NaCl.
Les données ont été analysées en utilisant le par le programme « SOAS » (C. Léger, BIP,
CNRS Joseph-Aiguier Marseille) qui permet la réalisation de régressions linéaires et de
transformées de Fourrier disponibles dans la banque NETLIB.
10.4.6 ICP-MS
La concentration des espèces métalliques (Fe, W...) présentes dans les protéines a été
déterminée par ICP-MS (spectrophotomètre HP 4500, calibrée par un étalon externe) en
collaboration avec Mme F. Chaspoul de la faculté de pharmacie de Marseille la Timone.
10.4.7
Techniques de spectroscopie de Masse
La protéine dialysée contre du tampon acétate d’ammonium a été analysée en MALDITOF selon le mode linéaire. La matrice (acide sinapinique à 6mg/ml dans 0.1% TFA 50%
CH3CN) est déposée sur la plaque avant la solution protéique (<1mg/ml).
Le calibrage (close calibration) a été réalisé avec une solution de BSA (standard Applied
66486) dont le PM est proche de GAPOR. Un contrôle a été effectué avec une solution d’Ig1
(masse théorique 148500 Da, masse expérimentale après calibration BSA 148564 Da). Ces
mesures ont été réalisées en collaboration avec Mr M. Rossignol de l’INRA d’Auzeville.
135
136
Chapitre VI
Etude de la Glycéraldéhyde
3-phosphate oxydoréductase
137
Chapitre VI
Etude de la Glycéraldéhyde 3-phosphate oxydoréductase
Chapitre VI
Etude de la Glycéraldéhyde 3-phosphate
oxydoréductase
1. Introduction
Dans l’optique d’augmenter le rendement de production d’hydrogène par insertion
d’une GAPOR dans le métabolisme de C. acetobutylicum (selon la stratégie décrite dans le
Chapitre I.3), notre choix s’est porté tout d’abord sur la GAPOR disponible fonctionnant à la
température la plus proche de celle de son futur hôte (37°C).
Plusieurs gènes candidats codant pour une GAPOR putative ont été identifiés grâce à une
recherche par alignements multiples (Logiciel Blast, NCBI) dans des banques de données
génomiques (Genbank...). La séquence de référence utilisée est celle de la GAPOR de
Pyrococcus furiosus, unique GAPOR caractérisée à ce jour. N’étant limités que par le nombre
de séquences génomiques disponibles au début de cette thèse, plusieurs séquences protéiques
présentant un degré d’identité très élevé (supérieur à 50%) ont été identifiées chez plusieurs
espèces très proches de P. furiosus (Pyrococcus horikoshi, Pyrococcus abyssi) qui se
développent également de manière optimale à des températures proches de 100°C. Une
séquence protéique a cependant pu être identifiée chez le méthanogène Methanococcus
jannaschii présentant un taux d’homologie élevé de 57% et une identité de 42% par rapport à
la GAPOR de P. furiosus.
Comparativement aux autres microorganismes disposant d’une GAPOR identifiée M.
jannaschii présente la particularité de posséder une température optimale de croissance plus
faible (de l’ordre de 85°C) et une gamme de températures de développement très large
pouvant descendre jusqu’à 48°C (données ATCC). Ceci laisserait à penser que cette GAPOR
putative correspondant à l’ORF MJ1185 serait susceptible d’être fonctionnelle à une
température beaucoup plus proche de celle de C. acetobutylicum que les GAPOR des
Pyrococcales. Cet argument est particulièrement essentiel dans le cadre de l’expression de la
GAPOR chez C. acetobutylicum qui nécessitera une adaptation de l’enzyme à la température
138
Chapitre VI
de croissance standard de la bactérie hôte (37°C), afin que celle-ci conserve sa fonctionnalité
et une activité significative.
Compte-tenu de ses caractéristiques et des objectifs du projet notre choix s’est
logiquement porté sur la GAPOR de M. jannaschii dans un premier temps. Nous avons donc
entrepris l’étude et la caractérisation biochimique de cette enzyme dans des conditions
d’expression hétérologue afin de préparer sa future insertion dans le métabolisme de C.
acetobutylicum en remplacement de la GAPDH.
2. Données de séquence et modélisation moléculaire de la
GAPOR de M. jannaschii
Les GAPOR sont des AOR singulières qui présentent la particularité d’avoir une
spécificité très élevée pour le glycéraldéhyde 3-phosphate. La GAPOR de M. jannaschi est
une protéine de 622 acides aminés codée par le gène gor (ORF MJ1185) de 1869 bases. C’est
l’unique séquence protéique présente dans le génome de M. jannaschii qui présente un taux
d’homologie significatif (>25%) avec la famille des AOR. L’analyse de sa séquence (figure
36) par alignement avec la GAPOR de P. furiosus, de P. abyssi et P. horikoshi a permis de
mettre en évidence la présence de motifs très conservés liés au site actif de l’enzyme et aux
liaisons avec le cofacteur W-ptérine et le centre [4Fe-4S]. Ces motifs ont été identifiés par la
résolution de la structure de la FOR et de l’AOR de P. furiosus (Chapitre IV section 3.2). La
GAPOR de M. jannaschii présente une homologie de séquence protéique d’environ 56%
(dont 42% d’identité) avec le groupe des GAPOR et d’environ 28% avec les AOR et FOR de
P. furiosus (figure 35). La présence de motifs fonctionnels conservés et le haut degré
d’homologie avec la GAPOR caractérisée de P. furiosus ainsi que l’unicité de la séquence
dans son génome, sont autant d’indices de la probable fonctionnalité de la GAPOR chez M.
jannaschii.
AOR P.
P. furiossus
furiosus (0.3218)
AOR
(0.3218)
FOR P. furiosus (0.2867)
GAPOR M. jannaschii (0.2849)
GAPOR P. furiosus (0.0952)
GAPOR P. abyssi (0.0590)
Gapor P. horikoshi (0.0665)
Figure 35 : Dendrogramme des séquences protéiques du groupe des GAPOR à l’AOR et la FOR de P. furiosus.
139
Chapitre VI
1
G
G
G
G
Mj
Pf
Pa
Ph
G
G
G
G
Mj
Pf
Pa
Ph
G
G
G
G
Mj
Pf
Pa
Ph
G
G
G
G
Mj
Pf
Pa
Ph
G
G
G
G
Mj
Pf
Pa
Ph
G
G
G
G
Mj
Pf
Pa
Ph
G
G
G
G
Mj
Pf
Pa
Ph
G
G
G
G
Mj
Pf
Pa
Ph
G
G
G
G
Mj
Pf
Pa
Ph
G
G
G
G
Mj
Pf
Pa
Ph
70
MKNALINATTKKFEIIEKTVLP------ITWGLYWHNKFETWKYDAYDEKNVFCFGSG---VLPVIGGHR
MKFSVLKLDVGKREVEAQEIEREDIFGVVDYGIMRHNELRTYEVDPYDPRNIVIFGIGPFAGSVLPGSHR
MKFSVLKIDVEKKDIKLEDFEREDIYGIIDYGIYVHTQLKTYELEPYDPRNVMIIGKGPFAGSALPGSHR
MRFSVLKLDVEKKEVKLEDVDIPEVYGIIDYGIHIHNKLKTYEIEPYDPRNVVIIGKGPFAGSALPGSHR
71
140
LIFSFRSPLWDGFYFSSMGGAGYQFKSTGLNNVAIIGRCENPSILVIENDGQLR------------IDFI
LVFFFRSPLYGGLFPSTMGGAGYQFKNVGVDFVEIHGKAEKPTVIILKNDGEKLSVDFYEIELEKLLDVW
LVFFYRSPLYGTLFPSTMGGASYQFQHVGVDFVEIHGKAEKPVVIIMKNDGEEISVNFYELEMDKLIEIW
LVFFYRSPLYGTLFPSTMGGASYQFQHVGVDFVEVHGRSEKPTVVIMKNDGENVSVSFYEIELEKVIEIW
141
211
EVKEELKTVYEVSKYILE----LYKDKNLRSVVVGEAAKRTNMGGLFSQTVRNGKFVEGSEDWAARGGGG
KEYKGEEGVYALTQYLLDNLASVFEGMEFRIAVVGPAALNTNMGAIFSQALRNGKRAVGSEDWAARGGPG
EGYKGEEGVYALTQYLLDNLSSEFEGMEFRIAVVGPAALNTNYGAVFSQALRNGKRAVGSEDWAARGGTG
KGYKGEEGVYALTQYLLDNLSPEFEGMEFRIAVVGPASLNTNYGAVFSQALRNGKRAIGSEDWAARGGTG
211
280
SVLYRAHNIMGIVFFGD---EK---EDKEEKEKAKKIIESYYKKPMSKVVLEHTKKYRYDEETKTGGTFG
SVLLRAHNVVAIAFGGKKRKREFPGEDISDVKVAKRVVEGIHKKAQRDVINESTVKYRYNPKLNTGGTFG
SVLLRAHNVVAIAFGGKKRKKKFPGEDITSMSTAKRIVEGVHKKPYNEVVTHATTKYRFNPKLNTGGTFG
SVLLRAHNVVGIAFGGKKRKKKFPGEDITNMSTAKRIVEGVHKKPYNDVVTSATTKYRYNPKLRTGGTFG
281
350
NNWLLYKEKVPIFNWRMPYIDKEDRKKILEKILKFYLEIFNKETIEPKRWANCGEPCPVLCKKYRNKNKV
GNYPAEGDLVPVLNWQMPYIPKEERIKIHELIMKYYWEPFNKESIQPKNWTTCGEPCPVVCKKHRKGHHV
GNYPAEGELVPILNWQMPYIPKEERIKIHELIMKYYWEPFNEESIKPKKWTTCGEPCPAVCKKHRRGHHV
GNYPAEGELVPILNWQMPYIPKEDRIKLHELIMKYYWEPFNKESIEPKNWTTCGEPCPAVCKKHRRGHHV
351
416
DYEPYASNGTLLGIFDLYEADRVVKTADALGFDAIEIGNLTAWVFELLDVGLLKEEELNIKKPIFDYKKI
EYEPYEANGPLSGSIYLYASDISVHAVDAMGFDAIEFGGTAAWVLELVHKGLLKPA----EVGISDVPEF
EYEPYEANGPLSGSIYLYASDISVHAVDSMGFDAIEFGGTAAWLLELVYRGLLKPE----EVGISDKPRF
EYEPYEANGPLSGSISLYASDISVHAVDAMGFDAIEFGGTAAWIFELIHRGLLKPE----EVGISDKPRF
417
485
TNDDDEEIR-EISKHNAEQAIKFMHNLAENSNDLYKILSLGKRKAAKILNERFKSRVNKIGKKFNDFAVY
TKDDLITKPVEASEKNAKLVAELAHSIAFGKTEVARIIGMGKRKASKILDEKFKDRL-SYGESFKDYGVY
SKDDLINNPKETSEHNAKLVAELAHVIAFAKTEIARIAGLGKRKASMILDEKFKDRL-KYGESFKDYAVY
SKEDLMNDPEGTSEHNAKLVAELAHSVAFAKTEIAKIVGLGKRKASRILDEKFKDRL-KYGESFKDYAVY
486
561
VPFGDWGEIAPNLYWTPGFFMPFVIQGRYLTYYKP-EFNEPEKLAELVVESIKLELPIENLGICRFHRKW
TPLGDDGEINPTMYWAIGNFIPLPIQGRYWTFYQFGVFLEPEELAQKIVSSALWEFWYDNVGWCRFHRGW
TPLGEDGEINPTMYWAIGNYIPLPIQGRYWTFYAFGTFLEPEELASKIVSSALWEFWYDNIGWCRFHRGW
TPLGEDGEINPTMYWAIGNYIPLPIQGRYWTFYAFGTFLEPEELAEKIVSSALWEFWYDNVGWCRFHRKW
556
631
LKPVLKELVKELLGIEDIVEDSIN-LYREICEYNKKIGYPAKIE-SERVKDLIIAMAKEFGNEEWTKKFE
MKKVLKALFMEAYGVSIDMEEHAKKQIRKLIDYLKKAGYEPVFWDSMRVIDLVAKGSEEFGNENWAKKFK
VKQTLRALFMEAYGVNVDMEEHARKQIRKLIDYAKRAGYIPVFWDSMRVIDLVAKGSEEFGNENWAKKFK
LKPTLKTLFMEAYGENVDMEEHAKKQIRRLIDYAKKAGYVPVFWDSMRVIDLVSKGSEEFGNEKWSEKFR
631
659
NKEN--VDEYVKRVLNKYSELLGIDWRIS
EDKIGTAKEYLKRVLDAYSQLIGTEWTLEDKIRAAKEYLKRVLEAYSKLMGVDWTIKDKIGTAKEYLKRVLEAYSLLMGTDWRI-
Figure 36 : Alignement de séquences entre la GAPOR de M. jannaschii (G Mj), et les GAPOR de P. furiosus (G
Pf), P. abyssi (G Pa) et P. horikoshi (G Ph). (algorithme d’alignement multiples et matrice Blosum62). Les
résidus présumés comme impliqués dans la constitution du centre [4Fe-4S] sont encadrés en bleu. Les résidus
directement impliqués dans le site actif à proximité du W sont encadrés et fléchés en fuchsia. Les résidus en
interaction avec la bis-ptérine sont encadrés en vert.
140
Chapitre VI
L’alignement (figure 36) révèle la présence de « gaps » dans la séquence de la GAPOR
de M. jannaschii dans des zones fortement similaires chez les GAPOR des Pyroccocalaes.
Trois de ces gaps font plus de 3 acides aminés (6, 12, 4 et 2x3) et sont situés dans des régions
éloignées du centre actif et des motifs de liaison aux cofacteurs. La zone présentant des acides
aminés en interaction avec les cofacteurs ptérine et [4Fe-4S] est très conservée ce qui laisse
présager de l’importance capitale du bon positionnement de ces cofacteurs pour la
fonctionnalité de l’enzyme.
La prédiction des structures secondaires de la GAPOR de M. jannaschii a été effectuée par un
consensus d’algorithmes de prédiction et de banques de données de séquences (jeux d’outils
www.infobiogen.fr). Un nouvel alignement a ensuite été réalisé avec la séquence des seules
deux AOR dont la structure est connue. L’alignement (figure 37) démontre la présence de
trois zones (notées I, II et III) dans la séquence d’homologie variable :
-
La première partie est comprise entre les acides aminés n°1 et 220 de la séquence de la
GAPOR. Elle présente une homologie des structures secondaires très élevée avec une
majorité de feuillets β et un taux d’homologie de séquences de près de 37%. L’excellente
conservation des motifs IIaires en feuillets β permet une superposition tridimensionnelle quasi
exacte des structures. Ce domaine est très compact et constitue un socle hydrophobe sur
lequel vient s’asseoir la W-ptérine.
-
La seconde est comprise entre les acides aminés n°221 et 440 avec un alignement des
structures secondaires moins fidèle mais avec des résidus très conservés impliqués dans le site
actif, la liaison avec les cofacteurs et la zone d’interaction avec la ferrédoxine. Cette partie de
la protéine conserve une identité structurale forte au niveau de ses centres réactionnels, mais
diffère au niveau de régions fonctionnellement neutres. Le taux d’homologie global de cette
seconde partie de séquence descend à 30%.
-
La troisième et dernière est formée par les acides aminés n°441 à 622 et ne présente
qu’une faible homologie de séquence de 24%. La présence de nombreux gaps dans
l’alignement montre la grande variabilité de cette partie de la GAPOR par rapport à
l’ensemble des AOR. Ce domaine se présente comme une rupture d’homologie nette de la
chaîne bien qu’elle conserve une certaine identité avec la FOR et l’AOR au niveau des 3 sites
de liaisons avec le centre Fe-S et la W-ptérine. D’après la littérature AOR, le substrat
pénètrerait dans la protéine au niveau de ce domaine. Cette partie de la chaîne protéique serait
141
Chapitre VI
également impliquée dans le cheminement du substrat jusqu’au site actif. D’après la structure
établie de la FOR (Hu and Rees, 1999), la chaîne formerait à cet endroit un filtre sélectif
permettant au substrat de cheminer jusqu’au site actif.
Compte tenu du fait que ces protéines homologues catalysent spécifiquement des substrats
différents, il est logique de constater que c’est au niveau de ce domaine que l’on observe la
plus grande variabilité de séquences.
GAPOR : 1
FOR
: 1
AOR
:
---------------------MKNALINATTKKFEIIEKTVLPITWGLYWHNKFETWKYDAYDE
MNVKMVDSMYGWWGRILRVNLTTGEVKVQEYPEEVAKKFIGGRGLAAWILWNEARGVEPLSP-MYGNWGRFIRVNLSTGDIKVEEYDEELAKKWLGSRGLAIYLLLKEMDPTVDPLSP-
43
62
GAPOR: 44
FOR : 63
AOR :
KNVFCFGSGV---LPVIGGHRLIFSFRSPLWDGFYFSSMGG-AGYQFKSTGLNNVAIIGR
ENKLIFAAGPFNGLPTPSGGKLVVAAKSPLTGGYGDGNLGTMASVHLRRAGYDALVVEGK
ENKLIIAAGPLTGTSAPTGGRYNVVTKSPLTGFITMANSGGYFGAELKFAGYDAIVVEGK
99
122
GAPOR: 100 CENPSILVIENDGQLRIDFIEVKEEL—KTVYEVSKYILELYKDKNLRSVVVGEAAKRTN
FOR : 123 AKKPVYIYIEDD-NVSILS---AEGLWGKTTFETERELKEIH-GKNVGVLTIGPAGENLAOR :
AEKPVYIYIK-DEHIEIRDA--SHIWGKKVSETEATIRKEVGSEK-VKIASIGPAGENL-
157
176
GAPOR: 158 MGGLFSQTVRNGKFVEGSEDWAARGGGGSVLYRAHNIMGIVFFGDEKEDKEEKEKAKKII
FOR : 177 ---VKYAVVISQEGRAAG-----RPGMGAVMGS-KKLKAVVIRGTKEIPVADKEELKKLS
AOR :
---VKFAAIMNDGHRAAG-----RGGVGAVMGS-KNLKAIAVEGSKTVPIADKQKFMLVV
217
227
GAPOR: 218 ESYYKKPMSKVVLEHTKKYRYDEETKTGGTFGNNWLLY-KEKVPIFNWRMPYIDKEDRK
FOR : 228 QEAYNEILN---------SPGYPFWKRQGTMAAVEWCNTNYALPTRNFSDGYFEF---AOR :
REKVNKLRN--------DPVAGGGLPKYGTAVLVNIINENGLYPVKNFQTGVYPY----
277
273
GAPOR: 278 KILEKILKFYLEIFNKETIEPKRWANCGEPCPVLCKK------YRNKNKVDYEPYASNGTL
FOR : 274 --ARSIDGYTMEGM----KVQQR--GCP-YCNMPCGNVVLDAEGQESEL-DYENVALLGSN
AOR :
AYEQSGEAMAAKY-------LVRNKPCY-ACPIGCGRVNRLPTVGETEGPEYESVWALGAN
336
330
GAPOR: 337 LGIFDLYEADRVVKTADALGFDAIEIGNLTAWVFELLDVGLLKEEELNIKKPIFDYKKITN
FOR : 331 LGIGKLNEVSVLNRIADEMGMDTISLGVSIAHVMEAVERGILKE----------------AOR :
LGINDLASIIEANHMCDELGLDTISTGGTLATAMELYEKGHIKDEEL--------------
401
395
I
II
GAPOR: 402 DDDEEIREISKHNAEQAIKFMHNLAENSNDLYKILSLG-KRKAAKILNERFKSRVNKIGKKFNDFA 472
FOR : 396 -----GPTF--GDFKGAKQLALDIAYRKGELGNLAAEGVKAMAEKLGTHDFAMHV-K-GLEVSGYN 466
AOR :
---GDAPPFRWGNTEVLHYYIEKIAKREGFGDK-LAEGSYRLAESYGHPELSMTV-K-KLELPAYD
GAPOR: 473 VYV-P----------FGDWGEIAPNLYWTPGFFMPFVIQGRYL--TYYK-PEFNEPEKLAEL
FOR : 467 CYIYPAMALAYGTSAIGAHHKEAWVIAWEIGTA-PIEGEKAEKVEYK----ISYDPIK-AQK
AOR :
PRGAEGHGLGYATNNRGGCHIKNYMISPEILGY-PY KMDPHDV--------SDDKIKM--L
513
517
GAPOR: 514 VVESIKLELPI-ENLGICRFHRKWLKPVLKE-----LVKELLGI----EDIVE---DSINLYR
FOR : 518 VVELQRLRGGLFEMLTACRL--PWVEVGLSLDYYPKLLKAITGVTYTWDDLYKAADRVYSLIR
AOR :
ILFQDLTALI--DSAGLCL----FTTFGLGADDYRDLLNAALGWDFTTEDYLKIGERIWNAER
559
565
GAPOR: 560 EICEYNKKIG-------YPAK----------------IESERVKDLIIAMAKEFG-NE-EWTK
FOR : 566 AYWVREFNGKWDRKMD-YPPKRWFTEGLKSGPHKGEHLDEKKYDELLSEYYRIRGWDERGIPK
AOR :
L-FNLKAG--LDPARDDTLPKRFLEEPMPEGPNKGHTVR---LKEMLPRYYKLRGWTEDGKIP
592
602
GAPOR: 593 KFENKENVD-EYVKRVLNKYSELLGIDWRIS
FOR : 603 KETLKELDLDFVIPELEKVTNLE-------AOR :
KEKLEELGIAEFY------------------
622
627
605
Figure 37 : Alignement de séquences entre la GAPOR de M. jannaschii et l’AOR et la FOR de P. furiosus.
142
III
Chapitre VI
Afin de visualiser le positionnement de ces trois zones sur la structure tridimensionnelle
de la GAPOR, nous avons construit un modèle par « homology modeling » à partir d’un
alignement optimisé avec la FOR et l’AOR de P. furiosus. Le modèle obtenu (figure 38) nous
permet de constater que la zone n°III de faible homologie ne contient aucun des cofacteurs
bien que certains résidus soient impliqués dans l’interaction avec le centre [4Fe-4S] et la
ptérine au niveau de l’interface inter-domaines (figure 38 C.).
III
A
II
B
C
I
III
W
Tungstoptérine
Centre [4Fe-4S]
Figure 38 : Modèle de la GAPOR de M. jannaschii obtenu par « Homology modeling » à partir des structures de
l’AOR et de la FOR de P. furiosus sur une station Silicon Graphics et à l’aide du logiciel Dyscovery d’Accelrys.
(4400 itérations de minimisation de l’énergie de Gibbs). A. Représentation des structures secondaires prédites.
B. Représentation des trois domaines. C. Visualisation du domaine n°III et du positionnement des cofacteurs.
143
Chapitre VI
Au niveau de l’AOR et de la FOR de P.furiosus le domaine n°III couvre la zone de
communication entre le site actif et la surface de la protéine. Ce domaine rassemble les
résidus qui forment un canal d’entrée et de sortie des composés biochimiques et sont donc
directement impliqués dans la spécificité de substrat. La faible homologie de la séquence de
ce domaine avec celles des AOR est une caractéristique que l’on retrouve également pour les
autres GAPOR. Cette propriété n’est donc pas spécifique à la GAPOR de M. jannaschii mais
constitue une caractéristique conservée pour toutes les GAPOR.
En dépit de la faible précision du modèle, il est cependant possible de formuler l’hypothèse
que ce domaine n°III pourrait être impliqué en partie dans la spécificité des GAPOR pour le
glycéraldéhyde 3-phosphate. C’est en effet la seule différence majeure que l’on observe sur
les alignements entre le groupe des GAPOR et le reste des AOR. Les deux autres domaines
restant très similaires dans leur structure et probablement dans leur rôle fonctionnel (site actif,
liaison des co-facteurs, interaction avec la ferrédoxine).
L’analyse des résidus de surface du domaine n°III du modèle de la GAPOR de M.
jannaschii montre la présence d’une dépression à la surface de la protéine suivie d’un canal
(figures 39 A. et B.) qui relie la surface de la protéine au site actif de l’enzyme. Cette cavité
est essentiellement occupée par le cofacteur W-ptérine au niveau du site actif (tyrosine 352 et
acide glutamique 353) et le centre [4Fe-4S] (figure 39 C. et D.).
A
B
144
Chapitre VI
Tungstoptérine
C
D
Centre [4Fe-4S]
Figure 39 : Modélisation de la GAPOR de M. jannaschii : A. modélisation de la surface de la protéine au niveau
du domaine n°III et de l’entrée du canal de communication au site actif (flèche jaune). B. modélisation des
cavités internes à la protéine. C. et D. Zoom sur la cavité interne du site actif de la GAPOR de M. jannaschii et
sur l’espace occupé par les cofacteurs biochimiques : W-ptérine et centre [4Fe-4S].
Comme on peut le constater sur le modèle de la GAPOR de M. jannaschii, le cofacteur
W-ptérine et l’atome de W sont étroitement impliqués au niveau du site actif de l’enzyme et
participent, probablement comme pour toutes les AOR (voir chapitre IV section 3.2),
directement à la catalyse du substrat. La forte homologie des résidus qui forment cette cavité
entre la GAPOR et les FOR/AOR de P. furiosus confirme la similarité du mécanisme
catalytique caractéristique de la famille des AOR (voir chapitre IV section 3.1 et 3.2).
La précision du modèle n’est cependant pas suffisante pour positionner avec un degré de
fiabilité suffisant les chaînes latérales des résidus du site actif et du canal interne. Il est donc
indispensable d’avoir accès à une structure de plus haut degré d’homologie (autres AOR,
GAPOR...) ou d’obtenir la structure d’une GAPOR par cristallisation et diffraction des rayons
X afin de pousser plus avant l’étude structure/fonctions de la GAPOR.
145
Chapitre VI
3. Expression / Purification de la GAPOR de M. jannaschii
La réalisation d’une étude biochimique de l’enzyme passe par l’obtention d’une quantité
suffisante de protéine afin de réaliser une caractérisation complète. Notre projet vise à étudier
et à optimiser la fonctionnalité de cette protéine chez C. acetobutylium, nous avons donc
envisagé de mettre au point un protocole d’expression/purification de la GAPOR de
M. jannaschii chez ce micro-organisme, et chez E. coli (intermédiaire de construction) Pour
des besoins complémentaires de l’étude l’expression dans la bactérie E. coli a également été
considérée.
3.1 Clonage du gène Mj gor
Le gène gor codant la GAPOR a été cloné à partir d’ADN génomique de M. jannaschii
(Bult et al., 1996) dans un vecteur d’expression navette pPHCtag sous le contrôle du
promoteur hydrogénase et sous la forme d’une fusion traductionnelle avec un StreptagII (voir
plan de clonage figure 40). Le promoteur hydrogénase est le promoteur de C. acetobutylicum
découvert à ce jour dont la force d’expression est la plus élevée. Ce promoteur possède
cependant une régulation physiologique qu’il est possible de contrôler de manière optimale
par la maîtrise des conditions de culture (Girbal et al., 2003). Les éléments que nous avons
insérés dans le vecteur pPHMjGAPORCtag (gène gor, étiquette Streptag II et promoteur
hydrogénase) ont été analysés et vérifiés par séquençage.
Un autre vecteur : le PTRC99AMjGAPORCtag, optimisé pour l’expression chez E. coli,
a été construit. Le gène gor est placé sous le contrôle du promoteur fort et inductible trp
dérivé de l’opéron tryptophane. La séquence de la Streptag II a également été rajoutée en Cterminal du gène codant pour la GAPOR. Ce vecteur a été validé par séquençage et il permet
de surproduire la GAPOR de manière efficace chez E. coli.
146
Chapitre VI
Amp
ADN génomique de M. jannaschii
pT GAPOR-C-Tag
PCR
ADNg
M. Jannashii
BamH1
Xma I
BamH1 + RBS
gor
XmaI
Xma I
BamH1
Amp
Fragment PCR
de 1900 pb
Amp
PCR
gor
pHHydA-C-Tag
Pr
Hydro
Hydrogénase
Cla I
600 pb
B
gor
Figure 40 : Plan de clonage de la GAPOR de M. jannaschii dans le vecteur d’expression navette pPHCtag
147
Chapitre VI
3.2 Optimisation de l’expression hétérologue de la
GAPOR
L’expression hétérologue de la GAPOR de M. jannaschii a été mise au point chez
C .acetobutylicum et chez E. coli afin de maximiser la qualité et la quantité de protéine
produite.
3.2.1 Chez E. coli
Plusieurs critères influencent de manière prépondérante l’expression hétérologue de la
GAPOR chez E. coli à partir du plasmide PTRC99gaporMjCtag :
L’analyse de la traduction du gène gor a permis de détecter la présence de 22 codons rares (5
AGG et 15 AGA codant pour des arginines et 2 CTA codant pour des leucines dont la
fréquence est < 5%) suivant le code de gestion des codons de la bactérie E. coli. L’impact de
ces codons rares sur l’expression de la protéine a pu être diminué par le recours à un système
d’expression cellulaire de type BL21 codonplus (Stratagen) possédant un plasmide
supplémentaire d’expression des ARNt minoritaires. Il a également été possible d’extraire le
plasmide « codon plus » et de conserver sa fonctionnalité en le transformant dans les autres
types cellulaires qu’il nous a été nécessaire d’utiliser au cours de cette étude. La présence
d’un antibiotique supplémentaire dans le milieu de culture (chloramphénicol à 50 µg/ml) a
augmenté la durée de la phase de latence mais n’a pas modifié la conduite globale de la
culture et le rendement de production en protéine final.
Les AOR étant sensibles à l’oxygène (Mukund & Adams, 1995), l’expression de la
GAPOR dans les conditions décrites dans le Matériel et Méthodes (Chapitre V section 4.2)
nécessite d’optimiser la croissance dans les conditions anaérobies afin de préserver la protéine
d’une inactivation par l’oxygène. La bactérie E. coli croît en condition anaérobie en milieu
MAC supplémenté en ampicilline (100µg/ml) avec un taux de croissance proche de ceux
obtenus en aérobiose.
Afin d’optimiser l’insertion du tungstène dans la protéine, il est nécessaire de déplacer
le rapport Mo/W en faveur du W. Nous avons donc réalisé nos cultures avec une
concentration en tungstate de sodium de 10 µM afin de conserver un rapport entre les deux
éléments 1000 fois plus favorable pour le W que pour le Mo. Cette concentration ne semble
148
Chapitre VI
pas affecter de manière significative la croissance de la bactérie en milieu riche. L’utilisation
d’un milieu minéral minimum ne nous a pas permis d’obtenir une expression satisfaisante en
conditions anaérobies et en présence d’un excès de tungstène.
3.2.2 Chez C. acetobutylicum
Les meilleures conditions d’expression de la GAPOR dans la bactérie C.
acetobutylicum contenant le plasmide pPHGAPORMJCtag ont été obtenues dans un premier
temps en milieu riche de type CGM supplémenté par 10 µM de tungstate de sodium et 200
µg/ml d’érythromycine. Cette concentration de tungstène ne semble pas affecter la croissance
du micro-organisme de manière significative. L’utilisation d’un milieu minimum synthétique
a été considéré et réalisé mais ne nous a pas permis d’obtenir des taux d’expression plus
élevés.
Les codons AGG, AGA et CTA dans la séquence de la GAPOR ne sont plus reconnus comme
des codons rares chez cette bactérie, il n’est donc plus nécessaire de recourir à des systèmes
de type « codon plus » lors de la phase d’expression.
C. acetobutylicum nécessite des conditions d’anaérobie strictes afin de se développer. La
culture est donc réalisée comme précisé dans le Matériel et Méthodes (Chapitre V section 4.1)
afin d’éliminer toute présence d’oxygène pendant la culture et la récolte des cellules.
3.3 Optimisation et mise au point des conditions de
purification de la GAPOR
3.3.1
Mise au point de la purification par affinité
Dans le but de valider le système d’expression de la GAPOR avec l’étiquette StrepTag
en C-terminal, E. coli DH5α (pPHMjGAPORCtag) a été cultivée en aérobiose dans un milieu
LB standard et la protéine recombinante a été purifiée directement après cassage des cellules
sur colonne d’affinité StrepTactin (chapitre V section 8.3).
L’élution de la protéine retenue sur la colonne Sépharose StrepTactin par une solution de
desthiobiotine à 2,5 mM a été réalisée sur plusieurs fractions de volume constant (figure 41).
Les diverses fractions d’élutions récupérées sont analysées en gel dénaturant SDS-PAGE.
Bien que la quantité de protéine produite soit faible (vecteur navette non optimisé pour
l’expression chez E. coli) on observe une protéine purifiée de taille proche de 70 kDa sur le
149
Chapitre VI
gel de coomassie. Cette taille correspond approximativement à la taille théorique attendue de
la GAPOR qui est de 72 kDa.
A
B
M
C
S
Fnr
E1
E2
E3
M
E4
97
66
112
97
45
66
30
30
C
S
Fnr
E1
E2
E3
E4
26
21
17
16
Figure 41 : Gel SDS-PAGE de contrôle de l’expression et de la purification de la GAPOR par le système
StrepTag II.,
A : Coloration au bleu de coomassie piste M : marqueur de taille Precision plus protein Biorad low range; piste
C : culot de cassage ; piste S : surnageant de cassage ; piste Fnr : fraction non retenue du passage sur la colonne
de StrepTactin ; pistes E1 – E4 : fractions d’élution. B : Western Blot : l’organisation est identique à celle du gel
A, M : marqueur de taille pré-coloré Biorad low-range.
La stratégie d’expression/purification d’une GAPOR de fusion étiquetée en C-terminal
ayant été validée (rendement de purification élevé, stabilité de la protéine satisfaisante), les
différents vecteurs construits par la suite pour l’expression des GAPOR ont également
incorporé un streptag en position C-terminal.
La fonctionnalité du vecteur pPHMJGAPORCTag ayant également été validée, sa
transformation dans la souche de C. acetobutylicum ATCC 824 a été réalisée.
3.3.2 Purification de la Mj GAPOR produite chez C. acetobutylicum et
amélioration de la méthode
La purification de la GAPOR de M. jannaschii produite chez C. acetobutylicum est
basée sur une purification par chromatographie d’affinité selon le protocole décrit dans le
chapitre précédent et dans le Matériel et Méthodes (chapitre V section 8.3). Il est cependant
apparu que la concentration élevée en protéines de l’extrait du surnageant de cassage chez
C. acetobutylicum (pPHMJGAPORCtag) diminuait les performances de fixation de la résine.
En effet, une grande partie de la GAPOR était retrouvée dans la fraction non retenue (Fnr)
150
Chapitre VI
(figure 42 B). Par ailleurs des bandes de dégradation de la protéine étaient aussi présentes.
Afin de pré-purifier le surnageant de cassage avant passage sur la colonne d’affinité nous
avons mis au point une étape de chromatographie par échange de cations sur SP-sépharose.
Cette étape de pré-purification a permis de diminuer l’exposition de la protéine d’intérêt aux
protéases contenues dans le surnageant de cassage en éliminant une grande partie des
composés cytosoliques avant incubation avec l’avidine et chargement sur la colonne
d’affinité.
A M E
C
S
Fnr E2 E3
B M E
E4 E5
100
75
112
97
50
66
37
S
Fnr E1 E2
E3 E4
30
27
20
26
15
17
C M
C
C
S
Fnr
E2
E3
D M
E4
100
C
S
Fnr
E2
E3
E4
112
97
75
66
50
30
37
26
27
20
17
15
Figure 42 : Contrôle de l’expression et de la purification de la GAPOR via le vecteur pPHMjGAPORCtag chez
C. acetobutylicum. Gels SDS-PAGE 12 %.
Gel A : Coloration au bleu de coomassie, piste M : marqueur de taille Precision plus protein Biorad™ low
range ; piste E : extrait cellulaire total ; piste C : culot de cassage ; piste S : surnageant de cassage ; piste Fnr :
fraction non retenue du passage sur la colonne de StrepTactin ; pistes E1 – E4 : fractions d’élution. B : Western
Blot : l’organisation est identique à celle du gel A, M : marqueur de taille pré-coloré Biorad™ precision plus
protein standard.
Gels C et D : Amélioration du protocole de purification de la MJ GAPOR C : coloration au bleu de coomassie
D : Western Blot ; marqueur de taille pré-coloré Biorad™ low range.
151
Chapitre VI
Nous avons pu observer immédiatement un bénéfice sur le degré de pureté général de la
protéine avec une diminution partielle des bandes de dégradation visibles en western-blot
(figure 42 D). De plus, cette étape a permis d’améliorer le rendement de purification en
diminuant la part de protéine d’intérêt perdue dans la fraction non retenue. Son introduction
nous a également permis de travailler sur des volumes de culture plus importants.
L’utilisation d’un tampon Tris-HCl pH 8,0, DTT 2 mM ne contenant pas de NaCl a
également permis de limiter la perte de protéines durant ces étapes. Les diverses améliorations
dans le protocole de purification ont permis d’obtenir environ 550 µg de GAPOR purifiée par
litre de culture (DO = 2,5) chez C. acetobutylicum (pPHMJGAPORCTag) et une
concentration finale maximale dans les fractions d’élution de 330 µg/ml (Dosage de Bradford
calibré au micro-biuret, Matériel et Méthodes chapitre V section 10.2.1). Le degré de pureté
obtenu d’environ 98 % (estimé à l’aide du logiciel de quantification Image J, voir Matériel et
Méthodes section 10.3.2) à l’issue de cette mise au point nous permet d’envisager la
caractérisation biochimique de la GAPOR exprimée chez C. acetobutylicum.
3.3.3 Purification de la GAPOR produite chez E. coli en anaérobie
L’expression de la GAPOR chez E. coli en anaérobiose a été réalisée à l’aide du vecteur
pTRC99AMJGAPORCtag tout d’abord dans une souche de type DH5α (Codon-plus). Les
premiers essais d’expression ont révélé un très faible taux d’expression de la protéine
recombinante bien en deçà des taux généralement rencontrés avec le vecteur pTRC99A. La
découverte des 22 codons rares et le recours au vecteur d’appoint « Codon-plus »
(Stratagène™, voir section 3.2.1 de ce chapitre) a permis de revenir à des taux d’expression
plus élevés et conformes à ceux attendus avec ce type de vecteur d’expression.
152
Chapitre VI
A M
C
S
Fnr lav1 E2
E3
B M
E4
100
90
112
97
50
66
33
30
21
26
C
S
Fnr Lav1 E2
E3
E4
17
16
chez E. col DH5α (Codon-plus). Gels SDS-PAGE 12 %,
A : Coloration au bleu de coomassie, piste M : marqueur de taille Precision plus protein Biorad low range ; piste
E : extrait cellulaire total ; piste C : culot de cassage ; piste S : surnageant de cassage ; piste Fnr : fraction non
retenue du passage sur la colonne de StrepTactin ; pistes E1 – E4 : fractions d’élution. B : Western Blot :
l’organisation est identique au gel A, M : marqueur de taille pré-coloré Biorad low range.
La protéine de fusion produite présente une taille d’environ 70 kDa visible en coomassie et en
western blot (figure 43). Cependant, la production de la MJ GAPOR présente de nombreuses
bandes de dégradation dont 3 majeures (45 kDa, 21 et 23 kDa). L’utilisation d’anti-protéases
(Kit Roche™) dans les tampons de purification ainsi que la diminution des temps
d’incubation après cassage cellulaire n’a pas permis d’améliorer significativement la pureté
finale de la MJ GAPOR produite chez E. coli DH5α. Le passage dans la souche BL21
(Codon-plus, Stratagène™) au génome est délété de nombreux gènes codant pour des
protéases naturelles, n’a pas permis d’améliorer de manière significative ce résultat.
Une séparation par chromatographie sur gel d’exclusion (sur gels Superose 12, Superdex et
Séphacryl ; Pharmacia™) a également été tentée mais il n’a jamais été possible d’obtenir une
séparation optimale de la GAPOR et des produits de dégradation contenus dans la fraction
d’élution.
En tenant compte de la concentration réelle en GAPOR, qui a été évaluée à 75 % par
quantification de l’intensité des bandes sur gel, la valeur réelle de la concentration en Mj
GAPOR purifiée obtenue dans les fractions d’élution est de 975 µg/ml soit une valeur trois
fois plus élevée que celle obtenue chez C. acetobutylicum.
153
Chapitre VI
4. Caractérisation biochimique de la GAPOR
La caractérisation biochimique de la GAPOR de M jannaschii est un préalable essentiel
avant d’envisager son intégration dans le métabolisme de C. acetobutylicum. La
caractérisation de la réaction catalysée par cette enzyme a donc été réalisée in vitro selon les
conditions décrites par Munkund (Mukund & Adams, 1995) pour la caractérisation de la
GAPOR de P. furiosus.
4.1 Activité sur extraits bruts
La détection d’une activité GAPOR sur les extraits bruts est délicate en particulier chez
C. acetobutylicum car ces extraits contiennent des hydrogénases capables de réduire
directement le benzyl viologène dans la cuve du spectrophotomètre avant même l’ajout de
GAP (voir protocole du dosage de l’activité GAPOR, Chapitre Matériel et Méthodes section
10.2.4.2). Les hydrogénases d’E. coli et surtout celles de C. acetobutylicum présentent des
activités très élevées qui réduisent immédiatement le benzyl viologène et nous empêchent
d’observer une différence d’activité GAPOR liée à la présence de GAP.
4.2 Activité de l’enzyme purifiée
Les dosages d’activité ont été réalisés selon le protocole décrit dans le Matériel et
Méthodes (section 10.2.4.2) dans une boîte à gants, en anaérobiose stricte (mélange : 85%
d’azote, 10% d’hydrogène et 5% de CO2) afin de ne pas altérer l’activité de l’enzyme. Les
tests sont réalisés dans un tampon Tris-HCl à 100 mM pH 7,5 à 50 °C, en présence de 0,5 mM
de GAP et de 25 mM de benzyl viologène et avec 50 µl d’une fraction d’élution de la GAPOR
pour un volume total de 1 ml. La longueur d’onde du spectrophotomètre est de 580 nm et la
réaction est déclenchée par injection du GAP dans la cuve.
Dans le cas de la Mj GAPOR produite chez C. acetobutylicum les tests d’activité
effectués sur les fractions purifiées E2 et E3 ont révélé une activité enzymatique significative
de réduction du Bv d’environ 0,4 µmol de Bv réduit/min/mg de GAPOR à 50 °C (bruit de
fond inférieur à 0,02 µmol de Bv réduit/min/mg).
Cependant, il nous est très rapidement apparu que cette activité de réduction du Bv était
présente que se soit en présence ou en absence de GAP. L’enzyme produite chez
154
Chapitre VI
C. acetobutylicum semble capable de réduire le Bv sans adjonction de GAP et l’ajout de celuici ne modifie pas la vitesse de la réaction.
Il est intéressant de remarquer que nous avons constaté la même activité de réduction du
benzyl viologène GAP-indépendante pour la Mj GAPOR produite chez E. coli DH5α/Bl21
(Codon-plus, pTRC99AMjGAPORCtag). L’activité détectée dans ce cas est du même ordre
que celle déterminée chez C. acetobutylicum avec une activité spécifique plus faible d’environ
0,28 µmol de Bv réduit/min/mg de GAPOR à 50°C (bruit de fond de 3.10-3 µmol de Bv
réduit/min/mg).
Il est intéressant de noter que ces activités spécifiques sont reproductibles entre
différentes cultures et purifications, que l’enzyme soit produite chez E. coli ou chez C.
acetobutylicum.
Ce type d’activité de réduction du Bv non GAP dépendante n’a pas été reporté lors de l’étude
biochimique de la GAPOR de P. furiosus ni lors des caractérisations des diverses AOR dans
la littérature (Mukund & Adams, 1991; Mukund & Adams, 1993; Mukund & Adams, 1995;
Rauh et al., 2004). Les conditions du dosage d’activité ont donc été modifiées afin de tenter
de retrouver une activité GAP dépendante.
Effet de la température :
Plusieurs températures de dosage ont été testées afin de se rapprocher de la température
optimale originelle de l’enzyme (60°C et 70°C). Bien que relativement faible et peu
significative, on observe à 70°C une légère augmentation de l’activité (de l’ordre de 3 - 4 %).
Afin de pousser plus loin notre étude sur l’effet de la température, nous avons pré-incubé
l’enzyme (1 min, 5 min et 10 min) avant le lancement de la réaction par l’ajout de Bv.
M. jannaschii étant un microorganisme se développant à 85 °C, la GAPOR de ce dernier doit
rester fonctionnelle à cette température pendant une durée significative. Les dosages d’activité
sur enzymes pré-incubées ont révélé un maintien de l’activité précédente pour une incubation
d’ 1 min tandis que pour des durées de l’ordre de 10 min et pour une température de 70°C, on
observe une nette baisse d’activité d’environ 2 à 3 fois par rapport à la valeur initiale.
L’impossibilité technique de monter à une température supérieure dans des conditions
155
Chapitre VI
satisfaisantes ne nous a pas permis de tester l’enzyme à la température originelle de
M. jannaschii.
Une température de 70°C ne semble donc affecter négativement l’enzyme que sur des
durées de plusieurs minutes tandis qu’une exposition courte maintient, ou améliore très
légèrement l’activité de l’enzyme.
Peu d’informations ont été obtenues sur l’origine de l’activité atypique de la Mj GAPOR à
partir de l’étude de l’effet de la température.
Analyse de l’activité de réduction des ferrédoxines
Nous avons testé l’activité de l’enzyme exprimée chez C. acetobutylicum et E. coli avec
la ferrédoxine de M. jannaschii reconstituée (Mjwt) (cf chapitre VII section 3) et la ferrédoxine
commerciale de C. pasteurianum et nous n’avons constaté aucune activité d’oxydoréduction
du GAP. Les tests ont montré une très faible activité non GAP-dépendante de l’enzyme mais
les valeurs sont restées trop faibles malgré nos efforts pour constituer un résultat significatif.
Effet du substrat :
Nous avons testé différentes concentrations de GAP (vérifiées par dosage enzymatique
décrit dans le Matériel et Méthodes section 10.1) de 0,1 mM à 5 mM (le Km de la GAPOR de
P. furiosus étant de 0,43 mM (Mukund & Adams, 1995)) avec la Mj GAPOR exprimée chez
E. coli et C. acetobutylicum sans jamais observer aucun effet sur l’activité de réduction du Bv
de l’enzyme.
Plusieurs températures ont été testées lors de ces analyses afin de limiter la dégradation du
GAP (demi-vie de 2 min à 70 °C). Les vitesses ont été mesurées dès les premières secondes
de la réaction mais aucune différence liée à la présence de GAP n’a pu être détectée.
Plusieurs substrats de la même famille ont également été testés afin de vérifier si nous étions
en présence d’une AOR classique et non pas d’une GAPOR : acétaldéhyde, formaldéhyde,
butyraldéhyde, glycéraldéhyde et glycérol 3-phosphate ainsi que le produit de la réaction : le
3-phosphoglycérate. Aucune différence d’activité n’a pu être observée suite à la présence de
l’un de ces substrats ou produit.
156
Chapitre VI
Effet du degré de réduction du milieu :
Dans le cas d’enzymes sensibles à l’oxygène, telles que la GAPOR, qui nécessitent un
environnement réducteur afin de catalyser efficacement leur réaction biochimique, il est
parfois nécessaire d’atteindre un degré de réduction suffisant avant d’observer une
quelconque activité enzymatique. Le DTT (testé de 0,5 à 5 mM) que nous utilisions dans le
dosage est un agent de réduction de force moyenne ayant l’inconvénient d’avoir une cinétique
de réduction lente. Nous avons donc envisagé d’utiliser des réducteurs de force croissante afin
de vérifier cette hypothèse. L’hydrosulfite de sodium («dithionite»), malgré un effet inhibiteur
sur la GAPOR de P. furiosus (Mukund & Adams, 1995) a été testée à des concentrations
finales de 0,5 à 5 mM. Nous n’avons pas relevé d’activité GAP dépendante suite à ces
modifications tout en conservant une activité de réduction du Bv. L’utilisation d’un des
réducteurs chimiques les plus efficaces tel que le citrate de titanium n’a pas permis d’observer
de changement significatif.
Effets d’activateurs de la GAPOR :
Afin d’augmenter l’activité dépendante du GAP nous avons eu recours à des sels
connus pour augmenter l’activité de la GAPOR (phosphate de potassium et sodium arsenate)
(Mukund & Adams, 1995). Une large gamme de concentrations a été testée (50 à 500 mM)
mais elle n’a pas permis de déceler un effet du GAP sur l’activité de réduction du Bv
observée.
Contrôles de purification :
Plusieurs contrôles de purification ont été effectués afin de vérifier que la présence de
cette activité n’était pas due à la mise en œuvre même du protocole de purification. Nous
avons réalisé des cultures témoins d’E. coli BL21 (pTRC99A) et de C. acetobutylicum ATCC
824 (pPHcTag) contenant chacune un vecteur dépourvu du gène de la GAPOR, dans les
mêmes conditions d’expression que celles décrites dans le Matériel et Méthodes section 4. Le
protocole de purification a été suivi rigoureusement et les fractions d’élution ont été testées
dans les mêmes conditions que précédemment. Les quatre fractions d’élution recueillies pour
E. coli et C. acetobutylicum ne contenaient pas de protéine détectable (dosage de protéines,
absorbance à 280 nm en spectrophotométrie UV/visible) et ces échantillons n’ont révélé
aucune activité de réduction du Bv.
157
Chapitre VI
Nous avons également optimisé le protocole de purification en augmentant l’astringence
des étapes de lavage de la pré-purification en colonne échangeuse d’ions et de la purification
en chromatographie d’affinité. Le rendement de purification de la GAPOR a été diminué par
un facteur 2 environ mais l’activité de réduction du Bv est restée présente avec une activité
spécifique globalement inchangée.
Nous avons par la suite poussé nos investigations plus loin afin de déterminer si cette
activité atypique ne serait pas due à des contaminants co-élués avec la Mj GAPOR pendant la
purification. Ces travaux sont développés dans la section 5 page suivante.
4.3 Discussion
L’étude biochimique de la Mj GAPOR purifiée et produite chez C. acetobutylicum
ATCC 824 ainsi que chez E. coli BL21/DH5α n’a pas permis de mettre en évidence l’activité
attendue d’oxydoréduction du glycéraldéhyde 3-phosphate. Une activité atypique de réduction
du benzyl viologène a cependant été découverte dès l’ajout de l’enzyme purifiée. Cette
activité se rapproche de celle d’une hydrogénase (voir Chapitre VII) qui est capable de
consommer de l’hydrogène dissous en solution pour réduire le Bv ou le méthyl viologène.
Après plusieurs vérifications de la mise en œuvre des tests biochimiques, il nous a été
impossible d’obtenir une réduction du Bv GAP-dépendante par la Mj GAPOR. Malgré les
différents contrôles effectués, il reste difficile d’expliquer la présence d’une telle activité chez
la Mj GAPOR. Il n’est pas exclu à ce stade que cette activité ne soit pas causée par la GAPOR
elle-même mais par une autre protéine de type hydrogénase co-purifiée.
Il est en effet possible d’observer ce type d’activité compte-tenu du haut niveau d’activité
spécifique de ces enzymes et de la présence permanente d’hydrogène à l’intérieur de la boîte à
gants utilisée lors de ces différentes expériences.
Il semble nécessaire d’approfondir la compréhension de cette activité inexpliquée par la
réalisation de plusieurs contrôles supplémentaires relatifs au système d’expression et de
purification utilisé pour la GAPOR (cf section 5 page suivante).
158
Chapitre VI
L’étude de la GAPOR de P. furiosus (Mukund & Adams, 1995; van der Oost et al.,
1998) n’a jamais révélé la présence d’une activité non GAP-dépendante apparentée. La
présence de cette activité inattendue n’explique pas pour autant l’absence d’activité
glycéraldéhyde 3-phosphate oxydoréductase de cette enzyme.
Certains problèmes de maturation de la protéine liés à une expression en dehors de son hôte
naturel peuvent être à l’origine de ce résultat. Ce phénomène a été particulièrement observé
pour les Mo/W-enzymes qui nécessitent des cofacteurs complexes et très spécifiques pour
acquérir leur activité catalytique (Temple et al., 2000). Nous avons donc réalisé différents
travaux visant à comprendre et à remédier à l’absence d’activité d’oxydoréduction du
glycéraldéhyde 3-phosphate de la Mj GAPOR produite chez C. acetobutylicum et E. coli.
159
Chapitre VI
5. Problématique de l’expression hétérologue
La GAPOR étant un élément indispensable du projet d’ingénierie métabolique de C.
acetobutylicum pour la production d’hydrogène, il nous est nécessaire de comprendre et de
remédier à ce défaut d’activité de la GAPOR de M. jannaschii produite et purifiée dans nos
conditions. Plusieurs hypothèses ont donc été formulées et discutées, en s’appuyant sur des
faits similaires décrits dans la littérature, et ont été testées par différentes analyses
biochimiques et biophysiques.
Nous avons tout d’abord approfondi l’étude de l’activité atypique de réduction du Bv non
GAP-dépendante (« hydrogenase-like ») découverte dans l’éluat de purification de la
GAPOR.
En effet, il n’est pas possible à ce stade d’attribuer cette activité atypique
spécifiquement à la Mj GAPOR dans nos fractions de purification ou à une autre protéine coéluée. Plusieurs expériences de contrôle ont donc été menées afin d’apporter une réponse
claire à cette problématique.
5.1 Etude de l’activité inattendue « hydrogenase-like » de
la GAPOR de M. jannaschii
Plusieurs analyses ont été menées afin de déterminer à quelle protéine attribuer
l’activité de réduction du Bv non GAP-dépendante observée. Cette activité se maintient
malgré l’augmentation de la stringence de la purification et on observe sa présence
uniquement dans les fractions de purification contenant la GAPOR (produite aussi bien chez
E. coli que chez C. acetobutylicum). Cependant, ces résultats ne suffisent pas à démontrer que
cette activité est réellement intrinsèque à la Mj GAPOR.
5.1.1
Isolement de l’activité « hydrogenase-like »
Nous avons tenté de comparer sur deux gels natifs identiques, en anaérobiose stricte, la
position de la GAPOR et celle de l‘activité de réduction du Bv. Le test d’activité a été réalisé
directement sur le premier gel par incubation dans une solution contenant du Bv, tandis que le
second était coloré en coomassie afin de repérer l’ensemble des protéines présentes.
La révélation du gel au bleu de coomassie n’a laissé apparaître qu’une seule bande pour les
fractions d’élution de la GAPOR produite chez E. coli et chez C. acetobutylicum (figure 44).
160
Chapitre VI
A
Mn
E2E. coli
B
E2C. aceto
Mn
E2E. coli
E2C. aceto
250
135
75
55
27
Figure 44 : Gels natifs d’une fraction d’élution purifiée de la Mj GAPOR produite chez E. coli (BL21,
pTRC99AGAPORCtag) et chez C. acetobutylicum ATCC 824 (pPHMjGAPORCtag). A : révélation au bleu de
coomassie. B : révélation de l’activité de réduction du benzyl viologène, la bande est difficilement visible sur
une photo numérique elle est donc signalée par une flèche.
La révélation du second gel par incubation dans un bain de benzyl viologène puis par fixation
au rouge de tétrazolium a permis de visualiser très nettement que l’activité enzymatique était
exclusivement concentrée au niveau de l’unique bande de protéine pour l’échantillon de
GAPOR produite chez E. coli et chez C. acetobutylicum.
Cependant, compte-tenu du manque de séparation du gel, la présence d’autres protéines copurifiées, à hauteur de la GAPOR n’est pas exclue et ne pouvons donc pas conclure que
l’activité observée soit seulement associée à la GAPOR.
5.1.2 Expression de la GAPOR dans un mutant d’E. coli hypF - au
phénotype [hydrogénase –]
Bien que n’ayant jamais pu dissocier l’activité « hydrogenase-like » de la de la bande
correspondant à la Mj GAPOR, l’hypothèse de la co-purification d’une hydrogénase avec la
GAPOR reste envisageable. E. coli et C. acetobutylicum produisent naturellement des
hydrogénases (voir chapitre III section 5) qui seraient susceptibles de produire une activité
similaire à celle que nous détectons même à des concentrations très faibles (<1µM) et donc
non détectables sur gel SDS-PAGE ou par micro-séquençage.
Nous avons donc envisagé l’utilisation d’une souche d’expression d’E. coli au
phénotype [hydrogénase–] afin de nous affranchir de toute activité parasite.
161
Chapitre VI
Dans un premier temps, nous avons travaillé avec la souche DHP-F (Maier et al., 1996)
d’E. coli au phénotype [hydrogénase–] mutée pour le gène hypF (fournie par A. Böck). Ce
gène est responsable chez E. coli de la maturation des 3 hydrogénases [NiFe] produites chez
cette bactérie (Blokesch et al., 2002; Blokesch et al., 2004; Lutz et al., 1991; Maier et al.,
1996; Paschos et al., 2002). Le phénotype [hydrogénase–] de cette souche a été confirmé en
réalisant un test d’activité à partir d’un extrait cellulaire brut (voir conditions d’un test
d’activité hydrogénase, Matériel et Méthodes section 10.2.4.1). Nous n’avons pas décelé
d’activité de type hydrogénase dans ce mutant d’E. coli ce qui confirme les résultats obtenus
dans la littérature (Maier et al., 1996; Paschos et al., 2002). Pour les besoins d’une autre
problématique, étudiée en parallèle et liée à la production du cofacteur ptérine chez E. coli,
nous avons poursuivi l’ensemble de nos travaux dans un double mutant E. coli
hypF – mobab – dénommé E. coli T5 (Codon-plus) (voir chapitre V section 5.3.2) muté pour
la voie de production du cofacteur MGD (la forme finale du cofacteur est de type MPT). Ce
-
double mutant a été construit par transduction et présente un phénotype [hydrogénase ]
identique à la souche simple mutant DHP-F.
Le double mutant T5 a ensuite été transformé par le plasmide pTRC99AMjGAPOR et
nous avons réalisé une expression et une purification dans des conditions identiques aux
conditions précédentes (Matériel et Méthodes section 4). Les fractions d’élution ont ensuite
été testées dans les mêmes conditions que précédemment. Les tests d’activité en boîte à gants
démontrent une conservation de l’activité de réduction du benzyl viologène non GAPdépendante des fractions d’élution de la Mj GAPOR purifiée et produite à partir de cette
souche d’E. coli T5 (hypF – mobab –, Condon-plus, pTRC99AMjGAPORCtag) au phénotype
-
[hydrogénase ]. Ce résultat élimine l’hypothèse d’une quelconque hydrogénase active copurifiée avec la Mj GAPOR lors d’une purification à partir du surnageant de cassage d’E. coli.
L’activité de réduction du Bv non GAP-dépendante détectée dans les fractions de GAPOR
purifiées ne peut donc être attribuable qu’à la GAPOR elle-même.
Il est difficile d’extrapoler ce résultat à la Mj GAPOR exprimée chez C. acetobutylicum
-
(pPHMjGAPORCtag) compte-tenu de l’absence de mutant [hydrogénase ]. Cependant, les
activités détectées chez E. coli et chez C. acetobutylicum présentent d’importantes
similitudes. En effet, elles sont qualitativement et quantitativement très proches et sont
162
Chapitre VI
dépendantes de la concentration en GAPOR dans la fraction purifiée. Il semble donc possible
d’envisager que l’activité similaire de réduction du Bv non GAP-dépendante détectée dans les
fractions purifiées de GAPOR chez C. acetobutylicum (pPHMjGAPORCtag) soit due à la
GAPOR elle-même et non pas à la co-purification d’une hydrogénase. Cette hypothèse reste à
-
confirmer par la suite lorsqu’un mutant de C. acetobutylicum au phénotype [hydrogénase ]
sera disponible.
5.1.3 Effet de la concentration en hydrogène
Au cours des différentes analyses de l’activité atypique de la Mj GAPOR, nous avons
identifié une réponse de l’enzyme à la quantité d’hydrogène dissoute dans la cuve d’analyse.
Nous nous sommes placés dans les conditions d’un véritable test biochimique d’une activité
hydrogénase avec une saturation du tampon d’analyse en hydrogène par un bullage permanent
d’hydrogène pur. Nous avons testé une nouvelle fois des extraits de Mj GAPOR exprimés
chez E. coli T5 (hypF
–
mobab
–
, Codon-plus, pTRC99AMjGAPORCtag) et C.
acetobutylicum (pPHMjGAPORCtag) et nous avons observé une augmentation proche d’un
facteur 10 de l’activité spécifique avec respectivement des activités spécifiques de 3,1 µmol
de Bv/min/mg de Mj GAPOR et 4,2 µmol de Bv/min/mg de protéine à 50 °C (ces valeurs
excluent la réduction chimique directe de l’hydrogène sur le benzyl viologène).
Ce résultat est cohérent avec l’augmentation de la concentration en hydrogène dans la
solution tampon qui est par défaut la même que celle de la boîte à gants (environ 10%) et qui
a été portée à 100% par un bullage permanent d’hydrogène pur. Tous les dosages ont été
réalisés à 100% d’hydrogène par la suite.
Il est particulièrement intéressant d’observer que la même GAPOR produite chez E. coli T5 et
chez C. acetobutylicum répond d’une façon similaire à la concentration en hydrogène. Il
semble que l’hydrogène puisse intervenir dans le processus de catalyse de la réduction du Bv
non GAP-dépendante.
5.1.4 Discussion
L’activité atypique de réduction du Bv détectée dans les fractions de purification de la
GAPOR de M. jannaschii exprimée dans la souche E. coli T5 ne peut être attribuée qu’à la
163
Chapitre VI
GAPOR elle-même. La co-purification d’autres protéines (autres que des hydrogénases) n’est
pas exclue mais celles-ci ne peuvent être responsables de la présence de cette activité.
La présence d’une telle activité chez une GAPOR n’a jamais été référencée dans la littérature
et cela amène plusieurs questions et hypothèses sur l’origine de cette activité ainsi que la
possibilité d’y remédier. Cette conclusion nous amène, en effet, à remettre en question la
fonctionnalité du gène de la GAPOR de M. jannaschii ainsi que de la présence des différents
cofacteurs nécessaire à la pleine fonctionnalité de l’enzyme. L’absence partielle ou totale de
ces cofacteurs particuliers (W-ptérine...) pourrait en effet être à l’origine du défaut d’activité
glycéraldéhyde 3-phosphate oxydoréductase de l’enzyme. La présence d’un cofacteur
incomplet ou d’une nature différente ainsi qu’un problème de maturation de la protéine
pourrait également être à l’origine de l’activité atypique que nous détectons.
Nous avons donc réalisé une série d’études biochimiques et biophysiques afin de tester les
différentes hypothèses émises et de redonner par là-même une pleine activité GAPOR à notre
enzyme dans nos conditions d’expression/purification.
5.2 Expression/Purification de la GAPOR de P. furiosus
chez C. acetobutylicum
Le défaut d’activité de la GAPOR de M. jannaschii produite dans nos conditions
d’expression/purification nous oblige à soulever l’hypothèse d’un problème lié à la non
fonctionnalité de la GAPOR issue du gène gor (MJ1185) de M. jannaschii. Bien que la
présence unique de ce gène dans le génome de l’archaeon ainsi que la conservation des
motifs fonctionnels dans la séquence de la protéine sont autant d’arguments en faveur de la
fonctionnalité de cette enzyme chez son hôte originel (voir section 1 et 2 de ce même
chapitre), aucune étude préalable ne le démontre.
La GAPOR de P. furiosus codée par le gène gor est la seule représentante de ce sous-groupe
des AOR, démontrée comme étant fonctionnelle dans la littérature (Mukund & Adams, 1995;
van der Oost et al., 1998). Nous avons donc envisagé de produire la GAPOR de P. furiosus de
manière hétérologue chez C. acetobutylicum afin de vérifier que le défaut d’activité que nous
constatons chez la GAPOR de M. jannashii n’est pas lié à la non fonctionnalité du gène.
164
Chapitre VI
Nous avons donc cloné le gène gor (ORF Pf0464) codant pour la GAPOR de P.
furiosus dans le vecteur pPHPfGAPORCtag selon le même schéma que pour le gène gor de
M. jannaschii puis introduit le plasmide chez C. acetobutylicum ATCC 824. L’expression et
la purification de la Pf GAPOR ont été réalisées dans les mêmes conditions que
précédemment (voir section 3.2.2 de ce chapitre et Matériel et Méthodes section 4) et ont
révélé une quantité plus faible de Pf GAPOR de l’ordre de 30 µg/ml dans la fraction d’élution
principale soit une quantité de l’ordre de 70 µg de protéine purifiée par litre de culture
environ. La concentration est plus faible que celle obtenue avec la GAPOR de M. jannaschii,
ce qui explique qu’elle ne soit visible que sur western-blot (figure 45) Bien que faible, cette
concentration reste suffisante pour envisager une analyse de l’activité de l’enzyme.
M
S
E2
E3
100
70
55
40
35
25
15
Figure 45 : Western-Blot : expression/purification de la GAPOR de P. furiosus. Marqueur : précoloré SDSPAGE Fermentas™, révélation par de la streptactin-HRP conjugated (IBA™). Piste S : surnageant de cassage.
Pistes E2 – E3 : Fractions d’élution. La bande correspondant à la GAPOR est signalée par une flèche noire.
L’étude biochimique de la Pf GAPOR a révélé le même profil d’activité que la Mj GAPOR
exprimée dans les mêmes conditions chez C. acetobutylicum. En effet, nous avons pu mettre
en évidence une activité spécifique de réduction du benzyl viologène également non-GAP
dépendante d’environ 21,8 µmol de Bv réduit/min/mg de protéine à 50°C. Cette activité est
environ 5 fois supérieure à celle détectée chez la GAPOR de M. jannaschii dans les mêmes
conditions d’expression chez C. acetobutylicum et de purification (environ 4,2 µmol de
Bv/min/mg de protéine) (100% d’H2) et s’est révélée reproductible sur plusieurs purifications.
La GAPOR de P. furiosus étant une enzyme fonctionnant à haute température, nous
avons donc testé l’activité de l’enzyme à 70°C pour préserver un minimum la conservation du
165
Chapitre VI
GAP (Mukund & Adams, 1995). A cette température nous observons toujours une réduction
du benzyl viologène non-GAP dépendante mais l’activité spécifique augmente d’environ 10%
avec une moyenne de 23,9 µmol de Bv réduit/min/mg de protéine (100% d’H2). Ce résultat
n’avait pas été observé de manière aussi nette (10% d’H2) chez la GAPOR de M. jannaschii
bien qu’il avait été possible de constater une très légère augmentation de l’activité liée à la
température.
Ces résultats démontrent un point essentiel : la similarité de comportement constatée
pour les deux enzymes GAPOR produites chez C. acetobutylicum et dont l’une a été
démontrée comme fonctionnelle dans son organisme d’origine. La question de la
fonctionnalité du gène de la GAPOR de M. jannaschii n’est pas résolue mais le comportement
biochimique identique d’une GAPOR démontrée comme fonctionnelle dans les mêmes
conditions d’expression/purification semblent indiquer que le problème de fonctionnalité de
l’enzyme pourrait être ailleurs.
L’hypothèse d’un défaut de maturation de la GAPOR lié à l’insertion des cofacteurs
et/ou au repliement de la protéine dans sont hôte hétérologue a donc été émise et explorée.
5.3 Optimisation de l’insertion des cofacteurs dans la
GAPOR
La famille des AOR, et la GAPOR en particulier, possède deux cofacteurs internes avec
une W-ptérine et un centre [4Fe-4S] dont la présence est indispensable à la fonctionnalité de
l’enzyme. La synthèse enzymologique de ces éléments n’étant pas codée par le gène de la
GAPOR, ils doivent donc être apportés par la bactérie hôte, en l’occurrence C. acetobutylicum
et E. coli dans notre cas. La synthèse est réalisée par un mécanisme cellulaire très conservé
chez tous les êtres vivants mais qui peuvent parfois présenter quelques spécificités notamment
à l’étape d’insertion du métal qui fait intervenir la protéine MoeA.
L’un des objectifs de cette étude est de mettre au point les conditions d’expression chez
C. acetobutylicum (et parallèlement chez E. coli) de la GAPOR afin d’obtenir une protéine
fonctionnelle au plus proche de son état naturel. Malgré la divergence évolutive conséquente
entre M. jannaschii (Archaea) et C. acetobutylicum (Bacteria), il est nécessaire que les
166
Chapitre VI
mécanismes, les précurseurs biochimiques, les voies métaboliques et les conditions physicochimiques, indispensables à l’obtention d’une GAPOR complète et active soient rassemblés
chez ce nouvel hôte.
La problématique de l’expression hétérologue réside donc dans la nécessité de maîtriser
ces différents facteurs au cours de l’expression et de la maturation de la protéine. On peut
diviser l’ensemble de ces facteurs en deux catégories :
-
La première rassemble certaines difficultés inhérentes à chaque expérience
d’expression hétérologue telles que la T°, le milieu de culture, le type de vecteur
d’expression…
Ces difficultés peuvent influer considérablement sur la quantité de protéine soluble et
active
exprimée
(problèmes
de
corps
d’inclusion
rencontrés
lors
d’une
surexpression…). Ces facteurs sont plutôt liés à une mise au point des conditions
d’expression et leur optimisation a été décrite au début de ce chapitre.
- La seconde catégorie regroupe des aspects plus spécifiques à la protéine. En ce qui
concerne la GAPOR, ces facteurs sont nombreux du fait de la nature atypique de cette
protéine. En effet, la synthèse et le repliement de la chaîne peptidique seule ne suffisent
pas à l’obtention d’une protéine active, il est nécessaire que celle-ci soit associée à une
molécule de W-ptérine ainsi qu’à un centre de type [4Fe-4S]. L’insertion de ces
cofacteurs couplée dynamiquement à un repliement de la chaîne polypeptidique dans sa
conformation native constituent les facteurs nécessaires à l’obtention d’une holoenzyme
fonctionnelle.
Nous avons tenté d’identifier et d’optimiser chez les bactéries hôtes les étapes de
maturation de la GAPOR pouvant se révéler limitantes pour l’obtention d’une protéine
complète et fonctionnelle. En nous appuyant sur des travaux antérieurs, nous avons donc
formulé différentes stratégies afin d’optimiser leur capacité à importer le W, à synthétiser le
cofacteur tungsto-ptérine et à y incorporer l’atome de W et enfin, à assembler le tout afin de
former une protéine complète et active.
167
Chapitre VI
5.3.1 Amélioration de l’import du W dans les bactéries hôtes
La GAPOR est une enzyme faisant partie de la grande famille des Molybdoenzymes,
qui comportent toutes en leur sein un cofacteur de type ptérine (simple ou double), lui-même
contenant un atome de molybdène (Mo) ou plus rare, de tungstène (W) (Voir Chapitre IV
section 1 et 5). Dans le cas de la GAPOR, il a été démontré que le W était nécessaire pour
obtenir une pleine activité de l’enzyme et que l’incorporation de Mo avait pour effet une nette
diminution de l’activité de la protéine (Mukund & Adams, 1996). Il est donc nécessaire
d’optimiser le rapport W/Mo pendant l’expression hétérologue de la protéine afin de favoriser
l’insertion de W.
Cependant, E. coli présente une incorporation préférentielle du Mo dans ses systèmes de
synthèse de ptérine (Voir chapitre IV section 1 et 5) liée à un système de transport actif
spécifique (le système ModABC, voir chapitre IV section 5.1). Le cas de C. acetobutylicum
est moins défini car bien qu’aucune molybdo ou tungstoenzyme n’ait été découverte chez ce
microorganisme de nombreuses enzymes des deux types ont été découvertes chez les
clostridies et plus particulièrement chez C. pasteurianum (Hinton & Mortenson, 1985; Hinton
& Merritt, 1986; Scherer & Thauer, 1978).
5.3.1.1 Gestion du rapport W/Mo dans le milieu de culture
Dans le cas des deux bactéries hôtes nous avons entrepris de déplacer le rapport W/Mo
très en faveur du W afin de forcer son import dans les bactéries. Cette stratégie a déjà été
employée avec succès chez E. coli pour plusieurs Mo-enzymes dont le Mo a été remplacé par
du W, telles que : la TMAO réductase (Buc et al., 1999) ou certaines Nitrogénases (Cardenas
& Mortenson, 1975; Siemann et al., 2003) démontrant qu’il était possible de forcer
l’incorporation du tungstène plutôt que du molybdène dans la protéine par un excès de W
dans le milieu de culture. En plaçant les bactéries à des rapports de concentrations W / Mo
supérieurs à 105, il devient alors possible de saturer totalement les systèmes de perméation
spécifiques (ABC transporteur de type ModB dans le cas d’E. coli …) et non spécifiques
(transporteurs sulfates) de la cellule et ainsi de déplacer considérablement l’équilibre vers
l’incorporation de tungstène dans la ptérine.
Ces deux éléments sont généralement présents à l’état de trace dans nos milieux de
culture communs, il est donc aisé d’établir le rapport Mo / W choisi en ajoutant en excès l’un
168
Chapitre VI
ou l’autre de ces éléments. Nous avons montré que C. acetobutylicum était capable de se
développer normalement en milieu riche jusqu’à une concentration maximale de 1 mM en
tungstate de sodium. Au-delà de cette valeur la concentration en W devient toxique pour la
cellule et inhibe toute croissance bactérienne. E. coli a montré une tolérance légèrement
supérieure avec une limite à environ 5 mM de tungstate de sodium. L’application de ces
concentrations élevées en W nous permet de nous placer à des rapports W/Mo supérieurs à
105 dans nos milieux de culture.
5.3.1.2 Effet sur l’incorporation du W dans la GAPOR
Nous avons exprimé la Mj GAPOR chez E. coli (pTRC99AMjGAPORCtag, Codonplus, hypF-, mobab-) et C. acetobutylicum (pPHMjGAPORCtag, ATCC 824) dans les mêmes
conditions que précédemment (voir Matériel et Méthodes Chapitre III section 4) mais avec
une concentration en W de 1 mM dans le milieu de culture au lieu de 10µM. Le taux de
croissance des deux bactéries a été légèrement ralenti mais leur comportement général
pendant la phase d’expression n’a pas été significativement modifié par la présence du W.
L’analyse de la GAPOR par ICPMS (voir Matériel et Méthodes chapitre III section
10.4.6) a permis de détecter la présence et de doser la quantité de W et/ou de Mo dans la
protéine purifiée. Les résultats (tableau 9) démontrent un profil d’incorporation du W très
différent selon que l’on est chez E. coli ou chez C. acetobutylicum. En effet, malgré l’excès
conséquent de W dans le milieu de culture d’E. coli, l’incorporation de ce métal dans la
GAPOR n’est que de 11 % et de 7,6 % de Mo alors que ce dernier est 105 à 106 fois moins
concentré.
GAPOR
M. jannaschii
produite chez
Dosage Protéine
[GAPOR] Pureté [GAPOR]
µg/ml
%
µmol
W
Mo
dosage
ICPMS
µM
%
insertion
dosage
ICPMS
µM
%
Insertion
Rapport
d'insertion
W/Mo
E. coli
1302
75
13,6
1,5
11
1
7,6
1,4
C.
acetobutylicum
640
98
8,7
6,2
70,4
0,3
3,4
20,7
Tableau 9: Dosage par ICPMS du W et du Mo contenu dans les échantillons de GAPOR de M. jannaschii
purifiée et produite chez E. coli T5 (hypF– mobab –, Codon-plus, pTRC99AMjGAPORCtag) et
C.
acetobutylicum.
169
Chapitre VI
Ce résultat confirme la sélectivité très nette d’E. coli pour l’import de Mo mais
démontre également qu’il est possible d’incorporer du W dans la protéine en conditions
d’excès de W dans le milieu de culture. Cependant, il est impossible de déduire à ce stade s’il
existe une sélectivité pour le Mo également au niveau du système de synthèse et
d’incorporation du métal dans la ptérine. Il n’a cependant pas été possible, au cours de cette
étude, de mettre au point un protocole de purification de la ptérine afin d’analyser le type de
métal qu’elle contient.
Le taux d’insertion de W de 11 % chez E. coli est à comparer aux 70,4 % d’insertion
métallique que l’on observe chez C. acetobutylicum. C. acetobutylicum semble moins
sélective pour le Mo qu’E. coli malgré la très faible concentration en Mo (traces) dans le
milieu de culture, on en détecte tout de même une part faible mais significative dans la
protéine (3,4 %). Ce résultat laisse donc présager de la présence effective d’un système de
transport actif du Mo chez ce microorganisme comme le montrent certaines études
bioinformatiques (de type ModABC, voir chapitre III section 5.2).
Nos résultats de dosage par ICP-MS indiquent que C. acetobutylicum semble à ce stade de
l’étude être l’hôte le plus adapté à l’expression de la GAPOR.
L’analyse biochimique des GAPOR produites chez E. coli et C. acetobutylicum en
présence de 1 mM de tungstate de sodium n’a cependant montré aucune modification
significative du problème d’activité non GAP-dépendante que nous rencontrons. L’activité de
type « hydrogenase-like » de la GAPOR est toujours présente et conserve les mêmes valeurs
qu’au chapitre précédent. L’analyse ICPMS ne nous donne cependant aucune information sur
la nature de l’interaction entre le W et la protéine. Plusieurs travaux de mise en évidence du
cofacteur ptérine associé au métal ont donc été initiés au laboratoire et sont actuellement en
cours.
5.3.2 Incorporation du cofacteur ptérine et optimisation de la souche pour
la production hétérologue de la GAPOR
L’import du W et son incorporation dans la ptérine représentent l’une des étapes clé
dans la production hétérologue de la GAPOR. Cependant, bien que la formation de la ptérine
170
Chapitre VI
soit une voie de synthèse ubiquitaire dans le monde du vivant, celle-ci diffère parfois selon les
espèces (voir chapitre III section 5.1). Seule la voie de synthèse ptérinique d’E. coli a été bien
caractérisée, elle permet à l’issue de la voie de transformation de produire un cofacteur ptérine
de type MGD. Cependant, la W-ptérine présente dans l’AOR et de la FOR de P. furiosus (voir
chapitre III section 3.2 et 5.1) est d’un type différent car il s’agit de ptérine de type MPT soit
un intermédiaire réactionnel présent également chez E. coli mais qui est transformé par
MobAB en ptérine de type MGD.
Nous avons pu observer que la structure de la GAPOR de M. jannaschii présente une grande
homologie de structure avec celles de l’AOR et de la FOR. La structure générale de ces deux
enzymes (voir chapitre III section 4) montre une cavité interne qui contient la W-ptérine et le
centre [4Fe-4S]. Comme on peut le constater figure 46 A, la forme MGD possède deux
nucléotides GMP et deux fonctions phosphate en plus, ce qui en fait une molécule de taille
bien plus importante que la ptérine MPT (figure 46 B).
Notre modèle de la MJ GAPOR montre une cavité de dimension comparable à celle de l’AOR
et de la FOR et compte-tenu de la grande homologie fonctionnelle et structurelle qu’il existe
entre ces AOR, il y a de fortes présomptions pour que la GAPOR de M. jannaschii nécessite
elle-aussi un cofacteur de type MPT.
A
B
Figure 46 : Modélisation moléculaire tridimensionnelle de la Bis W-ptérine : A : Forme MGD B : Forme MPT
L’atome de W est représenté en rouge. Les groupements phosphate sont représentés en vert
171
Chapitre VI
L’incorporation de la W-ptérine sous forme MPT chez E. coli pendant l’expression de la Mj
GAPOR peut donc se révéler être un facteur limitant car la forme MPT n’est qu’un
intermédiaire présent en faible quantité.
5.3.2.1 Etude bioinformatique et mise en évidence des gènes de synthèse de la
ptérine chez C. acetobutylicum
A notre connaissance, la synthèse de la ptérine chez C. acetobutylicum n’a jamais été
étudiée. Il existe cependant chez les clostridies de nombreuses enzymes possédant des
cofacteurs W-ptérine et Mo-ptérine (Hinton & Mortenson, 1985; Hinton & Merritt, 1986;
Scherer & Thauer, 1978).
Bien que la voie de synthèse ptérinique soit ubiquitaire et que l’enchaînement des réactions
soit très semblable, les gènes codant pour les enzymes impliquées peuvent diverger de
manière assez importante. Nous avons donc tenté d’identifier les éléments génétiques codant
pour cette voie de synthèse par analyse bioinformatique dans le génome de C. acetobutylicum
par comparaison de séquences avec des gènes codant pour des enzymes de la voie provenant
de divers microorganismes (E. coli, P. furiosus, autres clostridies...).
Cette étude a permis de mettre en évidence les principaux gènes de synthèse ptérinique que
l’on retrouve pour la plupart organisés sous la forme d’opérons (figure 47) dans le génome de
C. acetobutylicum. On observe sur le génome un regroupement fonctionnel des gènes codant
pour des enzymes intervenant sur une même étape de la voie. C’est le cas pour le système
MoaAC responsable de la transformation du GTP en précurseur Z dont les gènes sont
organisés en opérons CAC 1992, 1993 et 1994.
172
Chapitre VI
« Moa system like » :
CAC 1992 : Moa C
CAC 1993 : Moa A
CAC 1994 : Moa B
« Moe system like » :
CAC 2020 – 2021 Moe A like
CAC 2022 : Moa B
Permease system « Mod ABC system like » :
CAC 0280 : Mod B
CAC 0281 : Mod A
CAC 0282 : Guanine / cytosine deaminase related
CAC 0283 : Mog A / Moa B
Aucune présence de gènes homologues à MobAB
Figure 47 : Etude bioinformatique des gènes de synthèse de la ptérine chez C. acetobutylicum.
Présentation des ORF identifiées par comparaison de séquences et résolution de la voie métabolique d’après le
schéma de la voie d’E. coli (Vergnes et al., 2004).
De la même façon les gènes du système d’import ABC transporteur ModABC sont regroupés
avec ceux codant pour les protéines MogA et MoaB responsables de la formation du MPTAMP, nouvel intermédiaire de biosynthèse du Moco précédant l’étape d’addition du métal
catalysée par MoeA. On observe plusieurs ORF telles que la CAC2022 présentant un haut
degré d’homologie avec les gènes moab et positionnée à proximité d’un gène type moea qui
n’intervient pas à la même étape. Malgré des analyses poussées il n’a pas été possible de
détecter la présence des gènes mobab qui codent pour les protéines MobA et MobB
responsables de la transformation finale de la ptérine MPT en MGD. Bien qu’il ne s’agisse
que d’une étude bioinformatique, ce résultat nous indique que la forme finale de la ptérine
chez C. acetobutylicum serait de type MPT et non MGD. En se basant sur cette hypothèse, C.
acetobutylicum constituerait
donc un excellent hôte pour la production de protéines à
cofacteurs MPT telles que les AOR et la GAPOR.
173
Chapitre VI
5.3.2.2 Optimisation de la synthèse ptérinique chez E. coli pour la production
hétérologue de GAPOR
Chez E. coli, la transformation finale de la forme MPT en la forme MGD est réalisée
par les protéines MobA et MobB. Dans le cas de l’expression hétérologue d’une enzyme à
cofacteur MPT, l’étape d’insertion du cofacteur devient alors limitante car celui-ci n’est plus
qu’un intermédiaire réactionnel en faible concentration.
Afin de lever cette limitation, il a donc été nécessaire d’utiliser un mutant mobab
-
d’E. coli afin d’accumuler dans le cytoplasme de la cellule un cofacteur de type MPT capable
d’être incorporé dans la GAPOR. Nous avons donc construit le double mutant E. coli T5
(présenté Chapitre 5.1.2) par transduction de la souche DHP-F dans une souche receveuse
TP1000 (Buc et al., 1999; Rothery et al., 1998; Temple et al., 2000) dont l’opéron mobab est
interrompu par une cassette de résistance à la tétracycline (voir Matériel et Méthodes section
7.1.2).
Nous avons ensuite exprimé la GAPOR de M. jannaschii dans la souche T5 (hypF
–
mobab– , pTRC99AMjGAPORCtag, pCodonplus) avec 1 mM de W dans le milieu de culture,
puis purifié l’enzyme selon le même protocole.
5.3.2.3 Mise en évidence du cofacteur ptérine contenu dans les extraits
purifiés de GAPOR
Nous avons tenté de mettre en évidence la ptérine présente dans les fractions de
GAPOR purifiées par plusieurs méthodes biophysiques et biochimiques.
•
Maldi-TOF
La mise en évidence du cofacteur molybdoptérine par spectroscopie de masse MALDI a
été réalisée avec succès sur l’Acetylène hydratase de Pelobacter acetylenicus (Meckenstock et
al., 1999). L’analyse en spectroscopie de masse de la GAPOR (PM = 71730 Da ± 70 Da) à
permis de mettre en évidence une hétérogénéité du pic de la GAPOR avec plusieurs
épaulements ce qui indique la présence de 1 et 2 groupements de masse 185Da (+/-10Da)
(figure 48) (l’erreur est ici plus forte que celle sur la masse à cause du faible rapport
signal/bruit). L’analyse n’a pu se faire qu’en conditions dénaturantes (acide sinapinique +
174
Chapitre VI
acide TFA) ce qui a pour effet de relarguer les cofacteurs internes. Le fort bruit de fond
observé en MALDI dans les bas poids moléculaires ne permet pas en général de mettre en
évidence la présence de groupements de petite taille telles que la mono-ptérine 700Da ou la
bis ptérine (1400 Da).
Voyager Spec #1 MC=>MC=>SM49[BP = 2189.6, 288]
71731.95
100
71731
21.7
90
80
71913.75
71913
70
≠ 400
% Intensity
60
50
72103.21
72103
40
30
20
10
0
60000
65000
70000
75000
80000
85000
Mass (m/z)
Figure 48 : Spectre de détection en MALDI-TOF d’un échantillon de Mj GAPOR purifiée.
Le pic de GAPOR est bien visible au centre et indique une taille de la protéine est de 71730 kDa ± 70 Da. Les
différentes masses détectées dans le pic principal sont indiquées.
Aucun signal de la GAPOR n’a pu être obtenu dans des conditions non dénaturantes afin
d’observer la masse moléculaire d’une protéine contenant la W-ptérine. Les différences de
masse observées dans le pic principal peuvent être affectées à la perte d’un ou de deux acides
aminés. Cette technique ne nous permet donc pas de conclure sur la présence de la ptérine
dans la protéine.
•
Autres techniques
La Résonance paramagnétique électronique (RPE) est une technique qui permet la
détection de groupements paramagnétiques, il s’agit notamment,
dans les protéines, de
complexes de métaux de transition et de radicaux organiques. Nous avons tenté de mettre en
évidence par RPE (voir Matériel et Méthodes chapitre V section 10.4.4) la présence d’un
groupement tungstoptérine ou molybdoptérine. Dans les molybdoenzymes et les
tungstoenzymes, les éléments Mo et W existent généralement sous trois degrés d’oxydation
175
Chapitre VI
stables (Mo(VI), Mo(V), et Mo(IV), idem pour le tungstène). Seule la forme semi-réduite,
Mo(V) ou W(V) (configuration électronique –nd1), est détectable par spectroscopie RPE.
Dans la forme « as prepared » de l’enzyme, aucun signal du W n’a pu être observé en dépit
de la détection par ICPMS d’une très faible concentration en W pour cet échantillon (tableau
14 page 180). De même, cet échantillon, observé en RPE après réduction chimique avec
Na2S2O4 (permettant d’atteindre dans ces conditions de pH un potentiel assez réducteur autour
de – 500 mV/ENH), ne met pas en évidence de signal caractéristique de W(V). Les
concentrations en W et en Mo dans cet échantillon sont à la limite du seuil de détection
imposé par la sensibilité de la technique RPE, et ceci peut expliquer l’absence de signaux.
Une autre explication peut être fournie par extrapolation des résultats obtenus sur de la
GAPOR de P .furiosus (Hagedoorn et al., 1999b; van der Oost et al., 1998). Le potentiel du
groupement tungstoptérine associé aux états redox W(VI)/W(V) serait relativement bas
(- 600 mV) et par conséquent ils n’observent spectroscopiquement le signal RPE associé au
W qu’après réduction poussée par l’ajout de GAP à l’échantillon. L’absence d’activité GAPdépendante de la GAPOR n’a pas permis de réduire suffisamment l’enzyme afin de détecter
un signal typique du W (voir chapitre IV section 4.4).
Une autre approche de détection de la ptérine a été envisagée par fluorimétrie (Johnson et al.,
1984; Rajagopalan & Johnson, 1992; Whitman et al., 1987). Cette méthode est basée sur les
propriétés d’absorption des rayonnements UV/visibles de molécules aromatiques telles que
les ptérines. La protéine est dénaturée afin de relarguer la molécule et de permettre sa
détection par fluorimétrie après une suite de modifications chimiques. Un protocole est en
cours de mise au point au laboratoire. Les résultats de ces travaux sont en cours d’acquisition
et ne sont pas encore disponibles au moment de la rédaction de ce mémoire.
5.3.3 Incorporation du centre [4Fe-4S] dans la GAPOR
La synthèse des centres [Fe-S] est réalisée de manière ubiquitaire par les organismes
vivants qui possèdent de très nombreuses protéines Fe-S. E. coli et C. acetobutylicum sont des
organismes dont la capacité à former des centres [Fe-S] de différents types a été démontrée.
Nous avons donc dosé l’élément Fer présente dans les échantillons de Mj GAPOR afin de
déterminer la concentration en fer dans la protéine (tableau 10).
176
Chapitre VI
Dosage Protéine
Fe
GAPOR
M. jannaschii
produite chez
[GAPOR]
µg/ml
E. coli
1302
75
13,6
39,8
9,95
73,2
C. acetobutylicum
640
98
8,7
30
7,5
85,2
Pureté [GAPOR]
dosage
%
µMol
ICPMS µM
concentration
%
en [4Fe-4S]
insertion
µM
Tableau 10 : Dosage par ICPMS du Fer contenu dans les échantillons de GAPOR de M. jannaschii purifiée et
produite chez E. coli T5 (hypF – mobab– , pTRC99AMjGAPORCtag, pCodonplus) et C. acetobutylicum, avec
1 mM de W.
Les taux d’insertion du Fe sont élevés et correspondent aux chiffres attendus dans l’hypothèse
d’un centre [4Fe-4S] par molécule de GAPOR à environ 40 µM de Fe détecté dans la
GAPOR d’E.coli, ce qui correspond à environ 10 µM de centre [4Fe-4S] (en faisant
l’hypothèse que tout le Fe est sous la forme de centre [4Fe-4S]) soit un taux d’insertion de
73,2 %. Le taux d’insertion constaté chez C. acetobutylicum est encore plus élevé avec près
de 85,2 %. Dans les deux cas, le taux est suffisamment élevé pour que l’insertion de ce
cofacteur dans la Mj GAPOR ne constitue pas une limite à l’obtention d’une enzyme
complète active.
Nous avons cependant tenté de vérifier la nature des centres [Fe-S] par différentes
techniques de biophysique (spectrométrie UV/visible, RPE...) afin de confirmer leur présence
dans la protéine et de valider les taux d’insertion calculés à partir de l’ICPMS.
La mesure de l’absorbance à 390 nm permet de détecter la présence de centres [4Fe-4S]
et de donner une information quantitative sur leur concentration dans la mesure où le
coefficient d’extinction molaire est connu pour une certaine longueur d’onde de la bande
d’absorption du chromophore. Les résultats (tableau 11) montrent la présence très nette de
centres [4Fe-4S] dans l’échantillon de GAPOR produite chez E. coli avec une absorbance de
0,21 uDO et dans l’échantillon de GAPOR produite chez C. acetobutylicum avec une
absorbance de 0,09 uDO à 390 nm.
177
Chapitre VI
GAPOR
M. jannaschii
produite chez
Absorbance 280 nm
uDO
Absorbance 390 nm
uDO
E. coli
0,53
0,21
C. acetobutylicum
0,27
0,09
Tableau 11 : Mesure des absorbances à 280 nm et 390 nm des échantillons de GAPOR purifiés.
Le bruit de fond moyen à été mesuré à 4.10-3 uDO sur l’ensemble de ces mesures. La souche utilisée de E. coli
est la souche T5 (hypF – mobab– , pTRC99AMjGAPORCtag, pCodonplus). Les deux bactéries ont été cultivées
sur milieu supplémenté avec 1 mM de W.
Les résultats obtenus par spectrométrie UV/visible démontrent clairement la présence de
centres [4Fe-4S] dans la GAPOR ce qui nous indique que l’insertion de ces groupements n’est
pas une étape limitante dans la production d’une enzyme complète et fonctionnelle chez l’un
ou l’autre des deux hôtes d’expression.
Une analyse des centres métalliques par la technique de résonnance paramagnétique
électronique a été réalisée mais il ne nous a pas été possible d’observer un signal
caractéristique. Plusieurs hypothèses pourraient expliquer cette absence de résultat : une
concentration en centres [4Fe-4S] inférieures au seuil de détection moyen en RPE (~10 µM) ,
un potentiel d’oxydoreduction du couple trop bas par rapport au pouvoir réducteur de
l’hydrosulfite de sodium ou bien le centre [Fe-S] de cette GAPOR possède des propriétés
spectroscopiques inhabituelles. Nous allons voir que cela n’a pas été le cas avec la GAPOR de
M. maripaludis qui nous a permis de dépasser ce seuil et de détecter la présence de centres
[4Fe-4S] par RPE (cf chapitre 5.4.1.3).
5.4 Caractérisation de la GAPOR du mésophile
Methanococcus maripaludis
Parmi les différents problèmes qui peuvent affecter une enzyme d’un organisme
hyperthermophile produite de manière hétérologue, la température de culture de la souche au
moment de l’expression de la protéine, représente un facteur important qui peut altérer la
stabilité de la protéine et perturber l’incorporation des cofacteurs.
178
Chapitre VI
Les GAPOR de M. jannaschii et P. furiosus sont des enzymes issues d’organismes
hyperthermophiles dont les températures optimales de croissance sont respectivement
supérieures de 48°C et 63°C par rapport aux organismes mésophiles tels qu’E. coli et C.
acetobutylicum. Cette différence de température importante peut influer sur la dynamique de
repliement de la GAPOR lorsqu’elle est exprimée chez l’un de ces organismes hôtes, en
particulier au niveau de l’insertion des cofacteurs W-ptérine et au niveau de la formation du
centre [Fe-S].
Une nouvelle GAPOR très proche de la GAPOR de M. jannaschii, issue de l’archaeon
mésophile Methanococcus maripaludis a été annotée lors du séquençage de son génome fin
2004 (Hendrickson et al., 2004). Les deux organismes sont de la même famille et présentent
une divergence évolutive très faible malgré une température optimale de croissance très
différente (tableau 12).
Famille des AOR
Température °C
Nb résidus
Caracterisée
AOR E. acidaminophilum
AOR E. coli
AOR C. acetobutylicum
AOR P. furiosus
37
37
37
105
608
700
684
605
oui
oui
FOR P. furiosus
FOR T. littoralis
105
90
627
621
oui
-
GAPOR M. jannaschii
GAPOR M. maripaludis
GAPOR P. abyssi
GAPOR P. furiosus
GAPOR P. horikoshi
GAPOR P. aerophilum
85
37
100
105
95
90
622
613
653
653
653
622
cette étude
cette étude
oui
-
Conservation
SS-unités
motifs fonctionnels
oui
partiellement
partiellement
oui
Basics AA (%) Hydrophobic AA (%)
1
4
11,51
10,86
14,47
12,07
32,72
33
32
33,55
oui
oui
2
-
12,6
13,04
35,09
35,1
oui
oui
oui
oui
oui
oui
?
?
1
-
15,92
12,72
13,17
13,17
13,48
12,65
35,21
32,46
35,22
36,45
34
39,23
Tableau 12 : Tableau récapitulatif des principales AOR mises en évidence dans les banques de données
internationales.
Les AOR provenant d’organismes mésophiles sont surlignées en bleu et celles provenant d’hyperthermophiles le
sont en vert. Mise en évidence de la première GAPOR mésophile de Methanococcus maripaludis (en rouge).
La GAPOR de M. maripaludis présente une homologie avec celle de M. jannaschii très
importante avec plus de 72 % d’homologie et plus de 56 % d’identité entre les deux
séquences protéiques (tableau 13). Les deux GAPOR forment un deuxième sous-groupe dans
la famille des GAPOR avec le sous-groupe des Pyrococcales (voir figure 21 chapitre IV
section 3).
179
Chapitre VI
% Homologie
/ Identité
GAPOR
M. jannaschii
GAPOR
M. maripaludis
GAPOR
P. furiosus
GAPOR
M. jannaschii
-
72 / 56
56 / 42,4
-
56 / 42,2
GAPOR
M. maripaludis
GAPOR
P. furiosus
-
Tableau 13 : Comparaison de séquences protéiques entre la GAPOR de M. maripaludis et les GAPOR de
M. jannaschii et P. furiosus.
5.4.1 Expression/ purification de la GAPOR de M. maripaludis
L’ORF MMP0945 du génome de Methanococcus maripaludis (ATCC JJ) codant pour
la Mm GAPOR a été clonée dans un vecteur pTRC99A sous la forme d’une fusion
traductionnelle avec un StrepTag II, selon le même schéma que pour le gène gor de M.
jannaschii. Le vecteur pTRC99AMmGAPORCtag a ensuite été inséré dans la souche E. coli
T5 (pCodonplus). L’expression/purification a ensuite été conduite en anaérobiose avec 1 mM
de sodium-tungstate dans les mêmes conditions opératoires que précédemment (voir Matériel
et Méthodes chapitre V section 4).
La purification de la GAPOR de M. maripaludis a été effectuée par une purification d’affinité
sur Streptactin SuperFlow (voir Matériel et méthodes chapitre V section 8.2 et 8.3). Nous
avons obtenu une fraction purifiée E2 (figure 49) de Mm GAPOR à une concentration très
élevée de 3,8 mg/ml avec une pureté d’environ 99 % (gel SDS-PAGE figure 49 A et B). La
Mm GAPOR semble s’exprimer beaucoup mieux que celle de M. jannaschii malgré un
système d’expression /purification identique. La protéine semble plus stable et moins sujette à
la dégradation comme on peut le constater sur gel SDS-PAGE et sur Western-blot (figure 49
A et B).
180
Chapitre VI
A
B
M
C
S
Fnr E1
E2
E3
E4
130
100
70
55
130
100
70
55
M
C
S
Fnr
E1
E2 E3
E4
40
40
35
35
25
25
15
15
chez E. coli T5 (hypF- mobab-, Codon-plus) . Gels SDS-PAGE 12 %,
A : Coloration au bleu de coomassie piste M : marqueur de taille Precision plus protein Biorad low range ; piste
E : extrait cellulaire total ; piste C : culot de cassage ; piste S : surnageant de cassage ; piste Fnr : fraction non
retenue du passage sur la colonne de Streptactin ; pistes E1 – E4 : fractions d’élution. B : Western Blot :
l’organisation est identique au gel A, M : marqueur de taille pré-coloré Biorad low range.
5.4.1.1 Analyse biochimique
L’analyse biochimique de la Mm GAPOR a révélé le même profil d’activité que celui
des GAPOR de P. furiosus et de M. jannaschii. Une forte activité de réduction du benzyl
viologène a pu être mise en évidence mais sans GAP-dépendance. Les tests ont cette fois été
menés à 37°C qui est la température optimale de croissance de M. maripaludis. Nous avons
mesuré une activité moyenne de 11,3 µmol de Bv réduit/min/mg de Mm GAPOR en
saturation d’hydrogène. Cette activité est la plus importante jamais observée chez pour une
GAPOR produite chez E. coli T5, elle est environ 3,6 fois plus élevée que celle de la Mj
GAPOR (3,1 µmol réduit/min/mg de Bv) produite dans les mêmes conditions.
5.4.1.2 Analyse du cofacteur W-ptérine
Le dosage du W et du Mo par ICPMS révèle un taux d’incorporation du W beaucoup
plus important dans la GAPOR Mm que dans la GAPOR de M. jannaschii. On observe une
insertion du W très importante avec près de 80 % de W dans l’échantillon et une très forte
diminution de l’insertion de Mo qui descend à seulement 1 % (tableau 14). Le rapport W/Mo
progresse de manière significative de 1,4 à près de 84.
181
Chapitre VI
Dosage Protéine
W
Mo
dosage
%
ICPMS
µg/ml
%
µMol
insertion
µM
GAPOR
M. maripludis
dosage
ICPMS
µM
%
Insertion
Rapport
d'insertion
W/Mo
3803
99
52,3
41,6
79,5
0,5
0,95
84
1302
75
13,6
1,5
11
1
7,6
1,4
produite chez E. coli
GAPOR
M. jannaschii
Tableau 14 : Dosage par ICPMS du W et du Mo contenu dans les échantillons de GAPOR de M. maripaludis et
M. jannaschii purifiées et produites chez E. coli T5 (hypF – mobab– , pTRC99AMjGAPORCtag, pCodonplus).
Ces deux échantillons de GAPOR (tableau 14) ont été produits et purifiés dans les
mêmes conditions. Il est intéressant de constater que ces deux protéines, malgré une très forte
homologie de séquence et une parfaite conservation de leurs motifs fonctionnels, présentent
un comportement très différent du point de vue de l’incorporation du W.
En dehors de la différence de séquence, le seul critère de différenciation entre les deux
GAPORs est la température originelle de formation et de fonctionnement de la protéine.
Comme on peut le constater, cette caractéristique influe considérablement sur l’incorporation
du W et sur la stabilité générale de la protéine à 37°C. L’un des facteurs limitant
l’incorporation du W dans la protéine pourrait être la dynamique de repliement de la protéine
et la stabilité de la structure à la température d’expression.
Des travaux sont actuellement menés au laboratoire afin de valider par ailleurs la présence de
la ptérine dans la GAPOR de M. maripaludis.
5.4.1.3 Analyse du centre [4Fe-4S]
L’analyse par ICPMS du Fe présent dans l’échantillon de Mm GAPOR purifiée dénote
une baisse significative de l’insertion du métal avec un taux d’insertion qui passe de 73 % à
environ 50 % (tableau 15). Il est cependant difficile d’envisager que la structure de la Mm
GAPOR puisse avoir un effet négatif sur l’insertion du centre [4Fe-4S]. Cette baisse peut être
néanmoins imputée à la forte production de protéine que nous avons réalisée (plus de 3,8
mg/ml), qui a pu saturer les systèmes cellulaires de synthèse et d’incorporation des centres
182
Chapitre VI
[Fe-S]. Par exemple, ceci a été montré lors de la production inductible chez E. coli de la
ferrédoxine clostridiale CAC 0303 qui possède deux centres [4Fe-4S] (voir chapitre VII
section 3).
Dosage Protéine
µg/ml
%
µmol
GAPOR
M. maripludis
Fe
dosage
ICPMS
µM
concentration
%
en [4Fe-4S]
insertion
Absorbance Absorbance
280 nm
390 nm
uDO
uDO
3803
99
52,3
104
26
49,7
1,53
0,54
1302
75
13,6
39,8
9,95
73,2
0,53
0,21
GAPOR
M. jannaschii
Tableau 15 : Dosage par ICPMS du Fer contenu dans des échantillons de GAPOR de M. maripaludis et de
M. jannaschii purifiées et produites chez E. coli T5 (hypF – mobab– , pTRC99AMjGAPORCtag, pCodonplus) et
mesure de l’absorbance à 280 nm et 390 nm.
L’absorbance à 390 nm de 0,54 uDO mesurée en spectrométrie UV/visible confirme la
présence de centres [4Fe-4S] dans l’échantillon de Mm GAPOR (tableau 13). Le résultat
obtenu est cohérent vis-à-vis de la précédente mesure effectuée sur l’échantillon de
Mj GAPOR. En effet, le rapport entre la concentration en Fe entre les deux GAPOR est de 2,6
et le rapport entre les absorbances à 390 nm est très proche, avec une valeur de 2,5. Ce
résultat renforce l’hypothèse que le Fe détecté est effectivement sous la forme de centres
[4Fe-4S]. Afin de valider ce résultat, nous avons tenté de détecter ces centres métalliques par
RPE. La réduction poussée de l’échantillon par ajout d’un petit volume de l’hydrosulfite de
sodium très concentrée (10 µl à 100 mM) a permis de mettre en évidence le spectre RPE
caractéristique d’un centre [4Fe-4S]1+ (figure 49).
Aucun signal de Fe libre (à g = 4.3) n’a pu être détecté dans les échantillons non réduits et
réduits, ce qui indique qu’il n’y a pas de forme dégradée de centres [Fe-S] ou de Fe libre en
solution. Aucun signal de centre [3Fe-4S] n’a également pu être détecté, ce qui montre que la
majeure partie du Fe est présente sous la forme de centres [4Fe-4S] dans la protéine.
Pour les deux échantillons (figure 50), l’ajout d’un faible volume de l’hydrosulfite de sodium
très concentrée (10 µL à 100 mM dans un volume d’échantillon de 160 µL, soit plus de 100
équivalents protéine) a permis d’observer des signaux assez faibles d’un centre [4Fe-4S].
183
Chapitre VI
Dans l’échantillon E2 n°1, un signal axial à g = 2.04, 1.93 caractéristique d’un [4Fe-4S]1+ est
présent. Ce signal représente 3 µM en [4Fe-4S]1+ réduit. Dans l’échantillon E2 n°2, on
observe un signal similaire un peu moins intense (1 µM en [4F-4S] environ), avec cependant
une raie à 2.04 légèrement décalée à 2.06 (superposition de la raie à 2.04 avec un signal
contaminant).
2.04
GaporMMec10
GaporMMec12
1.93
E2 n°1
E2 n°2
280
300
320
340
360
380
400
B (mT)
Figure 50 : Spectre en résonnance paramagnétique électronique du centre [4Fe-4S] de la GAPOR de
M. maripaludis. (Etat réduit).
Les deux courbes représentent respectivement : l’échantillon E2 n°1 concentration 3,8 mg/mL, soit 53 µM
(déterminée avec une masse molaire de 72 kDa, pureté de 99%) et l’échantillon E2 n°2 de concentration 1,8
mg/mL, soit 28 µM (déterminée avec une masse molaire de 72 kDa, pureté de 99 %).
Les quantités estimées en RPE sont très en deçà de celles calculées par ICPMS (environ 10 à
20 fois moindre) ou par spectroscopie optique (voir le niveau d’absorbance à 390nm dans le
tableau 15, suggérant qu’une majeure partie du centre [4Fe-4S] n’est pas détectée par RPE. Le
centre [4Fe-4S] de la GAPOR est un centre enfoui qu’il est difficile de réduire en utilisant des
agents réducteurs externes. La méthode employée est généralement une réduction par le GAP
avec déazaflavine (Hagedoorn et al., 1999a; van der Oost et al., 1998). La mise en présence
du couple redox GAP/3PG avec la protéine a pour effet de réduire ses centres métalliques (Wptérine et centre [4Fe-4S]) et de permettre leur détection par RPE. Notre GAPOR n’étant pas
capable de réduire le GAP il ne nous a pas été possible d’appliquer ce protocole.
184
Chapitre VI
5.4.1.4 Analyses biophysiques de la Mm GAPOR : interprétation et
discussion
Les résultats de l’expression et de la purification de la GAPOR de M. maripaludis chez
E. coli suggèrent que l’insertion du W pourrait être fortement limitée chez la GAPOR de M.
jannaschii, par le repliement de la protéine et par la stabilité de l’enzyme à basse température.
L’expression de cette première GAPOR mésophile a permis de résoudre une partie de la
problématique de l’expression hétérologue. Cette enzyme présente une meilleure stabilité et
une insertion efficace du W et du centre [4Fe-4S] à 37°C. Il reste cependant à confirmer que
ces résultats sont également reproductibles chez C. acetobutylicum. Le clonage de la GAPOR
de M. maripaludis a été finalisé et les premiers tests d’expression sont actuellement en cours
dans le cadre de la poursuite de ce projet.
Il reste également à démontrer que le W détecté dans la protéine est effectivement intégré à
une tungsto-pterine. Un protocole de mise en évidence de la ptérine par fluorimétrie est
actuellement en cours de mise au point.
Bien que la GAPOR de M. maripaludis soit un meilleur candidat que la GAPOR de
M. jannaschii, et malgré les différentes configurations testées et les diverses optimisations
prodiguées, l’activité de réduction du benzyl viologène détectée demeure systématiquement
non dépendante du GAP. Le mécanisme catalytique à l’origine de cette activité inattendue et
non référencée dans la littérature reste obscur à ce jour.
L’insertion du tungtène et du centre [4Fe-4S] n’étant plus un facteur limitant, il reste à
approfondir la question de la nature et de la forme de la ptérine insérée dans la GAPOR
exprimée chez E. coli et C. acetobutylicum. Plusieurs analyses par fluorimétrie sont
actuellement menées afin d’explorer le sujet.
6. Discussion et conclusion
L’expression et la purification des GAPOR de M. jannaschii, M. maripaludis et
P. furiosus ont été réalisées chez E. coli et C. acetobutylicum. L’analyse biochimique de ces
trois GAPOR a révélé une activité atypique de réduction du benzyl viologène non GAPdépendante de type « hydrogenase-like » et une absence d’oxydoréduction du glycéraldéhyde
185
Chapitre VI
3-phosphate. Le profil biochimique a été retrouvé de manière reproductible chez chacune des
GAPOR des trois archaea purifiées.
Après différentes expériences de contrôle chez E. coli, il est apparu que cette activité de
réduction du Bv non GAP-dépendante était imputable à la GAPOR et ne provenait pas d’une
contamination externe. Ce
fait
reste
également
à
démontrer
par
la
suite
chez
-
C. acetobutylicum lorsqu’un mutant au phénotype [hydrogénase ] sera disponible.
Bien que la non fonctionnalité des gènes codant pour les GAPOR de M. jannaschii et de
M. maripaludis ne soit pas exclue, cette hypothèse semble peu réaliste en raison du profil
biochimique identique retrouvé chez la GAPOR caractérisée de P. furiosus (Mukund &
Adams, 1995; van der Oost et al., 1998) exprimée dans les même conditions. L’activité
atypique de réduction du benzyl viologène non GAP-dépendante n’est pas référencée dans la
littérature pour la GAPOR de P. furiosus et une activité apparentée n’a jamais été observée
chez aucune des AOR caractérisées (Mukund & Adams, 1991; Rauh et al., 2004; Roy et al.,
1999). L’expression hétérologue des GAPOR chez ces deux bactéries hôtes semble donc
affecter la fonctionnalité de ces enzymes.
Nous avons tenté d’identifier et d’optimiser chez les bactéries hôtes les étapes de
maturation de la GAPOR pouvant se révéler limitantes pour l’obtention d’une GAPOR
complète et fonctionnelle. La synthèse des cofacteurs tunsgto-pterine et du centre [4Fe-4S] et
l’import du tungstène (Mukund & Adams, 1996) ont été identifiés comme étant des étapes
pouvant se révéler problématiques pour la fonctionnalité de la GAPOR. Sur la base de travaux
antérieurs (Temple et al., 2000) différentes stratégies ont été formulées afin d’optimiser la
capacité des bactéries hôtes à importer le W, à synthétiser le cofacteur tungsto-ptérine, à
incorporer l’atome de W et enfin, à assembler le tout afin de former une protéine complète et
active. Des analyses en RPE, voltampérométrie et ICP-MS ont été réalisées en parallèle à ces
démarches afin d’évaluer les bénéfices ou les désavantages de chacune des stratégies qui ont
été testées.
La synthèse de la ptérine a été optimisée chez E. coli en faveur de la forme finale du
cofacteur caractérisé chez les AOR (Buc et al., 1999; Chan et al., 1995) et l’incorporation du
W dans la protéine a été considérablement améliorée par l’expression de la GAPOR
mésophile de M. maripaludis.
186
Chapitre VI
Ces optimisations n’ont cependant pas permis de retrouver une activité d’oxydoréduction du
glycéraldéhyde 3-phosphate pour les GAPOR de M. jannaschii, de M. maripaludis et de
P. furiosus exprimées chez les deux bactéries hôtes. Il reste cependant à démontrer que le W
incorporé dans la GAPOR est effectivement associé à une tungsto-ptérine. Des expériences de
fluorimétrie sont actuellement en cours dans le cadre de ce projet de recherche afin de mettre
en évidence la présence de la ptérine.
187
188
Chapitre VII
Etude de l’interaction entre
l’hydrogénase [FeFe] de
C. acetobutylicum et les
ferrédoxines
189
Chapitre VII
Etude de l’interaction entre Hydrogénase/ Ferrédoxines
Chapitre VII
Etude de l’interaction entre l’hydrogénase
[FeFe] de C. acetobutylicum et les
ferrédoxines :
1. Introduction et objectifs de l’étude
L’insertion de la GAPOR dans le métabolisme de C. acetobutylicum nécessite qu’elle
soit capable d’interagir efficacement avec son nouveau partenaire : la ferrédoxine de C.
acetobutylicum. La déviation du flux électronique vers l’hydrogénase nécessite donc un
transfert optimal des électrons de la GAPOR vers la ferrédoxine puis de la ferrédoxine vers
l’hydrogénase à fer de C. acetobutylicum.
La seconde partie de ce travail porte donc sur l’optimisation de l’interaction entre les trois
partenaires du système : la GAPOR, la ferrédoxine et l’hydrogénase. La ferrédoxine étant
l’intermédiaire dans cette nouvelle chaîne de transport des électrons, il est nécessaire qu’elle
soit capable d’interagir efficacement à la fois avec la GAPOR mais aussi avec l’hydrogénase
native de C. acetobutylicum. La GAPOR n’étant à ce jour, pas encore fonctionnelle (voir
Chapitre VI) notre étude s’est concentrée sur le doublet hydrogénase/ferrédoxine.
Nous avons donc entrepris une étude biochimique visant à déterminer les paramètres qui
influencent de manière prépondérante l’interaction entre l’hydrogénase de C. acetobutylicum
et la ferrédoxine à travers une étude impliquant plusieurs ferrédoxines de provenances
différentes.
2. Analyses bioinformatiques et choix des ferrédoxines
L’étude des interactions entre la ferrédoxine, la GAPOR, et l’hydrogénase nécessite
d’étudier les ferrédoxines avec lesquelles ces deux dernières protéines fonctionnent dans leur
190
Chapitre VII
environnent naturel. Nous avons donc retenu la ferrédoxine associée au locus CAC0303 de C.
acetobutylicum qui a été identifiée comme la ferrédoxine de type 2x[4Fe-4S] majoritaire chez
ce microorganisme en culture solvantogène à pH contrôlé (Demuez et al., 2007).
Aucune étude préalable n’a identifié la ferrédoxine majoritaire de M. jannaschii. Nous
avons entrepris une étude bioinformatique afin d’identifier des ferrédoxines candidates issues
de M. jannaschii et de C. acetobutylicum en fonction de différents critères que nous
développerons dans les chapitres suivants.
2.1.1 Etude bioinformatique des ferrédoxines de M. jannaschii
Quatre ferrédoxines (voir séquences figure 51) sont annotées dans le génome de M.
jannaschii (référence Genbank : L77117 ; NC_000909) par comparaison de séquence avec
différentes ferrédoxines 2x[4Fe-4S] et la ferrédoxine 1x[4Fe-4S] de P. furiosus (Heltzel et al.,
1994). D’autres séquences apparentées à d’autres ferrédoxines et polyferrédoxines ont pu être
identifiées mais leur degré d’identité reste trop faible pour être significatif.
Fdx MJ 0722 "FdxA"
Fdx MJ 0624
Fdx MJ 0533
Fdx MJ 0061
10
20
30
40
50
60
70
80
95
(1) 1
(1) ------------------MAVEIIVDREKCIGCGRCYDVCPKGPLIWTKDENGKYYAYDVEYCHNCKFCAGRCPTNAILIKVVKPKKKDENKNKK
(1) ---------------------MGIKILEKCVGCGNCVVFCPRRAIKTYG-----VAIVDENKCSNCGICARYCPINAIKVDTSL----------(1) ---------------------MVKIDYKKCGYCGACVGVCEKLAINLIEH----IIVIDEKKCNNCKLCTIVCPLNALEGE-------------(1) MLSKILGIFKGKEKIEEKSNKIIEIDYNKCKNCLSCYRVCKNNVFAIKNN---RVVVKNENNCTKCGECLKVCRYGAIILYDA------------
Figure 51 : Alignement des 4 séquences de ferrédoxines annotées dans le génome de M. jannaschii.
(algorithme d’alignement multiples et matrice Blosum62)
Parmi les ferrédoxines putatives, nous avons la ferrédoxine MJ0722 annotée comme « FdxA »
dans le génome de M. jannaschii (Bult et al., 1996). Cette ferrédoxine présente un taux
d’homologie élevé avec plusieurs ferrédoxines hyperthermophiles dont la ferrédoxine de P.
furiosus avec qui elle partage 31% d’homologie entre leurs séquences protéiques. Deux
clusters de cystéines sont identifiables, ce qui semble confirmer qu’il s’agit d’une ferrédoxine
de type 2x[4Fe-4S]. La prédiction de structure secondaire démontre une conservation
structurale classique des ferrédoxines clostridiales (voir chapitre III section 6.1.3) avec deux
clusters portés chacun par une courte hélice α et espacés par deux pseudo-feuillet β (figure
52).
191
Chapitre VII
Figure 52 : Alignement de la ferrédoxine de M. jannaschii 0722 avec la ferrédoxine de C. pasteurianum.
Prédiction de structure secondaire. Les acides aminés surlignés en bleu ont été marqués comme feuillets β par
prédiction de structure IIaire pour la Fdx de M. jasnnachii et d’après la structure résolue pour la Fdx de C.
pasteurianum. Les acides aminés surlignés en rouge ont été marqués comme hélices α par prédiction de structure
IIaire pour la Fdx de M. jasnnachii et d’après la structure résolue pour la Fdx de C. pasteurianum.
Les 2 clusters [Fe-S] composés de 4 cystéines sont surlignés en jaune.
Il est intéressant de constater que cette ferrédoxine présente un domaine atypique en Cterminal qui ne s’aligne pas avec les autres séquences de ferrédoxines. Ce domaine très
basique (7 lysines) ne présente également aucun motif de structure secondaire répertorié ni
aucune similitude avec les banques de séquences protéiques disponibles. Ce motif ne contient
aucun résidu ayant un rôle fonctionnel et se révèle absent dans la plupart des ferrédoxines
homologues d’autres micro-organismes. Lorsque ce domaine est délété, la ferrédoxine
MJ0722 présente alors un taux d’homologie plus élevé de 5,2 % avec la ferrédoxine de
P. furiosus.
Cette séquence pourrait être impliquée dans l’interaction avec des partenaires de la
ferrédoxine chez M. jannaschii tels que la GAPOR, il nous est donc nécessaire de la prendre
en compte dans nos analyses d’interaction avec l’hydrogénase. C’est pourquoi nous avons
pris la décision de cloner la ferrédoxine de M. jannaschii avec, et sans cette séquence afin de
vérifier sa nécessité dans l’interaction avec la GAPOR ultérieurement lors de tests
enzymatiques, et son effet lors de l’interaction avec l’hydrogénase à fer de C. acetobutylicum.
L’homologie de la ferrédoxine de M. jannaschii avec la ferrédoxine CAC0303 est
cependant plus réduite avec seulement 26 % ce qui indique une divergence évolutive
importante entre les deux ferrédoxines. Ce point est particulièrement intéressant dans le cadre
de notre étude afin de tester la capacité de l’hydrogénase de C. acetobutylicum à interagir
avec des ferrédoxines de type 2x[4Fe-4S] mais qui présentent des caractéristiques très
différentes (séquence, composition en acides aminés, point isoélectrique...). En effet, une plus
grande souplesse de l’hydrogénase vis-à-vis de la ferrédoxine nous permettra d’être plus
flexibles sur le choix de la ferrédoxine optimale à insérer dans le système
GAPOR/ferrédoxine/hydrogénase chez C. acetobutylicum.
192
Chapitre VII
Il est donc pertinent dans notre étude de retenir une ferrédoxine éloignée des ferrédoxines
clostridiales types. C’est pourquoi nous avons choisi dans un premier temps la ferrédoxine
MJ0722 « FdxA » et son mutant comme sujet d’étude représentatif des ferrédoxines de M.
jannaschii. Cette ferrédoxine et son mutant seront dénommées respectivement Fdx Mjwt et
Mj∆ au cours de cette étude.
2.1.2 Etude bioinformatique des ferrédoxines de C. acetobutylicum
Cinq ferrédoxines sont annotées dans le génome de C. acetobutylicum (Nolling et al.,
2001), ainsi que de nombreuses autres séquences de polyferrédoxines et de ferrédoxines de
type II (figure 53). Les ferrédoxines de C. pasteurianum (Bertini et al., 1995; Mortenson et
al., 1962) et la ferrédoxine CAC0303 de C. acetobutylicum nous ont servi de référence pour
les comparaisons de séquences. La CAC0303 présente la particularité d’avoir un très fort taux
d’homologie avec la ferrédoxine de C. pasteurianum (près de 95 %) mais une homologie plus
faible avec les ferrédoxines des Archaea (inférieure à 30 %). Les alignements que nous avons
effectués suggèrent qu’il s’agit d’une ferrédoxine de type 2x[4Fe-4S].
Fdx C. pasteurianum
Fdx CAC 0303
Fdx CAC 3527
Fdx CAC 3621
Fdx CAC 0105
Fdx CAC 0075
10
20
30
40
50
60
70
80
90
(1) 1
(1) ---------MAYKIADSCVSCGACASECPVNAISQG--DSIFVIDADTCIDCGNCANVCPVGAPVQE----------------------------(1) ---------MAYKITDACVSCGSCASECPVSAISQG--DTQFVIDADTCIECGNCANVCPVGAPVQE----------------------------(1) --------MPRRINKLDCVGCGTCQRVCIVGCITQEK-DRKRLINESACVDCGACQYACPKKCISEH----------------------------(1) --------MKAFVDKETCIGCGTCPAICPEIFEMEDD-GKAVASDAEIANDLKESAQDAAESCPVDAIMVR------------------------(1) --------MSIKIDLNKCVGCQKCINICPGSLIDKNNDGKAYIKYPKDCWGCTACLKECKFKAIKYFLGADIGGNGSYMYVSEKGEELEWHMINED
(1) MGVATMVTDKYQKCIDACNRCSQACYECFKACLNEPDVNARRTCISILFECAQMCQMSSALMSMDAQFAIDHCKLCSVICDKCAQECSMFQDPHCQ
Figure 53 : Alignement des 5 séquences de ferrédoxines décelées dans le génome de C. acetobutylicum avec la
ferrédoxine de C. pasteurianum.
(Algorithme d’alignement multiples et matrice Blosum62)
Parmi les ferrédoxines identifiées : la CAC3527 présente des caractéristiques
intéressantes. Son taux d’homologie avec la CAC0303 est relativement élevé avec près de
38% de similarité ce qui en fait la ferrédoxine de C. acetobutylicum la plus proche de la
CAC0303 et de la ferrédoxine de C. pasteurianum. Elle présente cependant des
caractéristiques atypiques avec un pI très élevé de 8,6 dû à sa composition en acides aminés
basiques. Cette particularité est singulière chez les clostridies qui présentent généralement des
pI très proches de 3,5 – 4 ce qui en fait des protéines très acides.
193
Chapitre VII
Cette propriété la rapproche de la ferrédoxine de M. jannaschii Mjwt et plus généralement des
autres ferrédoxines de ce microorganisme qui présentent toutes un pI très élevé (tableau 16).
La ferrédoxine CAC3527 présente également une meilleure homologie de 33% avec la
ferrédoxine Mjwt que la ferrédoxine CAC0303.
Microorganisme
Rhobacter capsulatus
Methanococcus jannaschii
Pyrococcus furiosus
Methanococcus jannaschii
Chromatium vinosum
Clostridium pasteurianum
Ferrédoxine
CAC 0105
CAC 0075
FdxA
Clusters
[Fe-S]
estimé
105
115
112
77
67
66
62
58
82
56
56
8,39
5,59
4,29
8,92
3,85
7,68
4,02
8,6
3,98
3,57
3,62
2x[4Fe-4S]
2x[4Fe-4S]
2x[4Fe-4S]
Mjwt
2x[4Fe-4S]
FdxA
2x[4Fe-4S]
Mj∆
2x[4Fe-4S]
CAC 3621
CAC 3527
FdxA
FdxA
CAC 0303
Nombre
de
résidus
1x[4Fe-4S]
2x[4Fe-4S]
2x[4Fe-4S]
2x[4Fe-4S]
2x[4Fe-4S]
pI
Caractérisée
% Homologie /
Fdx CAC 0303
putative
putative
oui
cette étude
oui
cette étude
putative
cette étude
oui
oui
cette étude
14,40%
15,40%
25,00%
26,00%
29,90%
30,30%
33,90%
37,90%
38,60%
95,16%
100,00%
Tableau 16 : Caractéristiques principales des ferrédoxines de C.acetobutylicum, de M. jannaschii et de plusieurs
microorganismes classées selon leur degré d’homologie avec la ferrédoxine CAC0303.
Le pI a été estimé par compilation des pI de chaque acide aminé de la séquence. Le degré d’homologie à été
évalué par alignement multiple (matrice blosum 62)
L’analyse des séquences a montré que la proline conservée qui complète habituellement le
motif (CxxCxxCxxxCP) a été conservée dans les deux motifs de la ferrédoxine CAC0303,
mais seulement dans le deuxième motif de la ferrédoxine CAC3527. Les expériences de
mutagénèse sur la ferrédoxine de C. pasteurianum ont prouvé que la proline trouvée dans le
cluster [Fe-S] stabilise fortement le site actif mais ne joue pas un rôle essentiel dans le
mécanisme du transfert d'électrons avec les partenaires redox (Quinkal et al., 1996).
La ferrédoxine CAC3527 présente deux motifs parfaitement conservés correspondant à
des clusters de quatre cystéines. Cette ferrédoxine est prédite comme étant de la forme
2x[4Fe-4S].
Les autres ferrédoxines clostridiales présentent des caractéristiques sensiblement très
éloignées des ferrédoxines clostridiales type, avec un seul cluster [4Fe-4S] identifié pour la
CAC3621 et un degré d’homologie de la séquence très faible (<15% par rapport à la
ferrédoxine de C. pasteurianum) pour les ferrédoxines CAC0075 et 0105 ainsi qu’une
194
Chapitre VII
extension très importante de leur partie C-terminale (entre 52 et 45 acides aminés). Plusieurs
ferrédoxines présentant une petite extension d'acides aminés en C-terminal ont été
précédemment rapportées chez Synechococcus (8 résidus, Cozens 1987), Bacillus
thermoproteolyticus (10 résidus, Kutty et Bennett, 2007) et Chromatium vinosum (21 acides
aminés, (Kyritsis et al., 1997)). Une longue extension N-terminale de 187 acides aminés a été
récemment rpportée chez la polyferredoxin EFR1 de C. acetobutylicum. Le rôle de cette
extension N-terminale de EFR1 n’est pas clair (Kutty et Bennett, 2007) tandis que les hélices
α en C-terminal de la ferrédoxine de C. vinosum contribuent à l’abaissement du potentiel
d’oxydoréduction du centre [Fe-S] à proximité (Kyritsis et al., 1997)
Nous avons donc également retenu la ferrédoxine CAC3527 de C. acetobutylicum en sus de la
ferrédoxine CAC0303 pour notre étude d’interaction avec l’hydrogénase de ce même
microorganisme.
Les ferrédoxines retenues pour cette étude sont donc les ferrédoxines 2x[4Fe-4S] de
C. acetobutylicum CAC0303 et CAC3527 et la ferrédoxine 2x[4Fe-4S] de M. jannaschii que
nous étudierons dans deux configurations, native : nommée Mjwt et délétée de la séquence
C-terminale basique : nommée Mj∆ (figure 54).
Fdx Mj wt
Fdx Mj delta
Fdx CAC 3527
Fdx CAC 0303
(1)
(1)
(1)
(1)
(1)
1
10
20
30
40
50
60
77
MAVEIIVDREKCIGCGRCYDVCPKGPLIWTKDENGKYYAYDVEYCHNCKFCAGRCPTNAILIKVVKPKKKDENKNKK
MAVEIIVDREKCIGCGRCYDVCPKGPLIWTKDENGKYYAYDVEYCHNCKFCAGRCPTNAILIKV--------------MPRRINKLDCVGCGTCQRVCIVGCITQEKDRKR---LINESACVDCGACQYACPKKCISEH----------------MAYKITDACVSCGSCASECPVSAISQGDTQFV----IDADTCIECGNCANVCPVGAPVQE--------------
Figure 54 : Alignement des ferrédoxines retenues pour cette étude.
Les deux clusters [Fe-S] sont formés de 4 cystéines chacun (indiquées par des flèches noires).
195
Chapitre VII
3. Production hétérologue des ferrédoxines CAC0303 /
CAC3527 de C. acetobutylicum et Mjwt et Mj∆ de M. jannaschii
Les 4 ferrédoxines retenues ont été clonées puis exprimées selon une stratégie
d’expression hétérologue chez E. coli et de reconstitution in vitro des centres Fe-S afin
d’obtenir en aval une protéine complète et fonctionnelle.
3.1 Constructions plasmidiques
Une stratégie d’expression chez E. coli par le vecteur pET21c a été retenue pour
l’expression des ferrédoxines et ainsi que la purification sur une colonne d’affinité de type
Streptactin SuperFlow via l’étiquette Strep-tagII de la ferrédoxine exprimée.
Nous avons donc amplifié par PCR (voir Matériel et Méthodes section 7) à partir de l’ADN
génomique de chacun des deux microorganismes, les séquences correspondantes aux ORF des
ferrédoxines retenues. Les séquences des ferrédoxines ont été clonées dans le vecteur
d’expression chez E. coli pET21c sous le contrôle du promoteur T7 et en fusion
traductionnelles avec le Streptag II (voir figure 55).
Les 4 vecteurs d’expression obtenus sont :
- pET21cMjwtCtag et le pET21cMJ∆Ctag pour respectivement la ferrédoxine de M. jannaschii
et sa forme tronquée de sa séquence C-terminale basique.
- pET21cCAC0303Ctag et le pET21cCAC3527Ctag pour les deux ferrédoxines de C.
acetobutylicum.
196
Chapitre VII
la c operator
T7 promote r
Ferredoxine MJw t (159)
Streptag II
ApaLI (5009)
EcoRI (418)
HindIII (437)
lac I
Ava I (452)
His ta g
T7 te rm ina tor
f1 origin
pET21cFdMJc
ApaLI (1328)
5659 bp
bla (Ap) se que nc e
Pst I (1758)
ApaLI (3074)
ApaLI (2574)
ColE 1 pBR3 22 origin
Figure 55 : Carte du vecteur d’expression retenu pour l’expression de la ferrédoxine Mjwt.
3.2 Production des ferrédoxines chez E. coli
Les quatre vecteurs d’expression ont ensuite été introduits dans la souche E. coli BL21
(DE3) (Codon-plus). Il a été nécessaire de recourir au plasmide Codon-plus afin de
compenser la présence de 5 codons rares dans la séquence de la CAC3527 et de 3 codons
rares dans celles de Mjwt et Mj∆ pendant l’expression, afin d’obtenir des rendements de
production plus importants (résultats non détaillés).
3.2.1 Expression des ferrédoxines
L’expression des ferrédoxines est réalisée à 30°C à partir de la souche E. coli BL21
(DE3) (pET21cTag, pCodonplus) dans du LB supplémenté avec du FeCl3, après induction à
197
Chapitre VII
une DO de 1.0 avec 1 mM d’IPTG pendant 3 heures à 30 °C. Les cellules sont ensuite
centrifugées puis cassées afin de séparer la fraction soluble de la fraction insoluble (voir
Matériel et Méthodes chapitre V section 8).
L’analyse du surnageant de cassage et de la fraction insoluble (culot) sur gels SDS-PAGE et
Western-blots a permis de mettre en évidence une grande hétérogénéité dans le profil
d’expression des 4 ferrédoxines.
•
Expression des ferrédoxines Mjwt et Mj∆
On constate que les ferrédoxines Mjwt et Mj∆ se retrouvent en très grande majorité dans
la fraction insoluble de l’extrait cellulaire (figure 56). Leur profil d’expression est identique
avec une quantité très importante de ferrédoxine visible sur gel SDS-PAGE coloré au bleu de
coomassie et sur western-blot au niveau de la piste correspondant au culot de cassage, ce qui
démontre la présence de corps d’inclusion. La quantité de ferrédoxines Mjwt et Mj∆ dans la
fraction soluble est par contre très faible et insuffisante pour envisager une série d’études
biochimiques de ces protéines par la suite à partir de cette fraction.
M
S
C
S
C
100
70
55
40
35
25
15
Figure 56 : Expression de la ferrédoxine Mjwt chez E. coli BL21 (DE3) (pCodon-plus).
Gel SDS-PAGE à 15% coloré au bleu de coomassie et Western-blot correspondant.
La détection par spectrophotométrie à 390nm de centres Fe-S n’a pu être réalisée compte-tenu
de la présence d’agrégats de protéines. Un protocole de resolubilisation des corps d’inclusion
a donc été mis au point afin de dissoudre cet agrégat, suivie d’une reconstitution des centres
[4Fe-4S].
198
Chapitre VII
•
Expression de la ferrédoxine CAC0303
Le profil d’expression de la ferrédoxine CAC0303 est totalement différent car il nous a
été impossible dans un premier temps de mettre en évidence la ferrédoxine par analyse SDSPAGE et même par western-blot. La fonctionnalité du vecteur a été validée par une
purification directe par chromatographie d’affinité à partir du surnageant de cassage ; ainsi il
nous a été possible de mettre en évidence par Western-blot une très petite quantité de
ferrédoxine CAC0303 purifiée. L’expression du vecteur pET21cCAC0303 produit une
protéine de fusion de 7 kd, qui migre à une taille d’environ 14 Kd (figure 57). Il semble que
pour des tailles aussi faibles, la migration de cette protéine fortement chargée négativement ne
soit plus représentative de sa taille réelle. Le marqueur de taille n’est donc présent ici qu’à
titre d’indicateur.
M
S
C
Fnr
E2
E3
E4
100
70
55
40
35
25
15
Figure 57 : Purification par chromatographie d’affinité de la ferrédoxine CAC0303 chez E. coli BL21 (DE3)
(pCodonplus).
Western Blot sur gel à 15 %. Pistes C : Culot de cassage, S : surnageant de cassage, Fnr : fraction non retenue
sur la chromatographie d’affinité, E2 – E4 fractions d’élution.
La faible proportion de résidus aromatiques dans la séquence de la ferrédoxine CAC0303 la
rend, de plus, difficilement visible sur gel SDS-PAGE coloré au bleu de coomassie.
Une faible production de ferrédoxine a été également rapportée, dans le cadre de
l’expression hétérologue chez E. coli de la ferrédoxine de C. pasteurianum (Davasse &
Moulis, 1992), ferrédoxine très proche de la CAC0303 avec 95% d’homologie de séquences.
199
Chapitre VII
Davasse a mis en évidence la dégradation importante de la protéine pendant son expression
dans la cellule comme la principale cause de ce phénomène (Davasse & Moulis, 1992). La
surproduction d’une ferrédoxine soluble telle que la CAC0303 chez E. coli la rend très
sensible à la dégradation par des protéases intra-cellulaires. Cette dégradation a lieu si
rapidement que les centres [4Fe-4S] n’ont pas le temps d’être insérés dans la protéine afin de
stabiliser la structure (Davasse & Moulis, 1992).
Nous avons cependant réussi à obtenir une amélioration significative de la quantité de
ferrédoxine CAC0303 produite et récupérable en portant la concentration en FeCl3 dans le
milieu de culture à 500 µM (au lieu de 25µM). La présence d’une grande quantité de fer
accessible favorise probablement l’insertion de celui-ci dans les clusters Fe-S de la CAC0303
et accélère la stabilisation de la protéine qui est alors moins sujette à la dégradation.
Ces conditions ont donc été retenues pour la production de la ferrédoxine CAC0303 et
permettent d’obtenir en moyenne 2 mg de ferrédoxine purifiée / litre de culture. Lorsque le
rapport d’absorbances R = A280nm/A390nm de la ferrédoxine CAC0303 produite dans ces
conditions est supérieur à 0.65, la qualité de la ferrédoxine est considérée comme satisfaisante
(avec un optimum autour de 0.8). Cependant, ce rapport R est très souvent inférieur à 0,5 à
l’issue de la production/purification. Il est donc nécessaire de réaliser une reconstitution de la
ferrédoxine CAC0303 afin d’obtenir un rapport R proche de 0,8.
•
Expression de la ferrédoxine CAC3527
Il est intéressant de constater que le profil d’expression de la ferrédoxine CAC3527 est
sensiblement le même que celui des ferrédoxines Mjwt et Mj∆ bien que la quantité globale de
ferrédoxine soit nettement moindre (figure 58).
200
Chapitre VII
M
C
S
130
100
70
55
40
35
25
15
10
Figure 58 : Expression de la ferrédoxine CAC3527 chez E. coli BL21 (DE3) (pCodon-plus).
Gel SDS-PAGE à 15%. Coloration au bleu de coomassie. Pistes C : Culot de cassage, S : surnageant de cassage.
La présence de corps d’inclusion dans la fraction insoluble et la très faible quantité de
ferrédoxine soluble nous ont conduit à suivre la même procédure que pour les ferrédoxines de
M. jannaschii avec une resolubilisation de cette fraction insoluble suivie par une
reconstitution chimique et une purification finale.
3.2.2 Discussion
L’expression des ferrédoxines est rendue délicate par un certain nombre de leurs
caractéristiques propres : leur taille réduite, leur composition en acides aminés (chargées
positivement ou négativement) et leur nécessité d’incorporer leur centres Fe-S afin d’acquérir
une conformation tridimensionnelle stable. L’expression de gènes de petite taille provoque
généralement des problèmes de stabilisation des ARNm et de la protéine neosynthétisée dans
le cytoplasme de la bactérie (Davasse & Moulis, 1992), ce qui entraîne généralement un
rendement de purification de la protéine d’intérêt faible.
Comme nous avons pu le constater, la composition en acides aminés induit des changements
radicaux du profil d’expression des ferrédoxines. La ferrédoxine clostridiale CAC0303 au pI
de 3,6 et fortement chargée négativement est très soluble même avec une insertion partielle et
est sujette à une forte dégradation dans le cytoplasme chez E. coli. A contrario, les
ferrédoxines de M. jannaschii et la ferrédoxine CAC3527 de C. acetobutylicum sont
fortement chargées positivement (pI respectifs de 7,6, 8,9 et 8,6), elles sont totalement
201
Chapitre VII
insolubles et leur expression chez E. coli provoque l’apparition de corps d’inclusion. La
formation de ces agrégats entraîne l’accumulation d’une grande quantité de ferrédoxine
insoluble dans le cytoplasme de la bactérie et la rend peu accessible à la dégradation par des
protéases cellulaires. La quantité de ferrédoxine CAC3527 reste cependant plus faible que
celles des ferrédoxines du méthanogène.
La production d’une ferrédoxine complète (holoferrédoxine) et fonctionnelle chez une
bactérie telle que E. coli, dépend de l’incorporation des centres métalliques dans le
cytoplasme de la bactérie. Seule la ferrédoxine CAC0303 semble avoir la possibilité
d’incorporer des centres Fe-S de manière naturelle à l’intérieur de la cellule. La surproduction
de cette ferrédoxine ne permet cependant pas une incorporation suffisante des centres [4Fe4S] et nécessite le recours à une reconstitution in vitro afin d’atteindre un rapport
d’absorbances A280nm/A390nm élevé (0,6 à 0,8).
La formation d’agrégats suite à l’expression des ferrédoxines Mjwt, Mj∆ et CAC3527 a
nécessité une solubilisation de ces corps d’inclusion suivie par une reconstitution chimique in
vitro des centres [4Fe-4S] afin d’obtenir ces holoferrédoxine purifiées et solubles.
3.3 Solubilisation des corps d’inclusion
Il est possible de récupérer la majeure partie d’une protéine produite sous forme de
corps d’inclusion par une solubilisation à l’aide d’un agent chaotropique à forte concentration.
Nous avons mis au point un protocole de solubilisation des corps d’inclusion issus de
l’expression des ferrédoxines Mjwt, Mj∆ et CAC3527 (voir matériel et méthodes section 8.4.2).
Ce protocole utilise différents traitements (urée à basse concentration couplée à un détergent)
visant à débarrasser les corps d’inclusions des débris cellulaires et autres impuretés, puis à les
solubiliser par un agent chaotropique (urée à 8M).
La solution obtenue contient en grande majorité (94%) de l’apoferrédoxine et quelques autres
protéines cellulaires dénaturées (figure 559). Ce protocole a été appliqué avec succès aux
ferrédoxines Mjwt, Mj∆ et CAC3527 et permet de solubiliser une grande partie des
ferrédoxines produites sous la forme d’agrégats dans la cellule.
202
Chapitre VII
M
S
C
Lav1 Lav2 Lav3
Rs1/2 Rs1/1
130
100
70
55
40
35
25
15
10
Figure 59 : Resolubilisation de la ferrédoxine de Mjwt.
Gels SDS-PAGE 15%, coloration au bleu de coomassie. Pistes C : Culot de cassage, S : surnageant de cassage,
Lav1-3 : fractions de lavage éliminées, Rs : fraction de ferrédoxine solubilisée.
Cette méthode constitue donc une étape de pré-purification efficace de l’apoferrédoxine avant
la reconstitution
in vitro des centres [4Fe-4S] afin d’obtenir une holoferrédoxine à la
structure native.
3.4 Reconstitution des centres [4Fe-4S]
Le protocole de reconstitution chimique des centres [4Fe-4S] des ferrédoxines mis au
point au cours de cette étude est basé sur la technique de Feinberg (Baur et al., 1990; Feinberg
et al., 1997; Smith et al., 1991), elle-même dérivée du protocole de Rabinowitz (Hong &
Rabinowitz, 1967; Malkin & Rabinowitz, 1966; Rabinowitz, 1972).
Cette reconstitution consiste en la synthèse chimique de centres [4Fe-4S] in vitro dans un
environnement très réducteur suivie d’une renaturation de l’apoferrédoxine en présence de ces
centres synthétiques afin de former une holoferrédoxine complète et fonctionnelle (voir
protocole Chapitre Matériel et Méthodes section 9.1). Les conditions de réduction et les
concentrations en S et Fe élevées favorisent la formation de complexes Fe-S complexes dont
une partie de centres [4Fe-4S] qui donne à la solution une coloration brune caractéristique
(forte absorbance à 390nm).
Cette technique est adaptée à la reconstitution de protéines comportant uniquement des
centres [4Fe-4S]. Les ferrédoxines possédant des centres de type [3Fe-4S] (Armengaud et al.,
203
Chapitre VII
1995; Armengaud & Jouanneau, 1995) sont difficiles à reconstituer in vitro par cette méthode.
La reconstitution chimique ne permet pas en effet de contrôler la cinétique d’insertion des
centres Fe-S au sein d’un cluster CxxCxxCxxxC.
Le protocole a été appliqué aux ferrédoxines Mjwt, Mj∆ et CAC3527 directement après
leur solubilisation finale à l’urée. La ferrédoxine exprimée et soluble dans le surnageant de
cassage ont subi une première purification d’affinité. Elle a ensuite été dénaturée et réduite
totalement par un traitement à l’urée 4M, Tris 0,1 M pH 8,0, DTT 10mM avant d’entrer dans
le protocole de reconstitution (voir Matériel et Méthodes section 9.1). Ce traitement dénature
également complètement les ferrédoxines présentant partiellement ou totalement des centres
[Fe-S] et homogénéise la solution d’apoferrédoxine avant la reconstitution.
L’étape de reconstitution permet la formation de centres [4Fe-4S] en excès par rapport à
l’apoferrédoxine avec un rapport théorique optimal déterminé expérimentalement de 3 centres
[4Fe-4S] formés pour 1 cluster de cystéines. La formation des centres et leur insertion se fait
progressivement par exposition des clusters de cystéines réduites et par un repliement de la
chaîne polypeptidique autour des centres métalliques. L’élimination progressive de l’agent
chaotropique par dialyse permet de stabiliser les holoferrédoxines dans cet état. A l’issue de la
reconstitution, les ferrédoxines doivent être purifiées (piste Rc, figure 60 page suivante) afin
d’éliminer les protéines contaminantes et les différentes molécules Fe-S formées pendant la
réaction.
La purification finale est réalisée par chromatographie d’affinité sur support Streptactin et
permet d’obtenir une ferrédoxine reconstituée pure (piste E2 et E3, figure 60) à plus de 99%
(estimation Image J®, voir Matériel et Méthodes chapitre V section 10.3.2).
204
Chapitre VII
M
Rs1/1 Rc Fnr
E1
E2
E3
M
Rs1/1 Rc Fnr
E1
E2
E3
130
100
70
55
40
35
25
15
10
Figure 60 : Dernières étapes de resolubilisation, dialyse et purification par chromatographie d’affinité de la
ferrédoxine Mj wt
Gel SDS-PAGE, coloration bleu de coomassie et Western-blot. Pistes Rs : fraction solubilisée, Rc : fraction
reconstituée, Fnr : fraction non retenue à l’étape de chromatographie d’affinité, E1-3 : fractions d’élution.
La pureté des ferrédoxines reconstituées obtenues a été vérifiée sur gel SDS-PAGE par
une coloration au bleu de coomassie et/ou par une coloration à l’argent (gel C, figure 61 page
suivante). Les ferrédoxines clostridiales (pistes CAC3527 et CAC0303) apparaissent sous la
forme d’un doublet sur le gel B (figure 61) en raison d’une dénaturation insuffisante de
l’échantillon avant migration sur gel. L’incubation des échantillons de ferrédoxines avec 20
mM de DTT pendant la phase de dénaturation thermique a permis d’obtenir une seule bande
nette de protéine (exemple de la ferrédoxine CAC0303, gel C, figure 61).
205
Chapitre VII
Gel B
Gel A
M
∆
Mj
M
wt
Mj
3527
130
100
70
55
40
35
Gel C
0303
M
0303
55
40
35
25
25
15
15
10
10
Figure 61 : Gels de comparaison des différentes ferrédoxines reconstituées et purifiées au cours de cette étude.
Gel A : Ferrédoxine Mj, coloration au bleu de coomassie ; Gel B : Ferrédoxine Mjwt, CAC3527 et CAC0303
coloration au bleu de coomassie ; Gel C : protocole de dénaturation au DTT 20mM et coloration du gel à
l’argent colloïdal.
Une estimation rapide de la qualité de la reconstitution peut s’effectuer par spectrométrie
UV/visible en évaluant le rapport R = Abs390nm / Abs280nm. Les centres [4Fe-4S] absorbent
spécifiquement à une longueur d’onde comprise entre 420 et 390 nm. La valeur de 390 nm est
généralement retenue pour l’observation de ces centres par spectrométrie optique. Le spectre
d’absorption (figure 62) d’une solution de ferrédoxine comporte un profil caractéristique de la
présence d’holoferrédoxine, formé d’un pic d’absorbance étalé à 390 nm et d’un pic très net à
280nm (absorption du polypeptide).
206
390 nm
280 nm
Chapitre VII
Figure 62 : Spectre d’absorption des ferrédoxines Mjwt (courbe rouge) et Mj∆ (courbe noire).
La mesure de l’absorbance à 280nm d’une protéine étant très dépendante de la composition en
acides aminés aromatiques, celle-ci peut varier considérablement d’une ferrédoxine à une
autre.
Le rendement de reconstitution est « très » approximativement (calibré à partir de la
ferrédoxine de C. pasteurianum) de l’ordre de 75 % (varie en fonction de la ferrédoxine)
lorsque le rapport R est compris entre 0,6 et 0,8 (chiffres établis sur la ferrédoxine de
C. pasteurianum (Davasse & Moulis, 1992)), le rapport sera un peu plus faible pour les
ferrédoxines de M. jannaschi pour un même taux de reconstitution compte tenu de la richesse
de leur séquence en acides aminés aromatiques (qui tend à biaiser le rapport R par une
absorbance à 280 nm plus élevée). Un calcul du taux de reconstitution est réalisé de manière
plus précise par un dosage de la concentration en Fe dans les ferrédoxines reconstituées par
anlyse ICP-MS couplé à la caractérisation de la nature des centres Fe-S par RPE et
Voltamétrie.
3.4.1 Stabilité et conservation des ferrédoxines reconstituées
Stabilité et conservation :
Les ferrédoxines reconstituées de M. jannaschii et les CAC 3527/0303 de
C. acetobutylicum ont pu être conservées plusieurs jours à 4°C ou 5 h à 20°C dans un tampon
réducteur (DTT à 2mM) en fiole sertie (aucune perte d’absorbance à 390nm significative n’a
pu être constatée). Les ferrédoxines Mjwt, Mj∆ et CAC0303 peuvent être conservées à -20°C
mais subissent une perte d’absorbance à 390nm variable (de l’ordre de 10%) à chaque cycle
de congélation/décongélation. La ferrédoxine CAC3527 s’est montrée particulièrement
207
Chapitre VII
sensible à la décongélation avec une perte d’absorbance à 390 nm pouvant atteindre 80% dans
certains cas. Cette ferrédoxine a donc été préparée le plus souvent extemporanément et
conservée à 4°C avant utilisation.
Thermostabilité :
Nous avons évalué la stabilité à haute température des ferrédoxines Mjwt et Mj∆ par
incubation d’un échantillon à différentes températures dans un environnement réducteur et
dépourvu d’oxygène par un suivi de l’absorbance à 390nm (Forget, 1982; Yang et al., 1977a).
Les résultats obtenus nous ont permis d’observer une perte d’environ 13 % de l’absorbance
après 1 heure d’incubation à 50°C et d’environ 22 % à 70°C pour la ferrédoxine Mjwt (tableau
16). Il est intéressant d’observer que les valeurs obtenues pour la ferrédoxine Mj∆ sont très
proches de celles obtenues pour la ferrédoxine WT avec environ 15 % de perte d’absorbance à
50°C après 1h d’incubation et environ 22 % à 70°C.
Il n’a pas été possible d’observer la thermostabilité à 85°C (température naturelle de M.
jannaschii) dans des conditions d’anaérobiose satisfaisante en raison de limitations
techniques.
La stabilité des ferrédoxines de C. acetobutylicum CAC0303 et CAC3527 à haute température
n’a pas été testée au cours de cette étude.
Ferredoxines 2x[4Fe-4S]
Fdx Mj
T°opt de
croissance du
microorganisme
wt
85°C
∆
85°C
65°C
50°C
Fdx Mj
1
Fdx M. thermolithotrophicus
2
Fdx M. thermophila
3
Fdx C. pasteurianum
Fdx C. thermoaceticum2
T°
d'incubation
Dénaturation
Abs390nm à
(% Abs390nm à t0)
t0
1 h d'incubation
70°C
70°C
0,108
0,87
77,8
80,5
70°C
70°C
-
90 (30 min)
91
35°C
60°C
80°C
80°C
-
44
89
100°C
95°C
-
90 (24h)
Ferredoxine [3Fe-4S][4Fe-4S]
4
Fdx P. furiosus
Tableau 17 : Analyse de la dénaturation à haute température des ferrédoxines de M. jannaschii reconstituées par
suivi de l’absorbance à 390nm.
1
Données de Yang et al., 1977. 2Données Terlesky & Ferry, 1988, 3Données Hatchikian et al., 1989, 4Données
Aono et al., 1989.
208
Chapitre VII
En guise de témoin de comparaison, les données de thermostabilité des ferrédoxines 2x[4Fe4S] de C. pasteurianum et de C. thermoaceticum ont été utilisées (Yang et al., 1977a).
Les deux ferrédoxines de M. jannaschii reconstituées présentent une stabilité
comparable à 70°C. Ne disposant pas d’un échantillon de ferrédoxine native issue de M.
jannaschii, il ne nous est pas possible d’établir une comparaison directe entre un échantillon
reconstitué et un échantillon natif. La comparaison avec les données de la littérature pour des
ferrédoxines thermostables 2x[4Fe-4S] (Aono et al., 1989; Forget, 1982; Hatchikian et al.,
1989; Terlesky & Ferry, 1988; Yang et al., 1977a) nous indique que les valeurs obtenues pour
les ferrédoxines de M. jannaschi sont globalement du même ordre. Néanmoins, on constate
que les valeurs mesurées restent toutefois plus faibles d’environ 9 % que celles des
ferrédoxines de thermophiles et d’hyperthermophiles. Une différence de thermosensibilité
importante de près de 50 % à 70°C (tableau 17) sépare les ferrédoxines de M. jannaschii
reconstituées de la ferrédoxine mésophile de C. pasteurianum et permet de positionner
clairement les ferrédoxines Mjwt et Mj∆ dans le groupe des ferrédoxines thermostables. Cette
observation serait néanmoins à confirmer ultérieurement par une comparaison directe avec la
ferrédoxine Mjwt purifiée directement à partir du microorganisme.
Nous avons pu établir également que la stabilité de la ferrédoxine Mj∆ n’était pas affectée par
la délétion de l’extrémité C-terminale basique.
3.4.2 Reconstitution des ferrédoxines : Conclusion et Discussion
Le protocole d’expression / reconstitution mis au point au cours de cette étude a permis
l’obtention de ferrédoxines reconstituées pures (figure 63) et de bonne qualité (rapport
d’absorbances RA390nm
/ A280nm
compris entre 0,58 et 0,82, tableau 18). Les ferrédoxines
obtenues sont stables en solution et l’optimisation des rendements de reconstitution et de
purification a permis d’obtenir les quantités nécessaires à l’étude biochimique de l’interaction
entre ces ferrédoxines et l’hydrogénase de C. acetobutylicum.
209
Chapitre VII
Ferrédoxine
Compartiment
cellulaire de
production
Rendement
d'expression
(mg de Fdx/ litre
de culture)
corps
d'inclusion
4-6
Mj∆
corps
d'inclusion
4-6
CAC3527
corps
d'inclusion
2-4
CAC0303
soluble
(surnageant)
2
Mj
wt
ere
1
étape
Solubisation
corps
d'inclusion
Solubisation
corps
d'inclusion
Solubisation
corps
d'inclusion
Purification
directe par
affinité
(mg/ml)
Ratio
A390 /
A280
oui
1,2
0,66
oui
1,5
0,6
oui
0,4
0,58
oui
0,65
0,82
Reconstitution
Purification
d'affinité
Tableau 18 : Récapitulatif des résultats de la purification/reconstitution des ferrédoxines utilisées au cours de
cette étude : Mjwt, Mj∆ et CAC3527 et CAC0303.
L’approximation de la qualité de la reconstitution d’une ferrédoxine par la mesure du
rapport R=A390nm / A280nm est un indicateur expérimental simple et rapide. Cependant, il ne
permet pas de connaître précisément la proportion réelle d’holoferrédoxine de type 2x[4Fe4S], ni la présence éventuelle d’autres espèces partiellement reconstituées pouvant interférer
lors de tests biochimiques. Une série d’études biophysiques permettant d’analyser la nature et
la proportion des centres métalliques dans les ferrédoxines reconstituées a donc été réalisée.
4. Analyses biophysiques des ferrédoxines reconstituées
L’ensemble des analyses biophysiques des ferrédoxines étudiées au cours de ce travail
ont été réalisées en collaboration avec l’équipe du laboratoire de Bioénergétique et
d’Ingénierie des Protéines du Professeur Bruno Guigliarelli au CNRS de Marseille.
4.1.1 Titrage potentiométrique suivi par spectrométrie Uv-Visible
Le titrage potentiométrique couplé à la spectroscopie optique de type Uv-Visible permet
de déterminer le potentiel d’oxydoréduction des centres [4Fe-4S] en suivant spectralement la
variation d’absorbance à une longueur d’onde donnée (420nm dans le cas présent) en fonction
du potentiel d’oxydoréduction de la solution de ferrédoxine (Chapitre V section 10.4.4). La
réduction progressive des centres [4Fe-4S] par l’agent réducteur (l’hydrosulfite de sodium)
entraîne une diminution de l’absorbance à 420 nm de la ferrédoxine (figure 63 A).
210
Chapitre VII
A
B
4,0
IntensityFeSMut
Nernstred simulation
3,5
integrated intensity (a. u.)
3,0
2,5
Amax = 3,5 (+0,3 ; -0,3)
E = -500 mV (+/- 20mV)
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
-0,5
-700 -650 -600 -550 -500 -450 -400 -350 -300 -250 -200 -150 -100
E (mV vs NHE)
Figure 63 : Exemple de titration potentiométrique de la ferrédoxine de Mjwt A : Evolution du spectre
d’absorption de la solution de ferrédoxine pendant la réduction des centres [4Fe-4S] et suivi de l’absorbance à
420nm B : Courbe de suivi du potentiel d’oxydoréduction de la solution de ferrédoxine (fonction de type
Nersnt).
Les résultats obtenus (tableau 19) montrent tout d’abord que les ferrédoxines Mjwt et Mj∆
possèdent un potentiel d’oxydoréduction très bas de l’ordre de -500 mV. La différence de 20
mV mesurée entre ces deux ferrédoxines n’est pas significative (du même ordre que l’erreur
expérimentale). Aucune influence de la délétion C-terminale sur le potentiel d’oxydoréduction
n’a pu être constatée à ce stade de l’étude.
Ferrédoxine
Potentiel d'oxydoréduction
(déterminé par titrage optique)
+/- 20 mV
Mjwt
- 480 mV
∆
- 500 mV
Mj
wt
∆
Tableau 19 : Potentiels d’oxydoréduction mesurés par titrage optique des ferrédoxines Mj et Mj reconstituées.
4.1.2 Résonance paramagnétique électronique (RPE)
Ferrédoxine CAC0303
La titration potentiométrique de la ferrédoxine CAC0303 suivie par spectroscopie
UV/Visible a permis de mettre en évidence la présence de centres [4Fe4S]2+/1+ dont les
signaux montrent généralement deux états redox (figure 64 A) : état oxydé (pas de signal en
211
Chapitre VII
EPR) et état réduit (paramagnétique S = 1/2). Dans l’échantillon natif (E ~ 0 mV versus
NHE), aucun signal n’a pu être détecté.
Pour un potentiel inférieur à - 300 mV, un signal à g = 2.064, 1.931 est visible. Ce signal est
caractéristique d’un centre [4Fe4S]1+ isolé magnétiquement (spectre de la ferredoxine
monoréduite). Des signaux supplémentaires à g = 2.009 et 1.971 sont également visibles et
proviennent d'une population mineure de ferrédoxines dans lesquelles les deux centres
[4Fe4S]1+ sont réduits et couplés par interaction magnétique de type spin-spin (ferredoxine bireduite). Dans les échantillons portés à plus bas potentiel (figure 64 A, signal à -506 mV), la
ferrédoxine est complètement réduite, la proportion de ferrédoxine mono-réduite diminue et
les spectres RPE sont dominés par le signal d’un couplage magnétique entre deux centres
[4Fe4S]1+.
Aucun signal significatif de centre [3Fe-4S]1+ ni de Fe libre n’a pu être mis en évidence sur
les spectres obtenus.
A
B
as prep + mediators
+1 mV
-304 mV
as prep+ mediator
-57 mV
-349 mV
-398 mV
-383 mV
-453 mV
-443 mV
-491 mV
-486 mV
-506 mV
-500 mV
260 280 300 320 340 360 380 400 420 440
300
B (mT)
400
B (mT)
Figure 64: Spectres RPE des échantillons de ferrédoxines A : CAC0303 B : CAC3527. Conditions :
Température 10 K , Fréquence micro-ondes 9 Ghz, Puissance micro-ondes Mw 1 mW.
Le profil de couplage observé est retrouvé communément chez les ferrédoxines
clostridiales, comme la ferrédoxine 2x[4Fe4S] de C. pasteurianum (Shergill et al., 1996).
L’intégration de l’intensité du signal RPE en fonction du potentiel d’oxydoréduction a permis
212
Chapitre VII
de déterminer le potentiel de réduction de la ferrédoxine. En se basant sur un système de
transfert à un électron, nous avons observé un potentiel de -400 mV en accord avec la mesure
par titration potentiométrique. Ce résultat démontre également que les deux centres [4Fe-4S]
présents dans la ferrédoxine CAC0303 ont des potentiels très proches.
Le spectre RPE de la ferrédoxine oxydée CAC3527 (figure 64, B) n'a montré aucun
signal significatif de la présence de centres de type [3Fe4S]1+. On observe un début de
réduction de la ferrédoxine seulement à partir d’un potentiel très bas de -400mV. Le spectre
RPE correspondant est très peu commun pour des centres de type [4Fe4S]1+. Un tel potentiel a
été observé chez la ferrédoxine 2x[4Fe-4S] de C. vinosum (Kyritsis et al., 1998; Kyritsis et
al., 1999), avec un potentiel d’oxydoréduction de -460 mV pour le cluster n°II et un potentiel
encore inférieur, de -660mV (/ NHE) pour le centre n°I.
L’état le plus réduit de l’échantillon de ferrédoxine CAC3527 a été obtenu à un potentiel de
-500mV. Compte-tenu du potentiel maximal de réduction de l’hydrosulfite de sodium
(-520mV à pH 8.0) il n’a pas été possible techniquement de descendre plus bas en potentiel.
Le spin de cet échantillon et la valeur du potentiel à laquelle la réduction a commencé
démontrent clairement que le potentiel d’oxydoréduction de ce centre est plus faible que la
valeur maximale de -500 mV que nous avons atteinte.
Ferrédoxine Mjwt et Mj∆
Le spectre RPE de la ferrédoxine Mjwt de M. jannaschii (figure 65 A) n’a pas permis la
mise en évidence d’espèces de type [3Fe4S]1+ dans l’échantillon de ferrédoxine testé. La
présence de centres [4Fe4S]1+ est confirmée par le spectre obtenu. La réduction de ces centres
débute à un potentiel bas d’environ -400 mV, tout comme la ferrédoxine CAC3527, mais le
signal obtenu est très différent. Le spectre de l’échantillon le plus réduit montre la présence de
deux centres [4Fe4S]1+ couplés magnétiquement. Le potentiel d’oxydoréduction évalué par
intégration de l’intensité du signal RPE à -500mV (+/-20 mV) confirme la valeur obtenue lors
du titrage potentiométrique de cette ferrédoxine (figure 65 B), de -480 mV (+/-20 mV).
213
Chapitre VII
A
B
Figure 65 : Spectres RPE des échantillons de ferrédoxines A : Mjwt B : Mj∆. Conditions RPE : 10 K , X Band 9
Ghz, Mw 1 mW.
Le spectre RPE de la ferrédoxine Mj∆ délétée de sa partie C-terminale est très proche de celui
de la ferrédoxine native de M. jannaschi. La présence de deux centres [4Fe4S]1+ couplés
magnétiquement est confirmée par le spectre obtenu sur l’échantillon le plus réduit
(- 575mV/NHE). Le potentiel d’oxydoréduction a été évalué à -480mV (+/- 20mV) par
intégration du signal RPE. L’enregistrement du spectre RPE sur une plus grande plage de
champ magnétique a cependant permis de mettre en évidence la présence d’une faible quantité
de Fe libre (signal typique à g =4,3) dans la solution de ferrédoxine. La présence de ce Fe peut
être provoquée par une dégradation partielle d’un centre [4Fe-4S]. L’absence de signal RPE
caractéristique de centres [3Fe-4S] (signal quatre fois plus intense qu’un centre [4Fe-4S] à
quantité égale) permet cependant d’exclure leur présence.
Comparaison et discussion des résultats en RPE
La ferrédoxine CAC0303 montre une valeur de potentiel de - 400 mV très proche de
celui la ferrédoxine de C. pasteurianum avec laquelle elle partage une très haute homologie de
séquences.
Le comportement particulier de la ferrédoxine CAC3527 est à signaler avec un potentiel très
bas, retrouvé chez certaines ferrédoxines atypiques (de type Chromatium vinosum...) mais qui
214
Chapitre VII
n’a jamais été mis en évidence chez une ferrédoxine clostridiale. Il ne nous a pas été possible
de mesurer un potentiel en dessous de -500mV avec les moyens techniques dont nous
disposions (méthode déazaflavine incluse).
La RPE a permis d’obtenir un signal caractéristique des ferrédoxines 2x[4Fe-4S] pour les 4
ferrédoxines étudiées (figure 62). Le spectre de la CAC0303 est caractéristique des
ferrédoxines clostridiales mais celui de la CAC3527 reste très atypique et se rapproche de
celui de la ferrédoxine de Chromatium vinosum (Kyritsis et al., 1998; Kyritsis et al., 1999).
x3
Fd MJ WT
x2
Fd MJ MUT
Fd Cac 0303
x1
Fd Cac 3527
x4
270
300
330
360
390
420
B (mT)
Figure 66 : Récapitulatif et mise à l’échelle des spectres RPE (état réduit maximal) des ferrédoxines utilisées au
cours de cette étude.
L’intensité du spectre est quatre fois moins forte pour la ferrédoxine CAC3527 que pour la
CAC0303. Ceci est à la fois dû à une quantité plus faible de protéine et parallèlement, à une
réduction incomplète de l’échantillon.
Les ferrédoxines de M. jannaschii présentent un potentiel d’oxydoréduction de -500 mV,
nettement plus bas que celui généralement retrouvé chez les ferrédoxines 2x[4Fe-4S] (entre
– 400 mV et -350 mV) (Aono et al., 1989; Forget, 1982; Hatchikian et al., 1989; Yang et al.,
1977a) et chez la ferrédoxine [3Fe-4S][4Fe-4S] de l’hyperthermophile P. furiosus dont le
centre [4Fe-4S] montre un potentiel de (-352 mV) (Aono et al., 1989).
Malgré la délétion de la partie C-terminale basique de la ferrédoxine Mjwt, il n’a pas été
possible d’observer une différence significative dans le spectre RPE de ces deux ferrédoxines.
215
Chapitre VII
Cette partie de la protéine ne semble donc pas être impliquée directement dans
l’environnement électronique des clusters [4Fe-4S].
L’analyse des spectres RPE a permis de mettre en évidence que les ferrédoxines
étudiées étaient toutes du type 2x[4Fe-4S]. Aucune espèce hétérogène de centre Fe-S n’a pu
être mise en évidence par RPE, la forme holoferrédoxine 2x[4Fe-4S] est donc la forme
majoritaire présente dans nos échantillons de ferrédoxines reconstituées.
Des expériences de voltamétrie ont également été réalisées afin de d’affranchir des seuils de
détection de la RPE et de permettre une quantification précise des espèces minoritaires.
4.1.3 Analyse par électrochimie directe des protéines (Protein film
voltammetry, PFV)
Les différentes ferrédoxines étudiées ont été adsorbées sur l’électrode en graphite
pyrolytique et un potentiel d’oxydoréduction cyclique a été imposé à l’échantillon. Le courant
électrique qui transite via la surface d’adsorption des protéines et la solution tampon est
recueilli par une électrode et enregistré sous la forme d’un voltampérogramme (voir Matériel
et Méthodes chapitre V section 10.4.5).
Après son adsorption sur l’électrode en graphite par dépôt d’1µl de solution de
ferrédoxine CAC0303 concentrée et de 1µl de polymyxine sulfate (Leger et al., 2004) un
signal, unique sur la gamme -760mV/+250mV vs SHE, très net a pu être observé sur le
voltampérogramme (figure 67). Le signal est toujours présent lorsque l’électrode est
transférée dans une solution de pH plus faible (pH 4), mais son intensité diminue quelque peu
du fait d’une probable désorption partielle de la protéine par effet pH.
216
Chapitre VII
du pH.
Conditions expérimentales : T = 20°C, v = 100 mV/sec, anaérobiose stricte. Graphe : en trait plein les signaux
bruts et en tirets les signaux après soustraction de la ligne de base.
A partir de l’aire sous les pics, on estime l’ordre de grandeur de la quantité d’électrons
transférés pour oxyder ou réduire complètement la protéine : soit 6 pmol. La largeur à mihauteur des pics est plus large que celle prévue si l’on ne considère qu’un seul centre à un
électron. En effet, on observe une largeur de pic de 120 à 130 mV au lieu des 90 mV attendus,
ce qui suggère un recouvrement des signaux électrochimiques de deux clusters [4Fe-4S] et
confirme les résultats observés par RPE.
Le potentiel de ces deux centres est équivalent et a été mesuré à environ -350 mV à pH 7 (+/15 mV), ce qui reste cohérent avec la valeur observée en RPE à pH 8 de -400 mV. La
variation du pH entraine une diminution progressive de l’intensité du pic (par désorption du
film) et un léger décalage vers les hauts potentiels (de -350 mV à pH 7 à -335 mV à pH 4).
Le décalage des hauts potentiels à différents pH est très faible (au niveau de la limite de
détection avec -5 mV/pH au lieu des – 58 mV/pH à 10 °C attendus) ce qui signifie que la
réduction n’est pas couplée à une protonation spécifique.
Nous n'avons pas pu détecter la signature d’un centre type [3Fe4S] ni dans le spectre de
RPE d’un échantillon oxydé par voltamétrie. A la vue de la qualité des signaux
électrochimiques, une quantité faible (> 5 %) de centres [3Fe4S] aurait été facilement
détectée par la formation d’une paire de pics additionnels. Le premier pic aurait été d’une
largeur d’environ 90 mV et aurait été indépendant du pH dans la gamme de haut-potentiel
tandis que le second pic aurait été deux fois plus grand et étroit et très dépendant du pH a
217
Chapitre VII
faible potentiel (Breton et al., 1995). Aucun des deux centres [4Fe-4S] présents dans la
ferrédoxine CAC0303 ne semble donc dégradé sous une forme [3Fe4S].
Dans le cas de la ferrédoxine CAC3527, même après optimisation de la méthode
d'adsorption (meilleurs signaux sans polymixine) les signaux électrochimiques obtenus étaient
juste au-dessus de la limite de détection. Toutefois, les signaux obtenus (figure 68, ligne noire
et rouge) restent significatifs par rapport à la ligne de base (figure 68, ligne verte). Comme
pour la ferrédoxine CAC0303 la position des pics est peu dépendante du pH (-500 mV à pH 7
et -450 mV à pH 4).
du pH.
Conditions expérimentales T = 20°C, v = 100 mV/sec, anaérobiose stricte. Graphe : en trait plein les signaux
bruts et en tirets les signaux après soustraction de la ligne de base.
La principale constatation est le très bas potentiel d’oxydoréduction mesuré (-500 mV) pour
cette ferrédoxine clostridiale, qui confirme la mesure effectuée en RPE. Compte-tenu de la
faiblesse du signal électrochimique, il est difficile de confirmer les résultats de la RPE sur la
forme 2x[4Fe-4S] de cette ferrédoxine.
Ferrédoxine Mjwt
La ferrédoxine Mjwt étant adsorbée sur l’électrode de graphite sans polymixine selon la
même méthode que les précédentes ferrédoxines, on observe un signal intense unique sur la
gamme -760 mV/+250 mV vs SHE (figure 69, voltampérogrammes gauches). Le signal varie
peu en fonction du pH et son intensité diminue très peu (légère désorption du film de protéine
218
Chapitre VII
par effet pH) ce qui signifie que la réduction n’est pas couplée à une protonation. Selon la
même méthode que précédemment on estime a 0,5-1 pmol la quantité d’électrons transférés
réduisant ou oxydant complètement la protéine. Les deux centres [4Fe-4S] semblent
équivalents et leur potentiel d’oxydoréduction a été mesuré à environ -500 mV et confirme la
mesure effectuée en RPE.
A
B
Figure 69 : Voltampérogrammes obtenus sur des échantillons de ferrédoxines Mjwt (A) et Mj∆ (B).
Conditions expérimentales : T = 5°C, v = 100 mV/sec, anaérobiose stricte. Les voltampérogrammes du haut
montrent le signal brut tandis que ceux du bas montrent le signal après soustraction de la ligne de base.
La largeur à mi-hauteur des pics est d’environ 140 à 150 mV au lieu des 90 mV attendus pour
un seul centre [4Fe-4S]. Ce résultat suggère que les signaux électrochimiques de deux centres
[4Fe-4S] tendent à se superposer au niveau du même pic et confirme les résultats de la RPE
sur la forme 2x[4Fe-4S] de la ferrédoxine de M. jannaschii.
Ferrédoxine Mj∆
La ferrédoxine de M. jannaschii délétée de son extrémité c-terminale a été adsorbée sur
l’électrode au graphite selon les mêmes conditions que la forme sauvage, sans adjonction de
polymixine.
219
Chapitre VII
La différence la plus marquante est la présence, en plus du signal précédent, d’un signal
typique d’un centre [3Fe-4S] dont la signature est très spécifique : 1 pic à un seul électron, à
haut potentiel, et un pic à très bas potentiel dont la position est très dépendant du pH
(-48mV/unité pH, proche des -55mV/unité pH attendus pour un transfert d’autant d’électrons
que de protons), mieux défini et deux fois plus intense que le premier (réduction à 2 électrons)
(Breton et al., 1995).
Le pic à haut potentiel correspond au couple 3Fe(+/0) et celui de bas potentiel au couple
3Fe(0/2-) couplé au transfert de deux protons. Nous avons pu vérifier que pour un pH bas, son
intensité intégrée était quantitativement le double de celle du pic à haut potentiel.
L’intégration du signal a également permis de calculer une proportion de 14 % de centres
[3Fe-4S] par rapport au nombre de centres [4Fe-4S] (pic de potentiel intermédiaire).
On observe également que le pic intermédiaire correspondant aux centres [4Fe-4S] est très
large avec environ 140 à 150 mV au lieu des 90 mV attendus pour un seul centre [4Fe-4S].
Tout comme pour la forme sauvage, les résultats de la voltamétrie de la forme tronquée sont
en accord avec la RPE et suggèrent la présence de formes à deux centres [4Fe-4S] par
protéine. Le potentiel d’oxydoréduction des centres [4Fe-4S] a été mesuré à environ -500 mV
et confirme la mesure effectuée en RPE.
Les résultats de la voltamétrie cyclique suggèrent donc la présence de diverses formes
de ferrédoxine Mj∆ dans l’échantillon avec des formes 2x[4Fe-4S] majoritaires (près de 86%)
et une proportion significative de formes [3Fe-4S]1-[4Fe-4S]2, [4Fe-4S]1-[3Fe-4S]2 et 2x[3Fe4S]. La présence concomitante de Fe libre détecté par RPE et de centres [3Fe-4S] suggère une
probable dégradation partielle de l’échantillon pendant les manipulations expérimentales
(exposition partielle à l’oxygène, dénaturation suite à une décongélation de l’échantillon...).
Conclusion des études de voltamétrie cyclique
Les résultats obtenus en voltamétrie ont permis de confirmer la forme à deux clusters
[4Fe-4S] de chacune des ferrédoxines reconstituées. La sensibilité élevée de cette technique a
également permis de mettre en évidence l’absence totale d’autres espèces de centres Fe-S
dans les échantillons de ferrédoxines CAC0303, CAC3527 et Mjwt. Il a été possible de
détecter dans un échantillon de ferrédoxine Mj∆ la présence d’une faible proportion (environ
14%) de centres [3Fe-4S], qui n’avait pas été mise en évidence par RPE.
220
Chapitre VII
Ces résultats viennent confirmer et compléter ceux obtenus en RPE et permettent de connaître
avec précision la proportion des atomes de Fe impliqués dans des clusters dans chacune des
ferrédoxines reconstituées. Ces données sont indispensables au calcul d’un taux de
reconstitution (de centres 2x[4Fe-4S]) précis basé sur le dosage du Fe par ICP-MS.
4.1.4 Calcul du taux de reconstitution
Le dosage des métaux en ICP-MS permet de quantifier précisément la concentration
élémentaire en Fe dans la préparation de ferrédoxine. D’après les résultats obtenus en RPE et
PFV (voir chapitres 3.5.2 et 3.5.3), les centres [4Fe-4S] sont pour les ferrédoxines CAC0303,
CAC3527 et Mjwt les seuls types de groupements présents ou, très largement majoritaires,
dans le cas de la ferrédoxine Mj∆ (plus de 86% de centres [4Fe-4S]). La présence de Fe libre
dans l’échantillon de ferrédoxine Mj∆ est cohérente avec une dégradation partielle, postreconstitution des centres [4Fe-4S] en [3Fe-4S]. La présence de cette petite proportion de
centres [3Fe-3S] dans la ferrédoxine Mj∆ ne peut donc pas être attribuée à l’étape de
reconstitution. Les analyses en RPE et en voltamétrie des quatre ferrédoxines reconstituées
suggère que le protocole de reconstitution mis au point permet la production exclusive
d’holoferrédoxine sous la forme 2x[4Fe-4S].
Un taux de reconstitution peut donc être calculé précisément à partir des résultats du dosage
de la concentration en Fe total par ICP-MS dans les échantillons de ferrédoxine (tableau 20).
[Protéine]
Bradford/Biuret +
Aminoquant
[Fe] Théorique
(100% de
reconstitution)
Dosage [Fe]
ICP-MS
Taux de Reconstitution
mesuré (ICP-MS)
wt
15,7 µM
125 µM
64 µM
51%
Fdx Mj∆
31,5 µM
252 µM
129 µM
52%
CAC 3527
71 µM
568 µM
343 µM
60%
CAC 0303
83,7 µM
669 µM
436 µM
66%
Ferrédoxine
Fdx Mj
Tableau 20 : Dosage élémentaire par ICPMS du Fe contenu dans les échantillons de ferrédoxines Mjwt, Mj∆,
CAC3527 et CAC0303.
221
Chapitre VII
Les taux de reconstitution obtenus sont dans l’ensemble supérieurs 50%, ce qui démontre
l’efficacité du protocole de reconstitution in vitro mis au point au cours de cette étude.
4.2 Interprétation et discussion
Les analyses biophysiques en RPE et en voltamétrie ont permis de valider la méthode
de reconstitution mise au point au cours de cette étude et de calculer avec précision un taux de
reconstitution des ferrédoxines à l’issue de cette étape. Les échantillons de ferrédoxine
obtenus sont formés exclusivement d’une majorité d’holoferrédoxine de type 2x[4Fe-4S] et
d’apoferrédoxine.
Les
proportions
d’holoferrédoxine
(forme
fonctionnelle)
et
d’apoferrédoxine (aucune fonctionnalité) ont pu être quantifiées avec précision. Ces données
seront prises en compte dans l’analyse biochimique de l’interaction de l’hydrogénase [FeFe]
de C. acetobutylicum avec ces quatre ferrédoxines.
L’analyse biophysique de la ferrédoxine mutée Mj∆ n’a pas permis de mettre en
évidence de différence au niveau des paramètres physiques (potentiel d’oxydoréduction,
couplages, intensité du signal) des centres [4Fe-4S].
La délétion c-terminale n’affecte pas les principaux paramètres physiques de la ferrédoxine de
M. jannaschii. Cette partie de la protéine ne semble donc pas située dans l’environnement
proche des centres [4Fe-4S] et n’a pas d’influence notable sur le transfert électronique.
De plus, la délétion de la parie C-terminale (10 acides aminés) de la protéine ne semble
pas affecter la stabilité de la ferrédoxine de M. jannaschii lors de la reconstitution (taux
d’incorporation très proches) ce qui suggère que cette partie de la protéine n’est pas
indispensable au repliement et à la stabilisation de la structure de la protéine. La présence
d’une petite proportion de formes dégradées de type [3Fe-4S] dans l’échantillon de
ferrédoxine Mj∆ suggère tout de même une légère différence de stabilité post-reconstitution
des centres Fe-S en comparaison avec la Mjwt.
222
Chapitre VII
5. Comparaison
de
l’interaction
biochimique
entre
les
ferrédoxines clostridiales et les ferrédoxines de M. jannaschii
avec l’hydrogénase [FeFe] de C. acetobutylicum
La comparaison de l’interaction entre les ferrédoxines clostridiales et les ferrédoxines
de M. jannaschii avec l’hydrogénase à fer de C. acetobutylicum a été effectuée. L’ingénierie
métabolique de C. acetobutylicum, par le remplacement de la GAPDH par une GAPOR
fonctionnelle, donne un rôle fondamental à la ferrédoxine qui devient l’unique intermédiaire
biochimique entre la GAPOR et l’hydrogénase. Cette fonction nécessite donc que la
ferrédoxine soit en mesure d’interagir de manière optimale avec ces deux protéines issues
d’organismes très éloignés phylogénétiquement. La mise au point in vitro d’un système
GAPOR/Ferrédoxine/Hydrogénase optimal constitue donc un préalable indispensable à
l’étape d’ingénierie métabolique in vivo.
L’étude comparative in vitro de l’interaction biochimique entre les ferrédoxines de
M. jannaschii et l’hydrogénase de C. acetobutylicum constitue une première étape dans la
construction de ce système triparti optimisé. Le travail présenté dans ce chapitre a fait l’objet
d’une publication (Guerrini et al., 2007).
5.1 Analyse biochimique comparative de la réduction des
ferrédoxines reconstituées de M. jannaschii et
C.acetobutylicum par l’hydrogénase
5.1.1 Purification de l’hydrogénase [FeFe] de C. acetobutylicum
L’expression du gène hydA codant pour l’hydrogénase de C. acetobutylicum a été
réalisée de manière homologue chez son hôte originel à partir du vecteur pPHhydACtag
(disponible au laboratoire) (Girbal et al., 2005). La protéine a été purifiée par
chromatographie d’affinité par son étiquette C-terminale StreptagII selon le même protocole
que la GAPOR de M. jannaschii et en conditions d’anaérobiose stricte (voir Matériel et
Méthodes chapitre V section 8.3).
223
Chapitre VII
M
E2
M
E2
100
70
55
40
35
25
15
Figure 70 : Contrôle de purification de l’hydrogénase HydA de C. acetobutylicum.
Gel SDS-PAGE 12% coloration au bleu de coomassie à gauche et en western blot à droite. La piste E2
correspond à la fraction d’élution de l’hydrogénase utilisée dans le cadre de l’étude biochimique avec les
ferrédoxines.
La fraction d’hydrogénase obtenue à l’issue du protocole de purification (figure 70) présente
une concentration de 1,2 mg/ml, soit environ 19 µM pour une pureté de plus de 95 % (estimée
à l’aide du logiciel de quantification Image J, voir Matériel et Méthodes chapitre V section
10.3.2).
5.1.2
Analyses biochimiques comparatives de réduction des ferrédoxines
Les activités spécifiques de réduction in vitro par l’hydrogénase à fer de C.
acetobutylicum des ferrédoxines reconstituées CAC0303, CAC3527, Mjwt et Mj∆ ont été
comparées à pH 6.6 pour une concentration en ferrédoxine de 2 µM (tableau 21 et figure 71).
Pour comparaison, l’activité avec la ferrédoxine CAC0303 native est aussi présentée.
Ferrédoxines (2 µM)
Activité spécifique de réduction des Ferrédoxines
par l'hydrogénase, pH 6.6
(µmol. min-1 mg-1)
CAC0303 native
28.4 ± 0.2
CAC0303 reconstituée
21.8 ± 0.3
CAC3527 reconstituée
2.4 ± 0.2
Mj
Mj
WT
∆
reconstituée
2,63 ± 0.2
reconstituée
3,04 ± 0.3
Tableau 21 : Comparaison des activités spécifiques de réduction des ferrédoxines par l’hydrogénase à fer de
C. acetobutylicum à pH 6.6.
224
20
18
16
4
2
Mj ∆
6
∆
8
Mj
10
CAC 3527
12
CAC 0303 Rc
14
CAC 0303 native
Activités spécifiques hydrogénase 10-3µmol.min-1.mg-1
Chapitre VII
0
pH 6.6
Figure 71 : Graphe de comparaison des activités spécifiques de réduction des ferrédoxines par l’hydrogénase à
fer de C. acetobutylicum à différents pH..
Les résultats obtenus montrent que l’hydrogénase est capable de réduire les ferrédoxines
clostridiales CAC0303 et CAC3527 et les ferrédoxines de M. jannaschii Mjwt et Mj∆.
Cependant, bien que l’hydrogénase apparait comme étant une enzyme présentant une grande
flexibilité au niveau de ses donneurs d’électrons (Fitzgerald et al., 1980; Girbal et al., 2005),
les activités de réduction mesurées à pH 6.6 présentent des écarts importants en fonction des
ferrédoxines.
La ferrédoxine CAC0303 reconstituée est réduite par l’hydrogénase de C. acetobutylicum et
présente une activité spécifique du même ordre que celle de la ferrédoxine CAC0303 native
(Demuez et al. sous presse). On constate une diminution de l’activité de 23% par rapport à la
forme native. Plusieurs hypothèses peuvent être formulées afin d’expliquer cette différence
(variabilité des échantillons, état de conservation, protocole de reconstitution...) mais des
investigations plus poussées seront nécessaires afin d’en déterminer la raison première.
225
Chapitre VII
Bien que significatives les activités de réduction des ferrédoxines de M. jannaschii sont
environ dix fois plus faibles que l’activité de réduction mesurées avec la CAC0303 à pH 6.6.
Il est intéressant de constater que malgré leur origine commune la ferrédoxine clostridiale
CAC3527 présente une activité environ dix fois plus faible que la ferrédoxine CAC0303 à ce
même pH.
Les résultats obtenus montrent que l’hydrogénase est une enzyme capable d’accepter une
large gamme de ferrédoxines mais qui présente toutefois une préférence très nette pour la
ferrédoxine CAC0303. Plusieurs hypothèses peuvent être formulées afin d’expliquer cette
spécificité
(différences
stériques
au
niveau
des
zones
d’interaction,
potentiels
d’oxydoréduction, présence de résidus inversement chargés sur la zone d’interaction...). Parmi
ces différentes hypothèses nous avons choisi d’explorer l’effet de la charge de surface
globale.
5.1.3 Effet de la charge globale de la Ferrédoxine dans l’interaction
Ferrédoxine / Hydrogénase :
La ferrédoxine CAC3527 a été retenue dans le cadre de cette étude parmi les différentes
ferrédoxines annotées chez C. acetobutylicum pour ses caractéristiques proches de la
ferrédoxine de M. jannaschii. Nous avons notamment remarqué que les valeurs du point
isoélectrique (pI) théorique de la CAC3527 et de la Mjwt (chapitre VII section 2.1.2) étaient
très proches (respectivement de 8.6 et 8.9) et radicalement opposées à celui de la ferrédoxine
CAC0303 qui est une protéine très acide (pI de 3.6). En raison de la très petite taille des
ferrédoxines, la majeure partie de leurs acides aminés présente une exposition à la surface de
la protéine (voir chapitre III figure 13 page 70 : Structure d’une ferrédoxine clostridiale). Le
pI de surface de la protéine est ainsi très proche du pI global de la séquence polypeptidique. Il
est ainsi possible d’avoir une estimation du pI de surface même dans les cas où la structure de
la protéine n’est pas disponible.
La comparaison de l’effet de la charge globale sur l’interaction biochimique des
ferrédoxines avec l’hydrogénase est d’autant plus pertinente que les écarts de pI théoriques
entre les différentes ferrédoxines sont importants. En variant le pH afin de modifier la charge
globale des ferrédoxines il est possible d’étudier l’influence de celle-ci au niveau de
l’interaction biochimique avec l’hydrogénase à fer de C. acetobutylicum.
226
Chapitre VII
En se basant sur la courbe de titration acido-basique théorique et pour un pH de 6.6, la
ferrédoxine CAC0303 serait négativement chargée tandis que les ferrédoxines CAC3527,
Mjwt et Mj∆ auraient une charge globale positive.
Nous avons choisi les pH 6.6 et 9.6 afin de réaliser des tests d’activité de réduction de
l’hydrogénase (figure 72). En se basant sur les courbes de titration théorique de chacune des
ferrédoxines, ces deux pH nous permettent d’explorer toutes les situations de changement de
charge.
CAC0303
Mj∆
CAC3527
MjWT
3,6
7,68
8,6
8,92
pI
Théoriques
pH
9,6
6,6
CHARGE nette
globale
CAC0303
pH
Expérimentaux
CHARGE nette
globale
CAC0303
CAC3527
Mj∆
MjWT
CAC3527
MjWT
Mj∆
Figure 72 : Schéma résumant l’ensemble les différentes situations de charge globale de chacune des
ferrédoxines testées au cours de cette étude.
Pour un pH de 9.6 par exemple, toutes les ferrédoxines devraient théoriquement être
chargées négativement. Pour un pH de 6.6, les ferrédoxines CAC3527, Mjwt et Mj∆ seront
chargées positivement tandis que la ferrédoxine CAC0303 sera chargée négativement. Seule
la ferrédoxine CAC0303 ne pourra être chargée positivement sans atteindre un pH dénaturant
pour l’hydrogénase.
La comparaison des activités spécifiques de réduction des ferrédoxines par
l’hydrogénase à pH 6.6 et 9.6 révèle une augmentation globale de toutes les activités à pH 9.6
(figure 73). Cet effet est plus marqué pour les ferrédoxines CAC3527, Mjwt et Mj∆ que pour la
CAC0303.
227
Chapitre VII
Afin de nous affranchir des effets du pH sur l’activité propre de l’hydrogénase à fer de
C. acetobutylicum nous avons normalisé toutes les activités de réduction des ferrédoxines en
les divisant par l’activité de réduction du méthyl viologène mesurée au même pH.
Nous constatons qu’une charge globale négative globale de la ferrédoxine semble être
par l'hydrogénase
18
16
14
Mj ∆
Mj WT
2
CAC3527
4
CAC0303 Rc
6
Mj ∆
8
Mj WT
10
CAC3527
12
CAC0303 Rc
Activités spécifiques hydrogénase 10-3µmol.min -1.mg -1
préférentielle au niveau de l’interaction avec l’hydrogénase.
0
pH 6.6
pH 9.6
Figure 73 : Graphe de comparaison des activités spécifiques de réduction des ferrédoxines à pH 6.6 et 9.6.
La figure 74 (page suivante) présente le gain en pourcentage d’activité spécifique de réduction
par l’hydrogénase constaté par le passage d’un pH 6.6 à 9.6.
.
228
Mj
Mj
∆
60
CAC3527
50
40
30
20
10
CAC0303
Activités spécifiques hydrogénase 10-3 µmol.min -1 .mg -1
WT
Chapitre VII
0
(%)
Figure 74 : Graphe de comparaison du gain d’activité spécifique pour chaque ferrédoxine par le passage d’un
pH de 6.6 à 9.6 lors de la réduction des ferrédoxines par l’hydrogénase. Le gain d’activité est exprimé en
pourcentage par rapport à l’activité à pH 9.6 (100%).
L’activité de réduction de la ferrédoxine CAC0303 par l’hydrogénase ne montre aucune
sensibilité au pH. Cette faible dépendance au pH peut s’expliquer par le fait que la charge de
la ferrédoxine CAC0303 restant négative quelque soit le pH, elle n’apparaît à aucun moment
comme étant un élément limitant le transfert électronique.
On constate pour les deux ferrédoxines de M. jannaschii une augmentation d’activité
importante de plus de 50 % de l’hydrogénase lorsque l’on passe de pH 6.6 à pH 9.6 (les
ferrédoxines passent alors d’une charge positive à négative). On note une légère différence
entre les deux ferrédoxines de M. jannaschii avec une différence d’activité légèrement moins
importante pour le mutant. Bien que ce résultat soit en faveur de l’hypothèse d’un effet de la
charge globale sur l’interaction ferrédoxine/hydrogénase (compte-tenu du pI plus bas de la
ferrédoxine mutée), il nous semble difficile à ce stade de conclure sur ce point sans études
complémentaires.
229
Chapitre VII
Les activités de l’hydrogénase avec la CAC3527 présentent également une différence
d’activité significative entre les deux pH, mais plus modérée avec une augmentation de
seulement 30 %. Cette ferrédoxine présente un comportement proche des deux ferrédoxines
du méthanogène mais d’autres facteurs non identifiés semblent se superposer à l’effet de la
charge nette globale. En effet, Le potentiel d’oxydoréduction très bas (<-500 mV) de cette
ferrédoxine peut constituer une limitation au transfert d’électrons avec l’hydrogénase.
L’augmentation du pH de 6.6 à 9.6 a pour effet de diminuer le potentiel d’oxydoréduction du
couple H+/H2 (solution à 37°C, 1 bar d’H2) et de rendre le transfert électronique entre la
ferrédoxine et l’hydrogénase plus favorable thermodynamiquement.
Compte-tenu du bas potentiel des ferrédoxines Mjwt et Mj∆, l’élévation du pH peut de la même
manière que pour la CAC3527, permettre de rendre le transfert électronique plus favorable
thermodynamiquement avec l’hydrogénase à pH 9.6 grâce à un potentiel du couple H+/H2
beaucoup plus bas.
Cependant, à pH 9.6, malgré une charge et un potentiel d’oxydoréduction du couple H+/H2
favorables, ces trois ferrédoxines de bas potentiel (Mjwt, Mj∆ et CAC3527) présentent toujours
des activités de réduction par l’hydrogénase à fer de C. acetobutylicum beaucoup plus faibles
que celle de la CAC0303. Ce résultat démontre que le potentiel d’oxydoréduction n’est pas,
dans ce cas, le seul facteur influant sur le transfert électronique entre l’hydrogénase et ces
ferrédoxines.
A l’issue de cette étude il apparaît que le transfert électronique entre l’hydrogénase et la
ferrédoxine semble gouverné par un ensemble de facteurs biochimiques et biophysiques dont
la prépondérance peut varier sous certaines conditions. L’effet de la charge électrostatique
globale apparaît, dans certains cas, significatif mais, contrairement à l’effet du potentiel
d’oxydoréduction des ferrédoxines, elle n’est pas systématique et apparaît le plus souvent
relativement limitée.
230
Chapitre VII
6. Discussion et conclusion
Les ferrédoxines CAC0303, CAC3527 et la forme sauvage (Mjwt) et mutée (Mj∆) de la
ferrédoxine de M. jannaschii ont été exprimées chez E. coli et reconstituées in vitro. Des
analyses en RPE, par titration d’oxydoréduction et en voltamétrie cyclique ont permis de
caractériser les centres métalliques de ces ferrédoxines 2x[4Fe-4S] et de déterminer leur
potentiel d’oxydoréduction. Des différences importantes de potentiel redox ont été mises en
évidence entre les ferrédoxines CAC3527, Mjwt , Mj∆ (très bas potentiel ≤ -500 mV) et la
ferrédoxine CAC0303 (bas potentiel avec environ -400 mV).
Le dosage par ICP-MS a permis de réaliser un calcul précis des taux de reconstitution. Ces
derniers sont globalement plus élevés pour les ferrédoxines clostridiales que pour les
ferrédoxines du méthanogène. La technique mise au point donne globalement des taux de
reconstitution satisfaisants compris entre 51 et 66 % et permet d’obtenir des ferrédoxines
purifiées et biochimiquement fonctionnelles.
Ces expérimentations ont conduit à l’évaluation de la capacité de l’hydrogénase à fer de
C. acetobutylicum à réduire différentes ferrédoxines et notamment les ferrédoxines
naturellement partenaires de la GAPOR.
La comparaison des activités de la ferrédoxine CAC0303 reconstituée et de son homologue
issu de son hôte originel (Demuez et al., 2007) a permis de valider la qualité biochimique des
ferrédoxines reconstituées en révélant des activités globalement du même ordre de grandeur.
L’étude de la réduction de l’hydrogénase à fer de C. acetobutylicum par chacune des quatre
ferrédoxines a révélé, quant à elle, de profondes différences d’activités. La ferrédoxine
CAC0303 qui est la forme majoritaire chez C. acetobutylicum est de loin la ferrédoxine
partenaire la plus efficace tandis que la CAC3527, la Mjwt et la Mj∆ présentent des activités
approximativement 10 fois plus faibles. Il est intéressant de constater que les ferrédoxines de
M. jannaschii sont tout à fait capables de fonctionner, même de manière peu efficace, avec
l’hydrogénase de C. acetobutylicum, confirmant la large flexibilité d’interaction de cette
classe d’enzyme avec des partenaires redox.
L’augmentation du rendement de production en hydrogène par C. acetobutylicum, via la
déviation du flux électronique vers l’hydrogénase par insertion de la GAPOR au niveau d’un
second point de la glycolyse, nécessite une optimisation des interactions biochimiques du
231
Chapitre VII
système [GAPOR / ferrédoxine / hydrogénase] chez C. acetobutylicum. Les résultats de cette
étude démontrent la difficulté d’optimiser un tel système avec des enzymes issues
d’organismes très éloignés phylogénétiquement.
La différence d’activité importante de l’hydrogénase de C. acetobutylicum constatée entre la
ferrédoxine CAC0303 et la ferrédoxine Mjwt ne nous permet pas à ce jour d’utiliser cette
dernière dans notre approche d’ingénierie métabolique. Cependant, la configuration de ce
système enzymatique pourrait faire l’objet d’une approche d’évolution moléculaire in vivo en
chémostat afin de sélectionner des mutants de cette ferrédoxine conférant un taux de
croissance plus élevé à la souche recombinante.
La modification de la ferrédoxine sauvage de M. jannaschii par délétion de la partie
C-terminale n’a pas permis d’améliorer les niveaux d’activité. Il apparaît à l’issue de cette
étude que le transfert électronique est gouverné par un ensemble de facteurs biochimique et
biophysiques qui interviennent de manière plus ou moins prépondérante lors de l’interaction
entre l’hydrogénase et la ferrédoxine. Contrairement à l’effet du potentiel d’oxydoréduction
des ferrédoxines, l’influence de la charge globale n’est pas systématique et apparaît le plus
souvent relativement limitée.
Une poursuite de l’approche d’ingénierie protéique de la ferrédoxine Mjwt pourrait être
réalisée sur la base d’un abaissement du potentiel d’oxydoréduction de ses centres métalliques
dont certains déterminants structuraux sont connus (Kyritsis et al., 1998).
Auparavant, il conviendra de déterminer les activités de réduction de ces ferrédoxines et
particulièrement de la ferrédoxine clostridiale CAC0303 avec la GAPOR, lorsque celle-ci sera
fonctionnelle.
232
Chapitre VIII
Conclusion et Perspectives
233
Conclusion et perspectives
Chapitre VIII
Le projet, dans le lequel ce travail de thèse s’inscrit, a pour objectif de doubler le
rendement de production d’hydrogène de la très performante bactérie C. acetobutylicum. La
stratégie proposée repose sur le remplacement dans la glycolyse du microorganisme de la
GAPDH originelle par une GAPOR (famille des AOR) capable d’utiliser la ferrédoxine à la
place du NAD (Mukund & Adams, 1995) et permettant de dévier une partie supplémentaire
du flux électronique glycolytique vers l’hydrogénase. La création de cette nouvelle voie de
transfert des électrons vers l’hydrogénase nécessite de disposer d’une GAPOR fonctionnelle
et d’optimiser l’interaction avec le partenaire intermédiaire de la chaine de transport
électronique : la ferrédoxine.
Avant d’entreprendre l’ingénierie métabolique de C. acetobutylicum, il est nécessaire
d’étudier et de reconstituer in vitro un système [GAPOR/ferrédoxine/hydrogénase] optimal et
d’évaluer la fonctionnalité d’une telle configuration avant son implémentation in vivo.
Etude et caractérisation biochimique de la GAPOR
L’étude et la caractérisation des GAPOR issues de l’archaea hyperthermophile
M. jannaschii et de l’archaea mésophile M. maripaludis ont permis d’isoler certains facteurs
limitants l’utilisation d’une enzyme issues de cette famille dans une approche d’ingénierie
métabolique chez C. acetobutylicum.
L’expression hétérologue de la GAPOR de M. jannaschii, et de M. maripaludis chez
C. acetobutylicum et chez E. coli n’a pas permis d’obtenir une enzyme capable de catalyser
l’oxydoréduction du glycéraldéhyde 3-phosphate. Il a cependant été mis en évidence une
activité reproductible de réduction du benzyl viologène non GAP-dépendante chez les deux
GAPOR des méthanogènes mais aussi chez la GAPOR caractérisée de P. furiosus (Mukund &
Adams, 1995; van der Oost et al., 1998) exprimée dans les mêmes conditions chez
C.
acetobutylicum.
La présence de cette activité inattendue n’explique pas pour autant l’absence d’activité
glycéraldéhyde 3-phosphate oxydoréductase de cette enzyme. Certains problèmes de
234
maturation de la protéine liés à une expression en dehors de son hôte naturel peuvent être à
l’origine de ce résultat. Cette problématique a été particulièrement observée pour les Mo/Wenzymes qui nécessitent des cofacteurs complexes (les composés ptériniques) et très
spécifiques pour acquérir leur pleine fonctionnalité (Johnson et al., 1993; Temple et al.,
2000).
Plusieurs hypothèses relatives au transport et à l’incorporation du W, à la synthèse de la
forme optimale du cofacteur tungsto-ptérine et à la formation du centre [4Fe-4S] ont été
testées et des améliorations significatives ont pu être apportées. Les différents travaux ont
essentiellement été menés chez C. acetobutylicum et chez un mutant d’E. coli optimisé pour la
synthèse de la forme du cofacteur tungsto-ptérine retrouvée généralement dans la famille des
AOR.
Le travail effectué dans le cadre de cette thèse a permis de démontrer que la bactérie
C. acetobutylicum est un hôte globalement plus adapté qu’E. coli pour l’incorporation des
cofacteurs W et des centres [4Fe-4S] chez la GAPOR issue de l’hyperthermophile
M. jannaschii. L’expression de la GAPOR du mésophile M. maripaludis chez E. coli a changé
ce constat en améliorant très significativement l’incorporation du W. Il est en outre apparu
que la différence entre la température originelle de fonctionnement de l’enzyme et la
température d’expression de cette même protéine chez son nouvel hôte pouvait constituer un
facteur d’influence majeur sur les mécanismes d’incorporation du métal. La GAPOR de
M. maripaludis a constitué dès lors le meilleur candidat pour la poursuite de cette étude.
L’optimisation de la forme du cofacteur ptérine n’a pas permis de résoudre le problème
d’activité rencontré. Cependant, il reste à démontrer que le W détecté dans les différentes
GAPOR purifiées est effectivement associé au cofacteur ptérine attendu. Une série de travaux
a été initiée à l’issue du présent travail de recherche et sont actuellement en cours au
laboratoire afin mettre en évidence la présence du cofacteur tungsto-ptérine dans nos
échantillons de GAPOR purifiés.
Les travaux effectués sur les GAPOR ont permis de mettre en évidence la complexité de
l’expression hétérologue des enzymes de la famille des AOR chez les bactéries
C. acetobutylicum et E. coli. La meilleure connaissance des mécanismes d’importation du W
et des voies de synthèse du cofacteur tungsto-ptérine chez E. coli a naturellement conduit à
235
pousser les investigations plus loin que chez C. acetobutylicum. Chez ce dernier, il n’a été
possible, à ce jour, que d’identifier par homologie de séquences les gènes putatifs codant pour
les mécanismes présumés de transport, d’incorporation et de synthèse du cofacteur tungstoptérine.
C. acetobutylicum représente l’organisme cible de l’approche d’ingénierie métabolique
envisagée dans le cadre de ce projet. A ce titre, il semble nécessaire d’approfondir notre
connaissance des mécanismes de synthèse et d’incorporation des cofacteurs ptérines chez
cette bactérie.
A court terme, il semble également pertinent d’étudier la GAPOR mésophile de
M. maripaludis purifiée directement à partir de l’organisme originel. L’étude biochimique et
biophysique de cette enzyme dans les conditions d’analyse mises au point permettra de
valider plusieurs hypothèses soulevées au cours de cette étude (chapitre VI).
Il serait également particulièrement intéressant d’entamer une démarche de recherche
d’un nouvel hôte d’expression de la GAPOR. Plusieurs bactéries du genre Clostridium
possèdent des caractéristiques similaires à C. acetobutylicum au niveau de la production
d’hydrogène parfois meilleures sur d’autres points comme les capacités cellulolytiques et
pourraient se révéler être des hôtes plus adaptés à la fonctionnalité des GAPOR.
Etude de l’interaction Hydrogénase/Ferrédoxines
La seconde partie de ce travail porte sur l’optimisation de l’interaction entre les trois
partenaires du système : la GAPOR, la ferrédoxine et l’hydrogénase. La ferrédoxine étant
l’intermédiaire dans cette nouvelle chaine de transport des électrons, il est nécessaire qu’elle
soit capable d’interagir efficacement avec la GAPOR mais aussi avec l’hydrogénase native de
C. acetobutylicum.
Dans l’attente de disposer d’une GAPOR pleinement active, notre étude s’est concentrée sur
les paramètres qui influencent de manière prépondérante l’interaction entre l’hydrogénase de
C. acetobutylicum et la ferrédoxine, à travers une étude impliquant plusieurs ferrédoxines de
provenances différentes. L’un des objectifs étant d’identifier la meilleure ferrédoxine, dans
une optique d’ingénierie métabolique de C. acetobutylicum, afin d’optimiser la déviation du
flux électronique de la GAPOR vers l’hydrogénase.
236
Plusieurs ferrédoxines de type 2x[4Fe-4S] représentatives de l’environnement naturel de
la GAPOR et de l’hydrogénase ont été choisies afin de mener les investigations décrites dans
ce mémoire (respectivement les ferrédoxines de M. jannaschii : Mjwt et son mutant Mj∆ et les
ferrédoxines clostridiales CAC0303 et CAC3527).
Ces ferrédoxines ont été purifiées et exprimées chez E.coli et leurs centres Fe-S ont été
reconstitués in vitro. Elles ont fait l’objet d’analyses biophysiques en RPE (Kyritsis et al.,
1999), en voltamétrie (Armstrong et al., 1997) et en ICP-MS. Cela a permis de déterminer un
taux de reconstitution précis et de valider l’efficacité de la méthodologie de reconstitution
ainsi que la qualité des ferrédoxines reconstituées.
A l’issue de ces analyses, les ferrédoxines ont été divisées en deux groupes : les ferrédoxines
CAC3527 et Mjwt et Mj∆ aux potentiels redox très bas (≤ -500 mV) et aux signatures RPE
atypiques ; et la ferrédoxine CAC0303 au profil RPE et aux caractéristiques redox typiques
des ferrédoxines clostridiales avec un potentiel de -400mV.
L’analyse comparative des activités de réduction des ferrédoxines reconstituées par
l’hydrogénase à fer de C. acetobutylicum constitue un autre objectif de ce travail de thèse.
Bien que les activités obtenues avec les ferrédoxines de M. jannaschii et la CAC3527 se
soient révélées environ dix fois plus faibles qu’avec la ferrédoxine CAC0303, elles restent
significatives et confirment la flexibilité naturelle de l’hydrogénase à fer vis-à-vis de ses
partenaires redox de type ferrédoxine (Fitzgerald et al., 1980). Cette flexibilité constitue un
avantage majeur dans la mise au point d’un système [GAPOR / ferrédoxine / hydrogénase]
optimal
en
permettant
de
se
focaliser
plus
particulièrement
sur
le
couple
[GAPOR / ferrédoxine] à l’avenir. Il reste désormais nécessaire de déterminer les activités de
réduction de ces ferrédoxines et particulièrement de la ferrédoxine clostridiale CAC0303 avec
la GAPOR lorsque celle-ci sera fonctionnelle.
Si aucune ferrédoxine sauvage n’était capable de satisfaire à la mise au point d’un
système tripartite optimal, il serait nécessaire de recourir à une approche d’ingénierie de la
ferrédoxine. Dans cette optique, il a été tenté d’isoler et d’étudier l’un des facteurs pouvant se
révéler déterminant dans l’interaction entre les ferrédoxines et leurs enzymes partenaires.
Cette étude a été réalisée avec l’hydrogénase à fer de C. acetobutylicum et a démontré que la
charge globale d’une ferrédoxine peut constituer un facteur significatif d’influence, mais que
237
d’autres facteurs tels que le potentiel redox restent généralement prépondérants (Guerrini et
al., 2007; Moulis & Davasse, 1995).
La modification de la ferrédoxine sauvage de M. jannaschii par délétion de la partie Cterminale (mutant Mj∆) n’a pas permis d’améliorer les niveaux d’activité de réduction par
l’hydrogénase
à
fer.
Cependant,
et sous
réserve
de
l’analyse
de
l’interaction
GAPOR/ferrédoxine Mjwt, le système [GAPOR / ferrédoxine Mjwt / hydrogénase] pourrait
faire l’objet d’une approche d’évolution moléculaire in vivo en chémostat afin de sélectionner
des mutants de cette ferrédoxine conférant un taux de croissance plus élevé à la souche
recombinante de C. acetobutylicum. La condition indispensable de la fonctionnalité d’un tel
système est de focaliser la pression de sélection sur la ferrédoxine qui deviendrait l’élément
limitatif majeur de la croissance de la bactérie.
Il semble particulièrement intéressant de compléter ce travail avec l’étude de la
ferrédoxine du mésophile M. maripaludis dont la GAPOR apparaît jusqu’à ce jour comme la
meilleure candidate dans le cadre de l’approche par ingénierie métabolique de
C. acetobutylicum présentée dans ce projet.
L’absence d’activité d’oxydoréduction du GAP rencontrée au cours de cette étude a
représenté un frein majeur à la bonne marche de ce projet mais a constitué également un relais
vers l’étude fondamentale des mécanismes biochimiques qui régissent la formation des
tungsto-enzymes telles que les GAPOR. La problématique de l’expression hétérologue de
cette classe d’enzyme touche plusieurs domaines de recherche et a nécessité le recours à un
large panel de techniques biochimiques, chimiques et biophysiques afin de pouvoir en aborder
tous les aspects.
Le travail initié par cette thèse a permis d’explorer un domaine nouveau au laboratoire
et de développer diverses compétences et savoir-faire en interne ou au travers de
collaborations fructueuses. Le travail accompli alimente désormais d’autres voies
d’exploration sur le sujet et ouvre de nouvelles perspectives.
238
Les outils de manipulation génétique étant disponibles à ce jour chez C. acetobutylicum,
il est possible d’utiliser d’autres stratégies de modification du métabolisme de cette bactérie
afin d’améliorer son rendement de production d’hydrogène.
A cet effet, il serait envisageable de diminuer le flux électronique reçu par les autres enzymes
consommatrices de ferrédoxine réduite telles que la NAD(P)H ferrédoxine oxydoréductase.
Une approche d’inactivation génétique de cette enzyme pourrait être étudiée afin de
maximiser le transfert électronique vers l’hydrogénase dans le métabolisme de
C. acetobutylicum. Cette approche serait de plus très complémentaire de la stratégie
« GAPOR » présentée dans ce manuscrit.
La bactérie C. acetobutylicum offre un potentiel d’amélioration élevé et constitue l’un
des meilleurs candidats pour la production d’hydrogène par voie biologique. Toutefois, la
fermentation et l’ensemble des solutions biotechnologiques de production d’hydrogène
nécessitent davantage de maturité avant de pouvoir être implémentées à l’échelle industrielle.
De nombreuses recherches, dont fait partie le travail présenté dans ce mémoire, contribuent
actuellement au développement et à l’amélioration des technologies de production de
biohydrogène, afin que cette voie devienne compétitive à moyen terme face aux énergies
fossiles et donne pleinement à l’hydrogène son titre d’énergie renouvelable.
239
240
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256
Annexes et
Publications
Annexes et Publications
Curr Microbiol
DOI 10.1007/s00284-007-9072-x
1
3
2
6
7
Olivier Guerrini Bénédicte Burlat Christophe Léger Bruno Guigliarelli
Philippe Soucaille Laurence Girbal
8
9
Received: 30 July 2007 / Accepted: 2 October 2007
Ó Springer Science+Business Media, LLC 2007
OO
A1
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A3
O. Guerrini P. Soucaille L. Girbal
UMR5504, UMR792 Ingénierie des Systèmes Biologiques et des
Procédés, CNRS, INRA, INSA, Toulouse F-31400, France
A4
A5
A6
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B. Burlat C. Léger B. Guigliarelli
Laboratoire de Bioénergétique et Ingénierie des protéines, UPR
9036, CNRS and Aix-Marseille University, 31 chemin Joseph
Aiguier, 13402 Marseille Cedex, France
PR
Abstract In vivo hydrogen production in Clostridium
acetobutylicum involves electron transfer between ferredoxin and [FeFe]-hydrogenase. Five C. acetobutylicum open
reading frames were annotated as coding for putative ferredoxins. We focused our biophysical and biochemical
investigations on CAC0303 and CAC3527, which possess
the sequence signature and length of classical 2[4Fe4S]
clostridial ferredoxins but differ significantly in theoretical
pI. After cloning, heterologous expression in E. coli followed by in vitro Fe-S incorporation and purification,
CAC0303 was shown to have a regular electron paramagnetic resonance (EPR) signal for a classical 2[4Fe4S]
clostridial ferredoxin ,while CAC3527 displayed an unusual
EPR signal and a quite low reduction potential. Both ferredoxins were reduced in vitro by C. acetobutylicum [FeFe]hydrogenase, but the CAC3527 reduction rate was 10-fold
lower than that of CAC0303. These results are consistent
with the efficiency of intermolecular electron transfer being
dictated by the redox thermodynamics, the contribution of
the ferredoxin global charge being only minor. The physiological function of CAC3527 is discussed.
ED
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L. Girbal (&)
Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes Biologiques et des
Procédés, 135 Avenue de Rangueil, 31077 Toulouse cedex 4,
France
e-mail: girbal@insa-toulouse.fr
A13
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A16
Present Address:
P. Soucaille
Metabolic Explorer, Bio pôle Clermont Limagne, Saint-Beauzire
63360, France
33
Biological hydrogen used as a fuel and produced from
renewable resources could provide an excellent opportunity to compensate environmental problems by reducing
global carbon dioxide emission and overcome shortages of
fossil fuel in the future.
Molecular hydrogen is produced by many microorganisms. The most efficient reported micro-organism for
hydrogen production from hexose is the anaerobic bacterium Clostridium acetobutylicum, with a chemostat
production of 2.4 l H2 L-1 h-1 [20]. Three hydrogenases, enzymes which catalyze the reversible reaction
2Hþ þ 2e $ H2 , are present in C. acetobutylicum ATCC
824: one [NiFe]-hydrogenase (HupS,L; genes CAP141 and
CAP142) and two [FeFe]-hydrogenases (HydA1, gene
CAC0028 [formerly called HydA]; and HydA2, gene
CAC3230 [formerly called HydB]) [5, 22]. [FeFe]- and
[NiFe]-hydrogenases differ in functionality since [NiFe]hydrogenases tend to be more involved in vivo in hydrogen
oxidation, and [FeFe]-hydrogenases in hydrogen production. Comparison of C. acetobutylicum HydA1 and HydA2
hydrogen production activities showed that HydA1 was
almost 10-fold more active than HydA2 [8, 9], meaning
that in vivo hydrogen production in C. acetobutylicum is
mainly provided by HydA1.
In C. acetobutylicum, a reduced ferredoxin is the physiological electron donor of hydrogenase. Bacterial-type
ferredoxins are low molecular weight carrier proteins
34
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Journal : Large 284
Dispatch : 4-12-2007
Pages : 7
Article No. : 9072
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MS Code : 9072
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Introduction
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Author Proof
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Characterization of Two 2[4Fe4S] Ferredoxins from Clostridium
acetobutylicum
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Ferredoxin cloning and expression
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Ferredoxin genes were PCR-amplified from C. digested
with NdeI and EcoRI and ligated to linearized pET21c,
generating pET21c3527. acetobutylicum ATCC 824
genomic DNA using primers 50 –TTTGGTTCCATATGGCATATAAAATAACAGACGCTTGTG–30 introducing NdeI and 50 - CCGGAATTCTTATTTTTCAAA
TTGAGGATGTGACCACTCTTGAACTGGAGCTCCTA
CTGG-30 inserting the Strep-tag sequence (IBA GmbH)
and EcoRI in the 30 end of CAC0303 and primers 50 –
TTTGGTTCCATATGCCTAGAAGAATTAATAAATT
AGATTGTGTTGG–30 introducing the NdeI and 50 CCGGAATTCTTATTTTTCAAATTGAGGATGTGACCAATGTTCGGATATGCATTTCTTAGGGC-30 inserting
the Strep-tag sequence and EcoRI at the 30 end of CAC
3527. The amplified CAC0303 fragment was digested with
NdeI and EcoRI and ligated to linearized pET21c (Novagen), yielding pET21c0303. The CAC3527 fragment was
pET21c0303 and pET21c3527 were aerobically
expressed in E. coli BL21(DE3) (Novagen) after induction
with 1 mM IPTG. At OD600 1.5, cells were collected by
centrifugation, resuspended in 0.1 M Tris-HCl, 0.25 M
NaCl, broken by ultrasonication, and centrifuged.
96
In vitro reconstitution of iron-sulfur centers
109
All experiments were performed in an anaerobic chamber.
Apo-ferredoxin samples were reduced by 10 mM dithiotreitol (DTT) for 1 h under slow agitation. Fe-S center
reconstitution was performed with FeCl3 and Na2S with a
molar ratio ([Fe] or [S]/[apo-ferredoxin]) close to 20.
Incubation for 2 h under slow agitation was performed,
followed by overnight dialysis against 50 mM Tris-HCl,
pH 8.0, 10 mM DTT. The dialysis extract was filtered.
Iron-sulfur content was checked by measurement of A390/
A280 absorbance ratio.
110
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115
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[FeFe]-hydrogenase expression, purification, and assay
120
Homologous expression and purification of C. acetobutylicum
HydA1 in the form of a Strep-tag tagged protein were
performed as previously described [5]. In vitro hydrogen
uptake assays coupled with methyl viologen and ferredoxin
reductions were adopted from Refs. 21 and 4, respectively.
121
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124
125
F
Materials and Methods
105
106
107
108
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Tris-HCl, pH 8.0, 2 mM DTT, filtered, and loaded on a
StrepTactin-Superflow (IBA GmbH) affinity column. Ferredoxin was eluted with 2.5 mM desthiobiotin in 50 mM
Tris-HCl, pH 8.0.
PR
containing two [4Fe4S] clusters involved in low-potential
oxidation-reduction reactions [19]. Five open reading
frames (ORFs) are annotated as coding for putative ferredoxins in the C. acetobutylicum genome [18]. Recently,
ORF CAC0303 was shown to express the major ferredoxin
in the solventogenic C. acetobutylicum cells [5].
In this study, we report cloning, expression, and biophysical characterization of two C. acetobutylicum low
molecular weight 2[4Fe4S] ferredoxins. Their role as
electron mediators with C. acetobutylicum HydA1 is also
investigated.
CT
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[FeFe]-hydrogenase concentration was determined with
bovine serum albumin used as standard [3]. Ferredoxin
concentration was determined by amino acid analysis using
a C18 reverse-phase column after online automated precolumn derivatization. Ferredoxin metal content was
measured using ICP-MS analysis (HP4500 spectrometer,
calibrated using external standard).
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Inclusion body solubilization
Electron paramagnetic resonance (EPR)
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Inclusion bodies were resuspended in 0.1 M Tris-HCl, pH
7.5, 1 M urea, 0.25 M NaCl, and 0.1% Tween. After
centrifugation, the pellet was washed with 0.1 M Tris-HCl,
pH 8, and the inclusion bodies were solubilized for 1 h in
0.1 M Tris-HCl, 8 M urea.
102
Ferredoxin purification
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104
Avidin (0.16 g/L) was added to samples. After 30 min of
incubation, the extract was diluted two times with 50 mM
EPR experiments were performed on a Bruker ELEXSYS
500E spectrometer fitted with an Oxford Instrument ESR900
helium flow cryostat. Samples containing 50–100 lM protein were buffered in 50 mM Tris at pH 8.0. This pH value
was chosen since it makes it possible to reduce completely
FeS clusters in ferredoxins by using dithionite as a reductant,
and a number of spectroscopic data are available under these
conditions. Potentiometric titrations were performed in an
anaerobic cuvette under argon atmosphere at 23°C [2], in the
presence of low-potential mediators (carmine indigodisulfonate, phenosafranine, neutral red, methyl viologen; 8 lM
135
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Protein and iron concentration determination
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O. Guerrini et al.: Clostridium acetobutylicum Ferredoxins
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Journal : Large 284
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We used the electrochemical setup and equipment described in Ref. 14. CAC0303 was adsorbed onto a freshly
polished pyrolytic graphite edge electrode (area, 0.1 cm2)
by coating the surface with polymyxin sulfate, 20 mg/ml in
water (Sigma), and then painting the electrode surface with
about 0.5 ll of protein (about 50 lM in 50 mM Tris buffer
at pH 8.0). The protein-film was stable enough that it could
be transferred to buffered solutions containing no protein
and the electrochemical signal remained visible. For
CAC3527, only faint electrochemical signals could be
detected, and the greatest electroactive coverage was
observed with no coadsorbate. In all voltammetric experiments, the buffer consisted of MES, HEPES, sodium
acetate, TAPS, CHES (5 mM of each component; Sigma),
and 0.1 M NaCl. The data were analyzed using the inhouse program SOAS available at the NETLIB repository.
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Results
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Sequence analysis
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Comparison of amino acid sequences deduced from
ORFs CAC0075, CAC0105, CAC3527, CAC3621, and
CAC0303 with C. pasteurianum 1CLF ferredoxin showed
that CAC0303 had the highest sequence identity (88%),
followed by CAC3527 (32%), CAC3621 and CAC0105
(21–23%), and CAC0075 (12%) (Fig. 1). A pair of
CX2CX2CX3C motifs, putatively binding to two [4Fe4S]
clusters, is highly conserved among bacterial ferredoxins.
CAC0075 and CAC3621 exhibited only one conserved
motif, the second being degenerated on one and three
cysteines, respectively. The two consensus motifs were
present in CAC0303, CAC3527, and CAC0105. However,
the conserved proline which usually complements the
motif (CX2CX2CX3CP) was conserved in the two motifs of
CAC0303, but only observed in the CAC3527 second
motif and in the CAC0105 first motif. Mutagenesis
Expression, reconstitution, and purification
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Protein film voltammetry
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experiments on C. pasteurianum ferredoxin showed that
this proline does not play an essential role in the mechanism of electron transfer with redox partners [19]. In
addition, CAC0075 and CAC0105 showed unusual C-terminal extensions (52 and 45 amino acids, respectively).
Ferredoxins with smaller C-terminal extensions were previously reported [10]. In C. vinosum, the C-terminal
extension contributes to the negative shift of one cluster
potential [11]. Bacterial ferredoxins are characterized by a
negative overall charge at neutral pH. From the deduced
amino acid sequences, determination of theoretical pI
revealed only two ferredoxins with a classical very low pI,
CAC0303 and CAC3621 (3.6 and 4.0, respectively).
CAC0075, CAC0105, and CAC3527 had higher pIs (5.6,
8.4, and 8.6, respectively).
We chose to focus on CAC0303 (the major ferredoxin
expressed in solventogenic C. acetobutylicum cells [5]) and
CAC3527, which conform to the two consensus pair of
cysteinyl ligands and have a low molecular weight, about
6 kDa, but differ strongly in theoretical pI.
PR
each). Reduction potentials were achieved by adding small
aliquots of 10 mM dithionite, then 160 ll of poised sample
was transferred into an EPR tube, which was quickly frozen.
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Biophysical characterization
219
Figure 2A shows selected spectra obtained during the
reductive potentiometric titration of CAC0303 monitored
by EPR spectroscopy. In the ‘‘as prepared’’ CAC0303
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Recombinant expression of CAC0303 and CAC3527 was
performed in E. coli. CAC0303 was mainly present in the
soluble fraction. A first purification of CAC0303 was carried out by affinity chromatography. The purified fraction
showed an A390/A280 of only 0.50, indicating a high proportion of apo-protein. In vitro Fe-S cluster incorporation
was thus carried out on the purified fraction, followed by a
second affinity chromatography leading to pure CAC0303
as determined by SDS-PAGE (data not shown), with A390/
A280 = 0.80. CAC3527 was expressed in E. coli in the form
of inclusion bodies. After a first step of inclusion body
solubilization, in vitro Fe-S cluster reconstitution was
performed. CAC3527 was purified by affinity chromatography (A390/A280 = 0.87).
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Cp 1CLF
CAC 0303
CAC 3527
CAC 3621
CAC 0105
CAC 0075
Fig. 1 Multiple alignment of C. pasteurianum ferredoxin (1CLF) with five annotated C. acetobutylicum ferredoxins. Residues which are
identical are in yellow, whereas residues which are identical and similar in 50% of the proteins are in blue and green, respectively
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nor in protein film voltammetry experiments. Considering
the quality of the electrochemical signals, even a substoichiometric amount ( [ 5%) of [3Fe4S] clusters would have
been easily detected as a pair of additional peaks [6]. We
conclude that neither of the two [4Fe4S] clusters is
degraded to a [3Fe4S] form.
Iron atom content measurements were performed by
ICP-MS on a CAC0303 solution at 84 lM and gave a value
of 445 lM for the iron content. Since EPR and protein
voltammetry experiments confirmed that Fe was only
present in the form of a [4Fe4S] cluster, we could consider
8 iron atoms per ferredoxin molecule and estimate a 66%
yield of 2[4Fe4S] holo-protein reconstitution in CAC0303
preparation. According to experimental errors, this value is
in agreement with spin intensity measurements performed
by EPR in the fully reduced state of the protein, which gave
a reconstitution yield close to 50%.
The EPR spectrum given by oxidized CAC3527 displayed no significant signal due to [3Fe4S] 1+ clusters.
Upon reduction, the [4Fe4S] +1 signal appeared at a much
lower potential than in CAC0303 (Fig. 2B; top spectrum).
The corresponding spectrum is quite unusual for a
[4Fe4S]1+ center, however, a similar shape has already
been observed for cluster II of the 2[4Fe4S] ferredoxin
from C. vinosum [12]. The most reduced sample was
obtained at a potential of about –500 mV, the reduction
being leveled off by the reduction potential of dithionite
(typically –520 mV at pH 8.0). The spin quantitation of
this sample indicated that only 10–20% of [4Fe4S] clusters
per molecule were reduced, which clearly demonstrates
that the reduction potential of this redox center is more
negative than -500 mV. In the ferredoxin from C. vinosum, cluster II displayed a reduction potential at -460 mV,
whereas the other cluster has an even lower potential
(-660 mV vs. NHE) [11].
In the case of CAC3527, even after optimizing the
adsorption procedure, the electrochemical signals we could
detect were only just above the detection limit. However,
the faint peaks seen at low potentials in Fig. 3B could
never be detected in control experiments carried out in the
absence of protein (green line), and they must result from
the redox transformation of the adsorbed ferredoxin. As
occurs with CAC0303, the peak position shows little
dependence on pH (-500 mV at pH 7, -450 mV at pH 4).
The main difference is that the redox process occurs at a
very low potential, and this is in agreement with the
potentiometric titration.
CAC3527 exhibited an iron content of 343 lM on a
CAC3527 solution at 71 lM per molecule. Since no
[3Fe4S]1+ cluster or free Fe was detected in EPR experiments, a CAC3527 reconstitution yield in the form of
2[4Fe4S] holo-protein of 60% was calculated considering 8
iron atoms per ferredoxin molecule.
CT
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state (E * 0 mV vs. NHE), no signal could be detected,
which indicates that no partial degradation of the [4Fe4S]
cluster into the [3Fe4S] cluster occurred in the studied
sample [2]. At potentials below –300 mV, an almost-axial
EPR signal at g = 2.064 and 1.931 developed. This main
signal is characteristic of a magnetically isolated
[4Fe4S]1+ cluster. Additional features at 2.009 and 1.971
were also visible and came from a minor population of
ferredoxin molecules, where both [4Fe4S]1+ clusters are
reduced and coupled by spin-spin magnetic interactions.
In samples poised at lower potentials, the proportion of
mono-reduced ferredoxin decreased and the EPR spectra
were dominated by the signal due to two magnetically
coupled [4Fe4S] 1+ clusters. The spectrum plotted at 506 mV vs. NHE is that of the fully reduced ferredoxin.
Such an interaction pattern is usual in clostridial ferredoxins, and this spectrum is highly reminiscent of that
given by the 2[4Fe4S] ferredoxin from C. pasteurianum
[15]. Plotting the integrated intensity of the EPR signal as
a function of the potential enabled the determination of
the reduction potential. A satisfactory simulation was
obtained assuming two independent one-electron redox
processes, with a reduction potential of -400 mV
( ± 10 mV), showing that the two [4Fe4S] clusters have
very similar reduction potentials.
Figure 3A shows cyclic voltammograms recorded after
a solution of CAC0303 was painted onto a graphite electrode, and the latter was transferred to a solution containing
no protein. Hence the positive and negative current peaks
at about -350 mV at pH 7 must result from the oxidation
and reduction (respectively) of the protein that is adsorbed
onto the electrode surface and able to directly exchange
electrons with the electrode. Consistently, the peak areas
(in units of AV), determined after subtracting the capacitive current, were identical for the oxidative and reductive
sweeps and proportional to scan rate [13]. A small residual
peak separation (20 mV at 100 mV/s) was observed even
at the lowest scan rates. This is in contrast with the ideal
behavior predicted by Laviron but often observed for
proteins adsorbed on graphite [1].
The width at half-height of the peak (120 mV to
130 mV) is greater than that expected for a single oneelectron redox process (90 mV), suggesting that the redox
transitions of the two [4Fe4S] clusters overlap in the
electrochemical signal. This is consistent with the result
of the EPR titration, which shows that both redox processes occur at about -400 mV. The shape and position
of the peak are hardly dependent on pH (-350 and
-335 mV at pH 7 and 4, respectively), demonstrating that
neither of the two redox processes is specifically coupled
to protonations.
Remarkably, we detected the signature of a [3Fe4S]
cluster neither in the EPR spectrum of the oxidized sample
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Fig. 3 Ferredoxin voltammograms. A The solid lines are raw
voltammograms for CAC0303 adsorbed at a graphite electrode and
recorded at pH 4.3 (red) and pH 7 (black). The dashed lines show
baseline subtracted data. B Raw voltammograms (solid lines),
including a blank (green), recorded at pH 4 (red) and pH 7 (black)
with CAC3527. The dashed lines are baseline subtracted data
enlarged 10-fold. T = 20°C. Scan rate, 100 mV/s
UN
Fig. 2 Ferredoxin EPR spectra: (A) CAC0303; (B) CAC3527.
Recording conditions: 15 K, 10-mW microwave power, and 1-mT
modulation amplitude. A star on the spectrum indicates contribution
from the baseline. Redox potentials are vs. NHE. Ferredoxin cyclic
voltammograms
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Reduction of reconstituted and native CAC0303 by C.
acetobutylicum HydA1
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The ability of reconstituted and native CAC0303 to accept
electrons from HydA1 was compared. In vitro ferredoxin
reduction activities of HydA1 were determined at pH 6.6
with 2 lM 2[4Fe4S]-containing ferredoxin. Reconstituted
and native CAC0303 were reduced by HydA1 at similar
in vitro rates (21.8 ± 0.3 and 28.4 ± 0.2 lmol min1
mg-1, respectively). Expression of tagged CAC0303 in E.
coli coupled with in vitro Fe-S cluster incorporation thus
led to equivalent reconstituted and native ferredoxins
concerning enzymatic reduction by HydA1.
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Comparative reduction of CAC0303 and CAC3527 by
C. acetobutylicum HydA1
341
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In vitro reductions of reconstituted CAC0303 and
CAC3527 by HydA1 were compared at pH 6.6 with 2 lM
2[4Fe4S]-containing ferredoxin. HydA1 was able to reduce
both CAC0303 and CAC3527, but the reduction activity was more than 10-fold higher with CAC0303
than CAC3527 (2.4 ± 0.2 lmol min-1 mg-1). Since
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Among five ORFs annotated as coding for C. acetobutylicum
ferredoxins, we have focused our investigation on
CAC0303 and CAC3527, the only two low molecular
weight proteins which also displayed the two sets of conserved cysteinyl ligands characteristic of 2[4Fe4S]
ferredoxins.
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Discussion
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Ferredoxin CAC0303 is the annotated ferredoxin from
C. acetobutylicum exhibiting the highest amino acid
sequence identity with C. pasteurianum ferredoxin, and
more importantly, CAC0303 was shown to be the major
expressed ferredoxin in solventogenic C. acetobutylicum
cells [5]. The reconstituted CAC0303 produced in our
study is of high quality and possesses typical clostridial
ferredoxin features [17]: (i) both EPR and protein film
voltammetry experiments demonstrated that no significant
amounts of [3Fe4S] or of free iron were present in reconstituted and purified ferredoxin CAC0303 preparations; (ii)
a typical EPR signal of two interacting [4Fe4S] clusters
was obtained; (iii) a classical -400-mV reduction potential
for the two [4Fe4S] clusters was determined by both EPR
and the electrochemistry techniques; (iv) a reconstitution
yield of 2[4Fe4S] holo-protein of 66% was calculated, in
agreement with previously reported ferredoxin reconstitution yields [7]; and (v) HydA1 did not discriminate
between reconstituted and native CAC0303 regarding in
vitro reduction activity.
The expression-purification-reconstitution protocol validated on CAC0303 was also applied to CAC3527. A high
quality of reconstituted ferredoxin was achieved, with
formation of only [4Fe4S] clusters and a reconstitution
yield at 60%. However, our results showed that CAC3527
is different from CAC0303 in terms of biophysical properties and enzymatic reduction. First, at the beginning of
the reduction, the CAC3527 EPR spectrum was unusual for
a [4Fe4S]1+ center and a reduction potential more negative
than -500 mV was demonstrated by potentiometric titration and protein film voltammetry. A similar
unconventional EPR signal was previously reported for
cluster II of C. vinosium 2[4Fe4S] ferredoxin [11]. Furthermore, both clusters of this ferredoxin displayed very
negative potentials [11]. Three factors were proposed to
explain the very negative potentials: a loop between two
ligand cysteines, a C-terminal a-helix, and, the most
determinant parameter, a bulky side chain in position X4 of
the CX1X2CX3X4C motif. CAC3527 has none of the above
characteristics. Second, in vitro CAC3527 reduction by
HydA1 at pH 6.6 was 10-fold lower than with CAC0303.
At pH 6.6 (at 37°C and 1 bar H2) E0H+/H2 is about
-405 mV. Since the CAC3527 reduction potential was
shown to be more negative than -500 mV, we conclude
that the low potential of CAC3527 makes it unable to
oxidize hydrogenase. When E0H+/H2 was decreased to
about -590 mV by increasing the pH to 9.6, the 41%
increase in the rate of ferredoxin reduction by HydA1 is
consistent with the thermodynamics of electron transfer
becoming more favorable. On the other hand, ferredoxin
CAC3527 displayed a theoretical pI value significantly
higher than that of classical ferredoxin. However, we
showed that the rate of ferredoxin reduction by HydA1 is
PR
CAC0303 and CAC3527 have lower and higher theoretical
pI values than the pH assay, respectively, we investigated
the hypothesis of a protein global charge effect on ferredoxin reduction activity. Indeed, at pH 6.6, CAC0303 and
CAC3527 should mainly be negatively and positively
charged, respectively. Therefore we chose to perform ferredoxin reduction assays by HydA1 at pH 9.6. At this pH,
both ferredoxins should be theoretically mainly negatively
charged. First, HydA1 activity versus the pH assay was
measured using methyl viologen as electron acceptor: a
31% increased activity was observed at pH 9.6 compared to
pH 6.6. This pH-dependent response was taken into
account when ferredoxin reductions by HydA1 were carried out: we normalized ferredoxin reduction activity by
dividing it by the methyl viologen reduction activity
measured at the same pH. Increasing the pH assay from 6.6
to 9.6 had no significant effect on the reduction activity of
CAC0303, while CAC3527 reduction was increased by
41% (Fig. 4). The negative CAC3527 global charge seems
only slightly more favorable for in vitro reduction by
HydA1. However, CAC3527 reduction at pH 9.6 was still
lower (almost eightfold) than CAC0303 reduction.
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Fig. 4 Histogram of C. acetobutylicum HydA1 reduction activity
with CAC0303 and CAC3527 normalized by methyl viologen activity
at pH 6.6 and 9.6
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Acknowledgments O.G. was the recipient of a doctoral fellowship
from the Centre National de la Recherche Scientifique and the Agence
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PR
only slightly dependent on the sign of the ferredoxin global
charge. This result is consistent with the reported conclusion that reversal of negative charges on the C.
pasteurianum 2[4Fe4S] ferredoxin surface had little influence on electron transfer between this ferredoxin and C.
pasteurianum [FeFe]-hydrogenase [16].
CAC0303 is thus a typical clostridial ferredoxin which
efficiently interacts in vitro with C. acetobutylicum HydA1
for H2 oxidation (this work) and H2 production [5]. We
suggest that its in vivo implication in C. acetobutylicum
metabolism is to channel electrons to HydA1. CAC3527 is
an unconventional ferredoxin with a quite low reduction
potential and a high pI. Its involvement in vivo is less
clear: CAC3527 may not interact with HydA1 under
physiological conditions; if it does, its low reduction
potential may be an advantage to channel electrons to the
hydrogenase, but the question remains as to which electron
donor would be able to reduce CAC3527 in vivo.
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THESE Décembre 2007 Edition Impression Finale

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