steering committee for the uk stem cell bank and for

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BANCO NACIONAL DE LÍNEAS CELULARES (TRONCALES)
National Bank of Stem Cell Lines
IMPRESO DE SOLICITUD DE DEPÓSITO DE UNA LÍNEA
Application Form to Deposit a Human Cell Line
Documentos que se acompañan:
Attached documents:
Copia de la autorización de derivación de la línea celular, junto con informe del Comité Ético del
centro de procedencia.
A copy of the authorization for the derivation of the cell line, with the corresponding ethics
committee approval
Copia de cualquier publicación científica relacionada con la derivación y/o caracterización de la
línea.
A copy of any relevant published scientific papers related to the derivation and/or
characterization of the cell line
C. V. del investigador principal (una página; formato libre).
A one page CV for the Principal Investigator
Otros (especificar).
Others (specify)
ANEXO
SECCIÓN 1
Section 1
Información General
General Information
Nombre de la línea:
Name of the line:
VAL-11B
Investigador principal:
Principal Investigator:
Carlos Simón Vallés
Origen de la línea celular:
Origin of the cell line
Embrionario
Fetal
Adulto
Embryonic
Fetal
Adult
¿La línea celular ha sido derivada de un embrión con anomalía genética?
Has the cell line been derived from an embryo with genetic anomaly?
NO
SÍ
No
Yes
(especificar)
(specify)
Identificación genética de la línea celular. Método y resultado
Genetic identity of the cell line. Method and result
Fingerprinting
Documento de Solicitud de Depósito de Línea Celular. Versión 3
Los apartados que requieran entrada de texto, deben rellenarse tanto en Castellano como en Inglés
Text items should be filled in both Spanish and English
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Valencia, 1 de Julio 2009
Código:
VAL-11B
Servicio:
Prueba de fingerprinting basada en el análisis de nueve marcadores
polimórficos (ver lista); Estos 9 loci se heredan de forma independiente.
Simultáneamente se co-amplifica un segmento del gen amelogenina, homólogo
en cr. X e Y, para determinación del sexo de la muestra:
A.
B.
C.
D.
E.
F.
G.
H.
I.
D3S1358
vWA
FGA
D8S1179
D21S11
D18S51
D5S818
D13S317
D7S820
Método:
PCR fluorescente y análisis de fragmentos en analizador genético AB 3130
según AmpFlSTR Profiler Plus Loci, Applied Biosystems.
Muestras:
ADN extraído a partir de colonias de VAL-11B recogidas en PBS.
Resultados:
Línea de sexo femenino
Ana Cervero, PhD
Laboratorio de Diagnóstico Molecular (DGP-PCR)
Unidad de Diagnóstico Genético Preimplantacional
Tel 96 303 72 73 (Horario 16-19:00 horas) Fax 96 345 55 12
Página 2 de 24
SECCIÓN 2
Section 2
Datos del Depositante
Applicant Details
Investigador Principal:
Principal Investigator:
Dirección Postal:
Postal address:
Av. Autopista del Saler, 16
Centro de Trabajo:
Institution:
Teléfono (phone): +34 963 28 96 80
Centro de Investigación Príncipe Felipe (C.I.P.F.)
Fax: +34 963 28 97 01
E-mail: csimon@cipf.es
SECCIÓN 3
Section 3
Datos de la Línea Celular
Details of Cell Line
Tipo de muestra biológica (especificar estadio embrionario, semanas de gestación,…)
Kind of biological sample (specify embryonic stage, weeks of pregnancy,...)
Blastómera de un embrión humano en día 3 de desarrollo.
Blastomere of a human embryo at day 3 of development.
Muestra biológica
Biological sample
Fresco
Fresh
Fecha de la obtención de la
muestra biológica
Date of obtaining the biological
sample
Congelación:
Recepción:
Freeze:
Reception:
Crioconservado
Cryopreserved
Fecha del uso o descongelación (si congelado)
Date used or thawed (if frozen)
25/05/2009
24/10/1996
18/05/2009
24/10/1996
18/05/2009
Fecha de la donación del
muestra biológica
Date of donation of the
biological sample
10/02/2009
Descripción general del procesamiento previo del muestra biológica utilizado (cultivo embrionario,
procesamiento muestra fetal o de tejido adulto)
General description of the processing of the biological sample used (embryonic culture, processing of fetal
sample or of adult tissue)
El embrión congelado en día 2 de desarrollo donado para este proyecto, fue descongelado mediante un protocolo con
DMSO y etilenglicol. Tras la descongelación, se mantuvo en medio IVF/CCM 1:1 (Vitrolife) durante 24 horas resultando en
un embrión en día 3 de desarrollo con 1 sola blastómera integra y 5 degeneradas. Posteriormente se realizó el
procedimiento modificado de biopsia de blastómera para PGD a través de micromanipulación y microdisección por láser. La
blastómera se dejó en cultivo y 24 horas después, tras haberse dividido se cocultivó con fibroblastos humanos de foreskin
irradiados y medio de cultivo hES y bFGF.
The frozen day-2 embryo was donated for this project, thawed following a protocol with DMSO and ethilenglicol. The embryo
obtained was cultured in IVF/CCM medium 1:1 (Vitrolife) for 24 hours resulting in a day 3 embryo with one normal blastomere
and five degenerated. After that, the blastomere biopsy procedure for PGD using laser microdissection and micromanipulation
was performed. The blastomere was cultured and divided for 24 hours and then was cocultured with irradiated human
foreskin fibroblast and hES medium plus bFGF.
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En caso de muestra embrionaria, indicar si se utilizaron blastómeros o células de la masa celular interna
y el método de aislamiento utilizado
If of embryonic origin, indicate whether blastomeres or internal cell mass were used, as well as the isolation
method
Se utilizó la única blastómera íntegra de un embrión en día 3 de desarrollo, obtenida por micromanipulación y
microdisección por láser siguiendo un procedimiento modificado para PGD.
A single blastomere from a day 3 embryo was used, obtained by laser microdissection and micromanipulation, following a
modified procedure for PGD.
Origen del soporte celular o acelular utilizado para la derivación, así como de los componentes de los
medios de cultivo (si se describen en publicación, indicar además referencia)
Origin of the cellular or cellular free support used in derivation in addition to the components of the culture
mediums (if they are described in a publication, please indicate the reference).
 Soporte cellular /cellular support : human foreskin fibroblasts CCD1112Sk (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA. Nº
catálogo: CRL-2429).
 Componentes del medio para Feeder / Feeder medium components: 90% Iscoves’ Modified Dulbecco´s médium (ATCC), nº Catálogo: 30-2005) +
10%Fetal Bovine Serum (PAA), nº catálogo:A15-101).
 Componentes del medio para hESC/ hESC medium components: 80% Knockout DMEM (Gibco/BRL, Paisley, Scotland, UK; nº catálogo 10829-018),
20% Knockout SERUM Replacement (Gibco/BRL; nº catálogo: 10828-028), 1 mM L-glutamine solution (Gibco/BRL; nº catálogo: 25030-024), 1% MEM
non essential amino acids (100x) (Gibco/BRL; nº catálogo: 11140-035), 0.1 mM -mercaptoethanol (Gibco/BRL; nº catálogo: 31350-10), 10 ng/ml human
recombinant basic fibroblast growth factor (bFGF) (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA ; nº catálogo: 13256-029)
Valbuena D, Galán A, Sánchez E, Poo ME, Gómez E, Sánchez-Luengo S, Melguizo D, García A, Ruiz A, Moreno R, Pellicer A, Simón C. Derivation and
characterization of three new Spanish human embryonic stem cell lines (VAL-3,-4,-5) on human feeder and in serum-free conditions. Reproductive
BioMedicine Online 2006; 13(6):875-86.
Cristobal Aguilar; Maria Poo; Eva Gomez; Amparo Galan; Eva Sanchez; Ana Marques-Mari; Veronica Ruiz; Jose Medrano; Marcia Riboldi; Diana
Valbuena; Carlos Simon. Derivation, Characterization, Differentiation and Registration of Seven Human Embryonic Stem Cell Lines (VAL-3, -4, -5, -6M,
-7, -8, and -9) on Human Feeder. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal 2009 ; In press.
Mantenimiento de la línea: Line maintenance
Ratio de pase: Passage ratio
1:5
Método de pase: Passage method
Xenobióticos
si
Xenobiotics
Yes
mecánico / mechanical
no
No
Descripción de las características morfológicas de la línea en cultivo
(forma y tamaño colonias; forma y tamaño células; ratio núcleo/citoplasma; otros)
Description of the morphological characteristics of the line in culture (form and size of the colonies; form and size
of the cells; nucleus/cytoplasm ratio; others)
Morfología característica de células madre: colonias aplanadas, translúcidas y con bordes definidos, con células
homogéneamente dispuestas en monocapa, y ratio núcleo/citoplasma elevado. Se agrupan en colonias de 3000-5000 células.
Characteristic morphology of human embryonic stem cells: flat colonies, translucent, with defined borders, with cells
homogeneusly located in a monolayer, and a high ratio of nucleus/cytoplasm . Colonies with 3000-5000 cells.
Controles microbiológicos realizados (indicar detalladamente)
Microbiological controls carried out (indicate in detail)
El soporte celular fue testado para: mycoplasma, endotoxinas, citomegalovirus, Epstein-Barr, VHB, VHC, herpes humano 6(A)
y 6(B), VIH1, VIH2, HTLV-I/II, parvovirus y transcriptasa reversa. Los resultados fueron negativos. Los controles fueron
realizados por el Instituto Valenciano de Microbiología (IVAMI), entidad homologada por AENOR, ENAC y Consellería de
Sanitat.
La línea fue testada para Mycoplasma y patógenos habituales. De forma rutinaria se realizan controles microbiológicos que
aseguran la ausencia de microorganismos en las condiciones de cultivo utilizadas.
Cellular support was tested for: usual bacteria, Mycoplasm, endotoxin, cytomegalovirus, Epstein-Barr, HBV, HCV, human
herpes 6(A) y 6(B), HIV1, HIV2, HTLV-I/II, parvovirus and reverse transcriptase. Results were negative. Controls were done by
the Instituto Valenciano de Microbiología (IVAMI), homologated by AENOR, ENAC and Consellería de Sanitat.
Cell line was tested for Mycoplasm and common pathogens. Routinely, we perform microbiologic controls that ensure the
absence of microorganisms in the culture conditions used.
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Marcadores:
Markers
Método
(ARN/proteínas)
Method
(RNA/proteins)
nº pase
resultado
Passage n.
results
Oct 4 PCR e inmunocitoquímica (ICQ) / PCR and immunocytochemistry ( ICC)
Nanog
PCR e ICQ/ PCR and ICC
Rex 1
Sox 2
SSEA3
SSEA4
ICQ / ICC
TRA-1-60
ICQ / ICC
TRA-1-81
ICQ / ICC
Telomerasa/Telomerase
PCR
Fosfatasa Alk. /Alkaline phosphatase
ICQ / ICC
Cariotipo / Karyotype
bandas G / G bands
Otros / Others
8
8
8
8
8
5
8
5
+
+
+
+
+
+
+
46,XX
comentarios
comments
indiferenciación / indiferentiation
femenino normal / normal female
Cripto, Dnmt3b, Gabr, Gdf3
PCR
5
+
Nfh
PCR
5
-
Ren
PCR
5
-
Amy
PCR
5
-
diferenciación / diferentiation
(ectodermo) / (ectoderm)
(mesodermo) / (mesoderm)
(endodermo) / (endoderm)
Capacidad de diferenciación
Differentiation capacity
In Vitro
In vitro
Ectodermo/ Ectoderm
marcador pase resultado
marker
passage result
tubulin -III
8
positivo
tubulin -III
8
positive
In vivo / in vivo
Método:
Method:
Endodermo/Endoderm
marker
passage result
-fetoproteina
8
positivo
-fetoprotein
8
positive
inducción de teratomas
teratomas induction
Mesodermo/ Mesoderm
marker
passage result
actina muscular 8
positivo
muscle actin
8
positive
Resultado: positivo
Result:
positive
Página 5 de 24
Descripción de las características de diferenciación in vitro
Description of the differentiation characteristics in vitro
Formación de cuerpos embrioides e inmunocitoquímica para marcadores de diferenciación de ectodermo, mesodermo y
endodermo.
Embryoid bodies formation and immunostaining against differentiation markers from ectoderm, mesoderm and endoderm.
Datos de la determinación de pluripotencialidad in vivo o formación de teratomas
Data of the pluripotentiality determination in vivo or teratoma formation
Inyección intratesticular en ratones SCID de 30 colonias de la línea por testículo (90.000-150.000 células). Transcurridas 12
semanas, se sacrificaron los ratones y se obtuvieron tumores cuyo análisis anatomo-patológico e inmunohistoquímico
demostró que se trataba de teratomas formados por tipos celulares propios de ectodermo, mesodermo y endodermo.
Intratesticular injection in SCID mice of 30 cell colonies of the line/testis ( 90,000-150,000 cells). After 12 weeks, the
mice were sacrificed and tumors were obtained. Anatomopathological analysis and immunohistochemistry of
tumors showed that they were teratomas with typical tissues from the ectoderm, mesoderm and endoderm.
Datos de la tipificación HLA
HLA typification data
HLA-A*0101, HLA-A*0201
HLA-B*1501, HLA-B*3701
HLA-Cw*0303, HLA-Cw*0602
HLA-DRB1*0401, HLA-DRB1*1104
HLA-DQA1*0301, HLA-DQA1*0505
HLA-DQB1*0302,HLA-DQB1*0301
HLA-DPB1*0401,HLA-DPB1*0502
Consistencia celular tras 6 pases de congelación y descongelación. Resultados.
Cell consistency alter 6 passages of freezing and thawing. Results.
La línea celular se mantiene estable tras más de 6 pases siguiendo los procedimientos de congelación y descongelación
propios.
The cell line is stable for more than 6 passages following our freezing and thawing protocol.
Valbuena D., Sánchez-Luengo S., Galán A., Sánchez E., Gómez E., Poo ME, Ruiz V, Genbacev O., Krtolica A., Pellicer A.,
Moreno R., Simón C. An Efficient Slow Freezing hESC Cryopreservation Method in Xeno-Free Conditions without the use of
a programmable freezer. Reproductive BioMedicine Online, 2008 ; 17(1) : 127-135.
Pase en el momento del registro
Passage at the time of the recording
Pase 25
Passage 25
¿Ha sido la línea modificada genéticamente?
Has the line been genetically modified?
Sí Yes
No No
¿Se llevó a cabo un análisis clonal?
Has a clonal analysis been carried out?
Sí/ Yes
No
Resultado / Result
Comentarios/ Comments:
Página 6 de 24
Otras observaciones o información relevantes (a juicio del Investigador Principal):
Other observations or relevant information (to the discretion of the Principal Investigator):
En los controles habituales, ésta línea de hESC obtenida de una blastómera se comporta igual a las
derivadas del embrión completo. Sin embargo, estamos realizando análisis genómicos y de metilación
comparativos con nuestras líneas registradas.
Normal controls showed that this hESC line derived from a single blastomere behaves like hESC derived
from complete embryos. However, we are making genomics and methylation analysis comparing with our
lines registered
Otras observaciones o información relevantes (a rellenar por el BNLC):
Other comments or relevant information (to be completed by BNLC)
Seguimiento de la línea (a rellenar por el BNLC):
Follow up of the line (to be completed by BNLC)
Página 7 de 24
SECCIÓN 4
Declaración
Confirmo que la información contenida en estos impresos es cierta y asumo total responsabilidad sobre la
misma.
I confirm that the information contained in this form is true and I assume total responsibility for it.
Firma en Representación del Centro / Signature in
Representation of the Centre
Firma del Investigador Principal
Signature of the Principal Investigator
(Representante legal del Departamento/Centro)
(Legal Reprentative of the Department/Centre)
Fecha/ Date: 22/02/2010
Fecha /Date 22/02/2010
Nombre y Cargo de la Persona Representante del Centro:
Name and Position of the Person Representing the Centre:
Carlos Simón Vallés. Director Científico.
Dirección Postal:
Postal Address:
Centro de Investigación Príncipe Felipe
Av. Autopista del Saler, 16-3
46012 Valencia
Teléfono /Telephone: +34 963 28 96 80
Fax: +34 963 28 97 01
E-mail: csimon@cipf.es
Página 8 de 24
BANCO NACIONAL DE LÍNEAS CELULARES
NODO COMUNIDAD VALENCIANA
ANEXO
Página 9 de 24
MORFOLOGÍA DE VAL-11B
(A) Embrión en estadío de 6 células en día 2 de desarrollo (40x)
(B) Blastómera dividida (20x)
(C) Outgrowth en día 10 after platting (10x)
(D) Morfología típica colonias de VAL-11B (10x)
A
B
C
D
Página 10 de 24
TIPIFICACIÓN HLA DE VAL-11B
Llevado a cabo en el pase 5, por el Centro de Transfusiones de la Comunidad Valenciana.
Página 11 de 24
MARCADORES INDIFERENCIACIÓN DE VAL-11B
Expresión de antígenos de indiferenciación en VAL-11B
Inmunocitoquímica para OCT-4 (A), Nanog (B) (R&D, Minneapolis, MN), SSEA-1 (C), SSEA-4 (D), Tra-1-60 (E) y
Tra-1-81 (F) (Chemicon, Temecula, CA). Barra de escala = 200 m.
A
B
C
D
E
F
A
B
Página 12 de 24
F
D
Ensayos de actividad de fosfatasa alcalina en VAL-11B
Inmunocitoquímica para isoenzima Fosfatasa Alcalina clon TRA 2-54/2J (Chemicon,Temecula,CA) (A) ; DAPI (B);
Fosfatasa Alcalina + DAPI (C). Barra de escala = 200 m.
C
B
A
A
Expresión de marcadores moleculares de indiferenciación de VAL-11B
RT-PCR positiva en pase 5 para Oct-3/4 (1), Nanog (2) Cripto (3), Dnmt3 (4), Gabr (5), y Gdf3 (6) y negativa para
Nfh (7), Ren (8) y Amy (9). El control interno de expresión utilizado es RPL19 (10).
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Página 13 de 24
Determinación de la existencia de actividad telomerasa en VAL-11B
La detección de la actividad telomerasa característica de células inmortales se ha realizado mediante una
reacción de PCR utilizando un kit específico (TRAPEZE  Telomerase Detection Kit; Chemicon, Australia) y tinción
con SYBR (Molecular probes, USA). Como controles negativos, se utilizaron células de la línea VAL-11B
inactivadas por calor (1), y fibroblastos (2). Se utilizó otra línea de células madre embrionarias humanas como
control positivo (3) mientras que el análisis se realizó sobre células intactas de VAL-11B en pase 5 (4).
1
2
3
4
Página 14 de 24
ESTUDIO DEL CARIOTIPO DE VAL-11B
Llevado a cabo en el pase 5, por un laboratorio independiente (IVI Murcia, España).
Página 15 de 24
PLURIPOTENCIALIDAD DE VAL-11B
Diferenciación espontánea in vitro de VAL-11B
Por flotación, en placas de no adhesión, se generan cuerpos embriodes y se mantienen en esas condiciones entre 4
y 7 días. Barra de escala = 1000 m.
Transcurrido ese tiempo, los cuerpos embrioides se transfieren a placas cubiertas con gelatina 1% para facilitar su
adhesión. Durante el cultivo en placa, se obtuvieron diferentes tipos celulares y a los 7 días se observaron focos de
latido. Barra escala = 100 m.
Página 16 de 24
Tras 10-14 días, se fijan y se analizan marcadores de diferenciación característicos de (A) ectodermo (tubulin, -III),
(B) mesodermo (actina muscular) y (C) endodermo (-fetoproteína). Barra de escala = 50 m.
Página 17 de 24
Diferenciación espontánea in vivo de VAL-11B
Para desarrollar los experimentos de diferenciación in vivo de las líneas, se utilizan ratones macho de 8 semanas de
edad, con inmunodeficiencia severa combinada (SCID). Las colonias de células madre utilizadas se aíslan
mecánicamente de la monocapa de feeder. Se inyectan 30 colonias por testículo. La aparición de tumores se puede
detectar por palpación transcurridas 8 semanas de la inyección. El desarrollo de los mismos se mantiene durante 24 semanas más, momento en el que los animales se sacrifican por desnucación cervical.
Página 18 de 24
Las muestras son fijadas y enviadas para estudio anatomopatológico por parte de un laboratorio independiente
(CITOPAT, S.L.).
Página 19 de 24
Microscópicamente, la búsqueda se orienta hacia la identificación de tejidos fácilmente distinguibles como (A)
rosetas neurales, (B) osificación encondral o (C) glándulas. Barra de escala = 100 m.
A
B
A
C
Página 20 de 24
Para confirmar la presencia de derivados de las tres hojas embrionarias, se analizan marcadores de diferenciación
característicos de (A) ectodermo (tubulin, -III), (B) mesodermo (actina muscular) y (C) endodermo (-fetoproteína).
Barra de escala = 100 m.
A
B
A
C
Página 21 de 24
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE VAL-11B
Página 22 de 24
Página 23 de 24
SOPORTE CELULAR
Ficha técnica y análisis microbiológicos del Feeder utilizado en la derivación y mantenimiento de las
líneas:
Página 24 de 24

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