peqGOLD Plant DNA Mini Kit

Transcription

Arbeitsanleitung – Instruction Manual
V0815
INHALT
EINLEITUNG
1
FUNKTIONSPRINZIP
1
KITBESTANDTEILE
2
LAGERUNG
2
BINDEKAPAZITÄT
2
WICHTIGE HINWEISE
3
GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE
4
PEQGOLD PLANT DNA MINI ISOLIERUNGSPROTOKOLLE
6
A. Trockene Proben
B. Frische und gefrorene Proben
C. Kurzprotokoll
6
7
8
AUFKONZENTRIERUNG DER DNA
11
QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER DNA
11
BESTELLINFORMATIONEN
12
TROUBLESHOOTING TIPS
12
CONTENT
INTRODUCTION
13
THEORY
13
KIT COMPONENTS
14
STORAGE AND STABILITY
14
BINDING CAPACITY
14
BEFORE STARTING
15
DANGEROUS COMPONENTS
16
PEQGOLD PLANT DNA ISOLATION PROTOCOL
18
A. Dry Specimens
B. Fresh and frozen Specimens
C. Short protocol
18
19
20
CONCENTRATING THE DNA
22
QUANTITATION AND STORAGE OF DNA
22
ORDERING INFORMATION
23
23
APPENDIX
24
EINLEITUNG
Der peqGOLD Plant DNA Mini Kit bietet eine schnelle und einfache Methode, um bis zu
30 µg Gesamtzell-DNA aus Kern, Plastiden und Mitochondrien von Zellen und Geweben
unterschiedlichster Pflanzenspezies zu isolieren. In weniger als 1 Stunde gestattet er die
Bearbeitung einzelner oder zahlreicher Proben, wobei je Präparation bis zu 50 mg
trockenes oder bis zu 180 mg frisches oder gefrorenes Pflanzenmaterial eingesetzt werden
können. Für das Entfernen der in Pflanzenmaterial meist reichlich vorhandenen
Polysaccharide und Phenole bedient sich der Kit eines einfachen und schnellen
Präzipitationsschrittes. In Verbindung mit der PerfectBind DNA Column kann dadurch
gereinigte DNA von höchster Qualität erhalten werden. Extraktionen mit organischen
Lösungsmitteln wie Phenol oder Chloroform müssen ebenso wenig durchgeführt werden,
wie arbeits- und zeitaufwendige CsCl-Dichtegradientenzentrifugationen. Kontaminationen
und Enzyminhibitoren werden vollständig entfernt.
Genomische DNA, die mit dem peqGOLD Plant DNA Mini Kit isoliert wurde, kann direkt
für alle Arten von Folgeexperimenten, wie PCR, Southern Blotting oder RFLP-Analysen,
weiterverwendet werden.
FUNKTIONSPRINZIP
Der peqGOLD Plant DNA Mini Kit kombiniert die selektiven und reversiblen Bindungseigenschaften von PerfectBind Silikamembranen mit der Schnelligkeit und leichten
Durchführbarkeit von Zentrifugationssäulenmethoden. Ein speziell entwickeltes und
optimiertes Puffersystem erlaubt das Entfernen von sekundären Metaboliten, wie
Polysacchariden und Phenolen, und die Reinigung von bis zu 30 µg DNA mit
Moleküllängen bis 60 kbp.
Die aufzuarbeitenden Proben werden homogenisiert und unter denaturierenden
Bedingungen lysiert. Die vorgereinigte DNA wird danach auf eine PerfectBind DNA
Column geladen, in der die DNA-Moleküle an die enthaltene Silikamembran binden.
Zellulärer Debris, Proteine und sonstige Kontaminationen können durch Waschen mit
speziellen Puffern schnell und einfach entfernt werden. Die gereinigte und qualitativ sehr
hochwertige DNA wird abschließend in Elution Buffer oder sterilem, deionisierten Wasser
eluiert.
PEQLAB_v0815_D
Art.-Nr. 12-3486
1
KITBESTANDTEILE
peqGOLD Plant DNA Mini
Kit
5 Reinigungen
50 Reinigungen
200 Reinigungen
12-3486-00
12-3486-01
12-3486-02
PerfectBind DNA Columns
5
50
200
Microfilter
5
50
200
2.0 ml Collection Tubes
20
200
800
Lysis Buffer PL1
2 x 1.2 ml
25 ml
100 ml
Lysis Buffer PL2
0.8 ml
7.5 ml
30 ml
DNA Binding Buffer
1.4 ml
12.5 ml
50 ml
4 ml
40 ml
3 x 40 ml
2 x 1.5 ml
25 ml
90 ml
80 µl
800 µl
2 x 1.6 ml
1
1
1
Bestellnummer
Bestandteile
DNA Wash Buffer (Konz.)
Elution Buffer
RNase A (20 mg/ml)
Arbeitsanleitung
LAGERUNG
Die Aufbewahrung von RNase A sollte bei 4 °C erfolgen, alle anderen Komponenten des
peqGOLD Plant DNA Mini Kits können bei Raumtemperatur gelagert werden. Bei einer
Umgebungstemperatur von 22 – 25 °C bleiben die Komponenten des Kits für mindestens
12 Monate ab Lieferung stabil. Kristalle, die sich während der Lieferung oder Lagerung
im DNA Binding Buffer bilden, sollten durch Erwärmen auf 37 °C wieder gelöst werden.
BINDEKAPAZITÄT
Jede PerfectBind DNA Column kann bis zu 30 µg genomischer DNA binden. Es sollten
nicht mehr als die angegebenen Mengen an Ausgangsmaterial eingesetzt werden.
PEQLAB_v0815_D
Art.-Nr. 12-3486
2
WICHTIGE HINWEISE
Bitte lesen Sie das vorliegende Protokoll vor der ersten Verwendung des Kits vollständig
durch und legen Sie vor Präparationsbeginn alle für die Isolierung benötigten Materialien
bereit.
! Bei niedrigen Außentemperaturen kann es im DNA Binding Buffer zur Bildung von
Salzkristallen kommen. Diese Kristallbildung ist normal, sollte aber vor der Verwendung
des Puffers durch Erwärmen auf 37 °C rückgängig gemacht werden.
! DNA Wash Buffer wird als Konzentrat geliefert und muss vor seiner ersten Verwendung
mit absolutem Ethanol verdünnt werden:
Kit 12-3486-00
4 ml DNA Wash Buffer mit 6 ml 100 % EtOH mischen.
Kit 12-3486-01
40 ml DNA Wash Buffer mit 60 ml 100 % EtOH mischen.
Kit 12-3486-02
3 x 40 ml DNA Wash Buffer mit 3 x 60 ml 100 % EtOH mischen.
! Verdünnter DNA Wash Buffer sollte bei Raumtemperatur gelagert oder vor seiner
Verwendung auf Raumtemperatur gebracht werden.
! Alle Zentrifugationsschritte müssen bei 22 – 25 °C ausgeführt werden.
PEQLAB_v0815_D
Art.-Nr. 12-3486
3
GEFÄHRLICHE INHALTSSTOFFE
Bestandteile
Signalwort /
Symbole
Gefährliche
Inhaltsstoffe
H- und P-Sätze
-
-
-
Microfilter
-
-
-
-
-
-
Lysis Buffer PL1
--- (not necessary)
sodium dodecyl sulphate
1-≤2.5%, CAS: 151-21-3
--- (not necessary)
Lysis Buffer PL2
DANGER
guanidinium thiocyanate
25-50%, CAS: 593-84-0
H302+H312+H332,
H314, H412, P101,
P102, P103, P260,
P280,
P303+P361+P353,
P305+P351+P338,
P405, P501
DNA Binding Buffer
DANGER
propan-2-ol 50-100%,
CAS: 67-63-0
H225, H319, H336,
P101, P102, P103,
P210, P261,
P303+P361+P353,
P305+P351+P338,
P405, P501
-
-
-
Elution Buffer
-
-
-
DANGER
Nuclease, ribo- 20
mg/ml, CAS: 9001-99-4
H317, H334, P261S,
P280sh, P302+P352,
P304+340,
P333+P313,
P342+P311, P363
RNase A (20 mg/ml)
PEQLAB_v0815_D
Art.-Nr. 12-3486
4
H- und P-Sätze
H225
H302+H312+H332
Erläuterungen
Flüssigkeit und Dampf leicht entzündbar.
Gesundheitsschädlich bei Verschlucken, Hautkontakt oder
Einatmen.
H314
Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere
Augenschäden.
H317
H319
H334
Kann allergische Hautreaktionen verursachen.
Verursacht schwere Augenreizung.
Kann bei Einatmen Allergie, asthmaartige Symptome oder
Atembeschwerden verursachen.
H336
H412
Kann Schläfrigkeit und Benommenheit verursachen.
Schädlich für Wasserorganismen, mit langfristiger Wirkung.
P101
Ist ärztlicher Rat erforderlich, Verpackung oder
Kennzeichnungsetikett bereithalten.
P102
P103
P210
Darf nicht in die Hände von Kindern gelangen.
Vor Gebrauch Kennzeichnungsetikett lesen.
Von Hitze, heissen Oberflächen, Funken, offenen Flammen
sowie anderen Zündquellenarten fernhalten. Nicht rauchen.
P260
Staub/Rauch/Gas/Nebel/Dampf/Aerosol nicht einatmen.
P261
Einatmen von Staub/Rauch/Gas/Nebel/Dampf/Aerosol
vermeiden.
Einatmen von Staub vermeiden
Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschutz
tragen.
P261S
P280
P280sh
P302+P352
Schutzhandschuhe/Augenschutz tragen.
BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT: Mit viel Wasser/… waschen.
P303+P361+P353
BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT (oder dem Haar): Alle
kontaminierten Kleidungsstücke sofort ausziehen. Haut mit
Wasser abwaschen/duschen.
P304+P340
BEI EINATMEN: Die Person an die frische Luft bringen und für
ungehinderte Atmung sorgen.
BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam
mit Wasser ausspülen. Eventuell vorhandene Kontaktlinsen nach
Möglichkeit entfernen. Weiter ausspülen.
P305+P351+P338
P333+P313
P342+P311
P363
P405
P501
Bei Hautreizung oder -ausschlag: Ärztlichen Rat
einholen/ärztliche Hilfe hinzuziehen.
Bei Symptomen der Atemwege:
GIFTINFORMATIONSZENTRUM/Arzt/… anrufen.
Kontaminierte Kleidung vor erneutem Tragen waschen.
Unter Verschluss aufbewahren.
Inhalt/Behälter … zuführen.
PEQLAB_v0815_D
Art.-Nr. 12-3486
5
PEQGOLD PLANT DNA MINI ISOLIERUNGSPROTOKOLLE
A. Trockene Proben
Das Trocknen von im Feld gesammeltem Pflanzenmaterial erlaubt eine sichere
Aufbewahrung der Proben auch über längere Zeiträume. Zu diesem Zweck kann das
Material beispielsweise über Nacht bei 45 °C inkubiert, pulverisiert und danach bei
Raumtemperatur trocken aufbewahrt werden.
Benötigte Materialien, die nicht mitgeliefert werden:
! Thermo-Shaker vorgewärmt auf 65 °C
! Steriles, deionisiertes Wasser (optional)
! Sterile Pipettenspitzen und Zentrifugenröhrchen
! 100 % Ethanol
! Eis
1. Homogenisierung und Lyse
10 bis 50 mg getrocknetes Pflanzenmaterial in ein 1.5 ml Zentrifugenröhrchen füllen und
mit einem Einmal-Pelletpistill fein zermahlen oder mithilfe eines Mörsers in flüssigem
Stickstoff homogenisieren.
Mörsern mithilfe von Seesand ist ebenfalls möglich. Alternativ zur manuellen
Homogenisation können auch kommerziell verfügbare Homogenisatoren (z.B. Precellys 24)
verwendet werden. Je feiner das Ausgangsmaterial pulverisiert wurde, desto besser ist die
zu erwartende Qualität und Quantität der isolierten DNA.
Für sensitive Folgeexperimente, wie PCR-Analysen und Klonierungen, sollten die Pistille nach
Möglichkeit nur einmal verwendet werden. Im Falle mehrfacher Verwendung sollten sie sofort nach
ihrer Verwendung und bis zu ihrer Reinigung in einer verdünnten Bleichlösung aufbewahrt werden.
Einmal-Pelletpistille können in der Regel mehrere Male autoklaviert werden. Für Standardanalysen,
wie RFLP-Analysen und Southern Blotting, können die Pistille einige Male wiederverwendet werden.
Zwischen zwei Verwendungen sollten sie mit Ethanol gewaschen und trockengewischt werden. Bei
der DNA-Isolierung aus mehreren Proben sollten nicht mehr als vier bis sechs Ansätze gleichzeitig
bearbeitet werden.
Nacheinander 400 µl Lysis Buffer PL1 und 15 µl RNase A (20 mg/ml) zugeben und durch
Vortexen für 10 sec mischen, bis alle Klumpen aufgelöst sind. Ansatz bei 65 °C in einem
Thermo-Shaker für 30 Minuten inkubieren. Wenn kein Thermo-Shaker verfügbar ist, den
Ansatz während der Inkubationszeit 3 – 4 mal für 10 sec vortexen.
100 µl Lysis Buffer PL2 zugeben und durch Vortexen für 5 sec mischen. Inkubation auf Eis
für 5 min. Ansatz für 5 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren.
Microfilter in ein frisches 2.0 ml Collection Tube stecken. Überstand vorsichtig in den
Microfilter überführen, ohne dabei Teile des Debrispellets zu verschleppen. Für 1 Minute
bei 10.000 x g* zentrifugieren. Microfilter verwerfen. Durchfluss im nächsten Schritt
weiterverwenden.
Nach der Lyse wird mit dem Protokoll ab Schritt 2 (Seite 9) weitergearbeitet.
* Umrechnung g (rcf) / rpm siehe Appendix, S. 24
PEQLAB_v0815_D
Art.-Nr. 12-3486
6
B. Frische und gefrorene Proben
Das folgende Protokoll ist für effiziente Gesamtzell-DNA-Isolierungen aus frischem oder
gefrorenem Material unterschiedlichster Pflanzenspezies geeignet. Wegen der in
Pflanzengeweben sehr großen Variationsbreite der Wasser- und Polysaccharidgehalte
sollte die bearbeitete Probenmenge auf maximal 100 mg beschränkt bleiben. Bei Proben,
die sehr viel Wasser enthalten, können bis zu 120 – 180 mg Ausgangsmaterial eingesetzt
werden. Für erste Versuche mit einer bisher noch nicht bearbeiteten Pflanzenspezies
empfiehlt es sich, die Aufarbeitung zunächst mit weniger Ausgangsmaterial durchzuführen
und die Ausgangsmenge erst nach Erhalt zufriedenstellender Ergebnisse zu erhöhen. Die
quantitativ und qualitativ besten Isolierungsergebnisse werden in der Regel aus jungen
Blättern und Nadeln erzielt.
! 100 % Ethanol
! Eis
Bis zu 100 mg Gewebe in ein 1.5 oder 2 ml Zentrifugenröhrchen überführen und durch
Zugabe von flüssigem Stickstoff tiefgefrieren. Gewebe danach mit einem EinmalPelletpistill zu möglichst feinem Pulver zermahlen oder mithilfe eines Mörsers in flüssigem
Stickstoff homogenisieren. Mörsern mithilfe von Seesand ist ebenfalls möglich. Alternativ
zur manuellen Homogenisation können auch kommerziell verfügbare Homogenisatoren
(z.B. Precellys 24) verwendet werden. Je feiner das Ausgangsmaterial pulverisiert wurde,
desto besser ist die zu erwartende Qualität und Quantität der isolierten DNA.
Alternativ kann man den flüssigen Stickstoff verdampfen lassen und die Proben bei –70 °C lagern,
um diese später zu verwenden. Für sensitive Folgeexperimente, wie PCR-Analysen und
Klonierungen, sollten die Pistille nach Möglichkeit nur einmal verwendet werden. Im Falle
mehrfacher Verwendung sollten sie sofort nach ihrer Verwendung und bis zu ihrer Reinigung in
einer verdünnten Bleichlösung aufbewahrt werden. Einmal-Pelletpistille können in der Regel mehrere
Male autoklaviert werden. Für Standardanalysen, wie RFLP-Analysen und Southern Blottings,
können die Pistille einige Male wiederverwendet werden. Zwischen zwei Verwendungen sollten sie
mit Ethanol gewaschen und trockengewischt werden. Bei der DNA-Isolierung aus mehreren Proben
sollten nicht mehr als vier bis sechs Ansätze gleichzeitig bearbeitet werden.
Nacheinander 400 µl Lysis Buffer PL1 und 15 µl RNase A (20 mg/ml) zugeben und durch
Vortexen für 10 sec mischen, bis alle Klumpen aufgelöst sind. Ansatz bei 65 °C in einem
Thermo-Shaker für 30 Minuten inkubieren. Wenn kein Thermo-Shaker verfügbar ist, den
Ansatz während der Inkubationszeit 3 – 4 mal für 10 sec vortexen.
100 µl Lysis Buffer PL2 zugeben und durch Vortexen für 5 sec mischen. Inkubation auf Eis
für 5 min. Ansatz für 5 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren.
PEQLAB_v0815_D
Art.-Nr. 12-3486
7
weiterverwenden.
C. Kurzprotokoll
Das folgende, vereinfachte Protokoll erlaubt die schnelle Präparation kleinerer DNAMengen aus getrocknetem, frischen oder gefrorenen Pflanzen-material für die Verwendung
in PCR-Reaktionen. Für andere Folgeanwendungen sollte die Präparation nach den
Protokollen A oder B durchgeführt werden.
! 100 % Ethanol
! Eis
Bis zu 10 mg trockenes oder bis zu 40 mg frisches oder gefrorenes Pflanzenmaterial in
1.5 ml Zentrifugenröhrchen zermahlen, wie in den Protokollen A und B angegeben. 400 µl
Lysis Buffer PL1 und 15 µl RNase A (20 mg/ml) und durch Vortexen für 10 sec mischen.
Ansatz bei 65 °C in einem Thermo-Shaker für 30 Minuten inkubieren. Wenn kein ThermoShaker verfügbar ist, den Ansatz während der Inkubationszeit 3 – 4 mal für 10 sec
vortexen. 100 µl Lysis Buffer PL2 zugeben und durch Vortexen für 5 sec mischen.
Inkubation auf Eis für 5 min. Ansatz für 5 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit
zentrifugieren.
weiterverwenden.
PEQLAB_v0815_D
Art.-Nr. 12-3486
8
2. Laden und Binden
0.5 Volumen (i.d.R. 225 µl) DNA Binding Buffer zugeben und mittels Pipettieren sorgfältig
mischen.
Eine PerfectBind DNA Column in ein 2.0 ml Collection Tube stecken und gesamten Ansatz
einschließlich eventuell auftretender Präzipitate auf die PerfectBind DNA Column laden.
PerfectBind DNA Column im Collection Tube für 1 Minute bei 10.000 x g* zentrifugieren.
Säulendurchfluss und Collection Tube verwerfen.
Beachte: Sollte das Lysat nicht vollständig durch den Filter gelaufen sein, dann
Zentrifugationsschritt wiederholen.
3. Waschen I
PerfectBind DNA Column in ein frisches 2.0 ml Collection Tube stecken und 650 µl des
komplettierten DNA Wash Buffers (Pufferkonzentrat plus 1.5 Volumen absolutes Ethanol)
auf die PerfectBind DNA Column pipettieren. PerfectBind DNA Column im Collection Tube
für 1 Minute bei 10.000 x g* zentrifugieren. Säulendurchfluss und Collection Tube
verwerfen.
4. Waschen II
Nochmals mit 650 µl DNA Wash Buffer waschen, wie in Schritt 3 beschrieben.
5. Trocknen (Essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!)
PerfectBind DNA Column in das geleerte 2.0 ml Collection Tube stecken und durch
Zentrifugieren für 2 Minuten bei 10.000 x g* vollständig trocknen.
6. Elution
PerfectBind DNA Column in ein sauberes 1.5 ml Zentrifugenröhrchen stecken und 100 200 µl Elution Buffer oder steriles, deionisiertes Wasser auf die PerfectBind DNA Column
pipettieren. PerfectBind DNA Column für ca. 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren
und danach für 1 Minute bei 6.000 x g* zentrifugieren. Elution eventuell mit weiteren
100 µl vorgewärmtem Elution Buffer wiederholen.
Bei jeder Elution mit 100 µl Elution Buffer oder sterilem, deionisierten Wasser werden bis zu 70 %
der gebundenen DNA eluiert. Zwei Elutionsrunden ermöglichen deshalb eine Wiederfindungsrate
von rund 90 %. Dabei ist allerdings zu beachten, dass mehrere Elutionsrunden zwar den absoluten
Ertrag erhöhen, dafür jedoch die Konzentration erniedrigen. Für hochkonzentrierte DNA kann die
Elution bei leicht reduziertem Gesamtertrag auch mit 50 µl bis 100 µl Elution Buffer durchgeführt
werden. Puffervolumina unter insgesamt 50 µl führen allerdings zu einer deutlichen Reduktion der
Erträge. Durch eine fünfminütige Inkubation der PerfectBind DNA Column bei 70 °C anstatt bei
Raumtemperatur oder Verwendung von auf 70 °C vorgewärmtem Elution Buffer kann der
Elutionsertrag noch etwas erhöht werden. Für die zweite Elution kann auch das erste Eluat
verwendet werden. Dadurch wird bei höherer Endkonzentration ebenfalls der Gesamtertrag
PEQLAB_v0815_D
Art.-Nr. 12-3486
9
verbessert. Er bleibt aber ca. 30 % hinter dem Ertrag zurück, der bei einer Nachelution mit einem
zweiten Aliquot Elution Buffer erreicht werden kann. Der erwartete Gesamtertrag aus 50 mg
getrocknetem Pflanzenmaterial liegt bei rund 10 – 30 µg DNA, bei 200 mg frischem oder
gefrorenen Pflanzenmaterial bei rund 20 – 30 µg DNA. Bei 10 mg trockenem oder bis zu 40 mg
frischem oder gefrorenem Material liegt der erwartete Gesamtbetrag bei rund 2 – 10 µg DNA.
PEQLAB_v0815_D
Art.-Nr. 12-3486
10
AUFKONZENTRIERUNG DER DNA
Genomische DNA, die mit dem peqGOLD Plant DNA Mini Kit aufgereinigt wurde, kann
bei Bedarf noch weiter konzentriert werden. Hierzu zunächst NaCl bis zu einer
Endkonzentration von 0.1 M und danach 2 Volumen absolutes Ethanol zugeben. Ansatz
durch Vortexen sorgfältig mischen und für 10 Minuten bei –20 °C inkubieren. Danach für
15 Minuten bei 10.000 x g* zentrifugieren und Überstand verwerfen. 700 µl 80 % Ethanol
zugeben und für 2 Minuten bei 10.000 x g* zentrifugieren. Überstand verwerfen, Pellet für
2 Minuten lufttrocknen und DNA in 20 µl sterilem, deionisierten Wasser oder 10 mM TrisHCl, pH 9.0 lösen.
QUANTIFIZIERUNG UND LAGERUNG DER DNA
Um die Konzentration und Reinheit einer DNA-Lösung zu bestimmen, muss die Absorption
eines geeignet verdünnten Aliquots (10- bis 50-fach) bei 260 nm und 280 nm gemessen
werden. Eine A260-Einheit entspricht dabei 50 µg DNA/ml. Die Konzentration berechnet
sich demnach wie folgt:
DNA-Konzentration (µg/ml) = Absorption260 x 50 x Verdünnungsfaktor
Das A260/280-Verhältnis reiner Nukleinsäuren liegt bei 2.0. Das mit dem peqGOLD Plant
DNA Mini Kit erzielbare Verhältnis von 1.7 bis 1.9 entspricht deshalb genomischer DNA
einer Reinheit von 85 % bis 95 %.
Alternativ können der ungefähre Ertrag und die Qualität der erhaltenen DNA auch durch
Agarosegelelektrophorese mit anschließender Ethidiumbromidfärbung und Vergleich mit bekannten
DNA-Proben bestimmt werden.
Genomische DNA, die mit dem peqGOLD Plant DNA Mini Kit aufgereinigt wurde, kann in
10 mM Tris-HCl (pH 9.0) oder sterilem, deionisierten Wasser für mehrere Jahre bei –20 °C
aufbewahrt werden. Dabei ist zu beachten, dass häufiges Auftauen und Einfrieren zum
Scheren der DNA und damit zu einer sukzessiven Reduktion der Molekülgrößen führt.
PEQLAB_v0815_D
Art.-Nr. 12-3486
11
BESTELLINFORMATIONEN
für die Isolierung von DNA aus Zellen und Geweben von Pflanzen und Pilzen:
12-3486-00
12-3486-01
12-3486-02
5 Reinigungen
50 Reinigungen
200 Reinigungen
peqGOLD Fungal DNA Mini Kit
12-3490-00
12-3490-01
12-3490-02
5 Reinigungen
50 Reinigungen
200 Reinigungen
Problem
Ursache
Abhilfe
PerfectBind DNA
Column verstopft
Debrisübertragung
Vor der Präzipitation mit DNA Binding Buffer darf
kein Debris übertragen werden.
Zu große Probenmenge
DNA Lysis Buffer DNA Binding Buffer-Volumen an
die Probenmenge anpassen und Lysat auf
mehrere Säulen verteilen.
Lysat zu viskös
In Protokoll C darf die angegebene Höchstmenge
an Ausgangsmaterial nicht überschritten werden.
Alternativ können die Mengen an DNA Lysis
Buffer PL1 und DNA Lysis Buffer PL2 erhöht und
mehrere PerfectBind DNA Columns je Probe
verwendet werden.
Unvollständige
Homogenisierung
Alle Arten von Ausgangsmaterial müssen vor der
Zugabe von DNA Lysis Buffer PL1 fein zermahlen
werden.
Unvollständige Lyse
Menge an Ausgangsmaterial reduzieren oder
mehr DNA Lysis Buffer PL1 und DNA Lysis Buffer
PL2 einsetzen.
DNA nicht von der
PerfectBind DNA Column
eluiert
Volumen des Elution Buffers auf 200 µl erhöhen
und PerfectBind DNA Column vor der
Zentrifugation für rund 5 Minuten bei 70 °C
inkubieren.
DNA vor der Elution von
der PerfectBind DNA
Column gewaschen
DNA Wash Buffer muss vor seiner Verwendung
mit 1.5 Volumen absolutem Ethanol verdünnt
werden.
Salzübertragung
DNA Wash Buffer muss Raumtemperatur haben.
Ethanolübertragung
Nach dem zweiten Waschen muss die PerfectBind
DNA Column durch Zentrifugieren für 2 Minuten
bei 10.000 x g* getrocknet werden.
Niedriger DNAErtrag
Probleme bei
Folgeanwendungen
PEQLAB_v0815_D
Art.-Nr. 12-3486
12
INTRODUCTION
The peqGOLD Plant DNA Miniprep Kit allows rapid and reliable isolation of up to 30 µg
high-quality total cellular DNA from a wide variety of plant species and tissues. Up to
180 mg of fresh or frozen tissue or 50 mg dry tissue can be processed in less than
1 hour. The system combines the reversible nucleic acid-binding properties of PerfectBind
matrix with the speed and versatility of PerfectBind DNA Column technology to eliminate
polysaccharides, phenolic compounds and enzyme inhibitors from plant tissue lysates.
Purified DNA is suitable for PCR, restriction digestion and hybridization techniques. There
are no organic extractions thus reducing plastic waste and hands-on time to allow
multiple samples to be processed in parallel. There is no need for phenol/chloroform
extractions. Time-consuming steps such as CsCl gradient ultracentrifugation or
precipitation with isopropanol or ethanol are eliminated.
Genomic DNA purified using the peqGOLD Plant DNA Mini Kit is ready for downstream
applications such as PCR, Southern blotting or RFLP analysis.
THEORY
The peqGOLD Plant DNA Kit uses the reversible nucleic acid-binding properties of the
PerfectBind matrix, combined with the speed of mini-column spin technology. A
specifically formulated buffer system allows up to 30 µg of genomic DNA with fragment
lengths up to 60 kbp to bind to the matrix.
Dry or fresh plant tissue is disrupted and then lysed in a specially formulated buffer
containing detergent. Proteins, polysaccharides and cellular debris are subsequently
precipitated. Binding conditions are then adjusted and the sample is applied to a
PerfectBind DNA Column. Two rapid wash steps remove trace contaminants such as
residual polysaccharides and pure DNA is eluted in Elution Buffer or water. Purified DNA
can be directly used in downstream applications without the need for further purification.
PEQLAB_v0815_E
Ord.-No. 12-3486
13
KIT COMPONENTS
peqGOLD Plant DNA Mini
Kit
5 Purifications
50 Purifications
200 Purifications
12-3486-00
12-3486-01
12-3486-02
5
50
200
Microfilter
5
50
200
20
200
800
Lysis Buffer PL1
2 x 1.2 ml
25 ml
100 ml
Lysis Buffer PL2
0.8 ml
7.5 ml
30 ml
DNA Binding Buffer
1.4 ml
12.5 ml
50 ml
4 ml
40 ml
3 x 40 ml
2 x 1.5 ml
25 ml
90 ml
80 µl
800 µl
2 x 1.6 ml
1
1
1
Product Number
Components
DNA Wash Buffer (conc.)
Elution Buffer
RNase A (20 mg/ml)
Instruction manual
STORAGE AND STABILITY
RNase A has to be stored at 4 °C, all other kit components should be stored at room
temperature (22 to 25 °C) and will then remain stable for at least 12 months after the date
of purchase. During shipment crystals may form in the DNA Binding Buffer. Warm up to
37 °C to dissolve.
BINDING CAPACITY
The binding capacity of a PerfectBind DNA Column is 30 µg DNA. Do not use more cell
or tissue material than indicated.
PEQLAB_v0815_E
Ord.-No. 12-3486
14
BEFORE STARTING
Briefly examine this booklet and become familiar with each step. Prepare all components
and have the necessary materials ready before starting.
!
Under cool ambient conditions, crystals may form in the DNA Binding Buffer. This is
normal and the bottle should be warmed to 37 °C to dissolve the salt before use.
!
DNA Wash Buffer is concentrated and has to be diluted with absolute ethanol as
follows:
Kit 12-3486-00
Add 6 ml 100 % EtOH to 4 ml DNA Wash Buffer
Kit 12-3486-01
Add 60 ml 100 % EtOH to 40 ml DNA Wash Buffer
Kit 12-3486-02
Add 3 x 60 ml 100 % EtOH to 3 x 40 ml DNA Wash Buffer
!
Store diluted DNA Wash Buffer at room temperature or equilibrate to room
temperature before using.
!
All steps must be carried out at room temperature (22 – 25 °C).
PEQLAB_v0815_E
Ord.-No.: 12-3486
15
DANGEROUS COMPONENTS
Components
Signal word /
symbols
Dangerous
components
H and P statements
-
-
-
Microfilter
-
-
-
-
-
-
Lysis Buffer PL1
--- (not necessary)
sodium dodecyl sulphate
1-≤2.5%, CAS: 151-21-3
--- (not necessary)
Lysis Buffer PL2
DANGER
guanidinium thiocyanate
25-50%, CAS: 593-84-0
H302+H312+H332,
H314, H412, P101,
P102, P103, P260,
P280,
P303+P361+P353,
P305+P351+P338,
P405, P501
DNA Binding Buffer
DANGER
propan-2-ol 50-100%,
CAS: 67-63-0
H225, H319, H336,
P101, P102, P103,
P210, P261,
P303+P361+P353,
P305+P351+P338,
P405, P501
-
-
-
Elution Buffer
-
-
-
DANGER
Nuclease, ribo- 20
mg/ml, CAS: 9001-99-4
H317, H334, P261S,
P280sh, P302+P352,
P304+340,
P333+P313,
P342+P311, P363
RNase A (20 mg/ml)
PEQLAB_v0815_E
Ord.-No.: 12-3486
16
H and P statements
H225
H302+H312+H332
H314
H317
H319
H334
H336
H412
P101
P102
P103
P210
P260
P261
P261S
P280
P280sh
P302+P352
P303+P361+P353
Descriptions
Highly flammable liquid and vapour.
Harmful if swallowed, in contact with skin or if inhaled.
Causes severe skin burns and eye damage.
May cause an allergic skin reaction.
Causes serious eye irritation.
May cause allergy or asthma symptoms or breathing difficulties if
inhaled.
May cause drowsiness or dizziness.
Harmful to aquatic life with long lasting effects.
If medical advice is needed, have product container or label at
hand.
Keep out of reach of children.
Read label before use.
Keep away from heat, hot surfaces, sparks, open flames and other
ignition sources. No smoking.
Do not breathe dust/fume/gas/mist/vapours/spray.
Avoid breathing dust/fume/gas/mist/vapours/spray.
Avoid breathing dust.
Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face
protection.
Wear protective gloves/eye protection.
IF ON SKIN: Wash with plenty of water/…
IF ON SKIN (or hair): Take off immediately all contaminated
clothing. Rinse skin with water/shower.
P304+P340
IF INHALED: Remove person to fresh air and keep comfortable for
breathing.
P305+P351+P338
IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minuts. Remove
contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing.
If skin irritation or rash occurs: Get medical advice/attention.
If experiencing respiratory symptoms: Call a POISON
CENTER/doctor/…
P333+P313
P342+P311
P363
P405
P501
Wash contaminated clothing before reuse.
Store locked up.
Dispose of contents/container to …
PEQLAB_v0815_E
Ord.-No.: 12-3486
17
PEQGOLD PLANT DNA ISOLATION PROTOCOL
A. Dry Specimens
Drying allows storage of field specimens for a prolonged period of time prior to processing.
Samples can be dried overnight in a 45 °C oven, powdered and stored dry at room
temperature.
Materials required, but not supplied:
! Thermo-Shaker equilibrated to 65 °C
! Absolute (96 % – 100 %) ethanol
! Sterile dH2O water (optional)
! Nuclease-free 1.5 ml or 2 ml microfuge tubes
! Ice
1. Homogenization and lysis
To prepare dried samples homogenize 10 – 50 mg sample material via a mortar and
liquid nitrogene or place 10 – 50 mg of dried tissue into a 1.5 ml microcentrifuge tube
and grind using a pellet pestle. Pestling with the aid of sea sand is also possible.
Alternatively, commercially available homogenizers (e.g. Precellys 24) can also be used.
A fine powder will ensure optimal DNA extraction and yield.
For critical work such as PCR and cloning, pestles are best used only once then soaked in a dilute
bleach solution immediately after use until cleaning. Disposable pestles may be autoclaved several
times. For standard applications such as RFLP analysis and Southern analysis, the same pestle can
be reused several times to grind multiple tissue samples by rinsing with ethanol and wiping the
surface clean between samples. When isolating DNA from more samples, do not work with 4 – 6
samples at the same time.
Add 400 µl Lysis Buffer PL1 and 15 µl RNase A (20 mg/ml) to the powdered dry tissue
and vortex for 10 sec to mix. Make sure to disperse all clumps. Incubate at 65 °C in a
Thermo-Shaker for 30 min. If no Thermo-Shaker is available, vortex the sample 3 to
4 times for 10 sec during incubation.
Add 100 µl Lysis Buffer PL2 and vortex for 5 sec to mix. Incubate on ice for 5 min.
Centrifuge for 5 min at maximum speed.
Place a Micrcofilter into a fresh 2.0 ml Collection Tube. Apply the supernatant thoroughly to
the Microfilter. Centrifuge for 1 min at 10.000 x g*. Discard the Microfilter. Use the flowthrough liquid in the next step.
After lysis continue with step 2 of the protocol (page 20).
* Translation of g (rcf) / rpm see Appendix, page 24
PEQLAB_v0815_E
Ord.-No.: 12-3486
18
B. Fresh and frozen Specimens
This protocol is suitable for most fresh or frozen tissue samples allowing more efficient
recovery of DNA. However, due to the tremendous variation in water and polysaccharide
content of plants, sample size should be limited to < 100 mg. Using samples that contain
plenty of water, 120 – 180 mg of material can be applied. For first experiments with a
not yet applied plant species begin with less amount of material and increase the amount
after achieving satisfying results. Best results are obtained with young leaves or needles.
! Ice
Collect tissue and homogenize 100 mg via a mortar and liquid nitrogen or place 100 mg
in a 1.5 ml or 2.0 ml microcentrifuge tube and freeze by dipping in liquid nitrogen with a
pair of tweezers to fill the tube. Grind the tissue using disposable pellet pestles. Pestling
with the aid of sea sand is also possible. Alternatively, commercially available
homogenizers (e.g. Precellys 24) can also be used.
Alternatively, one can allow liquid nitrogen to evaporate and then store samples at –70 °C for
later use. For critical work such as PCR and cloning, pestles are best used only once, then soaked
in a dilute bleach solution immediately after use until cleaning. Disposable pestles may be
autoclaved several times. For standard application such as RFLP analysis and Southern analysis,
the same pestle can be reused several times to grind multiple tissue samples by rinsing with
ethanol and carefully wiping the surfaces clean between samples. When isolating DNA from
more samples, do not work with 4 – 6 samples at the same time.
Add 400 µl Lysis Buffer PL1 and 15 µl RNase A (20 mg/ml) to the powdered dry tissue
and vortex for 10 sec to mix. Make sure to disperse all clumps. Incubate at 65 °C in a
Thermo-Shaker for 30 min. If no Thermo-Shaker is available, vortex the sample 3 to
4 times for 10 sec during incubation.
Centrifuge for 5 min at maximum speed.
After lysis continue with step 2 of the protocol (see page 20).
PEQLAB_v0815_E
Ord.-No.: 12-3486
19
C. Short protocol
This simplified method allows rapid isolation of DNA from fresh, frozen or dried
specimens for use in PCR reactions. The procedure limits the amount of starting material,
so that DNA yield will generally be lower than those obtained with protocols A and B.
Thus in most cases there may not be sufficient material for Southern analysis or cloning
work.
! Ice
Use up to 10 mg dry or up to 40 mg fresh or frozen plant material and homogenize as
described in protocol A or B in a 1.5 ml microcentrifuge tube. Add 400 µl Lysis Buffer PL1
and 15 µl RNase A (20 mg/ml). Vortex for 10 sec to mix. Incubate at 65 °C in a ThermoShaker for 30 min. If no Thermo-Shaker is available, vortex the sample 3 – 4 times for
10 sec during incubation.
Centrifuge at maximum speed for 5 min.
After lysis continue with step 2 of the protocol (below).
2. Load and Bind
Add 0.5 volumes (normally 225 µl) DNA Binding Buffer and mix thoroughly by pipetting.
Place a PerfectBind DNA Column into a fresh 2.0 ml Collection Tube and apply the entire
sample, including any precipitates that may have formed, to the PerfectBind DNA
Column. Centrifuge the PerfectBind DNA Column / Collection Tube assembly at
10.000 x g* for 1 min. Discard flow-through liquid and Collection Tube.
PEQLAB_v0815_E
Ord.-No.: 12-3486
20
3. Wash I
Place the PerfectBind DNA Column into a new Collection Tube. Add 650 µl of the DNA
Wash Buffer (completed with 1.5 volumes of 100 % ethanol) to the column and centrifuge
the PerfectBind DNA Column / Collection Tube assembly for 1 min at 10.000 x g*.
Discard flow-throw liquid and Collection Tube.
4. Wash II
Repeat the washing step as described in step 3 with another 650 µl of DNA Wash Buffer.
5. Dry (Important, do not skip this step!)
Place the PerfectBind DNA Column in the 2.0 ml Collection Tube and centrifuge for 2 min
at 10.000 x g* to dry the column matrix.
6. Elution
Transfer the PerfectBind DNA Column to a fresh 1.5 ml Centrifuge tube. Apply
100 – 200 µl Elution Buffer or sterile deionized water and incubate at room temperature
for 2 min. Centrifuge at 6.000 x g* for 1 min to elute DNA. Repeat elution optionally with
an additional 100 µl of prewarmed Elution Buffer.
With every elution with 100 µl Elution Buffer or sterile deionized water, up to 70 % of bound DNA
will be eluted. Two elution rounds allow a recovery rate of approx. 90 %. Consider that multiple
elution rounds increase the DNA yield but decrease the concentration. For highly concentrated
DNA the elution can be made with 50 – 100 µl Elution Buffer and reduced total yield. However
buffer volumes under 50 µl result in a clear reduction of the yield. A 5 minute incubation of the
PerfectBind DNA Column at 70 °C instead of room temperature or usage of 70 °C prewarmed
Elution Buffer can increase the yield. For the second elution the first eluate can also be used.
Thereby the total yield will be increased with a higher end concentration. But it drops behind
approx. 30 % of the yield which can be achieved with a second aliquot of Elution Buffer. Total
DNA yields vary depending on type and quantity of sample. Typically, 10 – 30 µg DNA can be
isolated using 50 mg dried tissue. 20 – 30 µg DNA can be isolated using 200 mg fresh or frozen
tissue. Total DNA yield using the short protocol is about 2 – 10 µg DNA.
PEQLAB_v0815_E
Ord.-No.: 12-3486
21
CONCENTRATING THE DNA
Genomic DNA purified with the peqGOLD Plant DNA Mini Kit can be further concentrated if
required. Add NaCl to an end concentration of 0.1 M and 2 sample volumes of absolute
ethanol. Mix thoroughly by vortexing and incubate for 10 minutes at –20 °C. Centrifuge for
15 minutes at 10.000 x g* and discard the supernatant. Add 700 µl of 80 % ethanol and
centrifuge for 2 minutes at 10.000 x g*. Discard the supernatant, air-dry the pellet for
2 minutes and dissolve the DNA in 20 µl of sterile, deionised water or 10 mM Tris-HCl,
pH 9.0.
QUANTITATION AND STORAGE OF DNA
To determine the concentration and the purity of a DNA containing solution, the absorbance of a 10- to 50-fold diluted aliquot is measured at 260 nm and 280 nm in a
spectrophotometer. One A260 unit corresponds to 50 µg of DNA per ml. The concentration
can be determined as follows:
DNA concentration (µg/ml) = absorbance260 x 50 x dilution factor
The A260/280 ratio of pure nucleic acids is 2.0. Generally genomic DNA isolated with the
peqGOLD Blood DNA Mini Kit shows ratios between 1.7 and 1.9 corresponding to a
purity of 85 % to 95 %.
Alternatively the approximate yield and the quality of the received DNA can also be determined
by agarose gel electrophoresis with subsequent ethidium bromide staining and comparison with
well-known DNA samples.
Genomic DNA isolated with peqGOLD Plant DNA Kits can be stored at –20 °C for years
if eluted in Elution buffer, 10 mM Tris-HCl, pH 9.0 or sterile, deionized water. Repeated
freeze-thaw-cycles can result in shearing of the DNA and therefore successive reduction
of fragment lengths can occur.
PEQLAB_v0815_E
Ord.-No.: 12-3486
22
ORDERING INFORMATION
For DNA isolation from plants and fungal species and tissues
12-3486-00
12-3486-01
12-3486-02
5 Preparations
50 Preparations
200 Preparations
peqGOLD Fungal DNA Mini Kit
12-3490-00
12-3490-01
12-3490-02
5 Preparations
50 Preparations
200 Preparations
Problem
Likely cause
Suggestion
Clogged column
Carry-over of debris
Following precipitation with Lysis Buffer PL2,
make sure no particulate material is transferred.
Sample too viscous
In protocol C, do not exceed suggested amount
of starting material. Alternatively, increase
amounts of Lysis Buffers PL1 and PL2 and use
two or more columns per sample.
Increase volumes of DNA Lysis Buffer and DNA
Binding Buffer. Distribute lysate on more than
one column.
Sample too large
Low DNA yield
Incomplete disruption
of starting material
For both dry and fresh samples, obtain a fine
homogeneous powder before adding Lysis
Buffer PL1.
Poor lysis of tissue
Decrease amount of starting material or
increase amount of Lysis Buffers PL1 and PL2.
DNA remains bound to Increase elution volume to 200 µl and incubate
column
on column at 70 °C for 5 min before
centrifugation.
Problems in
downstream
applications
DNA washed off
Dilute DNA Wash Buffer Concentrate by adding
appropriate volume of absolute ethanol prior to
use (page 13).
Salt carry-over
DNA Wash Buffer must be at room temperature.
Ethanol carry-over
Following the second wash spin, ensure that
centrifuging 2 min at 10.000 x g* dries the
column.
PEQLAB_v0815_E
Ord.-No.: 12-3486
23
APPENDIX
Abb. 1: Umrechnungstabelle rcf/rpm. Werte für Zentrifugen, abhängig vom Rotordurchmesser.
Fig. 1: Table rcf/rpm. Values for centrifuges depending on rotor diameter.
PEQLAB_v0815_E
Ord.-No. 12-3486
24

peqGOLD Plant DNA Mini Kit

Transcription

Similar documents

With hairfor2 you have chosen a unique and innovative product that

Anwenderinformationen für das 6850 Series Steuermodul