Simultanergebnisse mit Multiplex-Tests

Simultanergebnisse mit Multiplex-Tests

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MET H ODE N & AN WE N DU NGEN
Biochips
Simultanergebnisse mit Multiplex-Tests
CLAUDINE DONNELLY, AURORA SINCLAIR
RANDOX L ABORATORIES LTD., CRUMLIN, CO. ANTRIM, UK
Bis zur Einführung der Biochip-Array-Technologie (BAT) im Jahr 2002 sind
diagnostische Tests einzeln durchgeführt worden, obwohl Patienten normalerweise mehrere Tests auf einmal benötigen. Randox ist dieses Problem angegangen und hat BAT zur simultanen Durchführung mehrerer
Tests auf einem Biochip entwickelt. Dieser Chip benötigt nur eine geringe
Menge der zu analysierenden Probe, um mehrere Tests gleichzeitig durchzuführen und ein Patientenprofil zu erstellen. Anwendungsbereiche sind
Screening, Diagnose, Stadieneinteilung und Behandlungsüberwachung
von Krankheiten.
Biochip Array Technology is a revolutionary new technology for the simultaneous testing of multiple parameters on one biochip from one patient
sample.
Die Technologie
ó Die Technologie basiert auf dem Prinzip
kompetitiver und Sandwich-Immunoassays.
Das Abfangagenz ist normalerweise ein Antikörper, kann aber auch ein Antigen sein.
Ein Biochip hat eine Größe von 9 × 9 mm
und besitzt 25 diskrete Testregionen. Von
daher können bis zu 23 verschiedene Tests
auf einem Chip fixiert werden, zwei Testregionen sind für Kontrollen reserviert. Jeder
einzelne Test ist einer bestimmten Testregion
zugeordnet. Die Antikörper für einen
bestimmten Test sind in der entsprechenden
Region richtungsorientiert kovalent gebunden.
Abbildung 1 zeigt einen Sandwich-Immunoassay mit einem Antikörper als Abfangagenz. Ist der Testanalyt in der Probe vor-
˚ Abb. 1: Sandwich-Immunoassay mit
einem Antikörper als Abfangagenz.
handen, wird es als Antigen an die spezifischen Antikörper gebunden.
Sind zum Beispiel zehn
Tests auf einem Chip fixiert,
so werden zehn verschiedene Analyte, sofern in
der Probe vorhanden,
an ihre spezifischen
Antikörper in der
jeweiligen Testregion
gebunden. Je höher die
Konzentration eines Analyts
in der Probe, desto mehr Antigen wird
gebunden. Mit Enzym markierte Antikörper
für jeden Test befinden sich im Reagenz und
binden an die Antigen-Antikörper-Komplexe.
Das Enzym produziert ein chemisches Lichtsignal nach Anbindung an den Komplex. Je
mehr Komplexe entstehen, desto stärker ist
das Lichtsignal. Die Stärke des Lichtsignals
wird dann in Analytkonzentrationen übertragen und ist direkt proportional zur Konzentration.
Beim kompetitiven Immunoassay konkurrieren die zu testenden Analyte in der Patientenprobe mit strukturidentischen, enzymbeladenen Analyten im Reagenz um Anbindung
an den auf dem Biochip fixierten Antikörper.
Je mehr Analyt in der Patientenprobe vorhanden ist, desto weniger enzymbeladenes
Reagenzanalyt wird an die Antikörper gebunden. Daher ist hier die Stärke des Lichtsig-
nals umgekehrt proportional zur Konzentration des zu bestimmenden Analyts.
Analysegeräte
Drei Analysegeräte sind für die Technologie
entwickelt worden. Das Evidence® Analysegerät ist ein freistehender Automat für hohe
Biochip-Durchsatzraten. Dieser Automat ist
2003 mit dem McRobert-Preis der Royal Academy of Engineering (Großbritannien) ausgezeichnet worden und hat dabei im Finale
gegen Rolls Royce gewonnen. Diese Auszeichnung ist eine Anerkennung bedeutender technischer Entwicklungen zum Wohl der
Gesellschaft. Die Royal Academy of Engineering schätzt diese technische Innovation als
„eine signifikante Bereicherung für die
Menschheit“.
Zwei weitere Analysatoren stehen für die
Technologie zur Verfügung. Der Evidence
Investigator™ ist ein halbautomatisches
Tischanalysegerät für geringere Durchsatzraten und der Evidence MultiStat ist für
patientennahe Einzeltests entwickelt worden.
Die eigentliche Analyse erfolgt mithilfe
einer speziellen Kamera, die
mit einem Hochauflösungssensor die Stärke der chemisch produzierten Lichtsignale genau bestimmt. Die
Lichtstärke wird mithilfe
einer Kalibrationskurve in
relative Lichteinheiten (relative light units –
RLUs) umgewandelt. Für kompetitive Immuntests sind die RLUs umgekehrt proportional
und für Sandwich-Assays direkt proportional.
Biochip-Herstellung
Die Herstellung der Biochips unterliegt multidisziplinären Verfahren und einem strengen Qualitätskontrollverfahren. Die Produktion der Biochips findet in einem Reinraum
unter striktesten Konditionen statt.
Der Biochip hat eine Keramikoberfläche, die
sowohl die Stabilität als auch die analytische
Sensitivität der Tests bestimmt. Durch Spektroskopie wird die Oberfläche präpariert,
dann durch verschiedene chemische Prozesse aktiviert, bis eine einheitliche hydrophobe
Fläche entsteht. Die Abfangagenzien für die
jeweiligen Tests werden genau positioniert
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und es werden exakt 10 nl als Tropfen auf die
Oberfläche aufgetragen. Die hydrophobe
Oberfläche verhindert das Ausbreiten der
Flüssigkeit. Dadurch entstehen die Testregionen, von denen jede genau 0,3 nm im
Durchmesser misst. Im Dispenser eingebaute Kameras kontrollieren diesen Vorgang und
zeigen jegliche eventuellen Abweichungsfehler automatisch an.
A
B
C
˚ Abb. 2: A, Analysefoto mit Lichtsignalen von elf verschiedenen Testanalyten und zwei Kontrollstellen; B, einzelner Biochip; C, Auftragen von Antikörpern auf die Biochipplatte.
Herstellung der Testanalyten
Ein Team von knapp 200 Wissenschaftlern
arbeitet an der Herstellung der für die Tests
benötigten Antigene, Antikörper und Konjugate. Die Antigene werden als rekombinante
Proteine, die Antikörper monoklonal, polyklonal oder rekombinant hergestellt. Sowohl
Antikörper als auch Proteine unterliegen
strengsten Kontrollen und entsprechen dem
internationalen Standard ISO 13485.
Arrays
Die Arrays sind zusammengestellt, um auf
bestimmte Krankheiten hin zu testen, oder
in Gruppen verwandter Analyte bei Forschungszwecken und Screenings Verwendung zu finden. Die folgenden Biochip-Arrays
sind momentan verfügbar:
Adhäsionsmoleküle: E-Selektin, L-Selektin, P-Selektin, ICAM-1, VCAM-1
Die Adhäsionsmoleküle können in vier
Gruppen eingeteilt werden: die Selektine, die
Familie der Immunglobuline, Integrine und
Kadherine. Adhäsionsmoleküle spielen eine
Rolle in der Entwicklung und bei Immunprozessen.
Dieser Array ist für Forschungszwecke konzipiert.
Antimikrobiell: Sulphisoxazol, Sulphatjiazol, Sulphaquinoxalin, Sulphapyridin, Sulphamethoxypyridazin, Sulphamethizol, Sulphamethazin, Sulphadoxin, Sulphadimethoxin, Sulphadiazin, Sulphachlorpyridazin
Dieser Array testet Sulphonamidrückstände in Nutztieren, Fleisch und Honig. Anwendung in der Lebensmittelforschung und -Testung.
Herz: CK-MB, Troponin I, GPBB, Myoglobin, CA III, FABP
Dieser Array bietet eine Möglichkeit der
Herzinfarktdiagnose und findet Anwendung
speziell in Notaufnahmen. Für Ergebnisse in
20 Minuten wird er mit dem Evidence MultiStat kombiniert.
Zerebral I: BDNF, h-FABP, GFAP, IL-6
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Zerebral II: NSE, NGAL, sTNFR1, vWF, Ddimer, TM, CRP
Die Zerebral-Arrays wurden für Forschungszwecke entwickelt. Die Analyte sind assoziiert mit neurologischen Funktionsstörungen wie
zum Beispiel Alzheimer, MS und
zerebrovaskuläre Erkrankungen.
Kolorektal-Ca Ranplex:
Der CRC-Array ist ein DNA-Chip,
der 28 mit Kolorektal-Ca assoziierte Mutationen aufdeckt und
dadurch eine non-invasive CRCScreening-Methode bietet.
Zytokine I: EGF, IFN-γ, IL-1α,
IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8,
IL-10, MCP-1, TNF-α, VEGF
Zytokine II: Eotaxin, IGF1-frei,
IL-1Ra, IL12 p40, IP-10, PDGF-AA,
PDGF-BB, RANTES
Zytokine III: GMCSF, IL-5, IL-15, MIP-1α,
TNF-β
Zytokine IV: MMP-9, sIL-2Rα, sIL-6R,
sTNFR I, sTNFR II
Zytokine V: IL-3, IL-7, IL-12p70, IL-13,
IL-23
Zytokine sind Signalstoffe und involviert
in Immun-, Entzündungs- und
Infektionsprozesse. Zytokinrezeptoren sind zum Forschungsschwerpunkt geworden, da ihre
Abwesenheit einen direkten Einfluss auf Immunsuppression hat.
Alle fünf Arrays sind für Forschungszwecke entwickelt.
Missbrauchsdrogen I: Amphetamine,
Methamphetamine, Barbiturate, Benzodiazepine 1, Benzodiazepine 2, Cannabinoide, Benzoylecgonine, Methadone, Opiate, Phencyclidine
Missbrauchsdrogen II: Buprenorphine,
Fentanyl, Hydromorphone, Ketamine, Methaquolone, MDMA (Ecstasy), LSD, Oxicodone,
Propoxyphene
Diese Arrays ermöglichen das Screening
für Missbrauchsdrogen für forensische Zwecke.
Weibliche Hormone: FSH, LH, Östradiol,
Progesteron, Testosteron, Prolaktin
Das Simultantesten dieser Hormone kann
ein Profil erstellen, das wertvolle Aufschlüsse auf Probleme im weiblichen
Hormonzyklus zulässt.
Wachstumsfördernde Drogen:
Zeranol, Trenbolon, Stilben, Stanozolol, Ractopamin, Nandrolon, Boldenon, Kortokosteroide, Beta-Agonisten
Dieser Array ermittelt Rückstände dieser wachstumsfördernden Drogen und findet Anwendung im Sportund Lebensmittelbereich.
Thyroid frei: TSH, T3-frei, T4-frei
Thyroid total: TSH, T3 total,
T4 total
Das Simultanmessen dieser Hormone lässt
Rückschlüsse auf Schilddrüsenstörungen zu.
Prostata-Tumor: CEA, TPSA, FPSA
Array für Prostata-Ca-Screening.
ó
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Korrespondenzadresse:
Claudine Donnelly1
Aurora Sinclair2
Randox Laboratories Ltd.
55 Diamond Road
Crumlin
Co. Antrim
UK-BT29 4QY
Tel.: +44-(0) 28 9442 2413
Fax: +44-(0) 28 9445 2912
Claudine.Donnelly@randox.com
www.randox.com