Erfassung, Beschreibung und Bedeutung von Sequenzvarianten

Transcription

Zentrum für Kardiovaskuläre Genetik und Gendiagnostik
Das Genetikzentrum der Stiftung für Menschen mit seltenen Krankheiten
ASA/SVV Fortbildungsreihe Genetik 2014 - Module 2
Erfassung, Beschreibung und Bedeutung von
Sequenzvarianten sowie Umgang mit Datenbanken
Olten, 28. August 2014
PD Dr. Gabor Matyas, FAMH Medizinische Genetik
Leiter Zentrum für Kardiovaskuläre Genetik & Gendiagnostik
Geschäftsleiter Stiftung für Menschen mit seltenen Krankheiten
www.genetikzentrum.ch, www.stiftung-seltene-krankheiten.ch
Grundlagen - Modul 1
(Rückblick)
http://commons.wikimedia.org/wiki/Image:Karyotype.png
mtDNA
Chatterjee et al., Oncogene (2006) 25: 4663–4674
Das menschliche Erbgut (DNA)
Zellkern
Mitochondrium
3 Milliarden
Buchstaben
im Zellkern
(in jeder Zelle!)
23
ChromosomenPaare
ca. 20‘000
Gene
Transcriptomics
(mRNA)
Proteomics
(Proteins)
Aminosäuren
http://www.nature.com/scitable/topicpage/gene-expression-14121669
Metabolomics,
Glycomics, Lipidomics
UMSETZUNG BAUPLAN
(Momentaufnahme)
Genomics
(DNA)
BAUPLAN
FBN1 – Schematische Darstellung
DNA
...
...
prä-mRNA ...
...
RNA
Synthese
Splicing
mRNA
...
...
Protein
Faltung
Downing et al. 1996. Cell 85:597-605
– Protein:
2871 Aminosäuren
mRNA
N
C
tRNA
Ca
Ca
Ca
Ca
Gen: Abschnitt der DNA, der die Information zur Herstellung eines Proteins trägt
Disulfidbrückenbildung
Calcium-Bindung
Glykosylierung
Veränderung der DNA
Classification of Mutations by Effect on Structure
1. Genome mutations
Numerical change of the whole chromosome set (e.g. triploidy (3n), tetraploidy (4n))
Numerical change of a single chromosome (e.g. trisomy 21, 18, 13)
2. Chromosomal mutations
3. Gene mutations
Point mutations, deletions, insertions
http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Types-of-mutation.png
C>T
A>G
In vitro (Transkript) Analyse
Stille Mutation
c.6354C>T (p.I2118I)
C>T
Exon 50
150bp cF
Intron 50
380bp
Exon 51 Intron 51
...C…
66bp
244bp
Exon 52
117bp
PD Dr. G. Matyas | www.genetikzentrum.ch | www.stiftung-seltene-krankheiten.ch
Intron 52
2247bp
Exon 53
cR 120bp
22.05.2014
Genetic Assessment in
Patients with a Large Aorta
Difficulties
in sequence
data interpretation
In vitro (Transkript)
Analyse
• Prediction of the effect of novel sequence variants
Silent mutation
c.6354C>T (p.I2118I)
Deletion of 66bp (22 amino acids)
c.6314_6379del (p.Glu2105_Val2126del)
C>T
Exon 50
Exon 51 Intron 51
...C…
Intron 50
380bp
150bp cF
M
1.
2.
400bp
66bp
3.
244bp
Exon 52
117bp
Intron 52
2247bp
Exon 53
cR 120bp
a. Heteroduplex of b. + c.
+
300bp
b. Normal transcript
(317bp)
200bp
M
1.
2.
3.
100bp marker
FBN1 c.6354C>T
FBN1 c.6354C>T
Control
c. Transcript with deletion of exon 51
Seminar von PD Dr. G. Matyas
(251bp)
22.09.2009 / 56
22.05.2014 / 10
FBN1 – Schematische Darstellung
DNA
...
...
...
...
RNA
Synthese
Splicing
...
Auswirkung intronischer (+ exonischer)
Mutationen:
- Exon Skipping
...
- Cryptic/Novel Splice Site
- Intron Retention
Ca
Ca
22.05.2014 / 11
Die Änderung im Kodon für dieselbe Aminosäure
(silent mutation) führt zu veränderter Proteintranslation
22.05.2014
PD Dr. G. Matyas | www.genetikzentrum.ch |
www.stiftung-seltene-krankheiten.ch
12
Das Projekt ENCODE (the Encyclopedia of DNA Elements) zeigt, dass das Genom aus
viel mehr als nur aus Genen besteht: Die rund 20'000 proteinkodierenden Gene werden
von etwa vier Millionen «molekularen Schaltern», die je nach Zelltyp gewisse Abschnitte
des Erbguts an oder ausschalten, kontrolliert.
www.studyblue.com
Lesen und Interpretation von
genetischen Informationen
Erfassung (Gentest)
Beschreibung (Nomenklatur)
Bedeutung (Interpretation)
Umgang mit Datenbanken
Detection of Genome and Chromosomal Mutations
1. Genome mutations
>5Mb
Karyotyp
>1Mb
1 Mb BAC Array
Trisomy 21. Fluorescence in situ
hybridization (FISH) of interphase
nuclei (2x green spots 13q14, 3x
red spots 21q22)
www.biyokimya.org/belge/sunu_bclf/05.09.2007/Erdogan.ppt
>100kb
Hochauflösende BAC Array
<10kb
Hochauflösende CGH/SNP Array
Diagram of the microarray-based comparative genomic hybridization (aCGH) process.
Nature Education: www.nature.com/scitable/topicpage/microarray-based-comparative-genomic-hybridization-acgh-45432
Affymetrix SNP Array
NspI/StyI
NspI/StyI NspI/StyI
Modified after www.rzpd.de/public/uploads/ThfjNeCE1H0YahlGJ7bnlQ/MappingAssay-overview.jpg
1. Genome mutations
3. Gene mutations
Dynamic mutations
(tandem repeats that often change size on transmission to children)
15 CAG-Repeats
Size standards
49 CAG-Repeats
FRAXA & AD Trinukleotidexpansionskrankheiten
Risiko für Vollmutation
bei Nachkommen
Krankheit
Prämutation
Vollmutation
Normalbereich
Anzahl (n) der
Basentripletts
(n)
STABIL
5‘UTR
Position der
Basentripletts
Auswirkung
INSTABIL
ATG
(CGG)n
 fehlendes oder
vermindertes
Genprodukt infolge
Hypermethylierung
Krankheit
Fragiles X-Syndrom
Vererbung
X-chromosomal (Xq27.3), jedoch
weder rezessiv noch dominant!
offenes Leseraster (ORF)
Stop
(CAG)n
 Verlust der Proteinaktivität
 Effekte auf andere Proteine
 Effekte der Aggregatbildung
 Toxizität
3‘UTR
(CTG)n
 verminderte
Proteinsynthese
Polyglutaminkrankheiten:
HD, DRPLA
SCA 1, 2, 3, 6, 7
autosomal dominant
DM 1
SCA 8
5‘UTR
(CGG)n
www.studyblue.com
ATG
offenes Leseraster (ORF)
(CAG)n
Stop
3‘UTR
(CTG)n
1. Genome mutations
3. Gene mutations
Point mutations, deletions, insertions, inversions
C>T
A>G
Single nucleotide polymorphisms (SNP) genotyping
1 Hybridization-based methods
1.1 Dynamic allele-specific hybridization
1.2 Molecular beacons
1.3 SNP microarrays
2 Enzyme-based methods
2.1 Restriction fragment length polymorphism
2.2 PCR-based methods
2.3 Flap endonuclease
2.4 Primer extension
2.5 5’ nuclease
2.6 Oligonucleotide ligase assay
3 Other post-amplification methods based on physical properties of DNA
3.1 Single strand conformation polymorphism (SSCP)
3.2 Temperature gradient gel electrophoresis
3.3 Denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC)
3.4 High-Resolution Melting of the entire amplicon
3.5 SNPlex
4 Sequencing
Detection of Gene Mutations
1. Genome mutations
3. Gene mutations
C>T
A>G
• Sanger DNA sequencing
• Next-generation sequencing (NGS)
technologies (targeted, wholeexome, and whole-genome
sequencing)
How to find point mutations and small ins/dels?
DNA-Sequenzierung
Polymerasekettenreaktion (PCR)
Zyklus 35
Zyklus 4
DNA
zu amplifizieren
Schema der PCR
Zyklus 3
Zyklus 2
A>G
Zyklus 1
...
usw.
Zyklus 35
DNA
22 =
4 Kopien
23 =
8 Kopien 16 Kopien 32 Kopien 68 Mrd.
Kopien
236 =
68 Milliarden Kopien
22.05.2014 / 24
Laser-induced fluorescence CE (LIF-CE)
• Cycle Sequencing (only one primer per reaction)
X
ddNTPs during the primer-extension step (=> stop)
5'
5'
5'
5'
C
5'
T
5'
G
5'
A
5'
DNA Sequencing
Example
PD Dr. G. Matyas |
www.genetikzentrum.ch |
17. November 2009 / 25
Point mutations, small deletions/insertions/inversions, dynamic mutations
• PCR-based standard qualitative sequencing (Sanger and NGS)
IntronPrimer F
not analyzed
Exon
analyzed
Long-range PCR
Whole genome sequencing (WGS)
RNA-based transcript analysis (if possible)
Intron+
Primer R
not analyzed
– Chromosom 15q21.1
DNA
...
...
– FBN1: ~237,000 nucleotides
...
...
– 65 Exons
Splicing
...
Protein
Synthese
– Transkript: ~10 Kilobasen
...
– Protein:
2871 Aminosäuren
N
Protein
Faltung
Ca
C
Ca
Ca
Calcium-Bindung
Glykosylierung
Ca
Gen: Abschnitt der DNA, der die Information zur Herstellung eines Proteins trägt
Point mutations, small deletions/insertions/inversions, dynamic mutations
• PCR-based standard qualitative sequencing (Sanger and NGS)
IntronPrimer F
not analyzed
Long-range PCR
Whole genome sequencing (WGS)
RNA-based transcript analysis (if possible)
Exon
Intron+
analyzed
Primer R
not analyzed
Problem:
Deletions and
duplications
larger than the
amplified region
Real-time (long-range) PCR,
MLPA, CGH/SNP arrays,
Quantitative
sequencing
PD Dr. G. Matyas | www.genetikzentrum.ch
| www.stiftung-seltene-krankheiten.ch
(Sanger or NGS), … Southern
DELETION
DUPLICATION
Detection of Large Deletions
How to find large deletions/insertions?
• Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA):
FBN1 Ex 16
FBN1 Ex 13
FBN1 Ex 8
5
FBN1 Ex 9
3
FBN1 Ex 6
0.5
FBN1 Ex 7
0.5
FBN1 Ex 5
1.0
FBN1 Ex 4
1.0
Patient
FBN1 Ex 1
1.5
Kontrolle
FBN1 Ex 2
Relative Genkopienzahl
1.5
0.0
0.0
1
3
5
7
9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41
1
7
9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41
MLPA Fragment
MLPA Fragment
Deletion von Exons 1-16 des FBN1-Gens
22.05.2014 / 29
Detection of Large Deletions
How to find large deletions/insertions?
• Microarrays (SNP and array CGH)
Custom designed array CGH with exon enriched probes (CGH 2.1M, NimbleGen )
Probes of CGH 3x720K
human whole genome
Additional exon probes
Exon-intron annotation,
July 2010
Structural variants, DGV
v0310, July 2010
FBN1
CEP152
SHC4
22.05.2014 / 30
Characterization of large deletions
(Example Sanger sequencing)
46,489,479
46,724,391
46,820,637
FBN1
65
46,890,519 46,903,226
EID1
CEP152
23 17 16 15
1
25
3 21
47,042,933
SHC4
12
1
50 kb
15q21.1
15q21.1
Centromere
Decreased MLPA signals
SNP_A-2221556
rs11070644
46,571,789
SNP_A-2134212
rs2899422
46,888,783
SNP_A-2167448
rs7359317
47,063,708
Loss of heterozygosity
Decreased SNP array signal intensity
LR primer 70F
LR primer 70R
Deletion of 302,580 bp
46,580,456
46,883,035
T T T T GAA TA T T T TCA G TAC T T TAA ACA GC C TAC C CC a t a a t c a t c a t g t t a g a g t c a a t t c a g c t a t a t a t c Junction
Reference sequence
T PD
T TT
GAA
TA
T
T
T
TCA
G
TAC
T
T
TAA
ACA
GC
C
TAC
C
CCCC
A
T
T
CT
T
GA
A
A
T
GA
GGG
A
TA
T
C
C
TA
CA
T
TCGG
A
T
G
46,580,491
Dr. G. Matyas | www.genetikzentrum.ch | www.stiftung-seltene-krankheiten.ch
22.05.2014
/ 31
a t t t t t a t t a a c a t g a a g t t t t t t a c a a a t t t a a c c a t a a t c a t c a t g t t a g a g t c a a t t c a g c t a t a t a t c 46,883,071
Matyas et al., 2007, Hum Genet 122:23-32
1. Genome mutations
3. Gene mutations
C>T
A>G
• Next-generation sequencing (NGS)
technologies (targeted, wholeexome, and whole-genome
sequencing)
DNA Sequencing
• Sanger sequencing
• read length: ~600 bp
• one fragment/sequence per
reaction
• no allele discrimination
• Next generation sequencing (NGS)
• read length: up to ~2 kb
• many sequences per reaction
• allele discrimination
• targeted NGS
• whole exome (WES)
• whole genome (WGS)
33
Target Region &
Exome Sequencing
44 (blood)
280 (blood)
326 (fibroblasts)
29005 (blood)
70344 (blood)
70739 (saliva)
Illumina_V1
Illumina_V4
95
Mean Coverage at 20x [%]
90
85
80
75
70
65
Agilent_V1
Agilent_V2
NimbleGen_V1 NimbleGen_V3
Mean percent of coverage of all RefSeq exons at ≥20× per platform
(Agilent, NimbleGen, Illumina) and vendor (V1, V2, V3, and V4) for all
six DNA samples derived from blood, fibroblasts or saliva.
Comparison of different enrichment platforms and sequencing vendors
Nimblegen
(Roche);
Vendor 3
Nimblegen
(Roche);
Vendor 1
SureSelect
(Agilent);
Vendor 2
SureSelect
(Agilent);
Vendor 1
Nextera
(Illumina);
Vendor 4
Nextera
(Illumina);
Vendor 1
Design:
NimbleGen
SureSelect
Nextera
GC-rich regions - WES
Nimblegen
(Roche);
Vendor 3
Nimblegen
(Roche);
Vendor 1
SureSelect
(Agilent);
Vendor 2
SureSelect
(Agilent);
Vendor 1
Nextera
(Illumina);
Vendor 4
Nextera
(Illumina);
Vendor 1
Design:
NimbleGen
SureSelect
Nextera
Exon 2: 77.5% GC
GC-rich regions - WGS
Patient 1,
Vendor 3
Patient 1,
Vendor 4
Patient 2,
Vendor 3
Exon 2: 77.5% GC
GC-rich regions – Proton (Ion Torrent, Life Technologies)
Exon 2: 77.5% GC
Zukunft der Gendiagnostik
• Einerseits stehen Ultra-Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien (UHTS) zur Verfügung
• Andererseits stellt die Auswertung und Interpretation der durch
UHTS entstandenen Datenmengen noch eine grosse
Herausforderung für die Zukunft dar
COSTS:
Next Generation Sequencing (NGS) technologies (targeted,
whole-exome, and whole-genome sequencing)
Sequence data $ ~1‘000-12‘000
Data analysis/interpretation $ ~10‘000
22.05.2014
• Gentest ist nicht gleich Gentest (direkte vs. indirekte Analyse von
bekannten vs. unbekannten Mutationen, Analyse von einzelnen vs.
sämtlichen Mutationen/Genen, Analyse von Exom vs. Genom)
22.05.2014
• Gentest ist nicht gleich Gentest (direkte vs. indirekte Analyse von
bekannten vs. unbekannten Mutationen, Analyse von einzelnen vs.
sämtlichen Mutationen/Genen, Analyse von Exom vs. Genom)
Internet-Gentests sind problematisch:
bei Kindern, urteilsunfähigen und hypochondrisch veranlagten Personen
ohne begleitende Beratung von Experte zu Patient, vor allem bei
Risikobewertung und Interpretation der Untersuchungsergebnisse
durch die Ungewissheit der Testqualität
bezüglich Datenschutz
22.05.2014
Über Gentests berichten die Medien
aber
Gentest  Gentest
45
www.genetikzentrum.ch/Genetische+Beratung.htm
Die Schweizerische Akademie der Medizinischen Wissenschaften (SAMW)
befürchtet, dass Patientinnen und Patienten unnötig verunsichert werden, wenn sie
ohne qualifizierte ärztliche Beratung mit Ergebnissen von Gentests konfrontiert werden.
Sie warnt insbesondere vor unseriösen Gentest-Angeboten aus dem Internet und
fordert eine bessere Aufklärung der Bevölkerung über Nutzen und Risiken von
genetischen Untersuchungen. Die neuen technischen Möglichkeiten dürfen die
persönliche Arzt-Patienten-Beziehung nicht verdrängen, sondern sollen in die ärztliche
Beratung eingebettet werden.
«Ohne richtige Interpretation Verkommt der
Gentest zum Horoskop.»
az | www.limmattalerzeitung.ch
az | www.limmattalerzeitung.ch
Personalisierte Medizin: die SAMW warnt vor Fehlentwicklungen
46
GWAS: Genome-Wide Association Study
47
http://www.molekularediagnostik.ch/pdf/md09_12_johansson.pdf
Penetrance: high/full penetrance, low/reduced penetrance
Expressivity: describes quantitative differences in the manifestation of the disease
Gentest ist nicht gleich Gentest
DNA
...
...
Marker (e.g. SNP)
...
Disease-causing mutation
...
– 65 Exons
Gentest
Splicing
Gentest
direkte vs. indirekte Analyse
...
...
– von
Transkript:
~10vs.
Kilobasen
bekannten
unProtein
Synthese
bekannten Mutationen,
N
– Protein:
Analyse von einzelnen vs.
2871 Aminosäuren
Protein
sämtlichen Mutationen bzw.
C
Faltung
Genen,
Analyse von Exom
Calcium-Bindung
vs.
Genom
Ca
Ca
Glykosylierung
Indirect testing is used when the gene or disease-causing mutation cannot
Ca
Ca
be directly identified/analyzed but can be located within a specific region of a
chromosome
ACHTUNG: Bei 23andme werden nicht die einzelnen Gene auf Mutationen untersucht, sondern vorwiegend nur
Risikofaktoren (ausgewählte SNPs). Daraus wird dann eine Wahrscheinlichkeit abgeleitet, ob man die Krankheit bekommt.
50
Affymetrix SNP Array
NspI/StyI
NspI/StyI NspI/StyI
Modified after www.rzpd.de/public/uploads/ThfjNeCE1H0YahlGJ7bnlQ/MappingAssay-overview.jpg
Fachleute für
Humangenetik:
In der Schweiz gibt es
~100 Medizinische
Genetiker FMH/FAMH
23andMe has, for example,
suggested that its longer-range
goal is to collect a massive
biobank of genetic information
that can be used and sold for
medical research and could also
lead to patentable discoveries.
Fachleute für
Humangenetik:
~100 Medizinische
Genetiker FMH/FAMH
“Ask your physician.” That is
insufficient guidance unless your
physician has ready access to a
clinical geneticist or genetic
counselor.
Fachleute für
Humangenetik:
~100 Medizinische
Genetiker FMH/FAMH
Erfassung (Gentest)
Chr15 g.1 Genomic DNA (gDNA) level: Chr15(GRCh37(hg19)):g.48748879A>G
FBN1
Exon 1
http://genome-euro.ucsc.edu/index.html
c.5377T>C
http://de.wikipedia.org/wiki/Datei:Aminoacids_table.svg
Complementary DNA (cDNA) level:
NM_000138.4:c.5377T>C
5’377:3=1’792.33 => First position of codon for
amino acid #1793.
 Wildtype: TGT = Cys, mutated: CGT = Arg
 Protein: p.Cys1793Arg (p.C1793R)
Alternative splicing
a process by which a given gene is spliced into more than one type of mRNA molecule
DNA
prä-mRNA
mRNA
1 Gen => mehrere Proteine
~20‘000 Gene => ~100‘000 Proteine
Nature Education: http://www.nature.com/scitable/topicpage/chemical-structure-of-rna-348
www.hgvs.org/mutnomen
www.hgvs.org/mutnomen/quickref.html
Genetic Assessment in
Patients with a Large Aorta
Difficulties
in sequence
data interpretation
In vitro (Transkript)
Analyse
• Prediction of the effect of novel sequence variants
Silent mutation
c.6354C>T (p.I2118I)
Deletion of 66bp (22 amino acids)
c.6314_6379del (p.Glu2105_Val2126del)
C>T
Exon 50
Exon 51 Intron 51
...C…
Intron 50
380bp
150bp cF
M
1.
2.
400bp
66bp
3.
244bp
Exon 52
117bp
Intron 52
2247bp
Exon 53
cR 120bp
a. Heteroduplex of b. + c.
+
300bp
b. Normal transcript
(317bp)
200bp
M
1.
2.
3.
100bp marker
FBN1 c.6354C>T
FBN1 c.6354C>T
Control
c. Transcript with deletion of exon 51
Seminar von PD Dr. G. Matyas
(251bp)
22.09.2009 / 56
22.05.2014 / 61
Erfassung (Gentest)
http://www.molekularediagnostik.ch/pdf/md09_12_johansson.pdf
Rare/orphan
diseases
Penetrance: high/full penetrance, low/reduced penetrance
Expressivity: describes quantitative differences in the manifestation of the disease
Gentest ist nicht gleich Gentest
DNA
...
...
Marker (e.g. SNP)
...
Disease-causing mutation
...
– 65 Exons
Gentest
Splicing
Gentest
direkte vs. indirekte Analyse
...
...
– von
Transkript:
~10vs.
Kilobasen
bekannten
unProtein
Synthese
bekannten Mutationen,
N
– Protein:
Analyse von einzelnen vs.
2871 Aminosäuren
Protein
sämtlichen Mutationen bzw.
C
Faltung
Genen,
Analyse von Exom
Calcium-Bindung
vs.
Genom
Ca
Ca
Glykosylierung
Indirect testing is used when the gene or disease-causing mutation cannot
Ca
Ca
be directly identified/analyzed but can be located within a specific region of a
chromosome
MFS – Gendiagnostik
Gendiagnostik
Mutation gefunden
Bekannte
Mutation
Unbekannte Mutation
Q1: Ist die identifizierte
Sequenzänderung pathogen?
DIAGNOSE
Ja
Ja
Q2: Verursacht die pathogene
Sequenzänderung den klinischen
Phänotyp des Patienten?
22.05.2014
Human Gene Mutation Database: HGMD (www.hgmd.org), HGMD Professional (www.biobase-international.com)
Gendiagnostik
Mutation gefunden
Bekannte
Mutation
Unbekannte Mutation
DIAGNOSE
Ja
Ja
22.05.2014
tant Allele and Clinical Phenotype
Q1: Ist die identifizierte Sequenzänderung pathogen?
Extracellular
TGFBR2
TAG
9
60G>A
487Q
GG
. .
. .
.A
.A
.T
.C
.C
I-2
SS: -
ATG
1
2
Cytoplasmic
Kinase
3
c.773T>G c.1106G>T
p.V258G
p.G369V
Ser/Thr
Transmembrane
nts responsible for the MFS-like phenotypes of the patients?
• Analyse der evolutionären Konservierung der Sequenz
4
TAG
5
6
7
c.1159G>C c.1181G>A c.1561T>C c.1657T>A
p.V387L
p.C394Y
p.W521R
p.S553T
c.1159G>A
p.V387M
Human (H. sapiens)
GTC
GGG
GTG
TGC
Chimp (P. troglodytes)
...
...
...
...
Dog (C. familiaris)
...
...
...
...
Mouse (M. musculus)
...
...
...
...
Rat (R. norvegicus)
...
...
...
...
Chicken (G. gallus)
. .G
. .T
...
. .T
Fugu
(T.
rubripes)
.
.
.
.
.
A
.
.
.
PD Dr. G. Matyas | www.genetikzentrum.ch | www.stiftung-seltene-krankheiten.ch . . .
Zebrafish (D. rerio)
. .G
...
...
. .T
Matyas et al. 2006, Hum Mutat 27:760-769
TGG
...
...
...
...
...
...
...
TCG
...
. .T
. .C
. .C
...
. .C
. .T
22.05.2014
• In silico Vorhersagen
=> Mutation
=> Mutation
=> Mutation
=> Mutation
=> Mutation
=> Keine Mutation
=> Unsicher
=> Mutation
=> Mutation
=> Unsicher
et al. 2006, Hum Mutat 27:760-769
PD Dr.Matyas
G. Matyas
| www.genetikzentrum.ch | www.stiftung-seltene-krankheiten.ch
22.05.2014
B
C
Normal
G331
H
V387
V387
C393
β8
β10
D
β7
Mutant
β6
G331
β9
H
αEF
2.5 Å
Destabilisierende
Interaktion
zwischen Met387
und Cys393
M387
M387
C393
22.05.2014
Aber Vorsicht:
In silico Vorhersageprogrammen müssen sowohl mit bekannten
krankheitsverursachenden Mutationen als auch mit harmlosen
Polymorphismen für das betreffende Gen evaluiert werden
(Bestimmung von falsch-positiven und falsch-negativen
Vorhersagen)
22.05.2014
• In vitro Analysen, funktionelle Assays
22.05.2014
• Analyse von entsprechenden Kontrollproben und Abfrage
von entsprechenden Datenbanken (e.g. TGP, ESP, dbSNP)
22.05.2014
• Analyse von entsprechenden Kontrollproben und Abfrage
von entsprechenden Datenbanken (e.g. TGP, ESP, dbSNP)
• In vivo Analysen in Modellorganismen (z.B. Mausmodell)
22.05.2014
Gendiagnostik
Mutation gefunden
Bekannte
Mutation
Unbekannte Mutation
DIAGNOSE
Ja
Ja
22.05.2014
sociation
Mutant Allele and Clinical Phenotype
MFS Between
– Gendiagnostik
2
sapiens)
roglodytes)
miliaris)
musculus)
vegicus)
. gallus)
bripes)
D. rerio)
Q2: Verursacht die
pathogene Sequenzänderung den
klinischen Phänotyp
des Patienten?
GS
3
Extracellular
4
5
7
6
8
c.799A>C
p.N267H
c.1460G>A
p.R487Q
TCG
AAT
. . .
. . .
. .C
. .C
. .C
. .C
. .C
CGG
I-1
SS: OS: CS: -
. .
.A
.A
.A
.A
.C
.T
.
.
.
.
.
.
.
II-1 (#SZ)
SS: +
OS: CS: +
de novo
I-1
SS: OS: CS: -
II-1
SS: +
OS: CS: +
I-2 (#96)
SS: +
OS: CS: +
II-2
SS: +
OS: CS: +
segregating
I-1
SS: OS: CS: -
Kinase
TAG
4
3
c.773T>G c.1106G>T
p.V258G
p.G369V
5
6
7
c.1159G>C c.1181G>A c.1561T>C c.1657T>A
p.V387L
p.C394Y
p.W521R
p.S553T
c.1159G>A
p.V387M
Human (H. sapiens)
Chimp (P. troglodytes)
Dog (C. familiaris)
Mouse (M. musculus)
Rat (R. norvegicus)
Chicken (G. gallus)
Fugu (T. rubripes)
Zebrafish (D. rerio)
I-2
SS: OS: CS: -
II-1 (#147)
SS: OS: CS: +
2
1
. .
. .
.A
.A
.T
.C
.C
• Segregationsanalyse
in der Familie des
Patienten
I-2
SS: OS: CS: -
ATG
9
c.722C>T
p.S241L
.
.
.
.
.
.
.
TGFBR2
TAG
Kinase
Cytoplasmic
Ser/Thr
Cytoplasmic
Transmembrane
acellular
Transmembrane
Are the disease-causing sequence variants responsible for the MFS-like phenotypes of the patients?
I-1
GTC
GGG
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
..
..
..
..
.G
..
.G
GTG
...
...
...
...
...
...
...
..
..
..
..
.T
.A
..
I-2
SS: OS: CS: II-2 (#104)
SS: +
OS: CS: +
II-1
I-2
SS: OS: CS: -
I-1
segregiert
segregating
rious alleles occurred de novo or segregated
e disease in the families, indicating a causative
ation between the sequence variant and clinical
type (linkage disequilibrium cannot be excluded).
II-1
.
.
.
.
.
.
.
II-2 (#102)
SS: (+)
OS: CS: +
II-3
SS: OS: CS: -
II-4
SS: OS: CS: -
TGG
...
...
...
...
...
...
...
..
..
..
..
.T
..
.T
I-2
I-1
de novo
II-1
SS: +
OS: CS: +
TGC
II-2 (#72)
SS: OS: CS: +
II-3
SS: OS: CS: +
segregiert
segregating
III-1 (*1988)
SS: OS: CS: -
I-1
SS: OS: CS: -
TCG
...
. .T
. .C
. .C
...
. .C
. .T
I-2
SS: OS: CS: -
II-1 (#50)
SS: +
OS: CS: +
I-1
I-2
II-1 (#130)
SS: OS: CS: +
novo de
de novo
novo?
dedenovo
I-2
SS: OS: CS: -
I-1 (#67)
SS: (+)
OS: CS: +
segregating
segregiert
III-1
SS: OS: CS: -
III-2
SS: (+)
OS: CS: (+)
II-1
SS: OS: CS: -
II-2
SS: OS: CS: -
II-3
SS: OS: CS: -
22.05.2014
segregating
(normal allele)
segregiert
(Normalallel)
Comprehensive Genetic Testing for MFS in Switzerland
Clinical signs of MFS: Referrals from
- general practitioners and paediatricians because of Marfanoid habitus,
- cardiologist because of aortic dilatation or dissection,
- ophthalmologist because of dislocated lens.
Preanalytical requirements:
- Sample collection (3-6 ml EDTA blood, shipped without cooling)
- Informed consent of the patient
- Clinical data (needed to decide the order of the genes to be analyzed)
- Approval of expenses (provided upon request)
Genetic testing (analytical phase)
- Sequence analysis
- MLPA analysis
- Special analyses (could be time-consuming)
Diagnosis is
highly probable
Novel mutation with unknown effect
Q1: Is the identified sequence
variant a pathogenic mutation?
No
Yes
Yes
Q2: Is the pathogenic sequence
variant responsible for the clinical
phenotype of the patient?
• genetische Beratung vor
und nach dem Gentest
• Recht auf Nichtwissen
• präsymptomatischer
Gentest nur bei Volljährigen
• schriftliche Zustimmung
Special analyses
No mutation found
because the disease-causing mutation is
- not detectable with the method used
(ability of the testing method)
- located in another gene
Mutation found
Known mutation
associated with
the clinical
phenotype
• vom Arzt veranlasst
No
Further analyses in order to find the
disease-causing mutation (could be very
time-consuming, up to several years)
EDTA-Blutprobe (>3ml) + klinische Angaben + Zustimmung des Patienten + Kostengutsprache
Gendiagnostik (Analytische Phase)
- Sequenzanalysis
- MLPA-Analysis
- Spezial Analysis (z.B. cDNA-Analyse)
Keine Mutation gefunden, da
- die verwendete Methode/Strategie
dies nicht ermöglicht, oder
- ein anderes Gen mutiert ist
Mutation gefunden
Unsere Mission:
Bekannte
• Mutation
Bei allen
Unbekannte Mutation
uns zugewiesenen Patienten die
Weitere Analysen (Forschung),
krankheitsverursachende
(Über
Q1: Ist die identifizierte Mutation zu finden.
um die krankeitsverursachende
No
«Pflichtleistungen»
hinaus erfolgt dies
kostenlos
fürsehr
die
Mutation
zu finden (kann
DIAGNOSE
Yes
lange dauern, bis zu 5-15 Jahren!)
KK; nur bei
uns
in
der
Schweiz.)
Yes
No
22.05.2014 / 78
Erfassung (Gentest)
Core internet sites:
- Information on human diseases: GeneReviews
(www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1116/advanced)
- Information on mendelian phenotypes: OMIM (www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)
- Information on rare diseases: Orphanet (www.orpha.net)
- Biomedical literature: Pubmed (www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)
- Nomenclature for the description of sequence variants: HGVS
(www.hgvs.org/mutnomen)
- Human Gene Mutation Database: HGMD (www.hgmd.org), HGMD
Professional (www.biobase-international.com)
- 1000 Genomes Project (1000genomes.org)
- Database of single nucleotide polymorphisms (SNPs): dbSNP
(ncbi.nlm.nih.gov/snp)
- Genome data: ENSEMBL (www.ensembl.org), UCSC (genome.ucsc.edu)
- Genetic data: NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov), EBI (www.ebi.ac.uk/services)
GeneReviews
www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1116/advanced
OMIM
(www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)
GeneCards (www.genecards.org)
GenAtlas (http://genatlas.medecine.univ-paris5.fr)
Orphanet (www.orpha.net)
Zentrum für Kardiovaskuläre Genetik und Gendiagnostik
Das Genetikzentrum der Stiftung für Menschen mit seltenen Krankheiten
13:15 - 14:15
Genetische Krankheitsbilder und deren Abklärungen
Aortenkrankeiten und Orphan Diseases
Olten, 28. August 2014
PD Dr. Gabor Matyas, FAMH Medizinische Genetik
Leiter Zentrum für Kardiovaskuläre Genetik & Gendiagnostik
Geschäftsleiter Stiftung für Menschen mit seltenen Krankheiten
www.genetikzentrum.ch, www.stiftung-seltene-krankheiten.ch

Erfassung, Beschreibung und Bedeutung von Sequenzvarianten

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