Pipettenspitzen und ihr Einfluss auf Versuchsergebnisse
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Pipettenspitzen und ihr Einfluss auf Versuchsergebnisse
Nr. 44 – 2016 Pipettenspitzen und ihr Einfluss auf Versuchsergebnisse (BN 44) JANUAR 2016 SEITE 5 Schnell, präzise und steril: Flüssigkeitstransfer in der Zellkultur mit der Multipette® M4 Zusammenfassung Material und Methoden Die wichtigsten Faktoren in der Zellkultur sind Sterilität, Genauigkeit und Präzision. Dispenser, die nach dem Direktverdränger-Prinzip arbeiten, bieten den groβen Vorteil der vollständigen Unterbindung von Aerosolen. Der in die Spitze des Direktverdränger-Systems integrierte Kolben siegelt die Probe innerhalb der Dispenserspitze hermetisch ab und beugt somit Kontaminationen vor. Hinsichtlich Genauigkeit und Präzision sind die Ergebnisse von Direktverdränger-Systemen mit denen von Luftpolster-Pipetten vergleichbar. Im Gegensatz dazu wird die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse beeinträchtigt, wenn Pipettierhilfen in Verbindung mit serologischen Pipetten verwendet werden. Kalibrierung der Instrumente Systematische und zufällige Messabweichungen wurden mit Hilfe gravimetrischer Methoden gemäβ EN ISO 8655 :2002 bestimmt [1]. Die getesteten Volumina betrugen 100 µL in jedem Dosiersystem. Zellzählung Die Zellzahl wurde mit Hilfe des CASY® Cell Counter and Analyser, Modell TT 150 µm (Roche®, Basel, Schweiz) ermittelt. Zur Messung wurden 100 µL der Zellsuspension in 10 mL CASY ton resuspendiert. Einleitung Zellaussaat und kolorimetrischer WST-1-Test Die Kultivierung tierischer Zellen hat sich zu einer gängigen Labortechnik entwickelt und wird für zahlreiche Anwendungen eingesetzt. Die Zellkultivierung stellt besondere Ansprüche an die Sterilität, insbesondere an Kontaminationsvermeidung, sowie an Genauigkeit und Präzision. Zum Transfer gröβerer Volumina werden meist Pipettierhilfen mit serologischen Pipetten eingesetzt. Bei allen übrigen Schritten des Versuchsansatzes kommen Luftpolster-Pipetten zum Einsatz. Da die Bildung von Aerosolen die häufigste Ursache von Kontaminationen innerhalb der Pipette und somit Kreuzkontamination der Proben darstellt, empfiehlt Eppendorf die Verwendung einer Filterspitze mit Zwei-Phasen-Filterschutz. Nach der Zellzählung wurde zum Zwecke der Zellaussaat eine Zellsuspension von 1,5 x 106 HEK 293 Zellen/mL hergestellt. Verschiedene Mengen an Zellen wurden in 24-Well-Platten ausgesät (Eppendorf). 40 µL des wasserlöslichen Tetrazoliumsalzes (WST-1; Roche) wurden pro Well hinzugegeben. Die Zellkulturplatten wurden über einen Zeitraum von 3 h inkubiert (37 °C, 5 % CO 2 ). Die Platten wurden sodann in einem Plattenphotometer gemischt und bei 450 nm gelesen (Referenz: 690 nm). Eine Alternative zu den o.g. Systemen stellen DirektverdrängerSysteme wie die Multipette M4 dar, welche eine Kontamination des Instruments sowie Kreuzkontaminationen durch Aerosole komplett unterbinden. Dies wird durch den Kolben erzielt, der die Probe innerhalb der Dispenserspitze hermetisch versiegelt. Zusätzlich liefert dieses System genaue und präzise Pipettierergebnisse, insbesondere bei Flüssigkeiten, die sich in ihren physikalischen Eigenschaften von Wasser unterscheiden (z.B. DMSO, Zellkulturmedium). Jedes Instrument wurde mit seinem entsprechenden Verbrauchsartikel (Multipette M4 mit Combitips advanced® 1 mL, Eppendorf Research® plus Pipette mit Pipettenspitzen ep Dualfilter T.I.P.S.® 100 µL, Eppendorf Xplorer® Pipette mit Pipettenspitzen ep Dualfilter T.I.P.S. 1 mL und Easypet® 3 mit Eppendorf Serological Pipets 1 mL) eingesetzt. Easypet 3, die Pipettierhilfe für serologische Pipetten, ist das am wenigsten genaue und am wenigsten reproduzierbare aller vier Systeme (Abb. 1 und 2). 1 Ergebnisse und Diskussion Leistungsbeurteilung der eingesetzten Dosiersysteme 2 3,0 14,0 n=3 n=3 12,0 Zufällige Messabweichung [%] Application Notes Flüssigkeitstransfer in der Zellkultur mit der Multipette® M4 · Automatisierte Probenahme aus dem Bioreaktor zur optimierten Charakterisierung mikrobieller Stämme · etc. DIANA HÜBLER, EPPENDORF AG, HAMBURG Systematische Messabweichung [%] >Workflow-Lösungen für Mikrobiologie und Fermentation >Consumables: Negative Leaching-Effekte erfolgreich vermeiden >Automatisierte NGS-Probenvorbereitung NATHALIE CHANDELIER, VINCENT DUFEY, MURIEL ART, EPPENDORF APPLICATION TECHNOLOGIES S.A., NAMUR, BELGIEN 2,0 1,0 0,0 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 -1,0 Research plus Xplorer Multipette M4 Easypet 0,0 Research plus Xplorer Instrument Multipette M4 Instrument Abb. 1 und 2: Systematische (Abb. 1) und zufällige Messabweichung (Abb. 2) bei 100 µL, wie für die verschiedenen Dosiersysteme gemessen Your local distributor: www.eppendorf.com/contact Eppendorf AG · 22331 Hamburg · Germany · E-mail: eppendorf@eppendorf.com · www.eppendorf.com Easypet 2 EDITORIAL · LIEBE LESER Impressum Redaktion Berrit Hoff (Projektleitung), Axel Jahns, Jochen Müller-Ibeler, Natascha Weiß Anschrift Eppendorf AG, Barkhausenweg 1, 22339 Hamburg Telefon: (040) 53801-636 Fax: (040) 53801-840 E-Mail: bionews@eppendorf.de Internet: www.eppendorf.com Beiträge von Lesern sind willkommen. Liebe Leser, Qualität, Zuverlässigkeit, Erfahrung und Innovation sind Begriffe, die Anwender weltweit mit Eppendorf verbinden. Dieser exzellente Ruf ist das Ergebnis von rund 70 Jahren Engagement, um die besten Lösungen für das Handling wertvoller Proben in der LifeScience-Forschung zu bieten. Zum Beispiel Dosiersysteme, bei denen einfach alles stimmt – Präzision, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit. Wie Eppendorf-Pipetten und Eppendorf-Pipettenspitzen, zwei technologisch optimal aufeinander abgestimmte Systemkomponenten, die Ihnen die Sicherheit geben, verlässliche, konsistente Versuchsergebnisse zu erzielen (Seite 4 – 5 und Application Note S. 1– 2). Eine verantwortungsvolle Auswahl auch von vermeintlichen „Routineprodukten“ wie Spitzen und Gefäßen trägt zweifellos zu mehr Präzision und Verlässlichkeit und mehr Vertrauen in die Versuchsergebnisse bei. Für unsere Kunststoff-Einmalartikel verwenden wir ausschließlich sorgfältig ausgewählte Rohmaterialien, die nicht recycelt worden sind. Bei der Produktion verzichten wir völlig auf den Einsatz von Weichmachern, Bioziden oder Entformungshilfen, denn gerade bei diesen Stoffen sind „Leaching-Effekte“ nachgewiesen worden, die sich stark negativ auf Experimente auswirken können (S. 8). Sie beschäftigen sich mit mikrobieller Fermentation? Dann stehen Ihnen künftig, mit Einführung des neuen BioBLU® 3f Single-Use Vessels, Einweg-Bioreaktoren zur Kultivierung von Bakterien, Hefen und Pilzen im Volumenbereich von 65 mL bis 3,75 L zur Verfügung (S. 6 – 7)! Weitere Workflow-Lösungen für Mikrobiologie und Fermentation stellen wir Ihnen auf den Seiten 10 –11 vor. Ab dieser Ausgabe verzichten wir übrigens auf das traditionelle „Service-Fax“. Auf der BioNews-Serviceseite www.eppendorf.com/bn-service können Sie die mit Kennziffer gelisteten Prospekte zu einzelnen Produkten herunterladen oder uns online die Lösung unseres neuen Gewinnspiels (S. 15) mitteilen. Für persönliches Feedback, Lob und Kritik können Sie uns wie immer per E-Mail unter bionews@eppendorf.de erreichen. Gern hören wir von Ihnen! Für unverlangt eingesandte Manuskripte wird keine Verantwortung übernommen. Ihre Ansprechpartner Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH Peter-Henlein-Str. 2 50389 Wesseling-Berzdorf Tel. 01803 - 255911 (0,09 €/min aus dem Festnetz, Mobilfunk max. 0,42 €/min) E-Mail: vertrieb@eppendorf.de Vertrieb Schweiz Vaudaux-Eppendorf AG Im Kirschgarten 30 4124 Schönenbuch/Basel Tel. (061) 4821414 E-Mail: eppendorf@eppendorf.ch Vertrieb Österreich Eppendorf Austria GmbH Ignaz-Köck-Straße 10 1210 Wien Tel. (01) 8901364 - 0 E-Mail: office@eppendorf.at Hinweis Aus Gründen der besseren Lesbarkeit haben wir im Text auf die konsequente Nennung der männlichen und weiblichen Form verzichtet. Es sind selbstverständlich immer beide Geschlechter gemeint. Die Einführung von Produkten kann in verschiedenen Märkten zu unterschied lichen Zeitpunkten erfolgen. Wir beraten Sie gern. Ihr BioNews-Team Irrtum und technische Änderungen vorbehalten. Alle Rechte vorbehalten, einschließlich der Grafiken und Bilder. © Copyright Eppendorf AG, Januar 2016. Klimaneutral gedruckt in Deutschland. INHALT 4 IM BLICKPUNKT LABORPRAXIS 9 Wie „passende“ Pipettenspitzen das Versuchsergebnis verfälschen 11 4 – 5 Consumables: Negative Leaching-Effekte erfolgreich vermeiden Workflow-Lösungen für Mikrobiologie und Fermentation 8 10 –11 Automatisierte NGS-Probenvorbereitung INNOVATION NAHAUFNAHME NEWS / TIPPS SERVICE (BN 44) JANUAR 2016 SEITE 5 Schnell, präzise und steril: Flüssigkeitstransfer in der Zellkultur mit der Multipette® M4 NATHALIE CHANDELIER, VINCENT DUFEY, MURIEL ART, EPPENDORF APPLICATION TECHNOLOGIES S.A., NAMUR, BELGIEN DIANA HÜBLER, EPPENDORF AG, HAMBURG Zusammenfassung Material und Methoden Die wichtigsten Faktoren in der Zellkultur sind Sterilität, Genauigkeit und Präzision. Dispenser, die nach dem Direktverdränger-Prinzip arbeiten, bieten den groβen Vorteil der vollständigen Unterbindung von Aerosolen. Der in die Spitze des Direktverdränger-Systems integrierte Kolben siegelt die Probe innerhalb der Dispenserspitze hermetisch ab und beugt somit Kontaminationen vor. Hinsichtlich Genauigkeit und Präzision sind die Ergebnisse von Direktverdränger-Systemen mit denen von Luftpolster-Pipetten vergleichbar. Im Gegensatz dazu wird die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse beeinträchtigt, wenn Pipettierhilfen in Verbindung mit serologischen Pipetten verwendet werden. Die Zellzahl wurde mit Hilfe des CASY® Cell Counter and Analyser, Modell TT 150 µm (Roche®, Basel, Schweiz) ermittelt. Zur Messung wurden 100 µL der Zellsuspension in 10 mL CASY ton resuspendiert. Einleitung Zellaussaat und kolorimetrischer WST-1-Test Die Kultivierung tierischer Zellen hat sich zu einer gängigen Labortechnik entwickelt und wird für zahlreiche Anwendungen eingesetzt. Die Zellkultivierung stellt besondere Ansprüche an die Sterilität, insbesondere an Kontaminationsvermeidung, sowie an Genauigkeit und Präzision. Zum Transfer gröβerer Volumina werden meist Pipettierhilfen mit serologischen Pipetten eingesetzt. Bei allen übrigen Schritten des Versuchsansatzes kommen Luftpolster-Pipetten zum Einsatz. Da die Bildung von Aerosolen die häufigste Ursache von Kontaminationen innerhalb der Pipette und somit Kreuzkontamination der Proben darstellt, empfiehlt Eppendorf die Verwendung einer Filterspitze mit Zwei-Phasen-Filterschutz. Nach der Zellzählung wurde zum Zwecke der Zellaussaat eine Zellsuspension von 1,5 x 106 HEK 293 Zellen/mL hergestellt. Verschiedene Mengen an Zellen wurden in 24-Well-Platten ausgesät (Eppendorf). 40 µL des wasserlöslichen Tetrazoliumsalzes (WST-1; Roche) wurden pro Well hinzugegeben. Die Zellkulturplatten wurden über einen Zeitraum von 3 h inkubiert (37 °C, 5 % CO 2 ). Die Platten wurden sodann in einem Plattenphotometer gemischt und bei 450 nm gelesen (Referenz: 690 nm). Eine Alternative zu den o.g. Systemen stellen DirektverdrängerSysteme wie die Multipette M4 dar, welche eine Kontamination des Instruments sowie Kreuzkontaminationen durch Aerosole komplett unterbinden. Dies wird durch den Kolben erzielt, der die Probe innerhalb der Dispenserspitze hermetisch versiegelt. Zusätzlich liefert dieses System genaue und präzise Pipettierergebnisse, insbesondere bei Flüssigkeiten, die sich in ihren physikalischen Eigenschaften von Wasser unterscheiden (z.B. DMSO, Zellkulturmedium). Jedes Instrument wurde mit seinem entsprechenden Verbrauchsartikel (Multipette M4 mit Combitips advanced® 1 mL, Eppendorf Research® plus Pipette mit Pipettenspitzen ep Dualfilter T.I.P.S.® 100 µL, Eppendorf Xplorer® Pipette mit Pipettenspitzen ep Dualfilter T.I.P.S. 1 mL und Easypet® 3 mit Eppendorf Serological Pipets 1 mL) eingesetzt. Easypet 3, die Pipettierhilfe für serologische Pipetten, ist das am wenigsten genaue und am wenigsten reproduzierbare aller vier Systeme (Abb. 1 und 2). 1 Kalibrierung der Instrumente Systematische und zufällige Messabweichungen wurden mit Hilfe gravimetrischer Methoden gemäβ EN ISO 8655 :2002 bestimmt [1]. Die getesteten Volumina betrugen 100 µL in jedem Dosiersystem. Zellzählung 14,0 n=3 12,0 Zufällige Messabweichung [%] Systematische Messabweichung [%] n=3 2,0 1,0 0,0 Research plus Xplorer Multipette M4 Easypet 6 – 7 epMotion 96 pipettiert 96 Wells simultan 9 Extra lang, extra schlank, extra sicher – der neue 5 mL L Tip! 5 Schüttler P erformance Pläne für stets reproduzierbare Leistung 7 Gute Analysen für gutes Bier! 8 Liquid Handling mit Auszeichnung 9 ® Eppendorf-App: Willkommen in der digitalen Eppendorf-Welt 12 Eppendorf-Forschungspreise: Gewinner zu Gast bei Eppendorf 13 Für weitere Hinweise schauen Sie in die Bedienungsanleitung! 14 Warenzeichenhinweise 14 Gewinnspiel mit tollen Preisen 15 MURIEL ART, VINCENT DUFEY, IOAN GLIGOR, ULRIKE GAST, RONJA KUBASCH Die Spitze des Eisbergs: Wie Pipettenspitzen das Versuchsergebnis beeinflussen. Teil 1: Spitzensitz garantiert keine Genauigkeit 1 – 2 MATTHEW J. MAURER, JEFFREY M. SKERKER, ADAM P. ARKIN, WILLIAM MILLER, MICHAEL BIKSACKY, CLAUDIA M. HUETHER-FRANKEN, KARL RIX Automatisierte Probenahme aus dem Bioreaktor 3 – 4 NATHALIE CHANDELIER, VINCENT DUFEY, MURIEL ART, DIANA HÜBLER Schnell, präzise und steril: Flüssigkeitstransfer in der Zellkultur mit der Multipette® M4 5 – 6 10,0 8,0 STACEY WILLARD, MA SHA 6,0 4,0 2,0 -1,0 12 Ergebnisse und Diskussion Leistungsbeurteilung der eingesetzten Dosiersysteme 2 3,0 BioBLU 3f: Single-Use-Fermentation neu definiert ® 0,0 Research plus Xplorer Instrument Multipette M4 Instrument Abb. 1 und 2: Systematische (Abb. 1) und zufällige Messabweichung (Abb. 2) bei 100 µL, wie für die verschiedenen Dosiersysteme gemessen Your local distributor: www.eppendorf.com/contact Eppendorf AG · 22331 Hamburg · Germany · E-mail: eppendorf@eppendorf.com · www.eppendorf.com Easypet Adaption adhärenter HEK 293 Zellen an die Suspensionskultur mit Hilfe des New Brunswick™ S41i CO2 Inkubationsschüttlers 7 – 8 3 4 IM BLICKPUNKT · WIE „PASSENDE“ PIPETTENSPITZEN DAS VERSUCHSERGEBNIS VERFÄLSCHEN BRIGITTE KLOSE, EPPENDORF AG Wie „passende“ Pipettenspitzen das Versuchsergebnis verfälschen Beim Pipettieren geht es um mehr als den bloßen Transfer kleiner und kleinster Flüssigkeitsmengen. Wichtig dabei ist das exakt abgestimmte Zusammenspiel von Pipette und Pipettenspitze. Beide Komponenten müssen, jede für sich und zusammen als System, einem hohen Qualitätsanspruch genügen, um zuverlässige, präzise und reproduzierbare Ergebnisse liefern zu können. In diesem Artikel möchten wir Sie für den gravierenden Einfluss von Pipettenspitzen auf das Pipettierergebnis sensibilisieren. Wann haben Sie sich zuletzt über nicht reproduzierbare Ergebnisse, z.B. in einer real-time PCR, geärgert? Alle Variablen im Versuchsablauf haben Sie überprüft und trotzdem die Ursache nicht finden können? Auch beim Pipettieren, einem der häufigsten Schritte im Versuchsablauf, haben Sie jedes Mal eine Pipette mit „passender“ Spitze verwendet – also ein System mit zwei Komponenten, auf dessen Präzision und Richtigkeit Sie sich während des gesamten Workflows meinten verlassen zu können. Oder vielleicht doch nicht? Beschaffungsprozesse mit weitreichenden Folgen Dem Neukauf einer Pipette wird im Labor eine hohe Aufmerksamkeit geschenkt. Sie soll technologisch auf dem neuesten Stand sein und ein ergonomisches Handling bieten. Sie soll chemikalienbeständig und robust sein und genaue und präzise Ergebnisse liefern. Letzteres funktioniert allerdings nur mit der richtigen Pipettenspitze. Und genau hier findet sich häufig ein Widerspruch: Wird die Pipette noch mit aller Sorgfalt ausgewählt, erfolgt die Wahl der Pipettenspitzen häufig mit weit geringerem Anspruch (und Budget), in der Meinung, es handele sich hierbei um ein beliebiges Verbrauchsprodukt. Insbesondere bei der Beschaffung von Produkten für die tägliche Routine, wie z.B. Pipettenspitzen, spielt in vielen Labors der Preis mittlerweile eine größere Rolle als die Qualität. Leider ohne Wissen um die Folgen! Viele nicht reproduzierbare Versuchsergebnisse – und somit Kosten und zusätzlicher Zeitaufwand – könnten vermieden werden, wenn die Auswahl geeigneter Pipettenspitzen mit mehr Sorgfalt und auf Basis fundierter Sachkenntnis erfolgen würde. Bei Nutzung von Pipette und Pipettenspitze eines System-Anbieters kann der Anwender davon ausgehen, dass Fehler nicht entstehen können, denn Pipette mit Spitze sind vom Hersteller gemäß ISO 8655:2002 kalibriert und justiert. Studie mit Pipettenspitzen von 15 Herstellern Der Kunde kann sich darauf verlassen, dass jede Charge der hergestellten Pipettenspitzen genau diesem Kalibrierergebnis entspricht, so dass beim Pipettieren keine veränderten Ergebnisse erzielt werden. Der System-Hersteller stimmt seine Produktionen von Pipetten und Spitzen bezüglich Produktionstoleranzen präzise aufeinander ab und stellt somit jederzeit sicher, dass sich das System immer innerhalb seiner Spezifikationen bewegt. In einer breit angelegten Untersuchung von Pipettenspitzen 15 weltweit vertretener Hersteller haben wir uns diesem Thema genähert (s. auch Application Note S. 1 – 2). Natürlich gibt es weitaus mehr Hersteller. Die von uns untersuchten Spitzen sind unserer Erfahrung nach jedoch am häufigsten in den Labors vertreten, unabhängig davon, ob es sich um Spitzen von „System-Anbietern“ von Pipetten und Pipettenspitzen oder „Nicht-SystemAnbietern“, also von reinen Kunststoff- Laborartikel-Herstellern, handelt. Empfehlungen der ISO 8655:2002 Der internationale Standard ISO 8655:2002 empfiehlt die Nutzung von Pipetten und Spitzen desselben Herstellers. Denn auch wenn die Pipettenspitze von Hersteller A auf die Pipette von Hersteller B „passt“, sagt dies noch nichts über Präzision und Richtigkeit des Pipettierergebnisses aus. Nachdem wir alle 15 Spitzen der unterschiedlichen Hersteller in zwei unterschiedlichen Volumengrößen auf immer gleichen Pipetten getestet hatten, stand für uns fest: Die Pipettenspitze hat einen signifikanten Einfluss auf das Ergebnis. Die gleichbleibend hohe Qualität der Spitze ist Voraussetzung für reproduzierbare Ergebnisse. Im Bild eine epT.I.P.S.® Pipettenspitze mit ergonomisch optimierter Konusgeometrie, gut zu erkennen an den tropfenförmigen Relief-Elementen am oberen Rand. WIE „PASSENDE“ PIPETTENSPITZEN DAS VERSUCHSERGEBNIS VERFÄLSCHEN · IM BLICKPUNKT News Extra lang, extra schlank, extra sicher! Eine neue 175 mm lange 5 mL „L“ epT.I.P.S.® Pipettenspitze ergänzt ab sofort Eppendorfs Pipettenspitzen-Portfolio. Im Vergleich zur bereits vorhandenen 5 mL Version mit 120 mm Länge ist die neue Spitze nicht nur ganze 55 mm länger, sondern auch wesentlich schlanker. Hieraus ergeben sich entscheidende Anwendungsvorteile und mehr Sicherheit beim Pipettieren. Sie erreichen mühelos den Boden einer Vielzahl labor üblicher Gefäße, Flaschen und Kolben und haben somit weniger Probenverlust. Das schlanke Spitzendesign erleichtert das Pipettieren ohne Berührung von GefäßDie ISO 8655:2002 empfiehlt die Verwendung von Pipette und Spitze vom selben Hersteller. epT.I.P.S. sind optimal auf Eppendorf-Pipetten abgestimmt. Dies geschieht bei einem Nicht-SystemAnbieter nicht, da er keine System-Spezifikationen hat. Wird mit der Pipette eines Herstellers eine Pipettenspitze eines anderen Herstellers verwendet, übernimmt keiner von beiden eine Verantwortung in Bezug auf die Präzision und Richtigkeit des Systems. Hier ist der Anwender gezwungen, eine Kalibrierung und ggf. Justierung seiner Pipette mit den anderen Spitzen vorzunehmen – und zwar jedes Mal, wenn er Spitzen einer neuen Charge verwendet. Auch das Spitzen-Design spielt eine Rolle Bei unseren Untersuchungen fanden wir auch heraus, dass das Design einer Pipettenspitze einen großen Einfluss auf das Pipettierergebnis hat. Wer viel pipettiert, kennt meist die Pipettenspitzen verschiedener Anbieter und weiß, dass es im gleichen Volumenbereich völlig unterschiedlich geformte Pipettenspitzen gibt. Einige sind länger und schlanker als andere. Es gibt die sogenannte „Raketenform“ sowie ebenmäßig konisch zulaufende Spitzen. Solche unterschiedlichen Formen haben Einfluss auf das Pipettieren. Je länger eine Spitze bei ansonsten identischen inneren Abmessungen ist, desto höher ist das Luftpolster in der Spitze. Da Pipetten immer auf ein definiertes Luftpolster in der Pipettenspitze justiert sind, hat eine Veränderung des Luftpolsters, besonders bei größeren Nominal volumina, einen negativen Einfluss auf die Genauigkeit. Häufig ist den Anwendern nicht bewusst, welche Auswirkung die nachlässige Auswahl von Pipettenspitzen auf das Gesamtergebnis ihrer Arbeit haben kann. Dies mag auch der Grund dafür sein, dass in wissenschaftlichen Veröffentlichungen die Nennung der verwendeten Spitzen mit Bezeichnung von Spitze, Hersteller und Chargennummer – wenn überhaupt – nur unvollständig zu finden ist. Durch das Pipettiersystem entstandene Fehler können nicht nachvollzogen werden, und die Reproduktion der Ergebnisse durch andere wissenschaftliche Gruppen ist nicht mehr möglich. Lassen Sie es nicht so weit kommen und lesen Sie mehr zu diesem Thema in der Application Note (S. 1 – 2) „Die Spitze des Eisbergs: Wie Pipettenspitzen das Versuchsergebnis beeinflussen. Teil 1: Spitzensitz garantiert keine Genauigkeit“. wand oder Flaschenhals, so dass Kreuz kontaminationen von Gefäß und Probe vermieden werden können. Die gut sicht bare Graduierung der Spitze ermöglicht zu jeder Zeit eine einfache visuelle Volumenkontrolle. Die neuen epT.I.P.S. 5 mL L sind in den Reinheitsgraden Eppendorf Quality™ und Biopur ® sowie als ep Dualfilter T.I.P.S.® in PCR clean/Sterile erhältlich. „Form follows function“! Mit der neuen extralangen Spitze erreichen Sie mühelos den Boden von Eppendorf Conical Tubes 15 mL (Abb.) und anderen labor üblichen Gefäßen. Die schlanke Kontur ermöglicht berührungsfreies Eintauchen in das Gefäß. Mehr Info unter www.eppendorf.com/ consumables Übersichtsprospekt Eppendorf Liquid-Handling-Verbrauchs artikel • Kennziffer 288 epT.I.P.S.® 5 mL L • Kennziffer 286 5 6 INNOVATION · BIOBLU® 3F: SINGLE-USE-FERMENTATION NEU DEFINIERT ULRIKE BECKEN, EPPENDORF AG, BIOPROCESS CENTER EUROPE, JÜLICH KEVIN VOLL, EPPENDORF, INC., ENFIELD, USA BioBLU® 3f: Single-Use-Fermentation neu definiert Die Einweg-Technologie bietet zahlreiche Vorteile für die zeit- und kosteneffektive Durchführung von Bioprozessen, wie zum Beispiel vermindertes Kontaminationsrisiko, Zeitersparnis zwischen einzelnen Läufen und geringere Kosten. Mit dem neuen BioBLU 3f Bioreaktor für mikrobielle Fermentation erweitert Eppendorf sein Portfolio von E inweg-Bioreaktoren zur Kultivierung von Bakterien, Hefen und Pilzen. BioBLU f Einweg-Gefäβe umfassen jetzt Arbeitsvolumina von 65 mL bis zu 3,75 L und ermöglichen somit eine gröβere Flexibilität in Forschung und Prozessentwicklung. Moderne Bioprozessverfahren erfordern intelligente Lösungen Enzyme, Antibiotika oder Nahrungsergänzungsmittel … die Liste an Produkten, die durch mikrobielle Fermentation hergestellt werden, ist lang, und mit neuen, innovativen Bioprozessverfahren treiben Wissenschaftler die Entwicklung weiter voran. Um die Kosten für Rohmaterialien und Personal zu kompensieren, ist eine optimale Nutzung der Ressourcen wichtiger denn je. Die sorgfältige Auswahl und Optimierung von Bakterien- und Pilzstämmen steigert die Produktausbeute, während ein um fassendes Verständnis kritischer Prozess parameter die gleichbleibende Produkt qualität sicherstellt. Demzufolge benötigen Wissenschaftler anwenderfreundliche Fermentationssysteme, welche zeitsparende Verfahrensoptimierung und ein einfaches Scale-up auf gröβere Produktionsvolumina ermöglichen. Single-Use-Fermentation neu definiert Gegenüber herkömmlichen RührkesselBioreaktoren aus Glas oder Edelstahl bieten Einweg-Gefäβe signifikante Vorteile. Sie eliminieren das Risiko einer Kreuzkontamination und reduzieren die Rüstzeiten, da arbeitsintensive Reinigungsschritte entfallen. Dies bietet dem Anwender gröβere Sicherheit und hilft, die Produktivität zu erhöhen und die Gesamtkosten zu senken. Die Expansion von Säugerzellen in Einweg-Gefäßen wie den BioBLU c Einweg-Bioreaktoren ist ein etablierter Prozess. Bei der Kultivierung von Bakte- rien und Pilzen machen die spezifischen Anforderungen an Design und Funktionalität des Bioreaktors den Einsatz von Einweg-Technologie hingegen schwieriger. Mit der Familie der BioBLU f Einweg- Bioreaktoren setzt Eppendorf jetzt neue Maβstäbe für die mikrobielle Fermen tation. Eppendorfs Expertise auf den Gebieten der Bioprozess- und PolymerTechnologie ermöglichte die Entwicklung von speziell für mikrobielle Anwendungen optimierten Einweg-Bioreaktoren. Durch ihre starren Seitenwände lassen sie sich ohne das Risiko einer Beschädigung installieren. Die Verwendung von einlagigem Kunststoff für Gefäß und Kopfplatte vermindert Probleme mit Leachables und Extractables. Während des Spritzgusses werden keinerlei Zusätze, wie z. B. Weichmacher, eingesetzt. Das Rohmaterial ist frei von tierischen Komponenten und USP Class VI zertifiziert. Abb. 1: BioBLU 0.3f, 1f und 3f. Der neue BioBLU 3f erweitert das EppendorfPortfolio der Einweg-Bioreaktoren für mikrobielle Anwendungen. BioBLU 3f – das neueste Familienmitglied Von kostengünstiger Verfahrensentwicklung in geringen Volumina bis hin zur Produktion im Groβformat – die Skalierbarkeit ist ausschlaggebend. Bislang konnten Wissenschaftler bereits die Vorteile der BioBLU 0.3f und BioBLU 1f Gefäβe für Kulturgröβen von 65 mL bis zu 1,25 L für sich nutzen. Mit der bevorstehenden Einführung des BioBLU 3f erweitert Eppendorf jetzt sein Portfolio hin zu gröβeren Arbeitsvolumina bis zu 3,75 L (Abb. 1). BIOBLU® 3F: SINGLE-USE-FERMENTATION NEU DEFINIERT · INNOVATION BioBLU 0.3f BioBLU 1f BioBLU 3f Verhältnis Hi /Di 1,8 2,0 2,0 Verhältnis hVwmax /Di 1,2 1,4 1,5 2 2 oder 3 3 0,4 0,4 0,4 Anzahl der Rührer Verhältnis d/Di News Schüttler Performance Pläne Tabelle 1: Skalierbarkeit durch industrielles Design: Dimensionen der BioBLU f Einweg-Bioreaktoren. H i: innere Gefäβhöhe; D i: innerer Gefäβdurchmesser; hVwmax: maximale Flüssigkeitshöhe; d: Durchmesser des Rührers Schüttler für biologische Anwendungen müssen über Tage, Wochen und manchmal sogar Monate hinweg durchgehend laufen. 220 Ihre gleichbleibend verlässliche Funktion 3-L-Glas-Bioreaktor 200 mit reproduzierbarer Leistung ist essentiell BioBLU 3f Einweg-Bioreaktor für Zellwachstum und -proliferation unter stabilen, vorhersehbaren Umgebungsbe- 180 dingungen. Selbst geringe oder kurzzeitige Variationen beim Schütteln können die 160 Kulturbedingungen signifikant beeinflussen und negative Auswirkungen auf Ausbeute 140 und/oder Expression haben. OD600 120 Mit professionellen Inspektions- und Wartungsprogrammen im Rahmen unserer 100 Performance Pläne stellen wir den einwandfreien Betriebszustand Ihres Schüttlers 80 sicher. 60 40 20 0 Die Schüttler Performance Pläne bieten: 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Zeit [h] Abb. 2: E. coli K12 Wachstumskurven in BioBLU 3f Einweg-Bioreaktoren und konventionellen Glas-Bioreaktoren sind vergleichbar. Die Fermentation wurde mit Hilfe einer Eppendorf BioFlo 320 Steuerungsstation durchgeführt. Das Zellwachstum wurde durch Off-line-Messungen der optischen Dichte (OD600 ) überwacht. Industrielles Design gewährleistet Skalierbarkeit und vereinfacht den Technologie transfer sowie die Prozessentwicklung (Tabelle 1). So gut wie Glas BioBLU f Gefäβe verbinden die Vorteile der Einweg-Technologie mit der zuverlässigen Leistung konventioneller Glas- oder Edelstahl-Bioreaktoren. Industrielles Design sorgt dafür, dass BioBLU f Gefäβe den hohen Anforderungen an Stoffübertragung und Wärmeabführung im Laufe der mikrobiellen Fermentation standhalten. Bewährtes Rührkessel-Design, leistungsstarke Überkopfantriebe mit RushtonTyp-Rührern für hervorragendes Mischen sowie innovative Kühlschikanen lassen die Bakterien ebenso effizient wachsen wie in konventionellen Glasgefäβen (Abb. 2). Einfacher Umstieg auf EinwegTechnologie BioBLU f Fermentations-Gefäβe sind mit Eppendorf Benchtop-Bioreaktor-Systemen kompatibel, einschlieβlich den DASbox® und DASGIP® Systemen, BioFlo® 320 und New Brunswick™ BioFlo 115 und 310. BioBLU f Bioreaktoren wurden als vollwertiger Ersatz für autoklavierbare Gefäße konzipiert. Sie überzeugen durch minimale Rüstzeiten und besonders leichte Handhabung. BioBLU® f • Kennziffer 279 >> Vorbeugende Wartungsprogramme für Reinigung, Inspektion und Instandhaltung >> Verifizierung und Justierung von Betriebsparametern gemäß der Spezifikationen von Eppendorf >> Installationsqualifizierung-Zertifikat >> Funktionsqualifizierung-Zertifikat >> Vollständige Dokumentation Ihre Vorteile: >> Vermeidung von unerwartetem Geräteausfall >> Langlebigkeit Ihres Gerätes >> Konsistente und reproduzierbare Ergebnisse >> Bestätigung der Geräteleistung gemäß Herstellerangaben Weitere Informationen finden Sie unter: www.eppendorf.com/epServices oder auf lokalen Internetseiten.* *Performance Pläne (ebenfalls für andere EppendorfProdukte) sind in ausgewählten Ländern erhältlich. 7 LABORPRAXIS · CONSUMABLES: NEGATIVE LEACHING-EFFEKTE ERFOLGREICH VERMEIDEN NILS GERKE, EPPENDORF AG Consumables: Negative LeachingEffekte erfolgreich vermeiden Mit Eppendorf der Leachables- Problematik begegnen Noch immer wird in vielen Life-SciencesLaboren der Einfluss von Substanzen, die sich aus Kunststoff-Einmalartikeln herauslösen können, unterschätzt. Diese sogenannten „Leachables“ können Experimente in hohem Maße beeinträchtigen. Durch unsere langjährige Expertise in der Herstellung hochwertiger KunststoffEinmalartikel betrachten wir bei der Entwicklung und Produktion von EppendorfConsumables die gesamte Prozesskette. Das heißt konkret: Es werden ausschließlich sorgfältig ausgewählte Rohmaterialien verwendet, die nicht recycelt worden sind. Bei der Produktion wird völlig auf den Einsatz von Weichmachern, Bioziden oder Entformungshilfen verzichtet, denn gerade bei diesen Stoffen sind LeachingEffekte nachgewiesen worden, die sich stark negativ auf Experimente auswirken können. Leaching-Effekte nicht unterschätzen Bei der Etablierung von Experimenten wird der Fokus häufig nur auf die direkten Reaktionsbedingungen gerichtet, z.B. die Optimierung der Konzentrationen von Reaktionslösungen oder die Temperaturregulierung. Experimentelle Rahmenbedingungen, zu denen auch die verwendeten Kunststoff-Einmalartikel gehören, werden oft weniger beachtet. Dabei können Leaching-Effekte schon bei Labor-Standardmethoden wie der photometrischen Detektion von Nukleinsäuren und Proteinen die Ergebnisse erheblich verfälschen. Webinar „Good Plastics, Bad Plastics“ Ergänzend empfehlen wir Ihnen das Webinar „Good Plastics, Bad Plastics“, dessen Aufzeichnung Sie unter www.eppendorf.com/webinar_gpbp aufrufen können. Allein durch das Erhitzen von Wasser in Reaktionsgefäßen und einem anschließenden Absorptionsscan konnte bei Einmalartikeln anderer Hersteller gezeigt werden, dass UV-absorbierende Leachables zu einem Überschätzen von DNA-Konzen trationen führen können (Abb. 1). Umfassende Informationen sowie Em pfehlungen, wie das Risiko von LeachingEffekten beurteilt, minimiert und kon trolliert werden kann, finden Sie auf www.eppendorf.com/consumables. Tipp Gute Analysen für gutes Bier! Im Brauereiwesen gibt es zahlreiche photometrische Analysemethoden, die sowohl zur Qualitätskontrolle des fertigen Produktes als auch zur Überwachung des Brauprozesses eingesetzt werden. Dabei geht es um die Bestimmung von Farbe, möglichen Trübungen und speziellen chemischen Verbindungen, die Geschmack und Haltbarkeit des Bieres beeinflussen können. „Short Protocols“ für die Bieranalytik Unter www.eppendorf.com/shortprotocolsbeer bietet Eppendorf fünf Short Protocols für die Bieranalytik zum Herunterladen an. In diesen wird die Durchführung gängiger Brauereimethoden beschrieben, welche u.a. der Methodensammlung der Mitteleuro päischen Brautechnischen Analysenkommission (MEBAK® e.V.; www.mebak.org) entstammen. Sie beinhalten Tests zur Bestimmung von Farbe, Bitterkeit sowie weiterer qualitätsrelevanter Substanzen Absorptionsscan von Wasser nach Inkubation bei 95 °C für 30 min wie vicinalen Diketonen, Thiobarbitursäure 2,25 und freiem Aminostickstoff. 2,00 0,10 1,75 0,08 Eppendorf BioSpectrometer ® durchge- 0,06 führt. Mit im Bereich von 200 – 830 nm frei 0,04 wählbaren Wellenlängen ermöglicht dieses Extinktion [OD] Extinktion [OD] 8 1,50 1,25 1,00 0,75 Die Experimente wurden mit einem Gerät eine einfache Methodenetablierung. 0,02 0,00 240 260 280 300 Wellenlänge [nm] 0,50 0,25 0,00 190 210 230 250 270 290 310 330 350 370 Wellenlänge [nm] Eppendorf Hersteller V Hersteller A1 390 Abb. 1: Leaching-Effekte können bei den untersuchten 1,5-mL-Gefäßen von Hersteller V und A1 zu Fehlbestimmungen bei DNA-Konzentrationen führen. Für mehr Details siehe Eppendorf Application Note No. 235, herunterzuladen unter www.eppendorf.com/ applications. Eppendorf BioSpectrometer ® • Kennziffer 242 (BN 44) JANUAR 2016 SEITE 1 Die Spitze des Eisbergs: Wie Pipettenspitzen das Versuchsergebnis beeinflussen. Teil 1: Spitzensitz garantiert keine Genauigkeit MURIEL ART, VINCENT DUFEY, IOAN GLIGOR, EPPENDORF APPLICATION TECHNOLOGIES S.A., NAMUR, BELGIEN ULRIKE GAST, RONJA KUBASCH, EPPENDORF AG, HAMBURG Zusammenfassung Die Tatsache, dass Pipettenspitzen auf einen Pipettenkonus passen, lässt keine Rückschlüsse auf die Pipettiergenauigkeit des Systems „Pipette und Spitze“ zu. Um den Einfluss von Pipettenspitzen auf das Dosierergebnis zu ermitteln, wurde eine Studie mit Standardspitzen von 15 Wettbewerbern durchgeführt. Dabei zeigte sich ein dramatischer Einfluss der Spitzen auf das Pipettierergebnis. Die Norm ISO 8655:2002 [1] empfiehlt, Pipette und Spitze vom selben Hersteller zu verwenden. Unsere Untersuchungsergebnisse belegen die Richtigkeit dieser Empfehlung sowie die Notwendigkeit einer Kalibrierung und gegebenenfalls Justierung, wenn Spitzen anderer Hersteller verwendet werden. Einleitung Viele wissenschaftliche Veröffentlichungen können durch andere Arbeitsgruppen nicht reproduziert werden. Im Allgemeinen wird den im Labor verwendeten Plastikartikeln („Consumables“), wie Pipettenspitzen oder Reaktionsgefäßen, nur wenig Beachtung geschenkt. Die Folge sind durch z. B. inkorrekte Pipettiervolumina oder durch Leachables beeinflusste Analysenergebnisse. Dies kann dazu führen, dass Ergebnisse durch andere Arbeitsgruppen, die andere Consumables verwenden, nicht reproduziert werden können. Bezogen auf die Pipettenspitzen sind einige Probleme offensichtlich, z.B. die Notwendigkeit, Spitzen mit viel Druck aufzustecken, um einen dichten Sitz zu gewährleisten. Andere hingegen bleiben häufig unerkannt, wie z. B. eine verringerte Pipettiergenauigkeit bei Verwendung anderer als der vom Pipettenhersteller empfohlenen Spitzen. Die ISO 8655:2002 [1] beschreibt Pipette und Spitze als ein System, das eine zusätzliche Kalibrierung benötigt, wenn Spitzen anderer Hersteller verwendet werden sollen. Aber warum legt diese Norm einen so starken Fokus auf ein Produkt, das nach jeder Verwendung entsorgt wird? Die vorliegende Beitragsserie beantwortet diese Frage. Sie zeigt, dass Pipettenspitzen einen erheblichen Einfluss auf das Dosierergebnis haben, und benennt die wichtigsten Spitzenseitigen Einflussfaktoren. Material und Methoden Allgemeine Materialien Die Pipetten Eppendorf Xplorer ® plus 50 – 1.000 µL und 0,5 – 10 µL wurden für die Kalibrierung gesteckter Standardspitzen (10 µL und 1.000 µL) von Eppendorf und 14 anderen Herstellern verwendet. Ausnahmen: Anbieter H bot keine gesteckten 10 µL Standardspitzen an, bei den Herstellern K und N waren nur 1.250 µL Standardspitzen für 1.000 µL Pipetten erhältlich. Kalibrierung nach gravimetrischem Prüfverfahren Die Leistungsfähigkeit des Systems „Pipette und Spitze“ wurde durch Kalibrierung gemäß [1] bestimmt, unter Berücksichtigung der unter [1] geforderten Umgebungsbedingungen. Die Kalibrierung erfolgte unter Verwendung der Analysenwaage XP26PC (Mettler-Toledo®) bei 100 % und 10 % des Nennvolumens, mit je zwei Serien von 10 Pipettierungen. Aus den Messergebnissen wurde die systematische und zufällige Messabweichung bestimmt und mit den nach [1] und [2] zulässigen Grenzwerten verglichen. Für detaillierte Informationen siehe [3]. Ergebnisse und Diskussion Während das System „Pipette und Spitze“ mit Eppendorf-Spitzen innerhalb der Herstellertoleranzen lag, wurden diese Grenzwerte bei Verwendung von Spitzen anderer Hersteller nicht in allen Fällen eingehalten. Wie in Abb. 1 und 2 dargestellt, wurde das Limit der systematischen Messabweichung bei 1.000 µL bei den Tips von 4 Herstellern und bei 1 µL bei den Tips von 5 Herstellern überschritten. Beachtenswert ist, dass bei 1.000 µL nicht nur die Herstellertoleranzen überschritten wurden, sondern auch die (deutlich größere) maximal zulässige systematische Messabweichung gemäß ISO 8655:2002 [1]. 1 µL 10 µL 2 0,5 Zufällige Messabweichung [%] Zufällige Messabweichung [%] 0,45 1,5 1 0,5 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 -4 -2 0 2 4 6 Systematische Messabweichnung [%] 8 10 0 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 Systematische Messabweichnung [%] Abb. 1: Kalibrierergebnisse mit 10 µL Spitzen verschiedener Hersteller. Die rosa gefärbte Fläche gibt die Breite der Herstellertoleranzen für das System „Pipette und Spitze“ wieder. Alle Datenpunkte innerhalb dieser Fläche lagen innerhalb der Grenzwerte. Your local distributor: www.eppendorf.com/contact Eppendorf AG · 22331 Hamburg · Germany · E-Mail: eppendorf@eppendorf.com · www.eppendorf.com SEITE 2 (BN 44) JANUAR 2016 Die Spitze des Eisbergs: Wie Pipettenspitzen das Versuchsergebnis beeinflussen. Teil 1: Spitzensitz garantiert keine Genauigkeit 1.000 µL 3,5 3 3 Zufällige Messabweichung [%] Zufällige Messabweichung [%] 100 µL 3,5 2,5 2 1,5 1 0,5 0 -5 -4 -3 -2 -1 0 2,5 2 1,5 1 0,5 0 -5 -4 Systematische Messabweichnung [%] -3 -2 -1 0 Systematische Messabweichnung [%] Abb. 2: Kalibrierergebnisse mit 1.000 µL Spitzen verschiedener Hersteller. Die rosa gefärbte Fläche gibt die Breite der Herstellertoleranzen für das System „Pipette und Spitze“ wieder. Alle Datenpunkte innerhalb dieser Fläche lagen innerhalb der Grenzwerte. Die zufällige Messabweichung war in diesen Fällen jeweils erhöht, lag jedoch innerhalb der zulässigen Grenzwerte. Werden die Kalibrierergebnisse mit Ergebnissen der Dimensionsbestimmung [3] verglichen, wird klar, dass bei den 1.000 µL Spitzen das Luftpolstervolumen der größte Einflussfaktor ist: Die Spitzen, die die Leistungsfähigkeit des Systems außerhalb der Grenzwerte verschoben haben, wiesen bei vergleichbarem inneren Durchmesser die größte Länge auf – und damit das größte Luftpolster. Da Luftpolsterpipetten vom Hersteller auf eine bestimmte Luftpolstergröße justiert werden, hat eine Vergrößerung des Luftpolsters vor allem bei größeren Nominalvolumina einen negativen Effekt auf die Pipettiergenauigkeit. Dieser Zusammenhang ist Pipetten-unabhängig, die Kalibrierung wurde auf einer Pipette eines anderen Herstellers wiederholt und die Ergebnisse reproduziert (nicht dargestellt). Im Gegensatz zu den Erkenntnissen bei 1.000 µL Spitzen spielt der Einflussfaktor „Luftpolstergröße“ bei 10 µL Spitzen eine untergeordnete Rolle. Hier sind andere Einflussfaktoren, wie die Geometrie und Qualität der Spitzenöffnung, wichtiger. Diese Einflussfaktoren werden in der nächsten Ausgabe der BioNews sowie in [3] detailliert beleuchtet. Die vorliegenden Ergebnisse belegen, dass Vorsicht geboten ist, wenn Spitzen verwendet werden sollen, deren Design sich von den empfohlenen Spitzen unter- scheidet. Verlängerte Spitzen sind ein Beispiel. Die Eppendorf-Bedienungsanleitung weist in entsprechenden Fällen auf die Notwendigkeit einer Justierung der Pipette hin. Im Falle der Verwendung einer manuellen Pipette ist dies im Rahmen der Anwenderjustierung einfach umzusetzen. Noch bequemer ist die Justierung bei der elektronischen Xplorer-Pipette durch einfache Auswahl der Spitze im Menü. Die meisten NichtSystemanbieter informieren über die Passfähigkeit ihrer Pipettenspitzen auf unterschiedlichen Pipetten. Der Anwender sollte jedoch bedenken, dass die Information bezüglich der Passfähigkeit einer Spitze keine Aussage über die Genauigkeit des Pipettiersystems ermöglicht. Es obliegt dem Anwender, durch Kalibrierung zu überprüfen, ob das Pipettiersystem innerhalb zulässiger Grenzwerte arbeitet. Diese Erkenntnis wird durch die Norm [1] bestätigt, die generell die Verwendung der vom Pipettenhersteller empfohlenen Spitzen befürwortet. Sollte dies nicht möglich sein, fordert diese Norm: 1. eine Kalibrierung mit den empfohlenen Spitzen („Konformitätsprüfung“ um sicherzustellen, dass das System in Ordnung ist) und 2. eine Kalibrierung mit den nicht empfohlenen Spitzen. werte arbeitet. Wir haben für 1.000 µL und 10 µL gezeigt, dass die Leistungs fähigkeit des Systems durch die Pipettenspitze deutlich beeinflusst werden kann. Pipetten werden vom Hersteller auf eine bestimmte Luftpolstergröße justiert. Das Design von Spitzen beeinflusst jedoch die Luftpolstergröße direkt. Besonders bei größeren Volumina wie 1.000 µL ist dieser Faktor so einflussreich, dass die Pipettiergenauigkeit beeinträchtigt wird. Bei kleinen Volumina treten andere Einflussfaktoren in den Vordergrund, die in der nächsten Ausgabe der BioNews dargestellt und diskutiert werden. Literatur [1] DIN EN ISO 8655:2002, Teile 1, 2, 6. Volumenmessgeräte mit Hubkolben. Beuth-Verlag, Berlin. [2] Eppendorf Xplorer ® plus Bedienungs anleitung. www.eppendorf.com/manuals [3] Application Note No. 354: The tip of the iceberg: How pipette tips influence results. www.eppendorf.com/applications Fazit Dass eine Spitze physisch auf eine Pipette passt, heißt nicht, dass das Pipettiersystem innerhalb der zulässigen Grenz- Leserservice Eppendorf Liquid-Handling-Verbrauchsartikel • Kennziffer 288 Your local distributor: www.eppendorf.com/contact Eppendorf AG · 22331 Hamburg · Germany · E-Mail: eppendorf@eppendorf.com · www.eppendorf.com (BN 44) JANUAR 2016 SEITE 3 Automatisierte Probenahme aus dem Bioreaktor: Prozess-initiierte Probenahme zur optimierten Charakterisierung mikrobieller Stämme MATTHEW J. MAURER1, JEFFREY M. SKERKER1,2,3, ADAM P. ARKIN1,2,3, WILLIAM MILLER4, MICHAEL BIKSACKY4, CLAUDIA M. HUETHER-FRANKEN5 UND KARL RIX5 1 UC BERKELEY ENERGY BIOSCIENCES INSTITUTE (EBI), BERKELEY, CA, USA; 2 UC BERKELEY DEPARTMENT OF BIOENGINEERING, BERKELEY, CA, USA; 3 4 PHYSICAL BIOSCIENCES DIVISION, LAWRENCE BERKELEY NATIONAL LABORATORY, BERKELEY, CA, USA; FLOWNAMICS® ANALYTICAL INSTRUMENTS, INC., MADISON, WI, USA; 5 EPPENDORF AG, BIOPROCESS CENTER, JÜLICH KORRESPONDENZ: BECKEN.U@EPPENDORF.DE Einleitung Material und Methoden Das Quantitative Engineering of Industrial Yeast Programm am EBI konzentriert sich auf das systemische Verständnis von Stoffwechsel, Genregulation und Stress antworten bei Bakterien und Hefen. Dieses Verständnis soll die Grundlage dafür bilden, Bakterien- und Hefestämme gezielt so zu verändern, dass mit ihrer Hilfe eine effizientere Biokraftstoffproduktion aus ligninhaltigen Ausgangsmaterialien möglich wird [1]. Um die Charakterisierung und Selektion von Hefestämmen zu optimieren, haben Wissenschaftler automatisierte Verfahren, einschlieβlich des Einsatzes eines integrierten Bioreaktorsystems und eines automatisierten Systems zur Probenahme, eingeführt. Eppendorf DASGIP® Parallel Bioreactor System Eppendorf DASGIP Parallele Bioreaktorsysteme ermöglichen eine parallele Versuchsdurchführung, mittels derer sich die Prozessentwicklung beschleunigen und der Durchsatz erhöhen lassen. Mit der DASGIP Control Steuerungssoftware (jetzt Eppendorf DASware® control 5) werden mehrere Bioreaktoren von einem einzigen Computer gesteuert. So lassen sich gleichzeitig mehrere Versuchsbedingungen untersuchen und simultan verschiedene Experimente durchführen [2]. Die Eppendorf Software DASware analyze ermöglicht eine bidirektionale Kommunikation zwischen dem DASGIP System und Analysegeräten von Dritt anbietern. Seg-Flow® automatisiertes on-line System zur Probenahme Das patentierte Seg-Flow System ist ein Instrument zum Flüssigkeits- und DatenManagement. Es wurde für die Entnahme von Proben aus bis zu acht Bioreaktoren und deren Überführung in bis zu vier Analysegeräte und/oder Fraktionssammler konzipiert. Die FlowWeb™ Software Plattform, die sämtliche Seg-Flow Systemfunktionen steuert, stellt eine nahtlose Verbindung zu verschiedenen Analysegeräten von Drittanbietern her. Dies ermöglicht die Echtzeit-Analyse von Prozessparametern wie der Konzentration von Nährstoffen und Stoffwechselprodukten und die Messungen von verschiedenen Zellparametern. Nach Abschluss der Analyse erfasst und verarbeitet das Seg-Flow System diese Daten. Die FlowWeb OPC Software Suite kommuniziert die Analysedaten in OPC-fähige Überwachungs- und Datenerfassungssysteme (SCADA). Prozess-initiierte Probenahme Abb. 1: Architektur für die Seg-Flow 4800 Prozess-initiierte Probenentnahmefunktion. Das Prozessereignis oder „Auslöser“ wird durch den Anwender definiert und in das OPC-fähige SCADA-System des Bioreaktors oder das Bioprozess-Management-System programmiert, welches das Seg-Flow System fernsteuert. DASbox/ DASGIP System Seg-Flow System mit FlowFraction 400 OPC DASGIP Controller und DASware analyze (OPC-Client) Off-line HPLC Off-line FlowWeb mit OPC-Server Prozessereignis Probenanalyse Abb. 2: DASGIP/Seg-Flow Prozess-initiiertes Probenentnahmesystem. OPC-Kommunikation erlaubt eine kontinuierliche, bi-direktionale Kommunikation zwischen dem Seg-Flow automatisierten on-line Probenahmesystem und DASware control. Das Eppendorf DASGIP/DASbox System registriert das Anwender-definierte Prozessereignis und aktiviert das Seg-Flow System per Fernsteuerung, die Prozess-initiierte Probenahmefunktion auszuführen. Das Seg-Flow System ermöglicht eine automatisierte Probenahme und Analyse. Dies geschieht als Antwort auf ein externes SCADA- oder anderes Bioprozess-Management-System, wie z.B. der DASGIP Control/DASware Software Plattform. Die Prozessereignisse, die das Seg-Flow System aktivieren, werden durch den Anwender definiert. Beispiele sind Sollwertabweichungen von pH oder Gelöstsauerstoff, Kulturinduktion oder Fütterung. Die Ereignisse benötigen eine OPC-kompatible Kennzeichnung und müssen in das übergeordnete Management-System programmiert werden. Wenn das Prozessereignis durch die Bioreaktor-Station detektiert wird, wird dies zum SCADA-System kommuniziert, dadurch das Seg-Flow System aktiviert und automatisch eine Probe aus dem Your local distributor: www.eppendorf.com/contact Eppendorf AG · 22331 Hamburg · Germany · E-Mail: eppendorf@eppendorf.com · www.eppendorf.com SEITE 4 (BN 44) JANUAR 2016 Automatisierte Probenahme aus dem Bioreaktor: Prozess-initiierte Probenahme zur optimierten Charakterisierung mikrobieller Stämme Abb. 3: Prozess-initiierte Probenahme-Daten, welche mit Hilfe der DASware Plant Overview Funktion erstellt wurden. Die Abbildung zeigt (A) Zeit der Seg-Flow Aktivierung durch die DASGIP Steuerung (Gefäß 1 = grün, Gefäß 2 = rot); (B) Zeit und Dauer der Seg-Flow Probensammlung (Gefäß 1 = orange, Gefäß 2 = blau); (C) Zeit der Probenabgabe in das Sammelgefäß und Position des Sammelgefäßes (Gefäß 1 = magenta, Gefäß 2 = grün); (D) Dichte der Kultur laut der Biomasse-Sonde (Gefäß 1 = violett, Gefäß 2 = blau) und (E) kumulative Zugabe von Medium (Gefäß 1 = schwarz, Gefäß 2 = magenta). Bioreaktor entnommen. Ist die Probenahme oder Analyse abgeschlossen, werden die Daten über OPC über das Labornetzwerk an das SCADA-/Bioprozess-Management-System kommuniziert (Abb. 1). Diese einzigartige Fernsteuerungsfunktion ermöglicht eine „rund um die Uhr“ Probenahme und Überwachung von Ereignissen, die die Produktivität und /oder Produktqualität beeinflussen könnten. Als Antwort auf Messung der optischen Dichte aktivierte DASGIP Control die Zugabe und Entnahme von Medium aus den Kulturgefäβen. Anwender-definierte Volumina an zugeführtem Medium wurden als Trigger für das Seg-Flow Probenahme-System verwendet. Nach Zugabe des gewünschten Mediumvolumens wurde der Startbefehl durch DASGIP Control an das Seg‑Flow System kommuniziert (Abb. 3). Ergebnisse und Diskussion Dieses entnahm daraufhin das programmierte Probenvolumen aus dem Bioreaktor und überführte die Probe in den FlowFraction™ 400 Fraktionssammler. Dort wurde die Probe bis zur Analyse mittels einer off-line HPLC oder eines anderen Analysegerätes gelagert. Ge fäβspezifische Probendaten beinhalteten Anfang und Ende der Probensammelphase und die Position des Sammel gefäβes. Alle Daten wurden in der FlowWeb Software mit Datums- und Zeitstempel versehen, mit Hilfe des FlowWeb OPC-Servers an die DASGIP Control Software kommuniziert und dort aufgezeichnet. Die Daten wurden in Echtzeit mit der Information über den Fermentationsprozess und mit der Seg-Flow Aktivierungszeit (Prozess- Initiierungszeit) synchronisiert und so die ferngesteuerte Probensammlung mit dem Prozessereignis abgeglichen. (Abb. 3). Integration des Seg-Flow und des Eppendorf DASGIP Parallel Bioreactor Systems Mittels OPC-Kommunikation wurde das Seg-Flow System in das Eppendorf DASGIP Parallele Bioreaktorsystem eingebunden (Abb. 2). Kennzeichen für Prozessereignisse wurden in der DASGIP Control Software konfiguriert. Die Eppendorf Software DASware analyze ermöglichte die Kommunikation zwischen dem FlowWeb OPC-Server und dem DASGIP Steuerungssystem. Prozess-initiierte Probenahme Zwei Hefekulturen wurden für 2,5 Tage in einem kontinuierlichen Prozess kultiviert. Mittels einer Turbidostat-Kontrollschleife wurde eine vorgeschriebene Biomassekonzentration, gemessen durch eine in-situ Sonde für optische Dichte, aufrechterhalten. Schlussfolgerung Die Verbindung des Eppendorf DASGIP Parallelen Bioreaktorsystems mit den Seg‑Flow Technologien ermöglichte es dem wissenschaftlichen Team, die ferngesteuerte und prozess-initiierte Probenahme als einen integralen Bestandteil der Charakterisierung seiner Hefestämme einzuführen. Die Einführung solcher Werkzeuge kann Projektlaufzeiten signifikant reduzieren und die Effizienz von Charakterisierung und Selektion mikrobieller Stämme erhöhen. Literatur [1] Energy Biosciences Institute. Biofuels Production Research Programs. Programs and Projects. 24 March 2014. http://www.energybiosciencesinstitute.org/ research/biofuels#1. [2] Knocke, C., Vogt, J. Biofuels - Challenges & Chances: How Biofuel Development can Benefit from Advanced Process Technology. Eng. Life Sci. 9-2 (2009): 96-99. Diese Veröffentlichung wurde auf der Konferenz „Recent Advances in Fermentation Technology (RAFT 11)“ in Clearwater Beach, Florida, USA, vorgestellt. Die vollständige Version dieser Application Note (Nr. 298) kann im PDF Format bei www.eppendorf.com/applications heruntergeladen werden. Leserservice DASGIP ® Parallel Bioreactor Systems für die Mikrobiologie • Kennziffer 287 Your local distributor: www.eppendorf.com/contact Eppendorf AG · 22331 Hamburg · Germany · E-Mail: eppendorf@eppendorf.com · www.eppendorf.com (BN 44) JANUAR 2016 SEITE 5 Schnell, präzise und steril: Flüssigkeitstransfer in der Zellkultur mit der Multipette® M4 NATHALIE CHANDELIER, VINCENT DUFEY, MURIEL ART, EPPENDORF APPLICATION TECHNOLOGIES S.A., NAMUR, BELGIEN DIANA HÜBLER, EPPENDORF AG, HAMBURG Zusammenfassung Material und Methoden Die wichtigsten Faktoren in der Zellkultur sind Sterilität, Genauigkeit und Präzision. Dispenser, die nach dem Direktverdränger-Prinzip arbeiten, bieten den groβen Vorteil der vollständigen Unterbindung von Aerosolen. Der in die Spitze des Direktverdränger-Systems integrierte Kolben siegelt die Probe innerhalb der Dispenserspitze hermetisch ab und beugt somit Kontaminationen vor. Hinsichtlich Genauigkeit und Präzision sind die Ergebnisse von Direktverdränger-Systemen mit denen von Luftpolster-Pipetten vergleichbar. Im Gegensatz dazu wird die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse beeinträchtigt, wenn Pipettierhilfen in Verbindung mit serologischen Pipetten verwendet werden. Kalibrierung der Instrumente Zellzählung Die Zellzahl wurde mit Hilfe des CASY® Cell Counter and Analyser, Modell TT 150 µm (Roche®, Basel, Schweiz) ermittelt. Zur Messung wurden 100 µL der Zellsuspension in 10 mL CASY ton resuspendiert. Zellaussaat und kolorimetrischer WST-1-Test Einleitung Die Kultivierung tierischer Zellen hat sich zu einer gängigen Labortechnik entwickelt und wird für zahlreiche Anwendungen eingesetzt. Die Zellkultivierung stellt besondere Ansprüche an die Sterilität, insbesondere an Kontaminationsvermeidung, sowie an Genauigkeit und Präzision. Zum Transfer gröβerer Volumina werden meist Pipettierhilfen mit serologischen Pipetten eingesetzt. Bei allen übrigen Schritten des Versuchsansatzes kommen Luftpolster-Pipetten zum Einsatz. Da die Bildung von Aerosolen die häufigste Ursache von Kontaminationen innerhalb der Pipette und somit Kreuzkontamination der Proben darstellt, empfiehlt Eppendorf die Verwendung einer Filterspitze mit Zwei-Phasen-Filterschutz. Eine Alternative zu den o.g. Systemen stellen DirektverdrängerSysteme wie die Multipette M4 dar, welche eine K ontamination des Instruments sowie Kreuzkontaminationen durch Aerosole komplett unterbinden. Dies wird durch den Kolben erzielt, der die Probe innerhalb der Dispenserspitze hermetisch versiegelt. Zusätzlich liefert dieses System genaue und präzise Pipettierergebnisse, insbesondere bei Flüssigkeiten, die sich in ihren physikalischen Eigenschaften von Wasser unterscheiden (z.B. DMSO, Zellkulturmedium). 1 Systematische und zufällige Messabweichungen wurden mit Hilfe gravimetrischer Methoden gemäβ EN ISO 8655 :2002 bestimmt [1]. Die getesteten Volumina betrugen 100 µL in jedem Dosiersystem. Nach der Zellzählung wurde zum Zwecke der Zellaussaat eine Zellsuspension von 1,5 x 106 HEK 293 Zellen/mL hergestellt. Verschiedene Mengen an Zellen wurden in 24-Well-Platten ausgesät (Eppendorf). 40 µL des wasserlöslichen Tetrazoliumsalzes WST-1 (Roche) wurden pro Well hinzugegeben. Die Zellkulturplatten wurden über einen Zeitraum von 3 h inkubiert (37 °C, 5 % CO 2 ). Die Platten wurden sodann in einem Plattenphotometer gemischt und bei 450 nm gelesen (Referenz: 690 nm). Ergebnisse und Diskussion Leistungsbeurteilung der eingesetzten Dosiersysteme Jedes Instrument wurde mit seinem entsprechenden Verbrauchsartikel (Multipette M4 mit Combitips advanced® 1 mL, Eppendorf Research® plus Pipette mit Pipettenspitzen ep Dualfilter T.I.P.S.® 100 µL, Eppendorf Xplorer® Pipette mit Pipettenspitzen ep Dualfilter T.I.P.S. 1 mL und Easypet® 3 mit Eppendorf Serological Pipets 1 mL) eingesetzt. Easypet 3, die Pipettierhilfe für serologische Pipetten, ist das am wenigsten genaue und am wenigsten reproduzierbare aller vier Systeme (Abb. 1 und 2). 2 3,0 14,0 n=3 12,0 Zufällige Messabweichung [%] Systematische Messabweichung [%] n=3 2,0 1,0 0,0 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 -1,0 Research plus Xplorer Multipette M4 Easypet 0,0 Research plus Xplorer Instrument Multipette M4 Instrument Abb. 1 und 2: Systematische (Abb. 1) und zufällige Messabweichung (Abb. 2) bei 100 µL, wie für die verschiedenen Dosiersysteme gemessen Your local distributor: www.eppendorf.com/contact Eppendorf AG · 22331 Hamburg · Germany · E-Mail: eppendorf@eppendorf.com · www.eppendorf.com Easypet SEITE 6 (BN 44) JANUAR 2016 Schnell, präzise und steril: Flüssigkeitstransfer in der Zellkultur mit der Multipette® M4 Auswirkungen des Dosiersystems auf die Bestimmung der Zellzahl Um den Einfluss der drei Dosiersysteme auf den Vorgang der Zellzahlbestimmung zu beurteilen, wurde ein Vergleich zwischen einer manuellen Luftpolster-Pipette (Eppendorf Research plus) mit ep Dualfilter T.I.P.S., einem Direktverdränger-System (Multipette M4 mit Combitips advanced) sowie einer elektronischen Pipettierhilfe (Easypet 3) mit serologischen Pipetten erstellt. Die Anzahl der HEK 293 Zellen wurde mit Hilfe der CASY-Technologie ermittelt. 3 1,0 Eppendorf Xplorer Signal der lebenden Zellen (OD 450 – 690 nm) Im Gegensatz dazu erweisen sich sowohl die Luftpolster-Pipetten als auch die Multipette M4 mit durchschnittlichen systematischen und zufälligen Messabweichungen unter 0,6 % als die zuverlässigsten Systeme. höchster Wert 0,8 niedrigster Wert 0,6 0,4 0,2 0,0 0 150.000 300.000 450.000 600.000 Anzahl der dispensierten Zellen/Well Durchschnittliche Zellzahl CV Durchschnittlicher Anteil lebender Zellen Luftpolster 1,65 x 106 Zellen /mL 3,0 % 96,4 % Direktverdränger 1,62 x 10 Zellen /mL 2,5 % 96,0 % Pipettierhilfe 1,50 x 106 Zellen /mL 6,8 % 96,2 % 6 Tabelle 1: Ergebnisse der Zellzählungen, welche mit Hilfe von drei verschiedenen Dosiersystemen erzielt wurden. Es wurden jeweils 100 µL einer Zellsuspension pipettiert (n=30). Wie in Tabelle 1 gezeigt, beträgt der Anteil lebender Zellen unter allen untersuchten Bedingungen etwa 96 %. Die Variabilität der Zellzahl, welche mit Hilfe des Direktverdränger- Systems sowie der Luftpolster-Pipette erzielt wurde, ist nahezu gleichwertig, während die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse der Pipettierhilfe signifikant geringer ausfällt. 4 Die Ergebnisse zeigen, dass der Einsatz eines DirektverdrängerSystems, wie z.B. die Multipette M4 mit Combitips advanced, die zuverlässige Reproduzierbarkeit der Endergebnisse bei Anwendungen in der Zellkultur sicherstellt. Die Daten, welche mit Hilfe des Dispensers erzielt wurden, zeigen eine geringere Variabilität als die mit Hilfe von Luftpolster-Pipetten gewonnenen Daten. Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse wird beeinträchtigt durch Verwendung eines weniger präzisen Instrumentes, wie z.B. einer Pipettierhilfe. Durch die Kombination von Genauigkeit, Präzision und Kontaminationsvermeidung stellt die Multipette M4 mit Combitips advanced eine perfekte Alternative für alle routinemäβigen Liquid-Handling-Arbeitsschritte im Zellkulturlabor dar. niedrigster Wert 0,6 0,4 0,2 0 150.000 300.000 450.000 600.000 Anzahl der dispensierten Zellen/Well 5 1,0 Easypet 3 Signal der lebenden Zellen (OD 450 – 690 nm) Schlussfolgerung höchster Wert 0,8 0,0 Auswirkungen des Dosiersystems auf die Zellaussaat Aufgrund der ermittelten Zellzählungsdaten wurden sechs Zellsuspensionen von jeweils 1,5 x 10 6 Zellen/mL in 24-WellPlatten ausgesät. Die elektronische Xplorer Pipette mit epDualfilter T.I.P.S., die Multipette M4 mit Combitips advanced sowie die Easypet 3 mit serologischen Pipetten wurden für den Zelltransfer eingesetzt. Es wurden 40 µL/Well der WST1-Lösung hinzugegeben. WST-1 wird durch zelluläre Enzyme zu Formazan umgesetzt. Diese Enzyme sind weitgehend auf die Produktion von NAD(P)H in lebenden Zellen angewiesen, und Formazan korreliert somit direkt mit der Anzahl der lebenden Zellen (Abb. 3–5). 1,0 Multipette M4 Signal der lebenden Zellen (OD 450 – 690 nm) Dosiersystem N = 30 höchster Wert 0,8 niedrigster Wert 0,6 0,4 0,2 0,0 0 150.000 300.000 450.000 600.000 Anzahl der dispensierten Zellen/Well Abb. 3 – 5: Durch ansteigende Anzahl an Zellen erzeugte Signalkurven. Drei verschiedene Dosiersysteme wurden für die Zellaussaat verwendet: Xplorer (Abb. 3), Multipette M4 (Abb. 4) und Easypet 3 (Abb. 5). Literatur [1] EN ISO 8655:2002, Teile 1– 6. Volumenmessgeräte mit Hubkolben. Beuth-Verlag, Berlin. Leserservice Multipette ® M4 • Kennziffer 268 Your local distributor: www.eppendorf.com/contact Eppendorf AG · 22331 Hamburg · Germany · E-Mail: eppendorf@eppendorf.com · www.eppendorf.com (BN 44) JANUAR 2016 SEITE 7 Adaption adhärenter HEK 293 Zellen an die Suspensionskultur mit Hilfe des New Brunswick™ S41i CO2 Inkubationsschüttlers STACEY WILLARD, MA SHA, EPPENDORF, INC., ENFIELD, CT, USA Zusammenfassung HEK 293 Zellen stellen ein exzellentes System für die Expression humaner rekombinanter Proteine dar; allerdings ist ihr Einsatz für die Produktion im Bioprozessmaßstab nur eingeschränkt möglich, da die Zellen in Suspension zur Aggregation neigen und schnell verklumpen. Hier präsentieren wir ein erfolgreiches Beispiel der Adaption einer Protein-exprimierenden HEK 293 Zell linie von serumabhängiger Adhäsionskultur zu serumfreier Suspensionskultur unter Verwendung des CO2 Inkubationsschüttlers New Brunswick S41i. Adhärente Zellen und Suspensionskulturen können parallel im selben Gerät kultiviert und verschiedene Adaptionsmethoden zeitgleich getestet werden. Hierdurch ist der New Brunswick S41i sehr gut geeignet für die Evaluierung von Adaptionsmethoden. Einleitung In der biopharmazeutischen Industrie zählen HEK 293 Zellen zu den vielseitigsten Expressionssystemen für humane rekombinante Proteine. Selbst groβe Membranproteine werden korrekt exprimiert. Das Problem der Zellverklumpung von HEK Zellen bei der Adaption an die Suspensionskultur schränkt jedoch ihren Einsatz für die großvolumige Produktion ein. Um dies zu beheben, wurden zahlreiche spezielle Medien und Anti-Verklumpungs-Reagenzien entwickelt. Wir beurteilen hier die Effektivität verschiedener Anti-Verklumpungs-Methoden mit Hilfe einer kommerziell erworbenen HEK 293 Zelllinie, welche ein humanes Membranprotein exprimiert. Material und Methoden Das Medium der 293/hTLR4-HA Zellen wurde mit Blastizidin supplementiert, um die Stabilität des Plasmids zu gewährleisten. Adhärente Kulturen wurden in T-75 Zellkulturflaschen bei 37 °C, 5 % CO2 auf dem Einlegeboden des New Brunswick S41i kultiviert (Abb. 1). Abb. 1: New Brunswick S41i CO 2 Inkubationsschüttler Suspensions-Zellkultur Die Adaption an die Suspensionskultur wurde mit Hilfe unterschiedlicher Methoden gemäß Herstellerangaben durchgeführt. Blastizidin wurde jeder Medienrezeptur in einer anfänglichen Dosis von 5 μg/mL hinzugefügt. Die Zellen wurden in 125 mL Erlenmeyerkolben auf der Schüttelplattform des S41i bei 125 rpm, 8 % CO 2 und 37 °C kultiviert. Die Zelldichte, % Viabilität und der Grad der Zellaggregatbildung wurden in Intervallen von 72 h analysiert. Die Zellverklumpung wurde mit einer Punktzahl zwischen (-), keinerlei Zellverklumpung, bis (+++) für groβe Zellklumpen bewertet. Die Bewertung basierte auf der relativen Gröβe der Zellklumpen (Abb. 2). A Mit Hilfe einer Western Blot Analyse wurde die Expression von hTLR4 bestätigt. Zu diesem Zweck wurde ein muriner Antikörper gegen die HA-Markierung eingesetzt. Ergebnisse und Diskussion Wie in Tabelle 1 (siehe nächste Seite) gezeigt, konnten mit den verschiedenen Medienrezepturen in jeder Kategorie unterschiedliche Erfolgsgrade erreicht werden. Eine Adaption wurde nur dann als erfolgreich bewertet, wenn die Zellen eine hohe Viabilität beibehielten und gleichzeitig in der Gegenwart von Blastizidin eine hohe Zelldichte ohne Verklumpung erreichten. Falls eine starke Verklumpung eintrat (+++) oder die Viabilität gering war, wurde die Kultur als nicht erfolgreich adaptiert verworfen und die Methode entsprechend angepasst. Zum Beispiel resultierte DMEM mit 1 % hitzeinaktiviertem FBS in groβen Aggregaten mit über 50 Zellen in der Suspensionskultur (Abb. 2A). Aus diesem Grund wurde die Rezeptur nach 48 h Kultur dahingehend angepasst, dass sie zukünftig Anti-Verklumpungsfaktoren wie z.B. Pluronic F-68 und Anti-clump A enthielt, und eine neue Kultur wurde aus Zellen der Adhäsionskultur etabliert. Wie in Tabelle 1 dargestellt, war DMEM in diesem Experiment nicht in der Lage, das Wachstum von Suspensionskulturen ohne Aggregation zu unterstützen. Eine weitere Rezeptur, Pro293 s-CDM™, konnte das Wachstum von 293/hTLR4-HA Zellen mit Hilfe von Serumsupplementierung unterstützen; B Details sind der Application Note Nr. 339 unter www.eppendorf.de/application zu entnehmen. Adhäsions-Zellkultur HEK 293 Zellen, welche den Hämagglutinin-tagged human Toll-like Receptor 4 (hTLR4-HA) exprimieren sowie untransfizierte HEK 293 Zellen (Kontrolle) wurden zunächst in Standardmedium (DMEM, 4 mM L-Glutamin, 10 % FBS) kultiviert. 400 µm 400 µm Abb. 2: Bewertung der Verklumpung von 293/hTLR4-HA Suspensionszellen: A: Die Zellen bildeten groβe Aggregate mit > 50 Zellen; diese Kultur erhielt eine Aggregationspunktzahl von (+++). B: Erfolgreiche Adaption, in welcher die Kultur keine Zellklumpen von mehr als 2–4 Zellen zeigte; diese Kultur wurde mit (–) bewertet. Your local distributor: www.eppendorf.com/contact Eppendorf AG · 22331 Hamburg · Germany · E-Mail: eppendorf@eppendorf.com · www.eppendorf.com SEITE 8 (BN 44) JANUAR 2016 Adaption adhärenter HEK 293 Zellen an die Suspensionskultur mit Hilfe des New Brunswick™ S41i CO2 Inkubationsschüttlers Methode 1 Basismedium Rezeptur Aggregatbildung? Lebensfähig mit Blastizidin? Serumfrei? DMEM 0 % HI-FBS N/A Nein Nein 1 % HI-FBS +++ Nein Nein 1 % HI-FBS, Pluronic F-68 +++ Nein Nein 1 % HI-FBS, Anti-clumping agent A ++ Nein Nein 2 CD 293 Wie empfohlen +++ N/A Ja 3 293 SFM II Keine Supplementierung − N/A Ja 4 5 µg/mL Blastizidin − Nein Ja 1 % BSA, 5 µg/mL Blastizidin − Nein Ja Keine Supplementierung − N/A Ja 10 µg/mL Blastizidin − Nein Ja 5 µg/mL Blastizidin − Ja Ja EX-CELL 293 ® 5 Pro293 s-CDM ™ 6 5 % HI-FBS, 5 µg/mL Blastizidin − Ja Nein 2,5 % HI-FBS, 5 µg/mL Blastizidin − Ja Nein 1 % HI-FBS, 5 µg/mL Blastizidin − Ja Nein 5 µg/mL Blastizidin − Nein Ja Wie empfohlen +++ N/A Ja ™ PeproGro HEK293 Tabelle 1: Ergebnisse der Suspensionskulturen mit den untersuchten Rezepturen B 100 4,0 90 3,5 80 3,0 60 2,5 50 2,0 40 1,5 30 1,0 20 0,5 10 0,0 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 100 90 3,5 Zelldichte (x 10 6 Zellen/mL) 70 EX-CELL 293 4,0 80 3,0 70 2,5 60 2,0 50 40 1,5 30 1,0 20 0,5 0,0 Lebensfähigkeit (%) 293 II SFM 4,5 Lebensfähigkeit (%) Zelldichte (x 10 6 Zellen/mL) A 10 0 10 20 30 40 50 Zeit (Tage) Zeit (Tage) Zelldichte Lebensfähigkeit Zelldichte Lebensfähigkeit 60 0 Abb. 3: 293/hTLR4-HA Zellen: Adaption an die Suspensionskultur. A: Die Zellen konnten an die serumfreie Zellkultur adaptiert werden, starben jedoch bei Zugabe von Blastizidin ab (gelbe Linie). B: Erfolgreiche Adaption an eine serumfreie Suspensionskultur einzelner Zellen. Die gelbe Linie kennzeichnet die Zugabe von Blastizidin. Die Western Blot Analyse zeigte, dass die Proteinexpression suspensionsadaptierter Zellen durch den Adaptionsprozess unbeeinflusst blieb (Daten nicht gezeigt). allerdings waren die Zellen nicht in der Lage, nach dem Serumentzug über einen Zeitraum von mehreren Passagen zu überleben (Abb. 3A). Die erfolgreichste Adaptionsmethode innerhalb dieser Strategie war die Methode 4 (EX-CELL® 293), welche nach der Zugabe von Blastizidin so gut wie keine Zellverklumpungen zeigte und gleichzeitig sowohl reproduzierbar hohe Zelldichten als auch eine hohe Viabilität in Abwesenheit von Serum erzielte (Abb. 3B). Diese Methode wurde als erfolgreich für die Adaption dieser Zelllinie an die serumfreie Suspensionskultur eingestuft. Die anderen Methoden wurden an dieser Stelle nicht weiter verfolgt und somit auch nicht weiter bewertet. Schlussfolgerung Die Anzahl der von der FDA genehmigten in HEK 293 Zellen produzierten Biopharmazeutika ist bislang gering. Zum Teil ist dieses auf das Problem der Verklumpung der Suspensionskultur unter Bioreaktor-Bedingungen zurückzuführen. Hier präsentieren wir ein erfolgreiches Beispiel der Adaption einer Protein- exprimierenden HEK 293 Zelllinie von serumabhängiger Adhäsionskultur zu serumfreier Suspensionskultur unter Verwendung des CO 2 Inkubationsschüttlers New Brunswick S41i. Leserservice New Brunswick™ S41i CO2 Inkubationsschüttler • Kennziffer 253 Your local distributor: www.eppendorf.com/contact Eppendorf AG · 22331 Hamburg · Germany · E-Mail: eppendorf@eppendorf.com · www.eppendorf.com LIQUID HANDLING MIT AUSZEICHNUNG · NEWS CHRISTIANE MARKAU, EPPENDORF AG Liquid Handling mit Auszeichnung Seit Einführung der ersten Kolbenhub pipette und des Reaktionsgefäßes im Jahr 1961 ist ein Liquid Handling ohne Eppendorf-Produkte nicht mehr vorstellbar. Die Entwicklung innovativer, qualitativ hochwertiger und verlässlicher Produkte steht seither auf unseren Fahnen. Dabei spornt uns der typische „Eppendorf-Drive“ an, unsere Produkte durch neue smarte Funktionen stetig zu optimieren. So verfügen wir heute über ein breites LiquidHandling-Portfolio mit Pipetten, Dispensern und automatisierten Workstations, die sich höchst flexibel an die Bedürfnisse unserer Anwender anpassen. Für dieses Bekenntnis zu Innovation und zur Entwicklung kundenorientierter Produkte für breit gefächerte Branchenanforderungen wurde Eppendorf von Frost & Sullivan auf der „Excellence in Best Practices Awards Gala“ in San Diego, USA, im März 2015 mit dem „North American New Product Innovation Award for Liquid Handling“ ausgezeichnet. Die Laudatoren: „Eines der Hauptunterscheidungsmerkmale von Eppendorf-Pipetten ist der Fokus auf Ergonomie. Eppendorf erkannte die Notwendigkeit, Stressbelastungen der Hand zu reduzieren, die durch manuelles Pipet- tieren über längere Zeit verursacht werden können. … Mit Beratung durch Spezialisten aus den Bereichen Physiotherapie und Ergonomie wurden mehrere neue Produktmerkmale zur Minderung des RSI-Risiko (Repetitive Strain Injury) integriert.“ (Mehr Info unter www.eppendorf.com/ physiocare.) “…, Eppendorf setzt Industriemaßstäbe im Liquid Handling und bietet umfassende Systemlösungen, die Laborabläufe effizienter gestalten und Routineaufgaben spürbar erleichtern.” (Mehr Info unter www.eppendorf.com/epmotion.) Nahaufnahme epMotion ® 96 pipettiert 96 Wells simultan Die Eppendorf epMotion 96 ist eine semi- automatische elektronische Pipette, mit der Sie ganze 96-Well-Platten in einem Arbeitsgang schnell und präzise befüllen können, mit Volumina von 0,5 bis 300 μL. Mit einer epMotion 96 sparen Sie Zeit und verringern Ihr RSI-Risiko (Repetitive Strain Injury). Die Bedienung der epMotion 96 ist bequem und intuitiv! Bequeme Systemsteuerung >> Steuern Sie Ihre epMotion 96 mit einem Apple® iPod® mit hochwertigem Touchscreen >> epMotion 96 über WiFi auch für andere Über Frost & Sullivan iOS® 7 Geräte (iPhone®, iPad®) zugänglich Die Analysten der globalen Unternehmensberatung Frost & Sullivan (www.frost.com) vergleichen Marktteilnehmer und ermitteln „Best Practice“-Unternehmen, indem sie deren Leistungen anhand von Kundeninterviews, Analysen und Sekundärforschung bewerten. Unternehmen mit einer Vorreiterrolle und herausragender Performance in Hinblick auf technologische Innovationen, Kundenservice und strategische Produktentwicklung zeichnet Frost & Sullivan sowohl regional als auch global mit angesehenen Best Practices Awards aus. Intuitive Bedienung >> Software auf Basis elektronischer Pipetten vom Typ Eppendorf Xplorer ® als kostenlose Apple-App >> Intelligente voreingestellte Anwendungen >> Geschwindigkeiten für Flüssigkeitsaufnahme und -abgabe individuell einstellbar 2015 >> Einfaches Programmieren von Mehrschritt-Pipettieraufgaben Weitere Produkteigenschaften und Applikationen finden Sie unter www.eppendorf. com/epmotion oder im Prospekt. North American Liquid Handling New Product Innovation Award NORTH AMERICAN LIQUID HANDLING NEW PRODUCT INNOVATION AWARD eppendorf.com/frost epMotion® 96 • Kennziffer 275 9 10 LABORPRAXIS · WORKFLOW-LÖSUNGEN FÜR MIKROBIOLOGIE UND FERMENTATION TANJA MUSIOL UND CHRISTIANE SCHLOTTBOM, EPPENDORF AG Workflow-Lösungen für Mikro biologie und Fermentation Mikroorganismen wie Bakterien, Hefen und Pilze finden zahlreiche Anwendungen in der pharmazeutischen, biochemischen und Lebensmittelindustrie. Effiziente Methoden für ihre Kultivierung, Modifikation und Analyse sind entscheidend für die Produktion von Nahrungsmitteln, Wirk- und Impfstoffen, Enzymen und Biokraftstoffen oder Biopolymeren. Premium-Produkte von Eppendorf begleiten diese und weitere Schritte seit mehr als 70 Jahren. Unsere innovativen Technologien erleichtern Anwendern die tägliche Arbeit und bieten beste Voraussetzungen für reproduzierbare und skalierbare Ergebnisse. Microbiology (Prokaryotic cells) Electroporator Centrifuges Tubes Thermo mixing devices Shakers Bioreactors Pipettes and tips Deepwell plates Centrifuges Pipettes and tips Thermo mixing devices Automation Photometers Cuvettes Thermocyclers PCR consumables Deepwell plates Sealing options Concentrator Freezers Transformation Cultivation Preparation and purification Detection and amplification Storage Für Anwendungen in der Mikrobiologie bietet Eppendorf eine große Vielfalt an Laborgeräten und Zubehör an. Transformation Kultivierung Präparation und Aufreinigung Die Präparation von DNA ermöglicht es, Mikroorganismen und Zellen gezielt zu manipulieren. So kann durch Elektroporation, z. B. mit dem Eppendorf Eporator®, die Zellmembran der Mikroorganismen durch einen elektrischen Impuls vorübergehend permeabel (durchlässig) gemacht werden, um den Vektor, der die gewünschte Funktion trägt, in die Mikroorganismen einzubringen. Nach der Transformation werden die Mikroorganismen in speziellen Nähr medien kultiviert und vermehrt. Die gewonnene Plasmid-DNA wird isoliert, aufgereinigt und analysiert. Zur Aufreinigung werden sehr häufig entsprechende Reagenzien-Kits verwendet. Die DNA wird mit Hilfe von Chromatographiesäulen und durch Zugabe salzhaltiger Puffer und weiterer Reagenzien aus den Zellen isoliert und gereinigt. Dabei werden die Reagenzien mittels Zentrifugation oder Vakuumverfahren durch das Säulenmaterial befördert. Der benutzerfreundliche Eporator ermög licht eine schnelle und effektive Übertragung von DNA unter reproduzierbaren Bedingungen. Hierfür bietet Eppendorf z. B. die New Brunswick™ Innova® Shaker mit verschiedenen Schüttel- und Temperiereigenschaften an, die je nach Anforderung unterschiedlich programmierbar sind. Die flexible Gestaltung des Innenraums ermöglicht die Kultivierung in unterschiedlichen Gefäßen und Volumina. Nach der Inkubation dienen diese Kulturen häufig als Grundlage für anschließende PlasmidPräparationen. Auch die aufgereinigte DNA wird zum Abschluss mit diesem Verfahren aus der Säule gewonnen. WORKFLOW-LÖSUNGEN FÜR MIKROBIOLOGIE UND FERMENTATION · LABORPRAXIS 11 Erfolgt dies per Zentrifugation, kann es vorkommen, dass die Deckel der Gefäße, in denen das Reagenz oder die aufgereinigte DNA gesammelt werden soll, durch die Scherkräfte abreißen. Nicht so im speziellen Eppendorf Kit rotor® der Mikrozentrifugen 5424 / R, 5427 R und 5430 / R: Sein hochgezogener Rand unterstützt die Deckel der Gefäße und verhindert ihr Abreißen. Werden viele Proben gleichzeitig bearbeitet, kommen häufig Säulen im 96-WellPlattenformat zum Einsatz. Hier werden die Reagenzien z. B. mit Hilfe einer Vakuumkammer durch das Säulenmaterial befördert. Da im Laufe des Prozesses zahlreiche Reagenzien zum Einsatz kommen, kann eine elektronische Pipette wie die Eppendorf Xplorer® oder Xplorer plus oder ein 96-Well-Pipettiersystem wie die Eppendorf epMotion® 96 den Vorgang wesentlich vereinfachen. Mit Hilfe der größeren Liquid Handling Workstation, der epMotion 5075v, lässt sich der Prozess auch automatisieren. DASbox Mini-Bioreaktorsystem für mikrobielle Anwendungen Bei etablierten PCR-Protokollen sollten reproduzierbare Versuchsbedingungen in jedem Well der Platte herrschen. Hierfür ist neben einer exzellenten Homogenität des Blocks auch ein effektiver Verdunstungsschutz während der PCR notwendig. Zu diesem Zweck hat Eppendorf zwei neue HeatSealer im Programm, den handlichen HeatSealer S100 und den HeatSealer S200 mit flexibel programmierbaren Versiegelungsparametern. Das Mini-Bioreaktorsystem DASbox® sowie die DASGIP® Parallel Bioreactor Systems beschleunigen durch parallele Prozessführung die Stamm- und Medienoptimierung und Prozessentwicklung. Intelligente Softwarelösungen bieten umfangreiche Möglichkeiten für das Datenund Informationsmanagement, statistische Versuchsplanung (Design of Experiments, DoE) und die Integration externer Analysegeräte (s. auch Application Notes S. 3 – 4). Dank der BioBLU® f Single-Use Vessels profitieren nun auch Anwender in der Mikrobiologie von den Vorteilen der Einweg-Technologie (s. auch S. 6 – 7). Diese speziell auf die Bedürfnisse mikrobieller Kultivierungen abgestimmten Einweg-Bioreaktoren lassen sich mit den Eppendorf DASbox- oder DASGIP-Systemen und BioFlo® Benchtop-Controllern betreiben. Adapter-Kits für DrittanbieterGeräte sind ebenfalls erhältlich. Intuitives Bedienkonzept für schnelles und einfaches Arbeiten: elektronische Pipetten Eppendorf Xplorer und Xplorer plus Nachweis und Amplifikation Ist die DNA isoliert und aufgereinigt, wird sie analysiert. Eine PCR-Analyse gibt erste Aufschlüsse über Erfolg oder Misserfolg der Manipulation. Der Mastercycler ® nexus gradient bietet mit seiner Gradientenfunktion neben schnellen Reaktionszeiten auch die Möglichkeit, die Annealingtemperatur von Primerpaaren sehr einfach und in nur einem Versuchsansatz zu bestimmen. Arbeitsvolumina und deckt damit ein breites Spektrum von Prozessentwicklung bis Produktion ab. Modernes Networking: Ihr Mastercycler nexus informiert Sie per E-Mail, wenn Ihre PCR fertig ist. Von klein nach groß – Mikroorganismen in der industriellen Produktion Genetisch veränderte mikrobielle Stämme werden vielfach in der industriellen Produktion eingesetzt. Eppendorf bietet skalierbare Fermenter von 60 mL bis 2.400 L Flexible in situ sterilisierbare (SIP) BioFlo Fermenter ermöglichen Scale up in den Pilot- und Produktionsmaßstab. Sie zeichnen sich durch ein kompaktes Design und zahlreiche nachrüstbare Optionen aus, wodurch sie sich den Prozessanforderungen anpassen. Mehr Informationen www.eppendorf.com/microbiology 12 LABORPRAXIS · AUTOMATISIERTE NGS-PROBENVORBEREITUNG CARSTEN BUHLMANN, EPPENDORF AG Automatisierte NGSProbenvorbereitung Tipp Eppendorf-App Die Eppendorf-App bietet Ihnen Produkt informationen sowie eine Vielzahl nützlicher Helfer für Ihren Laboralltag, selbstverständ- Illumina® TruSeq® Stranded mRNA Library Prep Kit Das Short Protocol No. 02 beschreibt die Konfiguration und vorprogrammierte Methoden für die automatisierte Herstellung von 8, 16 oder 24 sequenzierfähigen Bibliotheken aus 100 – 1.000 ng Gesamt-RNA mithilfe des TruSeq Stranded mRNA Kits. Auch hier beträgt die Gesamtlaufzeit für 24 Proben ca. 11,5 Stunden, bei einer aktiven Arbeitszeit von weniger 60 Minuten. Mit einem integrierten Eppendorf ThermoMixer® sind die epMotion® 5075t und ihr Vorgänger 5075 TMX unsere flexibelsten automatisierten Liquid-Handling-Systeme. Für die automatisierte Probenvorbereitung mittels ausgewählter Illumina®* NGS-Library-Herstellungs-Kits auf Ihrer epMotion 5075t / TMX stehen entsprechende Short Protocols, „Illuminaqualifizierte“ Methoden- und LabwareDateien auf www.eppendorf.com/ epmotionvip zum Herunterladen bereit. Für seine MiSeq® und HiSeq® NGS-Systeme bietet Illumina verschiedene Probenvorbereitungs-Kits für die Umwandlung von DNA- oder RNA-Proben in sequenzierfähige Bibliotheken, einen kostenintensiven Vorgang mit vielen Arbeitsschritten. Aufgrund der Komplexität der Methoden zur Bibliothekskonstruktion wird Automation hierbei als sehr hilfreich empfunden. Illumina® TruSeq® Stranded Total RNA Library Prep Kit Short Protocol No. 01 beschreibt die Konfiguration und vorprogrammierte Methoden für die automatisierte Herstellung von 8, 16 oder 24 sequenzierfähigen Bibliotheken aus 100 – 1.000 ng GesamtRNA mithilfe des TruSeq Stranded Total RNA Kit. Die Gesamtlaufzeit des Prozesses beträgt ca. 11,5 Stunden für 24 Proben, mit einer aktiven Arbeitszeit von weniger als 60 Minuten. Illumina® TruSeq® Nano DNA Library Prep Kit Das Short Protocol No. 05 beschreibt die Konfiguration und vorprogrammierte Methoden für die automatisierte Herstellung von 8, 16 oder 24 sequenzierfähigen Bibliotheken aus 100 oder 200 ng DNA (je nach Insertgröße) mit Hilfe des TruSeq Nano DNA Kit. Mit einer aktiven Arbeitszeit von weniger als 90 Minuten beträgt die Gesamtlaufzeit für 24 Proben auf der epMotion 5075 TMX ca. 10 Stunden. Nach Fragmentierung der DNA (Covaris®) erfolgt die komplette Bibliothekskonstruktion automatisch auf der epMotion. lich optimiert für mobile Endgeräte! Neue Produkte >> Seien Sie stets informiert über Neuheiten im Eppendorf-Portfolio. Produkt-Katalog >> Blättern Sie im digitalen Gesamtkatalog mit Labor- und Bioprozessprodukten. >> Nutzen Sie den Katalog nach dem Download auch ohne aktive Internet verbindung. Werkzeuge >> Ob Timer oder Standard Genetic Code, hier finden Sie breit einsetzbare Laborhelfer. Kalkulatoren >> Nutzen Sie die einfach bedienbaren Kalkulatoren für viele Standardanwendungen. News >> Alle Neuigkeiten rund um Eppendorf sowie Informationen zu internationalen Messebeteiligungen. Kontakt & Feedback >> Nehmen Sie Kontakt mit Eppendorf auf, bestellen Sie Produktmuster oder fordern Sie den Besuch eines Eppendorf-Experten an. So läuft Ihre Illumina® NGS-Methode auf Ihrer epMotion® >> Helfen Sie uns dabei, unser Angebot Einfach die heruntergeladenen Methodenund Labware-Dateien auf Ihre epMotion übertragen und starten! (Je nach Probentyp, Volumen und Poolingstrategie kann eine Methodenoptimierung erforderlich sein.) Weitere NGS-Probenvorbereitungsmethoden sind auf Anfrage erhältlich bzw. in Vorbereitung. Jetzt herunterladen unter *Illumina (www.illumina.com) ist ein führender Entwickler, Hersteller und Vermarkter von Life-Sciences-Instrumenten und integrierten Systemen für die Analyse genetischer Variation und Funktion. Die hier aufgeführten Methoden sind ausschließlich für molekulare Forschungsanwendungen bestimmt. Sie sind nicht bestimmt, verifiziert oder validiert für die Diagnose von Krankheiten oder anderer menschlicher Gesundheitszustände. epMotion® Familienbroschüre • Kennziffer 254 weiter für Sie zu optimieren. www.eppendorf.com/eppendorf-app Oder QR-Code nutzen! EPPENDORF-FORSCHUNGSPREISE: GEWINNER ZU GAST BEI EPPENDORF · NEWS 13 BERRIT HOFF UND CAROLYN TAUBERT, EPPENDORF AG Eppendorf-Forschungspreise: Gewinner zu Gast bei Eppendorf Thomas Wollert bei seinem Vortrag in der Eppendorf-Konzernzentrale Dr. Thomas Wollert, Forschungsgruppenleiter am Max-Planck-Institut für Biochemie in Martinsried, erhielt den mit 20.000 Euro dotierten Eppendorf Award for Young European Investigators 2015 für seine bahnbrechende Rekonstitution komplexer intrazellulärer Prozesse im Reagenzglas unter Verwendung künstlicher Membranen und aufgereinigter Komponenten. Seine Experimente ermöglichen ein besseres Verständnis von Schlüsselschritten der Autophagozytose, eines zentralen Prozesses der Entsorgung von beschädigten zellulären Bestandteilen eukaryotischer Zellen. nach Wolfsratshausen gepaddelt, wo es ein leckeres Essen und Bier im Biergarten gab. Der Rest des Geldes wird auf die hohe Kante gelegt. Da meine Anstellung am Max-Planck-Institut zeitlich befristet ist, kann ich ein gewisses Polster gut gebrauchen. Mehr Info unter www.eppendorf.com/award Auch Eiman Azim, Ph.D., Postdoctoral Research Fellow an der Columbia University, New York, Gewinner des Eppendorf & Science Prize for Neurobiology 2014 (wir berichteten in BioNews 42), war im Sommer 2015 in Hamburg. Azims Arbeit hat grundlegende neue Einsichten in die neuronalen Mechanismen ermöglicht, die erlernte Bewegungen der Gliedmaßen geschmeidig und gleichzeitig präzise machen. Wir sprachen mit ihm. BioNews: Was war das für ein Gefühl, als Sie vom Preisgewinn erfuhren? Thomas Wollert: Ich war total überrascht und habe mich sehr gefreut! Diese Auszeichnung würdigt das hohe Engagement meiner Labormitglieder für unser Forschungsziel, die Autophagozytose auf molekularer Ebene zu verstehen. Unser außergewöhnlicher Ansatz, komplexe molekulare Maschinen aus ihren Einzelteilen zusammenzusetzen, um ihre Funktionsweise zu charakterisieren, erfährt durch diesen Preis Anerkennung und Beachtung. BN: Im Sommer 2015 besuchten Sie Eppendorf in Hamburg sowie unser Kunststoffwerk Eppendorf Polymere in Oldenburg. Wie war Ihr Kurztrip in den Norden? TW: Es war hochinteressant, Einblicke in ein Unternehmen zu gewinnen, dessen Produkte mir seit meinem Laborpraktikum bestens bekannt sind. Besonders gespannt war ich darauf, zu sehen, wie Pipetten und die berühmten „Eppis“ hergestellt werden. Es war wirklich toll, die Herstellung der Pipetten zu sehen. Mit großem Interesse habe ich die Kalibrierung und Qualitätskontrolle verfolgt. Der Besuch des Eppendorf-Kunststoffwerks war ein weiteres Highlight. Von Spritzguss hat wohl jeder schon einmal gehört. Dieses Verfahren aber in der Realität zu sehen, war spannend und informativ. Wie Pipettenspitzen und andere Verbrauchsmaterialien produziert werden – in welchen Stückzahlen und mit welchem Automatisierungsgrad – hat mich wirklich beeindruckt. BN: Was werden Sie mit dem Preisgeld machen? TW: Zunächst einmal habe ich mein Laborteam zu einem Paddel ausflug eingeladen. Zu zehnt sind wir auf der Isar von Bad Tölz Eiman Azim BioNews: Worin lag für Sie die Attraktivität des Eppendorf & Science Prize? Eiman Azim: Der Bewerbungsessay bot mir die einmalige Möglichkeit, einen Schritt zurückzutreten und zu sehen, wie sich meine Arbeit einem breiteren Publikum vermitteln ließe. Meine Wissenschaft auf kreative Weise zu beschreiben, war ein großer Ansporn. Zudem zielt der Prize auf den Schnittpunkt von Neurowissenschaften und Molekularbiologie, also genau mein Fachgebiet. BN: Glauben Sie, dass der Eppendorf & Science Prize Ihrer Karriere nützen wird? EA: Absolut. Bei der Bewerbung musste ich intensiv darüber nachdenken, was genau mich an der Bewegungssteuerung am meisten interessiert und unser Verständnis des Gehirns am entscheidendsten voranbringen könnte. Der Preisgewinn hat meiner Arbeit definitiv viel Aufmerksamkeit beschert, was im abgelaufenen Jahr enorm hilfreich war, da ich mich mit der kniffligen Situation auseinander setzen musste, zum einen eine unabhängige Stelle zu finden und gleichzeitig Fördermittel sicherzustellen. Daher bin ich Eppendorf und Science sehr dankbar für diese Auszeichnung. Mehr Info unter www.eppendorf.com/prize 14 TIPP · FÜR WEITERE HINWEISE SCHAUEN SIE IN DIE BEDIENUNGSANLEITUNG! BERRIT HOFF, EPPENDORF AG Für weitere Hinweise schauen Sie in die Bedienungsanleitung! Hand aufs Herz! Wann haben Sie zum letzten Mal bei einer Tasse Kaffee oder Tee ganz in Ruhe eine Bedienungsanleitung von Anfang bis Ende durchgelesen? Noch nie? Dann sind Sie nicht allein. Anwender greifen eigentlich nur zur Bedienungsanleitung, um zu erfahren, wie man ein Gerät in Betrieb nimmt oder um eine Lösung für ein Problem zu finden. Dabei hat eine Eppendorf-Anleitung noch einiges mehr zu bieten, erläutert Frank Thormählen (Bereichsleiter Technische Dokumentation bei Eppendorf). Herr Thormählen, was zeichnet eine gute Bedienungsanleitung aus? Frank Thormählen: Sie ermöglicht dem Anwender die Lösung seines Problems und zwar so schnell und einfach wie möglich. Hierbei unterstützen eine gute Kapitelstruktur, ein übersichtliches Inhaltsverzeichnis, Vollständigkeit, handlungsorientierte Überschriften sowie professionelle Illustrationen. Eine anspruchsvolle Aufgabe für die beteiligten Kollegen! Lesen Eppendorf-Kunden ihre Anleitungen? FT: Eppendorf-Produkte sind in der Regel ja intuitiv bedienbar, so dass ein Anwender für die grundlegende Bedienung nicht jedes Mal in die Anleitung schauen muss, obwohl sie noch einiges mehr zu bieten hat! Eine Zentrifugen-Anleitung enthält z.B. neben Informationen zur Reinigung und zum Umgang mit Zubehör auch Angaben darüber, für welche Gefäße welcher Rotor und welcher Adapter benutzt werden können. Ferner enthalten sind Details zu Radien und g-Zahlen, die für die korrekte Durchführung einer Anwendung wichtig sind und auch bei der Dokumentation von Kunden-Prozessen eine Rolle spielen. Für die häufige Nutzung unserer Anleitungen sprechen übrigens die Download-Zahlen von der Eppendorf-Internetseite! Welche Qualifikationen haben Ihre Mitarbeiter? FT: Vom studierten Technischen Redakteur über Sprachwissenschaftler bis zum Ingenieur haben wir ein breites Spektrum an Know-how und Erfahrung. Wir bilden uns regelmäßig fort, um über die neuesten Entwicklungen auf dem Laufenden zu bleiben. Wie ist die Herangehensweise Ihrer Mitarbeiter an ein neues Projekt? FT: Wir arbeiten eng mit verschiedenen Abteilungen zusammen, deren Anforderungen in ein Basismanuskript einfließen. An diesem „Rohdiamanten“ nehmen wir dann den „Feinschliff“ vor. Das beinhaltet sorgfältige Terminologie-Arbeit, die Erstellung der notwendigen Illustrationen durch unsere Grafiker, das „Hands-on“ am Produkt, um zu überprüfen, ob alles vollständig und korrekt beschrieben ist, und nicht zu vergessen sind die Sicherheitshinweise. Welche Technologien stehen Ihnen zur Verfügung? in eine Produkt-Informations-Datenbank, aus der unter anderem unsere Internetseiten und die Eppendorf-App (siehe auch Seite 12) gespeist werden. Welche gesetzlichen Vorgaben gibt es? FT: Für Anleitungen gilt die Norm EN 82079. Unsere Anleitungen berücksichtigen auch die Gesetze und Normen, die – zum Teil auch länderspezifisch – für die beschriebenen Geräte und Consumables gelten. Alle Normen sind in der CE-Er klärung des Geräts aufgeführt. Da die Anleitung auch haftungsrechtlich eine große Bedeutung hat, müssen wir hohe Anforderungen z.B. hinsichtlich Änderungsdokumentation und Versionsarchivierung erfüllen. Warenzeichenhinweise FT: Wir nutzen moderne, datenbankgestützte Werkzeuge. Ein Redaktionssystem und ein Terminologie-Tool unterstützen uns dabei, sprachlich korrekt und konsistent zu sein und bestimmte Sprachregeln einzuhalten, auch in Hinblick auf gute Lesbarkeit. Amazon® is a registered trademark of Amazon Tech, Inc., USA. Apple®, iPod®, iPad®, and iPhone® are registered trademarks of Apple, Inc., USA. CASY® and Roche® are registered trademarks of Roche Diagnostics Co., USA. Covaris® is a registered trademark of Covaris, Inc., USA. EX-CELL® is a registered trademark of Sigma-Aldrich Co. LLC., USA. Flownamics® and Seg-Flow® are registered trademarks of Flownamics Analytical Instruments, Inc., USA. HiSeq®, Illumina®, MiSeq®, and TruSeq® are registered trademarks of Illumina, Inc., USA. iOS® is a trademark or registered trademark of Cisco in the U.S. and other countries and is used by Apple under license. MEBAK® is a registered trademark of Mitteleuropäische Brautechnische Analysenkommision e.V., Germany. Mettler-Toledo® is a registered trademark of Mettler-Toledo AG, Switzerland. FlowWeb™ and FlowFraction™ are trademarks of Flownamics Analytical Instruments, Inc., USA. s-CDM™ and Pro293™ are trademarks of Lonza AG Corporation, Switzerland. Die fertigen Texte lassen wir in bis zu 26 Sprachen übersetzen! Das erledigt unser internes Übersetzungsmanagement. Wir übersetzen natürlich nicht alles selbst, verwenden aber das gleiche ÜbersetzungsTool wie unsere externen Übersetzer. Der letzte Schritt ist das Einstellen der Daten Eppendorf ®, the Eppendorf logo, BioBLU®, Biopur ®, Combi tips advanced®, Easypet ®, ep Dualfilter T.I.P.S.®, epMotion®, Eppendorf BioSpectrometer ®, Eppendorf Eporator ®, Eppendorf Kit rotor ®, Eppendorf Reference®, Eppendorf ThermoMixer®, Eppendorf Tubes®, Eppendorf Xplorer®, epPoints®, the epServices® logo, epT.I.P.S.®, Mastercycler ®, Multipette® are registered trademarks of Eppendorf AG, Germany. Eppendorf Quality™ and New Brunswick™ are trademarks of Eppendorf AG, Germany. DASbox®, DASGIP®, and DASware® are registered trademarks of DASGIP Information and Process Technology GmbH, Germany. BioFlo® and Innova® are registered trademarks of Eppendorf, Inc., USA. U.S. Design Patents are listed on www.eppendorf.com/ip. GEWINNSPIEL · SERVICE 15 Gewinnspiel mit tollen Preisen Die Lösung des Preisrätsels aus BioNews Nr. 42 lautete „Cell Biology Workflow“. Ewa Sztupecka (Kazimierz Wielki Universität, Bydgoszcz, Polen) gewann den ersten Preis. Viel Glück bei unserem neuen Rätsel! Bringen Sie alle Buchstaben in den grau hinterlegten Feldern in die korrekte Reihenfolge und schicken Sie uns die richtige Antwort bis zum 30. Juni 2016. 1 10 2 11 16 3 4 5 12 6 7 Einfach eine E-Mail an bionews@eppendorf.de senden oder online teilnehmen unter www.eppendorf.com/bn-service. Unter allen richtigen Einsendungen verlosen wir wieder attraktive Preise. Die Gewinner werden schriftlich benachrichtigt. Eine Barauszahlung ist nicht möglich. Der Rechtsweg ist aus geschlossen. Eppendorf-Mitarbeiter und deren Angehörige dürfen nicht teilnehmen. Der Gewinner des ersten Preises wird in Ausgabe 46 veröffentlicht. 8 9 13 17 14 18 20 22 24 25 29 33 34 30 31 35 38 23 26 27 41 42 43 46 47 50 36 37 44 45 48 54 59 16 18 19 20 22 24 26 28 29 6. bis 15. Preis: je 400 Bonus epPoints® 52 55 56 57 58 (Registrierung bei epPoints erforderlich) 60 WAAGERECHT 14 je 1 Amazon® Gutschein im Wert von 50,00 Euro 49 51 53 2 6 10 12 2. bis 5. Preis: 32 39 40 1. Preis: 1 Eppendorf Reference® 2 Pipette (Einkanal, variabel) Ihrer Wahl 19 21 28 15 Unerwünschte E-Mail Spanische Küste Engl. Präposition Für Elektrophorese verwendetes Polysaccharid Lima ist die Hauptstadt dieses Landes (ISO-Kürzel) Alkoholisches Getränk Requiescat in pace (Abk.) Thermoplastischer Kunststoff, aus dem u.a. Eppendorf Tubes® hergestellt werden (Abk.) Amerikanischer Maler (1903 –1970) Engl. Trinkgeld Namensbestandteil der Schiffe der Royal Navy Vorname der zweiten Ehefrau von Heinrich VIII. ISO-Kürzel für die Vereinigten Arabischen Emirate Motto, Werbespruch SENKRECHT 32 Juniperus gibt diesem Getränk das typische Aroma 33 Chemisches Kürzel für Mangan 34 100 Liter (auch in Lübeck, Abk.) 35 ISO-Kürzel für Ghana 37 Anno Domini 38 Altes Testament (Abk.) 39 ISO-Kürzel für Guadeloupe 40 Englisches Handbuch/ Bedienungsanleitung 44 Glückloser König, Vater dreier Töchter 46 Englische Blume (Liliengewächs) 47 Open Platform Communications (Abk.) 49 Rhesusfaktor (Abk.) 50 Der frühe englische ... fängt den Wurm 51 Chemisches Kürzel für Tantal 53 Teilnahmeschein in einer Lotterie (Pl.) 54 Teilstück 59 Römischer Kaiser 60 Edel, geschmackvoll 1 3 4 5 6 7 8 9 11 13 15 17 21 23 24 25 Kurzform von Robert Teil eines Ganzen Chemisches Kürzel für Silber Männlicher Vorname Amerikanischer Polizist Chemisches Kürzel für Osmium Bräunliche Fotofarbcharakteristik Läuft auf Smartphones und Tablets Biochemischer Prozess Zweitgrößte Stadt Brasiliens Gibt die BioNews heraus Göttin der Morgenröte Den Highway dorthin kennen AC/DC Grafikformat (Abk.) Türkisches Dampfbad Bundesstaat am Pazifik im Nordwesten der USA (Abk.) 27 Fitnesssportart 29 Englische Oberkörperregion 30 Gute Herstellungspraxis (z.B. für Arzneimittel, Abk.) 31 Non-governmental organization (Abk.) 36 Chromatographisches Trennverfahren (Abk.) 39 Gute Laborpraxis (Abk.) 41 Engl. Krankenschwester 42 ISO-Kürzel für Anguilla 43 Völlig, ganz und gar 45 Chemisches Kürzel für Argon 48 Hoteldiener 52 Englisches Heißgetränk 55 Chemisches Kürzel für Rhenium 56 Chemisches Kürzel für Magnesium 57 Normalnull (Abk.) 58 ISO-Kürzel für Trinidad und Tobago Lösungshinweis für das Gewinnspiel BioNews Nr. 44: U I F Einsendeschluss für das Gewinnspiel: 30. Juni 2016. Online teilnehmen unter www.eppendorf.com/bn-service oder das Lösungswort per E-Mail an bionews@eppendorf.de senden! ABN 4413010 want new technologies? antibodies apoptosis biomarkers cancer cytometry data diseases DNA epigenetics genomics immunotherapies medicine microbiomics microfluidics microscopy neuroscience proteomics watch our webinars Learn about the latest breakthroughs, new technologies, and ground-breaking research in a variety of fields. Our expert speakers explain their quality research to you and answer questions submitted by live viewers. sequencing toxicology transcriptomics VIEW NOW! webinar.sciencemag.org Brought to you by the Science/AAAS Custom Publishing Office @SciMagWebinars