Candida albicans

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Isolierung, Identifizierung und funktioneile Charakterisierung der
Metallo-Aminopeptidase CaApe2
Ein experimenteller Beitrag zur Beurteilung des
kariogenen Potentials von Candida albicans
INAUGURALDISSERTATION
zur Erlangung des doctor medicinae dentariae (Dr. med. dent.)
der Medizinischen Fakultät Carl Gustav Carus
der Technischen Universität Dresden
vorgelegt von
Roman Pönisch
aus Dresden
Dresden 2008
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung
1
1.1
1.2
1.3
1.3.1
1.3.2
1.3.3
1.3.4
1.3.5
1.3.6
1.4
1.4.1
1.4.2
1.4.3
1.4.4
1.4.5
1.5
1.5.1
1.5.2
1.5.3
1.5.4
1.5.5
1.6
1.7
1.8
1.9
Gruppe der Pilze
Candida albicans: Einordnung und Morphologie
Medizinische Bedeutung von Candida albicans
Epidemiologie der Ca/?d/da-lnfektionen
Candida in der Mundhöhle
Weitere klinisch relevante Candida-Spezles
Klinik der Candida-lnfektionen
Diagnostik der Cand/c/a-Infektionen
Therapie der Candida-\ nfektionen
Virulenzfaktoren von Candida albicans
Zellwand und Adhäsion von Candida albicans
Phänotypenwechsel
Dimorphismus
Thigmotropismus
Hydrolytische Enzyme von Candida albicans
Peptidasen
Funktionen von Peptidasen
Klassifikation der Peptidasen
Aminopeptidasen
Metallopeptidasen
Sezernierte Aspartylproteinasen (Saps) von Candida albicans
Kollagen-Struktur
Kollagenolyse
Zusammensetzung von Dentin
Candida albicans und Dentinkariogenese
1
2
3
4
5
6
7
9
9
10
11
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15
15
17
17
17
19
19
20
24
25
26
27
2
Zielsetzung der Arbeit
30
3
Material und Methoden
31
3.1
3.1.1
3.1.2
3.1.3
3.1.4
3.1.5
3.2
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.2.4
3.2.5
3.2.6
3.2.7
3.2.8
3.2.9
3.2.10
3.2.11
3.2.12
3.2.13
3.2.14
Geräte und Materialien
Geräte und Verbrauchsmaterialien
Chemikalien
Kulturmedien-Bestandteile
Enzyme und Antikörper
Cand/da-a/b/cans-Stämme
Methoden
Stammhaltung
Zellkultivierung von Candida albicans
Peptidase-Aktivitäts-Bestimmung
Methoden zur Enzymfreisetzung aus der Zellwand
Zellaufschluss
Enzymreinigung aus Zellwandlysat von Candida albicans
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Proteinkonzentrationsbestimmung
Peptididentifizierung mittels Massenspektrometrie
Datenbankrecherche
Charakterisierung der isolierten Peptidase
Albuminabbau-Test
Kollagenabbau-Tests
Dentinscheibengewinnung und Dentinabbau-Test
31
31
34
36
36
37
37
37
37
40
41
42
43
45
47
48
49
49
52
53
56
Inhaltsverzeichnis
4
Ergebnisse
58
4.1
4.1.1
58
4.4.3
Versuche zur Enzymfreisetzung aus der Zellwand
Vergleich von verschiedenen Methoden zur Enzymfreisetzung
aus der Zellwand
Vergleich der Zellwandlyse von Zellen verschiedener Nährmedien
Vergleich Zellaufschluss - Zellwandlyse
Reinigung eines peptidolytischen Enzyms aus Zellwandlysat
HiLoad 26/10 Q Sepharose HP
Mono Q HR 5/5
Superdex20010/300GL
RESOURCE™ ETH
Zusammenfassung der Enzymreinigung
Charakterisierung des peptidolytischen Enzyms aus der Zellwand
von Candida albicans
Molekulare und funktionelle Identifizierung der Peptidase
Vergleichende Sequenzanalyse der isolierten Peptidase mit
homologen Proteinen der Ascomycota
pH-Optimum der Enzymaktivität der isolierten Peptidase
Substratspezifität und Enzymkinetik der isolierten Peptidase
Wirkung von Proteinaseinhibitoren und Metallkationen auf die
L-Alanin-7-amido-4-rnethylcoumarin-Hydrolyse durch die Peptidase
Temperaturoptimum der Enzymaktivität
Endopeptidase-Aktivität enzymhaltiger Proben von Candida albicans
Albuminabbau durch enzymhaltige Proben von Candida albicans
Kollagenhydrolytische Aktivität enzymhaltiger Proben
von Candida albicans
Dentinhydrolyse durch enzymhaltige Proben von Candida albicans
79
82
5
Diskussion
83
5.1
5.2
Substrate zum Nachweis kollagenolytischer Aktivität
Reinigung eines peptidolytischen Enzyms aus der Zellwand
von Candida albicans
Vergleich der Zellwandlyse von Zellen verschiedener Nährmedien
Vergleich der Methoden Zellwandlyse und Zellaufschluss
Fünfstufige Reinigung des Zellwandlysats
Proteinidentifizierung und BLASTp-Suche
Diskussion der Eigenschaften der Metallo-Aminopeptidase
pH-Optimum der Enzymaktivität
Substratspezifität und Enzymkinetik
Inhibitionsprofil
Temperaturoptimum
Bedeutung der Metallo-Aminopeptidase
Wirkungsort und Aktivitätszustand der Metallo-Aminopeptidase
Kollagenolytische Wirksamkeit der Metallo-Aminopeptidase
Funktionen der Metallo-Aminopeptidase
Kollagenolyse durch Candida albicans im neutralen Milieu
Kollagenolyse durch Candida albicans im sauren Milieu
Kollagenolytische Aktivität des Kulturüberstandes
Kollagenolytische Aktivität des Zellaufschlusses
Hypothetische Rolle der sezemierten Aspartylproteinasen
in der Dentinkariogenese
83
4.1.2
4.1.3
4.2
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
4.2.5
4.3
4.3.1
4.3.2
4.3.3
4.3.4
4.3.5
4.3.6
4.4
4.4.1
4.4.2
5.2.1
5.2.2
5.2.3
5.3
5.4
5.4.1
5.4.2
5.4.3
5.4.4
5.5
5.5.1
5.5.2
5.5.3
5.6
5.7
5.7.1
5.7.2
5.7.3
58
59
59
60
60
61
63
64
65
68
68
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89
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96
96
98
99
Inhaltsverzeichnis
6
Ausblick
101
7
Zusammenfassung
102
8
Literaturverzeichnis
103
9
Anhang
121
9.1
9.2
9.3
9.4
9.5
9.6
9.7
Tabellenverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Danksagung
Tabellarischer Lebenslauf
Erklärung
Thesen
121
122
123
125
126
127
128