15,9 MB

Klinische Chemie und Laboratoriumdiagnostik
Vorlesung: Chromatographie und Massenspektrometrie
Dr. rer. nat. Frank Kannenberg
Centrum für Laboratoriumsmedizin
– Zentrallaboratorium –
Universitätsklinikum Münster
Albert‐Schweitzer‐Campus 1
D‐48149 Münster
Tel.: 0251 83‐47227
Fax: 0251 83‐47225
kannenberg@uni‐muenster.de
www.klichi.uni‐muenster.de
Sommersemester 2014
-1-
Gliederung
1.
2.
3.
4.
5.
Chromatographie, Geschichte, Prinzip
DC (Dünnschicht-Chromatographie)
HPLC (Flüssig-Chromatographie)
GC (Gas-Chromatographie)
Massenspektrometrie und MS-Kopplungen
-2-
M.Tswett 1903
f
• Chromatographie:
„mit Farbe schreiben“
• Tswett 1903: Auftrennung
von Chlorphyll
-3-
Säulenchromatographie
Petroleum ether
Chlorophyll-Extrakt
Farbe
“chroma”
schreiben
“graphein”
CaCO3
-4-
Was ist Chromatographie?
Trennung ähnlicher Moleküle aus komplexen Gemischen
• Die Analyte werden in einer mobilen Phase gelöst und
darin durch eine stationäre Phase transportiert.
• Die Phasen werden so gewählt, dass sich die Analyte
unterschiedlich in ihnen verteilen.
• Durch die dadurch entstehenden Mobilitätsunterschiede
trennen sich die Probe-Komponenten in Banden auf.
-5-
Trennprinzip
Säulenanfang
• Stoffgemisch
Stationäre
• Komponenten
Phase
wechseln ständig
zwischen mobiler
und stationärer
Phase
• Gleichgewicht
(Verteilung,
Adsorption)
• Trennung
mobile Phase
Säulenende
Zeit
-6-
Trennprinzip
I
Injektor
S
Säule
D
Detektor
C
Chromatogramm
-7-
Klassifikation der Chromatographie
• Planare Chromatographie:
– Papierchromatographie
– Dünnschichtchromatographie (DC)
• Säulenchromatographie:
– gepackte Säulen
– Flüssigchromatographie
(LC, HPLC, IEC, GPC)
– Gaschromatographie
(GC, GLC, GSC)
– Chromatographie mit
überkrit. Fluiden (SFC), z.B CO2
-8-
Dünschichtchromatographie (DC)
• stationäre Phase:
– z.B. Kieselgel (polar) auf
Glasplatte oder Alufolie
• mobile Phase:
– Laufmittel, z.B. Ethanol
• DC-Chromatogramm:
– Auftragen (man./autom.)
– Entwickeln („DC-Lauf“)
– Trocknen, Detektieren
(ggf. Anfärben)
• Polaritäten beachten!
- polare (hydrophile)
Analyten „laufen“ auf
Kieselgel nicht
-9-
Retentionsfaktor (Rf –Wert)
• Substanzspezifisch
(bei gleichen chromat.
Bedingungen)
Laufstrecke Substanz
Rf =
Laufstrecke Lösungsmittel
Rf 0.5
Rf 0.3
Eintauchtiefe
1
2
- 10 -
Normal-/Umkehrphasen-Chomatographie
• „Normalphase“:




Kieselgel (SiO2)
polar (hydrophil)
für hydrophobe Analyten
Laufmittel unpolar
(z.B. Heptan)
• RP-Phase
(„reversed phase“):
 Kieselgel (SiO2) mit
unpolaren Gruppen
 unpolar (hydrophob)
 Trennung hydrophiler
Analyten möglich
 Laufmittel polarer
(z.B. Acetonitril/Wasser)
- 11 -
HPLC (HighPerformanceLiquidChromatography)
Pumpe
Pumpe
Trennsäule
Detektor
Eluent
Einspritzventil
Säulennofen
- 12 -
HPLC-Säule
• Spezifikationen
CS-Chromatographie Service
Multospher 120 RP-18 HP 5µ
Säulendimension (Länge x ID)
Art.-Nr. xxxx HPLC-Säule 250x3 mm
Multospher 120 RP-18 HP-5
Ch. 70801
Säulen-Nr. 0103-01 Flow --------
Muster-Chromatographie
Tel., Fax, mail
Korngröße in µm
Modifizierung des Kieselgels
Porengröße (Angström)
Herstellername des Kieselgels
Flussrichtung
- 13 -
RP-HPLC: Medikamentenanalyse
• Detektion +
Quantifizierung
– Photometrie
(„UV-/vis Detektor“)
– auch andere
Detektoren
• Peak
– Retentionszeit
substanzspezifisch
– Höhe, Fläche
proportional zur
Konzentration
– Kalibration
– Quantifizierung
- 14 -
Schnelle HPLC (FAST- HPLC)
• kurze Säulen
 ca. 3 cm (statt 30 cm)
• sehr kleine Partikel
 ca. 1,5 µm (statt 5 µm)
• Vorteile:
– erheblich kürzere
Analysendauer
– weniger Lösungsmittel
• Nachteile:
– schneller Detektor notw.
– nicht alle Trennungen mögl.
– höhere Drucke
- 15 -
HPLC: „Sensorische Verkostung“
• menschl. Geschmack
als Detektor
• Eluat wird „verkostet“
• Aroma-Analytik
• „LC-Taste“
(Abb. Fa. Symrise)
- 16 -
Gaschromatographie: Vgl. HPLC
• HPLC: Mobile Phase flüssig (Laufmittel)
– z.B. Methanol/Wasser, Acetonitril/Wasser
• GC: Mobile Phase gasförmig (Trägergas)
– Stickstoff, Wasserstoff, Helium
– Vorteile GC:
• Trennleistung (v.a. kleine, unpolare Moleküle)
• Empfindlichkeit
– Nachteile GC:
• Verbindungen müssen flüchtig oder leicht
verdampfbar sein (ggf. Derivatisierung)
• Apparativer Aufwand (Gasleitungen)
- 17 -
GC: Schematischer Aufbau
Reservoir für
mobile Phase
Gasflasche
mit Vorreinigung
Probenaufgabe
Injektor
Autosampler
HeadspaceAufgabe
Chromatogr.
Trennsäule
gepackte Säule
Kapillarsäule
Detektor
Schreiber, EDV
FID
WLD
MSD
AED
NPD
ECD
- 18 -
Gaschromatograph
Autosampler
Injektor
Detektor
GC-Ofen
Bedienungsfeld
- 19 -
Quarzglas-Kapillaren im GC-Ofen
• GC-Säule aus Glas
• Polyimidbeschichtung
(Flexibilität)
• 10-100 m Länge
• 0,1-0,5 mm
Innendurchmesser
• 0,1-1,2 µm Beschichtung
stationäre Phase
• dreidimesional vernetzt
• verschiedene Polaritäten
- 20 -
Split-/Splitless-Injektor
• Injektion mit Spritze durch
Septum (etwa 1 µl)
• Heißes Rohr (Liner)
Verbindung zur Trennsäule
• Probe verdampft
• Splitventil auf oder zu
• Trägergas nimmt Probe mit
auf die Säule
- 21 -
Flammenionisationsdetektor (FID)
• GC-Detektor universell
für org.Verbindungen
• Pyrolyse in der Luft/
Wasserstoff-Flamme
•  Ionen + Elektronen
• Spannung zwischen
Brennerende und
Sammelelektrode:
•  Strom
•  analoges Signal
•  digitales Signal (PC)
- 22 -
GC: Olfaktometrische Detektion („Sniffer“)
Quelle: http://www.ak-hoffmann.chemie.unimainz.de/pdf/script/script2.pdf
- 23 -
GC-Anwendung: Toxikologie
Blutalkohol, Methanol-Vergiftung
Blood Alcohols
Column:
Econo-Cap™ EC-WAX ,
30m x 0.32mm x 0.25um
Temp: 50°C
Carrier:
Helium at 1.08mL/min
(22.5 cm/sec)
Detector:
FID at 300°C
Peak Identification
1 . Acetaldehyde
2 . Acetone
3 Methanol
. Methanol
4 . 2-Propanol
5 (Methylalkohol)
. Ethanol
- 24 -
Methanol-Vergiftung, Behandlung
Ethanol =ADH=> Acetdehyd
=langsam=> Essigsäure (==>Citratzyclus CO2, H2O)
Methanol =ADH=> Formaldehyd =schnell=> Ameisensäure (metabolische Acidose)
Isopropanol =ADH=> Aceton
Therapie:
•
Ethanol oder anderer ADHInhibitor (z.B. 4-Methylpyrazol;
kompetitve Hemmung von ADH)
•
Hämodialyse (Gifte eliminieren)
•
Folsäure (Abbau Ameisensäure)
•
Na-Hydrogencarbonat (Azidose)
Dr. F. Kannenberg
- 25 -
Smith-Lemli-Opitz Syndrom (SLO-S)
Häufige Missbildungen
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Schädeldeformierung (Mikrozephalie)
breite Nasenwurzel
hoher Gaumen
abnorm kleiner Oberkiefer (Mikrognathie)
Herabhängen der Lidspalten (Ptosis)
Verwachsungen an Fingern + Zehen (Syndaktylie)
Minderwuchs
geistige Retardierung
Muskelschwäche
Entwicklungsanomalie der Genitalien
- 26 -
GC-Anwendung: Stoffwechseldiagnostik
Smith-Lemli-Opitz Syndrom
• SLO-Syndrom
– vererbbarer Defekt in der Cholesterolbiosynthese
– schwere Missbildungen
– Cholesterin stark erniedrigt
– 7-Dehydrocholesterin (7-DHC) und 8-DHC stark
erhöht (Marker)
• Analytik
– Routine Cholesterin-Analytik ungeeignet
– GC zur Quant. von Cholesterin, 7-DHC, 8-DHC
– 24 Fälle seit 1995 hier entdeckt, davon 2 pränatal
- 27 -
SLO: GC-Chromatogramm
40
7-Dehydrocholesterol
Response in mV
60
8-Dehydrocholesterol
wl200195
Cholesterol
Interner Standard
80
20
0
0
10
20
30
Retentionszeit in min
GC-Chromatogramm der Plasma-Neutralsterolfraktion eines SLO-Patienten.
- 28 -
Cholesterinvorläufer & Defekte
• Endogenes Cholesterol
Biosynthese (Leber)
• Precurser
– Lanosterol, Cholestenol,
Lathosterol, 7-DHC, 8-DHC
– Desmosterol
• Enzymdefekte
– hereditär
– schwere Erkrankungen
•  Marker für die
Cholesterolsynthese
- 29 -
Gliederung
1.
2.
3.
4.
5.
Chromatographie, Geschichte, Prinzip
DC (Dünnschichtchromatographie)
HPLC (Flüssigchromatographie)
GC (Gaschromatographie)
Massenspektrometrie und MS-Kopplungen
a)
b)
c)
d)
GC/MS (Gaschromatographie/Massenspektrometrie)
LC/MS (HPLC/Massenspektrometrie)
MS/MS (Tandem-Massenspekrometrie)
MALDI-MS („Weiche Ionisierung“, Proteomics)
- 30 -
GC/MS-Kopplung
• GC
– Chromatographische
Gemisch-Trennung
Quelle der Animation: Trace GC. Thermo-Finnigan, 2002
• MS
– Detektor
– Ionisation durch
Elektronenstoß (EI)
– Massenspezifische
Trennung
– Massenspektrum
substanzspezifisch
- 31 -
Warum GC (oder HPLC) + MS?
• alle GC-Methoden (FID) auch GC/MS tauglich
– vielfältige Anwendungsbereiche
– Medizin, Lebensmittel, Umwelt, Industrie, Gericht
• höhere Empfindlichkeit
– mind. Faktor 100 im Vergleich zu GC (FID)
• NWG Dioxin: 1967 GC-FID 500 pg; 1992 GC/HRMS 0,005 pg
• z.B. Drogennachweis in Haaren („Drogenkarriere“ über Jahre)
• qualitativ besseres Messergebnis
– mehr Informationen (Massenspektrum)
– höhere Sicherheit bei der Substanzidentifizierung
(z.B. Doping-Kontrolle)
– Analyse unbekannter Verbindungen
(Spektren-Bibliotheken)
- 32 -
GC/MS 50er Jahre
DIE 5OER JAHRE - KOMMERZIALISIERUNG
CEC Model 21-103 Sector Field Mass Spectrometer (1950)
- 33 -
DIE 70ER JAHRE - EXTRATERRESTRISCHE
MASSENSPEKTROMETRIE
1969-1972: SECHS MISSIONEN
ZUM MOND MIT GC/MS
KEINE BEWEISE FÜR LEBEN
MINIATURISIERTE MASSENSPEKTROMETER AN
BORD VON SATELLITEN ZUR UNTERSUCHUNG
DER ÄUSSEREN ERDATMOSPHÄRE (SEIT 1961))
PIONEER 13
MISSION ZUR VENUS
MIT GC/MS (NASA 1979)
VIKING MISSION ZUM MARS:
VIKING LANDER MIT GC/MS
ZUR UNTERSUCHUNG DER
MARS-ATMOSPHÄRE
(NASA 1975)
- 34 -
GC/MS heute
GCMS-System „QP2010Ultra“; Abb.: Fa. Shimadzu, 2010
- 35 -
Grundprizip der MS
• geladene Teilchen (Ionen) können unter Vakuum
in einem Magnetfeld von ihrer Flugbahn
abgelenkt werden
• Abhängig von
–
–
–
–
Masse (m)
Ladung (z)
Geschwindigkeit
Magnetfeldstärke
•  massenabhängige Selektion von Ionen m/z
- 36 -
GC/MS: schematischer Geräteaufbau
• Verbindung zum GC:
Interface, Transfer Line
• Ionenerzeugung:
Quelle, Ionisierungskammer
• massenspezifische
Trennung der Ionen:
MS-Analysator, Magnetfeld
• Detektion der Ionen:
Detektor, Multiplier
• Datenaufnahme und
Auswertung:
PC, EDV
Quelle der Animation: T.G. Chasteen 1996 (www.shsu.edu)
- 37 -
Auswertung: „Chromatogramm“
• Totalionenstrom
– Entspricht GCChromatogramm
• „Summe aller
Massenspektren“
- 38 -
Auswertung: Massenspektren
• Massenspektrum
• M+  Fragmentierung
(EI-Ionisierung 70 eV)
• substanzspezifisch;
„Fingerabdruck“
• bekannte Substanzen:
eindeutige Identifizierung
• unbek. Substanzen:
– Strukturmerkmale
– Referenzspektren
– Spektrenbibliotheken
M+-3x90
M+-3x90-115
Basispeak=100%
M=638
M+-2x90
M+-90
M+-15
• PMW > 6000 Pharmatka,
Drogen, Gifte
• NIST > 190000 Substanzen
- 39 -
GC/MS: Dopingkontrolle
Urin
Isolierung
GC/MS-Analyse
GC/MS-Gerät
Labor
Analyse
Interner
Standard
x 10 6
2.43
2.42
2.41
2.40
2.39
2.38
Time -> 1.00
Coffein
Positiver Dopingbefund
Amphetamin
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
Quelle: „Doping im Sport“; W. Schänzer; Institut für Biochemie, DSHS Köln, 2000
- 40 -
Sitosterolämie (Phytosterolämie)
• Klinik:
– Xanthome, Xanthelasmen
– Gelenkschmerzen, Arthritis
– frühe Arteriosklerose + KHK
• Serum:
– Cholesterin norm bis leicht ↑
– Phytosterine↑↑ (pflanzl.Kost)
bes. Sitosterin, Capesterin
– CAVE! Cholesterinsenkende
Margarine u.ä. Produkte
(falsch positives Ergebnis)
• Nachweis:
– GC, GC/MS
– Gen-Sequenzierung
• genetischer Defekt:
– autosomal rezessiv
– Mutation ABC G5, ABC G8
Quelle : www.meded.ucsd.edu
- 41 -
LC/MS
• HPLC (LC)
– Chromatographische
Trennung
• MS
–
–
–
–
Problem: Lösungsmittel
Ionisation: Elektrospray (ESI)
Massenspezifische Trennung
„Sanfte Ionisierung“
• Analyse großer Moleküle und
Proteine
Quelle: “MASSENSPEKTROMETRIE gestern - heute – morgen”;
Dr. Stefan Schürch, Universität Bern, 2004
- 42 -
LCMS:Elektrospray-Ionisierung (ESI)
Protonen auf Tropfen-Oberfläche
+ + +
+
+
+
+
+
+ +
+
+ + ++
+
+
+ + ++
Verdampfen des
Lösungsmittels
++
++
+
++
+ ++
++
+ ++
Rayleigh-Grenze
 Coulomb-Explosion
+
+ ++
+
+ +
+
Desorption mehrfach
geladener Ionen durch selbst
erzeugtes elektrisches Feld
MASSENANALYSATOR
ATMOSPHÄRENDRUCK
DETEKTOR
SPRAY
5000 V
10-2 mbar
LCMS_ESI.avi
TROCKNUNGSGAS
10-5 mbar
Quelle: “MASSENSPEKTROMETRIE gestern - heute – morgen”;
Dr. Stefan Schürch, Universität Bern, 2004
- 43 -
Tandem-Massenspektrometrie
•
•
•
•
Kopplung von Massenspektrometern (MS)
„mehrdimensionale Massenspektrometrie“
Tandem-Massenspektrometrie = MS/MS
MS1: massenspezifisches „Clean up“
– Substanzgemisch
– Matrix (Blut, Serum, Urin)
• MS2: Detektion der Analyten
- 44 -
MS/MS: Prinzip
- 45 -
GCMS/MS: Drogen in Haaren
• Nachweis von Drogen in Haaren
– GC/MS (SIM)
– Signal: Analyt (Konzentration)
– S/N durch „clean up“ besser
• höhere Empfindlichkeit
• qualitativ besseres Messergebnis
– Informationsgehalt 1000x höher
im Vergleich zu GC/MS
– höhere Sicherheit bei der
Substanzidentifizierung
(z.B. Doping-Kontrolle)
– Analyse unbekannter Verbindungen
(Spektren-Bibliotheken)
- 46 -
Isotopen-Verdünnungs-Analyse (ID/MS)
• Zugabe eines
isotopenmarkierten Standards
(gleiches Verhalten wie Analyt)
• Extrem hohe
Richtigkeit/Präzision
• Referenzmethode für
Kreatinin, Cholesterin,
Testosteron, Glucose,
Harnsäure, Harnstoff,
Medikamente.....
- 47 -
LCMS/MS: Immunsuppressiva
• Kontrolle nach
Organtransplantationen
– Enges therapeutisches Fenster
– Zu niedrig: Organ-Abstoßung
– Zu hoch: Nebenwirkungen (z.B.
Nierenversagen)
(Abb. LCMS/MS, Fa. Shimadzu)
• hohe Empfindlichkeit
• qualitativ bessere Messergebnisse
im Vergleich zu Immunoassays
– Bestimmung der „Muttersubstanz“
– Metaboliten: keine Kreuzreaktivität
- 48 -
MS/MS: Neugeborenen-Screening
• Phenylketonurie (PKU)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Ahornsirupkrankheit (Leu, Ile, Val)
Homocystinurie
Glutarsäure Acidämie
Methylmalonsäure Acidämie
Propionsäure Acidämie
Tyrosinämie
Nicht-ketotische Hyperglyzinämie
Argininbernsteinsäure-Krankheit
Hyperprolinämie
Hypermethioninämie
- 49 -
Neugeborenen-Screening: PKU
Pro
Präparation und MS/MS-Analyse
Ala
Phe
• Blutspot auf Filterpapier (3 mm )
Mikrotiterplatte
• Zugabe von Methanol plus isotopenmarkierter interner Standard
• Butylierung aller Aminisäuren (AS)
Leu + Ile
Phe
Leu
Ala
Gly
Gly
140
Gln
Val
Ser Val
160
180
Tyr
Tyr
Glu
Asp Glu
Cit
Met
200
220
240
260
280
interner, isotopenmarkierter Standard
Phe
• Injektion und Ionisierung der Probe
keine Chromatographie !
Pro
• MS/MS-Analyse der AS-Produkte
(Neutralverlust-Analyse)
• Quantifizierung der AS durch
Standard
Kontrolle
PKU
Ala
Phe
Leu + Ile
Gly
Gly
Gln Leu
Val
Cit
Ala
Met
Val
Ser
140
160
180
200
220
Tyr Glu
Asp Glu
Tyr
240
260
280
m/z
- 50 -
„Proteomics & Genomics“
Protein
Zelle
DNA
Genome
Proteome
Spezies
Definition & Bestimmung
Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,1.0)=>NF0.7[BP = 4423.9, 2117]
mass
fingerprint
9476.2
4424.2
100
4861.0
90
80
8823.5
70
0
3000
DNA
fingerprint
9000
10975.2
10493.9
10110.8
9611.5
12271.4
8054.3
8903.3
9075.2
8383.8
7000
8610.6
7424.9
6786.7
6984.6
7209.8
6629.0
6271.2
5897.8
5000
6137.3
4026.9
10
4535.6
30
4765.4 4738.6
40
6533.3
50
3132.3
3311.8
3491.4
% Intensity
60
20
2117.3
11000
13000
Mass (m/z)
- 51 -
Historisches: MALDI-TOF-MS,
Münster & Nobelpreis
• Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry
• entwickelt in den 1980‘s von Karas & Hillenkamp und Tanaka et al.
• Nobelpreis für Chemie an Koichi Tanaka im Jahr 2002 (Fa. Shimadzu, Japan)
- 52 -
MALDI-TOF
MS:
Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry
Detektion
Trennung
ion detector
+
field-free
drift range
+
+
+
grid electrode
Beschleunigung
Ionisierung
+
acceleration
zone
+
Desorption
matrix/analyte
crystals
template
- 53 -
MALDI-TOF-MS Analyse
automated spectrum acquisition ~60 sec
ionisation of intact proteins and
molecular weight measurement
(Abb. : Fa. Shimadzu)
3775
<<C:\Dokumente und Einstellungen\m.erhard\Eigene Dateien\AnagnosTec-dc\Zwischenablage\Dokument Banner.txt>> Spec [BP = 3
5000
7000
10939
11000
11906
11572
10608
10347
9000
10226
9330
10
0
3000
9994
7980
20
8450
30
7863
40
6837
7092
7367
50
5931
5015
60
3581
% Intensity
70
9654
80
8744
8074
90
9453
1648.1
7075
100
13000
Mass (m/z)
- 54 -
Mikobiologie: Identifizierung von Keimen
• Spektrenbibliotheken
• Identifizierung des
Stammes und der
Spezies
• z.B. auch „EHEC“
(enterohämorrhagische
Escherichia coli)
- 55 -
ENDE
Herzlichen Dank fürs Zuhören!
- 56 -