Regulation von Zellteilung und -wachstum Regulation of cell growth

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Jahrbuch 2003/2004 | Barr, Francis | Regulation von Zellteilung und -w achstum
Regulation von Zellteilung und -wachstum
Regulation of cell growth and division
Barr, Francis
Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried
Korrespondierender Autor
E-Mail: barr@biochem.mpg.de
Zusammenfassung
Wachstum und Teilung tierischer Zellen erfordert die ständige Zufuhr neuer Proteine und Lipide von ihrem
Herstellungsort im Endoplasmatischen Retikulum an die Zelloberfläche. Dem Zellw achstum und der DNAVerdopplung in der S-Phase folgt zunächst die geregelte Aufteilung des genetischen Materials in zw ei
identische Chromosomensätze in der M-Phase und dann die eigentliche Zellteilung (Zytokinese), w elche die
Zelle so entzw eischneidet, dass jeder entstehende Teil einen Satz des genetischen Materials erhält (Abb. 1).
Die Untersuchung dieser Prozesse und ihrer Regulation auf molekularer Ebene ist daher w ichtig, um zu
verstehen, w ie sich normale Zellen teilen, und w ie - falls die Zellteilungnicht stattfindet - die aneuploiden
Zellen, die zur Bildung von Tumoren beitragen, entstehen. Meine Arbeitsgruppe beschäftigt sich mit der
Fragestellung, w ie menschliche Zellen die komplexen dreidimensionalen Strukturen, die sie für Zellw achstum
und -teilung benötigen, bilden und regulieren. Um diese Frage zu beantw orten, haben w ir uns auf zw ei
w ichtige Bereiche konzentriert: (i) Proteintransport und die Funktion des Hauptorganells des sekretorischen
Weges,des
Golgi-Apparates;
und
(ii)
die
Funktion
der
zentralen
Spindelregion
für
die
Proteintransportereignisse, die letztendlich zur Zytokinese führen.
Summary
Animal cell grow th and division requires the constant delivery of new proteins and lipids from their site of
synthesis in the endoplasmic reticulum to the cell surface. Cell grow th and DNA replication in S-phase is
follow ed in M-phase by the ordered segregation of the genetic material into tw o equivalent sets of
chromosomes, then by a cleavage event termed cytokinesis w hich divides the cell into tw o such that each part
contains one complete set of genetic material (Figure 1). Investigation of these processes and their regulation
at a molecular level is therefore important for understanding both normal cell grow th and division and how ,
w hen cell division fails, the aneuploid cells that contribute to human tumour formation arise. My group is
interested in understanding how human cells establish and regulate the complex three-dimensional structures
necessary for cell grow th and division. To do this w e have focussed our w ork on tw o areas central to these
processes: (i) protein traffic and the function of the key organelle of the secretory pathw ay, the Golgi
apparatus; and (ii) the function of the central spindle in protein trafficking events that lead to cytokinesis.
Wachstum und Teilung tierischer Zellen erfordert die ständige Zufuhr neuer Proteine und Lipide von ihrem
Herstellungsort im Endoplasmatischen Retikulum an die Zelloberfläche. Dem Zellw achstum und der DNA© 2004 Max-Planck-Gesellschaft
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Herstellungsort im Endoplasmatischen Retikulum an die Zelloberfläche. Dem Zellw achstum und der DNAVerdopplung in der S-Phase folgt zunächst die geregelte Aufteilung des genetischen Materials in zw ei
identische Chromosomensätze in der M-Phase und dann die eigentliche Zellteilung (Zytokinese), w elche die
Zelle so entzw eischneidet, dass jeder entstehende Teil einen Satz des genetischen Materials erhält (Abb. 1).
Die Untersuchung dieser Prozesse und ihrer Regulation auf molekularer Ebene ist daher w ichtig, um zu
verstehen, w ie sich normale Zellen teilen, und w ie - falls die Zellteilung nicht stattfindet - die aneuploiden
Zellen, die zur Bildung von Tumoren beitragen, entstehen.
Ze llwa chstum und -te ilung e rforde rt die stä ndige Zufuhr ne ue r
P rote ine und Lipide vom O rt ihre r Synthe se im
Endopla sm a tische n R e tik ulum übe r de n Golgi-Appa ra t (rot) a n
die Ze llobe rflä che . In de r Inte rpha se wa chse n Ze lle n und
ve rdoppe ln ihre DNA (bla u) und te ile n da nn in de r M-P ha se
m ithilfe de r a us Mik rotubuli a ufge ba ute n m itotische n Spinde l
(grün) die se s ge ne tische Ma te ria l in zwe i gle iche
C hrom osom e nsä tze a uf. Da ra ufhin e rfolgt e in
Te ilungse re ignis, da s a ls Zytok ine se be ze ichne t wird und die
Ze lle so e ntzwe i te ilt, da ss je de r Te il e ine n Sa tz de s
ge ne tische n Ma te ria ls e rhä lt. W ä hre nd de r Mitose wird de r
Golgi-Appa ra t in vie le k le ine Ve sik e l a ufge broche n, die so
zwische n de n be ide n Tochte rze lle n a ufge te ilt we rde n, da ss
je de e ine n funk tionstüchtige n Golgi-Appa ra t e rbt. Die
Ha uptze llzyk luse re ignisse und die m itotische n Kina se n, die für
die se Ere ignisse wichtig sind, sind in rot, be zie hungswe ise
bla u, a bge bilde t.
© Ma x -P la nck -Institut für Bioche m ie / Ba rr
Meine
Arbeitsgruppe
beschäftigt sich
mit der Fragestellung, w ie
menschliche
Zellen
die
komplexen
dreidimensionalen Strukturen, die sie für Zellw achstum und -teilung benötigen, bilden und regulieren. Um
diese Frage zu beantw orten, haben w ir uns auf zw ei w ichtige Bereiche konzentriert: (i) Proteintransport und
die Funktion des Hauptorganells des sekretorischen Weges, des Golgi-Apparates und (ii) die Funktion der
zentralen Spindelregion für die Proteintransportereignisse, die letztendlich zur Zytokinese führen.
i.i Proteintransport und die Funktion des Golgi-Apparates
In den meisten Tier- und Pflanzenzellen findet man den Golgi-Apparat als einen Stapel von zisternenförmigen
Membranen. Diese Membranstapel können dann entw eder in bandähnlichen Strukturen angeordnet sein oder
w ie in Pflanzenzellen als unabhängige Stapel fungieren. Pilze, w ie zum Beispiel Hefe, haben oft Golgi-Stapel,
die einen w eniger komplexen Aufbau aufzeigen, stattdessen sind die Golgi-Zisternen dort hochmobile
Strukturen, die man sow ohl in Stapeln als auch einzeln anfinden kann.
Obw ohl Golgi-Stapel solch einen komplizierten Aufbau haben, handelt es sich um extrem dynamische
Strukturen, durch w elche große Mengen an sekretorischem Material und Membran auf ihrem Weg zu ihren
verschiedenen Zielen innerhalb der Zelle geschleust w erden. Unsere Arbeit konzentriert sich auf die Funktion
von Rab GTP-bindenden Proteinen, einer großen Familie an coiled-coil Proteinen, den Golgins und ihren
Membranadaptoren, den GRASPs, in verschiedenen Aspekten des Golgi-Aufbaus und der Golgi-Dynamik in
tierischen Zellen. An der Oberfläche von Golgi-Zisternen bilden diese Proteine zusammen eine hochdynamische
Matrix, die sow ohl die Form als auch die Funktion der Zisternen reguliert. Ursprünglich hatten w ir die GRASPs,
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GRASP65 und GRASP55 als Faktoren identifiziert, die erforderlich sind, um die Golgi-Membranen nach der
Mitose w ieder in einem geordneten Zisternenstapel anzusammeln. W ir konnten w eiterhin zeigen, dass die
GRASPs notw endig sind, um eine Untergruppe von Golgins an den Golgi-Apparat zu lokalisieren. GRASP65 und
sein Golgin-Interaktionspartner GM130 befinden sich am frühen oder cis-Teil des Golgi-Apparates, w ährend
GRASP55 und sein Partner Golgin-45 an den medialen Golgi-Zisternen lokalisiert sind. Kürzlich konnten w ir
zeigen, dass sow ohl GM130 als auch Golgin-45 eine Untergruppe von Golgi-assoziierten Rab-Proteinen binden.
Dies scheint eine generelle Eigenschaft der Golgins zu sein, da w ir festgestellt haben, dass fast alle
bekannten Golgins ebenfalls mit Golgi-assoziierten Rab-Proteinen interagieren. W ir glauben, dass die GRASPGolgin-Komplexe als Markenzeichen fungieren und den unterschiedlichen Zisternen innerhalb des Golgi-Stapels
ihre Identität geben, die sow ohl für die räumliche Organisation als auch für die Vesikelerkennungsschritte
w ährend des Membranstransportes notw endig ist.
Doch nicht alle Golgins regulieren Interaktionen zw ischen Golgi-Membranen und Vesikeln; manche Golgins
können auch Wechselw irkungen zw ischen Membranen und dem Zytoskelett beeinflussen. Bicaudal-D1 und -D2
sind zw ei Doppelw endel ("coiled-coil")-Proteine der Golgin-Familie, die auf Transport-Vesikeln sitzen. Rab6
reguliert die Bindung der Bicaudal-D-Proteine an Membranen, und dies führt dann zur Rekrutierung des
Dynein-Dynactin-Komplexes, der w ichtig ist für Mikrotubuli-abhängige Vesikelbew egung.
Unsere momentane Arbeit zielt darauf hin zu verstehen, w ie Rab-Proteine das komplizierte Netzw erk von
Interaktionen zw ischen den unterschiedlichen Golgins regulieren, und w elche Rolle dies in der Kontrolle des
Membranentransportes spielt.
i.ii. Neue Funktionen für Golgi-assoziierte Signaltransduktionswege
Seit kurzem gibt es Hinw eise darauf, dass der Golgi-Apparat neben seiner Rolle in der Proteinsekretion auch
bei
verschiedenen
zellulären
Signalisierungsvorgängen
von
Bedeutung
ist.
So
w urde
zum Beispiel
vorgeschlagen, dass der Golgi-Apparat als eine Art Signalisierungplattform agieren könnte, über w elche
externe Wachstumsfaktorsignale sow ohl w ahrgenommen als auch integriert w erden könnten und die w eiter
folgende Ereignisse somit maßgeblich beeinflussen könnte. W ir haben uns darauf konzentriert zu untersuchen,
w elche zellulären Prozesse sow ohl die Koordination von Signalisierungsereignissen an der Zelloberfläche als
auch die unterschiedlichen Funktionen des Golgi-Apparates benötigen. Daraufhin haben w ir vor kurzem zw ei
Mitglieder der MST-Familie der STE20-Kinasen, YSK1 und MST4, als Golgi-assoziierte Kinasen identifiziert ( Abb.
2A). Diese beiden Kinasen interagieren mit dem Golgi-matrix-Protein GM130 und w erden von diesem sow ohl
an den Golgi-Apparat gebunden als auch in ihrer enzymatischen Tätigkeit aktiviert, w o hingegen das dritte und
sehr nahe verw andte Familienmitglied MST3 nicht am Golgi-Apparat zu finden ist und auch GM130 nicht bindet.
Eine nähere Charakterisierung der Funktion von YSK1 zeigte, dass eine dominant-negative Form von dieser
Kinase in der Lage ist, sow ohl die Zellmigration als auch die Einw anderung in Kollagen zu blockieren.
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Signa ltra nsduk tion a m Golgi-Appa ra t. (A) Me nschliche Ze lle n
wurde n m it Antik örpe rn a nge fä rbt, um die Lok a lisie rung de r
Ste 20-Kina se YSK1 (rot), de s Golgi-Kom ple x -P rote ins GM130
(grün) und de r DNA (bla u) zu ze ige n. (B) Mode ll, um die
Tä tigk e it von YSK1 a m Golgi-Appa ra t in Antwort a uf e in
e x tra ze llulä re s Signa l da rzuste lle n. YSK1 wird durch Bindung
a n GM130 a k tivie rt a nd k a nn da nn se in Substra t 14-3-3ζ
phosphorylie re n. Die s ist wichtig für die R e gula tion de r
Ere ignisse , die für die Ze llpola risie rung und -m igra tion
be nötigt we rde n.
Gerichtete Zellmotilität ist ein hochkomplizierter Prozess, der sich aus vielen unterschiedlichen Ereignissen w ie
Polarisierung
des
Zytoskelettes,
Signaltransduktion
und
Regulierung
der
Zelladhäsionskomplexe
zusammensetzt. Veränderungen in der Zellpolarität w erden insbesondere von der Neuorientierung des
Zytoskelettes und der Sekretion von Proteinen und Lipiden an bestimmte Unterregionen der Plasmamembran
begleitet, und Golgi-lokalisierte Kinasen w ie YSK1 und MST4 befinden sich in einer idealen Position, um diese
Prozesse durch Modulierung der Golgi-Funktion zu beeinflussen. Diese Idee w ird durch unsere Daten
unterstützt, die 14-3-3ζ als Golgi-lokalisiertes Substrat für YSK1 identifiziert haben, und uns dadurch einen
Hinw eis geben, w ie YSK1 sow ohl Golgi-Funktion als auch Zellmigration regulieren könnte (Abb. 2B). 14-3-3Proteine liegen als Dimere vor und binden typischerw eise an phosphorylierte Akzeptorstellen an ihren
Zielproteinen. Dadurch regulieren sie eine Vielzahl von zellulären Prozessen. Im Zusammenhang mit unserer
Arbeit sind besonders drei Funktionen dieser Proteine von Bedeutung. Erstens ist beschrieben w orden, dass
14-3-3ζ an phosphoryliertes Raf in der Ras-Signaltransduktionskaskade binden kann und dessen Aktivität
stimuliert. Da infolge von Wachstumsfaktor-Rezeptoraktivierung ein Teil der aktivierten Ras-Proteine am GolgiApparat erzeugt w ird, ist es möglich, dass YSK1 diesen Teil der Signaltransduktionskaskade über 14-3-3ζ
beeinflusst. Zw eitens sind 14-3-3-Proteine sow ohl in Verbindung mit den zytoplasmatischen Domänen
spezifischer Integrinkomplexe gefunden w orden, als auch mit Par3/Baz, eins von mehreren Proteinen mit einer
w ichtigen
Rolle
in
der
Kontrolle
der
Zellpolarität
und
Zellassymmetrie
w ährend
der
Entw icklung.
Überexpression von 14-3-3-Proteinen blockiert die Zellmigration, w ahrscheinlich über die Interaktion mit
Integrinen, w elche für die Zelladhäsion w ichtig sind. Eine offensichtliche Möglichkeit für YSK1, die Zellmigration
zu beeinflussen, bestände demnach darin, die 14-3-3-abhängige Modulation der Zelladhäsion zu regulieren.
Schließlich ist gezeigt w orden, dass 14-3-3-Proteine in der Qualitätskontrolle im ER, die die Bildung und den
Transport multimerer Membranproteine vom ER zum Golgi-Apparat reguliert, eine Rolle spielen. Diese Funktion
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könnte eine w eitere Möglichkeit für YSK1 darstellen, auf die Funktion des Golgi-Apparates maßgeblich Einfluss
zu nehmen. Welcher dieser Mechanismen genau für die Funktion von YSK1 von Bedeutung ist, w ird eine
w eitere Charakterisierung von 14-3-3ζ-Interaktionspartnern und YSK1-Regulatoren erfordern.
ii.i Die zentrale Spindelregion und die Kontrolle der Zytokinese
Wenn in der Anaphase die Chromosomen auf die beiden Spindelpole verteilt w erden, ordnet sich eine
Ansammlung ineinander greifender Mikrotubuli, die so genannte "Zentralspindel", entlang der langen
Spindelachse an. Diese Struktur spielt eine w ichtige Rolle dabei zu bestimmen, w o genau die Zelle sich teilen
w ird, und dementsprechend finden sich mehrere Proteine mit w ichtigen Funktionen in der Zellteilung genau
hier. Unter diesen Proteinen befinden sich auch die "Polo-like kinase", Plk1, und die so genannten
"Chromosomalen Passenger Proteine". "Chromosomal Passenger Proteine" sind eine Gruppe von Proteinen,
die für die Koordination der Chromosomenaufteilung mit der Zytokinese von Bedeutung sind. Sie befindet sich
w ährend der Metaphase an den Kinetochoren und w ird dann in der Ana- und Telophase an die Zentralspindel
w andern. Störungen in der Funktion dieser Proteine führen zu Fehlern in der Anordnung der MetaphaseChromosomen, der Chromosomenaufteilung und der Zytokinese.
Polo-Kinasen w urden zuerst in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster als Mutanten mit zahlreichen Defekten
sow ohl in der Bildung der mitotischen Spindel als auch der Zytokinese beschrieben. Seitdem sind diese
Kinasen auch in den meisten anderen Eukaryonten gefunden w orden, w o sie ebenfalls eine Rolle in der
Zelteilung spielen. W ir haben uns bemüht zu verstehen, w ieso die Lokalisierung menschlicher Plk1 w ährend
der Anaphase auf die Zentralspindel beschränkt bleibt und w ie diese Kinase dort zur Regulierung der
Zytokinese beiträgt. Um dies zu bew erkstelligen, haben w ir die Funktion des "mitotic kinesin-like protein",
Mklp2, das ebenfalls in der Anaphase an die Zentralspindel bindet und eine unentbehrliche Rolle in der
Anaphase spielt, analysiert. Diese Arbeit zeigt, dass Mklp2 ein Substrat und Bindungspartner für Plk1 ist und
nötig ist, um Plk1 in der Anaphase an die Zentraspindel zu binden.
Die räumliche Kontrolle von mitotischen Kinasen gew innt zunehmend an Bedeutung für die Regulierung vieler
Ereignisse w ährend der Zellteilung. Mithilfe unserer Daten lässt sich ein Modell für die räumliche Begrenzung
des Plk1-Signals auf die Zentralspindel w ährend der Zytokinese aufstellen. Unsere derzeitigen Projekte sind
darauf hin gerichtet herauszufinden, genau w elche Plk1-Substrate für die Zytokinese benötigt w erden.
ii.ii Regulation der "Passenger" Proteine durch mitotische Kinesine
Die Kinase Aurora B, INCENP und Survivin sind w ichtige "Passenger" Proteine. INCENP fungiert als ein
Strukturprotein, das Aurora B bindet und aktiviert, w ährend Survivin anscheinend die Kinaseaktivität von
Aurora B reguliert. In Saccharomyces cerevisiae w ird die Loslösung des Aurora B-INCENP-Komplexes von den
Kinetochoren beim Übergang von der Metaphase zur Anaphase durch die CDC14-Phosphatase kontrolliert, die
INCENP dephosphoryliert und somit seine Bindung and die Spindelmikrotubuli in der Anaphase ermöglicht.
Dieser Mechanismus ist höchstw ahrscheinlich konserviert, da Phosphatasen der CDC14-Familie sich in allen
Eukaryontischen Organismen finden lassen und diese außerdem schon mit der Regulation der Zytokinese in
Caenorhabditis elegans Embryonen und sich teilenden menschlichen Zellkulturzellen in Zusammenhang gebracht
w urden. Allerdings ist dies nicht der einzige Mechanismus, der die Lokalisierung des Aurora B-INCENPKomplexes in höheren Eukaryonten kontrolliert. Depletion des ZEN-4-Proteins, das Homolog des humanen
mitotischen Kinesine Mklp1/CHO1, führt zum Abfallen der Aurora B-Kinase von der Zentralspindel in C. elegans
und in vitro können diese beiden Proteine auch miteinander interagieren. Die Situation ist w ahrscheinlich noch
komplizierter in Vertebraten, da diese zw ei mitotische Kinesine besitzen, Mklp1 und Mklp2.
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Vor kurzem haben w ir in Kollaboration mit der Gruppe von Professor Nigg die unterschiedlichen Rollen von
Mklp1 und Mkp2 in der Lokalisierung von Aurora B in der Anaphase untersucht. Zusammen mit unserer
vorherigen Studie betreffend Mklp2, hat diese neue Arbeit sow ohl einen konservierten Mechanismus als auch
einen grundlegenden Unterschied zw ischen dem menschlichen Zellteilungsapparat und dem von Invertebraten
w ie D. melanogaster und C. elegans offen gelegt. In mehreren Studien an C. elegans ist das Mklp1-Homolog
ZEN-4 als ein w ichtiger und für die Zytokinese unentbehrlicher Bestandteil der Zentralspindel identifiziert
w orden. Der Hauptbindungspartner von ZEN-4, CYK-4, kontrolliert die Aktivität von Rho-GTPasen in der
Zytokinese. Dieser Komplex ist in humanen Zellen konserviert und scheint eine ähnliche Funktion zu haben. In
D. melanogaster w ird das Mklp1-Homolog Pav benötigt, um die Polo-Kinase zur Zentralspindel zu bringen,
Defekte in einer der beiden Komponenten führen zum Versagen der Zytokinese. In menschlichen Zellen jedoch
gibt es im Gegensatz zu Invertebraten zw ei mitotische Kinesine mit klar abgegrenzten Rollen. MKlp1 w ird
benötigt, um das Rho-GAP-Protein hsCyk-4 an die Zentralspindel zu bringen, w o es die Zytokinese reguliert,
w ährend Mklp2 für die Lokalisierung der Polo-Kinase Plk1 notw endig ist. Unsere neuesten Experimente zeigen
außerdem, dass Mklp2 auch gebraucht w ird, um den Aurora B-INCENP-Komplex von den Zentromeren an die
Zentralspindel in der Anaphase zu transportieren (Abb. 3A). Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit früheren
Studien, die einerseits zeigten, dass die Loslösung des Aurora B-INCENP-Komplexes von den Zentromeren
w ährend des Übergangs von der Meta- zur Anaphase ein Mikrotubuli-abhängiger Prozess ist und andererseits
vorschlugen, dass die Chromosomen die Mikrotubuli mit Faktoren versorgen, die die Zytokinese fördern.
Offensichtliche Kandidaten für diese Faktoren sind chromosomale Passenger Proteine w ie Aurora B-INCENP
und Plk1. W ir konnten zeigen, dass w enn kein Mklp2 vorhanden ist, die Zellteilungsfurche nicht ausgebildet
w ird und die Zytokinese nicht stattfindet und sow ohl der Aurora B-INCENP-Komplex als auch Plk1 beide nicht
korrekt w ährend der Ana- und Telophase lokalisiert w erden können. Aus diesem Grunde haben w ir ein Modell
entw ickelt, das besagt, dass Mklp2 an der Mikrotubuli-abhängigen Lokalisierung von Plk1, Aurora B und
Cdc14A an
die
Zentralspindel w ährend
der Anaphase
beteiligt
ist, und
dass
die
Integration
der
Signalisierungsprozesse durch diese Proteine für eine geregelte Zytokinese notw endig ist (Abb. 3B).
Unsere derzeitige Arbeitshypothese besteht darin, dass Mklp2 sow ohl notw endig ist für die frühen Ereignisse,
die die Position der Zellteilungsebene festlegen, als auch für die Koordination der Zytokinese mit der
Chromosomenaufteilung. Unsere zukünftigen Projekte w erden sich damit beschäftigen herauszufinden, w ie
genau Aurora B-INCENP und Plk1 diese Ereignisse kontrollieren.
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Die Funk tion de r Ze ntra lspinde l in de r Zytok ine se . (A) In
m e nschliche n Ze lle n ha t da s C hrom osom a le -P a sse nge rP rote in Aurora B (rot) in de r Ana pha se zwische n de n sich
te ile nde n C hrom osom e n (bla u) e ine ä hnliche Lok a lisie rung a n
de r Ze ntra lspinde l wie da s m itotische Kine sin Mk lp2 (grün). In
Ze lle n, in de ne n Mk lp2 de ple tie rt wurde , we rde n die
P a sse nge r-P rote ine wie Aurora B nicht von de n C hrom osom e n
a n die Ze ntra lspinde l tra nsfe rie rt. (B) Sche m a tische Abbildung
de r P a sse nge r-P rote ine wä hre nd de s Ze llzyk luse s und ihre
Be zie hung zu Mk lp2 und a nde re n Ha uptre gula tore n de r
Zytok ine se . Mik rotubuli und die m itotische Spinde l sind in
grün a bge bilde t, die Ze ntrosom e n in ge lb und die DNA in
he llba u.
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