Validierung von stabilitätsindizierenden HPLC

Validierung von stabilitätsindizierenden HPLC

SAQ
HPLC-Methoden
Optimierung, Validierung, Strukturaufklärung
8. Juni 2005, Olten
Validierung von stabilitätsindizierenden
HPLC-Methoden
Joachim Ermer
sanofi-aventis
Industrial Quality & Compliance
Joachim.Ermer@sanofi-aventis.com
Übersicht
Validierung als „Good Stability Practice“
Präzision und (Stabilitäts-) Eignung
Spezifität
Proben
Peakreinheit
Richtigkeit
Wiederfindung von Nebenprodukten
Integrationsart, Responsefaktoren
Bestimmungsgrenze
Anforderungen
BG aus Linearität
2
1
ICH Guidelines Q2A und Q2B
Analytical procedure
Validation
Minimum
Identi-
Impurities
Assay
Characteristic
number
fication
Quant.
Limit
Specificity
not applicable
+
+
+
+
Linearity
5
-
+
-
+
Range
not applicable
-
+
-
+
Accuracy
9 (e.g. 3x3)
-
+
-
+
Repeatability
6 or 9 (e.g. 3x3)
-
+
-
+
Intermediate Precision/
Reproducibility
2 series
-
+
-
+
Detection Limit (DL)
approach
dependent
-
-
+
-
Quantitation Limit (QL)
approach
dependent
-
+
-
-
Precision
3
Leistungsfähigkeit des analytischen Verfahrens
Qualität der
Analysenergebnisse
Nicht nur regulatorische
und GMP-Anforderung
Good Science
Good Compliance
Good Business
Stabilität
Robustheit OOS
&
Zuverlässigkeit
Anpassungen
(SST) Wdh.
Transfer
4
2
Präzision und Eignung
Assay: Erkennung einer Gehaltsabnahme
Beispiel: 1% wahre Abnahme in 36 Monaten
101%
100%
Content (%)
101%
σ = 0.5%
σ = 2.0%
100%
99%
99%
98%
98%
97%
97%
96%
96%
95%
95%
94%
94%
0
10
20
30
Storage interval (months)
40
0
10
20
Storage interval (months)
30
40
5
Präzision und Eignung
Assay: Extrapolation der Verwendungsfrist
Beispiel: 3% wahre Abnahme in 36 Monaten
1.02
1.01
1
1
0.99
0.99
0.98
0.98
0.97
0.97
0.96
0.96
0.95
σ = 1.0%
1.01
Content
Content
1.02
σ = 0.5%
0.95
0
Regression line
10
20
95% Confidence interval
30
Data
Storage interval
0
Regression line
10
20
95% Confidence interval
30
Data
40
Storage interval
6
3
Präzision aus Stabilitätsstudien
Langzeitanwendung des analytischen Verfahrens
Routinerelevante Variation aller Faktoren
Große Datenzahl – zuverlässige Abschätzung der Präzision
Berechnung aller Präzisionsebenen
Indiv. Wiederholpräzision (n≥4 pro Lagerzeit, evtl. Pooling)
Gesamtwiederholpräzision (n≥2 pro Lagerzeit)
Intermediate Precision/Vergleichspräzision
Kein signifikanter Anstieg: ANOVA
Signifikanter Anstieg: Reststandardabweichung der Regression
Projekt der FG Analytik der DPhG
9 Firmen, 44 Produkte, 156 Stabilitätsstudien
J. Ermer et. al.: J.Pharm.Biomed.Anal., Online Feb. 2005
7
Spezifität
Kritische Grundlage (“hallmark“) jedes Prüfverfahrens
Was ist ausreichend/angemessen?
Bezugnahme auf die gesamte Spezifikation (alle Prüfungen)
z.B. Assay Titration + chromat. Nebenproduktbestimmung
Indirekte Verfahren: Beleg der Richtigkeit
Bestätigung der Massenbilanz
Gleiches Ergebnis durch unabhängiges Prüfverfahren
z.B. Bei LC: Titration, N-Bestimmung, NMR
Statistische Signifikanztests nicht empfehlenswert
Statistische Signifikanz Ù praktische Relevanz
Unterschiedliche Spezifität zu erwarten = systematischer Fehler
8
4
Spezifität: Direkte Verfahren
Fehlender bzw. akzeptabler Einfluss von anderen
Substanzen
Nebenprodukte, Intermediate, Degradationsprodukte,
Matrices / Placebo
Untersuchung:
Übereinstimmende Ergebnisse mit und ohne
Chromatographische Auftrennung
Peakreinheitsuntersuchungen
Peakformanalyse
Rechromatographie
DAD
MS
10
To Stress or not to Stress?
Ziel der Validierung:
Eignung für die beabsichtigte Anwendung
Für Stabilität: relevante Degradationsprodukte
Muster aus akzelerierten Lagerbedingungen bevorzugt
Stressmuster: (einige) Degradationsprodukte sind evtl. nicht
von Bedeutung für angestrebte Lagerbedingungen
Wichtig für Degradationswege, Arzneimittelentwicklung
Für Validierung:
Anforderungen und relevante Bedingungen genau definieren
z.B. Nachweis der allg. Fähigkeit zur Auftrennung zusätzlicher Peaks
Auswahl von relevanten Stressbedingungen (Lagerung, Verpackung)
Beschränkung der Degradation (~ 10%)
11
5
Peakreinheit
Untersuchung auf Koelution
Nur Fehlen eines Beweises möglich (absence of evidence)
Kombination verschiedener Untersuchungen
Peakformanalyse
Rechromatographie
DAD
MS
Variation der chromatographischen Bedingungen
Gradient, pH, Säulen usw.
aus Methodenentwicklung, Robustheit
12
Vergleich der Peakformanalyse-Verfahren
Erkennen von Koelution, Peaktailing 1.33 (USP)
Peakverh.
100:10
100:1
100:0.5
Visuell
~0.7
~1.3
~1.5
Geringster Trennfaktor
Asymmetriekurve 1. Ableitung
~0.5
~0.4
~1.1
n.n. (Rauschen)
~1.3
n.n. (Rauschen)
Hoher Nebenproduktgehalt (~ 10%)
1. Ableitung geeignet
Geringer Nebenproduktgehalt (< 1%)
Asymmetriekurve nur geringer Vorteil gegenüber visuelle
Prüfung (nur wenn software-unterstützt)
13
6
Peakreinheit mittels Rechromatographie
200
10,0
mV
mAU
Sampling of a peak fraction
from 9.6 to 11.0 minutes
in acetonitrile/water/
0.1% trifluoroacetic acid
150
UV, 240 nm
8,0
Rechromatography with 0.2M sodium
6,0
phosphate
buffer pH 4.0 / acetonitrile
11.774
100
4,0
Impurity
1.6 %
2,0
50
7.572
8.911
0,0
-20
5.0
min
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
min
-2,0
10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0
8,0 14.5
9,0 15.0
10,0
11,0
12,0
13,0
14,0
15,0
16,0
17,0
18,0
19,0
20,0
21,0
22,0
23,0
24,0
14
Peakreinheit mittels Diodenarray Detektion
0.5 % Nebenprodukt
10 % Nebenprodukt
15
7
Peakreinheit mittels LC-MS
Relative Abundance
100
Relative Abundance
275.8
95
90
90
85
85
80
80
75
75
70
70
65
65
60
60
55
55
50
50
45
45
40
40
35
35
295.6
30
25
20
20
15
15
10
10
5
246.5
210
220
230
240
250
266.4
260
270
276.8
280
325.0
290
300
310
320
330
374.2
340
350
360
370
380
m/z
390
5
0
200
400
324.9
100
220
230
240
250
276.5
266.4
260
374.3
270
280
290
300
310
320
330
340
310
320
330
340
350
360
370
380
m/z
390
400
275.9
100
95
95
90
90
85
85
80
80
75
75
70
70
65
65
60
60
55
55
50
50
45
45
40
40
35
35
30
30
25
20
275.6
15
15
10
278.8
10
210
220
291.6
252.1259.6
213.9
230
240
250
260
270
280
295.6
25
297.0
20
0
200
246.3
210
Relative Abundance
Relative Abundance
5
295.6
30
25
0
275.8
100
95
290
316.9
300
310
320
5
m/z
330
340
350
360
370
380
390
0
400
246.4
210
220
230
240
250
266.1
260
374.3
270
280
290
300
350
360
370
380
m/z
390
400
UV chromatogram 240 nm
Mass chromatogram m/z 325
15.2
15.4
15.6
15.8
16.0
16.2
16.4
16.6
16.8
17.0
17.2
17.4
17.6
17.8
18.0
Time (min)
16
Peakreinheituntersuchungen - Grenzen
Variation der Chromatographiebedingungen
und/oder Rechromatographie
empfindlich
Abhängig von Substanzeigenschaften (Elutionsverhalten)
Peakformuntersuchung und DAD
Schwierig für geringe Konzentrationen der koeluierenden
Substanz
Unterschied der Retentionszeiten erforderlich
MS
Sehr empfindlich, hohe Selektivität
Abhängig von Substanzeigenschaften
(Ionisierung, -unterdrückung)
17
8
Wiederfindung bei Nebenprodukten
Nur für spezifizierte NP erforderlich
Bei gleichzeitiger Aufstockung mehrerer NP
Ggf. Berechnung der gespikten Gesamtmenge erforderlich
(wenn NP A auch in NP B enthalten ist)
Bei größerem Konzentrationsbereich
(~) gleiche Verteilung vorteilhaft (Wichtung, Hebeleffekt)
Kombination von Richtigkeit, Linearität,
BG (falls nicht zu groß, ~10-20xNG)
Wenn keine NP-freie Matrix vorhanden ist:
Berechnung der Wiederfindung bzgl. Gesamtmenge,
da Präzision abhängig von Gesamtkonzentration
18
Wiederfindung aus NP-haltiger Matrix
No.
Nebenproduktkonzentration
Vorh.
Zugeg.
Gesamt
Wiederfindung
Gefunden bezügl.
bezüglich
Gesamt
Zugeg.
Gesamt
Zugeg.
1
0,02
0,01
0,03
0,039
0,019
130,0 %
190,0 %
2
0,02
0,03
0,05
0,060
0,040
120,0 %
133,3 %
3
0,02
0,08
0,10
0,090
0,070
90,0 %
87,5 %
4
0,02
0,23
0,25
0,280
0,260
112,0 %
113,0 %
5
0,02
0,48
0,50
0,475
0,455
95,0 %
94,8 %
6
0,02
0,73
0,75
0,813
0,793
108,4 %
108,6 %
7
0,02
0,98
1,00
1,010
0,990
101,0 %
101,0 %
19
9
Lot oder Aufsetzer? Rechromatographie
15,0
mV
Fehler:
13,8
Bzgl. Hauptpeak: ~ 1.5 %
11,3
Bzgl. NP:
10,0
40 – 60 %
Rider: 2.1 %
8,8
7,5
Probe
6,3
5,0
3,8
2,5
1,3
Rechromatographie
des Hauptpeaks
Drop: 3.4 %
min
15,0
16,0
17,0
18,0
19,0
20,0
21,0
22,0
23,0
24,0
25,0
20
Lot oder Aufsetzer? Säulenschaltung
210 nm
99,06 %
0,49 %
Schaltung auf 2. Säule
10,0
0,17 %
0,27 %
12,5
7,5
0,51 %
5,0
0,18 %
mV
15,0
Rider
0,27 %
-1,0
2,5
0,03 %
0,13 %
0,25 %
0,21 % Drop
min
-2,0
20,0
25,0
30,0
35,0
40,0
45,0
48,0
21
10
UV-Responsefaktoren: Spezifizierte NP
Response für bekannte Konzentrationen von WS und NP
Verwendung von reinen NP-Standardlösungen
Berechnung:
Einzelkonzentration (spezifisches Responseverhältnis) oder
Aus Linearität (Verhältnis der Steigungen)
Bedingungen:
Ausreichende Anzahl an Bestimmungen (mind. 5 – 6)
Gleiche(r) Konzentration(sbereich) für Wirkstoff und NP
(zur Vermeidung von Wichtungs- und Variabilitätseffekt)
Ausreichend große Konzentration
(zur Minimierung der Variabilität)
22
Konzentrationsabhängigkeit der Präzision
16%
Relative Standard Deviation
14%
HORWITZ-Vorhersage
für Wiederholpräzision
12%
10%
8%
6%
4%
2%
0%
0.01%
0.10%
1.00%
Analyte (spiked)
10.00%
100.00%
Beispiel:
Aufstockung von
Glibenclamid auf
Tabletten-Placebo
0.025 – 120%
Jew. 5 - 7
Aufstockungen
U. Schepers, J. Ermer,
L. Preu, H. Wätzig:
Wide concentration
range investigation of
recovery, precision
and error structure in
HPLC
J. Chromatogr. B
810 (2004) 811-818
23
11
UV-Responsefaktoren: Unbekannte NP
0,02 %
0,14 %
0,26 %
0,47 %
0,41 %
2,63 %
Response-Check: Chromatogramme bei versch. λ
0,11 %
0,07 %
0,07 %
0,14 %
0,24 %
2,82 %
220 nm
240 nm
Retention time (min)
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
30.0
24
Bei (deutlich) unterschiedlichem Response
Identifizierung, Synthese von Referenzsubstanz ….
Analytische Untersuchung:
Massenspezifischer(er) Detektor
Brechungsindex (RI), Lichtstreuung (ELSD)
Identifizierung und universelle Kalibrierung
Stickstoffdetektor (CLND), oder anderer elementspezif. Detektor
LC-NMR
25
12
1.03 %
mV
0,54 %
35,0
2.86 %
Responsefaktorabschätzung durch RI
UV 240 nm
20 µg
0.12 %
0.08 %
2.45 %
20,0
0,81 %
1.16 %
0,17 %
10,0
0.73 %
RI
300 µg
0,0
RF≈ 9 - 10
min
-10,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
16,0
18,0
26
Responsefaktorbestimmung durch RI
0,87 %
0,05 %
0,04 %
0,04 %
0,02 %
240 nm
RFImp=
1,01 %
10,0
220 nm
0,05 %
0,24 %
0,14 %
20,0
0,11 %
0,07 %
0,07 %
2,82 %
30,0
0,14 %
0,26 %
40,0
50,0
0,05 %
0,05 %
0,47 %
0,41 %
2,63 %
50,0 mAU
40,0
(Area UV / Area RI)DS
= 14
(Area UV / Area RI)Imp
mV
13.44
mV*min
30,0
-5,0
15,0
17,5
20,0
22,5
25,0
27,5
30,0
32,5
min
35,0
2.01
mV*min
20,0
UV 240 nm
10,0
Rechromatographie der Peaks
RP-8 Säule 125x2mm, 50°C
0.2M Na-Phosphat, 0.5 ml/min
3.95 mV*min
0,0
-10,0
0,0
RI
0.1 mV*min
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
min
15,0
27
13
Bestimmungsgrenze: Anforderungen
Experimentelle BG = “Schnappschuß“
Hohe Variabilität, abhängig von
Actuellen Bedingungen
Berechnungsverfahren
Essentiell: BG muss für alle künftigen Anwendungen gelten
Wie kann das gewährleistet werden?
Robuste Bestimmung (“intermediate“ BG)
Definition aus Spezifikationsgrenzen (“allgemeine“ BG)
(Minimalanforderung)
Aktuelle Kontrolle im Systemeignungstest (Ph.Eur.)
28
“Allgemeine“ Bestimmungsgrenze
Approximation: ≤ 50% der Spezifikationsgrenze
z.B. 0.05% bei Limit von 0.1% (bei Präzision < ~20% RSD)
Entspricht ICH reporting threshold
Spezifischer Ansatz:
Spezif. Präzision (bei BG) und Anzahl der Bestimmungen
In Anlehnung an Positionspapier der DPhG
http://www.pharmchem.tu-bs.de/dphg_pospapier_eng03.pdf
QLgeneral = AL −
(s ∗ tdegrees of
)
freedom,0.95one sided validation
nassay
Validierung: Bestätigung, dass aktuelle BG kleiner ist
mit beliebigem/praktikabelstem Verfahren
29
14
“Intermediate” Bestimmungsgrenze
Wiederholte BG Bestimmungen
Falls Quantifizierung < reporting threshold von Interesse ist
Einbeziehung aller praktisch relevanten Faktoren
Intermediate BG = obere Verteilungsgrenze der indiv. BGs
Maximale indiv. BG (evtl. + Sicherheitsbetrag)
Aus Mittelwert und Standardabweichung
QLinterm = QLaverage + 3.3 ∗ sQL
Kombinationsansatz
Experimentelle BG < definierte BG < 50% Spezifikationsgrenze
30
Abhängigkeit der BG vom Regressionsbereich
1.0%
SD intercept
0.9%
Residual SD
0.8%
95% Prediction interv.
Calculated QL
0.7%
0.6%
Auf Grund der
Varianzeninhomogenität:
Größere Variabilität der
höheren Konzentrationen
dominiert
0.5%
0.4%
0.3%
0.2%
0.1%
Wahre BG
0.0%
4000
2000
400
200
100
40
20
10
Concentration range (max/min=0.025%)
31
15
Zusammenfassung
Validierungsziel: Leistungsfähigkeit der Routineanwendung
Experimentelle Bedingungen sollten (so weit wie möglich)
denen der Routineanwendung entsprechen
Akzeptanzkriterien zur Bewertung der Eignung
Vorsichtiger Umgang mit statistischen Signifikanztests
Absolute (Ober)Grenzen bevorzugt
Mehr Details:
J. Ermer, J.H.McB. Miller (Eds.): Method Validation in
Pharmaceutical Analysis. A Guide to Best Practice. Wiley
VCH, Weinheim 2005, ISBN 3-527-31255-2
Gute Validierung liegt im Eigeninteresse!
Risikominimierung
32
16