Methods - Paleomicrobiology group

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Methods
AG Cypionka/Paleomicrobiology
08.02.2008
Methodenskript AG Cypionka
-1-
CONTENT
Preparation of growth media ..................................................................................................... 3
Mineral base medium for many anaerobic bacteria ..................................................................... 4
Mineralisches Grundmedium für marine aerobe Bakterien.......................................................... 5
Spurenelementlösungen ............................................................................................................. 5
Selenit-Wolframat-Lösung......................................................................................................... 6
Vitaminlösungen........................................................................................................................ 6
Herstellung von HPG-Agarplatten ............................................................................................. 7
Bestimmung von Ammonium-Stickstoff .................................................................................... 8
Bestimmung von Nitrit-Stickstoff .............................................................................................. 8
Bestimmung von Nitrat-Stickstoff ............................................................................................. 8
Colorimetrische Sulfidbestimmung........................................................................................... 10
Determination of dissolved sulfide ........................................................................................... 10
Turbidometrische Bestimmung von anorganischem Sulfat........................................................ 11
Sulfat-Schnelltest .................................................................................................................... 11
Photometrische Analyse von Thionaten ................................................................................... 12
Colorimetrischer Sulfitnachweis............................................................................................... 13
Colorimetrischer Schwefel-Nachweis....................................................................................... 13
Photometrische Bestimmung von Orthophosphat..................................................................... 14
Proteinbestimmung nach Lowry............................................................................................... 15
Proteinbestimmung nach Schmidt et.al. (1963) ........................................................................ 15
Bradford protein assay (1976) ................................................................................................. 16
Dry mass determination ........................................................................................................... 17
Bestimmung von Carotinoiden phototropher Bakterien............................................................ 17
Bestimmung der Bacteriochlorophylle a, c, d und e.................................................................. 18
Cell number determination of (MPN) dilution series................................................................. 19
Quantification of MPN dilution series with SybrGreenI............................................................ 20
CFU-Berechnung mit verschiedenen Verdünnungsstufen ......................................................... 20
Preparation of slides coated with agarose for microscopy ........................................................ 21
Determination of gram type – Gram differentiation .................................................................. 21
Isolierung von Anaerobiern aus Tiefagar-Verdünnungsreihen................................................... 22
Agarverdünnungsreihe............................................................................................................. 22
Geißelfärbung.......................................................................................................................... 23
Catalase test ............................................................................................................................ 23
Oxidase test............................................................................................................................. 24
Analyse des Substratspektrums aerober Bakterienisolate.......................................................... 24
Recording of growth curves .................................................................................................... 25
Bestimmung der β-Glucosidase-Aktivität................................................................................. 26
Bestimmung der β-Glucosaminidase-Aktivität ......................................................................... 27
Bestimmung der Leucin-Aminopeptidase-Aktivität .................................................................. 28
Bestimmung der β-Glucosaminidase-Aktivität in Mikrotiterplatten .......................................... 28
Bestimmung der Gesamtzellzahl .............................................................................................. 29
Gesamtzellzahl in einer Wasserprobe ....................................................................................... 30
Determination of the total cell count with SybrGreenI ............................................................. 30
ATP-Bestimmung.................................................................................................................... 32
Determination of methane concentrations via Gas Chromatography......................................... 33
Zählung wachsender Zellen mit Nalidixinsäure......................................................................... 35
Life-Dead-Staining .................................................................................................................. 36
Zählung aktiv respirierender Zellen.......................................................................................... 37
-2-
Isolierung von DNA ................................................................................................................ 38
„Freeze & Thaw“ – DNA extraction from growing cultures..................................................... 39
DNA/RNA Extraktion aus Sedimentproben............................................................................. 39
Schnelltest zur DNA-Quantifizierung....................................................................................... 42
DNA extraction from sediments with FastDNA®Spin® Kit ....................................................... 42
Protokoll zur DNA-Extraktion aus Flüssigproben.................................................................... 43
Quantifizierung von DNA mit Pico Green................................................................................ 44
DNA-Quantification via a Microtiter plate reader .................................................................... 44
PCR (Polymerase Chain Reaction)........................................................................................... 46
Agarose gelelectrophoresis...................................................................................................... 48
Purification of PCR products................................................................................................... 49
DNA-sequencing via Sanger (Chain-abruption method) ........................................................... 50
Electrophoresis using the LiCor DNA Sequencing System 4200 .............................................. 52
DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) .................................................................. 53
Fluorescence-in situ-Hybridization (FISH) .............................................................................. 57
CARD (CAtalyzed Reporter Deposition)-FISH ....................................................................... 60
Quantitative PCR .................................................................................................................... 63
Microcalorimetry..................................................................................................................... 70
Literature ................................................................................................................................ 73
-3-
Preparation of growth media
The growth media are prepared in special glass vessels after WIDDEL (1980, figure 1). The
chemicals are weighed in and dissolved in the below mentioned succession (see schemata). The
bottling tube is covered with tinfoil and the connecting piece for gass inflow with the cotton filter
is closed by a rubber bung. The lateral screw caps are also closed but for autoclaving one of them
is screwn off a little in order to prevent the vessel from bursting during heating. The medium is
autoclaved 30 minutes with 121° C. After autoclaving supplement solutions are added through
one of the lateral connecting pieces.
Figure 1: Glass vessel for preparing anaerobic medium (WIDDEL 1980).
Oxic media:
After autoklaving the lateral screw caps are leakproof closed and the rubber bung is removed out
of the connecting piece for gass inflow. Now air is only able to get in the vessel through the
cotton filter. To add the supplement solutions to the cooled down medium the vessel is connected
to a N2 gas inflow (5 kPa). The vessel with the completed medium remains connected to nitrogen
influx because the excess pressure is needed for bottling. The completed medium is bottled to
sterile containers.
Anoxic media:
After autoclaving the head space above the medium is flushed with N2/CO2 (80/20, v/v) in short.
The screw caps are leakproof closed and the medium is cooled down while stirring under N2/CO2
(80/20, v/v) (5 kPa). The supplement solutions are aseptically added to the cooled down medium.
The pH-value of the medium is adjusted (if necessary) to 7.2 – 7.4 with sterile 1 N Na2CO3 or
1 N HCl. The completed medium is bottled to sterile containers.
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Mineral base medium for many anaerobic bacteria
(Cypionka & Pfennig 1986)
Substance
MW
KH2PO4
136.09
53.49
NH4Cl
KCl
74.55
CaCl2 * 2 H2O
147.02
MgCl2 * 6 H2O
203.30
NaCl
58.44
resazurine (0.5 mg/ ml)
(F => fresh water, B => brackwater, M => marine)
F
B M
F
B
M
mM
g/l
1.5 1.5
5.0 5.0
4.0 4.0
1.0 1.0
2.5 10
--- 222
1.5
5.0
4.0
1.0
15
342
0.20 0.20 0.20
0.25 0.25 0.25
0.30 0.30 0.30
0.15 0.15 0.15
0.50 2.00 3.00
--13 20
ml 0.50 0.50 0.50
After autoclaving and cooling down under N2 add out off sterile stock solutions:
Trace element solution (SL10)
1.0 ml
Vitamin solution (V 7)
1.0 ml
Se + W-solution 1) (0.1 mM) 2 * 10-8 M
0.2 ml
30 ml
NaHCO32) (1 M => 30 mM)
Dithionite (crystalline) a little until decolouration < 17 mg
pH3) adjust with
sterile 1 M HCl or Na2CO3
1)
not required for all strains
Attention! Protective vessel; do not touch hot containers!
3)
6.8 - 7.0 for medium F, 7.0 - 7.3 for medium B and medium M
2)
Annotation: The only difference between medium F and the media B and M is the concentration
of NaCl and MgCl2. By addition of a salt concentrate (NaCl, 5 M, + MgCl2, 0.2 M, ≈ 30 % salt)
you are able to create medium B and M out off a medium with a lower salt content:
45 ml/ l F-medium for
68 ml/ l F-medium for
23 ml/ l B-medium for
F => B
F => M
B => M
Often used electron donators and electron acceptors (mM)
H2 (80 %) + CO2 (20 %) + acetate (2 mM), lactate (20), Na2SO4 (10)
Na2S2O3 (10), Na2S2O5 (5), NaNO3 (10)
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Mineralisches Grundmedium für marine aerobe Bakterien
→ vor dem Autoklavieren
dest. Wasser
1000 ml
HEPES
2,38 g
NaCl
24,32 g
KBr (0,84 M)
1 ml
MgCl2 * 6 H2O
10 g
H3BO3 (0,4 M)
1 ml
CaCl2 * 2 H2O
1,5 g
SrCl2 (0,15 M)
1 ml
KCl
0,66 g
NH4Cl (0,4 M)
1 ml
Na2SO4
4g
KH2PO4 (0,04 M)
1 ml
Spurenelementlsg. SL 10
1 ml
NaF (0,07 M)
1 ml
Selenit-Wolfram-Lsg.
0,2 ml
KBr, H3BO3, SrCl2, NH4Cl, KH2PO4, NaF werden aus sterilen Stammlösungenzugesetzt.
Vor dem Autoklavieren wurde das Medium mit 4 M NaOH auf pH 7,2-7,4 eingestellt.
→ nach dem Autoklavieren dem abgekühlten Medium zusetzen.
NaHCO3 –Lösung
0,2 g in 10 ml H2O
10-Vitaminlösung (5fach konz.)
2 ml
Spurenelementlösungen
(nach Tschech und Pfennig 1984)
Destilliertes Wasser
SL101)
SL11
SL12
ad 1000 ml
ad 1000 ml2)
ad 1000 ml2)
5.2 g
--1.5 g
190 mg
100 mg
70 mg
24 mg
36 mg
6 mg
2 mg
3.0 g
1.1 g
--190 mg
50 mg
42 mg
24 mg
18 mg
300 mg
2 mg
Salzsäure, 25 %
10 ml
EDTA-Di-Natriumsalz
FeSO4 * 7 H2O
FeCl2 * 4 H2O
1.5 g
CoCl2 * 6 H2O
190 mg
MnCl2 * 2 H2O
100 mg
ZnCl2
70 mg
NiCl2 * 6 H2O
24 mg
Na2MoO4 * 2 H2O
36 mg
H3BO3
6 mg
CuCl2 * 2 H2O
2 mg
1)
Zuerst das Eisenchlorid in der Salzsäure lösen
2)
Vor dem Auffüllen mit Wasser auf pH 6.0 einstellen
• Anwendung: 1 ml pro Liter Medium.
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SL9
Wie SL11, aber anstelle von EDTA-Di-Na:
Nitrilotriessigsäure (NTA): 12.8 g
Selenit-Wolframat-Lösung
(nach Widdel 1980)
NaOH
1000 ml
0.4 g
Na2SeO3 · 5 H2O
6 mg
Na2WO4 · 2 H2O
8 mg
Vitaminlösungen
7-Vitamine-Lsg.1)
180 ml
20 ml
Biotinlösung3)
Biotin
Nikotinsäure
20 mg
Thiamin-Dichlorid
10 mg
p-Aminobenzoesäure
10 mg
Ca-D(+)-Pantothenat
5 mg
Pyridoxamin-Dihydrochlorid
50 mg
Cyanocobalamin (Vit. B12)
10 mg
Folsäure
Riboflavin
Liponsäure (Thioctinsäure)
1)
nach Pfennig 1978
2)
5fach konzentriert, nach Balch et al. 1979
3)
10 mg Biotin in 100 ml Wasser, in der Wärme lösen
10-Vitamine-Lsg2)
1000 ml
10 mg
25 mg
25 mg
25 mg
25 mg
50 mg
5 mg
10 mg
25 mg
25 mg
Lösung in sterile Schraubdeckelflaschen sterilfiltrieren.
Kühl und dunkel aufbewahren!
Anwendung: 1 ml pro Liter Medium (7-Vitaminelsg), bzw. 2 ml pro Liter Medium (10Vitaminelsg.).
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Herstellung von HPG-Agarplatten
Herstellung des Mediums
Das HPG-Medium beruht auf dem oxischen marinen Grundmedium. Da es erst direkt vor dem
Giessen der Platten mit Agar versetzt wird, werden die Salze in nur 700 ml Wasser gelöst.
→ vor dem Autoklavieren
dest. Wasser
700 ml
HEPES
2,38 g
NaCl
24,32 g
KBr (0,84 M)
1 ml
MgCl2 * 6 H2O
10 g
H3BO3 (0,4 M)
1 ml
CaCl2 * 2 H2O
1,5 g
SrCl2 (0,15 M)
1 ml
KCl
0,66 g
NH4Cl (0,4 M)
1 ml
Na2SO4
4g
KH2PO4 (0,04 M)
1 ml
Spurenelementlsg. SL 10
1 ml
NaF (0,07 M)
1 ml
Selenit-Wolfram-Lsg.
0,2 ml
Hefeextrakt
0,03 g
Na-Lactat (1 M)
5 ml
Pepton
0,06 g
Vor dem Autoklavieren wurde das Medium mit 4 M NaOH auf pH 7,2-7,4 eingestellt.
Das Medium wird in Duran-Flaschen (blauer Schraubverschluss) abgefüllt und autoklaviert. Dem
fertigen und abgekühlten Medium werden (in der Sterilbank) zugegeben:
NaHCO3 –Lösung
0,2 g in 10 ml H2O
10-Vitaminlösung (5fach konz.)
2 ml
Glucose-Lösung (0,5 M)
1,2 ml
Na-Thiosulfat (1 M)
1 ml
Vorsichtig und aseptisch arbeiten!
Der pH-Wert des fertigen Mediums muß nicht mehr kontrolliert werden.
Giessen der Platten
Bevor das Medium mit dem flüssigen Agar (4 %, mindestens fünfmal gewaschen) versetzt werden
kann, muss es im Wasserbad auf etwa 50 °C aufgeheizt werden. Nach der Zugabe des Agar in das
warme Medium wird dieses gut durchmischt (es sollten möglichst keine Schlieren mehr zu sehen
sein), und man kann mit dem Giessen der Platten unter der Sterilbank beginnen.
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Bestimmung von Ammonium-Stickstoff
(nach Chaney und Marbach)
Lösungen:
A) 3 g Phenol + 3 mg Na-nitroprussid (Na-pentacyanonitrosylferrat (III) in 100 ml H2O dest. Gekühlt ca. 2 Wochen haltbar.
B) 2 g NaOH in 80 ml H2O dest., abkühlen lassen, 0.5 ml NaClO-Lösung mit 13% wirksamem
Chlor zusetzen und auf 100 ml auffüllen. (Vorsicht! Stark ätzend!).
Vorgehen:
10 ml Probe werden in ein Reagenzglas pipettiert, 1 ml Lösung A zugesetzt, gemischt, 1 ml Lösung B zugesetzt und erneut gemischt. Eine Stunde bei Zimmertemperatur abgedunkelt stehen
lassen. Bei zu starker Farbreaktion muß die Bestimmung mit verdünnter Probe durchgeführt werden. Anschließend Messung der Absorption bei 635 nm Wellenlänge gegen Ammonium-freien
Leerwert. Niederschlag vorher abzentrifugieren! Der Nachweis ist sehr empfindlich. Die Glasgeräte müssen sauber sein; evtl. vorher nochmals spülen. Eichkurve: mit (NH4)2SO4 im Bereich 0 100 µM aufnehmen (Achtung: 2 x Ammonium!).
Prinzip der Reaktion siehe Abb.1
Bestimmung von Nitrit-Stickstoff
(nach Göttinger Kursskript)
Lösungen:
A) 1.65 g Sulfanilsäure wird in 375 ml heißem Wasser gelöst und mit 125 ml Eisessig versetzt.
B) 0.5 g a-Naphthylamin wird in 100 ml Wasser suspendiert, 125 ml Eisessig zugesetzt, bis zur
Lösung gerührt und mit H2O ad 500 ml aufgefüllt. Vorsicht, stark carcinogen! Nicht mit den
Händen berühren und nichts verschütten. Pipettierhilfe verwenden und benutzte Pipetten und Gefäße sogleich gut spülen.
Vorgehen:
0.5 ml Probe in Reagenzglas, 0.5 ml Lsg. A zusetzen, mischen, 2.5 ml Lsg. B zusetzen. Messung
nach 10 min. bei 530 nm.
Eichkurve: 0 - 100 µM mit KNO2 (Vorsicht, carcinogen!)
Bestimmung von Nitrat-Stickstoff
(nach Goltermann)
Lösungen:
A) 1 N HCl
B) 1 N NaOH
C) Reduktionsmischung:
C1) 0.039 g CuSO4 * 5 H2O in 100 ml H2O.
C2) 0.12 g Hydrazinsulfat N2H4 * H2SO4 in 25 ml H2O.
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5 ml C1 werden mit 25 ml C2 gemischt und mit H2O ad 50 ml aufgefüllt. Diese Reduktionsmischung und die Lösung C2 sind nicht haltbar und müssen täglich frisch hergestellt werden.
Vorgehen:
10 ml zentrifugierte, partikel- und sulfidfreie Probe (wenn nötig, Sulfid mit CO2 austreiben) wird
mit 0.25 ml Lsg. B versetzt, 0.25 ml Lsg. C zugefügt, gemischt und 30 min bei 28-30 °C stehengelassen. Anschließend wird 0.25 ml Aceton und nach 5 Min. 0.25 ml HCl zugefügt. Das durch
Reduktion gebildete Nitrit wird anschließend nach der obigen Methode bestimmt. Vorsichtsmaßnahmen wie bei der Nitritbestimmung!
Eichkurve: 0, 5 10, 20, 50, 100 und 200 µM KNO3.
Prinzip der Reaktion:
Nitrat wird zu Nitrit reduziert. Die Reaktion verläuft allerdings nicht ausschließlich bis zum Nitrit.
Daher Nitrit-Eichkurve nicht einfach übernehmen, sondern Eichkurve von Nitrat ausgehend
erstellen!
Abb. 1-3: Reaktionsprinzipien einiger photometrischer Tests
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Colorimetrische Sulfidbestimmung
(nach Cline)
Reagenz: 1 g N,N-Dimethyl-p-Phenylendiammonium-Dichlorid (DMPD) und 1.5 g FeCl3 * 6
H2O in 25%iger HCl lösen, mit 25%iger HCl auf 50 ml auffüllen. Vorsicht! Die Lösung ist stark
sauer und carcinogen! Reagenz nicht mit Händen berühren, stets Pipettierhilfe verwenden, auf
anhaftende Reste achten! Benutzte Pipetten und Gefäße nicht stehen lassen, sondern alsbald spülen.
Vorgehen: In verschraubbaren 15 ml-Reagenzgläsern 0.4 ml Reagenz (mit Eppendorfpipette)
vorlegen. Dazu 5 ml Probe pipettieren. Reagenzglas verschließen, sofort mischen und nach frühestens 20 min die Extinktion bei 670 nm messen. Sollte die Extinktion größer als 1 werden, muß
weniger Probe eingesetzt werden (und dann nach Entwicklung der blauen Farbe das Volumen mit
dest. Wasser auf 5 ml ergänzt werden).
Eichkurve: Als Standard dient eine Na2S-Lösung: 500 ml H2O wird in einem Meßkolben mit
einem NaOH-Plätzchen versetzt und für mindestens 20 min durch eine lange Kanüle mit N2
durchspült. Danach wird ein in dest. H2O gewaschener und getrockneter, genau gewogener Na2S
* 9 H2O, von etwa 0.6 g, hinzugegeben und der Kolben (N2-begast) mit einem Gummiseptum
verschlossen. Diese Stammlösung enthält etwa 5 mM Sulfid (= 5 nmol/µl bei 0.6 g Na2S * 9 H2O)
und ist nur unter Stickstoff maximal 1 Tag haltbar. Für die Eichkurve werden in 12 Reagenzröhrchen 5 ml H2O vorgelegt, mit einem Gummiseptum verschlossen und 20 Minuten mit Stickstoff
ausgeblasen. Mit einer Hamiltonspritze (Vorsicht beim Durchstechen des Gummiseptums!) werden 0, 2, 5, 10, 20 und 50 µl (0 bis 250 nmol Sulfid) der Sulfidstammlösung zugesetzt, gemischt
und sofort 0.4 ml Reagenz mit einer 1 ml-Spritze hinzugefügt (Doppelansätze). Nach 20 Minuten
wird die Extinktion bei 670 nm gegen einen Ansatz ohne Sulfidlösung gemesssen. Zur Berechnung der molaren Konzentration der Na2S-Lösung wird das Formel-Gewicht für Na2S * 9 H2O
angenommen, was sich bisher bewährt hat. Für sehr genaue Messungen müßte ein Aliquot der
Na2S-Lösung in eine frische, genau eingestellte saure J-KJ-Lösung gegeben und das überschüssige Jod mit einer Na2S2O3-Lösung zurücktitriert werden.
Determination of dissolved sulfide
after Cord Ruwisch
Sulfide is the final product of dissimilatory sulfate reduction. The presence of dissolved sulfide in
cultures can be rapidly proven by its colloidal precipitation as CuS in a copper sulfate reagent, and
quantified photometrically.
Copper reagent:
Chemical reaction:
HCl (50 mM), CuSO4 (5 mM)
CuSO4 + H2S CuS + H2SO4
Procedure
Remove 0.2 ml of culture from the culture vessel using a syringe. Inject 0.1 ml culture free of gas
bubbles into 4 ml of copper reagent (dispensed into glass tubes). Vortex and transfer the solution
into a cuvette. The absorbance is immediately measured at 480 nm in a photometer (the colloidal
CuS solution remains stable for 20-40s). Copper reagent free of sulfide serves as blank.
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Sulfide standard preparation
Washed crystals of Na2S · 9H20 (~13 g) are dissolved in 50 ml anoxic water to serve as a stock
solution (~1M; the final concentration should be determined via titration). An anoxic dilution serie
of dissolved sulphide is prepared in the desired range (0-30mM). An aliquot of the stock solution
is anaerobically transferred into a Hungate tube containing anoxic water. After shaking, an aliquot
of this mixture is transferred into a second tube and so on. Calibration curves should be linear up
to an absorbance of 0.5.
A factor could be used to calculate the sulfide concentration from the measured absorbance.
Reference: Cord Ruwisch R (1985) A quick method for the determination of dissolved and
precipitated sulfides in cultures of sulfate-reducing bacteria. Journal of Microbiological Methods
4:33-36
Turbidometrische Bestimmung von anorganischem Sulfat
(nach Cypionka und Pfennig, Tabatabai)
Reagentien:
A) 10 g Citronensäure * H2O, H2O ad 80 ml, lösen und mit 120 ml Glycerin (99.5%) mischen.
B) 0.5 g BaCl2 * 2 H2O, 5 g Citronensäure * H2O, H2O ad 50 ml.
Vorgehen:
2 ml Probe (wenn nötig, klarzentrifugiert) mit 2 ml Lösung A schlierenfrei mischen. 0.5 ml Lösung B zusetzen und sofort schlierenfrei mischen. Nach 30 - 45 Minuten erneut mischen und die
Trübung bei 436 nm gegen sulfatfreie Kontrolle messen. Immer Doppelbestimmungen mit verschieden verdünnten Proben durchführen! Stets Eichstandards über den erwarteten Konzentrationsbereich der Proben mitmessen!
Eichkurve im Bereich von 0.1 - 5.0 µmol Sulfat pro Testansatz anlegen. Für die Erstellung der
Tiefenprofile werden die von Sulfid und Partikeln befreiten Wasserproben (1 l) verwendet.
Prinzip der Reaktion: Ba2+ + SO42- → BaSO4 (unlöslich)
Citronensäure säuert den Ansatz an und komplexiert die Ba2+-Ionen. Aus den Komplexen entstehen bei der Reaktion mit Sulfat sehr kleine Kristalle mit hoher optischer Dichte. Glycerin verlangsamt die Sedimentation der Kristalle.
Sulfat-Schnelltest
mit 0.2 M HCl und 0.2 M BaCl2
1 ml Kultur mit 2 Tropfen HCl ansäuern, umschütteln, 2 Tropfen BaCl2 zusetzen. Sofortige
Trübung zeigt Sulfat, langsam auftretende evtl. Thiosulfat (=> Schwefel) an.
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Photometrische Analyse von Thionaten
(nach Kelly et al. 1969; Fitz & Cypionka 1990)
Der photometrische Nachweis von Thiosulfat, Trithionat und Tetrathionat beruht auf der alkalischen Cyanolyse der Thionate, die zu Thiocyanatäquivalenten umgesetzt werden. Zur Unterscheidung der Thionate wird die Cyanolyse-Reaktion bei verschiedenen Temperaturen und zum Teil
mit CuSO4 als Katalysator durchgeführt. Die dabei entstehenden Thiocyanate können dann als rotbrauner Komplex mit Eisen (III) photometrisch quantifiziert werden.
(0°C)
(0°C, CuSO4)
(100°C, CuSO4)
I S4O62- + 3 CN- + H2O → S2O32- + SO42- + 2 HCN + SCNII S2O32- + CN- → SO32- + SCNIII S3O62- + 3 CN- + H2O → SO32- + SO42- + 2 HCN + SCN-
Daraus folgt, daß bei der Messung von Ansatz I lediglich die Konzentration von Tetrathionat ermittelt wird. Bei der Messung des Ansatzes II werden die Konzentrationen von Tetrathionat, des
bei der Cyanolyse entstehenden Thiosulfates und des bereits im Ansatz befindlichen Thiosulfates
erfaßt. Bei der Messung des Ansatzes III wird die Gesamtkonzentration aller im Ansatz vorhandenen Thionate (Thiosulfat, Tri- und Tetrathionat) ermittelt.
Lösungen:
1 M, pH 7.4
1.) NaH2PO4 - NaOH - Puffer
2.) KCN
1.25 M
3.) CuSO4 * 5 H2O
0.375 M
4.) Fe(NO3)3 * H2O
1.5 M
gelöst in 4 M HClO4, Volumenzunahme beim Lösen!
=> 100 ml HClO4 + 92 g Fe(NO3)3 => 150 ml Gesamtvol.
Als Standards werden 1 mM Lösungen von Thiosulfat, Tetrathionat und Trithionat täglich frisch
angesetzt.
Ansätze:
In jedes Reagenzglas werden 0.06 ml der Lösung 1.) vorgelegt. Dann wird die Probe hinzupipettiert (max. 2.25 ml) und mit Aqua bidest. auf 2.31 ml Gesamtvolumen aufgefüllt. Der Standard
wird als Mix mit allen drei Thionaten eingesetzt. Es wird für jeden Ansatz eine Nullprobe gemacht, mit welcher der Nullabgleich bei der photometrischen Messung durchgeführt wird. 3 verschiedene Ansätze (I,II u. III)
Ansatz I zur Bestimmung von Tetrathionat:
Ansatz I wird 10 min auf 0°C abgekühlt, bevor 0.06 ml der Lösung 2.) und 0.06 ml Aqua bidest.
hinzugefügt werden (Mischen!). Der Ansatz bleibt dann ca. 20 min im Eisbad.
Ansatz II zur Bestimmung von Thiosulfat:
Ansatz II wird 10 min auf 0°C abgekühlt. Dann wird 0.06 ml der Lösung 2.) hinzupipettiert (Mischen!). Nach einer 10-minütigen Inkubationszeit werden 0.06 ml der Lösung 3.) hinzupipettiert
(Mischen!), bevor der Ansatz weitere 10 min im Eisbad verbleibt.
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Ansatz III zur Bestimmung von Trithionat:
Nachdem dem Ansatz III 0.06 ml der Lösung 2.) hinzugefügt werden, wird er 45 min im Wasserbad gekocht. Die Reagenzgläser sind dabei durch Glasmurmeln verschlossen. Danach wird der
Ansatz auf 0°C abgekühlt (ca. 10 min) bevor 0.06 ml der Lösung 3.) hinzupipettiert werden (Mischen!). Danach bleibt der Ansatz weitere 10 - 15 min im Eisbad.
Abschließend werden zu allen Ansätzen 1 ml der Lösung 4.) hinzugefügt (Mischen!). Wenn die
Ansätze dann auf Raumtemperatur wieder erwärmt sind, kann die Extinktion 460 nm gemessen
werden. Entsprechend den oben angegebenen Reaktionsgleichungen sind die Konzentrationen der
Thionate wie folgt zu ermitteln:
Konzentration von Tetrathionat: Ansatz I
Konzentration von Thiosulfat: Ansatz II - 2 x Ansatz I
Konzentration von Trithionat: Ansatz III - Ansatz II
Colorimetrischer Sulfitnachweis
(nach Pachmayr)
Reagenz A: Säureentfärbte Fuchsinlösung
400 mg Fuchsin werden mit Aqua bidest. und 125 ml Schwefelsäure (konz.) versetzt und mit
Aqua bidest. auf einen Liter aufgefüllt.
Reagenz B: Formaldehyd 32 %ige Lösung
Ansatz:
Die Probe wird mit Aqua bidest. auf 8.9 ml aufgefüllt. Dann erfolgt die Zugabe von 1 ml Reagenz
A und 0.1 ml Reagenz B (mischen!).
10 min nach der letzten Zugabe erfolgt die photometrische Messung bei 570 nm gegen einen Ansatz ohne Sulfit.
Colorimetrischer Schwefel-Nachweis
(nach Chan und Suzuki, 1993)
Lösungen:
(1) 10 ml A. dest + 190 ml Aceton
(2) 0.2 g NaCN + 125 ml Lösung (1)
(3) 0.4 g FeCl3 * 6 H2O + 5 ml A. dest
(4) Aceton
(5) Petrolether
(6) 6.4 mg S° in 10 ml DMSO (Endkonzentration 20 mM)
(7) 3.2 mg S° in 10 ml Petrolether
- 14 -
Vorgehen:
- Herstellen einer S°-Eichreihe mit Lösung (6) (weißer Niederschlag) und Puffer von 5-1000 µM
0 µM = Leerwert
- Extraktion: 0.5 ml Bakteriensuspension (oder Eichlösung) + 1.0 ml Lösung (5) in EppendorfCaps
- mischen (30 sec)
- Zentrifugation: 14 000 Upm, 10 min in der Eppendorfzentrifuge der Überstand wird klar
- Ansatz: 0.5 ml Überstand + 1.0 ml Lösung (2) in E.-Caps
- mischen u. 2 min reagieren lassen
- Meßansatz: 0.95 ml Lösung (4)
+ 0.05 ml Lösung (3)
+ 0.50 ml "Ansatz" in E.-Caps
- mischen, es bildet sich ein bräunlicher Niederschlag
- Zentrifugation: 14 000 Upm, 1 min in der Eppendorfzentrifuge
- Extinktion des Überstands messen bei 464 nm
Photometrische Bestimmung von Orthophosphat
Reagentien:
A) Molybdatschwefelsäurereagenz:
14.4 ml konz. H2SO4 (d = 1.84) werden in 30 ml H2O dest. gelöst und nach dem Abkühlen
folgende Lösungen zugesetzt:
1 g Amidosulfonsäure in 10 ml H2O;
1.25 g (NH4)6 Mo7O24 * 4 H2O in 20 ml H2O;
34.4 mg Kalium- antimontartrat in 10 ml H2O.
Es wird mit H2O dest. auf 100 ml aufgefüllt.
B) 1.0 g Ascorbinsäure in 10 ml H2O dest. Täglich frisch herstellen.
Vorgehen:
10 ml Wasserprobe (filtriert) werden im Reagenzglas mit 0.4 ml Reagenz A und 0.25 ml Reagenz
B versetzt. Nach mindestens 10 min wird die Absorption bei 865 nm Wellenlänge in 1 cmKüvetten gegen einen Reagenzienleerwert mit H2O gemessen.
Eichkurve:
Mit KH2PO4 im Bereich von 0.2 - 40 µmol/l. Vergleichsweise auch Eichwerte mit 400 und 4000
µmol/l einsetzen.
Prinzip der Reaktion: Das Molybdän in der entstandenen Molybdato-phosphorsäure wird mit
Ascorbinsäure zu Mo(+IV) reduziert, das mit dem übrigen Mo(+VI) eine blaue Verbindung aus
gemischten Wertigkeitsstufen bildet.
- 15 -
Proteinbestimmung nach Lowry
Reagenzien:
• Kupferreagenz: 0.1 g CuSO4 * 5 H2O in 20 ml 1%-iger K-Na-Tartratlösung lösen.
1 ml dieser Lösung mit 50 ml Na2CO3-Lösung (2%) vermischen. Die Lösung täglich frisch ansetzen.
• Folin-Reagenz: 1 Teil Folin-C.-Reagenz (Merck) mit 2 Teilen dest. Wasser mischen.
• NaOH: 0.3 M
Vorgehen:
10 ml Zellsuspension in der Kühlzentrifuge abzentrifugieren (6000g, 10 min) und einmal mit 0.6
%-iger Kochsalzlösung waschen. Das Sediment wird sorgfältig in Kochsalzlösung resuspendiert
und auf 10 ml aufgefüllt. In drei Proben von je 1 ml wird das Gesamtprotein nach LOWRY et al.
bestimmt.
Um die Zellen aufzuschließen, 1 ml Probe mit 0.50 ml 0.3 M NaOH versetzen und im
Wasserbad bei 60 °C in verschlossenem Reagenzglas während 90 min erhitzen. Nach dem Abkühlen 5 ml Kupferreagenz unter ständigem Schütteln zufügen und 10 min im Dunkeln stehen lassen.
Dann wird 0.5 ml Folin-Reagenz zugesetzt, sofort geschüttelt und 30 min im Dunkeln gehalten.
Dann wird zentrifugiert (6000g, 10 min) und anschließend bei 623 nm gegen einen Blindwert photometriert (d = 1cm). Mit Serumalbumin wird eine Eichkurve aufgestellt 10 – 200 g pro Ansatz.
Proteinbestimmung nach Schmidt et.al. (1963)
(abgewandelte Biuretmethode nach La Riviére 1958)
Reagenzien:
(A) NaOH
(B) K-Na-Tartrat
NaOH
CuSO4 * 5 H2O
KJ
in H2O
4 M (= 160 g/l)
5g
4g
1g
2.5 g
400 ml
Vorgehen:
- 10 ml Zellsuspension mit 0.9 % NaCl waschen und abzentrifugieren
- Röhrchen mit 0.9 % NaCl auf 5 ml auffüllen
- 0.5 ml Reagenz A zugeben, schütteln
- genau 10 Minuten in kochendes Wasserbad (Glaskugeln auf die Reagenzgläser)
- sofort in kaltem Wasser abkühlen
- 2 ml Reagenz B zugeben, schütteln
- 30 Minuten in 37 °C Wasserbad
- Bei Trübung Partikel abzentrifugieren
- Extinktion bei 546 nm messen
- Eichkurve mit BSA (Stammlösung: 50 mg/ml) im Bereich von 0 bis 10 mg/Ansatz
- 16 -
Bradford protein assay (1976)
The assay is based on the binding of Coomassie Brilliant Blue G-250 to protein. When binding to
protein occurs the absorbance maximum of the dye shifts from 465 nm to 595 nm. Therfore,
absorbance can be measured photometrically at 595 nm. The assay is quick and reliable since a
visible colour change occurs after 2 min and the extinction coefficient of a dye-albumin complex
solution is constant over a 10-fold concentration range. Furthermore, both hydrophobic and ionic
interactions stabilize the anionic form of the dye, i.e. there is no or neglible disturbance by natrium
and kalium ions or carbohydrates like sugars. Disturbances are only known from concentrated
detergent like Sodiumdodecylsulfate (SDS), Trition X-100 or commercially available solutions.
Controls are recommended.
Bradford reagent
Dissolve 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 in 50 ml 95% ethanol, add 100 ml 85% (w/v)
phosphoric acid. Dilute to 1 liter when the dye has completely dissolved. Final concentrations are
0.01% (w/v) Coomassie Brilliant Blue G-250, 4.7% (w/v) ethanol, and 8.5% 8w/v) phosphoric
acid. The Bradford reagent should be light brown/reddish in color. In case of blue components
filtrate the solution using a round filter.
Standard procedure
1) Transfer up to 5 ml of homogenised growing culture into 15 ml- centrifuge tubes.
Centrifuge for 15 min/4000rpm/4°C. Decant supernatant and freeze the pellet until the
Bradford assay is carried out.
2) Preheat a water bath (100°C)
3) Add 500 µl bidestilled water and 500 µl NaOH (0.5 M) to the cell pellet and mix
thoroughly.
4) Cook the suspension for 10 min at 100°C
5) Transfer 200 µl in three parallels into 1.5 ml Eppendorf reaction tubes. Mix with 800 µl of
Bradford reagent.
6) Incubate for 30 min at room temperature.
7) Transfer the whole volume into a half-micro disposable cuvette.
8) Measure the absorbance at 595 nm using the photometer. Don’t forget blind controls.
9) Note all values and use the mean value for further calculations.
Calibration curve
A calibration curve is made from bovine serum albumin (BSA). A stock solution (1mg/ml) is
diluted with bidistilled water in triplicates to prepare standard solutions with concentrations
ranging from 0 to 8 µg protein/200µl.
- 17 -
Dry mass determination
(after Widdel, modified by Cypionka and Pfennig)
• Thoroughly clean all weighing dishes (do not touch with your fingers but use tweezers to handle
the dishes during cleaning), place in clean Petri dish, dry at 80 °C. So as to assure accuracy of
your measurements, always weigh an empty container as a control.
• Precisely measure and note down the volume (500-1000 ml) and OD (at 436 nm) of the culture
to be examined (the more the better). Transfer cells into centrifuge beakers (250 ml), counterbalance with water (including lids) (to precisely 0.5 g) and centrifuge for 20 minutes at 12,000
rotations per minute to obtain a solid pellet. (Cultures of sulfate-reducing bacteria contain sulfide,
wich should be replaced completely with CO2 before further procedures)
• Prepare 300 ml ammonium-acetate buffer (~50 mM, pH 6.5; if necessary, adjust with acetic
acid). This buffer evaporates completely as NH3 and acetic acid when heated.
• Immediately after the centrifuge has stopped, carefully remove the supernatant, re-suspend the
cells in the ammonium acetate buffer. If necessary, gather cells from several beakers in one, wash
cells (= centrifuge again)
• Precisely weigh the dry containers. Write down empty weight.
• Immediately after the centrifuge has stopped, remove the supernatant. (!Carefully!) transfer the
cells to the weighing dish in 0.5 ml dist. water using a Pasteur pipette. Rinse with water at least
twice.
• Dry at 80 °C until the weight remains constant (1-2 days).
• The final weighing has to occur immediately after the samples are taken out of the hot drying
cabinet, as cells absorb considerable amounts of moisture while cooling down. Therefore, preset
the analytical scale accordingly.
• Thoroughly clean all weighing dishes. Calculate the dry mass per OD and volume (ml).
Bestimmung von Carotinoiden phototropher Bakterien
(nach Eichler und Pfennig)
a) Ernte der Bakterienmasse
Gut gewachsene Kulturen werden abzentrifugiert (9000 rpm, 20 min), das überstehende Kulturmedium vorsichtig dekantiert und verworfen.
b) Extraktion der Carotinoide
Carotinoide sind in Gegenwart von Luft und Licht unbeständig!
Extraktionsmittel: Ethanol abs.: Aceton = 1:1.
Das Pellet von a) wird in dem restlichen Überstand (evtl. 0,2 ml dest. Wasser zusetzen) resuspendiert und vollständig in ein 10 ml-Zentrifugenglas überführt. Dann werden 8 ml Extraktionsmittel
zugegeben, gut durchgemischt und das Röhrchen nach Begasen mit N2 mit einem Butylgummistopfen verschlossen. Röhrchen etwa 1 Stunde bei Zimmertemperatur extrahieren lassen, noch-
- 18 -
mals durchmischen und Zellreste abzentrifugieren; Gummistopfen vorher abnehmen, Tischzentrifuge, 15 min. Farbigen Überstand bei 25 °C im Rotationsverdampfer unter schwarzem Tuch einengen. Farbigen Satz mit 0,75 ml Extraktionsmittel aufnehmen, in ein Röhrchen überführen, mit
N2 begasen und mit Butylgummistopfen verschließen; im Dunkeln aufbewahren.
c) Chromatographie auf Dünnschicht-Platten
Laufmittel: Petroleumbenzin : Aceton = 9:1
Chromatographiekammer mit Fließpapier auslegen, mit N2 begasen und schließen. Dann 100_ml
Laufmittel einfüllen und 1 h sättigen lassen. Den Extrakt von b) mit Hamilton-Spritze vorsichtig
auf die Startlinie einer Kieselgel-Dünnschicht-Platte unter einem N2-Strom zum Trocknen auftragen (etwa 100 µl auf 3 cm Strecke auftragen, daneben etwa 50 µl auf 3 cm). Vergleichsextrakte
ebenso behandeln. Platte in der abgedunkelten Kammer entwickeln. Wenn Laufmittel etwa 16 cm
hoch gestiegen ist (mit Bleistift markieren), Platte kurz trocknen mit N2 und nochmals entwickeln.
Dann Platte mit N2 trocknen. Auf der trocknen Platte Banden mit Spatel vorsichtig markieren
(Laufhöhe!), Platte mit Glasplatte abdecken und möglichst rasch auf durchsichtige Folie und Papier kopieren. Farben der Banden genau aufschreiben und anhand der Banden der Vergleichsorganismen identifizieren.
Bestimmung der Bacteriochlorophylle a, c, d und e
(nach Oelze, bzw. Steenbergen und Korthals)
Bakterienkultur (2 bis 5 ml) wird über ein Glasfaserfilter (f 25 mm) bzw. (bei Stämmen mit besonders kleinen Zellen) über Membranfilter (Porenweite 0,2 µm , f 2,5 cm) abfiltriert. Nach Überführen in 3 ml Aceton wird im Dunkeln bei 4°C über Nacht extrahiert. Die Messung erfolgt
gegen reines Extraktionsmittel für Bchl a bei 771 nm Bchl c bei 663 nm Bchl d bei 652 nm Bchl e
bei 647 nm. Die Pigmentkonzentration errechnet sich nach dem Lambert-Beer'schen Gesetz
E=c*d*ε
mit E = Extinktion am Absorptionsmaximum
c = Pigmentkonzentration
d = Schichtdicke der Küvette (1 cm)
ε = Extinktionskoeffizient am Absorptionsmaximum für
Bchl a = 92.3 ml * mg-1 * cm-1
Bchl c = 92.6 ml * mg-1 * cm-1
Bchl d = 98.0 ml * mg-1 * cm-1 (dito anzunehmen für Bchl e)
- 19 -
Cell number determination of (MPN) dilution series
with three parallels
For quantification of viable cell counts a MPN dilution series with appropriate medium is
prepared with three parallels. For this purpose the culture is diluted stepwise 1: 10 and incubated
at least for one week. The number of wells or tubes that show microbial growth can be correlated
to the MPN-index which can be found in a statistic table that contains the cell numbers/ml.
number of
positive tubes with
MPN-Index
cells / ml
confidence interval (95%)
upper
lower
100 µl 10 µl 1 µl
0
0
0
1
1
0
3
3
<0.5
<0.5
9
13
1
1
1
1
1
0
0
1
1
2
0
1
0
1
0
4
7
7
11
11
<0.5
1
1
3
3
20
21
23
36
36
2
2
2
2
2
2
0
0
1
1
2
2
0
1
0
1
0
1
9
14
15
20
21
28
1
3
3
7
4
10
36
37
44
89
47
150
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
0
0
0
1
1
1
2
2
2
3
3
3
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
2
23
39
64
43
75
120
93
150
210
240
460
1100
4
7
15
7
14
30
15
30
35
36
71
150
120
130
380
210
230
380
380
440
470
1300
2400
4800
- 20 -
Quantification of MPN dilution series with SybrGreenI
according to Martens-Habbena et al.
Preparation of staining-solution
The SybrGreenI stock solution (10.000x) is diluted in TAE buffer (pH 7,4) which contains 1% of
a 1M ascorbic acid. The working solution must be prepared freshly each day at five times the
desired final assay concentration.
Quantification
200µl subsamples from each well of the 2ml 96-well plates and 50µl SybrGreenI solution are
transferred to black microplates and mixed cautiously. Fluorescence is measured after 2h of
incubation in the dark. Fluorescence intensities are determined in a microplate reader (Fluostar
Optima) at 485nm (excitation) and 520nm (emission). All measurements are carried out in three
reading cycles, with integration of 20 flashes, a 0,5 s delay time between reading, and without
shaking before each cycle.
CFU-Berechnung mit verschiedenen Verdünnungsstufen
(nach Cavalli-Sforza)
ΣiCi
x = ———
Σi(ni*zi)
x
= mittlere Zellzahl im Beimpfungsvolumen
C1, C2, ... , Ci
= Anzahl der auf den einzelnen Platten gezählten Kolonien
= Platten/Verdünnungsstufe
n1, n2, ... , ni
z1, z2, ... , zi = Verdünnungen
Beispiel:
Verdünnung: 10-6: 303, 290, 285 Kolonien
"
10-7: 32, 21
"
Mittlere Zellzahl x = 931/(3*10-6 + 2*10-7) = 2.91*108
- 21 -
Preparation of slides coated with agarose for microscopy
Or how to trick microbial cells into posing for microscopic photos
(after Pfennig and Wagener, modified by Cypionka)
Heat 100ml of an agarose solution (2%, w/v) – prepared in a Schott flask with blue cap – in the
microwave. The solution should be free from reams. Use a preheated water bath (~ 45°C) to keep
the liquid soluted. In order to get a smooth agarose film preheat clean object slides (free from
fluff) on a clean flat underground by using infrared light. Dispense 2 ml of agarose solution in
zigzag lines onto one slide by using a clean glass pipette. Avoid drainage of the agarose solution.
Before usage, the agarose slides have to air dry for a few days. The slides can be kept in closed
boxes for some time.
Preparing microsope slides for observation
First of all, cell conentrations in cultures should be high enough for photography. Otherwise you
should use a centrifuge to concentrate the cells. Transfer three drops of ~20, 22 and 25 µl,
respectively, onto the agarose-coated slide by using a micropipette (0.1 – 0.2 ml). Each drop has
to be covered immediately with a cover glass (18x18 mm). Normally, the liquid part of the cell
suspension is soacked into the agarose, while the bacterial cells are arranged on the top.
In special cases it is necessary to prevent the cell suspension from vaporescence. A paraffin
solution is used to seal all sides of the cover glass by using a warm spatula.
Don’t forget to take some nice pictures of your cells! It is worth it.
See also “How to get the perfect photomicrograph” of Heribert Cypionka
(http://www.icbm.de/pmbio/lehre/ws0708/ringvl/digitalemikrofotos.pdf)
Determination of gram type – Gram differentiation
Gram-negative bacteria do not retain the initial crystal violet stain. They are decolorized by the
organic solvent and hence show a pink/red counterstain. Gram-positive bacteria instead retain the
violet dye. This difference basically lies in the cell wall structure of the bacteria.
a) Gram staining (modified by Bartholomew)
1) Plate freshly grown cells (not older than 24 h) onto a clean object slide or cover slip and allow
the film to air dry. Fix the dried film by passing it quickly through the Bunsen flame (‚heat
fixation’; do not pyrolyse the cells!). Do the same procedure on the same slide with two reference
strains, one gram-negative, and one gram-positive strain.
2) Stain the fixed cells for up to 1 min with Huckers’ ammonium oxalate-crystal violet reagent.
3) Drain staining solution. Wash off briefly with water for 5 sec. Drain.
4) Flood the slide with Gram's Iodine solution for ca. 1 minute. Wash off with water. Drain.
5) Drain staining solution. Wash off briefly with water for 5 sec. Remove excess water.
6) Counterstain: 3 x 30 sec each in 3 drops of n-propanol.
7) Wash off with water for 5 sec.
8) Check quality using a microscope.
9) Flood slide with safranin solution and allow to counterstain for 30 seconds. Drain counterstain
solution and wash off with water. Remove excess water. Dry.
10) Find dry and stained bacteria under 10x-40x lenses. Then examine the bacteria using oil
immersion but no cover glass.
- 22 -
11) Compare your results with the gram test of gram-negative and gram-positive reference
strains.
b) KOH solution test (after Gregersen)
Put some drops of KOH solution (3%) onto a clean slide. Add cell material (colonies or cell
pellets) by using an inculating loop and mix for ~5 to 10 seconds. Carefully pull back the platine
loop. Slimy filaments are indicative for gram-neagtive cells. Gram-positive bacteria won’t produce
slimy material with solution of potassium hydroxide.
Reference: Gregersen T (1978) Rapid method for distinction of gram-negative from gram-positive
bacteria. Applied Microbiology and Biotechnology 5: 123-127
Isolierung von Anaerobiern aus Tiefagar-Verdünnungsreihen
Herstellung sog. "Shake-Röhrchen":
In einer 500 ml Schott- Flasche (mit Rührfisch und Deckel leer gewogen!!!) 300ml bidest. Wasser
geben und 12g gemahlenen Agar zusetzen und Suspension 10 min rühren. Danach Agar absetzen
lassen (ca. 20 min), Wasser vorsichtig dekantieren. Dieser Waschvorgang dient dazu, wachstumshemmende Bestandteile und Hydrolyseprodukte zu entfernen, und wird fünfmal wiederholt. Anschließend auf der Waage auf 300 g + Leergewicht der Flasche (zuvor mit Deckel und Rührfisch
ermittelt) auffüllen und autoklavieren (20 min bei 120 °C).
AGAR-PIPETTEN SOFORT IN EINEN GROßEN Erlenmeyerkolben MIT HEIßEM WASSER
STELLEN UND AUSKOCHEN
Agarverdünnungsreihe
Benötigt werden:
• Pro Reihe 7 durchnumerierte und beschriftete sterile Reagenzröhrchen mit passenden sterilen
Gummistopfen (Ersatzgummistopfen parat haben)
• 5-fach gewaschenen und sterilisierten Agar (4%)
• 1 Wasserbad mit 42 °C
• 1 Wasserbad mit 65 °C
• 1 Wasserbad mit kaltem Wasser (Eiswasser)
• 2 Bunsenbrenner
• 1 50 ml-Fläschchen mit komplettem Medium
• sterile 1ml, 10ml Pipetten
Vorgehen:
• Agar in der Flasche durch Kochen verflüssigen und bei 65°C flüssig haltenund 3ml in die durchnumerierten und beschrifteten Röhrchen (im Wasserbad (42°C) mit lockerem Stopfen vorgewärmt) geben.
• Zu den Agar-Röhrchen in dem Wasserbad (42 °C) je 6 ml Medium zusetzen
• Eine Reihe Reagenzgläser aus dem Wasserbadnehmen und bei RT in einen Reagenzglasständer
stellen.
- 23 -
• 1 Tropfen der Kultur (0,5 ml) in das 1. Röhrchen geben, einmal umschwenken
• 1 Tropfen ca. 05 ml in das zweite Röhrchen gießen, das erste Röhrchen in das kalte Wasserbad
stellen usw. (Das Röhrchen, aus dem gegossen wird, vorher außen abtrocknen, damit nicht Wassertropfen ausverdünnt werden.)
• Möglichst zügig die Röhrchen mit N2/CO2 (80/20) begasen und bei gewünschter Temperatur
inkubieren.
Im Agar gewachsene Einzelkolonien können mit 1ml Spritze und Kanüle ausgestochen, mikroskopiert und zur Gewinnung von Reinkulturen erneut in Medium verdünnt werden und gegebenenfalls erneut shaken.
Geißelfärbung
(nach Ryu)
Zunächst wird ein mikroskopisches Präparat einer Bakteriensuspension hergestellt. Sobald der
Großteil der Zellen angeheftet ist, wird die Färbelösung zu dem Präparat gegeben. Nach einer
Einwirkzeit von 5-15 min sollten die Geißeln sichtbar sein.
Lösung I:
5%-ige Phenollösung
Tanninsäure
10 ml
2g
AlK(SO4)2 x 12 H2O, ges. Lösung
Lösung II:
Färbelösung:
10 ml
ges. Lösung Kristallviolett (12 g/100 ml MeOH)
Lsg.I : Lsg.II = 10 : 1
Catalase test
Reagent: (will be provided)
5% H2O2 solution, produced by diluting a 30% stock solution with distilled water. Store in a cool
and dark place. Do not touch by hand! Contamination (e.g. dust, metal etc.) provokes corrosion.
Procedure:
Place some bacterial mass from the middle of one fresh colony on a clean slide. Then give one
drop of the diluted H2O2 solution onto it using a clean Pasteur-pipette. Formation of gas (O2)
shows catalase activity.
- 24 -
Oxidase test
Reagents:
H2O
100 ml
Ascorbic acid
0.1 g
Tetramethyl-p-phenylendiamin-HCl 1.0 g
Attention, carcinogen! Reagents (will be provided, freshly prepared every day!). Do not touch by
hand and do not spill! After using, wash immediately the vessels and pipettes!
Procedure:
Soak a strip of filter paper (cellulose) with some drops of the reagent (not too wet!). Give some
bacterial mass taken from a colony with an inoculation loop on the strip, and rub it in by a
rounded glass rod. Blue coloration shows oxidase activity. As a control compare with a
preparation of strains of known acitivity (e.g. E.coli).
Analyse des Substratspektrums aerober Bakterienisolate
Der Substrattest stellt den Mittelpunkt der physiologischen Charakterisierung von Bakterienisolaten dar. Getestet wird das bakterielle Wachstum auf 59 verschiedenen Kohlenstoffverbindungen
(Angabe in Klammern = Endkonzentration in mM):
Komplexsubstrate:
Polymersubstrate:
Disaccharide:
Monosaccharide:
Zuckerabkömmlinge:
Carbonsäuren:
Dicarbonsäuren:
Andere org. Säuren:
Alkohole:
Aminosäuren:
Amine:
Aromaten:
Heterozyklen:
Pepton (0.05 %), Casamino Acids (0.05 %), Hefeextrakt (0.005 %)
Cellulose (0.05%), Stärke (0.1 %), Chitin (0.05 %), Xylan (0.05 %), Laminarin (0.05 %)
Saccharose (5), Cellobiose (5), Maltose (5), Trehalose (5)
Arabinose (5), Rhamnose (5), Xylose (5), Fructose (5), Glucose (5),
Mannose (5),
Mannitol (5), Gluconat (5), Glucosamin (5)
Formiat (5), Acetat (5), Propionat (1), Butyrat (2.5), Valerat (0.5),
Capronat (0.5), Caprylat (0.5), Crotonat (0.2)
Malonat (5), Succinat (10), Fumarat (5), Malat (5), Tartrat (2)
Glycolat (5), Pyruvat (5), Lactat (10), 2-Ketoglutarat (5), Citrat (2)
Methanol (2), Ethanol (5), Propanol (5), Butanol (5), Glycol (5), Glycerin
(5), Tween 80 (0.001 %)
Alanin (2), Arginin (2), Asparagin (2), Cystein (2), Glutamin (2),
Isoleucin (2), Phenylalanin (2), Tryptophan (2), Prolin (2)
Betain (2)
Benzoat (2), Salicylat (2)
Nicotinat (2)
Der Test wird in 200 µl-Mikrotiterplatten (siehe Schema) unter aseptischen Bedingungen angesetzt. Dazu werden 140 µl Medium (s.o.), 40 µl Substratlösung (aus einer Masterplatte) und
20 µl der Bakterienflüssigkultur in jedes „Well“ pipettiert und bei 20°C inkubiert. Es müssen eine
zellfreie und eine subtratfreie Kontrolle angesetzt werden!
WICHTIG: Zellen vor dem Überimpfen waschen, um den Eintrag von „fremden“ Substraten zu
verhindern! Dafür 1.5 ml der Flüssigkultur in einer Tischzentrifuge abzentrifugieren, den Über-
- 25 -
stand mit einer Pipette abnehmen und mit frischem Medium wieder auf 1.5 ml auffüllen. Alle Arbeitsschritte werden in einer Sterilbank durchgeführt.
Die Auswertung erfolgt über die durch bakterielles Wachstum hervorgerufene Trübung bzw.
entstehende Bakterienpellets in den einzelnen Wells. Allerdings sollten Stichproben mikroskopisch
überprüft werden. WICHTIG: Es muss beachtet werden, dass einige der eingesetzten Substanzen
selbst eine Trübung hervorrufen!
Abb. Inkubationsschema für Substrattest auf Mikrotiterplatten
Recording of growth curves
The most important parameter of growth experiments is growth yield per substrate. This is
represented by dry weight and cell counts. Growth rates of bacteria cultures are determined by
turbidity measurements (optical density, OD) using the “Ratio/XR Turbidimeter” (HACH,
Germany). To convert OD to cell counts, a conversion factor has to be determined. Therefore, a
culture exhibiting a strong turbidity is analysed in respect to its cell concentration and then serially
diluted. The OD of the dilutions is noted and the respective cell counts calculated (cells/OD).
Equation to calculate growth rates:
µ = growth rates (h-1)
x = OD (current date)
ln( x) − ln( x0 )
µ=
(t − t0 )
x0 = OD (at the beginning of exponential growth)
t – t0 = period examined (h)
Turbidity measurements of microbial growth
The turbidity (OD436 against water) is measured, to estimate the growth yield. The photometer is
set to zero with water in a 3 ml-cuvette (if possible from glass) and the OD of the bacteria
suspension is measured. At values higher than 0.3 aerobic cultures should be diluted prior to the
measurement (with 70 mM phosphate buffer). This is not the case for anaerobically growing cells!
These are instead measured against a tube filled with water. When the tubes are measured for the
first time, the minimum absorption for each tube is found by turning the tube around in the
photometer. This position is marked on the tube with a felt pen, and the same position is used
(after adjusting) to measure OD throughout the experiment.
- 26 -
Taking samples
Immediately after inoculation, and at least every 60 minutes thereafter, 1 ml samples are taken
from aerobic cultures and examined for OD and cell number (max. once every hour). From
anaerobic samples only the OD is measured. The OD (and maybe other parameters) of slowly
growing strains should be checked once a day or even a larger time interval during the lag phase.
Temperature is an important parameter for biological turnover rates and should therefore remain
constant. In no case leave cultures standing at room temperature.
During the exponential growth phase, decrease the intervals at which samples are taken. OD
data are plotted semilogarithmically.
Bestimmung der β -Glucosidase-Aktivität
Die β-Glucosidase (= Cellulase) hydrolysiert die
heiten der Cellulose.
(1,4)-glucosidische Bindung zwischen den Glucoseein-
Testprinzip
Die in der Probe enthaltenen β-Glucosidasen hydrolysieren das nicht fluoreszierende Substratanalogon 4Methylumbelliferyl-β-D-Glucosid. Das abgespaltene 4-Methylumbelliferon wird fluorimetrisch gemessen.
HOH2C
CH3
CH3
O
HO
β-Glucosidase
HOH2C
O
HO
O
HO
O
O
OH
+
HO
O
O
HO
OH
OH
4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucosid
4-Methylumbelliferon
Geräte
Reagenzien
Spektrofluorophotometer
Reagenzgläser und Ständer
Vortexer
Magnetrührer
pH-Messgerät
Automatikpipetten
25°C Wasserbad
Zentrifuge
4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucosid
Glycin
Natriumchlorid
Natriumhydroxid
Ethylenglykol-Monomethylether
β-D-Glucose
Substratanalogon-Stammlösung
3 mg 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucosid in 0.5 ml Ethylenglykol-Monomethylether vollständig
lösen und 0.5 ml steriles bidest. H2O (in ausgeglühter Flasche) zusetzen. Die SubstratanalogonLösung muss vor jedem Messtag frisch angesetzt werden.
- 27 -
Fluorophor-Stammlösung
10 mg 4-Methylumbelliferon in 5 ml Ethylenglykol-Monomethylether lösen und 5 ml steriles bidest. H2O (in ausgeglühter Flasche) zusetzen. 100 µl dieser Lösung werden mit sterilem bidest.
H2O (in ausgeglühter Flasche) auf 100 ml aufgefüllt (Endkonzetration 1 µg/ml). Die Lösung ist im
Dunkeln bei 4°C lagerbar.
Glycinpuffer
0.75 g Glycin und 0.58 g Natriumchlorid in 100 ml sterilem bidest. H2O (in ausgeglühter Flasche)
lösen. Der pH-Wert wird mit 1 M Natronlauge auf pH 10 eingestellt.
Versuchsdurchführung
Pro Probe werden 3 Parallelen angesetzt. 1 ml Probe plus 100 µl Substratanalogon-Lösung.
Blindwert: 1 ml steriles bidest. H2O (in ausgeglühter Flasche) plus 100 µl Substratanalogon-Lösung.
Inkubation abgedeckt im Wasserbad bei 25°C für 2 h. Zum Abstoppen der Reaktion werden
jedem Ansatz 750 µl 0.1 M Glycinpuffer (pH 10) zugesetzt, gut durchmischt und sofort bei einer
Anregungswellenlänge von 360 nm und einer Emissionswellenlänge von 440 nm in Spektrofluorophotometer gegen den Blindwert gemessen.
Bei hoher Eigenfluoreszenz der Probe wird ein Probenblindwert aus 1 ml Probe und 100 µl
sterilem bidest. H2O (in ausgeglühter Flasche) angesetzt, genauso behandelt wie die Proben und
gegen einen fluorimetrischen Blindwert (3.3 ml steriles bidest. H2O) gemessen. Die Fluoreszenz
dieses Probenblindwertes wird von der Fluoreszenz der Probe subtrahiert.
Eichreihe
Für die den Test begleitende Eichreihe werden zwischen 10 und 70 µl MUF-Standardlösung zu
3.3 ml sterilem bidest. H2O (in ausgeglühter Flasche) zugefügt. Dem Ansatz werden 750 µl Glycinpuffer zugegeben, gut durchmischt und gegen einen Blindwert (3.3 ml steriles bidest. H2O plus
750 µl Glycinpuffer) gemessen. Die Eichreihe muss bei jeder Messerie mitgemessen werden.
Die Aktivitätstests der β-Glucosaminidase, der Leucin-Aminopeptidase sowie der
β-Glucosidase im Mikrotiterplattentest werden wie oben beschrieben, mit einigen Änderungen,
durchgeführt.
Bestimmung der β -Glucosaminidase-Aktivität
Die β-Glucosaminidase (= Chitinase) hydrolysiert die
N-Acetyl-Glucosamineinheiten des Chitins.
(1,4)-glucosidische Bindung zwischen den
Substratanalogon: 4-Methylumbelliferyl-N-Acetyl-β-D-Glucosaminid
HOH2C
CH3
CH3
O
HO
β-Glucosaminidase
HOH2C
HO
O
O
O
OH
+
O
HO
O
O
HO
NH
C
O
HO
NH
C
CH3
O
4-Methylumbelliferyl-N-Acetyl−β-D-Glucosaminid
N-Acetyl-β-D-Glucosamin
CH3
- 28 -
Bestimmung der Leucin-Aminopeptidase-Aktivität
Die Leucin-Aminopeptidase spaltet Pepton, welches ein Gemisch von Peptiden und Aminosäuren
aus tierischen oder pflanzlichen Proteinen ist.
Substratanalogon-Stammlösung
- Herstellung 100 ml einer 2 mM L-Leucin-7-Amido-4-Methylcoumarin-Lösung in sterilem bidest
H2O (in ausgeglühter Flasche; ausglühen: 12 h bei 180°C)
- Lagerung bei –20°C im Dunkeln möglich
- nach dem Auftauen Herstellung der benötigten Konzentrationen durch Verdünnung
Fluorophor-Stammlösung
- Herstellung 1 l einer 0.1 mM 7-Amino-4-Methylcoumarin-Lösung in 10 ml EthylenglykolMonomethylether und 990 ml sterilem bidest. H2O (in ausgeglühter Flasche)
- Lagerung als Teilmengen bei –20°C im Dunkeln
- nach dem Auftauen Herstellung der benötigten Konzentrationen durch Verdünnung
Ammonium-Glycin-Puffer
- Herstellung 1 l einer 0.2 M Ammoniumhydroxid / 0.05 M Glycin-Lösung in sterilem bidest.
H2O (in ausgeglühter Flasche); pH 10.5 mit 5 M Natronlauge einstellen
H3C
H3CHCH2C
H2N
C
H O
C
H
N
O
O
H2N
O
Leucin-Aminopeptidase
+
CH3
L-Leucin-7-Amido-4-Methylcoumarin
O
H3C
H2N
H3CHCH2C
H
C
COOH
CH3
7-Amino-4-Methylcoumarin
L-Leucin
1 ml Probe plus 1 ml Substratanalogon-Lösung (zur Eichung 1 ml Probe plus 1ml Fluorophor
Lösung). Blindwert: 1 ml steriles bidest. H2O (in ausgeglühter Flasche) plus 1 ml Substratanalogon-Lösung (zur Eichung 1 ml Probe plus 1 ml steriles bidest. H2O).
Zum Abstoppen der Reaktion werden die Proben 3 min gekocht und auf 25°C abgekühlt. Danach Zugabe von 1ml Ammonium-Glycin-Puffer, Sedimentation der groben Partikel, Überführung
des Überstandes und Zentrifugation 15 min 13000 rpm.
Bestimmung der β -Glucosaminidase-Aktivität in Mikrotiterplatten
Notwendige Geräte: Mikrotiterplatten mit 96 Kavitäten
Automatik-Mehrkanalpipette
Mikrotiterplatten-Fluoreszenzreader
Herstellung der Substratanalogon-Stammlösung in 10facher Menge.
Herstellung 1 l einer 0.14 M Natriumchloridlösung.
- 29 -
Jeweils 200 µl Probe werden in drei Kavitäten der Mikrotiterplatte pipettiert und mit 20 µl Substratanalogon-Lösung versetzt. Für den Probenblindwert werden zu 20 µl Natriumchloridlösung
200 µl Probe pipettiert. Für den photometrischen Blindwert werden zu 200 µl Natriumchloridlösung 20 µl Substratanalogon-Lösung pipettiert. Die Mikrotiterplatten werden abgedeckt und bei
30 °C im Brutschrank 24 h inkubiert. Nach der Inkubation wird der pH-Wert durch Zugabe von
50 µl Glycinpuffer auf pH 10 in den einzelnen Kavitäten eingestellt. Die Platten werden sofort in
einem Mikrotiterplatten-Fluoreszenzreader bei einer Anregungswellenlänge von 355 nm und einer
Emissionswellenlänge von 460 nm gemessen.
Eichreihe
Für die den Test begleitende Eichreihe werden zwischen 10 und 70 µl der MUF-Standardlösung
(mindestens drei Konzentrationsstufen) mit sterilem bidest. H2O (in ausgeglühter Flasche) auf 200
µl aufgefüllt und mit 20 µl Substratanalogon-Lösung versetzt. Die Eichreihe wird parallel zu jeder
Messreihe angesetzt und wie die Testansätze inkubiert. Auch hier wird nach der Inkubation der
pH-Wert durch Zugabe von 50 µl Glycinpuffer auf pH 10 in den einzelnen Kavitäten eingestellt.
Die Platten werden in einem Mikrotiterplatten-Fluoreszenzreader bei einer Anregungswellenlänge
von 355 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm gemessen.
Bestimmung der Gesamtzellzahl
Als Standard-Methode zur direkten Zählung von Mikroorganismen wird heute eine Kombination
aus Membranfiltertechnik und Epifluoreszenzmikroskopie verwendet. Dabei werden die Mikroorganismen vor oder nach der Filtration mit Fluoreszenzfarbstoffen wie Acridinorange oder DAPI
(= 4´,6-Diamidino-2-phenylindol) gefärbt. Acridinorange bindet an die Phosphatgruppen von Nucleinsäuren. Gefärbte Bakterien fluoreszieren grün, z.T. orange, Fremdpartikel rot, orange oder
gelb. DAPI reagiert mit doppelsträngiger DNA. Gefärbte Bakterien fluoreszieren blassblau,
Fremdpartikel gelb. Zur Filtration werden Membranfilter z.B. aus Polycarbonat oder anorganische
aus Aluminiumoxid (Anodisc) verwendet. Damit die Zellen nicht ins Innere der Filter eindringen,
sollte deren Porenweite maximal 0.2 µm betragen.
Materialien
- Filtrieraufsatz (Millipore 20 mm Glasfilterhalter)
- 0.2 µm Anodisc-Filter (Whatman)
Chemikalien
- 0.5% TWEEN 80 (sterilfiltriert)
- 0.22 µm sterilfiltriertes ddH2O
- 0.22 µm sterilfiltrierter PBS-Puffer (130 mM NaCl, 5 mM NaH2PO4; pH 7.2)
- Fixativ (4% Paraformaldehyd + 0.1% Triton X100in 1 x PBS; pH 7.25)
- DAPI-Lösung (10 µg/ml; sterilfiltriert)
- Einbettungsmittel DABCO (25 mg Diazabicyclo-octan + 1 ml PBS + 9 ml Glycerin)
-
Färbelösung:
1ml Fixativ
+ 930 µl ddH2O (sterilfiltriert)
+ 70 µl DAPI-Lösung
- 30 -
Methode
Zu den mit Glutardialdehyd (6 ml, 3%) fixierten Sedimentproben 100 µl TWEEN 80 zugeben und
die Proben mit Ultraschall behandeln (5x5 sec). In ausgeglühten Reagenzgläsern 10 ml PBSPuffer vorlegen. Vorbehandelte Proben nochmals vortexen und 10 µl davon in den PBS-Puffer
überführen. Proben erneut vortexen und über mit Glasfaser-Filter (GF) unterlegte AnodiscMembranfilter filtrieren. Reagenzglas und Filtrieraufsatz mit sterilfiltriertem Wasser nachspülen.
Membran trockenfiltrieren und während des Vakuums abnehmen. Filtrieraufsatz vor jedem neuen
Filtrationsvorgang mit Spülmittel, ddH2O und steril filtriertem ddH2O säubern.
In einem kleinen Wägeschälchen DAPI-Lösung ansetzen. Filter mit der Probenseite nach oben
vorsichtig auf die Färbelösung auflegen und 5 min im Dunkeln färben. Filter(rückseite) auf Küchenpapier im Dunkeln trocknen und danach auf einem Objektträger in DABCO einbetten, Deckglas auflegen. Filter unterm Epifluoreszenzmikroskop auszählen.
Gesamtzellzahl in einer Wasserprobe
(nach Hobbie et al.)
2-5 ml einer Wasserprobe mit Bakterien werden in einem Reagenzglas mit ca. 200 µl einer partikelfreien 0.1% Acridin-Orange Lösung 2 min lang gefärbt und dann durch einen mit Irgalanschwarzlösung (0.1%) vorgefärbten 0.2 µm Nucleporefilter abfiltriert. Als Unterlage kommt
auf den Filteruntersatz ein Cellulosemembranfilter. Der Nucleporefilter wird dann auf einem Objektträger getrocknet, mit einem fluoreszenzfreien Immersionsöl (z.B. Siliconöl) versehen und mit
einem Deckglas bedeckt. Die Probe wird bei fluoreszenzfreier Ölimmersion unter dem Epifluoreszenzmikroskop bei Blaulichtanregung betrachtet. Es werden pro Filter 10 Zählquadrate ausgezählt. Die Probenmenge sollte so gewählt sein, dass pro Zählquadrat ca. 30-50 Bakterien sichtbar
sind Berechnung der Bakterienzahl/ml:
Zahl/ml = (y • A)/(a • V)
y: mittlere Zellzahl pro Zählquadrat
A: effektive Filtrationsfläche (µm2)
a: Zählquadratfläche (µm2)
V: Filtrationsvolumen (ml)
Determination of the total cell count with SybrGreenI
(Lunau et al.)
1.
Dissolution of the cells with methanol and staining with SybrGreen I
To break the particles in the initial sample apart and to remove adherent bacteria, the samples are
treated with 100 % methanol in 1.5 ml Eppendorf® reaction tubes (final concentration
10 % [v/v]). After that, the samples are sonicated for 15 minutes at 35° C in the ultrasonic bath.
To remove detrital and inorganic particles, the samples are centrifuged for 1 minute with
2.000 rpm. 500 – 1.000 µl of the supernatant are filtrated on a black 0.2 µm polycarbonate filter
and stained with SybrGreen I. In case of sediment samples, the supernatant is diluted 1:100 with
TAE buffer before filtration. The filter is triply flushed in each case with 1 ml TAE buffer and then
transferred to an object slide. 6 µl staining- and mounting solution are dropped in the centre of a
- 31 -
cover slip (18 mm x 18 mm). The cover slip is brought to the object slide with the staining
solution towards the filter. To distribute the staining solution equally on the filter, you can
carefully press with tweezers onto the cover slip. After an "incubation time" of 15 to 30 minutes
at 4° C (refrigerator) the total cell count is determined with epifluorescence microscopy. The
storage of the preparations at -20° C allows the determination of the cell count also a few month
after staining.
2.
Preparation of the mounting medium
In a 25 ml polypropylene tube ("Falcontube") 2.4 g of polyvinylalcohol 4-88 (moviol 4-88, Fluka,
Switzerland) are added to 6 g of glycerol and vigorously mixed at room temperature. Moviol does
not dissolve completely. Thereafter, 6 ml double-distilled water is added and the solution is stirred
for two more hours (at room temperature). Some of the moviol still remains undissolved. The
addition of 14 ml of TEA buffer and mixing for another 2h at 50° C dissolve moviol completely
and turn the solution clear. Finally, the solution is filtered through a 0.2 µm Nalgene® filter and
aliquots of 200 – 1.000 µl are stored frozen at -20° C.
3.
Preparation of the staining solution
The SybrGreen I stock solution is added to the mounting medium in small PCR soft tubes. The
dilution depends on the sample fixation procedure. Samples which are fixed with formalin are
diluted 1:15, and those that such are fixed with glutardialdehyde are diluted 1:200. In addition, a
freshly prepared 1 M ascorbic acid solution, dissolved in TAE buffer, (pH 7.4) is added at a final
concentration of 1 % as an antioxidant. The staining solution can be kept at 4° C for several
weeks (do not freeze!).
4.
Total cell counting
Literature:
Lunau et al. 2004: Improved method for counting particle-associated bacteria, Environmental
Microbiology 2004 (submitted)
- 32 -
ATP-Bestimmung
(nach Bergmeyer)
Das Prinzip der ATP-Bestimmung mittels Luciferase-Assay beruht auf der Reaktion von ATP
mit Luciferin und Sauerstoff in Gegenwart des Enzyms Luciferase gemäß:
Luciferase
ATP + Luciferin + O2 → Oxyluciferin + AMP + PPi + CO2 + Licht
Wenn die übrigen Reagenzien im Überschuß vorliegen, ist die Lichtemission proportional zur
ATP-Menge. In einem geeichten Meßsystem kann also von der gemessenen Lichtintensität auf
den ATP-Gehalt einer Probe geschlossen werden. Die Lichtemission wird in einem Luminometer
(LKB Wallac) bestimmt, das mit einem internen 14C-Strahler auf die gewünschte Empfindlichkeit
eingestellt wird. Am Ausgang des Luminometers ist ein Schreiber angeschlossen, der die Meßwerte in mV registriert.
Um den ATP-Gehalt von Zellen bestimmen zu können, müssen diese erst aufgeschlossen werden.
Extraktion des ATP (nach Blaut und Gottschalk 1984): 100 µl auf Eis gelagerte 3 M Perchlorsäure wird in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß vorgelegt, 100 µl Probe zugegeben, einmal kurz
und dann jede halbe Stunde erneut geschüttelt. Nach 1½ Stunden Extraktionszeit auf Eis werden
50 µl 1 M Tes-Puffer pH 7.4 und 112 µl 3 M KOH zugegeben, sodaß der pH-Wert zwischen
7.0 und 8.0 liegt. Die Kaliumkonzentration im neutralisierten Extrakt reicht aus, um das Perchlorat auszufällen, das die ATP-Test-Reaktion stören würde. Die Ausfällung wird in einer Tischzentrifuge kurz abzentrifugiert.
Luciferase-Assay:
Für den Luciferase-Assay werden folgende Chemikalien eingesetzt:
Tris-Puffer (EDTA-Tris-Acetat, pH 7.75):
Es werden 12.12 g Tris-(hydroxy-methyl)aminomethan und 0.74 g Na2-EDTA eingewogen, mit
destilliertem Wasser auf 900 ml aufgefüllt, der pH-Wert mit 2 M Essigsäure auf 7.75 eingestellt
und schließlich destilliertes Wasser bis auf 1000 ml Endvolumen dazugegeben.
Test-Reagenz:
Das Test-Teagenz (1243-102 Monitoring Kit) der Firma LKB enthält:
I.)
II.)
III.)
IV).
V)
Firefly-Luciferase
D-Luciferin
50 mg Rinderserumalbumin
0.5 mmol Magnesiumacetat
0.1 µmol anorganisches Pyrophosphat
Die gefriergetrocknete Testreagenz-Fertigmischung wird unter vorsichtigem Schütteln in 10 ml
Ultrapure-Wasser (durch Umkehrosmose hochgradig gereinigtes Wasser mit einer Leitfähigkeit
von 0.05-0.07 µS) gelöst, in Portionen zu je 1 ml in Cryo-Tubes gefüllt und in flüssigem Stickstoff bis zu weiteren Verwendung aufbewahrt.
- 33 -
ATP-Standard (0.5 µM):
30.26 mg ATP (ATP Na2 H2 * 3 H2O, Boehringer, Mannheim) werden ad 100 ml in Tris-Puffer
(siehe oben) gelöst und zu je 1 ml in Cryo-Tubes portioniert und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. An jedem Versuchstag wird diese ATP-Stammlösung aufgetaut und in 3 Schritten insgesamt 1:1000 in Tris-Puffer verdünnt. Diese ATP-Standard-Lösung hat eine Konzentration von
0.5 µM i.e. 0.5 pmol/µl.
Durchführung der Messung:
160 µl Tris-puffer werden mit 40 µl Test-Reagenz in einer Polystyren Küvette durch langsames
Drehen gemischt und der Leerwert der Strahlung im Luminometer gemessen. Die Küvette wird
nun wieder herausgenommen, 10 µl Zellextrakt werden zugesetzt (resultierendes Volumen 210
µl), gemischt und wieder die Lichtemission ermittelt. Darauf wird die Messung zweimal durch
Zugabe von je 5 µl ATP-Standard (2.5 pmol) in dieselbe Küvette geeicht (resultierende Volumina: 215 µl und 220 µl). Durch diese interne Standardisierung werden Fehler, die durch die unterschiedlichen Komponenten der einzelnen Proben verursacht werden können, ausgeschlossen.
Determination of methane concentrations via Gas Chromatography
Material:
overheated (geglühte) 50 ml bottles or Bellco-tubes with defined volume
sterile rubber stoppers
1M NaOH
gastight syringe
methane standard 100ppmv
gaschromatograph Varian 3400
Preparation:
To stabilize the system the standby-modus of the GC should run 24h-48h before the first
measurement. The nitrogen valve on the floor must be opened first. The nitrogen pressure within
the GC should be adjusted to 0.8 bar. Now the GC can be turned on and method 4 must be
started. By pushing “reset” the error message disappears.
The content of the nitrogen bottle must be controlled regularly.
About 2h before measurement the synth. air and hydrogen bottles must be opened. The nitrogen
pressure within the GC must be corrected upwards to 5.7 bar. Now open the outlets for synth. air
and hydrogen. The pre-adjustments for synth. air and hydrogen are:
synthetic air
4,2bar
300 ml/min
hydrogen
2,8bar
30 ml/min
These two gases are the fuel-gases for the Flame Ionisation Detector (FID). Pay attention that the
hydrogen valve is opened after the valve for synth. air and that afterwards method 2 is started
immediately. After additional two hours the base line should be near zero and the measurements
can be started.
- 34 -
Calibration:
For calibration use method 2 and a methane standard of 100ppmv. The standard injection volume
is 20µl, that means 20µl of the standard is equal to 100ppmv. The volumes listed in the table
below are injected into Injector A. Three parallels are measured for calculating the calibration line
and the correlated standard deviation.
Before measuring a standard or a sample the syringe must be purged at least thrice with the
substance that should be measured.
Volume
1
2
5
7,5
10
15
20
25
30
40
50
ppmv
5
10
25
37,5
50
75
100
125
150
200
250
Methane measurement:
After calibration the syringe must be purged thrice with air and then air can be used as blankvalue. Homogenize the headspace of the sample and inject 20µl headspace immediately after
sampling into the injector – repeat the last step twice.
Determination of methane concentrations:
essential parameters for calculation:
• sample vessel volume
• head space volume
• GC area
• corrected GC area
• ppmv methane
• sediment volume
- 35 -
Zählung wachsender Zellen mit Nalidixinsäure
Prinzip
Die Bestimmung der Gesamtzellzahl mit Epifluoreszenzfarbstoffen liefert keine Aussage über den
physiologischen Zustand der Zellen. Zu diesem Zweck wurde der ‚direct viable count’ entwickelt
(Kogure et al. 1979). Bei dieser Methode wird der natürlichen Gemeinschaft ein Antibiotikum
zugesetzt, welches die Verdopplung der DNA unterbindet. Die Zellen können zwar wachsen und
Biomasse aufbauen, sich aber nicht teilen. Man geht davon aus, dass lebensfähige Zellen wachsen
und übernimmt die Zahl wachsender Zellen als ‚direct viable count’.
Benötigte Chemikalien
Nalidixinsäure, 1 mg in 10 ml-1 dest. Wasser lösen und sterilfiltrieren
Hefeextrakt, 10 g·l-1, autoklaviert
Durchführung
10 ml Wasserprobe werden mit sterilem Hefeextrakt versetzt (Endkonzentration (50 mg·l-1). Dann
wird Nalidixinsäure zugesetzt (Endkonzentration 20 µg·ml-1) bzw. das gleiche Volumen steriles
Wasser in Kontrollversuchen und für 8 bis 24 Stunden inkubiert. Danach wird die Probe mit
Formaldehyd fixiert und die Gesamtzellzahl bestimmt, sowie die Anzahl unnatürlich langer ungeteilter Zellen.
Analysiert werden:
- Probe ohne Hefeextrakt und ohne Nalidixinsäure
- Probe mit Hefeextrakt und ohne Nalidixinsäure
- Probe mit Hefeextrakt und mit Nalidixinsäure
Bei geringen Zellzahlen sollten die Zellen auf einem Filter (0.2 µm Porenweite) konzentriert werden.
Literatur
Kogure K, Simidu U & Taga N (1979) A tentative direct microscopic method for counting living
bacteria. Canadian Journal of Microbiology 25-3:415-420.
- 36 -
Life-Dead-Staining
Prinzip:
SybrGreen I und Propidiumjodid sind interkalierende Substanzen, die sich in doppelsträngige
DNA einlagern und bei UV-Anregung fluoreszieren (Abb 1a). SybrGreen I dringt in alle Zellen
ein und färbt diese grün. Aufgrund seiner Ladung färbt Propidiumjodid nur tote Zellen, die keine
intakten Membranen mehr haben. Unter dem Fluoreszenzmikrokop (Anregung 450-490nm)
leuchten diese Zellen orange Abb.1b).
Abb 1. Interkalierende Substanzen (a) Einlagerung in doppelsträngige
DNA (b) Life-Dead-Staining von Mikroorganismen aus einer Bodenprobe.
Lösungen:
alle Lösungen werden in ausgeglühten Pfennigflaschen (12 h/180°C) angesetzt
1l Tris-HCl-Puffer 10 mM, pH 8, sterilfiltriert
Tween 80, 0,5%, sterilfiltriert (nur für Untersuchung von Sedimenten)
SYBR-Green I, 1:200 verdünnt in Tris-HCl-Puffer
Propidiumiodid, 1 mg /ml Tris-HCl-Puffer
Einbettungsmittel: 1:1 Gemisch aus Glycerin und Tris-HCl-Puffer auf pH 8 einstellen.
900 µl dieses Gemisches mit 100 µl Phenoldiamin mischen und kühl lagern
Durchführung
1 g Sediment wird mit 10 ml Tris-HCl-Puffer in ausgeglühten Goldkopfröhrchen aufgeschlämmt
und 100 µl Tween 80-Lösung dazugegeben. Die Probe wird nun 5*30 sec. mit Ultraschall behandelt. In ein steriles Eppendorfreaktionsgefäß wird 1 ml Tris-HCl-Puffer vorgelegt und mit 5 µl der
Sedimentaufschlämmung bzw. einem geeigneten Volumen der Kulturlösung (max. 50µl) gemischt. Zu der Lösung werden zuerst (wichtig!!!) 10 µl SYBRGreen I –Lösung gegeben und gemischt, dann werden 15 µl Propidiumiodid-Lösung zugegeben und wieder gemischt. Der Färbeansatz wird 10 min. im Dunkeln inkubiert. Der Färbeansatz wird dann auf einen Polycarbonatfilter
(Anodisc) gezogen. Wichtig: Filterturm vorher mit TRIS-HCL Puffer gut spülen. TRIS-HCL im
Filterturm vorlegen, dann den Färbeansatz dazupipettieren, nach dem Absaugen nochmals mit
TRIS-HCL Puffer nachspülen. Anschließend wird der Filter im Dunkeln getrocknet und in das
oben genannte Einbettungsmittel auf einem Objektträger eingebettet. Die Präparate können im
Dunkeln bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank gelagert werden. Die Präparate werden unter
dem Fluoreszenzmikroskop mit dem Filterset BP 450-490 ausgezählt.
Literatur
Boulos L, Prévost M, Barbeau B, Coallier J & Raymond Desjardins (1999) LIVE/DEAD®
BacLight™: application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total
bacteria in drinking water. Journal of Microbiological Methods 34-1:77-86.
- 37 -
Zählung aktiv respirierender Zellen
Prinzip
Ein künstlicher Elektronenakzeptor ist durch hydrophobe Gruppen lipophil und membranpermeabel. Er wird aufgrund einer positiven Ladung von Zellen mit Membranpotential (Innenseite negativ) akkumuliert. In der Zelle entsteht durch Elektronenübertragung eine Form, die entweder farbig auskristallisiert (s. Beispiel TTC in der Abb.) oder fluoresziert wie das CTC.
Benötigte Chemikalien
CTC: 5-Cyano-2,3-ditolyl Tetrazoliumchlorid (50 mM): 0,1 g in 4,6 ml partikelfreiem dest. H2O
lösen. Kühl und dunkel lagern.
Vorsicht: Stoffwechselgift.
Durchführung
1ml Kulturlösung in ein Reagenzglas pipettieren und 40 µl CTC-Lösung zugeben (Endkonz.
2 mM). Als Kontrolle eine Probe mit Formaldehyd abtöten (Endkonz. 2 %) und mischen. Der
abgetöteten Probe CTC erst nach 5 min zugeben. Die Proben werden 4 h im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend werden die Proben mit DAPI gefärbt, filtriert und unter dem
Epifluoreszenzmikroskop ausgezählt. DAPI-Fluoreszenzanregung: 365nm, (DAPI-Filtersatz)
CTC-Fluoreszenzanregung: 546 nm, (Rhodamin-Filtersatz).
Abb. 1. Nachweis respirierender Zellen in einer Sedimentprobe des Bornhorster Sees. Links:
DAPI-Färbung, Mitte: CTC, rechts: beide Bilder übereinandergelegt.
- 38 -
Isolierung von DNA
Einleitung
Nucleinsäuren können mit verschiedenen Methoden isoliert werden. Die gewählte Methode ist
abhängig von der Art der zu isolierenden Nucleinsäuren und ihrem späteren Verwendungszweck.
Einige einfache Verfahren beruhen auf einem enzymatischen (mit Lysozym) oder mechanischen
(mittels freeze and thaw, Beadbeater, Ultraschall) Aufschluß. Da man mit diesen Methoden i.d.R.
stark kontaminierte Nucleinsäuren erhält, können Reinigungsverfahren, wie z.B. Extraktionen mit
organischen Lösungsmitteln, angeschlossen werden.
Beim Zellaufschluß spielt die Herkunft der Proben eine große Rolle. Bakterienzellen aus Umweltproben sind in einer Sedimentmatrix z.T. vor mechanischen Kräften und Enzymeinwirkungen
geschützt. In Kultur gewachsene Bakterien würden in einem Beadbeater zu großen Scherkräften
ausgesetzt. Neben diesen würde die Wärmeentwicklung zu einer Destabilisierung/Zerstörung der
Nucleinsäuren führen. In diesem Fall ist ein Aufschluß mittels freeze and thaw vorzuziehen, wobei
die Zellen durch plötzliches Einfrieren und Aufkochen physikalisch auseinandergebrochen werden.
Weiterhin ist zu beachten, daß dem mechanischen Aufschluß grampositiver Bakterien eine
Enyzmbehandlung mit z.B. Lysozym voranzustellen ist. Die Zellwand grampositiver Bakterien ist
mit 25 – 40 untereinander verknüpften Peptidoglycanlagen bis zu 10-mal dicker als die gramnegativer. Ihre Zellwand ist mechanisch wesentlich stabiler, die Stabilität nimmt mit dem Verknüpfungsgrad des Peptidoglycans zu. Mittels Lysozym kann die β-1,4-glykosidische Bindung zwischen N-Acetylglucosamin und N-Acetylmuraminsäure, die abwechselnd miteinander verknüpft
das Rückgrat der Mureinstruktur bilden, gespalten werden.
Materialien
-
Biozentrifuge
Gefrierschrank (-70°C)
Heizblock
Chemikalien
-
Lysozym-Lösung (0,8 mg⋅ml-1)
10 mM Tris-HCl, pH 8
10% SDS-Lösung (9,6 ml 20% SDS + 2,4 ml 0,5 M Natrium-Acetat (pH 7,5) + 66,4 ml
ddH2O; autoklavieren)
3 M Natrium-Acetatlösung
Methode
Die in Eppendorfcups bei –20°C eingefrorenen Proben werden aufgetaut und bei 19000 rpm
30 min bei 4°C zentrifugiert. Die Überstände werden verworfen. Den Proben werden 100 µl Lysozym-Lösung sowie 100 µl Tris-HCl zugesetzt. Die Proben werden zehnmal invertiert und anschließend 10 min auf Eis inkubiert. Danach werden 40 µl SDS-Mix und 60 µl NatriumAcetatlösung zugegeben und eine Stunde auf Eis inkubiert.
Für freeze and thaw werden die Proben in 5 Cyclen abwechselnd je 3 min bei –70°C eingefroren
und anschließend aufgekocht. Danach werden die Proben einer Phenol/Chloroform-Extraktion
unterzogen.
- 39 -
„Freeze & Thaw“ – DNA extraction from growing cultures
Procedure:
1)
2)
3)
4)
Harvesting cells:
a.
Transfer 2 ml of liquid culture into a sterile 2 ml – reaction tube (Eppendorf),
centrifuge for 30 min at 4°C and discard supernatant.
b.
Pick up a colony from agar plates / agar shakes and transfer it into a 1.5 ml –
reaction tube
Add 100 µl of TRIS buffer (50 mM, pH 7.4) or water used for PCR mix until you have a
cell suspension
Run five „freeze & thaw“ cycles: -80°C ethanolic bath, 85°C heater, 3 min each
It is recommended to use 2 µl of the fresh DNA extract for PCR (50µl reaction)
Since this is a “quick & dirty” procedure (no DNA stablisation, no DNA purification ect.) extracts
should be used for molecular biological purpose as soon as possible, kept on ice (or in the fridge)
and immediately frozen away after use.
DNA/RNA Extraktion aus Sedimentproben
Um in der PCR Nukleinsäuren als Template einsetzen zu können, ist es erforderlich sich diese erst
einmal zu beschaffen. Dabei spielt nicht nur der Aufschluss der Zellen eine entscheidende Rolle,
sondern auch die Aufreinigung und der Schutz der Nukleinsäuren vor DNasen und RNasen. Bei
Sedimentproben ist dabei ein Aufschluss der Bakterien durch „Freeze and Thaw“ (s. „Freeze and
Thaw“) meistens nicht möglich. Hierfür müssen stärkere Aufschlussmethoden verwendet werden,
da das Sediment den Bakterien einen Schutz bietet. Das Problem bei alternativen Aufschlussmechanismen ist aber nicht der Aufschluss der Zellen, sondern der Schutz der Nukleinsäuren. So
können durch eine zu starke mechanische Beanspruchung die Nukleinsäuren dermaßen geschert
werden, dass eine weitere Untersuchung nicht mehr möglich ist. Zudem müssen die Nukleinsäuren
beim Aufschluss vor DNasen und RNasen geschützt werden, die beim Aufschluss der Bakterien
ebenfalls freigesetzt werden.
Eine Aufreinigung der Nukleinsäuren ist ebenfalls notwendig, da die extrahierten Proben je
nach Sediment sehr viele Huminsäuren oder andere für die PCR inhibierende Substanzen enthalten
können. Eine Aufreinigung kann mittels der Phenol/Chloroform Reinigung erfolgen. Ebenso ist es
möglich Nukleinsäuren über Kits aufzureinigen, was in der Regel Kostenaufwendiger und nicht
unbedingt effektiver ist.
Die Fällung der Nukleinsäuren dient abschließend dazu, die Nukleinsäuren in ein bestimmtes Volumen und geeigneten Puffer aufzunehmen. Nach Abschluss der Extraktion und gegebenenfalls einer Quantifizierung der Nukleinsäuren, steht einer Amplifikation mittels PCR/RT-PCR
nichts mehr im Wege.
Material
-
Beadbeater
Eppendorf-Reaktionsgefäß Ständer
Sterile Kryroröhrchen + Deckel
Kühlfalle
-
- 40 -
Pumpe für die Speed Vac
Speed Vac
Sterile Eppendorf-Reaktionsgefäße (1,5 ml und 2,0 ml)
Sterile Zirkoniumperlen (∅ 0,1 mm)
Tischzentrifuge (Biofuge 13 R)
Wasserbad
Zentrifuge (Biofuge 15 R)
Chemikalien und Lösungen
-
-
-
-
-
-
Chloroform
DEPC behandeltes ddH2O (0,1% Diethylpyrocarbonat (DEPC) in ddH2O lösen und gut mischen. Über Nacht bei 37 °C inkubieren und anschließend autoklavieren. DEPC löst sich vollständig in CO2 und Ethanol auf).
DNase (1 U/µl)
DNase-Puffer (pH 7,5) (40 mM Tris (Base), 6 mM MgCl2 in ddH2O ansetzen, pH-Wert mit
HCl einstellen und autoklavieren)
Ethanol (70 %)
Fällungsmix (125 ml Ethanol (abs.), 5 ml Na-Acetat (3M))
Phenol -Wasser gesättigt- (pH 4,0 und 7,5)
Phenol/Chloroform -Wasser gesättigt- (pH 4,0 und 7,5)
SDS-Extraktions-Mix (9,6 ml 20 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS), 2,4 ml 0,5 M Na-Acetat
(pH 7,5) und 66,4 ml ddH2O in eine 100 ml Pfennigflasche pipettieren und autoklavieren)
TE-Puffer (pH 8,0) (10 mM Tris (Base), 1 mM EDTA in ddH2O ansetzen, pH-Wert mit HCl
einstellen und autoklavieren)
Sämtliche Lösungen sind mit DEPC behandeltes ddH2O angesetzt, um DNasen und RNasen
zu eliminieren
Autoklaviert wird 20 min bei 121 °C
Zellaufschluss mittels Beadbeater
Je 1 g Sediment, 1 g Zirkoniumperlen und 1 ml SDS-Extraktions-Mix werden für jede Probe in
ein Kryroröhrchen überführt. In einem Beadbeater werden die Proben für 1 min geschüttelt (bei
ca. 5.000 rpm), 30 sec gewartet und eine weitere Minute geschüttelt. Das Sediment und die Zirkoniumperlen werden in der Biofuge 15 R abzentrifugiert (5 min, 15.000 rpm). Der wässrige
Überstand wird in ein 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und auf Eis gestellt (dabei
möglichst kein Sediment mit überführen). In das Kryroröhrchen werden 500 µl Phenol (pH 7,5)
hinzupipettiert und ein weiteres Mal dem Beadbeater und der Zentrifuge unterzogen. Der wässrige Überstand wird mit dem Vorherigem vereinigt. Nun werden in das Kryroröhrchen 250 µl SDSExtraktions-Mix und 250 µl Phenol (pH 7,5) hinzugeführt und die Prozedur ein weiteres Mal
wiederholt.
Für eine kombinierte DNA/RNA Extraktion wird der Überstand, bevor er einer Phenol/Chloroform Reinigung unterzogen wird, aufgeteilt.
- 41 -
Phenol/Chloroform Reinigung
Zu der aufzureinigenden Nukleinsäurelösung wird das einfache Volumen an Phenol (pH 4,0 für
RNA und pH 7,5 für DNA) hinzupipettiert. Nach einer Inversion (10 x) und einer Zentrifugation
(13.000 rpm, 2 min), wird die wässrige Phase (in der Regel der Überstand) in ein neues 1,5 ml
Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Die organische Phase und die Interphase beinhalten die Proteine und Huminsäuren die durch diese Reinigung entfernt werden sollen.
Zur wässrigen Phase wird nun das einfache Volumen an Phenol/Chloroform (pH 4,0 für RNA und
pH 7,5 für DNA) hinzupipettiert. Es folgt wieder eine Inversion und Zentrifugation (s.o.). Der
wässrige Überstand wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt (s.o.). Der Probe wird als letztes
das einfache Volumen an Chloroform zugegeben und die Probe erneut wie oben beschrieben behandelt.
Die nun erhaltene wässrige Lösung, mit den gereinigten Nukleinsäuren, wird in ein 2 ml
Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. In der anschließenden Ethanol-Fällung werden die, für die
PCR, störenden Salze entfernt und die Nukleinsäuren in einen geeigneten Puffer aufgenommen.
Ethanol-Fällung
Der Probe wird das 2,6-fache Volumen des Fällungsmixes (immer frisch ansetzen, da Na-Acetat
bei längerer Lagerung ausfällt) beigefügt und die Nukleinsäuren über Nacht bei - 20 °C gefällt
(alternativ 4 h bei 4 °C). Am nächsten Tag werden die gefällten Nukleinsäuren abzentrifugiert
(15.000 rpm, 30 min). Hierbei ist auf eine Ausrichtung der Eppendorf-Reaktionsgefäße zu achten,
damit diese beim nächsten Zentrifugationsschritt ebenfalls in der gleichen Position zentrifugiert
werden. Nach der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und 500 µl 70 %iges Ethanol auf
die Proben zum Waschen gegeben. Es folgt eine erneute Zentrifugation (15.000 rpm, 10 min).
Der Überstand wird verworfen und die Proben werden für 5 - 10 min in der Speed Vac (Unterdruck wird durch eine Pumpe erreicht), bei einer mittleren Temperatureinstellung, zentrifugiert.
Hierdurch wird das restliche Ethanol entfernt. Mindestens 10 min vor Inbetriebnahme der Speed
Vac sollte die Kühlfalle angestellt werden, um die Pumpe vor Flüssigkeiten zu schützen. Die Nukleinsäuren können nach Trocknung in 50 µl TE-Puffer aufgenommen werden. Nach einer Inkubation von 30 min bei Zimmertemperatur können die Proben dann bei 4 °C für den Gebrauch gelagert werden. Proben die längere Zeit nicht benötigt werden und dementsprechend gelagert werden sollen, können wieder im Fällungsmix (2,6 fache Volumen) aufgenommen werden und bei –
70 °C eingefroren werden.
RNA-Extraktion und DNase-Verdau
Um reine RNA zu erhalten ist es notwendig Kontaminationen durch DNA vorzubeugen und/oder
zu entfernen. Dies ist Notwendig, da in einer PCR zusätzlich vorhandene DNA mitamplifiziert
wird. Bei der Extraktion von RNA wird die Phenol/Chloroform Reinigung bei einem pH-Wert
von 4,0 durchgeführt. Bei diesem pH-Wert fällt ein Teil der DNA in der Interphase aus. Die RNA
löst sich dagegen weiterhin vollständig in der wässrigen Phase. Da nach der Extraktion, Reinigung
und der Fällung immer noch DNA in der Probe vorhanden ist, muss die Probe einem DNaseVerdau unterzogen werden, um somit die letzten Spuren von DNA zu entfernen.
Dafür werden die RNA Proben nach der Ethanol-Fällung nicht in TE-Puffer aufgenommen, sondern in 500 µl DNase-Puffer. Weiter werden 5 µl DNase hinzupipettiert und die Proben 60 min
- 42 -
bei 37 °C in einem Wasserbad inkubiert. Anschließend werden die Schritte ab der Phenol/Chloroform Reinigung wiederholt (dient der Entfernung der DNase).
Um später nachzuweisen ob sich noch DNA in den RNA Proben befindet, werden die Proben in
einer PCR eingesetzt. Sollte sich in dieser PCR Nukleinsäuren amplifizieren lassen (RNA wird
nicht amplifiziert), ist die Probe noch mit DNA kontaminiert. Sollten keine Produkte zu erkennen
sein, kann man davon ausgehen, daß die Probe DNA frei ist.
Kurzdarstellung der kombinierten DNA/RNA Extraktion
-
Aufschluss der Zellen im Sediment mittels Beadbeater
Aufteilung der Proben in DNA und RNA Proben
Phenol/Chloroform Reinigung (pH Werte beachten)
Ethanol-Fällung
Aufnahme der DNA in TE-Puffer
DNase-Verdau mit den RNA Proben
Phenol/Chloroform Reinigung (pH 4,0)
Ethanol-Fällung
Aufnahme der RNA in TE-Puffer
Schnelltest zur DNA-Quantifizierung
Je 1 µl Probe wird auf eine EtBr-Platte pipettiert. (1,5 %iges Agarosegel in 1 x TAE Puffer ansetzen und in der Mikrowelle aufkochen. Nach Abkühlung (auf ca. 60 °C) werden 15 µl Ethidiumbromid (10 mg/ml) pro 100 ml Agarose hinzupipettiert und die Agarose in Petrischalen gegossen). Zusätzlich werden je 1 µl Heringssperma in verschiedenen Konzentrationen (z.B. 10, 30, 50,
100, 150 ng/µl) aufgetragen. Unter einem Transiluminator kann der DNA-Gehalt an Hand des
Standards abgeschätzt werden.
DNA extraction from sediments with FastDNA®Spin® Kit
Compared to phenol/chloroform extraction this is a fast but expensive method. A further
advavntage of a kit is, that filters are used for extraction so that the application of toxic
substances such as phenol and chloroform can be minimized. Besides the chemicals, columns and
tubes that are included in the kit four sterile 1.5 ml Eppicaps as well as acetate and ethanol are
needed. Unless otherwise noted an Eppendorf centrifuge is used by 13.000rpm.
− transfer 0,5 g sediment, 918 µl Sodium Phosphate Puffer, 122 µl MT-Buffer, 40 µl
Poly(A)-solution and 20 µl sodiumpyrophosphate-solution to a Lysing Matrix E Tube
− shake the tube slightly for 30 sec and wait two minutes before starting the cell lysis
− the cells are lysed mechanically by a beadbeater at 5000 rpm for 1 min, wait 30 sec before
beadbeating a second time
− centrifugation at 15.000 rpm for 15 min at 4°C
− transfer supernatant in a sterile 1,5 ml Eppi and add 250 µl PPS
− invert 10 times and centrifuge for 5 min
- 43 -
− split the supernatant in two sterile 1,5 ml Eppis and add 500 µl Binding Matrix
Suspension respectively, vortex the Matrix Suspension before addition
− shake the samples 2 min by hand and wait ten minutes, so that the particles can sediment
− remove 350µl of the supernatant and transfer 750µl of the suspended solution to a spin
filter, centrifuge 2 min
− remove filtrate, add the remaining supernatant to the supernatant of the second aliquot and
transfer it to the filter
− centrifugation for 2 min
− remove supernatant, add 500 µl SEWS-M and resuspend cautiously
− remove filtrate
− place the spin filter into a new catch tube (keep the old tube so that the filter can be placed
there later)
− dry the open tube for 5 min under the clean bench
− add 50 µl DES to the filter and centrifuge for 1 min
− transfer the extract to a sterile Eppicap and repeat the DES-step
Usually less than 50ml are needed for amplification. 30µl can be ttransfered to a sterile
Eppendorfcap. After precipitation with 90µl ethanol/ sodium-acetate the DNA can be stored at
70°C.
Protokoll zur DNA-Extraktion aus Flüssigproben
Die Wasserproben wurden über einem 0,2 µm-Polycarbonat-Filter abfiltriert. Im Eppendorfgefäß
wurden dem Filter 0,5 g Zirkonium Perlen, 20 µl SDS 25%, 600 µl Phosphatpuffer und 600 µl
Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol zugesetzt. Um die Zellen aufzuschließen, und um Fremdstoffe
wie Verunreinigungen durch das Probenwasser, sowie Zellbestandteile von der vorhandenen Bakterien-DNA zu entfernen wurde das Eppendorfgefäß drei Minuten gevortext, danach 10 min bei
60°C in einem Wasserbad inkubiert und wieder drei Minuten lang gevortext. Die organische Phenolphase der Probe wurde durch 10 minütige Zentrifugation bei Raumtemperartur und
10.000 rpm von der wässrigen Phasen getrennt. Die DNA befand sich nun in der oberen, wässrigen Phase, die in ein neues Eppendorfgefäß überführt wurde. Zur ursprünglichen Probe wurden
weitere 300 µl Phosphatpuffer zugegeben, erneut eine Minute gevortext und wie vorher 10 min
zentrifugiert. Der wässrige Überstand wurde zum ersten dazugegeben. Den Überständen wurde
nun wieder 1 ml Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol zugesetzt, um die restlichen Verunreinigungen von der DNA zu entfernen. Nach wiederholtem Vortexen und Zentrifugation konnte wieder
der Überstand abgenommen und in ein neues Gefäß überführt werden. Sofern noch ein durch Proteine verursachtes, weißes Präzipitat an der Interphase zu sehen war, wurde der Vorgang mit erneuter Zugabe von 1 ml Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol wiederholt.
Anschließend wurde die wässrige Lösung, in der sich die DNA befand, nach Hinzufügen
von 30 µl Natriumacetat und 2,25 ml Isopropanol über Nacht gefällt. Am nächsten Tag konnte
die DNA der Lösung durch Zentrifugation bei 4°C und 13000 rpm für 30 min pelletiert werden.
Der Überstand wurde abpipettiert und das Pellet wurde mit 1,5 ml Ethanol (70%) gewaschen. Die
Lösung wurde wiederum unter gleichen Bedingungen 10 min zentrifugiert, der Überstand abgenommen und das DNA-Pellet für drei Minuten in der Speed Vac getrocknet. Die präzipitierte und
getrocknete DNA wurde in 50 µl PCR-Wasser aufgenommen und stand für weitere molekularbiologische Untersuchungen zur Verfügung.
- 44 -
Quantifizierung von DNA mit Pico Green
Je 1 µl Probe werden in 899 µl TE-Puffer aufgenommen. Zur Quantifizierung werden zu jeder
Probe 100 µl Pico Green Reagenz (Pico Green 1:40 in TE-Puffer angesetzt) hinzupipettiert. Mittels eines Blindwertes und eines Standards (Blindwert: 900 µl TE-Puffer + 100 µl Pico-Green
Reagenz; Standard: 899 µl TE-Puffer + 1 µl Heringssperma (100 ng/µl) + 100 µl Pico Green
Reagenz) kann der DNA Gehalt in der Probe bestimmt werden. Dabei werden die Proben in einem Spektrofluorophotometer (Shimadzu) bei einer Extinktion von 460 nm und einer Emission
von 540 nm gemessen. Das Gerät liefert dabei Werte in ng/µl. Hierbei ist darauf zu achten, daß
der Standard nicht von 100 ng/µl abweichen sollte (im Ergebnis). Vor der Messung müssen die
einzelnen Proben nach Zugabe des Pico Green Reagenz gevortext und 5 Minuten dunkel inkubiert werden.
Während der gesamten Messung ist mit Handschuhen und Kittel zu arbeiten. Die Abfälle werden im Färbeabfall entsorgt.
DNA-Quantification via a Microtiter plate reader
Since it is necessary to know the accurate amount of DNA for sequencing, Real-Time PCR and
DGGE, you have to quantify them. The quantification is carried out by using the DNAfluorescence dye PicoGreen as well as the fluorescence reader. The calculation is carried out via a
calibration line resulting from defined concentrations of DNA.
1) Pipette the following DNA-standards
DNA-concentration
100 ng/µl
50 ng/µl
25 ng/µl
0 ng/µl
TE-buffer
pH 7.5
99 µl
99 µl
99 µl
100 µl
DNA-stock solution
1 µl
1 µl
1 µl
0 µl
PicoGreen 1:200 diluted in TEbuffer pH 7.5
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
2) Pipette the DNA-samples
TE-buffer
pH 7.5
99 µl
1)
2)
3)
4)
DNA-sample
1 µl
Pipette Pico Green PicoGreen not until measurement
Incubation of 5 min in the reader
Turn on the microtiterwellreader
Turn on the computer
Start program FLUOstar Optima
Push the button “Test Protocols”
Test name: „Reinhard Versuch“
Settings:
PicoGreen 1:200 diluted in TEbuffer pH 7.5
100 µl
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a) Basic parameters
Test name: „Reinhard Versuch“
Microplate: Nunc F96 Microwell 96
Positioning delay: 0.1
Number of kinetic windows: 1
Number of cycles: 3
Measurement start time: 0.0
Number of flashes per cycle: 20
Cycle time: =variable (depends on the number of samples)
x fluorescence intensity
Number of multichromatics: 1
Excitation filter: 485 nm
Emission filter: 520 nm
Gain: =variable (depends on the highest DNA concentration)
Start: 1
Stop: 1
Pause before cycle: 0
b) Layout
Record the adjustment of your samples- and standards on the plate and push the
button „check timing“
5) Push the „traffic light“ button -> Push Test name: „Reinhard Versuch“
6) Start the measurement by pushing the button „Start test run“
7) Reporting
Push the „Excel“ button -> choose your test name („Reinhard Versuch“) -> Recording of
the raw data
- 46 -
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Introduction:
Specific DNA sequences are amplified by the Polymerase Chain Reaction. In the first step doublestranded DNA is denatured at 94°C – 96°C. In the next step, specific primers (oligonucleotides)
bind to the single- stranded DNA (annealing temperature 50-65°C). Two different primers that
match the 5énd and the 3ènd of the target DNA sequence (template) are used. In the third step
the primers are elongated by a thermostable polymerase at 72°C. By repeating this procedure
several times the amplification is nearly exponentially, because the original DNA as well as its
copies is multiplied.
RT-PCR is a method which does not amplify DNA but RNA. As the Taq. Polymerase can
only elongate DNA an additional step is required: The Reverse Transcriptase (RT) transcribes
RNA to complementary DNA (cDNA) and is then amplified via PCR.
Procedure:
The solutions, tubes and tips must be free of DNA/RNA, because DNA from the outside is
amplified exponentially as well. Therefore a contamination must be excluded by using a negative
control without template. An additional positive control (known template) is needed to control
the PCR procedure.
Furthermore all solutions, tubes and tips must be DNase and RNase free, so that the nucleic acids
are not degraded.
exemplary PCR procedure:
solution
H2O (Ampuwa, PCR-water) from Fresenius
10fach konz. PCR Puffer für RedTaq from Sigma
dNTP-solution (contains 2,5 Mm of each
deoxynucleosidetriphosphate solution)
Primer 1 (10 pmol/µl stock-solution)
BSA (10 mg/ml)
MgCl2 (20 mM)
RedTaq-Polymerase from Sigma (1U/µl)
DNA (ca. 50 ng/µl)
total volume:
−
−
volume [µl]
35
5
4
1
1
1
1
1
1
50
dilute the DNA/RNA extract with PCR-water if the concentration is too high
the 10x PCR-buffer contains Tris-HCl (pH 8,7), KCl, 12,5 mM MgCl2,
0,01 % (w/v) Gelatine, (NH4)2SO4, DTT.
−
prepare
the
dNTP-solution
with
10mM
stock
solutions
of
the
deoxynucleosidetriphosphates (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) at a ratio of 1:1:1:1
−
exemplary primer-pair for 16S rRNA:
a) primer GC357f (universal eubacteria primer) (sequence: 5'-CGC CCG CCG CGC CCC GCG
CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CCC TAC GGG AGG CAG CAG-3')
b) primer 907r (universal primer) (sequence: 5'-CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT-3')
target is a fragment of 626bp (based on E. coli) within the 16S rRNA gene
− the GC-clamp at the 5ènd of the amplicons is necessary for separating the DNA via DGGE
- enzyme: RedTaq DNA Polymerase: 1 Unit/µl
- 47 -
exemplary RT-PCR-procedure:
solution
volume [µl]
H2O (RNase free water) from Qiagen
5x RT-PCR buffer from Qiagen
RT-PCR dNTP-solution (contains 2.5 mM of each
deoxynucleosidetriphosphate) from Qiagen
BSA (10mg/ml)
RT-PCR enzyme-mix (1U/µl) from Qiagen
RNA (ca. 50 ng/µl)
total volume:
−
−
−
−
32
10
2
1
1
1
2
1
50
dilute the DNA/RNA extract with PCR-water if the concentration is too high
Der 5fach konzentrierte RT-PCR-Puffer enthält Tris-HCl (pH 8,7), KCl, 12,5 mM MgCl2,
0,01 % (w/v) Gelatine, (NH4)2SO4, DTT
the same primers are used like above
RT-PCR enzyme-mix: Omniscript and Sensiscript Reverse Transcriptase and HotStarTaq
DNA- Polymerase
For more than one PCR a “Mastermix”is time-saving: All solutions (except the template) are
transferred to an Eppicap. The final step is to add the polymerase. For x reactions the volume for
x + 1 reaction of the recommended solutions are transferred to the Eppicap and mixed. After
transferring 49µl Mastermix to the 0,25ml PCR-tube, add 1µl template. The template is amplified
automatically by a PCR-thermocycler.
exemplary temperature programs:
PCR: 16S-rDNA-Amplifikation
RT-PCR: 16S-rRNA-Amplifikation
1 cycle
Denaturation
96 °C, 4 min
1 cycle
Reverse
Transcription
50 °C, 35 min
10 cycles
Denaturation
96 °C, 30 sec
1 cycle
Denaturation
96 °C, 4 min
Annealing
62 °C, 45 sec
10 cycles
Denaturation
96 °C, 30 sec
Elongation
72°C, 1 min
Annealing
62 °C, 45 sec
96 °C, 30 sec
Elongation
70 °C, 1 min
20 - 30 cycles Denaturation
Annealing
57 °C, 45 sec
Elongation
72 °C, 1 min
20 – 30 cycles Denaturation
96 °C, 30 sec
Annealing
57 °C, 45 sec
Elongation
70 °C, 1 min
When the second annealing temperature is lower than the first one, the PCR is called StepDown or Two-Step-PCR
In a terminal step the temperature is kept at 72°C for 10 min, so that interrupted elongations of
the last cycle can be completed..
After PCR procedure all samples are kept at 4°C
Samples can be kept at 4°C or analysed directly via agarose gelelectrophoresis.
- 48 -
The PCR Song There was a time when to amplify DNA,
You had to grow tons and tons of tiny cells.
Then along came a guy named Dr. Kary Mullis,
Said you can amplify in vitro just as well.
Just mix your template with a buffer and some primers,
Nucleotides and polymerases, too.
Denaturing, annealing, and extending.
Well it’s amazing what heating and cooling and heating will do.
PCR, when you need to detect mutations.
PCR, when you need to recombine.
PCR, when you need to find out who the daddy is.
PCR, when you need to solve a crime.
Video at: http://bio-rad.cnpg.com/lsca/videos/ScientistsForBetterPCR/
Agarose gelelectrophoresis
DNA fragments of 200 – 50.000 bp are separated by agarose gelelectrophoresis due to their size.
Negatively charged DNA molecules move through an agarose matrix with an electric field.
Shorter molecules move faster and migrate further than longer ones. The movement decelerates
logarithmically according to the number of base-pairs. After the electrophoresis the separated
fragments are stained with ethidium bromide. This is an intercalating fluorescent dye, which
is mutagen and carcinogen, so that gloves and a lab coat are required.
Preparation of agarose gels
The gels are prepared in Plexiglas trays which have only two opposite side walls so that the gel is
in contact with the electric field. Before preparation the open sides must be sealed with tape. A
standard gel contains 1,5 % (w/v) agarose which is dissolved in 40 ml 1xTAE buffer. The agarose
is dissolved in a microwave oven until the solution is clear. The solution is then poured into the
tray and a comb is inserted so that gaps are developed for the PCR products. After 20 min the gel
becomes solid and the comb and tape can be removed cautiously.
1x TAE buffer: 40 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane; 1 mM EDTA, pH 7,4 adjusted with
acetate
- 49 -
Electrophoresis
The tray is transferred to the electrophoreses chamber which contains 1x TAE buffer. Make sure
that the gel is covered entirely with buffer.
1 µl 6x loading-buffer is pipetted on a piece of Parafilm and mixed with 5µl PCR product. This
mixture is then transferred to the gel. 1.5µl standard solution (concentration 125ng/µl) are applied
to the gel. The electrophoreses is carried out at 100V for 40 min (or 90V for 45min). Pay
attention that the correct polarity is choosen.
Loading buffer: 0,25% (w/v) brome phenol blue 40% (v/v) glycerine in 1x
TAE
After the electrophoresis the gel is stained for 20 min in an ethidium
bromide solution (0,8µg/ml). The documentation is done with a
transilluminator.
Purification of PCR products
The PCR products will be purified using the PCR-Kombi purification kit (Seqlab) and a
centrifuge. Before starting with the purification procedure place a Spin filter into a 2 ml Receiver
vessel.
1. Binding of the PCR products
Mix 500 ml Binding buffer thoroughly with the PCR sample by pipetting or vortexing. Transfer
that solution completely onto a Filter cartridge and centrifuge for 2 minutes at 10,000 x g.
Discard the Receiver vessel with the flow-through.
If the volume of the PCR reaction is higher than 50 µl, split the PCR Mix and add 500 µl
Binding buffer to each part. Load both mixes one after the other onto the Filter cartridge.
Centrifuge the first part for 1 minute and discard the filtrate. Centrifuge the second part of the
mixture for 2 minutes. Then carry on with the elution step.
2. Elution of the PCR products
Place the Filter cartridge into an Elution vessel. Pipet at least 10 µl Elution buffer (or ddH2O)
directly onto the centre of the Filter membrane. (For concentrating the PCR fragments it is
possible to perform the elution with a lower volume of Elution buffer than the volume of the
initial PCR mixture. The minimum volume is 10 µl. Incubate for 1 minute (best is 5 – to
increase the normally already high final DNA yield further, an extended incubation time for up
to 5 minutes is recommanded) at room temperature, then centrifuge for another minute at
5,000 x g. The Elution vessel now contains the purified PCR product.
- 50 -
DNA-sequencing via Sanger (Chain-abruption method)
using the LiCor DNA Sequencing System 4200 of MWG Biotech
Preliminaries
The sequencing reaction via Sanger is a PCR-like methode using just one primer. Since the use of
several cycles of temperatures is also necessary, it is spoken of „Cycle Sequencing“. In order to
encode one single sequence, four different approaches are necessary, each of them containing
another didesoxynucleotide (ddNTP) (= chain abruption nucleotide). The reaction approach
contains up to 3% of the „general“ dNTP`s. All ddNTP`s are incorporated just like the „general“
dNTP`s by using the DNA-polymerase. However, the ddNTP`s induce a chain abruption because
of the lack of the OH-group on the 3`-end. Depending on a statical distribution of the
incorporation of ddNTP`s, you will obtain a mixture of DNA fragments with a distinct length
ending with a particular nucleotide (e.g. the nucleotide of the ddATP approach is an A). (see
figure beneath)
The four different approaches will be plotted next to each other on a gel and in the
following the mixture of DNA-fragments will be separated due to length by electrophoretic
separation (short fragments running faster than the long ones). The detection of the DNA bands is
carried out via computer controlled laser and is possible because of the flourescence excitation of
the bands. The comparison of the band running length of the four approaches results in the
uncovering of the unknown sequence. Finally, the sequence will be transmitted into a internet data
bank (e.g. EMBL, RDP) and compared with known sequences.
Material
Equipment:
Thermocycler
LiCor DNA Sequencing System 4200
Chemicals and reagents:
DYEnamic Direct Cycle Sequencing Kit (Amersham)
Sequencing primer (IRD-marked)
Stock solutions:
TBE-buffer (10 ×)
Tris Base (890 mM)
Boric Acid (890 mM)
Na2EDTA × 2H20 (20mM)
H20 (dest.)
Working solution:
Gel solution:
dest H2O
Urea NF
10x TBE-buffer
"Long Ranger 50% gel solution"
108
55
7.44
ad. 1
g
g
g
l
14.5 ml
12.6 g
3.6 ml
4.5 ml
- 51 -
Fig. Scheme of the sequencing principle after Sanger.
Procedure
Sequencing reaction
The sequencing reaction is carried out via DYEnamic Direct Cycle Sequencing Kit (Amersham).
For one single sample you will need four 0.2 ml tubes in order to pipette all four nucleotides
(G, A, T, C). The DNA-sample (volume = 2 µl) will be transfered in each of the four tubes.
Afterward you prepare the master mix (for each sample you need: 1 µl of ddNTP`s + 2 µl of IRDlabeled primer. One aliquot of the master mix contains a volume of 3 µl and will be transfered into
your sample tube. Finally, the tubes will be put into the cycler and the you can start the run. (The
program depends upon your primer.)
Sequencing-program:
Temp.[C°]
95
95
*
72
4
Time [min]
5
0.5
0.5
1
∞
Cycles [n]
1
30
*The annealing-temperature depends upon the melting temperature (TM) of the primer you use.
- 52 -
After the completion of the program, you add 5 µl formamide loading buffer to each approach
and spin up the samples by using the centrifuge. Before plotting the samples onto the gel, you
have to denature them using a temperature of 70 °C (5 min). Afterwards you put the tubes
immediatly on ice-water in the dark until you start plotting the gel.
Electrophoresis using the LiCor DNA Sequencing System 4200
Prearrange the glass plates:
In order to carry out the electrophoresis, you have to put together the „Gel-Sandwich“ (length:
33cm, thickness: 0.25 mm). Wear gloves and a lab coat while working (acrylamide is
carcinogenic). The glass plates are marked in order to identify the interior and outerior plates.
Spill the plates using SDS (25%), ddH2O and ethanol (98%). You have to remove ethanol
completely because it constricts the polymerization of acrylamide.Afterwards, put the glass plates
in the brackets of the equipment.
Casting the gel:
Prepare the gel solution not until casting the gel (under the flume hood). Mix the chemicals using
the protocol in the beaker on a magnet stirrer. Add TEMED (20 µl) and APS (200 µl) to start the
polymerization of the gel and Pipette the gel through a 0.2 µm filter between the horizontal glass
plates using a 50 ml syringe. Avoid the formation of air bubbles by knocking gently on the glass
plates. Afterwards attach the precomb into the gel. The complete polymerization time lasts 1.5
hours.
Install the „Gel sandwich“:
After polymerization is done, you have to pull out the precomb and clean the upper border of the
gel. Clean the glass plates in the scope of the detector using ethanol. Install the „gel-Sandwich“
into the sequencer and mount the upper and lower buffer chamber. Fill both chambers with 1 x
TBE-buffer (ca. 1 l) up to the check mark and flush the gel slote with TBE-buffer using a syringe.
Finally mount the cover and the electric cable carefully. You can find further information in „DNA
Sequencing and Genetic Analysis Manual“, section „Gel preparation and Electrophoresis“.
Electrophoresis settings:
Voltage
Amperage
Power
Temperature
Motor speed
Signal Channel
Frames
1500 V
35 mA
45 Watt
50°C
2
2
25
Loading the gel:
Stop the electrophoresis after the prerun is done. Take off the cover of the upper buffer chamber
and spill the gel slots a second time. Attach the comb (64-sharkstooth-comb) to the gel. Denature
the samples (70°C, 3-5 minutes) and store them on ice before plotting them onto the gel using a
8-channel-Hammilton syringe (max. 0,8 µl sample for every single slot). Cover the buffer chamber
and start the electrophoresis. The run lasts 5-10 hours. The generated data will be stored
automatically.
- 53 -
Denotation of the bases and ambiguities according to the IUPAC glossary:
IUPAC Bedeutung Komplement
A
A
T
C
C
G
G
G
C
T/U
T
A
M
A, C
K
R
A, G
Y
W
A, T
W
S
C, G
S
Y
C, T
R
K
G, T
M
V
A, C, G
B
H
A, C, T
D
D
A, G, T
H
B
C, G, T
V
N
G, A, T, C
N
DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
The DGGE is a molecular technique used to separate different DNA sequences of the same length
from each other. The separation is carried out via a polyacrylamidegel composed of a gradient of
denaturing agens (urea and formamide). Diverse DNA sequences run in a different way from each
other resulting in a separation due to the amount of GC and generating melting domains (Muyzer
et al. 1993).
I. Materials
DGGE-Equipment (Ingeny)
a) Gel
- Urea
DGGE-Apparatur
- Formamide
- 50 x TAE buffer pH 7,4 (242 g Trisbase, 57.1 ml konz. Acetic acid, 100 ml 0.5 M EDTA pH
7.4, fill up to 850 ml using ddH20 (pH 7.4) Volumen mit ddH20 auf 1 l auffüllen.
- Acrylamide/Bisacrylamide 40 %ig (37.5:1)
- ddH20
- 10 % Ammoniumpersulfate (APS)
- Tetramethylethylendiamine (TEMED )
- Loading buffer
b)
-
Ethanol 70%
3 x 50 ml Beaker
Cannula (yellow) and tubes
2 Glasplates (1x block out at the top, 1x block out at the bottom)
-
- 54 -
Spacer (U-shaped)
casting equipment (= electrode chamber)
Comb (20 - 48 choppers)
Srew conservation
Gradient mixer
DGGE-Equipment
Magnet stirrer
c) Staining
Gradientenmischer
-
2 black tanks
1000 ml 1 x Sybr Gold dye solution (100 µl Sybr Gold (10.000 x concentrated) will be diluted
in 1000 ml 1 x TAE-buffer pH 7,4)
1000 ml ddH2O
Gel beam (UV-permeable)
Shaker
II. Prearrangement
Work neatly:
- Clean the glas plates, the spacer and the comb using ddH2O and ethanol.
- Combine the glas plates with the spacer and the screw protection.
- Mount the glass plates into the inductor.
- Put the comb between the glas plates.
- Stick together the tubes of the gradient mixer.
- Put the magnetic stirrer into the first chamber and the contrary volume (tube) inton the retral
chamber.
- Start the magnetic stirrer.
- Prepare 3 beakers, APS, TEMED as well as the stock solutions (refrigerator).
III. Casting the gel
-
Set up the gel solution in the beakers under the fume hood and mix them slightly.
Add APS and TEMED on the verge of casting the gel (Add APS and TEMED to the 0%
solution later on).
Transfer the lower concentrated solution into the posterior chamber of the gradient mixer.
Open the plug quickly in order to remove air bubbles.
Transfer the higher concentrated solution into the anterior chamber of the gradient mixer.
Don`t put the cannula on the tube yet, because of the resistance will be to high.
Afterwards, put the cannula onto the tube.
Putt he gradient mixer onto the magnet stirrer. Hold the tube as high as possible (at least
higher than the gradient mixer is situated).
Connect both chambers by turning over the plug.
-
-
-
- 55 -
Clamp he cannula between the both glas plates and let the gel run between them. Thereb you
should notice the mixture of both solutions in the anterior chamber of the gradient mixer
(Formation of striae).
Let the complete solution drop out of the tube. Thereby, you have to take care that the
cannula doesn`t dip into the gel and that the gel solution doesn`t reach the comb during the
casting. Preliminarily, you have to remove the cannula and let the residual solution drop out
into a beaker.
Add APS and TEMED to the 0% solution.
Absorb the solution using a 10 ml syringe and put a cannula onto it.
Pipette the solution carefully on one side onto the gel. Change sides. Take care that the
gradient doesn`t reach the comb.
Cast the gel up to the border of the plates, so that the gel will almost overflow.
Wait at leat 2-4 hours until the gel is polymerized.
Spill all beakers, tubes and equipment you have used with ddH2O.
Stock solutions 0% and 80%:
Substance
Urea
Formamide
50 x TAE, pH 7,4
Acrylamide/Bisacrylamide
Fill up with ddH2O
Stock solution 0 % denaturing
3.0 ml
22.5 ml
150 ml
Stock solution 80 % denaturing
50.4 g
48 ml
3.0 ml
22.5 ml
150 ml
Gel solutions: e.g. gradient of 50-70%
Substance
Gel
Low concentrated
(50 %)
9 ml
15 ml
24 ml
High concentrated
(70 %)
3 ml
21 ml
24 ml
Stock solution 0 %
9 ml
Stock solution 80 %
End volume
9 ml
Add on the verge of use:
TEMED
8 µl
17 µl
17 µl
APS (10 %)
100 µl
86 µl
86 µl
If you use another gradient you have to mix up the stock solutions in a different proportions to
each other. The end volume of the gel solutions need to be a volume of 24 ml. The amounts of
TEMED and APS stay the same no matter which gradient you use.
IV. Loading the gel and electrophoresis
-
-
Produce 17 l loading buffer directly in the electrophoresis chamber using the stock solution
(50xTAE). You just have to exchange 5 l loading buffer for further runs. In order, you have
to remove 5 l used buffer and produce 5 l new buffer using the stock solution (50 x TAE) and
fill up the DGGE chamber.
Attach the chamber cover.
Put the casting equipment with the gel into the electrophoresis chamber at least 1.5 hours
before loading the gel.
-
-
- 56 -
Connect the plugs of the electrophoresis and the pump to the casting equipment and turn on
the Low Voltage (LV) suplly. Let the buffer heat up to 60°C.
While heating up the buffer, you have to prepare the PCR samples to load the gell ater on.
Possibly you have to purify your samples (Purification of PCR-products). Endvolume max. 40
µl.
Load the gel using a „Hamilton“ syringe with max. 40 µl for every single gel slot. Flush the
syringe after the loading of each sample.
Pipette 5 µl loading buffer into the empty slots.
Pipette 10 µl DGGE-standard (mixture of 16S rRNA products of pure cultures).
Turn on High Voltage (HV) up to 100 V.
The running time is 20 hours.
V. Analysing the DGGE gel
-
Turn off the voltage.
Take the gel out of the DGGE brackets and release the screws.
Take off the upper glass plate carefully.
Take off the DGGE spacer and mark one edge of the gelb y cutting them in order to
remember the loading direction later on.
Put the gel bracket into the staining tank and fill in the staining solution.
Transfer the gel into the staining tank by inverting the glas plate with the gel and holding it
into the staining solution.
Use 1 x Sybr Gold staining solution in order to stain the DNA (light sensitive!)
Cover the staining tank with the another black tank.
Shake slightly 1-2 hours.
Transfer the staining solution back into the bottle (the solution can be used several times).
Cover the gel with ddH2O and incubate it 15 minutes.
Document and save the gel parameters on the UV/blue light table using a documentation
program.
Wear cloves and a lab coat during
staining procedures!
- 57 -
Fluorescence-in situ-Hybridization (FISH)
using rRNA probes to detect distinct phylogenetic groups
Introduction
Fluorescence in situ hybridization (FISH) with rRNA-targeted oligonucleotide probes has
developed into an invaluable molecular tool in the late 80ìes (Giovannoni et al., 1988; DeLong et
al., 1998; Amann et al., 1990) and is now a well-established technique. It is a method for the
rapid and specific in situ identification of prokaryotes (bacteria and archaea) on different
phylogenetic levels independent of whether or not they can be cultured. FISH is a staining
technique using fixed cells and the technique of microscopy. The selectivity of staining is based on
the particular organisation of the ribosomal RNA. Due to comparative sequence analyses, it is
possible to identify scopes on the samll subunit of the ribosomal RNA (16S or 18S rRNA) which
are consistent on distinct phylogenetic levels (class up to domain). The gene sections of 18 base
pair length provide the target sequence for the oligonucleotides labeld with a fluorescence dye
(e.g. Cy3).
Primarily, the cells of pure cultures or bacterial communities from environmental samples
will be fixed on a microscope slide. Afterwards, the cells will be touched and entered by the
oligonucleotide probe that hybridizes on the target sequence of the ribosomal RNA. In addition, it
is necessary to check out particular conditions of every single probe. After the hybridization is
done, non-specific probes will be washed off and the cells will be labeld using a conventional dye
like DAPI. Finally, the samples will be analysed by epifluorescence-microscopy. The option of
different microscopic filters allows for the discrimination of non-specific (DAPI) and specific
(FISH) labeld cells. Anyway, some problems could occur. Frequently, it could be that cells of
natural environmental samples possess a lower amount of ribosomes and therefore a lower
fluorescence. Also, interfering compounds of the sampling site that are characterized by their own
fluorescence (e.g. sediment or precipitations) could have an disturbing effect on the hybridization.
Further information can be gained from review articles (e.g. Amman & Ludwig, 2000).
Materials
Equipment:
Microscopic slides, Epoxy-coated, 8 chambers, ∅ 6mm
Hybridization chambers (Greiner Röhrchen or Falcon Tubes)
Hybridization oven, Water bath, Block thermostat
3 Staining chambers
Fluorescence microscope with DAPI- and Cy3-filter
Washing chambers (Greiner Röhrchen or Falcon Tubes)
Chemicals and reagents:
Oligonucleotide probes, Cy3 labeld
Fixed cells of pure cultures to test the specificity of the probes
Stock solution: NaCl-Stock solution (5 M), autoclaved:
1000 ml = 292.2 g NaCl
100 ml = 29.22 g NaCl
- 58 -
Tris/HCl-Stock solution (1 M, pH 7.2), autoclaved:
1000 ml = 157.6 g Tris/HCl
500 ml = 78.8 g Tris/HCl
SDS-Stock solution (1%), sterile filtrated:
100 ml = 1g SDS
Working solutions:
Hybridization buffer with 35% formamide:
Formamide
17.5 ml
3.5 ml
350 µl
NaCl (5 M)
9 ml
1.8 ml
180 µl
Tris/HCL (1 M)
1 ml
0.2 ml
20 µl
SDS (1%)
0.5 ml
0,1 ml
1 0 µl
H2O bidest.
22 ml
4.4 ml
440 µl
175 µl
90 µl
10 µl
5 µl
220 µl
Washing buffer with 35% formamide (80 mM NaCl):
NaCl (5 M)
16 ml
8 ml
Tris/HCL (1 M)
20 ml
10 ml
SDS (1%)
10 ml
H2O bidest.
ad. 1000 ml
5 ml
ad. 500 ml
Concentration of NaCL in the washing buffer using different concentrations of formamide
in the hybridization buffer:
Formamide in the
NaCl in the
hybridization buffer [%]
washing buffer [mM]
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
900
636
450
318
225
159
112
80
56
40
28
20
14
10
7
5
3.5
- 59 -
Procedure:
Prepare microscope slides:
Coat the slots of the microscope slides (8 chambers, ∅ 6mm) with coating solution and dry them
on air
Plot the samples:
Plott the cell or sediment suspension (3-4 µl) into the slots of the coated microscope slides and
dry them on air (15 min). If you use environmental samples, you can use up to 10 µl of sample.
Lysozyme treatment (use only for gram-positive bacteria):
Pipette 10 µl of lysozyme solution (10 mg/ml PBS-buffer = 1% lysozyme) and incubate at room
temperature for 15 min (use a cup as dust protector). Wash off the lysozyme solution using
ddH2O.
Prepare hybridization chamber (falcon tube):
Put parts of pulp into the tube and pipette hybridization buffer (1.5 ml) on in. Afterwards, put the
tube into the hybridization for 30 min and incubate at 46 °C in order to adjust a continous vapor
pressure.
Ethanol treatment in the staining chamber:
Put the microscope slides into the first ethanol bath (50%, 3 min). Afterwards, put the slides into
the second ethanol bath (80%, 3 min) and finally, putt he slides into the third ethanol bath (9698%, 3 min). Dry the slides on air. The ethanol baths can be used several times.
Hybridization of the samples:
You need 7 µl hybridization buffer for every single approach (prepare fresh) and 1 µlprobe 850
ng/µl). Prepare the master mix for the appropriate amount of sample and preheat them (46°C).
Afterwards, pipette the hybridization solution (8 µl for every sample) into the slots. Put the
microscope slides carefully into the hybridisation chambers and incubate them (46°C, 2 h).
Stop the reaction:
Put two microscope slides in one Falcon tube (back on back) with cold water, sway it and discard
the water.
Remove non-specific probes:
Put two microscope slides in one Falcon tube (back on back) with preheated washing buffer and
sway them (48°C, 20 min). Discard the washing buffer, flush the microscope slides with ddH2O
and dry them on air.
Incorporation and anti staining:
Pipette 1 µl of Vecta Shield solution into every single slote. Put a cover glas onto the microscope
slide and microscope after ca. 5 min or sore the slides in the dark.
- 60 -
CARD (CAtalyzed Reporter Deposition)-FISH
(Sekar et al. 2003 ; modifiziert durch Ishii et al. 2004)
Einleitung
Da sich nur ein sehr geringer Anteil aller in situ vorkommenden Mikroorganismen im Labor kultivieren lässt (ca. 1%, Amann et al. 1995), kommt der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)
und ihrer Weiterentwicklung (CARD – CAtalyzed Reporter Deposition) eine besondere Stellung
im Rahmen der Identifizierung und Beschreibung mikrobieller Gemeinschaften zu. Mit HorseRadishPeroxidase (HRP) markierte Oligonukleotidsonden werden an komplementäre 16S-rRNAFragmente gebunden und fluoreszenzmarkierte Tyramidmoleküle am Reaktionszentrum des Enzyms in Radikale umgewandelt. Aufgrund der Anlagerung dieser fluoreszenzmarkierten Radikale
an Proteinstrukturen innerhalb der Zelle kommt es zur Akkumulation des Fluoreszenzfarbstoffes
und damit zur Verstärkung des Fluoreszenzsignals (Pernthaler et al. 2002, siehe Abbildung 1).
Abbildung 1
Prinzip der CARD-FISH-Technik
Methodik
1) Einbetten
1. Probe abfiltrieren (Polycarbonat-Filter, matte Seite nach oben), Filter mit Bleistift beschriften
2. Filter in 0.2% low gelling point agarose (in PBS 1x, handwarm, sonst Zellschädigung)
eintauchen
3. Filter auf Rundfilter trocknen lassen (Achtung: Filtrationsseite nach oben!)
4. Dehydrierung in Ethanol (96%) bei RT für 1 min.
5. Filter auf Rundfilter lufttrocknen lassen
- 61 -
2) Permeabilisierung
Lysozym
1.
2.
3.
4.
5.
Lysozym lösen (10 mg/ml) in 0.05 M EDTA (pH 8.0) und 0.1 Tris-HCl (pH 7.4)
Inkubation in Lysozymlösung bei 37°C mind. 60 min.
Waschen des Filters in stf. ddH2O 1 min. bei RT
Filter in EtOH (96%) überführen, 1 min. bei RT inkubieren
Filter auf Rundfilter lufttrocknen lassen
Achromopeptidase
1.
2.
3.
4.
5.
2 µl Achromopeptidase in 1 ml Puffer (0.01 M NaCl, 0.01 M Tris-HCl, pH 8.0) geben
Inkubation in Achromopeptidase-Lösung mind. 30 min. bei 37°C
Waschen des Filters in stf. ddH2O 1 min. bei RT
Filter in EtOH (96%) überführen, 1 min. bei RT inkubieren
Filter auf Rundfilter lufttrocknen lassen
Für Sedimentproben Inaktivierung end. Peroxidasen und Cytochrome mit 0.15% H2O2 in
Methanol (30 min., RT)
3) Hybridisierung
1. Filter teilen und entsprechend der verwendeten Sonde mit Bleistift beschriften
2. Eppicap (0,5 ml) vorbereiten mit 400 µl Hybridisierungspuffer + 1,3 µl Sondenlösung
(50 ng/µl)
3. Filter in Eppi überführen (max. 6-10 Filterteile möglich)
4. Inkubation im Rotationsschüttler mind. 2 h bei 35°C (Inkubationsdauer und temperatur abhängig von Formamidkonzentration)
5. Filter in vorgewärmtem Waschpuffer 30 min. bei 37°C waschen
Tabelle 1
Verwendete CARD-FISH-Sonden
Probe
Target
Sequence (5’-3’) of probe
FA (%)a
Reference
EUB338
NON338
DSB985
DSR651
GCT GCC TCC CGT AGG AGT
ACT CCT ACG GGA GGC AGC
CAC AGG ATG TCA AAC CCA G
CCC CCT CCA GTA CTC AAG
55
55
(20)
55
Amann et al. (1990)
Wallner et al. (1993)
Manz et al. ( 1998)
Manz et al. ( 1998)
DSS658
DSV698
Bacteria
None (negative control)
Desulfobacter / D’bacula
Desulforhopalus, some D’bulbus,
D’bacterium, D’capsa
Desulfosarcina- related bacteria
Most Desulfovibrio spp.
TCC ACT TCC CTC TCC CAT
GTT CCT CCA GAT ATC TAC GG
60
40
DSV698c
Competitor to DSV698
GTT CCT CCA GAT ATC TAC GC
40
Manz et al. ( 1998)
Manz et al. ( 1998);
Mußmann et al.
(2005)
Manz et al. ( 1998);
Mußmann et al.
(2005)
Sahm et al. (1999)
Sval428
CCA TCT GAC AGG ATT TTA C
Desulfotalea spp.
a
Formamidkonzentration im Hybridizierungspuffer
(25)
- 62 -
4) Thyramid-Signal-Amplifikation
1.
2.
3.
4.
5.
Inkubation in 15 ml PBS-Triton 15 min. bei RT
Inkubation im Substratmix 30 min. bei 37°C im Dunkeln im Rotationsschüttler
Inkubation in 15 ml PBS-Triton 15 min. bei RT
Waschen des Filters in ddH2O 1 min. bei RT
Filter in EtOH (96%) überführen, 1 min. bei RT inkubieren, auf Objektträger überführen und lufttrocknen lassen
5) Gegenfärbung mit DAPI
6) Lösungen
1. Lysozymlösung (10 mg/ml)
Lysozym lösen in 0,5 M EDTA (pH 8.0) und 0,1 M Tris-HCl (pH 7.4)
2. Achromopeptidase (10 mg/ml)
2 µl Achromopeptidase in 1 ml Puffer (0,01 M NaCl, 0,01 M Tris-HCl, pH 8.0) lösen
3. Hybridisierungspuffer
0,9 M NaCl
20 mM Tris-HCl (pH 7.4)
10% w/v Dextransulfat
xy v/v Formamid
2% Blocking Reagenz
0,05% v/v TritonX-100
4. Waschpuffer
xy mM NaCl (abhängig von Formamid-Konzentration im Hybridisierungspuffer)
5 mM EDTA (pH 8.0)
20 mM Tris-HCl (pH 7.4)
0,02% w/v SDS
5. PBS-Triton
PBS 1x (pH 7.3)
0,05% TritonX-100
6. Amplifikationspuffer
FITC-Tyramid in H2O2
PBS 1x (pH 7.3)
0,0015% H2O2
0,1% Blocking Reagenz
10% Dextransulfat
- 63 -
1x PBS, Dextransulfat und Blocking Reagenz ansetzen (=Amplifikationspuffer)
1 µl H2O2 (30%) in 200 µl PBS 1x verdünnen
20 µl H2O2-Lösung in 2 ml Amplifikationspuffer geben
4 µl FITC-Tyramid in H2O2-Amplifikationspuffer geben
7. DAPI-Lösung (= Mountant Lösung)
5,5 Teile PBS1 x / Glycerin / Ascorbinsäure
1 Teil Vectashield
0,5 Teile DAPI-Lösung (1 µg/ml in H2O oder Puffer)
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Quantitative PCR
Einleitung
Die quantitative PCR, auch Real-Time-PCR genannt, ist eine Methode, die es ermöglicht die
Amplifizierung eines spezifischen Sequenzabschnittes (target) während des Experiments über
Fluoreszenzmessungen zu verfolgen. Zu welchem Zeitpunkt während der cyclischen Amplifizierung die Konzentration der PCR-Produkte messbar wird, hängt ab von der Zahl an Zielsequenzen
(targets) in der eingesetzten DNA (template). Dies bildet die Grundlage für die Quantifizierung
von spezifischen Zielsequenzen und somit der Zahl an Organismen in der Ausgangsprobe (z.B.
Umweltprobe). Grundsätzlich gibt es zwei verschiedene Möglichkeiten der Durchführung:
- 64 -
• Einsatz von spezifischen Primern in Kombination mit interkalierenden Substanzen (z.B.
SYBRGreen I), die nach Einlagerung in doppelsträngige DNA fluoreszieren.
• Einsatz von fluoreszenzgelabelten spezifischen Sonden (FRET- und TaqMan-Sonden, Molecular Beacons etc.).
In diesem Skript soll die erste Methode beschrieben werden.
Durchführung
Grundsätzlich gelten für die Real-Time-PCR die selben allgemeinen Arbeitsanleitungen wie für die
PCR. Es gibt jedoch einige Abwandlungen. So werden in der Real-Time-PCR nur „halbe“ Ansätze (25µl) gefahren. Es werden 10µl stärker verdünnter DNA-Lösungen eingesetzt. Dies verringert
den Pipettierfehler und verbessert die Quantifizierung. Bei der Real-Time-PCR wird eine farbstofffreie DNA-Polymerase eingesetzt (New England Biolab Taq DNA-Polymerase, 5U/µl). Dadurch kann eine störungsfreie Fluoreszenzmessung garantiert werden. Der 10fach konzentrierte
PCR-Puffer für die NEB Taq Polymerase enthält: 10mM KCl, 10mM (NH4)2SO4, 20mM TrisHCl, 2mM MgSO4, 0,1% Triton X-100 (pH=8,8). Als Fluoreszenzmittel soll SYBRGreen ITM
genutzt werden. Pro Ansatz wird 1µl einer 400fachen Verdünnung der SYBRGreen IStammlösung eingesetzt. Da SYBRGreen I, wie alle interkalierenden Substanzen mutagen ist,
müssen bei der Herstellung der Verdünnung grüne Gifthandschuhe getragen werden.
Lösung
10 x Puffer(2mM MgCl2)
dNTPs ( 2,5mM each)
BSA(20mg/ml)
MgCl2 (10mM)
PCR H2O dest.
357f (10pmol/µl)
907R (10pmol/µl)
SYBRGreen I (1:400)
NEB Taq-Polymerase (5U/µl)
DNA-Template
Endvolumen
Volumen [µl]
2,5
2
0,25
0,75
7,4
0,5
0,5
1
0,1
10
25
Temp. [°C]
Time [min] Cycles
96
94
55
72
72
25
4
1
1
2
10
1
1
40
Fl.-Messung
1
1
Die Fluoreszenz wird in jedem
Zyklus nach der Elongation
gemessen
Beispiel für einen PCR-Ansatz und das dazugehörige Temperaturprogramm
Der Thermocycler
Durchgeführt wird die Real-Time-PCR am Thermocycler „ROTOR-GENE 2000/3000“ der Firma
„Corbett-Research“. Der Cycler wird durch einen angeschlossenen Computer über die ROTORGENE Software gesteuert. Es existiert ein Handbuch in dem alle Details ausführlich dargestellt
sind. Hier sollen nur die wichtigsten Punkte aufgeführt werden. Der Cycler verfügt über ein
36/72er Dual-Kanal-Rotorsystem, wobei für unsere Zwecke der 36er Rotor (s.Abb), der mit 36
Flachdeckel PCR-Tubes (0,2ml) beladen werden kann, ausreicht. Der Rotor muß immer voll bestückt sein, leere Positionen werden mit leeren Tubes aufgefüllt. Der ROTOR-GENE-Cycler ist
mit 2 Detektions-Einheiten ausgestattet. Kanal (1) detektiert bei 510nm und Kanal (2) detektiert
bei 555nm. Dies ermöglicht Multiplex-Detektionen mit 2 Farbstoffen gleichzeitig.
Sobald das Probenröhrchen die Detektions-Einheit passiert, wird es durch hochenergetische
Blitze der entsprechenden Wellenlänge angeregt, und das entstehende Emissionslicht durch einen
- 65 -
Photomultiplier gemessen. Diese Daten werden an den PC gesandt und dort graphisch dargestellt
(Fluoreszenzeinheiten / Cyklusnummer, s.Abb.).
Die ROTOR-GENE Software
Vor dem Start der ROTOR-GENE Software muß der Cycler eingeschaltet werden, da die Software sonst nur im virtuellen Modus läuft.
Nach dem Start des ROTOR-GENE Programms erscheint zuerst das Experiment-Menüfenster
Die Option NEW öffnet das Auswahlfenster, um ein
neues Experiment vorzubereiten und zu starten.
Vor dem Start der PCR: Die Toolbar-Arbeitsoberfläche
EXP. INFO (SETTINGS)
Hier wird der Name des Operators und des Experiments eingegeben, außerdem werden das Reaktionsvolumen, der Detektionskanal für die Fluoreszenzmessung und der Rotor des Cyclers ausgewählt.
PROFILE
Hier wird das Temperaturprogramm für die PCR geschrieben, dabei können die Optionen HOLD,
CYCLING und MELT ausgewählt werden.
HOLD: Auswahl einer Temperatur, die über einen bestimmten Zeitraum gehalten wird
(DENATURE: Extraoption für den ersten Deaturierungsvorgang)
CYCLING: Auswahl von max. 5 nacheinander ablaufenden Temperaturen und Zeiträumen (Deaturierung, Annealing, Elongation, siehe PCR-Methodenteil). Unter dieser Option wird auch der
Zeitpunkt der Fluoreszenzmessung bestimmt. Da durch interkalierende Substanzen nur doppelsträngige DNA detektiert werden kann, erfolgt die Fluoreszenzmessung direkt nach der Elongation (bei 72°C). An dieser Stelle muß beachtet werden, dass durch den Einsatz interkalierender
- 66 -
Substanzen auch unspezifische Produkte (z.B. Primerdimere) detektiert werden. Durch Auswahl
einer Temperatur bei der z.B. Primerdimere wieder aufgeschmolzen sind (über 80°C) kann die
Detektion von unspezifischen Produkten von vorneherein ausgeschlossen werden. Außerdem
können hier auch die Darstellungen für die Rohdaten (Normal/High Sensitive/Low Sensitive) ausgewählt werden (man lässt sich meistens alle 3 anzeigen).
MELT: Im Anschluss an das PCR-Programm oder separat kann eine Schmelzkurve der PCR Produkte aufgenommen werden. Dabei wird die Temperatur langsam von einer niedrigen Ausgangstemperatur (meist 50°C) über 1°C-Schritte auf 99°C erhöht. Dabei wird kontinuierlich die Fluoreszenz für alle Proben gemessen. Vor dem Lauf muß die Anfangstemperatur der Schmelzkurve
über einen Zeitraum von mind. 1 min konstant gehalten werden.
SAMPLES
Hier werden die Namen des Proben eingetragen. Man kann zwischen SAMPLE, NTC (non template controle), STANDARD und NONE wählen. Für die Standards können auch Konzentrationen bzw. Kopienzahlen angegeben werden.
HOLD bzw. DENATURE
MELT
CYCLING
START
Beim Starten des PCR-Laufs erscheint nochmals das PCR-Profil. Außerdem wird das Experiment
gespeichert. Die Rohdaten der Fluoreszenzmessungen und der Temperaturverlauf
können während des gesamten PCR-Laufs auf dem Bildschirm verfolgt werden.
Nach Beendigung der PCR: Das Analysemenü
- 67 -
Durch Klicken auf den ANALYSIS-Button im Toolbarmenü wird das Analysenmenü geöffnet.
Das „Analysis“-Fenster ermöglicht es neue Analysen durchzuführen bzw. zeigt bereits durchgeführte an. Als Analysen stehen:
COMP. QUANTITATION, ALLELIC DISC., MELT und
QUANTITATION zur Verfügung, wobei nur die beiden letzteren
für uns interessant sind. Bei Auswahl einer der Analysen erscheint
die Liste der möglichen Kanäle in den die Auswertungen durchgeführt werden können. Um die Analyse sichtbar zu machen, genügt
ein einfacher Doppelklick auf dem Kanal-Namen.
QUANTITATION
Bei Doppelklick auf diese Analysenfunktion werden drei Fenster geöffnet, das Hauptfenster in
dem die normalisierten Kurven der Rohdaten zu sehen sind, das Standardkurvenfenster (wenn
Standards bei der PCR definiert wurden) und das Ergebnisfenster, in dem sämtliche Daten der
einzelnen Proben aufgelistet sind.
Hauptfenster
Die normalisierten Rohdaten werden hier linear bzw. logarithmisch dargestellt (Button: LINEAR
SCALE/LOG. SCALE)
CT-CALCULATION
Der Ct-Wert (cycle time-Wert) ist der Punkt, an dem der Schwellenwert (Threshold) die Amplifikationskurven schneidet. Er gibt den Startzeitpunkt der exponentiellen Amplifikation an. Er kann
direkt in Bezug zur Ausgangskopienzahl gesetzt werden. Der Threshold kann automatisch über
den AUTO-FIND THRESHOLD-Button (nach Eingabe von Minimum und Maximum) oder manuell über den Button rechts neben dem THRESHOLD eingestellt werden. Über den Button
rechts neben ELIMINATE CYCLES BEFORE können die ersten PCR-Zyklen, die meist höhere
Schwankungen in der Hintergrundfluoreszenz aufweisen, aus den Berechnungen eliminiert werden.
Standardkurve
In der Standardkurve sind die Ct-Werte gegen die für die Standards ausgewählten Einheiten
(Konzentration, Kopienzahl etc.) aufgetragen. Die Standardkurve kann durch hinzufügen bzw.
- 68 -
entfernen von Standards verändert werden. Die blauen Punkte in der Kurve zeigen die als Standard definierten Proben an, die roten die Werte der unbekannten Proben.
R-value: Korrelations-Koeffizient, Zahl zwischen 1
und –1, die angibt wie gut eine Kurve die Beziehung zwischen 2 Variablen (in diesem Fall: y =
mx+b) ausdrückt. Ein guter Wert liegt bei 0,99
bzw. –0,99.
CONC=.... : gibt das Verhältnis zwischen Ct-Wert und target-Konzentration im Template an.
TYPE FLOATING: Bei Auswahl dieser Option wird die Standardkurve bei Veränderung des
Thresholds neu berechnet.
TYPE FIXED: Bei Auswahl dieser Option bleibt die Standardkurve auch bei Veränderung des
Threshold unverändert. Dies ist sinnvoll, wenn die Standardkurve auch für andere Experimente
genutzt werden soll.
IMPORT CURVE: hier kann eine Standardkurve aus einem anderen Experiment importiert und
zur Berechnung herangezogen werden.
Ergebnisfenster
Neben den Ct-Werten (Ct) und deren Standardabweichung (CT STD. DEV.), sind auch die als
Standard definierten Konzentrationen (GIVEN CONZ.) und die aus den Ct-Werten berechneten
Konzentrationen (CALC. CONC.= m*Ct + b) angegeben, die optimalerweise identisch sein sollten. Der CV-Wert (Koeffizient der Variation = 1-[berechnete Konzentration zu gegebene Konzentration]) wäre in diesem Fall 0. Das Ergebnisfenster kann über die rechte Maustaste nach Excel exportiert werden.
MELT
Die Schmelzkurve stellt das Schmelzverhalten der PCR-Produkte nach dem Lauf dar. Sie ermöglicht es spezifische Produkte von unspezifischen (z.B. Primerdimere) zu unterscheiden.
Primerdimeree
- 69 -
Amplifikationsprodukte
Agarosegelelektrophorese
Nach dem PCR-Lauf werden 5µl der PCR-Produkte (Zugabe von 3µl loading buffer nötig, da die
NEB Taq Polymerase keinen Farbstoff und kein Glycerin enthält) zusätzlich auf einem 1,5%igen
Agarosegel aufgetrennt (s. d.).
- 70 -
Microcalorimetry
Introduction
Calorimetry is the science of measuring the heat production of physical, chemical or biological
reactions.
Fig.1 Thermal activity monitor
Fig.2 Measuring cylinder
The microcalorimeter “Thermal Activity Monitor 2277” is an ultrasensitive instrument that
measures the heat flow in µW. It consists of four measuring cylinders (Fig.1) that are surrounded
by a water bath with a constant temperature (isotherm). Each cylinder is divided into two
channels - the left one for the sample and the right one for the reference (Fig.2). When heat is
produced in the sample the temperature difference is conversed into an electricity flow by the
surrounding Peltier elements (Fig.2). The temperature increase of the internal water bath is
compensated by an external thermostate next to the microcalorimeter.
In this case the microcalorimeter is used to monitor growth experiments. Heat is produced when a
substrate is degraded due to microbial activity. This is plotted in a heat-production versus time
diagram on a computer. With the data set the energy yield can be calculated:
1Joule = 1 Watt*Second
Vice versa the energy yield can be predicted if the reactions in the degradation processes of the
substrate are known.
- 71 -
Running the microcalorimeter
First of all, the thermostate on the left side of the microcalorimeter must be turned on,
otherwise the microcalorimeter will start to heat. The tempertature in the internal waterbath of the
microcalorimeter keeps it temperature, because it is connected to the thermostate next to the
microcalorimeter which can cool down as well as heat. Always pay attention that the external
waterbath contains enough water. Because the microcalorimeter itself can only heat, the
temperature of the external water bath must be lower than in the internal one. To adjust the
appropriate temperature of the external as well as the internal water bath, have a look at the
temperature regulator unit (Fig. 1) in front of the microcalorimeter.
Now the microcalorimeter and then the computer can be turned on. The Kennwort is
agcyp.
Recording data
By choosing the calorimetry software “Digitam for windows” four red lights will appear on the
front panel of the microcalorimeter.
Choose “Control” and “Initiate experiment”
Fill in the parameters for each channel:
Channel: 1, 2, 3 or 4 (for each measuring cylinder)
Amplifier setting: 300µW, 1000µW or 3000µW (usually 1000µW is enough).
Operator: enter your name
Results name: Use the right mouse button and choose “Browse file”and enter a name for the data
file. For example jutta001-3: the first number is the number of the run and the second one the
number of the channel. Sometimes it is impossible to enter a new name. The easiest way is to
change the name of an already existing file.
Method name: Use the right mouse button and choose “Browse file”and enter a name for your
method.
When you have filled in the parameters of the first channel do not press enter, just change in the
field “Channel “ 1 to 2 and the parameters for channel 1 will disappear.
When you have defined the parameters of all four channels, press “Close”.
To close a window, choose the upper left corner not the right one as usual.
Go to menu “Control” and the submenu “Experiment control” to start the monitoring.
Mark “Start Experiment” for all four channels and then press “OK”. If you want to monitor an
experiment for a longer period than a week, end the running experiment and start a new one with
the same parameters (except “results name”) and combine the two data sets in “Data plot”. This is
necessary because the virtual memory is too little.
Go to menu “Plot” and submenu “Define Screen Plot” and insert the names of the Results
name (see above) of the four running channels. Update the plot by pressing “Scale to show all”.
- 72 -
End the experiment in menu “Control” and submenu “Experimental control”.
Saving the data on a disc
Menu “File”, “Open”, “Results file”, click on the file to be saved. Ignore the now opening
window.
Go to menu “File”, “Export” and mark “Generate numeric data report” and press “OK”
Mark only “P” in the next window.
Choose device “A” and the files will be saved as text files.
Analysing the data
Using “Data Plot” is the easiest way to plot and integrate the data.
Preparing the samples
Material:
20 ml autoclaved glass bottles 23mm diameter N20 opening
rubber stoppers and hooks
medium (page …) or sterilized sea water
inoculum (e.g. sediment)
substrate
optionally inhibitor
For anaerobic growth experiments use the anaerobic chamber to fill the bottles with medium and
sediment.
Put the filled and closed sample and reference ampoules (attached to a hook respectively) slowly!
into the equilibration position of the microcalorimeter. Make sure that the ampoules are clean and
dry. After at least half an hour the ampoules can be lowered to the measuring position (again
slowly). The microcalorimeter is so sensitive that it can even measure frictional heat caused by
vibrations.
When the heat flow is constant (approximately after two days) the substrate can be added.
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