PRODUCCION DE XANTANO POR Xanthomonas campestris EN

BIOLOGIA
Acta Científica Venezolana, 50: 201–209, 1999
PRODUCCION DE XANTANO POR Xanthomonas campestris
EN UN MEDIO DE CULTIVO NO CONVENCIONAL
Ricardo A. Azuaje y José A. Sánchez
Laboratorio de Insumos Biológicos, PROULA, Mérida, Venezuela.
e-mail: azuajer@ciens.ula.ve y jcrispin@etheron.net
Recibido: 17/03/98 ; Revisado: 28/07/98 ; Aceptado: 25/03/99
RESUMEN: Se determinó que X. campestris vp. ocumo, exhibió mayor capacidad para crecer y producir xantano que las
otras dos variedades de X. campestris analizadas. Utiliza una amplia diversidad de fuentes de carbohidratos. Sin embargo,
la cepa no produce el exopolisacárido cuando la fuente de carbohidrato proviene de materiales ricos en lignocelulosa. El
Jarabe Glucosado FAVEPRO (JGF) fue la fuente de carbono con la que se logró el mayor rendimiento de xantano (23g/l)
con la mayor viscosidad (7000 cps). Las condiciones óptimas de producción determinadas en fiolas de 1 L (volumen de
trabajo 0.2 L) y en fermentador tipo tanque agitado de 14 L (volumen de trabajo 10 L) fueron las siguientes: 5% de azúcares
totales, 0.05% de urea como fuente de nitrógeno, 0.5% de fosfato dipotásico, pH 7.5, 10% de inóculo, temperatura 30 Æ C,
agitación entre 250-1000 rpm y aireación entre 0.3-1.0 vvm. X. campestris vp. ocumo, fue también capaz de producir
xantano (10g/l), y aumentar la viscosidad (hasta 1500 cps) de un medio basado en el extracto ácido soluble de corteza
de yuca molida (EACY). Palabras clave: Xantano, Xanthomonas campestris vp. ocumo, Jarabe glucosado FAVEPRO,
Extracto ácido soluble de corteza de yuca molida (EACY).
XANTHAN PRODUCTION BY Xanthomonas campestris IN NO-CONVENTIONAL CULTURE MEDIUM
ABSTRACT: Among 3 varieties of Xanthomonas campestris, the variety ocumo (X. campestris pv. ocumo), showed the
greatest capacity for producing xanthan. This bacteria grows appropiately and produces this polysaccharide in a wide
diversity of carbohydrate sources. However, this strain does not produce xanthan when the carbohydrate comes from
lignocellulosic materials. The glucose syrup FAVEPRO was the carbon source that showed the best yield (23 g/l) with the
greatest viscosity (7000 cps) of xanthan. The optimun production conditions in 1 L erlenmeyer flasks, with a working volume
of 0.2 L and in a 14 L (stirred tank type bioreactor) with a working volume of 10 L, were the following: total sugar 5%, urea
0.05%, di-potassium hydrogen phosphate 0.5%, pH 7.5, inoculum 10%, temperature 30 Æ C, agitation 250-1000 rpm and
aereation 0.3-1.0 vvm. This strain of X. campestris pv. ocumo was able to produce xanthan (10 g/l) in a culture medium
based on a previously treated agricultural waste, called soluble acid extract of cassava bark. The viscosity of this medium
increased up to 1500 cps. Key Words: Xanthan, Xanthomonas campestris pv. ocumo, glucouse syrup FAVEPRO, soluble
acid extract of cassava bark.
INTRODUCCION
La goma xantano es un exopolisacárido, producido por
bacterias del género Xanthomonas. Fue descubierta en el
Northern Regional Research Laboratoty (NRRL) del Departamento de Agricultura de USA, cuando se buscaban
sustitutos a las gomas de origen vegetal9 . El polisacárido
se reportó por primera vez en 196130 , como un producto
de fermentación de la bacteria Xanthomonas campestris
NRRL B-1459 y se le denominó xantano. Más tarde, se
determinó que tenía una estructura conformada por una
cadena principal celulósica sustituida, cada dos unidades
de D-glucosa, por una cadena lateral de trisacáridos de
D-manosa y ácido D-glucorónico en relación molar 2:1 (Figura 1). La unidad manosa -enlazada o externa, es sustituida variable y específicamente, en las posiciones 4 y 6
por los residuos de acetal del ácido pirúvico. A su vez, la
manosa interna, o -enlazada, es O-acetilada en la posición 6. El peso molecular del xantano oscila entre 1.25 y
10 millones de g/mol32 .
Debido a sus excelentes propiedades reológicas, el xantano tiene una amplia aplicación como agente homoge-
neizador, estabilizador, emulsificador y espesador en las
industrias alimenticia, cosmética farmacéutica, química,
papelera y téxtil10 . También en la industria petrolera se
utiliza en los lodos de perforación como lubricante y como polímero de inundación para controlar la movilidad del
agua en los procesos terciarios de recuperación mejorada
de petróleo7;14;26 . A nivel industrial el xantano se produce mediante fermentación sumergida aeróbica, creciendo
cultivos puros de X. campestris en diferentes medios en
los que se utiliza como fuente de carbono glucosa, sacarosa, melaza e hidrolizados de almidón de cereales10 .
El medio se complementa con una fuente nitrogenada y
algunas sales minerales. Aditivos adicionales y la búsqueda de parámetros óptimos de fermentación, son decisivos en la obtención de rendimientos aceptables para un xantano de calidad8;27;37 . Se han utilizado diferentes métodos genéticos para obtener cepas superproductoras de xantano11;12;28;29 y mutantes capaces de fermentar
lactosa5;22;40 y degradar con mayor eficiencia almidón36 .
En nuestro país, a pesar de la importancia que representa el biopolímero xantano para la industria petrolera,
pocos son los estudios que se han realizado sobre este te-
202
Figura 1. Unidad de repetición pentasacárida de la goma xantano.
ma. Las primeras investigaciones sobre el xantano en Venezuela fueron realizadas entre 1985-198717;20;21;23;38;39 .
No obstante, en la bibliografía no están disponibles los resultados detallados de estas investigaciones. Por otra parte, las empresas transnacionales que lo producen tienen
patentados los procesos y tampoco se puede disponer de
la información existente.
El propósito de este trabajo está dirigido a seleccionar
un medio de cultivo relativamente barato y disponible en
Venezuela para estudiar, mediante métodos fermentativos, la capacidad productora de xantano por cepas autóctonas de Xanthomonas campestris.
MATERIALES Y METODOS
Microorganismos
Se utilizaron cepas aisladas por el Laboratorio de Bacteriología de la Facultad de Agronomía de la UCV con las
denominaciones de X. campestris vp. cala blanca, X.
campestris vp. cala rosada, X. campestris vp. ocumo.
Medios de Cultivo
La materia prima que contiene los carbohidratos no convencionales tiene dos orígenes:
1. El Jarabe Glucosado de FAVEPRO (JGF) fue comprado
a una casa comercial. Se utilizó en los medios de cultivo, a
las concentraciones de azúcar requeridas, sin ningún tratamiento previo. Este jarabe es un hidrolizado ácido de
harina de arroz. Su contenido en azúcares totales, determinados por el método fenol-ácido sulfúrico, fue de 80% y
el contenido en nitrógeno Kjeldhal de 0.05%.
2. El extracto ácido soluble de corteza molida de yuca
(EACY) se preparó en nuestro Laboratorio: La yuca comercial fue pelada y la corteza, una vez lavada con agua,
se secó en una estufa a 80Æ C durante 12 horas y se molió
Azuaje y Sánchez
Figura 2. Efecto de la concentración de jarabe glucosado FAVEPRO sobre parámetros relacionados con la producción de exopolisacárido por Xanthomonas campestris vp. ocumo.
Volumen de medio: 200 ml en fiolas de 1 litro. Se utilizó como
fuente de carbono el JGF con las concentraciones de azúcares
totales indicadas arriba. Los demás componentes del medio fueron: K2 HPO4 3H2 O 6.5 g/l, MgSO 4 7H2 O 0.01 g/l, Urea 2.3
g/l (equivalente a 1 g/l de nitrógeno). El proceso se realizó a
28Æ C, y agitación 280 rpm. Cada valor es un promedio de tres
experiencias diferentes. El rendimiento se calculó dividiendo la
cantidad de xantano obtenido entre la cantidad de azúcar consumido. Los análisis se realizaron como se indicó en Materiales y
Métodos.
y mezcló con agua caliente (70Æ C). La suspensión se trató
con calor (flujo de vapor vivo) a alrededor de 100Æ C por
una hora. Luego se le adicionó lentamente ácido sulfúrico
concentrado (98%), bajo agitación a una concentración final de 1% (V/V). Este extracto se llevó a pH 7.0 con una
solución concentrada de NaOH y las sales precipitadas se
separaron por sedimentación seguida por centrifugación a
3000 xg. Al final se obtuvo un extracto con un contenido
de azúcares totales entre 8 y 10% y alrededor de 0.5% de
nitrógeno Kjeldhal.
Medio de mantenimiento: contiene JGF con 0.2% de
azúcares, triptona 0.5%, extracto de levadura 0.5%, K2
HPO4 0.1%, agar 2% y agua; pH 7.0 y esterilizado a
121Æ C por 15 minutos.
Medio de desarrollo de los inóculos: contiene JGF con
1% de azúcares, 0.5% de peptona, 0.3% de extracto de
levadura y 0.3% de extracto de malta. El pH se ajustó a
7.0 y el medio se esterilizó a 121Æ C durante 20 minutos.
Medios de producción (basado en el medio Norton24
con ligeras modificaciones): estos medios constan de un
medio base, el cual consiste en una solución acuosa de
(NH4 )2 HPO4 0.8%, MgSO4 7H2 O 0.01%, ajustado a pH
203
Producción de xantano
Tabla 1. Producción de biomasa y de exopolisacárido por tres
variedades de X. campestris.
Figura 3. Cambios dinámicos en concentración celular, producción xantano y carbohidrato consumido durante la fermentación
del medio JGF por Xanthomonas campestris vp. ocumo.
X. campestris P.S.C (g/l) P.S.X. (g/l) P.E.X. R (%)
vp. cala blanca
vp. cala rosada
vp. ocumo
1.90
1.43
3.70
3.6
2.6
8.0
1.9
1.8
2.2
36
19
45
Composición del medio: (NH 4 )2 HPO4 0.8%, MgSO4 7H2 O
0.01%, azúcares totales (JGF) 2%, pH 7.0. Los valores promedio
de tres análisis se refieren a muestras tomadas a las 96 horas.
P.S.C.: Peso seco celular, P.S.X.: Peso seco de xantano, P.E.X.:
Producción específica de xantano = P.S.X./P.S.C., Rendimiento
(R) = P.S.X.(g/l)/C.C. (g/l) 100. Los valores son promedios de
tres experiencias distintas. Las determinaciones se realizaron
según se indica en Materiales y Métodos.
7.0 y esterilizado a 121Æ C por 20 minutos. El azúcar lo provee el JGF, EACY u otra fuente y las soluciones se ajustaron a pH 7.0 y esterilizaron aparte, bajo las mismas condiciones anteriores, y luego se mezclaron asépticamente
con el medio base.
Inóculos y cultivos
1. Para estudios de fermentación en fiolas de 1 litro: Mediante métodos reportados30 , se sembraron varios cultivos
en cuñas con medio sólido de mantenimiento a partir de
colonias grandes y mucoides provenientes de los cultivos
originales de la UCV y se incubaron a 30Æ C durante 3 días.
En todos los casos, éstas cuñas fueron utilizadas antes
de los 4 días y con ellas se inocularon 15 ml de cada medio líquido de crecimiento dispuestos en fiolas de 50 ml.
Después de 24 horas de incubación a 30Æ C con agitación
orbital (280 rpm), éste cultivo sirvió de inoculo a un nuevo
cultivo, consistente de 30 ml del mismo medio, que creció
bajos iguales condiciones. A las 24 horas se preparó otro
cultivo de 100 ml en fiolas de 500 ml, que nuevamente se
incubó bajo las mismas condiciones. Finalmente, 20 ml de
éste último cultivo sirvieron para sembrar 180 ml de medio
de producción dispuestos en fiolas de 1 litro de capacidad.
La incubación se realizó a 30Æ C con agitación orbital (280
rpm) durante 96 horas. A este tiempo se hicieron las determinaciones del caso.
2. Para estudios en fermentador de 14 litros cada 24 horas se prepararon precultivos de 100, 200 y 1000 ml en
el medio de producción y cada uno sirvió de inóculo al
siguiente, bajo las condiciones indicadas arriba. El cultivo de 1 litro sirvió para inocular 9 litros del mismo medio
dispuestos en un fermentador LKB de 14 litros. Las condiciones de fermentación se precisarán en cada caso. A
diferentes tiempos se retiraron muestras de 100 ml para
realizar las diferentes determinaciones.
Para optimizar la producción de xantano se estudió el
efecto de diferentes tipos y concentraciones de fuentes de
carbono y nitrógeno, y los valores más adecuados de pH,
Se utilizó un fermentador LKB de 14 litros con un volumen de
trabajo de 10 litros. La composición del medio fue (g/l): Azúcares (JGF) 50, urea 0.5, K 2 HPO4 3H2 O 5, MgSO4 7H2 O 0.1. El
proceso se realizó a 28 Æ C y pH 7.5. El cultivo no se agitó durante
las primeras 72 horas y se suministró aire a un flujo de 0.3 a 1
vvm. Durante las siguientes 96 horas se inicio la agitación a 250
rpm y aireación de 0.3 vvm y se finalizó a 1000 rpm y 1.0 vvm
para compensar el incremento de viscosidad del cultivo. Cuando
fue necesario se agregó antiespumante (Wacker silicone). Las
determinaciones se hicieron como se indica en Materiales y Métodos.
temperatura, agitación, aireación, concentración de fosfato y volumen de los inóculos; en cada caso serán precisadas las condiciones experimentales.
Medidas y métodos analíticos
Las diferentes determinaciones se realizaron siguiendo
metodologías reportadas anteriormente25;30;33;34 , con algunas modificaciones. Se procedió de la manera siguiente: Para todos los cultivos, en fiolas y fermentador, se midió viscosidad, a 20Æ C, a muestras de 100 ml. Se ulitizó
un viscosímetro Brookfield LVR, al que se conectó un eje
TA NÆ 4 dispuesto a 10 rpm. Las lecturas de viscosidad se
hicieron en el visor del aparato.
Los 200 ml de cada cultivo en fiolas, retirados a las 96
horas, fueron centrifugados a 17000 xg durante 1 hora a
20Æ C. Las células en el sedimento se lavaron dos veces,
por centrifugaciones sucesivas, con agua destilada. La
biomasa (peso seco) fue medida por gravimetría después
de secar en una estufa a 80Æ C durante 14 horas. Al microscopio de luz se observó la presencia o ausencia de
contaminación. Para los cultivos en el fermentador se tomaron, a cada tiempo, muestras de 100 ml y se procesa-
204
Azuaje y Sánchez
Tabla 2. Capacidad de X. campestris vp. ocumo para crecer e
incrementar la viscosidad del medio, en medios de cultivo con
diferentes fuentes de carbono en fiolas de 1 litro.
Fuente de carbono
Jarabe glucosado
FAVEPRO (JGF)
Sacarosa
Papelón
Dextrina
Almidón de maíz (Maízina)
Almidón de arroz
Almidón crudo resistente
Almidón de arroz-trigo
Harina de soya
Harina de yuca
Melaza
Suero en polvo
Torta de maíz
Corteza yuca tratatada:
calor/ presión
EACY
Tusa de maíz
Cutícula de arroz
Cáscara de arroz
Cáscara de frijol
Bagazo de caña
Material vegetal de tártago
Material vegetal Taiwan
Material vegetal Kikuyo
Tabla 3. Efecto de diferentes fuentes de nitrógeno sobre la producción, por X. campestris vp. ocumo, de xantano, y su contenido en proteinas y cenizas, en la fracción de polisacárido precipìtada con alcohol.
Crecimiento Viscosidad (cps)
Fuente de
nitrógeno
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
2400
400
500
200
500
200
200
300
0
200
100
0
0
++
++
–
+
–
–
–
–
–
–
100
350
0
0
0
0
0
0
0
0
(NH4 )2 HPO4
NH4 Cl
Urea
(NH4 )2 SO4
Xantano Proteínas Cenizas
(g/l)
% (P/P) % (P/P)
7.0
6.3
11.0
9.0
2.5
2
3
2
28
25
20
35
Los valores son promedios de tres experiencis distintas. Se utlizó
5% de azúcares totales y el medio base. Las determinaciones se
realizaron de la manera indicada en la Tabla 1.
en el que la cantidad de xantano alcanzó su máximo valor.
++: Crecimiento denso; +: Crecimiento menos denso; –: Crecimiento muy pobre o inapreciable: cps; Centipoises (medida de
viscosidad). El volumen del cultivo fue de 200 ml, la composición del medio (% P/V): (NH 4 )2 HPO4 0.8, MgSO4 7H2 O 0.01.
La concentración inicial de azúcares totales fue de 2%. Para el
material lignocelulósico se prepararon infusiones y se filtraron.
La temperatura fue de 28 Æ C, el pH inicial 7.0 y la velocidad de
agitación 280 rpm en un agitador orbital. El crecimiento y la viscosidad se midieron a las 96 horas del cultivo. Cada valor es un
promedio de tres experiencias distintas.
ron de igual manera que para los cultivos en fiolas.
Los sobrenadantes de las centrifugaciones se enfriaron
a 4Æ C. A un volumen de cada sobrenadante se añadió KCl
sólido hasta concentración final de 1%. Se agitó fuertemente y a la suspensión se le agregaron, bajo agitación
constante, dos volúmenes de etanol al 95%. Todo el proceso se realizó a 4Æ C en un cuarto-cava. La mezcla se
centrifugó a 4Æ C y 17000 xg durante 1 hora. Al sobrenadante se le determinó azúcares totales por el método
Fenol-Acido sufúrico3 . El sedimento se secó en una estufa a 100Æ C durante 1 hora. Una vez seco, se pesó y al
valor obtenido se le restó el contenido de proteinas determinadas por el método de Lowry y col.16 , más el de cenizas (determinado por incineración de una muestra de 1
gramo). La diferencia es el contenido de xantano. El rendimiento se calculó dividiendo la cantidad de xantano producido entre la cantidad de carbohidrato consumido por
100. La productividad se obtuvo dividiendo la cantidad de
xantano entre la cantidad azúcar consumido y el tiempo
RESULTADOS Y DISCUSION
Selección de microorganismos y fuentes de carbono
Los resultados mostrados en la Tabla 1 indican, para el
medio de producción seleccionado, que, de las tres cepas estudiadas, X. campestris vp. ocumo fue la que creció
mejor y produjo mayor rendimiento en xantano. Esta cepa
puede utilizar todos los almidones probados (Tabla 2), y en
la medida que es menor el tamaño del azúcar en estudio,
es mayor su capacidad de incrementar la viscosidad del
medio. Es interesante observar que los medios que poseen una relación C/N relativamente baja (harina de soya,
suero de leche, torta de maíz y cutícula de arroz) favorecen el crecimiento de X. Campestris vp. ocumo, pero
no incrementan la viscosidad del cultivo, lo que confirma
evidencias previas15;35 . Por otra parte, en los materiales
lignocelulósicos, son nulos tanto el crecimiento como el incremento de viscosidad del medio, lo que ha sido atribuido
a que esta bacteria no sintetiza celulasas13 . A los efectos
del presente estudio decidimos escoger la cepa X. campestris vp. ocumo como probable productora de xantano,
y seleccionamos también al JGF como fuente de carbono
y energía para la preparación de medios de cultivo ya que
con él se obtuvo el mayor cambio de viscosidad (Tabla 2).
Características fisiológicas de la producción de xantano
Con el fin de optimizar la producción de xantano por X.
campestris vp. ocumo, en fiolas de 1 litro en medio con
fuente de carbono proveniente del JGF, se estudió el efecto de la variación de distintos parámetros. En la figura 2,
se observa que 5% es la concentración óptima de azúcares totales en el JGF que favorece el mayor rendimiento
y producción de xantano y permite obtener el caldo con
mayor viscosidad. Concentraciones superiores son inhibitorias para todos los parámetros medidos. Probablemente
ello se deba a que se incrementa el poder reductor del me-
205
Producción de xantano
Tabla 4. Efecto de la concentración de urea sobre la producción de xantano, la viscosidad final del caldo y el contenido de proteinas
y cenizas en la fracción de polisacárido precipitada con alcohol. Cepa X. campestris vp. ocumo.
Urea % (P/V) 10
Xantano (g/l)
Viscosidad (cps)
Proteínas % (P/P)
Cenizas % (P/P)
2
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
2
0
ND
ND
15
1900
2.5
15
13.6
1700
2.5
15
13.4
1700
2.5
18
13
1600
3.0
18
12.8
1600
3.0
20
12.6
1500
3.0
20
12.3
1400
3.5
30
12
1400
3.5
30
11
1200
3.5
25
11
1100
3.5
25
Cada medida es un promedio de tres experiencias diferentes. ND: no se determinó. El medio de cultivo contenía: (% P/V): 5 azúcares
totales (JGF), 0.65 K 2 HPO4 3H2 O, 0.01 MgSO4 7H2 O, pH 7.0, temperatura 28 Æ C, volumen de inóculo 10 %, agitación 280 rpm.
Las determinaciones se realizaron como se indica en la sección de Materiales y Métodos.
Tabla 5. Efecto de la concentración de fosfato (K 2 HPO4 3H2 O) sobre la producción de xantano, la viscosidad del cultivo y el
contenido en proteina y cenizas del polisacárido precipitado con alcohol. Cepa X. campestris vp. ocumo.
Fosfato (P/V) 10
Xantano (g/l)
Viscosidad (cps)
Proteína % (P/P)
Cenizas % (P/P)
1
0
1
2
3
4
1.5
0
ND
ND
5.15
400
2.0
15
9.85
800
2.0
15
11.8
1400
2.5
16
13.6
1700
2.5
17
5
6
8
10
16 15.15 13.8 10.25
2000 1900 1700 1000
3.0 3.0 2.5 2.0
17
18
20
25
Cada valor es un promedio de tres medidas diferentes. El medio contenía: (% P/V): azúcar total (JGF) 5, Urea 0.05, MgSO 4 7H2 O
0.01, pH 7.0, temperatura 28 Æ C, volumen de inóculo 10%, agitación 280 rpm. Las determinaciones se realizaron como se indica en
Materiales y Métodos.
dio ambiente con carencia efectiva de oxígeno para otras
funciones celulares.
En la Tabla 3 puede observarse que con la urea se logra
la mayor producción de xantano con menor porcentaje de
cenizas, en comparación con las demás fuentes de nitrógeno probadas. El precipitado obtenido con esta fuente de
nitrógeno presentó una textura más gomosa y fácilmente
soluble en agua en comparación con los precipitados obtenidos con los otros compuestos nitrogenados. Por otra
parte, entre varias concentraciones de urea probadas (Tabla 4), valores alrededor de 0.05% producen la mayor viscosidad (1900 cps) y el menor contenido de cenizas en el
xantano precipitado. Se seleccionó así, esa concentración
de urea para futuras experiencias.
Del estudio de las Tablas 5, 6, 7 pueden establecerse
valores óptimos de fosfato de 0.5 g/l, pH de 7.5 y volúmenes de inóculos (de 24 horas) del 10%. El pH es uno de
los parámetros que afecta más la producción de xantano
y variaciones de menos de una unidad de pH por arriba
o por debajo de valores cercanos a la neutralidad, disminuyen drásticamente la producción del polisacárido. No
obstante, se han reportado que valores de pH entre 6.0
y 7.5, son óptimos para el crecimiento celular de X. campestris y de 7.0 a 8.0 para la obtención de un xantano con
buenas características reológicas4 .
Los resultados que venimos de reportar nos permiten
disponer de parámetros útiles para fijar condiciones preliminares destinadas a producir xantano. No obstante, en
estos sistemas prácticamente cerrados (fiolas), es difícil
crear mezclas homogéneas adecuadas de las fases (sólida, líquida y gaseosa) involucradas en el metabolismo
bacteriano. Tampoco el tamaño y geometría de las fiolas
ayuda a lograr una mayor eficiencia para el proceso.
Con el fin de superar estas dificultades, utilizamos un
fermentador LKB de 14 litros provisto de sistemas de aireación y agitación más eficientes. En la figura 3 se aprecia que hasta las 72 horas de iniciado el cultivo, en ausencia de agitación y con una aireación entre 0.3-1 vvm,
el crecimiento celular y la producción del polisacárido son
práticamente nulos. Esto se explica porque las burbujas
de aire, por si mismas, y en el tipo de fermentador utilizado, apenas contribuyen a romper la barrera mucilaginosa
formada por el polisacárido que rodea a las células. La
difusión del oxígeno del aire y de los nutrientes está restringida y se observa que el azúcar no es consumido. Una
vez establecida la agitación (inicialmente 250 rpm) los tres
parámetros registrados cambian rápidamente con el tiempo de forma dependiente uno de otro. El incremento de la
producción de xantano ocurre linealmente hasta 145 horas, donde alcanza 23 g/l y se detiene a partir de este tiempo, cuando la concentración de azúcar residual está alrededor de 10 g/l. Es interesante observar que la producción
del polisacárido prácticamente se inicia una vez finalizado
el crecimiento exponencial y prosigue durante la fase estacionaria. Una situación similar ha sido reportada19 . El aumento en la medida de la concentración de xantano, corre
206
Azuaje y Sánchez
Tabla 6. Efecto del pH sobre la producción de xantano, la viscosidad final del caldo y el contenido en proteina y cenizas del
polisacárido precipitado con alcohol. Cepa X. campestris vp. ocumo.
PH
Xantano (g/l)
Viscosidad (cps)
Proteína % (P/P)
Cenizas % (P/P)
5
5.5
6
6.5
7
7.5
8
0 0.25 3.5 8.45 13.6 16.5 9.5
0
0 100 900 1700 2200 1200
ND ND 1.5 2
3
3
2.5
ND ND 30 25 20
18
22
8.5
9
6
500
2
25
4.23
200
1.5
30
Los valores son un promedio de tres experiencias diferentes. El medio de cultivo fue: (% P/V): Azúcar total (JGF) 5, Urea 0.05,
K2 HPO4 3H2 O 0.5, MgSO4 7H2 O 0.01, temperatura 28 Æ C, volumen de inóculo 10%, agitación 280 rpm. Las determinaciones se
hicieron como se indica en Materiales y Métodos.
Tabla 7. Efecto de la concentración de inóculo, sobre la producción de xantano y la viscosidad final del caldo fermentado por X.
campestris vp. ocumo.
(Inóc.) % (V/V) 0.05 0.1 0.25 0.5
1
2.5
5
7.5
10
15
20
Xantano (g/l) 7.97 8.97 9 9.87 11.08 11.45 12.86 14.17 17 13.86 12.67
Viscosidad (cps) 800 900 900 1000 1100 1200 1400 1800 2400 1700 1600
Los valores son un promedio de tres experiencias distintas. La composición del medio fue igual al de la Tabla 6 y el pH se ajustó a
7.5. Las determinaciones analíticas se realizaron como se indica en Materiales y Métodos.
paralelo con el de su viscosidad y la disminución del pH
que tiene que ser mantenido en 7.5 con NaOH concentrado. El deterioro global de la transferencia de masas en el
fermentador, debido al aumento de la viscosidad, se trató de evitar aumentando paulatinamente la velocidad de
agitación (de 250 a 1000 rpm) y el flujo de aire (de 0.3
a 1.0 vvm) y controlando la espuma mediante adición de
antiespumante (Wacker Silicone). No obstante, no se pudo impedir la formación de zonas muertas (no agitadas),
visibles en la base y paredes del fermentador. En ellas
las bacterias estaban expuestas a condiciones ambientales desfavorables. Esto pudo influir en la disminución de
la biomasa, probablemente por lisis celular, después de
las 135 horas y hasta el final de la fermentación (Figura
3). La viscosidad final del caldo fue de 3000 cps. Se han
utilizado diferentes fuentes de carbono y distintas relaciones de C/N, y se han reportado producciones de xantano
entre 15-25 g/l1;2;31;35 . Por ejemplo, De Vuyst y col.2 reportaron una producción de xantano de 16,5 g/Kg de medio
con una viscosidad de 6.200 cps, utilizando glucosa como
fuente de carbono.
En la Tabla 8 podemos observar que la velocidad de
producción de xantano (Vpx) tiene su mayor expresión a
30Æ C y coincide con una mayor velocidad de consumo de
azúcares (Vcc). Igualmente, la productividad en biomasa
(PB ) y xantano (PX ), es mayor a 30Æ C, ya que la mayor
producción de xantano se alcanza en menos tiempo (84
horas) a esta temperatura que a 28 y 32Æ C (96 horas).
Esto ocurre no obstante que las cantidades de peso seco
bacteriano (P.S.C), xantano producido (P.S.X) y azúcares
consumidos (carbohidrato consumido (C.C)) son mayores
a 28Æ C (Tabla 8). Sin embargo, como se observa en la
figura 4, tanto el rendimiento de xantano, en base a carbohidratos consumidos, como la producción específica de
xantano, por peso seco celular, son mayores a 30Æ C que
a 28 y 32Æ C. La temperatura tiene también un marcado
efecto sobre la cantidad de proteinas y cenizas que coprecipitan con el xantano mediante el tratamiento alcohólico. La menor cantidad de coprecipitados se obtiene a
30Æ C (Tabla 8). Aunque 28 y 32Æ C han sido reportados
como óptimos18 , nuestros resultados son consistentes en
indicar que 30Æ C es la temperatura óptima a la cual X.
campestris vp. ocumo produce la mayor cantidad de xantano. En el futuro seleccionaremos 28Æ C como la temperatura adecuada para lograr mayor cantidad de células y
mediante el cambio a 30Æ C, en medio de producción más
rico en azúcares, produciremos el polisacárido. Procesos
de fermentación similares (a dos pasos) han sido objeto
de patentes4 . Se ha reportado que un rango de temperatura entre 25 y 27Æ C es óptimo para el crecimiento de
X. campestris, mientras que para la producción de xantano en procesos por carga, el rango se encuentra entre
25 y 30Æ C4 . En la Tabla 8 se muestra que existen cambios notables en la viscosidad del caldo que pasa de 3000
a 7000 cps al cambiar la temperatura de 28 a 30Æ C y de
7000 a 2700 cps al incrementarla de 30 a 32Æ C. Ha sido definido un Indice de viscosidad (Iv) que representa el
grado de polimerización del polisacárido, y se expresa como el Ln de la viscosidad dividido entre la concentración
del polisacárido6 . Así, el mayor valor obtenido para el Iv a
30Æ C (Tabla 8) estaría indicando que el polisacárido producido tiene una composición de sustituyentes diferente al
207
Producción de xantano
Figura 4. Efecto de la temperatura sobre el rendimiento y la
producción específica de xantano por Xanthomonas campestris
vp. ocumo.
El proceso se realizó en un fermentador LKB de 14 litros con un
volumen de trabajo de 10 litros. La composición del medio fue
(g/l): azúcares (JGF) 50, urea 0.5, K 2 HPO4 3H2 O 5, MgSO4
7H2 O 0.1, pH 7.5. Otras condiciones: aireación entre 0.3 y 1
vvm, agitación de 250 a 1000 rpm. La formación de espuma se
controló con silicona (Wacker Silicone). Las medidas se realizaron (de acuerdo a lo indicado en Materiales y Métodos) a las
84 horas para la experiencia a 30 Æ C y a las 96 para las de 28 y
32Æ C.
obtenido a 28 y 32Æ C.
Con el fin de iniciar un estudio en base a costos para
la producción de xantano, comparamos la diferencia en la
dinámica existente entre varios parámetros cuando se utilizó una fuente de carbohidrato no convencional y barata,
como el Extracto Acido de Corteza de Yuca (EACY), en
sustitución del JGF. En la figura 5 se puede observar que
todos los valores son menores cuando se utiliza EACY como medio de producción. El resultado era de esperar por
cuanto este medio contiene una elevada proporción de
material lignocelulósico que no puede degradar X. campestris vp. ocumo en tanto que el JGF conforma un medio
con elevado grado de concentración en glucosa y relativamente alta pureza. No obstante, el EACY es un medio con un costo prácticamente nulo en el que habría que
pensar para el caso de una producción industrial del xantano. Un resultado observado fue la poca competitividad
de X. campestris vp. ocumo, frente a la contaminación por
otros microorganismos. Esta vulnerabilidad debe tomarse
en cuenta en el desarrollo de mutantes superproductores
de xantano resistentes a antibióticos.
En este trabajo hemos utilizado indistintamente la deno-
Figura 5. Comparación de los cambios dinámicos en parámetros relacionados con la producción de xantano por Xanthomas
campestris vp. ocumo en dos medios con diferentes fuentes de
carbono.
Volumen del medio: 10 litros en un fermentador de 14 litros.
Las fuentes de carbono (50 g/l) fueron el Jarabe glucosado FAVEPRO (JGF) y el extracto ácido soluble de corteza de yuca (EACY). Los demás componentes del medio (g/l): urea 0.5,
K2 HPO4 3H2 O 5, MgSO4 7H2 O 0.1. La incubación se realizó
a 30Æ C, pH 7.5, aireación entre 0.3 y 1 vvm y agitación de 250
a 1000 rpm. Se controló la espuma mediante la adición de silicona (Wacker Silicone). Las medidas analíticas se realizaron de
acuerdo a lo indicado en Materiales y Métodos.
minación de producción de viscosidad o de polisacárido y
producción de xantano como equivalentes. No obstante,
estamos conscientes de que no hemos demostrado con
resultados inequívocos que esa equivalencia exista. Así,
aunque sabemos por determinaciones de azúcar que en
la fracción precipitada con etanol existe un carbohidrato,
queda por caracterizar la composición química del polisacárido producido por X. campestris vp ocumo.
CONCLUSIONES
Se demostró que en Venezuela se pueden encontrar cepas autóctonas de X. campestris, buenas productoras de
goma xantano con rendimiento similar a los reportados en
la bibliografía consultada. Por otro lado, nuestro país elabora sustratos como el JGF, obtenido por hidrólisis ácida
a partir de arroz, donde X. campestris puede sintetizar un
xantano con buenas propiedades reológicas. Además, es
posible desarrollar medios de cultivo baratos basados en
desechos agroindustriales (p.e., EACY), donde la bacteria
puede sintetizar el polisacárido. La urea como fuente de
208
Azuaje y Sánchez
Tabla 8. Efecto de la temperatura sobre diferentes parámetros medidos durante el proceso de producción de xantano por X. campestris vp. ocumo.
Temperatura
P.S.C
P.S.X
Viscosidad
Indice de Viscosidad
C.C.
Proteína
Cenizas
K
Vpx.
Vcc.
PB
PX
ÆC
28
30
g/l
3.45
2.52
g/l
24.32
23
cps
3000
7000
–
0.33
0.38
g/l
37
30
%
3.5
3
%
20
15
g P.S.C/C.C h
0.24
0.17
g P.S.X./C.C h
0.22
0.28
g C.C/h
0.33
0.44
g P.S.C/C.C h 9.7 10 4 1 10
g P.S.X/C.C h 7 10 3 9 10
32
3
3
2.45
21.5
2700
0.36
34
2.5
25
0.16
0.15
0.29
7.5 10 4
6 10 3
Cada valor es un promedio de tres experiencias diferentes. La composición del medio: (% P/V): Azúcar total (JGF) 5, Urea 0.05,
K2 HPO4 3H2 O 0.5, MgSO4 7H2 O 0.01, pH 7.5, volumen de inóculo 10%, antiespumante silicona (Wacker Silicone), aireación entre
0.3 vvm-1 vvm, agitación entre 250 - 1000 rpm. Las velocidades K (velocidad de crecimiento celular en la fase exponencial), Vpx.
y Vcc. se calcularon durante la fase de crecimiento exponencial, mientras que la productividad de biomasa (P B ) y de xantano (P X ),
se calcularon cuando la concentración de xantano se hizo constante. Se utilizó un Fermentador LKB de 14 litros con un volumen de
trabajo de 10 litros. Las determinaciones se hicieron como se indica en Materiales y Métodos.
nitrógeno, puede ser útil en la formulación de medios para la producción de xantano en gran escala. El establecimiento de parámetros óptimos a escala de fermentador de
14 litros es un punto de referencia para el escalamiento a
volúmenes de planta piloto. Debido a que la acumulación
de xantano en el medio disminuye la transferencia de masas en el bioproceso, es necesario diseñar fermentadores
donde este fenómeno sea minimizado al máximo y mejorar también las características del medio de cultivo. Todo
ello conduciría a una mayor producción y rendimiento de
goma xantano, para la que faltaría precisar su tipo y cali-
dad reológica.
AGRADECIMIENTOS
El desarrollo de este trabajo fue posible gracias al financiamiento del C.D.C.H.T-ULA, subsidio C487-91. Queremos
agradecer al Laboratorio de Bacteriología de la Facultad
de Agronomía de la U.C.V, en especial a los Profesores
Gustavo Trujillo y Yonis Hernández, por la donación de las
cepas bacterianas utilizadas en este estudio.
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