ODZIV BIOMEMBRANSKIH DOMEN NA ZUNANJE DRAŽLJAJE

Transcription

UNIVERZA V MARIBORU
FAKULTETA ZA NARAVOSLOVJE IN MATEMATIKO
DOKTORSKA DISERTACIJA
ODZIV BIOMEMBRANSKIH DOMEN
NA ZUNANJE DRAŽLJAJE
Iztok Urbančič
mentor: izr. prof. dr. Janez Štrancar
somentor: doc. dr. Miha Škarabot
December, 2013
Biba leze, biba gre,
da bi prišla do gore,
vrh gore do bistre vode,
kamor nihče drug ne more.
Iskrena hvala
mentorjema za zemljevid,
sodelavcem za brvi,
domačim za čevlje
ter Dunji in Brini za sonce.
Kazalo
Povzetek ................................................................................................................................ 7
Abstract .................................................................................................................................. 9
Seznam pogosto uporabljenih kratic in oznak ..................................................................... 11
1
Membranske domene................................................................................................ 13
1.1
1.2
1.3
1.4
Kratke osnove bioloških membran .................................................................... 14
Pregled zgodovine in današnjega razumevanja membranskih domen .............. 15
Pregled razpoložljivih merilnih metod .............................................................. 17
Cilji doktorske disertacije.................................................................................. 20
Fluorescenčna mikrospektroskopija ......................................................................... 21
2
2.1
2.2
2.3
2.4
3
Fluorescenca ...................................................................................................... 22
Fluorescenčna mikroskopija .............................................................................. 26
Fluorescenčna mikrospektroskopija .................................................................. 29
Uporabljeni merilni sistem FMS ....................................................................... 32
Podrobnosti laboratorijskega dela ............................................................................ 39
3.1
3.2
Priprava vzorcev ................................................................................................ 39
Potek meritev..................................................................................................... 41
Obdelava fluorescenčnih spektrov............................................................................ 43
4
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
5
Matematični modeli oblike fluorescenčnega spektra ........................................ 45
Prilagajanje modela bledečim spektrom ........................................................... 51
Natančnost določanja lege spektralnega vrha ................................................... 52
Odpravljanje vplivov bledenja fluorescence na izmerjen spekter ..................... 56
Načini predstavitve rezultatov FMS .................................................................. 60
Program FMSfit................................................................................................. 62
Prepoznavanje odziva biomembranskih faz s FMS .................................................. 65
5.1
5.2
5.3
5.4
Spremljanje biomembranskih faz zaradi biokemijske sestave .......................... 66
Spreminjanje biomembranskih faz zaradi temperaturnih vplivov .................... 70
Zaznavanje lastnosti pestrejših membranskih sistemov .................................... 73
Uporabnost FMS za raziskovanje membranskih faz in domen ......................... 77
Prepoznavanje soobstoječih konformacij označevalcev........................................... 79
6
6.1
6.2
6.3
6.4
Kotna odvisnost fluorescence zaradi soobstoja stanj označevalcev .................. 81
Ugotovljeno obnašanje označevalcev NBD-PC ................................................ 83
Primerjava z doslej znanimi značilnostmi označevalcev NBD-PC .................. 87
Razprava o metodi ............................................................................................. 91
5
Odziv biomembranskih domen na zunanje dražljaje
7
Znanstveni prispevki ................................................................................................ 95
7.1
7.2
7.3
Dodatek A
A.1
A.2
Dodatek B
B.1
B.2
Dodatek C
C.1
C.2
C.3
Celostni razvoj metode FMS ............................................................................ 95
»Slikanje« molekularnih konformacij označevalcev s pFMS .......................... 98
Raziskave zgradbe in lastnosti biomembran ..................................................... 99
Ustreznost koncentracij označevalcev .................................................... 101
Označevalci NBD-PC ..................................................................................... 101
Označevalec SPP268 ...................................................................................... 102
Toplotni učinek žarka optične pincete ..................................................... 103
Izračun pričakovanega temperaturnega polja ................................................. 103
Meritve toplotnega učinka optične pincete ..................................................... 108
Model soobstoječih konformacij označevalcev ....................................... 111
Opis kotno odvisnih spektralnih lastnosti ....................................................... 111
Model dveh molekularnih konformacij označevalcev .................................... 112
Ocena ureditvenih potencialov ....................................................................... 116
Viri .................................................................................................................................... 117
Življenjepis ........................................................................................................................ 125
6
Povzetek
Membrane živih celic opravljajo vrsto nujno potrebnih nalog in omogočajo mnogo
ključnih procesov: opredeljujejo notranjost celice, jo ščitijo pred zunanjimi vplivi,
nadzirajo pretok snovi v celico in iz nje ter s tem vzdržujejo stalne notranje razmere,
prevajajo električne in biokemijske signale, omogočajo ali pospešujejo kemijske reakcije
idr. V zadnjem času postaja jasno, da pri tem poleg beljakovin, ki so donedavna veljale za
glavno aktivno sestavino, ključno vlogo igrajo tudi maščobne molekule, ki se v membrani
lateralno razporedijo v heterogene strukture, t. i. membranske domene. Njihove vloge in
lastnosti so danes še razmeroma nepoznane, saj so domene zaradi svoje velikosti med
nano- in mikrometri ter življenjskega časa med nano- in milisekundami današnjim
merilnim metodam težko dostopne.
Dandanes se zato živahno razvijajo nove tehnike, ki skušajo z združevanjem različnih
pristopov razširiti svoja krajevna in časovna okna zaznavanja ter s tem obogatiti dostopne
podatke. V okviru tega doktorskega dela smo tako razvili sistem za fluorescenčno
mikrospektroskopijo (FMS), ki povezuje dve zelo uveljavljeni metodi: fluorescenčno
mikroskopijo, ki omogoča slikanje vzorcev z krajevno ločljivostjo okoli 200 nm, ter
spektroskopijo, s katero lahko spremljamo molekularne lastnosti neposredne okolice
označevalcev na ravni nanometrov in nanosekund. S FMS lahko tako izvor omenjenih
molekularnih informacij opredelimo z natančnostjo, ki je primerna za raziskovanje celičnih
struktur.
Zaradi šibkih razpoložljivih signalov fluorescence smo posebno pozornost posvetili
izvedbi meritev in njihovi obdelavi. Z izvirnim načinom zajemanja podatkov in uvedenim
prilagajanjem modelnih funkcij smo spektralno ločljivost, značilno za spektroskopske
meritve razsežnih vzorcev, prenesli na mikroskopski nivo. Hkrati smo odpravili tudi vpliv
bledenja fluorescence na izmerjene podatke, ki je doslej neobhodno popačilo obliko
spektrov svetlobno neobstojnih barvil in je zato močno omejevalo zanesljivost razlage
rezultatov FMS. Z uvedenim pristopom smo tako močno razširili paleto uporabnih
okoljsko občutljivih molekularnih označevalcev, ki jih lahko raziskovalci sedaj še bolje
prilagodijo potrebam svojih raziskav.
Bledenje fluorescenčnega signala smo lahko z razvitim načinom merjenja in obdelave
celo izkoristili za pridobivanje novih pomembnih podatkov o značilnostih molekularnega
okolja, saj je tudi hitrost bledenja nekaterih barvil odvisna od fizikalno-kemijskih lastnosti
neposredne okolice označevalcev. Tako smo še dopolnili nabor krajevno odvisnih
informacij, kar je še posebno pomembno za raziskave pestrih bioloških sistemov, pri
katerih za zadovoljiv opis potrebujemo čim več neodvisnih spremenljivk.
7
Z razvito metodo FMS smo pokazali, da lahko tako na modelnih membranskih sistemih
kot na membranah živih celic zanesljivo spremljamo spremembe faz in domen pod
vplivom temperature in biokemijske sestave. Izmerjen premik vrha fluorescenčnega
spektra barvil NBD in Laurdan za 1-3 nm zaradi različnih lokalnih polarnosti je
zadostoval, da smo razločili posamezne liposome v gelski, tekoči urejeni ali tekoči
neurejeni lipidni fazi, ki smo jih pripravili iz različnih mešanic lipidov. Nedvoumnost
rezultatov smo potrdili z opazovanjem faznega prehoda posameznih liposomov iz gelske v
tekočo neurejeno fazo med nadzorovanim segrevanjem vzorca z grelnim stekelcem ali
infrardečim laserskim žarkom optične pincete.
Spektralna in krajevna ločljivost FMS sta ostali na podobni ravni tudi pri opazovanju
kompleksnejših vzorcev, kot so npr. mešanice liposomov in celic, pri katerih meritve
pogosto otežujeta svetlobna prispevka avtofluorescence in celičnega gojišča. Zaradi
robustnosti metode FMS smo vseeno lahko razjasnili mehanizem dostave protitumorske
učinkovine v celice raka dojke s pomočjo lipidnih nanodelcev. Iz razlik v izsevanih
fluorescenčnih spektrih okoljsko občutljivih barvil smo ugotovili, da se membrane
dostavnih liposomov zlivajo z membranami celic in tako prenesejo učinkovino do svojega
cilja. S tem dognanjem smo pripomogli k razvoju novih biomedicinskih pristopov za
učinkovitejše zdravljenje najtežjih bolezni našega časa.
Metodo FMS smo nato nadgradili še z analizo polarizacije izsevane fluorescenčne
svetlobe, ki je povezana z ureditvijo dipolov barvila v membranah in s tem s
konformacijami označevalnih molekul. Z združitvijo spektralnega in polariziranega
zaznavanja smo podali prvi neposredno izmerjen dokaz, da eni najpogosteje uporabljenih
okoljsko občutljivih fluorescenčnih membranskih označevalcev – fosfolipidi z barvilom
NBD – v membranah zavzamejo različne konformacije na razdaljah pod optično krajevno
ločljivostjo. S pomočjo razvitega matematičnega modela smo ta stanja tudi podrobneje
opisali in določili njihove relativne deleže. Ugotovili smo, da na slednje najmočneje vpliva
visoka koncentracija holesterola v membrani, čigar toga ravninska kemijska zgradba s
tesnim zlaganjem okoliških molekul označevalcem očitno vsili drugačno konformacijo.
Ker je prav visoka koncentracija holesterola značilna za še vedno skrivnostne lipidne
splave in nanodomene, bi lahko s tovrstnim konformacijskim slikanjem v prihodnje
pridobili mnogo novega znanja o nanoskopskih značilnostih zgradbe bioloških membran
ter z njo povezanih biofizikalnih in biokemijskih procesih. S tem bi pomembno dopolnili
svoje razumevanje osupljivega delovanja osnovne enote življenja – celice.
Ključne besede: fluorescenčna mikrospektroskopija, spektralno slikanje, obdelava
spektrov, bledenje fluorescence, okoljsko občutljivi fluorescenčni označevalci, NBD,
Laurdan, biološke membrane, membranske domene, velikanski enoslojni liposomi,
molekularne konformacije
UDK:
8
[543.423.3:535.372]:577.352(043.3)
[681.785.5:681.723.27]:577.336(043.3)
Response of biomembrane domains to external stimuli
Abstract
The membranes of living cells support diverse vital functions and enable various crucial
processes: they define and protect the interior of the cell, control the flux of matter to
sustain desirable internal conditions, transmit electrical and biochemical signals, enable or
promote chemical reactions, etc. It has recently become clear that besides proteins, which
had long been considered the main active component of biomembranes, lipids also play an
important part by organizing themselves into heterogeneous structures, termed lipid rafts or
membrane domains. However, their roles and functions remain largely unclear due to their
small size, ranging between nano- and micrometers, and short lifetimes on the order of
nano- to milliseconds, which makes them inaccessible to the experimental methods
presently available.
To enrich our knowledge about membrane domains, new measurement techniques with
extended spatial and temporal windows are being vigorously developed by combining
various approaches. Following such efforts of the scientific community, we set up
fluorescence microspectroscopy (FMS), bridging two well-established methods:
fluorescence microscopy, which enables imaging of the samples with spatial resolution
down to 200 nm, and fluorescence spectroscopy that provides molecular information of the
environment at nanometer and nanosecond scale. The combined method therefore allows
us to localize this type of information with the precision suitable for studying various
cellular structures.
Faced with weak available fluorescence signals, we have put considerable efforts into
optimization of measurement processes and analysis of the data. By introducing a novel
acquisition scheme and by fitting the data with a mathematical model, we preserved the
spectral resolution, characteristic for spectroscopic measurements of bulk samples, also at
microscopic level. We have at the same time overcome the effects of photobleaching,
which had previously considerably distorted the measured spectral lineshape of
photosensitive dyes and consequently hindered the reliability of FMS. Our new approach
has therefore greatly extended the range of applicable environmentally sensitive probes,
which can now be designed to better accommodate the needs of each particular
experiment.
Moreover, photobleaching of fluorescence signal can now even be exploited to obtain
new valuable information about molecular environment of the probes, as bleaching rates of
certain probes also depend on physical and chemical properties of the local surroundings.
In this manner we increased the number of available spatially localized spectral
9
Response of biomembrane domains to external stimuli
parameters, which becomes invaluable when investigating complex biological systems that
can only be adequately characterized by several independent variables.
Applying the developed method FMS to several model membrane systems as well as to
living cells, we showed that we can reliably detect the differences in lipid phases and
membrane domains upon changes of temperature or biochemical composition. A 1–3 nm
spectral shift of probes NBD and Laurdan due to different local polarity was sufficient to
clearly distinguish individual vesicles in gel, liquid ordered, or liquid disordered lipid
phase that had been prepared from different lipid mixtures. The results were corroborated
by observations of phase transition of individual liposomes from gel to liquid disordered
phase upon controlled heating of the sample by a heating slide or by a focused infrared
laser beam of optical tweezers.
The spectral and spatial resolution of FMS were preserved also when observing more
complex biological samples, such as mixtures of liposomes and cells, showing that our
results were not affected by signals of autofluorescence and growth medium, which often
obstruct other fluorescence measurements. The robustness of the method allowed us to
identify the delivery mechanism of a cancerostatic drug into human breast cancer cells by
lipid nanoparticles. Small spectral shifts of an environment-sensitive dye revealed that the
membranes of drug-carrying liposomes fuse with the membranes of cancer cells, delivering
the therapeutic substance into the target. Our findings pave the way towards new
biomedical approaches for more efficient treatment of the gravest maladies of our time.
Furthermore, we upgraded FMS by analyzing the polarization of emitted fluorescence,
which is related to the orientational order of dyes’ dipoles in the membrane and therefore
also to molecular conformations of the probes. The combination of spectral and polarized
detection enabled us to provide the first direct experimental evidence that some of the most
widely used environment-sensitive membrane probes – NBD-labelled phospholipids –
undertake various conformations that coexist at distances below optical spatial resolution.
Developing a mathematical model, we additionally characterized these conformations and
determined their relative portions. We found that they are greatly affected by high
concentration of cholesterol, which forces the probes into a different conformation due to
its rigid planar chemical structure that favors tight packing of neighboring molecules.
Since high concentration of cholesterol is characteristic for mysterious lipid rafts and
nanodomains, such conformational imaging could be in future largely exploited to extend
our insight into the nanoscale structure of biomembranes and associated biophysical and
biochemical processes. Hence, it could enlighten many current mysteries about the basic
unit of life – the cell.
Keywords: fluorescence microspectroscopy, spectral imaging, spectral analysis,
fluorescence photobleaching, environment-sensitive fluorescent probes, NBD, Laurdan,
biomembranes, membrane domains, giant unilamellar vesicles, molecular conformations
UDC:
10
[543.423.3:535.372]:577.352(043.3)
[681.785.5:681.723.27]:577.336(043.3)
Seznam pogosto uporabljenih kratic in oznak
Kemikalije in vzorci
C6-NBD-PC
Fluorescenčni označevalec 1-palmitoil-2-{6-[(7-nitro-2-1,3benzoksadiazol-4-il)amino]heksanoil}-sn-gicero-3-fosfoholin
C12-NBD-PC Fluorescenčni označevalec 1-palmitoil-2-{12-[(7-nitro-2-1,3benzoksadiazol-4-il)amino]dodekanoil}-sn-glicero-3-fosfoholin
DCP
Lipid dicetil fosfat
DMSO
Topilo dimetil sulfoksid
DOPC
Lipid 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoholin
DPPC
Lipid 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoholin
GUV
Velikanski enoslojni liposomi
hol
Lipid holesterol
Laurdan
Barvilo 6-dodekanoil-2-dimetilaminonaftalen
NBD
Barvilo 7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-il
OPP
(1,1-dimetilpiperidin-1-ium-4-il) oktadecil fosfat
PG
Lipid 1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfo-[1-rac-glicerol]
SPP268
Fluorescenčni označevalec (2R,3S,4R,5R,6R)-2-(hidroksimetil)-5-((7nitrobenzo [c][1,2,5]oksadiazol-4-il)amino)-6-((1-tetradecil-1H-1,2,3triazol-4-il)metoksi)tetrahidro-2H-piran-3,4-diol
Raziskovalne metode in oprema
EPR
Elektronska paramagnetna resonanca
FCS
Fluorescenčna korelacijska spektroskopija
FLIM
Slikanje življenjskega časa fluorescence
FMS
Fluorescenčna mikrospektroskopija
FRET
Försterjev resonančni prenos energije
LCTF
Nastavljivi tekočekristalni filter
MD
Molekularna dinamika
NMR
Jedrska magnetna resonanca
11
Fizikalne količine, konstante in merske opazljivke
a
Nesimetričnost fluorescenčnega emisijskega spektra
b
Hitrost bledenja fluorescence
c
Hitrost svetlobe v vakuumu
d1,2
Relativni delež prve oz. druge spektralne komponente
eLCTF
Smer polarizacije, ki jo prepusti LCTF
h
Planckova konstanta
I
Jakost signala fluorescenčne svetlobe
I0
Najvišja jakost signala nezbledelega spektra
kB
Boltzmannova konstanta
n
Lomni količnik snovi
n
Pravokotnica na ravnino membrane
NA
Numerična odprtina objektiva
PLCTF
Spektralna prepustnost LCTF
S
Matematična funkcija opisa oblike spektra
SNR
Razmerje signala proti šumu
SNRTOT
Celokupni SNR pri meritvah FMS
t
Čas od začetka poskusa
tEXP
Osvetlitveni čas posameznega posnetka
tTOT
Trajanje celotnega poskusa
T
Temperatura
Tm
Temperatura glavnega faznega prehoda lipidov
w
Širina fluorescenčnega emisijskega spektra na polovični širini
W
Razpon vzorčenja valovnih dolžin

p


Kot po obodu liposoma, merjen od polarizacijske smeri LCTF

Razpon vzorčenja valovnih dolžin

MAX
p
max
Valovna dolžina

Kvantni izkoristek barvila

Mera za uspešnost prilagajanja modela podatkom
2
12
Napaka parametra p oz. njegovo odstopanje od pričakovane vrednosti
Dielektričnost snovi
Velikost koraka vzorčenja valovnih dolžin
Lega vrha fluorescenčnega emisijskega spektra
Nedoločenost parametra p
Nedoločenost lege spektralnega vrha
1 Membranske domene
Biološka membrana je tanka dvojna plast lipidnih in proteinskih molekul, ki razmejuje
notranjost vsake celice živih organizmov od zunanjega sveta in notranje celične organele
od citosola [1]. S tem celici oz. organelu omogoča, da v svoji notranjosti vzdržuje
drugačne koncentracije snovi kot v neposredni okolici, kar pomeni, da mora krajevno in
časovno nadzorovati prehod posameznih vrst molekul v celico (organel) in iz nje (-ga).
Hkrati membrane prenašajo biokemijska sporočila iz okolice, omogočajo delovanje
mnogih encimov in receptorjev, posredujejo interakcije z zunajceličnim matriksom,
obvladujejo stike s sosednjimi celicami, ščitijo celico pred tujki, itd. [1]
Že iz pestrosti vlog je očitno, da mora biti zgradba bioloških membran zelo bogata.
Včasih so predvidevali, da so za večino nalog odgovorni proteini (encimi, receptorji ...), ki
plavajo v enakomernem »lipidnem morju«, kar so opisali z modelom t. i. tekočega
mozaika [2]. Po štiridesetih letih intenzivnih bioloških, biokemijskih in biofizikalnih
raziskav je jasno, da to lipidno morje še zdaleč ni enakomerno, niti ni le pasivno nosilno
okolje proteinom, temveč se njegova biokemijska sestava in s tem biofizikalne lastnosti
krajevno in časovno spreminjajo ter s tem dejavno sodeluje pri mnogih življenjsko
pomembnih procesih: pri endocitozi, pri organizaciji receptorjev, združevanju
membranskih proteinov v skupke, pri prenosu snovi med posameznimi deli celice, pri
delovanju toksinov, vstopu virusov v celico in iz nje itd. [3]
Omenjene lokalne membranske strukture oz. domene, ki jih skupaj gradijo lipidi in
proteini, glede na njihovo velikost in sestavo imenujejo nanoskupki ali lipidne lupine (angl.
nanoclusters oz. lipid shells; 1–10 nm), lipidni splavi ali nanodomene (angl. lipid rafts oz.
nanodomains; 10–200 nm) [4] ter (mikro)domene (angl. microdomains; nad 200 nm) [5].
Prav tako kot velikost domen je biološko pomembna tudi njihova časovna stabilnost [3]:
termodinamične fluktuacije lokalne sestave se dogajajo na nanosekundni ravni, nekatere
membranske domene so lahko obstojne tudi po več ur, večina z domenami povezanih
molekularnih procesov pa poteka v časovnem okviru med mikro- in milisekundami.
Kot je podrobno predstavljeno v nadaljevanju tega poglavja, so membranske domene
prav zaradi svojih krajevnih in časovnih značilnosti večini merilnih metod le s težavo
dostopne. Zato se v zadnjem času bliskovito razvijajo nove metode, ki se želijo
opazovanemu problemu približati z novimi pristopi ali z združevanjem obstoječih. V tej
luči smo tekom pričujočega doktorskega dela zasnovali in razvili fluorescenčno
mikrospektroskopijo (FMS) in konformacijsko slikanje, s katerima bomo lahko v prihodnje
pomembno dopolnili naše razumevanje delovanja membranskih domen in splavov.
13
1.1 Kratke osnove bioloških membran
Več kot polovico mase membran običajnih živalskih celic predstavljajo različne maščobne
molekule, med katerimi so najštevilčnejši fosfolipidi [1]. Molekule slednjih so zgrajene iz
polarne glave in dveh nepolarnih ogljikovodičnih (alkilnih) repov, zato ob stiku z vodo
spontano tvorijo zgradbe, ki nepolarne dele skrijejo v notranjost, proti topilu pa izpostavijo
polarne dele. Ob zadostni koncentraciji se uredijo v ravninski dvosloj (Slika 1.1), ki se ob
robovih zaključi sam vase. Nastali stabilni mehurček imenujemo liposom ali vesikel, ki
predstavlja najpreprostejši modelni sistem za membrane celic in njenih organelov.
Membrane različne biokemijske sestave se zaradi različnega prileganja sosednjih
molekul ter posledično različno močnih medsebojnih vplivov nahajajo v različnih stanjih
oz. fazah [6]. Med nasičenimi alkilnimi verigami, tj. takimi s samimi enojnimi vezmi,
daljšimi od 12 C-atomov, van der Waalsov privlak med gibkimi repi pri sobni temperaturi
prevlada nad njihovim termičnim opletanjem, zaradi česar se verige smerno uredijo
(Slika 1.1 A).
Ob segrevanju nad temperaturo glavnega faznega prehoda (Tm) se membrana iz
t. i. gelske faze stopi v tekočo neurejeno fazo (Slika 1.1 B), ob čemer se nezvezno zniža
ureditveni parameter verig in povišata tako lateralna kot rotacijska difuzija [7]. Spremembo
spremlja utajena toplota, tako da gre za pravi termodinamski fazni prehod prvega reda. V
podobnem stanju se že pri sobni temperaturi nahajajo membrane iz fosfolipidov z
nenasičenimi alkilnimi repi, katerih dvojne vezi povzročajo kolena v poteku verige in s tem
preprečujejo tesno zlaganje molekul [6]. Hitra difuzija gradnikov tekoče neurejene faze
celičnim membranam omogoča hipen odziv na lokalne molekularne spremembe.
Lastnosti obeh lipidnih faz se močno spremenijo ob koncentracijah holesterola, ki je
prav tako zelo pogosta sestavina celičnih membran, nad okoli 30 % [7]. Njegova toga
zgradba v zunanjem predelu membrane uredi alkilne verige okoliških lipidov, v sredici pa
repom sprosti nekaj prostora za poganjanje hitre lateralne difuzije (Slika 1.1 C), zaradi
česar tako stanje najpogosteje imenujejo tekoča urejana faza [7].
Opisani primeri predstavljajo obnašanje najpreprostejših modelnih membranskih
sistemov. Ob večanju pestrosti njihovih gradnikov se le-ti zaradi različnih medsebojnih
vplivov lahko tudi lateralno razporedijo v otočke različne zgradbe v različnih fazah,
t. i. membranske domene in splave.
Slika 1.1 Biološke membrane so zgrajene iz dvosloja maščobnih molekul, ki vodi izpostavijo
polarne glave, nepolarne repe pa skrijejo v notranjost. Membrane fosfolipidov (PL) se glede na
temperaturo in biokemijsko sestavo nahajajo v treh glavnih lipidnih fazah: (A) gelski,
(B) tekoči neurejeni in (C) tekoči urejeni fazi, za katero je značilna visoka koncentracija
holesterola (hol). Faze se med seboj razlikujejo predvsem v urejenosti alkilnih verig ter hitrosti
lateralne in rotacijske difuzije gibanja molekul.
14
1 Membranske domene
1.2 Pregled zgodovine in današnjega razumevanja membranskih domen
Prve namige o obstoju splavov [8] in podobnih struktur so podali poskusi, s katerimi so
ugotovili, da nekateri deli celičnih membran niso topni v sicer zelo učinkovitem detergentu
Triton X-100 [9]. Biokemijska analiza je pokazala, da ti deli membran vsebujejo
nenavadno visoke koncentracije holesterola ter nekaterih drugih vrst lipidov in beljakovin.
Ponovitev poskusov na biokemijsko podobnih modelnih membranah je potrdila opaženo
obnašanje [10], iz česar so zaključili, da se lipidne molekule samourejajo tudi v ravnini
membrane in glede na biokemijsko sestavo tvorijo lateralno heterogene supramolekularne
strukture z značilno velikostjo okoli 50 nm [11].
Iz poplave sledečih raziskav na modelnih membranskih sistemih so s fluorescenčno
mikroskopijo (FM), Försterjevim resonančnim prenosom energije (FRET), jedrsko in
elektronsko (para)magnetno resonanco (NMR oz. EPR) in drugimi raziskovalnimi
metodami dobili obilo informacij o ločevanju faz v različno sestavljenih lipidnih
dvoslojih [12–15]. Najpogostejši kombinaciji lipidov, v katerih se zaradi neidealnega
mešanja tekočin pod kritično temperaturo pojavi soobstoj različnih faz, sta

hol + sfingomielin + fosfatidilholin (PC) z eno nenasičeno verigo ter

hol + PC z nizko Tm + PC z visoko Tm.
Pri velikanskih enoslojnih liposomih (angl. giant unilamellar vesicles, GUV) iz ustreznih
razmerij omenjenih kombinacij lipidov v določenem temperaturnem območju nastanejo
membranske domene, velike tudi po 10 m in stabilne več ur. Taki liposomi so zaradi
velikosti 10–50 m zelo prikladni za neposredno opazovanje s fluorescenčno mikroskopijo
in ustreznim označevanjem [10] ter so posledično najpogosteje uporabljen približek za
celične membrane.
Pravkar opisani modelni sistemi sicer lepo pokažejo, da lahko lipidne molekule
spontano tvorijo heterogene strukture, a se njihovo obnašanje močno razlikuje od
opaženega v živih bioloških sistemih, saj tako velikih in stabilnih domen v celicah niso
zaznali. Njihove učinke so v celicah doslej povečini lahko opazovali le posredno [3,5], saj
so domene celičnih membran očitno veliko manjše (pod ločljivostjo običajnih svetlobnih
mikroskopov, tj. okoli 200 nm [16,17]) in bolj kratkožive (predvidoma pod 1 ms) [18].
Trokomponentni modelni sistemi so torej premočno poenostavljeni, da bi zvesto
posnemali pestrost naravnih membran, kar ponazarjajo naslednje znane značilnosti:

Celice evkariontskih organizmov gradi več kot tisoč vrst lipidnih molekul [19],
njihova razmerja pa se med posameznimi organeli močno razlikujejo [20].

Nekaj novejših raziskav sicer nakazuje, da so tudi iz celic pridobljene mešanice
lipidov nagnjene k faznemu ločevanju [21,22]; mikrometrske domene opazijo pri
temperaturah pod okoli 25 °C, pri fiziološki temperaturi pa so membrane še vedno
dovolj blizu kritični točki mešanja komponent, da bi lahko zaradi fluktuacij lokalne
sestave nastajali okoli 20 nm veliki lipidni splavi [22].

Sestava zunanjega in notranjega enosloja celičnih membran je za razliko od umetno
pripravljenih liposomov izrazito nesimetrična [23], mehanizem sklopitve med
njima pa je še precej nejasen [3,24].
15

Oblika zdravih celic je daleč od okrogle, značilne za modelne lipidne mehurčke;
nekatere raziskave kažejo, da lahko lokalna ukrivljenost membrane spodbuja
ločevanje različnih vrst lipidnih molekul [25], čeprav to v nekaterih primerih
opaženih splavov verjetno ni ključni dejavnik njihovega nastanka [26].

Membrane živih celic so daleč od termodinamičnega ravnovesja zaradi neprestane
celične dejavnosti – presnove lipidov, delovanja encimov, ki premeščajo lipidne
molekule, ter zlivanja in odcepljanja membranskih mehurčkov. Omenjeni procesi
imajo veliko hitrejše učinke kot spontano vračanje v ravnovesno stanje velikih
domen z najmanjšo energijo linijskih napetosti [3,18]. Pokazali so tudi, da je velik
del genskega zapisa celic neposredno povezan s premeščanjem holesterola ter za
splave značilnih lipidov in proteinov, kar nakazuje, da naj bi celice načrtno
vzdrževale majhne domene [5,18].

Celične membrane poleg lipidov gradi tudi velika količina proteinov, ki
predstavljajo okoli 50 % celotne mase membran [1]. Pri taki koncentraciji je v
povprečju okoli vsakega proteina prostora le za nekaj plasti lipidnih molekul [5],
kar lahko močno otežuje kolektivne lipidne pojave.

Membranski proteini lahko po drugi strani tudi stabilizirajo sicer le prehodno
kolebanje lokalne sestave lipidov, saj lahko kot detergenti zmanjšajo linijsko
napetost na meji dveh domen [13,18]. Prav tako so znane specifične interakcije
med nekaterimi proteinskimi in lipidnimi molekulami, ki lahko spodbudijo lokalno
združevanje molekul [5]. Slednje je pomembno za pravilno delovanje membranskih
proteinov, saj so energije posameznih konformacij – in s tem prehodi med njimi,
potrebni za opravljanje naloge proteina – tesno povezane z njihovim neposrednim
okoljem, torej lipidnim ovojem in morebitnimi partnerskimi proteini.

Poleg membranskih proteinov lahko na strukturo domen vpliva tudi celični
skelet [3], tj. preplet vlaknatih proteinov pod membrano, ki se na več mestih sidra
vanjo in celici daje mehansko oporo. Mesta pritrditve na membrano so lahko
lokalna jedra nastanka nanodomen, celotna mreža sider pa predstavlja širše ogrodje,
ki lahko lokalno omejuje difuzijo in s tem oblikovanje mikrodomen [3].
Tako očitno še ni enoznačnega odgovora, ali se membranski proteini razporejajo v
predpripravljene lipidne domene ali so tudi aktivni vzrok njihovega nastanka; gre za
zapletene medsebojne vplive med lipidi, lipidi in proteini ter med samimi proteinskimi
molekulami, ki se skupaj sestavijo v osupljivo natančno delujočo celoto – membrano žive
celice.
16
1 Membranske domene
1.3 Pregled razpoložljivih merilnih metod
Ob vsej biološki pestrosti k še večji nepreglednosti področja prispevajo tudi različne
raziskovalne metode. Vsaka tehnika ima namreč svoje časovno in krajevno okno
občutljivosti, pogojeno z osnovnimi fizikalnimi lastnostmi delovanja, zaradi česar različne
metode tudi na enakih sistemih domene vidijo različno [3]. Slika 1.2 predstavlja poskus
preglednega povzetka krajevnih in časovnih območij ločljivosti trenutno dosegljivih
tehnik, ki se najpogosteje uporabljajo za raziskovanje membranskih domen.

Metodi raztapljanja v detergentih, s katero so sprva odkrili domene, ne moremo
pripisati ne krajevnega ne časovnega okna, saj povsem uniči preiskovani sistem [3].

Diferencialna kalorimetrija (angl. differential scanning calorimetry, DSC) na
modelnih sistemih ne more določiti velikosti domen, lahko pa opazi njihove fazne
prehode, če so domene stabilne na minutni časovni ravni trajanja poskusa [27].

Po drugi strani lahko slikanje s presevnim elektronskim mikroskopom
(angl. transmission electron microscopy, TEM) določi velikosti domen tudi z
nanometrsko ločljivostjo [28], a je zaradi potrebne predpriprave vzorca izključeno
časovno dogajanje. Biološka smiselnost takih poskusov je zato precej vprašljiva.

Živim celicam veliko prijaznejše so fluorescenčne mikroskopije (FM) – konfokalna
FM (angl. confocal FM, CFM), FM pod popolnim notranjim odbojem (angl. total
internal reflection fluorescence microscopy, TIRFm) ipd. Zaradi uklona svetlobe so
omejene na krajevno ločljivost okoli polovice valovne dolžine [16,17], za poskuse
v vidnem področju torej na okoli 200 nm. Časovna ločljivost je pogojena z jakostjo
vzbujanja fluorescence, s svetlostjo označevalcev in občutljivostjo zaznavanja.
Trenutni sistemi lahko slikajo polna vidna polja mikroskopov (ob 100-kratni
povečavi to recimo pomeni okoli 80 m × 80 m oz. nekaj celic običajne velikosti)
z osvetlitvenimi časi nekaj milisekund [29,30].

Z optično krajevno ločljivostjo sta omejeni tudi metodi, ki merita hitrost difuzije
molekul v membrani: fluorescenčna korelacijska spektroskopija (angl. fluorescence
correlation spectroscopy, FCS) in obnavljanje fluorescence po bledenju
(angl. fluorescence recovery after photobleaching, FRAP). Zaradi razmeroma
počasne difuzije in potrebnega statističnega nabiranja signala morajo biti domene
zanju stabilne več sekund [31,32].

V zadnjih nekaj letih se je pojavila cela vrsta optičnih metod, ki vsaka na svoj način
obidejo omejitve uklona svetlobe ter tako dosegajo krajevne ločljivosti okoli 10–
20 nm. Sledenje posameznim delcem (angl. single particle tracking, SPT) je z
mikrosekundno časovno ločljivostjo med njimi najhitrejše [5], ki mu sledi dušenje
fluorescence s stimulirano emisijo (angl. stimulated emission depletion,
STED) [29,33]. Stohastične metode PALM (angl. photoactivated localization
microscopy), STORM (angl. stochastic optical reconstruction microscopy) ter
njune podizpeljanke, ki z naključno aktivacijo barvila vzbujajo zgolj podmnožico v
vzorcu prisotnih fluorescirajočih molekul, potrebujejo za rekonstrukcijo slike več
kot tisoč posnetkov in so zato temu primerno počasnejše [29].
17
Slika 1.2 Primerjava časovnih in krajevnih oken občutljivosti metod za raziskovanje
membranskih domen. Z razvojem FMS smo se z združevanjem tehnik v poševnem tisku želeli
približati biološko najpomembnejšemu področju faznega prostora domen in njihove
lokalizacije v celicah (siva področja). Podrobnejša razlaga kratic se nahaja v besedilu.
18

Z nekaterimi »super-ločljivimi« pristopi (STED, dvofotonsko vzbujanje) se lahko
enako izboljša ločljivost FCS. Hkrati se zaradi korenske povezave med povprečno
prepotovano potjo molekule in za to potrebnim časom še močneje spremeni
časovna občutljivost, ki sega že skoraj v mikrosekundno področje [31,33].

Podobne krajevne in časovne lastnosti kot prej omenjeni PALM in STORM ima
tudi vrstična mikroskopija v bližnjem polju (angl. near-field scanning optical
microscopy, NSOM) [29], ki vzbuja fluorescenco skozi vodnik v konici
mikroskopa na atomsko silo (angl. atomic force microscopy, AFM). Tako NSOM
kot AFM sta zaradi načina snemanja omejeni le na proučevanje površine celic.
Boljšo krajevno ločljivost (okoli 1 nm ali še nekoliko manj) lahko dosežeta na
podprtih modelnih membranah, tudi hitrost slikanja mikroskopskih območij se v
tem primeru lahko poviša na milisekundno raven [34,35].

Nanometrsko ločljivost dosegajo tudi ozko- in širokokotno sipanje rentgenskih
žarkov (angl. small/wide-angle X-ray scattering, SWAXS) ter ozkokotno sipanje
nevtronov (angl. small-angle neutron scattering, SANS), podoben problem kot
metode zgoraj pa imajo pri časovni komponenti; še najbliže fiziološko pomembnim
časom se približajo rentgenski poskusi s svetlobo sinhrotrona, medtem ko lahko
laboratorijski rentgenski viri in nevtronski viri zaznavajo le stabilne
domene [27,36,37]. Tovrstni poskusi lahko potekajo le na modelnih membranah.
1 Membranske domene

Povsem drugo področje faznega prostora v osnovi pokrivajo spektroskopske
metode: fluorescenčna spektroskopija (FS), FRET in merjenje časovnega
pojemanja fluorescence (angl. fluorescence lifetime spectroscopy, FLS) posredujejo
informacije o svojem neposrednem molekularnem okolju, kot ga občuti barvilo v
nekaj nanosekund trajajočem vzbujenem stanju [38,39]. V tem času lahko z
barvilom označene molekule v membrani z difuzijo prepotujejo nekaj nanometrov,
kar določa krajevno občutljivost omenjenih metod. Podoben krajevni doseg ima
tudi prenos energije med barvili pri tehniki FRET [40,41].

Še nekoliko hitrejše (pod 1 ns) in zato lokalno občutljivejše (pod 1 nm) so
spektroskopije, ki poročajo neposredno o gibanju delov molekul – Ramanova
spektroskopija in infrardeča (IR) spektroskopija s Fourjerjevo transformacijo
(angl. Fourier-transformed IR spectroscopy, FTIR) [27,42].

Podobne lastnosti ima tudi EPR [43,44], ki v kombinaciji z napredno spektralno
analizo [45–50] omogoča določanje membranskih heterogenosti v modelnih in
celičnih membranah [51,52]. Novi spinsko-fluorescenčni označevalci zdaj
omogočajo tudi krajevno lokalizacijo signala EPR [53].

Sorodna metoda NMR ima zaradi daljših relaksacijskih časov (okoli 10 s) okno
občutljivosti premaknjeno nekaj velikostnih redov višje [54,55].

Prej naštete spektroskopske metode z nanometrsko in nanosekundno ločljivostjo
(torej brez NMR) načeloma ne morejo razločevati med nanodomenami, obstojnimi
le nekaj nanosekund, in bolj stabilnimi mikrodomenami, a si lahko s časovno
odvisnimi poskusi tudi te metode podaljšajo okno občutljivosti v območje nad
milisekundami. Sunkovne metode EPR bi sicer lahko poročale tudi o dogajanju na
vmesnih časovnih ravneh, a ker tovrstne meritve potekajo pri nizkih temperaturah
(77 K ali še nižje), so lahko rezultati poskusov biološko manj smotrni.

Z mikroskopsko krajevno lokalizacijo spektroskopskih informacij si lahko
mikrospektroskopije podaljšajo tudi krajevno občutljivost v področje optične
ločljivosti in tako v živo sledijo molekularnim procesom na ravni celičnih struktur.
Med tovrstne metode sodijo slikanje FRET (FRETim) [40,41] in življenjskega časa
fluorescence (angl. fluorescence lifetime imaging, FLIM) [39] ter Ramanova
mikrospektroskopija (Raman), ki omogoča slikanje lokalne kemijske sestave [56].
Temeljit pregled lastnosti metod torej pokaže, da je najpomembnejše področje bioloških
membranskih domen in njihove lokalizacije še vedno težko dostopno (Slika 1.2). Poleg
(grobozrnatih) simulacij molekularne dinamike (MD) [24], ki so vendarle zgolj računski
pripomoček, jih za zdaj najbolje pokrivajo molekularne spektroskopije in mikrospektroskopije, z druge strani se bližajo superločljive optične metode. Očitna potreba po
razvijanju novih in kombiniranju obstoječih metod ter združevanju njihovih informacij
predstavlja temeljno gonilo tehnično-fizikalnega raziskovanja na tem področju, čemur smo
v okviru tega doktorskega dela sledili z razvojem fluorescenčne mikrospektroskopije
(FMS) [57–59]. Z novimi biofizikalnimi pristopi bomo lahko torej bolje razjasnjevali
trenutno biološko zmedo o membranskih domenah.
19
1.4 Cilji doktorske disertacije
V okviru pričujočega doktorskega dela smo želeli združiti dve že zelo uveljavljeni metodi
– fluorescenčni mikroskopijo in spektroskopijo – za potrebe raziskovanja bioloških
membran in njihovih domen. S FMS smo tako nameravali povezati dve povsem različni
območji občutljivosti ter tako izvor spektroskopskih informacij o molekularnem dogajanju
na nanometrski in nanosekundni ravni, ki ustrezata tudi najmanjšim in najhitreje
spreminjajočim se lipidnim splavom in membranskim domenam, lokalizirati s krajevno
ločljivostjo mikroskopije, ki sovpada z značilnimi velikostmi celičnih zgradb. S tem smo
se nadejali pomakniti mejo krajevnega in časovnega dosega trenutno dosegljivih metod za
raziskovanje domenske zgradbe bioloških membran proti biološko najpomembnejšemu, a v
veliki meri še neraziskanemu področju (Slika 1.2).
Razvita metoda FMS je sicer na videz zelo sorodna spektralnemu slikanju [60,61], saj
obe tehniki uporabljata merilni sistem enake zasnove, a sta njuna namena in s tem tudi
načina uporabe povsem različna. Slednja je namenjena razločevanju fluorescenčnih barvil
s prekrivajočimi se spektri in s tem sočasnemu slikanju mnogih celičnih zgradb, medtem
ko lahko s prvo iz spektralnih lastnosti izsevane svetlobe v vsaki točki slike izluščimo
mnogo informacij o fizikalno-kemijskih značilnostih neposredne molekularne okolice
fluorescenčnega barvila [57].
Hkrati smo želeli povečati uporabnost slikanja spektralnih razmerij [62,63], ki je zaradi
zelo nizke spektralne ločljivosti omejeno le na nekaj posebnih barvil z zelo močnim
spektralnim odzivom na spremembe okolice. Z natančnejšim merjenjem in naprednejšo
obdelavo podatkov smo nameravali omogočiti uporabo tudi mnogih drugih okoljsko
občutljivih fluorescenčnih označevalcev, ki jih sicer pogosto izkoriščajo pri
spektroskopskih raziskavah bioloških membran [64], a jim je šibkejši spektralni odziv
doslej preprečeval uporabo na posameznih mikroskopskih vzorcih. S tem smo načrtovali
razširiti nabor orodij za raziskovanje membranskih domen, saj se lahko tako zapletenih
problemov lotimo le z množico dopolnjujočih se pristopov.
Za ovrednotenje tovrstne ustreznosti in občutljivosti razvite metode FMS smo
nameravali opazovati nekaj nadzorovanih odzivov membranskih faz oz. domen na
temperaturne in biokemijske vplive, ki smo jih spremljali na modelnih membranah
liposomov različne sestave ter na membranah živih celic. Z uporabo različnih
označevalcev smo želeli predstaviti možnosti, ki jih nudi predstavljena tehnika za bodoče
raziskave na tem področju, ter ponazoriti njeno širšo uporabnost tudi pri razjasnjevanju
mnogih drugih zapletenih bioloških in biofizikalnih vprašanj, kot so denimo interakcije
celičnih membran z novimi dostavnimi načini protitumorskih zdravilnih učinkovin s
pomočjo lipidnih nanodelcev.
20
2 Fluorescenčna mikrospektroskopija
Živahen razvoj fluorescenčne mikroskopije je v zadnjih desetletjih spodbudil bliskovit
napredek našega razumevanja življenja [30]. K temu so ključno pripomogle naslednje
lastnosti metode: primernost za poskuse z živimi celicami, sposobnost vizualizacije vzorca
z mikrometrsko krajevno ločljivostjo ter izjemna občutljivost zaznavanja svetlobe, ki že
dosega raven posameznih molekul. S tem je fluorescenčna mikroskopija z vsemi
izpeljankami (CFM, TIRFm, STED, STORM idr. – za razlage kratic in kratek opis glej
prejšnje poglavje) omogočila mnogo ključnih dognanj o osnovnih bioloških, kemijskih in
fizikalnih procesih v celici in organizmih [30].
Po drugi strani so se vzporedno razvijale mnoge fluorescenčne spektroskopske metode,
ki so preko oblik absorpcijskih in emisijskih spektrov, življenjskih časov fluorescence
(FLS), učinkovitosti resonančnega prenosa energije (FRET) ali različnih korelacijskih
časov (FCS, anizotropija) prispevale pomembne podatke o dogajanju na molekularni
ravni [38]. Z napredki organske kemije smo v ta namen v uporabo dobili množico barvil in
označevalcev, ki se vgradijo v dobro določene ciljne celične strukture ter od tam poročajo
o fizikalnih in kemijskih lastnostih svoje neposredne okolice, denimo o njeni polarnosti,
mikroviskoznosti, molekularni urejenosti, električnem potencialu ali koncentracijah
določenih snovi [64].
Z združitvijo obeh področij – mikroskopije in spektroskopije – so nastale številne
hibridne raziskovalne tehnike, s katerimi lahko izvor omenjenih molekularnih informacij
omejimo z mikrometrsko krajevno ločljivostjo, ki jo v osnovni izvedbi določa uklon
uporabljene svetlobe [16,17]. Med najpogostejše tovrstne tehnike spadajo FLIM, slikanje
FRET, FCS, anizotropije ipd. [38], ki se jim zdaj pridružuje tudi v tem delu razvita
FMS [57–59].
Osnovo za uporabljen merilni sistem predstavljata konfokalni fluorescenčni mikroskop
in občutljiva kamera z elektronskim pomnoževanjem, kot je podrobneje predstavljeno v
nadaljevanju poglavja. Za spektralno zaznavanje smo mednju namestili nastavljivi
tekočekristalni filter (angl. liquid crystal tunable filter, LCTF), katerega ozko prepustno
spektralno okno lahko zvezno krmilimo. S tem lahko izmerimo signal vzorca pri izbrani
valovni dolžini (), z zaporednim snemanjem slik pri različnih  pa v vsaki točki vidnega
polja posnamemo cel izsevan fluorescenčni spekter [57]. Iz njegove oblike lahko nato z
metodami, predstavljenimi v poglavju 4 [59], pridobimo mnogo informacij o neposredni
okolici fluorescenčnih označevalcev [57] ter o njihovem vedenju v membrani [58].
21
2.1 Fluorescenca
Že davnega leta 1565 naj bi španski fizik in botanik Nicolas Monardes objavil opazovanja
zanimivega pojava [65]: voda, v kateri je plaval košček tropskega lesa Lignum
nephriticum, je na sončni svetlobi nenavadno živo-modro žarela. Približno sto let kasneje
sta isti pojav proučevala tudi Robert Boyle [65] in Sir Isaac Newton [66]. Slednji ga je
poskusil vključiti v svojo teorijo o svetlobi in barvah, a ga ni znal zadovoljivo pojasniti.
Pomemben korak v razumevanju fluorescence je sredi devetnajstega stoletja prispeval
Sir George Gabriel Stokes, ki je do svojih spoznanj prišel z za današnji čas nadvse
preprostim poskusom [67]. S stekleno prizmo je razklonil svetlobo v mavrico in skoznjo
premikal epruveto z raztopino kininovega sulfata. Dokler je vzorec osvetljevala vidna
svetloba, je bila tekočina prozorna, ko pa je epruveto pomaknil v temo naprej od vijoličnih
žarkov, je vsebina modro zažarela. Poskus ga je prepričal, da je snov najprej svetlobo
sprejela in nato oddala, pri čemer je imela izsevana svetloba daljšo valovno dolžino kot
absorbirana (Slika 2.1 A). Slednje pravilo še danes imenujemo Stokesov zakon ali
Stokesov premik. Pojav je najprej imenoval »razpršilni odboj« (angl. dispersive reflection),
a ga je že v svojem drugem delu po vzoru opalescence preimenoval v fluorescenco. Tako
sta oba pojava poimenovana po mineralih, kjer sta bila opažena – po opalu in fluoritu [67].
2.1.1 Osnove
Za ustrezno razlago fluorescence je bilo potrebno počakati na kvantno mehaniko, s katero
je Jean Perrin leta 1918 pojasnil vpoj in izsev elektromagnetnega valovanja s prehodi med
ločenimi energijskimi stanji molekule [68]. Shematsko jih lahko najpregledneje
predstavimo z diagramom Jablonskega (Slika 2.1 B). Elektron izkoristi energijo vpadlega
fotona za prehod v višje stanje, pri čemer se zaradi spremembe oblike orbitale molekula
navadno znajde tudi v vzbujenem nihajnem stanju. Le-to se v nekaj pikosekundah sprosti v
svoje termično ravnovesje, razliko v energiji pa preda okolici v obliki toplote. Čez nekaj
nanosekund se tudi elektron z izsevom fotona vrne v svoje osnovno stanje, molekulo pa
zopet vzbudi v enega od višjih nihajnih načinov. Razlika v energiji vpadlega in oddanega
fotona se izrazi v prej omenjenem Stokesovem premiku spektrov in je posledica zgradbe
fluorescirajoče molekule.
Elektron lahko iz vzbujenega stanja v osnovno preide tudi brez oddaje svetlobe, če
energijo molekula s trki sprosti v okolico. S tem se zmanjša njen kvantni izkoristek (), ki
meri učinkovitost pretvorbe:

št. izsevanih fotonov
.
št. prejetih fotonov
(2.1)
Za najpogostejša fluorescenčna barvila se izkoristek giblje med 0,01 in 1 [38].
Zaradi dodane energije je elektron v vzbujenem stanju precej bolj dovzeten za kemijske
reakcije z okoliškimi molekulami, še posebno v dolgoživem tripletnem stanju, pri čemer
barvilo izgubi svojo sposobnost fluorescence [69]. Posledično bledenje signala tekom
poskusa je linearno odvisno od količine vpadne svetlobe [70] in je za različna barvila
različno izrazito.
22
Slika 2.1 (A) Shematski prikaz absorpcijskega in emisijskega fluorescenčnega spektra ter
Stokesovega premika. (B) Diagram Jablonskega predstavlja pri fluorescenci udeležene
energijske prehode med elektronskimi in vibracijskimi stanji.
2.1.2 Barvila
Z zgodovinskega vidika je povsem razumljivo, da so fluorescenco najprej odkrili v vidnem
področju svetlobnega spektra, tj. pri valovnih dolžinah 400–700 nm. Razvoj umetnih
načinov zaznavanja, ki so nadomestili človeškega opazovalca, je območje sicer nekoliko
razširil v bližnje ultravijolično (UV) in infrardeče območje (IR). Vseeno še danes povečini
uporabljamo svetlobo v razponu 340–800 nm, saj nas na kratkovalovni meji omejuje
prepustnost stekla najdostopnejših optičnih elementov [71], na nasprotni strani pa
občutljivost običajnih slikovnih tipal [72].
Za fluorescenco v izbranem področju valovnih dolžin morajo energijski razmiki
elektronskih stanj (E) snovi ustrezati energiji sodelujočih fotonov (Ef):
E  E f 
hc

,
(2.2)
kjer h predstavlja Planckovo konstanto, c pa hitrost svetlobe v vakuumu. Fluorescenca v
vidnem delu spektra je torej možna v snoveh, katerih prvo vzbujeno elektronsko stanje se
nahaja okoli 1,8–3 eV nad osnovnim, kar je precej manj od vrednosti za večino elektronov,
ki so čvrsto vezani na jedra atomov [73]. Še dodatno omejitev predstavlja pogoj, da se
energije vibracijskih stanj osnovnega in vzbujenega elektronskega nivoja ne smejo
prekrivati in s tem omogočiti energijskega prehoda elektrona brez izseva svetlobe. Če bi
bila oba pogoja izpolnjena za veliko snovi v naravi, bi bil svet okoli nas še veliko bolj
žareč in barvit.
Fluorescenco pa vseeno lahko opazimo pri dopiranih kristalih ali pri organskih
fluorescenčnih barvilih (fluoroforih). Slednji so praviloma spojine s sistemom več
izmenjujočih se enojnih in dvojnih vezi med sosednjimi C-atomi, npr. molekule s
povezanimi aromatskimi obroči. Pri takih snoveh se molekularne orbitale nekaterih
elektronov raztezajo po večjem delu molekule, podobno kot se pri kristalih elektronska
stanja združujejo v energijske pasove. Skupna posledica pri obeh družinah snovi so
elektroni, šibkeje vezani na izvorno jedro atoma, kar omogoči fluorescenco v vidnem delu
spektra elektromagnetnega valovanja.
23
2.1.3 Označevalci
V bioloških okoljih so pravkar opisana fluorescenčna barvila naravno le redko prisotna.
Med dvajsetimi aminokislinami, osnovnimi gradniki beljakovin, le tri vsebujejo aromatske
obroče (fenilalanin, tirozin in triptofan), a vse fluorescirajo v UV področju svetlobnega
spektra [38]. Poleg njih so v večini živih celic fluorescenčni le še nekateri kofaktorji
encimov, npr. nikotinamid adenin dinukleotid (NADH) ali nekaj vitaminov skupine B [38].
Za potrebe fluorescenčne mikroskopije so zato v zadnjih desetletjih razvili umetne
načine barvanja izbranih celičnih gradnikov s fluorescenčnimi označevalci [38]. Molekule
barvila dednega materiala se zaradi svoje oblike in fizikalno-kemijskih lastnosti vgradijo
med zavoje molekule DNK ali se vežejo na določena zaporedja baznih parov. Beljakovine
lahko fluorescenčno označijo s ciljano kemijsko vezavo izbranega barvila ali z vstavitvijo
gena z zapisom za proizvodnjo fluorescenčnih proteinov. Za obarvanje maščobnih zgradb,
torej tudi celičnih membran, pa fluorescirajoče kemijske skupine najpogosteje pripnejo na
lipidom podobne nosilne molekule, ki se zaradi svojih hidrofobnih lastnosti nato same
porazdelijo na želena mesta v celici.
Z izbiro nosilne molekule torej opredelimo glavne značilnosti obnašanja označevalcev
v danem okolju, z izbiro barvila in načinom njegove vezave na osnovno molekulo pa
določimo, kakšne informacije bomo od označevalcev pridobili. Pri običajni fluorescenčni
mikroskopiji nam zadošča, da vidimo njihovo lego, torej sta ključni lastnosti specifično
porazdeljevanje molekule in svetlost barvila. Za različne izvedbe fluorescenčne
spektroskopije poleg naštetega pričakujemo, da se določena lastnost vpite ali izsevane
svetlobe spremeni pod vplivom izbranih zunanjih pogojev. V ta namen je bilo v zadnjih
desetletjih razvitih mnogo zelo različnih okoljsko občutljivih označevalcev [64].
2.1.4 Okoljsko občutljivi membranski označevalci
Tovrstne molekule pogosto izkoriščajo barvila, ki spreminjajo lastnosti izsevane svetlobe
glede na polar(izabil)nost zunanjega okolja. Nekaj nanosekund, kolikor navadno vztraja
elektron v višjem stanju s povečanim dipolnim momentom, zadošča, da se molekule
polarnega topila preuredijo in s tem nekoliko znižajo energijo vzbujenega stanja [38].
Spekter izsevane svetlobe se zato premakne proti daljšim valovnim dolžinam, pogosto pa
se hkrati zmanjša kvantni izkoristek in skrajša življenjski čas vzbujenega stanja [74].
Med barvila s tovrstnim odzivom sodi tudi NBD (Slika 2.2 A) [74,75], ki smo ga v tem
delu uporabljali najpogosteje. Zaradi izkazane okoljske občutljivosti, visokega izkoristka
svetlobe v prikladnem območju okoli 500 nm ter razmeroma enostavne izvedljivosti
kemijskih sprememb [53] se je barvilo trdno uveljavilo za raznovrstne spektroskopske
raziskave bioloških membran, npr. meritve lokalne polarnosti, vrtilne gibljivosti molekul,
njihovega zlaganja in organizacije, nesimetričnosti dvosloja, temperature idr. [76,77]
Uporabo pri mikroskopiji in različnih mikrospektroskopskih metodah je do zdaj
omejevala njegova svetlobna neobstojnost. Težavo smo v okviru tega doktorskega dela
zaobšli z razvitimi postopki merjenja in obdelave podatkov [57–59], predstavljenimi
nekoliko kasneje. Tako smo lahko s pridom uporabili dva označevalca, kjer je bilo barvilo
NBD vezano na eno od verig fosfolipidnih molekul (NBD-PC, Slika 2.2 B in C), ter eno
molekulo z eno alkilno verigo in barvilom v polarnem predelu (Slika 2.2 D).
24
Označevalec SPP268 (Slika 2.2 D), ki v nadaljevanju največkrat nastopa, so razvili
sodelavci na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani. Molekula je bila zasnovana kot
temelj za dvojne spinsko-fluorescenčne označevalce (SPP257, Slika 2.2 E), namenjene
raziskovanju lastnosti bioloških membran živih celic [53]. Ker je oblika spektra
elektronske paramagnetne resonance (EPR) veliko bolj občutljiva na molekularna gibanja
in lokalno polarnost, ji je pripadlo mesto na nepolarnem repu, saj se lastnosti membranskih
faz biofizikalno najbolj razlikujejo v osrednjem, nepolarnem delu prereza dvosloja [78].
Fluorescenčna skupina je bila sprva mišljena predvsem kot vidna oznaka molekul, da bi
lahko pod mikroskopom preverili njihovo razporejanje po različnih membranskih celičnih
strukturah in krajevno določili izvor signala EPR. Okoljska občutljivost barvila je bila
izvorno šele drugotnega pomena, zato je bilo tudi njeno mesto v polarnem predelu
molekule sprejemljivo. Tudi odziv barvila NBD na lokalne lastnosti [74,75] ni med
najmočnejšimi [64], a so pri izbiri prevladale druge njegove prednosti: i) zgradba barvila je
med najmanjšimi, kar ugodno zmanjšuje njen vpliv na obnašanje nosilne molekule in
molekul v okolici; ii) emisijski spekter leži v območju zadovoljivo visoke prepustnosti
LCTF; iii) potrebne kemijske reakcije so razmeroma enostavno izvedljive. Kljub vsemu se
je izkazalo, da lahko s pomočjo razvite napredne metode FMS, predstavljene nekoliko
kasneje, zanesljivo spremljamo razlike membranskih faz tudi s pomočjo fluorescenčnega
spektra [59], kar obljublja visoko uporabno vrednost prihajajočih dvojnih označevalcev.
Še večji spektralni odziv na polarnost okolice in podobno svetlobno neobstojnost kot
NBD izkazuje tudi označevalec Laurdan [79] (Slika 2.2 F), ki smo ga uporabili pri enem
izmed poskusov v nadaljevanju. Zaradi svoje amfifilne strukture, podobne maščobnim
kislinam, se prav tako kot NBD-PC in SPP268 prevladujoče razporeja v lipidne dvosloje.
Slika 2.2 (A) Okoljsko občutljiva kemijska skupina barvila NBD je ključni del večine v tem
delu uporabljenih označevalcev: dveh fosfolipidnih molekul (B) C6- in (C) C12-NBD-PC,
(D) označevalca SPP268 ter (E) njegove nadgradnje SPP257 z dodatno spinsko skupino. Pri
zaznavanju membranskih faz smo uporabili tudi (F) enega najpogosteje izkoriščanih okoljsko
občutljivih barvil, Laurdan, pri enem od kalibracijskih poskusov pa še (G) molekulo SPP158 z
barvilom rodamin, ki ga odlikujeta visoka svetlost in svetlobna obstojnost.
25
2.2 Fluorescenčna mikroskopija
Iznajdba mikroskopa v 16. stoletju je človeškemu umu odprla vrata v nov svet, ki je bil z
opazovanjem s prostim očesom do tedaj nedosegljiv [80]. Z napredki razumevanja optike
in spretnosti obdelave stekla so v nekaj sto letih dosegli teoretično krajevno ločljivost, kot
jo določa uklon svetlobe [16,17]. Naravoslovci so tako lahko spoznali mnogo
mikrometrskih podrobnosti zgradbe snovi in organizmov. Še posebno pri proučevanju
slednjih pa se je kmalu izkazalo, da je pretežno vodnata zgradba celic s šibkim kontrastom
med posameznimi gradniki tudi pri doseženi krajevni ločljivosti še vedno skrivala mnogo
nedostopnih informacij. Zato so tekom 20. stoletja razvili nekaj novih metod osvetljevanja,
ki so močno olajšale razločevanje celične zgradbe: pojavile so se mikroskopija s faznim
kontrastom, diferenčnim interferenčnim kontrastom ter fluorescenčna mikroskopija [81].
Še posebno slednja je v zadnjih desetletjih z razvojem metod specifičnega označevanja
posameznih gradnikov celice doživela nesluten razmah, še posebno po množični
uveljavitvi konfokalne mikroskopije [30]. Uspeh je nedvomno predvsem posledica izjemne
občutljivosti zaznavanja izbranih barvil, ki jo omogoča temno ozadje vidnega polja zaradi
ustreznega filtriranja neželene svetlobe. Kratek oris potrebne opreme je predstavljen v
nadaljevanju.
2.2.1 Zgradba fluorescenčnih mikroskopov
Fluorescenčni mikroskopi za celično-biološke raziskave (Slika 2.3 A) običajno temeljijo na
obrnjenih svetlobnih mikroskopih. Opazovanje s spodnje strani vzorca namreč močno
olajša raziskovanje živih celic, pritrjenih na dno posodic za gojenje.
Za osvetljevanje vzorca in vzbujanje fluorescence se uporabljajo različni viri svetlobe.
Laserji se odlikujejo po visoki moči in dobro določeni valovni dolžini izsevanega
valovanja, njihov snop je mogoče najučinkoviteje zbrati v goriščni točki ipd. Za vzbujanje
različnih barvil pogosto potrebujemo več laserjev pri različnih , kar lahko za laboratorij
predstavlja razmeroma visok strošek. Cenovno dostopnejše so močne živosrebrne ali
ksenonske obločne svetilke z zveznim širokim spektrom preko celotnega vidnega območja,
iz katerega lahko nato z vzbujevalnimi filtri izberemo barvilu ustrezno spektralno okno
(Slika 2.3 B).
Ker je absorpcija valovanja na po vzorcu redko posejanih molekulah barvila
razmeroma neučinkovit proces, želimo jakost vzbujevalne svetlobe čim bolj povečati.
Žarek zato do vzorca vodimo skozi objektiv mikroskopa, ki močno zgosti svetlobni tok. Z
opazovanjem izsevane fluorescenčne svetlobe nazaj preko istega objektiva se hkrati
znebimo prispevkov neabsorbirane vzbujevalne svetlobe ter pretežnega dela njenega
sipanja, ki bi sicer lahko preglasila merjen signal fluorescence. Vseeno pred zaznavalo
praviloma postavimo tudi ustrezni izsevni filter, ki zaustavi vso preostalo svetlobo
vzbujevalnih valovnih dolžin, prepusti pa le del spektra, kjer pričakujemo fluorescenco
uporabljenega barvila (Slika 2.3 B). Vzbujevalno in izsevano svetlobo, ki potujeta po isti
optični poti, ločimo z dvobarvnim (dikroičnim) zrcalom, s čimer proti zaznavalu
prepustimo le fluorescenčni signal barvila.
26
Slika 2.3 (A) Pregled zgradbe osnovnih fluorescenčnih mikroskopov s širokospektralnim
izvorom svetlobe: z vzbujevalnim filtrom izberemo svetlobo barvilu ustreznega dela spektra in
jo proti vzorcu odbijemo z dvobarvnim zrcalom. Slednje proti detektorju prepusti izsevano
fluorescenčno svetlobo, izsevni filter pa zadrži vse neželene prispevke drugih valovnih dolžin.
(B) Shema prepustnosti optičnih elementov, označenih z enakimi barvami kot pri prikazu A.
2.2.2 Konfokalna mikroskopija
Čeprav se lahko s spektralnimi filtri znebimo večine moteče svetlobe vzbujanja ali drugih
virov, nas pri opazovanju pogosto ovira tudi prepuščena izsevana svetloba izbranega
barvila, ki izvira iz izvenžariščnih ravnin opazovanega vzorca. Elegantna rešitev,
imenovana konfokalna (»sožariščna«) mikroskopija [30], je v zadnjih nekaj desetletjih
ključno pripomogla k uporabnosti in priljubljenosti fluorescenčnih mikroskopskih metod.
Konfokalna mikroskopija temelji na prehodu svetlobe skozi dve drobni luknjici, ki se
glede na vzorec nahajata v ustreznih žariščnih ravninah optičnega sistema [30]. Prva
luknjica v zaslonu iz vzbujevalne svetlobe med potovanjem proti vzorcu odbere le žarke, ki
se bodo po prehodu objektiva zbrali v opazovani goriščni ravnini vzorca (Slika 2.4 A).
Tam je jakost vzbujanja in posledično tudi izseva fluorescence mnogo višja kot v sosednjih
ravninah. Vseeno lahko v določenih primerih razporeditve barvil svetloba iz sosednjih
ravnin preglasi ali vsaj močno zamegli opazovano sliko iz goriščne ravnine. Pri konfokalni
mikroskopiji se zato v sogoriščni ravnini na izsevni strani nahaja še drugi zaslon z
luknjico, ki proti zaznavalu prepusti vso svetlobo iz opazovane ravnine vzorca in zadrži
večino preostale (Slika 2.4 A).
Z opisanim postopkom osvetlimo in do zaznavala pripeljemo svetlobo zgolj iz ene
točke vidnega polja, ki jo določata legi obeh luknjic v zaslonu. Za pregled celotne slike je
torej potrebno žarek po vzorcu ustrezno premikati, za kar sta se uveljavila dva načina. Pri
sistemih z laserskim osvetljevanjem prevladuje vrstično vzorčenje signala (angl. laser
scanning confocal microscopy; Slika 2.4 B) z mehanskim ali akusto-optičnim krmiljenjem
vzbujevalnega žarka, v kombinaciji s širokospektralnimi izvori pa se navadno uporablja
vrteči se disk z luknjicami, razporejenimi v spiralo (angl. spinning/Nipkow disk;
Slika 2.4 B), ki hkrati služi tako za omejevanje vzbujevalne kot izsevne svetlobe [30]. Oba
načina zaporedno osvetlita posamezne točke vidnega polja in s tem omogočita nastanek
celotne slike.
27
Slika 2.4 (A) Konfokalni fluorescenčni mikroskopi se svetlobe iz izvengoriščnih ravnin vzorca
znebijo z uporabo dveh zaslonov z luknjicami v sožariščnih ravninah. (B) Za nastanek celotne
slike sta se uveljavila dva prevladujoča načina: izvedbe z laserskim osvetljevanjem vzorec
navadno presvetlijo z vrstičnim krmiljenjem žarka, pri širokopasovnih izvorih pa uporabljajo
vrteči se disk z luknjicami, razporejenimi v spirale.
Velikosti obeh luknjic določata globinsko ločljivost sistema, tj. debelino rezine vzorca,
od koder prihaja izmerjen signal. Manjša luknjica načeloma prinese boljšo ločljivost, a le
do meje, ki jo določa uklon svetlobe – za najpogosteje uporabljene vrhunske objektive
mikroskopov z veliko povečavo zmanjševanje premera luknjic pod 20–30 m ni
smiselno [82]. Po drugi strani manjša luknjica prepusti manj svetlobe, kar pomeni nižjo
jakost vzbujevalne svetlobe in s tem slabšo kakovost zajetega signala. Učinkovito
zaznavanje preostale fluorescenčne svetlobe je zato pri konfokalni mikroskopiji še posebno
pomembno.
2.2.3 Zaznavanje svetlobe
Jakost in prostorski razpored izsevane svetlobe dandanes najlaže zabeležimo z
dvorazsežnim tipalom digitalne kamere. Glede na nameravano uporabo lahko izberemo
model z visoko krajevno ločljivostjo, hitrostjo branja ali občutljivostjo. Predvsem slednje
je pri (konfokalni) fluorescenčni mikroskopiji pogosto najpomembnejši kriterij, saj
neredko merimo zelo šibke jakosti izsevane svetlobe. K občutljivosti kamere najobčutneje
pripomorejo velikost posameznih slikovnih elementov, nizkotemperaturno hlajenje
zaznavala ter možnost elektronskega pomnoževanja signala.
Podobni kriteriji veljajo tudi pri izbiri opreme za zaznavanje šibkih signalov
fluorescenčne mikrospektroskopije, predstavljene v nadaljevanju.
28
2.3 Fluorescenčna mikrospektroskopija
Že med izpopolnjevanjem pravkar opisane fluorescenčne mikroskopije so spoznali, da bi
se lahko z ustreznimi nadgradnjami merilnega sistema dokopali tudi do dodatnih podatkov
o fizikalno-kemijskih lastnostih neposredne okolice označevalcev, ki se skrivajo v izsevani
svetlobi nekaterih barvil [64]. Ena tovrstnih nadgradenj je tudi v tem delu razvita
fluorescenčna mikrospektroskopija (FMS) [57–59], s katero lahko v vsaki točki vidnega
polja izmerimo obliko izsevanega fluorescenčnega spektra in tako z mikrometrsko
krajevno natančnostjo določimo izvor informacij, ki jih sicer nudi fluorescenčna
spektroskopija s povprečevanjem signala veliko večjih vzorcev [38].
2.3.1 Različne izvedbe FMS
Ker še ne poznamo načina, kako naenkrat učinkovito zaznati porazdelitev jakosti svetlobe
po treh dimenzijah, tj. po dveh prostorskih oseh ter po valovni dolžini, je očitno potrebno
vsaj eno od koordinat prečesati zaporedno. Za spektralno slikanje [60,61], sorodno FMS,
sta se uveljavila dva prevladujoča načina merjenja [61]. i) Pri enem z dvorazsežnim
tipalom običajne digitalne kamere hkrati posnamemo krajevni razpored fluorescenčnega
signala, njegovo spektralno odvisnost pa nato z uporabo ozkopasovnih filtrov pri različnih
 izmerimo zaporedoma. ii) Pri drugem načinu izsevano fluorescenčno svetlobo iz izbrane
točke slike z ustreznim uklonskim optičnim elementom razklonimo, tako da lahko eno
razsežnost linijskega ali površinskega tipala izkoristimo za spektralno zaznavanje, obe oz.
drugo manjkajočo prostorsko dimenzijo pa nadoknadimo z zaporednim snemanjem
različnih predelov vzorca. Tovrstna metoda je najpogostejša pri izvedbah z laserskim
osvetljevanjem, prva pa prevladuje pri merilnih sistemih s širokospektralnim vzbujanjem
fluorescence, kot smo ga izbrali pri zasnovi uporabljenega merilnega sistema [57].
Tudi izvedbe naprav FMS z zaporednim snemanjem slik pri različnih valovnih dolžinah
(način i) se med seboj razlikujejo po načinu spektralnega filtriranja izsevane svetlobe [61].
Najpreprostejše izvedbe temeljijo na množici ozkopasovnih filtrov, pritrjenih na vrtljivo
kolo, a si je lahko predstavljati, da so taki merilni sistemi močno omejeni po
prilagodljivosti, spektralni ločljivosti in hitrost merjenja. Za resno uporabo so zato mnogo
priročnejše izvedbe z optičnimi elementi, katerih spektralno prepustnost lahko zvezno
krmilimo. Tovrstno obnašanje omogočajo akusto-optični modulatorji in nastavljivi
tekočekristalni filtri (LCTF). Prvi so nekoliko hitrejši, omogočajo prilagodljivo širino
spektralnega okna ali sočasno izbiro več ločenih prepustnih pasov [61], vendar močneje
popačijo prepuščeno sliko kot LCTF [83], zaradi česar smo za sklopitev s fluorescenčno
mikroskopijo izbrali slednjega.
2.3.2 Nastavljivi tekočekristalni filter
Najpogostejše izvedbe LCTF slonijo na osnovah delovanja Lyotovih filtrov [61,83]. Le-te
sestavlja zaporedje različno debelih ploščic dvolomnih kristalov, ločenih z linearnimi
polarizatorji, katerih prepustna smer je glede na optično os kristala nagnjena za 45°
(Slika 2.5 A). Ko pride svetloba skozi vhodni polarizator v prvo ploščico, posamezni
komponenti polarizacije čutita različna lomna količnika (Δn) in potujeta vsaka s svojo
29
fazno hitrostjo. Pri izhodu iz ploščice izbrane debeline (d) sta zato fazi prispevkov svetlobe
iste  z različnima polarizacijama zamaknjeni () za
  2
n d

,
(2.3)
kar v splošnem ne predstavlja več linearno polarizirane svetlobe, razen če je debelina
ploščice polovični mnogokratnik (M) razlike dolžin optičnih poti:
d
M 
   M .
2 n
(2.4)
Naslednji polarizator v tem primeru prepusti vso svetlobo izbrane , prepustnost ostalih (T)
pa zmanjša v skladu s predpisom
T     cos2     .
(2.5)
(Slika 2.5 B).
Če zaporedoma zložimo več takih parov s polarizatorjem in ploščico dvolomnega
kristala, pri čemer je vsaka ploščica dvakrat debelejša od predhodne, potem vse plasti
prepustijo svetlobo valovne dolžine, za katero ima tudi prva največjo prepustnost, vmesna
spektralna področja pa so zaradi zmnožka vseh prepustnosti močno zadušena (Slika 2.5 B).
Izbira kristala in debeline prve ploščice določita spektralno območje učinkovitosti filtra,
število plasti pa širino prepuščenega pasu in stopnjo dušenja preostale svetlobe.
Prepustnosti tovrstnega filtra med poskusom seveda ne moremo spreminjati. Zato je pri
LCTF v vsaki stopnji Lyotovega filtra vgrajena še celica dvolomnih tekočih kristalov z
elektrodami (Slika 2.5 A), tako da lahko z električno napetostjo uravnavamo dvolomnost
vmesne plasti in s tem fazni zamik med prispevkoma svetlobe z različnima polarizacijama.
Usklajeno krmiljenje vseh zaporednih stopenj omogoča zvezno nastavljanje lege
prepustnosti celotnega filtra.
Slika 2.5 (A) Vsako stopnjo LCTF sestavljata plasti dvolomnega kristala in tekočih kristalov
med linearnima polarizatorjema. (B) Z zlaganjem različno debelih plasti, katerih prepustnosti
(sive krivulje) se med seboj zmnožijo, dobimo ozek spektralni pas (črna krivulja), katerega
lego lahko krmilimo z napetostjo na tekočekristalnih plasteh.
30
Slika 2.6 (A) Z LCTF pred kamero lahko posnamemo slike pri različnih valovnih dolžinah
izsevane svetlobe. Iz zaporedja jakosti signala lahko v vsaki izbrani točki slike izluščimo
(B) obliko fluorescenčnega spektra.
Če tovrstno napravo namestimo neposredno pred kamero fluorescenčnega mikroskopa,
lahko zaporedoma posnamemo slike pri različnih  (Slika 2.6 A). Iz zaporedja jakosti
signala na izbranem kraju preko niza vseh posnetkov lahko nato v vsaki točki vidnega
polja določimo obliko celotnega izsevanega fluorescenčnega spektra (Slika 2.6 B). V
nadaljevanju bo pomembno, da LCTF zaradi svoje zgradbe (Slika 2.5 A) prepusti le eno
linearno polarizacijo vhodne svetlobe.
31
Slika 2.7 (A) Shema in (B) fotografija uporabljenega merilnega sistema FMS z označenimi
poglavitnimi sestavnimi deli.
2.4 Uporabljeni merilni sistem FMS
Pri poskusih, predstavljenih v naslednjih poglavjih, smo uporabljali napravo FMS, ki smo
jo v Laboratoriju za biofiziko na Institutu »Jožef Stefan« sestavili iz posameznih kosov
opreme. Na obrnjeni mikroskop smo priključili konfokalno-fluorescenčni modul ter
osvetljevanje z obločno svetilko, zaznavanje pa smo s pomičnim zrcalom razdelili v dve
veji – eno za običajno fluorescenčno mikroskopijo in drugo za spektralno občutljivo
snemanje (Slika 2.7). V nadaljevanju sledi podrobnejši opis naprave ter pregled nekaterih
njegovih najpomembnejših lastnosti.
2.4.1 Opis posameznih sestavnih delov
Osnovo za nadgradnjo je predstavljal obrnjeni mikroskop Nikon Eclipse TE2000-E (Tokio,
Japonska) z motorizirano mizico ProScan II proizvajalca Prior Scientific (Cambridge,
Velika Britanija), ki omogoča posebno natančno določanje lege vzorcev s koraki po
10 nm [84]. Od objektivov, ki smo jih imeli na voljo (Preglednica 2.1), smo največkrat
uporabili zračnega z 10-kratno povečavo in vodnega potopnega s 60-kratno povečavo.
Preglednica 2.1 Nabor razpoložljivih objektivov in njihove najpomembnejše lastnosti
Objektiv
(vsi iz družine Nikon CFI)
Delovna
Povečava
Medij
NA
razdalja
[mm]
Debelina
Premer
krovnega
vstopne
stekelca
odprtine
[mm]
[mm]
Plan Fluor 10x
10×
zrak
0,30
16
0,17
12,5
S Plan Fluor ELWD 40xC
40×
zrak
0,60
3,6–2,8
0–2,0
6
Plan Fluor 60x
60×
zrak
0,85
0,40–0,31
0,11–0,23
7
Plan Apo IR 60xWI
60×
voda
1,27
0,17
0,15–0,19
8
Plan 100xW
100×
voda
1,10
2,50
0
8
Plan Apo VC 100xH
100×
olje
1,40
0,13
0,17
5
32
Slika 2.8 (A) Tovarniški podatki prepustnosti LCTF (PLCTF) pri različnih nastavitvah , iz
katerih smo določili (B) širine posameznih spektralnih oken (wLCTF).
Za vzbujanje fluorescence smo uporabljali ksenonsko obločno luč Lambda LS (Sutter
Instrument, Novato, ZDA) z nazivno močjo 300 W [85] in izhodno svetlobno močjo okoli
2 W. Njena svetloba je razporejena po širokem spektru od UV do IR, ki jo na izhodu
ustrezno steklo omeji na 340–700 nm in s tem zavaruje naslednje optične elemente pred
prekomernim segrevanjem.
Prepuščeno svetlobo smo s svetlobnim vodnikom s tekočim polnilom Lumatec 300
(Deisenhofen, Nemčija) pripeljali do konfokalno-fluorescenčne enote Carv II proizvajalca
BD Biosciences (Franklin Lakes, ZDA). Slednja vsebuje tri vrtljiva kolesa z vzbujevalnimi
in izsevnimi filtri ter dvobarvnimi zrcali Brightline proizvajalca Semrock (Rochester,
ZDA) [86] z različnimi spektralnimi območji prepustnosti. Njihovo izbiro pri vsakem
poskusu prilagodimo lastnostim uporabljenega barvila. Ista enota vsebuje tudi vrteči se
disk z luknjicami premera 70 m, razporejenimi v več prepletenih spiral, ki pokrivajo 8 %
površine diska [87]. Hitro vrtenje načeloma omogoča konfokalno slikanje s hitrostmi do
1000 posnetkov na sekundo [87].
Za spektralno občutljivo zaznavanje, potrebno pri FMS, smo uporabili LCTF Varispec
VIS-10 proizvajalca CRi (Woburn, ZDA). Lego njegovega prepustnega spektralnega pasu
lahko v korakih po 1 nm nastavljamo v območju 400–720 nm (Slika 2.8 A). Pri tem se
nekoliko spreminja tudi širina spektralnega okna, ki za svetlobo pri 550 nm znaša okoli
12 nm (Slika 2.8 B). Preklop med nastavitvami naj bi trajal okoli 50 ms [88].
Svetlobo pri fluorescenčni mikroskopiji zaznavamo s kamero Rolera-MGi podjetja
QImaging (Surrey, Kanada), ki je prilagojena beleženju šibkih signalov. V ta namen ima
vgrajen senzor s 512 × 512 slikovnimi elementi velikosti 16 m [89], ki zaradi
osvetljevanja z zadnje strani v delu spektra 500–650 nm doseže kvantni izkoristek nad
90 % [72]. Termoelektrično hlajenje tipala na temperaturo –25 °C [89] poskrbi za nizke
vrednosti šuma pri daljših osvetlitvenih časih, elektronsko pomnoževanje signala pa
omogoča zanesljivejše meritve medlih vzorcev [90].
Žal se je izkazalo, da ob uporabi pomnoževanja pri zaporednem snemanju izhodišče
signala nepredvidljivo drsi zaradi neuravnovešene elektronike (Slika 2.9 A). Pri
posameznih mikroskopskih slikah to ni moteče, zaporedno snemanje pri različnih  in
določanje oblike spektra pa s tako napravo ni zanesljivo. Zato smo za LCTF namestili
kamero Andor iXon3 897 (Belfast, Velika Britanija), ki sicer uporablja enako tipalo kot
33
Rolera-MGi, a ji bolj dodelana bralna elektronika zagotavlja stalno izhodišče signala ne
glede na pogoje uporabe (Slika 2.9 B). Da smo lahko izkoristili tudi zmogljivejše hlajenje
tipala do –100 °C [91], ki še učinkoviteje zmanjšuje šum, smo tej kameri dodali tekočinsko
hlajenje z napravo Koolance Exos 2 (Auburn, ZDA).
Ob vseh za FMS potrebnih sestavnih delih obsega uporabljen merilni sistem tudi
optično pinceto Aresis Tweez 200si (Ljubljana, Slovenija) z laserjem valovne dolžine
1064 nm in moči do 4 W. S tem omogoča mikromanipulacijo vzorcev s poljubno množico
optičnih pasti, ki jih lahko s frekvenco do 100 kHz v ugodnih primerih krmilimo s krajevno
natančnostjo nekaj 10 nm [92]. Celotna naprava torej omogoča zelo raznovrstno in
prilagodljivo uporabo. Lastnosti sestavljenega merilnega sistema smo najprej temeljito
preverili z nekaterimi referenčnimi meritvami, predstavljenimi v nadaljevanju.
Slika 2.9 Časovno spreminjanje signala ozadja ob vklopljenem elektronskem pomnoževanju za
različne osvetlitvene čase (barvna legenda) s kamero (A) Rolera MGi in (B) Andor iXon3.
2.4.2 Prepustnost LCTF
Najprej smo morali natančno umeriti spektralno prepustnost LCTF, saj je bilo iz sicer
pomanjkljivih proizvajalčevih podatkov (Slika 2.8) jasno, da ta ni preprosta. V skladu s
priporočili [93] smo s FMS posneli niz spektrov barvil, ki svetijo na različnih predelih
merilnega območja LCTF, in jih primerjali z rezultati enakih poskusov z umerjenim
spektrofluorimetrom (Slika 2.10 A). Iz razmerja jakosti obeh signalov smo za vsak
izmerjen vzorec določili relativno prepustnost LCTF na ustreznem območju , posamezne
meritve pa smo nato z najustreznejšim lepljenjem združili v enotno umeritveno krivuljo
(PLCTF), ki se je občutno razlikovala od uradnih podatkov (Slika 2.10 B). V nadaljevanju
smo vse posnete spektre pred obdelavo najprej delili z ustreznimi vrednostmi PLCTF, s
čimer smo dobili mnogo prepričljivejše ujemanje rezultatov, posnetih na obeh napravah –
tako za umeritvene kot neodvisno posnete spektre (Slika 2.10 C oz. D).
Po določenem času smo ugotovili, da umeritev ni bila več ustrezna, saj so se v spektru
začeli pojavljati nezvezni skoki, prepustnost po vidnem polju pa ni bila enotna
(Slika 2.11 A), kar je lahko navidezno premaknilo spekter tudi za 5 nm. Dognali smo, da
so bile za pojav očitno krive motnje v urejenosti tekočih kristalov LCTF, ki so se sčasoma
nabrale v celicah filtra. Z izvajanjem skokov med skrajnimi vrednostmi nastavitev pred
vsakim merilnim dnem smo neželeni pojav ukrotili v sprejemljiv okvir – razlike v legi
spektralnega vrha so bile na različnih koncih slike manjše od 0,5 nm (Slika 2.11 B).
34
Slika 2.10 (A) Primerjava spektrov šestih fluorescenčnih vzorcev, posnetih s FMS in
spektrofluorimetrom (Tecan, barvna legenda na prikazu B): laurdanom v etanolu,
fluorescenčnimi kroglicami Fluoresbrite YG (Polysciences, Warrington, ZDA) in FluoSpheres
Crimson (Life Technologies, Carlsbad, ZDA) ter etanolnima raztopinama označevalcev
SPP268 (Slika 2.2 D) in SPP158 (Slika 2.2 G) z barviloma NBD oz. rodamin. Iz razmerij
jakosti, posnetih na obeh napravah, smo določili (B) spektralno odvisno prepustnost LCTF
(PLCTF), ki se je opazno razlikovala od tovarniških podatkov (črna prekinjena črta). (C) Z
dobljeno funkcijo smo nato lahko popravili umeritvene spektre, (D) zanesljivost popravka pa
smo potrdili še z neodvisno posnetimi spektri treh vrst kroglic FocalCheck (Life Technologies;
barvna legenda z navedenimi uradnimi legami spektralnih vrhov).
Slika 2.11 Lega spektralnega vrha (MAX) fluorescenčnega stekelca po vidnem polju (A) pred
uvedbo načrtnega odstranjevanja motenj v tekočih kristalih in (B) po njej. Pri meritvah smo
uporabili objektiv z 10-kratno povečavo, a smo zelo podobno obnašanje opazili tudi z drugimi.
2.4.3 Osvetlitveno polje
Naslednjo neidealnost merilnega sistema predstavlja neenakomerna porazdelitev jakosti
vzbujevalne svetlobe po vidnem polju. Zaradi razsežnosti svetila žarki izhodne svetlobe
niso povsem vzporedni, tudi gostota toka po preseku zaradi geometrije svetila ni
enakomerna. Jakostni profil se še nekoliko spremeni med potjo skozi svetlobni vodnik. Za
35
karseda enakomerno osvetljevanje celotnega vidnega polja zato optika fluorescenčne enote
vzbujevalni žarek tako razširi, da vstopna odprtina objektiva zajame le osrednji stržen.
Med poskusi smo vseeno opazili, da vzorec ni povsem enakomerno osvetljen, zaradi
česar tudi izsevana jakost fluorescence na različnih koncih slike ni enotna (Slika 2.12).
Izrazitost pojava je močno odvisna od odprtosti zaslonke na vhodu v fluorescenčno enoto
in nekoliko od uporabljenega objektiva, saj se razlikujejo po premeru vstopne odprtine
(Preglednica 2.1). Tovrstne vplive na izmerjene jakosti fluorescence bi načeloma lahko
odpravili z uporabo umeritvenih tabel za vsako kombinacijo objektiva in odprtosti
zaslonke. Ker pa se oblika osvetlitvenega profila s časom nekoliko spreminja zaradi
migotanja plamena v svetilki na sekundni ravni, bi bila taka umeritev nezanesljiva in bi
lahko med rezultate vnašala dodatno negotovost in popačitve.
Večino poskusov tega doktorskega dela smo izvedli pri polno odprti zaslonki z
objektivom s 60-kratno povečavo, ki ima razmeroma majhno vstopno odprtino, zato pojav
ni bil posebno moteč. S testnimi meritvami na raztopini označevalca SPP268 v etanolu
smo ugotovili, da je bila jakost vzbujevalne in s tem tudi izsevane svetlobe ob robovih
okoli 20 % nižja (Slika 2.12 A). V skladu s pričakovanji se je to izrazilo v primerljivo
različnih hitrostih bledenja fluorescenčnega signala (Slika 2.12 B) [94], ni pa vplivalo na
določanje lege spektralnega vrha (Slika 2.12 C), ki smo se ji v nadaljevanju najpogosteje
posvetili. Same jakosti fluorescence tudi iz drugih razlogov, navedenih med razlago
rezultatov v poglavjih 5 in 6, nismo nikoli primerjali, zato omenjena neidealnost ni
bistveno vplivala na naša dognanja.
Slika 2.12 (A) Nekoliko neenakomerna osvetljenost vidnega polja, posnetega z etanolno
raztopino označevalca SPP268, vpliva na (B) hitrost bledenja fluorescence (b; za definicijo in
podrobnejšo razlago glej razdelek 4.2), ne pa tudi na (C) lego spektralnega vrha (MAX). Ker je
bila resnična razlika med skrajnima jakostma signala na sliki manj kot 20 %, je svetlobni
kontrast zaradi preglednosti na vseh prikazih nekoliko poudarjen.
2.4.4 Konfokalnost
V nadaljevanju smo preverili učinkovitost konfokalnega diska. V ta namen smo pod
krovno stekelce zaprli 16 m debelo plast etanolne raztopine barvila rodamin B [38] in po
globini posneli niz slik v konfokalnem in običajnem načinu. Primerjava povprečnih
relativnih jakosti signala je pokazala, da pri konfokalnem slikanju ustrezno debela svetlejša
plast jasno izstopi iz zožene, a še vedno široke porazdelitve (Slika 2.13 A). Slednja je
posledica geometrije vzorca, saj barvilo po celotni prostornini oddaja močan signal, tako
da se svetloba preko mnogih luknjic na disku vseeno v veliki meri prebije do tipala.
Takih primerov navadno ne srečamo pri resničnih meritvah fluorescenčno označenih
bioloških vzorcev, ki so po prostoru praviloma posejani mnogo redkeje. V takem režimu je
36
tudi konfokalni sistem mnogo učinkovitejši, kar smo preverili s slikanjem kroglic
FocalCheck [95] premera 6 m z barvilom, nanešenim na njihovo površino (Slika 2.13 B).
S konfokalnim diskom smo znižali jakost sipane svetlobe iz izvengoriščnih ravnin
približno za polovico. Iz predstavljenih meritev je očitno, da ima konfokalno slikanje
najboljši učinek pri vzorcih s pozitivnim svetlobnim kontrastom, tj. pri majhnih svetlih
predmetih na temnem ozadju, k čemur stremimo pri načrtovanju tovrstnih poskusov.
Slika 2.13 Meritve jakosti signala (A) po globini (z) plasti etanolne raztopine barvila
rodamin B (zgradba v kotu), debele 16 m (navpični prekinjeni črti), in (B) preko steklene
kroglice velikosti 6 m s površinsko plastjo barvila. Oba vzorca smo z oljnim potopnim
objektivom s 100-kratno povečavo posneli v konfokalnem (CF) in običajnem načinu (nonCF).
2.4.5 Analiza svetlobnega toka pri FMS
Oba glavna elementa konfokalne FMS, tj. vrteči se disk in LCTF, prepustita le majhen del
vpadne svetlobe, zato pri hkratni uporabi obeh v za poskus razpoložljivem času nismo
mogli dobiti zadovoljivega signala. Za boljšo predstavo o skupni učinkovitosti sistema smo
želeli oceniti svetlobe izkoristke posameznih sklopov – prepustnosti stalnih in nastavljivih
filtrov, izkoristke ostalih optičnih elementov, učinkovitost vpitja in oddaje svetlobe v
barvilu ter občutljivost zaznavanja s kamero (Preglednica 2.2).
Na izhodu iz svetlobnega vodnika smo z bolometrom Gentec-EO Solo 2 (St-JeanBaptiste, Kanada) namerili svetlobni tok okoli 500 mW, ki je razporejen po celotnem
vidnem spektru. Z vzbujevalnim filtrom, ki ima v pasu 60 nm prepustnost nad 95 %, in
dvobarvnim zrcalom z odbojnostjo 99 % [86] odberemo približno petino vpadne svetlobe.
Konfokalni disk je nato prepusti okoli 8 %, kolikor znaša delež površine luknjic [87].
Zaradi prej omenjenega zagotavljanja čim enakomernejše osvetljenosti pokrije vstopna
odprtina objektiva le kakih 10 % površine žarka. Vzorec tako v konfokalnem načinu
doseže nekaj manj kot 1 mW svetlobnega toka, v običajnem pa približno za velikostni
razred več, kar se ujema z našimi meritvami.
Vidno polje kamere po lastnih opazovanjih obsega približno 15 % celotnega
osvetljenega področja, iz česar lahko ocenimo, da pri konfokalnem slikanju na površino
vzorca, ki jo pokriva vsak izmed 512 × 512 slikovnih elementov elektronskega tipala,
prileti okoli 109 fotonov na sekundo. Če opazujemo presek biološke membrane pri
60-kratni povečavi, kot v primeru večine kasneje predstavljenih meritev, lahko v
prostornini vzorca, pripadajoči posameznemu slikovnemu elementu (širina slike ×
globinska ločljivost × debelina membrane  270 nm × 700 nm × 4 nm), pri smiselnem
množinskem deležu označevalcev (0,004) pričakujemo okoli 2000 molekul barvila.
37
Preglednica 2.2 Ocena svetlobnega toka skozi uporabljen optični sistem z upoštevanjem
prepustnosti posameznih optičnih elementov, izkoristkov fluorescence in zaznavanja itn.
Stopnja
Izhod iz svetlobnega vodnika
Vzbujevalni filter in dvobarvno zrcalo
Konfokalni disk
Vstopna odprtina objektiva
Površinski delež vidnega polja kamere
Površinski delež slikovnega elementa
Absorpcija barvila NBD
Kvantni izkoristek barvila NBD
Prostorski kot objektiva
Prepustnost optike mikroskopa
Izsevni filter in dvobarvno zrcalo
LCTF
Kvantni izkoristek zaznavanja
Digitalizacija signala
Prepustnost,
Izkoristek,
Delež (0–1)
0,2
0,08
0,1
0,15
4 × 10–6
1 × 10–4
0,3
0,3
0,9
0,7
0,02
0,9
0,05
Jakost
svetlobnega
toka [W]
5 × 10–1
1 × 10–1
8 × 10–3
8 × 10–4
1 × 10–4
5 × 10–10
Jakost
fotonskega
toka [s–1 pix–1]
1 × 109
1 × 105
4 × 104
1 × 104
1 × 104
8 × 103
2 × 102
2 × 102
8 dig. enot
Upoštevaje absorpcijski koeficient barvila NBD (2 × 106 M–1 m–1) [74] in prekrivanje
absorpcijskega spektra z vzbujevalnim filtrom (0,7) lahko izračunamo, da te molekule
absorbirajo le majhen delež vpadne svetlobe (okoli 10–4). Poznan kvantni izkoristek barvila
pove, da je približno tretjino [74] zatem izsevajo v vse smeri, približno enak delež oddane
svetlobe pa nato lahko zajame dober objektiv (NA = 1,27, n = 1,33).
Fluorescenčna svetloba nato potuje nazaj skozi mikroskop, pri katerem smo prepustnost
vseh optičnih elementov za obe smeri potovanja skupaj ocenili na 90 %. Konfokalni disk
izsevane svetlobe iz goriščne ravnine skoraj ne ovira, saj so luknjice v našem primeru
precej večje od uklonskih omejitev [87]. Prepustnosti dvobarvnega zrcala in izsevnega
filtra za večino fluorescenčne svetlobe sicer znašata po 95 %, a navadno ne zajameta
celotnega spektra barvila, s čimer lahko izgubimo nadaljnjo tretjino fotonov.
Od prepuščenih 90 nm spektralne širine nato LCTF zajame približno 15 %, kar pa je
potrebno obtežiti še s PLCTF (0,3) in prepustnostjo vhodnega polarizatorja (0,5), kar skupaj
pomeni, da skozi LCTF pride le okoli 2 % do tod prispele svetlobe. Tako nam pred
posameznim slikovnim elementom kamere ostane nekaj manj kot 200 fotonov na sekundo.
Kvantni izkoristek zaznavanja je pri uporabljenih kamerah sicer visok (0,9), a potrebujemo
za pretvorbo v posamezno digitalno enoto signala v povprečju okoli 20 izbitih elektronov.
Pri poskusih, kjer lahko zaradi premikanja vzorca ali bledenja signala posamezni
posnetek osvetlimo le za nekaj desetink sekunde, smo na koncu torej ostali praktično
povsem brez signala, pri čemer nam tudi možnost elektronskega pomnoževanja ne
pomaga. V nadaljevanju smo se zato odpovedali konfokalnemu snemanju, s čimer smo
pridobili manjkajoči velikostni razred signala, v prihodnosti pa načrtujemo nadgradnjo
sistema z močnejšim diodnim virom svetlobe.
38
3 Podrobnosti laboratorijskega dela
Za raziskovanje biomembranskih faz in domen smo pripravili velikanske enoplastne
mehurčke (angl. giant unilamellar vesicles, GUV) ter jih označili z enim od fluorescenčnih
označevalcev. Kot primer kompleksnejšega okolja smo uporabili žive celice ter spremljali
interakcije med njihovimi membranami ter velikimi enoplastnimi liposomi (angl. large
unilamellar vesicles, LUV). Ustrezne referenčne spektre celotnih raztopin vzorcev smo
posneli s spektrofluorimetrom ter jih primerjali z meritvami FMS posameznih liposomov.
3.1 Priprava vzorcev
3.1.1 Kemikalije
Velikanske liposome (GUV) smo pripravljali iz fosfolipidov DOPC (Slika 3.1 A) in DPPC
(Slika 3.1 B) proizvajalca Avanti Polar Lipids (Alabaster, ZDA) ter holesterola (hol;
Slika 3.1 C) in negativno nabitega lipida PG (Slika 3.1 D), kupljenih pri podjetju
Sigma-Aldrich (St. Louis, ZDA). Pri pripravi LUV smo uporabili tudi spojini OPP
(Slika 3.1 E), ki smo ga dobili v dar od Prof. Reinerja Zeisiga, ter DCP (Sigma-Aldrich,
Slika 3.1 F). Pri tem smo uporabljali organska topila kloroform, metanol, etanol in DMSO
proizvajalcev AppliChem GmbH in Merck KGaA (oba Darmstadt, Nemčija). Pri uporabi
topil, še posebno pri kloroformu, smo uporabili ustrezna zaščitna sredstva ter upoštevali
navodila za delo.
Fluorescenčne označevalce SPP268, SPP257 ter SPP158 (Slika 2.2 D, E in G) je razvil
in izdelal sodelavec Dr. Stane Pajk s Fakultete za farmacijo na Univerzi v Ljubljani
(Slovenija), fosfolipidne označevalce C6- in C12-NBD-PC (Slika 2.2 B in C) smo naročili
pri podjetju Avanti Polar Lipids, fluorescirajočo molekulo Laurdan (Slika 2.2 F) pa pri
Molecular Probes (Eugene, ZDA).
Glukozo in saharozo za raztapljanje vzorcev smo kupili od proizvajalcev
Sigma-Aldrich oz. Kemika (Zagreb, Hrvaška), fosfatni pufer PBS pa smo pripravili sami iz
laboratorijske založne raztopine. Organsko želirno sredstvo podjetja Biomade (Groningen,
Nizozemska) na osnovi molekule 1,3,5-cikloheksiltrikarboksamid [96], ki smo ga
uporabljali za preprečevanje premikanja liposomov med nekaterimi meritvami FMS, nam
je prijazno odstopil Dr. Ilja Küsters. Vse snovi smo uporabljali brez dodatnega čiščenja.
3.1.2 Priprava velikanskih enoplastnih liposomov (GUV)
Liposome različnih biokemijskih sestav smo pripravljali po metodi nežne kopeli (angl.
gentle hydration) [97–99]. Vsaki izbrani mešanici lipidov smo dodali 15 % nabitih
maščobnih molekul PG, ki z medsebojnim odbojem spodbudijo tvorbo enoplastnih
mehurčkov. Običajno smo lipide v stekleni epruveti z notranjim premerom 7 mm razredčili
z mešanico kloroforma in metanola (prostorninsko razmerje 7:3) do koncentracije
39
0,1 mg/ml. Organska topila smo izparili v dveh stopnjah: najprej v eni do dveh urah z
vrtečim izparjevalnikom (Rotavapor R-200, Büchi Labortechnik AG, Postfach,
Switzerland) pri temperaturi med 50 in 60 °C ter nato še v dodatnih treh urah na
vakuumski črpalki pri sobni temperaturi. Tako je na stenah epruvete nastal tanek sloj
posušenih lipidov, ki smo ga najprej 30 min »predhidrirali« v nasičeno vlažnem ozračju pri
60 °C. V epruveto smo nato previdno dodali 1,5 ml raztopine 0,1 M saharoze, pogrete na
50 °C, in vzorec pri 50–60 °C pustili hidrirati preko noči. Medtem so se plasti lipidov
odluščile s sten epruvet in zavile v liposome. Prihodnje jutro smo vzorec počasi ohladili,
prelili v stekleno vialo in še isti ali naslednji dan uporabili pri meritvah.
Ker lipidi v liposomih ne fluorescirajo, smo jim vsakič dodali eno izmed izbranih
barvil. Laurdan ter lipidne fluorescenčne označevalce C6- in C12-NBD-PC, raztopljene v
kloroformu, smo zamešali med lipide v množinskem razmerju 1:250 pred izparevanjem
organskih topil. Molekuli SPP268 ali SPP257, raztopljeni v etanolu, smo običajno dodali
šele končni raztopini liposomov, tako da je bilo končno množinsko razmerje glede na
lipide v vzorcu 1:200. Zaradi svoje amfifilnosti in učinkovite lateralne difuzije so se
označevalci v nekaj minutah sami prerazporedili v membrane liposomov.
S poskusnimi meritvami pri različnih koncentracijah označevalcev smo se prepričali, da
so bile zgoraj navedena razmerja dodanih molekul dovolj nizka, da so bili vplivi njihovega
kopičenja [100] ali resonančnega prenosa energije [101] na izmerjene fluorescenčne
emisijske spektre zanemarljivi (Dodatek A).
3.1.3 Priprava velikih enoplastnih liposomov (LUV)
Vzorce LUV smo pripravljali po ustaljeni metodi hidriranja lipidnih filmov in
ekstruzije [102]. Najprej smo suh film lipidov pripravili enako kot pri GUV, le da smo
uporabili mešanico lipidov OPP, hol in DCP v množinskih razmerjih 10:5:2 in končno
skupno koncentracijo 10 mM. Lipidom v organskem topilu smo dodali tudi fluorescenčni
označevalec C6-NBD-PC v množinskem deležu 1:200. Z raztapljanjem filma v PBS so
med stresanjem nastali večplastni liposomi (angl. multilamellar vesicles, MLV), iz katerih
smo nato pripravili enoplastne z večkratno ekstruzijo skozi polikarbonatni filter z
velikostjo pore 100 nm. Pri tem smo uporabili pripravo LiposoFast Basic proizvajalca
Avestin (Ottawa, Kanada). Negativno nabita molekula DCP je preprečevala sprijemanje
nastalih liposomov in s tem zagotavljala stabilnost končne suspenzije.
3.1.4 Gojenje celic
Človeške celice raka dojke (MCF-7) smo pri temperaturi 37 °C in nasičeno vlažni
atmosferi s 5 % CO2 gojili v celicam prilagojenem mediju DMEM (Dulbecco's modified
Eagle's medium) Gibco proizvajalca Invitrogen (Carlsbad, ZDA), ki je vseboval 10 %
seruma govejega zarodka (angl. fetal bovine serum, FBS), penicilin (100 mednarodnih
enot/ml) in streptomicin (100 g/ml) proizvajalca Sigma-Aldrich. Dva dni pred poskusi
FMS smo celice presadili v bazenčke s steklenim dnom Lab-Tek Chambered Coverglass
proizvajalca Nalge Nunc (Rochester, ZDA). Do meritev so se celice namnožile do gostote
okoli 3 × 104 celic/bazenček.
40
3 Podrobnosti laboratorijskega dela
Slika 3.1 Kemijske zgradbe v tem delu uporabljenih lipidov: (A) DOPC, (B) DPPC, (C) hol,
(D) PG, (E) OPP in (F) DCP.
3.2 Potek meritev
3.2.1 Meritve s spektrofluorimetrom
Večino referenčnih meritev fluorescenčnih emisijskih spektrov GUV in LUV smo pri
sobni temperaturi opravili s spektrofluorimetrom Infinite M1000 (Tecan, Männendorf,
Švica) na Odseku za molekularne in biomedicinske znanosti (B2) Inštituta »Jožef Stefan«.
V ta namen smo po 150 l vsakega vzorca nanesli na črno mikrotitrsko ploščico s 96
prostorčki, spektre pa nato posneli brez pokrova. Barvili NBD in Laurdan smo vzbujali z
žarkoma valovne dolžine 450 nm oz. 370 nm, izsevano svetlobo pa vzorčili na območju
480–650 nm oz. 400–550 nm. Širini tako vzbujevalne kot merilne reže smo nastavili na
10 nm, kar je primerljivo s širino prepustnega okna LCTF. Od izmerjenih spektrov smo
odšteli referenčni spekter ozadja, ki smo ga hkrati z ostalimi meritvami posneli iz
prostorčkov z raztopino 0,1 M saharoze. Za večjo zanesljivost rezultatov smo spektre
vzorca in ozadja vedno izmerili vsaj iz dveh prostorčkov in podatke povprečili.
Temperaturno odvisne meritve fluorescence smo opravili na Fakulteti za farmacijo
Univerze v Ljubljani z napravo PerkinElmer LS55 (Waltham, ZDA) s termostatsko enoto
PCB 1500. Uporabili smo podobne nastavitve kot pri zgoraj opisanih poskusih. Ker se je
izkazalo, da valovne dolžine na detektorju niso bile pravilno umerjene, smo rezultate s te
naprave vedno primerjali le med seboj, ne pa tudi s spektri, posnetimi s Tecan-om ali FMS.
3.2.2 Poskusi FMS z GUV
Za meritve FMS smo okoli 40–60 l suspenzije liposomov prenesli v bazenček, ki smo ga
s silikonskim mazivom (Klüber Lubrication, München, Nemčija) izdelali na običajnem
objektnem stekelcu ter nato pokrili s krovnim stekelcem. Pri tem smo vzorec običajno
10-krat razredčili z 0,1 M raztopino glukoze. Zaradi posledične razlike v gostotah raztopin
znotraj in zunaj liposomov so se le-ti posedli na dno bazenčka, kar je močno olajšalo
opazovanje z obrnjenim mikroskopom. V nekaterih primerih smo vzorcu dodali tudi zelo
priročno prozorno želirno sredstvo [96], ki se je utekočinilo ob kratkem stresanju na
41
stresalniku ter se nato v nekaj minutah ponovno strdilo. Gost preplet polimerov je še
dodatno umiril gibanje liposomov, zaradi česar smo lahko uporabili daljše osvetlitvene
čase in s tem dosegli boljši signal.
Za temperaturno odvisne meritve smo silikonski bazenček z vzorcem pripravili med
dvema krovnima stekelcema in ga z lepilnim trakom pritrdili na grelno stekelce z
naparjenim prosojnim nanosom indijevega kositrovega oksida (angl. indium tin oxide,
ITO), ki je bilo izdelano na našem inštitutu. V bližini vzorca je bil s toplotno prevodnim
lepilom pričvrščen termočlen, katerega signal je v povratni zanki izkoriščala nadzorna
enota temperature Oxford Instruments ITC503 (Abingdon, Velika Britanija).
Predstavljene meritve smo izvedli z zračnim objektivom z 10-kratno povečavo ali z
vodnim potopnim objektivom s 60-kratno povečavo (Preglednica 2.1). Fluorescenco
barvila NBD smo vzbujali skozi širokopasovni filter Semrock BrightLine 460/60; oznaka
predstavlja lego sredine in širino prepustnega okna v nanometrih, torej tak filter prepusti
svetlobo v razponu med 430 in 490 nm. Dvobarvno zrcalo s prehodom prepustnosti pri
495 nm je vzbujevalno svetlobo usmerilo proti vzorcu, zbrano izsevano svetlobo pa
prepustilo proti emisijskemu filtru 550/88, ki prepušča valovne dolžine v razponu med 506
in 594 nm. Slednji je omejil vzorčenje z LCTF, katerega širina prepustnega okna pri teh
valovnih dolžinah znaša okoli 12 nm (Slika 2.8 B), na območje približno 515–585 nm. Za
barvilo Laurdan smo uporabili vzbujevalni filter 377/50, dvobarvno zrcalo s prehodom pri
valovni dolžini 409 nm ter izsevni filter 470/100, s katerim smo lahko s FMS pregledali
fluorescenco v razponu okoli 430–510 nm.
3.2.3 Poskusi FMS s celicami
Pred poskusom smo celični medij v opazovalnem bazenčku nadomestili s 120 l mešanice
medija brez FBS in suspenzije liposomov v razmerju 1:1. Vzorcu smo nato dodali
približno 2 l raztopine SPP268 koncentracije 10–5 M, tako da je bila končna koncentracija
označevalca približno 1,5 × 10–7 M. Celice smo opazovali z vodnim potopnim objektivom
s 60-kratno povečavo, katerega temperaturo smo z v laboratoriju narejenim grelnim
obročkom vzdrževali pri za celice najugodnejših 37 °C, ali oljnim objektivom s 100-kratno
povečavo. Pri vseh poskusih smo uporabili isto kombinacijo filtrov kot zgoraj za NBD in
spektre posneli v primerljivih razponih valovnih dolžin.
3.2.4 Priprava podatkov FMS
Iz vsakega posnetega niza slik pri različnih valovnih dolžinah smo v vsaki točki vidnega
polja določili spekter izsevane svetlobe kot zaporedje jakosti signala na danem mestu
(Slika 2.6). Pred nadaljnjo obravnavo smo obliko spektra popravili z izmerjeno
prepustnostno funkcijo LCTF (Slika 2.10). Za uspešnejšo obdelavo smo slike običajno
predhodno povprečili po kvadratnih območjih po 5 × 5 slikovnih elementov, kar pri
60-kratni povečavi še vedno predstavlja krajevno ločljivost okoli 1,3 m. Pri meritvah z
GUV smo vsem spektrom odšteli signal ozadja zaradi sipane svetlobe, ki smo ga razbrali iz
temnih delov vidnega polja brez liposomov. Omenjenim korakom je sledil postopek
obdelave spektrov in predstavitve rezultatov, ki je podrobno opisan v naslednjem poglavju.
42
4 Obdelava fluorescenčnih spektrov
Spektralno odvisno slikanje fluorescence sodi med novejše kombinirane eksperimentalne
metode, ki omogočajo določanje spektralnih lastnosti z mikroskopsko krajevno
ločljivostjo [60,61]. Najpogosteje se uporablja za slikanje in razločevanje flourescenčnih
označevalcev z močno prekrivajočimi se spektri. Za razstavljanje signala na posamezne
prispevke (angl. linear/spectral unmixing) so v zadnjem času razvili mnogo naprednih
algoritmov [103–106]. Nasprotno je bila spektroskopsko usmerjena uporaba metode (FMS)
v kombinaciji z okoljsko občutljivimi barvili [64] močno zapostavljena, četudi se ta barvila
redno uporabljajo pri fluorescenčni spektroskopiji za določanje biokemijskih in
biofizikalnih molekularnih lastnosti preiskovanih sistemov. Donedavno so pri meritvah
posameznih mikroskopskih vzorcev uporabljali le barvila z velikim spektralnim odzivom,
ki omogočajo slikanje spektralnih razmerij (angl. ratiometric imaging) z zelo nizko
spektralno ločljivostjo nekaj deset nanometrov [62,63].
Da bi razširili nabor eksperimentalnih možnosti z barvili in označevalci s šibkejšim
spektralnim odzivom, a želenimi drugimi fizikalno-kemijskimi lastnostmi, smo uvedli
prilagajanje modelnih spektrov [57]. S tem smo izboljšali natančnost določanja lege
spektralnega vrha (MAX) mnogo pod velikost koraka vzorčenja valovnih dolžin () ali
širino ozkopasovnega filtra [59]. Podobne metode uporabljajo pri natančnem določanju
lege delcev [107], od koder smo zato lahko povzeli tudi podrobno teoretično
obravnavo [108]. V nadaljevanju bomo pokazali, da lahko s FMS v skladu s teoretično
napovedjo dosežemo nanometrsko ločljivost MAX pri razmeroma nizkih vrednostih signala
proti šumu (angl. signal-to-noise ratio, SNR) ter velikih  [59], kar bi moralo biti
dosegljivo z večino danes dostopnih sistemov za FMS oz. spektralno slikanje.
S spektralnim prilagajanjem in posebnim načinom zajemanja signala smo zaobšli tudi
učinek bledenja fluorescence (angl. photobleaching). Le-to je posledica postopnega
uničenja barvila zaradi močne vzbujevalne svetlobe [38] ter močno vpliva na vse poskuse,
kjer fluorescenčni signal zajemamo zaporedoma. V izogib popačenim rezultatom so doslej
razvili učinkovite načine merjenja in obdelave podatkov za poskuse časovne
odvisnosti [109,110], 3D konfokalnega slikanja [111,112] ter slikanja FRET [113]. Po
drugi strani so za FMS le odsvetovali uporabo sistemov z ozkopasovnimi filtri, ki signal
pri različnih valovnih dolžinah zajemajo zaporedno in zato popačijo hitro bledeč spekter
(Slika 4.1 A); kot zanesljivejšo izbiro so predlagali sisteme z uklonskimi elementi, ki
signal po valovnih dolžinah zajemajo sočasno [60,114].
Ker so stalni ali nastavljivi filtri dostopnejši in je njihova vgradnja v obstoječe
fluorescenčne mikroskope enostavnejša, se nam je zdela tovrstna »rešitev« preveč
omejujoča. Zato smo razvili preprosto tehniko odpravljanja vpliva bledenja na obliko
spektrov [57], ki temelji na večkratnih meritvah signala pri določeni referenčni valovni
dolžini med snemanjem posameznega spektra (Slika 4.1 B). Časovno zaporedje
43
referenčnih točk uporabimo za določitev hitrosti bledenja, kar nato upoštevamo med
računskim prilagajanjem spektra. Pri zadostnem SNR omenjeni postopek učinkovito
odstrani popačitve zaradi bledenja, le v primeru zelo nizkega signala smo opazili nekaj
doslednih odstopanj. Tudi te smo nadalje odpravili z naključnim vzorčenjem po valovnih
dolžinah (Slika 4.1 C). Posledična žagasta oblika izhodnega spektra poleg izvorne oblike
hrani tudi podroben odtis hitrosti bledenja, ki jo izluščimo med prilagajanjem
spektrov [58].
Podrobna numerična analiza in številni poskusi, predstavljeni v nadaljevanju poglavja,
so pokazali, da lahko tudi pri močno zbledelih spektrih dosežemo nanometrsko ločljivost
MAX [59]. Ugotovitve dokazujejo, da lahko torej tudi pri poskusih FMS z zaporednim
zajemom valovnih dolžin uporabimo mnogo uporabnih okoljsko občutljivih, a svetlobno
neobstojnih fluorescenčnih barvil, kot denimo NBD [53,77]. Z ustreznimi meritvami in
obdelavo lahko njihovo bledenje celo izkoristimo kot dodaten vir informacij [59], ki ga
sicer izkoriščajo pri slikanju hitrosti bledenja (angl. bleach rate imaging) [115–117].
Slika 4.1 (A) Pri zaporednem (t) vzorčenju signala (I) pri različnih valovnih dolžinah ()
bledenje fluorescence popači obliko izmerjenega spektra (polni krožci), ki se zato lahko močno
razlikuje od pričakovane (prekinjena črta na spodnjem prikazu). Zato smo uvedli dve metodi
zajemanja, ki vsaka na svoj način shranita podatek o hitrosti bledenja: (B) med meritvami
občasno pomerimo signal pri izbrani referenčni  (svetlo sive točke) ali pa (C) svetlobo pri
različnih  posnamemo v naključnem vrstnem redu. V zadnjih dveh primerih nato med
naknadno računalniško obdelavo podatkov določimo hitrost bledenja in odpravimo njegov
vpliv na izmerjene podatke.
44
4.1 Matematični modeli oblike fluorescenčnega spektra
Pri poskusih FMS z okoljsko občutljivimi barvili spremljamo razlike v obliki
fluorescenčnih spektrov pod vplivom zunanjih fizikalno-kemijskih pogojev. Za
enostavnejše vrednotenje teh sprememb smo uvedli opis z matematičnimi modeli, ki
razlike v oblikah spektrov prevedejo na spremembe ustreznih parametrov. Posledično
lahko spektralne lastnosti, denimo položaj vrha, določimo s precej večjo natančnostjo kot
nakazujeta velikost koraka vzorčenja ali širina ozkopasovnega filtra tudi pri spektrih z
nizkim signalom.
Še posebno pri takih je naša prvotna metoda s prilagajanjem polinoma [57] hitro
odpovedala. Zato smo želeli poiskati primernejši matematični model, ki bi lahko opisal
glavne oblikovne značilnosti preprostih fluorescenčnih spektrov, tj. lego vrha ter širino in
nesimetričnost oblike, za kar torej potrebujemo vsaj tri neodvisne parametre. Ker pri FMS
običajno ne merimo skrajnih koncev spektralne porazdelitve in ker so spektri velikokrat
obremenjeni z močnim šumom, smo izbiro omejili na modele z najmanjšo zadovoljivo
pestrostjo, tj. s po tremi parametri. S tem smo želeli preprečiti močne korelacije med
parametri ter zagotoviti kar najhitrejše in najzanesljivejše prilagajanje.
V preteklosti so se opisov fluorescenčnih spektrov lotevali na dva načina: ali so obliko
izračunali iz osnovnih načel kvantne mehanike [118–120] ali jo opisali z izkustvenimi
modeli nesimetričnih porazdelitev [121,122]. Zato smo izbrali za naše potrebe
najprimernejša predstavnika obeh razredov – fizikalni opis prehodov med stanji kvantnega
harmonskega oscilatorja (HO) ter logaritemsko normalno porazdelitev (LN). Kot je
podrobno predstavljeno v nadaljevanju, smo zaradi nižje računske zahtevnosti in večje
robustnosti modela za obdelavo FMS spektrov izbrali slednjega [59].
4.1.1 Kvantno-mehanski spektralni model – harmonski oscilator
Najpreprostejši in hkrati edini smiselni 3-parametrični fizikalni model fluorescenčnega
spektra opisuje elektronske prehode (Slika 4.2) iz osnovnega molekularnega nihajnega
stanja vzbujenega elektronskega nivoja (0*) v diskretna nihajna stanja osnovnega
elektronskega nivoja (n). Omenjena stanja opisujejo valovne funkcije kvantnega
harmonskega oscilatorja () [123]:
 n  x    2n n !
1/2
 1/4 exp   x 2 2  H n  x  ,
 n*  x    n  x  x  ,
(4.1)
kjer brezdimenzijski parameter x = (m E0)1/2 ħ–1 x' predstavlja efektiven raztezek
molekule (x'), normiran na reducirano maso oscilirajočega sistema (m), energijski razmak
med vibracijskimi stanji (E0) ter reducirano Planckovo konstanto (ħ = h/2), x opisuje
povečanje ravnovesne razdalje v vzbujenem elektronskem stanju [120] in je vzrok
nesimetričnosti spektralne porazdelitve, Hn pa je oznaka za Hermitov polinom n-te stopnje.
Verjetnost za prehod P0*n je po Franck-Condonovem pravilu sorazmerna
prekrivalnemu integralu valovnih funkcij [120], ki ga lahko v tem razmeroma preprostem
primeru izračunamo analitično:
45

P0*n    n  x   0*  x  x  dx 

 x /2
2
n
Exp  x 2 /2 
  n  1
,
(4.2)
pri čemer  predstavlja funkcijo gama [124]. Spekter (SHO) v odvisnosti od valovne
dolžine () končno dobimo z zvezama
SHO  P0*n
E  hc / 
dn
, n *
,
d
E0
(4.3)
kjer je E* energijska razlika med elektronskimi stanji (Slika 4.2). Dobljen spekter je sicer
diskreten po celoštevilskih n, a ga pozvezimo z določilom, da lahko n zavzame katerokoli
pozitivno realno vrednost. Privzetek lahko upravičimo z dejstvom, da k spektru večjih
molekularnih sistemov, kot so fluorofori, prispeva več podobnih molekularnih orbital in
nihajnih načinov, kar razmaže posamezne diskretne spektre v široko zvezno porazdelitev.
Oblika izpeljanega spektra je odvisna od treh parametrov (E*, E0 in x), višina signala
pa je umerjena za vsako kombinacijo parametrov posebej. Bolj podroben opis resničnega
kvantnomehanskega dogajanja bi zahteval različni jakosti potencialov v osnovnem in
vzbujenem stanju ter morebitne anharmonske popravke [118,119,125], a bi s tem presegli
zgoraj predpisano število parametrov za opis FMS meritev. Poleg tega se pogosto izkaže,
da so vplivi dodatnih parametrov na razmeroma preprosto obliko spektra že tako
prepleteni, da je reševanje obratnega problema (tj. iskanje najboljšega prileganja
modelnega spektra danim podatkom) neučinkovito [121].
Ob tem lahko še omenimo zanimivo sorodnost izpeljane spektralne oblike, podane z
enačbo (4.2), s Poissonovo verjetnostjo za n dogodkov pri povprečju x2/2 [124].
Podobnost lahko opazimo tudi s porazdelitvijo 2 s k prostostnimi stopnjami [124], pri
kateri x2 nadomešča 2, n, ki je povezan z , pa teče po k = 2 (n + 1). Iskanje vzrokov za
tovrstne vezi je seveda izven okvira tega dela.
Slika 4.2 Shema fizikalnega modela prehodov (rdeča puščica) med lastnimi stanji zamaknjenih
harmonskih oscilatorjev. Črtkane črte predstavljajo potencial v odvisnosti od reduciranega
molekularnega raztezka (x), polne senčene krivulje pa verjetnostne porazdelitve posameznih
vibracijskih stanj (n2). Podrobnejša razlaga oznak se nahaja v besedilu.
46
4.1.2 Izkustveni spektralni model – logaritemska normalna porazdelitev
Nesimetrično obliko izkustvenega matematičnega modela smo dosegli z logaritemsko
pretvorbo argumenta Gaussove normalne porazdelitve enotske širine (SLN)
SLN  q   exp  q 2  , q  log  q ' /  ,
(4.4)
ki smo jo zaradi potreb prilagajanja spektrov umerili na višino signala namesto na vrednost
integrala. Parameter  nastavlja stopnjo nesimetričnosti in v limiti   0 funkcijo pripelje
nazaj v normalno porazdelitev. Nastavljivost lege vrha in širine spektra smo nadalje
dosegli z uvedbo parametrov  in :
q '       .
(4.5)
Ker je logaritem definiran le za pozitivne q', je definicijsko območje S omejeno na  > , ki
pa ga lahko zvezno razširimo z določilom SLN = 0 za   .
Za še bolj intuitivno obravnavo smo želeli parametre prevesti na položaj spektralnega
vrha (MAX), širino na polovični višini (w) ter nesimetričnost (a), definirano kot
a   wD  wL  w ,
(4.6)
kjer wD in wL predstavljata delni širini na polovični višini desno in levo od MAX
(Slika 4.3). S temi zahtevami smo izpeljali naslednje zveze:

2
2
w
arctanh  a  ,   sinh  2a  ,   MAX  ,
w
4a
log 2
(4.7)
kar se za nizke stopnje nesimetričnosti poenostavi v

2a
4a
w
,   ,   MAX  .
w
4a
log 2
(4.8)
Slika 4.3 Skica modelnega spektra z vrisanimi lastnostmi, potrebnimi za določitev parametrov
spektralnega modela logaritemske normalne porazdelitve.
47
Pri a = 0,24, značilni za spektre barvila NBD, se ob uporabi zgornje poenostavitve
parametra za širino in nesimetričnost spektra razlikujeta od točnih vrednosti le za 4 oz. 2 %,
kar je v primerjavi z natančnostjo določanja povsem sprejemljivo. Končna oblika LN
porazdelitve, ki smo jo uporabili za opis fluorescenčnih emisijskih spektrov, se tako glasi
2

 log 2   4a
w
 
exp  
log     MAX   1   ,   MAX  ,
2 
 4a   w

4a
  

SLN     

w
0,
  MAX  .

4a

(4.9)
Med naknadnim pregledom literature se je izkazalo, da so podobno obliko z nekoliko
drugače definirano nesimetričnostjo že večkrat uporabljali za opis fluorescenčnih
spektrov [121,122,126–128]. V ta namen je bilo predlaganih tudi več drugih funkcijskih
oblik [122], a so se med našimi preizkusi izkazale za numerično manj stabilne od modela
LN, saj vplivi parametrov na glavne oblikovne značilnosti spektra niso tako lepo
razklopljeni.
4.1.3 Primerjava obeh spektralnih modelov
Za izbiro najprimernejšega modela za opis izmerjenih spektrov smo obe zgoraj
predstavljeni spektralni funkciji nato uporabili za opis istih podatkov. Le-teh nismo umetno
ustvarili s katerim od preiskovanih modelov, saj nismo želeli nobenemu vnaprej dati
prednosti. Zato smo za preizkušanje uporabili normiran spekter označevalca SPP268 v
liposomih DPPC (SE), posnet s spektrofluorimetrom (Slika 4.4 A). Ker se model HO ni
uspel zadovoljivo prilagoditi repom porazdelitve in ker teh na FMS običajno niti ne
merimo, smo uporabili le podatke nad pragom signala IT = 0,2. Parametre najboljšega
prileganja vsake od obeh funkcij (v nadaljevanju za oba uporabljamo splošno oznako S)
smo določali z metodo Nelder-Mead [129], vgrajeno v programskem orodju Mathematica
(Wolfram Research, Champaign, ZDA), pri čemer smo uspešnost rezultata ocenjevali s
standardno vrednostjo 2, reducirano na število merskih točk (N) in normirano na varianco
šuma (2)

2
  S     S   
 
E
N 2
2
.
(4.10)
V za FMS značilnem razponu SNR med 10 in 100, ki smo ga dosegli s prištevanjem
ustreznega naključnega signala, sta oba modela spekter opisala popolno, kar se odraža v
vrednostih 2 okoli 1 (Slika 4.4 B).
Hkrati smo spremljali tudi čas, potreben za optimizacijo parametrov, in ugotovili, da je
funkcija LN očitno računsko veliko manj zahtevna od HO (Slika 4.4 C). Podatek je nadvse
pomemben, saj je potrebno pri obdelavi posameznega poskusa FMS prilagoditi nekaj deset
tisoč spektrov iz vseh obravnavanih točk vidnega polja mikroskopa. Za sprotno obdelavo
slik FMS smo kasneje vpeljali približno tisočkrat hitrejši algoritem [130].
48
Nadalje smo ocenili še občutljivost modelov na vhodne podatke. Želeli smo namreč
zagotoviti, da bi za spektre istega vzorca, izmerjene pri različnih nastavitvah, dobili vedno
isto kombinacijo parametrov. To smo preverili na več načinov: z izpuščanjem ustreznih
merskih točk smo dvigovali prag jakosti signala (IT) ali povečevali korak vzorčenja (), z
dodajanjem naključnega signala pa smo nižali SNR. Ker nobena sprememba ni vplivala na
osnovno obliko spektra, ki smo ga želeli opisati, smo v vseh primerih v povprečju
pričakovali podoben nabor optimalnih parametrov (pi) kot za izhodiščni spekter (pi,1). Zato
smo spremljali povprečno relativno odstopanje parametrov (p/p1), definirano kot
3
 p p1   pi  pi ,1
i 1
3 p  ,
i ,1
(4.11)
kjer smo s tekočim indeksom i zajeli vse tri parametre vsakega od modelov. Postopek
prilagajanja smo v vsakem primeru ponovili 64-krat, vsakič s sveže ustvarjenim šumom,
ter izračunali povprečno vrednost p/p1 ter njen raztros.
Primerjava med modeloma (Slika 4.4 D–F) je pokazala, da je funkcija LN mnogo manj
občutljiva na opisane spremembe podatkov kot HO. Vzrok najverjetneje leži v
korelacijskih matrikah parametrov (C), ki smo jih za oba modela izračunali po
predpisu [131]
C  A 1 ,
Aij  

S    S   
,
pi
p j
(4.12)
Slika 4.4 Primerjava ustreznosti obeh spektralnih modelov: kvantno-mehanskega harmonskega
oscilatorja (HO, črne oznake) in logaritemske normalne porazdelitve (LN, rdeče oznake). Med
iskanjem (A) najboljšega prileganja obeh modelnih funkcij spektrofluorimetričnim meritvam
liposomov DPPC z označevalcem SPP268 (sivi krožci) nad pragom jakosti signala 0,2
(prekinjena vodoravna črta) smo primerjali (B) uspešnost prilagajanja (2) in (C) potreben
čas (t). Robustnost modelov smo spremljali s pomočjo povprečne relativne napake parametrov
(p/p1), kot smo jo glede na izhodiščne vrednosti (p1) določili med spreminjanjem (D) praga
upoštevanega signala (IT), (E) koraka vzorčenja valovnih dolžin () ter (F) kvalitete signala
(SNR). Stolpci in krožci na prikazih B–F predstavljajo povprečne vrednosti 64 ponovitev z na
novo izračunanim prispevkom šuma, narisane napake pa njihove standardne odklone.
49
kjer S in pi,j nadomeščata spektralno funkcijo oz. parametre vsakega od modelov.
Diagonalni elementi Cii predstavljajo variance posameznih parametrov (Slika 4.5 A), ki
smo jih za lažjo primerjavo umerili na smiselne velikosti njihovih območij (ri, navedeni
pod prikazom Slika 4.5). Rezultati kažejo, da so bili parametri modela LN precej bolje
določeni, zaradi česar so bili raztrosi prej primerjanih napak bistveno nižji (Slika 4.4 D–F).
Za občutljivost modela HO na vhodne podatke pa so bile morda še pomembnejše visoke
vrednosti izvendiagonalnih elementov Cij (Slika 4.5 C), ki predstavljajo računske
soodvisnosti parametrov. Zaradi le-teh je optimizacijski algoritem nekoliko spremenjene
spektre opisal z drugačno kombinacijo parametrov, kar se je odrazilo v njihovih visokih
povprečnih napakah (Slika 4.4 D–F).
Zaradi večje robustnosti in nižje računske zahtevnosti smo za obdelavo spektrov FMS
izbrali izkustveni model LN [59]. Pred tem smo seveda preverili, da je funkcija dovolj
prilagodljiva za uspešen opis tudi drugih fluorescenčnih spektrov preproste oblike, in ne le
dotičnega primera, ki smo ga uporabili za testiranje.
Slika 4.5 (A) Primerjava varianc parametrov obeh modelov (Cii), normiranih na smiselne
razpone možnih vrednosti (ri): {0,35, 0,05, 0,1} eV za parametre {E*, E0, Ex = x2/2 E0}
modela HO ter {80 nm, 40 nm, 0,1} za parametre {MAX, w, a} modela LN, ki si sledijo v
vrstnem redu i,j = 1–3. Z navedenimi intervali smo pri obeh modelih zajeli primerljive
spremembe oblike spektra. Za primerjavo medsebojnih odvisnosti parametrov modelov (B) LN
in (C) HO smo elemente kovariančne matrike (Cij) umerili na ustrezne kombinacije varianc
(|Cii Cjj|1/2).
50
4.2 Prilagajanje modela bledečim spektrom
Po podrobni obravnavi pravkar predstavljenih različnih funkcijskih oblik za opis
fluorescenčnih spektrov smo za obdelavo meritev FMS s svetlobno občutljivimi barvili
izbrani model LN še nekoliko razširili [58]. Bledenju smo pripisali eksponentno pojemanje
signala [94] s hitrostjo b, tako da smo poljuben modelni spekter (I) opisali z izrazom
I     I 0 SLN    exp  bt   I 0 SB    ,
(4.13)
kjer I0 predstavlja vrednost signala nezbledelega spektra pri  = MAX, t pa čas od začetka
poskusa do trenutka meritve pri dani . Z oznako SB smo povzeli obliko bledečega spektra.
Oblikovne parametre (MAX, w, a in b) najboljšega prileganja modelnega spektra z
eksperimentalnim (IE) smo iskali z minimizacijo normiranega reduciranega2 (4.10),
najprimernejši I0 pa smo za vsako kombinacijo oblikovnih parametrov določili analitično
d 2
0
dI 0

I0 
 I   S   ,
 S  
E
B
2
B
(4.14)
zato ga v nadaljevanju ne prištevamo med prilagojene parametre [59].
Z uporabo izpopolnjene optimizacijske metode Nelder-Mead [130] smo dosegli, da je
štirijedrni namizni računalnik okoli deset tisoč spektrov značilnega poskusa FMS obdelal v
manj kot petih sekundah. V primerjavi s prej uporabljenim algoritmom (Slika 4.5 C) je to
tri velikostne rede hitreje in uporabniku omogoča sprotno obdelavo meritev.
Model (4.13) lahko po potrebi preprosto razširimo na več spektralnih komponent (SB,j)
z različnimi nabori parametrov (MAX,j, wj, aj, bj) in ustreznimi utežmi (dj)
I     I 0  d j SB, j ( ) .
(4.15)
j
Kot v primeru prilagajanja z eno spektralno komponento, lahko tudi tu poljubno
podmnožico parametrov dobimo z minimizacijo 2, pri čemer je uspešnost seveda odvisna
od količine informacij, vsebovanih v izmerjenem spektru. Bolj kot se spektralne
komponente prekrivajo, več parametrov moramo določiti neodvisno in s tem izboljšati
zanesljivost določanja ostalih. V skrajnem primeru, ko metodi podamo vse oblikovne
parametre in iščemo le deleže posameznih prispevkov ter hitrosti bledenja, deluje
algoritem kot linearno razstavljanje spektrov [103–106], a s pomembno izboljšavo –
popravkom zaradi bledenja signala.
Pri obdelavi s FMS posnetih spektrov barvila NBD je bilo potrebno tudi za prilagajanje
z eno komponento parametra w in a oceniti ločeno. Njihovo določanje iz meritev FMS je
bilo namreč nezanesljivo zaradi ozkega prepustnega območja razpoložljivega emisijskega
filtra, ki je omejilo vzorčenje z LCTF na interval, širok okoli 1 w, za natančnost določanja
omenjenih parametrov pa so ključnega pomena točke čim dlje od MAX. Zato smo za širino
in nesimetričnost uporabili vrednosti okoli w = 78 nm ter a = 0,24, dobljene z obdelavo
ustreznih spektrofluorimetričnih meritev. Z numeričnimi poskusi, predstavljenimi nekoliko
kasneje, smo preverili, da to ni bistveno vplivalo na določanje ostalih parametrov.
51
4.3 Natančnost določanja lege spektralnega vrha
Pri poskusih FMS z okoljsko občutljivimi barvili nas pogosto najbolj zanima lega vrha
fluorescenčnega spektra (MAX). Zato smo želeli preveriti, kolikšne najmanjše premike še
lahko zanesljivo zaznamo [59], kar je povezano z natančnostjo določanja MAX. Pri tem
smo si pomagali z uveljavljeno teorijo o ločljivosti merilnih sistemov [108], ki smo jo
zaradi enostavnosti funkcije LN ter njene podobnosti z Gaussovo preprosto priredili za
naše potrebe. S podrobno razčlembo smo nekoliko presenetljivo ugotovili, da je ločljivost
MAX za dovolj svetle vzorce odvisna predvsem od trajanja poskusa in ne od gostote
vzorčenja valovnih dolžin, kar smo v nadaljevanju potrdili tudi z meritvami. Slednje so se
lepo ujemale s teoretično napovedjo, da lahko za spektre NBD pod povsem sprejemljivimi
merskimi pogoji dosežemo nanometrsko ločljivost MAX [59].
4.3.1 Teoretična obravnava natančnosti MAX
Pri napovedi nedoločenosti lege spektralnega vrha (max) smo se oprli na predhodno
temeljito obravnavo določanja položaja opazovanega signala, izpeljano za Gaussovo
obliko prenosne funkcije merilne naprave [108]. S preimenovanjem količin in nekaj
preprostimi preračuni smo njihove zaključke prevedli v obliko [59]
  max 
 W
SNR

,
F ()
(4.16)
kjer  predstavlja velikost koraka vzorčenja valovnih dolžin; W je povezana s širino
spektra kot W = w/(8 log 2)1/2  w/2,35; SNR v primeru stalnega šuma ozadja definiramo
kot največjo vrednost signala (I0), deljeno s standardnim odklonom prispevka šuma, za
meritve s prevladujočim Poissonovim šumom pa kot I01/2;  je konstanta, odvisna od
izbrane stopnje zaupanja – pri 0,68 (»1 «) zavzame vrednosti 1 za enoparametrično
prilagajanje ter 2,3 oz. 3,5 za dva oz. tri iskane parametre [132]; F pa je brezdimenzijsko
število, povezano z integralom (S/MAX)2 preko celotnega merjenega območja valovnih
dolžin ():
 u2    2
2
za Gaussov šum,
  u exp  u  exp  u a   du
 u1   
F     u 
 
2
2
2
  u exp   u 2  exp  u a   du za Poissonov šum,
 u1   
(4.17)
pri čemer smo zgolj zaradi preglednosti uvedli konstanto  = (2/log 2)1/2  1,70, odvisnost
od  pa skrili v meje integracije:
u1,2 
52
log 1 a   2W 
.
a
(4.18)
Slika 4.6 (A) Prikaz odvisnosti F1/2 od razpona vzorčenja valovnih dolžin () glede na širino
spektra (W), ki smo jih po enačbi (4.17) izračunali za oba primera šuma ter dve vrednosti
nesimetričnosti oblike spektra (a) (glej barvno legendo). (B) Teoretično pričakovana
nedoločenost lege spektralnega vrha (max) glede na kakovost signala (SNR) in pogostost
vzorčenja valovnih dolžin (). Pri tem smo v enačbi (4.16) predpostavili obliko spektra,
podobno spektrom barvila NBD (w = 78 nm, a = 0,24), razpon zajemanja  kot pri naših
poskusih ( = 70 nm), en prilagajan parameter in Poissonov šum.
V primeru spektrov barvila NBD z a = 0,24, ki smo jih vzorčili na območju  = 2,4 W, je
vrednost F1/2 okoli 0,8 ali 1,0 za primera meritev s prevladujočim Gaussovim oz.
Poissonovim šumom (Slika 4.6 A). Zavedamo se, da so pri izpeljavi izvorne teorije privzeli
liho ali sodo simetrijo signala [108], kar v našem primeru ne drži povsem. A ker je
nesimetričnost spektrov barvila NBD razmeroma nizka in ker smo pri poskusih vedno
vzorčili le vršni del signala brez repov spektralne porazdelitve, smo vseeno uporabili
enačbo (4.16) kot naš prvi približek.
Glede na zgornji izraz lahko po pričakovanjih izboljšamo natančnost MAX z gostejšim
vzorčenjem (krajšim ) ali višjim SNR (Slika 4.6 B). Upoštevaje potence v izrazu, bi
lahko na prvi pogled sklepali, da je drugi način učinkovitejši [108], a je potrebno vprašanje
obdelati bolj celostno. S krajšanjem  se število posnetkov po  (N) in s tem celotni čas
meritve (tTOT) povečujeta linearno, kar pri FMS sistemih s filtri stalne spektralne širine ne
vpliva na SNR posameznega posnetka. Po drugi strani lahko SNR pri danem 
povečujemo z daljšanjem osvetlitvenega časa posameznega posnetka (tEXP = tTOT/N), a je
odvisnost – ob predpostavljenem nizkem bralnem šumu kamere – zaradi Poissonove
statistike le korenska. S pomočjo izraza (4.16) torej ugotovimo, da sta oba načina
zniževanja max časovno enako učinkovita, kar pomeni, da so vse informacije, zbrane v
času tTOT, enakovredne. To seveda drži, če sicer poznamo obliko spektra in iščemo le MAX.
Zato je smiselno uvesti t. i. »celokupni SNR« (SNRTOT), definiran kot
SNR TOT  SNR N  SNR

SNR


tEXP
tTOT ,
(4.19)
ki opisuje kvaliteto informacij celotnega poskusa FMS [59]. Ker je člen SNR/tEXP1/2
odvisen izključno od svetlosti vzorca in lastnosti merilnega sistema, predvsem od jakosti
osvetlitve in učinkovitosti zaznave, lahko SNRTOT povečamo izključno s podaljševanjem
53
tTOT. Z upoštevanjem zvez (4.19) lahko nadomestimo SNR in  v enačbi (4.16) z glavnim
vplivom na ločljivost MAX, SNRTOT [59]:
  max 
W
SNR TOT

.
F ()
(4.20)
Ker nam največjo možno vrednost  navadno določa širina prepustnega okna izsevnega
filtra, znotraj katerega lahko vzorčimo z LCTF, ostane tTOT, ki nadalje pogojuje SNRTOT,
edina spremenljivka za izboljševanje ločljivosti MAX. Ko določimo tTOT glede na hitrost
procesov v vzorcu ali bledenja barvila, lahko  in s tem tEXP prilagodimo drugim
zahtevam poskusa, ne da bi s tem vplivali na max. Če se vzorec med meritvijo giblje ali
če ne poznamo vseh parametrov oblike spektra, bomo raje posneli več slik s krajšima  in
tEXP, pri zelo medlih vzorcih pa se bomo v izogib prevelikemu prispevku bralnega šuma
kamere raje odločili za manj slik pri daljših  in tEXP. Pri tem je edini pogoj, da je število
merskih točk po  večje od števila parametrov, ki jih želimo iz podatkov izluščiti [108].
4.3.2 Meritve natančnosti MAX
Seveda smo želeli zgornje teoretične ugotovitve preveriti tudi z meritvami, zato smo s
FMS posneli fluorescenčne spektre 10–4 M raztopine označevalca SPP268 v DMSO, v
kateri barvilo NBD občuti podobno polarnost (MAX okoli 543 nm) kot v membranah v
nadaljevanju uporabljenih liposomov (MAX okoli 536–538 nm). Bledenju signala smo se
izognili z uporabo objektiva z 10-kratno povečavo, z različnimi nastavitvami tEXP in  pa
smo spreminjali SNR in SNRTOT. Prvega smo izračunali iz najsvetlejše slike v -nizu kot
razmerje med povprečno vrednostjo signala in njegovim standardnim odklonom, ko smo
odšteli profil iste, a umetno zglajene slike, drugega pa smo nato določili po enačbi (4.19).
Spektre iz osrednjega, enakomerno osvetljenega dela vidnega polja (200 × 200 slikovnih
elementov) smo obdelali z metodo, predstavljeno v podpoglavju 4.2. Pri tem smo za w in a
uporabili vrednosti 78 nm in 0,24, dobljeni s prilagajanjem modela spektrofluorimetričnim
meritvam istega vzorca, b pa smo glede na zgoraj opisane merilne pogoje postavili na 0.
Iz rezultatov vsake meritve smo izračunali standardni odklon dobljenih MAX (max).
Primerjava med različnimi merskimi nastavitvami je potrdila, da v skladu z napovedjo
(4.20) na nedoločenost lege spektralnega vrha vpliva predvsem SNRTOT (Slika 4.7 A) [59].
Ujemanje s teorijo je še posebno prepričljivo pri meritvah z visokim SNR, kjer je
prispevek bralnega šuma zares zanemarljiv – pri modelu v predstavitvi smo namreč
predpostavili Poissonov šum in en prilagojen parameter. Čeprav smo v resnici iz podatkov
izluščili po dva parametra (I0 in MAX), je tudi iz rezultatov očitno, da deluje analitični
izračun I0 (4.14) kot točna umeritev signala in ne vpliva na natančnost določanja MAX.
Dognanje smo nadalje potrdili, ko smo med obdelavo prilagajali tudi w; v tem primeru smo
opazili očitno ujemanje z napovedjo za dvoparametrično optimizacijo (Slika 4.7 B).
Dobljeni rezultati potrjujejo, da lahko v prejšnjem razdelku izpeljano oceno kljub
določenim poenostavitvam in približkom uspešno uporabimo pri meritvah FMS. S tem
smo se prepričali, da lahko pri poskusih dosežemo nanometrsko natančnost določanja MAX,
kar obljublja mnoge nove možnosti uporabe označevalcev s šibkejšim okoljskim odzivom.
54
Slika 4.7 Primerjava nedoločenosti lege spektralnega vrha (max) pri obdelavi meritev FMS
raztopine barvila NBD v DMSO, ki smo jih posneli z različnimi koraki vzorčenja valovnih
dolžin (, barvna legenda) in obdelali s prilagajanjem (A) enega (MAX) ali (B) dveh
spektralnih parametrov (MAX in w). Sivi krivulji predstavljata teoretični napovedi po
enačbi (4.20), pri izračunu katerih smo uporabil enake ostale predpostavke kot pri prejšnjem
prikazu (Slika 4.6 B).
55
4.4 Odpravljanje vplivov bledenja fluorescence na izmerjen spekter
V uvodu poglavja smo predstavili, da lahko bledenje fluorescence močno popači meritve
FMS, če signal pri različnih  zajemamo zaporedno (Slika 4.1 A). Podobni obliki
padajočega spektralnega repa in eksponentnega pojemanja signala zaradi bledenja
preprečujeta učinkovit razklop obeh pojavov med računalniško obdelavo, saj lahko vsak
spekter primerljivo dobro opišemo z različnimi kombinacijami MAX in b. V izogib
napačnim zaključkom pri razlagi rezultatov smo uvedli dve namenski metodi vzorčenja ,
s katerima ločeno shranimo podatek o hitrosti bledenja signala in ga nato upoštevamo pri
obdelavi spektrov: zaporedno vzorčenje z večkratnimi vmesnimi meritvami pri referenčni
 (Slika 4.1 B) [57] ter naključno vzorčenje  (Slika 4.1 C) [58]. Z računalniškim
posnemanjem meritev in z obdelavo testnih poskusov FMS smo pokazali, da ob zadostni
kakovosti signala obe metodi uspešno odpravita popačitve, obdelava naključno vzorčenih
meritev pa je učinkovita celo pri zelo nizkih SNR [59]. Z omenjenimi postopki lahko kljub
močnemu bledenju še vedno dosežemo nanometrsko natančnost MAX.
4.4.1 Računalniško posnemanje različnih načinov odpravljanja vplivov bledenja
Metodi za zmanjševanje vplivov bledenja smo najprej preizkusili na umetno ustvarjenih
spektrih, s katerimi smo posnemali rezultate meritev FMS z barvilom NBD. Zato smo
»merske točke« v razponu valovnih dolžin med 515 in 585 nm izračunali po enačbi (4.13)
s parametri I0 = 1, MAX = 535 nm, w = 78 nm in a = 0,24. Pri tem smo uporabili različne
hitrosti bledenja in velikosti korakov vzorčenja; v nadaljevanju so predstavljeni rezultati za
b = 0,02/»tEXP« in  = 3 nm. Pri osnovnem načinu so si točke pri naraščajočih  sledile
zaporedno in imele zato ustrezno postopno znižan signal. Metodi z referenčnimi meritvami
smo dodatno izračunali še šest točk signala pri 540 nm, ki so bile časovno enakomerno
razporejene med preostale merske točke; da pa bi bilo celotno število merskih točk za vse
metode enako, smo tej ustrezno podaljšali . Za posnemanje meritev z naključnim
vzorčenjem smo zaporedje točk premešali in jih temu ustrezno obremenili z bledenjem.
Vsem podatkom smo pred obdelavo prišteli naključno ustvarjen šum (Slika 4.8 A),
celoten postopek pa za dobro statistiko ponovili 104-krat. Parametroma w in a smo pripisali
njuni pravi vrednosti in ju med obdelavo nismo prilagajali, kot običajno pri FMS. Pri
zaporednem snemanju smo b ali postavili na vrednost 0 (temno modre oznake) ali pa smo
ga kljub pomanjkanju zanesljivih opornih točk poskušali določiti iz oblike spektra
(turkizne oznake). Vse dobljene parametre prilagajanja (pi) smo primerjali z njihovimi
pravimi vrednostmi (pi,0) in izračunali pripadajoče napake (pi = |pi – pi,0|, Slika 4.8 B–D).
Rezultati so potrdili nekaj pričakovanih lastnosti metod. Če pri obravnavi nismo
upoštevali bledenja, smo dosledno dobili napačne vrednosti I0 in MAX (visoki modri
stolpci). Poznavanje w in a je sicer omogočilo, da smo ob upoštevanju bledenja tudi iz
zaporedno vzorčenih podatkov v povprečju dokaj točno določili iskane parametre (turkizne
oznake), a je bil njihov raztros nesprejemljivo velik. Temu je botrovala slaba pogojenost
računskega problema, saj je moral algoritem iz padajoče oblike spektra razločiti zelo
podobna vpliva oblike spektralnega repa in eksponentnega pojemanja signala zaradi
bledenja. Raztrosi so bili pričakovano manjši v primeru metode z referenčnimi meritvami
(oranžne oznake), ki pa je pri nižjih SNR iz le šestih točk pogosto napačno ocenila b ter
56
posledično tudi I0 in MAX. Za najboljše se je izkazalo naključno vzorčenje (rdeče oznake),
pri katerem smo imeli za določevanje b na voljo vseh N točk, vpliv bledenja in osnovna
oblika spektra pa sta bila v žagastem signalu lepo razklopljena [59].
Več ponovitev omenjenega računskega poskusa pri različnih privzetih hitrostih
bledenja ter gostotah vzorčenja  so potrdile, da so zgornje ugotovitve neodvisne od b in
. Celo če smo w in a namenoma predpisali nekoliko napačne vrednosti, posnemajoč
resnične poskuse, kjer točne vrednosti pogosto niso znane, smo z obdelavo naključno
vzorčenih podatkov vseeno dobili podobno točne vrednosti MAX in b. S tem smo upravičili
uporabo oblikovnih parametrov, izluščenih iz spektrofluorimetričnih meritev, kadar je bilo
njihovo določanje iz podatkov FMS nezanesljivo, hkrati pa smo še dodatno podkrepili
izbiro zanesljivega spektralnega modela LN.
Slika 4.8 Računalniška simulacija primerjave učinkovitosti različnih načinov odpravljanja
vplivov bledenja (Slika 4.1): (A) modelnemu spektru, podobnemu spektru barvila NBD (sive
črte), smo glede na izbrani način vzorčenja  dodali vpliv sprotnega bledenja signala ter
naključni šum (barvne točke: temno modre – zaporedno vzorčenje  brez odpravljanja vplivov
bledenja (b = 0), turkizne – zaporedno vzorčenje za računsko prilagajanje hitrosti bledenja
(b > 0), oranžne – zaporedno vzorčenje z dodatnimi podatki pri referenčni , rdeče – naključno
vzorčenje ). Nato smo podatke obdelali z ustrezno metodo prilagajanja modelnih spektrov
(polne barvne črte) in odpravili vpliv bledenja (prekinjene barvne črte). Učinkovitost različnih
pristopov smo ovrednotili s primerjavo odstopanja () dobljenih spektralnih parametrov od
izvornih modelnih vrednosti pri različnih stopnjah šuma glede na signal (SNR): (B) jakosti
signala (I0), (C) lege spektralnega vrha (MAX) in (D) hitrosti bledenja (b). Barve ustrezajo
načinom vzorčenja  po barvni shemi prikaza A, višine stolpcev pa povprečja 104 ponovitev.
4.4.2 Meritve FMS z različnimi načini odpravljanja bledenja
Podobno kot v prejšnjem podpoglavju smo tudi sedaj želeli računske rezultate primerjati z
dejanskimi meritvami FMS. Ponovno smo za testni vzorec izkoristili raztopino SPP268 v
DMSO, le da smo tokrat uporabili vodni imerzijski objektiv s 60-kratno povečavo. S tem
smo povzročili opazen vpliv bledenja na spektre, ki smo jih izmerili z vpeljanima
namenskima metodama vzorčenja  pri različnih nastavitvah tEXP in . Podatke smo
57
obdelali podobno kot v razdelku 4.3.2, le da smo tokrat prilagajali tudi b, ter za vsak
poskus določili povprečno vrednost dobljenih parametrov in njihove raztrose.
Ker smo s spreminjanjem tEXP vplivali na svetlost posameznih slik, smo dobljene
jakosti signala (I0) primerjali absolutno in ne glede na referenčno vrednost. S prilagajanjem
kvadratne funkcije rezultatom I0 smo potrdili osnovno pričakovanje, da omenjeni
parameter ne glede na način zajemanja s SNR rase kvadratno (Slika 4.9 A, siva črtkana
krivulja), njegov raztros pa je približno I01/2 (Slika 4.9 B).
Ostala dva parametra (MAX in b) naj bi imela za izbran vzorec ne glede na pogoje
meritev dobro določeni vrednosti, ki pa ju za razliko od poskusov z umetno ustvarjenimi
spektri nismo poznali. Pri izračunih napak (MAX in b) smo zato za referenco vzeli
povprečja rezultatov pri visokih SNR, ki so se očitno ustalili pri določenih vrednostih.
Kot so napovedali prej opisani rezultati računskega posnemanja meritev, smo lahko
tudi s pravimi podatki FMS z obema načinoma vzorčenja  pri visokih SNR točno določili
MAX (Slika 4.9 C), medtem ko smo ob nizkem SNR pri metodi z referenčnimi meritvami
opazili dosledno odstopanje za 1–2 nm. Čeprav so bile napake b le nekoliko višje in bolj
raztresene kot pri metodi naključnega vzorčenja (Slika 4.9 E in F), so pri prvi neposredno
vplivale na napačno končno vrednost MAX. Zato je bilo nedoločenost MAX (max) s
teoretično napovedjo smiselno primerjati le za rezultate naključnega vzorčenja, ki v
celotnem raziskanem območju SNR niso kazali nikakršnih doslednih odstopanj. Ponovno
smo ugotovili, da max še vedno predvidljivo sledi SNRTOT ter da lahko MAX kljub
močnemu vplivu bledenja določimo z natančnostjo pod 1 nm (Slika 4.9 D).
Slika 4.9 Z obema načinoma vzorčenja  za odpravljanje vplivov bledenja (oranžne oznake –
zaporedno z referenčnimi meritvami, rdeče oznake – naključno vzorčenje) smo s FMS pri
različnih SNR posneli spektre raztopine označevalca SPP268 v DMSO ter primerjali dobljene
parametre in njihove raztrose: (A) absolutna jakosti signala (I0) z najboljšim prileganjem
pričakovane kvadratne odvisnosti (- -); (B) nedoločenost I0 () in kvadratni koren ugotovljene
odvisnosti I0 (- -); (C) odstopanje lege spektralnega vrha od referenčne vrednosti (MAX);
(D) nedoločenost MAX (max) in teoretična napoved po izrazu (4.20) (); (E) odstopanje
hitrosti bledenja od referenčnih vrednosti (b) in (F) njihovi raztrosi (b).
58
4.4.3 Določanje najučinkovitejšega trajanja poskusa z bledečimi vzorci
Nazadnje smo želeli določiti, koliko naj bi trajala posamezna meritev FMS v primerjavi s
hitrostjo bledenja vzorca, da bi bilo določanje parametrov MAX in b kar najnatančnejše. Pri
tem smo predpostavili, da narava poskusa ne zahteva več ponovitev meritev z istim
vzorcem in da lahko torej barvilo med snemanjem enega spektra poljubno uničimo. S
hitrim zajemom bi se izognili močnim popačitvam zaradi bledenja, a hkrati znižali SNR TOT
in s tem tudi natančnost določanja parametrov. Nasprotno bi med zelo dolgim poskusom
izgubili večino signala, tako da s dodatnim podaljševanjem meritev ne bi pridobili nobenih
uporabnih informacij.
S podobnim računalniškim posnemanjem meritev, kot smo ga uporabili v razdelku
4.4.1, smo ocenili, da dobimo najboljše rezultate pri tTOT v razponu 1–1,5 b–1 (Slika 4.10),
torej ko med vzorčenjem posameznega spektra zbledi 60–75 % signala. Rezultat je bil le
malo odvisen od izbrane jakosti signala ali . Do podobnega zaključka (84 %) so prišli
pri sorodni raziskavi, kjer so iskali optimalno trajanje poskusa za razstavljanje
spektrov [133] in predpostavili vzporedno vzorčenje  z uklonskim merilnim sistemom,
kar nakazuje na splošnost problema meritev pojemajočih signalov.
Slika 4.10 Z računalniškim posnemanjem meritev bledečih spektrov, posnetih z obema
namenskima pristopoma za odpravljanje vplivov bledenja (oranžne oznake – zaporedno
vzorčenje  z referenčnimi meritvami, rdeče oznake – naključno vzorčenje ) smo želeli
določiti najustreznejše trajanje poskusa FMS (tTOT) glede na hitrost bledenja vzorca (b).
Umetno ustvarjene spektre (Slika 4.8 A) smo obdelali z razvitim matematičnim modelom in
primerjali odstopanja () dobljenih parametrov od nastavljenih izhodiščnih vrednosti:
(A) jakosti signala (I0), (B) lege spektralnega vrha (MAX) in (C) hitrosti bledenja fluorescence
(b). Ugotovili smo, da je najustreznejše trajanje celotne meritve glede na dano hitrost bledenja
med 1 b–1 in 1,5 b–1.
59
4.5 Načini predstavitve rezultatov FMS
Za hiter in intuitiven pregled rezultatov prilagajanja spektralnih parametrov pri
posameznem poskusu FMS smo uvedli spektralno kontrastiranje slik [57]. Glede na
vrednosti izbranega spektralnega parametra (pi) ter jakosti signala (I0) na danem mestu
(x,y), smo vsaki točki slike določili barvo po barvni shemi »HSV«, ki podaja odtenek
(angl. hue, H), nasičenost (angl. saturation, S) in svetlost (angl. value, V):
  p  x, y   p
i ,MIN
H  x, y   0,8 1   i

  pi ,MAX  pi ,MIN

S  x, y   1,
V  x, y  



k1
k2

 ,


(4.21)
I 0  x, y   I MIN
.
I MAX  I MIN
V tem delu od parametrov spektralnega modela najpogosteje prikazujemo MAX in b, pri
drugih poskusih pa bi nas lahko zanimali tudi w, a, ali d1,2 (glej razdelek 4.2). Simboli z
oznakami MIN in MAX predstavljajo spodnjo in zgornjo mejo izbranega območja
vrednosti vsakega od parametrov, koeficient 0,8 iz ciklične funkcije H odbere območje
odtenkov od rdeče do vijolične barve, potenci k1,2 pa smo uvedli zgolj zaradi boljšega
barvnega kontrasta ter ju najpogosteje nastavili na vrednosti med 1,3 in 1,8.
S spektralno kontrastiranimi slikami lahko prikažemo mnogo več informacij, kot jih
lahko razberemo iz običajne mikroskopske slike, ki predstavlja krajevni razpored svetlosti
vzorca (Slika 4.11 A). V nadaljevanju se bomo pri obravnavi poskusov z okoljsko
občutljivimi barvili najpogosteje osredotočili na opazovanje lege spektralnega vrha
(Slika 4.11 B) ter hitrosti bledenja fluorescence (Slika 4.11 C).
Za preglednejše vrednotenje smo rezultate iz posameznih delov slik včasih predstavili
tudi v obliki histogramov posameznih parametrov (Slika 4.11 D in E). Pri njihovem
izračunu smo prispevke vsake točke slike obtežili z vrednostjo I0 na tistem mestu. S tem
smo zmanjšali vpliv slabo določenih vrednosti parametrov iz temnih predelov slike, kjer je
prisoten le signal ozadja.
Lahko si je predstavljati, da premikanje vzorca med zaporednim snemanjem slik pri
različnih valovnih dolžinah močno popači rezultate (Slika 4.12). Pojav je neodvisen od
načina vzorčenja. Težavo smo odpravili z uvedbo samodejnega zamikanja slik, za kar smo
uporabili obstoječe algoritme za sledenje opazovanih predmetov v orodju Mathematica. Če
je bil le signal posameznih posnetkov zadosten za računalniško prepoznavanje oblik, smo
na ta način kljub premikanju vzorca dobili ponovljive in zanesljive rezultate (Slika 4.11).
60
Slika 4.11 Primer predstavitve rezultatov obdelave meritev FMS velikanskih enoslojnih
liposomov, označenih z membranskim fluorescenčnim barvilom. (A) Običajna slika
fluorescenčne mikroskopije podaja razpored jakosti signala po opazovanem vzorcu; svetel
obroč predstavlja presek membrane liposoma z goriščno ravnino, medel signal v notranjosti pa
je posledica svetlobe barvila na površini liposoma iz izvengoriščnih ravnin. S FMS lahko iz
niza slik, posnetih pri različnih valovnih dolžinah (Slika 2.6 A), v vsaki točki analiziramo
obliko spektra in za preglednejši prikaz rezultatov ustvarimo umetno obarvane slike glede na
vrednosti prilagojenih parametrov – v tem primeru (B) lege spektralnega vrha (MAX) in
(C) hitrosti bledenja (b). Za lažje vrednotenje in primerjavo rezultatov smo se pogosto poslužili
tudi (D–F) histogramskih prikazov porazdelitev dobljenih vrednosti iskanih parametrov. Na
sliki je primer liposoma DOPC s fluorescenčnim označevalcem SPP268.
Slika 4.12 Enak prikaz rezultatov obdelave istih meritev kot zgoraj (Slika 4.11), le da slik,
posnetih pri različnih valovnih dolžinah, nismo predhodno med seboj poravnali.
(A) Premikanje vzorca med potekom meritve FMS se odrazi v (B,C) očitnih popačitvah
rezultatov in (D–F) razširjenih porazdelitvah dobljenih vrednosti parametrov.
61
4.6 Program FMSfit
Celoten postopek obdelave meritev FMS in predstavitve rezultatov smo združili v enoten
programski paket »FMSfit« (Slika 4.13), ki smo ga za potrebe tega dela razvili z orodjem
Mathematica. Izdelek trenutno omogoča

uvažanje rezultatov poskusov FMS, posnetih s poljubnim načinom zajemanja
valovnih dolžin (Slika 4.1),

izbiro območja slike za spektralno obdelavo,

izbiro območja za odštevanje signala ozadja iz grafično izbranega dela slike,

izbiro velikosti območja za lateralno povprečevanja signala,

nastavitev praga signala za odstranjevanje šuma,

prilagodljivo obdelavo spektrov z eno ali dvema spektralnima komponentama z
neodvisnimi nabori prilagajanih ali ročno nastavljenih parametrov,

poravnavanje slik v -nizu za premikajoče se vzorce,

nastavljanje kontrasta in barvnih lestvic prikaza vrednosti posameznih parametrov,

shranjevanje uporabniških nastavitev ter

shranjevanje različnih prikazov rezultatov obdelave.
Slednji obsegajo

spektralno obtežene barvne slike s prostorskim razporedom vrednosti posameznih
prilagojenih parametrov,

histograme prilagojenih parametrov,

tabelo številskih vrednosti prilagojenih parametrov ter

vzorčne spektre iz nekaj izbranih mest na sliki.
Z novimi poskusi ter predlogi in željami ostalih uporabnikov program sproti nadgrajujemo,
v trenutni obliki pa smo ga uporabili za obdelavo večine meritev raziskav biomembranskih
faz in domen, predstavljenih v sledečih poglavjih.
62
Slika 4.13 Uporabniški vmesnik tekom doktorskega dela razvitega programskega paketa
»FMSfit«, s katerim smo zaobjeli celotno obdelavo meritev FMS.
63
5 Prepoznavanje odziva biomembranskih faz s FMS
V prejšnjem poglavju predstavljena obdelava fluorescenčnih emisijskih spektrov omogoča,
da natančno in zanesljivo določimo glavne spektralne značilnosti signala tudi v primeru, ko
imamo na voljo podatke z redkim vzorčenjem valovnih dolžin ali z močnim prispevkom
šuma. Z ustreznim načinom zajemanja signala in primerno obravnavo lahko visoko
spektralno ločljivost v veliki meri obdržimo tudi pri meritvah s svetlobno občutljivimi
barvili [59], katerih jakost svetlobe med meritvijo hitro pojema. Celoten postopek meritev
in obdelave tako omogoča, da pri FMS uporabimo mnoge molekularne označevalce z
želenimi fizikalno-kemijskimi lastnostmi, ki so do sedaj veljali za premalo okoljsko
občutljive ali premalo svetlobno stabilne.
Označevalec SPP268 (Slika 2.2 D na strani 25), ki smo ga uporabili v nadaljevanju, je
bil zasnovan kot temelj za dvojne spinsko-fluorescenčne označevalce (SPP257,
Slika 2.2 E). Kot smo podrobneje predstavili v razdelku 2.1.4, njegova okoljska
občutljivost fluorescence pri razvoju ni bila na prvem mestu. Kljub vsemu se je izkazalo,
da lahko z omenjenim označevalcem tudi preko oblike fluorescenčnega spektra zanesljivo
zaznamo razlike med membranskimi fazami zaradi biokemijskih ali temperaturnih vplivov,
četudi se vrh spektra premakne le za 1–3 nm [59]. Primer SPP268 potrjuje, da smo
uporabnikom FMS močno razširili nabor razpoložljivih označevalcev, tako da se lahko pri
izbiri namesto na jakost okoljskega odziva osredotočijo predvsem na njihovo biološko oz.
biokemijsko ustreznost za načrtovan poskus. Tovrstno prilagodljivost metode smo še
dodatno potrdili z uspešnim razločevanjem membranskih faz s še enim okoljsko
občutljivim membranskim barvilom, Laurdanom [59].
Poleg visoke spektralne ločljivosti nam je razviti algoritem za odpravljanje vplivov
bledenja omogočil, da smo tudi to neljubo lastnost lahko izkoristili za prepoznavanje
značilnosti molekularne okolice označevalcev [59], podobno kot pri sicer zelo redko
uporabljanem slikanju bledenja fluorescence [115–117]. S celostnim pristopom smo tako
še razširili nabor dostopnih informacij, ki jih lahko uporabimo pri raziskovanju pestrih
bioloških sistemov, kjer je pogosto potrebno razločiti raznovrstne vplive na svetilne
lastnosti barvil.
Da metoda ohrani svojo spektralno ločljivost in s tem sposobnost razlikovanja
membranskih faz tudi pri meritvah bolj kompleksnih sistemov, smo pokazali z nekaj
poskusi z živimi celicami [59], predstavljenimi proti koncu tega poglavja. Uporabna
vrednost občutljive FMS pri biofizikalnih raziskavah se je še posebno izkazala pri
opazovanju interakcij celičnih membran z liposomi koti napredno farmacevtsko obliko
dostave zdravilne učinkovine. Spektralne informacije so nam v tem primeru omogočile
raziskati mehanizem vnosa zdravila v celico, česar ne bi mogli doseči s samo mikroskopijo
ali spektroskopijo [57].
65
5.1 Spremljanje biomembranskih faz zaradi biokemijske sestave
Biomembranska domenska struktura živih celic je predvsem posledica neenakomernega
razporejanja maščobnih in beljakovinskih gradnikov membran [3]. Le-ti v različnih
kombinacijah tvorijo sloj z različnimi lastnostmi – debelino, hitrostjo difuzije molekul,
urejenostjo lipidnih verig, globinskim profilom polarnosti [7,78,134,135] idr. Na razlikah v
slednjem temelji tudi v neposrednem nadaljevanju predstavljeno spremljanje lipidnih faz s
FMS ter fluorescenčnima barviloma NBD in Laurdan.
Za preverjanje občutljivosti označevalca SPP268 na spremembe urejenosti bioloških
membran smo izdelali velikanske enoplastne liposome iz lipidov DPPC oz. DOPC, ki
zaradi različne zgradbe in posledičnega različnega medsebojnega prileganja molekul pri
sobni temperaturi tvorita membranske dvosloje v gelski oz. tekoči neurejeni fazi [6]. Prej
omenjene razlike v globinskem profilu polarnosti [78] se pri uporabljenem barvilu NBD
odrazijo tudi v premiku izsevanega fluorescenčnega spektra [74]. Ker pa je barvilo na
nosilno molekulo vezano v polarnem delu, kjer so razlike med fazami manjše kot v
nepolarni notranjosti dvosloja [78], smo v obliki spektra pričakovali razmeroma majhne
razlike. Čeprav se je spekter med obema vzorcema premaknil le za okoli 3–4 % svoje
širine, smo lahko s FMS nezgrešljivo razločevali posamezne liposome z različno
biokemijsko sestavo njihovih membran.
5.1.1 Občutljivost označevalca SPP268 na biomembranske faze
Primerjava podatkov s spektrofluorimetra je pokazala, da se spekter označevalca SPP268 v
liposomih DOPC v primerjavi z DPPC premakne za okoli 3 nm proti višjim valovnim
dolžinam (Slika 5.1 A). Glede na znan okoljski odziv NBD [74,75] nakazuje omenjeni
spektralni premik povišano lokalno polarnost, kar je v skladu s povečano hidriranostjo
zunanjega dela membrane v tekoči neurejeni fazi [136,137]. Podobno razliko MAX smo
opazili, ko smo vzorec DPPC segreli nad temperaturo glavnega faznega prehoda 41 °C [6]
(Slika 5.1 B). S ponovnim ohlajanjem vzorca smo preverili, da je bil pojav – pričakovano –
povraten.
Da bi zanesljivo potrdili, ali smo zares opazovali fazni prehod membran in ne le
temperaturnega učinka na barvilo, smo meritve ponovili tudi z liposomi DOPC, katerih
membrane so pri temperaturah nad zmrziščem vode vedno v tekoči neurejeni fazi [6]. Pri
podobnih toplotnih spremembah kot pri meritvah z DPPC smo tokrat v skladu s
pričakovanji opazili precej manjši premik MAX (Slika 5.1 B), iz česar sklepamo, da so bile
zgoraj opisane razlike res posledica spremembe biomembranske faze, določene z
urejenostjo lipidnih repov.
Z omenjenimi poskusi smo se prepričali, da je lega spektralnega vrha zanesljiva
opazljivka za spremljanje faze liposomov s fluorescenčnim označevalcem SPP268.
Izmerjeni razliki MAX nekaj nanometrov, ki relativno predstavlja manj kot 4 % širine
spektra na njegovi polovični višini, bi morala biti FMS glede na napovedi iz prejšnjega
poglavja prepričljivo kos, kar bomo predstavili v nadaljevanju.
66
Slika 5.1 (A) Referenčne meritve spektrov raztopin z SPP268 označenih liposomov DPPC in
DOPC, posnete pri sobni temperaturi; (B) premik lege spektralnega vrha (MAX) v odvisnosti
od temperature (T). Membrane DOPC so v tem temperaturnem območju v tekoči neurejeni
fazi, DPPC pa doživijo glavni fazni prehod pri 41 °C ter »predprehod« okoli 34 °C [6].
5.1.2 Prepoznavanje faz posameznih liposomov s FMS
Pravkar opisane razlike pri spektrofluorimetričnih meritvah suspenzij liposomov DPPC in
DOPC smo želeli preveriti še s FMS na posameznih mikroskopskih maščobnih mehurčkih.
Zato smo vzorca DPPC (Slika 5.2 A) in DOPC (Slika 5.2 B) najprej opazovali ločeno. Že
prvi pogled na spektralno kontrastirane slike je razkril očiten premik spektra SPP268 v
DOPC proti višjim valovnim dolžinam, kar je v skladu s prej opisanimi rezultati. Iz
preglednega prikaza histogramov (Slika 5.2 C) smo razbrali, da je razlika MAX znašala
okoli 3 nm, tako kot pri spektrofluorimetričnih meritvah.
Naključno vzorčenje in ustrezna obdelava spektrov sta poleg določanja oblike spektra
omogočila tudi spremljanje bledenja fluorescence, kar je razkrilo očitno razliko v hitrosti
pojemanja signala (Slika 5.2 D in E). Kratek pregled literature je pokazal, da je tudi ta
sprememba pričakovana. V bolj polarnem okolju, ki ga pri DOPC nakazuje premik MAX
proti višjim valovnim dolžinam, se življenjski čas fluorescence NBD skrajša [74]. S tem se
zmanjša možnost, da bi elektron v vzbujenem elektronskem stanju kemijsko reagiral z
molekulami v okolici in izgubil sposobnost fluorescence [94], kar je osnovni mehanizem
bledenja. Le-to naj bi bilo torej v bolj polarnem okolju počasnejše, kar so res potrdile nižje
opažene vrednosti b za označevalec SPP268 v liposomih DOPC (Slika 5.2 F).
Pri omenjenih meritvah smo opazovali goste vzorce, zaradi česar je bil signal ozadja
zaradi sipane svetlobe dokaj močan. Čeprav smo ga pred obdelavo slik odšteli, bi bilo
možno, da je enotnost vzorca delno pripomogla k zanesljivejšemu določanju parametrov.
Zato smo v nadaljevanju suspenziji liposomov DPPC in DOPC zmešali, dodatno razredčili
in nato ponovno določili membranske faze posameznih maščobnih mehurčkov. Za lažje
opazovanje smo gibanje liposomov tokrat umirili s prozornim želirnim sredstvom [96].
Čeprav se NBD z lokalno polarnostjo spreminja tudi kvantni izkoristek [74] in s tem
svetlost vzorca (Slika 5.3 A), omenjene lastnosti nismo mogli izkoristiti za razločevanje
membranskih faz, ker pri uporabljeni metodi tvorbe včasih nastanejo tudi večplastni
mehurčki, zaradi neenakomerne jakosti osvetlitve po vidnem polju ter zaradi bledenja
signala pred začetkom meritve med iskanjem primernih liposomov. Zato smo se pri
razlikovanju vzorcev lahko opirali zgolj na spektralne lastnosti izmerjene svetlobe, ki jih v
vsaki točki mikroskopske slike nudi FMS.
67
Slika 5.2 Rezultati obdelave meritev FMS ločenih vzorcev z SPP268 označenih liposomov
DPPC in DOPC; (A,B) slike liposomov obeh vrst, obarvane glede na izmerjeno lego
spektralnega vrha (MAX), iz katerih smo izračunali (C) porazdelitev dobljenih vrednosti MAX;
(D–F) enaki prikazi za hitrost bledenja (b).
Zanesljivo prilagajanje modelnih spektrov je znova učinkovito odpravilo vplive
bledenja (Slika 5.3 B), kar je omogočilo nezmotljivo razločevanje prikazanih liposomov
(Slika 5.3 C) [59]. Razlika v MAX okoli 2 nm (Slika 5.3 D) je bila veliko večja od
nedoločenosti parametrov, kot jo lahko ocenimo iz histogramov, in podobna kot pri
meritvah posameznih suspenzij (Slika 5.2 C). Zatorej lahko z veliko gotovostjo trdimo, da
je pripadal manjši liposom »1« vzorcu DPPC in je bil pri pogojih meritev v gelski fazi,
medtem ko je bil mehurček »2« zgrajen iz lipidov DOPC in zato v tekoči neurejeni fazi.
Trditev smo še podkrepili z ugotovljeno razliko v hitrosti bledenja signala (Slika 5.3 E
in F) [59], ki se je povsem ujemala z zgoraj navedenimi ugotovitvami (Slika 5.2 F) –
bledenje liposoma »2« (DOPC) je bilo za okoli tretjino počasnejše kot pri »1« (DPPC). Ob
tem naj poudarimo, da absolutna primerjava vrednosti b med poskusi ni zanesljiva, saj je
hitrost bledenja odvisna od trenutne moči vzbujevalne svetlobe, ki se s časom zaradi
68
temperaturnih učinkov v žarnici nekoliko spreminja, ter od lokalnih fizikalno-kemijskih
pogojev. Med pripravo hidrogela z mešanimi liposomi smo s stresanjem v vzorcu
spremenili koncentracijo raztopljenega kisika, ki je znan pospeševalec bledenja [38,138],
kar bi lahko botrovalo skoraj dvakrat višjim izmerjenim vrednostim b v primerjavi s prej
predstavljenimi meritvami posameznih suspenzij.
Predstavljeni poskusi nedvoumno dokazujejo, da lahko s FMS prepričljivo zaznavamo
razlike v biokemijski sestavi membran, četudi lahko od uporabljenega označevalca
pričakujemo le drobne razlike v obliki spektra ali hitrosti bledenja.
Slika 5.3 (A) Fluorescenčno-mikroskopska slika mešanice liposomov DOPC in DPPC,
označenih z SPP268; barvni piki prikazujeta mesti, od koder smo z ustrezajočimi barvami
izrisali (B) s FMS posneta spektra (krožci). Ta smo nadalje obdelali s spektralnim modelom
(polni črti; žagasta oblika je posledica bledenja barvila in naključnega vzorčenja  – Slika 4.1)
in odpravili vpliv bledenja (prekinjeni črti, b = 0). Po tovrstni obdelavi spektrov po celotnem
vidnem polju smo dobljene parametre predstavili s spektralno obteženimi slikami in
histogrami: (C) barve predstavljajo izračunane lege spektralnega vrha (MAX), okvirja pa
označujeta območji, od koder smo izrisali (D) porazdelitvi MAX posameznih liposomov. S
primerjavo z meritvami ločenih vzorcev (Slika 5.2 C) smo lahko določili biokemijsko zgradbo
posameznih liposomov: »1« – DPPC, »2« – DOPC. (E,F) Podobna prikaza za hitrost bledenja
(b), ki potrjujeta razliko med mehurčkoma v različnih lipidnih fazah.
69
5.2 Spreminjanje biomembranskih faz zaradi temperaturnih vplivov
Za dodatno potrditev zanesljivosti določanja biomembranskih faz z metodo FMS smo
želeli pod mikroskopom spremljati še fazni prehod posameznega mehurčka zaradi
spreminjanja temperature. Čeravno celice tega načina po vsej verjetnosti ne uporabljajo za
vplivanje na domensko strukturo svojih membran, lahko dobro znan in enostavno
nadzorovan pojav izkoristimo za raziskovanje biofizikalnih lastnosti membranskih domen
ali preizkušanje metode.
V ta namen smo vzorec najprej segrevali z grelnim stekelcem in preko premika
fluorescenčnega spektra barvila NBD zanesljivo zaznali fazni prehod posameznih
liposomov [59]. Nato smo želeli z infrardečim žarkom optične pincete pogreti le del
membrane, a se je izkazalo, da je bila difuzija toplote v okolico očitno prehitra, zaradi
česar smo zopet vzbudili fazni prehod celotnega mehurčka. Kljub vsemu smo s
predstavljenimi meritvami potrdili, da je metoda določanja membranskih faz zanesljiva in
torej zrela za raziskovanje zahtevnejših biomembranskih sistemov.
5.2.1 Opazovanje faznega prehoda posameznih liposomov s FMS
V ta namen smo opazovalni bazenček s suspenzijo liposomov DPPC namestili na grelno
stekelce ter spreminjali temperaturo vzorca. Fazni prehod iz gelske v tekočo neurejeno
fazo smo pričakovali pri temperaturi okoli 41 °C [6]. Ker je bil vzorec na eni strani v stiku
z grelno površino, na drugi pa je objektiv preko imerzijske tekočine predstavljal učinkovit
ponor toplote, temperature v samem vzorcu pri tem poskusu nismo mogli točno določiti.
Vrednosti, navedene v nadaljevanju, tako predstavljajo naše približne ocene. Tovrstna
nenatančnost za poskus niti ni bila preveč moteča, saj nismo nameravali podrobno
raziskovati že znanega faznega prehoda, temveč nas je predvsem zanimalo, ali pojav z
razvito metodo lahko opazimo.
Ko smo vzorec DPPC z označevalcem SPP268 segreli od temperature približno 35 °C
(Slika 5.4 A) na okoli 45 °C (Slika 5.4 B), smo zaznali nezgrešljiv premik spektralnega
vrha za okoli 1,5 nm proti višjim valovnim dolžinam [59]. Opaženo je zopet skladno s prej
izmerjenimi razlikami med biomembranskimi fazami (Slika 5.2) ter z meritvami spektrov
SPP268 ob faznem prehodu suspenzije liposomov DPPC s spektrofluorimetrom
(Slika 5.1 B). Ob ponovnem ohlajanju je eden izmed opazovanih liposomov očitno prešel
fazni prehod nekoliko pred drugim (Slika 5.4 C), a je bila sprememba MAX nazadnje
povsem povratna (Slika 5.4 D), kot se za fazni prehod spodobi. Predvidene razlike ob
prehodu smo zaznali tudi v hitrosti bledenja fluorescence.
Podobno kot v prejšnjem razdelku smo tudi s FMS preverili, da je bil spektralni premik
pri podobnem segrevanju vzorca DOPC zanemarljivo majhen (Slika 5.5). S tem smo
potrdili, da je bil prej opisan temperaturni odziv označevalca v membranah DPPC res
posledica faznega prehoda membrane.
70
Slika 5.4 (A–D) Slike istih z SPP268 označenih liposomov DPPC, spektralno obtežene gleda
na izmerjeno lego spektralnega vrha (MAX), ki smo jih s FMS posneli pri različnih
temperaturah (oznake v desnem zgornjem kotu vsake slike): (A,B) med segrevanjem čez fazni
prehod membran iz gelske v tekočo neurejeno fazo (Tm = 41 °C) in (C,D) med ponovnim
ohlajanjem vzorca. Iz (E–H) histogramov vrednosti MAX, ki smo jih izračunali iz ustrezno
označenih delov slik na levi, smo ob faznem prehodu razbrali premik spektralnega vrha za
1,5 nm. Iz prikazov C in G je razvidno, da liposoma faznega prehoda nista doživela sočasno.
71
Slika 5.5 Temperaturno odvisne meritve FMS istega liposoma DOPC, označenega z SPP268;
barve na slikah predstavljajo izmerjene lege spektralnega vrha (MAX). V razponu temperatur
(oznake v zgornjem desnem kotu vsake slike), pri katerem smo opazovali fazni prehod
membran DPPC (Slika 5.4), pri DOPC po pričakovanjih nismo opazili spektralnih razlik.
5.2.2 Vzbujanje faznega prehoda z optično pinceto
V nadaljevanju smo želeli čez fazni prehod pogreti le del membrane liposoma DPPC in
tako umetno ustvariti membransko mikrodomeno. Izziva smo se lotili z optično pinceto,
katere infrardeči žarek naj bi v žarišču zaradi absorpcije svetlobe v vodi ravno prav segrel
okolico, da bi del membrane prešel iz gelske v tekočo neurejeno fazo, kar bi zaznali s
krajevno omejenim premikom spektra.
Kljub množici poskusov z liposomi različnih velikosti in lamelarnosti, različnimi
izhodiščnimi temperaturami vzorca ter jakostmi grelnega žarka smo čez fazni prehod
vedno pogreli celoten mehurček (Slika 5.6). Izkazalo se je namreč, da je difuzija toplote v
vodi na tej krajevni ravni prehitra, zaradi česar se močno segreje tudi širša okolica grla
laserskega žarka. Pojav smo preverili z meritvami posrednega merjenja toplotnega učinka
optične pincete in še dodatno potrdili z izračuni toplotne difuzije (Dodatek B). Kljub
vsemu smo še na en način dokazali, da je spremljanje faznih sprememb s FMS zelo
zanesljivo in torej pripravljeno za zahtevnejšo uporabo pri poskusih z živimi celicami.
Slika 5.6 Lega spektralnega vrha označevalca SPP268 v istem liposomu DPPC (A) pred in
(B) po vklopu gretja s tremi IR laserskimi žarki optične pincete (rdeče pike nakazujejo njihove
približne lege) skupne moči okoli 500 mW. Mehurček je spremenil obliko zaradi sil optičnih
pasti na njegove membrane.
72
5.3 Zaznavanje lastnosti pestrejših membranskih sistemov
Pri biofizikalnih raziskavah pogosto naletimo na mnogo kompleksnejše sisteme, kot so
vodne suspenzije liposomov iz preprostih lipidnih mešanic, kar zahteva visoko robustnost
uporabljenih merilnih metod. V celicah lahko k izmerjenemu svetlobnemu signalu poleg
barvila prispevajo tudi celici lastne fluorescirajoče snovi (t. i. avtofluorescenca), kar smo
se najprej naučili odpravljati z razstavljanjem spektrov na več prispevkov. Nato smo z
dodajanjem prej uporabljenih velikanskih liposomov k celicam preverili, da tudi prisotnost
celičnega medija ne vpliva bistveno na zaznavanje biomembranskih faz s FMS [59].
Končno smo metodo uporabili za raziskovanje membranskih faz pri interakciji tumorskih
celic z liposomi in razjasnili mehanizem dostave zdravilne učinkovine v celico [57]. S tem
smo podkrepili uporabni pomen visoke spektralne občutljivosti razvite metode ter
ponazorili pomembnost raziskav membranskih faz in domen.
5.3.1 Odpravljanje vpliva spektralnega ozadja
Kot smo pravkar omenili, lahko fluorescenca naravno prisotnih snovi v celici vpliva na
analizo spektrov opazovanega barvila. Pri naših poskusih je bila avtofluorescenca, ki smo
jo pomerili pred dodatkom označevalcev, v primerjavi s signalom označevalca SPP268
sicer zanemarljiva, namesto nje pa nam je včasih opazovanje otežila zunanja svetloba, ki se
je kljub skrbno zatesnjeni zgradbi optičnega sistema prebila do tipala in neenakomerno
dosvetlila vidno polje z vzorcem celic (Slika 5.7 A). Čeprav je enostavno prilagajanje
modelnih spektrov na videz znova uspešno odpravilo vplive bledenja barvila NBD in s tem
zanesljivo opisalo meritve (Slika 5.7 B, spekter »CEL«), so bili dobljeni rezultati očitno
močno popačeni, kar nakazuje enakomerno in dosledno krajevno spreminjanje prilagojenih
parametrov (Slika 5.7 C) ter njihove široke porazdelitve (Slika 5.7 D, histogram »C«).
Časovno nespremenljiv spekter zunanje svetlobe, ki smo ga izluščili iz predela slike brez
celic (Slika 5.7 B, spekter »OZ«), je ob levem robu slike navidezno premaknil spektralni
vrh označevalca proti nižjim valovnim dolžinam ter zmanjšal vpliv bledenja.
Zato smo meritve opisali z vsoto dveh spektralnih prispevkov, kot je predstavljeno v
poglavju 4.2. Prvemu prispevku smo predpisali obliko glede na značilnosti spektra ozadja
(Slika 5.7 E) ter izvzeli možnost njegovega bledenja (b = 0), medtem ko smo pri drugem
obdržali običajni prostostni stopnji MAX in b. Deleži obeh prispevkov (d1,2), kot jih je v
vsaki točki vidnega polja določil razviti postopek obdelave spektrov, so skladno s
pričakovanji potrdili neenakomerno razporeditev svetlobe ozadja (Slika 5.7 F). V nasprotju
z rezultati preproste obdelave so bile spektralne lastnosti opazovanega barvila zdaj zaradi
ustrezno določenega deleža njegovega prispevka (Slika 5.7 H) pričakovano enakomerne
(Slika 5.7 G), njihove porazdelitve pa občutno ožje (Slika 5.7 D, histogram »G«).
Opisan način obdelave podatkov FMS sledi metodi za razstavljanje spektrov na
posamezne prispevke (t. i. linear oz. spectral unmixing) [103–106], ki smo ji dodali visoko
spektralno občutljivost in učinkovito popravljanje učinkov bledenja signala. Razvita
metoda torej tudi v zelo zahtevnih primerih omogoča zanesljivo ovrednotenje lastnosti
izmerjene fluorescenčne svetlobe, kar ji močno razširja možnosti uporabe v pestrih
bioloških okoljih.
73
Slika 5.7 (A) Fluorescenčna slika celic, označenih z SPP268; piki označujeta mesti, od koder
smo izrisali (B) s FMS izmerjena spektra ozadja (vijolični krožci, OZ) in celic (modri krožci,
CEL). Slednjega smo lahko opisali z eno spektralno komponento (polna črta) ali ga sestavili iz
ustrezno obteženih (d1,2) prispevkov ozadja in barvila (pikčasti črti). (C) Pri enokomponentni
obdelavi so bili rezultati MAX zaradi signala ozadja očitno popačeni in posledično
(D) porazdelitve parametrov široke (histogram »C«), z dvokomponentnim prilagajanjem pa
smo izločili ozadje in za SPP268 dobili veliko natančnejšo oceno MAX (histogram »G«). Pri
tem načinu smo (E) obliko prvega prispevka povzeli po ozadju, razviti računalniški postopek
obdelave pa je v vsaki točki poiskal (F) njegov delež (d1) ter (G) lego vrha spektra SPP268,
(H) njegov relativni prispevek (d2) ter hitrost bledenja (ni prikazana).
74
Slika 5.8 (A) Fluorescenčno-mikroskopska slika mešanice celic (CEL) ter eno- in večplastnih
liposomov DOPC (LIP); vse membrane so označene z SPP268. Barvni piki označujeta mesti,
od koder smo izrisali (B) s FMS posneta spektra (krožci ustrezajočih barv), vpliv bledenja na
katere smo popravili (prekinjeni črti, b = 0) s prilagajanjem modela bledečih spektrov (polni
črti). (C) Rezultate obdelave spektrov celega vidnega polja smo predstavili s krajevnim
razporedom lege spektralnega vrha (MAX); okvirja označujeta območji za (D) primerjavo
porazdelitev dobljenih vrednosti MAX obeh delov vzorca.
5.3.2 Razločevanje membranskih lastnosti liposomov in celic
Na lastnosti fluorescenčne svetlobe organskih barvil lahko vpliva mnogo lastnosti njihove
neposredne okolice – poleg že večkrat omenjene polarnosti denimo tudi pH, membranski
potencial, prisotnost določenih kemijskih spojin v celicah ali okoliškem mediju, gručenje
označevalcev itd. [64]. Vsi našteti pojavi bi lahko zmanjšali zanesljivost razvite metode ali
celo močno omejili možnosti njene uporabe, zato smo želeli preveriti njeno robustnost in
zanesljivost tudi z zahtevnejšim preizkusom.
V ta namen smo eno- in večlamelarne liposome DOPC zamešali v gojišče s kulturo
celic (Slika 5.8 A), vse membrane fluorescenčno označili z molekulami SPP268, z
naključnim vzorčenjem  posneli izsevano svetlobo (Slika 5.8 B) in po popravku bledenja
primerjali lastnosti njihovih spektrov. S pomočjo preglednih barvnih prikazov (Slika 5.8 C)
in histogramov dobljenih vrednosti MAX (Slika 5.8 D) smo potrdili, da se lega
spektralnega vrha barvila v liposomih kljub prisotnosti celičnega medija natančno ujema s
prejšnjimi meritvami modelnega vzorca (Slika 5.2) [59]. S tem smo utrdili zaupanje v
ponovljivost rezultatov in dokazali robustnost svoje metode. Hkrati smo pokazali, da je
majhen relativni premik spektra označevalcev v membranah celic glede na SPP268 v
liposomih zares verodostojen. Opažena spektralna razlika je najverjetneje posledica nižje
lokalne polarnosti s holesterolom bogatih celičnih membran [78], kar je omogočilo
natančno spremljanje pomembnih membranskih procesov, predstavljenih v nadaljevanju.
75
5.3.3 Spremljanje interakcij med liposomi in celicami
Kot smo napovedali v uvodu poglavja, smo s FMS raziskovali tudi mehanizem dostave
zdravilnih učinkovin v celice s pomočjo lipidnih nanodelcev – liposomov velikosti okoli
100 nm. Njihove membrane so vsebovale lipofilne molekule OPP (Slika 3.1 E) s
protitumorskim delovanjem, od koncentracij drugih sestavin membrane pa je bilo odvisno,
ali liposomi učinkovino dostavijo v celico [139]. Učinek smo sicer lahko spremljali že s
samo fluorescenčno mikroskopijo (Slika 5.9 A), nismo mogli pa ločiti različnih možnih
načinov dostave zdravila – ali gre za internalizacijo liposomov z endocitozo, zlivanje
membran ali prerazporeditev molekul čez vodno fazo. Za natančen opis dogajanja ob stiku
s celicami smo potrebovali mikrospektroskopsko metodo, kakršna je FMS.
Pri tem poskusu smo zaradi želene višje okoljske občutljivosti namesto SPP268
uporabili označevalec C6-NBD-PC (Slika 2.2 C), ki smo ga vgradili v membrane
liposomov. Slednje smo dodali fluorescenčno neoznačeni celični kulturi in spremljali
interakcijo njihovih membran (Slika 5.9 A). Ob prehodu označevalcev iz membran
liposomov, prisotnih vsepovsod po vidnem polju, v celične membrane smo zaznali premik
spektralnega vrha za okoli 1 nm proti nižjim valovnim dolžinam (Slika 5.9 B in C) [57], ki
ustreza višji vsebnosti holesterola v celičnih membranah v primerjavi z liposomi in
posledični nižji polarnosti [74,78].
Če bi liposomi v notranjost prešli z endocitozo, bi v začetku opazili nehomogeno
razporeditev jakosti fluorescence, spekter barvila pa bi vsaj nekaj časa ostal nespremenjen.
Učinkovitost procesa tudi ne bi smela biti odvisna od sestave liposomov [139]. Ker lipidni
označevalec med membranami ne more prehajati preko vodne faze, rezultati nakazujejo, da
je ob stiku najverjetneje prišlo do zlivanja liposomov z membranami celic [57], česar s
samo mikroskopijo ne bi mogli dognati. S tem poskusom smo še enkrat podkrepili potrebo
po občutljivem spektralnem zaznavanju, razvitem tekom pričujočega doktorskega dela.
Orodje lahko zdaj uporabimo za mnoge raziskave bioloških membran, vključno z
razkrivanjem še neznanih lastnosti celičnih membranskih domen in splavov.
Slika 5.9 (A) Fluorescenčna slika celice raka dojke (MCF-7; svetla oblika na desni strani slike,
temna lisa predstavlja njeno jedro), obdane z raztopino liposomov velikosti 100 nm (meglena
okolica). Membrane slednjih vsebujejo protitumorsko učinkovino OPP in okoljsko občutljive
označevalce C6-NBD-PC, ki so ob stiku iz liposomov prešli v sprva neoznačene celične
membrane. (B) Razpored lege spektralnega vrha (MAX), ki smo ga dobili iz meritev FMS, ter
(C) iz uokvirjenih območij sestavljene porazdelitve nakazujejo, da se ob prehodu spekter v
povprečju premakne za 1 nm proti nižjim valovnim dolžinam.
76
5.4 Uporabnost FMS za raziskovanje membranskih faz in domen
S predstavljenimi rezultati smo pokazali, da lahko s FMS in prilagajanjem modelnih
spektrov ob upoštevanju popravkov bledenja fluorescence zanesljivo spremljamo lastnosti
biomembranskih faz tako na modelnih kot živih membranskih sistemih. Ker pa smo doslej
vse meritve opravljali z označevalci, ki temeljijo na sicer pogosto uporabljenem barvilu
NBD, smo pred koncem poglavja za nedvoumno ponazoritev širše uporabnosti razvite
metode uporabili še eno uveljavljeno tržno dostopno okoljsko občutljivo barvilo – Laurdan
(Slika 2.2 F na strani 25) [79].
Slednje predvsem zaradi svojega močnega odziva na lokalno polarnost med
raziskovalci velja za enega najuporabnejših membranskih označevalcev [64]. Njegov
spekter se med gelsko in tekočo neurejeno lipidno fazo, ki smo ju primerjali v tem
poglavju, premakne za okoli 50 nm [79], kar je zelo enostavno ločiti tudi s
širokopasovnimi izsevnimi filtri. S tem pristopom pa ne moremo ločiti membran v gelski
in tekoči urejeni fazi, med katerima naj bi se vrh premaknil za okoli 3 nm [79], kar več kot
očitno potrebuje visoko spektralno ločljivost FMS. Podobno kot pri NBD tudi fluorescenca
barvila Laurdan pod vplivom svetlobe hitro bledi [140], kar je doslej očitno zadrževalo
njegovo širšo izrabo s FMS.
Kot modelni sistem omenjenih dveh faz smo zato pripravili liposome iz lipidov DPPC
ter DPPC z dodatkom holesterola (40 %). Rezultati referenčnih spektrofluorimetričnih
meritev celotnih suspenzij liposomov (Slika 5.10 A) se ujemajo z zgoraj navedenimi
pričakovanji [79]. Poleg premika spektralnega vrha se signalu med fazama očitno spremeni
tudi oblika, zaradi česar smo morali pri obdelavi meritev FMS prilagajati tudi asimetrijo
spektrov (a), kar pa ni zmanjšalo zanesljivosti odpravljanja vplivov bledenja (Slika 5.10 B)
ali spektralne ločljivosti. Slednja je tako zopet omogočila, da smo med posameznimi
liposomi različnih lipidnih faz izmerili nedvoumne razlike v oblikah izsevanih spektrov
barvila Laurdan (Slika 5.10 C–F) [59], ki so bile skladne s prej navedenimi lastnimi in
tujimi opazovanji.
S tem smo potrdili, da razvita metoda FMS z odpravljanjem vplivov bledenja zares
omogoča uporabo mnogih okoljsko občutljivih barvil z izbranimi biokemijskimi
lastnostmi, saj lahko z ustreznim zajemom signala in napredno obdelavo nadoknadimo
morebitne njihove fluorescenčne pomanjkljivosti, npr. šibek okoljski odziv ali svetlobno
neobstojnost. Za razklopitev različnih vplivov je zelo pomembno, da lahko s FMS iz
posnetih spektrov izluščimo precej neodvisnih podatkov o spektralni obliki ter hitrosti
bledenja.
Za še podrobnejšo analizo kompleksnih vzorcev bomo v prihodnosti FMS nadgradili s
sposobnostjo meritev dodatnih lastnosti fluorescenčne svetlobe, npr. življenjskega časa,
anizotropije, resonančnega prenosa energije idr. Hkrati poteka tudi sklopitev z metodami,
ki za opisovanje lastnosti membran ne uporabljajo zunanjih označevalnih molekul,
npr. Raman [56]. Tovrstne ideje seveda že močno presegajo okvir pričujočega
doktorskega dela, kjer smo se osredotočili predvsem na razvoj izvedbe in obdelave meritev
FMS.
Ob zaključku poglavja naj le še bežno omenimo, da smo podobne poskuse, kot so
predstavljeni v tem poglavju, izvedli tudi s dvojnim spinsko-fluorescenčnim označevalcem
77
SPP257 (Slika 2.2 E) [53] in opazili povsem enak spektralni odziv na membranske faze kot
z SPP268. Dodatna kemijska skupina z nesparjenim spinom torej ni občutno spremenila
obnašanja molekule v membranskem okolju ali kakorkoli vplivala na okoljsko občutljivost
fluorescenčnega barvila. Ugotovitev obljublja visoko uporabno vrednost tovrstnih
označevalcev pri nadaljnjih raziskavah zapletene zgradbe bioloških membran, ki za dovolj
natančen in nedvoumen opis zahtevajo domiselne kombinacije različnih metod.
V tem duhu bomo nadaljevali tudi prihodnje poglavje, v katerem bomo predstavili
zanimiv pristop za določanje soobstoja različnih konformacij označevalnih molekul na
območju pod krajevno ločljivostjo mikroskopije kjer smo poleg spektralne odvisnosti
izsevane svetlobe fluorescenčnih barvil izkoristili tudi podatke o njeni polarizaciji [58].
Slika 5.10 (A) Spektrofluorimetrične meritve označevalca Laurdan v liposomih DPPC in
DPPC + 40 % hol, ki se pri sobni temperaturi nahajajo v gelski oz. tekoči urejeni lipidni fazi,
zaradi česar se vrh spektra premakne za okoli 3 nm. (B) S FMS posnetima spektroma obeh
vzorcev (krožci) smo prilagodili modelni funkciji (polni črti) in rekonstruirali nezbledeli obliki
spektrov (prekinjeni črti, b = 0). Podatke smo razbrali iz rdeče označenih mest na (C,E) slikah
značilnih liposomov obeh biokemijskih sestav, obarvanih glede na določeno lego spektralnega
vrha (MAX). (D,F) Porazdelitvi vrednosti MAX s slik na levi, iz katerih lahko ocenimo premik
spektra barvila Laurdan med posameznimi liposomi v različnih lipidnih fazah za okoli 2–3 nm.
78
6 Prepoznavanje soobstoječih konformacij označevalcev
S pravkar opisanimi poskusi FMS smo pokazali, da lahko tudi z barvili s šibkim okoljskim
odzivom zanesljivo razlikujemo membranske faze posameznih liposomov. A izziv
današnjih metod za raziskovanje zgradbe bioloških membran sega še dlje – opisati lastnosti
membran na ravni velikosti domnevnih nanodomen oz. lipidnih splavov, torej pod
krajevno ločljivostjo običajnih svetlobnih mikroskopov. Domet običajne fluorescenčne
mikroskopije omejuje uklon svetlobe, saj lahko z opazovanjem porazdeljevanja
označevalnih molekul raziskujemo le zgradbo membran z značilnimi velikostmi nad
polovico valovne dolžine uporabljene svetlobe [16,17], kar za vidni del spektra znaša okoli
200–300 nm. Napredek v razumevanju manjših sestavnih delov membrane lahko zato
pričakujemo od novih super-ločljivih optičnih metod [29], ki že danes pomikajo mejo
krajevne ločljivosti proti 10 nm, ali od tehnik spektroskopskega slikanja [38], s katerimi
lahko iz izmerjenega skupnega signala v vsaki točki običajne mikroskopske slike izluščimo
prispevke nanometrskih skupkov molekul oz. posameznih molekularnih konformacij.
Pri razvoju metode, s katero bi se lahko dokopali do podatkov o molekularnih stanjih še
razmeroma neraziskanih membranskih nanodomen, smo se oprli na posebnosti poročanja
dveh zelo pogosto uporabljenih okoljsko občutljivih označevalcev. V poplavi možnosti, ki
jih v zadnjem času odpirajo napredki organske kemije, namreč vse prehitro pozabimo, da
označevalci v membrani (ali na proteinu ali DNK) niso naravno prisotne molekule z dobro
določeno vlogo v celotnem sistemu, temveč se morajo danemu okolju prilagoditi. Pri tem
so izpostavljeni mnogim medsebojnim vplivom z okoliškimi molekularnimi skupinami,
zaradi česar lahko med minimizacijo svoje lastne proste energije v sistemu zavzamejo
mnogotera ali nepričakovana mesta, konformacije in vezavna stanja [77,141–143].
V izogib napačnim razlagam dobljenih meritev je zato koristno čim podrobneje poznati
obnašanje izbranih označevalcev. Za alkilne verige fosfolipidnih označevalcev, na katere je
pripet NBD (NBD-PC), so denimo že večkrat pokazali, da se v membrani upognejo in
omogočijo stik polarne molekularne skupine barvila s polarnim zunanjim predelom prereza
membrane [144–148]. Poleg tega so opazili nekatere dvojne lastnosti, ki so jih pripisali
soobstoju molekul z repi v iztegnjenem in upognjenem stanju [142], kar bi lahko bilo
odvisno tudi od lastnosti okoliške membrane [143].
Opisane nejasnosti smo se odločili raziskati tudi s FMS, zato smo dva predstavnika
omenjene družine označevalcev vgradili v velikanske enoplastne liposome treh različnih
lipidnih sestav [58]. Nanometrska natančnost določanja lege spektralnega vrha je kljub
bledenju fluorescence omogočila natančno ocenjevanje lokalne polarnosti, kot jo občuti
barvilo v različnih membranskih okoljih. Zaradi polarizirane prepustnosti LCTF smo lahko
hkrati določili tudi prevladujočo usmeritev dipolov NBD, podobno kot pri polarizacijski
mikroskopiji [149]. Združitev obeh pristopov, polarizirana FMS (pFMS), je razkrila
soobstoj različnih konformacij označevalnih molekul na razdalji pod krajevno ločljivostjo
79
mikroskopije, kar smo dodatno ovrednotili še s primerjavo z ustreznim računskim
modelom [58]. Meritve smo uspešno opisali s sočasno prisotnostjo dveh glavnih
konformacij označevalcev z medsebojno pravokotnima prevladujočima smerema dipolov
in nekoliko različnima lokalnima polarnostma. Ugotovili smo, da so tako lastnosti
posameznih konformacij kot tudi razmerja njihove zasedenosti močno odvisni od faze
membrane in se še posebno spremenijo ob visoki koncentraciji holesterola [58].
Ker je slednje ravno predvidena lastnost skrivnostnih lipidnih splavov [3,9–12], bi
lahko soobstoj konformacij označevalcev in metodo, razvito tekom tega doktorskega dela,
v prihodnje s pridom izkoristili za raziskovanje zapletene zgradbe in delovanja membran
živih celic. Celotno zasnovo polariziranega zaznavanja in računskega opisa s soobstoječimi
konformacijami označevalcev bi lahko preprosto prenesli tudi na katerokoli drugo
fluorescenčno tehniko slikanja, ki nudi dodatne okoljsko občutljive informacije (FLIM,
FRET, FCS idr.), in s tem obogatili razumevanje zapletenih bioloških sistemov.
Slika 6.1 Shematski prikaz poteka raziskovanja soobstoječih konformacij fluorescenčnih
označevalcev NBD-PC v membranah liposomov: (A) prilagajanje enokomponentnih bledečih
spektrov (rdeča polna črta) meritvam FMS (prazni krožci), posnetih z naključnim vzorčenjem
valovnih dolžin; (B) iz spektralno obteženih slik smo odčitali spreminjanje jakosti (I0) in lege
spektralnega vrha (MAX) fluorescence po obodu liposoma () glede na prepustno smer
polarizacije LCTF (eLCTF). (C) Z modelom molekularnega gibanja, ki predpostavlja soobstoj
dveh konformacij označevalcev z smerjo dipolov (rdeče puščice) vzporedno (||) oz. pravokotno
() na normalo membrane (n), smo (D) opisali izmerjena obodna nihanja I0 in MAX. (E) Iz
dobljenih vrednosti parametrov obeh konformacij smo izračunali pričakovani spekter (polna
siva črta) kot superpozicijo obeh prispevkov (prekinjeni sivi črti) in ga primerjali z izvornim.
80
6.1 Kotna odvisnost fluorescence zaradi soobstoja stanj označevalcev
Za raziskovanje soobstoja konformacij označevalcev smo pod drobnogled vzeli dve
fosfolipidni molekuli z barvilom NBD (NBD-PC), vezanim na različno dolgi alkilni verigi
– nepolarna repa sta bila dolga 6 (C6-) oz. 12 (C12-NBD-PC) ogljikovih atomov
(Slika 2.2 B in C na strani 25). Posamič smo ju vgradili v velikanske enoplastne liposome
treh različnih lipidnih sestav – DOPC, DPPC in DPPC z dodatkom 40 % holesterola. Tako
pripravljeni vzorci pri sobni temperaturi predstavljajo tri glavne membranske faze – tekočo
neurejeno, gelsko in tekočo urejeno lipidno fazo [12,14].
Z naključnim zajemanjem signala po valovnih dolžinah in ustrezno obdelavo smo
odpravili vpliv bledenja na obliko spektra (Slika 6.1 A). Pri nekaterih vzorcih smo na
spektralno obteženih slikah opazili izrazito in dosledno spreminjanje jakosti fluorescence
in lege spektralnega vrha po obodu liposoma (Slika 6.1 B). Odvisnost dobljenih
parametrov I0 in MAX od obodnega kota  (Slika 6.1 B) smo zato analizirali v korakih po
/10 (Slika 6.1 D, polni črni krožci). Podatke I0 smo umerili na najvišjo opaženo vrednost,
saj so bile absolutne velikosti parametra neprimerljive iz istih razlogov kot pri poskusih,
predstavljenih v prejšnjem poglavju (glej četrti odstavek razdelka 5.1.2). Po potrebi smo za
zmanjševanje šuma povprečili kotne odvisnosti do šestih podobnih liposomov z istim
označevalcem v membranah iste sestave.
6.1.1 Pomen izmerjenih kotnih odvisnosti
Vzrok prej omenjenega nihanja moči signala leži v kombinaciji LCTF, ki prepušča le
vodoravno linearno polarizacijo svetlobe (Slika 6.1 B, eLCTF), in delne urejenosti smeri
dipolov barvila v membrani. LCTF namreč najmanj ovira svetlobo od dipolov, ki so v času
izseva usmerjeni vzdolž eLCTF, prispevke ostalih pa zaduši s kvadratom kosinusa vmesnega
kota [149]. Če so torej dipoli pretežno poravnani (||) s pravokotnico na ravnino membrane
(n), pričakujemo višek jakosti fluorescence na »ekvatorju« maščobnih mehurčkov
(Slika 6.1 C). Nasprotno so na sliki najsvetlejši »tečaji« liposomov, kadar se dipoli barvila
povečini uredijo v ravnini membrane, tj. pravokotno na n (). Podobno kombinacijo
pojavov, a s polariziranim osvetljevanjem namesto zaznavanja, s pridom izkoriščajo pri
polarizacijski fluorescenčni mikroskopiji [149] in izbirnim vzbujanjem fluorescence [62].
Če lahko spreminjanje jakosti fluorescence po obodu liposomov razložimo zgolj s
prevladujočo usmeritvijo dipolov v membrani, potrebujemo za opis sprememb MAX
bogatejšo porazdelitev označevalcev, ki poleg različnih leg dipolov barvila čutijo tudi
različno polarnost neposredne okolice [58]. Zaradi različnih usmeritev barvila glede na
membrano – in posledično različno učinkovitega filtriranja polarizacij z LCTF – pri
različnih  prevladuje prispevek različnih podmnožic označevalcev (Slika 6.1 C). Zaradi
različno obteženih prispevkov se zato oblika celotnega izmerjenega spektra, ki predstavlja
njihovo vsoto, spreminja vzdolž oboda.
6.1.2 Matematični model dveh soobstoječih konformacij označevalcev
Za podrobnejši opis pojava smo zasnovali računski model (Dodatek C), v katerem smo
predpostavili dve prevladujoči konformaciji označevalcev z dipoli, pretežno usmerjenimi
81
vzporedno (||) oz. pravokotno () glede na lokalno normalo membrane (Slika 6.1 C).
Omenjeni obliki predstavljata najpreprostejši nabor osnovnih konformacij za približni opis
vsake porazdelitve usmeritev, osno simetrične glede na lokalno smer n. Gibanje molekul
smo – podobno kot pri računanju spektrov EPR [46,49] – popisali z opletanjem dipolov
znotraj stožcev, ki jih ustvarja ureditveni potencial. Iz pričakovanih kotnih porazdelitev
usmeritev dipolov smo za vsako smer n glede na eLCTF () lahko določili relativni
prispevek signala vsake od konformacij označevalcev. Prispevka se po obodu spreminjata
z nasprotno fazo (Slika 6.1 D, črtkani črti na levem grafu), njuna vsota, ustrezno obtežena
z deleži molekul v vsakem od stanj (d|| in d), pa prestavlja skupno jakost signala, kot jo
izmerimo s pFMS (polna siva črta na istem prikazu).
Konformacijama smo v skladu s prejšnjim razmišljanjem pripisali tudi različni legi
spektralnega vrha (||MAX in MAX). Z upoštevanjem prej predstavljenih kotnih odvisnosti
jakosti posameznih prispevkov smo lahko izračunali tudi spreminjanje MAX vzdolž oboda
vsakega liposoma (Slika 6.1 D, desni graf).
V modelu smo uporabili jakosti ureditvenih potencialov (U), ki smo jih povzeli po
podatkih v literaturi (Dodatek C.3). Za oba označevalca v tekoči neurejeni fazi smo
uporabili vrednosti ureditvenih parametrov (SZ) na ustreznih mestih alkilnih verig s pripeto
skupino NBD, ki so jih izračunali iz simulacij MD [148]. Iz teh podatkov smo za obe
molekuli NBD-PC ocenili jakosti potencialov na podobno vrednost okoli
UDOPC = (4,0  0,5) kBT, kjer kB predstavlja Boltzmannovo konstanto in T absolutno
temperaturo.
Za molekule v membranah tekoče urejene faze nismo našli nobenih ustreznih
izmerjenih ali izračunanih rezultatov z omenjenima označevalcema. Zato smo upoštevali,
da se ureditveni parameter lipidov v membrani poveča za 30–50 % v primerjavi z
neurejeno membransko fazo [150], kar smo za svoje potrebe prevedli v
UDPPC+hol = (8  1) kBT. Isto vrednost smo uporabili tudi za gelsko lipidno fazo
(UDPPC = UDPPC+hol), saj pri tako močnih ureditvenih potencialih izbrana jakost ni imela več
prav močnega vpliva na rezultate (Slika C.2). Načeloma bi lahko vrednosti U izračunali
tudi iz kotov stožcev opletanja, ki bi jih izmerili z anizotropijo fluorescence [38].
6.1.3 Preverjanje modela s primerjavo oblik spektrov
Na koncu smo še preverili, da dobljeni parametri modela dveh soobstoječih konformacij še
vedno opisujejo izvorne podatke. V ta namen smo računsko sestavili spekter iz dveh
prispevkov z ||,MAX, ustrezno obteženih glede na jakosti signala posameznih komponent.
Slednji smo ob upoštevanju d||, izračunali v vsaki izbrani točki  (Slika 6.1 E; polna
temno siva linija predstavlja vsoto obeh delnih spektrov, izrisanih s prekinjenimi črtami).
Pri tem smo uporabili enake vrednosti parametrov w, a in b, kot smo jih nastavili oz. dobili
pri prvotnem prilagajanju z eno spektralno komponento. Končni spekter smo primerjali s
podatki meritev in z rezultati prilagajanja enokomponentnega spektralnega modela.
V nadaljevanju so prikazana dognanja o obnašanju označevalcev C6- in C12-NBD-PC
v biomembranah različnih faz, vse izpeljave in dodatne razlage pravkar orisanih postopkov
pa so podrobno predstavljene ob koncu dela (Dodatek C).
82
6.2 Ugotovljeno obnašanje označevalcev NBD-PC
Pregled spektralno obteženih slik značilnih liposomov v treh različnih lipidnih fazah in
označenih z dvema različnima fosfolipidnima označevalcema (Slika 6.2 A–F) je jasno
pokazal očitne razlike med posameznimi vzorci, kar smo seveda tudi pričakovali od
okoljsko občutljivega barvila NBD. Liposomi so se razlikovali po razporeditvi jakosti
signala, kar nakazuje na različne usmeritve dipolov v membrani, ter po barvnem vzorcu, ki
predstavlja lego spektralnega vrha [58]. Za lažjo primerjavo smo spreminjanje obeh količin
po obodu liposomov povzeli tudi z ločenima prikazoma (Slika 6.2 G in H).
Slika 6.2 (A–F) Spektralno obtežene slike značilnih liposomov iz lipidov DOPC, DPPC ali
DPPC + hol (40 %), označenih z enim od fosfolipidnih označevalcev C6- oz. C12-NBD-PC.
Barvne puščice ponazarjajo prevladujoče usmeritve dipolov barvila v membrani, njihove
svetlosti pa relativne jakosti njihovih prispevkov glede na prepustno smer polarizacije LCTF
(eLCTF). Iz povprečij rezultatov do 6 primerljivih liposomov enake sestave smo izrisali kotne
odvisnosti (G) jakosti fluorescence (I0) ter (H) lege spektralnega vrha (MAX) vzdolž oboda
liposomov (). (J) Referenčne spektrofluorimetrične meritve vseh šestih proučevanih vzorcev.
6.2.1 Usmeritev dipolov barvila NBD v membrani
Upoštevaje vodoravno prepustno smer polarizacije LCTF (Slika 6.1 B), je najvišja jakost
signala obeh označevalcev na »tečajih« liposomov DOPC in DPPC (Slika 6.2 A, B, D in E
oz. rdeča, oranžna in zeleni krivulji na prikazu G) pokazala, da leži večina dipolov barvila
približno v ravnini membrane, tj. pravokotno na lokalno normalo ravnine (Slika 6.1 C, ).
Nasprotno se je glavna os skupine NBD v vzorcih s holesterolom (Slika 6.2 C in F oz.
modri krivulji na prikazu G) pri obeh označevalcih očitno pogosteje postavila vzdolž
83
normale na ravnino membrane (||), zaradi česar so bili v teh primerih najsvetlejši predeli
okoli »ekvatorja« liposomov.
Pri dveh vzorcih – C6-NBD-PC v DPPC in C12-NBD-PC v DPPC + hol – so bila ta
nihanja komaj opazna, kar bi lahko zmotno pripisali neurejenemu gibanju označevalcev v
membrani ali urejenemu gibanju dipolov v stožcu z nagnjeno osjo simetrije glede na
normalo membrane. Pravi vzrok enakomerne svetlosti je v resnici ležal v uravnoteženih
prispevkih obeh hkrati prisotnih glavnih konformacij označevalcev (|| in ), saj smo le tako
lahko pojasnili tudi opaženo spreminjanje lege spektralnega vrha po obodu posameznih
liposomov [58], kar bomo podrobno predstavili nekoliko kasneje.
6.2.2 Spektralni odziv barvila na lipidno okolico
Primerjava dobljenih MAX (Slika 6.2 H) je pokazala, da se spekter obeh označevalcev v
gelski fazi (DPPC) v primerjavi s tekočo neurejeno (DOPC) v povprečju premakne za
okoli 4,5 nm proti nižjim valovnim dolžinam, v tekoči urejeni fazi (DPPC + hol) pa še za
dodatne 3 nm. Ugotovitve se skladajo z meritvami celotnih suspenzij liposomov
(Slika 6.2 J). S FMS smo opazili tudi dosledno razliko 1–2 nm med spektri obeh
označevalcev v istem okolju, kar se prav tako povečini ujema z referenčnimi meritvami.
S spektrofluorimetrom seveda nismo mogli zaznati prisotnosti različnih molekularnih
stanj označevalcev, ki so jih razkrile zanimive kotne odvisnosti MAX po obodu liposomov.
Kot smo podrobno opisali nekoliko prej, so se vzdolž oboda posameznih liposomov
izmenjevali prevladujoči prispevki konformacij z različnimi ravnovesnimi smermi dipolov
glede na membrano, ki so bila hkrati izpostavjena tudi različni polarnosti neposredne
okolice. Pri tem velja še enkrat poudariti, da smo za to ugotovitev potrebovali tako
polarizirano kot spektralno občutljivo zaznavanje [58], kar je neposredno omogočila
polarizacijsko odvisna prepustnost LCTF našega sistema pFMS.
6.2.3 Soobstoj konformacij molekul NBD-PC
Za natančnejše ovrednotenje hipoteze smo zgradili matematični model, v okviru katerega
smo skušali dobljene podatke opisati s soobstojem dveh glavnih konformacij označevalnih
molekul. Stanjema smo pripisali medsebojno pravokotni prevladujoči smeri dipolov
barvila, tj. vzporedno (||) in pravokotno () na normalo membrane (Slika 6.1 C), ter
nekoliko različni polarnosti molekularne okolice barvila [58]. Iz opaženih spreminjanj
jakosti signala in lege spektralnega vrha smo za vsak vzorec določili relativna deleža obeh
stanj (d||,) ter njuni značilni legi spektralnega vrha (||,MAX), kot je orisano v prejšnjem
podpoglavju in podrobno predstavljeno na koncu disertacije (Dodatek C).
Računski rezultati kotnih odvisnosti obeh opazovanih količin po obodu liposomov so
lepo opisali podatke pFMS (Slika 6.3), kar je potrdilo ustreznost uporabljenega računskega
modela. Tudi dobljeni parametri obeh konformacij (Slika 6.4) so se skladali s
pričakovanjem iz pregleda spektralno obteženih slik (Slika 6.2), da visoke koncentracije
holesterola v membrani najmočneje vplivajo na obnašanje označevalcev. V tekoči urejeni
fazi so bili namreč deleži stanja || največji, prav tako so bile največje razlike med MAX
obeh konformacij [58]. Za stanje || je bil še posebno dovzeten označevalec C6-NBD-PC,
kar kažejo dvakrat večje vrednosti d|| kot pri C12-NBD-PC (Preglednica 6.1).
84
Slika 6.3 Izmerjenim potekom vrednosti I0 in MAX okoli oboda liposomov vsakega od vzorcev
(polni krožci) smo prilagodili modelne kotne odvisnosti (polne sive krivulje), ki predstavljajo
ustrezno obtežen seštevek prispevkov konformacij || (- -) in  ().
Slika 6.4 Slikovna predstavitev rezultatov modela dveh soobstoječih konformacij za vseh šest
primerjanih vzorcev: lege mehurčkov predstavljajo dobljene vrednosti ||,MAX, njihove
ploščine pa so sorazmerne izračunanim deležem d||,.
Preglednica 6.1 Številske vrednosti (in nedoločenosti) izračunanih parametrov modela dveh
soobstoječih konformacij za vseh šest vzorcev; podrobnejša razlaga se nahaja v besedilu.
lipid
DOPC
DPPC
označevalec
6-NBD-PC
||MAX
d||
MAX
MAX
[]
[nm]
[]
[nm]
[nm]
U
[kBT]
0,18 (0,04) 535,4 (+0,5, –1)
0,82 (0,04)
537,6 (0,3)
2,2 (+1, –0,5)
4 (0,5)
12-NBD-PC
0,08 (0,04) 537
(+1, –3)
0,92 (0,04)
538,7 (0,3)
1,5 (+3, –1)
4 (0,5)
6-NBD-PC
0,25 (0,02) 531
(1,5)
0,75 (0,02)
533,5 (1)
2,5 (1,5)
8 (1)
0,15 (0,02) 532,5 (1)
0,85 (0,02)
534,9 (0,7)
2,4 (+1, –0,7)
8 (1)
6-NBD-PC
0,63 (0,07) 528,0 (0,8)
0,37 (0,07)
532,5 (1,5)
4,5 (1)
8 (1)
12-NBD-PC
0,33 (0,03) 527,9 (0,8)
0,67 (0,03)
533,5 (0,7)
5,6 (0,7)
8 (1)
12-NBD-PC
DPPC+hol
d||
85
6.2.4 Oblike modelnih spektrov
Čeravno so bili dobljeni rezultati matematičnega modela zelo smiselni in pričakovani, smo
njihovo zanesljivost vseeno preverili še z enim korakom. S parametri d||, in ||,MAX smo iz
dveh prispevkov sestavili pričakovane fluorescenčne spektre in jih primerjali z izvornimi
meritvami ter rezultati prvotnega prilagajanja spektrov. Izkazalo se je, da so bili eno- in
dvokomponentni modelni spektri tako rekoč neločljivi (Slika 6.5) [58], kar je razumljiva
posledica zelo majhnega zamika med posameznimi spektralnimi prispevki || in  (MAX
okoli 2–6 nm) v primerjavi s širino celotnega signala NBD (w okoli 78 nm). Iz povedanega
lahko torej zaključimo, da sta oba opisa izmerjenih spektrov popolnoma primerljivo
zanesljiva. Pri tem je pomembno opomniti, da smo dve spektralni komponenti uvedli za
smiselno razlago spreminjanja MAX okoli oboda liposomov, ne za zadovoljiv opis
posameznega spektra, za kar je zadostovala že ena spektralna komponenta.
Ker sta bila oba delna spektra posameznih konformacij označevalcev neločljivo zlita v
enotno obliko izmerjenega signala, nismo mogli njunih prispevkov zanesljivo določiti že
takoj v prvem koraku z dvokomponentnim prilagajanjem spektralnih oblik, kot nam je to
uspelo v razdelku 5.3.1. Če pa smo naknadno programu podali tudi obe vrednosti ||,MAX,
dobljeni iz računskega modela, smo za delne jakosti signala dobili povsem primerljivo
spreminjanje kot z modelom dveh konformacij. V okviru tega doktorskega dela razvit
postopek prilagajanja spektrov torej deluje tudi za razstavljanje spektrov na
komponente [103–106] s hkratnim odpravljanjem vpliva bledenja.
Slika 6.5 Primerjava spektrov, dobljenih z enokomponentnim prilagajanjem (rdeče črte) ter z
modelom dveh konformacij (polne sive črte), ki so izračunani kot superpozicija posameznih
prispevkov (prekinjene črte). Žagasta oblika je posledica naključnega zajemanja valovnih
dolžin med bledenjem signala, ki pa jo lahko odpravimo z uporabljenim spektralnim modelom
(svetli krivulji, b = 0). Podatke FMS (krožci) smo izbrali iz s številkami označenih delov
spektralno obtežene slike liposoma DPPC + hol z označevalcem C12-NBD-PC (zgoraj desno).
86
6.3 Primerjava z doslej znanimi značilnostmi označevalcev NBD-PC
Pravkar opisane ugotovitve smo želeli vzporediti s preteklimi dognanji o obnašanju
uporabljenih označevalcev v različnih membranskih okoljih. Izkazalo se je, da znano
upogibanje alkilnih repov z vezanim barvilom NBD [144–147] lepo razloži opažene
vrednosti MAX. Naše meritve nadalje predstavljajo prvi neposredno izmerjen dokaz o
različnih hkrati prisotnih usmeritvah dipolov v membrani [58], ki so jih do zdaj opazili le z
računalniškimi simulacijami MD [148]. Z opaženim soobstojem dveh glavnih konformacij
označevalcev smo lahko prepričljivo pojasnili nekatera dvojna vedenja, ki so jih zabeležile
tudi nekatere druge merilne metode [142,143,147]. Z gostoto molekul in togostjo okoliške
membrane pa smo lahko razložili tudi razlike v obnašanju med obema označevalcema in
med različnimi membranskimi fazami [58].
6.3.1 Upognjena konformacija alkilnih verig NBD-PC
Najprej smo izmerjene vrednosti MAX primerjali z znanim okoljskim odzivom
NBD [74,75] in ugotovili, da nakazujejo razmeroma visoko polarnost neposredne okolice
barvila. Položajem spektralnega vrha okoli 537–538 nm za tekočo neurejeno fazo vzorca
DOPC (Slika 6.2 H) po umeritvi obnašanja NBD v različno polarnih topilih namreč ustreza
okolje z vrednostjo dielektrične konstante () med 30 in 40 (Slika 6.6 A) [58]. Te vrednosti
v membrani navadno najdemo na meji med nepolarnim in polarnim delom prereza
dvosloja [151], kar približno ustreza višini pritrdišča alkilnih repov na glave lipidov
(Slika 3.1).
Ugotovitev je povsem v skladu z znanim vedenjem molekul NBD-PC. Precej
neodvisnih raziskav z različnimi fluorescenčnimi metodami [144–147], NMR [146] in
simulacijami MD [148] je namreč enoznačno pokazalo, da se alkilni repi označevalcev, na
katerih je pripeta molekularna skupina NBD, v membranah tekoče neurejene faze upognejo
in omogočijo stik razmeroma polarnega barvila s polarnim predelom dvosloja. Skupina
NBD se tako navadno nahaja približno na višini glicerolnih skupin okoliških lipidov
(Slika 6.1 C) [145–148] in ne v osrednjem delu membrane, kot bi sprva pričakovali iz
kemijske strukture (Slika 2.2 B in C) brez upoštevanja posebnega obnašanja molekule
zaradi dodanega barvila. Glede na opisano so zgoraj podane vrednosti lege spektralnega
vrha povsem smiselne, saj bi v osrednjem nepolarnem predelu membrane z  okoli 2 [151]
pričakovali ustrezno nižje vrednosti MAX (Slika 6.6 A) [74,75].
Za dodatno potrditev zanesljivosti MAX kot mere za polarnost neposredne okolice smo
še nekoliko natančneje proučili zbrano literaturo. Za označevalec C12-NBD-PC v
membranah iz lipidov jajčnega rumenjaka, ki se – podobno kot DOPC – pri sobni
temperaturi nahajajo v tekoči neurejeni fazi, so izmerili MAX okoli 541 nm [145]. Po
modelu globinskega poteka polarnosti v membrani iste sestave (Slika 6.6 B) [145,151,152]
to ustreza legi barvila NBD pri z = 1,98 ± 0,05 nm, merjeno od sredine maščobnega
dvosloja proti površju (Slika 6.6 C) [58]. Dobljena vrednost se povsem ujema z globino
1,98 nm, ki so jo za isti označevalec v membranah iz istih lipidov po podobnem postopku
izračunali iz izmerjenih hitrosti nesevalnih prehodov iz vzbujenega elektronskega
stanja [145].
87
Slika 6.6 (A) Spreminjanje lege spektralnega vrha (MAX) barvila NBD glede na polarnost
okolice (); podatke smo povzeli po literaturi [74,75]. (B) Model profila polarnosti po globini
membrane (z, merjeno od sredine dvosloja navzven) v tekoči neurejeni fazi [145,151,152].
(C) Predvidena odvisnost MAX od lege NBD v membrani.
Ko smo se tako prepričali, da lahko z MAX zanesljivo ocenimo vedenje označevalcev v
tekoči neurejeni fazi, smo želeli ovrednotiti tudi opaženo spektralno razliko med obema
označevalcema. Spekter molekule z NBD na daljši verigi (C12-NBD-PC) je bil namreč
dosledno zamaknjen za okoli 1,5 nm proti daljšim valovnim dolžinam v primerjavi s
sorodnim označevalcem C6-NBD-PC (Slika 6.2 H). Opažena spektralna razlika po
modelu, ki smo ga uporabili zgoraj za membrane podobne zgradbe, ustreza premiku
barvila na C12-NBD-PC za okoli 0,27 ± 0,03 nm proti zunanjosti membrane [58], kar
približno ustreza razdalji dveh vezi C–C. Glede na večjo prilagodljivost daljšega repa je
rezultat pričakovan. Nekoliko plitkejšo lego barvila na C12- v primerjavi s C6-NBD-PC so
pokazale tudi meritve NMR in dušenja fluorescence z vodotopnim sredstvom [146] kot
tudi simulacije MD [148]. Nasprotno pa razlike v globini skupine NBD med sorodnima
molekulama niso zaznali pri poskusih dušenja fluorescence s fosfolipidnimi spinskimi
označevalci in paralaktično metodo določevanja lege barvila [144,147]. Neskladje je po
vsej verjetnosti posledica zelo široke porazdelitve nitroksidne spinske skupine po globini,
ki lahko obsega celoten lipidni enosloj [153], zaradi česar s to metodo tako majhne razlike
v legi barvila NBD niso mogli zanesljivo izmeriti.
6.3.2 Dodatni dokazi za soobstoj dveh molekularnih konformacij NBD-PC
Prej omenjena raziskava MD je poleg razlike v globini barvila NBD razkrila nekaj še
pomembnejših razlik med obema označevalcema v membranah tekoče neurejene faze.
Barvilo molekule C12-NBD-PC večinoma leži plosko v ravnini membrane, torej so
njegovi dipoli pretežno pravokotni na normalo ravnine (). Nasprotno pa le-ti v primeru
C6-NBD-PC zaradi »preskokov med konformacijami molekule« precej časa preživijo tudi
poravnani z normalo na ravnino membrane (||), pri čemer proti površju izpostavijo zgolj
88
ozko stranico aromatskih obročev [148]. Posledično skupina NBD na označevalcu
C6-NBD-PC redkeje tvori vodikove vezi z molekulami vode kot pri C12-NBD-PC [148].
Naštete ugotovitve neposredno podpirajo izbiro našega matematičnega modela dveh
konformacij označevalcev ter njegove rezultate, po katerih je stanje || za C6-NBD-PC
precej verjetnejše kot za C12-NBD-PC (Slika 6.4) [58]. Nižje vrednosti ||MAX v primerjavi
z MAX [58], ki nakazujejo nižjo polarnost okolice [74,75], so prav tako v skladu z
redkejšimi stiki barvila z vodo pri konformaciji || v primerjavi s  [148]. Njihovi izsledki
obenem lepo pojasnijo tudi prej opisano večjo dovzetnost C12-NBD-PC na vpliv
vodotopnega dušilca fluorescence [146].
Dve konformaciji proučevanih označevalcev, ki sta izpostavljeni nekoliko različni
polarnosti okolice, bi lahko razložili tudi dvokomponentno pojemanje fluorescence v
membranah DOPC [147]. Deleži prispevkov s počasnejšim oz. hitrejšim pojemanjem, ki
ustrezajo okoljem z nižjo oz. višjo polarnostjo, so namreč primerljivi s d||, naših rezultatov
pFMS [58]. Poleg tega smo za označevalec z daljšim povprečnim življenjskim časom
fluorescence, tj. C6-NBD-PC [147], opazili tudi počasnejše bledenje signala [58], kar se
ujema z znano povezavo med življenjskim časom fluorescence in hitrostjo pojemanja
signala [94]. Teh rezultatov sicer nismo prikazovali, saj zaradi razmeroma šibkega
bledenja parameter b ni bil dovolj natančno določen za podrobnejšo primerjavo.
6.3.3 Občutljivost molekularnih konformacij NBD-PC na faze lipidnih membran
Kolikor nam je znano, je bilo do danes opravljenih zelo malo načrtnih raziskav obnašanja
označevalcev NBD-PC v gelski membranski fazi [142,143], medtem ko za s holesterolom
bogato tekočo urejeno fazo nismo našli prav nobenih objavljenih rezultatov. Pri razlagi
svojih dognanj smo si zato pomagali tudi z drugimi sorodnimi meritvami.
Dobljene vrednosti MAX v različnih membranskih okoljih kažejo, da se polarnost
okolice, ki jo čuti NBD, znižuje v vrstnem redu DOPC > DPPC > DPPC + 40 % hol
(Slika 6.4) [58]. Pravilo velja za oba označevalca in za katerokoli od njunih konformacij.
Rezultati se ujemajo z izsledki spektrofluorimetričnih raziskav s fluorescenčnim barvilom
Laurdan [154] ter z jakostmi medsebojnih vplivov med karbonilnimi skupinami (C=O)
lipidov in molekulami vode, izmerjenimi z IR spektroskopijo pod popolnim odbojem s
Fourjerjevo transformacijo (angl. attenuated total reflectance Fourier-transformed
infrared spectroscopy, ATR-FTIR) [136,137]. Obe metodi zaznavata polarnost okolice na
meji med polarnim in nepolarnim delom prereza membrane, torej na podobni globini kot
oba označevalca NBD-PC z barvilom na upognjeni alkilni verigi.
Nekoliko begajoča bi lahko bila primerjava z globinskimi poteki polarnosti, kot so jih
izmerili z različnimi spinskimi označevalci. Spektri EPR so namreč za membrane v tekoči
urejeni fazi (DPPC + hol) v zunanjem delu dvosloja, tj. od polarnih glav lipidov do 7. ali
celo 9. C-atoma alkilnih verig, nakazovali višjo polarnost kot v tekoči neurejeni fazi
(DOPC), medtem ko je bila razlika v sredini dvosloja ravno nasprotna [78,155]. Pri tem se
je potrebno zavedati, da se lahko, podobno kot pri NBD-PC, tudi alkilne verige nekaterih
spinskih označevalcev v membrani upognejo in omogočijo stik polarne nitroksidne skupine
z zanjo ugodnejšim polarnim okoljem zunanjega dela dvosloja [156,157]. Hkrati lahko v
membrani z dodatno spinsko molekularno skupino zmotijo zlaganje okoliških alkilnih
89
verig [157,158], kar lahko povzroči vdor vodnih molekul globlje v membrano in s tem
umetno spremeni polarnost v neposredni okolici nitroksida.
Pri tem se je potrebno zavedati, da se primerjani fluorescenčni in spinski označevalec
razlikujeta v nekaj pomembnih lastnostih: i) v polarnosti fluorescenčne oz. spinske
skupine, ki vpliva na nagnjenje molekule k upogibanju repa; ii) v legi omenjenih skupin na
koncu oz. v sredini alkilne verige, ki zaradi svoje hidrofobnosti stremi k iztegnjenemu
stanju; iii) v velikosti dodanih obročev, kar povzroča motnje v zgradbi membrane. Zato je
med različnimi označevalci pričakovati nekoliko različen izid medsebojnih vplivov in s
tem različnih končnih molekularnih oblik. Pri primerjavi rezultatov metod, ki uporabljajo
različne sistemu tuje označevalne molekule, je torej je potrebno biti nadvse previden.
Glede na opisano se najlaže opremo na rezultate metode ATR-FTIR, ki polarnost meri
neposredno na lipidnih molekulah in označevalcev ne potrebuje.
Za določitev globine skupine NBD v membranah gelske in tekoče urejene faze žal ne
moremo izkoristiti prej uporabljenega modela za spreminjanje polarnosti po globini tekoče
neurejene membrane [145,151,152], saj se profili polarnosti med fazami močno
razlikujejo [78,155], direktna pretvorba izmerjene izkustvene polarnosti v dielektričnost
okolice pa ni prav enostavna [145,151,152]. Iz izmerjenih vrednosti MAX in znane
umeritve za NBD (Slika 6.6 A) vseeno lahko ocenimo, da se barvilo tudi v obeh ostalih
fazah nahaja v okolju z  precej nad 10, kar bi po vsej verjetnosti še vedno moralo biti
razmeroma blizu polarnih glav lipidov (Slika 6.6 B). V notranjosti membrane bi namreč
pričakovali vrednost  med 1 in 2 [151] in temu ustrezno nižje vrednosti MAX [74,75].
Predvidevanje lahko utemeljimo s primerom NBD, pripetega na rep molekule holesterola,
ki se zanesljivo nahaja v nepolarni sredici membrane in izkazuje tem dielektričnostim
ustrezajočo lego spektralnega vrha okoli 520 nm [143].
Majhno opaženo razliko v polarnosti med konformacijama || in  lahko pripišemo zgolj
različni usmeritvi barvila in posledični razliki v izpostavljenosti stikom z vodnimi
molekulami, kot smo razglabljali nekoliko poprej [58]. Vseeno pa ne moremo povsem
izključiti nekoč predlagane možnosti, da bi del označevalcev, katerih barvilo poroča o nižji
polarnosti okolice (||), iztegnilo verige globlje v membrano [142,143]. V skladu z vsebino
prejšnjega odstavka bi v tem primeru razmeroma visoke izmerjene vrednosti ||MAX okoli
528 nm potrebovale dodaten mehanizem za premik spektra proti daljšim valovnim
dolžinam, npr. nekaj molekul vode, ki bi spremljale barvilo NBD v sredici membrane in
tako navidezno povišale polarnost neposredne okolice [159].
Med opisom rezultatov smo že omenili, da sprememba lipidne faze poleg premika
MAX povzroči tudi spremenjeno razmerje deležev obeh konformacij označevalcev
(Slika 6.4) [58]. Delež alternativne oblike || narašča v vrstnem redu DOPC < DPPC <
DPPC + 40 % hol, kar je ravno nasprotno od povprečne površine membrane na posamezno
maščobno molekulo [134,135]. Povišana gostota molekul barvilu NBD očitno pogosteje
vsili pokončno lego, ki zavzame manj prostora in s tem omogoči tesnejše prileganje z
okoliškimi molekulami. Pojav je še zlasti izrazit pri visokih koncentracijah holesterola, saj
so tovrstne molekule zaradi svojega togega ravninskega sistema obročev še posebno
neprilagodljive. Izmed obeh primerjanih označevalcev je zaradi krajšega in zato manj
gibljivega repa tovrstnemu vplivu okolice bolj podvržen C6-NBD-PC (Slika 6.4) [58].
90
6.4 Razprava o metodi
V tem poglavju doktorskega dela smo pokazali, da lahko z natančno obdelavo rezultatov
pFMS izluščimo precej podrobnih informacij o vedenju označevalcev v membrani. Kljub
nekaterim merskim omejitvam in računskim poenostavitvam, predstavljenim v
neposrednem nadaljevanju, ostajajo zaključki jasni: i) oba označevalca lahko v membrani
zavzameta različne, hkrati prisotne konformacije, ii) ki so izpostavljene okoljem različne
polarnosti; iii) deleži konformacij se glede na fazo okoliške membrane izraziteje
spreminjajo pri molekuli C6-NBD-PC, iv) še posebno v tekoči urejeni fazi z visoko
vsebnostjo holesterola [58]. Zato predvidevamo, da bi bil lahko omenjeni označevalec v
kombinaciji z razvito metodo zelo obetavno orodje za raziskovanje s holesterolom bogatih
lipidnih splavov in nanodomen [3,9–12], kar smo že nakazali z opazovanjem interakcije
membran liposomov z živimi celicami [57], predstavljenim pri koncu prejšnjega poglavja.
6.4.1 Hitro opletanje molekul
Celotna razprava o zaznavanju prispevkov posameznih konformacij označevalcev temelji
na predpostavki, da molekule vztrajajo v določeni družini oblik tekom vzbujenega
elektronskega stanja. Hitrejše spreminjanje konformacij bi namreč izpovprečilo vplive
različne polarnosti neposredne okolice, zaradi česar po obodu liposomov ne bi zaznali
nobenih razlik v položaju spektralnega vrha.
Za oba uporabljena označevalca NBD-PC v membranah najživahnejše tekoče neurejene
faze so zares pokazali, da je za zadovoljiv opis tako meritev anizotropije fluorescence kot
simulacij MD potreben nezanemarljiv delež gibanja z značilnimi rotacijskimi
korelacijskimi časi [148], primerljivimi z življenjskim časom fluorescence NBD [147].
Omenjene raziskave so prav tako razkrile sicer majhne, a nedvoumne omejitve gibanja
dipolov barvila, značilne za »opletanje v stožcu« [147,148], kar še dodatno potrjuje izbiro
našega računskega modela [58]. Njegova uporaba v preostalih dveh fazah je torej še toliko
bolj upravičena. V le-teh naj bi se zaradi nekoliko nižje občutene polarnosti življenjski čas
vzbujenega elektronskega stanja NBD v primerjavi s tekočo neurejeno fazo sicer podaljšal,
a za največ 20 % [74], kar ne odtehta počasnejšega opletanja z vsaj za velikostni razred
daljšimi značilnimi časi [7].
Za tekočo neurejeno fazo po drugi strani vsekakor drži, da je del gibanja označevalcev
hitrejše, kot ga lahko zaznamo s fluorescenco [147,148]. Zato predvidevamo, da je bil
signal razločenih konformacij iz membran DOPC naložen na izpovprečeno spektralno
ozadje vseh hkrati prisotnih oblik označevalcev, ki smo ga v računskem modelu
zanemarili. Z upoštevanjem le-tega bi za opis opaženega spreminjanja MAX po obodu
liposomov potrebovali nekoliko bolj razmaknjeni vrednosti ||,MAX. Ker pa je razlika v legi
spektralnega vrha med obema konformacijama le malo manjša kot pri membranah v gelski
fazi (Slika 6.4), za katero je tako hitro gibanje molekul zelo malo verjetno, lahko
sklepamo, da omenjena poenostavitev ni pomembno vplivala na končne ugotovitve o
obnašanju označevalcev NBD-PC [58].
91
Slika 6.7 Odvisnost kvantnega izkoristka () barvila NBD od dielektričnosti () okoliškega
topila; povzeto po literaturi [74,145].
6.4.2 Okoljska odvisnost kvantnega izkoristka NBD
Pri obdelavi rezultatov bi morali upoštevali tudi odvisnost kvantnega izkoristka () barvila
NBD od polarnosti okolice [74,145]. Glede na opažene razlike MAX bi med
konformacijama || in  po znani umeritvi (Slika 6.7) [74] pričakovali največ 10-odstotno
razliko  za označevalca v membranah DOPC in DPPC ter približno dvakrat večjo pri
DPPC + hol. Ker pa se razlike v razmerju jakosti signala, računanem po enačbi (C.12),
delno uravnotežijo, je njihov vpliv na končne rezultate dva- do trikrat manjši in torej
primerljiv z natančnostjo določanja obodnih potekov jakosti signala (Slika C.2). To končno
pomeni, da bi z upoštevanjem okoljske odvisnosti  dobili za nekaj stotink nižje deleže d||,
kar pa bi bilo še vedno v okviru podanih negotovosti (Preglednica 6.1). Nadaljnji vplivi na
vrednosti ||,MAX bi bili neznatni.
6.4.3 Resonančni prenos energije med označevalci
Pri izračunu smo zanemarili tudi učinek resonančnega prenosa energije med označevalci
(homo-FRET), ki bi načeloma lahko spremenil obliko posnetega fluorescenčnega spektra,
lege spektralnih vrhov ter deleže posameznih konformacij. Čeprav imajo vse molekule
pripeto isto barvilo, je učinkovitost pri NBD zaradi močnega prekrivanja absorpcijskega
spektra z emisijskim nadpovprečno visoka [101].
S pregledom znane literature in nekaj dodatnimi meritvami (Dodatek A.1) smo se
prepričali, da je bil vpliv FRET pri zgoraj uporabljenih koncentracijah označevalcev 0,4 %
za obe molekuli v vseh membranskih fazah zanemarljiv. Hkrati smo potrdili tudi
enakomerno porazdeljevanje molekul NBD-PC v membrani in s tem izključili možnost
njihovega gručenja [100], ki bi sicer lahko vplivalo na opažene konformacije
označevalcev.
6.4.4 Uporabnost pFMS za raziskovanje membranskih domen
Kljub navedenim merskim negotovostim in računskim poenostavitvam smo z uvedbo
pFMS prikazali nov način, kako lahko iz polarizacijske odvisnosti spektralnih značilnosti
izsevane svetlobe pridobimo podatke o konformacijah fluorescenčnih označevalcev in s
tem raziskujemo lastnosti bioloških membran [58]. S tega zornega kota upogibanje alkilnih
verig molekul NBD-PC in mnogoterost možnih stanj ne predstavljata več ovire za njihovo
92
uporabo, temveč dodatno stopnjo občutljivosti za proučevanje okolice. Za raziskovanje
biomembranskih domen in lipidnih splavov je še posebno spodbuden ugotovljen močen
odziv konformacij na prisotnost visoke koncentracije holesterola [58]. Povsem možno se
zdi, da je prav ta pojav omogočil v prejšnjem poglavju opisano spremljanje interakcij
liposomov s celičnimi membranami, kjer nam je droben premik spektra pomagal razjasniti
način dostave zdravilne učinkovine [57].
Sposobnost zaznavanja in razlage tovrstnih heterogenosti bi lahko v nadaljevanju s
pridom izkoristili tudi za raziskovanje drobnih zgradb v membranah živih celic, npr.
lipidnih splavov in nanodomen. Pri tem je potrebno pojasniti, da je bil postopek v primeru
velikanskih liposomov nekoliko enostavnejši, saj smo zaradi značilnosti prepustnosti
LCTF in simetrije vzorca podatke za vse smeri polarizacije fluorescenčne svetlobe glede
na membrano dobili med enim samim poskusom FMS. Za nehomogene vzorce nepravilnih
oblik bi morali opraviti več meritev pri različnih legah LCTF ali zasukih vzorca, kar ob
sedanji postavitvi merilnega sistema ni povsem enostavno. Ker pa so potrebne nadgradnje
v svoji zasnovi razmeroma preprosto izvedljive, si lahko od metode pFMS v prihodnosti
obetamo novih odgovorov tudi na bolj zapletena biofizikalna vprašanja.
93
7 Znanstveni prispevki
Najpomembnejši rezultati predstavljenega doktorskega dela in njegovi prispevki k
napredkom znanosti so razvoj spektralno visoko ločljive metode FMS [57–59],
odpravljanje vplivov bledenja fluorescence z uvedenim naključnim vzorčenjem valovnih
dolžin in ustrezno obdelavo meritev [59] ter nadgradnja FMS za slikanje molekularnih
konformacij označevalcev [58]. Z razvitim naborom orodij lahko z mikroskopsko krajevno
ločljivostjo spremljamo razlike domenske zgradbe modelnih in celičnih membran zaradi
biokemijskih in temperaturnih vplivov [59] ter zaradi njihovih medsebojnih interakcij.
Slednje smo izkoristili za raziskovanje mehanizma dostave protitumorske učinkovine v
celice s pomočjo lipidnih nanodelcev [57].
7.1 Celostni razvoj metode FMS
Temelj naših raziskav predstavlja razvita metoda FMS, s katero smo združili dve za
biološke in biofizikalne raziskave izjemno pomembni in uspešni tehniki – fluorescenčni
mikroskopijo in spektroskopijo – ter tako povezali dve zelo različni področji občutljivosti.
Z izvirnim načinom zajemanja in natančno obdelavo meritev smo dosegli nanometrsko
natančnost določanja lege spektralnega vrha ter odpravili vplive bledenja na dobljene
podatke, s čimer smo rešili ključne dosedanje omejitve za širšo uveljavitev metode.
7.1.1 FMS povezuje informacije nano- in mikrometrskega sveta
Fluorescenčna mikroskopija omogoča opazovanje vzorcev s krajevno ločljivostjo do
200 nm v časovnih intervalih okoli milisekund, kar oboje ustreza značilnim ravnem
celičnih zgradb in procesov, fluorescenčna spektroskopija pa raziskovanje lastnosti okolja,
kot ga čutijo molekule na ravni nekaj nanometrov v nanosekundnem časovnem oknu
(Slika 7.1 A). Združitev metod omogoča krajevno in časovno spremljanje molekularnih
procesov tako v živih celicah kot v modelnih sistemih, kar je odlična osnova za nova
spoznanja molekularne biofizike, biokemije in biologije (na tej ravni je delitev precej
vprašljivega pomena), vključno s področjem membranskih domen in lipidnih splavov.
Čeprav uporabljen merilni sistem deluje podobno kot naprave za spektralno
slikanje [60,61], je izviren njegov način uporabe ter s tem nabor dosegljivih informacij.
Kot nakazujejo že izbrana imena tehnik, je pri spektralnem slikanju v ospredju slikanje,
spektralno zaznavanje pa omogoča predvsem razločevanje večjega števila hkrati prisotnih
barvil kot sicer z običajno fluorescenčno mikroskopijo. Nasprotno je pri FMS poglavitni
namen spektroskopija – torej merjenje oblike spektra okoljsko občutljivih barvil ter s tem
pridobivanje informacij o molekularnih lastnostih neposredne soseščine označevalcev,
krajevno opredeljene z optično ločljivostjo mikroskopije. V primerjavi s spektroskopijo
razsežnih vzorcev lahko s FMS pridobimo iste podatke iz za 6–8 velikostnih redov manjših
opazovanih predmetov.
95
7.1.2 Prilagajanje modelnih spektrov omogoča nanometrsko natančnost
Pri tako občutnem zmanjševanju vzorca je zaradi znižanja signala običajno potrebno
žrtvovati ločljivost katere od preostalih razsežnosti – časovne ali spektralne. Ker se lahko
biološki vzorci razmeroma hitro spreminjajo, so se doslej vedno raje odrekli podrobnim
spektralnim informacijam in pod mikroskopom uporabljali kvečjemu tistih nekaj barvil,
katerih spektralne spremembe lahko spremljamo s širokopasovnimi filtri [62,63].
Da bi FMS zagotovili polno spektralno občutljivost spektroskopije, ki na obilnih
vzorcih nedvoumno razloči nanometrske spektralne premike, smo pri obdelavi meritev
FMS uvedli prilagajanje modelnih spektrov (Slika 7.1 B) [57,59]. Podobno kot lahko pri
mikroskopskem slikanju delcev določijo njihovo lego mnogo natančneje od pogostosti
vzorčenja s prilagajanjem zvonastih funkcij izmerjenemu signalu [107], lahko z ustreznimi
nesimetričnimi porazdelitvami natančno opišemo tudi izmerjene spektre FMS [59].
S podrobno teoretično obravnavo merilne ločljivosti [108], ki smo jo prilagodili
spektralni uporabi, ter z neposrednimi meritvami smo potrdili, da lahko s tovrstno
obdelavo podatkov FMS določimo lego spektralnega vrha z nanometrsko natančnostjo ob
povsem dosegljivih merskih pogojih [59]. S tem smo občutljivost meritev mikroskopskih
predmetov postavili ob bok običajni spektroskopiji mnogo večjih vzorcev ter omogočili
uporabo enako široke palete okoljsko občutljivih barvil in označevalcev [64].
Slika 7.1 (A) S FMS lahko slikamo značilnosti molekularnega okolja z mikrometrsko krajevno
ločljivostjo. (B) Opis meritev z modelnimi spektri omogoča razlikovanje zelo majhnih
sprememb v legi vrha (MAX) ali obliki spektrov tudi ob razmeroma visokem prispevku šuma.
(C) Z naključnim vzorčenjem valovnih dolžin in upoštevanjem bledenja fluorescence med
prilagajanjem spektrov lahko kljub popačitvam določimo izvorno obliko spektra (b = 0), zaradi
česar lahko s FMS uporabljamo tudi mnoge svetlobno neobstojne označevalce. (D) Hitrost
bledenja nekaterih barvil prav tako odraža lastnosti njihove neposredne molekularne okolice.
96
7.1.3 Odpravljanje vpliva bledenja fluorescence izboljša zanesljivost FMS
Pri uporabi tovrstnih označevalcev pod mikroskopom pogosto naletimo na še eno
eksperimentalno oviro – mnoga barvila pod vplivom močne vzbujevalne svetlobe hitro
izgubljajo sposobnost fluorescence. Če je pojemanje signala pri običajni mikroskopiji
samo nadležno [140], je pri zaporednem vzorčenju valovnih dolžin merilnega sistema FMS
oz. spektralnega slikanja povsem nesprejemljivo [60,114], saj popači obliko izmerjenega
spektra (Slika 4.1 A na strani 44) in s tem onemogoči zanesljivo razlago rezultatov.
Težave zaradi bledenja fluorescence smo tekom doktorskega dela odpravili z vpeljavo
naključnega vzorčenja valovnih dolžin [59]. Vpliv bledenja na izmerjen signal lahko v tem
primeru z računsko obdelavo učinkovito razklopimo od izvorne oblike spektra
(Slika 7.1 C). Z računalniškimi simulacijami in meritvami smo pokazali, da lahko z
opisanim pristopom ohranimo nanometrsko natančnost določanja lege spektralnega vrha
tudi ob uporabi svetlobno občutljivih barvil [59], kot sta npr. NBD in Laurdan. V prihodnje
se lahko torej raziskovalci pri izbiri ali načrtovanju poročevalskih molekul povsem
posvetijo njihovi biofizikalno-kemijski primernosti za izbrano nalogo, saj lahko morebitne
pomanjkljive svetlobne lastnosti v veliki meri nadoknadimo s celostnim pristopom
zajemanja meritev in njihove obdelave.
7.1.4 Hitrost bledenja je pomemben podatek
Uspešno obvladovanje bledenja nam obenem omogoča krajevno ločljivo spremljanje
hitrosti pojemanja signala (Slika 7.1 D), ki prav tako razkriva fizikalno-kemijske lastnosti
molekularne okolice označevalcev, do česar smo se dokopali »spotoma« med
popravljanjem oblike spektra. S tem smo razširili nabor dostopnih informacij za
raziskovanje pestrih bioloških in biofizikalnih sistemov.
Pojav so nekajkrat sicer že izkoristili za namensko slikanje hitrosti bledenja
fluorescence (angl. bleach rate imaging) [115–117], kjer so spremljali zgolj krajevno
odvisno pojemanje signala, a je uporaba omenjene metode presenetljivo redka. Zaradi
neposredne povezave med hitrostjo bledenja in življenjskim časom vzbujenega
elektronskega stanja [94] tehnika namreč predstavlja nadvse preprost in dosegljiv
nadomestek FLIM. Morda bo metoda resneje zaživela v kombinaciji z določanjem ostalih
spektralnih parametrov, kot pri razviti FMS z odpravljanjem vplivov bledenja. Iz sprva
neljubega pojava lahko torej z ustreznim pristopom pridobimo pomembne dodatne
informacije in dobesedno udejanjimo staro modrost: »Če sovražnika ne moreš premagati,
se spoprijatelji z njim.« [160]
V podobnem duhu smo obravnavali tudi lastnost uporabljenega tekočekristalnega filtra,
da polarizira prepuščeno fluorescenčno svetlobo, kar je omogočilo zaznavanje usmeritev
dipolov barvila v membrani.
97
7.2
»Slikanje« molekularnih konformacij označevalcev s pFMS
S polarizirano nadgradnjo FMS (pFMS) in podrobno računsko podporo smo uresničili
poglavitni cilj doktorskega dela, da se s spektroskopijo dokopljemo do podrobnih
molekularnih informacij z mikroskopsko krajevno ločljivostjo.
7.2.1 Združitev polariziranega in spektralnega zaznavanja odpira nov vpogled
Z mikroskopskim slikanjem spektralnih lastnosti v različnih polarizacijskih smereh glede
na smer membrane smo razkrili soobstoj molekularnih konformacij, ki jih molekule
fluorescenčnih označevalcev v membrani hkrati zavzamejo na razdaljah pod krajevno
ločljivostjo mikroskopije (Slika 7.2) [58]. Pri tem je pomembno poudariti, da je odkritje
omogočila prav kombinacija obeh načinov zaznavanja, saj bi imeli zgolj s polariziranim ali
spektralnim slikanjem premalo podatkov za podroben opis tako kompleksnega sistema.
7.2.2 Konformacije NBD-PC so močno odvisne od koncentracije holesterola
Z opisanim pristopom smo neposredno pojasnili že večkrat opaženo dvojno obnašanje
družine zelo pogosto uporabljanih okoljsko občutljivih fluorescenčnih označevalcev
NBD-PC [142–148]. Ugotovili smo, da tovrstne molekule v membranah zavzamejo dve
prevladujoči konformaciji, ki zaradi različne usmeritve dipola barvila glede na ravnino
membrane občutita nekoliko različno polarnost okolice (Slika 7.2) [58].
S pomočjo razvitega matematičnega modela smo obe konformaciji tudi podrobneje
opisali ter določili njune relativne deleže zasedenosti. Rezultati meritev v različnih lipidnih
fazah so pokazali, da na konformacijska stanja označevalcev NBD-PC še posebno odločno
vpliva visoka koncentracija holesterola v membrani [58].
V okviru predstavljenih raziskav smo razjasnili raznovrstno obnašanje označevalcev v
enovitih membranskih okoljih. S pridobljenim znanjem bi lahko v prihodnje mnogoterost
njihovih konformacij še bolje izkoristili za mikrospektroskopsko raziskovanje pestrih
membranskih okolij, vključno z nanoskopskimi domenami in lipidnimi splavi.
7.2.3 S pFMS in njenimi posplošitvami bi lahko raziskovali lipidne splave
Občutljivost uporabljenih označevalcev na lokalno koncentracijo holesterola nakazuje, da
bi pFMS lahko v prihodnje izkoristili za raziskovanje s holesterolom bogatih membranskih
nanodomen in lipidnih splavov [3,9–12], katerih lastnosti in vloge v celičnih membranah
so zaradi majhnosti in kratkoživosti tovrstnih lipidnih struktur še vedno slabo poznane. Z
razvito metodo bi lahko presegli obe omejitvi, saj lahko z njo opazujemo molekularne
konformacije z življenjskimi časi nekaj nanosekund, označevalci pa se v membranah
nahajajo na razdaljah okoli 10 nm.
Pristop polariziranega opazovanja izbrane fluorescenčne spremenljivke bi lahko s FMS
neposredno prenesli tudi na slikanje življenjskega časa fluorescence (FLIM),
korelacijskega časa (FCS), resonančnega prenosa energije (FRET), anizotropije ali
katerekoli druge lastnosti izsevane fluorescenčne svetlobe, ki se spreminja s
fizikalno-kemijskimi lastnostmi neposredne okolice barvila. Splošna uporabnost uvedene
metode še poudarja pomen opravljenega dela.
98
Slika 7.2 S kombinacijo polariziranega in spektralnega zaznavanja smo pri velikanskih
liposomih, označenih z molekulami NBD-PC, opazili dosledno spreminjanje jakosti in lege
spektralnega vrha fluorescenčne svetlobe vzdolž oboda liposomov (sredina). Pojav smo
razložili s soobstojem različnih konformacij označevalcev, ki zaradi različne usmeritve dipola
(bele puščice v barvnih ovalih na shemah levo in desno) glede na membrano (||,  na n) čutijo
različno polarnost. Tovrstna molekularna stanja so v membrani hkrati prisotna na razdaljah pod
krajevno ločljivostjo mikroskopije, zaradi izhodnega polarizatorja pred kamero pa na različnih
delih liposoma prevladuje signal različnih prispevkov (,).
7.3 Raziskave zgradbe in lastnosti biomembran
Razvito metodo FMS smo uporabili za raziskovanje lastnosti modelnih in celičnih
membran ter njihovih medsebojnih interakcij pri dostavi zdravilne učinkovine v celice z
lipidnimi nanodelci. Hkrati smo podrobno proučili obnašanje različnih okoljsko občutljivih
membranskih označevalcev, na kar se bomo v prihodnje lahko oprli pri razlagi raziskav še
bolj zapletenih bioloških in biofizikalnih sistemov.
7.3.1 Razvili smo učinkovito orodje za raziskave membranskih faz in domen
S številnimi poskusi na modelnih sistemih smo potrdili, da nam uvedeno raziskovalno
orodje FMS omogoča zanesljivo spremljanje in opisovanje lastnosti membranskih domen,
saj smo lahko zelo učinkovito zaznavali spremembe faz posameznih liposomov zaradi
različne lipidne sestave (Slika 7.1 A) ter opazovali njihov fazni prehod ob spremembi
temperature (Slika 7.3 A) [58,59]. V prihodnje bomo lahko tako na različnih modelnih
membranah še bolj podrobno raziskali fizikalne lastnosti faznih prehodov, npr. njihove
hitrosti, prehodna stanja, kolektivne molekularne pojave idr.
Med svojim delom smo prav tako nedvoumno lahko opisali tudi razlike biološko
pestrejših vzorcev – mešanice celic in liposomov, s čimer smo potrdili robustnost vpeljane
metode. To nam bo v nadaljevanju omogočilo raziskovanje vlog nano- in mikrometrskih
lipidnih zgradb v membranah živih celic.
Ker nam za zanesljivo prepoznavanje membranskih pojavov zadoščajo že zelo majhni
spektralni premiki, lahko v prihodnosti pričakujemo mnogo pomembnih odkritij o
membranskih domenah s pomočjo novih, namensko razvitih označevalnih molekul. Še
posebno obetajoči se zdijo dvojni spinsko-fluorescenčni označevalci [53], katerih
fluorescenčno osnovo SPP268 smo v okviru tega doktorskega dela temeljito preizkusili.
Skupaj s spinsko molekulsko skupino bodo tovrstni označevalci že tako zgovorne podatke
(p)FMS nadgradili še z dopolnjujočimi informacijami, ki jih o membranski zgradbi
prispeva metoda EPR, tj. urejenosti lipidov ter živahnosti njihovega gibanja [43–46].
99
Slika 7.3 S FMS smo raziskovali (A) fazne prehode posameznih liposomov zaradi spremembe
temperature ter (B) interakcije med liposomi s protitumorskim delovanjem in membranami
rakastih celic. Izmerjen spektralni premik okoljsko občutljivega barvila ob stiku liposomov s
celicami kaže, da je označevalec prešel v membrane z drugačnim okoljem, kar lahko razložimo
z zlivanjem membran.
7.3.2 Pojasnili smo dostavni mehanizem nove terapevtske oblike
Poleg že naštetih prispevkov je za širšo raziskovalno javnost nedvomno pomemben tudi
doprinos k razumevanju interakcij med biološkimi membranami. Pri raziskavi posebnega
mehanizma dostave protitumorske učinkovine v celice smo pokazali, da se liposomi
izbrane biokemijske sestave zlivajo z membranami celic (Slika 7.3 B) [57]. Občutljivo
spektralno zaznavanje lastnosti membranskih faz z mikroskopsko krajevno ločljivostjo
lahko torej izkoristimo tudi za raziskave in razvoj novih pristopov k zdravljenju najtežjih
obolenj.
Trenutno je v teku še nekaj drugih podobno zanimivih uporab v tem delu razvite
tehnike FMS. i) Sodelujemo pri pojasnjevanju delovanja vrste celičnih receptorjev, ki
virusu HIV omogočajo vstop v celice. Razumevanje tovrstnih procesov bi lahko vodilo do
odkritja novih načinov preprečevanja in zdravljenja te bolezni. ii) Raziskujemo način
prehoda danes vedno bolj vseprisotnih anorganskih in organskih nanodelcev čez modelne
in celične membrane; zaradi svoje majhnosti in posebnih površinskih lastnosti ti delci ne
upoštevajo celici poznanih pravil igre, s čimer se odpirajo mnoge nove možnosti uporabe,
a hkrati tudi mnoga vprašanja o njihovi varnosti. iii) Opazujemo odziv celic na nove
biomedicinske materiale, namenjene vsaditvi v poškodovana mesta tkiv, kar bi lahko v
prihodnje izboljšalo, pospešilo in pocenilo zahtevna zdravljenja.
Pri vseh naštetih projektih se močno prepletajo mnogi biofizikalni pojavi na
molekularni in celični ravni, kar povsem ustreza tekom doktorskega dela večkrat
poudarjenim kombiniranim oknom občutljivosti FMS. Pred nami je torej vrsta novih
izzivov, od katerih si obetamo mnogo zanimivih spoznanj, ki jih bomo skušali uporabiti v
dobrobit naše družbe in okolja.
100
Dodatek A Ustreznost koncentracij označevalcev
Pri kakršnihkoli poskusih z molekularnimi označevalci moramo poskrbeti, da z
dodajanjem tujih delcev v opazovani sistem le-tega premočno ne spremenimo. Hkrati
moramo preprečiti tudi morebitne popačitve rezultatov zaradi medsebojnih vplivov med
samimi označevalci. Pri fluorescenčnih so najpogostejši tovrstni zapleti povezani z
neenakomernim razporejanjem barvila [100] in Försterjevim resonančnim prenosom
energije med enakimi molekulami (homo-FRET) [101], ki vplivata na izmerjen spektralni
signal. Odsotnost obeh pojavov smo za najzgovornejše kombinacije označevalcev in
lipidnih okolij preverili z nizom referenčnih meritev vzorcev z različnimi koncentracijami
označevalcev.
A.1
Označevalci NBD-PC
Za prenos energije morajo priti označevalci v neposredno bližino, saj učinkovitost pada s
šesto potenco medsebojne oddaljenosti [38]. Za uporabljene koncentracije označevalcev
(množinski delež 0,4 %) lahko iz površine membrane na maščobno molekulo
(0,7 nm2) [134,135] ocenimo, da je povprečna razdalja med označevalci znašala okoli
13 nm. To je mnogo več od Försterjevega radija za NBD-PC, ki znaša okoli 3 nm [101],
zato vpliv FRET pri naših poskusih ne bi smel biti občuten.
Sklep se ne spremeni, tudi če upoštevamo termično gibanje molekul. Difuzijski
koeficient lipidov in njim podobnih označevalcev v najživahnejši tekoči neurejeni fazi
znaša med 10–12 m2/s in 4 × 10–10 m2/s [7,101], kar pomeni, da molekule v nekaj
nanosekundah vzbujenega elektronskega stanja v povprečju prepotujejo manj kot 2 nm.
Verjetnost za približanje v doseg FRET je torej še vedno zanemarljiv.
Pri tem smo predpostavili enakomerno porazdeljevanje označevalcev med molekulami
prevladujočih lipidov. Za oba uporabljena označevalca pri uporabljenih koncentracijah so
predpostavko v membranah tekoče neurejene faze zares že potrdili z meritvami FRET in
dušenja lastne fluorescence [100]. Zato smo morali preveriti le še obnašanje molekule
C12-NBD-PC, ki je pri omenjeni raziskavi kazala močnejše težnje h kopičenju kakor
C6-NBD-PC [100], v membranah gelske faze, v kateri je gibanje molekul najpočasnejše in
zato verjetnost za sprijemanje označevalcev v skupke največja. V ta namen smo pripravili
dodatne vzorce liposomov DPPC z različnimi množinskimi razmerji označevalca
C12-NBD-PC glede na lipide in primerjali njihove fluorescenčne signale. Ugotovili smo,
da se spekter merljivo premakne šele pri koncentracijah označevalca okoli 1 %
(Slika A.1 A). Tudi jakost signala se zaradi medsebojnega dušenja molekul od
pričakovanega linearnega naraščanja odkloni pri podobnih vrednostih (Slika A.1 B).
Iz omenjenih rezultatov lahko za koncentracije, uporabljene pri poskusih v poglavju 6,
izključimo vpliva FRET in kopičenja obeh označevalcev na njihov fluorescenčni spekter in
s tem povezanih morebitnih popačitev rezultatov soobstoja različnih konformacij.
101
Slika A.1 Odvisnost (A) lege in oblike spektra ter (B) njegove jakosti (I0) od množinske
koncentracije označevalca C12-NBD-PC v liposomih DPPC (barvna legenda v %). Prekinjena
črta zgolj pomaga oceniti linearno odvisnost pri nizkih koncentracijah.
A.2
Označevalec SPP268
Podobne dodatne meritve kot zgoraj smo izvedli tudi z označevalcem SPP268 v liposomih
DPPC in ugotovili, da tudi pri precej višjih koncentracijah, kot smo jih uporabljali pri
predstavljenih poskusih (0,5 %), ne kaže nobenih znakov FRET ali gručenja molekul
(Slika A.2). Pojava bi morala biti v membranah DOPC zaradi hitrejšega gibanja molekul še
mnogo manj izrazita, zatorej je skrb o kakršnihkoli tovrstnih popačitvah pri poskusih v
poglavju 5 povsem odveč.
Slika A.2 Odvisnost (A) lege in oblike spektra ter (B) njegove jakosti (I0) od množinske
koncentracije označevalca SPP268 v liposomih DPPC (barvna legenda v %).
102
Dodatek B Toplotni učinek žarka optične pincete
V razdelku 5.2.2 smo skušali z infrardečim laserskim žarkom optične pincete čez fazni
prehod pogreti del membrane liposoma in tako umetno ustvariti majhno membransko
domeno. Za boljšo predstavo o toplotnem učinku smo izračunali pričakovan temperaturni
odziv vzorca ter rezultate nato preverili še z neposrednimi meritvami. Razmeroma
prepričljivo ujemanje je potrdilo daljnosežen vpliv segrevanja, zaradi česar smo pri vseh
poskusih čez fazni prehod pogreli celoten liposom.
B.1
Izračun pričakovanega temperaturnega polja
Najprej smo želeli toplotni učinek žarka optične pincete oceniti z izračunom difuzije
absorbirane toplote, ki jo v snovi z dano gostoto () ter toplotno kapaciteto (c) in
prevodnostjo (k) opisuje parcialna diferencialna enačba krajevno (r) in časovno (t) odvisne
temperature (T):
T  r, t  k 2
1

 T  r, t  
q  r, t  .
t
c
c
(B.1)
S pomočjo Greenovih funkcij [124] smo v približku neomejenega prostora časovno
nespremenljivo spremembo temperature (T) dobili z integracijo gostote virov toplote (q)
po vsem prostoru
T  r  
q  r  3
1
d r.

k 4 r  r
(B.2)
Pri tem smo za prostorski razpored grelnih virov vzdolž optične osi (z) in prečno nanjo (r)
uporabili porazdelitev gostote svetlobnega toka za laserski snop znane moči (P0) in
valovne dolžine () [161], pomnoženo z absorpcijskim koeficientom svetlobe v snovi (A)
q  r, z   A


2r 2

.
exp
2
2 
2 
2

 w0 1   z zR   
 w0 1   z zR  





2 P0
(B.3)
V zadnjem zapisu predstavljata w0 in zR polmer grla žarka oz. t. i. Rayleighjevo dolžino, ki
ju v snovi z danim lomnim količnikom (n) določa numerična odprtina uporabljenega
optičnega sistema (NA) [161]
w0

 arcsin  NA n 
,
zR 
 w02
.

(B.4)
103
Pri svojih poskusih smo uporabljali vodni potopni objektiv s 60-kratno povečavo in
NA = 1,27, a ker laserski žarek valovne dolžine 1064 nm in premera okoli 5 mm ni
zapolnil celotne vstopne odprtine objektiva (Preglednica 2.1 na strani 32), smo za w0 dobili
vrednost približno /2  0,5 m. Nadalje smo privzeli, da je absorpcija v sami membrani
zaradi njene tankosti (4 nm) v primerjavi s pravkar ocenjeno širino grla laserskega žarka
zanemarljiva. Zato smo upoštevali izmerjeno vrednost absorpcije IR svetlobe v vodi
(Slika B.1,  = 7,5 m–1), ki se je približno ujemala tudi z vrednostmi v literaturi (okoli
10 m–1) [162]. S podatkom za toplotno prevodnost vode (k = 0,61 W m–1 K–1) [163] smo
končno lahko numerično izračunali integral (B.2) za toplotni učinek žarka moči 500 mW,
kakršno smo najpogosteje uporabljali pri segrevanju liposomov.
Rezultati kažejo, da lahko ob uporabljeni navedeni moči IR svetlobe v gorišču
pričakujemo dvig temperature za okoli 6 K (Slika B.2 A in B). Hkrati lahko opazimo, da se
občutno segreje tudi širša okolica, kar je posledica difuzije toplote, proizvedene tudi v
izvengoriščnih ravninah. Glede na najmočnejši dvig temperature v grlu lahko na prečni
razdalji okoli 10 m oz. 30 m vzdolžno po žarku še vedno pričakujemo vsaj polovični
učinek, ki nato le počasi pojema. Zaključki se smiselno ujemajo s podobnimi, a nekoliko
poenostavljenimi izračuni v literaturi (Slika B.2 B, siva prekinjena črta) [162].
Z dobljenim temperaturnim poljem bi torej radi čez fazni prehod (Tm) segreli del
membrane liposoma. Če se za največje primerke mehurčkov s premerom okoli 40 m še
zdi izvedljivo, da bi izhodiščno temperaturo okolice naravnali ustreznih nekaj stopinj pod
Tm, postane izziv bistveno večji, ko upoštevamo, da potrebujemo za uravnovešenje sil na
liposom vsaj dve ali še raje tri optične pasti, ki jih enakomerno razporedimo po obodu. Ob
ohranjeni skupni moči celotne svetlobe tako dobimo v goriščni ravnini občutno zglajeno
temperaturno polje (Slika B.2 C), ki se vzdolž oboda liposoma spreminja za manj kot
stopinjo (Slika B.2 D) in tako onemogoča krajevno omejeno vzbujanje faznega prehoda.
Ob tem je smiselno opomniti, da je absolutni temperaturni odziv linearno povezan z
jakostjo svetlobe grelnega žarka – značilni velikostni razred spremembe temperature (T0)
namreč podaja izraz
T0 
2 AP0
.
k
(B.5)
Slika B.1 Spektralne odvisnosti koeficientov absorpcije svetlobe (A) bližnjega infrardečega
spektra etanola, vode in stekla (barvna legenda), ki smo jih izmerili na UV-VIS spektrometru
PerkinElmer Lambda 17. Navpična prekinjena črta pri 1064 nm ponazarja valovno dolžino
uporabljenega laserja optične pincete.
104
Slika B.2 (A) Pričakovano temperaturno polje prečno (r) in vzdolž (z) IR laserskega žarka, kot
smo ga izračunali po enačbi (B.2) za moč svetlobe 500 mW. Sive črte ponazarjajo njegovo
širino pri jakosti svetlobnega toka 1/e glede na vrednost v optični osi, barvni črti pa profila, od
koder smo izrisali (B) temperaturna poteka po obeh oseh za preglednejšo primerjavo z
literaturo [162]. (C) Prečni prerez pričakovanega toplotnega učinka ob sočasni uporabi treh
optičnih pasti (zelene pike) s skupno močjo 500 mW, enakomerno razporejenih vzdolž oboda
namišljene membrane liposoma s premerom 40 m v goriščni ravnini, ki jo ponazarja moder
krog in po obodnem kotu katere () je izrisan (D) izračunan potek temperature.
Večjo razliko med deli membrane bi lahko torej dosegli z uporabo močnejšega žarka, kar
pa ima tudi svoje praktične omejitve. Ob večji moči grelne svetlobe se je zaradi dodatnega
fotonskega tlaka na liposome v vzorcu hitro vzpostavilo tako močno konvekcijsko gibanje
tekočine, da je iztrgalo liposom iz optične pasti še pred izvedbo meritev.
Zato smo v nadaljevanju želeli oceniti, ali bi lahko ob še sprejemljivi moči laserskega
žarka dosegli bolj lokalizirano segrevanje z učinkovitim ohlajanjem robov vzorca, ki bi ga
izvedli s ponorom toplote v hlajenem potopnem objektivu ali objektnem stekelcu. Časovno
neodvisno stanje smo poiskali z analitičnim izračunom lastnih funkcij na omejenem
prostoru:
T  r , z  
 
n 1,2,3,... p 1,2,3...
Cnp
   p2
2
n
J 0  n r w0  cos  p z w0 ,
(B.6)
105
Slika B.3 (A) Temperaturno polje in ustrezno označena (B) osna poteka temperature zaradi
absorpcije laserske svetlobe moči 500 mW v vzorcu s hlajenimi robovi, izračunano po
enačbi (B.6). Prekinjeni krivulji predstavljata prejšnje rezultate (Slika B.2), kjer v izrazu (B.2)
hlajenja nismo upoštevali.
kjer predstavlja Jm Besselovo cilindrično funkcijo prve vrste reda m z n-to ničlo pri n(m),
koeficienta n in p ob stranicah (r0 = z0 = 100 m) poskrbita robni pogoj T = 0
n 
n(0)
r0 w0
p 
,
  2 p  1
2 z0 w0
,
(B.7)
s konstantami Cnp pa opišemo vpliv porazdelitve virov toplote v izbrani bazi lastnih funkcij:
Cnp 
2w02
k r02 z0
 q  r, z  J  r
0
n
w0  cos  p z w0  r dr dz
J12 n r0 w0 
.
(B.8)
Po numeričnem izračunu koeficientov Cnp do redov n = 20 in p = 10 ter njihovem
upoštevanju v izrazu (B.6) smo ugotovili, da bi se toplotni učinek optične pasti ob zelo
učinkovitem hlajenju robov vzorca po celotnem polju približno prepolovil (Slika B.3 A),
značilna razdalja segretega jedra pa se ne bi prav nič zmanjšala (Slika B.3 B). S tem
ukrepom torej ne bi mogli dovolj omejiti segrevanja vzorca, da bi vzbudili fazni prehod
zgolj dela membrane.
Končno smo želeli oceniti še toplotni vpliv opaženega konvekcijskega gibanja
tekočine, ki bi lahko odnašalo toploto od opazovanega mesta, za kar smo difuzijski
enačbi (B.1) dodali še en člen:
T  r , z, t  k 2
T  r , z, t 
1

 T  r , z, t  
q  r , z , t   vz
.
t
c
c
z
(B.9)
Na tem mestu smo računski problem močno poenostavili s predpostavko, da se tekočina po
celotnem vzorcu giblje z enakomerno hitrostjo vzdolž žarka (vz). Pri reševanju z lastnimi
funkcijami smo morali zdaj robni pogoj hladnega robu na vrhnjem delu vzorca sprostiti ter
uporabiti kompleksne koeficiente, da smo se prebili do realnega rezultata:
106
Slika B.4 (A) Prejšnjemu primeru (Slika B.3) smo dodali ohlajanje zaradi pretiranega
konvekcijskega gibanja tekočine vzdolž laserskega žarka (vz = 1 mm/s) in sprostili robni pogoj
na zgornji strani, zaradi česar je postal (B) potek temperature po optični osi (zelena krivulja)
občutno nesimetričen.
T  r , z  
 
Cnp
J 0  n r w0  
      v v 
     cos  z w   
n 1,2,3,... p 1,2,3,...
2 2
p
2
n
2
n
2
p z
2
p
p
(B.10)
0
0
v v0  sin  p z w0   .
p z
Pri tem smo zaradi preglednosti uvedli zapis v0 = k /cw0, koeficienti p so zdaj periodične
rešitve enačbe
cot  p z0 w0  
 p vz v0
 n2   p2
(B.11)
in torej odvisni od n iz izraza (B.7), po enačbi (B.8) pa se ustrezno spremenijo tudi
vrednosti konstant Cnp pri razvoju virov toplote po lastnih funkcijah sistema.
Z izpeljanimi izrazi smo lahko ponovno izračunali pričakovano temperaturno polje po
vzorcu. Pri vrednostih hitrosti tekočine zaradi konvekcije, ki smo jih iz opazovanj gibanja
liposomov ocenili na 10–100 m/s, je bilo odnašanje toplote iz grla žarka zaradi masnega
toka zanemarljivo. Občuten vpliv smo opazili šele pri za še en velikostni razred višji
hitrosti (1 mm/s), ko je postalo temperaturno polje pričakovano nesimetrično (Slika B.4), v
sami okolici grla žarka, kjer se med poskusom nahaja membrana liposomov, pa je bil
toplotni učinek vseeno še vedno povsem primerljiv s prejšnjim računskim primerom. Iz
dobljenih rezultatov torej sklepamo, da je bil tudi med resničnimi poskusi ohlajevalni vpliv
konvekcije tekočine zanemarljiv.
107
B.2
Meritve toplotnega učinka optične pincete
Po vsej računski telovadbi smo segrevanje vzorca zaradi absorpcije IR laserskega žarka
želeli tudi neposredno izmeriti. V ta namen smo se poslužili temperaturne odvisnosti
kvantnega izkoristka barvila NBD [74], tako da smo lahko uporabili kar v tem delu
pogosto predstavljen označevalec SPP268. Žal tovrstne molekule v vodi, kjer nas je
segrevanje okolice zaradi absorpcije IR svetlobe najbolj zanimala, niso topne, tako da smo
meritve izvedli z etanolno raztopino in jih nato s pomočjo dodatnih poskusov in znanih
lastnostih obeh tekočin ustrezno »prevedli«.
Za umeritev temperaturnega odziva etanolne raztopine SPP268 smo s termostatiranim
spektrofluorimetrom posneli izsevane fluorescenčne spektre med segrevanjem vzorca v
razponu 20–51 °C (Slika B.5 A). S primerjavo njihovih integralov smo ugotovili, da jakost
izsevane svetlobe barvila okoli temperature 30 °C pada z naklonom približno 2 %/K
(Slika B.5 B). Z dodatno meritvijo med ohlajanjem (prekinjena krivulja pri prikazu A in
prazen krožec na grafu B) smo preverili, da izmerjeno padanje signala ni bilo predvsem
posledica bledenja fluorescence med zaporednimi meritvami, temveč zares zaradi
temperaturne spremembe kvantnega izkoristka.
V nadaljevanju smo plast etanolne raztopine SPP268 med objektnim in krovnim
stekelcem, debelo okoli 5 m, izpostavili žarku optične pincete in pod mikroskopom
opazovali krajevni razpored svetlosti barvila (Slika B.6 A). Ker smo želeli opazovati pojav
z negativnim svetlobnim kontrastom, ki je za fluorescenčno mikroskopijo sicer neugoden
(glej razdelek 2.4.4), smo se potrudili pripraviti čim tanjši vzorec, da ni svetloba iz
izvengoriščnih ravnin prekrila opazovanega zmanjšanja signala iz grla grelnega žarka.
Iz poteka jakosti signala v vsaki točki vidnega polja smo odčitali relativno spremembo
fluorescenčne svetlobe neposredno po vklopu oz. izklopu laserja (Slika B.6 B, I).
Temperaturni odziv vzorca ob spremembi toplotnih virov je namreč mnogo hitrejši od ene
sekunde, kar lahko ocenimo iz življenjskih časov prej izpeljanih lastnih funkcij (np)
 np 
 cw02
,
k  n2   p2 
(B.12)
Slika B.5 (A) Temperaturna odvisnost posnetih fluorescenčnih spektrov etanolne raztopine
označevalca SPP268 (10–6 M) ter (B) njihovih relativnih jakosti, s katerimi smo umerili
temperaturni odziv barvila NBD. Prekinjena črta in prazen krožec pri prikazih A oz. B
predstavljata dodatno naknadno meritev, s katero smo izključili občuten vpliv bledenja
fluorescence.
108
Slika B.6 (A) Meritve toplotnega učinka IR žarka optične pincete moči 500 mW v tanki plasti
etanolne raztopine označevalca SPP268, ki se mu s temperaturo znižuje kvantni izkoristek in s
tem jakost izsevane fluorescenčne svetlobe. (B) Relativne velikosti skokov neposredno po
vklopu in izklopu grelnega žarka (I) smo v vsaki točki slike (prikazana sta poteka za mesti, ki
sta na prikazu A označeni z ustrezno obarvanima pikama) z pomočjo prej predstavljene
umeritve (Slika B.5) pretvorili v (C) temperaturno polje. Povprečje narisanih profilov (rdeč
križ) smo (D) primerjali s teoretično napovedjo, izračunano po enačbi (B.2) za razširjanje
toplote v neskončni prostor (siva prekinjena krivulja).
krajših od 10 ms, ali rezultatov reševanja časovno odvisne difuzijske enačbe [162]. Opažen
potek je torej vseboval še en počasnejši proces, ki smo ga pripisali pospešenemu bledenju
barvila zaradi IR svetlobe [70] ter naknadni difuziji označevalnih molekul iz okolice v
zbledelo območje, kar smo z ustrezno obdelavo meritev izločili iz nadaljnje obravnave.
Dobljen prostorski razpored velikosti hitrih skokov signala smo s prej predstavljeno
umeritvijo (Slika B.5 B) prevedli v temperaturno polje vzorca (Slika B.6 C). Rezultate smo
nato primerjali z izpeljano teoretično napovedjo za razširjanje toplote v neskončni prostor
po enačbi (B.2). Pri izračunu slednje smo za razliko od prejšnjih prikazov tokrat upoštevali
vrednosti parametrov za etanol (A = 4,1 m–1 (Slika B.1), k = 0,17 W m–1 K–1 [163]), zaradi
česar je bil toplotni učinek laserskega žarka ob isti uporabljeni moči približno dvakrat višji
kot v vodi. Brez kakršnega koli prilagajanja parametrov smo za večji del meritev opazili
nadvse prepričljivo ujemanje s predvidenim potekom temperature (Slika B.6 D). Le v
samem grlu žarka so bile izmerjene vrednosti nižje od pričakovanih, kar je najverjetneje
109
posledica svetlobe iz izvengoriščnih ravnin, ki je kljub že omenjeni tankosti vzorca in
visoki NA uporabljenega objektiva dosvetlila signal iz žarišča in s tem navidezno znižala
toplotni učinek IR žarka.
Podobno ujemanje smo dobili za širok razpon uporabljenih moči grelnega žarka
(Slika B.7 A), iz česar sklepamo, da je bil približek razširjanja toplote v razsežen prostor
brez učinkovitega hlajenja ob robovih pri naših meritvah upravičen. Čeprav je bila plast
raztopine barvila debela le 5 m in s tem mnogo tanjša od v računu zajetega področja
absorpcije toplote (100 m), moramo očitno upoštevati tudi segrevanje krovnega in
objektnega stekelca. Podrobnejša primerjava snovnih lastnosti pokaže, da se učinka
osemkrat učinkovitejše absorpcije IR (Slika B.1) in 8,4-krat večje prevodnosti stekla v
primerjavi z etanolom [163] v zvezi (B.5) ravno približno izničita, torej res pričakujemo,
da se sklad plasti teh dveh snovi v primeru naših poskusov obnaša homogeno.
Končno smo želeli izsledke meritev prevesti na primer, ki nas je izvorno zanimal –
segrevanje liposomov v vodi, opisanem v razdelku 5.2.2. Zato smo vse meritve po
enačbi (B.5) pretvorili v pričakovane vrednosti za segrevanje vode, v kateri je toplotni
učinek približno dvakrat šibkejši kot v etanolu, z IR žarkom moči 500 mW (Slika B.7 B).
Popolno ujemanje vseh podatkov in računske napovedi nas je ponovno prepričalo, da je
deljenje moči žarka na tri optične pasti, razporejene po obodu liposomov, ustvarilo tako
homogeno temperaturno polje (Slika B.2 C), da ni bilo možno vzbuditi faznega prehoda le
posameznega dela membrane.
Slika B.7 (A) Rezultati meritev, posnetih pri različnih uporabljenih močeh grelnega žarka, ki
smo jih nato z upoštevanjem snovnih značilnosti, podanih v besedilu, pretvorili v
(B) pričakovan temperaturni odziv vode zaradi absorpcije IR svetlobe moči 500 mW.
110
Dodatek C Model soobstoječih konformacij
označevalcev
V poglavju 6 glavnega dela disertacije smo raziskovali hkrati prisotne molekularne
konformacije označevalcev. Lastnosti posameznih stanj in razmerja zasedenosti smo
določili na podlagi spreminjanja jakosti signala in oblike spektra po obodu posameznih
enoplastnih mehurčkov [58]. Nekoliko daljšo računsko izpeljavo smo zaradi preglednosti
dela na tistem mestu zgolj opisali, v nadaljevanju pa jo predstavljamo v celoti.
C.1
Opis kotno odvisnih spektralnih lastnosti
Za ovrednotenje doslednega spreminjanja jakosti signala (I0) in lege spektralnega vrha
(MAX) po obodu liposomov, ki smo jih opazili na spektralno obteženih slikah rezultatov
enokomponentnega prilagajanja spektrov (Slika 6.2), smo najprej določili povprečne
vrednosti omenjenih parametrov v točkah vzdolž obsega v korakih po /10. Signal smo
nato še nekoliko izboljšali s povprečevanjem rezultatov do šestih podobnih liposomov iste
lipidne sestave in označenih z istim označevalcem. Iz dobljenih N = 20 točk kotnih
odvisnosti smo izračunali sledeče vrednosti: razmerje jakosti signala (RI) med »tečaji«
( = /2, Slika 6.1 B) in »ekvatorjem« ( = 0)
RI 
I 0  2 
,
I0  0
(C.1)
povprečno lego spektralnega vrha (MAX)
Λ MAX 
1
N



MAX
  (C.2)
ter razliko MAX med »tečaji« in »ekvatorjem« (MAX)
ΔMAX  MAX  2   MAX  0  .
(C.3)
Vrednosti parametrov na obeh koncih liposoma smo dobili s prilagajanjem parabole v
okolici ustreznih ekstremov nihajočih kotnih odvisnosti, ki smo jih za izboljšanje signala
predhodno povprečili po obeh glavnih oseh simetrije.
111
C.2
Model dveh molekularnih konformacij označevalcev
Izvor opaženih nihanj jakosti fluorescence in lege vrha spektra okoli oboda liposomov smo
opisali z dvema podmnožicama označevalcev, ki čutita različni polarnosti okolice in
katerih dipoli so pretežno urejeni vzporedno (||) oz. pravokotno () na normalo membrane
(Slika 6.1 C). S pomočjo v nadaljevanju opisanega matematičnega modela smo določili
njuna relativna deleža (d|| in d) ter značilni legi spektralnega vrha (||MAX in MAX).
Za začetek smo predpostavili, da lahko gibanje barvila v membrani opišemo z
ureditvenim potencialom jakosti U, ki glavno os molekule vrača proti ravnovesni legi
(ϑ = 0) zaradi povišanja proste energije sistema (F):
F    U cos2.
(C.4)
Verjetnost za odklon smeri dipola od simetrijske osi namišljenega stožca (ϑ) v relativnem
koordinatnem sistemu stožca smo opisali z Boltzmannovo statistiko
    C exp   F kBT   C exp  u cos2  ,
(C.5)
kjer smo jakost potenciala umerili na termično energijo sistema (u = U/kBT), s konstanto c
pa poskrbeli za ustrezno umeritev verjetnosti:
1 c  2
 /2
 exp  u cos   sin  d.
2
(C.6)
0
Nato smo poljubno usmeritev dipola, v lokalnem sistemu izraženo z vektorjem
vREL = (sin cos, sin sin, cos) (Slika C.1 A), pretvorili v laboratorijski koordinatni
sistem (vLAB), ki ga določa smer prepuščene polarizacije LCTF (Slika C.1 B). Prepis smo
opravili z ustreznimi Eulerjevimi vrteži (Rx,y,z), s katerimi smo upoštevali nagib stožca
glede na normalo membrane ( = 0 za konformacijo || in /2 za ), vse možne usmeritve
konformacije  okoli normale () ter lego same membrane glede na koordinatni sistem
LCTF ():
v LAB  R x    R z    R y     v REL .
(C.7)
Za izračun količine svetlobe, prepuščene skozi filter, smo morali nadalje določiti
pričakovan kvadrat velikosti projekcije dipola na prepustno smer LCTF (g):
g  ,   
1
2
  v
 eLCTF     sin d d d
2
LAB
(C.8)
z mejami integralov (0,/2) za  ter (0,2) za  in . Analitični izračun zgornjega izraza
smo uporabili za določitev kotnih odvisnosti jakosti signala obeh molekularnih
konformacij označevalca (i|| in i):
i    g  ,0  ,
112
i     f NA g  ,  2  .
(C.9)
Dodatek C Model soobstoječih konformacij označevalcev
Slika C.1 (A) V relativnem koordinatnem sistemu, določenem s simetrijsko osjo opletanja
dipola (zREL), usmeritev dipola v vsakem trenutku (vREL) opišemo z dvema kotoma (𝜗 in ).
(B) Prikaz potrebnih vrtežev pri pretvorbi koordinat iz lokalnega sistema, določenega s
stožcem opletanja molekule (x,y,zREL), preko membranskega (x,y,zM) v laboratorijski sistem
(x,y,zLAB), ki ga usmerimo glede na prepustno smer polarizacije LCTF (eLCTF).
Pri stanju || smo ocenili, da smo z uporabljenim objektivom pri danih vrednostih U zajeli
vso svetlobo, izsevano v polovični prostor proti objektivu, za konformacijo  pa smo s
faktorjem fNA upoštevali, da se nam je del fotonov iz nekaterih rotacij  izmuznil zaradi
končne vrednosti numerične odprtine uporabljenega objektiva (NA = 1,27):
f NA 
0
,
 4
 0  arcsin  NA n  .
(C.10)
Oznaka n predstavlja lomni količnik okoliškega sredstva in za vodo znaša 1,33.
Celotno jakost fluorescence v vsaki točki na obodu liposoma (i0) smo končno dobili z
ustrezno obteženo vsoto prispevkov obeh konformacij:
i 0    d i    d  i    .
(C.11)
Ko smo zgornji izraz vstavili v definicijo RI (C.1)
i 0  2 
RI  0
i  0
(C.12)
in upoštevali še umeritev d|| + d = 1, smo lahko iz izmerjenih vrednosti RI pri izbrani
jakosti ureditvenega potenciala določili iskana relativna deleža obeh molekularnih
konformacij označevalcev (Slika C.2).
113
Slika C.2 Določanje relativnega deleža ene izmed konformacij (d||) iz izmerjenega razmerja
jakosti signala med »polom« in »ekvatorjem« liposomov (RI) pri izbrani vrednosti
ureditvenega potenciala (U). Barvni križci predstavljajo vrednosti in njihove negotovosti za
vseh šest primerjanih vzorcev.
Določitev ||,MAX je zahtevala še nekaj računske telovadbe. Lego spektralnega vrha
skupnega signala smo v vsaki točki na obodu liposoma izračunali z ustreznim
povprečenjem obeh prispevkov:

d i   MAX  d  i    MAX
MAX   
.
i 0  
(C.13)
Povprečno vrednost po celem mehurčku (MAX) smo nato po izvornem predpisu (C.2) z
nekaj dodatnega matematičnega premetavanja izrazili kot

ΛMAX   MAX    MAX
,
(C.14)
kjer smo zapis zaradi preglednosti skrajšali z uvedbo uteži ||,

i  
d ,

.

N  i 0  
,
,
(C.15)
Za smiselne vrednosti ureditvenega potenciala (U > 0) zveza (C.14) pričakovano ni več
linearna po d||, (Slika C.3 A).
Na podoben način smo podali tudi amplitudo sprememb MAX vzdolž roba liposoma
MAX, predpisano z izrazom (C.3):

ΔMAX  MAX   MAX
(C.16)
z okrajšavo (Slika C.3 B)

114
,
d
,
 i ,   2  i ,   0  
 0
 0
 .
 i  2  i  0  
(C.17)
Dodatek C Model soobstoječih konformacij označevalcev
Slika C.3 Slikovna predstavitev uvedenih uteži (A) ||, in (B) ||, iz enačb (C.15) oz. (C.17).
Polne črte predstavljajo vrednosti za U = 4 kBT, ki smo jo uporabili za vzorce DOPC, pikčaste
črte pa bi veljale v primeru povsem neurejenega gibanja označevalcev (U = 0).
Končno smo lahko iz izmerjenih vrednosti MAX in MAX ter zvez (C.14) in (C.16)
določili tudi legi spektralnih vrhov za obe konformaciji označevalcev:
MAX
  Δ MAX   ΛMAX

,
     

MAX

ΛMAX   MAX

.
(C.18)
Ko smo tako iz treh izmerjenih značilnosti spreminjanja fluorescence po obodu
liposoma določili parametre modela dveh soobstoječih konformacij označevalnih molekul
(d||, in ||,MAX), smo lahko po enačbah (C.11) in (C.13) izračunali celotni kotni odvisnosti
(Slika 6.3). Ker smo doslej izmerjeno jakost signala (I0) in njeno modelno različico (i0)
umerjali ločeno, smo jih za končno primerjavo vzporedili z že opisanim analitičnim
pristopom, podanim z enačbo (4.14).
115
C.3
Ocena ureditvenih potencialov
V modelu dveh molekularnih konformacij označevalcev smo uporabili ureditvene
potenciale, ki smo jih določili iz ustreznih podatkov v literaturi [148,150]. Stopnjo
opletanja molekul v membrani navadno podajajo z ureditvenim parametrom (SZ)
SZ 
3cos 2M  1
,
2
(C.19)
kjer predstavlja ϑM kot med pravokotnico na ravnino membrane in usmeritvijo
opazovanega vektorja. Slednjega je v našem primeru predstavljal dipol barvila NBD. Iz
predpostavljene porazdelitve njegovih usmeritev (C.5) smo lahko izračunali zahtevani
povprečni kosinus
cos2M    v M  eZ     sin d d ,
2
(C.20)
pred čemer pa smo morali usmeritev dipola (vREL) še pretvoriti iz njegovega lastnega v
membranski koordinatni sistem (vM) s podobnim predpisom kot zgoraj (C.7):
v M  R y     v REL .
(C.21)
Z numeričnim prilagajanjem smo tako lahko iz izbranih vrednosti SZ določili jakosti
ureditvenih potencialov (U).
116
Viri
1.
B. Alberts, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts in P. Walter, Molecular Biology of the Cell, 5th
ed. (Garland Science, 2007).
2.
S. J. Singer in G. L. Nicolson, "The fluid mosaic model of the structure of cell membranes," Science
175, 720–731 (1972).
3.
K. Simons in M. Gerl, "Revitalizing membrane rafts: new tools and insights," Nat Rev Mol Cell Biol 11,
688–699 (2010).
4.
L. J. Pike, "Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function," J. Lipid
Res. 47, 1597 –1598 (2006).
5.
K. Jacobson, O. G. Mouritsen in R. G. W. Anderson, "Lipid rafts: at a crossroad between cell biology
and physics," Nat Cell Biol 9, 7–14 (2007).
6.
R. Koynova in M. Caffrey, "Phases and phase transitions of the phosphatidylcholines," Biochim.
Biophys. Acta 1376, 91–145 (1998).
7.
W. L. C. Vaz, "Properties of Lipid Bilayers,” v Wiley Encyclopedia of Chemical Biology, T. P. Begley,
ured. (Wiley-Blackwell, 2008), pp. 1–15.
8.
K. Simons in E. Ikonen, "Functional rafts in cell membranes," Nature 387, 569–572 (1997).
9.
D. Brown, "GPI-anchored proteins and detergent-resistant membrane domains," Braz. J. Med. Biol. Res.
Rev. Bras. Pesqui. Médicas E Biológicas Soc. Bras. Biofísica Al 27, 309–315 (1994).
10. C. Dietrich, "Lipid Rafts Reconstituted in Model Membranes," Biophys. J. 80, 1417–1428 (2001).
11. A. Pralle, P. Keller, E. L. Florin, K. Simons in J. K. Hörber, "Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as
small entities in the plasma membrane of mammalian cells," J. Cell Biol. 148, 997–1008 (2000).
12. D. Marsh, "Cholesterol-induced fluid membrane domains: A compendium of lipid-raft ternary phase
diagrams," Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1788, 2114–2123 (2009).
13. R. F. M. de Almeida, L. M. S. Loura, A. Fedorov in M. Prieto, "Lipid Rafts have Different Sizes
Depending on Membrane Composition: A Time-resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer
Study," J. Mol. Biol. 346, 1109–1120 (2005).
14. S. L. Veatch in S. L. Keller, "Seeing spots: complex phase behavior in simple membranes," Biochim.
Biophys. Acta 1746, 172–185 (2005).
15. F. M. Goñi, A. Alonso, L. A. Bagatolli, R. E. Brown, D. Marsh, M. Prieto in J. L. Thewalt, "Phase
diagrams of lipid mixtures relevant to the study of membrane rafts," Biochim. Biophys. Acta BBA Mol. Cell Biol. Lipids 1781, 665–684 (2008).
16. E. Abbe, "Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung," Arch. Für
Mikrosk. Anat. 9, 413–418 (1873).
17. Rayleigh, L, "On the theory of optical images, with special reference to the microscope," Philos. Mag. 5,
2009 (1896).
18. J. F. Hancock, "Lipid rafts: contentious only from simplistic standpoints," Nat Rev Mol Cell Biol 7,
456–462 (2006).
19. M. Sud, E. Fahy, D. Cotter, A. Brown, E. A. Dennis, C. K. Glass, A. H. Merrill Jr, R. C. Murphy, C. R.
H. Raetz, D. W. Russell in S. Subramaniam, "LMSD: LIPID MAPS structure database," Nucleic Acids
Res. 35, D527–532 (2007).
117
20. G. van Meer, D. R. Voelker in G. W. Feigenson, "Membrane lipids: where they are and how they
behave," Nat Rev Mol Cell Biol 9, 112–124 (2008).
21. T. Baumgart, A. T. Hammond, P. Sengupta, S. T. Hess, D. A. Holowka, B. A. Baird in W. W. Webb,
"Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles,"
Proc. Natl. Acad. Sci. 104, 3165 –3170 (2007).
22. S. L. Veatch, P. Cicuta, P. Sengupta, A. Honerkamp-Smith, D. Holowka in B. Baird, "Critical
Fluctuations in Plasma Membrane Vesicles," ACS Chem. Biol. 3, 287–293 (2008).
23. P. F. Devaux in R. Morris, "Transmembrane Asymmetry and Lateral Domains in Biological
Membranes," Traffic 5, 241–246 (2004).
24. H. J. Risselada in S. J. Marrink, "The molecular face of lipid rafts in model membranes," Proc. Natl.
Acad. Sci. 105, 17367 –17372 (2008).
25. J. Pencer, T. Mills, V. Anghel, S. Krueger, R. M. Epand in J. Katsaras, "Detection of submicron-sized
raft-like domains in membranes by small-angle neutron scattering," Eur. Phys. J. E Soft Matter 18, 447–
458 (2005).
26. J. Fan, M. Sammalkorpi in M. Haataja, "Formation and regulation of lipid microdomains in cell
membranes: Theory, modeling, and speculation," FEBS Lett 584, 1678–1684 (2010).
27. B. Boulgaropoulos, Z. Arsov, P. Laggner in G. Pabst, "Stable and Unstable Lipid Domains in CeramideContaining Membranes," Biophys. J. 100, 2160–2168 (2011).
28. T. S. van Zanten, A. Cambi in M. F. Garcia-Parajo, "A nanometer scale optical view on the
compartmentalization of cell membranes," Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr. 1798, 777–787
(2010).
29. L. Schermelleh, R. Heintzmann in H. Leonhardt, "A guide to super-resolution fluorescence
microscopy," J. Cell Biol. 190, 165 –175 (2010).
30. J. Pawley, Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd ed. (Springer, 2006).
31. S. Chiantia, J. Ries in P. Schwille, "Fluorescence correlation spectroscopy in membrane structure
elucidation," Biochim. Biophys. Acta 1788, 225–233 (2009).
32. R. Machan in M. Hof, "Lipid diffusion in planar membranes investigated by fluorescence correlation
spectroscopy," Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr. 1798, 1377–1391 (2010).
33. C. Eggeling, C. Ringemann, R. Medda, G. Schwarzmann, K. Sandhoff, S. Polyakova, V. N. Belov, B.
Hein, C. von Middendorff, A. Schonle in S. W. Hell, "Direct observation of the nanoscale dynamics of
membrane lipids in a living cell," Nature 457, 1159–1162 (2009).
34. M. Giocondi, D. Yamamoto, E. Lesniewska, P. Milhiet, T. Ando in C. Le Grimellec, "Surface
topography of membrane domains," Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr. 1798, 703–718 (2010).
35. C. Yuan, J. Furlong, P. Burgos in L. J. Johnston, "The size of lipid rafts: an atomic force microscopy
study of ganglioside GM1 domains in sphingomyelin/DOPC/cholesterol membranes.," Biophys. J. 82,
2526–2535 (2002).
36. G. Pabst, N. Kucerka, M.-P. Nieh, M. C. Rheinstädter in J. Katsaras, "Applications of neutron and X-ray
scattering to the study of biologically relevant model membranes," Chem. Phys. Lipids 163, 460–479
(2010).
37. V. N. P. Anghel, N. Kučerka, J. Pencer in J. Katsaras, "Scattering from laterally heterogeneous vesicles.
II. The form factor," J. Appl. Crystallogr. 40, 513–525 (2007).
38. J. R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd ed. (Springer, 2006).
39. R. de Almeida, L. Loura in M. Prieto, "Membrane lipid domains and rafts: current applications of
fluorescence lifetime spectroscopy and imaging," Chem. Phys. Lipids 157, 61–77 (2009).
40. M. Rao in S. Mayor, "Use of Forster’s resonance energy transfer microscopy to study lipid rafts,"
Biochim. Biophys. Acta BBA - Mol. Cell Res. 1746, 221–233 (2005).
118
Viri
41. L. M. S. Loura, R. F. M. de Almeida, L. C. Silva in M. Prieto, "FRET analysis of domain formation and
properties in complex membrane systems," Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr. 1788, 209–224
(2009).
42. R. Mendelsohn in D. J. Moore, "Vibrational spectroscopic studies of lipid domains in biomembranes and
model systems," Chem. Phys. Lipids 96, 141–157 (1998).
43. J. Štrancar, "Advanced ESR Spectroscopy in Membrane Biophysics," v ESR Spectroscopy in Membrane
Biophysics, M. A. Hemminga in L. Berliner, ured., Biological Magnetic Resonance (Springer, 2007), pp.
49–93.
44. M. J. Swamy, L. Ciani, M. Ge, A. K. Smith, D. Holowka, B. Baird in J. H. Freed, "Coexisting domains
in the plasma membranes of live cells characterized by spin-label ESR spectroscopy," Biophys J 90,
4452–65 (2006).
45. Z. Arsov, M. Schara, M. Zorko in J. Strancar, "The membrane lateral domain approach in the studies of
lipid-protein interaction of GPI-anchored bovine erythrocyte acetylcholinesterase," Eur Biophys J 33,
715–25 (2004).
46. J. Strancar, T. Koklic, Z. Arsov, B. Filipic, D. Stopar in M. A. Hemminga, "Spin label EPR-based
characterization of biosystem complexity," J Chem Inf Model 45, 394–406 (2005).
47. A. A. Kavalenka, B. Filipic, M. A. Hemminga in J. Strancar, "Speeding up a genetic algorithm for EPRbased spin label characterization of biosystem complexity," J Chem Inf Model 45, 1628–35 (2005).
48. Z. Arsov in J. Strancar, "Determination of partition coefficient of spin probe between different lipid
membrane phases," J Chem Inf Model 45, 1662–71 (2005).
49. J. Strancar, A. Kavalenka, I. Urbancic, A. Ljubetic in M. A. Hemminga, "SDSL-ESR-based protein
structure characterization," Eur. Biophys. J. EBJ 39, 499–511 (2010).
50. A. Kavalenka, I. Urbancic, V. Belle, S. Rouger, S. Costanzo, S. Kure, A. Fournel, S. Longhi, B.
Guigliarelli in J. Strancar, "Conformational analysis of the partially disordered measles virus N(TAIL)XD complex by SDSL EPR spectroscopy," Biophys. J. 98, 1055–1064 (2010).
51. T. Koklic, R. Zeisig in M. Sentjurc, "Interaction of alkylphospholipid liposomes with MT-3 breastcancer cells depends critically on cholesterol concentration," Biochim. Biophys. Acta 1778, 2682–2689
(2008).
52. T. Koklic, M. Sentjurc in R. Zeisig, "Determination of the amount of micelles in alkylphospholipid
liposome formulations with electron paramagnetic resonance method," J. Liposome Res. 21, 1–8 (2011).
53. S. Pajk, M. Garvas, J. Štrancar in S. Pečar, "Nitroxide-fluorophore double probes: a potential tool for
studying membrane heterogeneity by ESR in fluorescence," Org. Biomol. Chem. 9, 4150–4159 (2011).
54. S. L. Veatch, I. V. Polozov, K. Gawrisch in S. L. Keller, "Liquid Domains in Vesicles Investigated by
NMR and Fluorescence Microscopy," Biophys. J. 86, 2910–2922 (2004).
55. Y.-W. Hsueh, K. Gilbert, C. Trandum, M. Zuckermann in J. Thewalt, "The Effect of Ergosterol on
Dipalmitoylphosphatidylcholine Bilayers: A Deuterium NMR and Calorimetric Study," Biophys. J. 88,
1799–1808 (2005).
56. M. M. Mariani, L. J. Maccoux, C. Matthäus, M. Diem, J. G. Hengstler in V. Deckert, "Micro-Raman
detection of nuclear membrane lipid fluctuations in senescent epithelial breast cancer cells," Anal.
Chem. 82, 4259–4263 (2010).
57. Z. Arsov, I. Urbančič, M. Garvas, D. Biglino, A. Ljubetič, T. Koklič in J. Štrancar, "Fluorescence
microspectroscopy as a tool to study mechanism of nanoparticles delivery into living cancer cells,"
Biomed. Opt. Express 2, 2083–2095 (2011).
58. I. Urbančič, A. Ljubetič, Z. Arsov in J. Štrancar, "Coexistence of probe conformations in lipid phases—a
polarized fluorescence microspectroscopy study," Biophys. J. 105, 919–927 (2013).
59. I. Urbančič, Z. Arsov, A. Ljubetič, D. Biglino in J. Štrancar, "Bleaching-corrected fluorescence
microspectroscopy with nanometer peak position resolution," Opt. Express 21, 25291–25306 (2013).
119
60. T. Zimmermann, J. Rietdorf in R. Pepperkok, "Spectral imaging and its applications in live cell
microscopy," FEBS Lett. 546, 87–92 (2003).
61. Y. Garini in E. Tauber, "Spectral imaging: methods, design, and applications," v Biomedical Optical
Imaging Technologies, R. Liang, ured. (Springer, 2013), pp. 111–161.
62. L. A. Bagatolli in E. Gratton, "Two photon fluorescence microscopy of coexisting lipid domains in giant
unilamellar vesicles of binary phospholipid mixtures.," Biophys. J. 78, 290–305 (2000).
63. A. S. Klymchenko, S. Oncul, P. Didier, E. Schaub, L. Bagatolli, G. Duportail in Y. Mély, "Visualization
of lipid domains in giant unilamellar vesicles using an environment-sensitive membrane probe based on
3-hydroxyflavone," Biochim. Biophys. Acta 1788, 495–499 (2009).
64. A. P. Demchenko, Y. Mély, G. Duportail in A. S. Klymchenko, "Monitoring biophysical properties of
lipid membranes by environment-sensitive fluorescent probes," Biophys. J. 96, 3461–3470 (2009).
65. J. R. Partington, "Lignum nephriticum," Ann. Sci. 11, 1–26 (1955).
66. E. N. Harvey, A History of Luminescence from the Earliest Times until 1900 (American Philosophical
Society, 1957).
67. B. Valeur, "Introduction: On the Origin of the Terms Fluorescence, Phosphorescence, and
Luminescence," v New Trends in Fluorescence Spectroscopy, B. Valeur in J.-C. Brochon, ured.
(Springer Berlin Heidelberg, 2001), Vol. 1, pp. 3–6.
68. M. N. Berberan-Santos, "Pioneering Contributions of Jean and Francis Perrin to Molecular
Luminescence,” v New Trends in Fluorescence Spectroscopy, B. Valeur in J.-C. Brochon, ured.
(Springer Berlin Heidelberg, 2001), Vol. 1, pp. 7–33.
69. A. Diaspro, G. Chirico, C. Usai, P. Ramoino, in J. Dobrucki, "Photobleaching,” v Handbook Of
Biological Confocal Microscopy, J. B. Pawley, ured. (Springer US, 2006), pp. 690–702.
70. M. A. van Dijk, L. C. Kapitein, J. van Mameren, C. F. Schmidt, in E. J. G. Peterman, "Combining
optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of
fluorophores," J. Phys. Chem. B 108, 6479–6484 (2004).
71. W. L. Wolfe, E. R. I. of M. I. I. in A. Center, G. J. Zissis, in U. S. O. of N. Research, The Infrared
Handbook (Environmental Research Institute of Michigan, 1985).
72. e2v technologies, L3VisionTM CD97-00 Back Illuminated 2-Phase IMO Series Peltier Pack Electron
Multiplying CCD Sensor (2004).
73. J. Strnad, Fizika: Posebna teorija relativnosti, kvantna fizika, atomi. Del 3 (Društvo matematikov,
fizikov in astronomov Slovenije, 1998).
74. S. Fery-Forgues, J.-P. Fayet, in A. Lopez, "Drastic changes in the fluorescence properties of NBD
probes with the polarity of the medium: involvement of a TICT state?," J. Photochem. Photobiol. Chem.
70, 229–243 (1993).
75. S. Mukherjee, A. Chattopadhyay, A. Samanta, in T. Soujanya, "Dipole moment change of NBD group
upon excitation studied using solvatochromic and quantum chemical approaches: Implications in
membrane research," J. Phys. Chem. 98, 2809–2812 (1994).
76. A. Chattopadhyay, "Chemistry and biology of N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-labeled lipids:
fluorescent probes of biological and model membranes," Chem. Phys. Lipids 53, 1–15 (1990).
77. S. Haldar in A. Chattopadhyay, "Application of NBD-labeled lipids in membrane and cell biology,” v
Fluorescent Methods to Study Biological Membranes, Y. Mély in G. Duportail, ured., Springer Series on
Fluorescence No. 13 (Springer Berlin Heidelberg, 2013), pp. 37–50.
78. W. K. Subczynski, A. Wisniewska, J.-J. Yin, J. S. Hyde, in A. Kusumi, "Hydrophobic Barriers of Lipid
Bilayer Membranes Formed by Reduction of Water Penetration by Alkyl Chain Unsaturation and
Cholesterol," Biochemistry (Mosc.) 33, 7670–7681 (1994).
79. T. Parasassi, M. Di Stefano, M. Loiero, G. Ravagnan, in E. Gratton, "Influence of cholesterol on
phospholipid bilayers phase domains as detected by Laurdan fluorescence," Biophys. J. 66, 120–132
(1994).
120
Viri
80. D. Bardell, "The First Record of Microscopic Observations," BioScience 33, 36–38 (1983).
81. I. C. Ghiran, "Introduction to Fluorescence Microscopy,” v Light Microscopy, H. Chiarini-Garcia in R.
C. N. Melo, ured., Methods in Molecular Biology No. 689 (Humana Press, 2011), pp. 93–136.
82. G. S. Kino, "Intermediate Optics in Nipkow Disk Microscopes,” v Handbook of Biological Confocal
Microscopy, J. B. Pawley, ured. (Springer US, 1995), pp. 105–111.
83. H. R. Morris, C. C. Hoyt, in P. J. Treado, "Imaging Spectrometers for Fluorescence and Raman
Microscopy: Acousto-Optic and Liquid Crystal Tunable Filters," Appl. Spectrosc. 48, 857–866 (1994).
84. Prior Scientific, ProScanTM II - High Performance Motorized Stage Systems (2003).
85. Sutter Instruments, Lambda LS Stand-Alone Xenon Arc Lamp and Power Supply (2007).
86. Semrock, A Unit of IDEX Corporation, 2011 Master Catalog - The Right Filter. Right Now. (2011).
87. BD Biosciences, BD CARV IITM Confocal Imager - Real-Time, Full Spectrum, Personal Confocal
(2005).
88. CRi, VariSpecTM Liquid Crystal Tunable Filters - Fast, Flexible, Solid-State (2007).
89. QImaging, Rolera-MGi - High-Speed, Extremely Sensitive IEEE 1394 FireWire ® Digital EMCCD
Camera (2007).
90. e2v technologies, Low-Light Technical Note 2 - The Use of Multiplication Gain in L3Vision TM Electron
Multiplying CCD Sensors (2003).
91. AndorTM Technology, iXon3 - Driving the Absolute Best from EMCCD Technology (n.d.).
92. Aresis - Advanced Research Instrumentation Solutions, Tweez - The Art of Optical Manipulation (2010).
93. U. Resch-Genger, D. Pfeifer, C. Monte, W. Pilz, A. Hoffmann, M. Spieles, K. Rurack, J. Hollandt, D.
Taubert, B. Schönenberger, in P. Nording, "Traceability in fluorometry: Part II. Spectral fluorescence
standards," J. Fluoresc. 15, 315–336 (2005).
94. T. Hirschfeld, "Quantum efficiency independence of the time integrated emission from a fluorescent
molecule," Appl. Opt. 15, 3135–3139 (1976).
95. Life Technologies - Molecular Probes ®, FocalCheckTM Fluorescent Microscope Test Slides (2011).
96. I. Kusters, N. Mukherjee, M. R. de Jong, S. Tans, A. Koçer, in A. J. M. Driessen, "Taming membranes:
functional immobilization of biological membranes in hydrogels," PLOS ONE 6, e20435 (2011).
97. J. P. Reeves in R. M. Dowben, "Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles," J. Cell.
Physiol. 73, 49–60 (1969).
98. K. Akashi, H. Miyata, H. Itoh, in K. Kinosita, "Preparation of giant liposomes in physiological
conditions and their characterization under an optical microscope.," Biophys. J. 71, 3242–3250 (1996).
99. P. Walde, K. Cosentino, H. Engel, in P. Stano, "Giant vesicles: preparations and applications,"
Chembiochem Eur. J. Chem. Biol. 11, 848–865 (2010).
100. L. Loura, "Lateral Distribution of NBD-PC Fluorescent Lipid Analogs in Membranes Probed by
Molecular Dynamics-Assisted Analysis of Förster Resonance Energy Transfer (FRET) and Fluorescence
Quenching," Int. J. Mol. Sci. 13, 14545–14564 (2012).
101. M. J. Prieto, M. Castanho, A. Coutinho, A. Ortiz, F. J. Aranda, in J. C. Gómez-Fernández,
"Fluorescence study of a derivatized diacylglycerol incorporated in model membranes," Chem. Phys.
Lipids 69, 75–85 (1994).
102. R. Zeisig, D. Arndt, R. Stahn, in I. Fichtner, "Physical properties and pharmacological activity in vitro
and in vivo of optimised liposomes prepared from a new cancerostatic alkylphospholipid," Biochim.
Biophys. Acta 1414, 238–248 (1998).
103. R. A. Neher, M. Mitkovski, F. Kirchhoff, E. Neher, F. J. Theis, in A. Zeug, "Blind source separation
techniques for the decomposition of multiply labeled fluorescence images," Biophys. J. 96, 3791–3800
(2009).
121
104. H. Xu in B. W. Rice, "In-vivo fluorescence imaging with a multivariate curve resolution spectral
unmixing technique," J. Biomed. Opt. 14, 064011 (2009).
105. A. M. Valm, J. L. M. Welch, C. W. Rieken, Y. Hasegawa, M. L. Sogin, R. Oldenbourg, F. E. Dewhirst,
in G. G. Borisy, "Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial
labeling and spectral imaging," Proc. Natl. Acad. Sci. (2011).
106. F. Fereidouni, A. N. Bader, in H. C. Gerritsen, "Spectral phasor analysis allows rapid and reliable
unmixing of fluorescence microscopy spectral images," Opt. Express 20, 12729–12741 (2012).
107. T. Schmidt, G. J. Schütz, W. Baumgartner, H. J. Gruber, in H. Schindler, "Imaging of single molecule
diffusion," Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 2926–2929 (1996).
108. N. Bobroff, "Position measurement with a resolution and noise‐limited instrument," Rev. Sci. Instrum.
57, 1152–1157 (1986).
109. A. Bullen in P. Saggau, "High-speed, random-access fluorescence microscopy: II. Fast quantitative
measurements with voltage-sensitive dyes.," Biophys. J. 76, 2272–2287 (1999).
110. S. Duhr, S. Arduini, in D. Braun, "Thermophoresis of DNA determined by microfluidic fluorescence,"
Eur. Phys. J. E Soft Matter 15, 277–286 (2004).
111. J. P. Rigaut in J. Vassy, "High-resolution three-dimensional images from confocal scanning laser
microscopy. Quantitative study and mathematical correction of the effects from bleaching and
fluorescence attenuation in depth," Anal. Quant. Cytol. Histol. Int. Acad. Cytol. Am. Soc. Cytol. 13,
223–232 (1991).
112. J. Markham in J.-A. Conchello, "Artefacts in restored images due to intensity loss in three-dimensional
fluorescence microscopy," J. Microsc. 204, 93–98 (2001).
113. T. Zal in N. R. J. Gascoigne, "Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells,"
Biophys. J. 86, 3923–3939 (2004).
114. R. Lansford, G. Bearman, in S. E. Fraser, "Resolution of multiple green fluorescent protein color
variants and dyes using two-photon microscopy and imaging spectroscopy," J. Biomed. Opt. 6, 311–318
(2001).
115. D. M. Benson, J. Bryan, A. L. Plant, A. M. Gotto Jr, in L. C. Smith, "Digital imaging fluorescence
microscopy: spatial heterogeneity of photobleaching rate constants in individual cells," J. Cell Biol. 100,
1309–1323 (1985).
116. G. J. Brakenhoff, K. Visscher, in E. J. Gijsbers, "Fluorescence bleach rate imaging," J. Microsc. 175,
154–161 (1994).
117. D. Wüstner, A. Landt Larsen, N. J. Faergeman, J. R. Brewer, in D. Sage, "Selective visualization of
fluorescent sterols in Caenorhabditis elegans by bleach-rate-based image segmentation," Traffic Cph.
Den. 11, 440–454 (2010).
118. G. W. Robinson in R. P. Frosch, "Theory of Electronic Energy Relaxation in the Solid Phase," J. Chem.
Phys. 37, 1962–1973 (1962).
119. D. M. Burland in G. W. Robinson, "Calculated Radiationless Transition Rates for Benzene and
Deuterobenzene," J. Chem. Phys. 51, 4548–4559 (1969).
120. S. Waldenstrøm in K. R. Naqvi, "The overlap integrals of two harmonic-oscillator wavefunctions: some
remarks on originals and reproductions," Chem. Phys. Lett. 85, 581–584 (1982).
121. D. B. Siano in D. E. Metzler, "Band shapes of the electronic spectra of complex molecules," J. Chem.
Phys. 51, 1856–1861 (1969).
122. A. Kalauzi, D. Mutavdzić, D. Djikanović, K. Radotić, in M. Jeremić, "Application of asymmetric model
in analysis of fluorescence spectra of biologically important molecules," J. Fluoresc. 17, 319–329
(2007).
123. D. J. Griffiths, Introduction to Quantum Mechanics (Pearson Prentice Hall, 2005).
124. M. Abramowitz in I. A. Stegun, Handbook of Mathematical Functions: With Formulas, Graphs and
Mathematical Tables (Dover, 1972).
122
Viri
125. F. Iachello in M. Ibrahim, "Analytic and algebraic evaluation of Franck−Condon overlap integrals," J.
Phys. Chem. A 102, 9427–9432 (1998).
126. E. A. Burstein in V. I. Emelyanenko, "Log-normal description of fluorescence spectra of organic
fluorophores," Photochem. Photobiol. 64, 316–320 (1996).
127. V. I. Emelyanenko in É. A. Burstein, "Analytical description of the fluorescence spectra of aromatic
amino acids and proteins," J. Appl. Spectrosc. 65, 372–378 (1998).
128. H. Langhals, "A re-examination of the line shape of the electronic spectra of complex molecules in
solution: log-normal function versus gaussian," Spectrochim. Acta. A. Mol. Biomol. Spectrosc. 56A,
2207–2210 (2000).
129. J. A. Nelder in R. Mead, "A Simplex Method for Function Minimization," Comput. J. 7, 308–313
(1965).
130. O.
R.,
"Shaving
the
last
50
ms
off
NMinimize
http://mathematica.stackexchange.com/a/4877/5443," (2012).
Web.
29
April
2012
131. W. H. Press, Numerical Recipes: The Art of Scientific Computing (Cambridge University Press, 2007).
132. M. Lampton, B. Margon, in S. Bowyer, "Parameter estimation in X-ray astronomy," Astrophys. J. 208,
177 (1976).
133. R. Neher in E. Neher, "Optimizing imaging parameters for the separation of multiple labels in a
fluorescence image," J. Microsc. 213, 46–62 (2004).
134. J. F. Nagle in S. Tristram-Nagle, "Structure of lipid bilayers," Biochim. Biophys. Acta 1469, 159–195
(2000).
135. E. Falck, M. Patra, M. Karttunen, M. T. Hyvönen, in I. Vattulainen, "Lessons of slicing membranes:
interplay of packing, free area, and lateral diffusion in phospholipid/cholesterol bilayers," Biophys. J.
87, 1076–1091 (2004).
136. Hubner W. in Blume A., "Interactions at the lipid-water interface," Chem. Phys. Lipids 96, 99–123
(1998).
137. Z. Arsov in L. Quaroni, "Direct interaction between cholesterol and phosphatidylcholines in hydrated
membranes revealed by ATR-FTIR spectroscopy," Chem Phys Lipids 150, 35–48 (2007).
138. L. Song, E. J. Hennink, I. T. Young, in H. J. Tanke, "Photobleaching kinetics of fluorescein in
quantitative fluorescence microscopy.," Biophys. J. 68, 2588–2600 (1995).
139. A. Orthmann, R. Zeisig, T. Koklic, M. Sentjurc, B. Wiesner, M. Lemm, in I. Fichtner, "Impact of
membrane properties on uptake and transcytosis of colloidal nanocarriers across an epithelial cell barrier
model," J. Pharm. Sci. 99, 2423–2433 (2010).
140. L. A. Bagatolli, S. A. Sanchez, T. Hazlett, in E. Gratton, "Giant vesicles, Laurdan, and two-photon
fluorescence microscopy: evidence of lipid lateral separation in bilayers," Methods Enzymol. 360, 481–
500 (2003).
141. A. S. Klymchenko, G. Duportail, A. P. Demchenko, in Y. Mely, "Bimodal Distribution and
Fluorescence Response of Environment-Sensitive Probes in Lipid Bilayers," Biophys. J. 86, 2929–2941
(2004).
142. J.-M. I. Alakoskela in P. K. J. Kinnunen, "Probing Phospholipid Main Phase Transition by Fluorescence
Spectroscopy and a Surface Redox Reaction," J. Phys. Chem. B 105, 11294–11301 (2001).
143. H. Raghuraman, S. Shrivastava, in A. Chattopadhyay, "Monitoring the looping up of acyl chain labeled
NBD lipids in membranes as a function of membrane phase state," Biochim. Biophys. Acta 1768, 1258–
1267 (2007).
144. A. Chattopadhyay in E. London, "Parallax method for direct measurement of membrane penetration
depth utilizing fluorescence quenching by spin-labeled phospholipids," Biochemistry (Mosc.) 26, 39–45
(1987).
123
145. S. Mazères, V. Schram, J. F. Tocanne, in A. Lopez, "7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole-4-yl-labeled
phospholipids in lipid membranes: differences in fluorescence behavior.," Biophys. J. 71, 327–335
(1996).
146. D. Huster, P. Müller, K. Arnold, in A. Herrmann, "Dynamics of membrane penetration of the
fluorescent 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl (NBD) group attached to an acyl chain of
phosphatidylcholine.," Biophys. J. 80, 822–831 (2001).
147. S. Mukherjee, H. Raghuraman, S. Dasgupta, in A. Chattopadhyay, "Organization and dynamics of N(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-labeled lipids: a fluorescence approach," Chem. Phys. Lipids 127,
91–101 (2004).
148. L. M. S. Loura in J. P. P. Ramalho, "Location and dynamics of acyl chain NBD-labeled
phosphatidylcholine (NBD-PC) in DPPC bilayers. A molecular dynamics and time-resolved
fluorescence anisotropy study," Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr. 1768, 467–478 (2007).
149. D. Axelrod, "Carbocyanine dye orientation in red cell membrane studied by microscopic fluorescence
polarization.," Biophys. J. 26, 557–573 (1979).
150. C. Hofsass, E. Lindahl, in O. Edholm, "Molecular dynamics simulations of phospholipid bilayers with
cholesterol," Biophys J 84, 2192–206 (2003).
151. C. R. Sanders in J. P. Schwonek, "An approximate model and empirical energy function for solute
interactions with a water-phosphatidylcholine interface.," Biophys. J. 65, 1207–1218 (1993).
152. M. C. Wiener in S. H. White, "Structure of a fluid dioleoylphosphatidylcholine bilayer determined by
joint refinement of x-ray and neutron diffraction data. III. Complete structure.," Biophys. J. 61, 434–447
(1992).
153. A. Vogel, H. A. Scheidt, in D. Huster, "The distribution of lipid attached spin probes in bilayers:
application to membrane protein topology," Biophys. J. 85, 1691–1701 (2003).
154. T. Parasassi, M. Di Stefano, M. Loiero, G. Ravagnan, in E. Gratton, "Cholesterol modifies water
concentration and dynamics in phospholipid bilayers: a fluorescence study using Laurdan probe,"
Biophys. J. 66, 763–768 (1994).
155. D. Marsh, "Polarity and permeation profiles in lipid membranes," Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98,
7777–7782 (2001).
156. J. Mravljak, J. Konc, M. H. C. Ek, T. Solmajer, in S. Pecar, "Spin-labeled alkylphospholipids in a
dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer: molecular dynamics simulations," J Phys Chem B 110, 25559–
61 (2006).
157. M. R. Vartorelli, A. S. Garay, in D. E. Rodrigues, "Spin-labeled stearic acid behavior and perturbations
on the structure of a gel-phase-lipid bilayer in water: 5-, 12- and 16-SASL," J. Phys. Chem. B 112,
16830–16842 (2008).
158. A. Wisniewska, Y. Nishimoto, J. S. Hyde, A. Kusumi, in W. K. Subczynski, "Depth dependence of the
perturbing effect of placing a bulky group (oxazolidine ring spin labels) in the membrane on the
membrane phase transition," Biochim. Biophys. Acta 1278, 68–72 (1996).
159. E. Perochon, A. Lopez, in J. F. Tocanne, "Polarity of lipid bilayers. A fluorescence investigation,"
Biochemistry (Mosc.) 31, 7672–7682 (1992).
160. G. Titelman, Random House Dictionary of Popular Proverbs & Sayings (Random House, 1996).
161. O. Svelto in D. C. Hanna, Principles of Lasers (Springer, 2010).
162. Y. Liu, D. K. Cheng, G. J. Sonek, M. W. Berns, C. F. Chapman, in B. J. Tromberg, "Evidence for
localized cell heating induced by infrared optical tweezers.," Biophys. J. 68, 2137–2144 (1995).
163. J. H. Lienhard, A Heat Transfer Textbook (Prentice-Hall, 1987).
124
Življenjepis
Datum in kraj rojstva
27. 11. 1985, Ljubljana
Zaposlitev
2012–
Institut »Jožef Stefan« (Mladi raziskovalec ARRS) - Višji asistent
2009–2012
Institut »Jožef Stefan« (Mladi raziskovalec ARRS) - Asistent
Izobrazba
2004–2009
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za matematiko in fiziko
smer: univerzitetni študij Fizika, naravoslovna smer
naziv: univerzitetni diplomirani fizik
2000–2004
Gimnazija Bežigrad, Ljubljana
1992–2000
Osnovna šola narodnega heroja Maksa Pečarja, Ljubljana-Črnuče
Dodatna izobraževanja v tujini
2011
FEBS/EMBO Advanced Lecture Course – Biomembrane Dynamics: From
Molecules to Cells (Cargèse, Francija)
2011
XIII. Annual Linz Winter School and Workshop: Advances in Single
Molecule Research for Biology & Nanoscience (Linz, Avstrija)
2010
EBSA Biophysics Course on: Membrane Biophysics & Lipid/Protein
Interaction (Bordeaux-Arcachon, Francija)
2010
Enotedenski delovni obisk na Inštitutu za biofiziko in nanosisteme – IBN
(Gradec, Avstrija)
2007
European Summer University – Physics in Living Matter (Strasbourg,
Francija)
Priznanja in nagrade
2009
Fakultetna Prešernova nagrada za diplomsko delo
2004
Zlati maturant
125
Metode raziskovanja
Fluorescenčna mikrospektroskopija (FMS), konfokalna fluorescenčna mikroskopija
(CFM), fluorescenčna in UV-VIS spektroskopija, optična pinceta, elektronska
paramagnetna resonanca (EPR), ozko- in širokokotno sipanje rentgenskih žarkov
(SWAXS), dinamična kalorimetrija (DSC), mikroskopija na atomsko silo (AFM), priprava
liposomov, matematično modeliranje
Področja raziskovanja
2010–
Razvoj FMS za raziskovanje biomembranskih faz in domen
(doktorsko delo)
2010–
Biokompatibilnost nosilcev umetnih tkiv
(sodelovanje s Centrom odličnosti NAMASTE in podjetjem Educell d. o. o.)
2011–2013
Fluorescenčno merjenje temperature mikrometrskih mehurčkov pri vrenju
(sodelovanje s Fakulteto za strojništvo, Univerza v Ljubljani)
2011–2012
Raziskovanje zgradbe dentina z EPR in modeliranjem
(sodelovanje z Veterinarsko fakulteto, Univerza v Ljubljani)
2011–2012
Modeliranje difuzije toplote in vlage v pasivnih hišah
(sodelovanje s podjetjem Ekoprodukt d. o. o.)
2010–2012
Raziskovanje nanoreologije morskih gelov z EPR in modeliranjem
(sodelovanje z Institutom Ruđer Bošković, Zagreb, Hrvaška)
2007–2009
Raziskovanje intrinzično neurejenih proteinov z mestno usmerjenim
spinskim označevanjem in EPR (SDSL-EPR)
(sodelovanje z Univerzo Aix-Marseille, Francija)
2006–2010
Raziskovanje modelnih biomembran s spinskimi označevalci in EPR
(diplomsko delo)
126
Življenjepis
Osebna COBISS bibliografija
Izvirni znanstveni članek
URBANČIČ, Iztok, ARSOV, Zoran, LJUBETIČ, Ajasja, BIGLINO, Daniele, ŠTRANCAR, Janez.
Bleaching-corrected fluorescence microspectroscopy with nanometer peak position resolution. Opt. express,
2013, vol. 21, no. 21, str. 25291-25306, doi:10.1364/OE.21.025291. [COBISS.SI-ID 27156007]
URBANČIČ, Iztok, LJUBETIČ, Ajasja, ARSOV, Zoran, ŠTRANCAR, Janez. Coexistence of probe
conformations in lipid phases : a polarized fluorescence microspectroscopy study. Biophys. j., 2013, vol. 105,
no. 4, str. 919-927, doi: 10.1016/j.bpj.2013.07.005. [COBISS.SI-ID 26970919]
ARSOV, Zoran, URBANČIČ, Iztok, GARVAS, Maja, BIGLINO, Daniele, LJUBETIČ, Ajasja, KOKLIČ,
Tilen, ŠTRANCAR, Janez. Fluorescence microspectroscopy as a tool to study mechanism of nanoparticles
delivery into living cancer cells. Biomedical optics express, 2011, vol. 2, no. 8, str. 2083-2095,
doi: 10.1364/BOE.2.002083. [COBISS.SI-ID 24859687]
KAVALENKA, Aleh A., URBANČIČ, Iztok, KURE, Sandra, ŠTRANCAR, Janez. Conformational analysis
of the partially disordered measles virus NTAIL-XD complex by SDSL EPR spectroscopy. Biophys. j., 2010,
vol. 98, no. 6, str. 1055-1064. [COBISS.SI-ID 23487783]
DREVENŠEK OLENIK, Irena, URBANČIČ, Iztok, ČOPIČ, Martin, SOUSA, M. E., CRAWFORD, Gregory
Philip. In-plane switching of holographic polymer-dispersed liquid crystal transmission gratings. Mol. cryst.
liq. cryst. (Phila. Pa. : 2003), 2008, vol. 495, str. 177-185. [COBISS.SI-ID 22395431]
Pregledni znanstveni članek
ŠTRANCAR, Janez, KAVALENKA, Aleh A., URBANČIČ, Iztok, LJUBETIČ, Ajasja, HEMMINGA,
Marcus A. SDSL-ESR-based protein structure characterization. Eur. biophys. j., 2010, vol. 39, no. 4, str. 499511, doi: 10.1007/s00249-009-0510-5. [COBISS.SI-ID 22799655]
Poljudni članek
ARSOV, Zoran, KOKLIČ, Tilen, URBANČIČ, Iztok, ŠTRANCAR, Janez. Sistem za fluoroscenčno
mikrospektroskopijo na Odseku za fiziko trdne snovi. Novice - IJS (Tisk. izd.). [Tiskana izd.], sep. 2008, št.
139. [COBISS.SI-ID 22064167]
Objavljeni znanstveni prispevek na konferenci
SEDMAK, Ivan, URBANČIČ, Iztok, ŠTRANCAR, Janez, AIGOUY, Lionel, MORTIER, Michel,
GOLOBIČ, Iztok. Towards high spatial resolution and non-invasive thermometry. V: GOLOBIČ, Iztok (ur.),
CIMERMAN, Franc (ur.). Development and implementation of enhanced technologies 2011 : proceedings of
the 3rd AMES International Conference, Ljubljana, Slovenia, November 29th-30th, 2011. 1st ed. Ljubljana:
Association of Mechanical Engineers of Slovenia - AMES, 2011, str. 59-66. [COBISS.SI-ID 12102683]
Objavljeni povzetek znanstvenega prispevka na konferenci
URBANČIČ, Iztok, LJUBETIČ, Ajasja, ARSOV, Zoran, ŠTRANCAR, Janez. Fluorescence
microspectroscopy - a promising tool for membrane domain characterization. V: 7th Christmas Biophysics
Workshop, XBW 2012, 17.-18.12.2012, Riegersburg, Austria. Book of abstracts. [S. l.: s. n.], 2012, str. 14.
[COBISS.SI-ID 26362663]
ARSOV, Zoran, URBANČIČ, Iztok, GARVAS, Maja, BIGLINO, Daniele, LJUBETIČ, Ajasja, PODLIPEC,
Rok, KOKLIČ, Tilen, ŠTRANCAR, Janez. Confocal fluorescence microspectroscopy : powerful biophysical
tool to resolve molecular environment. V: ZAKRZEWSKA, Joanna (ur.), ŽIVIĆ, Miroslav (ur.), ANDJUS,
Pavle (ur.). Regional Biophysics Conference 2012, Kladovo-Beograd, Serbia, September 03-07, 2012.Book
of abstracts. Beograd: Društvo biofizičara Srbije, 2012, str. 41. [COBISS.SI-ID 26065191]
URBANČIČ, Iztok, ŠTRANCAR, Janez. Membrane domain structure and its response to external stimuli. V:
XIII. Annual Linz Winter Workshop, February 4-7, 2011, Linz Austria. Advances in single-molecule
research for biology & nanoscience. Linz: Johannes Kepler University, Institut for Biophysics, 2011, str. 510. [COBISS.SI-ID 24504103]
127
GARVAS, Maja, URBANČIČ, Iztok, BIGLINO, Daniele, KOKLIČ, Tilen, ŠTRANCAR, Janez. New
method of detection of nanoparticles. V: XIII. Annual Linz Winter Workshop, February 4-7, 2011, Linz
Austria. Advances in single-molecule research for biology & nanoscience. Linz: Johannes Kepler University,
Institut for Biophysics, 2011, str. 18. [COBISS.SI-ID 24503591]
URBANČIČ, Iztok, ŠTRANCAR, Janez. Membrane domain structure and its response to external stimuli.
V: Biomembrane dynamics: from molecules to cells : FEBS/EMBO advanced lecture course, June 20-30,
2011, Cargèse, Corsica, France. Cargèse: Institut d'Etudes Scientifiques, 2011, str. 130. [COBISS.SIID 24896551]
BIGLINO, Daniele, ARSOV, Zoran, URBANČIČ, Iztok, KOKLIČ, Tilen, ŠTRANCAR, Janez. Spinningdisk confocal fluorescence microscopy : instrumental setup and features : [presented at 8th EBSA European
Biophysics Congress, August 23rd-27th 2011, Budapest, Hungary]. Eur. biophys. j., 2011, vol. 40, suppl. 1,
str. S123. [COBISS.SI-ID 24995367]
ARSOV, Zoran, URBANČIČ, Iztok, GARVAS, Maja, BIGLINO, Daniele, LJUBETIČ, Ajasja, KOKLIČ,
Tilen, ŠTRANCAR, Janez. Use of fluorescence microspectroscopy to study nanoparticles delivery into living
cancer cells : [presented at 8th EBSA European Biophysics Congress, August 23rd-27th 2011, Budapest,
Hungary]. Eur. biophys. j., 2011, vol. 40, suppl. 1, str. S147. [COBISS.SI-ID 24994343]
URBANČIČ, Iztok, ŠTRANCAR, Janez. What do reflect motional patterns of the amphiphilic spin probe in
a lipid bilayer?. V: RBC 2010, Regional biophysics conference, 15-18 September 2010, Primošten,
Croatia. Book of abstracts : RBC 2010. [S. l.: s. n.], 2010, str. 45. [COBISS.SI-ID 23943463]
URBANČIČ, Iztok, ŠTRANCAR, Janez. Membrane domain structure response to external stimuli.
V: Membrane biophysics & lipid/protein interaction : [First] EBSA Biophysics Course, 6th-11th June 2010,
Bordeaux-Arcachon, France. [S. l.]: EBSA, 2010, str. 10. [COBISS.SI-ID23756327]
URBANČIČ, Iztok. Infrardeče tehnologije. V: RAZPET, Nada (ur.). Strokovno srečanje in 62. občni zbor,
Portorož, 5.-6. 11. 2010. Ljubljana: DMFA - založništvo, 2010, str. 61-62. [COBISS.SI-ID 24160807]
ŠTRANCAR, Janez, URBANČIČ, Iztok, KOKLIČ, Tilen, GORGIEVA, Selestina, KOKOL, Vanja.
Fluorescence microspectroscopy - a tool for scaffold-cell interactions investigation. V: COST Action 868
(COST Domain Food and Agriculture), September 2nd-3rd, 2010, Crete, Greece.Understanding polymer
(bio)functionalisation at the nanoscale. [S. l.: s. n.], 2010, [1] str. [COBISS.SI-ID 14483734]
URBANČIČ, Iztok, LJUBETIČ, Ajasja, NEMEC, Marjanca, SVETLIČIĆ, Vesna, ŠTRANCAR, Janez.
Determining nanorheology of gels with EPR. V: 5th Christmas Biophysics Workshop, December 10-11,
2010, Ptuj, Slovenia. XBW 2010. [S. l.: s. n.], 2010, str. 11. [COBISS.SI-ID24326439]
URBANČIČ, Iztok, ŠTRANCAR, Janez. Kaj odražajo gibalni vzorci spinskih označevalcev v lipidnih
membranah?. V: HUMAR, Matjaž (ur.), ŠKARABOT, Miha (ur.). 7. konferenca fizikov v osnovnih
raziskavah, Portorož 2010. Zbornik povzetkov. Ljubljana: DMFA - založništvo, 2010, str. 73. [COBISS.SIID 24143399]
KAVALENKA, Oleg, URBANČIČ, Iztok, BELLE, Valerie, ROUGER, Sabrina, COSTANZO, Stéphanie,
KURE, Sandra, FOURNEL, André, LONGHI, Sonia, GUIGLIARELLI, Bruno, ŠTRANCAR, Janez. SDSL
EPR coupled to conformational space modeling - accessing NTAIL-XD protein complex structure.
V: Regional biophysics conference 2009 : February 10-14, 2009, Linz, Austria : programme and abstract
book. [S.l.: s.n.], 2009, str. 113. [COBISS.SI-ID 22515495]
URBANČIČ, Iztok, ŠTRANCAR, Janez. High-throughput spin label EPR spetra analysis reveals biased
reporting. V: XBW 2009, 4th Christmas Biophysics Workshop, December 14-15,2009, Leibnitz,
Austria. Soft matter meets biological physics : book of abstracts. [S. l.: s. n.], 2009, str. 12. [COBISS.SIID 23755559]
BIGLINO, Daniele, ARSOV, Zoran, KOKLIČ, Tilen, URBANČIČ, Iztok, ŠTRANCAR, Janez. Confocal
fluorescence microspectroscopy : acquiring spectra from a specific volume element. V: XBW 2009, 4th
Christmas Biophysics Workshop, December 14-15,2009, Leibnitz, Austria. Soft matter meets biological
physics : book of abstracts. [S. l.: s. n.], 2009, str. 17. [COBISS.SI-ID 23556391]
GARVAS, Maja, KURE, Sandra, URBANČIČ, Iztok, KOKLIČ, Tilen, ARSOV, Zoran, BIGLINO, Daniele,
ŠENTJURC, Marjeta, ŠTRANCAR, Janez. Searching the interactions of nanoparticles and biological
systems. V: PIFAT-MRZLJAK, Greta (ur.), ZAHRADKA, Ksenija (ur.). Tenth International Summer School
of Biophysics, September 19 - October 1, 2009, Rovinj, Croatia. Supramolecular structure and function :
128
Življenjepis
book of abstracts. Zagreb: The Croatian Biophysical Society, Ruđer Bošković Institute, 2009, str. 102.
URBANČIČ, Iztok, ŠTRANCAR, Janez. Comparison of motional patterns of various spin-labels-biased
reporting. V: International COST P15 action meeting on advanced paramagnetic resonance methods in
molecular biophysics, 4th joint Working Group Meeting and 5th Management Committee Meeting, Siena,
[Italy], 24-26 September, 2008. Book of abstracts. Siena: Bruker, 2008. [COBISS.SI-ID 23756583]
URBANČIČ, Iztok, ZIDAR, Nace, ŠTRANCAR, Janez. Comparison of motional patterns detected in various
membranes and with different spin labels = Primerjava detekcije vzorcev rotacijskih gibanj v različnih
membranah in z različnimi spinskimi označevalci. V: BAVCON KRALJ, Mojca (ur.), TREBŠE, Polonca
(ur.). 15th International Symposium Spectroscopy in Theory and Practice = 15. mednarodni simpozij
Spektroskopija v teoriji in praksi, Nova Gorica, Slovenija, 18.-21. april 2007. Book of abstracts. Nova
Gorica: Univerza, 2007, str. 54. [COBISS.SI-ID 22679513]
DREVENŠEK OLENIK, Irena, URBANČIČ, Iztok, ČOPIČ, Martin, SOUSA, M. E., CRAWFORD, Gregory
Philip. In-plane switching of holographic polymer-dispersed liquid crystal transmission gratings. V: ECLC
2007,9th European Conference on Liquid Crystals, Lisbon, Portugal, July 2-6, 2007. [Book of abstracts].
Lisboa: Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciěncias e Technologia, 2007. [COBISS.SIID 20871207]
Objavljeni povzetek strokovnega prispevka na konferenci
KAVALENKA, Oleg, URBANČIČ, Iztok, BELLE, Valerie, ROUGER, Sabrina, COSTANZO, Stéphanie,
KURE, Sandra, FOURNEL, André, LONGHI, Sonia, GUIGLIARELLI, Bruno, ŠTRANCAR, Janez.
Konformacijski prostori stranskih verig aminokislin in strukura proteinov. V: HUMAR, Matjaž (ur.),
ŠKARABOT, Miha (ur.), CONRADI, Marjetka (ur.). 6. konferenca fizikov v osnovnih raziskavah,
Podčetrtek, 7. november 2008. Zbornik povzetkov. Ljubljana: DMFA - založništvo, 2008, str. 17.
Prispevek na konferenci brez natisa
GORGIEVA, Selestina, URBANČIČ, Iztok, GARVAS, Maja, ŠTRANCAR, Janez, KOKOL, Vanja.
Interactions between cells and 3D engineered gelatin-based scaffolds : lecture, presented at the ESF-EMBO
Conference on Biological Surfaces and Interfaces, 26 June-1 July 2011, Sant Feliu, Spain. Sant Feliu, Spain,
2011. [COBISS.SI-ID 15125526]
GORGIEVA, Selestina, URBANČIČ, Iztok, GARVAS, Maja, ŠTRANCAR, Janez, KOKOL, Vanja.
Interference of the experiments - how to optimize the scaffold properties in a reasonable way : lecture,
presented at the workshop Exploring Cell-Material Interaction, tourist farm of Kosmina family in the village
Brje near Komen, 15th of November 2010. Komen, 2010. [COBISS.SI-ID 14912534]
Diplomsko delo
URBANČIČ, Iztok. Neidealnost spinskih označevalcev: diplomsko delo. Ljubljana: [I. Urbančič], 2009. 67
str., graf. prikazi. [COBISS.SI-ID 2172004]
129
UNIVERZA V MARIBORU
Fakulteta za naravoslovje in matematiko
IZJAVA DOKTORSKEGA KANDIDATA
Podpisani Iztok Urbančič, vpisna številka N3000188
izjavljam,
da je doktorska disertacija z naslovom Odziv biomembranskih domen na zunanje
dražljaje

rezultat lastnega raziskovalnega dela,

da predložena disertacija v celoti ali v delih ni bila predložena za pridobitev
kakršnekoli izobrazbe po študijskem programu druge fakultete ali univerze,

da so rezultati korektno navedeni in

da nisem kršil-a avtorskih pravic in intelektualne lastnine drugih.
Podpis doktorskega kandidata
V Ljubljani, dne 17. decembra 2013.
131

ODZIV BIOMEMBRANSKIH DOMEN NA ZUNANJE DRAŽLJAJE

Transcription

Similar documents

Fluorescenčna mikrospektroskopija (FMS) - lokalizacija

Kako koristne so lahko hidrometrične meritve?

Tehnični list

Sintofoil - Zelena membrana za zelene strehe (april 2010)

revija žit o elektroporaciji (2011)

Farmacevtski vestnik - Slovensko farmacevtsko društvo

Firestone hidroizolacije ravnih streh

Raziskave vpliva lokalne geolo{ke zgradbe na potresno

preuzmite pun tekst