Postavitev laboratorijskega sistema za ramansko mikroskopijo

Postavitev laboratorijskega sistema za ramansko mikroskopijo

UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA MATEMATIKO IN FIZIKO
ODDELEK ZA FIZIKO
ˇ
PEDAGOSKA
SMER
Grega Celcar
Postavitev laboratorijskega sistema za
ramansko mikroskopijo
Diplomsko delo
Mentor: izr. prof. dr. Boris Majaron
Somentor: dr. Zoran Arsov
Ljubljana, maj 2014
Povzetek
Pogosto nas zanimajo fizikalne in kemijske lastnosti razliˇcnih vzorcev. Prouˇcujemo jih lahko na razliˇcne naˇcine, ena od primernih eksperimentalnih metod
pa je ramanska spektroskopija. Z opazovanjem spektra Ramanovega sipanja lahko ugotovimo prisotne nihajne naˇcine molekulskih struktur, kar nam
da podatke o kemijski sestavi vzorcev ter o medmolekulskih interakcijah.
Pomanjkljivost spektroskopskega pristopa je v tem, da merimo povpreˇcne lastnosti po celem vzorcu. Eden od naˇcinov dobivanja informacij o lokalnih lastnostih vzorca je sklopitev spektroskopije z mikroskopijo. Zdruˇzena metoda
mikrospektroskopije nam omogoˇca, da dobimo sliko vzorca, kjer kontrast
slike doloˇcajo lokalne spektroskopske lastnosti opazovanega vzorca. Namen
diplomskega dela je bila postavitev laboratorijskega sistema za ramansko mikroskopijo ter predstavitev koncepta mikrospektroskopije. Sistem smo najprej preizkusili z opazovanjem spektrov standardnih topil organskih snovi,
ki smo jih primerjali s priˇcakovanimi spektri. Nato pa smo funkcionalnost
sistema potrdili z mikrospektroskopskim slikanjem. Za primerjavo smo uporabili tudi komercialni sistem za ramansko mikroskopijo. Na koncu diplome
je podan ˇse kratek pedagoˇski model, s katerim bi lahko Ramanovo sipanje
vkljuˇcili v gimnazijski pouk fizike.
Kljuˇ
cne besede: Ramanska spektroskopija, Ramanovo sipanje, ramanski
spekter.
Abstract
We are often interested in physical and chemical characteristics of different
samples. We can study them in different ways. One of possible experimental
techniques is Raman spectroscopy. While observing spectrum of the Raman scattering, we are able to detect different vibrations in the molecular
structure. This can give us information about composition of samples and
intermolecular interactions. A disadvantage of the spectroscopic approach is
the measurement of average characteristics in the whole sample area. One
of the ways to get information of a specific area in the sample is to couple
spectroscopy with microscopy. With the help of microspectroscopy we can
get an image of a sample, where the contrast of the image is determined by
1
the local spectroscopic characteristics of the observed sample. The aim of
this work was to introduce the concept of microspectroscopy and to build
the laboratory system for Raman microscopy. Firstly, we observed spectra of
standard organic compounds, which we compared with the expected spectra.
Secondly, the functionality of the system was confirmed with the microspectroscopical imaging. For comparison, we also used a commercial system for
the Raman microscopy. Finally, a short teaching model of Raman scattering
is described that could be used in the grammar school physics classes.
Keywords: Raman spectroscopy, Raman scattering, Raman spectrum.
PACS: 01.40.ek, 33.20.Fb, 87.64.kp
2
Kazalo
1 Uvod
5
2 Zgodovina
6
3 Osnove
9
3.1
Prostostne stopnje molekule . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
3.2
Klasiˇcen opis Ramanovega sipanja . . . . . . . . . . . . . . . . 10
3.3
Kvantni opis Ramanovega sipanja . . . . . . . . . . . . . . . . 14
3.4
Razlaga spektrov . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
3.5
Prikaz nekaterih spektrov
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
4 Sestavni deli laboratorijskega sistema za ramansko mikroskopijo
24
4.1
Laserski izvor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
4.2
Osnovna shema postavitve . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
4.3
Uklonski spektrometer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
4.4
Detektor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
5 Postavitev laboratorijskega sistema za ramansko mikroskopijo
31
5.1
Opis in lastnosti sestavnih delov . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
5.2
Postavitev sestavnih delov in optiˇcnih komponent . . . . . . . 38
5.3
Izraˇcun postavitve leˇc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
5.4
Ustrezna postavitev in zasuk spektrometra . . . . . . . . . . . 43
3
6 Primeri slikanja z laboratorijskim sistemom za ramansko mikroskopijo
45
6.1
Ramanska spektroskopija standardnih topil . . . . . . . . . . . 45
6.2
Slikanje s sistemom za ramansko mikroskopijo . . . . . . . . . 47
6.3
Primerjava s komercialnim sistemom za ramansko mikroskopijo 51
7 Pedagoˇ
ski model Ramanovega sipanja
55
8 Zakljuˇ
cek
62
4
1
Uvod
Ramanska spektroskopija meri vibracijska stanja molekule. To pomeni, da
je ramanska spektroskopija podzvrst t. i. vibracijske spektroskopije. Osnova
ramanske spektroskopije je Ramanovo sipanje svetlobe na vzorcu. Z opazovanjem spektra sipane svetlobe, lahko doloˇcimo posamezne karakteristike oziroma kemijsko sestavo opazovanega materiala [1]. Glavna prednost ramanske
spektroskopije je njena enostavnost, saj ni potrebna posebna priprava vzorcev. Poleg tega gre za nedestruktivno tehniko. To pomeni, da lahko vzorec
uporabimo veˇckrat, ne da bi pri tem spremenili lastnosti vzorca [2].
Ramanska spektroskopija se veliko uporablja v kemijskem in fizikalnem laboratoriju. Vendar se zahvaljujoˇc tehnoloˇskemu napredku ramanska spektroskopija ˇsiri tudi na druga znanstvena podroˇcja, kot so farmacija, sodna
medicina, geologija, metalurgija, biokemija, nanotehnologija itd. V biomedicini se na primer uporablja za doloˇcanje rakastih in drugih bolezni pri ˇcloveku
in ˇzivalih. Prav tako se NASA ukvarja z izdelavo ramanskega spektrometra,
ki bi ga poslali na Luno in Mars z namenom analize kamnin in tal [3].
Za pridobivanja informacij o lokalnih lastnostih vzorca ter slikanje, kjer kontrast slike doloˇcajo spektroskopske lastnosti opazovanega vzorca, lahko uporabimo ramansko mikroskopijo. Pri ramanski mikroskopiji gre za sklopitev
spektroskopije z mikroskopijo.
Namen diplomskega dela je bila postavitev laboratorijskega sistema za ramansko mikroskopijo. Na zaˇcetku smo se ukvarjali z ustrezno postavitvijo
optiˇcnih elementov. Potem smo za referenco opazovali tipiˇcne organske
vzorce, ki imajo znaˇcile ramanske spektre. Te vzorce smo torej izbrali zato,
ker nam lahko sluˇzijo kot primerjalni sistem. Ramanski mikroskop namreˇc
ˇzelimo uporabljati za slikanje vzorcev na osnovi lipidnih, proteinskih in drugih organskih molekul, npr. za slikanje modelnih in bioloˇskih lipidnih membran. Da bi potrdili ustrezno delovanje sistema, smo izmerjene spektre izbranih topil primerjali s priˇcakovanimi spektri. Kasneje nas je tudi zanimalo, ali
je z naˇsim sistemom moˇzno posneti mikrospektroskopsko sliko. Na koncu smo
za primerjavo posneli spektre in mikrospektroskopsko sliko izbranih vzorcev
tudi na komercialnem sistemu za ramansko mikroskopijo.
5
2
Zgodovina
”Profesor Compton je opazoval dve vrsti sipanja rentgenske svetlobe. Prva izmed teh je bilo nespremenjeno sipanje, ki ustreza
normalnim stanjem molekul in atomov, medtem ko druga ustreza
spremenjenemu sipanju rentgenske svetlobe in ustreza fluktuacijam med stanji atomov. Zato lahko upraviˇceno priˇcakujemo, da
bomo ti dve sipanji opazili tudi pri vidni svetlobi. Prva bo rezultat zaradi optiˇcnih lastnosti atomov in molekul, medtem ko
bo druga posledica prehoda iz osnovnega oziroma normalnega
stanja. Eksperiment, ki sva ga naredila s K. S. Krishnanom, je
potrdil najina priˇcakovanja. Rezultat je pokazal, da se svetloba
na molekulah v ˇcisti tekoˇcini in plinu siplje tako, da dobimo poleg
elastiˇcnega sipanja tudi neelastiˇcno sipanje.”(Prevedeno po [4]).
Tako se je leta 1928 glasil zaˇcetek ˇclanka indijskega fizika Sira Chandrasekharja Venkate Ramana (slika 1) in njegovega ˇstudenta K. S. Krishnana. V
tem ˇclanku sta objavila svojo ugotovitev glede neelastiˇcnega sipanja. Teoretiˇcno zasnovo je sicer ˇze leta 1923 postavil avstrijski fizik A. Smekal, vendar
vse do leta 1928, z izjemo Comptonovega sipanja iz leta 1923, ni bilo nobene
eksperimentalne potrditve o neelastiˇcnem sipanju [5].
Slika 1: Indijski fizik Sir Chandrasekhar Venkata Raman (1888-1970) [6].
Raman je pri svojem odkritju uporabil teleskop, skozi katerega je usmeril
snop bele svetlobe [4]. Za teleskopom je postavil dva razliˇcna filtra, med
katera je postavil vzorec, kot prikazuje slika 2.
6
Slika 2: Model eksperimenta, ki ga je izvedel Raman. Vijoliˇcni filter prepuˇsˇca
svetlobo vijoliˇcne barve, ostalo svetlobo pa absorbira. Svetloba vijoliˇcne
barve vpada na vzorec, na katerem se siplje elastiˇcno in neelastiˇcno. Povzeto
po [7].
Na sliki 2 je razvidno, da vijoliˇcni filter prepuˇsˇca le vijoliˇcno svetlobo. Vijoliˇcna svetloba se na vzorcu sipa elastiˇcno in neelastiˇcno. Pri elastiˇcnem
oziroma Rayleighjevem sipanju ima svetloba enako valovno dolˇzino kot vpadna svetloba. Drugi del sipane svetlobe ustreza neelastiˇcnemu sipanju. Valovna dolˇzina sipane svetlobe je razliˇcna od valovne dolˇzine vpadle svetlobe.
Raman je neelastiˇcno sipanje opazoval tako, da je za vzorcem postavil zelen
filter. Pri tem je Raman opazoval pribliˇzno 60 razliˇcnih tekoˇcin. Pri vseh
tekoˇcinah je priˇslo do neelastiˇcnega sipanja [7]. Za svoje delo je C. V. Raman leta 1930 dobil Nobelovo nagrado za fiziko. Takˇsno neelastiˇcno sipanje
se imenuje Ramanovo sipanje [5].
Kljub zaˇcetnemu navduˇsenju se je med 30-imi in 60-imi leti 20. stoletja
z ramansko sprektroskopijo ukvarjala le peˇsˇcica ljudi. Glavni razlog je bilo
teˇzavno merjenje ramanskega signala, ki je ˇsibak. Najveˇcji razvoj je ramanska
spektroskopija doˇzivela ˇsele v 60-ih letih 20. stoletja, ko je ameriˇski fizik T.
Maiman razvil prvi laser. Laser namreˇc oddaja zelo moˇcno monokromatsko
(enobarvno) svetlobo, ki je idealna za eksperimente povezane z Ramanovim
sipanjem [5].
V 70-ih letih se je v Lillu, Franciji, pod vodstvom M. Delhayeja zaˇcela razvijati ramanska mikroskopija, ki so jo poimenovali MOLE (Molecular Op7
tics Laser Examiner). Z razvojem holografskih uklonskih mreˇzic, laserjev,
veˇckanalnih detektorjev in CCD kamer je bilo v 90-ih letih mogoˇce zgraditi
ramanski mikroskop v obliki ene aparature. Ramanski mikroskop omogoˇca
analizo mikroskopskih vzorcev ali mikroskopsko podroˇcje veˇcjih vzorcev [8].
8
3
3.1
Osnove
Prostostne stopnje molekule
ˇ ˇzelimo razloˇziti Ramanovo sipanje, je potrebno vpeljati prostostne stoCe
pnje, ki doloˇcajo moˇzne lastne nihajne naˇcine molekule. V sploˇsnem so proˇ imamo v molekuli
stostne stopnje med seboj neodvisne moˇznosti gibanja. Ce
N atomov, imamo v sploˇsnem 3N prostostnih stopenj [9]. Vzemimo molekulo vode, ki je sestavljena iz dveh atomov vodika in enega atoma kisika.
Molekula vode ima 9 prostostnih stopenj. Tri prostostne stopnje ustrezajo
premiku teˇziˇsˇca molekule v smeri x, y in z. Prav tako molekuli vode ustrezajo
tri rotacijske koordinate, ki predstavljajo orientacijo molekule v prostoru [9].
Slika 3a prikazuje ˇse tri prostostne stopnje, ki ustrezajo lastnim nihajnim
naˇcinom molekule vode. Ena prostostna stopnja ustreza simetriˇcnemu raztezanju, druga ustreza asimetriˇcnemu raztezanju in tretja ustreza ravninskemu
upogibanju (striˇzenju) [1].
Po prostorski razporeditvi atomov molekulo vode uvrˇsˇcamo med molekule,
ki niso linearne. V sploˇsnem je ˇstevilo lastnih nihajnih naˇcinov 3N -6 v molekuli, ki ni linearna. Za linearno molekulo ustreza lastnim nihajnim naˇcinom
molekuke 3N -5 prostostnih stopenj. Slika 3b prikazuje linearno molekulo
(CO2 ), za katero so znaˇcilni ˇstirje lastni nihajni naˇcini. Prva prostostna stopnja ustreza vzdolˇznemu simetriˇcnemu raztezanju, druga ustreza vzdolˇznemu
asimetriˇcnemu raztezanju, medtem ko tretja in ˇcetrta ustrezata ravninskemu
(striˇzenju) upogibanju [1].
Za laˇzjo predstavitev molekularnih deformacij si sedaj oglejmo klasiˇcen opis.
9
Slika 3: Prikazani so razliˇcni nihajni naˇcini za a) molekulo vode in za b)
molekulo CO2 . Povzeto po [1].
3.2
Klasiˇ
cen opis Ramanovega sipanja
Predstavljajmo si enostavno dvoatomno molekulo, ki jo prikazuje slika 4.
Slika 4: Dvoatomna molekula je sestavljena iz dveh atomov, ki sta povezana
z vezjo [1].
Atoma v molekuli sta povezana z vezjo, ki si jo lahko predstavljamo kot vzmet
s koeficientom k. Ko atoma nihata, imata razliˇcni amplitudi, ampak nihata
z enako frekvenco. Klasiˇcno lahko frekvenco nihanja molekule zapiˇsemo z
zvezo
10
1
ν=
2π
r
k(
1
1
+
).
m1 m2
(1)
Iz zveze (1) vidimo, da veˇcji kot je koeficient k vzmeti, veˇcja je frekvenca ν.
ˇ sta atoma v molekuli povezana z dvojno ali trojno vzmetjo, bo koeficient
Ce
vzmeti veˇcji in s tem poslediˇcno frekvenca ν.
Sedaj nas zanima, kako bi lahko fizikalno opisali sipanje svetlobe na nihajoˇci
molekuli. Svetlobo v klasiˇcni fiziki obravnavamo kot elektromagnetno valovanje. Nihajoˇce elektriˇcno polje opiˇsemo z zvezo
E = E0 cos(2πν0 t).
(2)
Svetloba s frekvenco ν0 , ki vpada na molekulo, deformira elektronski oblak
molekule. Vzrok za to je delovanje elektriˇcne sile na delce, ki so v elektriˇcnem polju E, pri ˇcemer elektriˇcna sila deluje na pozitivne delce v smeri
elektriˇcnega polja in na negativne delce v nasprotni smeri elektriˇcnega polja
[10].
Rezultat deformacije elektronskega oblaka je inducirani dipol µind , ki ga
zapiˇsemo z zvezo
µind = αE,
(3)
kjer α predstavlja polarizabilnost molekule.
Polarizabilnost je v sploˇsnem tenzor drugega ranga in je odvisna od simetriˇcnosti molekule. Polarizabilnost v molekuli ni konstantna, saj se zaradi vibracije molekule elektronski oblak ves ˇcas spreminja. Za naˇse potrebe smemo
predpostaviti, da imamo eno molekulo, katere jedra nihajo okoli ravnovesne
lege in se ne vrti. Takrat je polarizabilnost funkcija normalnih koordinat
[11]. Za majhne vibracije lahko polarizabilnost razvijemo v Taylorjevo vrsto
po normalnih koordinatah:
Q
X
∂α
)0 qn + ...
α = α0 +
(
∂q
n
n=1
11
(4)
ˇ gre za majhna nihanja
kjer Q predstavlja ˇstevilo lastnih nihajnih naˇcinov. Ce
jeder, lahko normalne koordinate zapiˇsemo v obliki harmonskega nihanja
qn = qn0 cos(2πνn t),
(5)
kjer qn0 predstavlja amplitudo nihanja in νn frekvenco lastnega nihajnega
naˇcina molekule n. Sedaj lahko zvezi (4) in (5) vstavimo v zvezo (3) in
dobimo
µind
Q
X
∂α
)0 qn0 cos(2πνn t)]E0 cos(2πν0 t).
= [α0 +
(
∂q
n
n=1
(6)
V naslednjem koraku preoblikujemo produkt trigonometriˇcnih funkcij v vsoto
in dobimo
µind = α0 E0 cos(2πν0 t) +
Q
1 X ∂α
(
+
)0 qn0 E0 [cos(2π(ν0 − νn )t) + cos(2π(ν0 + νn )t)]. (7)
2 n=1 ∂qn
Prvi ˇclen na desni strani predstavlja nihanje induciranega dipola z enako
frekvenco kot je frekvenca vpadle svetlobe. Tedaj govorimo o elastiˇcnem
ali Rayleighjevem sipanju. Drugi ˇclen v zvezi (7) je znaˇcilen za Ramanovo
sipanje. Razlika frekvence ν0 − νn predstavlja niˇzjo frekvenco sipanja od
frekvence vpadle svetlobe in jo imenujemo Stokesovo sipanje. Vsota frekvenc
ν0 + νn predstavlja viˇsjo frekvenco sipanja od frekvence vpadle svetlobe in jo
imenujemo anti-Stokesovo sipanje.
∂α
)0 = 0 nimamo Ramanovega sipanja [10].
Iz zveze (7) ˇse opazimo, da za ( ∂q
n
To je torej izbirno pravilo za Ramanovo sipanje. Klasiˇcni opis nam poda
pravilne frekvence ramanskih ˇcrt.
V naslednjem koraku si poglejmo kako je z intenziteto elastiˇcnega in Ramanovega sipanja. Klasiˇcno si lahko predstavljamo, da elektron kroˇzi v atomu
12
okoli jedra s frekvenco ν0 . Takˇsno gibanje ustreza pospeˇsenemu gibanju. Zato
elektron seva elektromagnetno sevanje. Izkaˇze se, da je izsevano elektriˇcno
polje sorazmerno s pospeˇskom elektrona. Pospeˇsek a elektrona predstavlja
drugi odvod dipolnega momenta [12]:
Esev ∝ a =
∂ 2µ
.
∂t2
(8)
Skupna gostota energijskega toka je sorazmerna s kvadratom izsevanega ele2
ktriˇcnega polja Esev
, povpreˇcenega po ˇcasu. Ob upoˇstevanju pogoja (8) je
gostota energijskega toka sorazmerna z ν04 µ2 [12]. Poslediˇcno lahko intenziteto zapiˇsemo, kot prikazuje zveza
I=
ν04 µ2
,
12π0 c3
(9)
ˇ v zvezi (9) dipolni moment
kjer 0 predstavlja influenˇcno konstanto. Ce
nadomestimo z induciranim dipolnim momentom iz zveze (7), ter upoˇstevamo
povpreˇcenje po ˇcasu, dobimo zvezo
B
I = ν04 Acos2 (2πν0 t)+ [(ν0 −νn )4 cos(2π(ν0 −νn )t+(ν0 +νn )4 cos(2π(ν0 +νn )t)].
4
(10)
V zvezi (10) je konstanta A =
α20 E0 2
12π0 c3
q2 E
2
∂α 2 n0 0
in konstanta B = ( ∂q
)
3.
n 0 12π0 c
Iz zveze (10) vidimo, da je intenziteta Rayleighjevega sipanja sorazmerna ν04 ,
intenziteta Stokesovega sipanja z (ν0 − νn )4 in intenziteta anti-Stokesovega
sipanja z (ν0 + νn )4 . Razmerje intezitet anti-Stokesovega in Stokesovega
sipanja lahko zapiˇsemo z zvezo
IAS
(ν0 + νn )4
=
.
IS
(ν0 − νn )4
(11)
Zveza (11) napove, da je intenziteta anti-Stokesovega sipanja veˇcja od intenzitete Stokesovega sipanja, kar pa ne ustreza eksperimentalnim vrednostim
[13]. Da razloˇzimo to odstopanje je potrebno vpeljati kvantno mehaniko.
13
3.3
Kvantni opis Ramanovega sipanja
V kvantni mehaniki svetlobo obravnavamo kot fotone. Vibracijska energija v
kvantni mehaniki ni zvezna, ampak je diskretna spremenljivka. To pomeni,
da molekula lahko prejme ali izgubi le doloˇceno koliˇcino energije, da preide iz
enega energijskega stanja v drugega [9]. V kvantnem opisu lahko uporabimo
harmonski oscilator, kjer je vibracijska energija doloˇcena z zvezo
1
Ev = (v + )hν,
2
(12)
kjer je v = 0, 1, 2... in predstavlja vibracijsko kvantno ˇstevilo.
Pri prehodu iz enega stanja v drugega pride do spremembe vibracijske enerˇ preide molekula iz niˇzjega stanja v viˇsje stanje, se
gije molekule ∆Ev . Ce
energija molekule poveˇca za ∆Ev [9]:
1
1
∆Ev = [(v + 1) + ]hνn − (v + )hνn = hνn .
2
2
(13)
Kadar foton s frekvenco ν0 interagira z molekulo, ga lahko molekula sipa [9].
Pri sipanju molekula najprej preide v viˇsje neobstojeˇce energijsko stanje, ki
ga imenujemo ”virtualno stanje”. Ker gre za prepovedani prehod, molekula
hitro odda (sipa) foton in se vrne najveˇckrat nazaj v osnovno energijsko
stanje [14]. Ta sipani foton ima potem enako frekvenco ν0 kot vpadni foton.
To ustreza elastiˇcnemu ali Rayleighjevem sipanju (slika 5), kjer ni spremembe
vibracijske energije [9].
Lahko se zgodi, da majhen deleˇz molekul ne pade nazaj v osnovno stanje,
ampak zasede viˇsje vibracijsko energijsko stanje. Pri tem se molekuli poveˇca
vibracijska energija za ∆Ev [9]. Ker velja ohranitev energije, lahko to spremembo zapiˇsemo kot
∆Ev = hν0 − hνs ,
14
(14a)
kjer νs predstavlja frekvenco sipanega fotona. Za ∆Ev lahko uporabimo
rezutat iz zveze (13) in dobimo
νs = ν0 − νn .
(14b)
Zveza (14b) ustreza Stokesovemu sipanju, ki je prikazano na sliki 5. Druga
moˇznost je, da je molekula ˇze v vzbujenem vibracijskem stanju pred procesom
ˇ molekula pri sipanju preide iz ”virtualnega stanja”v osnovno
sipanja. Ce
stanje, se vibracijska energija molekule zmanjˇsa za ∆Ev . Ker velja izrek o
ohranitvi energije, lahko postopamo podobno kot v prejˇsnjem primeru, le da
tokrat dobimo
νs = ν0 + νn
(15)
kar ustreza frekvenci sipanega fotona pri anti-Stokesovemu sipanju [11].
Slika 5: Energijski diagram za Rayleighjevo in Ramanovo sipanje.
Ramanski spekter prikaˇzemo kot funkcijo ramanskega premika ∆w. Zvezo
za ramanski premik pri Stokesovemu sipanju definiramo kot
∆w = (
1
1
− ),
λ0 λS
15
(16)
kjer je λ0 vzbujevalna valovna dolˇzina in λS valovna dolˇzina Stokesovega
sipanja. ∆w je obiˇcajno izraˇzena v cm−1 . Ramanski premik za Stokesovo ˇcrto
je nasprotno enak ramanskemu premiku za anti-Stokesovo ˇcrto, kot prikazuje
slika 6.
S pomoˇcjo kvantne mehanike lahko doloˇcimo pravilno intenziteto Stokesovih in anti-Stokesovih ˇcrt. Veˇcina svetlobe se siplje elastiˇcno, medtem ko se
en foton na pribliˇzno 106 -108 fotonov siplje Ramanovo. Poslediˇcno je intenziteta Rayleighjevega sipanja pribliˇzno 106 -108 -krat veˇcja od Ramanovega
sipanja. Na sliki 6 intenziteto Rayleighjevega sipanja predstavlja sredinska ˇcrta. Razmerje ˇstevilske gostote molekul, ki se nahajajo v osnovnem in
v viˇsjem vibracijskem energijskem nivoju podaja Boltzmanova porazdelitev
[13],
hνn
n1
= exp(−
).
n0
kb T
(17)
V zvezi (17) n0 predstavlja ˇstevilsko gostoto molekul v osnovnem vibracijskem stanju, n1 ˇstevilsko gostoto molekul v vzbujenem vibracijskem stanju, T
ˇ zdruˇzimo razmerje intenzitemperaturo in kb Boltzmanovo konstanto [9]. Ce
tet sevanja (10) in Boltzmanovo porazdelitev (17), dobimo pravilno razmerje
intenzitet
IAS
hνn
(ν0 + νn )4
exp(−
).
=
4
IS
(ν0 − νn )
kb T
(18)
1
Ker je kb T ≈ 40
eV, hνn pa je tipiˇcno reda velikosti nekaj desetink eV,
je iz zveze (18) razvidno, da je pri tipiˇcnih ramanskih premikih intenziteta
Stokesovega sipanja praviloma veˇcja od intenzitete anti-Stokesovega sipanja.
Ta trditev se sklada z eksperimentalnimi vrednostmi.
16
Slika 6: Sredinski vrh predstavlja intenziteto Rayleighjevega sipanja. Levo
od sredinskega vrha vidimo Stokesove vrhove, kjer je intenziteta veˇcja od
intenzitete anti-Stokesovih vrhov, ki leˇzijo desno od sredinskega vrha [13].
3.4
Razlaga spektrov
Za razlago ramanskih spektrov so v tabeli 1 prikazani ramanski premiki in
nihajni naˇcini nekaterih najpomembnejˇsih molekulskih skupin za naˇs eksperiment, ki smo jih opazovali v srednjem IR obmoˇcju (λ = 2,5 - 25 µm oziroma
∆w = 400 - 4000 cm−1 ).
Za doloˇcitev nihajnih naˇcinov molekulskih skupin smo si pomagali s sledeˇco
klasifikacijo. Vzdolˇznemu raztezanju ustrezata simetriˇcno in asimetriˇcno raztezanje. Ravninskemu upogibanju ustrezata striˇzenje in zibanje. Neravninskemu upogibanju ustrezata kolebanje in zvijanje.
17
Tabela 1: Izbrane molekulske skupine za naˇs eksperiment. Oznaka za jakost:
m - moˇcna, s - srednja in ˇs - ˇsibka
Molekulska skupina Ramanski premik [cm−1 ] Nihajni naˇ
cin
Metilenska CH2
1430 - 1480 (ˇs-s)
Striˇzenje
2840 - 2870 (m)
Simetriˇcno raztezanje
2900 - 2940 (m)
Asimetriˇcno raztezanje
Metilna CH3
1430 - 1480 (ˇs-s)
Kolebanje
2865 - 2885 (m)
Simetriˇcno raztezanje
2920 - 2975 (m)
Asimetriˇcno raztezanje
Hidroksilna O − H
3000 - 3700 (ˇs)
Simetriˇcno raztezanje
CH
600 - 900 (ˇs-s)
Kolebanje
2980 - 3200 (m)
Simetriˇcno raztezanje
C − OH
750 - 1250 (m)
Asimetriˇcno raztezanje
C−O−C
800 - 1140 (m)
Simetriˇcno raztezanje
Aromatski obroˇc C − C
1580 - 1620 (m)
Simetriˇcno raztezanje
3.5
3.5.1
Prikaz nekaterih spektrov
Etanol
Etanol je predstavnik alkoholov. Njegovo strukturno formulo prikazuje slika
7.
Slika 7: Strukturna formula za etanol [15].
Moˇcne ramanske ˇcrte okrog ∆w = 3000 cm−1 ustrezajo simetriˇcnim raztegom OH skupine. Ramanska ˇcrta pri ∆w = 880 cm−1 ustreza simetriˇcnemu
raztezanju skupine C − C − O. Asimetriˇcnemu raztezanju skupine C − OH
18
ustrezata dvojni ramanski ˇcrti, in sicer pri ∆w = 1023 cm−1 in ∆w = 1078
cm−1 . Ramanska ˇcrta pri ∆w = 1456 cm−1 ustreza kolebanju metilne skupine
CH3 [1].
Slika 8: Spekter etanola [16].
3.5.2
Toluen
Toluen je predstavnik aromatskih ogljikovodikov. Slika 9 prikazuje sestavo
toluena. Vidimo, da ga sestavlja aromatski obroˇc, na katerega je vezana
metilna skupina CH3 .
Spekter toluena je prikazan na sliki 10. Srednje moˇcne ramanske ˇcrte pri
∆w = 3056 cm−1 ustrezajo simetriˇcnim raztezanjem skupine CH. Dvojni ramanski ˇcrti pri ∆w = 1032 cm−1 ustrezata striˇzenju aromatskega obroˇca.
Ramanska ˇcrta pri ∆w = 1005 cm−1 ustreza kolebanju aromatskega obroˇca.
Srednje moˇcna ramanska ˇcrta pri ∆w = 787 cm−1 ustreza kolebanju skupin
ˇ
CH. Sibka
ramanska ˇcrta pri ∆w = 623 cm−1 predstavlja kolebanje aromatskega obroˇca. Prisotnost metilne skupine CH3 prikazuje ramanska ˇcrta pri
∆w = 2921 cm−1 , ki predstavlja asimetriˇcno raztezanje. Prav tako prisotnost
19
Slika 9: Strukturna formula toluena [17].
metilne skupine predstavljata zelo ˇsibki ramanski ˇcrti pri ∆w = 1400 cm−1 .
ˇ
Nihajni naˇcin pri teh dveh ramanskih ˇcrtah ustreza kolebanju CH3 . Sibka
−1
ramanska ˇcrta pri ∆w = 1606 cm je posledica simetriˇcnega raztezanja
aromatskega kvarteta [1].
Na sliki 10 in na sliki 12, spodnja spektra prikazujeta ramanski spekter,
medtem ko zgornja spektra prikazujeta IR spekter. Pri ramanskem spektru vrhovi predstavljajo intenziteto sipane svetlobe. Pri IR spektroskopiji je
osnova absorpcija fotona na ustreznih molekulskih skupinah, kar prikazujejo
doline v transmisijskem spektru. Veˇcja kot je absorpcija, manjˇsa je prepustnost. Do absorpcije pride takrat, kadar pri prehodu med vibracijskimi
stanji pride do spremembe dipolnega momenta molekule. To je izbirno pravilo za absorpcijo infrardeˇce svetlobe. Ker izbirni pravili za procesa sipanja
in absorpcije nista enaki, sta ramanska in IR spektroskopija komplementarni
metodi.
3.5.3
Cikloheksan
Strukturno formulo za cikloheksan prikazuje slika 11. Opazimo, da je molekula cikloheksana sestavljena iz 6 atomov ogljika in 12 atomov vodika.
Cikloheksan je predstavnik alkanov, saj so vse vezi v molekuli enojne.
Slika 12 predstavlja ramanski spekter, na katerem vidimo, da ima cikloheksan
pri ramanskem premiku okrog 2900 cm−1 dva vrhova. Ta vrhova ustrezata
20
Slika 10: Spekter toluena [1].
Slika 11: Strukturna formula cikloheksana [18].
metilenski skupini CH2 , kjer levi viˇsji vrh predstavlja simetriˇcno raztezanje
molekule, medtem ko desni niˇzji vrh predstavlja asimetriˇcno raztezanje molekule. Vrh pri ∆w = 1445 cm−1 prikazuje srednje moˇcno ramansko ˇcrto, ki
ustreza striˇzenju metilena. Simetriˇcno raztezanje aromatskega obroˇca predstavlja moˇcna ramanska ˇcrta pri ∆w = 802 cm−1 .
21
Slika 12: Spekter cikloheksana [1].
3.5.4
Polistiren
Stireni se lahko s polimerizacijo veˇzejo v verige polistirena. Slika 13 prikazuje
strukturo stirena in polistirena. Skupine CH − CH2 so v polistirenu povezane
z enojno vezjo.
Slika 13: Strukturna formula polistirena [22].
Na sliki 14 je prikazan spekter polistirena. Srednje moˇcna ramanska ˇcrta
pri ∆w = 3054 cm−1 in ˇsibka ramanska ˇcrta pri ∆w = 1155 cm−1 ustrezata
olefinski skupini. Za prvo je znaˇcilno simetriˇcno raztezanje skupine CH, medtem ko je za drugo znaˇcilno kolebanje skupine CH. Metilenski skupini CH2
ustreza simetriˇcno raztezanje pri ∆w = 2852 cm−1 in asimetriˇcno raztezanje
22
pri ∆w = 2904 cm−1 . Simetriˇcnemu raztezanju aromatskega obroˇca ustreza
ˇ
moˇcna ramanska ˇcrta pri ∆w = 1001 cm−1 . Sibka
ramanska ˇcrta pri ∆w =
−1
795 cm ustreza kolebanju skupine HC = CH v aromatskem obroˇcu [1].
Slika 14: Spekter polistirena [20].
23
4
Sestavni deli laboratorijskega sistema za ramansko mikroskopijo
Ramanski mikrospektrometer predstavlja sklopitev optiˇcnega mikroskopa in
spektrometra. Sestava teh dveh komponent nam omogoˇca zajem slike, ki
odraˇza vibracijske lastnosti opazovanega vzorca v posamezni toˇcki [14]. Iz
vsake toˇcke vzorca namreˇc zajamemo svoj ramanski spekter.
4.1
Laserski izvor
Starejˇsi sistemi ramanskih spektrometrov so uporabljali ˇzivosrebrno svetilo
kot izvor svetlobe. Problem teh svetil so ˇsiroke emisijske ˇcrte. Poslediˇcno
so bile tudi ramanske ˇcrte ˇsiroke in so se med seboj prekrivale. Zato so
laserji idealen izvor svetlobe, saj ustvarjajo ozke ramanske ˇcrte [13]. Uporabljajo se laserji z razliˇcnimi valovnimi dolˇzinami v UV, vidnem in bliˇznjem
IR obmoˇcju. Kot je razvidno iz enaˇcbe (9), je intenziteta Ramanovega sipanja odvisna od ν 4 . ν je obratno sorazmerna z valovno dolˇzino λ. Torej je
intenziteta Ramanovega sipanja sorazmerna λ−4 , kjer je λ valovna dolˇzina
vzbujevalnega laserja [21]. Recimo, da primerjamo intenziteto Ramanovega
sipanja za laserja z valovnima dolˇzinama za vzbujanje 785 nm in 448 nm.
Potem dobimo
(785nm)4
IV
=
= 9, 4.
INIR
(448nm)4
(19)
To nakazuje, da je za moˇcan ramanski signal ustreznejˇsi laser z niˇzjo valovno
dolˇzino.
Teˇzava, ki nastopi pri laserjih z niˇzjo valovno dolˇzino, je pojav fluorescence.
Fluorescenca je fizikalni pojav, pri katerem je energija izsevanega fotona pri
prehodu med elektronskimi stanji manjˇsa od energije absorbiranega fotona
(slika 5). Prisotnost fluorescence pada z valovno dolˇzino, ker fotoni z daljˇso
valovno dolˇzino nimajo dovolj energije, da bi vzbudili molekulo v viˇsja elektronska stanja.
24
4.2
Osnovna shema postavitve
Ramanovo sipanje lahko zbiramo pod kotom 90 stopinj (slika 15a) ali pod
kotom 180 stopinj (slika 15b) glede na vpadni laserski snop [14].
Slika 15: Prikazana sta sistema za a) 90 stopinjsko in za b) 180 stopinjsko
zbiranje Ramanovega sipanja [14]. Kratica DZ pomeni dikroiˇcno zrcalo.
Pri obeh postavitvah uporabimo leˇce, da veˇcino sipane svetlobe preslikamo
na vhod v spektrometer. Postavitev pod kotom 180 stopinj je primernejˇsa,
ˇce ˇzelimo v sistem postaviti optiˇcni mikroskop [14].
S pomoˇcjo dikroiˇcnega zrcala, ki je postavljen pred leˇci, preusmerimo laserski snop v mikroskop (slika 15b). Odbojnost dikroiˇcnega zrcala pri valovni
dolˇzini laserja mora biti ˇcim veˇcja. Svetloba potuje v mikroskopu skozi mikroskopski objektiv [21]. Zatem svetloba vpade na vzorec, na katerem se
siplje.
V ramanski spektroskopiji nas elastiˇcno oziroma Rayleighjevo sipanje ne zanima. Ker je intenziteta elastiˇcnega sipanja mnogo veˇcja od intenzitete Raˇ ne bi izloˇcili
manovega sipanja, smo primorani izloˇciti elastiˇcno sipanje. Ce
elastiˇcnega sipanja, ne bi mogli opazovati ramanskih ˇcrt blizu elastiˇcnega
sipanja. Nezaˇzeljeni signal lahko izloˇcimo s pomoˇcjo filtrov, ki imajo to lastnost, da prepustijo le doloˇcen del svetlobnega spektra [5].
25
4.3
Uklonski spektrometer
Spektrometer je naprava, s katero izmerimo spekter opazovane svetlobe.
Optiˇcna shema Czerny-Turnerjevega spektrometra [22] je predstavljena na
sliki 16.
Slika 16: Czerny-Turnerjev spektrometer, ki je sestavljen iz konkavnega zrcala (kolimatorja), uklonskega zrcala in konkavnega zrcala. Povzeto po [22].
Spektrometer je sestavljen iz kolimatorja, uklonskega zrcala in konkavnega
zrcala. Naloga kolimatorja je, da divergentni snop sipane svetlobe, ki pride
v notranjost spektrometra, pretvori v vzporednega in ga usmeri proti uklonskemu zrcalu pod kotom α. Uklonsko zrcalo je sestavljeno iz majhnih stopnic. Razdalja med sosednjimi stopnicami je d. Iz posameznih stopnic izvirajo delna valovanja, ki se seˇstejejo in tvorijo konstruktivno interferenco
ˇ
pri doloˇcenem kotu za doloˇceno valovno dolˇzino. Zarek,
ki vpada na sredino vrstiˇcnega CCD detektorja, se na uklonskem zrcalu odbije pod kotom
β in ustreza centralni valovni dolˇzini λc . Na sliki 16 je to valovanje prikazano kot pravokotnica na ravnino CCD detektorja [22]. Konstruktivna
interferenca nastane tudi pod drugimi uklonskimi koti, ki ustrezajo drugaˇcni
26
valovni dolˇzini. Slika 16 prikazuje ojaˇcitev delnih valovanj pod kotom β+ξ in
z valovno dolˇzino λ0 . Vpadni kot α in kot β sta merjena od normale na uklonˇ se svetloba odbije na isto stran glede na normalo uklonskega
sko zrcalo. Ce
zrcala, potem je β > 0 [22].
Slika 17: Vzporedna ˇzarka vpadata vsak na svojo stopnico na uklonskem
zrcalu in se odbijeta. Do konstruktivne interference pride, ko je razlika poti
enaka mnogokratniku valovne dolˇzine.
Povezavo med obema kotoma prikaˇzemo s sliko 17. Kadar je razlika optiˇcnih
poti enaka valovni dolˇzini λc , bo priˇslo do konstruktivne interference [22]. To
lahko zapiˇsemo z zvezo
mλc = d sin α + d sin β,
27
(20a)
ˇ je m =
kjer m predstavlja red ojaˇcitve in je lahko pozitiven ali negativen. Ce
0, sta kota α in β enaka. Takrat se uklonsko zrcalo obnaˇsa kot ravno zrcalo.
ˇ je red ojaˇcitve m = 1, govorimo o prvem redu interference, itd. Za viˇsje
Ce
rede pri istih kotih lahko pride do prekrivanja odbite svetlobe z ustrezno
manjˇsimi valovnimi dolˇzinami za vsak red, kot izhaja iz zveze (20a). Ker na
optiˇcni poti uporabimo dikroiˇcno zrcalo (slika 15b), ki prepuˇsˇca le svetlobo z
veˇcjo valovno dolˇzino kot laserski izvor, izloˇcimo viˇsje rede razen prvega [14].
Zato v nadaljni izpeljavi upoˇstevamo le prvi red ojaˇcanja. Ker obiˇcajno ne
poznamo vpadnega kota α, uporabimo v zvezi (20a) izraz za vsoto sinusov
[22]. Tedaj dobimo
λc
α+β
β−α
= 2 sin(
) cos(
).
d
2
2
(20b)
Razliko med odbitim in vpadnim kotom lahko zapiˇsemo s kotom γ = β −
α. Kot γ je konstanten in znaˇcilen za doloˇcen spektrometer. Z njim lahko
izrazimo kot α in ga vstavimo v zvezo (20b). Iz dobljene enaˇcbe izrazimo kot
β in dobimo zvezo
β = arcsin[
γ
λc
γ ]+ .
2d cos( 2 )
2
(20c)
ˇ ˇzelimo zvezo (20c) zapisati s kotom ψ, lahko iz slike 16 razberemo, da je
Ce
ψ = β − γ2 . Kot ψ je kot vrtenja uklonskega zrcala. Potem dobimo
ψ = arcsin[
λc
].
2d sin( γ2 )
(20d)
Kota β in kot ψ bosta veˇcja, ˇcim veˇcja je valovna dolˇzina λc in ˇcim manjˇsa je
razdalja d med stopnicami na uklonskem zrcalu. V spektrometru so izraˇcuni
kotov ˇze vneˇseni v programsko opremo [5]. Ko nastavimo ˇzeljeno centralno
valovno dolˇzino, se uklonsko zrcalo samodejno zavrti za ustrezen kot ψ.
4.4
Detektor
Slika 16 prikazuje, da se odbita svetloba odbije od konkavnega zrcala proti
vrstiˇcnemu CCD detektorju. Da ugotovimo, kakˇsen je spektralni obseg CCD
28
kamere, je potrebno izraˇcunati λ0 , ki takrat pade na rob vrstiˇcnega CCD detektorja v oddaljenosti l od sredine vrstiˇcnega CCD detektorja [5]. Razdaljo
l lahko zapiˇsemo z zvezo
l = nx,
(21)
kjer je n ˇstevilo slikovnih elementov ˇsteto od sredine CCD dektektorja in x je
razdalja med sredinama sosednjih slikovnih elementov (slika 16). Odbiti kot
za svetlobo z valovno dolˇzino λ0 lahko s pomoˇcjo slike 16 zapiˇsemo z zvezo
β 0 = β + ξ.
(22)
Kot ξ lahko zapiˇsemo tudi kot tangens kota, in sicer kot zvezo
tan ξ =
nx
,
f
(23)
kjer je f goriˇsˇcna razdalja spektrometra. Iz zveze (23) lahko izrazimo kot ξ
kot
ξ = arctan(
nx
).
f
(24)
Sedaj v zvezo (20a) za valovno dolˇzino vstavimo λ0 , za odbiti kot β 0 pa
upoˇstevamo zvezo (22)
λ0 = d sin(α) + d sin(β + ξ).
ˇ upoˇstevamo ˇse zvezo (24), ter α = ψ −
Ce
γ
2
(25a)
in β = ψ + γ2 , dobimo
γ
γ
nx
λ0 = d[sin(ψ − ) + sin(ψ + + arctan( ))].
2
2
f
(25b)
Zveza (25b) prikazuje, da manjˇsa razdalja d med stopnicami na uklonskem
zrcalu, povzroˇci manjˇsi spektralni obseg [5].
29
4.4.1
CCD detektor
ˇ je energija absorbiraCCD kamera vsebuje silicijev polprevodnik [30]. Ce
nega fotona veˇcja od energijske reˇze (za silicij 1,1 eV), pride do nastanka
para elektron-vrzel. Elektron pri tem preide iz valenˇcnega pasu v prevodni
pas [23]. Valovno dolˇzino fotonov, s katerim ustvarimo dovolj energije za
vzbuditev elektronov v prevodni pas, izraˇcunamo iz
λ=
hc
,
Ef
(26)
kjer je c svetlobna hitrost (3 · 108 ms ), h Planckova konstanta (6, 6 · 10−34 Js)
in λ valovna dolˇzina fotona.
Za zgornje podatke dobimo za valovno dolˇzino, s katero ˇse lahko vzbudimo
elektron v prevodni pas, okrog 1,1 µm. Kvantni izkoristek CCD kamere, ki
je definiran kot razmerje med ˇstevilom izbitih elektronov in vpadlih fotonov
[22], pri daljˇsih valovnih dolˇzinah torej pade na niˇc.
30
5
Postavitev laboratorijskega sistema za ramansko mikroskopijo
Naloga v delu je bila postavitev laboratorijskega sistema za ramansko mikroskopijo, s katerim smo opazovali Stokesovo sipanje bliˇznje IR svetlobe. Stokesovo sipanje smo zbirali s 180 stopinjsko geometrijsko nastavitvijo sistema.
Da smo skonstruirali celotno napravo, smo uporabili optiˇcni mikroskop, spektrometer s CCD kamero za zajem spektra, laser z valovno dolˇzino 785 nm z
dodatnim ozkopasovnim filtrom, dve dikroiˇcni zrcali (DZ1 in DZ2, glej sliko
18), filter, ki dovoljuje prehod valovnim dolˇzinam nad 800 nm, razprˇsilno in
zbiralno leˇco in CCD kamero za zajem slike v vidni svetlobi. Shema postavitve sistema prikazuje slika 18, medtem ko fotografijo postavitve prikazuje
slika 19.
Slika 18: Shematiˇcni prikaz postavitve eksperimenta. Za laserjem je postavljeno prvo dikroiˇcno zrcalo (DZ1), pred mikroskopom pa drugo (DZ2).
31
Slika 19: Prikazana je postavitev vseh optiˇcnih elementov in naprav na
optiˇcni mizi. Rdeˇca polna ˇcrta predstavlja laserski snop, medtem ko rdeˇca
ˇcrtkana ˇcrta predstavlja svetlobo, ki potuje od vzorca do spektrometra. Zelena ˇcrtkana ˇcrta predstavlja vidno svetlobo.
32
5.1
5.1.1
Opis in lastnosti sestavnih delov
Laserski izvor
Uporabili smo diodni laser TEC510, ki ga proizvaja podjetje Sacher Lasertechnik Group, Marburg, Nemˇcija. Valovna dolˇzina uporabljenega diodnega
laserja je 785 nm, medtem ko je bila uporabljena moˇc 38 mW. Maksimalna
moˇc tega laserja je 150 mW. Pri delu z laserjem smo se ustrezno zavarovali
z zaˇsˇcitnimi oˇcali, saj je laser zelo nevaren za oˇci.
5.1.2
Optiˇ
cni filtri
Spekter laserja prikazuje slika 20, na kateri je prikazana njegova intenziteta,
ki je normirana na maksimum. Intenziteta je seveda najveˇcja okrog 785 nm,
vendar pa dobimo nekaj izsevane svetlobe tudi pri niˇzjih in viˇsjih valovnih
dolˇzinah. Tako kljub temu, da je laser definiran kot izvor bliˇznje IR svetlobe,
del laserske svetlobe vidimo tudi kot vidno svetlobo.
Slika 20: Spekter laserja z vzbujevalno valovno dolˇzino 785 nm.
Za laserjem je bil postavljen ozkopasovni filter s ˇsirino nekaj nm, ki prepuˇsˇca
svetlobo z valovno dolˇzino 785 nm. Ker ozkopasovni filter ni idealen, pre33
pusti majhen del svetlobe tudi pri drugih valovnih dolˇzinah. Na sliki 21
prepustnost ozkopasovnega filtra prikazuje ˇcrna krivulja.
Za ozkopasovnim filtrom je bilo postavljeno prvo dikroiˇcno zrcalo (DZ1). Naloga DZ1 je, da odbije lasersko svetlobo v mikroskop in da prepusti Stokesovo
sipano svetlobo. Na sliki 21 prepustnost DZ1 prikazuje rdeˇca krivulja.
Med DZ1 in mikroskopom smo postavili drugo dikroiˇcno zrcalo (DZ2). Naloga DZ2 je odboj vidnega dela svetlobe na CCD kamero za zajem slike v
vidni svetlobi. Del vidne svetlobe, ki jo opazujemo, dobimo z osvetljevanjem
vzorca na mikroskopu, del svetlobe pa iz laserja, ki jo ne uspemo odfiltrirati.
Prepustnost DZ2 na sliki 21 prikazuje zelena krivulja.
Ker smo ˇzeleli ˇse dodatno zmanjˇsati prispevek Rayleighjevega sipanja, smo
na pot svetlobe postavili ˇse dodatni filter (slika 18). Prepustnost tega filtra
na sliki 21 prikazuje modra krivulja.
ˇ
Slika 21: Crna
krivulja prikazuje spektralno odvisnost prepustnosti ozkopasovnega filtra, ki prepuˇsˇca lasersko svetlobo z valovno dolˇzino 785 nm, rdeˇca
krivulja prikazuje prepustnost za prvo dikroiˇcno zrcalo (DZ1), zelena krivulja prikazuje prepustnost za drugo dikroiˇcno zrcalo (DZ2) in modra krivulja
prikazuje prepustnost filtra, ki prepuˇsˇca sipano svetlobo nad 800 nm [25-27].
34
5.1.3
Optiˇ
cni mikroskop
Uporabljali smo optiˇcni mikroskop Nikon, Eclipse TE-2000, Tokio, Japonska.
Pri mikroskopiji v svetlem polju, snop ˇzarkov svetlobe, ki jih oddaja halogenska ˇzarnica, potuje skozi kondenzor. Kondenzor je sestav leˇc, ki ˇzarke iz
svetila zbere in usmeri v ravnino vzorca. Od tod svetloba vpada skozi mikroskopski objektiv na premiˇcno veˇcstrano prizmo. Veˇcstrana prizma lahko
ˇ hoˇcemo videti sliko vzorca
prepusti ali odbije svetlobo proti ˇzeljeni smeri. Ce
skozi okular, potem prizma prepusti svetlobo in svetloba vpada na zrcala,
ki ˇzarke odbijejo proti okularju. V naˇsem primeru smo s premiˇcno stekleno
prizmo usmerili sliko vzorca iz ohiˇsja mikroskopa. Nastalo sliko smo preslikali
z leˇcama na vhod spektrometra. Sestava pomembnejˇsih delov mikroskopa za
naˇso postavitev prikazuje slika 22. Modra ˇcrtkana ˇcrta prikazuje ˇzarke svetlobe znotraj ohiˇsja mikroskopa, medtem ko rumena ˇcrtkana ˇcrta prikazuje
ˇzarke svetlobe, ki jih steklena prizma odbije iz ohiˇsja mikroskopa.
Slika 22: Optiˇcni mikroskop in shematiˇcno prikazana notranja sestava, ter
pot ˇzarkov.
35
5.1.4
Uklonski spektrometer s CCD kamero
Uporabili smo spektrometer iHR 320 (Horiba, Francija), kjer ˇstevilka 320 pomeni goriˇsˇcno razdaljo f = 320 mm. Notranjost uporabljenega spektrometra
prikazuje slika 23.
Slika 23: Spektrometer iHR320, ki vsebuje kolimator, konkavno zrcalo in tri
ˇ
uklonska zrcala nameˇsˇcena na vrtljivem nosilcu. Stevilo
uklonskih mreˇz je
300 na mm, 600 na mm in 1200 na mm [28].
V naˇsem eksperimentu smo uporabili uklonsko zrcalo s d1 = 300 reˇzami na
mm. Za detektor smo uporabili CCD kamero s 1024 (n = 512) x 256 slikovnimi elementi. Razdalja med sredinama sosednjih slikovnih elementov je bila
x = 26 µm. Tipiˇcno smo za centralno valovno dolˇzino λc izbrali 950 nm. Za
uporabljen spektrometer velja: Ψ = 8,377◦ , γ = 24◦ . Z zgornjimi podatki
lahko iz zveze (25b) izraˇcunamo, da sta robni valovni dolˇzini λ0 pri izbranih
nastavitvah spektrometra okrog 820 in 1080 nm.
Spektralni odziv uporabljene CCD kamere prikazuje slika 24. Vidimo, da
spektralni odziv naraˇsˇca z valovno dolˇzino, nato pa pade na 0 pri pribliˇzno
1100 nm. Zaradi uporabljenih filtrov smo lahko opazovali sipano svetlobo z
valovno dolˇzino nad 800 nm. Spektralni obseg, ki smo ga torej lahko opazovali
je med pribliˇzno 800 nm in 1100 nm. To predstavlja obmoˇcje ramanskega
36
premika od 600 cm−1 do 3650 cm−1 , kar ustreza obmoˇcju nihajnih frekvenc
molekulskih skupin, ki nas zanimajo.
Slika 24: Krivulja prikazuje spektralni odziv uporabljene CCD kamere [29].
37
5.2
Postavitev sestavnih delov in optiˇ
cnih komponent
1. korak:
Izraˇcun za izbiro in postavitev razprˇsilne in zbiralne leˇce. Izpeljava sledi v
podpoglavju 5.3.
2. korak:
Nastavitev razprˇsilne in zbiralne leˇce glede na optiˇcno os izhoda iz mikroskopa.
3. korak:
Ustrezna postavitev in zasuk spektrometra. Podrobna razlaga sledi v podpoglavju 5.4.
4. korak
Ustrezna postavitev laserja, prvega dikroiˇcnega zrcala in filtra, ki dovoljuje
prehod valovnim dolˇzinam nad 800 nm. Filter smo postavili med prvo dikroiˇcno zrcalo in zbiralno leˇco.
5. korak
Z ustreznim zasukom prvega dikroiˇcnega zrcala smo laserski curek preusmerili
v optiˇcni mikroskop.
6. korak
Ustrezna postavitev drugega dikroiˇcnega zrcala in CCD kamere tik ob izhodu
mikroskopa. S to CCD kamero smo dobili optiˇcno sliko vzorcev. Pri nastavitvi poloˇzaja dikroiˇcnega zrcala in CCD kamere smo si pomagali s toˇcko na
sredini slike v mikroskopu.
5.3
Izraˇ
cun postavitve leˇ
c
Sliko iz mikroskopa kot navidezni predmet, ki ga na sliki 25 prikazuje toˇcka
C, preslikamo na vhod spektrometra. Preslikavo naredimo s pomoˇcjo zbiralne (f1 = 5 cm) in razprˇsilne leˇce (f2 = −10 cm), kot prikazuje slika 25.
38
Razdalja med navideznim predmetom C in spektrometrom je bila fiksna, x”
= 22 cm.
Slika 25: Shema, ki prikazuje postavitev zbiralne in razprˇsilne leˇce. Modra
barva prikazuje pot ˇzarkov skozi zbiralno leˇco, medtem ko ˇzarki z rdeˇco barvo
prikazujejo pot ˇzarkov skozi razprˇsilno leˇco. C predstavlja navidezno sliko,
medtem ko E predstavlja sliko na vhodu v spektrometer.
Zbiralna leˇca prepuˇsˇca in lomi svetlobo, pri tem pa ˇzarke svetlobe zbere.
Tam, kjer se ˇzarki svetlobe sekajo v eni toˇcki, dobimo obrnjeno realno sliko
navideznega predmeta (na sliki 25 oznaˇcena s toˇcko D). Nato upoˇstevamo ˇse
razprˇsilno leˇco, ki svetlobo razprˇsi. Kjer se podaljˇski ˇzarkov sekajo v toˇcki,
dobimo sliko pred vhodom v spektrometer. To na sliki 25 prikazuje toˇcka
E. Pri izpeljavi, ki sledi, smo uporabili enaˇcbe za tanke leˇce. Najprej si
pomagamo z zvezo za zbiralno leˇco
1 1
1
= + ,
f1
a b
(27)
kjer a predstavlja razdaljo med navideznim predmetom v toˇcki C in zbiralno
leˇco ter b predstavlja razdaljo od zbiralne leˇce do slike v toˇcki D. Razdalja
med toˇckama C in D ustreza razdalji x in jo lahko zapiˇsemo kot x =a+b. Ob
39
poznavanju goriˇsˇcne razdalje zbiralne leˇce (f1 ) in ob izbrani razdalji a lahko
s pomoˇcjo zveze (27) izraˇcunamo razdaljo b. Sedaj, ko poznamo razdaljo b,
lahko izraˇcunamo razdaljo x. Razdalja x’ ustreza razdalji med toˇckama D
in E. Razdaljo x’ lahko izraˇcunamo kot x’ = x” − x. Razdalja x’ prav tako
ustreza razliki b’ in a’. b’ predstavlja razdaljo od razprˇsilne leˇce do toˇcke E,
medtem ko a’ predstavlja razdaljo od razprˇsilne leˇce do toˇcke D. S pomoˇcjo
zveze za razprˇsilno leˇco
1
1
1
− 0 =−
0
a
|b |
|f2 |
(28)
ˇ v zvezo (28) vstavimo a’ =
in ob poznavanju f2 lahko izraˇcunamo b’. Ce
|b0 | − x’, dobimo kvadratno enaˇcbo
|b02 | − |b0 |x0 − |f2 |x0 = 0.
(29)
Kvadratna enaˇcba nam da eno ustrezno reˇsitev za b’, ki jo zapiˇsemo kot
p
1
b0 = [x0 + x02 + 4|f2 |x0 ].
2
(30)
S pomoˇcjo zveze x’ = b’ − a’ lahko izraˇcunamo a’. Ker poznamo razdaljo b
in a’, lahko sedaj izraˇcunamo razdaljo d, ki predstavlja razdaljo med leˇcama:
d = b − a0 .
(31)
Naslednja pomembna lastnost je poveˇcava predmeta. Poveˇcavo slike v toˇcki
D, ki jo ustvari zbiralna leˇca, zapiˇsemo kot
b
N= ,
a
(32)
medtem ko je poveˇcava slike v toˇcki E za razprˇsilno leˇco podana kot
N0 =
b0
b0
=
.
a0
b0 − x 0
40
(33)
Skupna poveˇcava obeh leˇc je potem podana kot produkt obeh poveˇcav:
N 00 = N N 0 =
b0
b
.
a (b0 − x0 )
(34)
Iz enaˇcb (30), (31) in (34) je bilo veˇc moˇznih reˇsitev, vendar smo ˇzeleli, da
je N 00 = 1. Iz enaˇcbe (33) izrazimo b’ za N”=1:
b0 =
x0
.
1 − ab
(35)
Iz zveze (35) vidimo, da mora biti razmerje ab manjˇse od 1. To pomeni, da
je a veˇcji od b. Ker je x” fiksna, vsota a in b ne sme biti veˇcja od 22 cm.
Razdalja a ustreza navedenima pogojema takrat, kadar je a med 10,1 cm
in 14,3 cm. V tabeli 2 so prikazane nekatere moˇzne reˇsitve. Rezultati v
prvi vrstici ne ustrezajo naˇsi postavitvi, ker zbiralne in razprˇsilne leˇce zaradi
njihovih debelin ne moremo postaviti bliˇze od 3 cm. Druga in tretja vrstica
ne ustrezata naˇsi postavitvi, ker razprˇsilne leˇce ne moremo postaviti preblizu spektrometra zaradi konstrukcije samega spektometra. Zadnja vrstica
prikazuje rezultate, ki so bili ugodni za naˇse potrebe.
Tabela 2: Prikazane vrednosti razdalj za izbrano postavitev pri x00 = 22 cm
in N 00 = 1.
a [cm]
11
13
14
12
b [cm]
9,2
8,1
7,8
8,6
x [cm]
20,2
21,1
21,8
20,6
x’ [cm]
1,8
0,9
0,2
1,4
b’ [cm]
11
2,4
0,5
4,9
a’ [cm]
9,2
1,5
0,3
3,5
d [cm]
0
6,6
7,5
5,1
Druga ideja je bila, da bi zbiralno in razprˇsilno leˇco zamenjali z eno leˇco.
Goriˇsˇcno razdaljo leˇce izraˇcunamo kot
1
1
1
=
+
.
f0
f1 f2
41
(36)
Za f1 = 5 cm in f2 = −10 cm je goriˇsˇcna razdalja f ’ nove leˇce 10 cm. To
pomeni, da imamo opravka z zbiralno leˇco.
Razdalja a” predstavlja razdaljo od toˇcke C do zbiralne leˇce, razdalja b” pa
ˇ
razdaljo od zbiralne leˇce do toˇcke E, ki je na vhodu v spektrometer. Ce
navidezni predmet v toˇcki C leˇzi med zbiralno leˇco in goriˇsˇcem leˇce, dobimo
navidezno sliko na isti strani kot svetloba vpada na zbiralno leˇco. Zato nam
ostane primer, ko je razdalja a” veˇcja od goriˇsˇcne razdalje f ’. Ta primer
prikazuje slika 26.
Slika 26: Sistem leˇcja z znaˇcilnimi ˇzarki.
Vsota razdalj a” in b” ne sme preseˇci 22 cm. Uporabimo enaˇcbo za tanke
leˇce
1
1
1
= 00 + 00
f
a
b
(37)
in iz nje izrazimo razdaljo b”. V zvezi (37) spreminjamo razdaljo a”. Rezultati nekaterih primerov so prikazani v tabeli 3. Rezultati v tabeli 3 prikazujejo, da je sistem z eno leˇco neustrezen. Pri vseh navedenih primerih
je vsota razdalj a” in b” veˇcja od 22 cm. Drugi razlog za neustreznost je
poveˇcava. Naˇsa ˇzelja je bila, da je N”= 1, kar pa pri sistemu z eno leˇco za
naˇso postavitev zaradi prostorskih omejitev ni moˇzna. Poveˇcava je vedno
veˇcja od 1.
42
Tabela 3: Prikazane vrednosti razdalj pri x00 = 22 cm za sistem z eno leˇco.
a” [cm]
11
14
16
19
5.4
b” [cm]
110
35
27
21
a” + b” [cm]
121
49
43
40
N”
11
8,8
1,7
1,1
Ustrezna postavitev in zasuk spektrometra
Za ustrezno postavitev spektrometra smo uporabili sredino slike, ki smo jo
opazovali v mikroskopu. Sliko, ki smo jo opazovali skozi okular v mikroskopu,
prikazuje slika 27. S pomoˇcjo kriˇza smo doloˇcili sredino slike v mikroskopu.
Kriˇzec je na sliki 27 prikazan kot ilustracija in ni del slike.
Slika 27: Opazovana slika v mikroskopu.
Slika, ki smo jo dobili zunaj ohiˇsja mikroskopa, je bila obrnjena za 90 stopinj.
To sliko smo z leˇcama preslikali na vhod spektrometra. Spektrometer smo
nastavili tako, da je toˇcka, ki je na sredini slike 27, prav tako na sredini
CCD detektorja na spektrometru. Tukaj smo si pomagali z niˇcelnim redom
interference. Da smo doloˇcili sredino slike na CCD kameri, smo si pomagali
z opazovanjem slike 28 na raˇcunalniˇskem zaslonu.
43
Slika 28: Opazovana slika na raˇcunalniˇskem zaslonu za 90◦ obrnjeno ustrezno postavljeno sliko 27, s pomoˇcjo katere smo doloˇcili ustrezno postavitev
spektrometra.
Vodoravna os na sliki 28 ustreza valovni dolˇzini. Dve debelejˇsi ˇcrti na sliki
27 ustrezata daljˇsima robovoma niˇcle, ki ju vidimo na sliki 27. Tanjˇsa ˇcrta,
ki jo opazimo na sliki 28, ustreza tanjˇsi ˇcrti na sliki 27.
44
6
6.1
Primeri slikanja z laboratorijskim sistemom
za ramansko mikroskopijo
Ramanska spektroskopija standardnih topil
Kot smo omenili ˇze v uvodu, ˇzelimo ramanski mikroskop uporabljati za slikanje vzorcev na osnovi lipidnih, proteinskih in drugih organskih molekul. Zato
organska topila, ki jih sestavljajo podobne molekulske skupine kot omenjene
vzorce, uporabimo kot neke vrste standarde. V naˇsem primeru smo opazovali
spektra dveh topil, in sicer cikloheksana in toluena. Na vsakem spektru je
na osi x prikazan ramanski premik v cm−1 , ki ga izraˇcunamo po zvezi (16),
medtem ko os y predstavlja intenziteto signala na CCD kameri.
Izmerjena spektra smo prekrili s znanimi spektri standardnih topil, ki smo jih
predstavili v podpoglavju 3.5. Prvi posneti ramanski spekter je bil spekter
cikloheksana. Ekspozicijski ˇcas za cikloheksan je bil 1 s. Spekter, ki smo ga
dobili, prikazuje slika 29.
Izmerjeni ramanski spekter je naloˇzen na ozadje, zato imamo opravka z viˇsjo
intenziteto. Vzrok za ozadje je lahko elastiˇcno sipanje, ki ga nismo uspeli
odfiltrirati, sipanje vidne svetlobe na neˇcistoˇcah, svetloba drugih svetil, kot
ˇ ˇzelimo od spektra odˇsteti ozadje, moramo spekje raˇcunalniˇski zaslon ... Ce
ter prilagoditi s krivuljo prileganja. Na sliki 29 krivuljo prileganja prikazuje
rdeˇca krivulja. Vrh, ki ga vidimo na izmerjenem spektru pri valovni dolˇzini
920 nm, ustreza ozadju. Obdelavo spektra smo naredili v programu OriginPro 8. Podobno obdelavo smo naredili tudi pri ostalih izmerjenih spektrih.
Po obdelavi izmerjenega spektra smo ga primerjali z znanmim spektrom.
Zgornji spekter na sliki 30 prikazuje priˇcakovani spekter cikloheksana [1],
medtem ko spodnji spekter prikazuje izmerjeni spekter cikoheksana po obdelavi. Razvidno je, da se ramanski premiki za izmerjeni in znani spekter za
cikloheksan zelo dobro ujemajo.
Slika 31 prikazuje spekter toluena. Ekspozicijski ˇcas za toluen je bil 1 s. Zgornji spekter na sliki 31 prikazuje znani spekter toluena [8], medtem ko spodnji
spekter prikazuje izmerjeni spekter toluena. Iz te primerjave je razvidno, da
se izmerjeni in znani spekter toluena zelo dobro ujemata.
45
Slika 29: Izmerjeni spekter cikloheksana pred obdelavo. Za odpravo ozadja
smo si pomagali s krivuljo prileganja, ki jo prikazuje rdeˇca barva.
Pri spektrih toluena in cikloheksana vidimo, da se pri viˇsjih ramanskih premikih oziroma pri daljˇsih valovnih dolˇzinah (glej zvezo (16)) intenziteti izmerjenega in znanega spektra razlikujeta. Intenziteta v naˇsem primeru zaradi
slabˇsega izkoristka CCD kamere pri daljˇsih valovnih dolˇzinah λS moˇcno pade.
46
Slika 30: Zgornji spekter predstavlja priˇcakovani spekter cikloheksana [1].
Spodnji spekter predstavlja izmerjeni spekter cikloheksana po obdelavi.
6.2
Slikanje s sistemom za ramansko mikroskopijo
Za mikrospektroskopsko slikanje cikloheksana in etanola smo uporabili objektno stekelce, na katerem so ”bazenˇcki”velikosti 9,6 mm x 9,5 mm x 9,6 mm.
Sliko ”bazenˇckov”prikazuje slika 32. ”Bazenˇcki” so narejeni iz borosilikatnega materiala (Lab-Tek, New York, Zdruˇzene Drˇzave Amerike).
47
Slika 31: Zgornji spekter prikazuje priˇcakovani spekter toluena [1]. Spodnji
spekter predstavlja izmerjeni spekter toluena po obdelavi.
Slika 32: ”Bazenˇcki”.
Uporabili smo dva ”bazenˇcka”, pri ˇcemer je en vseboval etanol in drugi cikloˇ
heksan. Crna
kvadratka na sliki 32 prikazujeta, katero obmoˇcje smo posneli.
Optiˇcno sliko teh dveh obmoˇcij, ki smo ju opazovali na zaslonu, prikazujeta
sliki 33a in 34a.
Velikost slike, ki smo jo opazovali, je bila 862 µm x 694 µm. Pri tem nas je
48
zanimalo, kako se intenziteta Ramanovega sipanja spreminja z razdaljo od
roba ”bazenˇcka”proti notranjosti. Opazovano obmoˇcje za ramansko slikanje
smo razdelili na mreˇzo. Smiselna razdalja med dvema sosednjima toˇckama
mreˇze je odvisna od velikosti laserskega snopa in razdalje med sredinama sosednjih slikovnih elementov CCD kamere na spektrometru. Presek laserskega
snopa je eliptiˇcen, kjer je premer daljˇse polosi 24 µm in premer krajˇse polosi
20 µm pri 10 X poveˇcavi, medtem ko je razdalja med sredinama sosednjih
slikovnih elementov v CCD kameri na spektrometru 6,7 µm. To pomeni, da
smo bili v naˇsem primeru pri ˇclenjenju mreˇze in s tem pri lateralni loˇcljivosti
omejeni predvsem z velikostjo laserskega snopa. Mreˇzo smo razdelili na 10 x
8 elementov, kjer je bila velikost posameznega elementa pribliˇzno 87 µm x 87
µm. V naˇsem primeru bi torej lahko ˇse nekoliko zmanjˇsali velikost elementov,
vendar je bila za naˇso postavitev takˇsna izbira zadovoljiva.
Teoretiˇcna lateralna loˇcljivost y0 naˇsega sistema je odvisna od valovne dolˇzine
laserja in numeriˇcne aperture (NA) mikroskopskega objektiva [12] in jo zapiˇsemo kot
y0 =
0.61λ
.
NA
(38)
V naˇsem primeru smo uporabljali mikroskopski objektiv z numeriˇcno aperturo 0,3 in svetlobo z valovno dolˇzino 785 nm. Ko ta dva podatka vstavimo
v zvezo (38), dobimo za loˇcljivost pribliˇzno 1,6 µm. Ta vrednost je mnogo
manjˇsa od premera laserskega snopa. Pri izbranih nastavitvah je torej lateralna loˇcjivost omejena s premerom snopa na okrog 20 µm.
Optiˇcno mizo, na kateri je bil ”bazenˇcek”, smo prestavljali tako, da je laserski
snop vpadal na sredino posameznega elementa mreˇze za slikanje. Za vsak
element posebej smo izmerili spekter. Skupaj smo dobili 80 spektrov, tako
za topili etanola kot tudi cikloheksana. Pri tem smo vsak spekter ustrezno
obdelali, kot je bilo razloˇzeno v prejˇsnjem podpoglavju. Pri obeh topilih
smo za kontrastiranje vzeli najmoˇcnejˇso ramansko ˇcrto in spremljali njeno
intenziteto. Za cikloheksan smo vzeli ˇcrto pri ∆w = 820 cm−1 in za etanol
ˇcrto pri ∆w = 880 cm−1 . Odvisnost te intenzitete od poloˇzaja na opazovanem
delu vzorca je prikazana na mikrospektroskopski sliki.
Slika 33a prikazuje optiˇcno sliko ”bazenˇcka”, napolnjenega s cikloheksanom.
Slika 33b prikazuje mikrospektroskopsko sliko za cikloheksan. Obmoˇcje s
49
temno barvo prikazuje ˇsibak ramanski signal, saj se nahajamo na robu ”bazenˇcka”. Proti notranjosti ”bazenˇcka” intenziteta ramanskih ˇcrt naraˇsˇca. Na
sliki 33b najveˇcjo intenziteto Ramanovega sipanja prikazuje rumeno obmoˇcje.
Slika 33: Prikazani sta a) optiˇcna slika in b) mikrospektroskopska slika za
cikloheksan.
Optiˇcno in mikrospektroskopsko sliko za etanol prikazuje slika 34. Vidimo,
da temno obmoˇcje ustreza robu oziroma bliˇzini roba ”bazenˇcka”. Ko premikamo optiˇcno mizo tako, da se premikamo proti notranjosti ”bazenˇcka”, se
intenziteta Ramanovega sipanja poveˇcuje.
50
Slika 34: Prikazani sta a) optiˇcna slika in b) mikrospektroskopska slika za
etanol.
6.3
Primerjava s komercialnim sistemom za ramansko
mikroskopijo
Podobne poskuse kot z naˇsim laboratorijskim sistemom smo izvedli s komercialnim ramanskim mikroskopom WITec alpha 300 (WITec, Ulm, Nemˇcija).
Pri teh poskusih je bil uporabljen frekvenˇcno podvojen Nd:YAG laser z valovno dolˇzino 532 nm. Najprej smo posneli spekter cikloheksana, ki ga prikazuje slika 35. Izmerjeni spekter (spodnja slika) smo primerjali z znanim
spektrom (zgornja slika). Oba spektra se zelo dobro ujameta v ramanskih
premikih. Uporabljena moˇc laserja je bila 6 mW.
Prav tako smo posneli spekter polistirenskega filma, kjer je bila moˇc laserja
1 mW in spekter polistirenskih kroglic pri laserski moˇci 2 mW. Premer polistirenskih kroglic je bil 10 µm. Na stekleno objektno stekelce smo dali eno
51
Slika 35: Zgornji spekter predstavlja priˇcakovani spekter cikloheksana. Spodnji spekter predstavlja izmerjeni spekter cikloheksana na komercialnem ramanskem mikroskopu.
kapljico suspenzije polistirenskih kroglic. Kapljico smo prekrili s krovnim
stekelcem. Zaradi kapilarne sile se je kapljica moˇcno sploˇsˇcila, tako da so
bile polistirenske kroglice fiksne. Zgornji del slike 36 prikazuje znani spekter
polistirena, sredinski del prikazuje spekter polistirenskega filma in spodnji
del spekter polistirenske kroglice. Na slednjem so vidne enake ramanske ˇcrte
kot na polistirenskem filmu.
Podobno kot pri zajemu mikrospektroskopske slike etanola in toluena smo za
zajem mikrospektroskopske slike polistirenskih kroglic razdelili opazovani del
vzorca na mreˇzo veˇcih elementov. Premer laserskega snopa pri 60 X poveˇcavi
je bil 1 µm. V skladu z zvezo (38) je teoretiˇcna lateralna loˇcljivost komercialnega ramanskega sistema pribliˇzno y0 = 0, 4 µm, pri ˇcemer je numeriˇcna
apertura objektiva 0,8. Premer laserskega snopa je torej tukaj zelo blizu
izraˇcunani loˇcljivosti.
52
Slika 36: Zgornji spekter prikazuje priˇcakovani spekter polistirena, sredinski spekter prikazuje spekter polistirenskega filma, posnet na komercialnem
ramanskem mikroskopu in spodnji spekter prikazuje spekter polistirenske
kroglice, posnete na komercialnem ramanskem mikroskopu.
Opazovano obmoˇcje vzorca smo razdelili na 25 x 25 elementov s korakom 2
µm. Velikost optiˇcne slike je torej bila 50 µm x 50 µm. Skupaj smo torej
posneli 625 spektrov v posameznih toˇckah, pri ˇcemer je bil ekspozicijski ˇcas
posameznega spektra 1 s. Za izdelavo celotne mikrospektroskopske slike je
bilo torej potrebno poˇcakati pribliˇzno 10 minut.
Slika 37a prikazuje optiˇcno sliko polistirenskih kroglic, medtem ko slika 37b
prikazuje mikrospektroskopsko sliko. Za kontrastiranje mikrospektroskopske
slike smo izbrali intenziteto najmoˇcnejˇse ˇcrte v ramanskem spektru (∆w
= 1000 cm−1 ). Obmoˇcje s temno barvo prikazuje ˇsibak ramanski signal
53
Slika 37: Prikazani sta a) optiˇcna slika in b) mikrospektroskopska slika polistirenskih kroglic, posnetih na komercialnem ramanskem mikroskopu.
in obmoˇcje z rumeno barvo prikazuje visok ramanski signal. Vidimo torej,
da ramanski mikroskop odliˇcno loˇci med obmoˇcji brez prisotnosti doloˇcene
snovi in obmoˇcji, kjer imamo snov, z lateralno loˇcljivostjo vsaj primerljivo z
velikostjo koraka zajema spektrov 2 µm.
54
7
Pedagoˇ
ski model Ramanovega sipanja
Kadar se foton siplje na molekuli elastiˇcno in se njegova energija ohranja, govorimo o Rayleighjevem sipanju. Pri Stokesovem in anti-Stokesovem sipanju
pa se foton siplje na molekuli neelastiˇcno. Pri Stokesovem sipanju foton po
trku izgubi energijo, medtem ko pri anti-Stokesovem sipanju pridobi energijo.
Po analogiji si smemo elastiˇcno sipanje predstavljati kot proˇzen trk, medtem
ko Stokesovo in anti-Stokesovo sipanje ustrezata neproˇznemu trku.
Po uˇcnem naˇcrtu za gimnazije [30] se obravnavata proˇzni in neproˇzni trk.
Slednjega najdemo v poglavju 5, ki je namenjeno posebnemu znanju in izbirnim vsebinam. Predvideva se, da dijaki znajo uporabiti izrek o ohranitvi
gibalne koliˇcine pri trkih. Poglavje 7 v uˇcnem naˇcrtu pod ”sploˇsna znanja”
predvideva, da dijaki znajo uporabiti izrek o mehanski energiji vkljuˇcno s
proˇznostno energijo, ter da znajo razloˇziti, kdaj se mehanska energija ohranja [30].
Dijaki imajo torej dovolj znanja, da bi jim lahko poskuˇsali razloˇziti Ramanovo
sipanje na podlagi mehanskega modela. V literaturi [31] smo naˇsli primer
takega modela, s katerim bi lahko preko opazovanja razliˇcnih trkov predstavili
Rayleighjevo, Stokesovo in anti-Stokesovo sipanje.
V prvem primeru na trdo podlago z viˇsine h spuˇsˇcamo elastiˇcno ˇzogico (”skokico”). Slika 38a prikazuje elastiˇcni trk, kjer je hitrost ˇzogice po trku enaka
ˇ
hitrosti ˇzogice pred trkom. Zogica
odskoˇci nazaj do zaˇcetne viˇsine h. V
tem primeru se kinetiˇcna energija ˇzogice ne spremeni. Ta primer ustreza
Rayleighjevem sipanju.
V drugem primeru na podlago z vzmetjo pritrdimo ploˇsˇco z veˇcjo maso v
primerjavi z ˇzogico. Ta model predstavlja dvoatomno molekulo. Na zaˇcetku
ploˇsˇca miruje in nanjo spustimo ˇzogico z viˇsine h. Hitrost ˇzogice v’ po trku
je manjˇsa kot je hitrost ˇzogice pred trkom v, saj je ˇzogica nekaj kinetiˇcne
energije predala vzmeti v obliki proˇznostne energije. Konˇcna viˇsina ˇzogice
h’ je manjˇsa od zaˇcetne viˇsine h (slika 38b). Ta primer ustreza neproˇznemu
trku, saj ne velja ohranitev kinetiˇcne energije. Ker se kinetiˇcna energija
ˇzogice pri odboju zmanjˇsa, gre za analogijo s Stokesovim sipanjem.
V tretjem primeru ploˇsˇcico zanihamo in nanjo spustimo ˇzogico z viˇsine h.
ˇ ˇzogica prileti na ploˇsˇco, ko se ta dviguje, prejme nekaj energije in ˇzogica
Ce
55
odleti viˇse (do viˇsine h”) kot je bila njena zaˇcetna viˇsina h. Hitrost ˇzogice
v” po trku je veˇcja, kot je bila pred trkom (slika 38c). Gre torej zopet za
neproˇzni trk. Ker se kinetiˇcna energija kroglice pri odboju poveˇca, ta primer
ustreza anti-Stokesovem sipanju.
Slika 38: Prikazani so mehanski modeli za demonstracijo Ramanovega sipanja
[31]. (a) Zgornja slika prikazuje primer za Rayleighjevo sipanje, kjer se ohrani
kinetiˇcna energija. Drugi dve sliki predstavljata neelastiˇcno sipanje, saj se
kinetiˇcna energija zmanjˇsa (b) oziroma poveˇca (c). Sprememba kinetiˇcne
energije ˇzogice je nasprotno enaka spremembi proˇznostne energije vzmeti.
Opisani model zahteva izbiro razliˇcnih pogojev. Rayleighjevo sipanje je namreˇc prikazano v primeru, kadar ni ploˇsˇce z vzmetjo. Poleg tega v primeru
Stokesovega sipanja ploˇsˇca na vzmeti miruje, v primeru Anti-Stokesovega sipanja pa se ploˇsˇca giblje proti ˇzogici. Ker vsi trije primeri sipanja nastopijo
56
za razliˇcen mehanski sistem, je naˇsa ˇzelja, da bi dobili vse tri moˇzne trke pri
istem mehanskem modelu. Zato predlagamo poenoten model, v katerem je
moˇzen prikaz Rayleighjevega, Stokesovega in anti-Stokesovega sipanja.
Naˇs model je osnovan na ploˇsˇci, ki niha v vodoravni smeri, kot prikazuje slika
39. Pri prehodu skozi ravnovesno lego je hitrost v2 ploˇsˇce najveˇcja in je na
sliki 39 prikazana v obe smeri. Enkrat se bo ploˇsˇca gibala v smeri proti ˇzogici,
drugiˇc pa stran od ˇzogice. Kadar je odmik ploˇsˇce od ravnovesne lege najveˇcji
x0 , takrat ploˇsˇca miruje (slika 39). Nihajoˇco ploˇsˇco potem obstreljujemo z
ˇzogico v vodoravni smeri. Masa ˇzogice m1 naj bo mnogo manjˇsa od mase
ploˇsˇce m2 .
Slika 39: Zgornja slika prikazuje nihajoˇco ploˇsˇco, ki prehaja skozi ravnovesno
lego bodisi v smeri proti ˇzogici bodisi v smeri stran od ˇzogice. Spodnji dve
sliki prikazujeta skrajni legi ploˇsˇce.
Pri obravnavi vseh treh primerov trkov predpostavimo, da je ˇcas trka ˇzogice
s ploˇsˇco majhen, tako da se med trkom proˇznostna energija vzmeti ne bo
spremenila. Poleg tega bomo predpostavili proˇzni trk med ˇzogico in ploˇsˇco.
Ker imata ˇzogica in ploˇsˇca pred in po trku hitrosti vzdolˇz iste smeri, lahko
torej naˇs model fizikalno opiˇsemo kot centralni trk. Zapiˇsemo lahko izraza
57
za ohranitev gibalne koliˇcine ter kinetiˇcne energije:
m1 v1 + m2 v2 = m1 u1 + m2 u2
1
1
1
1
m1 v12 + m2 v22 =
m1 u21 + m2 u22
2
2
2
2
(39)
kjer sta v1 in u1 hitrosti ˇzogice pred in po trku ter v2 in u2 hitrost ploˇsˇce
pred in po trku.
Iz zvez (39) lahko izrazimo hitrost u1 ˇzogice po trku:
u1 =
2m2 v2 + v1 (m1 − m2 )
.
m1 + m2
(40)
V naˇsem primeru je masa ˇzogice m1 mnogo manjˇsa od mase ploˇsˇce m2 , kar
pomeni, da lahko v pribliˇzku upoˇstevamo m1 +m2 ≈ m2 . V tej limiti dobimo
u1 = 2v2 − v1 .
(41)
Sedaj pa si oglejmo vse tri primere trkov. V vseh trej primerih pripiˇsemo
premikanju v desno pozitivno hitrost in premikanju v levo negativno hitrost.
V prvem primeru ˇzogica trˇci s ploˇsˇco, ko ta miruje. Takrat je hitrost ploˇsˇce
v2 = 0. Iz zveze (41) dobimo, da je hitrost ˇzogice po trku u1 = −v1 , kjer
sta u1 in v1 absolutni vrednosti hitrosti. Ta primer torej ustreza elastiˇcnemu
Rayleighjevemu sipanju, ki ga prikazuje slika 40, saj se kinetiˇcna energija
ˇzogice ohrani.
V drugem primeru naj se ploˇsˇca giba med obema skrajnima legama v enako
smer kot vpada ˇzogica (slika 41). Za to, da izvedemo ustrezen poskus
ter da dobimo smiselno reˇsitev, moramo dodatno zahtevati v1 > 2v2 . Ob
upoˇstevanju ustrezne smeri premikanja ˇzogice in ploˇsˇce v zvezi (41) dobimo
u1 = 2v2 − v1 .
(42)
V tem primeru je hitrost ˇzogice po trku u1 manjˇsa kot hitrost ˇzogice pred
trkom v1 . Kinetiˇcna energija ˇzogice se torej zmanjˇsa
58
1
1
1
m1 u21 = m1 (2v2 − v1 )2 < m1 v12 .
2
2
2
(43)
Ta primer ustreza neelastiˇcnemu Stokesovemu sipanju.
Slika 40: Ploˇsˇca je v skrajni legi in miruje. Hitrost ˇzogice po odboju je enaka
hitrosti ˇzogice pred odbojem. Primer ustreza Rayleighjevem sipanju.
V tretjem primeru naj se ploˇsˇca giblje v smeri proti ˇzogici (slika 42). Ob
upoˇstevanju ustrezne smeri premikanja ˇzogice in ploˇsˇce v zvezi (41) dobimo
u1 = −(2v2 + v1 ),
(44)
kjer vidimo, da bo hitrost ˇzogice u1 po trku veˇcja kot je bila hitrost pred
ˇ
trkom v1 . Zogici
se torej poveˇca kinetiˇcna energija
1
1
1
m1 u21 = m1 (2v2 + v1 )2 > m1 v12 .
2
2
2
Po analogiji ta primer ustreza neelastiˇcnemu anti-Stokesovemu sipanju.
59
(45)
Slika 41: Zgornja slika prikazuje hitrost ˇzogice in ploˇsˇce pred trkom in spodnja
slika po trku. V prikazanem primeru se hitrost ˇzogice zmanjˇsa, kar ustreza
Stokesovemu sipanju.
Iz prikazanih primerov ugotovimo, da vpeljani pedagoˇski mehanski model
omogoˇca opis in razumevanje elastiˇcnega in neelastiˇcnega Ramanovega sipanja z osnovnim fizikalnim znanjem centralnega proˇznega trka. Pri tem je
moˇzno vse tri primere teoretiˇcno izvesti pri nihajoˇci ploˇsˇci.
60
Slika 42: Zgornja slika prikazuje hitrost ˇzogice in ploˇsˇce pred trkom in spodnja
slika po trku. V prikazanem primeru se hitrost ˇzogice poveˇca, kar ustreza
anti-Stokesovemu sipanju.
61
8
Zakljuˇ
cek
V diplomskem delu smo postavili laboratorijski sistem za ramansko mikroskopijo. Najprej se je bilo potrebno seznaniti z delovanjem ramanske spektroskopije, z delovanjem optiˇcnega mikroskopa in spektrometra in s tem, kako
postaviti optiˇcne elemente, da lahko opazujemo Stokesovo sipanje. Opazovali
smo organske snovi v bliˇznjem infrardeˇcem obmoˇcju.
Po seznanitvi z delovanjem optiˇcnega mikroskopa in spektrometra je bilo potrebno ustrezno namestiti optiˇcne elemente in ostale komponente, da smo
opazovali ramanski spekter. Zatem nas je zanimalo, kakˇsen je opazovani
spektralni obseg naˇsega sistema. Ko smo postavili sistem za ramansko mikroskopijo, smo izmerili spektre organskih snovi in jih primerjali s priˇcakovanimi
spektri. Izmerjeni spektri so se lepo ujemali v primerjavi s priˇcakovanimi
spektri. Prav tako smo posneli mikrospektroskopsko sliko raztopin.
Za primerjavo smo uporabili ˇze postavljeni komercialni ramanski mikrospektrometer. Tam smo poleg spektrov topil posneli tudi spekter polistirenskega
filma in polistirenskih kroglic, ter ju prav tako primerjali s priˇcakovanimi
spektri. Posneli smo tudi mikrospektroskopsko sliko polistirenskih kroglic. S
tem smo pokazali uporabnost ramanske mikrospektroskopije za karakterizacijo kemijskih lastnosti opazovanih vzorcev na mikroskopski skali.
Na koncu podajamo ˇse preprost mehanski model, s katerim bi lahko predstavili elastiˇcno in neelastiˇcno Ramanovo sipanje v uˇcnem procesu.
62
Literatura
[1] P. J. Larkin, IR and Raman Spectroscopy: The Principles and Spectral
Interpretation, Elsevier Inc., Oxford, 2011
[2] A. F. Goncharov, Raman Spectroscopy at High Pressures, International
Journal of Spectroscopy, 2012, 1-16 (2012)
[3] http://www.spectroscopyonline.com/spectroscopy/Articles/LowResolution-Raman-Spectroscopy-in-Science-Educa/ArticleStandard/
Article/detail/673399 (13.4.2013)
[4] C. V. Raman, K. S. Krishnan, A New Type of Secondary Radiation,
Nature, 121, 501-502 (1928)
[5] R. Horn, Script to Lecture Raman Spectroscopy, Berlin, Fritz-Haber Institute of MPG, 2009.
[6] http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/e6/Sir CV
Raman.JPG (27.3.2013)
[7] J. J. Bohning, T. N. Mistra, M.Choudhury, The Raman effect, Calcutta,
American Chemical Society and Indian Association for Cultivattion of
Science, 1998.
[8] http://www.horiba.com/scientific/products/raman-spectroscopy/
history/ (1.4.2013)
[9] N. B. Colthup, L. H. Daly, S. E. Wiberley, Introduction to Infrared and
Raman Spectroscopy, Academic Press, Boston, 1990
[10] S. Chandra, Molecular Spectroscopy, Alpha Science, Oxford, 2009
[11] W. Demtr¨oder, Laser Spectroscopy Volume 2: Experimental Techniques,
Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Berlin, 2008
[12] J. Strnad, Fizika 2. del Elektrika. Optika, DMFA, Ljubljana, 2005
[13] http://users.abo.fi/mhotokka/mhotokka/lecturenotes/ms.html
(25.7.2013)
63
[14] E. Smith, G. Dent, Modern Raman Spectroscopy: A Practical Approach
(John Wiley Sons, Chichester, 2005)
[15] http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/37/Ethanol-2Dflat.png (30.7.2013)
[16] R. Alexander, Advantages of Raman Spectroscopy when analyzing Materials Through glass or Polymer Containers and in Aquesous Solution,
PerkinElmer, Zdruˇzene Drˇzave Amerike, 2008
[17] http://img.bhs4.com/44/6/44601248935f489062feaa31dc7c30f7f84b3d53
large.jpg (5.9.2013)
[18] http://www.gcsescience.com/cyclohexane.gif (5.9.2013)
[19] https://sl.m.wikipedia.org/wiki/Slika:Polystyrene formation.PNG
(30.7.2013)
[20] http://www.chem.ualberta.ca/ mccreery/images/Photo%20raman%20
intensity%20standard/polystyrene.jpg (30. 7. 2013)
[21] T. Dieing, O. Hollricher, J. Toporski, Confocal Raman Microscopy,
Springer, Berlin, 2010
[22] C. Palmer, Diffraction Grating Handbook, Newport Corporation, New
York, 2005
[23] Andor Technology, CCD Detectors: Course Notes, Andor Technology,
2003
[24] J. Strnad, Fizika 4. del Molekule. Kristali. Delci, DMFA, Ljubljana, 2005
[25] http://www.semrock.com/FilterDetails.aspx?id=LP02-785RS-25
(18.5.2013)
[26] http://www.semrock.com/FilterDetails.aspx?id=LL01-785-12.5
(18.5.2013)
[27] http://www.semrock.com/FilterDetails.aspx?id=FF757-Di01-25x36
(17.6.2013)
[28] Horiba Jobin Yvon Inc, iHR, Fully Automated Imaging Spectrometer:
User Manual, HORIBA Jobin Yvon, 2006
64
[29] http://www.horiba.com/fileadmin/uploads/Scientific/Documents/
OSD/OSD0020256BIDDLN.pdf (4. 10. 2013)
[30] http://www.mss.gov.si/fileadmin/mss.gov.si/pageuploads/podrocje/
ss/programi/2008/Gimnazije/UN FIZIKA strok gimn.pdf (25. 8. 2013)
[31] W. R. C. Somerwille et al., High performance Raman spectroscopy with
simple optical components, American Journal Physics, 78 , 671- 677
(Julij 2010)
65
Zahvala
Za pomoˇc, nasvete in ideje pri izdelavi diplomskega dela se zahvaljujem mentorju izr. prof. dr. Borisu Majaronu in somentorju dr. Zoranu Arsovu. Zahvala gre tudi kolegici Ani Varlec in njeni mentorici prof. dr. Maji Remˇskar
za pomoˇc pri uporabi komercialnega ramanskega mikroskopa na Reaktorskem centru v Podgorici. Zahvala gre tudi druˇzini in prijateljem, ki so mi
med ˇstudijem stali ob strani v dobrem in slabem.
66
Izjava o avtorstvu
Spodaj podpisani Grega Celcar, rojen 27. 4. 1987 v Rakiˇcanu, potrjujem,
da je predloˇzena diplomska naloga z naslovom
”Postavitev laboratorijskega sistema za ramansko mikroskopijo”
plod mojega samostojnega dela in da sem pri njenem pisanju upoˇsteval
doloˇcbe Pravilnika o diplomski nalogi.
Grega Celcar
Ljubljana, 12. maj 2014
67