Bachelor_katrine

BACHELOROPPGAVE I BIOINGENIØRFAG
Evaluering av DRI® ETG immunoassay på Cobas® 6000
Utprøving av en screeningsmetode for etylglukuronid (EtG) i urin
på Cobas® 6000
av
Katrine Kaino
Kristian Tverelv
Mai 2014
DET HELSEVITENSKAPELIGE FAKULTET
Institutt for medisinsk biologi
UiT – Norges Arktiske Universitet
FORORD
Dette er en avsluttende bachelor-oppgave i Bioingeniørfag ved Universitetet i Tromsø våren
2014. Laboratoriearbeidet ble utført ved fagområdet russcreening og medikamentanalyser,
seksjon 3 ved Laboratoriemedisin Universitetssykehuset Nord-Norge (UNN) Tromsø.
Arbeidet med oppgaven pågikk i perioden april til mai, og laboratoriearbeidet ble utført over
totalt 7 dager. Arbeidet med oppgaven har vært spennende, lærerikt og utfordrende.
Vi vil rette en stor takk til skriveveileder Thorsten Steiro Thoresen, for raske tilbakemeldinger
og svært grundig og god veiledning. Vi vil også rette en stor takk til fagveileder Elisabet
Tverelv Jakobsen, for god tålmodighet under opplæring på laboratoriet og i endeløse
spørsmålsseanser. Takk til dere begge for godt samarbeid og for at dere har hatt god tro på oss
gjennom hele perioden.
En takk sendes også til Anita Seljelund og Ole-Martin Fuskevåg på MS-laboratoriet ved UNN
Tromsø, for veiledning ved analysering av prøver på LC/MS-MS og hjelp med teorispørsmål
og korrekturlesing.
Tromsø 31. mai 2014
i
SAMMENDRAG
Bakgrunn
Laboratoriemedisin ved UNN Tromsø ønsker å prøve ut en screeningsmetode for
etylyglukuronid (EtG) i urin. Screeningsmetoden skal analyseres på Cobas® 6000 med et
Diagnostic Reagents Inc (DRI®) ETG immunoassay, og resultatene skal vurderes mot
etablert metode på væskekromatografi/tandem massespektrometri (LC/MS-MS).
Målet med oppgaven er å finne ut om DRI® ETG assayet er en god nok screeningsmetode for
EtG i urin for å unngå å analysere negative prøver på LC/MS-MS, samt om rekvirenter
raskere kan få tilgang på negative prøvesvar.
Metode
Tilfeldige anonymiserte spoturinprøver (n=117) ble analysert i duplikat med DRI® ETG
assayet på Cobas® 6000, og på LC/MS-MS. Mellom-seriepresisjon på Cobas® 6000 ble
utført med kontrollprøver i to nivåer, og innen-seriepresisjon ble utført med tre av de tilfeldige
prøvene i tre utvalgte nivåer.
Resultat
Resultatene viste at det er godt kvalitativt samsvar mellom DRI® ETG assayet og
LC/MS-MS. Det bør tas høyde for en potensiell feilkilde med DRI® ETG assayet på Cobas®
6000 og urinprøver med svært høy optisk densitet. I tillegg bør det vurderes om analysen skal
ha en gråsone rundt beslutningsgrensen (cut-off) tilsvarende metodens impresisjon.
ii
Liste over forkortelser
Forkortelse
Definisjon
ADH
Alkohol dehydrogenase
ALAT
Alanin aminotransferase
ALDH
Aldehyd dehydrogenase
ASAT
Aspartat aminotransferase
CDT
Carbohydate deficient transferrin
CV
Variasjonskoeffisient
CYP2E1
Cytochrome P450 2E1
DRI®
Diagnostic Reagents Inc
ECLIA
Electrochemiluminescence immunoassay
EIA
Enzym immuno-assay
EMIT®
Enzyme multiplied immunoassay technique
ESI
Elektrospray ionisering
EtG
Etylglukuronid
EtS
Etylsulfat
FAEE
Fettsyre etylestere
G6P
Glukose-6-fosfat
G6PDH
Glukose-6-fosfat-dehydrogenase
GGT
Gammaglutamyl transferase
HEtG
Etylglukuronid i hår
ISE
Ion selective electrode
LC/MS
Væskekromatografi/massespektrometri
LC/MS-MS
Væskekromatografi/tandem massespektrometri
iii
m/z-ratio
Masse til ladning ratio
MCV
Mean corpuscular volume
MEOS
Microsomal ethanol oxidizing system
NAD
Nikotinamid adenin dinukleotid
Peth
Fosfatidyletanol
SRM
Selected reaction monitoring
SULT
Sulfotransferase
UGT
uridin-5`-difosfo-glukuronosyltransferase
UNN
Universitetssykehuset Nord-Norge
UPLC®
Ultra performance liquid chromatography
iv
INNHOLDSFORTEGNELSE
1
INNLEDNING .................................................................................................................. 1
1.1
ETANOLMETABOLISME .......................................................................................... 1
1.2
TRADISJONELLE MARKØRER FOR ALKOHOLINNTAK ................................... 2
1.2.1
CDT ........................................................................................................................ 2
1.2.2
GGT........................................................................................................................ 3
1.2.3
MCV ....................................................................................................................... 3
1.2.4
ASAT OG ALAT ................................................................................................... 3
1.2.5
ETANOL ................................................................................................................ 4
1.3
ETG ............................................................................................................................... 5
1.4
ETS ............................................................................................................................... 6
1.5
KLINISK NYTTEVERDI AV ETG OG ETS .............................................................. 6
1.6
KREATININ ................................................................................................................. 7
1.7
KREATININJUSTERING ........................................................................................... 7
1.8
RUSMIDDEL-SCREENING ....................................................................................... 8
1.10
COBAS® 6000 .......................................................................................................... 9
1.11
DRI® ETG ASSAY ................................................................................................. 10
1.12
LC/MS-MS .............................................................................................................. 11
1.13 PROBLEMSTILLING ............................................................................................... 13
2
MATERIALE OG METODE ........................................................................................ 14
2.1
KJEMIKALIER DRI® ETG ASSAY ........................................................................ 14
2.2
KJEMIKALIER LC/MS-MS ...................................................................................... 14
2.3
DRI® ETG ASSAY PÅ COBAS® 6000 ................................................................... 15
2.4
ETG OG ETS METODE PÅ LC/MS-MS .................................................................. 16
2.5
PRØVEMATERIALE ................................................................................................ 17
2.6
PROSEDYRE ............................................................................................................. 17
v
2.7
BEHANDLING AV RESULTATER ......................................................................... 19
3
RESULTATER ............................................................................................................... 20
4
DISKUSJON.................................................................................................................... 23
5
4.1
INNEN-SERIE- OG MELLOM-SERIEPRESISJON ................................................ 23
4.2
BETYDNING AV URINENS EGENFARGE ........................................................... 24
4.3
SAMMENLIGNING AV RESULTATER ................................................................. 24
4.4
DRI® ETG ASSSAYET SOM SCREENINGSMETODE ......................................... 26
4.5
FALSKE POSITIVE ................................................................................................... 26
4.6
FALSKE NEGATIVE ................................................................................................ 28
KONKLUSJON .............................................................................................................. 30
LITTERATURLISTE ............................................................................................................ 31
6
VEDLEGG ...................................................................................................................... 34
6.1
PRØVERESULTATER COBAS® 6000.................................................................... 34
6.2
INNEN-SERIEPRESISJON COBAS® 6000 ............................................................. 37
6.3
MELLOM-SERIEPRESISJON COBAS® 6000 ........................................................ 37
6.4
PRØVERESULTATER LC/MS-MS .......................................................................... 38
vi
1 INNLEDNING
1.1 ETANOLMETABOLISME
Alkoholmisbruk er et av de største helseproblemene i verden i dag. Ved inntak av alkohol
(etanol), absorberes 20 % i magesekken og 80 % i tynntarmen. Menneskekroppen har ulike
mekanismer som bryter ned og skiller ut etanolen som inntas (fig. 1).
Omlag 90 til 95 % av etanolen oksideres i leveren av bl.a. alkohol dehydrogenase (ADH). Et
av oksidasjonsproduktene er acetaldehyd, som er assosiert med mange patologiske effekter av
etanol. Acetaldehyd oksideres videre av aldehyd dehydrogenase (ALDH) til acetat. En
alternativ nedbrytningsvei for etanol er via microsomal ethanol oxidizing system (MEOS). I
utgangspunktet er det lite etanol som oksideres via MEOS, men ved kronisk høyt inntak vil
MEOS (hovedsakelig enzymet CYP2E1) utvides, slik at kroppens evne til å bryte ned etanol
øker. CYP2E1 oksiderer i likhet med ADH etanol til acetaldehyd, men har større affinitet for
substratet. CYP2E1 er en del av Cytokrom P-450-familien av enzymer.
Oksidasjonsproduktene skilles ut i urinen. (1)
Av de resterende 5 til 10 % av etanolen vil i underkant av 5 % skilles ut direkte via urin,
svette og respirasjon. Resten vil bli tatt hånd om av ikke-oksidative nedbrytningsveier i
leveren (2). Mindre enn 0,05 % av etanol konjugeres med glukuronidsyre av
uridin-5`-difosfo-glukuronosyltransferase (UGT) til etylglukuronid (EtG). En omtrent like
stor andel vil konjugeres til etylsulfat (EtS) av sulfotransferase (SULT). Sistnevnte
konjugering utføres med sulfat (3).
En liten fraksjon av etanol vil bli påkoplet fettsyrer og fosfolipider. Dette gir produktene
fettsyre etylestere (FAEE) og fosfatidyletanol (PEth). Figur 1 visualiserer de ulike
nedbrytningsveiene for etanol. Flere av produktene fra etanolmetabolismen kan benyttes til å
overvåke et etanolinntak.
1
ALAT, ASAT
Plasmamarkører for
vevs- eller organskade
CDT
MCV
Assosiert med mange
patologiske effekter
av etanol
GGT
NAD+ NADH
Oksidativ:
CH3CH2OH
(Etanol)
ADH
NAD+ NADH
CH3CHO
(Acetaldehyd)
FAEE Syntase
Ikke-oksidativ:
Fosfolipase
UDP-Glukuronosyltransferase (UGT)
Sulfotransferase (SULT)
ALDH
CH3COOH
(Acetat)
Fettsyre etylestere (FAEE)
Fosfatidyletanol (PEth)
Etylglukoronid (EtG)
Etylsulfat (EtS)
Figur 1 Oksidativ og ikke-oksidativ metabolismeveier for alkohol (etanol). Alanin aminotransferase (ALAT),
aspartat aminotransferase (ASAT), carbohydrate deficient transferrin (CDT), mean corpuscular
volume (MCV), gammaglutamyl transferase (GGT), alkohol dehydrogenase (ADH), aldehyd
dehydrogenase (ALDH), nikotinamid adenin dinukleotid (NAD) (egen figur modifisert fra (2)).
1.2 TRADISJONELLE MARKØRER FOR ALKOHOLINNTAK
Tradisjonelt har det ikke vært vanlig å analysere direkte metabolitter fra nedbrytning av
etanol. Det har vært mer vanlig å analysere plasmamarkører som oppstår som en
skadevirkning av alkoholmisbruk. Figur 1 gir en oversikt av de forskjellige markørene som
kan brukes ved stort alkoholinntak over lengere tid.
1.2.1 CDT
Et av produktene av skadevirkningen, er carbohydrate deficient transferrin (CDT). Transferrin
er et transportprotein som transporterer jern i plasma. Det er flere ulike karbohydratgrupper
festet til transferrin. CDT vil mangle disse karbohydratgruppene, helt eller delvis.
Et stort inntak av alkohol over lengere tid, det vil si rundt en uke med 50 g alkohol eller mer
per dag, vil gi en økning av CDT. Kun økt konsentrasjon av CDT har klinisk interesse. Det er
ikke sett noen sammenheng mellom lav CDT i plasma og patologiske tilstander. CDT kan øke
også uten inntak av alkohol, blant annet ved leversykdommer. Det er også observert økte
2
verdier hos kvinner i siste trimester av graviditeten. Oppfølging av misbrukspasienter og
diagnostikk av misbruk bør derfor ikke baseres kun på CDT-verdier. Som regel blir bl.a.
gammaglutamyl transferase (GGT) og mean corposcular volume (MCV) vurdert sammen med
CDT. (4)
1.2.2 GGT
GGT er et membranbundet enzym som det finnes mest av i leveren, men er også lokalisert i
andre organer som f.eks. prostata, nyrene og pankreas. Enzymets funksjon er å flytte
glutamylgrupper til peptider og proteiner, i tillegg til at det har en hydrolytisk funksjon på
enkelte peptider.
I og med at enzymet er lokalisert i flere ulike organer, er det mange tilstander i kroppen som
kan gi patologiske plasmaverdier. Leversykdom på grunn av alkoholmisbruk er kun en av
disse tilstandene. Andre typer leversykdom kan også gi økte plasmaverdier. Ved vurdering av
GGT er det i hovedsak kun økte verdier om har klinisk interesse. GGT har en halveringstid i
plasma på 1 – 2 uker. Dette gir GGT potensiell nytteverdi som kontroll ved avrusning og
generelt av alkoholikere som avslutter alkoholinntaket. (2) (4)
1.2.3 MCV
En annen markør for skadevirkning av langvarig alkoholmisbruk, er økt MCV. MCV er en
analyse av gjennomsnittlig volum av røde blodceller. Ved langvarig alkoholmisbruk vil MCV
kunne øke, fordi dette fører til at utviklingen av erytroblastene i beinmargen forstyrres. Økt
MCV kan også sees ved mange andre patologiske tilstander og er derfor en meget lite
spesifikk indikasjon på alkoholmisbruk. Ved stopp i alkoholinntak etter langvarig misbruk, vil
man se en meget langsom nedgang av MCV. (4)
1.2.4 ASAT OG ALAT
ALAT er et enzym som hovedsakelig finnes i leveren. ALAT overfører en aminogruppe fra
alanin til α-ketoglutarat, som resulterer i pyruvat og glutamat. Både pyruvat og glutamat kan
gå inn i ureasyklusen. ALAT finnes hovedsakelig i leveren, og høye plasmakonsentrasjoner
gir relativt god spesifisitet for leversykdom. En patologisk høy plasmaverdi sier allikevel
ingenting om hvilken leversykdom pasienter lider av. (4)
3
ASAT er et enzym som finnes i mange ulike celler og vev, men har høyest konsentrasjon i
lever, hjerte og skjelettmuskulatur. Enzymet overfører en aminogruppe fra aspartat til
α-ketoglutarat. Det gir produktene oksaloacetat og glutamat. Oksaloacetat er i likhet med
pyruvat og glutamat, en komponent som kan gå inn i ureasyklusen. (4)
De to enzymene ASAT og ALAT kan brukes som markører på skadevirkning av
alkoholmisbruk. Da ASAT ikke er et spesifikt leverenzym, vil det alene ikke være en god
markør for leverskade. De to enzymene sammen kan derimot brukes til å vurdere omfang av
leverskade. Forholdet mellom ASAT og ALAT er interessant på grunn av at ASAT har to
ulike isoenzymer, der et er lokalisert i cytoplasma og et er lokalisert i mitokondriene. Ved
cellenekrose vil både ASAT fra mitokondriene og cytoplasma lekke ut i plasma, mens ved
celleskade vil kun ASAT fra cytoplasma lekke ut. Hvis forholdet mellom ASAT og ALAT
blir høyt, vil det derfor være mistanke om alvorlig leverskade. ASAT og ALAT kan allikevel
ikke brukes til å diagnostisere at en leverskade skyldes alkoholmisbruk, da alle patologiske
forhold som gir uttalt leverskade vil gi høye verdier. (2) (4)
1.2.5 ETANOL
De ulike plasmamarkørene for skadevirkning av alkoholmisbruk kan være til hjelp ved
overvåking av pasienter over tid. For derimot å påvise et nylig inntak av alkohol, er den mest
objektive måten å måle etanol direkte i serum eller urin. Analysen kan f.eks. utføres ved
mistanke om kjøring i alkoholpåvirket tilstand. Ved analyse av etanol i serum, vil prøvesvaret
gi et korrekt bilde på hva som er tilfellet der og da. En positiv serumprøve betyr at pasienten
har inntatt alkohol i løpet av de siste timene og fortsatt er påvirket. Ved analyse av etanol i
urin, vil det være mulig å konkludere med at det har vært et inntak i løpet av det siste døgnet.
Omtrent 12 timer etter inntak vil ikke lenger etanol kunne påvises i serum. (4)
Ved overvåking av alkoholikere, vil analyse av etanol i serum kun gi et bilde av hva pasienten
har inntatt de siste timene før prøven blir tatt. Prøveresultatet vil ikke si noe om hva som har
hendt de siste dagene. I tillegg kan analyse av etanol i urin gi et falskt positivt resultat. Ulike
mikroorganismer benytter sukker i en fermenteringsprosess der etanol er produktet. Det
muliggjør bl.a. etanoldannelse in vitro i urin som stammer fra pasienter med diabetes.
4
Da etanol raskt elimineres fra kroppen og har et smalt deteksjonsvindu, er andre metabolitter
foretrukket for å påvise nylige eller langvarig alkoholinntak. EtG er en god kandidat, på grunn
av at den har et lengere deteksjonsvindu i urin enn etanol.
1.3 ETG
Den kjemiske formelen til EtG er H8C12O7 (fig. 2).
EtG er en ikke-flyktig, vannløselig komponent med
lang holdbarhet ved -20 °C (6). Det er en direkte
metabolitt av etanol, som dannes av enzymet UGT
i leveren. Flere isoformer av enzymet kan danne
EtG (7). EtG elimineres via nyrene.
Da EtG har lengere halveringstid enn etanol, er det
mulig å oppdage et alkoholkonsum også etter at
etanol er totalt eliminert fra kroppen. Schmitt et al
Figur 2 Molekylstruktur (2S,3S,4S,5R,6S)6-ethoxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2carboxylic acid (EtG) (5).
rapporterte en halveringstid for EtG på 2 til 3 timer i serum (8). Ifølge Dahl et al er det
imidlertid mulig å detektere EtG i urin i opptil 80 timer etter alkoholinntak (9). Nøyaktig hvor
lenge EtG kan detekteres i urin, varierer allikevel ut fra mengden konsumert alkohol.
EtG er en direkte metabolitt av etanol, og kan derfor benyttes som biomarkør på
alkoholinntak. Dette bekreftes av Wurst og Metzger, som konkluderer med at EtG er en god
kandidat som biomarkør for alkoholinntak (10). EtG er meget spesifikk, i og med at det kun
dannes fra etanol. Verken alder, kjønn eller etnisitet har vist å ha innvirkning på mengden
utskillelse av EtG i urin ved alkoholinntak.
I tillegg til å bli detektert i urin, kan EtG også detekteres i både hår og negler. Morini et al
konkluderte med at analyse av EtG i hår (HEtG) gir en meget god indikasjon på kronisk
alkoholmisbruk over lengere tid (11).
Kharbouche et al bekrefter at HEtG er en god og pålitelig markør for alvorlig og langvarig
alkoholmisbruk. Resultatene viste også at HEtG var mer pålitelig enn de tradisjonelle
markørene GGT, CDT, ASAT og ALAT. Vurdering av HEtG alene gav samme konklusjon
som når HEtG ble vurdert sammen med disse. Hver for seg viste dessuten de tradisjonelle
5
markørene å ha dårlig pålitelighet. Forfatterne konkluderte med at HEtG er bedre enn de
tradisjonelle markørene for overvåkning og påvisning av langvarig alkoholmisbruk. (12)
Wurst et al fant at i tillegg til å benytte EtG som markør for alkoholinntak, kan også EtS
benyttes. (13)
1.4 ETS
Den kjemiske formelen til EtS er C2H6O4S
(fig. 3). EtS er som nevnt en direkte metabolitt av
etanol, som dannes av enzymet SULT i leveren. EtS er
meget sensitiv og spesifikk for alkoholinntak, og har
alle fordelene EtG har. I og med at EtG og EtS dannes
fra etanol i to ulike metabolismeveier, vil det øke
sensitiviteten å bruke begge parameterne (13). Ved
Figur 3 Molekylstruktur ethyl
hydrogen sulfate (EtS) (14).
Laboratoriemedisin UNN Tromsø, vurderes alltid EtG
og EtS sammen.
1.5 KLINISK NYTTEVERDI AV ETG OG ETS
Som tidligere nevnt, har etanol kortere halveringstid i serum enn EtG. Dermed kan analyse av
EtG gi et bilde av pasientens inntak av alkohol de siste dagene. Konsentrasjonen av EtG i urin
vil avhenge av hvor stort inntak pasienten har hatt og hvor lenge siden det ble inntatt. Analyse
av EtG benyttes ofte på pasienter som inngår i et avrusningsprogram. Junghanns et al fant at
analyse av EtG og EtS i urin var til stor hjelp for å verifisere avhold hos pasienter på
avrusning (15).
Det er ikke uvanlig at alkoholikere har så alvorlig leversvikt, at de behøver en
levertransplantasjon. Erim et al har vist at pasienter som er levertransplantasjons-kandidater
ikke rapporterer korrekt om sitt alkoholkonsum. Studien gikk ut på at pasientene skulle føre et
skjema over alkoholkonsum selv, i tillegg til at de frivillig skulle avgi urinprøve.
Pustemålinger av alkohol ble også gjennomført. Ingen av pasientene i studien rapporterte om
alkoholkonsum, men det ble detektert EtG i urinprøvene til halvparten av pasientene. Det var
også flere pasienter som ikke avga urinprøve ved flere anledninger. Dette kan indikere at flere
av pasientene enn de som ble identifisert av analysen, hadde konsumert alkohol. Studien
6
indikerer at det er behov for oppfølging med urinprøver hos pasienter med leversvikt, som står
i kø til levertransplantasjon. (16)
Wurst et al fant at EtG er en markør som kan ha stor nytte i mange forskjellige situasjoner
utover overvåking og behandling av alkoholmisbruk. Dette kan være bl.a. i yrker der
alkoholbruk medfører risiko, som f.eks. sjåfører, piloter eller leger. Det er også en markør
som er svært nyttig innen rettsmedisin. Hvis det stilles et kvalitativt spørsmål ang. nylig
alkoholinntak, er EtG den foretrukne analysen. (17)
Noe som reduserer klinisk nytteverdi av EtG og EtS i urin, er at urinkonsentrasjonen varierer
individuelt og med væskeinntak. Urinprøver som skal til analyse kan også bli manipulert,
enten før eller etter prøvetaking. I denne forbindelse øker klinisk nytteverdi ved å vurdere
kreatininkonsentrasjon i urinprøven.
1.6 KREATININ
Kreatinin er et avfallsstoff i kroppen, som dannes ved at kreatin-fosfat spaltes til fosfat, vann
og kreatinin. Reaksjonen skjer spontant uten enzymatisk hjelp og er irreversibel. Kreatinfosfat utgjør størsteparten av skjelettmuskulaturens energilager. Hastigheten til spaltingen av
kreatin-fosfat er til en viss grad proporsjonal med skjelettmuskelmasse. Kreatinin vil fordele
seg i kroppens væske. Det er ikke rapportert at kreatinin er toksisk for kroppen. En person
med høy skjelettmuskelmasse vil ha mer kreatinin i blodet, enn en person med lav
skjelettmuskelmasse. Konsentrasjonen av kreatinin vil også variere med inntak av mat. F.eks.
vil et stort inntak av rødt kjøtt eller fisk føre til høyere konsentrasjon av kreatinin i blod. (4)
Kreatinin skilles ut gjennom nyrene. Kreatininkonsentrasjonen i urin tilsvarer i hovedsak hvor
mye kreatinin som filtreres i glumeruli, fordi det ikke blir reabsorbert eller aktivt sekrert i
nyretubuli. Noe kreatinin kan allikevel reabsorberes hos personer med lav diurese. Et
menneske med normale nyrer, som har konstant funksjon og et fast kreatinininntak, vil ha en
døgnurin-kreatinin som er tilnærmet stabil. (4)
1.7 KREATININJUSTERING
Ved rusmiddelanalyser i urin vil konsentrasjonen av rusmiddelet variere med
urinkonsentrasjonen. Kreatininkonsentrasjonen kan brukes som et mål på hvor konsentrert
urinen er. En normal, nyrefrisk person har meget sjeldent verdier under 2 mmol/L. Lavere
verdi tyder på at urinprøven er fortynnet. Den vanligste manipulasjonsmetoden er å fortynne
7
prøven enten ved å drikke veldig mye vann like før prøvetaking, eller å tilsette vann direkte i
prøveglasset. Vurdering av kreatininkonsentrasjonen vil derfor gi informasjon om prøvens
representativitet, og avdekke evt. manipulasjon av prøvematerialet.
Helander et al anbefaler en nedre grense på 2 mmol/L for å påvise en fortynnet urinprøve.
Forfatterne understreker allikevel at en kreatininkonsentrasjon under denne grensen, ikke
automatisk bør tolkes som juks og dermed positiv prøve. Det er fordi en slik lav
kreatininkonsentrasjon i visse tilfeller kan skyldes andre årsaker enn tilsiktet manipulasjon.
(18)
Fysiologisk urin varierer i konsentrasjon utfra væskeinntak og hydreringsstatus. Da
rusmiddelkonsentrasjonen varierer med urinkonsentrasjonen, blir det ikke sammenliknbart å
vurdere rusmiddelkonsentrasjonen i en fysiologisk fortynnet urinprøve mot en konsentrert
urinprøve. Ved å kreatininjustere resultatene tas det høyde for slike konsentrasjonsforskjeller.
Når det gjelder EtG og EtS kan altså kreatininjusterte resultater brukes til å vurdere mulige
nye inntak av alkohol, da slike resultater kan sammenlignes over tid. Ved Laboratoriemedisin
UNN Tromsø kreatininjusteres analyse av EtG og EtS, samt cannabinoider (hasj) før de gis ut
til rekvirent.
1.8 RUSMIDDEL-SCREENING
Kvantitering og spesifikk påvisning av lege- og rusmidler krever en sensitiv og spesifikk
metode. Slike analyser utføres derfor som regel på f.eks. et
væskekromatografi/massespektrometri (LC/MS) system. Analysemetodene på slike systemer
er ofte kompliserte og tidkrevende. I tillegg kreves spesialisert personell til å drifte
instrumentene. Dette medfører et kostnadsnivå i form av instrumenter, reagenser og ekstra
personell ikke alle laboratorier kan forsvare.
Som et alternativ er det vanlig å benytte immunologiske screeningsmetoder. En
screeningsmetode er kvalitativ, og brukes til å skille mellom positive og negative prøver.
Slike metoder er ofte enklere å ta i bruk, og kan utføres på instrumenter laboratoriet allerede
har uten ekstra personellbehov. Immunologiske metoder er i tillegg raskere, og kan ta unna
mange prøver på kort tid.
De fleste rusmiddelprøvene som analyseres, blir analysert i forbindelse med behandling eller
diagnostikk av pasienter. Disse prøvene blir kalt IS-13 prøver. Det finnes i tillegg IS-14
8
prøver, som analyseres i forbindelse med rettslige forhold. Positive prøvesvar på IS-14 prøver
kan således gi grunnlag for alvorlige rettslige og personlige konsekvenser. Dette kan være
f.eks. å miste samvær med egne barn, miste skoleplass, miste arbeidsplass og lignende.
Immunologiske screeningsmetoder er ikke like spesifikke som LC/MS. Ofte har de spesifisitet
for flere beslektede molekyler, f.eks. flere typer benzodiazepiner eller cannabinoider. Ifølge
helsedirektoratet er allikevel immunologiske screeningsmetoder gode nok til å påvise positive
IS-13 prøver. IS-14 prøver med positivt screening-resultat må derimot bekreftes på en
spesifikk ikke-immunologisk metode. Bekreftelsesmetoden må ivareta rettstoksikologiske
krav. Ifølge helsedirektoratet ivaretar f.eks. væskekromatografi/tandem massespektrometri
(LC/MS-MS) disse kravene, og metoden kan derfor brukes til bekreftelse av positive prøver.
Negative prøver behøver ingen bekreftelse, verken for IS-13 eller IS-14 prøver. Dette gjelder
dersom det ikke er noen mistanke om manipulasjon av prøvematerialet. Screeningsmetoder er
derfor også aktuelt for laboratorier som analyserer IS-14 prøver, da tidsbesparelsen ved å luke
ut negative prøver før analyse på LC/MS-MS kan være betydelig. (19) (20)
1.10
COBAS® 6000
Cobas® 6000 (Roche) er en helautomatisk
modulær analytisk plattform. Systemet kan
tilknyttes moduler for klinisk kjemi og
immunkjemi, og er tilpasset både
kvantitative og kvalitative in vitro
bestemmelser av mange ulike analytter.
Systemet kan utføre ion selective electrode-
Illustrasjon av Cobas® 6000 med c501 og e601 (21).
(ISE) og spektrofotometriske metoder på
c501 moduler, samt electrochemiluminescence immuno assay (ECLIA) metoder på e601
moduler. DRI® ETG assayet er en spektrofotometrisk metode som utføres på c501.
c501 består av tre hovedkomponenter i tillegg til ISE; prøve-, reagens- og reaksjonssystem.
Prøve- og reagenspipetter har egne rensestasjoner, hvor pipettespissene renses inn- og
utvendig mellom hver pipettering. Reagenssystemet benytter reagenskassetter, og behandling
av nye og brukte kassetter er helautomatisk; nye kassetter tas inn, åpnes og lagres, gamle
kassetter kasseres. Reagensrommet holder en optimal temperatur på 4 °C. Reaksjonssystemet
består av en roterende disk med reaksjonsceller, en fotometrisk måleenhet og et
9
cellerensesystem. Disken er omgitt av et inkubasjonsbad som holder 37 ± 0,1 °C. Blanding av
reaksjonsløsninger gjøres med ultralydmikser. (22)
c501 tilfredsstiller kravene til DRI® ETG assayet, ved at det er i stand til å opprettholde en
konstant reaksjonstemperatur, pipettere prøver, blande reagenser, måle enzymatiske
hastigheter ved 340nm og tidsberegne reaksjonen nøyaktig (23). Informasjon om utførelsen
av assayet er lagret i en analyseapplikasjon. Alle analyser som utføres på Cobas® 6000 har en
tilhørende applikasjon installert i kontrollenheten. Applikasjonene inneholder instrukser for
hvordan de respektive analysene skal utføres. Applikasjonen for DRI® ETG assayet er
utarbeidet av Thermo Fisher, og er tilpasset Cobas® 6000 c501.
1.11
DRI® ETG ASSAY
DRI® ETG (Thermo Fisher) er et flytende, homogent kompetitivt enzym immuno-assay
(EIA). Assayet benytter musmonoklonale anti-EtG-antistoffer, som ikke viser signifikant
kryssreaksjon med andre glukoronidforbindelser. (23)
Assayet har samme prinsipp som enzyme multiplied immunoassay technique (EMIT®)
teknologi. EMIT® er mye brukt ved kvalitativ, kvantitativ og semi-kvantitativ bestemmelse
av lege- og rusmidler i serum eller urin. Prinsippet går ut på at det er konkurranse for en
bestemt mengde spesifikke antistoff-bindingssteder mellom fritt EtG fra urinprøven og EtG
merket med enzymet glukose-6-fosfat dehydrogenase (G6PDH). Antistoffer som ikke binder
til EtG fra urinprøven, binder enzymmerket EtG. Enzymet er designet slik at når antistoff
binder enzymmerket EtG blir det deaktivert. Ved lav konsentrasjon av fritt EtG fra
urinprøven, vil en større del av mengden antistoff binde enzymmerket EtG og dermed
reduseres enzymaktiviteten. Ved høy konsentrasjon av fritt EtG fra urinprøven, vil en større
del av mengden antistoff binde fritt EtG og en mindre del antistoff binde enzymmerket EtG.
Dermed vil enzymaktiviteten være større. Dette fenomenet skaper et direkte forhold mellom
fritt EtG i urinprøven og enzymaktiviteten. (23) (24) (25)
Enzymet G6PDH omdanner NAD+ til NADH ved følgende reaksjon:
D-glukose-6-fosfat + NAD+ ⎯⎯⎯⎯⎯⎯ 6-fosfoglukonolakton + NADH + H+ (26)
10
Enzymmerket
EtG
Kofaktor
NAD
Substrat
G6P
Aktivert
Enzym
Produkt
NADH
Figur 4 Illustrasjon av den enzymatiske reaksjonen i DRI® ETG assayet. G6PDH med kofaktor og
substrat danner NADH, som absorberer lys ved 340nm. (egen figur)
NADH absorberer lys ved 340nm. Raten på absorbansendringen vil tilsvare enzymaktiviteten
til G6PDH, og kan avleses spektrofotometrisk.
Assayet kan brukes kvantitativt og semi-kvantitativt med cut-off grense på 500 eller 1000
ng/ml for å skille negative og positive prøver.
Produsenten understreker at DRI® ETG assayet kun gir et foreløpig ubekreftet resultat, og
anbefaler at positivt resultat bekreftes av en mer spesifikk alternativ metode (23). For
rusmiddeltesting på IS-14 prøver der positivt prøvesvar kan få rettslige konsekvenser for
pasienten, er det som nevnt et krav at positiv screening skal bekreftes med en metode som
ivaretar rettstoksikologiske krav, f.eks. LC/MS-MS.
1.12
LC/MS-MS
Væskekromatografi/tandem massespektrometri er en
analysemetode som måler masse til ladning (m/z) ratio for
ladde partikler. På grunn av høy spesifisitet og
sensitivitet, er LC/MS-MS mye brukt til påvisning og
kvantitering av lege- og rusmidler. Ved MS-laboratoriet
UNN Tromsø benyttes elektrospray ionisering (ESI)
LC/MS-MS i selected reaction monitoring (SRM) modus
til analyse av mange ulike legemidler og rusmidler, bl.a.
Illustrasjon av et Xevo TQ-S tandem
massespektrometer (27).
EtG og EtS i urin.
11
Systemet er bygget opp slik at forbindelsene i prøveløsningen overføres fra væskefase ved
atmosfærisk trykk til gassfase i vakuum. Opparbeidet prøveløsning innføres via ultra
performance liquid chromatography (UPLC®), som separerer forbindelsene i prøven basert
på deres affinitet til stasjonær fase i kromatografikolonnen. Analyttene i mobilfasen går
deretter videre inn i ESI-proben, hvor løsemiddelet samt analytter går over til gassfase ved
bruk av varme, høy spenning og en tørkegass (nitrogen). Dette skjer ved at prøveløsningen
sendes gjennom et tynt kapillærrør, hvor kapillærspissen har påsatt elektrisk spenning. Det
elektriske feltet fører til at prøveløsningen ved utgangen av kapillærspissen danner en aerosol
av ladde dråper. Nitrogengassen som strømmer langs kapillærrøret forsterker dannelsen av
aerosol, samtidig som dråpene føres mot inngangen til massespektrometeret. De ladde
dråpene minker i størrelse ved at løsemiddelet fordamper, noe som framskyndes ved å bruke
en strøm av varm gass foran ioniseringskilden. Ladde ioner vil «løsne» fra dråpene og dermed
overføres til gassfase. Ionene føres videre inn i massespektrometeret som holdes under
vakuum. (28)
Et tandem massespektrometer er bygget opp av en detektor og to masseanalysatorer i serie
adskilt av en kollisjonscelle. Masseanalysatorene sorterer ioner basert på deres m/z-ratio ved
hjelp av et justerbart elektrisk felt. Analyttioner kan manipuleres ved bruk av
elektromagnetiske frekvensfelt slik at disse får en stabil reisebane igjennom instrumentet helt
til detektoren. (28)
I kollisjonscellen kolliderer ioner selektert av den første masseanalysatoren med en inert gass,
slik at kovalente bindinger brytes, noe som resulterer i fragmentdannelser. Når molekyler
brytes ned i fragmenter, vil ulike forbindelser gi et fragmentmønster som er ulikt andre
molekylers mønster (kjemisk fingeravtrykk). Det opprinnelige ionet kalles mor-ionet, og
fragmentene kalles datter-ioner. Den andre masseanalysatoren sorterer datter-ionene med
samme prinsipp som den første. (28)
Ønskede ioner som har passert gjennom masseanalysatorene treffer detektoren. Detektoren
danner en elektrisk strøm proporsjonal med mengden ioner (intensitet) som treffer den per
tidsenhet. Informasjonen behandles i et dataprogram, som lager et massespekter over
molekylmasse og intensitet. (28)
12
Ved å analysere i SRM-modus får systemet svært høy spesifisitet og sensitivitet da den
kjemiske støyen reduseres betraktelig. SRM går ut på at begge masseanalysatorene selekterer
på spesifikke masser. Den første analysatoren låses på mor-ionets m/z-ratio, den andre låses
på m/z-ratio til et eller flere datter-ioner. Da datter-ionene er et direkte produkt av mor-ionet,
vil denne teknikken danne et unikt «fingeravtrykk» for analytten. Ved å bruke et eller flere
datter-ioner til kvantiteringen, fås en svært spesifikk kvantiteringsmetode. Det er usannsynlig
at flere forbindelser i organisk prøvemateriale har samme m/z-ratio for mor-ionet, med de
samme spesifikke datter-ioner. Unntaksvis kan dette gjelde beslektede isomerer. (29)
Bruk av internstandard under opparbeidelse av prøver før analysering øker presisjon og
riktighet. En kjent mengde internstandard tilsettes prøvematerialet, standarder og kontroller
før disse opparbeides. Dette vil korrigere for evt. tilfeldige feil under prosessen med å
klargjøre prøvene for analyse, og variasjoner ved innføring av prøve via UPLC® eller i
ioniseringsprosessen. Hvis noe prøvemateriale går tapt, vil tilsvarende mengde internstandard
gå tapt. Ved analysering med ESI LC/MS-MS gir bruk av isotopmerkede internstandarder det
beste resultatet, da disse korrigerer best for ioneundertrykkelse/ioneforsterkning som kommer
fra prøvematrisen. Ved kvantitering brukes forholdet mellom internstandard og analytt
(respons) mot standardkurve. (28)
1.13 PROBLEMSTILLING
Det overordnede formålet med oppgaven var å finne ut om DRI® ETG assayet er en god nok
screeningsmetode for EtG i urin. Laboratoriet har allerede en etablert metode for analyse av
EtG og EtS på LC/MS-MS, som ble brukt som referansemetode.
Da alkohol finnes i mange andre produkter enn drikkevarer, kan EtG påvises i urinprøver uten
at vedkommende har drukket alkohol. Derfor har referansemetoden en etablert cut-off grense
(2,5 µmol/L) for å redusere antallet falske positive prøver til et minimum. Cut-off grensen er
satt på bakgrunn av kliniske vurderinger.
DRI® ETG assayet benytter cut-off grense anbefalt av produsenten (500 ng/ml). Målet var å
vurdere metodens innen-serie- og mellom-seriepresisjon i området rundt beslutningsgrensen
(cut-off), og vurdere samsvaret mellom resultatene fra DRI® ETG assayet og LC/MS-MS.
13
2 MATERIALE OG METODE
2.1 KJEMIKALIER DRI® ETG ASSAY
Alle kjemikalier ble oppbevart ved 4 °C.
Tabell 1 Kjemikalier brukt i DRI® ETG assayet
Type
Navn
Produktnr
LOT
Holdbarhet
Reagens A
Antistoff/substrat
Reagens E
Enzymkonjugat
10011723
60178626
2014-08
Kalibrator
DRI® EtG negativ kalibrator
10011207
59883091
2015-01
Kalibrator
DRI® EtG kalibrator 100 ng/ml
10011208
60050313
2014-07
Kalibrator
DRI® EtG kalibrator 500 ng/ml
10011210
59807121
2014-07
Kalibrator
DRI® EtG kalibrator 1000 ng/ml
10011212
60050312
2014-11
Kalibrator
DRI® EtG kalibrator 2000 ng/ml
10011213
60186722
2014-07
Kontroll
DRI® EtG 375 ng/ml kontroll
10012135
60420589
2015-06
Kontroll
DRI® EtG 625 ng/ml kontroll
10012136
59883094
2014-07
2.2 KJEMIKALIER LC/MS-MS
MS-laboratoriet ved UNN Tromsø lager de fleste reagenser selv. Kalibratorer og kontroller
lages ved å tilsette EtG/EtS arbeidsløsning (750 µmol/L) til blank urin fra frivillig
alkoholavholdende donor. EtG/EtS arbeidsløsning lages fra stamløsning. Internstandard lages
ved å tilsette 460 µl penta-deuteriummerket d5-EtG stamløsning og 270 µl d5-EtS
stamløsning til 100 ml Milli-Q-vann. Alle stamløsninger lages ved å tilsette 3ml metanol til
1mg/ml respektiv ampulle EtG/ EtS/ d5-EtG/ d5-EtS fra Cerilliant. Stamløsninger og negativ
donorurin oppbevares ved -20 °C. Ferdig opparbeidede kalibratorer og kontroller oppbevares
ved -70 °C. Internstandard oppbevares i kjøleskap ved 4 °C. (30)
14
Tabell 2 Kjemikalier brukt ved analyse av EtG/EtS på LC/MS-MS
Type
Navn
Kontroll
Kontrollprøve EtG/EtS 40 µmol/L
Kontroll
Kontrollprøve EtG/EtS 4 µmol/L
Internstandard
d5-EtG/d5-EtS i Milli-Q-vann
Blank
Urin fra etanolavholdende donor
Kalibrator
Standard EtG/EtS 100 µmol/L
Kalibrator
Standard EtG/EtS 50 µmol/L
Kalibrator
Standard EtG/EtS 10 µmol/L
Kalibrator
Standard EtG/EtS 5 µmol/L
Kalibrator
Standard EtG/EtS 1 µmol/L
Mobil fase A
0,1 % maursyre
Mobil fase B
100 % metanol
2.3 DRI® ETG ASSAY PÅ COBAS® 6000
DRI® ETG assayet ble utført på Cobas® 6000 som en fotometrisk metode på c501 med
kinetisk avlesning. Assayet ble brukt semikvantitativt. En cut-off grense på 500 ng/ml ble
brukt for å skille positive og negative prøver.
Reagenser overføres til en tom reagenskassett av type Cobas® CDC-302. Reagens A og
reagens E overføres til hhv. posisjon B og C. EtG-applikasjonen definerer CDC-302 som
DRI® ETG reagenser, og reagens A og E som hhv. reagens R1 og R3:
-
R1: Antistoff-/substratreagens inneholder musmonoklonalt anti-EtG-antistoff,
glukose-6-fosfat (G6P) og NAD i Tris-buffer med natriumazid som konserveringsmiddel
-
R3: Enzymkonjugat-reagens inneholder EtG-derivat merket med G6PDH i Tris-buffer
med natriumazid som konserveringsmiddel
c501 tidsberegner i sykluser. En hel rotasjon av reaksjonsdisken er definert som 1 syklus, og
tar ca. 8,5s (8,57s = 1 syklus). En bikromatisk fotometrisk avlesning utføres ved spesifiserte
bølgelengder en gang per syklus.
14 µl prøvemateriale inkuberes med 80 µl R1 i 300s. Deretter tilsettes 80 µl R3, og
reaksjonsløsningen inkuberes i ytterligere 45s. Deretter måles enzymaktiviteten bikromatisk
15
ved primær/sekundær bølgelengde på 340/415nm i 51s. Prøvens EtG konsentrasjon beregnes
ut fra målt ∆abs i henhold til standardkurve og faktorer. Resultater rapporteres i ng/ml.
En 5-punkts polynomisk standardkurve lages ved å analysere kalibratorer i duplikat. DRI®
ETG assayet har et oppgitt måleområde fra 100 – 2000 ng/ml. (23)
23985
Absorbanskurve prøve #93 DRI® ETG assay på Cobas 6000
Abs
20105
16225
3
4
40
45
12345
1
2
8465
4585
0
5
10
15
20
25
30
35
50
55
60
65
Syklus
70
Figur 5 Absorbanskurve på DRI® ETG assayet for en tilfeldig valgt prøve. 1. Prøvemateriale og R1
inkuberes sammen i ca. 300s. Anti-EtG-antistoffer vil binde evt. fritt EtG fra prøven. 2. Deretter
tilsettes R2, og absorbansen faller noe pga. fortynningseffekt. Evt. resterende anti-EtG-antistoffer
vil nå binde enzymmerket EtG. 3. Etter en inkubering på ca. 45s starter målingen av
reaksjonshastigheten, som vil være proporsjonal med mengden fritt EtG fra prøven. 4. Målingen
skjer over ca. 51s. ∆abs for prøven beregnes, og EtG konsentrasjonen bestemmes ved hjelp av standardkurven.
2.4 ETG OG ETS METODE PÅ LC/MS-MS
Kvantitering av EtG og EtS er en del av rutinen på MS-laboratoriet ved UNN Tromsø. Til
opparbeiding av prøvemateriale benyttes en Freedom Evo® (Tecan) pipetteringsrobot.
Roboten overfører 50 µl prøvemateriale og 950 µl internstandard til en prøveblokk, og
blander løsningen.
LC/MS-MS systemet består av et Acquity UPLC® I-Class System (Waters) tilkoplet et Xevo
TQ-S (Waters) tandem massespektrometer.
Analysen benytter en Acquity HSS T3 2.1x100 mm kolonne. Injeksjonsvolum er 1 µl, flow
rate ~0,5 ml/min og total analysetid ~2 min. ESI brukes i negativ ion modus.
16
EtG/EtS konsentrasjoner beregnes ut fra forholdet mellom arealet av EtG/EtS datter-ion og
d5-EtG/d5-EtS datter-ion i massespektret, i henhold til standardkurven. Analysen utføres i
MRM modus, med massene 221→75.1 og 221→85.1 for EtG, og 125→97.1 for EtS.
Kriterier for et positivt svar er at alle datter-ioner til forbindelsen må være tilstede, og
konsentrasjonen for hvert datter-ion må ligge i samme nivå. For EtG benyttes datter-ion med
høyest intensitet til kvantitering. Kvantitering utføres i MassLynx MS Software (Waters,
USA). Resultater rapporteres i µmol/L. For å skille positive og negative prøver benyttes
cut-off grense på 2,5 µmol/L.
En lineær standardkurve lages ved å analysere kalibratorer i duplikat. Prøvesekvens er
standardrekke, kontroller og blank, ukjente prøver, kontroller.
2.5 PRØVEMATERIALE
Overflødig materiale fra anonymiserte spoturinprøver (n=117) fra laboratoriets rutinedrift ble
brukt til evalueringen av DRI® ETG assayet. Positive prøver (n=31) ble samlet fra
rutinedriften (LC/MS-MS) over en periode på tre måneder før evalueringen startet. Utover
dette ble tilfeldige utvalgte prøver fra rus-screening (n=68) og urinlab (n=18) brukt. Alle
prøver ble alikvotert i tre eksemplarer, og lagret ved -20 °C inntil analyse. Ferdig analyserte
prøver ble lagret videre ved -20 °C. EtG har vist seg stabil ved en slik lagringstemperatur (6).
2.6 PROSEDYRE
To av alikvotene ble brukt til å analysere alle prøver i paralleller på Cobas® 6000. Den tredje
alikvoten ble analysert på LC/MS-MS. Da LC/MS-MS er en sensitiv metode, bør ikke prøver
ha vært i et annet instrument først pga. fare for kontaminering.
Da vi startet alikvoteringen av tilfeldige utvalgte prøver, ble prøvemateriale overført i
sarstedtrør ved helling. Vi oppdaget raskt at ved å helle prøvematerialet kom det mye bunnfall
over i det siste av de tre alikvotene. Vi bestemte oss for å bruke pasteurpippetter til
alikvoteringen av resterende prøver, da det var lettere å unngå overføring av uønsket utfelling.
Samtidig med alikvoteringen ble alle prøver merket med barkode og labnummer fra 0 til 116.
Før analysering på Cobas® 6000, ble prøvene tint, blandet opp og stående en tid på benk for å
sedimentere. Noen av de tilfeldige utvalgte prøvene ble ikke frosset før analyse på Cobas®
17
6000, men analysert direkte og frosset etterpå. Alle prøvene som skulle til analyse på MSlaboratoriet ved UNN Tromsø ble oppbevart ved -20 °C inntil analyse.
Analyseringen på Cobas® 6000 ble utført over fem dager, med opphold i helg og helligdager.
To av dagene var påfølgende. Det ble opprettet en egen profil på analyseinstrumentet for våre
prøver. Dette innebærer at instrumentet automatisk rekvirerte kreatinin og EtG på urinprøver
som ikke tilhørte rutinen. I tillegg til prøvene ble det analysert kontroller. Kontrollene ble
analysert i Hitachi-kopper. Kontroller ble analysert daglig over en periode på en måned, men
opphold i helger og helligdager. På dagene vi analyserte prøver, ble kontrollene analysert flere
ganger. Enkelte dager ble de analysert opp til seks ganger. I tillegg ble analysen rekalibrert
ved reagensskifte, og kontroller analysert etter kalibreringen.
Tre prøver ble identifisert som kandidater til å sjekke analysens innen-seriepresisjon på
instrumentet. Prøvene var hhv. Omtrent 400, 500 og 600 ng/ml. De tre prøvene ble analysert i
serie (n=21). Prøvene ble alikvotert i både hitachi-kopper og mikro-kopper, alt ettersom hvor
mye materiale som var tilgjengelig. Der vi ikke hadde nok til 21 alikvoter, ble prøvene
analysert på nytt til vi hadde 21 resultat. I denne sammenheng ble re-run for analysen avslått,
slik at prøvene kom ut av instrumentet straks etter pipettering. Det ble beregnet middelverdi,
standardavvik og variasjonskoeffisient (CV) på innen-seriepresisjon.
Ca. en uke etter at de siste prøvene ble analysert på Cobas® 6000, ble prøvene analysert på
LC/MS-MS. Alikvotene som var beregnet til dette ble tint, blandet opp og montert i egne rack
til pipetteringsroboten. Prøvene, kalibratorene, kontrollene og internstandardløsning ble
plassert i roboten. Opparbeidingen av prøveløsning i blokk ble så utført automatisk. På to av
prøvene feilet roboten og prøvematerialet ble ikke pipettert. Disse to prøvene ble derfor
pipettert manuelt. En blokk har plass til 88 prøver i tillegg til kalibratorer og kontroller. Det
ble derfor brukt to blokker. Prøveblokkene ble forseglet med silikonmatte, og lagret kjølig for
analyse senere på dagen. Prøvenes barkodene ble scannet inn i MassLynx for å få korrekt
prøveidentifikasjon på resultatene.
18
2.7 BEHANDLING AV RESULTATER
Excel 2010 (Microsoft, USA) ble brukt til behandling og formatering av resultater,
utregninger, statistiske beregninger og grafisk framstilling. Resultater fra Cobas® 6000 ble
ført inn i Excel manuelt. Resultater fra LC/MS-MS ble overført til Excel direkte fra
MassLynx.
19
3 RESULTATER
Kontrollskjema DRI® EtG 375 ng/ml (n=40)
2SD
Target
-2SD
Kontrollmålinger over tid
Figur 6 Kontrollskjema for DRI® EtG 375 ng/ml på Cobas® 6000. Striplet linje er kusum (kumulert
avvik). Punktene viser kontrollmålingenes avvik fra målverdi i antall standardavvik.
Kontrollgrensene er beregnet ut fra en CV på 10 %, som er bestemt på bakgrunn av kliniske
vurderinger.
Kontrollskjema DRI® EtG 625 ng/ml (n=40)
2SD
Target
-2SD
Kontrollmålinger over tid
Figur 7 Kontrollskjema for DRI® EtG 625 ng/ml på Cobas® 6000. Striplet linje er kusum
(kumulert avvik). Punktene viser kontrollmålingenes avvik fra målverdi i antall
standardavvik. Kontrollgrensene er beregnet ut fra en CV på 10 %, som er bestemt på
bakgrunn av kliniske vurderinger.
20
Tabell 3 Mellom-seriepresisjon DRI® ETG på Cobas® 6000 (n=40)
Middel
ng/ml
Median
ng/ml
Range
ng/ml
SD
ng/ml
CV %
DRI® EtG 375
388
388
96
19,8
5,1
DRI® EtG 625
637
635
69
17,2
2,7
Kontroll
Tabell 4 Innen-seriepresisjon DRI® EtG på Cobas® 6000 (n=21)
Middel
ng/ml
Median
ng/ml
Range
ng/ml
SD
ng/ml
CV %
Prøve #113
413
414
56
15,7
3,8
Prøve #47
528
531
78
20,0
3,8
Prøve #95
591
591
59
16,9
2,9
Prøve
Tabell 5 Sammenligning mellom ufortynnet og fortynnet prøveresultat for prøve #74. Prøven
hadde svært høy optisk densitet, og ufortynnet fikk parallell 2 en feilmelding.
Parallell 1
Parallell 2
Prøve #74
Kreatinin
mmol/L
EtG
ng/ml
Kreatinin
mmol/L
EtG
ng/ml
Ufortynnet
19,9
99
20,7
> Abs
Fortynnet 1:5*
21,3
245
23,5
230
* Resultatene er korrigert for fortynning
Ved vurdering av resultatene fra DRI® ETG assayet mot LC/MS-MS, ble parallell 1 benyttet.
Med en cut-off verdi på 500 ng/ml, ble 58 prøver detektert som positive og 59 prøver
detektert som negative på DRI® ETG assayet. På LC/MS-MS ble 59 prøver detektert som
positive og 58 prøver detektert som negative. Av totalt 117 prøver fikk 116 prøver samme
resultat på DRI® ETG assayet og LC/MS-MS (99,1 %). Det var en uoverensstemmende
prøve. Resultatene oppsummeres i tabell 6.
21
Tabell 6 Sammenligning av kvalitative resultater mellom DRI® ETG assayet og LC/MS-MS for alle
prøver (n=117). Ved å bruke resultater fra LC/MS-MS som referanse, var sensitiviteten til
DRI® ETG assayet 98,3 % og spesifisiteten 100 %.
LC/MS-MS
+
Cobas® 6000
+
58
0
-
1*
58
* Prøve #47 hadde negativt resultat på parallell 1, og positivt resultat på parallell
2 på DRI® ETG assayet. For alle andre prøver gav begge paralleller samme
kvalitative resultat.
Kji-kvadrat ble benyttet til å sjekke om det var sannsynlig at resultatene mellom DRI® ETG
assayet og LC/MS-MS var signifikant forskjellige. Testen indikerte at det ikke var signifikant
forskjell (p = 0,89).
Korrelasjonen mellom semi-kvantitative resultater fra DRI® ETG assayet (n=16) og
kvantitative resultater fra LC/MS-MS ble vurdert ved å beregne korrelasjonskoeffisient
(r = 0,97). Prøver med EtG konsentrasjoner over eller under måleområdet til DRI® ETG
assayet (n=101) ble ikke tatt med i beregningen.
22
4 DISKUSJON
4.1 INNEN-SERIE- OG MELLOM-SERIEPRESISJON
Tabell 4 viser resultater for innen-seriepresisjon på Cobas® 6000. Resultatene viser at
metodens CV er høyere under og ved cut-off grensen (500 ng/ml) enn over. Selv om CV er
høyere i lavt enn høyt område, ser vi at range er bedre på det laveste nivået. Det er vanskelig å
få en lav CV ved lavere konsentrasjoner enn høye, fordi samme konsentrasjonsendring gir
større prosentvis utslag. Hvis vi sammenligner CV for innen-seriepresisjon med prøve #95
(tabell 4) med CV for mellom-seriepresisjon for kontrollen ETG 625 (tabell 3), er innenseriepresisjonen dårligere ved omtrent samme konsentrasjonsnivå. Dette kan skyldes at innenseriepresisjon ble utført med pasientprøver, mens mellom-seriepresisjon ble utført med rene
kontrollprøver. Kontrollprøvene består av renset humant urin tilsatt rent EtG, og det kan
tenkes at pasientprøver med matriksforskjeller kan gi større svingninger i resultatene.
Da laboratoriet etablerte rus-screening på analyseinstrumentet Cobas® 6000, ble det på
bakgrunn av kliniske vurderinger bestemt at kontrollgrenser beregnet fra en CV på 10 % var
godt nok. Vi brukte samme kontrollgrenser ved evalueringen av DRI® ETG assayet.
Tabell 3 viser resultatene for mellom-seriepresisjon på Cobas® 6000. Middelverdi er nær
målverdi for begge kontroller. Median er lik middelverdi for begge kontroller. CV er en del
høyere ved lavt enn ved høyt kontrollnivå. Range viser også at det er større svingninger i
resultatene til lav kontroll. Dette visualiseres i figur 6, der kontrollmålingene er veldig spredt.
Kusum (kummulert avvik) viser først en oppadgående trend, men går ned mot slutten av
målingene. På det antallet målinger vi har, viser kusum at de fleste målingene er over
målverdi.
Figur 7 visualiserer målingene for høy kontroll. Det er tydelig at metoden har mindre
svingninger i resultatene her. Kusum holder seg jevnt over og under målverdi, og viser ingen
spesiell tendens. Målingene er jevnt spredt rundt målverdi.
Immunologiske metoder har som regel høyere CV enn tradisjonelle klinisk kjemi metoder.
Våre resultater viser at begge kontroller er langt bedre enn fastsatt kontrollgrense. Mellomseriepresisjon for DRI® ETG assayet er også bedre enn mange av laboratoriets øvrige russcreeningmetoder.
23
4.2 BETYDNING AV URINENS EGENFARGE
Ved analysering av EtG i prøve #74 rapporterte c501 feilkode «< abs» på parallell 1 (P1).
Parallell 2 (P2) ble analysert uten feilkode. Det ble kjørt automatisk re-run på P1, med samme
feilkode.
Brukermanualen til Cobas® 6000 forklarer feilkoden med at prøvens optiske densitet er så
høy at de fotometriske målingene blir usikre. Begge alikvotene ble fortynnet1:5 med saline,
og analysert på nytt. Tabell 5 viser resultatene før og etter fortynning. Etter fortynning var
EtG konsentrasjonen for P1 omtrent 3 ganger høyere enn før fortynning. P2 har ikke resultat
før fortynning. Resultatene for P1 og P2 etter fortynning er gode paralleller.
Den aktuelle prøven var svært mørk gul, den mørkeste av alle prøvene. Da kun en av
alikvotene fikk feilkode, kan det tyde på at prøvens optiske densitet ved 340nm var i
grenseland for hva instrumentet takler. Pga. at resultatet for EtG etter fortynning var høyere
enn før fortynning, kan det se ut som at analysen har en øvre grense for hvor høy optisk
densitet prøvematerialet kan ha før resultatet blir usikkert. Det kan virke som at denne grensen
er lavere enn grensen for feilmelding.
Den aktuelle prøven hadde negativt resultat både på Cobas® 6000 og LC/MS-MS. I dette
tilfellet hadde derfor ikke fenomenet noe å si for den kvalitative bestemmelsen.
Dette fenomenet ble kun observert i en av prøvene våre. I tillegg hadde denne prøven en EtG
konsentrasjon nær metodens nedre målegrense, som kan gi målingene ekstra usikkerhet. Vi
forsøkte å finne flere prøver med tilsvarende eller mørkere egenfarge uten å lykkes. Ved en
evt. etablering av DRI® ETG assayet i rutinen, bør en derfor vurdere om prøver med en
optisk densitet over en viss grense automatisk fortynnes før analyse.
4.3 SAMMENLIGNING AV RESULTATER
Resultatene for EtG på Cobas® 6000 har gode paralleller i metodens måleområde. For
konsentrasjoner over måleområdet, blir parallellene gradvis dårligere jo høyere
konsentrasjonen blir. Da metoden brukes semi-kvantitativt, har ikke presisjonen over
måleområdet betydning for å skille positive og negative prøver.
24
På prøver med EtG konsentrasjoner over måleområdet til DRI® ETG assayet, var det dårlig
samsvar mellom semi-kvantitative resultater fra Cobas® 6000 og kvantitative resultater fra
LC/MS-MS. Flere prøver fikk rapportert omtrent samme svært høye EtG konsentrasjon på
LC/MS-MS. Ved å sammenligne resultatene for disse prøvene med resultatene fra Cobas®
6000, var det ingen sammenheng og resultatene varierte svært mye i begge retninger. Dette er
allikevel svært positive prøver, og resultatene var langt over måleområdet til DRI® ETG
assayet. Dette fenomenet har derfor ingen betydning for det kvalitative screenings-resultatet.
Prøver målt med DRI® ETG assayet som fikk rapportert EtG konsentrasjoner i metodens
måleområde, hadde godt samsvar med tilsvarende resultater på LC/MS-MS
(r = 0,97). Korrelasjonskoeffisienten forteller oss at det er en viss linearitet mellom
resultatene for de to metodene. Dette er vesentlig, da immunoassayets riktighet og presisjon i
og rundt beslutningsgrensen er det som er viktig for en screeningsmetode.
Tabell 6 viser en sammenligning av kvalitative resultater mellom Cobas® 6000 og
LC/MS-MS. Ved å bruke LC/MS-MS som referanse, er sensitiviteten 98,3 % og spesifisiteten
100 %.
P1 av prøve #47 ble negativ på DRI® ETG assayet, mens P2 av samme prøve ble positiv på
DRI® ETG assayet. EtG konsentrasjonen i denne prøven lå omtrent på cut-off verdi (500
ng/ml). Prøven ble brukt ved undersøkelse av innen-seriepresisjon på cut-off. Tabell 4 viser at
prøvens middelverdi ble målt til 528 ng/ml. Målt middelverdi er et sikrere anslag av prøvens
sanne verdi, og viser at prøven fikk et negativt resultat på DRI® ETG assayet pga. tilfeldige
feil. Dette støttes av den teoretiske testen, som indikerer at forskjellen i resultater mellom
Cobas® 6000 og LC/MS-MS skyldes tilfeldigheter (p = 0,89). Dette skyldes kun stort øvrig
samsvar i resultatene, da den teoretiske testen ikke tar hensyn til om en prøve er i en gråsone
eller ikke.
Sensitiviteten i dette tilfellet sier noe om testens evne til å identifisere alkoholmisbruk i
gruppen med resultat over cut-off grensen. Spesifisiteten sier noe om testens evne til å
identifisere alkoholavhold i gruppen med resultat under cut-off grensen.
Både sensitiviteten og spesifisiteten for DRI® ETG assayet er meget høyt. Dette kan skyldes
at de fleste av prøvene var klart positive eller klart negative. Kun noen få av prøvene (n=6)
25
hadde EtG konsentrasjoner rundt cut-off verdi (500 ± ~150 ng/ml), og én prøve hadde EtG
konsentrasjon omtrent på cut-off verdi. Det er i dette området spesifisiteten og sensitiviteten
må være god.
4.4 DRI® ETG ASSSAYET SOM SCREENINGSMETODE
Tiltenkt bruk for DRI® ETG assayet er screening av både IS-13 og IS-14 prøver. For IS-13
prøver kan det være hensiktsmessig med god spesifisitet, slik at man unngår falske positive
prøver. Dette skyldes at rekvirenten ikke alltid ber om at et positivt resultat
bekreftes/kvantiteres på LC/MS-MS. Dette kan føre til at falske positive får negative
konsekvenser for vedkommende. For IS-14 prøver hvor positivt resultat kan ha rettslige og
personlige konsekvenser, kan det være hensiktsmessig med god sensitivitet. Dette kommer av
at IS-14 prøver med positiv screeningsresultat, uansett sendes videre til LC/MS-MS for
bekreftelse.
En potensiell løsning er å etablere en gråsone på cut-off verdi tilsvarende DRI® ETG assayets
impresisjon. IS-13 prøver i gråsonen kan svares ut med inkonklusivt svar og IS-14 prøver i
gråsonen sendes til LC/MS-MS for bekreftelse. På denne måten kunne en unngå falske
positive IS-13 prøver. I tillegg vil rettslige prosesser avhengig av IS-14 prøvesvar ikke
avgjøres av falske negative svar pga. DRI® ETG assayets impresisjon. Alle prøveresultater
både fra rus-screening og LC/MS-MS blir sett over og evt. kommentert av medisinsk
ansvarlig lege før de gis ut til rekvirent.
4.5 FALSKE POSITIVE
Falske positive prøver kan skyldes metodens impresisjon, dårlig spesifisitet, uskyldig
eksponering for alkohol eller at EtG dannes i prøvematerialet in vitro.
EtG er en robust analytt mtp. oppbevaring av prøvematerialet. Stephanson et al viste at
urinprøver oppbevart ved 4 °C og ved romtemperatur i 14 dager, ikke viste signifikant
endring i EtG konsentrasjon. Urinprøver oppbevart ved -20 °C viste lang holdbarhet (6).
Helander et al har i etterkant vist at EtG både kan dannes og brytes ned in vitro gitt visse
betingelser. Dette var tilfellet dersom urinprøven inneholdt både E. coli bakterier og etanol.
Etanolen trenger ikke stamme fra nylig alkoholinntak. Som tidligere nevnt, er det mulig at
etanol dannes in vitro bakterielt ved fermentering av sukker. Forfatterne fant at i 35 % av
26
prøvene som inneholdt E. coli og etanol, ble det detektert EtG som ikke hadde vært i prøven
fra før. Prøvematerialet ble oppbevart ved romtemperatur. (31)
Dette kan være problematisk da analyse av EtG i urin ikke bare brukes som dokumentasjon på
avhold hos alkoholikere, men også i andre situasjoner som i skoler og på arbeidsplasser. I
tillegg brukes analyse av EtG post mortem som en markør for antemortem alkoholinntak. (31)
Uskyldig eksponering for etanol kan gi tilstrekkelig mengde ekskresjon av EtG til positivt
screenings-resultat. Dette er ikke falske positive i analytisk forstand, men de skyldes annen
eksponering enn etanolkonsum i form av drikkevarer. Reisfield et al fant at regelmessig bruk
av etanolbasert hånddesinfeksjon kan føre til ekskresjon av EtG i urin opptil fire ganger
høyere enn vanlig akseptert cut-off verdi (500 ng/ml) (32). Et slikt resultat ville blitt bekreftet
på LC/MS-MS, da det er en reell EtG konsentrasjon i prøven. Det er viktig at rekvirenter og
pasienter et tilstrekkelig informert om at utilsiktet eksponering for etanol kan gi positivt
resultat.
Personer som er med i et avholdsprogram, må derfor få beskjed om å holde seg unna all form
for alkohol. Informasjon om at det er alkohol også i andre kilder enn drikkevarer må gis.
Munnskyllevann, konfekter, hånddesinfeksjon og etterbarberingsvann kan inneholde etanol.
Inntak eller bruk av slike produkter, kan gi tilstrekkelige EtG konsentrasjoner i urin til et
positivt resultat.
Prøvematerialet som kommer inn til rusmiddel-screening ved Laboratoriemedisin UNN
Tromsø, har svært varierende utseende. Omtrent halvparten av prøvene brukt til denne
evalueringen ble plukket fra disse. Prøvene har svært varierende mengde utfelling, farge,
turbiditet og viskositet. Prøvene stammer fra klientell som potensielt utsetter kroppen sin for
«hard behandling». Det kan tenkes at det er større sjanser for at slike prøver oppfyller
betingelsene for in vitro endring av EtG konsentrasjonen. Derfor blir det viktig med korrekt
oppbevaring før analyse. I tillegg kan den store variasjonen i disse prøvenes matriks, ha
innvirkning på metodens presisjon.
Produsenten av DRI® ETG assayet har gjort spesifisitetsforsøk mot glukoronidforbindelser
som vanligvis finnes i urin, uten å finne noen signifikant kryssreaksjon. (23)
27
Arndt et al fant en mulig kryssreaksjon med trikloroetylglukuronid. Kryssreaksjonen kunne
ikke bekreftes pga. at trikloroetylglukuronid ikke var tilgjengelig i ren form (33).
Trikloroetylglukoronid er en metabolitt av kloralhydrat, som benyttes bl.a. som et beroligende
legemiddel og til kortidsbehandling ved alkoholabstinenser (34).
Arndt et al fant i en annen studie at DRI® ETG assayet kryssreagerer med
n-propylglukuronid. Jevnlig bruk av propanolbasert hånddesinfeksjonsmiddel gir samtidig
passiv inhalering av damp fra denne. Dette kan føre til tilstrekkelig inntak av propylalkoholer
og påfølgende ekskresjon av propylglukoronider. I studiet ble det brukt hånddesinfeksjon
hvert 15 min i 8 timer, som skulle simulere en vanlig arbeidsdag. Dette førte til ekskresjon av
tilstrekkelig propylglukuronider til et positivt resultat på DRI® ETG assayet. (35)
Dette er to eksempler på falske positive prøver pga. dårlig spesifisitet på DRI® ETG assayet.
I begge disse tilfellene ble det ikke påvist EtG med LC/MS-MS. Det er viktig at rekvirent har
tilstrekkelig informasjon om at immunologiske metoder har dårligere spesifisitet enn
LC/MS-MS, slik at de ikke stoler blindt på en positiv screening. Hvis pasienten nekter for
alkoholinntak, er det hensiktsmessig at prøven analyseres på LC/MS-MS i tillegg. Slike falske
positive vil ikke ha betydning for rettslige konsekvenser av IS-14 prøver, da disse uansett må
bekreftes på LC/MS-MS.
4.6 FALSKE NEGATIVE
Falske negative prøver kan skyldes metodens impresisjon, dårlig sensitivitet, manipulasjon av
prøvematerialet eller nedbrytning av EtG in vitro.
Helander et al fant i tillegg til at EtG kan dannes in vitro, at EtG kan bli nedbrutt in vitro.
Årsaken er at flere E. coli bakterier har enzymet β-glucuronidase som spalter EtG. Forfatterne
viste også at EtS konsentrasjonen ikke ble påvirket av verken E. coli eller etanol i
prøvematerialet. Avslutningsvis anbefalte forfatterne å måle både EtG og EtS, og vurdere dem
sammen for å fastslå alkoholkonsum. (31)
En svakhet med immunologiske metoder er muligheten til å manipulere prøvematerialet for å
få et negativt screenings-resultat. Helander et al drøfter problemstillingen med manipulasjon
av prøvematerialet ved fortynning, og bruk av kreatininmåling til å oppdage dette (18).
Forfatterne nevner eksempler på metoder for manipulering, f.eks. tilsetting av kjemikalier
som klorin, salt, syre, base eller detergent, som forstyrrer eller umuliggjør bruk av
28
immunologiske metoder. Det vanligste er derimot å vanne ut urinen, enten etter prøvetaking
eller in vivo ved å innta store mengder drikke. Ved å måle kreatinin i prøvematerialet, vil en
kunne vurdere om det er en ufortynnet fysiologisk prøve. Fortynnede prøver kan få så lav
rusmiddelkonsentrasjon at de faller under påvisningsgrensen for analyseinstrumentet og gir et
falskt negativt svar.
Prøvene som ble brukt i evalueringen av DRI® ETG assayet, var av svært varierende
egenfarge. Det ble ikke observert noen sammenheng mellom kreatininverdi og egenfarge, dvs.
at mørke prøver kunne ha lavere kreatininverdi enn lyse prøver og motsatt. Visuell vurdering
av prøvematerialet for å oppdage utvanning er derfor ikke mulig. F.eks. hadde vi en prøve
som lignet vann i farge, men hadde allikevel svært høy kreatininverdi. Noen av prøvene i
evalueringen hadde kreatininverdi < 2 mmol/L (n=4). Alle disse prøvene var positive for EtG
på begge metodene.
DRI® ETG assayet er ifølge produsenten egnet til analyse av urinprøver med pH i området
4,5 – 11 (23). For å unngå et usikkert resultat hvis prøvematerialet er tilsatt syre eller base,
kan c501 måle pH i prøven for å sjekke at prøvematerialet er egnet til analyse med DRI®
ETG assayet.
LC/MS-MS er en sensitiv og spesifikk metode, og det er vanskelig å manipulere
prøvematerialet slik at det forstyrrer metoden. Så lenge analytten er til stede i prøvematerialet,
vil det kunne påvises og kvantiteres. Unntaket vil være dersom prøvematerialet er tilsatt noe
som binder til analytten, slik at det feller ut som bunnfall. Dette kalles flokkulering.
29
5 KONKLUSJON
DRI® ETG assayets innen-serie- og mellom-seriepresisjon tilfredsstiller kravene satt på
bakgrunn av kliniske vurderinger. De kvalitative resultatene viste et meget godt samsvar
mellom DRI® ETG assayet og LC/MS-MS (99,1 %). Ved å bruke LC/MS-MS som referanse
fikk DRI® ETG assayet en beregnet spesifisitet og sensitivitet på hhv. 100 % og 98,3 %. Kun
en prøve hadde uoverensstemmende resultater. Den aktuelle prøven hadde en EtG
konsentrasjon like ved cut-off verdi, og resultatet kunne svinge begge veier pga. impresisjon.
For å unngå feilaktige screeningsresultater på prøver med en EtG konsentrasjon i området
rundt cut-off grense, bør det vurderes å etablere en gråsone tilsvarende DRI® ETG assayet
impresisjon.
Underveis i evalueringen ble det oppdaget en potensiell feilkilde med DRI® ETG assayet på
Cobas® 6000 og urinprøver med høy optisk intensitet. Før metoden evt. tas i bruk bør dette
undersøkes, evt. bør det etableres en øvre grense for prøvens egenabsorbans ved
340 nm med en automatisk fortynning av prøvematerialet.
Utfra våre resultater kan vi konkludere med at DRI® ETG assayet er en god nok
screeningsmetode for EtG i urin.
30
LITTERATURLISTE
1. Lieber CS. Microsomal Ethanol-Oxidizing System (MEOS): The First 30 Years (1968-1998)–
A Review.
Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 1999; vol 23, nr. 6: 991-1007.
2. Abudu N. Ethyl Glucuronide: A Sensitive Marker for Alcohol Consumption.
Warde Report. 2008; vol 19, nr. 3.
http://tinyurl.com/q7jpkbm (8.5.2014)
3. Böttcher M, et al. Evaluation of a New Immunoassay For Urinary Ethyl Glucoronide Testing.
Alcohol & Alcoholism. 2008; vol 43, nr. 1: 46-48.
4. Urdal P, et al. Brukerhåndbok Medisinsk Biokjemi. 4. utgave.
Stavanger: Akademisk Fagforlag AS; 2009.
5. ChemSpider. Search and Share Chemistry. Ethyl Glucoronide.
http://tinyurl.com/o4c8ago (19.5.2014)
6. Stephanson N, et al. Direct Quantification of Ethyl Glucuronide in Clinical Urine Samples by
Liquid Chromatography–Mass Spectrometry.
Therapeutic Drug Monitoring. 2002; vol 24, nr. 5: 645-651.
7. Foti RS, Michael B Fisher.Assessment of UDP-glucuronosyltransferase catalyzed formation
of ethyl glucuronide in human liver microsomes and recombinant UGTs.
Forensic Science International. 2005: vol 153: 109-116.
8. Schmitt G, et al. Ethyl glucuronide concentration in serum of human volunteers, teetotalers,
and suspected drinking drivers.
Journal of Forensic Sciences. 1997; nr. 42: 1099-1102.
9. Dahl H, et al. Comparison of Urinary Excretion Characteristics of Ethanol and Ethyl
Glucuronide.
Journal of Analytical Toxicology. 2002; vol 26: 201-204.
http://tinyurl.com/qbshdpa (8.5.2014)
10. Wurst FM, Metzger J. The Ethanol Conjugate Ethyl Glucuronide Is a Useful Marker of
Recent Alcohol Consumption.
Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 2002; vol 26, nr. 7: 1114-1119.
11. Morini L, et al. Ethyl glucuronide in hair. A sensitive and specific marker of chronic heavy
drinking.
Addiction. 2009; vol 104, nr. 6: 915-920.
31
12. Kharbouche H, et al. Diagnostic performance of ethyl glucuronide in hair for the investigation
of alcohol drinking behavior: a comparison with traditional biomarkers.
International Journal of Legal Medicine. 2012; vol 126, nr. 2: 243-250.
http://tinyurl.com/k8c9wuj (8.5.2014)
13. Wurst FM, et al. Ethyl sulphate: a direct ethanol metabolite reflecting recent alcohol
consumption.
Addiction. 2006; vol 101, nr. 2: 204-211.
14. ChemSpider. Search and Share Chemistry. Ethyl hydrogen sulfate.
http://tinyurl.com/n7ynfsy (19.5.2014)
15. Junghanns K, et al. Urinary ethyl glucuronide (EtG) and ethyl sulphate (EtS) assessment:
valuable tools to improve verification of abstention in alcohol-dependent patients during inpatient treatment and at follow-ups.
Addiction. 2009; vol 104, nr. 6: 921-926.
16. Erim Y, et al. Urinary ethyl glucuronide testing detects alcohol consumption in alcoholic liver
disease patients awaiting liver transplantation.
Liver Transplantation. 2007; vol 13, nr. 5: 757-761.
http://tinyurl.com/kejp938 (8.5.2014)
17. Wurst FM, et al. Ethyl glucuronide--the direct ethanol metabolite on the threshold from
science to routine use.
Addiction. 2003; vol 98, nr. 2: 51-61.
18. Helander A, et al. Kreatininkoncentrationen i urin bör mätas vid drogtestning.
Läkartidningen 2011. vol 108; nr. 24-25: 1311-1314.
19. Sosial- og Helsedirektoratet. Rundskriv IS-14/2002.
http://tinyurl.com/kss7u89 (9.5.2014)
20. Sosial- og Helsedirektoratet. Rundskriv IS-13/2002.
http://tinyurl.com/kj7xcv9 (14.5.2014)
21. Roche. Cobas® 6000 analyzer series.
http://tinyurl.com/o9als7v (22.5.2014)
22. Cobas® 6000 analyzer series. Operator's manual. Manual version 5.0.
23. Pakningsvedlegg Microgenics DRI® etylglukoronid-assay.
24. Wikipedia. Enzyme multiplied immunoassay technique.
http://tinyurl.com/lavl8pe (8.5.2014)
25. Thermo Fisher Scientific Inc. Drug Monitoring and Quality Control Products and
32
Instrumentation.
http://tinyurl.com/mjaazh2 (8.5.2014)
26. MetaCyc. SRI International. Enzyme: glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase.
http://tinyurl.com/ppshrgo (8.5.2014)
27. BGI Americas. Waters Xevo TQ-S.
http://tinyurl.com/p35jfkb (22.5.2014)
28. Hoffmann E, Stroobant V. Mass Spectrometry Principles and Applications. 4. utgave.
Chichester: John Wiley & Sons Ltd; 2007.
29. The University of Leeds. An Introduction to Mass Spectrometry.
http://tinyurl.com/cf62go (10.5.2014)
30. Kvantifisering av etylglukuronid og etylsulfat i urin (LC -MS-MS). Laboratoriemedisin UNN
Tromsø. Dok.nr. PR09216 v1. Gyldig fra 15.11.2012.
31. Helander A, et al. Postcollection Synthesis of Ethyl Glucuronide by Bacteria in Urine May
Cause False Identification of Alcohol Consumption.
Clinical Chemistry. 2007; vol 53, nr. 10: 1855-1857.
http://tinyurl.com/nv2k6ks (8.5.2014)
32. Reisfield GM, et al. Ethyl Glucuronide, Ethyl Sulfate, and Ethanol in Urine after Sustained
Exposure to an Ethanol-Based Hand Sanitizer.
Journal of Analytical Toxicology. 2011; vol 35: 85-91.
33. Arndt T, et al. False-positive ethyl glucuronide immunoassay screening associated with
chloral hydrate medication as confirmed by LC–MS/MS and self-medication.
Forensic Science International. 2009; nr. 184: e27-e29.
34. MedlinePlus. National Institute of Health. Chloral Hydrate.
http://tinyurl.com/8x9ypkf (15.5.2014)
35. Arndt T, et al. False-positive ethyl glucuronide immunoassay screening caused by a propyl
alcohol-based hand sanitizer.
Forensic Science International. 2012; nr. 223: 359-363.
33
6 VEDLEGG
6.1 PRØVERESULTATER COBAS® 6000
Prøvenr
10130000
10130001
10130002
10130003
10130004
10130005
10130006
10130007
10130008
10130009
10130010
10130011
10130012
10130013
10130014
10130015
10130016
10130017
10130018
10130019
10130020
10130021
10130022
10130023
10130024
10130025
10130026
10130027
10130028
10130029
10130030
10130031
10130032
10130033
10130034
10130035
10130036
Kreatinin
mmol/L
Parallell 1 Parallell 2
10,587
10,502
3,567
3,522
10,169
9,859
2,619
2,557
1,326
1,321
8,070
7,822
5,327
5,367
3,036
3,059
12,579
12,409
12,703
12,725
11,698
11,789
2,128
2,133
8,730
8,634
11,428
11,349
11,049
10,801
8,657
8,595
13,933
13,871
9,498
9,582
15,694
15,637
8,290
8,188
12,601
12,494
12,630
12,669
11,004
10,959
15,530
15,795
8,171
8,087
26,461
26,162
6,321
6,292
9,311
9,345
10,649
10,536
9,306
8,950
17,861
18,132
16,862
16,444
20,490
20,327
25,456
24,875
1,005
1,010
10,897
10,976
11,320
11,343
EtG
ng/ml
Parallell 1 Parallell 2
10213
10169
3905
3859
19784
19234
5284
4950
1538
1451
10586
10293
7721
7768
2868
2921
15167
14595
17477
17318
1303
1333
5219
5232
3632
3710
13852
13797
11181
10948
18779
18667
14345
13907
668
670
2621
2681
19235
18714
996
1019
5669
5724
16968
17202
12922
13127
879
875
4105
4164
5493
5480
21966
21899
8336
8389
21177
21098
2344
2412
40
31
76
94
0
0
8694
8602
30
35
0
0
Kommentar
34
10130037
10130038
10130039
10130040
10130041
10130042
10130043
10130044
10130045
10130046
10130047
10130048
10130049
10130050
10130051
10130052
10130053
10130054
10130055
10130056
10130057
10130058
10130059
10130060
10130061
10130062
10130063
10130064
10130065
10130066
10130067
10130068
10130069
10130070
10130071
10130072
10130073
10130074
101300741:5
10130075
10130076
10130077
10130078
10130079
6,879
18,306
1,744
12,443
12,376
31,585
16,788
22,612
14,384
5,293
6,603
11,365
15,084
22,482
11,484
12,821
9,847
11,411
16,975
8,634
12,590
16,010
4,949
6,242
1,400
28,464
9,526
7,218
21,529
2,833
11,123
28,526
12,855
2,094
24,429
5,847
12,731
19,945
6,749
18,064
1,688
12,844
12,285
31,855
16,636
22,877
14,266
5,169
6,659
11,168
15,231
22,432
11,665
12,906
9,757
11,490
16,755
8,854
12,782
16,202
5,023
6,230
1,405
28,329
9,605
7,218
20,959
2,794
11,078
28,447
12,816
2,083
24,881
5,835
12,793
20,749
41
20
3165
0
59
541
33
48
1734
97
488
6130
32
84
13
55
264
38
74
7030
11
26
108
43
7176
50
1438
29
2698
21
89
64
0
53
292
137
0
99
45
15
3251
0
48
597
15
40
1682
96
516
6125
43
63
35
59
274
21
76
7062
31
29
101
56
7304
68
1422
40
2599
31
99
81
0
40
291
138
0
-
21,330
12,161
9,667
7,274
7,127
9,599
23,535
12,127
9,763
7,607
7,178
9,667
245
38
21
72
0
15
230
11
23
87
0
9
Gråsone
> Abs
Resultat justert for fortynning
< Test Samp.C (Crea -0,034) - RERUN
35
10130080
10130081
10130082
10130083
10130084
10130085
10130086
10130087
10130088
10130089
10130090
10130091
10130092
10130093
10130094
10130095
10130096
10130097
10130098
10130099
10130100
10130101
10130102
10130103
10130104
10130105
10130106
10130107
10130108
10130109
10130110
10130111
10130112
10130113
10130114
10130115
10130116
11,862
33,419
19,424
9,938
20,366
25,293
19,300
20,394
8,194
9,644
24,683
18,871
11,642
19,853
16,467
11,236
21,043
11,033
20,265
28,261
6,874
2,715
12,308
14,994
17,082
5,271
6,586
11,134
21,088
26,348
5,028
9,582
3,132
15,998
6,907
3,443
2,867
11,732
34,079
19,424
9,994
20,643
25,140
19,672
20,519
8,228
9,577
24,017
18,882
11,631
19,582
16,360
11,162
21,325
10,993
20,462
28,058
6,953
2,737
12,534
14,943
17,313
5,35
6,507
11,106
20,97
26,325
5,034
9,515
3,036
15,524
7,009
3,443
2,873
7
142
14684
42
9
35
73
32
8
7
658
148
75
117
133
621
9710
96
4545
93
9611
6850
14877
9355
1192
1649
6480
5034
2544
2055
9690
7942
10408
394
105
4
17
0
156
14782
52
42
32
56
11
12
7
627
138
99
125
148
606
9860
62
4557
70
9701
6865
15577
9362
1175
1711
6459
4968
2507
2074
9741
8002
10556
367
107
19
17
36
6.2 INNEN-SERIEPRESISJON COBAS® 6000
Parallell
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
Ca. 400 ng/ml Ca. 500 ng/ml Ca. 600 ng/ml
Prøve #113
Prøve #47
Prøve #95
414
500
587
424
493
610
407
533
606
421
546
616
418
526
597
450
519
566
395
521
586
419
519
575
426
505
584
395
506
567
408
533
606
397
531
591
394
542
606
423
517
613
394
543
602
398
545
585
400
534
578
401
546
574
424
555
557
436
571
605
426
504
595
6.3 MELLOM-SERIEPRESISJON COBAS® 6000
DRI® ETG 375 ng/ml
Dato
8.4
9.4
10.4
10.4
10.4
10.4
10.4
10.4
11.4
13.4
14.4
14.4
Lot
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
Resultat ng/ml
388
436
395
400
391
376
419
414
414
368
413
363
DRI® ETG 625 ng/ml
Dato
8.4
9.4
10.4
10.4
10.4
10.4
10.4
10.4
11.4
13.4
14.4
14.4
Lot
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
Resultat ng/ml
644
653
653
657
664
653
654
629
636
625
617
638
37
14.4
14.4
14.4
14.4
15.4
15.4
15.4
15.4
17.4
18.4
19.4
20.4
20.4
21.4
22.4
22.4
22.4
22.4
22.4
23.4
25.4
25.4
29.4
30.4
5.5
6.5
7.5
8.5
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
60420589
389
371
401
421
377
413
340
380
385
363
385
403
401
395
362
388
379
379
401
389
388
356
362
393
376
387
382
380
14.4
14.4
14.4
14.4
15.4
15.4
15.4
15.4
17.4
18.4
19.4
20.4
20.4
21.4
22.4
22.4
22.4
22.4
22.4
23.4
25.4
25.4
29.4
30.4
5.5
6.5
7.5
8.5
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
59883094
645
630
634
642
617
624
607
626
645
618
612
651
649
622
634
658
608
630
666
668
676
623
637
645
626
626
628
627
6.4 PRØVERESULTATER LC/MS-MS
Resultater i kolonne merket med * er beregnet ut fra molekylvekt for EtG (222,193 g/mol).
Det er definert en arealgrense i MassLynx slik at resultater for prøver med konsentrasjoner under
ca. 0,8 µM ikke beregnes automatisk.
EtS
Prøvenr.
10130000
10130001
10130002
10130003
µmol/L
69,3
19,5
159,8
34,2
EtG
µmol/L
109,5
21,4
296,1
44,0
ng/ml*
24330
4759
65794
9783
Kommentar
Pipettert manuelt i blokk
38
10130004
10130005
10130006
10130007
10130008
10130009
10130010
10130011
10130012
10130013
10130014
10130015
10130016
10130017
10130018
10130019
10130020
10130021
10130022
10130023
10130024
10130025
10130026
10130027
10130028
10130029
10130030
10130031
10130032
10130033
10130034
10130035
10130036
10130037
10130038
10130039
10130040
10130041
10130042
10130043
10130044
10130045
10130046
10130047
9,7
34,5
33,3
10,5
249,8
237,4
2,5
6,8
4,4
114,5
33,4
62,9
233,5
7,5
10,0
393,6
3,9
8,9
510,5
263,1
3,4
13,4
21,8
154,1
20,9
154,2
11,6
17,5
1,3
8,6
4,5
7,8
1,8
10,4
49,1
45,3
13,2
428,6
836,2
6,9
23,2
19,3
209,2
67,9
151,6
360,0
4,3
17,6
1075,0
6,3
35,9
1368,6
412,1
3,8
23,6
33,6
535,0
62,5
541,2
13,6
44,8
15,4
2,9
9,7
2,8
2306
10919
10059
2931
95227
185798
1526
5159
4293
46492
15076
33693
79987
964
3911
238860
1398
7970
304098
91555
835
5235
7468
118873
13885
120246
3020
9945
3415
640
2151
613
39
10130048
10130049
10130050
10130051
10130052
10130053
10130054
10130055
10130056
10130057
10130058
10130059
10130060
10130061
10130062
10130063
10130064
10130065
10130066
10130067
10130068
10130069
10130070
10130071
10130072
10130073
10130074
10130075
10130076
10130077
10130078
10130079
10130080
10130081
10130082
10130083
10130084
10130085
10130086
10130087
10130088
10130089
10130090
10130091
32,1
0,7
0,1
0,1
17,9
28,6
3,0
11,8
2,5
480,6
1,2
-
41,0
1,9
40,7
36,4
7,3
16,0
1,7
1475,6
3,2
-
9112
427
9034
8097
1618
3562
371
327866
715
-
Pipettert manuelt i blokk
40
10130092
10130093
10130094
10130095
10130096
10130097
10130098
10130099
10130100
10130101
10130102
10130103
10130104
10130105
10130106
10130107
10130108
10130109
10130110
10130111
10130112
10130113
10130114
10130115
10130116
0,8
1,6
33,3
14,3
39,9
13,9
264,8
449,7
6,6
4,3
25,8
32,1
12,4
17,4
66,5
47,3
102,6
1,5
-
2,8
93,6
28,4
54,6
33,9
437,3
1594,6
6,6
8,3
51,8
42,8
15,7
14,6
178,8
92,7
259,7
2,1
-
624
20786
6315
12123
7521
97165
354309
1469
1849
11516
9517
3480
3251
39733
20591
57712
460
-
Prøve var gråsone på Cobas® 6000
41