Tillåter smart design

kristallografins år 2014
Tillåter smart design
[Av Elisabeth Sauer-Eriksson, Kemiska Institutionen, Umeå universitet, Anders Liljas,
Institutionen för biokemi och strukturbiologi, Lunds universitet, Helena Käck, Discovery Sciences,
AstraZeneca R&D, Mölndal]
Hur och varför binder målprotein och förhoppningsfull
läkemedelsmolekyl till varandra? Den frågan kan den snabbt växande
makromolekylära kristallografin svara på.
M
akromolekylär kristallografi
har genomgått en fantastisk
utveckling sedan metoden
på allvar började tillämpas i
slutet av 1960-talet. Under de senaste 2030 åren har antalet deponerade strukturer
i proteindatabanken ökat exponentiellt. En
milstolpe värd att nämna passerades i maj
2014 då struktur nummer 100 000 publicerades i proteindatabanken (www.rcsb.org).
Redan vid analysen av de allra första proteinstrukturerna stod det klart att även små
molekyler bundna till proteiner kan påvisas.
De allra första icke-proteinmolekylerna som
identifierades från en proteinkristallstruktur var hem-gruppen, bunden till hemoglobin och myoglobin, och allteftersom proteinstrukturernas upplösning och kvalitet
förbättrades kunde även mindre molekyler
som vatten och enatomjoner identifieras.
Intressant är att man redan på 70-talet
började använda hemoglobinstrukturen
som mall för att utforma nya hem-liknande molekyler med funktion att stabilisera
proteinet, ett exempel på tidig strukturbaserad design [1].
I Sverige var karboanhydras det första
proteinet som strukturbestämdes med
röntgenkristallografi [2]. Proteinet är involverat i flera sjukdomar och den första
strukturen har följts upp av ett antal strukturer av proteinet i komplex med olika inhibitorer, varav några idag är läkemedel
som används bl a för behandling av epilepsi och glaukom.
På 80- och 90-talet utvecklades kristallografin allt snabbare med etablering
av nya synkrotroner, mätningar vid låg
temperatur (100 K), snabbare detektorer och ökad datorkapacitet. Istället för
att ta år kunde nu strukturer bestämmas
inom månader. Parallellt utvecklades även
andra discipliner som organisk syntes
och beräkningskemi. Samtidigt började
nya angreppssätt och koncept etableras
inom läkemedelsindustrin, t ex identifiering av nya mediciner baserad på s k
high throughput screening (HTS), med stort
fokus på förståelse av substansernas verkningsmekanism, mode-of-action. Under
90-talet satsade både Astra och Pharmacia, Sveriges ledande läkemedelsföretag,
på kompetens inom strukturbaserad läkemedelsdesign där proteinkristallografi
spelar en avgörande roll.
AstraZeneca är fortfarande verksamma
i Sverige och ett av företagets center för
strukturbaserad läkemedelsutveckling ligger i Mölndal.
Konceptet läkemedelsdesign innefattar
flera moment: identifiering av målprotein kopplat till den sjukdom man avser
att behandla; identifiering av startmolekyler med intressanta kemiska egenskaper; optimering – där ett mindre antal
kemiska startmolekyler väljs för utveckling till mer läkemedelslika molekyler
(se Lipinskis fem regler) – leads; lead optimering där man optimerar egenskaper
och effekt hos ett fåtal utvalda molekyler
samt candidate selection där den slutgiltiga molekylen som går vidare in i kliniska
prövningar väljs ut.
Förhoppningen är positiva resultat vad
gäller både klinisk effekt och säkerhet och
att molekylen ska nå marknaden som
en ny effektiv behandlingsmetod för patienter.
Figur 1. Ett exempel på fragmentbaserad lead-generering för proteinet HSP90 utfört av Astex Pharmaceuticals. En av de tidiga startmolekylerna identifierade i en screening av 1600 fragment visas bunden till HSP90 i figur 1a, Kd=790μM.
Figur 1b illustrerar hur en vätebindning till en aspartat sidokedja (Asp) har bildats genom att en hydroxylgrupp adderats till molekylen (1). Samtidigt har metoxygruppen ersatts av en grenad butyl som bättre interagerar med de hydrofoba sidokedjorna (2). Slutligen
har de flexibla etylgrupperna ersatts av en indolgrupp (3). Kd= 0.54 nM.
Figur 1c visar hur molekylens egenskaper har modulerats genom addition av en metylerad piperazinring som inte direkt interagerar
med proteinet. Affiniteten för HSP90 påverkas inte nämnvärt denna modifikation. Kd=0.70 nM.
Denna molekyl är i klinisk fas där den testas för lungcancer och melanom. Figurerna är baserade på pdbkoderna 2xdl, 2xab och 2xjx.
20
Kemivärlden Biotech med Kemisk Tidskrift. Nr 7-8 Juli/Augusti 2014
Styrkan med proteinkristallografi i läkemedelsdesign är att man i detalj kan studera bindningen mellan målproteinet och
den kemiska molekylen (substansen). Det
öppnar för ökad förståelse av interaktioner mellan protein och substans, t ex vilka kemiska element i substansen som är
kritiska för bindning och vilka som kan
förbättras eller helt enkelt kan uteslutas
och påverkar på så sätt riktningen av den
medicinska kemin i ett projekt.
Typiska applikationer av strukturell information inom läkemedelsdesign kan vara:
• Optimera affinitet för en kemisk substans
till målproteinet t ex. genom att möjliggöra nya vätebindningar eller hydrofoba
interaktioner och anpassa formen av substansen till proteinets bindningsficka (Figur 1a,b). Bindningspotens är viktigt för
att kunna minimera dosen av läkemedel
och därmed också risken för bieffekter.
• Optimera selektivitet över besläktade
proteiner genom att fokusera på element
som är distinkta för målproteinet och
bygga in element som förhindrar bindning till besläktade proteiner. Selektivitet är viktigt för att undvika oönskade
toxiska sidoeffekter.
• Överlagring av flera kristallstrukturer möjliggör design av hybrider där man kombinerar de bästa elementen från olika kemiska substanser (scaffold hopping). Det
ger ofta upphov till nya startmolekyler,
ökar möjligheten att optimera substanserna för det givna målproteinet och kan
vara betydelsefullt i patentsammanhang.
• En lead molekyl måste ofta modifieras
för t ex ökad biotillgänglighet, löslighet
eller livslängd, alternativt för att undvika kemiska motiv som medför toxicitet.
Strukturinformation kan vägleda modifieringarna så att de inte ger negativ effekt på bindningspotensen (Figur 1c).
Det finns många alternativa tillvägagångssätt för identifiering av startmolekyler idag,
typiskt används HTS där substansbibliotek med hundratusentals olika kemiska
föreningar testas mot ett visst målprotein.
Ett alternativ eller komplement till
HTS som har utvecklats sedan början av
2000-talet är fragmentbaserad lead-generering (FBLG). Principen utgår från screening av ett begränsat substansbibliotek
med fragment (molekyler med vikt < 300
Da) i en assay med hög känslighet.
Figur 1. En dimer av
HIV-proteas (rosa och
turkos) med Nelfinavir,
det första icke peptidlika HIV-läkemedlet,
bundet. Den katalytiska
asparaginsyran är markerad i strukturen (Asp
resp. Asp’). Nelfinavir,
här visad som van der
Waals-sfär, binder till
aktiva ytan på proteinet
och blockerar dess aktivitet. Figuren är baserad på pdbkoden 1ohr.
Fragment kan sedan expanderas stegvis
för att öka affiniteten mot målproteinet, samtidigt som önskvärda egenskaper kan läggas
till. Den kemiska rymden utforskas på så vis
mer effektivt än med större molekyler och
resultatet är inte sällan en molekyl med bättre egenskaper än vad man får genom HTS.
Avgörande för FBLG är tillgång till strukturinformation för att förstå hur tidiga
”träffar” effektivt kan byggas på. Det finns
idag ett flertal molekyler i kliniska studier för olika sjukdomar där FBLG spelat
en avgörande roll, t ex föreningar riktade
mot -sekretas (Alzheimers) och kinaser
(cancer) [3]. I figur 1 visas ett exempel med
HSP90, som är av intresse att blockera eftersom proteinet påverkar tumörtillväxt [4].
Utvecklingen av inhibitorer mot HIVproteas är ett klassiskt exempel på framgångsrik, strukturbaserad design (figur
2). Enzymet HIV-proteas aktiverar HIVvirusproteiner och identifierades tidigt
som ett viktigt målprotein för utveckling
av läkemedel mot HIV. Kristallografi har
använts, inte bara för design av läkemedel,
men dessutom för att förstå bakgrunden
till resistens mot olika inhibitorer av HIVproteas och för att utveckla strategier för att
övervinna resistens [5]. I dag finns ett antal
kraftfulla inhibitorer mot HIV-proteas på
marknaden som utvecklats med hjälp av
strukturbaserad design.
Läkemedelsdesign handlar inte bara om
målproteiner direkt kopplade till sjukdom.
I ett nyligen publicerat arbete har kristallografi framgångsrikt använts för att studera
bindning till så kallade CYP-enzymer [6]. De
är viktiga för kroppens förmåga att bryta
ned främmande substanser, inklusive läkemedel. CYP:ar – vi har cirka 60 olika va-
rianter – utgör därför nyckelproteiner för
nedbrytning av läkemedel, vilket gör det
speciellt viktigt för oss att förstå CYP- metabolism och undvika inhibering av dem.
Ett annat spännande utvecklingsområde
för strukturbaserad design är membranproteiner, särskilt G-proteinkopplade receptorer, GPCR. De är målproteiner för
ca 40 % av alla läkemedel på grund av sin
centrala funktion i många cellulära processer. Membranproteinkristallografi är en
utmaning, men de senare åren har en rad
framgångar inom området ökat möjligheterna att kunna strukturbestämma GPCRproteiner med bundna kemiska föreningar
och därmed också för design av läkemedel.
Den första kristallstrukturen av en GPCR,
i komplex med sitt G-protein, framtagen av
Brian Kobilka och Robert Lefkowitz, belönades 2012 med Nobelpriset i kemi, vilket
understryker vikten av arbetet [7].
Läkemedelsutveckling spänner över
många discipliner och kräver samarbeten över gränser för att vara framgångsrik.
I det sammanhanget kan man se proteinkristallografi som en viktig kugge som idag
starkt bidrar till förståelse och utveckling
av nya säkrare mediciner. KB
Lipinskis fem-regler
Reglerna (som innehåller fem eller
multiplar av fem) beskriver kemiska och
biologiska egenskaper hos en molekyl och
används som indikator för dess potential
som ett oralt läkemedel dvs beskriver hur
läkemedelslik en molekyl är.
• Inte mer än 5 vätedonatorer
• Inte mer än 10 väteacceptorer
• En molekylvikt under 500 g/mol
• En fördelningskoefficient (log P)
mindre än 5
Referenser:
1. Beddell CR, Goodford PJ, Norrington FE, Wilkinson S, Wootton R (1976) Compounds designed to fit a site of known structure in human haemoglobin. Br J Pharmacol 57: 201-209.
2. Liljas A, Kannan KK, Bergsten PC, Waara I, Fridborg K, et al. (1972) Crystal structure of human carbonic anhydrase C. Nat New Biol 235: 131-137.
3. Baker M (2013) Fragment-based lead discovery grows up. Nat Rev Drug Discov 12: 5-7.
4. Woodhead AJ, Angove H, Carr MG, Chessari G, Congreve M, et al. (2010) Discovery of (2,4-dihydroxy-5-isopropylphenyl)-[5-(4-methylpiperazin-1-ylmethyl)-1,3-dihydrois oindol-2-yl]methanone (AT13387), a novel inhibitor
of the molecular chaperone Hsp90 by fragment based drug design. J Med Chem 53: 5956-5969.
5. Wlodawer A (2002) Rational approach to AIDS drug design through structural biology. Annual Review of Medicine 53: 595-614
6. Branden G, Sjogren T, Schnecke V, Xue Y (2014) Structure-based ligand design to overcome CYP inhibition in drug discovery projects. Drug Discov Today 19: 905-911.
7. Andrews SP, Brown GA, Christopher JA (2014) Structure-based and fragment-based GPCR drug discovery. ChemMedChem 9: 256-275
Kemivärlden Biotech med Kemisk Tidskrift. Nr 7-8 Juli/Augusti 2014
21