Detektion av könskromosomer med hjälp av FISH

Umeå Universitet
Biomedicinska analytikerprogrammet
Detektion av könskromosomer med hjälp av FISH
XXXX XXXX, YYYY YYYYY
GGGG GGGGG, ZZZZZ ZZZZZZZ
Årskull:
BMA-08
Laborationsrapport i Laboratoriemedicin 1, termin 5
Laborationsdatum: 2010-11-01 – 2010-12-01
Handledare: XXXX XXXXX
Inlämnad: 2010-12-02 Godkänd: [(2010-12-XX)]
Abstrakt
Fluorescerande in situ hybridisering är en metod där en fluorescence inmärkt probe binder in till en
specifik nukleotidsekvens hos patientens DNA för att synliggöra förekomst eller avsaknad av en
kromosom eller ett kromosomfragment. Vid Turners syndrom saknas en X kromosom hos flickor som
yttrar sig med bland annat kortväxthet och infertilitet. En sann Turners innebär att X kromosomen
saknas i alla celler, medan en mosaik innebär en blandning av celler med genuppsättningarna 45 X0
och 46 XX. Syftet med laborationen var att detektera avvikelser i könskromosomernas uppsättning
med hjälp av FISH. T-lymfocyter från en gravid kvinna preparerades för FISH och analyserades i
fluorescencemikroskop. Slutsatsen var att kvinnan saknade en X kromosom vilket tydde på Turners
syndrom.
Nyckelord:
Fluorescence in situ hybridisation, Turners syndrom, könskromosomer, probe, mosaik
1
Introduktion
Normalt innehåller alla somatiska celler hos människan 46 kromosomer eller 23 par, 22 par är
autosomala och 1 par är könskromosomer. De vanligaste avvikelserna hos könskromosomerna är
Klinefelter’s (47,XXY), Turner’s (45, X0), Trippel-X (47, XXX) och XYY syndrom (47, XYY) (1).
Turner’s syndrom kan uppkomma i äggcellerna när separationen av XX kromosomerna misslyckas så
att den ena dottercellen helt saknar X kromosom. Vid befruktning med en X-spermie bildas ett embryo
med 45 X0 (sann Turners), men om den befruktas av en Y-spermie så dör cellen (2). Om den felaktiga
separationen uppkommer efter befruktningen, bildas en så kallad mosaik där några celler har
genuppsättningen 45 X0 och andra har 46 XX. Dessa individer är ofta mindre drabbade av sjukdomen
och dess symptom och kan spontant bli gravida (3). Flickor med syndromet är ofta kortväxta, har
defekter i inre organ såsom skelettet, kardiovaskulärt och urinsystemet, går inte in i puberteten och är
ofta infertila (4).
Trisomier och monosomier kan detekteras vid karyotypering där kromosomerna färgats med Giemsa
(G-bandning), och man ser avvikelser i antalet kromosomer. Men vid ytterligare diagnostik och vid
mer specifika frågeställningnar är Fluorescence in situ hybridization (FISH) att föredra.
Vid både G-bandning och FISH måste kromosomerna vara i sitt mest kondenserade tillstånd. I
cellcykeln är kromosomerna endast synliga under mitosen, när själva DNAt ska replikera sig. Inom
mitosen är kromosomerna som mest kondenserade i metafasen och kan då differentieras. Tillsatts av
phytohemagglutinin vid cellodlingen ökar cellproliferationen och ett större antal celler fås (5). Efter
skörd tillsätts colcemid som förhindrar bildning av mitosspindeln vilket gör att cellcykeln stannar upp
i metafasen (6).
Detektion av specifika gensekvenser sker med prober riktade mot kända loci som normalt finns hos
kromosomerna. Det möjliggör att antal, förekomst eller avsaknad av gener kan bestämmas som ett led
i diagnostiken av bland annat cancer och könsbestämning. En probe är en kort DNA sekvens med känd
nukleotidsekvens som är inmärkt med flourescence som hybridiserar med DNA och kan detekteras i
flourescence mikroskop. Proberna kan vara centromerprober, lokus-specifika, telomerprober eller
kromosomspecifika. Prober riktade mot centromerer används ofta vid aneuploiditet (trisomier och
monosomier) hos könskromosomerna (1) vid könsbestämning eller prenatal diagnostik, men även
efter benmärgstransplantationer. Telomerprobe märker in telomererna på kromosomerna och kan
dels användas vid åldersbestämning, men även vid cancergenetik. Lokus-specifika prober används för
att se avvikelser som deletioner, amplifieringar, insertioner och translokationer (7), medan
kromosomspecifika prober färgar varje kromosom med en specifik färg i så kallad Multicolour FISH
(M-FISH) och visar mer omfattande kromosomstörningar som ger komplexa karyotyper.
Prober som kan användas vid könsbestämning är CEPX, en centromerprobe som märker in Xp11.1 –
q11.1 och avger en orange färg och CEPY som märker in Yq12 och avger en grön färg. Med hjälp av
dessa räknas antalet X och Y kromosomer i metafaser och interfaser.
Syftet med laborationen var att med hjälp av interfas- och metafas FISH upptäcka avvikelser i antalet
könskromosomer i ett patientprov i fluorescencemikroskop.
2
Material och metoder
Patient
Helblod i Na-Heparinrör från gravid kvinna (född 1976) med Turner frågeställning.
Odling och fixering av celler
Lymfocyter från perifert blod odlades i cellodlingsmedium och phytohemagglutinin i 37◦C i 72 timmar.
Colcemid tillsattes och efter två timmar centrifugerades röret och supernatanten avlägsnades och en
hypoton lösning tillsattes till cellerna. Röret inkuberades i 20 minuter i rumstemperatur. Efter
centrifugering sögs supernatanten bort och nygjord fixeringslösning tillsattes (metanol:ättiksyra 3:1).
Detta upprepades två till tre gånger. Röret centrifugerades och supernatanten avlägsnades så att rätt
koncentration lösning erhölls. Fixerade celler droppades på glas och glaset lades på en kyvett i ett
vattenbad i 55◦C i några minuter. Antalet metafaser i preparatet bedömdes i mikroskop. Glaset
förvarades i rumstemperatur över natten för att åldras.
Hybridisering med probe
Arbete med probe utfördes i mörker. Proben (CEP X/CEP Y) (Cat # 7J2050, Vysis, Illinois) vortexades
och snabbcentrifugerades. 10 µL probe applicerades på det område på glaset med flest metafaser. Ett
täckglas lades ovanpå proben och limmades fast. Proben denaturerades genom att inkubera glaset på
värmeblock, 73 ◦C i 3 minuter. Glaset inkuberades i en fuktkammare i 37 ◦C över natten.
Färgning av kromosomer
En kyvett med tvättlösning (0,4xSSC/0,3%NP40) placerades i ett vattenbad, 73 ◦C. Täckglaset
avlägsnades och glaset tvättades i tvättlösningen i 2 minuter. Glaset sattes i en kyvett med 2xSSC i
rumstemperatur i 3 minuter. Glaset kontrastfärgades med DAPI (20µL DAPI + 80 mL 2xSSC) i
rumstemperatur i 3 minuter. Tre droppar antifade applicerades på glaset och ett stort täckglas sattes
ovanpå. Glaset förvarades i en svart box tills det analyserades med ett fluorescensmikroskop.
3
Resultat
Detektion av könskromosomer
I interfas FISH fanns en cell med en orange fluorescerande signal, som bundit till centromeren hos en
X-kromosom, figur 1. En orange fluorescerande signal syntes i metafas FISH i centromeren hos en Xkromosom, figur 2. I metafas FISH fanns 45 kromosomer.
4
Diskussion
Den fluorescerande signalen i både interfas- och metafas FISH visade att patienten saknade en X
kromosom och att det endast fanns 45 kromosomer bekräftade frågeställningen om Turners syndrom
(2). Vidare fanns en frågeställning om mosaik eftersom patienten spontant blivit gravid, men på glaset
fanns för få metafaser för att kunna bekräfta misstanken.
I fluorescencemikroskop detekterades en X kromosom i interfas och metafas FISH.
5
Referenser
1.
Shaffer L.G, Bejjani B.A. Development of new postnatal diagnostic methods for chromosome
disorders. Semin Fetal Neonatal Med. 2010 Nov 25.
2. Turners syndrom. Wikipedia (29 september 2010).
http://sv.wikipedia.org/wiki/Turners_syndrom, 101202
3. Pasquino A.M, Passeri F, Pucarelli I, Segni M, Municchi G (1997). Spontaneous Pubertal
Developements in Turner’s Syndrome. J Clin Endocrinol Metab. 1997 Jun 82(6): 1810-3.
4. Bouchlariotou S, Tsikouras P, Dimitraki M et al. Turner’s syndrome and pregnancy: has the
45,X/47XXX mosaicism a different prognosis?. J Matern Fetal Neonatal Med. 2010 Oct 5.
5. Phytohemagglutinin. Wikipedia (29 november 2010).
http://en.wikipedia.org/wiki/Phytohaemagglutinin, 101201
6. Colcemid. Wikipedia (2 december 2010). http://en.wikipedia.org/wiki/Colcemid, 101202
7.
FISH. Wikipedia (11 september 2010). http://sv.wikipedia.org/wiki/FISH, 101201
6
Figur 1. Visar interfas FISH där CEPX ska avge en orange färg, och CEPY ska avge en grön färg. I cellen
syns en orange fluorescerande signal.
7
Figur 2. Visar metafas FISH där CEPX ska avge en orange färg och CEPY ska avge en grön färg. I
figuren finns 45 kromosomer och centromeren hos X kromosomen fluorescerar med en orange signal.
8
Bilaga 1
Riskbedömning
Riskbedömning av Colcemid
På vilket sätt är kemikalien farlig?
Mutagen, teratogen, toxisk.
Hantering av kemikalien samt adekvat skyddsutrustning
Kemikalien förvaras i +4˚C. Skyddsrock och skyddshandskar används, gärna dubbla. Arbeta i
dragskåp.
Skyddsåtgärder
Uppsök vård.
Avfallshantering
Cytostatika avfall. Undvik utsläpp i avloppet. (1)
Riskbedömning av Metanol
På vilket sätt är kemikalien farlig?
Mycket brandfarlig och giftig.
Hantering av kemikalien samt adekvat skyddsutrustning
Använd skyddsrock, handskar och glasögon. Arbeta i dragskåp.
Skyddsåtgärder
Undvik inandning, hudkontakt och förtäring.
Avfallshantering
Hanteras som farligt avfall. Undvik utsläpp i avloppet. (2)
Riskbedömning av Ättiksyra (Etansyra)
På vilket sätt är kemikalien farlig?
Starkt frätande.
Hantering av kemikalien samt adekvat skyddsutrustning
Använd skyddsrock, handskar och glasögon. Arbeta i dragskåp.
Skyddsåtgärder
Undvik inandning, hudkontakt och ögonkontakt.
Avfallshantering
Hanteras som farligt avfall. Mindre mängder kan spolas ner i avloppet med mycket vatten. (3)
9
Referenser
1.
Colcemid. Enzo Lifescience (2010). www.enzolifescineces.com/ALX-430-033/colcemid/, 101202
2. Säkerhetsdatablad, Metanol. VWR (2006-05-18). www.varor.lul.se/webbreg/infoblad/54.pdf,
101202
3. Säkerhetsdatablad, Ättiksyra. VWR (1999-11-01). www.varor.lul.se/webbreg/infoblad/6132.pdf,
101202
10