Transport proteinov v in iz jedra-Merljak

PRENOS
PROTEINOV
V IN IZ JEDRA
Seminar pri predmetu Biološke membrane
Estera Merljak
December, 2014
1 CELICA
Celica je osnovna enota vseh živih bitij. Najbolj primitivna živa bitja so enoceličarji, to pomeni,
da celoten organizem predstavlja ena sama celica. Višje razviti organizmi pa sestojijo iz več
celic, ki se povezujejo v tkiva, kjer celice med sabo izmenjujejo informacije in zato usklajeno
delujejo. Živa bitja generalno delimo na prokarionte in evkarionte. Prokarionti so enocelični
organizmi pri katerih dedna informacija v obliki DNA prosto plava v citoplazmi. Evkarionti so
širša skupina, od prokariontov pa se razlikuje predvsem v celični kompartmentalizaciji. Različni
procesi se dogajajo na točno določenih mestih v celici, v specifičnih organelih. Pri evkariontskih
celicah (Slika 1) je večina DNA shranjena v jedru.
Slika 1: Prikaz evkariontske celice in notranjost njenih organelov.
2 CELIČNO JEDRO
2.1 FUNKCIJA
Jedro je z membrano obdan celični organel v evkariontskih celicah, kjer se nahaja DNA. Celice
imajo lahko eno ali več jeder (hepatociti, celice srčne mišičnine, megakariociti, epitelske
celice sečnega mehurja, endotelij – roženica, …), poznamo pa tudi takšne, ki nimajo jeder
(eritrociti, kožne celice povrhnjice).
Jedro je pomembno je za zaščito dednega materiala,
uravnavanje izražanja genov ter s tem uravnavanje delovanja celotne celice. V jedru poteka
prepisovanje DNA ter sinteza RNA molekul.
Pri celični delitvi jedna lamina razpade, s tem pa se poruši struktura jedra. To je potrebno za
razdelitev podvojenega dednga materiala, ter s tem delitev celice. Jedro se v kasnejših fazah
delitve ponovno strukturira in opravlja svojo primarno funkcijo.
2.2 STRUKTURA CELIČNEGA JEDRA
Celično jedro je v grobem sestavjeno iz jedrca in nukleoplazme ter je obdano z jedrno ovojnico
(Slika 2).
V jedrcu poteka sinteza ribosomskih podenot (rRNA) in tRNA. Ribosomske podenote se
dokončno sestavijo in opravljajo svojo funkcijo v citoplazmi celice.
V nukleoplazmi je kromatin, to je DNA molekula v kompleksu s histoni in drugimi na DNA
vezanimi proteini. Kromatin je lahko v dveh oblikah: evkromatin, ki je prost v nukleoplazmi in
heterokromatin, ki je pripet na jedrno lamino.
Jedrna lamina je mreža intermediarnih filamentov (laminov A, B in C), ki daje jedru mehansko
oporo in trdnost ter z vezavo heterokromatina sodeluje pri izražanju genov. Jedrna lamina je
pripeta na notranjo membrano jedrne ovojnice. Zunanja membrana jedrne ovojnice povezuje
jedro z endoplazmatskim retikulumom, zato so tu prisotni ribosomi, kot je tudi značilno za
membrano zrnatega endoplazemskega retikuluma. Na mestih, kjer se zunanja in notranja
jedrna ovojnica zlivata, ju prebadajo velike multiproteinske strukture, imenovane kompleksi
jedrnih por.
Slika 2: Prikaz jedra evkarionstke celice.
3 JEDRNA PORA
Slika 3: Slika jedrne ovojnice z označenimi jedrnimi porami pod elektronskim mikroskopom.
3.1 FUNKCIJA
Jedrne pore (Slika 3) so edini kanali skozi katere lahko v in iz jedra prehajajo majhne polarne
molekule, ioni in makromolekule. Je multiproteinski kompleks, ki uravnava selektivno
izmenjavo makromolekul med jedrom in citoplazmo. Vstop in izstop makromolekul poteka z
aktivnim transportom, za katerega je značila poraba energije. Majhne polarne molekule in ioni
prehajajo jedrno membrano preko por z difuzijo.
3.2 STRUKTURA JEDRNE PORE
Jedro tipične sesalske celice ima od 3000 do 4000 jedrnih por. To so multiproteinski kompleksi,
veliki okoli 100nm. Pora je sestavljena iz osmih monomernih proteinskih kompleksov, ki tvorijo
kanal za prehajanje v in iz jedra. Celostno laho porni oktamer razdelimo na tri enote:
citoplazemski del, osrednji del in jedrni del pore (Slika 4).
 Citoplazemski del
Obsega proteine, ki sestavljajo citoplazemski obroč in fibrilarne proteine, ki segajo globoko v
citoplazmo in služijo za prepoznavanje molekul in kontrolo prehoda v in iz jedra.
 Osednji del
Prisotni proteini, ki sestavljajo osrednje obroče in proteini, ki sidrajo poro v jedno ovojnico.
Fibrilarni proteini segajo v notranjost pore ter omogočajo transport.
 Jedrni del
Obsega proteine, ki sestavljajo jedrni obroč in fibrilarne proteine, ki tvorijo strukturo podobno
košu. Ti fibrilarni proteini sepovezujejo z intermediarnimi filamenti jedrne lamine.
Slika 4: Prikaz sestave jedrnega pornega kompleksa s primeri proteinov pri kvasovkah (yeast) in vretenčarjih
(vertebrate).
4 TRANSPORT PROTEINOV IZ JEDRA
V celici so različni procesi ločeni v specializiranih organelih in so odvisni od različnih
makromolekul. Pomembno je, da se ob pravem trenutku izražajo določeni proteini, ki
omogočajo potek različnih procesov. Sinteza vsakega proteina se začne v jedru, s
prepisovanjem gena za protein, zapisanega v DNA. DNA zaporedje se prepiše v mRNA
zaporedje. mRNA se nato prenese iz jedra v citoplazmo, kjer se nanjo vežejo podentote
ribosomov. To so proteinski kompleksi, ki katalizirajo reakcijo prevajanja mRNA v
aminokislinsko zaporedje, ki predstavlja primarno strukturo proteina. Ribosomi spadajo v
družino ribonukleoproteinov. Ribosomske podenote se sestavijo v jedrcu, ter se morajo
prenesti v citoplazmo, kjer se sestavijo v aktiven ribosom.
V jedru so prisotni tudi drugi proteini, ki uravnavajo izražanje genov ali drugače pripomorejo k
pravilnem delovanju celice. Tako je za pravilno delovanje celice zelo pomembno prehajanje teh
proteinov preko jedrne ovojnice, ki mora biti zelo specifično in tesno regulirano.
4.1 SIGNALI ZA PRENOS IZ JEDRA
RNA molekule nimajo posebnega signalnega zaporedja za prenos iz jedra. Prenos teh molekul
iz jedra lahko poteka preko direktne vezave RNA molekul na transportne proteine ali preko
posredne vezave na adapterske proteine, ki se povežejo s transportnimi proteini.
Pri proteiniskih makromolekulah, ki so namenjene iz jedra, pa je prisoten signal za prenos iz
jedra (ang. nuclear export signal, NES) – kratko aminokislinsko zaporedje.
4.2 MEHANIZEM TRANSPORTA PROTEINOV IZ JEDRA V CITOPLAZMO
Eksportini so široka družina proteinov, ki služijo kot transporterji za prenos makromolekul iz
jedra v citoplazmo. Delijo se glede na to, kakšne makromolekule vežejo in prenesejo iz jedra v
citoplazmo. Večina jih veže NES zaporedje na proteinih, namenjenih iz jedra ali adapterskih
proteinih, ki vežejo proteine brez NES zaporedja. Obstajajo pa tudi taki, ki direktno vežejo RNA
namenjeno iz jedra brez adapterskih proteinov (Slika 5).
Slika 5: Prikaz eksportina-5 z vezano pre-miRNA.
Prenos proteina iz jedra v citoplazmo se prične z vezavo Ran-GTP na eksportin. To povzroči
konformacijsko spremembo eksportina tako, da dobi visoko afiniteto do NES na proteinu.
Protein se z NES zaporedjem veže na kompleks eksportin-Ran-GTP, kar pride v bližino jedrne
pore. Kompleks se prenese iz jedra v citoplazmo. V citoplazmi encim Ran-GAP katalizira
hidrolizo v Ran protein vezanega GTP v GDP. To povzroči oddisociacijo Ran-GDP od eksportina,
s čimer se zmanjša tudi afiniteta eksportina do NES zaporedja zato oddifundira tudi protein.
Prosti eksportin se prenese prek jedrne pore nazaj iz citoplazme v jedro, kjer lahko ponovno
veže Ran-GTP in NES zeporedje in cikel se ponovi (Slika 6).
Slika 6: Shema prenosa proteina iz jedra v citoplazmo.
5 TRANSPORT PROTEINOV V JEDRO
Za uravnavanje izražanja genov so zelo pomembni proteini, ki se nahajajo v jedru. Vendar pa
sinteza vseh proteinov poteka v citoplazmi. Zato obstaja poseben transportni mehanizem za
prenos sintetiziranih proteinov v jedro, kjer opravljo svojo funkcijo.
5.1 SIGNALI ZA PRENOS V JEDRO
Proteini, katerih funkcija je znotraj jedra, imajo zaporedje aminokislin, ki v pravilni konformaciji
tvorijo na površini jedrski lokalizacijski signal (ang. nuclear localization signal, NLS). Brez tega
zaporedja protein ne more vstopiti v jedro. Zato je pomembno, da se to signalno zaporedje ne
odcepi, saj se pri celični delitvi jedro razpusti in se pomeša vsebina jedra s citoplazmo. Celica
mora po ponovni vzpostavitvi jedra selektivno izbrati proteine, ki sodijo v jedro. Ti bodo vedno
imeli prisoten NLS.
5.2 MEHANIZEM TRANSPORTA PROTEINOV IZ CITOPLAZME V JEDRO
NLS na površini proteina, ki ga je potrebno prenesti v jedro, v citoplazmi prepoznajo proteini iz
družine importinov. Importini so proteini, ki opravljo funkcijo prenašalca drugih proteinov v
jedro. Sestavljeni so iz dveh podenot, importina α in importina β (Slika 7).
Slika 7: Prikaz človeškega importina z vezanim tovorom. Importin β označen z modro barvo, importin α označen z
zeleno barvo, eden izmed proteinov z NLS (tovor) označen z rumeno barvo.
Importin α prepozna in močno veže NLS tarčnega proteina. Kompleks se prenese do jedrne
pore, kjer se prek drugega vezavnega mesta importin α veže na importin β. Importin β
vzpostavlja kratkotrajne interakcije s fibrilarnimi proteini osrednjega dela kompleksa, ter tako
omogoča prenos proteina v jedro.
V jedru se na importin β veže protein Ran-GTP, kar povzroči disociacijo importina β od
importina α. Importin β se skupaj z Ran-GTP prenese nazaj v citoplazmo. Tam se v Ran protein
vezan GTP hidrolizira v GDP s pomočjo encima Ran-GTPazni aktivirajoči protein (Ran-GAP). To
povzroči, da se importin β odcepi od Ran-GDP in je prost za vezavo naslednje importin α
molekule povezane s tovorom v citoplazmi.
Importin α v jedru ostane vezan na protein prek NLS. Po odcepitvi importina β se na preostali
kompleks veže protein NUP50 (nukleoporin, 50kDa), kar povzroči sprostitev proteina v
nukleoplazmo. NUP50 zamenja protein CAS (CRISPR associated protein) v kompleksu z RanGTP molekulo. Tak kompleks se prenese iz jedra v citoplazmo, kjer encim Ran-GAP hidrolizira v
Ran vezan GTP v GDP. Zaradi tega kompleks razpade na prost importin α, ki lahko ponovno
veže nov protein z NLS, protein CAS in Ran-GDP (Slika 8, a).
Slika 8: a) Shema vnosa proteina z NLS v jedro. b)Shema regeneracije zaloge proteina Ran-GTP v jedru.
5.2.1 Primeri proteinov potrebnih v jedru
V jedru so nujno potrebni proteini, ki so zadolženi za podvajanje DNA ter prepisovanje DNA v
RNA (DNA-polimeraza, RNA-polimeraza,). Prav tako so pomembni za izražanje genov proteini,
ki se vežejo na samo DNA ter s tem omogočijo ali inhibirajo izražanje določenega gena (histoni,
transkripcijski faktorji, helikaze ...).
6 REGENERACIJA ZALOGE RAN PROTEINA V JEDRU
Ker je za prenos proteinov med citoplazmo in jedrom potreben Ran-GTP protein v jedru,
obstaja dodatni transportni mehanizem za vzdrževanje zaloge Ran-GTP proteina v jedru celice
(Slika 8, b). Po odcepu transportnega proteina (importin β, importin α ali eksportina) se RanGDP veže na prenašalni protein NTF2, ki ga preko jedrne pore prenese nazaj v notranjost jedra.
Tam encim Ran-gvanin nukleotid izmenjajoči faktor (ang. Ran-guanine nucleotide exchange
factor, Ran-GEF) zamenja v Ran vezan GDP s prostim GTP. Nastali Ran-GTP se odcepi od
prenašalnega proteina NTF2 in lahko ponovno vstopi v cikel vezave na transportni protein.
7 BOLEZNI POVEZANE S TRANSPORTOM V IN IZ JEDRA
Veliko bolezni je posredno ali neposredno povezanih s transportom proteinov v in iz jedra ter
posledično z lokalizacijo proteinov v celici.
Bolezni so lahko posledica v mutaciji signalnega peptida ali mutacij v proteinih jedrnega
pornega kompleksa. V obeh primerih je transport preko jedrne ovojnice omejen oziroma lahko
celo onemogočen, kar privede do bolezenskih stanj.
Tabela 1: Prikaz nekaterih bolezni povezanih s transportom preko jedrne ovojnice.
7.1 SWYERJEV SINDROM
Pri ljudeh določa spol kromosom Y, prisoten pri osebah moškega spola. Na njem je zapisan gen
za protein SRY (sex-determining region Y protein). SRY je jedrni protein, ki ima ključno vlogo pri
razvoju moških spolnih organov med razvojem fetusa.
Pri mutaciji NLS signala proteina SRY se le-ta ne prenese v jedro in svoje funkcije ne more
opravljati. Čeprav imajo ljudje s Swyerjevim sindromom spolna kromosoma XY, so po
zunanjem videzu podobni ženskam.
V večini primerov ženske s Swyerjevim sindromom niso sposobne reprodukcije, saj za razvoj
primernih spolnih organov manjkajo ustrezni hormoni.
7.2 PRITLIKAVOST (ANG. DWARFISM)
Mutacija v NLS transkripcijskega aktivatorja SHOX (short statue homeobox) povzroči, da se ta
protein zadržuje v citoplazmi namesto v jedru. Posledica tega sta Léri-Weill dishondrosteoza
(Léri–Weill dyschondrosteosis) ali Langerjeva mezomelična displazija (Langer mesomelic
dysplasia, LMD). Obe bolezenski stanji vodita v mezomelično pritlikavost, pri kateri imajo ljudje
krajše podlakti ali spodnji del noge.
7.3 AVTOIMUNA POLIENDOKRINOPATIJA S KANDIDOZO IN
EKTODERMALNO DISTROFJO
Mutacija transkripcijskega faktorja AIRE (autoimune regulator) v domeni cinkovega prsta
prepreči vnos AIRE v jedro kljub prisotnemu NLS zporedju. Zaradi tega se protein zadržuje v
citoplazmi in ne more opravljati svoje funkcije. To povzroči razvoj bolezni avtoimune
poliendokrinopatije s kandidozo in ektodermalno distrofjo, za katero so značilne neprestane
okužbe sluznice in kože z glivo kandido. Bolezen spada med avtosomne recesivne bolezni in se
prenaša dedno.
7.4 DRUŽINSKA ATRIJSKA FIBRILACIJA
Eden izmed razlogov za pojav družinske atrijske fibrilacije je mutacija v nukleoporinu NUP155,
ki je eden izmed proteinov, ki sestavljajo jedrne pore. Mutacija NUP155 povzroči zmanjšan
prenos Hsp70 mRNA iz jedra v citoplazmo ter zmanjšan prenos proteina HSP70 iz citoplazme v
jedro, kjer deluje kot del celičnega mehanizma za pravilno zvijanje proteinov in zaščito pred
celičnim stresom.
8 VIRI









Mien-Chie Hung in Wolfgang Link: Protein localization in disease and therapy. 2011.
Journal of Cell Science, 124, 3381–3392.
Zhang, X., Chen, S., Yoo, S., Chakrabarti, S., Zhang, T., Ke, T., Oberti, C., Yong, S., L.,
Fang, F., Li, L. et al.: Mutation in nuclear pore component NUP155 leads to atrial
fibrillation and early sudden cardiac death. 2008. Cell, 135, 1017-1027.
McLane, L. M. in Corbett, A. H.: Nuclear localization signals and human disease. 2009.
IUBMB Life, 61, 697-706.
Sabherwal, N., Schneider, K. U., Blaschke, R. J., Marchini, A. in Rappold, G.: Impairment
of SHOX nuclear localization as a cause for Leri-Weill syndrome. 2004. Journal of Cell
Science, 117, 3041-3048.
Bjorses, P., Halonen, M., Palvimo, J. J., Kolmer, M., Aaltonen, J., Ellonen, P.,
Perheentupa, J., Ulmanen, I. in Peltonen, L.: Mutations in the AIRE gene: effects on
subcellular location and transactivation function of the autoimmune
polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy protein. 2000. The American
Journal of Human Genetics, 66, 378-392.
Masahiro Nagai in Yoshihiro Yoneda: Small GTPase Ran and Ran-binding proteins.
2012, Biomolecular Concepts, 3, 307-318.
Ralph H. Kehlenbach: Nuclear Transport. Landes Bioscience, 2009, ZDA. ISBN 978-158706-333-6
Spletni iskalnik PDB (protein database, http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)
Spletni brskalnik Wikipedija (http://en.wikipedia.org/wiki/Main_Page)