Ohjelma ja esitystiivistelmät

14. Kansallinen Massaspektrometriasymposium
Koli 19.–21.3.2014
Ohjelma ja abstraktit
1
Ohjelma
Keskiviikko 19.3.
09:00-13:00 Ilmoittautuminen + majoittuminen
Sessio 1 (Pj. Olli Laine)
13:00-13:10 Janne Jänis (Itä-Suomen yliopisto):
Tervetulosanat + info
13:10-13:40 Leena Valmu (Thermo Fisher Scientific/Helsingin yliopisto):
Massaspektrometria kliinisten biomarkkereiden metsästyksessä
13:40-14:00 Outi Itkonen (HUSLAB/Helsingin yliopisto):
New LC-MS based assay of serum tumor-associated trypsin
inhibitor (TATI) allows simultaneous quantitation and detection
of TATI variants
14:00-15:00 Lounas/kahvitauko + posteriesitykset
15:00-15:20 Elias Ikonen (Neste Oil):
Lentopetrolin hapettumistuotteiden massaspektrometrinen
karakterisointi
15:20-15:40 Timo Kekäläinen (Itä-Suomen yliopisto):
Bioöljyjen analytiikka APPI/ESI-FTICR-massaspektrometrialla
15:40-16:00 Marjaana Nousiainen (Suomen ympäristökeskus)
Bromattujen palonestoaineiden määrittäminen
ympäristönäytteistä
16:00-16:20 Peter Abrahamsson (Agilent Technologies):
Trace level analysis of emergent pollutants – How to reach the
ultimate sensitivity?
16:20-17:30 FMSS kevätkokous (tarjolla viiniä, juustoja, hedelmiä ym.)
17:30-20:00 Vapaata ohjelmaa (ulkoilu, kylpylä yms.)
20:00-21:00 Illallinen
Torstai 20.3.
07:00-09:00 Aamiainen
Sessio 2 (Pj. Timo Kekäläinen)
09:00-09:30 Tiina Sikanen (Helsingin yliopisto):
Kolikon kokoinen laboratorio - Mikrosiruteknologiaa
massaspektrometriaan
09:30-09:50 Martin Söderström (VERIFIN/Helsingin yliopisto):
Kemiallisten aseiden käytön varmistus Syyriassa
09:50-10:10 Sami Huhtala (Keskusrikospoliisi):
2
Kaksoisdetektoritekniikat huumausaineiden analysoinnissa
10:10-10:50 Tauko + posteriesitykset
10:50-11:10 Petri Kylli (Helsingin yliopisto):
Oksisterolien analysointi biologisista näytteistä: UPLC-TQ-S:n ja
UPLC Q-TOF:n vertailua
11:10-11:30 Milla Neffling (AB Sciex):
Accelerating Metabolomics with High Speed and High
Resolution MS/MS
11:30-13:00 Lounas
Sessio 3 (Pj. Helena Taberman)
13:00-13:20 Ari Tolonen (Admescope):
Massapektrometria reaktiivisten lääkeainemetaboliittien
tutkimuksessa
13:20-13:40 Marko Lehtonen (Itä-Suomen yliopisto):
HPLC-MS menetelmien ja näytteenkäsittelyn kehitys BioCenter
Kuopion metabolomiikkalaboratoriossa
13:40-14:00 Jonas Björklund (PerkinElmer):
Direct Sample Analysis with Time of Flight Mass Spectrometry
(DSA-TOF) and the new GC/MS/MS from PerkinElmer.
14:00-14:40 Kahvitauko + posteriesitykset
14:40-15:00 Miina Ruokolainen (Helsingin yliopisto):
Faasin I metaboliareaktioiden jäljittely
titaanidioksidivalokatalyysilla, sähkökemiallisilla reaktioilla ja
sähkökemiallisesti avustetulla Fenton-reaktiolla
15:00-15:20 Riikka-Marjaana Räsänen (Helsingin yliopisto):
Desorption atmospheric pressure photoionization combined with
travelling wave ion mobility-mass spectrometry
15:20-15:40 Janne Jänis (Itä-Suomen yliopisto):
MphR(E) makrolidibiosensoriproteiinin rakenteen ja toiminnan
tutkiminen natiivimassaspektrometrialla
15:40-16:00 Jean-Marc Joumier (Waters Corporation):
Revealing the identification power of Collision Cross Section
(CCS): a novel approach applied to pesticide analysis in food
16:00-20:00 Vapaata ohjelmaa (ulkoaktiviteetit, kylpylä yms.)
20:00-22:00 Juhlaillallinen
22:00-23:00 Jatkot Hietapakassa (live-musiikkia, karaoke yms.)
3
Perjantai 21.3.
07:00-09:00 Aamiainen
Sessio 4 (Pj. Mikko Laitaoja)
09:00-09:20 Niina Tohmola (HUSLAB/Helsingin yliopisto):
Seerumin 5-HIAA:n massaspektrometrinen menetelmä
neuroendokriinisten kasvainten diagnostiikassa
09:20-09:40 Anthony Sullivan (Agilent Technologies):
Characterisation of a New Uniform-Field Ion Mobility Q-TOF
Mass Spectrometer and its application to Life Science Research
09:40-10:00 Mikko Savin (Sigma-Aldrich):
The importance of sample preparation, pure reagents and
solvents for easy interpretable mass spectra and reproducible
analytical methods
10:00-10:20 Tauko + posteriesitykset
10:20-11:00 Risto Kostiainen (Helsingin yliopisto):
Ionisaatiomenetelmät LC/MS-menetelmässä
11:00-11:15 Tiina Kauppila (Helsingin yliopisto):
Konferenssin yhteenveto, päätössanat
11:15-13:00 Lounas
Linja-autokuljetus Joensuun rautatieasemalle/lentoasemalle lähtee heti
lounaan jälkeen.
4
Tapahtuman sponsorit:
5
SUULLISET ESITYKSET
6
Massaspektrometria kliinisten biomarkkereiden metsästyksessä
Leena Valmu1,2
1
University of Helsinki, Helsinki, Finland, 2Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland
S-posti: leena.valmu@thermofisher.com
Biomolekyylien, erityisesti proteiinien ja pienemmässä määrin hiilihydraattien, massaspektrometria on kehittynyt merkittävästi muutaman viime vuosikymmenen aikana.
Kehityksen mahdollisti aikanaan hellävaraisten ionisaatiomenetelmien, MALDI:n ja
sähkösumutuksen, käyttöönotto ja sitä on myöhemmin vienyt eteenpäin sekä korkean
resoluution analysaattoreiden että bioinformatiikan työkalujen kehittyminen. Jo vuosia on
kiihkeästi odotettu tämän kehitystyön tuloksia kliiniseen käyttöön.
Kliininen biomarkkeri tarkoittaa mitattavaa indikaattoria, useimmiten molekyyliä, joka kuvaa
tietyn tautitilan riskiä, olemassaoloa, tasoa tai hoitovastetta. Varsin merkittävä osa näistä
biomarkkereista on proteiineja, joita on perinteisesti mitattu kliinisillä, usein immunokemiallisilla, analysaattoreilla. Proteiinien massaspektrometrian eli proteomiikan
kehittyminen on tuonut alalle suuria odotuksia sekä uusien biomarkkereiden löytämisen
että niiden kliiniseen käyttöönoton suhteen.
Kliinisten biomarkkereiden kehitystyön voi karkeasti jakaa kolmeen osaan: 1)
biomarkkereiden etsintään, 2) validaatiovaiheeseen ja 3) kliinisiin sovelluksiin. Biomolekulaarisesta massaspektrometriasta on valtaosa runsaasta kehityksestään huolimatta
yhä edelleen keskittynyt näistä vaiheista ensimmäiseen. Kliinisten biomarkkereiden
tunnistamista on vaikeuttanut sekä biologisten lähtömateriaalien kompleksisuus että
biomolekyylien monimuotoisuus. Analyyttien esipuhdistuksen kehittyminen ja analyyttisen
sensitiivisyyden sekä spesifisyyden lisääntyminen on edistänyt biomarkkeritutkimusta
huomattavasti. Kliinisesti lupaavia biomarkkereita onkin tunnistettu viime vuosina tuhansia.
Pullonkaulaksi kliinisten biomarkkereiden kehitystyössä on muodostunut haasteellinen
validaatiovaihe, joka tulee toteuttaa paitsi suurehkolla potilasmateriaalilla myös riittävän
robustilla, usein kvantitatiivisellä, analyysimenetelmällä. Kun potentiaalisia validaatiokandidaatteja on tarjolla tuhansia, on vaikeaa, jollei mahdotonta, etukäteen tietää, mikä
näistä
sisältää
suurimman
lääketieteellisen
arvolupauksen.
Niinpä
kliinisiä
proteiinibiomarkkereita hyväksytään tällä hetkellä kliiniseen rutiinikäyttöön vain noin yksi
vuodessa. Nähtäväksi jää, miten proteomiikan ja glykomiikan lupaukset tulevat
toteutumaan tulevaisuuden kliinisessä analytiikassa.
7
New LC-MS based assay of serum tumor-associated trypsin inhibitor
(TATI) allows simultaneous quantitation and detection of TATI variants
Suvi Ravela1,2, Leena Valmu1,2, Ulf-Håkan Stenman1 Esa Hämäläinen3 and Outi Itkonen3
1
Departmet of Clinical Chemistry, University of Helsinki, Helsinki, Finland
2
3
Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland
HUSLAB, Helsinki University Central Hospital, Helsinki, Finland
outi.itkonen@hus.fi
Background. We aimed to develop an LC-MS based assay for quantification of serum
tumor-associated trypsin inhibitor (TATI) and known TATI variants (N34S and P55S)
associated with pancreatitis. TATI is a 6 kDa peptide associated with many cancers,
especially mucinous ovarian carcinoma. Elevated serum TATI concentrations are also
found in severe inflammations including pancreatitis (1).
Methods. Serum TATI was captured using an antibody (MAb 6E8) coupled to protein G
Mag Sepharose beads (GE Healthcare). TATI was then quantified by an LC-MS pseudoMRM assay using an Agilent 1200 LC (Agilent Technologies) with Polaris C18-A column
(Varian Inc.) and a 4000 QTRAP mass spectrometer (AB Sciex). The newly developed LCMS assay was validated and compared with a time-resolved immunofluorometric assay
(TR-IFMA) using 90 serum samples from patients with acute pancreatitis (n=30), renal cell
carcinoma (n=30), and benign urological conditions (n=30).
Results. The analytical recovery of the assay was 87%-100% and the linear range 1-500
ng/ml. Within-assay CV was <6.4 %. The assay facilitated quantitation of the N34S variant
in serum from a confirmed carrier and from patients. Our novel LC-MS assay for serum
TATI shows good correlation with TR-IFMA. Most importantly, it enables simultaneous
detection and quantification of TATI variants N34S and P55S from the same sample.
References.
Stenman UH.Tumor-associated trypsin inhibitor. Clin Chem. 48, 2002,1206-1209.
1
8
Lentopetrolin hapettumistuotteiden massaspektrometrinen
karakterisointi
Tekijä(t): Elias Ikonen, Kim Wickström, Alpo Toivo, Maaria Seläntaus, Jaana Keskiniva ja
Sirpa Nordling
1
Yhteystiedot: Neste Oil Oyj, Tutkimus ja Kehitys/ Tutkimusanalytiikka, Porvoo
S-posti: elias.ikonen@nesteoil.com
Johdanto. Jet A-1 lentopetroli valmistetaan raakaöljyn tislausjakeesta, jonka kiehumaalue on noin 150-300 oC. Näin saatu suoratisle jatkokäsitellään edelleen esimerkiksi
UOP:n (Universal Oil Products) MEROX-prosessilla, jotta se täyttää tuotteelle vaaditut
ominaisuudet. Lentopetrolin varastoinnin tai valmistusprosessin aikana tapahtuva
hapettuminen saattaa laskea lentopetrolin veden erottumista ja sähkönjohtavuutta, sekä
aiheuttaa saostumia lentopetroliin. Tällöin vaarana on, että lentopetroli ei ole
ominaisuuksiltaan ASTM D1655 - ja DEF STAN 91-91 -spesifikaatioiden vaatimusten
mukaista. Lentopetrolin hapettumisen estäminen ja siitä aiheutuvien haittojen korjaaminen
edellyttää hapettumistuotteiden tunnistamista. Tämän työn tavoitteena oli siten eristää ja
karakterisoida lentopetrolin hapettumistuotteet. Eristetyt hapettumistuotteet analysoitiin
aluksi IR-spektroskopialla ja tarkemmin massaspektrometrialla käyttäen apuna derivointia.
Koska yhdisteiden EI-MS-spektrejä ei löytynyt spektrikirjastoista, spektrien tulkkaaminen
tehtiin pääasiassa odd electron -ionien fragmentaatiomekanismeja käsittelevän
kirjallisuuden avulla.1-2
Materiaalit ja menetelmät. Tutkitut näytteet olivat Neste Oilin Merox -prosessilla tuotettua
Jet A-1 -lentopetrolia ennen ja jälkeen laboratoriossa tehtyä hapettamista, sekä Airbus
A319A:n polttoainesuodatin. Hapettumistuotteiden eristäminen lentopetrolinäytteistä tehtiin
kiinteäfaasiuutolla (silikageeli) ja karakterisoinnin apuna käytettiin Tri-Sil derivointireagenssia. Hapettumistuotteiden eristäminen polttoainesuodattimesta tehtiin
nestefaasiuutolla ja ISOLUTE SAX -anioninvaihtopatruunalla. Karakterisoinnin apuna
käytettiin Tri-Sil -derivointireagenssia. Tärkeimmät analyysilaitteistot olivat: Waters GCT
premier TOF -mass-spectrometer, FTIR Avatar 360 spectrofotometer, Agilent GC-MSD.
Tulokset. Työn perusteella Merox prosessoidun Jet A-1 -lentopetrolin hapettumistuotteita
ovat disulfidien ja tiolien hapettuessa muodostuvat sulfonihapot, sekä fenoleista ja
disulfideista ja/tai tioleista muodostuvat fenolidimeerit ja alkyylisulfanyylifenolit.
1
McLafferty, F.W. ja Turecek, F., Interpretation of mass spectra, 4th Edition, University
Science Books, Sausalito, California, USA, 1993
2
Gross, J.H., Mass Spectrometry, 2nd Edition, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, 2004,
2011, 249-342.
9
Bioöljyjen analytiikka APPI/ESI-FTICR-massaspektrometrialla
Timo Kekäläinen, Laura Hiltunen, Tapani Venäläinen, Janne Jänis
Itä-Suomen yliopisto, Kemian laitos, Joensuu
timo.kekalainen@uef.fi / janne.janis@uef.fi
Johdanto. Mielenkiinto erilaisten bioöljyjen, erityisesti puupohjaisten pyrolyysiöljyjen
tuotantoon on kasvanut merkittävästi viime aikoina. Puubiomassasta valmistettu
pyrolyysiöljy on halvin nestemäinen biopolttoaine ja tulevaisuudessa monen uusiutuvan
liikennepolttoaineen lähde. Bioöljyjen kemiallinen koostumus on erittäin kompleksinen ja
koostumuksen selvittäminen on ollut vaativaa, varsinkin suurempien molekyylien (M > 200
Da) osalta. Bioöljyjen koostumuksen tunteminen auttaa kehittämään niiden varastointia,
käyttöä sekä jatkojalostusprosesseja. Bioöljyn lähtömateriaali ja sen tuottamistapa sekä
käsittelyprosessit vaikuttavat merkittävästi sen koostumukseen ja ominaisuuksiin, kuten
lämpöarvoon, vesipitoisuuteen ja happamuuteen. Korkean resoluution Fourier-muunnosionisyklotroniresonanssimassaspektrometria (FT-ICR-MS) on erittäin tehokas menetelmä
erityisesti bioöljyjen suurempien yhdisteiden analysointiin.
Materiaalit ja menetelmät. Tämän esitelmän tuloksissa käsitellään mm. puolinopealla
pyrolyysillä koivusta (Betula pendula) ja hitaalla pyrolyysillä männystä (Pinus sylvestris)
valmistettuja bioöljyjä. Öljyjen kemiallista koostumusta selvitettiin 12-T Bruker APEX-Qe
hybridi–kvadrupoli FT-ICR-massaspektrometrilla, käyttäen sähkösumutusionisaatiota (ESI)
tai normaali-ilmanpaineista fotoionisaatiota (APPI). Datan analysointiin käytettiin ns.
Kendrickin massajäännösmenetelmää ja tunnistetut yhdisteet jaettiin homologisiin sarjoihin
heteroatomiluokan ja kaksoissidosekvivalentin (DBE) mukaisesti.
Tulokset. Puupohjaiset pyrolyysiöljyt ovat seoksia, jotka sisältävät vettä, tervaa ja erilaisia
orgaanisia yhdisteitä, kuten happoja, alkoholeja, aldehydejä, ketoneja, fenolisia yhdisteitä
ja sokereita. Puun pääkomponenttien, selluloosan, hemiselluloosan ja ligniinin hajoaminen
tuottaa pyrolyysiöljyyn runsaasti reaktiivisia, happea sisältäviä yhdisteitä. Työn tulokset
vahvistivat tämän: heteroatomeja sisältävistä yhdisteistä suurin osa (>90 %) oli ns. Oluokan yhdisteitä, joista O2–O15-luokkiin kuuluvia yhdisteitä havaittiin. O-luokan yhdisteistä
tunnistettiin mm. rasva- ja hartsihappoja, sokereita/sokereiden kaltaisia yhdisteitä ja
erilaisia, mahdollisesti ligniinin hajoamisen myötä muodostuvia fenolijohdannaisia. ESI ja
APPI tuottavat bioöljyjen koostumuksesta komplementaarista tietoa; siinä missä ESI
ionisoi lähinnä pooliset, happamat heteroatomiyhdisteet, APPI ionisoi tehokkaasti myös
öljyjen poolittomat komponentit, esim. PAH-yhdisteet.
10
Bromattujen palonestoaineiden määrittäminen ympäristönäytteistä
Marjaana Nousiainen
Suomen ympäristökeskus, Laboratorio, Helsinki
marjaana.nousiainen@ymparisto.fi
Suomen ympäristökeskuksen (SYKE) laboratoriokeskuksessa kehitetään haitallisten
ympäristökemikaalien analytiikkaa ja seurataan ympäristön tilaa ajanmukaisilla
epäorgaanisen ja orgaanisen kemian analyyseilla. Laboratoriokeskus toimii myös
kansallisena vertailu- ja kalibrointilaboratoriona ja ympäristönäytteenottajien
henkilösertifiointielimenä.
Menetelmänkehitys on tärkeä osa SYKEn laboratoriotoimintaa. Ympäristönäytteiden
esikäsittelyyn käytetään erilaisia uutto- ja puhdistustekniikoita ja orgaanisen
analytiikan
mittaustekniikat
perustuvat
laajalti
kaasukromatografiamassaspektrometriaan (GC-MS) ja nestekromatografia-massaspektrometriaan (LCMS). Näytematriisien monimutkaisuudesta ja analysoitavien yhdisteiden pienestä
pitoisuudesta johtuen menetelmänkehitys voi olla haasteellista.
Tässä esityksessä on esimerkkinä kvantitatiivisen menetelmän kehitystyö
polybromattujen difenyylieettereiden (PBDE) määritykseen pintavedestä. PBDEyhdisteet ovat yleisesti käytettyjä palonestoaineita mm. autoissa, elektroniikassa,
muoveissa ja tekstiileissä. Ne ovat haitallisia, pysyviä ja helposti ympäristöön ja
eliöihin kertyviä. Yhdisteryhmään kuuluu 209 eri kongeneeria, jotka eroavat toisistaan
bromausasteen suhteen. Näistä kuusi kongeneeria (PBDE #28, #47, #99, #100,
#153 ja #154) on mukana EU:n vesipuitedirektiivin ympäristölle haitallisten
prioriteettiaineiden listalla. Vaadittu ympäristönlaatunormi (EQS) kyseisille
kongeneereille on hyvin pieni (0.5 ng/l ΣPBDE). Työssä yhdisteet uutettiin vedestä
kiinteäfaasiuutolla, edelleen puhdistettiin silika-kolonnilla ja analysoitiin GC-MS/MS
tekniikalla. Kvantitatiivisessa analyysissä käytettiin isotooppilaimennustekniikkaa.
Menetelmä osoittautui tehokkaaksi ja toistettavaksi pienten PBDE-pitoisuuksien
konsentrointiin ja määritykseen. Kvantitatiivisissa mittauksissa kunkin kongeneerin
kohdalla saavutettiin määritysraja vaaditulla EQS-tasolla.
11
Trace level analysis of emergent pollutants –
How to reach the ultimate sensitivity?
Peter Abrahamsson
Agilent Technologies, Kronborgsgränd 23,SE-164 94 Kista, Sweden
peter.abrahamsson@agilent.com
Introduction. In liquid chromatography mass spectrometry it is a constant strive to
improve sensitivity. By different reasons, but regardless of application area, e.g.
environmental, food, pharmaceuticals, forensic, doping control, metabolomics, additional
sensitivity will at some stage always add knowledge. Achieving the best possible
sensitivity for a certain compound or mix of compounds is a combination of optimizing
each individual step in the analysis method. First, the compound or the compounds should
be extracted from the sample matrix to the highest possible recovery. Second, the sample
matrix should be removed while maintaining the highest possible recovery. Third,
chromatographic conditions should be chosen by selecting the most suitable column
dimensions and type in combination with the mobile phase conditions. Fourth, the type of
mass spectrometer should be selected to achieve the necessary sensitivity, selectivity,
robustness and reproducibility at the lowest amount injected on column. Fifth, the right ion
source and ion source parameters should be carefully selected to fit the compounds and
sample matrix. Sixth, the settings for data acquisition should match the number of
compounds eluting off the column at a certain time. In this talk, an extensive number of
examples will be presented to highlight the importance of each individual step in order to
achieve the ultimate sensitivity.
Materials and methods. Pesticides standards and steroid standards spiked into authentic
matrices, e.g. plasma, soil and water. Sample analysis have been performed using Agilent
1290 Infinity liquid chromatographic system coupled to a 6490 triple quadrupole mass
spectrometer or a 6550 quadrupole time-of-flight system. Both mass spectrometers have
been equipped with Agilent Jet Stream ion source.
Results. For steroid analysis, a low fg on column detection limit for 17β-estradiol in
different matrices will be presented. For a multi-compound method for pesticide analysis in
water, a low fg/high ag on column detection limit will be demonstrated.
12
Kolikon kokoinen laboratorio
– Mikrosiruteknologiaa massaspektrometriaan
Tiina Sikanen
Helsingin yliopisto, Farmasian tiedekunta, Farmaseuttisen kemian ja teknologian osasto,
Helsinki
tiina.sikanen@helsinki.fi
Johdanto. Mikrofluidistiikkaa ja nanoteknologiaa hyödynnetään enenevässä määrin eri
bioanalytiikan osa-alueilla. Erityisesti useiden yksittäisten analyysivaiheiden liittäminen
samalle mikrosirulle ts. mikrofluidistiikkaan perustuvat kokonaisanalyysilaitteistot (engl.
lab-on-a-chip) tarjoavat monipuolisia mahdollisuuksia näytteenkäsittelyyn ja yhdisteiden
erottamiseen ennen massaspektrometrista (MS) analyysia.1
Materiaalit ja menetelmät. Tässä esityksessä keskitytään erityisesti kapillaarielektroforeesin (CE) ja sähkösumutusionisaation (ESI) miniatyrisointiin ja puolijohdeteollisuuden
menetelmillä valmistettujen CE-ESI-mikrosirujen sovelluksiin lääkeaineiden, peptidien ja
proteiinien MS-analytiikassa. Lisäksi tarkastellaan erilaisten näytteenesikäsittelymenetelmien, kuten kiinteäfaasiuuton ja neste-nesteuuton, integrointia CE-ESI-mikrosiruun
sekä CE-ESI-mikrosirujen sovelluksia mm. kaksiulotteisessa elektroforeesissa.
Tulokset. CE-ESI-mikrosiruteknologian merkittävimmät edut perinteisiin erotusmenetelmiin verrattuna ovat ennen kaikkea suuri analyysinopeus (tyypillisesti <1
min/näyte) sekä pieni näyte- ja liuotinkulutus (5-10 µL/analyysi). Mikrosiru-CE:n korkea
erotustehokkuus perustuu pitkälti poikittaisinjektiotekniikkaan, joka mahdollistaa hyvin
kapean (V~50-100 pL) näytevyöhykkeen injektoinnin ja siten erittäin nopean CEerotuksen. ESI-kärjen integrointi suoraan CE-kanavan päähän puolestaan eliminoi
kuolleen tilavuuden, jolloin tyypillisesti saavutetaan jopa 3500-5500 teoreettista pohjaa
vain 2 cm:n pituisissa erotuskanavissa. Mikrosiruteknologia mahdollistaa myös
massaspektrometrisen analyysin hyvin pienistä ainemääristä (<1 amol per injektiotilavuus),
joskin vain murto-osa (~1/105) näytteestä hyödynnetään aktiivisesti analyysiin. Tässä
esityksessä kuvataan, kuinka näytteenesikäsittely-yksikön liittäminen kiinteäksi osaksi CEESI-mikrosirua mahdollistaa paitsi näytteen puhdistuksen, myös parantaa näytteensyötön
hyötysuhdetta ilman, että kokonaisanalyysiaika merkittävästi pitenee. CE-erotuksen
selektiivisyyttä voidaan puolestaan manipuloida liittämällä kaksi (tai useampia)
erotuskanavistoja peräkkäin, tässä tapauksessa kapillaarivyöhyke-elektroforeesin ja
kapillaari-isoelektrisen fokusoinnin yhdistämiseksi. Toisaalta erotuskanavan pintakemiaa
voidaan muuttaa bioyhteensopivaksi yksinkertaisesti mikrosirun valmistusmateriaalia
vaihtamalla, mistä esimerkkinä proteiinien CE-ESI/MS-analyysi mikrosirulla.
1
Sikanen, T., Franssila, S., Kauppila, T.J., Kostiainen, R., Kotiaho, T. ja Ketola, R.,
”Microchip Technology in Mass Spectrometry”, Mass Spectrom. Rev. 29, 2010, 351-391.
13
Kemiallisten aseiden käytön varmistus Syyriassa
Martin Söderström,1 Ullastiina Hakala, Harri Kiljunen, Olli Kostiainen,
Marja-Leena Kuitunen, Paula Vanninen
1
Helsingin yliopisto, Kemian laitos, VERIFIN
martin.soderstrom@helsinki.fi
Johdanto. Koko alkuvuoden 2013 jatkuneiden kemiallisen aseiden käytön epäilysten
jälkeen YK:n tutkijaryhmä pääsi elokuussa Syyriaan tutkimaan syytösten paikkansapitävyyttä. Ryhmä koostui YK:n, Kemiallisen aseen kieltojärjestön (OPCW) ja Maailman
terveysjärjestön (WHO) tutkijoista. Kun ryhmä valmistautui tutkimuksiin Damaskoksessa,
Ghoutassa, Damaskoksen esikaupungissa, tehtiin kemialliselta iskulta vaikuttanut
hyökkäys. Ryhmä sai sovittua viiden tunnin tulitauon neljäksi päiväksi, jolloin he pääsivät
tutkimaan aluetta, tekemään haastatteluja ja ottamaan näytteitä. OPCW:n
normaalitarkastuksessa paikalle olisi viety kenttälaboratorio, joka olisi seulonut ryhmän
ottamat näytteet ennen niiden lähetystä varmistuslaboratorioihin. Syyrian tapauksessa
sisällissota esti kenttälaboratorion käytön ja kaikki n. 50 ympäristö- ja 50
biolääketieteellistä näytettä lähetettiin analysoitaviksi. Syyskuussa ryhmä palasi Syyriaan
tutkimaan väitteitä muista kemiallisista iskuista. Ryhmä sai n. 20 verinäytettä syyrialaisilta
ja otti n. 30 uutta plasmanäytettä, jotka kaikki lähetettiin edelleen analysoitaviksi.
Materiaalit ja menetelmät. Ympäristönäytteiden (esim. maa-, vesi-, pyyhkäisy- ja
materiaalinäytteet) analyysissä etsitään hermokaasuja ja niiden hydrolyysituotteita
(fosfonihappoja) GC–MS/MS ja LC–MS/MS menetelmillä. Näytteenkäsittely ja analyysi on
melko suoraviivaista. Suurin ongelma on mahdollisesti vaihteleva ja hankala näytetausta.
Pitoisuudet ovat tyypillisesti ppm-tasolla.
Tärkeimmät biolääketieteelliset näytetyypit ovat virtsa ja plasma. Virtsasta etsitään
hermokaasujen hydrolyysituotteita noin 1–800 ppb pitoisuuksista. Hydrolyysituotteet
poistuvat elimistössä hieman yli viikossa. Plasmasta etsitään proteiineihin sitoutunutta
hermokaasua. Proteiinista vapautettua hermokaasua analysoidaan GC–MS/MS:llä ja
sitoutunutta LC–MS/MS:llä. Proteiiniadduktien pitoisuudet ovat luokkaa 50 ppt–5 ppb.
Tulokset. Ympäristönäytteet analysoitiin kahdessa laboratoriossa ja biolääketieteelliset
kahdessa laboratoriossa. Laboratorioiden tulokset olivat keskenään yhtäpitävät, joten
väitteet sariinin käytöstä Ghoutassa ja muutamassa muussa iskussa pystyttiin osoittamaan
todeksi. Biolääketieteellisten näytteiden kvalitatiiviset tulokset vastasivat toisiaan
täydellisesti. YK on julkaissut tulokset kahdessa raportissa.1,2 Kvantitatiiviset tulokset ovat
vielä salaisia, koska YK:n selvitys on kesken.
Kirjallisuusviitteet.
“United Nations Mission to Investigate Allegations of the Use of Chemical Weapons in
the Syrian Arab Republic, Report on the Alleged Use of Chemical Weapons in the
Ghouta Area of Damascus on 21 August 2013”, YK, 13.9.2013, 41 sivua.
2
“United Nations Mission to Investigate Allegations of the Use of Chemical Weapons in
the Syrian Arab Republic, Final report”, YK, 15.12.2013, 82 sivua.
1
14
Kaksoisdetektoritekniikat huumausaineiden analysoinnissa
Laura Harvilahti,1,2 Jukka Niiranen,1 Sami Huhtala,2
1
Metropolia Ammattikorkeakoulu, Helsinki
2
Keskusrikospoliisi, Rikostekninen laboratorio, Vantaa
sami.huhtala@poliisi.fi
Johdanto. Huumausaineiden analysoinnissa käytettävien menetelmien tulee olla
spesifisiä, jotta näytteistä tutkittavien yhdisteiden tunnistus on luotettavaa. Samalla
näytemäärät ja tulosten toimitusajat asettavat analytiikalle omat haasteensa. Asiaa on
lähestytty kehittämällä ns. kaksoisdetektorimenetelmiä, jolloin samasta kromatografisesta
ajosta saadaan kaksi toisiaan täydentävää detektori vastetta. Nykyisin kannabisnäytteiden
analysoinnissa käytetään kahta eri laitetta. Jos ensin tehtävässä GC-FID määrityksessä
(THC -yhdisteen tunnistus/pitoisuus) on tunnistamaton signaali tai tulos on negatiivinen,
analysoidaan näyte uudelleen GC-MS:lla mahdollisten muiden yhdisteiden toteamiseksi.
Näyte voi sisältää esimerkiksi synteettisiä kannabinoideja kuten JWH-018.
Materiaalit ja menetelmät. Kannabisnäytteiden analysointiin testattiin menetelmää, jossa
kaasukromatografi on liitetty kahteen detektoriin, liekki-ionisaatiodetektoriin ja
massaspektrometriin (GC-FID/MS, Agilent 6890 GC-FID-5973 MS, kolonni(t) DB-5: 10 m x
100 μm x 0,17 μm). Yhdistelmä toteutettiin kolmella erilaisella kolonniliitoksella, joissa
näytteen jakaminen tapahtui laiteanalyysin eri vaiheissa: i) jako tapahtuu injektorissa
(kaksi kolonnia), ii) esikolonnin ja analyyttisten kolonnien liitoksessa (kaksi kolonnia) ja iii)
analyyttisen erotuksen jälkeen (yksi kolonni) ennen detektoreita. Näiden kolmen eri
ratkaisun antamia tuloksia verrattiin GC-FID:n ja GC-MS:n samoista näytteistä antamiin
tuloksiin. Laitteiston toimivuus testattiin sekä vaikuttavan aineen tunnistuksen että THC pitoisuuden määrityksen osalta.
Tulokset. Kolonniliitos: Testatuista vaihtoehdoista kolonniliitos 2 todettiin parhaiten
toimivaksi. Tunnistus: MS-detektorin toimivuus ja tunnistuskyky testattiin ajamalla
näytteitä, joissa tiedettiin olevan THC:tä tai synteettisiä kannabinoideja. Näytteitä oli 27,
joissa tunnistettavia yhdisteitä yhteensä 33. GC-FID/MS -laitteisto tunnisti yhdisteet
yhtenevästi käytössä olevan tunnistusmenetelmän/laitteiston (GC-MS) kanssa. Pitoisuus:
GC-FID/MS -laitteistolla tehtävän pitoisuusmäärityksen tulosten yhtenevyys, toistettavuus
sekä uusittavuus testattiin käytössä olevan pitoisuusmenetelmän/laitteiston (GC-FID)
suhteen. Kannabisnäytteet (13 eri marihuananäytettä) edustivat eri THC -pitoisuuksia (0,115 p-%). Saatujen tuloksien keskiarvot (<2% toistettavuus, <5% uusittavuus) tai
hajonnat (<6% toistettavuus, <10% uusittavuus) eivät poikkea merkittävästi toisistaan.
Vastaavalla periaatteella on kehitteillä pitoisuus-/ tunnistusmenetelmä UHPLC-DAD-TQMS
-laitteistolla (Shimadzu) tehtävälle amfetamiinin, metamfetamiinin ja MDMA:n
määritykselle.
15
Oksisterolien analysointi biologisista näytteistä:
UPLC-TQ-S:n ja UPLC-Q-TOF:n vertailua
Petri Kylli,1 Linda Ahonen1, Florian B.R. Maire, 2 Rob J. Vreeken,2 Risto Kostiainen1
1
Helsingin yliopisto, farmaseuttisen kemian ja teknologian osasto, Helsinki
2
Leiden University, Analytical BioSciences, LACDR, Leiden
petri.kylli@helsinki.fi
Johdanto. Työn tavoitteena oli kehittää herkkä analyysimenetelmä kolesterolin
hapettumistuotteiden ja D3 vitamiinin metaboliittien analysoimiseksi aivo- ja
solumallinäytteistä.
Työssä
vertailtiin
kahta
erilaista
massaspektrometria,
kolmoiskvadrupolia ja Q-TOF:a.
Materiaalit ja menetelmät. Näytteinä olivat kokonaiset hiiren aivot ja Parkinsonin taudin
malleina käytettävät SH-SY5Y –solulinjanäytteet. Solulinjanäytteille aiheutettiin
oksidatiivinen stressi, jolloin ne muodostavat Parkinsonin taudille tyypillisiä
proteiiniplakkeja1. Sekä hiiren aivot että solulinjanäytteet uutettiin metanolidikloorimetaaniseoksella, supernatantti haihdutettiin kuiviin ja liuotettiin sisäistä standardia
sisältävään metanoliin. Käytetyt standardiyhdisteet olivat sekä hydroksikolesteroleita että
D3 vitamiinin metaboliitteja. Näytteet analysoitiin Waters Acquity UPLC Xevo TQ-S ja
Waters Acquity UPLC Synapt G2-S Q-TOF-MS –laitteistoilla käyttäen APPI ionisatiota ja
tolueenia dopanttina. Ajoliuoksina käytettiin vettä (A) ja metanolia (B). Kolonni oli Waters
BEH C18, 1,7 µm, 2,1 x 100 mm. Xevo TQ-S massaspektrometrilla mittaukset suoritettiin
SRM –moodissa ja Synapt G2-S:lla MSe-moodissa massa-alueella m/z 50-600.
Tulokset. Menetelmien todettiin olevan herkkiä ja toistettavia sekä lineaarisia tutkituilla
pitoisuusalueilla. Kolmoiskvadrupolilaitteella mittausalue oli 0,5-1000 ng/ml ja Q-TOF laitteella 10-500 ng/ml. Hiiren aivonäytteistä havaittiin 24-OH-, 27-OH-, 7α-OH- ja 7β-OHkolesteroleita sekä 7-ketokolesterolia ja desmosterolia. Solumallinäytteistä havaittiin samat
yhdisteet paitsi 27-OH-kolesteroli. Tulokset ovat samankaltaisia kuin aiemmissa
tutkimuksissa havaitut2,3. Solunäytteistä havaittiin Q-TOF –laitteella myös neljä
tuntematonta yhdistettä, joiden tarkka m/z –arvo ja fragmentoitaatio olivat tyypillisiä
hydroksikolesteroleille4.
Kirjallisuusviitteet.
Myöhänen TT, Hannula MJ, Van Elzen R, Gerard M, Van Der Veken P, García-Horsman
JA, Baeklandt V, Männistö PT ja Lambeir AM. Br J Pharmacol 2012; 166: 1097.
2
Griffiths WJ ja Wang Y. Biochim Biophys Acta 2011; 1811: 784.
3
Heverin M, Meaney S, Lütjohann D, Diczfalusy U, Wahren J ja Björkhem I. J Lipid Res
2005; 46: 1047.
4
Brouwers JF, Boerke A, Silva PFN, Garcia-Gila N, van Gestel RA, Helms JB, van de Lest
CHA ja Gadella BM. Biol Reprod 2011; 85: 128.
1
16
Accelerating Metabolomics with High Speed and High Resolution
MS/MS
Milla Neffling,1 Baljit Ubhi2, Jean-Baptiste Vincendet3
1
AB Sciex, Warrington, UK; 2 AB Sciex Redwood Shores, CA, USA: 3 AB Sciex, France,
EMEA
Milla.Neffling@absciex.com
Biologisten järjestelmien kohdentamattomat (Non-Targeted) analyysit ovat avainasemassa
tutkittaessa biologisia systeemejä ja sairauksia. Korkean erotuskyvyn (High Res) MS ja
MSMS
kohdentamattomat
analyysimetodit
mahdollistavat
uusien
yhdisteiden
havaitsemisen ja identifikaation, joiden tuntemus voi olla avainasemassa metaboliareittien
ja sairauksien ymmärtämisessa.
Perinteisesti
alemman
resoluution
MS
laitteistolla
mitatut
kohdennetut
tandemmassaspektrometri-analyysit on suunniteltu määrittamään näytteestä tietyt ja jo
ennalta tunnetut analyyytit, joiden osuus on rajoitettu otos koko systeemistä.
Tarkoituksena yleisesti on testata hypoteesi biologisesta systeemistä. Kohdennetun
analyysin etuna usein on parempi herkkyys, suorituskyky ja dynaaminen alue kuin
kohdentamattomissa analyyseissa. Kohdennettujen analyysien metodinkehityksessa
vaaditaan jo ennakolta laajaa tietämystä määritettavistä analyyteista.
AB Sciexin TripleTOF (kvadrupoli-TOF) teknologia yhdistää molempien anaalyysimetodien
parhaat puolet. Laboratoriot pystyvät suorittamaan näytteiden sekä kvantitatiiviset, että
kvalitatiiviset analyysit, usein yhdessä analyysimetodissa.
Käyttäjät voivat suorittaa kohdentamattomia analyyseja korkean erotuskyvyn MS ja MSMS
analyyseilla kaikista havaituista piikeistä. Tämä data voidaan prosessoida käyttäen
hyväksi joko ennaltaluotuja yhdiste-listoja (mittavampi lista kuin kohdennetuissa
analyyseissä mahdollista) hyödyntäen retentioaikaa, MS ja MSMS tarkka massa kirjastoja, - tai kohdentamatonta analyysia, jossa seulonta-prosessi suoritetaan käyttäen
tarkan massan MS ja MSMS-dataa, isotooppikuviota seka adduktien välittämää tietoa.
Kun haluttu määrä informatiota on tarjolla, voivat käyttäjät hyodyntää kohdennettuja MRM–
HR analyyseja, ja saavuttaa korkeaa selektiivisyytta käyttämällä korkean erotuskyvyn
MSMS dataa kaikista fragmenteista ja prosessoida dataa kohdennetusti.
Näiden hyvin-tunnettujen metodien lisaksi AB Sciexin TripleTOF instrumentilla dataa
voidaan kerätä SWATH moodilla. SWATH on kohdentamaton, informaatiosta riippumaton
analyysimetodi, joka kerää korkean resoluution MSMS spektran kaikista havaittavista
analyyteistä monimutkaisessa näytteessä, yhdessä analyysissa. SWATH tarjoaa MRMtason selektiivisyyden joka analyytille, ilman monivaiheista metodinkehitystä. SWATH
avaa
useita
mahdollisuuksia
metaboliareittien
kartoitukseen
kuten
myös
massaspektrometriaan yleensä.
17
Massaspektrometria reaktiivisten lääkeainemetaboliittien tutkimuksessa
Tekijä(t): Ari Tolonen1
1
Yhteystiedot: Admescope Oy, Oulu
S-posti: ari.tolonen@admescope.com
Johdanto. Kemiallisesti reaktiivisten metaboliittien muodostuminen on yksi lääkeaineiden
haittavaikutusten ja odottamattomien toksisuusilmiöiden pääsyistä. Reaktiiviset metaboliitit
voivat sitoutua elimistön proteiineihin ja DNA:han, minkä vuoksi niiden muodostumisen
ennustaminen on oleellista lääkekehityksen aikana. Reaktiivisuuden vuoksi näiden
elektrofiilisten yhdisteiden elinikä on hyvin lyhyt, minkä vuoksi niitä ei voi analysoida in
vitro- tai in vivo-näytteistä suoraan sellaisenaan. Perinteisesti niiden analysointiin onkin
käytetty stabilointia (trapping) nukleofiilisillä reagensseilla, kuten esimerkiksi glutationilla
(GSH) tai syanidilla (CN), ennen niiden analysointia LC/MS-tekniikoilla.
Materiaalit ja menetelmät. Esitys sisältää lyhyen katsauksen massaspektrometrisistä
menetelmistä reaktiivisten lääkeainemetaboliittien analytiikassa; alkaen perinteisistä
glutationi-spesifisten neutraalilohkeamien LC/MS/MS-mittauksista ja edeten moderneihin
korkean resoluution MS-tekniikoihin, isotooppi-leimattujen tai muuten muokattujen
stabilointireagenssien sovellutuksiin, datankäsittelymenetelmiin kuten massadefekti- ja
isotooppi-filtteröinti, korkean resoluution neutraalilohkeamamittauksiin, asyyliglukuronidikonjugaattien
analysointiin,
sekä
kovalenttien
proteiini-metaboliitti-kompleksien
massaspektrometriaan.
18
HPLC-MS menetelmien ja näytteenkäsittelyn kehitys BioCenter Kuopion
metabolomiikkalaboratoriossa
Marko Lehtonen,1 Seppo Auriola,1 ja Kati Hanhineva2
1
2
Itä-Suomen yliopisto, Farmasian laitos, Kuopio
Itä-Suomen yliopisto, Kliininen ravitsemustiede, Kuopio
S-posti: marko.lehtonen@uef.fi
Johdanto. Itä-Suomen yliopiston Kuopion kampuksella toimiva Metabolomiikkakeskus
tarjoaa massaspektrometriaan perustuvia tutkimuspalveluja yliopistojen tutkijoille sekä
kotimaisille ja kansainvälisille yhteistyökumppaneille. Metabolomiikalla, eli metabolisella
profiloinnilla tutkitaan kokonaisvaltaisesti elimistön aineenvaihdunnassa syntyneiden
pienikokoisten yhdisteiden rakenteita ja pitoisuustasoja. Sitä voidaan hyödyntää mm.
tutkimuksissa, joissa seurataan ravitsemuksen ja muiden ympäristötekijöiden vaikutusta
yhdessä perintötekijöiden kanssa elimistön aineenvaihduntatuotteiden koostumukseen,
mitä kautta voidaan löytää biomarkkereita esim. erilaisten sairauksien varhaisille
riskitekijöille.
Materiaalit ja menetelmät. Tyypillisimmät yksikössämme analysoitavat näytematriisit ovat
plasma, virtsa sekä eläin- tai kasviperäiset kudosnäytteet, joille on optimoitu
näytteenkäsittelymenetelmät entsymaattisen toiminnan lopettamiseksi ja tutkittavien
yhdisteiden uuttamiseksi. Kullekin näytteelle tehdään kaksi kromatografista erottelua (RP
ja HILIC, Agilent 1290 UPLC) ja massaspektrometrinen detektointi (Agilent 6540 QTOF)
käyttämällä sekä positiivista että negatiivisesta ionisaatiota (Jetspray ESI). Yhdisteiden
tunnistus perustuu yhdisteelle ominaisen retentioajan ja tarkan molekyylimassan lisäksi
MSMS-määrityksiin kolmella eri törmäyskammion energialla ja saatujen tuloksien
vertaamiseen puhtaista standardeista, datapankeista sekä kirjallisuudesta saatavaan
tietoon.
Tulokset. Mittauksien haaste on elimistön aineenvaihduntatuotteiden ison lukumäärän
lisäksi erittäin laaja pitoisuusalue ja määritettävien yhdisteiden erilainen kemiallinen
luonne. Käytössämme olevilla menetelmillä voidaan määrittää satoja, jopa tuhansia
yhdisteitä biologisista näytteistä. Optimoiduilla näytteenkäsittelymenetelmillä saadaan
samanaikaisesti sekä hidastettua näytteen koostumusta muuttavat entsymaattiset
prosessit että uutettua mahdollisimman laajan polaarisen alueen kattava joukko
metaboliitteja. Käytetyt olosuhteet ottavat myös huomioon näytteiden mahdollisimman
hyvän säilyvyyden. Kahdella erilaisella erottelutekniikalla (RP ja HILIC) saadaan tutkittua
polaarisuusalueeltaan laaja joukko yhdisteitä. Menetelmien kehityksessä on myös havaittu
mm. negatiivisen ESI-ionisaation kannalta optimaalisten ajoliuoksien soveltuvan huonosti
metabolomiikkatyöhön, koska tällöin kromatografinen toistettavuus on huono ko.
projekteihin liittyvissä pitkissä näytesarjoissa. Tutkittavien näytteiden randomisoinnit ja
laadunvalvontanäytekäytännöt lisäävät saatujen tulosten vertailtavuutta ja näin toimivat
tärkeänä perustana tutkimuksien seuraavaan vaiheeseen, eli tulosten käsittelyyn
tilastollisten ja kemometristen työkalujen avulla.
19
Direct sample analysis with Time of Flight Mass spectrometry (DSATOF) and the new GC/MS/MS from PerkinElmer
PerkinElmer Sweden, Upplands Väsby, Sweden
jonas.bjorklund@perkinelmer.com
Introduction. The Best Sample Prep is No Sample Prep - Direct Sample Analysis Time of
Flight Mass Spectrometry (DSA-TOF).
TM
AxION DSA system, a breakthrough technology coupled with mass spectrometry that
allows the direct analysis of a sample with minimal to no sample prep or chromatography.
Quantify and Identify with the NEW revolutionary AxION iQT™ GC/MS/MS. The AxION
iQT is one-of-a-kind technology that combines triple quad quantification and Q-TOF
identification capabilities in just one instrument, and is 50 times faster than any quadrupole
without compromising sensitivity. We are also introducing the unique Cold EI ion source
enabling true quantitation from the molecular ion.
20
Faasin I metaboliareaktioiden jäljittely titaanidioksidivalokatalyysilla,
sähkökemiallisilla reaktioilla ja sähkökemiallisesti avustetulla Fentonreaktiolla
Miina Ruokolainen,1 Hjalmar Permentier,2 Tiina Sikanen,1 Risto Kostiainen,1 Tapio
Kotiaho1,3
1
2
Helsingin yliopisto, Farmaseuttisen kemian ja teknologian osasto, Helsinki
University of Groningen, Mass Spectrometry Core Facility, Groningen, the Netherlands
3
Helsingin yliopisto, Analyyttisen kemian laitos, Helsinki
tapio.kotiaho@helsinki.fi
Johdanto. Faasin I metaboliassa voi syntyä toksisia tai aktiivisia metaboliitteja ja
epätoivottu metabolia voi olla syynä lääkeainekandidaattien karsiutumiseen. Siksi
metabolian tutkiminen on aikaistunut lääkekehitysprosessissa, mikä on lisännyt tutkittavien
yhdisteiden määrää ja siten synnyttänyt tarpeen nykyisiä in vitro -menetelmiä
nopeammille, helpommille ja edullisemmille menetelmille. Sytokromi P450 -isoentsyymien
katalysoimat hapetusreaktiot ovat tärkein faasi I -metaboliareitti. Siksi useiden eri
hapetusmenetelmien, kuten metalloporfyriinien, sähkökemiallisen (EC) hapetuksen ja
Fenton-reaktioiden, soveltuvuutta lääkeainemetabolian jäljittelyyn on tutkittu.1 Myös
titaanidioksidi- (TiO2) valokatalyyttisissa reaktioissa on osoitettu syntyvän metaboliitteja
muistuttavia yhdisteitä.2 Tämän työn tarkoituksena on vertailla TiO2-valokatalyysin, suoran
sähkökemiallisen hapetuksen ja sähkökemiallisesti avustetun Fenton-reaktion (EC-Fenton)
soveltuvuutta lääkeainemetabolian jäljittelyyn.
Materiaalit ja menetelmät. Amfetamiinin, buspironin, promatsiinin, testosteronin ja 7etoksikumariinin TiO2-valokatalysoiduissa, EC- ja EC-Fenton-reaktioissa syntyneitä
tuotteita vertailtiin in vitro humaani maksamikrosomeilla tuotettuihin faasin I
metaboliitteihin. Näytteet analysoitiin UPLC–ESI–Q-TOF-menetelmällä.
Tulokset. Hydroksyyliradikaaleihin perustuvilla TiO2-valokatalyysilla ja EC-Fentonreaktioilla pystyttiin jäljittelemään useampia HLM-metaboliareaktioita kuin suoralla EChapetuksella, jolla esimerkiksi useat hydroksylaatioreaktiot ja O-dealkylaatio eivät ole
mahdollisia. TiO2-valokatalyysi ja EC-Fenton-reaktiot ovat kuitenkin epäselektiivisempiä ja
tuottivat siksi useampia reaktiotuotteita, joita HLM-metaboliareaktioissa ei havaittu.
Kehitetty TiO2-valokatalyysimenetelmä oli huomattavasti nopeampi verrattuna EC-Fentonmenetelmään. Millään vertailluista menetelmistä ei pystytä jäljittelemään kaikkia faasin I
metaboliareaktioita, ja siksi EC-, EC-Fenton- ja TiO2-valokatalyyttiset hapetusmenetelmät
soveltuvat vain rajoitetusti lääkeainemetabolian ennustamiseen. Niillä voidaan kuitenkin
tuottaa useita tärkeitä metaboliitteja muihin lääkekehitysprosessin tarpeisiin.
Kirjallisuusviitteet.
Lohmann, W. ja Karst, U., Anal. Bioanal. Chem. 391, 2008, 79-96
2
Nissilä, T., Sainiemi L., Karikko, M., Kemell, M., Ritala, M., Franssila, S., Kostiainen, R. ja
Ketola R.A., Lab Chip 11, 2011, 1470-1476
1
21
Desorption atmospheric pressure photoionization combined with
travelling wave ion mobility-mass spectrometry
Riikka-Marjaana Räsänen,1 Prabha Dwivedi,2 Facundo M. Fernández,2 Tiina Kauppila2*
1
2
University of Helsinki, Division of Pharmaceutical Chemistry, Helsinki
Georgia Institute of Technology, School of Chemistry and Biochemistry, Atlanta, USA
*
tiina.kauppila@helsinki.fi
Introduction. Desorption atmospheric pressure photoionization (DAPPI) is a direct open
air surface sampling and ionization technique to analyze studied compounds directly from
the solid sample surface without pre-handling or pre-separation of the sample.1 DAPPI has
been used to analyze e.g. pharmaceuticals,1 poly-aromatic hydrocarbons2 and lipids.3
Previous studies with other ambient ionization techniques have shown that ion mobility
separation enhances the selectivity and increases the signal-to-noise ratio (S/N).4
Therefore, the objective of this study was to couple DAPPI to travelling wave ion mobilitymass spectrometry (TWIM-MS) to increase spectrum interpretability, and to explore the
potential applications of DAPPI-TWIM-MS.
Materials and methods. DAPPI was assembled in front of a Synapt G2 TWIM-MS
instrument (Waters, UK). 1 µL of 1-100 µM single standards (retinol (vitamin A), cortisol,
cholecalciferol (vitamin D3), α-tocopherol (vitamin E), ranitidine, benzo[a]pyrene,
phylloquinone (vitamin K1), bisphenol A) and a mixture of retinol, cholecalciferol and αtocopherol, were applied on PTFE plates and left to dry. The analytes were vaporized
using hot toluene vapor and ionized using a VUV krypton discharge lamp. In case of
authentic samples, pharmaceutical tablets and almonds, the analysis was performed
directly from the sample surface.
Results. The selected compounds were efficiently ionized by DAPPI. The estimated limits
of detection for the studied compounds were in the range of 30-290 fmol. The main ions
detected in the spectra of the non-polar vitamins D3 and E were at m/z 383 ([M-H]+ of D3)
and 430 (M+· of E), respectively. Vitamin A dissociated showing a fragment at m/z 255 as
the main ion. Vitamins A, D3 and E were successfully separated by TWIM. In the analysis
of authentic samples, vitamin E was detected from almonds as an intensive M+·. DAPPI
was applied to the analysis of a genuine emergency contraceptive tablet and a potentially
fake tablet. These were clearly differentiated according to the different mobilities of the
analytes and the mass spectra. In the all TWIM-MS measurements, the TWIM separation
enhanced the spectral quality and the S/N.
References
1
Haapala M., Pol J., Saarela V., Arvola V., Kotiaho T., Ketola R.A., Franssila S., Kauppila
T.J., and Kostiainen R., Anal. Chem. 79, 2007, 7867-7872.
2
Luosujärvi L., Kanerva S., Saarela V., Franssila S., Kostiainen R., Kotiaho T., Kauppila
T.J., Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 2010, 1343-1350.
3
Suni N.M., Aalto H., Kauppila T.J., Kotiaho T., Kostiainen R., J. Mass Spectrom. 47,
2012, 611-619.
4
Harris G., Graf S., Knochenmuss R., Fernández F., Analyst, 137, 2012, 3039-3044.
22
MphR(E) makrolidibiosensoriproteiinin rakenteen ja toiminnan
tutkiminen natiivimassaspektrometrialla
Nina Virolainen,1 Mika Torvinen,2 Josefiina Viitamäki,1 Antti Larjo,1 Matti Karp,1
Jarkko Valjakka,3 Janne Jänis1
1
Tampereen teknillinen yliopisto, kemian ja biotekniikan laitos, Tampere; 2 Tampereen
yliopisto, BioMediTech, Tampere; 3 Itä-Suomen yliopisto, kemian laitos, Joensuu
janne.janis@uef.fi
Johdanto. Bakteerien voimakkaasti yleistyvän antibioottiresistenssin syynä on erityisesti
makrolidiantibioottien lisääntynyt käyttö. Antibioottiresistenssiä aiheuttava geeni säätelee
esimerkiksi antibioottia tehottomaksi muokkaavan entsyymin ilmentymistä. Geeni voi olla
bakteerissa jo luontaisesti tai se voi mutatoitua perimään. Ympäristöömme päätyneiden
antibioottijäämien tunnistamiseen on kehitetty ja kehitetään edelleen bioluminesenssiin
perustuvia kokosolubiosensoreita.1 MphR(E) on makrolideja sitova repressoriproteiini, joka
säätelee makrolidi-2′-fosfotransferaasigeenin (mphE) transkriptiota. Kun makrolidi kiinnittyy
MphR(E)-proteiiniin, mphE-geenin transkription operaattorialue DNA:ssa vapautuu ja
aktivoituu. Näin vapautuneen geenin koodaama fosfotransferaasi tuottuu katalysoimaan
makrolidien desosamiiniryhmän fosforylaatiota, jolloin antibiootit inaktivoituvat ja syntyy
resistenssi. Tämän vuoksi MphR(E) on potentiaalinen säätelijäproteiini makrolideja
spesifisesti tunnistavien biosensoreiden suunnittelussa.
Materiaalit ja menetelmät. Työssä tutkittiin korkean erotuskyvyn natiivi–ESI-FTICR
massaspektrometrialla villityypin rekombinantti MphR(E)-proteiinin rakennetta ja erityisesti
sen makrolidispesifisyyttä. Lisäksi proteiiniin suunniteltiin DNA-sitomiskykyä parantavia
pistemutaatioita homologisen MphR(A) proteiinin kiderakenteen2 perusteella.
Tulokset. MphR(E) on kahdesta identtisestä 21,5 kDa:n alayksiköstä koostuva
homodimeerinen proteiini. Molempiin alayksiköihin voi sitoutua spesifisesti yksi
makrolidiantibiootti. MphR(E):n natiivimassaspektri vahvisti proteiinin esiintyvän
dimeerisenä myös ilman makrolidien tai DNA:n läsnäoloa. MphR(E):n ligandispesifisyyttä
tutkittiin 7:n eri makrolidin (erytromysiini, klaritromysiini, oleandomysiini, klindamysiini,
linkomysiini, spiramysiini ja tylosiini) kanssa. Sitoutumista havaittiin vain kolmen ensiksi
mainitun makrolidin kanssa, jotka ovat kaikki 14:n rengasatomin makrolideja. Sitoutuminen
oli likimain yhtä voimakasta erytromysiiniin ja klaritromysiiniin, mutta selvästi heikompaa
oleandomysiiniin. Erytromysiinin dissosiaatiovakioksi määritettiin ligandititrauksella Kd =
4,4 M ja Hillin vakioksi n = 1,7, eli kahden makrolidiligandin sitoutumisessa proteiiniin
havaittiin voimakas positiivinen ko-operatiivisuus. Tehdyillä aminohappomutaatioilla ei
pystytty merkittävästi parantamaan proteiinin affiniteettiä DNA:han, mutta niiden vaikutus
heijastui yllättäen jonkin verran makrolidien sitoutumisen affiniteetteihin.
1
2
Möhrle, V., Stadler, M., Eberz, G. Anal. Bioanal. Chem. 2007, 388, 1117–1125.
Zheng, J., Sagar, V., Smolinsky, A., Bourke, C., LaRonde-LeBlanc, N., Cropp, T.A. J.
Mol. Biol. 2009, 387, 1250–1260.
23
Revealing the identification power of Collision Cross Section
(CCS): a novel approach applied to pesticide analysis in food
Séverine Goscinny1, Michael McCullagh2, Vincent Hanot1, Gauthier Eppe3, David
Douce2 and Daniel McMillan2
1
Scientific Institute of Public Health, rue Juliette Wytsman 14, 1050 Brussels
2
3
Waters, Floats Road, Manchester, United Kingdom
Universityof Liège, MS Laboratory, Institut de Chimie, Bat. B6c, B-4000 Liège
mike_mccullagh@waters.com
Performing pesticide analysis in food requires coping with multi-class compounds,
different matrices and responding rapidly. Screening methods are very useful as they
can discriminate samples without any pesticides from those with detectable residues.
The laboratory can then focus their efforts on quantitative methods for a smaller
number of samples. Different strategies can be applied for screening purposes. Full
scan acquisition has however driven most of the attention because of its inherent
benefit of theoretical detection of unlimited number of compounds. In spite of this
analytical potential, it is well characterized that many factors can influence mass
spectra for LC-based methods and given the complexity of the samples analysed,
reliable identification can be unreachable in some cases. Ion mobility is known to be
a powerful analytical tool for the separation of complex samples and collision cross
sections of compounds derived from drift time has been extensively used for
characterization purposes. We will present a novel way to use these special mobility
features in screening methods from acquisition to data processing.
For the assay, UPLC-HDMSE experiments were performed on a Synapt G2-S using
a series of standard solutions, spiked matrices and a previous proficiency test. CCS
values were generated from the standard solutions and inserted into a scientific
library within a new scientific information system.
The screening method performances were tested with samples (blank matrices,
spiked samples and proficiency test). From these results, we will show how we can
reliably reduce the number of false positive and importantly avoid false negative
identifications.
Keywords: Multidimensional analysis, pesticide analysis, Liquid chromatography-Ion
mobility-High Resolution Mass spectrometry, identity confirmation
24
Seerumin 5-HIAA:n massaspektrometrinen menetelmä
neuroendokriinisten kasvainten diagnostiikassa
Niina Tohmola1,2, Outi Itkonen1, Timo Sane3, Helene Markkanen1, Sakari Joenväärä2,
Risto Renkonen1,2 ja Esa Hämäläinen1
1
HUSLAB, Helsingin yliopistollinen keskussairaala, Helsinki, 2 Haartman instituutti,
Helsingin yliopisto ja 3 Endokrinologian osasto, Helsingin yliopistollinen keskusairaala,
Helsinki
niina.tohmola@helsinki.fi
Johdanto: Neuroendokriiniset kasvaimet (NET) ovat peräisin hormoneja tuottavista
soluista. Näitä kasvaimia esiintyy yleisimmin suolistossa, mutta voi löytyä myös
esimerkiksi haimasta, kateenkorvasta tai keukoista.1 Kasvaimet voivat aiheuttaa useiden
bioaktiivisten yhdisteiden, kuten kromograniinien tai hormonien ylieritystä.2 Useimmiten
serotoniinin tuotanto on lisääntynyt NET potilailla ja sen metaboliatuote 5-hydroksyyliindoliasetaatti (5-HIAA) virtsasta määritettynä on yleisimmin käytetty merkkiaine NET
diagnosoinnissa
ja
seuraamisessa.
Virtsan
5-HIAA:n
HPLC-menetelmät
elektrokemiallisella tai flurometrisella detektiolla voivat kuitenkin olla alttiita häiritseville
yhdisteille, kuten lääkeaineille tai toisille metaboliiteille. Vuorokausivirtsan keräys on myös
haastavaa sekä altista virheille.3 Näiden syiden vuoksi, kehitimme ja validoimme
suoraviivaisen LC-MS/MS-menetelmän seerumin 5-HIAA:n mittaukseen.
Materiaalit ja metodit: Käytimme tässä työssä seeruminäytteitä, jotka oli kerätty terveiltä
vapaaehtoisilta (n=136), sekä potilailta, joilla epäiltiin tai oli todettu NET (n=129).
Näytteisiin lisättiin leimattu 5-HIAA-D2 sisäiseksi standardiksi, ne esipuhdistettiin
kiinteäfaasiuutolla ja kvantitoitiin massaspektrometrialla. Tutkimme myös säilytyksen,
näytteenottoputken, kellonajan ja aamupalan vaikutusta seerumin 5-HIAA pitoisuuteen.
Lisäksi määritimme viitearvot seerumin 5-HIAA:lle ja vertasimme kehitettyä LC-MS/MS
menetelmää virtsan HPLC- sekä plasman immunometriseen kromograniini A (CgA) menetelmään.
Tulokset: Kehittämämme LC-MS/MS-menetelmä on sensitiivinen (LOQ 5 nmol/L), ja
lisäksi sillä on laaja lineaarinen alue (5-10000 nmol/L), sekä lyhyt analyysiaika (7 min).
Seerumin 5-HIAA säilyy useita päiviä eri lämpötiloissa ja kestää ainakin viisi sulatuspakastus kertaa. Me emme löytäneet variaatiota seerumin 5-HIAA pitoisuuksissa päivän
sisällä (p≥ 0.20), eikä aamiaisella ollut vaikutusta seerumin 5-HIAA pitoisuuteen (p=0.89).
Ehdotamme 123 nmol/L viiteylärajaa seerumin 5-HIAA pitoisuudelle. ROC-analyysissä
käyrän alapuolinen pinta-ala (AUC) oli 0.83 virtsan 5-HIAA:lle, 0.81 seerumin 5-HIAA:lle ja
0.76 plasman CgA:lle.
Yhteenveto: Seerumin 5-HIAA:n massaspektrometrinen menetelmä erottaa hyvin terveet
henkilöt ja NET potilaat toisistaan, sekä soveltuu serotoniinia tuottavien
neuroendokriinisten kasvainten diagnosointiin ja seuraamiseen.
1
Modlin, I.M. and Sandor, A., Cancer 79, 2000, 813-829
Ramage J. et al. Gut 54, 2005, IV1-16
3
O’Toole D. et al. Neuroendocrinology 90, 2009, 194-202
2
25
Characterisation of a New Uniform-Field Ion Mobility Q-TOF Mass
Spectrometer and its application to Life Science Research
Anthony Sullivan, Agilent Technologies
anthony_sullivan@agilent.com
High resolution mass spectrometry is now established as the analytical cornerstone in
proteomics, metabolomics and other research applications requiring the analysis of highly
complex samples. In recent years, substantial interest has grown in the utilisation of fast,
orthogonal ion mobility-based techniques to provide added levels of separation. In
collaboration with several academic institutions, Agilent have introduced the first uniform
field ion mobility system, which enables the combined separation power of LC, IM and MS
techniques. This presentation will describe the technical details of the new 6560 IMS-QTOF instrument and show the instrument’s performance, with examples of proteomics,
metabolomics, sugars, lipids and the direct measurement of collisional cross-sectional
area.
26
The importance of sample preparation, pure reagents and
solvents for easy interpretable mass spectra and reproducible
analytical methods
Mikko Savin, Sigma Aldrich Finland
mikko.savin@sial.com
27
POSTERIESITYKSET
28
LC-MS/MS method development of an initial testing procedure for
prohibited substances in sport
Laura Harju,1 Tiia Kuuranne,1 Antti Leinonen,1 Reetta Uusalo,1
1
United Medix Laboratories Ltd., Doping Control Laboratory, Helsinki
laura.harju@medix.fi
Introduction. The use of performance enhancing substances is prohibited in sports by the
World Anti-Doping Agency (WADA). Doping analytics requires fast and reliable
examination of several hundred substances, and their metabolic products from a small
sample volume. The purpose of this work was to develop a simple and rapid liquid
chromatographic/tandem mass spectrometric (LC-MS/MS) screening method for doping
agents in human urine.
Materials and methods. A general screening method based on enzymatic hydrolysis of
conjugated substances followed by two stages of (pH 9.6 and 12) liquid-liquid extraction
(LLE) and LC-MS/MS identification was developed. In this method 63 different doping
agents, including anabolic agents, beta-2-agonists, hormone and metabolic modulators,
diuretics, stimulants, narcotics, cannabinoids, glucocorticosteroids and beta-blockers were
investigated. Chromatography was based on gradient elution on a rapid resolution C18
column and ionization of the analytes was achieved with electrospray ionization in positive
ion mode. The performance of the method was evaluated with regard to specificity,
analytical recovery, limit of detection and repeatability.
Results. The method was proven specific and sensitive. The minimum required
performance limit (MRPL), established by WADA, was attained to all 63 doping agents.
The extraction recoveries were higher than 80% for most of the analytes and above 25%
for certain more polar compounds. The average repeatability of ion ratios and retention
times was 2%. The developed method was proven applicable to the analysis of wide
selection of prohibited substances, and allows flexible method extensions which may arise
from the modifications of WADA prohibited list.
29
Rho-kinaasi-inhibiittori Y-27632 vähentää hypoksiaolosuhteissa
verisuonikasvutekijä α:n ilmentymistä fibroblastisoluissa
Juha Piltti 1, Markku Varjosalo 2, Chengjuan Qu 1, Jukka Häyrinen 1, ja Mikko J. Lammi 1
1
Itä-Suomen yliopisto, Biolääketieteen yksikkö, Kuopio
2
Helsingin yliopisto, Biotekniikan instituutti, Helsinki
E-mail: mikko.lammi@uef.fi
Johdanto. Rho-kinaasi-inhibiittori Y-27632 on lääketieteellisesti potentiaalinen molekyyli,
joka kykenee edistämään normaalia nivelruston ilmiasua ylläpitävien geenien
ilmentymistä1.
Tämän
ominaisuuden
yhdistäminen
potilailta
eristettyihin
ja
pluripotenttivaiheeseen muokattuihin kantasoluihin voisi mahdollistaa suoran kemiallisen
soluerilaistamisen pyrittäessä tuottamaan korjauskudosta vaurioituneeseen nivelrustoon.
Tässä tutkimuksessa on keskitytty lyhytkestoisen Rho-kinaasi-inhibiittori Y-27632:n
altistuksen indusoimien biologisten vasteiden selvittämiseen.
Materiaalit ja menetelmät. Fibroblastisolut (Human Foreskin Fibroblast, CRL-2429,
ATCC) on altistettu 10 µM:n Rho-kinaasi-inhibiittoripitoisuuksille sekä 20 %:n normaaliilmakehän olosuhteissa että rustokudoksessa vallitsevissa 5 %:n hypoksiaolosuhteissa.
Analytiikka perustuu proteiinimuutosten massaspektrometriseen seulontaan spectral
counting -tekniikalla, sekä visualisoiviin mikroskopointitekniikoihin automatisoitua
faasikontrastimikroskooppimonitorointia ja spesifisiä immunokemiallisia merkkiaineita
käyttäen. Koekäsittelyjen vaikutus fibroblastisolujen ilmiasuun on määritetty kvantitatiivista
RT-PCR-analytiikkaa käyttäen.
Tulokset. Rho-kinaasi-inhibiittori Y-27632 vaikuttaa dynaamisesti aktiinifilamenttien
muodostumiseen ja purkautumiseen ensimmäisen kolmen vuorokauden aikana Rhokinaasi-inhibiittorialtistuksen aloittamisesta. Enimmillään keskimääräinen aktiinifilamenttien
pituus solua kohden on nelinkertainen käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen välillä.
Rho-kinaasi-inhibiittori
kiihdyttää
myös
solujen
jakaantumista
ensimmäisen
käsittelyvuorokauden aikana, mutta solumäärät tasaantuvat seuraavien kahden
vuorokauden aikana. Immunokemiallisten merkkiaineiden avulla on havaittu solujen
tarttumiseen vaikuttavien, vinkuliinivälitteisten kiinnittymispesäkkeiden muodostumisen
vähenevän Rho-kinaasi-inhibiittorikäsittelyjen vaikutuksesta. Kvantitatiivisten proteiiniseulontojen perusteella vinkuliini-proteiinin määrä ei soluissa muutu, vaan kyseessä on
proteiinin solunsisäiseen jakautumiseen liittyvä muutos. Tutkittujen fibroblastisolujen
ilmiasussa ei havaittu muutoksia huolimatta koejärjestelyjen pidentämisestä kolmesta
vuorokaudesta 28 vuorokauteen. Pitkän altistusjakson yhteydessä havaittiin Rho-kinaasiinhibiittorin vähentävän verisuonikasvutekijä α:n ilmentymistä hypoksiaolosuhteissa, mutta
ei normaali-ilmakehän olosuhteissa. Mikäli havainto on vahvistettavissa proteiinitasolla
myös transformoidulla solulinjalla, se voi mahdollistaa uuden lähtökohdan rajoittaa
hypoksian indusoimaa angiogeneesiä syöpäsoluissa.
1
Matsumoto, E ym. Biochem Biophys Res Commun. 420, 2012, 124-129.
30