KOTITEHTÄVÄ 1 Biokemian menetelmät I syksy 2015

KOTITEHTÄVÄ 1
Biokemian menetelmät I syksy 2015
Opiskelijanumero:
Kotitehtäviä saa miettiä ryhminä, mutta jokainen opiskelija palauttaa oman itsenäisesti käsin
kirjoitetun vastauksen tehtäviin. Kotitehtävästä voi saada yhden pisteen kurssin arvostelua
laskettaessa. Jotta opiskelija saa pisteen kotitehtävästä, vastausten tulee olla vähintään arvosanan
3 oppimisen tasoa (ks. Kurssin yleinen info). Kotitehtävä tulee palauttaa luennolla tai ”Biokemian
menetelmät I –kotitehtävät” -palautuslaatikkoon, joka on toimiston KE1132 (Opintokadulta
keltainen opaste ”Biokemian ja molekyylilääketieteen tiedekunta”) edessä olevassa hyllykössä,
viimeistään Ke 16.9.15 klo 10.00 mennessä. Arvostellut kotitehtävät palautetaan opiskelijoille ja
luennolla annetaan yleistä palautetta kotitehtävistä. Mallivastaukset julkaistaan kurssin Noppasivuilla. Myöhästyneitä kotitehtäviä ei oteta arvosteltavaksi.
1. Nimeä kuvaan nuolien osoittamat reitit/tavat, joiden kautta haitalliset aineet voivat päästä
elimistöön.
-Hengityksen kautta
-Suun/ruoansulatuskanavan kautta
-Paljaan ihon kautta
-Roiske ohuessa vaatteessa → imeytyminen ihon kautta huomaamatta
(tämän oli vain muutama hoksannut)
2.
Tutustu
kemikaalien
käyttöturvallisuustiedotteisiin
esim.
osoitteessa
http://www.sigmaaldrich.com/finland.html (tuotenimi hakukenttään, usein löytyy monta tuotenimikettä, klikkaa
MSDS, jolloin käyttöturvallisuustiedote avautuu)
A. Miten työskentelet fenolin kanssa?
- Myrkyllistä ja voi aiheuttaa vakavia terveyshaittoja.
- Suojauduttava työskentelemällä vetokaapissa ja käyttämällä suojalaseja, nitriilihansikkaita ja
työtakkia.
- Roiskeet pestävä aina runsaalla vedellä ja iholta saippuan kanssa, käytävä lääkärissä, jos
vahinkoja sattuu.
- Jätteet ongelmajätteisiin.
Yleisesti ottaen perusteellisesti vastattu, monikaan ei kertonut mitä pitää tehdä jos fenolia joutuu
iholle
B. Valitse kotoasi jokin kemikaali tai sen ainesosa (esim. puhdistusaine, kosmetiikkatuote), jonka
käyttöturvallisuustiedotteeseen perehdyt. Mihin kemikaaliin tutustuit ja mitä sait selville?
mm. seuraaviin aineisiin/ainesosiin olitte tutustuneet: astianpesuaineet (fairy, natriumkarbonaatti),
viemärinavaaja (NaOH, rikkihappo [huh, minulle uusi tieto], pyykinpesuaine, sähköisyyden
poistaja,
kynsilakan
poistoaine
(asetoni),
klorin
puhdistusaine,
octyldodecanol,
propylleeniglykoli, titaanidioksidi, vetyperoksidi, kuivashampoo (butaani), desinfiointiaine,
natriumhypokloriitti,
shampoita
(cocotrimonium
methosufaatti),
isopropanoli,
methylisothiazolinone. Joissain vastauksissa pohdittiin kriittisesti aineiden annostusta/ pääsyä
ympäristöön.
3. Sinulla on plasmidi-DNA:n eristystä varten 200 ml bakteerikasvustoa, josta työohjeen
mukaan pitää kerätä bakteerisolut sentrifugoimalla 4000 x g 20 min +4C:ssa. Mihin
kerääminen perustuu ja mitä välineitä/laitteita tarvitset? (Millaisen roottorin, sentrifugin ja
putket valitset? Mitä kierrosnopeutta käytät ?, Tehtävässä tarvitaan myös luennon 2 sivu 10
taulukkoa.) Miten huolehdit jätteistä?
-
-
-
-
Bakteerien kerääminen sentrifugoimalla perustuu sedimentaatioon. Bakteerit ovat
kasvatusliuosta painavampia, joten kertyvät pelletiksi putken seinämälle jo melko alhaisella
sentrifugaalivoimalla.
Kätevintä käyttää lattiasentrifugia, jolloin kasvuston saa yhteen GSA-pulloon. Kasvuston voi
myös jakaa 50 ml eriin SS-34 putkiin (lattiasentrifugi) tai 50 ml falcon-putkiin
(pöytäsentrifugi), mutta varsinaista plasmidin eristystä varten sakka olisi hyvä olla yhdessä
putkessa.
Lattiasentrifugi kannattaa varata ja laittaa jäähtymään hyvissä ajoin.
Näyteputkelle pitää aina olla samanpainoinen vastaputki, erityisesti GSA- ja SS-34-roottoriin
vaa’alla punnittu.
g-arvo pitää muuttaa rpm-arvoksi eli GSA:lla 4000 x g on 5000 rpm (ks. Muuntotaulukko)
Roottori otetaan kylmästä ja laitetaan sentrifugiin, näyte ja vastaputki vastakkain roottoriin.
Säädetään sentrifugiin oikeat olosuhteet, käynnistetään ja odotetaan, että sentrifugointi
alkaa normaalista.
Sentrifugoinnin jälkeen nostetaan putket roottorista ja huomioidaan, missä kohtaa haluttu
bakteeripelletti on.
Jos sentrifugia ei käytä enää, roottori kylmään nurinpäin käännettynä ja sentrifugista virta
pois. Jos roottori on likaantunut, pesu saippualla ja kuivaus.
-
Supernatantin (bakteerien kasvatusliuos) voi kaataa pullosta pois, kun sakka on pullon
yläosassa. Supernatantti on biologista jätettä, joka pitää käsitellä kloriitilla, voimakkaalla
detergentillä tai autoklavoida, koska se sisältää geenimuunneltua mikro-organismia.
yleisesti ottaen perusteellisesti ja oikein vastattu
4. Määritit spektrofotometrillä DNA-näytteelle (laimennettu 1:200) A260=0,125 ja A280=0,079. Mitä
sait selville?
-
Näillä tiedoilla voi määritää DNA-näytteen pitoisuuden ja puhtauden
laimentamattoman näytteen A260 = 200 x 0,125 = 25
jos A260 = 1 on pitoisuus 50 µg/ml
 kun A260 = 25 → pitoisuus 25 x 50 µg/ml = 1250 µg/ml = 1,25 mg/ml
Puhtaus on 0,125/0,079=1,58, joka on pienempi kuin 1,8 eli näytteessä on
todennäköisesti proteiinikontaminaatio. Tämä ei kuitenkaan yleensä ole este, etteikö DNA:ta
voisi käyttää esim. PCR:ssa templaattina.
joiltakin oli jäänyt DNA:n pitoisuus laskematta
5. Sinkin pitoisuutta liuoksessa määritettiin atomiabsorptiospektrometrialla. Määritystä varten
mitattiin standardien absorbanssit oheisen taulukon mukaisesti.
Zn pitoisuus µg/ml
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Absorbanssi
0,000
0,082
0,174
0,257
0,34
0,408
0,463
0,511
0,543
0,561
0,575
Piirrä standardikuvaaja ja määritä sen avulla sinkin pitoisuus
seuraavissa näytteissä:
a) laimentamaton näyte A= 0,157
b) 1:20 laimennos A= 0,304
c) 1:5 laimennos A=550
oheisen kuvaajan perusteella:
a) kuvaajalta luetaan pitoisuudeksi 1,9 µg/ml. koska näytettä ei ole laimennettu tämä on
todellinen pitoisuus.
b) kuvaajalta luetaan 3,6 µg/ml ja laimennos huomioiden todellinen pitoisuus on 20 x 3,6 µg/ml
= 72 µg/ml
c) tähän tuli painovirhe. A=550 menee yli asteikon joten sille ei voida määrittää pitoisuutta. Jos
oletetaan A=0,550, kuvaajalta luetaan laimennoksen pitoisuudeksi 8,4 µg/ml ja todelliseksi
pitoisuudeksi saadaan 5 x 8,4 µg/ml = 42 µg/ml. Koska ollaan ei-lineaarisella alueella,
tarkemman tuloksen saamiseksi c-kohdan näytteestä pitäisi mitata laimeampi näyte esim.
1:10-laimennos.
yleisiä huomoita standardipisteistä:
välillä 1-4 µg/ml pisteet ovat suoralla. Välillä 4-10 µg/ml pisteet alkavat kaareutua, jolloin sinkin pitoisuuden
kasvaessa vastaava absorbanssi ei kasva enää lineaarisesti. Tällöin mittaustarkkuus huononee.
→
kuvaaja kannattaa pirtää suoraksi välillä 1-4 µg/ml ja sen jälkeen ”kauniisti kaartuen” standardipisteiden 4-10 µg/ml
kautta.
Jos kuvaaja piirretään suoraksi välillä 1-10 µg/ml, osalla aluetta määritystarkkuus huononee: mitä kauempana suora
on pisteiden kautta kulkevasta kauniisti kaartuvasta käyrästä, sen epätarkempi saatava tulos on.
Standardikuvaajan piirtämisessä on olemassa erilaisia koulukuntia. Itse ( Jari Heikkinen) edustan sitä jonka mukaan
parhaiten todellisuuttta kuvaava tulos saadaan kun piirretään mitattujen standardien kautta mahdollisimman
hyvin kulkeva, tarvittaessa kauniisti kaartuva kuvaaja. Jos jokin standardipiste selvästi poikkeaa linjasta se voidaan
hylätä virheellisenä. Yleinen suositus on se, että kuvaajaa ei jatkettaisi uloimpien standardipisteiden ulkopuolelle
(ekstrapolointi). Tässä tapauksessa kuvaaja näyttäisi kulkevan origon kautta, joten todennäköisesti hieman alle 1
µg/ml mittausarvot olisivat vielä tarkkoja.
Tässä selvästi eniten päänvaivaa aiheutti laimennoksen huomioiminen (b-tehtävä).
näytettä laimennetaan siis sen takia että päästään sopivalle (lineaariselle ) mittausalueelle. Ellei näytteen pitoisuutta
osata arvioida etukäteen, voidaan tehdä erilaisia laimennoksia esim 5-kertaisin eroin ja mitataan ne ensiksi. Kun
sopiva laimennos on löydetty voidaan tällä alueella tehdä uusia määrityksiä ko. näytteelle
laimennokselle mitattu pitoisuus täytyy siis KERTOA (ei jakaa) laimennoskertoimella. esim jos näyte on laimennettu
1:10, laimennoskerroin on 10.
aika moni oli jakanut laimennoskertoimella ja suunnilleen yhtä moni oli jättänyt kertoimen huomioimatta
muutama oli määrittänyt standardisuoran avulla montako µg/ml sinkkiä vastaa tiettyä absorbanssilukemaa ja
kertonut luvun laskennallisella laimentamattoman liuoksen absorbanssilla. Niin kauan kun ollaan lineaarisella
alueella tämäkin toimii. Tosin lasku on hieman monimutkaisempi kuin mallivastauksessa.
c-kohdan painovirheen suurin osa oli huomannut ja todennut ihan oikein että arvo menee yli mittausalueen. Suuren
absorbanssilukeman perusteella pitoisuutta ei voi määrittää koska pitoisuuden ja absorbanssin suhde ei ole enää
lineaarinen.
Standardikuvaajan piirtämisessä tuli kaksi koulukuntaa esille :
noin puolet piirsi kauniisti kaartuvan kuvaajan ja toinen puoli suoran. Jokainen päättäköön tahollaan kuinka kuvaajan
piirtää. Tarkempaan tulokseen päästään kauniisti kartuvalla… (sanon minä). Palaamme asiaan parin luennon
päästä kun tarkastellaan molekyylipainojen/kokojen arviointia elektroforeesigeeleillä.