Professor Lone Gram

Forbedring af fødevaresikkerhed gennem
eliminering af patogene bakterier i
blandede biofilm
Lone Gram, Karen Kiesbye Dittmann og Virginie Oxaran
gram@bio.dtu.dk
Et projekt støttet af DSF/IF
Samarbejde med Brasilien/São Paulo
Faculty of Animal Science and Food Engineering, USP
Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeirão Preto, USP
Faculty of Pharmacy, Federal University of Goiás
Professor Elaine C.P. De Martinis
Professor Carlos Augusto Fernandes de Oliveira
Professor Carlos Humberto Corassin
Ass. Professor Virginia Alves
2
Baggrund, mål, work-in-progress
(Brasilianske) oste associeret med sygdom forårsaget af
Staphylococcus aureus og Listeria monocytogenes
Spørgsmål:
• De patogene bakterier koloniserer og persisterer i
produktions-anlægget ?
• De patogene bakterier er vanskelige at fjerne i ”blandede
biofilm” ?
3
4
5
Minas cheese
• Frisk ost; fra både rå og pasteuriseret mælk
• Kan modnes, kort/lang tid
6
Rå mælk
Minas cheese
Starterkultur,
Filtrering (pasteurisering)
Ostemasse (32°C, 50-70 min)
løbe,
CaCl2
Opskæring af ostemasse
Fjernelse af valle
Overføres til forme, dræning, saltning
Eventuel modning
Plastpakning
Kølelagring
7
Persistens ?
• Prøver af råvarer, miljøprøver, færdigvarer analyseres for
L. monocytogenes og S. aureus (og ”normal” mikrobiologi)
• Isolater sendes til DK
• Identificeres (fænotype, 16S rRNA gen)
• Sub-types (multilocus sequence typing, MLST)
8
Loci for MLST-typning
L. monocytogenes
abcZ (ABC transporter)
bglA (beta glucosidase)
cat (catalase)
dapE (succinyl diaminopimelate
desuccinylase)
dat (D-amino acid
aminotransferase)
ldh (L-lactate dehydrogenase)
lhkA (histidine kinase)
Inst. Pasteur MLST base
9
S. aureus
arc (Carbamate kinase)
aroE (Shikimate
dehydrogenase)
glpF (Glycerol kinase)
gmk (Guanylate kinase)
pta (Phosphate
acetyltransferase)
tpi (Triosephosphate isomerase)
yqiL (Acetyle coenzyme A
acetyltransferase)
MLST data base (mlst.net)
L. monocytogenes persistens
8-10 prøveindsamlinger: eet isolat
– ST2
Tidligere (2008-2009):
– 3 virksomheder
– 393 prøver
– 28 positive (to virksomheder)
– 85 isolater
10
L. monocytogenes MLST
Antal isolater
Pulsotype
ST
9
XXV, XXVI, XXVII,
XXVIII, XXIX
1
52
11
XIV, XV, XVII
XVIII
XIX, XX, XXI, XXII,
XXIII, XXIV
2
10
I, II, III, IV, XVI
3
8
VIII, IX, X, XI, XII, XIII
218
2
2
1
1
VI, VII
XXX
V
XXI
520
9
New
New
L. monocytogenes persistens
• Dominans af lineage 1 (ikke lineage 2)
• Sekvenstype 2 re-isoleres hyppigt (30-40% af isolater);
ofte i kølerum/gulv
• Inst. Pasteur MLST-base: ST2 er primært humane isolater
• PFGE giver bedre opløsning
• Sekvenstyper tillader sammenligning med andre
indsamlinger og sub-typninger
12
S. aureus persistens
• Første indsamling
– Eet isolat
– Sekvenstypet: ST398
– ST398 MSSA hos mennesker har fået MetR og TetR I
grise og er blevet MRSA [Price et al. 2012]
• Anden indsamling
– 64 isolater (43 sekvenstypet)
13
S. aureus persistens (43 stammer)
# S. aureus isolater
ST
30
1
3
1
1
4
3
1
126
97
5
30
188
?
Ingen nye isolater af ST398
Alle stammer antibiotika-resistens-testes
14
S. aureus ST1?
• ST1 tilhører clonal complex (CC) 1, der inkluderer
community-associated MRSA (CA-MRSA) også kaldet
USA400
• MRSA spa type t127, ST1 er først for nylig fundet hos
grise
• Muligvis ny MRSA-infektion hos mennesker
• Omtales ofte sammen med ST398
15
Kontrol af persistens
Forhindre kolonisering (bakterie-biofilm)
Fjernelse (rengøring / desinfektion)
• Er persistente stammer bedre til at danne biofilm?
• Er persistente stammer mere tolerante overfor rengøring /
desinfektion?
16
17
persisterende
V518a
4666
7418
7291
La22
4446
No40-1
4459
O57
6895
R479a
EGD
4239
LO28
H13-1
La111
N53-1
M103-1
Crystal violet (OD590)
L. monocytogenes biofilm
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
andre
Jensen et al. 2007 JFP
L. monocytogenes desinfektions-tolerance
5
b
b
4
b
b
b
b
b
b,d
b,c
b,d
c,d
3
a
a
2315
2
EGD
log10 reduction (cfu/ml)
b
1
4446
7291
7418
Scott A
LO28
Br22
3R1
N22-2
La22
V518a
N53-1
La111
0
Reduktion i celletal ved behandling med Incimaxx
18
Kastebjerg og Gram 2009 JAM
Biofilm/desinfektion afhænger af miljø
• Naturlig snavs (mælk, protein, fedt, salt) og mikrobiologi
Biofilmdannelse
hos fire jordbakterier i
monokultur eller
blandet kultur
Ren et al. 2015 ISME J
19
Isolering af ”microbial community”
BZ002 - Klebsiella sp
L. monocytogenes
BZ001
BZ003 - Escherichia coli
BZ004 - Comamonas sp
BZ006 - Acinetobacter sp
BZ008 - Macrococcus caseolytens
S. aureus
BZ007
BZ009 - Lactococcus lactis
BZ010 - Kurthia gibsonii
BZ011 - Acinetobacter sp
BZ013 - Aeromonas sp
S. aureus
BZ012
BZ014 - Lactococcus lactis
BZ017 - Candida tropicalis
BZ018 - Lactobacillus sp
20
Elimineres den patogene bakterie af andre?
1,2E+10
1E+10
8E+09
6E+09
4E+09
2E+09
0
21
Total
S. aureus
Mere biofilm i blanding (L.m.)
72H biofilm mass in microplate -Static, Cristal violet
Ratio Biofilm mass (CV OD595nm)/
Biomass (OD600nm)
1,8
1,6
1,4
1,2
L. monocytogenes
udgør 6-34% af
den blandede
biofilm
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
L. monocytogenes
22
Mixed community
(Foreløbige) konklusioner og planer
• L. monocytogenes kontaminering (i Minas osterier) er
reduceret markant
• Sekvens-typning af L. monocytogenes tillader
sammenligning på tværs, men PFGE giver bedre opløsning
• S. aureus isoleres hyppigt fra Minas osterier
• Muligvis hyppig forekomst af MRSA
23
(Foreløbige) konklusioner og planer
• ”Blandede bakteriebiofilm” er etableret
• Kvantificering af den patogene i blandede biofilm er en
udfordring (selektive plader el qPCR)
• Test af desinfektions-tolerance følger
• Undersøgelse af virulens-egenskaber efter dyrkning i
blandede biofilm følger
24