docKemian kevät `15 abstraktikirja
download 
Report Transcription
Kemian kevät `15 abstraktikirja
15 Kemia kartalle 21.4. - 23.4.2015 Kemia kartalle 21.4. - 23.4.2015 SISÄLLYSLUETTELO Esipuhe Johtajan jorinat Ohjelma Luonnonyhdistekemia Tutkimusryhmäesittely LuK-tutkielmien abstraktit FM-erikoistyötä käsittelevät minijulkaisut FT-vaiheen etenemisraportit Laitekeskuksen FT-vaiheen etenemisraportti Bio-orgaaninen kemia Tutkimusryhmäesittely LuK-tutkielmien abstraktit FM-erikoistyötä käsittelevät minijulkaisut FT-vaiheen etenemisraportit Radiofarmaseuttisen kemian laboratorion FM-erikoistyötä käsittelevä minijulkaisu Radiofarmaseuttisen kemian laboratorion FT-vaiheen etenemisraportit Funktionaalinen materiaalikemia Tutkimusryhmäesittely FM-erikoistyötä käsittelevät minijulkaisut FT-vaiheen etenemisraportit Epäorgaaninen materiaalikemia Tutkimusryhmäesittely LuK-tutkielmien abstraktit FM-erikoistyötä käsittelevät minijulkaisut FT-vaiheen etenemisraportit 1 2 3 10 13 19 27 33 45 48 51 53 57 79 81 90 95 101 112 117 119 121 Kemian kevät 2015 – Esipuhe Arvoisat Kemian kevät 2015 –tapahtuman osanottajat ja tämän vihkosen lukijat, Yliopistomaailma on Suomessa jo tottunut siihen, että mikään muu ei ole pysyvää kuin muutos. Maailma ei tunnu koskaan tulevan valmiiksi, joten muutoksiahan siihen sitten pitää tehdä. Vaikka tähän jatkuvaan muutosprosessiin aletaan jo vähitellen väsyä, niin on se toisaalta nähtävä myös mahdollisuutena. Jos lasiin suhtautuu näin puoliksi täytenä, on meillä siis käsissämme jatkuva mahdollisuuksien sarja. Kemian laitoksen kohdalla tilanne on juuri näin ja näitä mahdollisuuksia pyritään kuvaamaan tämän vihkosen sivuilla. Sen vuoksi normaalien alkusanojen lisäksi olen lisännyt muutaman sivun tarinoita, joiden tarkoituksena on valottaa laitoksella jatkossa tapahtuvia muutoksia niin henkilökunnalle kuin opiskelijoille. Kaikkein pienimpänä muutoksena, joka on jo lisäksi toteutunut, voidaan pitää tämän vihkosen sisältöön tehtyä rakenteellista uudistusta. Tänä vuonna mukaan on otettu ensimmäistä kertaa myös väitöskirjaa valmistelevat jatko-opiskelijat ja näin vihkosta lukemalla on mahdollista muodostaa jo melko hyvä kokonaiskäsitys kemian laitoksella tehtävästä tutkimuksesta. Ensi vuonna jatkoopiskelijoita odottaa uusi uudistus, mutta ei siitä tässä vaiheessa sen enempää. Perinteisesti Kemian kevät –tapahtumassa päärooli on annettu opiskelijoille ja niin on tänäkin vuonna. LuK-vaiheen opiskelijat esittävät vihkosessa omaan tutkielmaansa liittyvän yhden sivun mittaisen lyhennelmän, joka on tarkoitettu esimerkiksi abstraktista, jonka avulla tutkijat hakevat pääsyä esimerkiksi kansainväliseen tiedekonferenssiin. Kun pääsy on taattu, kirjoittavat tutkijat konferenssista laadittavaan kirjaan esimerkiksi kaksisivuisen julkaisun, jonka formaattia FMopiskelijat taas ovat pyrkineet noudattamaan oman viisikuukautisen erikoistyön tuloksista kertovissa teksteissään. Jatko-opiskelijoilla tieteen kieli on yleisesti englanti ja tällä logiikalla he kertovat tämän vihkosen sivuilla oman nelivuotisen prosessinsa etenemisestä. Näin saadaan aikaan melko hyvä naamakirja kemian laitoksen tutkimusaktiviteetista kolmella eri tasolla etenevien opiskelijoiden silmin nähtynä. Itse Kemian kevät ’15 –tapahtuma avataan tänä vuonna FM-opiskelijoiden töiden lyhyillä muutaman minuutin trailer-tyylisillä esittelyillä, jotta kaikilla laitoksen henkilö- ja opiskelijakuntaan kuuluvilla on mahdollisuus päättää kenen esityksen he haluavat kuulla keskiviikkona tai torstaina kokonaisuudessaan, jos aivan kaikkia esityksiä ei jaksaisikaan käydä kuuntelemassa. Tiistaina järjestetään lisäksi posterisessio I ja sen perään Varsinais-Suomen alueen opoilla on mahdollisuus saada lisätietoa yliopisto-opinnoista ja yliopistoon hakemisesta. Keskiviikkona ja torstaina käydään läpi perinteiset opiskelijaesitelmät. LuK-vaiheessa olevat opiskelijat ovat valmistelleet tutkielmastaan tieteellisen esitelmän ja saavat näin ensimmäisen kosketuspinnan siitä, millaista on esiintyä kansallisissa konferensseissa. FM-opiskelijat ovat tässä suhteessa jo jossain määrin konkareita, joskin he saavat nyt ensi kertaa esittää omia tutkimustuloksiaan isommalle yleisölle, niin posterein kuin esitelmin. Kuulijakunnalla on velvollisuus paitsi esittää jokaiselle esiintyjälle asiaan kuuluvia kysymyksiä, niin myös seurata esityksiä siinä määrin tarkkaavaisesti, että voivat ottaa osaa leffalippuja palkintona jakavaan kisaan. Tapahtuman päättää torstaina iltajuhla, josta saamme kiittää tapahtumaa sponsoroineita yrityksiä ja muita kemiasta kiinnostuneita tahoja, tietenkään laitoksen omaa vapaaehtoistyövoimaa unohtamatta. Lopuksi haluan toivottaa lämpimät etukäteisonnittelut kaikille tapahtumaan osallistuville kemian opiskelijoille. Iltajuhla on teitä varten ja olette juhlanne ansainneet! Turku, 4.4.2015 2 Kemian kevät 2015 – Johtajan jorinat Johtajan jorinat Yksi kemian kevät –vihkosen uudistuksia on käyttää tätä kerran vuodessa julkaistavaa opusta tiedonjakokanavana niin opiskelijoiden, henkilökunnan kuin muiden kemian laitoksen asioista kiinnostuneiden tahojen suuntaan. Nyky-yliopiston johtamismalli on sikäli yksinkertainen, että rehtori johtaa yliopistoa, dekaaanit johtaa tiedekuntia ja laitosjohtajat johtaa laitoksia. Tämä kaikki voidaan tehdä hyvässä yhteisymmärryksessä eri henkilöstö- ja sidosryhmien kanssa, mutta yhteisymmärryksen puutteessa laitosjohtajalla on laitoksen asioista aina ylin päätäntävalta ja se voidaan kokea ongelmana verrattuna aiempaan tapaan, jossa kaikkia henkilöstöryhmiä edustanut laitosneuvosto päätti asioista yhdessä. Kemian laitoksella ei onneksi ole ollut juuri lainkaan merkittäviä erimielisyyksiä suurista linjoista, mutta siitä huolimatta on tarpeellista jakaa aika ajoin informaatiota tehdyistä päätöksistä ja tulevaisuuden suunnitelmista, sikäli kun niitä on mahdollista etukäteen julkistaa. Kemian laitos elää tällä hetkellä ehkä historiansa suurimman mahdollisuuden aikaa ja tämä mahdollisuus pitää nyt käyttää hyväksi oikealla tavalla. Olemme mukana monessa kansallisesti ja kansainvälisesti merkittävässä hankkeessa ja sen lisäksi olemme täyttämässä laitokselle viittä pysyväisluonteista tehtävää, joista kolme on professuuria ja kaksi yliopistonlehtorin tehtäviä. Näissä rekrytoinneissa ei ole mahdollisuutta epäonnistua, vaan ne pitää hoitaa niin, että laitoksessa kasvaa dynaamisuus ja tekemisen sekä eteenpäin menemisen meininki. Kaikkien pitää ymmärtää se, että jokaisen rekrytoinnin tavoitteena on vain ja ainoastaan koko laitoksen edun tavoittelu. On epätodennäköistä, että eteemme tulee nopeasti – tai koskaan – samankaltaista mahdollisuutta, jossa voimme kehittää laitoksen toimintaa viiden merkittävän rekrytoinnin myötä. Samaan aikaan on mahdollista, että lisäämme laitoksen dynaamisuutta ottamalla tiloihimme lääketieteelliseen kemiaan keskittyvän professorivetoisen tutkimusryhmän. Toteutuessaan tämä olisi osa kansallisesti merkittävänä nähtävää Lääkekehitys ja diagnostiikka –hanketta, johon myös kemian laitos on sitoutunut omia rekrytointeja suunnitellessaan. Aika näyttää miten tässä kaikessa onnistutaan ja kuinka merkittävään nousuun laitos saadaan näiden uusien avausten myötä. Kemian laitos ei ole vielä niin moderni, että olisi avannut verkkomaailmaan omia blogejaan tai muuta tällaista nyky-yhteiskunnan hektisen kommunikoinnin kanavaa. Sen sijaan tähän vihkoseen avataan nyt Johtajan jorinat –kanava, joka toivottavasti parantaa tiedonkulkua ja –jakoa tässä tilanteessa, jossa muutos saattaa näyttää ainoalta pysyvältä elementiltä. Muutosvastarinnan sijaan tilanteeseen pitää pystyä suhtautumaan positiivisesti, koska tavoiteltujen muutostenkin jälkeen kemian laitoksella tehtävä tutkimus on edelleen tutkijoiden ja tutkimusryhmien omissa käsissä, ja innovatiivisuudelta ja perustutkimuksen kaltaiselta tärkeältä toiminnalta ei olla leikkaamassa siipiä pois. Kemian laitos on tulevaisuudessakin paikka, jossa tutkijalla on mahdollisuus luoda uusia avauksia, mutta niille avauksille ollaan nyt luomassa tietyt puitteet, joiden raameissa pitäisi pysyä. Ne ajat ovat ohi, jolloin jokainen sai tutkia täysin vapaasti yksin omassa kopissaan mitä halusi ja laitos antoi siihen rahat. Näin pienellä laitoksella ei ole jatkossa varaa tällaiseen toimintaan ja tämän vuoksi halusinkin esittää jokaiselle väitöskirjatyöntekijällemme kysymyksen, mikä hänen tutkimuksessaan on merkittävää oman tutkimusryhmän kannalta. Kun tähän kysymykseen saadaan monia hyviä vastauksia ja jokainen tutkimusryhmä onnistuu hankkimaan laitoksen profilointia tukevaa merkittävää ulkopuolista rahoitusta, niin olemme osa oikeaan, positiiviseen suuntaan vyöryvää kokonaisuutta. Seuraavilla sivuilla tulee lisää jorinaa aiheista: x Kemia kartalle – mitä ihmettä? x Mitä opiskelijan tulisi tietää kemian laitoksen rakenteesta? x Laitoksen laiteinfrastruktuuri uudistuu – juuri ajoissa? x Muutoksen tuulet puhaltaa – mutta myötä- vai vastatuuleen? 3 Kemian kevät 2015 – Johtajan jorinat Kemia kartalle – mitä ihmettä? Tämänvuotisen kemian kevät –tapahtuman teemana on kemia kartalle. Tällä viitataan Suomen yliopistoissa kemian ja kemiantekniikan koulutusta antavien yksiköiden yhteishankkeeseen Kemia Suomi, jonka tavoitteena on saada kemia paremmin kartalle noin yleisestikin ottaen, mutta erityisesti tällä tarkoitetaan kemian saattamista niin sanotulle kansalliselle tiekartalle, jota kautta eri tieteenalat voivat saada käyttöönsä merkittäviä infrastruktuurimäärärahoja. Hankkeen aikana yhdeksän eri yliopiston kemian laitosjohtajat ja muut edustajat ovat istuneet yhteisen pöydän ääressä lukuisia kertoja ja saaneet aikaan tarkan kuvan tällä hetkellä Suomessa tehtävästä kemian ja kemiantekniikan tutkimuksesta. Kunkin laitoksen listattua tärkeimmät tutkimushankkeensa voitiin todeta yliopistoissa tehtävän kemian tutkimuksen olevan hyvin temaattista ja keskittyneen etsimään vastauksia ihmiskunnan suuriin haasteisiin: energia, ruoka, puhdas vesi, terveys ja hyvinvointi, ympäristö, ja raaka-aineiden riittävyys. Tutkimus jakautuu neljään pääteemaan kaavion 1 mukaisesti: (1) ihmisen ja hyvinvoinnin kemia, (2) kestävä kemia, (3) energian tuotantoon ja varastointiin liittyvä kemia, ja (4) materiaalikemia. Kemian ja kemian tekniikan tutkimus Suomessa Ihmisen ja hyvinvoinnin kemia Kestävä kemia UTU: Bio-orgaanisen kemian tutkimusryhmä UTU: Luonnonyhdistekemian tutkimusryhmä Energian tuotantoon ja varastointiin liittyvä kemia Materiaalikemia UTU: Toiminnallisten materiaalien tutkimusryhmä UTU: Epäorgaanisen materiaalikemian tutkimusryhmä Kaavio 1. Kemian ja kemian tekniikan tutkimuksen neljä pääteemaa Suomessa ja niitä pääosin toteuttavat tutkimusryhmät Turun yliopiston kemian laitoksessa. Pääteema-alueet ovat niin laajoja, että niiden alle mahtuu huomattavan suuri kirjo erilaisia tutkimuskokonaisuuksia. Kemian yksiköiden tavoitteena onkin selventää eri yliopistojen työnjakoa niin, että suorilta päälekkäisyyksiltä vältyttäisiin. Tässä yhteydessä jokaisen yksikön pitää pystyä selkeästi osoittamaan, miten se on omalta osaltaan profiloitunut Suomen kemian tutkimuksen kentässä. Kaiken kaaviossa 1 kuvatun kemian tutkimuksen perustana ja yhdistävänä tekijänä ovat kemialliset menetelmät ja niihin liittyvä infrastruktuuri: synteettinen kemia, analytiikka, spektroskopia, laskennallinen kemia, materiaalien karakterisointi. Nämä ovat siis tutkimukselle välttämättömiä komponentteja, joiden pitää olla kunnossa jokaisessa varteenotettavassa kemian laitoksessa, mutta niitä ei sinällään lasketa mukaan neljään tutkimukselliseen pääteemaan, koska ne ovat taustavaikuttajina mukana kaikissa teemoissa. Turun yliopiston kemian laitoksen profilointityö aloitettiin jo noin kymmenen vuotta sitten, kun laitosrakenne muutettiin nykyiseen kahden laboratorion malliin: orgaanisen kemian ja kemiallisen 4 Kemian kevät 2015 – Johtajan jorinat biologian laboratorio ottaa tällä hetkellä osaa teemoihin ihmisen ja hyvinvoinnin kemia sekä kestävä kemia, ja materiaalikemian ja kemiallisen analyysin laboratorio teemaan materiaalikemia. Näistä ensin mainittu laboratorio on tutkimuslinjoiltaan Suomen mittakaavassa täysin ainutlaatuinen vahvoine bio-orgaanisen kemian ja luonnonyhdistekemian aloineen, joita yhdistää vahvasti yleisteema kemiallinen biologia. Jälkimmäistä laboratoriota taas yhdistää vahvasti yleisteema materiaalikemia, jonka profiloinnin haasteena on se, että materiaalikemia nähdään vahvana tieteenalana lähes kaikissa Suomen yliopistoissa. Turussa profilointi on kohdistunut elektroaktiivisiin materiaaleihin, loisteaineisiin ja aurinkoenergian keräykseen liittyviin sovelluksiin. Edellä mainittujen tutkimuslinjojen eteenpäin vieminen ja jatkoprofilointi Turun yliopiston kemian laitoksessa vaatii pitkäjänteisyyttä ja jokaisen työntekijän sitoutumista yhteisiin tavoitteisiin. Lisäksi kemian parempi kartalle saaminen vaatii tutkijoiden ajoittaisia esiintuloja, tarkoittaen aktiivisempaa kemian tieteellistä viestintää. Kemianteollisuus on tällä hetkellä Suomen tärkein vientiala ja kemian tuotteiden osuus Suomen koko viennistä on noin neljännes. Kun samaan aikaa kemian laitoksella tehtävä tutkimus on korkealaatuista ja kansainvälisesti arvostettua, ei ole mitään syytä pitää kynttilää vakan alla. Onneksi laitoksen jokaisesta tutkimusryhmästä on viimeksi kuluneen kahden vuoden aikana noussut esiin tutkijoita, jotka ovat tämän oivaltaneet. Tätä suuntausta pitää jatkaa, ellei parempana suuntauksena sitten pidetä hiljaiseloa ja vähittäistä näivettymistä. Jokainen tutkija ja tutkimusryhmä ratkaisee omalla kohdallaan mihin suuntaan haluaa pyöränsä pyörivän. Mitä opiskelijan tulisi tietää kemian laitoksen rakenteesta? Edellisessä kappaleessa (Kemia kartalle – mitä ihmettä?) kuvatun kansallisen profiloinnin lisäksi, kemian laitoksen tutkimuksen ja opetuksen profilointi on tärkeää opiskelijan kannalta katsottuna. Mitä selkeämpänä laitoksen rakenne ja profiili pidetään, sitä helmompaa myös opiskelijan on hahmottaa, miten hänen kannattaa kemian opinnoissaan suuntautua. Menneinä vuosina edes kaikki opiskelijatuutorit eivät ole aina hahmottaneet, mikä kemian laboratoriojaossa on oleellista tai mitä ovat ne tiedot ja taidot, joita kussakin laboratoriossa opiskelijoille voidaan opettaa. Tämä on tietty valitettavaa, mutta toivottavasti historiaa, kun jo kahden vuoden ajan ensimmäisen vuoden opiskelijoille on esitelty eri tutkimusryhmien toimintaa ja tätä kautta ryhmillä on ollut mahdollisuus jakaa totuudenmukaista informaatiota eteenpäin. Toivottavasti tilanne jatkuu tämänkaltaisena ja selkeytyy mahdollisuuksien mukaan edelleen. Tätä prosessia helpottamaan on tähän vihkoseen lisätty esittelyt kustakin tutkimusryhmästä ja edelleen niiden perään näissä ryhmissä työskentelevien LuK-, FM- ja FT-vaiheen opiskelijoiden abstraktit tai minijulkaisut. Kemian laitoksessa toimii tällä hetkellä kaavion 2 mukaisesti kaksi tutkimuslaboratoriota, joissa molemmissa on kaksi tutkimusryhmää. Kahden ensimmäisen opiskeluvuoden aikana opiskelija tutustuu näitä laboratorioita ja tutkimusryhmiä paremmin opetuslaboratorioon, joka myös on osa kemian laitosta. Siinä missä opetuslaboratoriossa vietetty aika saa opiskelijan orientoitumaan kemiassa niin oleelliseen laboratoriotyöskentelyyn, niin opintojen jatkon kannalta kaavion 2 vihreät ja kellertävät laatikot ovat niitä vielä ratkaisevampia. Nämä valinnat muodostavat sen polun, jonka varrelta opiskelija imee itseensä sen ekspertiisin, jonka turvin hän hakee itselleen työ- tai jatkoopintopaikkaa kemistiksi valmistuttuaan. 5 Kemian kevät 2015 – Johtajan jorinat Kemian laitos Orgaanisen kemian ja kemiallisen biologian laboratorio Bio-orgaanisen kemian tutkimusryhmä Materiaalikemian ja kemiallisen analyysin laboratorio Luonnonyhdistekemian tutkimusryhmä Toiminnallisten materiaalien tutkimusryhmä Epäorgaanisen materiaalikemian tutkimusryhmä Kaavio 2. Kemian laitoksen tämänhetkinen laboratorio- ja tutkimusryhmärakenne. Osa orgaanisen kemian ja kemiallisen biologian opiskelijoista voi suuntautua myös radiokemian tutkimusryhmään, joka toimii PET-keskuksessa. Tämän lisäksi laitoksessa toimii kaikkia ryhmiä palveleva laitekeskus, jossa on jatkossa mahdollista tehdä laitoksen tutkimusprofiiliin sopivia erikoistöitä ja/tai väitöskirjoja. Kemistiksi tähtäävä opiskelija etenee kaksi ensimmäistä vuotta enemmän tai vähemmän putkimaista opintopolkua pitkin kaavion 2 punertavassa laatikossa, jossa ei juuri haaroittumismahdollisuuksia ole. Ainoa merkittävä poikkeus on kemian aineenopettajaksi tähtäävät, joilla toiseksi opetettavaksi aineeksi tulevasta alasta pitää opiskella 60 op kokonaisuus ja tämä on syytä aloittaa jo kahtena ensimmäisenä vuonna. Kolmantena opintovuonnaan kemian opiskelijan pitää pystyä päättämään, jatkaako opintojaan orgaanisen kemian ja kemiallisen biologian vai materiaalikemian ja kemiallisen analyysin laboratorion tarjoamilla vaihtoehtopoluilla. Myös opettajaksi suuntautuvat tekevät tämän päätöksen. Kolmannen vuoden syksyllä ensimmäisen periodin aineopintojen harjoitustyöt III noudattaa jo tätä joko/tai -valintaa ja valinta täsmentyy edelleen kolmannen vuoden toiseen periodiin mennessä, kun opiskelija ilmoittautuu LuK-harjoitustyöhön; opettajalinjalaisilla LuK-työ on lyhyempi kuin kemistiksi tähtäävillä. Tätä valintaa tehdessä on jo syytä paneutua siihen, mikä on opiskelijan mielestä se oikea polku kohti FM-tutkintoa ja kuka on tätä polkua jatkossa ohjaava vastuuprofessori. Tätä valintaa selkeyttääkseni olen koonnut seuraaville sivuille lyhyesti laitoksen kahden laboratorion nykytilanteen ja kuvauksen niiden tulevaisuuden suunnitelmista, sikäli kun olen niistä tietoinen. On kuitenkin tarpeen lisäksi huomioida, että parhaan kuvan kulloisestakin tilanteesta saa aina henkilökohtaisen kontaktin kautta ja jos asioissa on epäselvyyksiä, ei mikään ole järkevämpää kuin astella potentiaalisen vastuuprofessorin pakeille ja selvittää asiat sitä kautta. Jos tähän rohkeus ei riitä, apua on tarjolla myös opettajatuutoreiden ja kemian laitoksen toimiston kautta. 6 Kemian kevät 2015 – Johtajan jorinat Orgaanisen kemian ja kemiallisen biologian laboratorio Laboratoriossa on kaksi vastuuprofessoria, joista kummallakin on oma tutkimusryhmänsä. Prof. Harri Lönnberg vetää Bio-orgaanisen kemian tutkimusryhmää ja prof. Juha-Pekka Salminen vetää Luonnonyhdistekemian tutkimusryhmää. Molemmat ryhmät keskittyvät tällä hetkellä erityisesti suurikokoisten molekyylien kemialliseen biologiaan. Opiskelijan kannalta tilanne on sikäli selkeä, että orgaanisesta synteesistä ja sen kehittämisestä kiinnostuneiden kannattaa valita jo LuK-vaiheessa prof. Lönnbergin ryhmä, kun taas orgaanisten yhdisteiden kemiallisesta analytiikasta ja sen kehittämisestä kiinnostuneiden kannattaa suuntautua LuK-vaiheessa prof. Salmisen ryhmään. Molemmat ryhmät toki tekevät paljon muutakin ja ryhmien nettisivut ja tämän vihkosen kautta avautuva tutkimusprofiili toivottavasti valottavat tätä asiaa edelleen. PET-keskuksessa toimii prof. Olof Solinin vetämä radiokemian tutkimusryhmä ja joillakin opiskelijoilla on mahdollisuus suuntautua myös sinne kehittämään radioaktiivisesti leimattujen lääkeaineiden synteesiä. Tässä mielessä radiokemian ryhmä on siis rinnakkaisvalinta prof. Lönnbergin ryhmän kanssa, koska molemmissa ryhmissä tutkimus etenee orgaanisten molekyylien synteesin kautta. Radiokemian maisteriopiskelijat ja väitöskirjatyöntekijät on tämän vuoksi listattu tässä vihkosessa bio-orgaanisen kemian tutkimusryhmän välittömään läheisyyteen, vaikka radiokemian tutkimusryhmä ei ole kemian laitoksen oma tutkimusryhmä, vaan toimii siis PETkeskuksessa. Laitoksen tiloissa toimiva Turun yliopiston ja Åbo Akademin yhteinen kemian laitekeskus – vetäjänään erikoistutkija Jari Sinkkonen – omaa myös resursseja maisteriopiskelijoiden ja väitöskirjatyöntekijöiden ohjaamiseen, vaikka se ei sen päätehtävä olekaan. Laitekeskus ei sinällään kuulu kumpaankaan laboratorioon, mutta massaspektrometrian ja NMR-spektroskopian kautta etenevä tutkimus linkittyy tiiviimmin orgaanisen kemian ja kemiallisen biologian laboratoriossa tehtävään tutkimukseen. Tätä tukee myös laitekeskuksen väitöskirjatyöntekijän linkittyminen epäsuorasti luonnonyhdistekemian tutkimusryhmään. Orgaanisen kemian ja kemiallisen biologian laboratoriossa on tapahtumassa isoja muutoksia lähiaikoina. Olisi ehkä väärin sanoa, että toimintaa ollaan kehittämässä, koska kansallisesti ja kansainvälisesti korkealle arvostettu professori Lönnberg on jäämässä eläkkeelle syksyllä 2016. Tosiasia kuitenkin on, että laboratorioon ollaan rekrytoimassa kahta uutta orgaanisen kemian professoria. Tämän lisäksi on mahdollista, että jatkossa laboratorion tiloihin sijoittuu vielä neljäskin professuuri, mutta jonka rahoitus ei tule kemian laitoksen kautta. Näillä muutoksilla pyritään vahvistamaan laboratorion kansallisesti vahvaa profiilia kemiallisen biologian tutkimuksessa sekä luomaan uusia edellytyksiä Turun alueelle vahvuusalueeksi pyrkivälle Lääkekehitys ja diagnostiikka –sektorille. Jos näkyvissä olevat muutokset viedään läpi onnistuneesti, on seurauksena se, että laboratoriossa voi jatkossa toimia jopa neljä tutkimusryhmää, mikä on varmasti omiaan kasvattamaaan laboratorion dynaamisuutta entisestään. Tällöin laboratorion profiiliksi voi hyvinkin täsmentyä kemiallinen biologia ja lääkekehitys, jota kaikki ryhmät tukisivat omalla toisiaan täydentävällä panoksellaan. 7 Kemian kevät 2015 – Johtajan jorinat Materiaalikemian ja kemiallisen analyysin laboratorio Laboratoriossa on tällä hetkellä kolme professoria ja kaksi tutkimusryhmää ja niistä molemmat ovat vahvasti profiloituneet materiaalikemialliseen tutkimukseen. Toiminnallisten materiaalien tutkimusryhmässä toimii prof. Carita Kvarnström, prof. Jukka Lukkari ja prof. Keijo Haapakka. Epäorgaanisen materiaalikemian ryhmää vetää tällä hetkellä yliopistonlehtorit Mika Lastusaari ja Ari Lehtonen. Laboratorion ryhmäjako on läpikäymässä muutoksia, ei vähiten sen vuoksi, että analyyttisen kemian luento-opetuksesta vastannut prof. Haapakka on jäämässä eläkkeelle vuoden 2016 alussa ja epäorgaaniseen kemiaan ollaan parhaillaan rekrytoimassa uutta professoria. Analyyttiseen kemiaan ei haeta uutta professoria, vaan opetus hoidetaan jatkossa yliopistonlehtorin tehtävän kautta. Näillä kahdella uudella tehtävällä pyritään kasvattamaan laboratorion dynaamisuutta etenkin tutkimuspuolella ja eläköitymisten ja rekrytointien jälkeen näemme millaiset tutkimusryhmät materiaalikemian ja kemiallisen analyysin laboratorioon muotoutuu. Odotettavissa on kolmen tutkimusryhmän hyvässä yhteistyössä toimiva kokonaisuus. Tällä hetkellä laboratoriossa toimii siis kaksi tutkimusryhmää ja LuK-vaiheeseen siirtymässä olevan opiskelijan pitäisi pystyä päättelemään mitä polkua pitkin oma FM-tutkinto kannattaa rakentaa ja kuka on tätä polkua ohjaava vastuuprofessori. Toiminnallisten materiaalien ryhmässä on tällä hetkellä tarjolla kaksi vaihtoehtoa, omalla tavallaan käytäntö vs. teoria. Prof. Carita Kvarnström on vastuussa sovelletusta materiaalikemiasta, jonka avulla pyritään löytämään käytännön ratkaisuja materiaalikemiallisiin ongelmiin. Prof. Jukka Lukkarin vastuulla on fysikaalinen materiaalikemia, joka lähestyy materiaalikemiaa askeleen tai pari teoreettisemmalta pohjalta. Epäorgaanisen materiaalikemian ryhmän jatkokuvioiden kannalta oleellista on, kuinka epäorgaanisen kemian professorin rekrytoinnissa tullaan onnistumaan. Molemmat materiaalikemian ryhmät toki tekevät paljon muutakin ja ryhmien nettisivut ja tämän vihkosen kautta avautuva tutkimusprofiili toivottavasti valottavat tätä asiaa edelleen. Laboratorion profiiliksi on joka tapauksessa muotoutunut hyvin vahvasti materiaalikemia, mutta profiilin täsmentymistä jouduttaneen odottamaan yli uusien rekrytointien. Laitoksen laiteinfrastruktuuri uudistuu – juuri ajoissa? Kemia on hyvin vahvasti laboratorio- ja laitevaltainen tieteenala ja ilman näitä kahta komponenttia on hyvin vaikeaa tehdä vakavasti otettavaa kemiallista tutkimusta. Laboratoriovaltaisuus aiheuttaa myös tavallaan ongelman infrastruktuuripuolella, koska iso osa käytettävissä olevista määrärahoista kuluu tilavuokriin. Toinen ”ongelma” on se, että suurin osa kemian laitekannasta on ns. keskikalliita investointeja (miljoona euroa tai sen alle), joita tarvitaan paikallisesti juuri siellä missä tutkimustakin tehdään. Näin ollen kemian laitosten on ollut hankalaa hankkia laitteita yhteistyössä ja sen vuoksi ala ei ole pärjännyt hyvin infrastruktuurihankinnoissa vielä kalliimpien laitteiden kansallisella tiekartalla. Tähän pyritään nyt saamaan muutos kemian laitosten kasvaneen yhteistyön seurauksena ja työn alla on ensimmäisen ison Kemia Suomi –hankkeen yhteiskäyttöön tulevan laitteen hakuprosessi. Turun seudulla on vahvuutena Turun yliopiston ja Åbo Akademin vuosia jatkunut kemian alan yhteistyö, jonka seurauksena tänä vuonna molemmat tahot investoivat vajaat miljoona euroa 8 Kemian kevät 2015 – Johtajan jorinat kumpikin kemian laitoksen NMR-laitekannan päivitykseen. Kun kemian laitos on samanaikaisesti tuplannut omat laiteinvestointinsa tilapäisesti – tavoitteena kasvu pienellä riskillä mieluummin kuin näivettyminen ilman riskiä – näyttää laitoksen tutkimusryhmien infrastruktuuri kotvan kuluttua siltä, että siitä ei tarvitse itkeä muutamaan vuoteen ainakaan kovin vuolaasti. Tämä on tärkeää niin tutkimuksellisesti kuin opiskelijoidenkin kannalta, jotta kaikille tahoille pystytään tarjoamaan ajanmukaiset ja modernit tutkimuslaitteet. Monella kemian alalla suurimmat tutkimukselliset innovaatiot ja avaukset syntyvät juuri uusien laitteiden avaamien mahdollisuuksien kautta. Enää ei siis tarvita muuta kuin jatkuvia uusia innovaatioita ja sitä kautta uutta tutkimusrahoitusta. Positiivinen pyörä olisi pidettävä pyörimässä oikeaan suuntaan ja nyt tätä palloa on helppo tarjota tutkijoille ja tutkimusryhmille. Kuka ottaa kopin, kuka juoksee kunnarin? Ei ole enää laitteista kiinni. Laitokseen rekrytoitavat professorit ja yliopistonlehtorit saavatkin käyttöönsä hyvän laitekannan, juuri oikeaan aikaan. Olettaen tietty, että laitehankinnoissa onnistutaan. Muutoksen tuulet puhaltavat – myötä- vai vastatuuleen? Jos jollakin tämän vihkosen lukijalla on ollut riittävästi kestävyyttä lukea johtajan jorinoita näin pitkälle asti, on hänelle ehkä käynyt selväksi, että lyhyen ajan sisään kemian laitos tulee käymään läpi ison joukon muutoksia. Yksi tiedossa ja julkistettavissa oleva muutos jäi vielä listaamatta ja se on opetuslaboratorion esimiehenä toimivan perusopetuksen yliopistonlehtorin paikan vakinaistaminen. Tämä tehtävä ei ole sen vähäpätöisempi kuin professorienkaan rekrytoinnit, sillä opetuslaboratorion toimintaan ollaan tekemässä mahdollisesti mittaviakin muutoksia, joilla voi olla merkitystä niin opiskelijoiden oppimistuloksiin kuin uusien motivoituneiden kemian opiskelijoiden saamiseen laitokselle. Lyhyellä aikavälillä näkyvin muutos on fysiikan laitoksen kanssa toteutettava Luonnontiedeluokan avaaminen opetuslaboratorioon: jatkossa luokka toimii mallilaboratoriona laitoksella vieraileville koululaisryhmille, joille ollaan myös valmistelemassa ns. mobiililaboratoriota. Mobiililabraan liittyvä ensimmäinen opettajalinjalaisen erikoistyö on juuri valmistumassa ja työn tuloksia tullaan testaamaan myöhemmin pilottihankkeessa alueen koulujen kanssa. Tämä on hyvä esimerkki siitä, millaisia uusia avauksia kemia tarvitsee omaa näkyvyyttään parantaakseen ja toisaalta palvellakseen paremmin lähialueen kemian opettajien mahdollista tarvetta saada näyttää omille opiskelijoilleen mitä on kemian tutkimus yliopistossa. Muutosta ei kannata tehdä pelkästään muutoksen vuoksi. Jos näin menetellään, niin tullaan noin 15‒20 vuoden välein uusimaan kertaalleen tai kahdesti tehdyt virheet: ainahan voidaan palata siihen mistä joskus lähdettiin ja sitten lähdetään taas kovalla rytinällä kohti uusia pettymyksiä. Eikö olisi paljon mukavampaa olla vaan tekemättä yhtään mitään? Toki, jos kuppi on jo valmiiksi puoliksi tyhjä ja pyörä pyörii jo entuudestaan väärään suuntaan ja töihin tullessakin on aina vastatuuli. Mutta jos nyt kuitenkin lähdetään siitä, että positiivisen ajattelun ja tieteellisesti korkealaatuisten henkilökohtaisten ratkaisujen kautta meidän jokaisen on mahdollista rakentaa kemian laitoksesta entistä dynaamisempi ja innostavampi työ- ja koulutuspaikka. Sillai kai. 9 Kemian kevät 2015 – Ohjelma Tiistai 21.4. 13.30–15.00 Tapahtuman avaus ja esimakua FM-erikoistöistä (Arc1) – Laitoksen johtaja Juha-Pekka Salminen – FM-erikoistyöntekijät: Laura Hauta, Annika Lehtimäki, Reetta Ylöstalo, Juho Jaakkola, Olli Moisio, Salla Lahdenpohja, Hannu Grönberg, Ilkka Palmunen, Timo Parviainen, Isabella Norrbo 15.00–16.00 Posterisessio I (Arc ala-aula) – FM-erikoistyöntekijät ja väitöskirjatyöntekijät 16.00-17.00 Kemian opinnot: mitä, miten, missä ja miksi (Arc1) – Varsinais-Suomen alueen opinto-ohjaajille suunnattu tilaisuus Keskiviikko 22.4. 9.00-10.15 Luonnonyhdistekemia I (Arc1) 9.00 Plenaariluento ”Kasvien puolustusyhdisteiden kemia: uusia menetelmiä ja käyttötarkoituksia bioaktiivisiksi osoitetuille yhdisteille ja yhdisteryhmille” – Prof. Juha-Pekka Salminen 9.30 LuK -esitelmä ”Antosyaanit ovat enemmän kuin karbokationeja” – Henna Koivikko 9.45 LuK -esitelmä ”Oligomeeristen ellagitanniinien rakenteellinen monimuotoisuus” – Juuso Laitila 10.00 LuK -esitelmä ”Antosyaanianalytiikkaan liittyvät ongelmat ja niiden ratkaisut” – Marianna Manninen 10.30-11.45 Luonnonyhdistekemia II (Arc1) 10.30 10.45 11.00 11.15 11.30 LuK -esitelmä ”2D-LC-ABTS-menetelmän käyttö fenolisten antioksidanttien analytiikassa” – Karoliina Mäkinen LuK -esitelmä ”Kapsaisinoidien erilaiset uuttomenetelmät” – Saara Nenonen LuK -esitelmä ”Granaattiomenan polyfenolien sormenjälkiprofilointi UHPLC-MSn - tekniikalla” – Marko Pakanen LuK -esitelmä ”Granaattiomenan ellagitanniinit sekä niiden mahdolliset syöpää estävät ominaisuudet” – Juha Pekkala LuK -esitelmä ”Hydrolysoituvien tanniinien vesiliukoisuus ja hydrofobiset vuorovaikutukset” – Heikki Saine 13.00-14.00 Luonnonyhdistekemia III (Arc1) 13.00 13.20 13.40 FM -esitelmä ”Hydrolysoituvat tanniinit- biosynteesipolulta spektri- ja menetelmäkirjastoksi” – Laura Hauta FM –esitelmä ”Proantosyanidiinien metabolia lampaissa: kvalitatiivinen ja kvantitatiivinen analyysi” – Annika Lehtimäki FM –esitelmä ”Tanniinien kemialliset ominaisuudet ja niiden mittausmenetelmiä” – Reetta Ylöstalo 14.00-15.00 Yritysmaailman puheenvuoro 14.00 14.30 Tero Parkatti (Bayer Oy): ”Bayer – Science For A Better Life” Ville Nieminen (Raisio Oyj): ”Prosessikemistin arkea” 15.00-16.00 Posterisessio II (Arc ala-aula) 10 Kemian kevät 2015 – Ohjelma Torstai 23.4. 9.00-10.00 Bio-orgaaninen kemia I (Arc1) 9.00 Plenaariluento ”Biomolekyylien kemiaa” – Prof. Harri Lönnberg 9.30 LuK -esitelmä ”Hiilidioksidin talteenotto ja hyötykäyttö” – Asmo Aro-Heinilä 9.45 LuK -esitelmä ”MikroRNA biologisen säätelyn ja havainnoinnin kohteena” – Antti Äärelä 10.15-11.15 Bio-orgaaninen kemia II + Radiokemia (Arc1) 10.15 10.35 10.55 FM -esitelmä ”UDP-riboosin ja UDP-fruktoosin pilkkoutuminen metabolisissa prosesseissa” – Juho Jaakkola FM -esitelmä ”DNA-pohjainen asymmetrinen hybridikatalyysi Diels-Alder –reaktiossa” – Olli Moisio FM -esitelmä ”Selectfluor-prekursorin valmistus ja [18F]selectfluorin radioanalyyttisten menetelmien kehitys” – Salla Lahdenpohja 12.30-14.00 Toiminnalliset materiaalit (Arc1) 12.30 13.00 13.20 13.40 Plenaariluento ”Funktionaalisia materiaaleja ja ohuita kalvoja : Molekyylien kemiallisten ja fysikaalisten ominaisuuksien käyttöä ihmisen parhaaksi …Eli mitä on materiaalikemia” – Prof. Jukka Lukkari FM –esitelmä ”Kerros-kerrokselta kootut ohutkalvot ja luminesoivat kalvosensorit” – Hannu Grönberg FM –esitelmä ”Sähköä johtavat komposiitit: kalsiumkarbonaatin päällystäminen johdepolymeereillä” – Ilkka Palmunen FM –esitelmä ”Hyvälaatuisten ohutkalvojen kasvatus grafeenioksidilla ja polyelektrolyyteillä ultraääninebulisaation avulla” – Timo Parviainen 14.15-15.35 Epäorgaaninen materiaalikemia (Arc1) 14.15 14.45 15.00 15.15 Plenaariluento ”Epäorgaanista materiaalikemiaa” – Dos. Mika Lastusaari LuK –esitelmä ”Siirtymämetalli-ionien komplekseja nelihampaisten aminobisfenoliligandien kanssa” – Ville Eskonen LuK -esitelmä ”Upkonvertoivat nanopartikkelit biologisessa kuvantamisessa” – Jaakko Oksa FM -esitelmä ”Rakenteen vaikutus sodaliitin tenebresenssiin ja luminesenssiin” – Isabella Norrbo 18.00-24.00 Iltajuhla (Arc aula) 11 Kemian kevät 2015 Luonnonyhdistekemian tutkimusryhmäesittely ja opiskelijoiden abstraktit 8 kpl LuK-tutkielmien abstrakteja 3 kpl FM-erikoistyötä käsitteleviä minijulkaisuja 6 kpl FT-vaiheen etenemisraportteja sekä Laitekeskuksesta 1 kpl FT-vaiheen etenemisraportteja 12 Kemian kevät 2015 – Tutkimusryhmät KASVIEN PUOLUSTUSYHDISTEIDEN KEMIA: UUSIA MENETELMIÄ JA KÄYTTÖTARKOITUKSIA BIOAKTIIVISIKSI OSOITETUILLLE YHDISTEILLE JA YHDISTERYHMILLE Prof. Juha-Pekka Salminen Luonnonyhdistekemian tutkimusryhmä, Orgaanisen kemian ja kemiallisen biologian laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto s-posti: j-p.salminen@utu.fi Luonnonyhdistekemian tutkimusryhmän (Natural Chemistry Research Group, naturalchemistry.utu.fi) aktiviteetti kohdistuu luonnonyhdisteiden, etenkin polyfenolien kemiaan. Tutkimuksemme avulla löydämme luonnosta uusia molekyylejä tai luomme entistä tehokkaampia menetelmiä, joiden avulla muidenkin tutkimusryhmien on mahdollista kvantitoida poikkeuksellisen hankalan rakenteen omaavia polyfenoleja tai määrittää niistä aiheutuvaa bioaktiivisuutta. Samalla opimme paremmin ymmärtämään miten erilaiset puolustusyhdisteet ovat jakautuneet kasvikunnassa ja mitkä ovat aktiivisuudeltaan parhaimmat kasviheimot, -suvut ja -lajit. Loppusovelluksina tutkimustoimintamme voi johtaa esimerkiksi sellaisten kasvilajien tai lajikkeiden jalostamiseen, joilla voidaan pyrkiä korvaamaan märehtijöiden synteettisiä loislääkkeitä ja samalla hillitä märehtijöiden tuottamia kasvihuonekaasupäästöjä. Kaikki tämä vaatii laajaa analyyttis-orgaanisten ja fysikaalis-orgaanisten analyysimenetelmien hallintaa. Tätä kautta opiskelijat paneutuvat myös kemistin työelämän kannalta relevantteihin menetelmiin, mistä on heille hyötyä myöhemmin työelämässä. Aktiivisten ja inaktiivisten molekyylien seulominen kasvikunnasta Kasvien puolustusyhdistekoostumus on täysin lajikohtainen, vaikka samoja yhdisteitä voi esiintyä useammassa eri lajissa. Yhden lajin yhdistekirjo kattaa kymmeniä tai satoja erilaisia luonnonyhdisteitä, jotta kyseinen laji olisi mahdollisimman hyvin varustautunut erilaisten puolustusmekanismien kautta monenlaisia kasvinsyöjiä ja taudinaiheuttajia vastaan. Esimerkiksi tietynlaiset tanniinirakenteet vaikuttavat hyönteistoukkiin hapettavaa stressiä aiheuttamalla, kun taas hieman erilaisen rakenteen omaavat tanniinit vaikuttavat hirviin ja peuroihin tanniinien proteiiniaffiniteetista aiheutuvan epämiellyttävän maun tai muunlaisen limakalvotuntemuksen kautta. Nämä samat molekyylit voivat toisaalta toimia ihmisellä rintasyöpää ehkäisevästi tai märehtijöillä loiskuormaa vähentävästi. Bioaktiivisuuden kannalta onkin tyypillistä, että yksi yhdiste voi olosuhteista riippuen olla aktiivinen joko usean tai vain yhden aktiivisuusmekanismin kautta. Jos tietynlaisen aktiivisuuden ja luonnonyhdisteiden rakenteiden välinen yhteys tunnetaan, on mahdollista selvittää missä kasvilajissa esiintyy suurin konsentraatio aktiivisiksi luokiteltavia molekyylejä. Luonnonyhdistekemian tutkimusryhmässä tutkitaan tällä hetkellä muun muassa (1) mikä polyfenolien rakenteessa aiheuttaa niiden pro-oksidanttiaktiivisuuden entsymaattisen hapettumisen tai auto-oksidaation kautta, (2) miten pro-oksidanttiaktiivisuutta omaavat molekyylit ovat jakaantuneet kasvikunnassa ja (3) miten aktiivisten molekyylien evoluutio on mahdollisesti edennyt kasvilajien evoluution mukana. Globaalisti kattavan kokonaiskuvan saavuttamiseksi tutkimuskohteiksi on valittu yli 2500 kasvilajia viideltä eri mantereelta. 13 Kemian kevät 2015 – Tutkimusryhmät 5e+5 Lupiini lähtötilanne 4e+5 3e+5 2e+5 1e+5 0 3.5 5e+5 Absorbanssi (au) Potentiaalisia pro-oksidantteja seulotaan kasvikunnasta ultrakorkean erotuskyvyn omaavan nestekromatografian, UVspektroskopian ja massaspektrometrian (UPLCDAD-MS/MS) avulla sekä tutkimalla eri kasvilajien polyfenolikoostumusta ennen hapetusreaktioita ja niiden jälkeen. Näin jokaisesta tutkitusta kasvilajista on mahdollista nimetä ne yksittäiset polyfenolimolekyylit, jotka ovat joko potentiaalisesti aktiivisia prooksidantteja tai vastaavasti täysin inaktiivisia. Kuva 1 näyttää miten lupiinin flavonoidiglykosidit ovat melko inaktiivisia korkeassa pH:ssa tapahtuvassa autooksidaatiossa, kun taas osa samoista yhdisteistä hapettuu tehokkaasti lupiinille spesifisten entsyymien vaikutuksesta. Toistaiseksi ei ole tietoa siitä, noudattaako aktiivisten ja inaktiivisten yhdisteiden jakauma kasvikunnassa kasviheimojen, –sukujen, ja –lajien evolutiivisia suhteita (kuva 2), mutta luonnonyhdistekemian tutkimustyö pyrkii tuomaan valoa myös tähän kysymykseen. Johanna Moilasen, Anu Tuomisen ja Jorma Kimin väitöskirjatyöt (s. 40, 44 ja 30) liittyvät tähän tutkimuskokonaisuuteen. 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 5.0 5.5 6.0 6.5 5.0 5.5 6.0 6.5 Lupiini pH10-hapetus 4e+5 3e+5 2e+5 1e+5 0 3.5 5e+5 4.0 4.5 Lupiini entsyymihapetus 4e+5 3e+5 2e+5 1e+5 0 3.5 4.0 4.5 Retentioaika (min) Kuva 1. Lupiinin flavonoidiglykosidien UPLC-sormenjälki ennen hapetusta, pH 10hapetuksen ja entsymaattisen hapetuksen jälkeen. Kasvitanniinien positiivisten ympäristövaikutusten mekanismien ymmärtäminen Kasvien tuottamia puolustusyhdisteitä on mahdollista hyödyntää monin tavoin. Yksi tavallisimmista käyttötarkoituksista on ihmisterveyden edistäminen, koska yli puolet länsimaissa nykyään käytetyistä lääkkeistä sisältää vähintään yhtenä vaikuttavana aineena – tai sen osana – kasveista alun perin eristettyä yhdistettä. Paljon harvemmin tullaan ajatelleeksi, että näitä samoja yhdisteitä voidaan hyödyntää myös kotieläinten, karjan ja edelleen ympäristön tilan kohentamiseksi. On selvää, että märehtijöiden avulla tuotettu eläinproteiini kuormittaa ympäristöä enemmän kuin esimerkiksi siipikarjan avulla tuotettu proteiini. Tässä märehtijäperäisessä ympäristökuormituksessa on kolme osa-aluetta, joihin voidaan vaikuttaa oikeilla, erityisesti kasvitanniineja sisältävillä rehuvalinnoilla: (1) Märehtimisprosessi tuottaa runsaasti metaanipäästöjä, jopa 140 kg lypsylehmää kohden vuodessa. (2) Märehtijät käyttävät kasviperäisen proteiinin tehottomasti hyödykseen, jolloin märehtimisestä karkaava typpi erittyy virtsaan ja voi muuttua luonnossa edelleen typpioksiduuliksi, joka on 200 kertaa hiilidioksidia tehokkaampi kasvihuonekaasu. (3) Märehtijöiden terveyden ja ruuantuotantokyvyn ylläpito vaatii synteettisten loislääkkeiden käyttöä, joita vastaan monille loisille on kehittymässä maailmanlaajuinen resistenssi. Tämä saattaa ensi vaiheessa kasvattaa lääkkeiden annoskokoa, jolloin synteettisten kemikaalien päästöt ympäristöön kasvavat samoin kuin lääkejäämien esiintymisen todennäköisyys ihmisravinnossa. 14 Kemian kevät 2015 – Tutkimusryhmät Kuva 2. Suomessa esiintyvien kasviheimojen fylogeneettiset suhteet, josta voidaan päätellä kuinka läheistä tai kaukaista sukua heimot ovat toisilleen. Heimon nimen perään on merkitty heimossa esiintyvien sukujen ja edelleen lajien arvioitu lukumäärä Suomessa. Luonnonyhdistekemian tutkimusryhmä selvittää parhaillaan, millaisten tanniinirakenteiden avulla olisi mahdollista kaikkein tehokkaimmin puuttua yllä kuvattuihin kolmeen epäkohtaan luontaisin keinoin. On todennäköistä, että jokaisen epäkohdan tehokas korjaaminen vaatii tanniini-proteiini – vuorovaikutusten yksityiskohtaista ymmärtämistä ja että eri ongelmien ratkaisuun vaaditaan erilaisen kemiallisen ominaisuuden omaavia tanniinirakenteita. Tämän vuoksi tutkimusongelmaa lähestytään neljän osa-alueen kautta. (1) Valitaan kasveista mahdollisimman laajan rakenteellisen kirjon omaavia ellagitanniinirakenteita ja puhdistetaan ne 10–150 mg skaalassa semipreparatiivisella LC-tekniikalla. (2) Selvitetään puhdistettujen molekyylien affiniteetti, sitoutumisen stoikiometria ja spesifisyys kahteen erilaiseen proteiiniin isotermisen titrauskalorimetrian avulla. (3) Mitataan puhdasaineiden kyky alentaa metanogeenibakteerien tuottamia metaanipäästöjä nautaeläinten pötsistä. (4) Selvitetään mikä tanniinien rakenteessa tehokkaimmin inaktivoi märehtijöiden loisten kolmea eri kehitysvaihetta. Alustavien tulosten perusteella vaikuttaa siltä, että tanniinien avulla on mahdollista alentaa märehtijöiden kasvihuonekaasupäästöjä ja loiskuormaa selvästi yli 50 %. Kun kasvitanniinien positiivisten ympäristövaikutusten mekanismit ymmärretään 15 Kemian kevät 2015 – Tutkimusryhmät paremmin osa-alue osa-alueelta, on mahdollista selvittää, millaisia tanniineja sisältävät kasvit muodostaisivat energiatehokkaimman ja samalla myös ympäristöystävällisimmän tavan ruokkia maidon ja lihan tuotannossa maailmanlaajuisesti käytettäviä märehtijöitä. Annika Lehtimäen ja Reetta Ylöstalon (s. 30 ja 32) erikoistyöt ja Nicolas Baertin ja Marica Engströmin väitöskirjatyöt (s. 34 ja 36) liittyvät tähän tutkimuskokonaisuuteen. Tuntemattomien molekyylien rakenteen selvittäminen bioaktiivisuuden mekanismien ymmärtämiseksi Aiemmin tutkimattoman bioaktiivisuuden mekanismien ymmärtämiseksi on yhtä tärkeää pystyä spesifisesti tunnistamaan kyseisen aktiivisuuden kannalta niin aktiiviset kuin inaktiivisetkin molekyylit. Vasta tämän vaiheen jälkeen voidaan edetä rakenteen ja aktiivisuuden välillä vallitsevan yhteyden selvittämiseen. Luonnonyhdistekemian ryhmän kehittämät UPLC-DAD-MS/MS – analyysimenetelmät mahdollistavat useimpien polyfenoliryhmien puoliautomaattisen detektoinnin tuntemattomistakin kasvilajeista. Massaspektrometrisen molekyylipainon määrityksen kautta voidaan edetä polyfenoliryhmän sisällä yksittäisten yhdisteiden alustavaan rakenneanalyysin. Spesifinen rakenteen määritys vaatii kuitenkin erilaisten NMR- ja joissain tilanteissa myös CDspektroskooppisten menetelmien hyväksikäyttöä (kuva 3). Näitä puhdasainemenetelmiä varten pitää hallita myös semi-preparatiivisen tai preparatiivisen nestekromatografian kautta tapahtuva molekyylien puhdistaminen. Tätä vaihetta hankaloittaa kasvien maine loistavina kemisteinä: yksi molekyyli pitää pystyä eristämään kymmenien tai satojen vastaavien joukosta, jotta NMR-analyysi ja sitä kautta bioaktiivisuuden syiden selvittäminen mahdollistuisi. Jussi Suvannon, Anu Tuomisen ja Johanna Moilasen väitöskirjatyöt (s. 42, 44 ja 40) liittyvät tähän tutkimuskokonaisuuteen. ppm 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 5.4 5.3 5.2 5.1 5.0 4.9 4.8 4.7 4.6 4.5 4.4 4.3 4.2 4.1 4.0 ppm Kuva 3. Ellagitanniinin kaksidimensioinen HSQC NMR-spektri, joka paljastaa yhdisteen vety- ja hiiliatomien välisen sitoutumisen sekä sitoutuneiden vetyjen lukumäärän. 16 Kemian kevät 2015 – Tutkimusryhmät Bioaktiivisten yhdisteiden molekyylispesifinen kvantitointi parhaalla mahdollisella analyysimenetelmällä Kun on päästy selvyyteen siitä, minkälaiset luonnonyhdisteet ovat tehokkaimpia kasvien puolustusyhdisteinä tai märehtijöiden kasvihuonekaasupäästöjen vähentäjinä tai mitkä ovat jollain muulla tavalla tiedemaailmaa kiinnostavia, on tarpeen selvittää mitkä kasvilajit tuottavat suuria pitoisuuksia juuri näitä molekyylejä. Tähän tavoitteeseen ei päästä ilman tehokkaita ja molekyylispesifisiä kvantitointimenetelmiä. Parhaimmillaan tällaiset menetelmät yhdistävät nopean UPLC-kromatografian massaspektrometrisen MRM-kvantitointitekniikan (Multiple Reaction Monitoring) kanssa. Laura Haudan erikoistyö (s. 28) liittyy tähän tutkimuskokonaisuuteen. Luonnonyhdistekemian UPLC-DAD-MS/MS –laitteisto ja sen MRM-teknologia mahdollistavat jopa 250 yhdisteen molekyylispesifisen kvantitoinnin per analyysiminuutti. Viiden minuutin UPLCanalyysin aikana on siis teoreettisesti mahdollista detektoida ja kvantitoida yli tuhat orgaanista molekyyliä sillä edellytyksellä, että ne kaikki ovat tasaisesti jakautuneet koko UPLC-analyysin retentioaika-alueelle. Käytännössä tilanne ei kasvinäytteiden kohdalla luonnollisestikaan ole näin ideaalinen, vaan on tyydyttävä esimerkiksi 200–300 tehokkaimman puolustusyhdisteen tai loislääketanniinin pitoisuuden määrittämiseen per analyysi, mikäli halutaan selvittää miten niitä esiintyy kasvikunnassa. Kuvasta 4 nähdään, miten molekyylispesifinen MRM-tekniikka on toiminut käytännössä mansikan 36 bioaktiivisen polyfenolin kvantitoinnissa. Luonnonyhdistekemian tutkimusryhmään kesän 2015 kuluessa hankittava uusi UPLC-DADESI-Orbitrap-MS –laitteisto tulee mahdollistamaan entistä innovatiivisempien erittäin korkeaa MSresoluutiota hyödyntävien analyysimenetelmien kehittämisen niin luonnonyhdisteille kuin muillekin orgaanisille molekyyleille. Nämä menetelmät tulevat uudistamaan tavan, jolla kasvikunnasta jatkossa etsitään ja tunnistetaan bioaktiivisuudeltaan potentiaalisia makromolekyylejä, joita voidaan käyttää lisäämään esimerkiksi Suomessa rehuteollisuuden tuotteiden aktiivisuutta ja ympäristöystävällisyyttä. 3e+7 3e+7 Intensity 2e+7 2e+7 1e+7 5e+6 0 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 Retentioaika (min) Kuva 4. Esimerkki mansikan polyfenolien kvantitoinnista molekyylispesifisillä MRMmenetelmillä. 17 5.5 Kemian kevät 2015 – Tutkimusryhmät Lisätietoja saatavissa luonnonyhdistekemian tutkimusryhmän nettisivujen kautta: naturalchemistry.utu.fi Rakennamme ryhmän nettisivuja koko ajan informatiivisemmiksi (kuva 5). Tavoitteena on saada sivut toimimaan tutkimuksellisena ja opetuksellisena alustana, jota kautta on mahdollista jakaa tietoa (1) kasvikunnan polyfenolikoostumuksesta ja polyfenoleista johtuvasta bioaktiivisuudesta (kasvitietokanta), (2) polyfenolien rakenteesta ja rakenteen tunnistamista helpottavista yhdisteiden kemiallisista ominaisuuksista (yhdistetietokanta) ja (3) polyfenolien korkealuokkaisista analyysimenetelmistä (menetelmätietokanta). Näin ryhmän tutkijoiden ja opiskelijoiden työpanos on suoraan muun tiedeyhteisön hyödynnettävissä, kun se ensin on julkaistu arvostetuissa tiedelehdissä. Kuva 5. Näkymä luonnonyhdistekemian nettisivuilta, joiden kautta löydät lisätietoa ryhmän uutisista, tutkimuksesta, ihmisistä, projekteista, julkaisuista ja mediaklipeistä. 18 Kemian kevät 2015 – LuK-tutkielmat ANTOSYAANIT OVAT ENEMMÄN KUIN KARBOKATIONEJA Henna Koivikko Luonnonyhdistekemian tutkimusryhmä, Orgaanisen kemian ja kemiallisen biologian laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto hennkoi@utu.fi Antosyaanit ovat kasveissa esiintyviä väriaineita, jotka vastaavat lehdissä, kukissa, marjoissa ja hedelmissä olevista punaisen, violetin ja sinisen sävyistä. Ne suojelevat kasvia liialliselta auringonvalolta absorboimalla näkyvää valoa sekä toimivat eläinten ja pölyttäjähyönteisten houkuttimina. Antosyaanien ilmentämä väri on kuitenkin hyvin herkkä pH:n vaihtelulle. Karbokationimuoto, jossa antosyaanien rakennekaavat tavallisesti esitetään, on todellisuudessa pysyvä ainoastaan hyvin happamissa olosuhteissa. Tämä flavylium-kationiksi kutsuttu, tavallisesti punaisen sävyinen molekyyli reagoi helposti värittömiksi yhdisteiksi neutraaleissa ja heikosti happamissa olosuhteissa. Antosyaanien pH-riippuvainen reaktioketju [1-3] on esitetty alla (kaavio 1). Reaktioketju on tärkeä värin kannalta, sillä ainoastaan kinonimuoto ja flavylium-kationi ovat voimakkaan värisiä. Kinonimuodon konsentraatio kasvaa, kun pH:ta nostetaan; flavylium-kationin puolestaan pienenee. Heikosti happamissa olosuhteissa termodynaamisesti pysyvimpiä ovat kuitenkin värittömät muodot, jolloin tasapainon muodostuessa antosyaanien väri vähitellen katoaa liuoksesta. Kasveilla täytyy siis olla jokin keino, jonka avulla antosyaanien värit voivat säilyä kasveissa muuttumattomina, sillä myös luonnossa antosyaanit sijaitsevat tavallisesti veden ympäröiminä, heikosti happamissa tai neutraaleissa olosuhteissa kasvisolujen solunesterakkuloissa. Myös punaviinien antosyaanit muuttavat väriään viinin vanhetessa. Tämän värinmuutoksen mekanismit ovat kiinnostaneet monia tutkijoita [3]. Kaavio 1. Antosyaanien pH-riippuvainen reaktioketju [1-3]. Gly = sokeriosa, R1 ja R2 = H, OH tai OCH3. Viitteet 1. 2. 3. Brouillard, R., Dubois, J.-E., J. Am. Chem. Soc. 1977, 99, 1359-1364. Brouillard, R., Lang, J., Can. J. Chem. 1990, 68, 755-761. Pina, F., Olivera, J., de Freitas, V., Tetrahedron 2015, painossa, DOI 10.1016/j.tet.2014.09.051. 19 Kemian kevät 2015 – LuK-tutkielmat OLIGOMEERISTEN ELLAGITANNIINIEN RAKENTEELLINEN MONIMUOTOISUUS Juuso Laitila Luonnonyhdistekemian tutkimusryhmä, Orgaanisen kemian ja kemiallisen biologian laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto juerlai@utu.fi Ellagitanniinit ovat hydrolysoituviin tanniineihin kuuluvia kasvien polyfenolisia sekundäärimetaboliitteja. Ellagitanniinit muodostuvat yleensä pentagalloyyliglukoosista molekyylin sisäisen oksidatiivisen kytkeytymisen kautta, jossa yksinkertaisimmillaan kahdesta galloyyliryhmästä muodostuu heksahydroksidifenoyyliryhmä (HHDP). Oligomeeriset ellagitanniinit muodostuvat puolestaan molekyylien välisen oksidatiivisen kytkeytymisen kautta, jolloin voi syntyä jopa 11 monomeeristä koostuvia oligomeerejä [1]. Ellagitanniinit ovat rakenteellisesti monipuolisin tanniiniryhmä ja kaikkiaan yli 500 erilaista ellagitanniinia on karakterisoitu. Kaikista karakterisoiduista ellagitanniineista yli puolet ovat rakenteeltaan oligomeerisiä ja juuri oligomeerisillä ellagitanniineilla on usein esimerkiksi sellaisia farmakologisia ominaisuuksia, joita ei ole monomeerisillä ellagitanniineilla tai muilla tanniineilla lainkaan [2]. Tässä tutkielmassa perehdytään oligomeeristen ellagitanniinien ryhmittelyyn monomeerien välissä olevien sidosryhmien avulla. Lisäksi käydään yksityiskohtaisesti läpi erilaisten oligomeerien rakenteita ulottuen ensimmäisestä karakterisoidusta oligomeeristä (kuva 1) aina modernien kromatografisten ja spektrometristen menetelmien mahdollistamiin löytöihin. Kuva 1. Ensimmäinen eristetty ja karakterisoitu oligomeerinen ellagitanniini, agrimoniini. Vihreällä on esitetty ellagitanniineille ominainen HHDP-ryhmä ja ruskealla eräs yleinen oligomeerien sidosryhmä, dehydrodigalloyyliryhmä. Viitteet 1. 2. Salminen, J-P., Karonen, M. ja Sinkkonen, J., Chem. Eur. J. 2011, 17 (10), 2806-2816. Quideau, S., Chemistry and Biology of Ellagitannins, World Scientific, Singapore, 2009. 20 Kemian kevät 2015 – LuK-tutkielmat ANTOSYAANIANALYTIIKKAAN LIITTYVÄT ONGELMAT JA NIIDEN RATKAISUT Marianna Manninen Luonnonyhdistekemian tutkimusryhmä, Orgaanisen kemian ja kemiallisen biologian laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto mailma@utu.fi Antosyaanit ovat kasveissa, hedelmissä ja marjoissa esiintyviä punaisia, sinisiä ja violetteja väriaineita. Kuten muitakin flavonoideja, myös antosyaaneja pidetään terveysvaikutteisina. Lisäksi niitä käytetään ruoassa väriaineina, jotka tunnistaa E-koodista E163. Antosyaanien analysoimisessa tehokas yhdistelmä on käänteisfaasinestekromatografia yhdistettynä diodirividetektoriin (reversedphase high-performance liquid chromatography with diode array detection, RP-HPLC-DAD). Siinä antosyaanit erotetaan toisistaan nestekromatografisesti käänteisfaasikolonnilla ja detektoidaan spektrofotometrisesti. Eräs menetelmän suurimmista eduista on se, että näytteen sisältämät antosyaanit voidaan tunnistaa ilman erillistä eristämistä ennen analysointia. Antosyaanianalytiikasta haastavan tekee se, että antosyaanien aglykonit, antosyanidiinit muuttavat rakennettaan ja samalla väriään pH:n mukaan [1]. Paras ratkaisu ongelmaan on siirtää antosyaanien rakennetasapaino kohti punaista flavylium-ionia (kuva 1). Samalla antosyaanien detektointi spektrofotometrisesti helpottuu, sillä flavylium-ioni absorboi valoa aallonpituudella 520 nm, toisin kuin muut uutteessa mahdollisesti olevat fenoliset yhdisteet ja flavonoidit. Käytännössä tasapainon siirtäminen tapahtuu siten, että liikkuvan faasin pH säädetään alle antosyaanin protonin siirtoreaktion pK-arvon, joka tyypillisesti on noin kaksi. Lisäksi itse uute voidaan happamoida ennen injektointia. Käänteisfaasikromatografiassa yhdisteiden erottuminen perustuu niiden polaarisuuteen. Kun analysoitavana on seos polaarisuudeltaan samanlaisia antosyaaneja, on yhdisteiden erottaminen hankalaa. Siksi liikkuva faasi koostuu usein kahdesta eluentista. Liikkuvan faasin koostumusta muutetaan analyysin aikana siten, että orgaanisen eluentin osuus kasvaa analyysin edetessä. Laitteisto ja käytetyt liuottimet voivat kuitenkin vaikuttaa erottumiseen ja UV-spektreihin, minkä vuoksi on hyvä käyttää vertailunäytteitä uuden menetelmän optimoimiseksi. Esimerkiksi punaviiniä on käytetty tähän tarkoitukseen [2]. Kuva 1. Flavylium-ionin rakenne luonnossa yleisimmin esiintyville antosyanidiineille. R1 ja R2 voivat olla H, OH tai OCH3. Viitteet 1. Santos-Buelga, C., García-Viguera, C., Tomás-Barberán, F. A. Kirjassa Methods in Polyphenol Analysis, Santos-Buelga, C. ja Williamson, G., Toim., The Royal Society of Chemistry, Cambridge, 2003, s. 338-357. 2. Berente, B., Reichenbächer, M. ja Danzer, K., Fresen J. Anal. Chem. 2001, 371, 68-72. 21 Kemian kevät 2015 – LuK-tutkielmat 2D-LC-ABTS-MENETELMÄN KÄYTTÖ FENOLISTEN ANTIOKSIDANTTIEN ANALYTIIKASSA Karoliina Mäkinen Luonnonyhdistekemian tutkimusryhmä, Orgaanisen kemian ja kemiallisen biologian laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto kavima@utu.fi Fenoliset yhdisteet ovat kasvien yleisin sekundaarimetaboliittiryhmä. Niitä löytyy lähes kaikista kasvilajeista ja niiden pitoisuudet voivat olla jopa 30 % kasvin kuivapainosta. Useat fenoliset yhdisteet ovat antioksidatiivisesti aktiivisia eli ne kykenevät sitomaan vapaita radikaaleja ja estämään niiden jatkoreagointia. Fenolisten antioksidanttien analytiikka on usein hankalaa, koska tutkittavat näytteet ovat yhdistekoostumukseltaan monimutkaisia. Esimerkiksi kaakaossa ja viinirypäleissä esiintyy prosyanidiineja monissa eri polymerisaatioasteissa, vihreässä teessä puolestaan on pienemmän molekyylipainon proantosyanidiineja sekä flavanoleja ja fenolisia happoja [1]. Näiden kasvinäytteiden analysointiin on kehitetty menetelmä, jolla voidaan määrittää fenolisten yhdisteiden koostumus sekä niiden 2,2'-atsino-bis-(3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihappo) (ABTS) -radikaalinsieppausaktiivisuus. Kaksiulotteinen nestekromatografia, johon on yhdistetty ABTS-radikaalinsieppausmenetelmä, on todettu tehokkaaksi menetelmäksi antioksidatiivisen aktiivisuuden määrittämiseksi yksittäisille fenolisille yhdisteille. Hydrofiiliseen vuorovaikutukseen perustuvan kromatografian (HILIC) ja käänteisfaasinestekromatografian (RP-LC) yhdistelmällä saadaan paljon parempia tuloksia kuin voidaan saada yhden kolonnin systeemillä. HILIC erottaa yhdisteet polaarisuuden mukaan ja RP-LC hydrofobisuuden. Kun nämä yhdistetään ABTShuuhteluun, saadaan tarkka menetelmä antioksidanttien määrittämiseen. Kaksiulotteisella menetelmällä saadaan todennäköisemmin selkeitä ja tulkittavia kromatogrammipiikkejä kuin käytettäessä vain yhtä kolonnia. [1] Kuva 1. Työssä käytetty 2D-LC-ABTS-laitteisto [1]. HILIC eli hydrofiiliseen vuorovaikutukseen perustuva kromatografia ja RP eli käänteisfaasikromatografia ovat tehokas yhdistelmä ABTShuuhtelun kanssa fenolisten antioksidanttien analysointiin. Viitteet 1. Kalili, K.M., De Smet, S., van Hoeylandt, T., Lynen, F. ja de Villiers, A., Anal Bioanal Chem. 2014, 406, 4233-4242. 22 Kemian kevät 2015 – LuK-tutkielmat KAPSAISINOIDIEN ERILAISET UUTTOMENETELMÄT Saara Nenonen Luonnonyhdistekemian tutkimusryhmä, Orgaanisen kemian ja kemiallisen biologian laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto sakane@utu.fi Kapsaisinoidit ovat chilin tulisuuden aiheuttava alkaloidiryhmä [1]. Luonnosta löytyviä kapsaisinoideja ovat kapsaisiini, dihydrokapsaisiini, nordihydrokapsaisiini, homokapsaisiini ja homodihydrokapsaisiini (kuva 1), joista kapsaisiini ja dihydrokapsaisiini aiheuttavat 90 % chilien tulisuudesta [2]. Kapsaisinoidien tulisuuserot johtuvat niiden kyvyistä edistää membraanin depolarisaatiota sitoutumalla vanilloidireseptoriin [3]. Ne ovat lääketieteellisesti aktiivisia ja kipua tuottavia komponentteja [4], joilla on todettu positiivisia neurologisia ja ravitsemustieteellisiä vaikutuksia. Ne vaikuttavat esimerkiksi ääri- ja keskuslämpötunnistimiin [5] ja keuhkovaltimoihin [6] sekä alifaattisten aineiden ja hiilihydraattien metaboliaan [4]. Tässä tutkielmassa esitellään erilaisia menetelmiä uuttaa kapsaisinoidit, ja etenkin kapsaisiini ja dihydrokapsaisiini, chilistä. Menetelmiä ja niillä saatuja tuloksia kapsaisinoidipitoisuudelle vertaillaan keskenään. Vanhempia käsiteltyjä menetelmiä ovat refluksointi ja ravistelu uuttoliuottimina erilaisia orgaanisia liuottimia, kuten asetoni ja metanoli. Uudempia menetelmiä ovat ohutkerroskromatografia-avusteinen uutto, mikroaaltoavusteinen uutto ja ylikriittinen uutto sekä uutto käyttäen butyylikloridia uuttoliuottimena. Kuva 1. Kapsaisinoidien rakenteet Viitteet 1. 2. 3. 4. 5. 6. Govindarajan, S. V., CRC Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 1985, 22, 109–179. Perucka, I. ja Oleszek, W., Food Chem. 2000, 71, 287–291. Reilly, C. A., Crouch, D. J. ja Yost, G. S., J. Forensic Sci. 2001, 46, 502–509. Govindarajan, V. S. ja Sathyanarayana, M. N., Food Sci. Nutr. 1991, 29, 435–474. Jancsó-Gábor, A., Szolcsányi, J. ja Jancsó, N., J. Physiol. 1970, 208, 449–459. Pórszasz, J., Such, G. ja Pórszasz-Gibiszer, K., Acta Physiol. Acad. Sci. Hung. 1957, 12, 189–205. 23 Kemian kevät 2015 – LuK-tutkielmat GRANAATTIOMENAN POLYFENOLIEN SORMENJÄLKIPROFILOINTI UHPLC-MSn TEKNIIKALLA Marko Pakanen Luonnonyhdistekemian tutkimusryhmä, Orgaanisen kemian ja kemiallisen biologian laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto mavapa@utu.fi Jo muinaisista ajoista lähtien lääkekasvinakin käytetyllä granaattiomenalla (Punica granatum) on sen (poly)fenolirikkaan koostumuksen ansiosta lukuisia terveysvaikutuksia. Näihin lukeutuvat muun muassa antioksidatiivisuus, anti-inflammatorisuus sekä syöpää, mikrobeja, diabetesta ja mutageenisuutta mahdollisesti ehkäisevä vaikutus [1]. Kuluttajien tietoisuuden kasvaessa näistä terveysvaikutuksista on granaattiomenan ja etenkin siitä valmistettujen mehujen suosio ollut kasvussa jo useiden vuosien ajan [2]. Granaattiomenan yhdistekoostumus voi kuitenkin vaihdella, paitsi eri lajikkeiden välillä, myös ympäristötekijöiden ja erilaisten keräys-, kuljetus- ja valmistusmenetelmien vaikutuksesta. Perinteisillä korkean erotuskyvyn nestekromatografiaan perustuvilla menetelmillä pystytään havaitsemaan vain pieniä yhdistejoukkoja kerrallaan ja yksittäisten näytteiden valmistamiseen ja analysoimiseen kuluva aika on usein epäkäytännöllisen pitkä suurille näytemäärille. [2,3] Ratkaisuksi tähän on kehitetty UHPLC-MS (ultra high-performance liquid chromatographymass spectrometry, ultra-korkean erotuskyvyn nestekromatografia-massaspektrometria) käyttöön perustuva menetelmä, jolla on pystytty havaitsemaan granaattiomenamehunäytteistä jopa 75 erilaista yhdistettä. Menetelmässä käytetään kahta eri negatiivistä H-ESI-ionisaatiota (heated electrospray ionization, lämmitetty sähkösumutusionisaatio). Ensimmäisessä on käytössä flavonoideille ja muille pienille fenolisille yhdisteille optimoidut olosuhteet ja toisessa raskaammille ellagitanniineille optimoidut olosuhteet. Lisäksi menetelmään kuuluu kolmas positiivista H-ESI-ionisaatiota käyttävä analyysi, jolla havaitaan antosyaanit. Lineaarisen ioniloukun avulla suoritetaan täysskannauksen lisäksi MS2- ja MS3-mittaukset yhdisteiden tunnistamiseksi [3]. Näytteiden valmistaminen on helppoa ja nopeaa, eikä vaikuta tutkittavien yhdisteiden rakenteeseen. Kromatografinen erottuminen on nopeaa, kvalitatiivinen aineisto on laaja ja tulokset voidaan käsitellä kemometrisesti automaattisilla tietokoneohjelmilla, minkä ansiosta menetelmä voisi soveltua käytettäväksi muun muassa granaattiomenan laadunvalvonnassa ja jalostuksessa [2]. Viitteet 1. 2. 3. Ito, H., Peng Li, P., Koreishi, M., Nagatomo, A., Nishida, N. ja Yoshida, T. Food Chem. 2014, 152, 323–330. Calani, L., Beghe, D., Mena, P., Del Rio, D., Bruni, R., Fabbri, A., Dall’Asta, C. ja Galaverna, G. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 5600−5609. Mena, P., Calani, L., Dall’Asta, C., Galaverna, G., Garcia-Viguera, C., Bruni, R., Crozier, A. ja Del Rio, D. Molecules 2012, 17, 14821−14840. 24 Kemian kevät 2015 – LuK-tutkielmat GRANAATTIOMENAN ELLAGITANNIINIT SEKÄ NIIDEN MAHDOLLISET SYÖPÄÄ ESTÄVÄT OMINAISUUDET Juha Pekkala Luonnonyhdistekemian tutkimusryhmä, Orgaanisen kemian ja kemiallisen biologian laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto juwape@utu.fi Paljon polyfenoleita sisältävää granaattiomenaa on käytetty vuosisatoja ravitsemus- ja lääketieteellisiin tarkoituksiin. Granaattiomena sisältää paljon erilaisia polyfenoleita, joista ellagitanniineilla on havaittu olevan positiivisesti terveyteen vaikuttavia ominaisuuksia. Eri tutkimuksissa on havaittu, että todetut antimikrobiset, antikarsinogeeniset ja anti-inflammatoriset ominaisuudet johtuvat ellagitanniineista. [1] Kirjallisuuskatsauksessa pyrittiin selvittämään, miten erilaiset ellagitanniinit estävät syövän eri vaiheita. Lisäksi tarkasteltiin, miten eri ellagitanniinit ja niiden johdannaiset vaikuttivat syöpää edistäviin tekijöihin, kuten esimerkiksi CYP1-entsyymien aktiivisuuteen, suolistopatogeenien kasvuun ja HT-29-solujen lisääntymiseen. Granaattiomenan ellagitanniineista yleisimmät ovat punikalagiini ja punikaliini (kuva 1). Ellagitanniinit hajoavat ellagihapoiksi hydrolyysin kautta. Urolitiinit muodostuvat ellagihapoista suolistomikrobien vaikutuksesta. On havaittu, että urolitiinit ovat pääsääntöisesti bioaktiiviset yhdisteet suolistossa ellagitanniinien ja ellagihappojen sijasta. [2] Erilaisten urolitiinien rakenteet eroavat hydroksyyliryhmien määrässä ja sijainnissa. Yleisimpiä ovat urolitiini A ja B, joissa A:ssa on kaksi hydroksyyliryhmää ja B:ssä yksi hydroksyyliryhmä (kuva 2). Kuva 1. Granaattiomenan yleisimmät ellagitanniinit ja ellagihappo. Kuva 2. Yleisimmät urolitiinit Viitteet 1. 2. Bialonska, D., Kasimsetty, S. ja Schrader, K., Ferreira D., J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 8344-8349. Espin, J., Larrosa, M., Garcìa-Conesa, M., Tomàs-Barberàn, F., Evid.-based Complement Altern. Med. 2013, 2013, Article ID 270418. 25 Kemian kevät 2015 – LuK-tutkielmat HYDROLYSOITUVIEN TANNIINIEN VESILIUKOISUUS JA HYDROFOBISET VUOROVAIKUTUKSET Heikki Saine Luonnonyhdistekemian tutkimusryhmä, Orgaanisen kemian ja kemiallisen biologian laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto heilsai@utu.fi Hydrolysoituvat tanniinit ovat joukko fenolisia yhdisteitä, joita esiintyy yleisesti kasvikunnassa. Hydrolysoituvat tanniinit toimivat kasveissa osana kasvien puolustusjärjestelmää. Ne aiheuttavat monille kasveille ominaisen karvaan maun, sekä sitovat ja saostavat kasvinsyöjän ruoansulatuksen entsyymejä, jolloin kasvinsyöjän ruoansulatus hidastuu ja ruoansulatuksen teho alenee [1]. Tässä tutkielmassa perehdytään erityisesti hydrolysoituvien tanniinien vesiliukoisuuteen sekä niiden hydrofobisiin vuorovaikutuksiin muiden yhdisteiden, kuten proteiinien, kanssa. Tutkielmassa esitellään aluksi hydrolysoituvien tanniinien alaluokat, jotka ovat gallotanniinit ja ellagitanniinit. Tämän jälkeen pohditaan näiden yhdisteiden vesiliukoisuuteen vaikuttavia tekijöitä. Vesiliukoisuus on näiden yhdisteiden osalta merkittävä ominaisuus, sillä hydrolysoituvien tanniinien tulee olla liuenneena veteen, jotta ne pystyvät olemaan vuorovaikutuksessa tehokkaasti muiden yhdisteiden kanssa. Toinen tutkielman pääaiheista vesiliukoisuuden lisäksi on hydrolysoituvien tanniinien hydrofobiset vuorovaikutukset. Tutkielmassa pohditaan, millainen rooli hydrofobisilla vuorovaikutuksilla on tanniinien itsejärjestäytymiseen sekä sitoutumiseen muihin yhdisteisiin (kuva 1). Lopuksi pohditaan, millaisia käytännön sovelluksia hydrolysoituvilla tanniineilla voisi olla ihmisten terveyteen ja teollisuuteen. Kuva 1. Pentagalloyyliglukoosin (harmaa) mahdollinen sitoutuminen proteiiniin [2]. Viitteet 1. 2. Barrett, A., Ndou, T., Hughey, C.A., Straut, C., Howell, A., Dai, Z. et al., Inhibition of ±-amylase and glucoamylase by tannins extracted from cocoa, pomegranates, cranberries, and grapes. J. Agric Food Chem. 2013, 61(7), 1477-1486. Baxter, N.J., Lilley, T.H., Haslam, E. ja Williamson, M.P., Multiple interactions between polyphenols and a salivary proline-rich protein repeat result in complexation and precipitation. Biochemistry 1997, 36(18), 5566-5577. 26 Kemian kevät 2015 – Erikoistyöt HYDROLYSOITUVAT TANNIINITBIOSYNTEESIPOLULTA SPEKTRI- JA MENETELMÄKIRJASTOKSI Laura Hauta*, Tuomas Karskela ja Juha-Pekka Salminen Luonnonyhdistekemian tutkimusryhmä, Orgaanisen kemian ja kemiallisen biologian laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto *lahaut@utu.fi Abstrakti Hydrolysoituvat tanniinit (HT) ovat luonnossa esiintyviä suurikokoisia yhdisteitä, joiden biosynteesipolun voidaan ajatella jakaantuvan ainakin kolmeentoista eri osaan. Tässä työssä kehitettiin yhdistespesifisiä menetelmiä, joiden avulla on jatkossa mahdollista vastata nopeasti kysymyksiin: tuottaako jokin kasvilaji HT-yhdisteitä, millä biosynteesipolun osalla ne tuotetaan ja millainen on tätä kautta kyseisen kasvilajin potentiaalisin HT-lähtöinen bioaktiivisuus. Tämän lisäksi jokaisen biosynteesipolun osan HT:lle luotiin spektrikirjasto UV-, ECD- ja MS/MS spektrien avulla. Tämä helpottaa kyseisten polkujen varrelta mahdollisesti havaittavien uusien yhdisteiden karakterisointia. Johdanto Hydrolysoituvat tanniinit (HT) ovat kasveissa esiintyviä sekundäärimetaboliitteja, joiden rakenteet vaihtelevat melko yksinkertaisista monomeereista hyvin monimutkaisiin oligomeereihin. Jo niiden karakterisointi voi olla hankalaa, vaikka tähän onkin tarjottu työkaluja mm. kromatografisen eluoitumisjärjestyksen, UV-spektrien, korkean resoluution massaspektrometrian ja massaspektrometristen frakmentoitumisten kautta [1]. Samankaltaisia haasteita liittyy myös HT:den totuudenmukaiseen kvantitointiin, sillä niitä on yleensä vaikea poimia yhdistespesifisesti esiin kasvisolun tuottamasta kymmenien ja satojen yhdisteiden seoksesta. Jos kvantitointiin olisi saatavilla valmiita työkaluja, voisi näiden monenlaista bioaktiivisuutta omaavien yhdisteiden tutkiminen helpottua huomattavasti. HT:den biosynteesipolun voidaan ajatella jakaantuvan ainakin kolmeentoista eri osaan (Kaavio 1). Biosynteesipolun osasta riippuen HT-yhdisteiden rakenteet ovat erilaisia ja sitä kautta myös niitä akkumuloivien kasvisolujen bioaktiivisuuksissa havaitaan eroja. Kasvilajien HT-profiilille on tyypillistä, että kunkin lajin tuottamat pääyhdisteet edustavat yleensä vain yhtä tai kahta biosynteesipolun osaa, jolloin tämä profiili voi toimia kemotaksonomisena markkerina ja samalla sen perusteella voidaan tehdä arvioita kyseisen kasvilajin bioaktiivisuudesta. Esimerkiksi gallotanniineja akkumuloivien lajien voidaan olettaa omaavan hyvän proteiiniaffiniteetin, kun taas avoketjuisia ellagitanniineja tuottavat lajit ovat tyypillisemmin hyviä oksidatiivisen aktiivisuuden aiheuttajia [1]. Tämän erikoistyön tarkoituksena oli puhdistaa malliyhdisteitä jokaisesta HT-biosynteesipolun haarasta ja kehittää jokaiselle yhdisteelle UPLC-DAD-ESI-MS/MS –tekniikkaa hyödyntävä spesifinen MRM-kvantitointimenetelmä, jonka avulla yhdisteet voisi jatkossa sekä tunnistaa että kvantitoida mistä tahansa kasviuutteesta alle 10 minuutissa. Tämän lisäksi jokaiselle yhdisteelle on tarkoitus mitata UV- ja ECD-spektrit sekä useita erilaisia MS/MS-spektrejä, joita voidaan jatkossa käyttää hyväksi vastaavien uusien HT-yhdisteiden karakterisoinnissa. Materiaalit ja menetelmät Valitut yhdisteet puhdistettiin semipreparatiivisen käänteisfaaasinestekromatografian avulla. Yhdisteet analysoitiin UPLC-DAD-ESI-MS/MS:llä usealla eri tavalla, jolloin selvitettiin jokaiselle yhdisteelle (1) retentioaikaikkuna, (2) UV-spektri, (3) äiti-ionin molekyylipaino, (4) äiti-ionia 27 Kemian kevät 2015 – Erikoistyöt parhaiten akkumuloiva kartiojännite, (5) äiti-ionista frakmentoituvat tytärionit, (6) jokaiselle tytärionille paras törmäysenergia, ja (7) jokaista kartiojännite-törmäysenergiaparia vastaava MS/MS-spektri. Lisäksi määritettiin ECD-spektri ja yhdiste talletettiin molekyylikirjastoon. Tulokset ja johtopäätökset Kasvinäytteistä saatiin puhdistettua semipreparatiivisella nestekromatografialla useampi yhdiste jokaisesta hydrolysoituvien tanniinien biosynteesipolun kolmestatoista oletetusta haarasta (kaavio 1). Tunnistetut yhdisteet koostuivat kaksista erityyppisistä galloyylijohdannaisista, viisistä erityyppisistä ellagitanniinimonomeereista ja kuusista erityyppisistä ellagitanniinioligomeereista. Lisäksi puhdistettiin oligomeereille tyypillisiä hydrolyysituotteita. Yhdisteiden molekyylimassat vaihtelivat 332 Da ja 2804 Da välillä. Esittelen työni tarkemmat tulokset posterissa ja erikoistyöesitelmässä. GALLOYYLIGLUKOOSIT 1GG 2GG 3GG GALLOTANNIINIT Pentagalloyyliglukoosi (5GG) 4GG MONOMEERISET ELLAGITANNIINIT Modifioidut Dehydro-ET:t Tsebulagihappo Tsebulaniini Yksinkertaiset HHDP-esterit Dehydro-ET:t Gallagyyliesterit Geraniini Askorgeraniini* Punikalagiini DiGGgallagyyliglukoosi (kaksi isomeeria) m-DOGoligomeerit m-GOGoligomeerit m-DOG-oligomeerit, makrosyklinen Rugosiini D* Rugosiini G* Rugosiini E* Agrimoniini* Gemiini A* Oenotheiini A Oenotheiini B Hydrolyysituotteet Rugosiini A* Rugosiini B* 6GG OLIGOMEERISET ELLAGITANNIINIT C-glukosidiset ET:t Veskalagiini Kastalagiini Veskavaloniinihappo Kastavaloniinihappo Stakhyuriini Kasuariniini Hippophaeniini A Hippophaeniini B Pedunkulagiini Tellimagrandiini I Tellimagrandiini II Striktiniini Isostriktiniini Kasuariktiini m-GODoligomeerit Sanguiini H-6* Lambertianiini A* Lambertianiini C* Rubusuaviini C* Glukopyranoosi- ja C-glukosidipohjaiset m-DOG-oligomeerit Hydrolyysituotteet Hydrolyysituotteet Agrimoniinihappo A* Agrimoniinihappo B* Sanguiini H-2* Rubusuaviini A* 8GG Kokkiferiini D2 C-glukosidiset m-DOGoligomeerit Salikariniini A* Salikariniini B* Salikariniini C* OLIGOMEERISTEN ET:EN HYDROLYYSITUOTTEET Kaavio 1. Hydrolysoituvien tanniinien biosynteesipolun kolmetoista olettua haaraa ja kustakin haarasta puhdistetut yhdisteet [2]. GG = galloyyliglukoosi, ET = ellagitanniini. DOG, GOG ja GOD kuvaavat monomeerien välistä linkitystapaaa. *= yhdisteen osalta työ on vielä kesken. Viitteet 1. 2. Moilanen, J., Sinkkonen, J. ja Salminen, J.-P., Chemoecology. 2013, 23, 165-179. Moilanen, J., Koskinen, P. ja Salminen, J.-P., Phytochemistry. 2015, http://dx.doi.org/10/1016/j.phytochem.2015.03.002. 28 Kemian kevät 2015 – Erikoistyöt PROANTOSYANIDIINIEN METABOLIA LAMPAISSA: KVALITATIIVINEN JA KVANTITATIIVINEN ANALYYSI Annika Lehtimäki*, Maarit Karonen ja Juha-Pekka Salminen Luonnonyhdistekemian tutkimusryhmä, Orgaanisen kemian ja kemiallisen biologian laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto *anleht@utu.fi Abstrakti Proantosyanidiinit ovat tanniineihin kuuluva ryhmä kasvien puolustusyhdisteitä, jotka kykenevät sitoutumaan ja muodostamaan komplekseja proteiinien kanssa. Märehtijöillä kompleksin muodostumisen on havaittu parantavan proteiininkäyttöä. Työssä tutkittiin esparsetista (Onobrychis viciifolia) ja keltamaiteesta (Lotus corniculatus) valmistetun säilörehun sisältämien proantosyanidiinien metaboliaa lampaissa in vivo. Tutkimuksessa hyödynnettiin kemiallisia menetelmiä (mm. HCl/BuOH-depolymerisaatiota), joiden avulla pystyttiin todentamaan liukenemattomat ja sitoutuneet proantosyanidiinit. Tuloksista nähdään, että juoksutusmahassa suurin osa proantosyanidiineista on sitoutuneessa muodossa (proteiineihin tai kasvikuituun) ja että liukoisten proantosyanidiinien osuus kasvaa ohutsuoleen mentäessä. Johdanto Proantosyanidiinit ovat kasvien yleisin tanniiniluokka, ja ne esiintyvät flavan-3-olien oligomeereina ja polymeereina. Ne jaetaan useaan eri alaryhmään, joista yleisimpiä ovat prosyanidiinit (PC) ja prodelfinidiinit (PD). PC- ja PD-yksiköistä muodostuneet oligo- ja polymeerit ovat biologisesti aktiivisia, mikä perustuu osittain niiden kykyyn sitoutua ja muodostaa liukoisia tai liukenemattomia komplekseja proteiinien kanssa. Märehtijöiden aineenvaihdunnassa muodostuneiden tanniini-proteiini -kompleksien ansiosta eläin pystyy tehostamaan proteiinien hyödyntämistä. Proteiineihin sitoutunut tanniinikerros suojaa proteiineja pilkkoutumiselta pötsissä ja vuorovaikutuksen voimakkuudesta riippuen, ne saattavat vapautua ohutsuolessa ruuansulatuksen käytettäväksi. Kokonaisuudessaan prosessi voi parantaa eläimen terveyttä, maidontuottoa ja -laatua sekä vähentää märehtijöistä aiheutuvia ympäristöpäästöjä [1]. Työssä tutkittiin in vivo -tasolla lampaille syötetyn esparsetista (Onobrychis viciifolia) ja keltamaiteesta (Lotus corniculatus) valmistetun säilörehun sisältämien proantosyanidiinien metaboliaa. Tarkoituksena oli myös selvittää, miten tanniinikoostumus mahdollisesti muuttuu säilörehua valmistettaessa. Materiaalit ja menetelmät Näytemateriaaleina olivat kunkin kasvilajin tuore kasvi, säilörehun valmistukseen käytetty nahistunut kasvi ja säilörehunäyte sekä lampaista saadut juoksutusmaha-, ohutsuoli- ja paksusuolinäytteet. Näytteet uutettiin asetoni/veden (80/20, V/V) avulla. Uuttojäännös pestiin vielä asetonilla ja dikloorimetaani/metanolilla (1:1, V/V). Uute jaettiin vesi- ja rasvaliukoiseen osaan vesi/heksaaniuuton avulla. HCl/BuOH-menetelmää käytettiin proantosyanidiinipitoisuuden määrittämiseen. Menetelmä perustuu vahvan hapon (HCl) katalysoimaan depolymerisaatioreaktioon, jossa proantosyanidiinipolymeerit hajoavat värillisiksi antosyanidiineiksi, jotka voidaan mitata spektrofotometrisesti kuoppalevylukijalla (550 nm). Perinteisessä menetelmässä näyte inkuboitiin 95-asteisessa 2-butanolissa, joka sisälsi 5 % HCl:ää [3]. Sovelletussa menetelmässä näyte 29 Kemian kevät 2015 – Erikoistyöt inkuboitiin 70-asteisessa 2-butanolissa, joka sisälsi 50 % asetonia, 5 % HCl:ää ja 0,4 g/l ammoniumrauta(III)sulfaattia [2]. Proantosyanidiinien sitoutumista proteiineihin ja kasvikuituun tutkittiin SDS-liuoksen ja perinteisen HCl/BuOH-menetelmän avulla. SDS-liuos sisälsi 10 g/l SDS:ää ja 50 g/l merkaptoetanolia 10 mM:ssa trishydrokloridia, jonka pH säädettiin NaOH:n avulla arvoon 8,00. Kokonaisfenolipitoisuus määritettiin Folin Ciocalteu -reagenssin avulla. Menetelmässä näytteen sisältämät fenoliset hydroksyyliryhmät pelkistävät reagenssin ja näyte värjäytyy siniseksi, mikä voidaan detektoida spektrofotometrisesti kuoppalevylukijalla (730 nm). Kasviuutteiden tanniinikoostumus, kvantitatiivinen proantosyanidiinipitoisuus, PC/PD-suhde ja proantosyanidiinien keskimääräinen polymerisaatioaste määritettiin hyödyntämällä ultrakorkean erotuskyvyn nestekromatografia yhdistettynä diodirividetektoriin- ja kolmoiskvadrupoli massaspektrometriin (UPLC-DAD-MS/MS). Tulokset ja johtopäätökset Kuvassa 1 esitetyistä esparsetista (Onobrychis viciifolia) johtuvista proantosyanidiinipitoisuuksista havaitaan, että liukoisten proantosyanidiinien pitoisuus laskee jo säilörehun valmistuksen yhteydessä. Suurin osa proantosyanidiineista on juoksutusmahassa liukenemattomassa sitoutuneessa muodossa (proteiineihin tai kasvikuituun), mutta ohut- ja paksusuolessa liukoisten tanniinien suhteellinen osuus nousee lähes tuoreesta kasvista havaitulle tasolle. Nämä havainnot jo yksinään antavat viitteitä esparsetin PC/PD- oligomeerien ja polymeerien toimintamekanismeista lampaissa. Tarkemmat tulokset tulen esittelemään posterissa ja erikoistyöesitelmässä. mg/g Proantosyanidiinien kokonaispitoisuuden jakaantuminen 140 120 100 80 60 40 20 0 Liukoinen Liukenematon Kuva 1. Esparsetin (Onobrychis viciifolia) sisältämien proantosyanidiinien kokonaispitoisuuden jakaantuminen kasvi- ja rehunäytteissä sekä rehua syöneiden ja myöhemmin teurastettujen lampaiden juoksutusmaha-, ohutsuoli- ja paksusuolinäytteissä. Viitteet 1. 2. 3. Adamczyk, B., Salminen, J.-P., Smolander, A. ja Kitunen, V., Int. J. Food Sci. Technol. 2012, 47, 875-878 Grabber, J.H., Zeller, W.E. ja Mueller-Harvey, I., J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 2669-2678 Terrill, T.H., Rowan, A.M., Douglas, G.B. ja Barry, T.N., J. Sci. Food Agric. 1992, 58, 321329 30 Kemian kevät 2015 – Erikoistyöt TANNIINIEN KEMIALLISET OMINAISUUDET JA NIIDEN MITTAUSMENETELMIÄ Reetta Ylöstalo* ja Maarit Karonen Luonnonyhdistekemian tutkimusryhmä, Orgaanisen kemian ja kemiallisen biologian laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto *reylos@utu.fi Abstrakti Tanniinin kyky sitoutua proteiiniin ei ole aina ennustettavissa tanniinin rakenteen perusteella, mutta sen sijaan niiden oktanoli-vesi-jakaantumiskertoimien (Kow) on havaittu korreloivan in vivo määritettyjen tanniini-proteiini-vuorovaikutusten kanssa. Erikoistyössä kehitetään erilaisia menetelmiä Kow-kertoimien määrittämiseksi sekä selvitetään tanniineille havaittujen kertoimien ja pro-oksidanttiaktiivisuuksien yhteneväisyyttä. Kow-kertoimet mitataan kolmella eri metodilla: korkean erotuskyvyn nestekromatografilla ja diodirividetektorilla (HPLC-DAD), erittäin korkean erotuskyvyn nestekromatografilla ja diodirividetektorilla tai massaspektrometrillä (UHPLCDAD/MS) ja kuoppalevylukijalla tehtävällä Folin-Ciocalteu -menetelmällä. Johdanto Kasvien tanniinit vuorovaikuttavat proteiinien kanssa joko hapettumisen tai muun sitoutumisen ja saostamisen kautta [1]. Tämä kyky vaikuttaa mm. proteiinien imeytymistehokkuuteen kasvinsyöjien suolesta [1], mitä voidaan käyttää hyödyksi esimerkiksi maataloudessa parantamaan typen imeytymistä märehtijöiden ravinnosta tai torjumaan sisäloisia [2]. Kow-kerrointa käytetään yleisesti ympäristötutkimuksessa ja farmakologiassa arvioitaessa yhdisteen affiniteettia esimerkiksi epäorgaanisiin maahiukkasiin ja solukalvoihin. Erikoistyön tavoitteena on testata ja kehittää Kow-kertoimien määrittämiseen soveltuvia menetelmiä ja verrata saatuja arvoja yhdisteiden hapettumisherkkyyteen. Materiaalit ja menetelmät Tutkimuksessa käytetään noin 40:ä rakenteellisesti erilaista proantosyanidiinia ja ellagitanniinia (kuva 1), jotka eristetään useista eri kasvilajeista preparatiivisella ja semipreparatiivisella nestekromatografialla. Eri puhdistusvaiheiden seurantaan ja yhdisteiden tunnistamiseen käytetään UHPLC-DAD-MS:a. Kow-kertoimet määritetään ensin perinteisesti antamalla tunnetun yhdistepitoisuuden tasapainottua oktanoli- ja vesifaasin välillä ja mittaamalla konsentraatio kummassakin faasissa HPLC-DAD:lla. Vastaavat määritykset tehdään UHPLC-DAD-laitteistolla ja Folin-Ciocalteumenetelmällä kuoppalevylukijalla. Kuoppalevylukijalla mitataan myös yhdisteiden autooksidaatiolla pH:ssa 10 hapettuva osuus kokonaisfenolipitoisuudesta. Lisäksi kehitetään nopea ja herkkä usean reaktion seuranta (multiple reaction monitoring) -mittausmenetelmä UHPLC-MS:lle, jonka avulla voidaan määrittää yksittäisten yhdisteiden Kow-kertoimet useita yhdisteitä sisältävistä kasviuutteista ja -fraktioista. 31 Kemian kevät 2015 – Erikoistyöt a) b) Kuva 1. Työssä käytettyjen tanniinien tyypillisiä rakenteita: a) tellimagrandiini I (ellagitanniini) b) dimeerinen prodelfinidiini (proantosyanidiini). Tulokset ja johtopäätökset Ruusujen sisältämästä laajasta ellagitanniini- ja galloyyliglukoosikirjosta ja mustaherukan proantosyanidiineistä eristettiin noin 5–20 mg yksittäisiä tanniineja – ellagitanniineista monomeerejä, dimeerejä ja trimeerejä ja proantosyanidiineistä dimeerejä ja trimeerejä. Kaikille tutkittaville yhdisteille on löydetty yhteinen sopiva konsentraatio (1 mM kantaliuos) ja käytännön testeissä havaittu kokeiden onnistuvan huomattavan pienessä mittaluokassa. HPLC-DAD -mittaus toimii kaikille tähän asti testatuille yhdisteille. Haittapuolena on analyysiajan pituus: yhden yhdisteen analyysiaika rinnakkaismäärityksineen on 16 tuntia. Kuoppalevylukijamenetelmällä saatavat tulokset yhtenevät HPLC-DAD-tulosten kanssa melko hyvin. Yhteneväisyyteen saattavat vaikuttaa puhdasaineiden sisältämät epäpuhtaudet, jotka myös detektoidaan kuoppalevylukijalla ja lukijan määritysrajat, joiden vuoksi liuoksista on analysoitava useampia laimennoksia. Alustavien tulosten perusteella Kow-kerroin ei riipu edes tanniiniryhmän sisällä yhdisteen koosta, ts. molekyylipainosta. Tutkitut dimeerit ovat monomeereihin verrattuna vesiliukoisempia ja lisäksi heksahydroksidifenyyliryhmien määrällä vaikuttaisi olevan merkitystä jakaantumiseen. Yksittäisten yhdisteiden UHPLC-MS-kvantitoinnin suoraan yhdisteseoksista odotetaan onnistuessaan nopeuttavan Kow-kerroinmäärityksen tekoa huomattavasti, sillä yhdisteiden puhdistamisen tarve poistuisi ja puhdasainekokeissa käsin tehtäviä vaiheita voitaisiin mahdollisesti automatisoida. Lisäksi analyysiaika lyhenisi merkittävästi. Massaspektrometria kuitenkin asettaa menetelmälle tiettyjä rajoituksia: Kasviuutteet sisältävät sekä vesi- että rasvaliukoisia yhdisteitä ja jos kummatkin halutaan detektoida, sekä oktanoli- että vesifaasi on analysoitava. Erilaiset liuottimet saattavat kuitenkin vaikuttaa sähkösumutusionisaation tehokkuuteen. Viitteet 1. 2. 3. Salminen, J.-P. ja Karonen, M., Funct. Ecol. 2011, 25 (2), 325–338. Mueller-Harvey, I., Mlambo, V., Sikosana, J. L. N., Smith, T., Owen, E. ja Brown, R. H., J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 5436–5444. Hagerman, A. E., Rice, M. E. ja Ritchard, N. T., J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 2590–2595. 32 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät WILLOWHERB OLIGOMERIC ELLAGITANNINS: QUANTIFICATION AND BIOACTIVITY Nicolas Baert Natural Chemistry Research Group, Laboratory of Organic Chemistry and Chemical Biology, Department of Chemistry, University of Turku nicbae@utu.fi Research Director: Prof. Juha-Pekka Salminen Supervisor(s): Doc. Maarit Karonen and Doc. Jari Sinkkonen Funding: European Commission (PITN-GA-2011-289377, “LegumePlus” project). Estimated time of PhD dissertation: 2016. Main aims of the PhD research Tannin-rich forages have numerous benefits in animal nutrition. However, tannins are a very diverse family of molecules with various chemical structures and, therefore, contrasting activities. Knowledge is scarce about what structure causes what activity, yet understanding that correlation is highly important to achieve a more efficient and targeted use of tannin-rich forages. My research aims at reducing that gap in the knowledge of plant polyphenols bioactivity by addressing one aspect of the question: the size-effect. That goal will be achieved by testing 6 oligomeric ellagitannins (fig. 1) isolated from willowherb (Epilobium angustifolium) in a series of in vitro tests. I will evaluate and compare their potency to reduce methane production in cows, and their capacity to weaken sheep intestinal parasites. Those compounds constitute an excellent model for this research purpose as they differ from one another by size only. In addition, a method that enables the quantification of those compounds in willowherb will be developed and implemented to study their distribution in the plant and in several populations of that species. Main results so far Tellimagrandin I –based oligomeric ellagitannins up to heptamer were isolated and purified from willowherb for the first time. Those pure compounds were then utilised to create a UPLC-MS/MS method using the Multiple Reaction Monitoring (MRM) technology (fig. 2). This method enables fast and selective detection and quantification of those oligomers in Epilobium angustifolium samples [1]. The in vitro assays on ruminal fermentation showed a decrease in methane production and a correlated shift in the volatile fatty acids synthesis. Both activities vary according to the oligomer size and reach an optimum with a certain oligomer size [2]. The oligomeric ellagitannins’ ability to induce paralysis on sheep’s nematodes was tested in vitro. Results show a significant dose-dependent and sizedependent response. Interestingly, positive results were obtained at concentrations as low as 25 μM, which is physiologically conceivable for an animal feeding on willowherb [3]. The distribution of oligomeric ellagitannins – along with several flavonoid glycosides – was studied in different parts of willowherb. Preliminary results indicate that the concentration in oligomers decreases as their size increases. Oenothein B and A (dimer and trimer, respectively) are the most abundant phenolic compounds in the plant and represent, together, about 10% of the dry weight in leaves and flowers [4]. 33 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät UV 280 MRM of Dimer MRM of Trimer MRM of Tetramer MRM of Pentamer MRM of Hexamer MRM of Heptamer Figure 1. Structure of tetrameric tellimagrandin I. Figure 2. UPLC-UV chromatogram of willowherb flower extract and detection of the oligomers by the created MRM methods. The significance of my research for the research group and the whole research field My research is a continuum for our group’s previous findings of the presence of the largest ellagitannins, up to undecamers, from the plant kingdom. I have now isolated these exceptionally large ellagitannins up to heptamer and studied their bioactivity for the first time. At the same time my bioactivity studies are a part of two larger projects conducted by our group that will comprehensively evaluate ruminant-related bioactivities of more than 30 ellagitannins. Additionally, this research is part of a European project named LegumePlus that aims at promoting a more rational use of bioactive forages in animal nutrition. By gaining a finer comprehension of the structure-activity relationship of polyphenols we are able to select the most efficient and the most suitable crop for a desired result: increasing milk and meat quality, protection against intestinal nematodes or decreasing methane emissions. Papers to be included in the PhD thesis 1. 2. 3. 4. Baert, N., Karonen, M., Salminen, J-P. UPLC-MS/MS enables quantification of macrocyclic oligomeric ellagitannins. Manuscript to be submitted to J. Chrom. A. in April 2015 Baert, N., Pellikaan, W. F., Karonen, M., Salminen, J-P. Oligomeric ellagitannins affect in vitro ruminal methanogenesis in a size-dependent manner. Submission planned for 2015 Baert, N., Hoste, H., Karonen, M., Salminen, J-P. Anthelminthic activity of willowherb oligomeric ellagitannins. Submission planned for 2015. Baert, N., Kim, J., Karonen, M., Salminen, J-P. Distribution of main phenolic compounds in willowherb populations. Submission planned for 2016. 34 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät UNDERSTANDING THE POSITIVE ENVIRONMENTAL EFFECTS OF PLANT TANNINS: ASSESSMENT AND APPLICATIONS Marica Engström Natural Chemistry Research Group, Laboratory of Organic Chemistry and Chemical Biology, Department of Chemistry, University of Turku mtengs@utu.fi Research Director: Prof. Juha-Pekka Salminen Supervisor(s): Doc. Maarit Karonen and Doc. Petri Tähtinen Funding: Doctoral Programme in Physical and Chemical Sciences, Turku University Foundation, Svenska tekniska vetenskapsakademien i Finland (STV) Estimated time of PhD dissertation: 2016 Main aims of the PhD research The aim of my PhD research is (1) to develop rapid and specific UPLC-QqQ-MS/MS methods for screening plant samples for their bioactive polyphenol content, (2) to develop simple methods which can be used to quickly test if some plant species is a potential candidate to be used as environmentally friendly forage, (3) to investigate the chemical properties of those plant tannins that have greatest anthelmintic effects on the different stages of ruminant parasites (egg, L1 and L2 stage larvae) and (4) to study the covalent complex formation of tannins and proteins. Main results so far We developed UPLC-QqQ-MS/MS methods that offer fast, sensitive and selective tools for achieving a more thorough understanding of the active and inactive polyphenols in plants. With the methods, a broad overview of fingerprints of eight common polyphenol classes, ellagitannins, gallic acid and quinic acid derivatives, quercetin, kaempferol and myricetin glycosides, procyanidins and prodelphinidins can be achieved in relatively short time. Together with my undergraduate student Milla Leppä, we have also developed a UPLC-MS based method for the rapid screening of protein precipitation capacity of different plant polyphenols from plant extracts (Figure 1). During my six month visit in French National Institute for Agricultural Research (Toulouse, France) I studied the in vitro effect of series of 27 ellagitannins, 7 galloylglucoses/ gallotannins and their hydrolysis product, gallic acid, on egg hatching and motility of L1 and L2 stage larvae of the Haemonchus contortus. The results indicated that the activity of these compounds depended on many structural features, including size, functional groups present in the structure, stereochemistry of certain functional groups, and the structural rigidness of the studied compounds. Results from scanning electron microscopy further confirmed the effect of the studied tannin molecules. Studies on tanninprotein complex formation suggested that in general, higher pH, higher tannin: protein ratio, and longer incubation time favor the formation of covalently stabilized complexes. Furthermore, the exact tannin structure plays a crucial role in the relative importance of these variables as well. 35 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät Figure 1. UPLC-DAD trace at 280 nm of a plant extract before (A) and after (B) removal of polyphenols with high protein affinity. The significance of my research for the research group and the whole research field My PhD research is adjacent to two other studies in our laboratory, Academy of Finland Postdoctoral Researchers project "Promising ellagitannins: effects on ruminant health and greenhouse gas emissions" of my supervisor Maarit Karonen and the EU Marie Curie Initial Training Network project “Legume Plus” of my principal supervisor Juha-Pekka Salminen, funding also PhD student Nicolas Baert. In these projects the role of single ellagitannins and forage plants in environmental related ruminant aspects is evaluated by investigating the effect of ellagitannins on different larval stages and on the production of methane and nitrogen emissions by ruminants. By understanding the mechanisms behind the positive environmental effects of the plant tannins, it is possible to tell which forages would be both energetically and environmentally the best choice for the worldwide ruminant feeding. The developed UPLC-QqQ-MS/MS methods offer a user-friendly, robust and fast addition to the chemistry tools currently used for the qualitative and quantitative screening of large numbers of samples for their bioactive polyphenol-types and content, and these methods are in routine use in our laboratory. The better knowledge obtained on the anthelmintic properties of single ellagitannins and galloyglucoses/gallotannins should further promote the selection of most suitable plants to be tested for their anthelmintic properties in other research groups as well. Papers to be included in the PhD thesis 1. 2. 3. 4. 5. Engström, M.T, Pälijärvi, M., Fryganas, C., Grabber, J., Mueller-Harvey, I., Salminen, J.-P., J. Agric. Food Chem., 2014, 62, 3390–3399. Engström, M.T, Pälijärvi, M., Salminen, J.-P. 2015. Rapid fingerprint analysis of plant extracts for ellagitannins, gallic acid and quinic acid derivatives, and quercetin-, kaempferol- and myricetin-based flavonol glycosides by UPLC-QqQ-MS/MS (submitted to J. Agric. Food Chem., under revision) Engström, M.T, Karonen, M., Baert, N. Payré, B., Hoste, H., Salminen, J.-P. 2015. Beneath the surface: Structure-activity relationships and the anthelmintic properties of plant tannins (to be submitted to Int. J. Parasitol.) Engström, M.T, Suber, M.P., Salminen, J.-P., Hagerman, A. 2015. Covalent stabilization of ellagitannin-protein complexes (to be submitted to J. Agric. Food Chem.) Engström, M.T., Leppä, M., Salminen, J.-P. 2016. Rapid analysis of plant polyphenols with protein affinity by UPLC-QqQ-MS/MS (to be submitted to J. Agric. Food Chem.) 36 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät EVOLUTION AND DISTRIBUTION OF POLYPHENOLBASED DEFENSES OF PLANTS Jorma Kim Natural Chemistry Research Group, Laboratory of Organic Chemistry and Chemical Biology, Department of Chemistry, University of Turku jookim@utu.fi Research Director: Prof. Juha-Pekka Salminen Supervisors: Prof. Juha-Pekka Salminen and Doc. Maarit Karonen Funding: NCRG Research Services, Department of Chemistry Estimated time of PhD dissertation: 2018 Main aims of the PhD research Plants produce tannins for chemodefensive means against herbivory. Two mechanisms have been proposed: 1) precipitation with plant proteins, compromising the nutritional value of plant, and 2) auto-oxidation in alkaline conditions in caterpillar midguts followed by oxidative stress as the oxidation products and their by-products damage nutrients or cause cytotoxic effects on the gut lumens. My aim is to comprehensively study the polyphenol profiles and bioactive effects – i.e. oxidation at elevated pH, and protein precipitation capacity – of a wide selection of species from different parts of plant phylogeny and observe the distribution of these two defensive means in the plant kingdom from an evolutionary point of view. During my studies I use the state-of-the-art technology available in our laboratory to analyse thousands of samples with relative ease, thanks to the extensive development of analysis techniques during the past decades. In addition I will further develop and improve these analysis methods from the metabolomics point of view. Polyphenol profiles are studied using ultrahigh-performance liquid chromatography (UPLC) and mass spectrometry (MS), utilising both triple quadrupole MS/MS and quadrupole orbitrap MS/MS technologies. Main results so far At the moment the research is focused on the seed polyphenols of Panamanian trees. Seeds of Psychotria genus were found to contain oligo- and polymeric propelargonidins, a subgroup of proanthocyanidins (Figure 1) consisting mainly of afzelechin units, for which selective MS/MS quantitation methods are not yet available. After obtaining propelargonidin-rich fractions from Psychotria grandis seed extract using Sephadex LH-20 gel, I observed how these oligo- and polymers fragment by triple quadrupole MS/MS. The information obtained was used to develop a group-selective MS/MS quantitation method. The results are promising (Figure 2), and I expect to publish the finalized method later this year. The significance of my research for the research group and the whole research field My research benefits directly two projects conducted in our group. By combining the plant samples of the Panama (led by Dr. Sofia Gripenberg from University of Oxford) and PolyphenoOx (led by Prof. Salminen) projects, I am able to obtain a uniquely wide selection of polyphenol-rich plants from five continents. These help me to develop new group-specific MS/MS and metabolomicsoriented MS tools to be used by others as well. My research will be one of the first large-scale polyphenol studies to benefit from the high-resolution orbitrap MS combined to UPLC, and I will also be one of the first to use the metabolomic approach in my data processing in this scale. As a whole, my research will result in comprehensive database of the distribution of polyphenol-based 37 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät defensive mechanisms in the plant kingdom. The database will be made available for all scientists in the research field so that they can readily utilise my findings in their own work. Platypodium elegans caffeic acid derivative Machaerium seemannii procyanidins Licania platypus prodelphinidins Anacardium excelsum tri- and tetragalloyl glucose Lafoensia punicifolia punicalagin Combretum fructicosum punicalagin Combretum laxum punicalagin Psychotria limonensis propelargonidins Psychotria chagrensis propelargonidins Psychotria grandis propelargonidins Psychotria marginata propelargonidins Psychotria horizontalis propelargonidins Figure 1. Simplified phylogenetic tree for selected tree species of Panama. The highest polyphenol concentration in mg/g, and the highest absolute protein precipitation capacity (PPC) and pro-oxidant activity. The highest relative pro-oxidant activity. The highest relative PPC. extension units afzelechin terminal unit catechin Figure 2. The UV chromatogram recorded at 280 nm of the Psychotria grandis raw extract with superimposed normalised total ion chromatograms from multiple reaction monitoring (MRM) analyses of Sephadex fractions 6 and 8. Ion with m/z at 271 represents the afzelechin extension unit while ion with m/z at 289 represents the catechin terminal unit, illustrated in the trimer structure on the right. Papers to be included in the PhD thesis Kim, J., Gripenberg, S., Karonen, M., Salminen, J.-P. Oligomeric and polymeric propelargonidins can be quantified by selective MS/MS technology. 2015. Manuscript to be submitted. 38 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät ELLAGITANNINS IN FINNISH PLANT SPECIES – CHARACTERIZATION, DISTRIBUTION AND OXIDATIVE ACTIVITY Johanna Moilanen Natural Chemistry Research Group, Laboratory of Organic Chemistry and Chemical Biology, Department of Chemistry, University of Turku jmmoil@utu.fi Research Director: Prof. Juha-Pekka Salminen Supervisor(s): Doc. Maarit Karonen and Doc. Petri Tähtinen Funding: Academy of Finland, Kone Foundation, Turku University Foundation and Department of Chemistry. Estimated time of PhD dissertation: 6/2015. Main aims of the PhD research The main aims of my thesis work can be summarized by posing the following questions. How and by which methods ellagitannins (ETs; Fig. 1) can be effectively and easily recognized/characterized from complex plant samples without having to isolate each one them for individual characterization? Which kind of ETs Finnish plant species produce? How much different plant species produce them? How they are distributed among plant families, genera and species? How structurally different ETs react in different biological environments? Which structural features affect their reactivity? Main results so far The basis for my PhD work originates from the fact that ETs are more prone to oxidation than are other types of tannins (i.e. proanthocyanidins, gallotannins and galloyl glucoses) in the highly alkaline gut conditions of plant-eating insect herbivores. Thus, it was of interest to study in more detail how ETs with different structures differ in their propensity to oxidize. To study this, 27 ETs were purified and their oxidative activity (i.e. the rate at which they form quinones and other oxidation products at pH 10) was measured [1]. It was found that ETs differed significantly in their propensity to oxidize, and that this propensity was attributable to certain structural features. The first study generated also a lot of characterization-related data. The published data on the characterization of ETs is mainly focused on reporting detailed spectroscopic and spectrometric data of individual ETs, and there is no literature available that concerns the characterization of ETs from more complex samples, e.g. from plant crude extracts. Thus, there was a need for a more general approach that would make the characterization of ETs easier. By utilizing the chromatographic, spectroscopic and spectrometric data of 22 ETs, we showed that it is possible to classify ETs into different sub-groups and even identify ETs straight from the crude extracts of the plant samples [2]. The characterization patterns presented in [2] were of significant aid in the next study, in which 82 Finnish plant species were screened [3]. The aim was to find out, which plant species contain ETs, which type of ETs they produce and how much ETs they produce. From the studied plant species 30 were found to contain ETs and the content of ETs varied, depending on the species, from trace amounts to more than 90 mg g–1 of the crude extract. The specific ET compositions of the studied plant species was also associated to their taxonomic classification. It was found that these two are surprisingly compatible with each other. For example, it was found that species belonging to same genera have similar ET profiles. 39 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät The final study to be included in my PhD thesis will extend the bioactivity part of my research. In [4], the activities of 13 ETs have been measured with an assay that can be used to evaluate the radical scavenging activity, metal ion chelating ability and pro-oxidant activity of ETs. The reaction conditions are quite different from those used in [1], and thus, these results will give a wider picture of the activities of ETs. Furthermore, this study included some new ETs that were not available for [1]. The results of these ETs will be included in [4], and they will thus widen the oxidative activity perspective too. Figure 1. Examples of ellagitannins belonging to different sub-groups. A = pedunculagin, a glucopyranose-based ellagitannin, B = vescalagin, a C-glucosidic ellagitannin and C = geraniin, a dehydroellagitannin. The significance of my research for the research group and the whole research field The results of my thesis work have provided information about the activities of ETs [1, 4], about their characterization from complex plant samples [2] and about their occurrence in Finnish plant species [3]. The results from the activity studies have shown that ETs possess activity in different conditions and that they can be harmful for herbivores that consume them. For a long time, ETs were considered to be biologically non-relevant because they are not as good in precipitating proteins as are other types of tannins. The protein precipitation hypothesis has had a significant impact on the studies concerning plant-herbivore interactions, but as our results (among many others) show, this is not the case. On the other hand, ETs are sometimes said to be difficult to analyze because of their complex structures. This is not valid either since the data presented in [2] showed that a lot of information about the structures of ETs can already be obtained from, for example, the liquid chromatographic retention order and from the UV spectrum. Thus, [2] should be useful for all those who are interested in finding out the ET compositions of their plant samples. The results presented in [3] are part of wider study ongoing in our research group. In [3], the focus was set on ETs, but in the future more studies will be published in which the polyphenol profiles of plant species are presented in more detail. Nevertheless, [3] was first study in which the ET composition of Finnish plant species was studied at this extent. Papers to be included in the PhD thesis 1. 2. 3. 4. Moilanen, J., Salminen, J.-P. Chemoecology 2008, 18, 73–83. Moilanen, J., Sinkkonen, J., Salminen, J.-P. Chemoecology 2013, 23, 165–179. Moilanen, J., Koskinen, P., Salminen, J.-P. Distribution and content of ellagitannins in Finnish plant species. Phytochemistry 2015 (available online at http://dx.doi.org/10.1016/j.phytochem.2015.03.002). Moilanen, J., Karonen M., Tähtinen, P., Jacquet, R., Quideau, S., Salminen, J.-P. Additional evidence on the variable bioactivity of ellagitannins: effects as antioxidants, pro-oxidants and metal chelators. Manuscript to be submitted to Chemoecology. 40 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät TANNIN DIVERSITY OF RUBUS CELL AND ORGAN CULTURES: CHARACTERIZATION, BIOSYNTHESIS AND METABOLISM Jussi Suvanto Natural Chemistry Research Group, Laboratory of Organic Chemistry and Chemical Biology, Department of Chemistry, University of Turku josuva@utu.fi Research Director: Prof. Juha-Pekka Salminen Supervisor(s): Doc. Maarit Karonen and Doc. Petri Tähtinen Funding: NCRG Research Services Estimated time of PhD dissertation: 2019 Main aims of the PhD research Berries of Rubus genus are unique in that they are unusually rich in polyphenolic ellagitannins. Plant phenolics often possess various bioactivities, thus being beneficial not only for plant, but also for human health. The yearly crop of Rubus berries in Nordic countries, on the other hand, is highly varying as the climate and conditions are varying and overall challenging. The project aims to produce and characterize polyphenolic secondary metabolites, most importantly ellagitannins and proanthocyanidins (syn. condensed tannins) in cell and organ cultures of several Rubus species (Fig 1). The profile and quantity of produced tannins will be modulated and boosted with the use of suitable chemical elicitors and tannin pathway precursors. Tannins found in the cell culture samples will be identified and quantified. The characterization of unknown compounds will mainly be done by high resolution mass spectrometry and NMR spectroscopy. Time-point measurements will be done from the cell culture samples at regular intervals to qualitatively and quantitatively monitor the biosynthesis of tannins and other polyphenols. Figure 1. Production of ellagitannins from cell cultures of cloudberry (Rubus chamaemorus). At the same time, the project will also focus on studying and achieving a better understanding of the poorly known biosynthesis of ellagitannins. This will be done by feeding the Rubus cell cultures different types of various ellagitannins and their biosynthetic precursors. As ellagitannins are not commercially available, they will be isolated and purified for the project from plant material. The tannins produced by the cell cultures will also be studied for their ability to release tannin metabolites when introduced to gut microbiota as much of the health-promoting effects of ETs are due to their metabolism in the gut into e.g. different types of urolithins. The work will be done in collaboration with a team at VTT Technical Research Centre of Finland. Berries have been intensively studied by the VTT group over the past ten years in several 41 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät research projects coordinated by docent Riitta Puupponen-Pimiä, and they have established cell cultures for both several Rubus species and other plants. Main results so far Berry plants of the Rubus genus are commonly reported to contain two main ellagitannins, as well as a myriad of other monomeric and oligomeric ellagitannins. The cell cultures of several Rubus species at VTT, on the other hand, are rich in various phenolic compounds not detected in actual plant samples (Fig 2). Interestingly, proanthocyanidins with high polymerization level were detected in these cell cultures which shows that the cultures have the biosynthetic capacity to form complex tannins. Preliminary studies have also shown the cell culture samples to contain anthocyanins (which are biosynthetic precursors to proanthocyanidins), flavonoids, monogalloyl glucose and several so far unknown secondary metabolites. Monogalloyl glucose is an important part of the biosynthetic pathway of ellagitannins: all ellagitannins are produced via pentagalloyl glucose that needs monogalloyl glucose as the key metabolite in the formation of di-, tri- and tetragalloyl glucoses. Therefore the production of monogalloyl glucose but not yet the other galloyl glucoses or ellagitannins by the cell cultures is of particular interest. Figure 2. UV chromatograms (λ = 280 nm) of a typical Rubus plant sample (left) and of a preliminary cell culture sample (right). The significance of my research for the research group and the whole research field Our research group hasn’t previously done work on cell cultures, which provide an excellent base for biosynthetic studies on ellagitannins and possibly growing platforms for novel ellagitannins. The biosynthetic pathways themselves are not well known, so the results will provide valuable understanding on what happens inside plant cells throughout the growing period. The studies done on ellagitannin metabolite production will provide information on which types of ellagitannins are the most efficient producers of urolithins. This will tell us which compounds could be used to maximize the health benefits of ellagitannins. Together with the in vitro knowledge of the ease of formation of different types of gut metabolites (catechols vs pyrogallols vs urolithins) from the isolated berry tannins, this project will serve as a platform for development of future cell cultures to optimize the production of most potent ellagitannins in other ellagitannin producing berries such as strawberries. Novel components will be discovered and characterized in berry cell cultures, and potentially biofunctional ellagitannins will be identified. If the cell cultures are able to produce fully novel structures, they can be later accumulated into large-scale batch cultures at VTT for further testing by the industry collaborators. 42 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät TANNINS AND OTHER POLYPHENOLS IN GERANIUM SYLVATICUM: ISOLATION, IDENTIFICATION AND BIOLOGICAL SIGNIFICANCE Anu Tuominen Natural Chemistry Research Group, Laboratory of Organic Chemistry and Chemical Biology, Department of Chemistry, University of Turku ankatu@utu.fi Research Director: Prof. Juha-Pekka Salminen Supervisor(s): Doc. Maarit Karonen and Doc. Jari Sinkkonen Funding: Emil Aaltonen Foundation, Turku University Foundation, Department of Chemistry Estimated time of PhD dissertation: 8/2015 Main aims of the PhD research This study originates from the co-operation with ecologists of University of Turku who studied the preference of pollinators and herbivores between female and gynodioecious plants of Geranium sylvaticum. The aim of this study is to characterize tannins in G. sylvaticum and study their biological activity and the variation of tannin content and tannin type among organs, throughout the growing season, between sexual morphs and populations. Then we can better understand what kind of defensive compounds different plant organs contain and what is the role of these compounds in ecological interactions. Main results so far My first two papers describe the organ-specific distribution of water-soluble tannins, flavonoids and phenolic acids in G. sylvaticum and discuss how chemical profiles can reflect different pressures against natural enemies (Fig. 1) [1-2]. This plant is very rich in tannins and other phenolic constituents which content and type vary significantly in different organs. Leaves contain considerably high content (13% of dry weight) of ellagitannin, geraniin. Seasonal and ontogenic variation of tannins in G. sylvaticum was studied using UPLC-DAD-tripleQ-MS and MRM methods which showed that geraniin content in leaves is at the highest during flowering [6]. Proanthocyanidins are more abundant in roots and seeds of this plant [1]. Proanthocyanidin type and size was more deeply studied with off-line 2-dimensional chromatographic analysis using HILIC and RP columns [1-2,5]. The main degree of polymerization in roots and seeds was similar (5-7), but seeds contained mainly procyanidins whereas roots contained also prodelphinidins and mixed oligomers [1,5]. Petals accumulate a unique group of phenolic compounds that were not found in the other plant parts [1]. These compounds compose a totally new group of hydrolysable tannins that contain additional acetylglucose moiety attached to the galloyl groups of galloyl glucoses and chebulinic acid (Fig. 1) [3]. This new hydrolysable tannin group was named as sylvatiins. Sylvatiins showed ability to act as co-pigments of petal anthocyanins by enhancing their color in a large pH scale (Fig. 1) [3]. In fourth paper, a new method was developed to study the stability and oxidation products of selected hydrolysable tannins in basic conditions by HPLC/DAD-ESI/QTOF/MS [4]. Hydrolysable tannins degraded or oxidized rapidly in basic conditions and half-lives were mostly less than 10 min at pH 10. HPLC analyses revealed that various products were formed and identified to be the result of hydrolysis, deprotonation and oxidation. Interestingly, the main hydrolysis product was ellagic acid; also for galloyl derivatives not containing coupled galloyl groups in their initial structures [4]. 43 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät Figure 1. Distribution of polyphenols and biological activity among organs of Geranium sylvaticum and some of the main tannins. The well plate demonstrates co-pigment effect of sylvatiins. The significance of my research for the research group and the whole research field My research fits well to the very core of our research group which is phytochemistry and especially chemically demanding tannins. I have done thorough qualitative and quantitative analysis of G. sylvaticum tannins and this knowledge will aid further utilization of this plant for example in compound isolation. I have developed our existing pro-oxidant activity method so that the oxidation products at basic pH are analyzed with LC-DAD-MS to better understand the reactions that may happen in insect gut. New compounds found from petals broaden compound library of the group and our insight what kind of roles ellagitannins can have in plants. Papers to be included in the PhD thesis 1. 2. 3. 4. 5. 6. Tuominen, A., Toivonen, E., Mutikainen, P., Salminen, J.-P. 2013. Phytochemistry 95: 394407. Tuominen, A., 2013. Phytochemistry 95: 408-420. Tuominen, A., Sinkkonen, J., Karonen, M., Salminen, J.-P., 2015. Phytochemistry, http://dx.doi.org/10.1016/j.phytochem.2015.01.005 Tuominen, A., Sundman, T., 2013. Phytochem. Anal. 24:424-435. Tuominen, A., Karonen, M. 2015. Off-line 2-dimensional chromatographic analysis of proanthocyanidins in Geranium sylvaticum (Manuscript to be submitted to Phytochemistry) Tuominen, A., Salminen, J.-P., 2015. Seasonal and ontogenic variation of tannins and other polyphenols in Geranium sylvaticum (Manuscript to be submitted to Phytochemistry) 44 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät MUTANT APPROACH TO IDENTIFY DEFENSEASSOCIATED PLANT METABOLITES: NMR PROFILING OF ARABIDOPSIS THALIANA Tahereh Jafari Instrument Centre, Department of Chemistry, University of Turku tahjaf@utu.fi Research Director: Prof. Juha-Pekka Salminen Supervisor(s): Dr. Jari Sinkkonen and Dr. Saijaliisa Kangasjärvi Funding: Centre for International Mobility Estimated time of PhD dissertation: 2019 Main aims of the PhD research The main aim of the study is to reveal defense-associated metabolites with potential impact in biotic stress resistance in plant Arabidopsis thaliana. To this end, the metabolomes of wild type, constitutively defense-active pp2a-b’γ mutant and a pp2a-b’γ line complemented by 35S-driven expression of the PP2A-B’γ gene will be compared by NMR. Depending on results first obtained, further analysis will be designed, e.g. using high light stressed or pathogen-infected plants and/or higher order mutants where additional signaling components have been mutated in the pp2a-b’γ background (Figure 1). An additional aim of the study is to characterize as many metabolites from Arabidopsis as possible focusing especially to phenolic compounds and other secondary metabolites. Main results so far Various plant species respond to bacterial infections by producing a range of secondary metabolites that act as deterrents to prevent the pathogen from colonizing the host tissue. In cruciferous plants, like the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis; mouse ear cress), methionine serves as a precursor for glucosinolates, which confer resistance against herbivores and pathogens. Glucosinolates may also be applicable in biotechnology, since they affect the taste of cruciferous crops and have medicinal activity in humans by inhibiting carcinogenesis. Due to the tremendous diversity of plant metabolites, comprehensive view to defense-inducible plant metabolites and their possible impact in biotechnology and medicine, however, remains to be established. In this study, we will utilize the pp2a-b’γ mutant and NMR spectroscopy for detailed view to defense-active metabolites in Arabidopsis. I have started my work at the beginning of October. So far I have learned to use NMR spectrometer and made a lot of testing about the best extraction protocol. I have also done preliminary measurements for wild type and mutant plant materials and found differences with them. I have identified some of the metabolites from NMR spectra. I have grown a large number of plants to make the systematic and statistically valid conclusions, and at the moment I am doing NMR measurements from the plant samples. 45 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät Figure 1. Aradopsis thaliana. Left wild type; right mutant; upside high light; downside growth light. The significance of my research for the research group and the whole research field Identification of bioactive compounds from plants is drawing increasing attention worldwide. This study will utilize Arabidopsis to identify novel defense active metabolites. Once the most interesting candidates have been identified, Arabidopsis offers a powerful system for follow-up studies where the underlying biosynthetic enzymes and their metabolic interactions can be identified. On the chemical side of the work, the candidate metabolites may be isolated and thereafter assessed for their chemical properties and potential biotechnological importance. Papers to be included in the PhD thesis I have started my PhD work few months ago. Therefore I have not got all results for my first paper yet. However as soon as I achieve the results, I will start to write my first manuscript. 46 Kemian kevät 2015 Bio-orgaaninen kemia tutkimusryhmäesittely ja opiskelijoiden abstraktit 2 kpl LuK-tutkielmien abstrakteja 2 kpl FM-erikoistyötä käsitteleviä minijulkaisuja 11 kpl FT-vaiheen etenemisraportteja sekä Radiokemia, PET-keskus 1 kpl FM-erikoistyötä käsitteleviä minijulkaisuja 4 kpl FT-vaiheen etenemisraportteja 47 Kemian kevät 2015 – Tutkimusryhmät BIOMOLEKYYLIEN KEMIAA Prof. Harri Lönnberg Bio-orgaanisen kemian tutkimusryhmä, Orgaanisen kemian ja kemiallisen biologian laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto s-posti: harlon@utu.fi Bio-orgaanisen kemian tutkimus on keskittynyt nukleiinihappojen kemiaan. Keskeisimpinä tutkimuksen kohteina ovat oligonukleotidit ja niiden konjugaatit, siis oligonukleotidit, joihin on kovalenttisesti sidottu niille vieraita rakenneosia. Tavoitteena on ymmärtää miten nukleiinihappoja voidaan tunnistaa ja niiden rakennetta manipuloida, sekä miten suunnitella ja valmistaa oligonukleotidien konjugaatteja solubiologian ja lääkekehityksen tutkimusvälineiksi. RNA:n tunnistus Proteiinisynteesiä ohjaavien lähetti-RNA molekyylien ohella genomi tuottaa runsaasti ns. eikoodaavia ribonukleiinihappoja. Näistä eniten tutkittuja ovat pienikokoiset mikroRNA (miRNA) molekyylit, jotka osallistuvat geeni-ilmentymän säätelyyn, mutta erittyvät myös verenkiertoon toimien siis biologisina merkkiaineina. Niiden rakenne on hiusneulamainen kaksoiskierre, jossa on lisäksi yksi tai useampia pullistumia. miRNA:sta ja niitä rakenteellisesti muistuttavista viraalisen RNA:n osista on tullut uusi lääkekehityksen kohde. Rakenteiden tunnistus perinteisellä kaksoiskierteen muodostumiseen perustuvalla hybridisaatiodiagnostiikalla ei ole mahdollista, koska oligonukleotidit eivät useinkaan pysty avaamaan kaksoiskierteistä rakennetta. Joidenkin pienimolekyyliyhdisteiden, kuten eräiden aminoglykosidien, tiedetään sitoutuvan RNA:n silmukoihin ja pullistumiin jopa nanomolaarisissa konsentraatioissa. Sitoutuminen ei kuitenkaan ole niin valikoivaa, että sitä voitaisiin hyödyntää kemoterapiassa. Konjugoimalla aminoglykosideja emäsjärjestyksen tunnistaviin rakenteeltaan muokattuihin oligonukleotideihin, kuten peptidinukleiinihappoihin, pyritään riittävään selektiivisyyteen. Vuorovaikusta RNA:n kanssa tutkitaan NMR-spektroskooppisesti käyttämällä 19F-leimattuja koettimia. Vaihtoehtoinen tapa lisätä koettimen affiniteettia miRNA:han on korvata yksi tai useampi koettimen emäsosista voimakkaasti metalli-ioneja sitovalla analogilla, jolloin metalli-ionin välittämä koordinatiivinen sitoutuminen lisää muodostuvan kaksoiskierteen pysyvyyttä. Kun metalli-ionina käytetään Pt2+-ionia, jonka ligandien vaihtoreaktiot ovat erittäin hitaita, muodostuu juosteiden välille pysyvyydeltään kovalenttista sidosta vastaava sidos. Kuva 1. Ko-operatiivinen sitoutuminen, jossa toteutuu yhtäaikainen pienmolekyylin sitoutuminen ja hybridisaatio. Luonnolliset emäsparit voidaan korvata myös kenotekoisilla metalliionivälitteisillä emäspareilla. Syntyvät kompleksit ovat optimitapauksessa luonnollisten rakenteiden mukaisesti sekvenssispesifisiä, mutta huomattavasti pysyvämpiä. 48 Kemian kevät 2015 – Tutkimusryhmät Oligonukleotidilääkkeiden kohdentaminen Oligonukleotideja muokataan lääkkeiksi sairauksiin, joita ei kyetä hoitamaan perinteisillä pienimolekyylisillä lääkkeillä. Voidaanko oligonukleotidilääkkeiden kulkua elimistössä ohjata haluttuun elimeen tai kasvaimeen liittämällä niihin kemiallisia osoitelappuja, jotka kykenevät tunnistamaan erilaisten solujen pintarakenteita? Tätä pyritään selvittämään konjugoimalla oligonukleotideja erilaisiin hiilihydraatti-, peptidi- ja bis(fosfonaatti) rakenteisiin, leimaamalla konjugaatit positroniemittoreilla ja seuraamalla niiden kulkua koe-eläimessä yliopiston PETkeskuksessa (PET = positroniemissiotomografia). Kuva 2. Voidaanko oligonukleotidilääkkeiden kulkua elimistössä ohjata liittämällä niihin kemiallisia osoitelappuja, jotka kykenevät tunnistamaan erilaisten solujen pintarakenteita. Antiviraalisten lääkkeiden soluun otto Nukleotidien rakenneanalogit ovat potentiaalisia viruslääkkeitä. Niiden tehokkuutta rajoittaa kuitenkin heikko tunkeutuvuus solukalvon läpi. Aihiolääkestrategioiden tarkoituksena on viedä lääke soluun johdoksena, joka helposti läpäisee solukalvon ja vapautuu sitten entsyymien vaikutuksesta solun sisällä. Vaihtoehtoisesti suojatun johdoksen hydrolyyttinen pysyvyys voidaan räätälöidä sellaiseksi, että ionisen lääkkeen vapautuminen tapahtuu ei-entsymaattisesti pääosin soluun oton jälkeen. Erityisesti oligomeeristen nukleotidien tapauksessa on tarkoituksenmukaista käyttää näiden kahden lähestymistavan kombinaatiota, koska entsyymien kyky hyväksyä aihiolääke substraatikseen alenee nopeasti negatiivisen varauksen kertyessä molekyyliin. Kuva 3. Aihiolääkestrategioiden tarkoituksena on viedä lääke soluun johdoksena, joka helposti läpäisee solukalvon ja vapautuu sitten entsyymien vaikutuksesta solun sisällä. 49 Kemian kevät 2015 – Tutkimusryhmät RNA:n pilkkominen: mekanismeista sovelluksiin Kun RNA:n rakenteen tunnistavaan koettimeen liitetään fosfodiesterisidoksen hydrolyysiä katalysoiva rakenne, saadaan keinotekoinen entsyymi, joka pilkkoo kohde RNA:n ja irtoaa sitten sitoutuakseen seuraavaan kohdemolekyyliin. Stoikiometrinen tunnistus muuttuu näin katalyyttiseksi. Tutkimalla yksityiskohtaisesti kineettisin menetelmin RNA:n fosfodiesterisidoksen hydrolyysin mekanismia ja sen nopeuteen vaikuttavia tekijöitä pyritään kehittämään pienimolekyyliyhdisteitä, jotka entistä tehokkaammin pilkkovat RNA:ta. Kuva 4. RNA:n pilkkominen: mekanismitutkimusta keinotekoisten entsyymien kehittämiseksi Oligonukleotidien synteesi liukoisella kantajalla Oligonukleotidien käytön yleistyminen lääkekehityksessä ja nanoteknologiassa on luonut tarpeen valmistaa niitä entistä suuremmassa mittakaavassa. Yhtenä kustannustehokkaana vaihtoehtona on kiinteän kantajan korvaaminen liukoisella kantajalla, joka voidaan jokaisen kytkentäsyklin jälkeen helposti saostaa siten, että monomeeriset reagenssit jäävät liuokseen, tai ne voidaan erottaa kantajasta nanosuodatuksella orgaanisessa liuottimessa. Tutkimus keskittyy ryhmän aikaisemmin kehittämän tetrapodaalisen kantajan käyttöön, joka voidaan kvantitatiivisesti saostaa metanolilla. Kuva 5. Lyhyen oligonukleotidin suuren mittakaavan synteesi saostettavalla kantajalla. 50 Kemian kevät 2015 – LuK-tutkielmat HIILIDIOKSIDIN TALTEENOTTO JA HYÖTYKÄYTTÖ Asmo Aro-Heinilä Bio-orgaanisen kemian tutkimusryhmä, Orgaanisen kemian ja kemiallisen biologian laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto ajmaro@utu.fi Fossiiliset polttoaineiden käyttö on mahdollistanut ihmiskunnan nopean teollisen kehittymisen nykytasolleen. Näiden polttoaineiden käytössä on hyötyjen lisäksi myös ongelmia; raaka-aine varojen rajallisuus ja poltosta aiheutuvat suuret hiilidioksidipäästöt. Ilmakehän hiilidioksidipitoisuus on noussut teollisuusajan alun 270 ppm:stä nykyiseen 400 ppm:ään. Hiilidioksidi on kasvihuonekaasu, joten pitoisuuden nousun uskotaan olevan yhtenä syynä ilmastonmuutokseen. [1] Kasvavassa väestössä hiilipohjaisten tuotteiden, kuten muovien, lääkkeiden ja liikennepolttoaineiden, tarve tulee kokoajan nousemaan. Fossiilisten polttoaineiden rajallisuuden ja ilmakehän hiilidioksidipitoisuuden nousun hillitsemisen takia on kehitelty erilaisia menetelmiä kerätä hiilidioksidia talteen ja jatkojalostaa siitä tarvittavia hiilipohjaisia tuotteita. KK Kuva 1. Antropogeeninen eli ihmisperäinen hiilen kierto. [1] Tässä tutkielmassa esitellään hiilidioksidin talteenottomenetelmiä suoraan ilmasta ja konsentroiduista lähteistä. Lisäksi tutkielmassa käsitellään talteenotetun hiilidioksidin hyötykäyttöä muuntamalla se metanoliksi. Metanoli soveltuu tähän tarkoitukseen hyvin, koska se on yksinkertainen yhdiste, jota on helppo valmistaa CO2:n hydrogenaatiolla. Tuotetulle metanolille löytyy myös paljon käyttökohteita, sillä se soveltuu hyvin polttoainekäyttöön ja se on yksi tärkeimmistä kemianteollisuuden orgaanisista raaka-aineista. Viitteet 1. Goeppert, A., Czaun, M., Jones, J,Surya Prakash, G. K., Olah, G. A., Chem. Soc. Rev. 2014, 43,7995-8048 51 Kemian kevät 2015 – LuK-tutkielmat MIKRORNA BIOLOGISEN SÄÄTELYN JA HAVAINNOINNIN KOHTEENA Antti Äärelä Bio-orgaanisen kemian tutkimusryhmä, Orgaanisen kemian ja kemiallisen biologian laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto ankaaar@utu.fi MikroRNA:iksi (miRNA) kutsutaan yksijuosteisia noin 22 nukleotidia pitkiä ei koodavia RNAketjuja. Ne osallistuvat geenien ilmentymisen säätelyyn vaikuttamalla translaatioon sekä edistämällä lähetti-RNA:n hajoamista [1]. MikroRNA:ta esiintyy verenkierrossa [2] ja on esitetty, että seerumin miRNA-profiilia voitaisiin käyttää erilaisten tautitilojen diagnosointiin eiinvasiivisesti. Nykyiset miRNA:n polymeraasiketjureaktioon perustuvat kvantifiointimenetelmät ovat kuitenkin hitaita ja verrattain kalliita. Tämän vuoksi onkin tarpeen kehittää uusia edistyneempiä analyysimenetelmiä miRNA:n havaitsemiseksi. Kemialliset koettimet miRNA:n havaitsemiseksi ovat usein yksijuosteisia oligonukleotideja, jotka ovat kiertyneet silmukalliseksi kaksoiskierteeksi. Oligonukleotidiin on liitetty fluoresoiva ilmaisin, jonka fluoresenssi aktivoituu kohde miRNA:n pariutuessa koettimen kanssa. Koettimen havainnointiherkkyyttä voidaan tehostaa entsymaattisesti. Myös nanopartikkeleja, kuten grafeenioksidia tai kultaa, voidaan käyttää apuna miRNA:n havainnoinnissa. MikroRNA:lla on myös terapeuttista potentiaalia. Jos miRNA:n rooli sairauden kulussa tiedetään, voidaan sen esiintymistä ja toimintaa säätelemällä hoitaa sairautta. Synteettisiä miRNAmolekyyleja voidaan käyttää myös vaikuttamaan suoraan geenien toimintaan esimerkiksi syöpäsairauksien yhteydessä. Synteettisiin miRNA-molekyyleihin on kuitenkin tehtävä rakennemuunnelmia tehokkuuden ja pysyvyyden lisäämiseksi. MikroRNA:n toimintaa voidaan säädellä synteettisillä oligonukleotideilla. Nämä niin sanotut antisense-oligonukleotidit estävät miRNA:n normaalia toimintaa pariutumalla sen kanssa tai hajottamalla sitä. Antisene oligonukleotidien hybridisaatioaffiniteettia ja –spesifisyyttä voidaan parantaa muokkaamalla niiden rakennetta. [3] Kuva 1. Orgaaniseen fluoroforiin perustuvan koettimen toimintamekanismi. Viitteet 1. 2. 3. Bartel, D. P, Cell, 2009, 136, 215-233 Chen, X., Ba ,Y., Ma, L., Cai, X., Yin, Y., Wang, K., Guo, J., Zhang, Y., Chen, J., Guo, X., Li, Q., Li, X., Wang, W., Zhang, Y., Wang, J., Jiang, X., Xiang, Y., Xu, C., Zheng, P., Zhang, J., Li, R., Zhang, H., Shang, X., Gong, T., Ning, G., Wang, J., Zen, K., Zhang J., Zhang, C. Y., Cell Res., 2008,18, 997–1006. Li, J., Tan, S., Kooger, R., Zhang, C., Zhang, Y., Chem. Soc. Rev., 2014, 43, 506 52 Kemian kevät 2015 – Erikoistyöt UDP-RIBOOSIN JA UDP-FRUKTOOSIN PILKKOUTUMINEN METABOLISISSA PROSESSEISSA Juho Jaakkola1*, Satu Mikkola1, Petri Tähtinen2 1 Bio-orgaanisen kemian tutkimusryhmä, 2Luonnonyhdistekemian tutkimusryhmä, Orgaanisen kemian ja kemiallisen biologian laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto *juhjaa@utu.fi Abstrakti Erikoistyöni tavoitteena oli tutkia kahta sokerinukleotidia: UDP-riboosia (1) ja UDP-fruktoosia (2) sekä näiden pilkkoutumista. Pilkkoutumisolosuhteet pyrittiin säätämään mahdollisimman lähelle metabolisia olosuhteita käyttäen laimeita happoja ja emäksiä. Työn tarkoituksena oli saada lisätietoa näiden kahden sokerinukleotidin käyttäytymisestä ihmisen elimistössä, jonka avulla voitaisiin mahdollisesti tulevaisuudessa kehittää uusia ja tehokkaampia syöpälääkkeitä. Pilkkoutumistuotteina havaittiin esimerkiksi UMP:n (4) ja UDP:n (5) kaltaisia yhdisteitä sekä pienissä määrin erilaisia riboosin ja fruktoosin pilkkoutumistuotteita. Huomioitavaa on se, että UDP-fruktoosin (2) mittaukset ehdittiin suorittaa ainoastaan emäksisissä olosuhteissa eikä happamissa. 1 2 Kuva 1. UDP-riboosi (1) ja UDP-fruktoosi (2) Johdanto Tutkijat ovat jo vuosia kiistelleet hiilihydraattien käytöstä ruokavaliossa, sillä niiden on havaittu aiheuttavan esimerkiksi liikalihavuutta ja diabetesta [1]. Siitä huolimatta, hiilihydraatit ovat yksi tärkeimmistä ruokaryhmistä elimistössämme, sillä elimistömme pystyy nopeasti vapauttamaan niistä energiaa. Energiaa tarvitaan kehossamme esimerkiksi kasvuun, lihastyöhön, lämmön ylläpitämiseen, aineenvaihduntaan sekä hermoston ja elinten toimintaan. Hiilihydraatit ja niiden hajoamistuotteet vastaavat näiden toimintojen lisäksi solujen tiedonkulusta, jonka takia niitä on alettu käyttämään uudenlaisten syöpälääkkeiden kehittelyssä. Sokerinukleotidit ovat hiilihydraattien hajoamisesta syntyviä yhdisteitä, jotka vastaavat elimistössä erilaisista sokeriaineenvaihdunnan toiminnoista sekä tuottavat elimistölle energiaa. Sokerinukleotidit ovat monosakkaridien aktivoituja muotoja. Tässä erikoistyössä riboosi ja fruktoosi olivat monosakkareita, jotka on aktivoitu nukleotidillä nimeltä uridiini (Kuva 1). Aikaisemmissa tutkimuksissa ei ole tutkittu UDP-riboosin (1) ja UDP-fruktoosin (2) pilkkoutumista vaan on keskitytty tarkemmin muihin samankaltaisiin yhdisteisiin [2]. Esimerkiksi UDP-glukoosin on jo havaittu osallistuvan glykogeenin synteesiin ja galaktoosin aineenvaihduntaan sekä olevan osa aineenvaihduntamme glykosyyli transferaasi – reaktioita. Jotta tulevaisuudessa UDP-riboosia (1) ja UDP-fruktoosia (2) voitaisiin hyödyntää paremmin lääkekehityksessä, täytyy niiden pilkkoutumista ymmärtää paremmin. Näiden syiden takia myös tämä erikoistyötutkimus oli erittäin tärkeää. 53 Kemian kevät 2015 – Erikoistyöt Materiaalit ja menetelmät Kineettiset mittaukset suoritettiin BECKMAN COULTER P/ACETM MDQ kapillaarielektroforeesilla. Kapillaarielektroforeesin lisäksi pilkkoutumistuotteita analysoitiin 1H ja 31 P NMR:n avulla käyttäen Bruker 500 MHz laitteistoa sekä massamittauksilla käyttäen Agilentin 6120 kvadrupoli LC/MS – massaspektrometria. Tulokset ja johtopäätökset UDP-riboosin (1) ja UDP-fruktoosin (2) pilkkoutuminen emäksisissä olosuhteissa tuotti hajoamistuotteina UMP:tä (4) ja UDP:tä (5). Molemmissa tapauksissa päätuotteena näistä kahdesta hajoamistuotteesta oli UMP (4), jota syntyi reaktion loppuvaiheessa vielä lisää UDP:n (5) hajoamisen kautta. UDP-riboosin (1) pilkkoutuminen happamissa olosuhteissa tuotti hyvin samankaltaisia hajoamistuotteita kuin pilkkoutuminen emäksisissä olosuhteissa (Kaavio 1). Kaavio 1. UDP-riboosin (1) pilkkoutuminen emäksisissä ja happamissa olosuhteissa UDP-riboosin (1) pilkkoutuminen tapahtui emäksessä aina riboosin avoketjuisen muodon kautta (3) ja lopulta pilkkoutumistuotteina havaittiin yhdisteiden 4 ja 5 lisäksi ”riboosi-enoni” (6) sekä vapaa fosfaatti (7). UDP-riboosin (1) pilkkoutumisen merkittävänä erona UDP-glukoosiin oli se, että UDP-glukoosi tuotti happamissa olosuhteissa päätuotteena UDP:tä (5), kun taas UDP-riboosi tuotti aina UMP:tä (4). UDP-fruktoosin (2) pilkkoutuminen tuotti yhdisteiden 4, 5, 6 ja 7 kaltaisten hajoamistuotteiden lisäksi muita fruktoosin ja fosfaatin johdannaisia. Viitteet 1. Wrolstad R. E., Food Carbohydrate Chemistry 1. painos; Wiley-Blackwell, 2012 2. Huhta E., Parjanen A., Mikkola S., Carbohydr. Res., 2010, 345, 696-703 54 Kemian kevät 2015 – Erikoistyöt DNA-POHJAINEN ASYMMETRINEN HYBRIDIKATALYYSI DIELS-ALDER –REAKTIOSSA Olli Moisio*, Pasi Virta Bio-orgaanisen kemian tutkimusryhmä, Orgaanisen kemian ja kemiallisen biologian laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto oamois@utu.fi Abstrakti Erikoistyössä tutkittiin DNA:n ja siihen sidotun Cu2+-ionin muodostamien hybridikatalyyttien kykyä toimia stereoselektiivisenä katalyyttinä Diels-Alder –reaktiossa. Erityisesti tarkasteltiin puriinijuosteen Hoogsten-sivuun sitoutuvan kolmannen juosteen vaikutusta katalyysiin. Katalyytit muodostettiin supramolekulaarisesti kupari-bipyridyylikompleksin interkalaation kautta (I) ja sitomalla bipyridyyli kovalenttisesti modifioituun uridiinifosforamidiittiin (II). Reaktiotuotteiden stereomeerijakauman seuraamista varten määritettiin kiraalinen HPLC-systeemi. Parhaimmillaan hybridikatalyytin avulla saavutettiin 71%:n enantiomeerinen ylimäärä endo(+) -isomeerin suhteen. Kuva 1. DNA-pohjaisen hybridikatalyytin muodostus supramolekulaarisesti ja kovalenttisesti. Johdanto Voimakas stereoselektiivisyys ja kyky nopeuttaa reaktiota hyvin miedoissa reaktio-olosuhteissa ovat entsyymeille luonteenomaisia ominaisuuksia, jotka ovat erittäin haluttuja, mutta harvemmin saavutettuja ominaisuuksia myös synteettisten katalyyttien kohdalla. Proteiinipohjaisten entsyymien katalysoimien reaktioiden kirjo on synteettisiin katalyytteihin verrattuna kuitenkin varsin kapea. Hybridikatalyyttien avulla pyritään yhdistämään biopolymeerien stereoselektiiviset ominaisuudet ja siirtymämetallikatalyyttien monipuolisuus. DNA:n ikoninen, oikeakätinen kaksoiskierre on hyvä esimerkki toisesta luonnon tarjoamasta kiraalisesta biopolymeeristä, jonka kykyä toimia stereoselektiivisyyden lähteenä on viime vuosina tutkittu useiden orgaanisten reaktioiden kohdalla1. Erikoistyön hybridikatalyytissä yhdistyvät asymmetrisyyden lähteenä toimiva DNA, sekä substraatin, eli katalyysin kohteen sitova, reaktiota nopeuttava siirtymämetallikeskus (Cu2+) Tutkimuksessa hyödynnettiin sekä synteettistä, että luonnollisista lähteistä saatavaa DNA:ta ja kahta eri menetelmää Cu2+-katalyytin liittämiseksi rakenteeseen. 55 Kemian kevät 2015 – Erikoistyöt Materiaalit ja menetelmät Spesifiset DNA-sekvenssit syntetisoitiin fosforamidiittisynteesillä Applied Biosystemsin 3400 DNA-syntetisaattorilla ja karakterisoitiin MS-spektroskopisesti. Erikoistyössä käytetty luonnollinen DNA (st-DNA:n natriumsuola) on Sigma-Aldrichin kaupallinen tuote. Diels-Alder -reaktion stereomeerijakaumaa seurattiin normaalifaasikromatografisesti isokraattisella virtauksella (1-5% isopropanoli/heksaani) Phenomenexin kiraalisella Lux® Cellulose-1 -kolonnilla. Tulokset ja johtopäätökset Kuparikatalysoitu Diels-alder reaktion reaktioseos tuotti vedessä ilman DNA:n läsnäoloa oikealla esitetyn kromatogrammin (1% iPrOH/heksaani) mukaisen stereomeerijakauman (95:5 endo/exo, 1:1 +/-). Supramolekulaarisesti muodostettu katalyytti (ON 1) tuotti 71% enantiomeerisen ylimäärän endo(+)-isomeerin suhteen. Kolmannen DNA-juosteen lisääminen katalyytin rakenteeseen (ON 2) alensi ylimäärän 19 %:iin. Luonnollisen, kokeen kannalta satunnaisen sekvenssin omaava st-DNA tuotti 15% enantioylimäärän. Heikomman streoselektiivisyyden arveltiin johtuvan sen sisältämän natriumin kaksoiskierrettä stabiloivasta vaikutuksesta. Jatkotutkimuksia varten syntetisoitiin jodouridiinista bipyridyylimodifioitu fosforamidiitti, jota käytettiin onnistuneesti rakennusosana DNA- Kuva 2. DA–reaktion kiinteäkantajasynteesissä. kromatogrammi (ei DNA:ta). Taulukko 1. Stereomeerijakauma erilaisille hybridikatalyyteille. Oligonukleotidi endo/exo endo + [% ee] Ei DNA:ta 95:5 ei ylimäärää st-DNA (natriumsuola) 96:4 15 ON 1: 98:2 71 ON 2: 97:3 19 Reaktio-olosuhteet: 2.0 mM DNA (emäsparien suhteen), 0,33 mM [Cu(bipy)(NO3)2, 1 mM dienofiili ja 15 mM syklopentadieeni MOPSpuskurissa (20 mM, ph 6,5). *ON2: Kakodylaattipuskuri (20 mM, pH 5.0) Kuva 3. Jodouridiinista johdettu katalyytti, jossa kovalenttisesti sidottu bipyridyyli. Viitteet 1. Park, S.; Sugiyama, H. Angew. Chem. Int. Ed.. 2010, 49, 3870–3878. 56 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät METAL CHELATES ENHANCING OLIGONUCLEOTIDE HYBRIDISATION Oleg Golubev Bioorganic Chemistry Research Group, Laboratory of Organic Chemistry and Chemical Biology, Department of Chemistry, University of Turku olegol@utu.fi Research Director: Prof. Harri Lönnberg Supervisor(s): Dr. Tuomas Lönnberg Funding: National Graduate School of Organic Chemistry and Chemical Biology; University of Turku research grant fund; Turun yliopistosäätiö. Estimated time of PhD dissertation: 12/2015 Main aims of the PhD research The objective of the PhD research is to develop metal-ion-binding surrogate nucleosides, the base moieties of which serve as tridentate ligands for soft metal ions and the resulting complexes bind tightly and selectively to natural nucleic acid bases within nucleic acids. Incorporation of such surrogate nucleosides to oligonucleotides hopefully leads to short oligonucleotide probes that hybridize with native DNA or RNA oligonucleotides with an enhanced affinity, while retaining the high sequence specificity of the natural nucleic acids. Such probes would be particularly useful in recognition of short non-coding RNAs, such as micro-RNA that gain ever increasing interest as a biomarker and target of drug development. Main results so far Screening for potential metallo-nucleobases by NMR titrations. Screening for potential metallonucleobases by NMR titrations. Four metal-ion-binding nucleosides, viz. 2,4-bis(3,5-dimethyl-1Hpyrazol-1-yl)-5-(β-D-ribofuranosyl)pyrimidine (1), 2,4-bis(1-methylhydrazinyl)-5-(β-Dribofuranosyl)-pyrimidine (2), 2,6-bis(1-methylhydrazinyl)-9-(β-D-ribofuranosyl)-9H-purine (3), and 6-(3,5-dimethyl-1H-pyrazol-1-yl)-9-(β-D-ribofuranosyl)-9H-purine (4) have been synthesized (Fig.1). The ability of these nucleosides and the previously prepared 2,6-bis(3,5-dimethyl-1Hpyrazol-1-yl)-9-(β-D-ribofuranosyl)-9H-purine (5) to form Pd2+ mediated complexes with canonical nucleosides and nucleoside 5´-monophosphates has been studied by 1H NMR spectroscopy [1,2]. Fig. 1. Structures of the metal-ion-binding nucleosides 1-5 used in the present studies. 57 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät To learn more about the underlying principles of metal-ion-mediated recognition of nucleic acid bases, chlorido complexes of 6-11 were prepared (Fig.2) and their interaction with nucleoside 5´monophosphate (NMP) has also been investigated by 1H NMR spectroscopy. In all cases, the binding sites within the nucleobases were assigned on the basis of Pd2+ induced changes in chemical shifts of the base moiety proton resonances. The selectivity obtained by varying the hydrogen bonding properties and size of the ortho-substituents of Pd2+-bound pyridine ligands was rather modest [3]. Fig. 2. 2,6-Disubstituted pyridine Pd2+ complexes used to study the discrimination of nucleobases by metal-ion-mediated base-pairing. Metal-ion-mediated hybridization of modified oligonucleotides. The potential of three modified purine bases, namely, 6-(3,5-dimethylpyrazol-1-yl)purine, 2-(3,5-dimethylpyrazol-1yl)hypoxanthine, and 2-(3,5-dimethylpyrazol-1-yl)adenine were incorporated in the middle of 9mer 2′-O-methyl oligonucleotides and the hybridization of these modified oligonucleotides with their unmodified counterparts studied by UV and CD spectrometry in the absence and presence of Cu2+ or Zn2+[4]. All of the modified oligonucleotides formed more stable duplexes in the presence of divalent metal ions than in the absence thereof, but with different preferences for the complementary oligonucleotide. The objective of the final part of my PhD studies is to find metal ion complexes that could discriminate between natural nucleobases upon double helix formation, oligonucleotides carrying a Pd2+ ion with vacant coordination sites at a predetermined position will be synthesized and their affinity to complementary as well as mismatched counterparts quantified by UV-melting measurements. In the first stage, the most promising candidates of the monomer studies 6-11 will be converted into phosphoramidite building blocks, which are then introduced into oligonucleotides on solid support. For more facile synthesis of these modified building blocks, GNA, rather than DNA or RNA, backbone will be used in these studies. The significance of my research for the research group and the whole research field Non-coding RNAs, in particular microRNAs (miRNA) are emerging as novel targets of diagnostics and chemotherapy. Owing to the short length and stable double helical hairpin structure, their recognition and/or intervention of their biological action by conventional hybridization by WatsonCrick base-pairing is not possible. My studies bring basic information about the feasibility of enforcing the sequence selective hydridization by exploitation of metal-ion-binding surrogate bases within the oligonucleotide probes, in particular about the use of Pd2+-mediated binding for the purpose. Papers to be included in the PhD thesis 1. 2. 3. 4. O. Golubev, T. Lönnberg and H. Lönnberg, Helv. Chim. Acta, 2013, 96, 1658-1669 O. Golubev, T. Lönnberg and H. Lönnberg, J. Inorg. Biochem., 2014, 139, 21-29 O. Golubev, T. Lönnberg and H. Lönnberg, Molecules 2014, 19, 16976-16986 S. Taherpour, O. Golubev and T. Lönnberg,. J. Org. Chem., 2014, 79, 8990-899 58 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät IMPROVED 19F NMR SENSORS FOR THE CHARACTERIZATION OF DNA AND RNA SECONDARY STRUCTURES AND OF THEIR COMPLEXES WITH NOVEL DRUG CANDIDATES Lotta Granqvist ltgran@utu.fi Bioorganic Chemistry Research Group, Laboratory of Organic Chemistry and Chemical Biology, Department of Chemistry, University of Turku Research Director: Prof. Harri Lönnberg Supervisor(s): Dr. Pasi Virta Funding: Doctoral Programme in Physical and Chemical Sciences Estimated time of PhD dissertation: 2017 Main aims of the PhD research 19 F NMR spectroscopy is a promising tool for the characterization of molecular interactions, secondary structural arrangements, and their dynamics in oligonucleotides. 19F NMR spectroscopy gives quantitative information about molar ratios of the secondary structural species and it usually is clearly superior for the detection of processes, which are too dynamic in spectrophotometric terms. The goals of this research project are (1) to develop novel high-fluorine-content sensors, which reliably detect RNA and DNA secondary structures at micromolar concentrations, (2) to apply these sensors for the characterization of molecular interactions involved in RNA and DNA and (3) to use this knowledge for the design of novel RNA and DNA targeting molecules. Main results so far A fluorine sensor (1) for DNA has been synthesized and it's applicability in an automated DNA/RNA-synthesis has been verified. This sensor bears three magnetically equivalent fluorine atoms, which don't couple to neighbouring protons, and hence the sensor allows 19F NMR experiments to be performed at micromolar oligonucleotide concentrations. The sensor 1 is primaly designed for the detection of DNA secondary structures, which has been demonstrated by the 19F NMR spectroscopic monitoring of DNA-triplex/duplex/single strand conversion (figure 1).The experiments with HIV-1 TAR model have shown that the sensor is informative also in the RNA environment. [1] Figure 1. 19F NMR signals of sensor 1 in different DNA hybridization modes. 59 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät In addition, potential fluorine sensors for RNA have been synthesized, and the ongoing work is focused to the 19F NMR-based detection of RNA secondary structures. The significance of my research for the research group and the whole research field One of the main interests of the laboratory is the applications of modified oligonucleotides or oligonucleotide-related oligomers. 19F NMR spectroscopy gives an additional tool to characterize their interactions with RNA- or DNA-targets. The main advantage is the detailed information, which may be provided even in local environmental level. Our recent results have e.g. revealed new or unexpected information about the strand-invasion that takes place, when hairpin-type microRNAs are targeted with an exterior single strand (i.e. an invader oligonucleotide). These results are significant in the field of oligonucleotide chemistry in general. Papers to be included in the PhD thesis 1. Granqvist, L. and Virta, P. J. Org. Chem. 2014, 79, 3529-3536. 60 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät CELL SPECIFIC TARGETING OF THERAPEUTIC OLIGONUCLEOTIDES WITH COVALENT CONJUGATION Satish Jadhav Bioorganic Chemistry Research Group, Laboratory of Organic Chemistry and Chemical Biology, Department of Chemistry, University of Turku satjad@utu.fi Research Director: Prof. Harri Lönnberg Supervisor(s): Dr. Päivi Poijärvi-Virta and Dr. Pasi Virta Funding: Erasmus Mundus Action II (EXPERTS), Finnish Cultural Foundation, Doctoral Programme in Physical and Chemical Sciences. Estimated time of PhD dissertation: 12/2015 Main aims of the PhD research Aim of the PhD research is the development of cells specific therapeutic oligonucleotide delivery methods by covalent conjugation. The major obstacle to the use of therapeutic RNAs is the internalization of the large anionic oligonucleotides across the plasma membrane of the cells. In PhD studies the applicability of the different receptor based strategies for cell-specific targeting and internalization of therapeutic oligonucleotides are studied: Carbohydrates, Bisphosphonate are conjugated to PET labelled oligonucleotides by covalent conjugation. Main results so far First project was the synthesis of multi-galactose-conjugated 2’-O-methyl oligoribonucleotides (fig. 1) and their in vivo imaging with positron emission tomography in rat. Protected 1,4,7triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid (NOTA) precursor bearing a 4-[4-(4,4 ́dimethoxytrityloxy)butoxy]phenyl side arm was first immobilized via a base labile linker to the support and the oligonucleotide was assembled on the detritylated hydroxyl function of this handle. One, three or seven galactopyranosides conjugated to 5’-terminus by coupling phosphoramidite building block bearing two phthaloyl protected aminooxy groups and one protected hydroxyl function. In vivo imaging in rats with PET showed remarkable galactose-dependent liver targeting of the conjugates1. Figure 1. Structure of the tri and, hepta galactose -oligonucleotide conjugates A second project was the synthesis of hyaluronic acid oligosaccharides-ribonucleic acid conjugation (fig. 2) and their in vivo PET imaging in rat. Hyaluronic acid hexasaccharide had been prepared from HA disaccharides by using trichloroacetimidate activated glycosylation method and TMSOTf as a glycosylation activator. The critical deprotection step e.g. deprotection of trichloroacetyl amide functional group was carried out in ammonolysis reaction condition. We had synthesized the hyaluronic acid hexasaccharide, tetrasaccharide, and maltohexaose oligonucleotide conjugates with 61 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät NOTA ligand efficiently by using copper free clik reaction. In vivo PET imaging showed biodistribution of intravenously injected 68Ga-NOTA-anti-miR-15b-conjugates varied notably with the structure. Results of this work will be submitted to journal very soon. Figure 2. Structure of the hyaluronic acid-oligonucleotide conjugates The third project is the synthesis of bone targeting bisphosphonate oligonucleotide conjugates (fig. 3). Bisphosphonate drug, alendronate azide derivate was prepared and subsequent copper free click chemistry for preparation of oligonucleotide conjugates is carried out. Currently the synthesis of both bisphosphonate oligonucleotides conjugates is completed and further studies of preclinical tests are in progress at Turku PET center and Dept. of Biomedicine, University of Turku. Figure 3. Structure of the Alendronate-oligonucleotide conjugates Fourth project, synthesis of chondroitin sulfate-fluorophore conjugates (fig. 4) and their binding/uptake studies in neuronal cells. Syntheses of CS tetrasacharide and disaccharide fluorophore conjugates are carried out by very efficient method using orthogonal copper free click reaction and their cellular uptake/binding in primary neuronal cell culture are studied. This manuscript is under preparation. Figure 4. Structures of the chondroitin tetrasaccharide-flurophore conjugate. The significance of my research for the research group and the whole research field In continuation of the research program at our research group for the development of oligonucleotide conjugation strategies, my research could produce orthogonal oligonucleotide conjugation methods with interest of various preclinical tests by using PET studies. Papers to be included in the PhD thesis 1. Mäkilä, J., Jadhav, S., Kiviniemi, A., Käkelä, M., Liljenbäck, H., Poijärvi-Virta, P., LaitalaLeinonen, T., Lönnberg, H., Roivainen, A., Virta, P. Bioorg. Med.Chem 2014, 22, 6806-6813. 62 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät SOLID-SUPPORTED SYNTHESIS OF MULTIPODAL SCAFFOLDS FOR GLYCOTARGETING Marika Karskela Bioorganic Chemistry Research Group, Laboratory of Organic Chemistry and Chemical Biology, Department of Chemistry, University of Turku mimlepp@utu.fi Research Director: Prof. Harri Lönnberg Supervisor(s): Dr. Pasi Virta Funding: Doctoral Programme in Physical and Chemical Sciences, Department of Chemistry, Instrument Center, Magnus Ehrnrooth Foundation, Turku University Foundation. Estimated time of PhD dissertation: 2016 Main aims of the PhD research I have studied methods to conjugate carbohydrates with other bioactive molecules, e.g. oligonucleotides and peptide structures. The main aim is to create conjugates that enable cell-type specific targeting and enhanced cell penetration of therapeutic compounds, driven by the selective binding between carbohydrates and cell surface sugar-binding proteins, lectins. Carbohydrate– protein interactions are responsible for the initiation of numerous physiological processes. Synthetic carbohydrate clusters, i.e. glycoclusters, are potential tools for the utilization and modification of these recognition events. Synthetic clusters may also inhibit unwanted interactions in auto-immune diseases or block microbial infections on cell surface. Model compounds aim to mimic natural glycostructures that bind to protein receptors. Their binding properties can be modified through their chemical structures. Multivalency is generally preferred in nature and is required for high affinity and specificity. To synthesize glycoclusters, multifunctional building blocks, i.e. scaffolds are needed. Hence, other aim of this study was to develop such scaffolds to which several carbohydrates can be covalently attached. Particularly of interest was the controlled, orthogonal attachment of dissimilar carbohydrates to create heterotypic clusters. Main results so far Diverse multipodal scaffolds were synthesized to build homotypic and heterotypic glycoclusters. These clusters were further conjugated with oligonucleotides or peptide structures using oximation or peptide couplings. All glycoconjugates were synthesized entirely on solid support, followed by release and deprotection, RP HPLC purification, and MS & NMR (only peptide conjugates) characterization. The synthesis of oligonucleotide glycoconjugates involved either stepwise ligation of prefabricated glycoclusters to growing oligonucleotide chain (in 1, Fig. 1.) [1] or ligation of several disaccharides simultaneously (in 2) [2]. Prefabricated homotypic clusters in 1 were prepared using Cu(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloaddition (i.e. click) reaction. Aldehyde-functionalized glucose and mannose clusters were ligated to the oligonucleotide chain through oximation with aminooxyfunctionalized nucleotide branching units.[1] Another approach utilized hyaluronan which is the main ligand for transmembrane glycoprotein CD44 that is overexpressed in many cancers. Hyaluronan disaccharides of 2 were studied as mediators of cellular delivery through receptor mediated endocytosis in vitro.[2] Disaccharides were ligated to chain using oximation. With this assembly only unspecific cellular entrance was detected although hyaluronan conjugates have been detected to increase the uptake of cancer drugs to cancer cells. 63 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät We have also developed various methods for the preparation of heterotypic glycoclusters. These have been synthesized using mainly peptide coupling chemistry to create structures with branched (in 3)[3] or cyclic (in 4)[4] peptide scaffolds. Also the aglycon moieties can contribute to high-affinity binding to lectins through peptide-peptide interactions. Hence, this creates an additional dimension to the diversity of the clusters. The branched glycocluster in 3 was further conjugated with a biotin ligand to allow convenient immobilization on avidin- or streptavidincoated surfaces.[3] The approach should be extendable to conjugation of the clusters with any aminooxy-functionalized compound. Figure 1. Structures of the glycoconjugates. Ligations with click reaction shown in blue color, oximation in orange, and peptide couplings of the sugar units in green. The significance of my research for the research group and the whole research field My research is part of our research program to develop cell specific delivery methods for therapeutic oligonucleotides. This study includes developing of methods and model compounds for the needs of basic research. Synthetic glycoclusters and their conjugates have been studied by several research groups during last decades but the synthesis of heterotypic clusters, containing dissimilar sugar units in same cluster, remains less studied. Papers to be included in the PhD thesis 1. 2. 3. 4. Karskela, M., Helkearo, M., Virta, P., Lönnberg, H. Bioconjugate Chem. 2010, 21, 748-755. Karskela, M., Virta, P., Malinen, M., Urtti, A., Lönnberg, H. Bioconjugate Chem. 2008, 19, 2549-2558. Karskela, M., von Usedom, M., Virta, P., Lönnberg, H. Eur. J. Org. Chem. 2012, 33, 65946605. Virta, P., Karskela, M., Lönnberg, H. J. Org. Chem. 2006, 71, 1989-1999. 64 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät NUCLEOTIDES AS ANTIVIRAL COMPOUNDS: ON THE FEASIBILITY OF AN ESTERASE-DEPENDENT PRODRUG STRATEGY FOR 2-5A Emilia Kiuru Bioorganic Chemistry Research Group, Laboratory of Organic Chemistry and Chemical Biology, Department of Chemistry, University of Turku emilia.kiuru@utu.fi Research Director: Prof. Harri Lönnberg Supervisor(s): Dr. Mikko Ora Funding: Alios Biopharma, Doctoral Programme in Physical and Chemical Sciences, Department of Chemistry Estimated time of PhD dissertation: 2015 Main aims of the PhD research Analogues of nucleotides and oligonucleotides constitute a promising class of therapeutic agents. The efficiency of phosphate based drugs, however, largely depends on the prodrug strategy used to enhance their cellular uptake. The basic idea with most of the prodrug strategies is that the negative charges of the phosphate groups are kept masked in plasma and restored by an enzyme-triggered removal of the protecting groups inside the cell. The primary aim of the thesis was to evaluate the feasibility of a prodrug strategy, based on esterase-labile protecting groups, for an antiviral compound called 2-5A, which is a short 2´,5´-linked oligoribonucleotide. In spite of the success of the esterase-dependent prodrug strategies, they still suffer from one major shortcoming. The enzymatic deacylation is markedly retarded upon accumulation of negative charge on the substrate, which is the case with molecules having several phosphodiester linkages. Another general problem is that biodegradation of the prodrugs often releases potentially toxic by-products, for example, formaldehyde and electrophilic alkylating structures are typically formed. For these reasons, development of protecting groups, which are not dependent on enzymatic activation and do not liberate toxic compounds, appeared highly desirable. Main results so far Two different oligoadenylate trimers 1 and 2 (Figure 1.), protected with esterase-labile protecting groups, were synthesized as prodrug candidates for the short oligoribonucleotide 2-5A and the multistep release of 2-5A by carboxyesterases was studied.[3] In addition, measurements were made with protected adenylyl-2´,5´-adenosines [2], and thymidine 5´-monophosphates [1] to optimize the structures of esterase-labile protecting groups. The protecting group scheme of the prodrug candidates was based on 3-acetyloxy-2,2-bis(ethoxycarbonyl)propyl group for the protection of the phosphate groups and acyloxymethyl groups for the protection of 3´-hydroxyl groups adjacent the phosphodiester linkages. The results demonstrated that the deprotection of 25A, bearing four esterase-labile protecting group, became significantly slower upon accumulation of negative charge. The 3-acetyloxy-2,2-bis(ethoxycarbonyl) propyl groups, did not function as protecting groups for the 5´-terminal phosphate and the 2-5A prodrug candidate I (1) was never converted to the desired 2-5A. The situation was markedly improved when the distance between the enzyme cleavage site and the negative charge was increased and a considerable proportion of 2-5A having a bis(3-acetyloxymethoxy-2,2-bis(ethoxycarbonyl)propyl) protected 5´-terminal phosphate, was released from the 2-5A prodrug candidate II (2). The removal of the protecting groups still seemed to be too slow, leading to formation of several by-products. For the reason, a feasible prodrug strategy could be found on thermolabile protecting groups. The applicability of six novel 65 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät 2,2-disubstituted 4-acylthio-3-oxobutyl groups as protecting groups of phosphodiester linkages was studied.[4,5] Appropriately protected nucleoside 5´-methyl phosphates 3a-b, 4a-c and 5 were prepared as model compounds and the enzymatic and non-enzymatic removal of such groups was followed at pH 7.5 and 37 °C. The protecting groups are cleaved by esterases, but they undergo thermolytic removal in case the enzymatic reaction becomes retarded. The branched structure allows tuning of the deprotection rate by varying the structure of 2-substituents. The released protecting groups did not form adducts with glutathione and thus, most likely are not markedly alkylating. The developed protecting groups are expected to be useful as protecting groups of oligonucleotides and compounds containing several phosphodiester linkages. Figure 1. Structures of the protected 2-5A trimers (1, 2) and nucleoside 5´-methyl phosphates (3-5). The significance of my research for the research group and the whole research field The research area of Bioorganic Group is focused on chemical biology of nucleic acids, among other things in the synthesis and characterization of structural analogues and conjugates of oligonucleotides, as well as investigation of their exploitation as therapeutics. My research contributes to the development of knowledge on the synthesis of novel antiviral prodrugs based on nucleotides and short oligoribonucleotides. The developed prodrugs having esterase- and thermolabile protecting groups may significantly enhance the therapeutic potential of such drugs by facilitating their cellular uptake. Papers to be included in the PhD thesis 1. 2. 3. 4. 5. Ora, M., Taherpour, S., Linna, R., Leisvuori, A., Hietamäki, E., Poijärvi-Virta, P., Beigelman, L., Lönnberg, H. J. Org. Chem. 2009, 74, 4992–5001. Kiuru, E., Ora, M., Beigelman, L., Blatt, L., Lönnberg, H. Chem. Biodiversity 2011, 8, 266286. Kiuru, E., Ora, M., Beigelman, L., Blatt, L., Lönnberg, H. Chem. Biodiversity 2012, 9, 669688. Kiuru, E., Ahmed, Z., Lönnberg, H., Beigelman L., Ora, M. J. Org. Chem. 2013, 78, 950-959. Kiuru, E., Lönnberg, H., Ora, M. Helv. Chim. Acta 2013, 96, 1997-2008. 66 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät SOLUTION PHASE SYNTHESIS OF SHORT DEOXYOLIGONUCLEOTIDES ON PRECIPITATIVE TETRAPODAL SOLUBLE SUPPORT Vyacheslav Kungurtsev Bioorganic Chemistry Research Group, Laboratory of Organic Chemistry and Chemical Biology, Department of Chemistry, University of Turku vyakun@utu.fi Research Director: Prof. Harri Lönnberg Supervisor(s): Dr. Pasi Virta and Prof. Harri Lönnberg Funding: Marie Curie Actions MEMTIDE, Doctoral Programme in Physical and Chemical Sciences. Estimated time of PhD dissertation: 2016 Main aims of the PhD research The ultimate objective for the project was to make a paradigm shift in the technology used for the synthesis of oligonucleotides by coupling the organic solvent nanofiltration (the technique using membranes to discriminate between molecules present in homogeneous solution with novel soluble supports into a breakthrough technology – membrane enhanced synthesis. The development of protocols to make novel soluble supports and new blockwise strategies for assembly of deoxyoligonucleotides on a soluble support allows to advance the use of solution phase synthesis of DNA oligomers. Main results so far The growing oligonucleotides, which are tetrahedrally branched from a pentaerythritol-derived core (Fig. 1 A), were found to precipitate virtually quantitatively from methanol; a feature that could be utilized as a purification step in the liquid-phase synthesis. Two precipitations are needed in each coupling cycle when using commercially available phosphoramidite building blocks: one after the oxidation step and the second after removal of the 5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl) protecting group. Couplings using a small excess (1.5 equiv. of a nucleoside phosphoramidite per 5’-OH group) of the standard 5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-protected phosphoramidite building blocks proved efficient, and purification of the products could be carried out by simple precipitation (over 90% of the products usually gained) in methanol. Ammonolysis gave nearly homogeneous nucleotide trimers (CCT, GCT, ACT) in ca. 70% yield and a pentamer (AGCCT) in 43% yield. A B Figure 1. Structures of the soluble supports developed The protocol employed still suffered from some minor side reactions, including traces of premature cleavage of the 2-cyanoethyl and benzoyl protecting groups and depurination of 2´-deoxyadenosine upon acidolytic removal of the 5´-O-(4,4´-dimethoxytrityl group. For these reasons, and to avoid the 67 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät oxidation step, the feasibility of phosphotriester chemistry using 3´-(1-benzotriazoly-1-yl 2chlorophenyl) phosphotriesters as building blocks was studied. The method5 is based on 1methylimidazole promoted assembly of appropriately protected nucleoside 3´-(benzotriazol-1-yl 2chlorophenyl phosphates. All small molecules are removed after each coupling and 5´-Odetritylation by precipitating the support with MeOH. On using 2 equiv. of building blocks per 5´OH trimers (CCT, AAT, GGT, TTT) have been obtained in 70% isolated yield and pentamer (CGCAT) containing all four nucleosides in 55% isolated yield calculated according to UVabsorbance. Clustered nucleosides (1) have successfully been used as a support for the synthesis of short oligonucleotides in solution [2, 3]. The modular structure of the cluster allows varying both the linker and nucleoside parts. In order to meet the conditions at which the grown oligomer could be released in a fully protected form, hydroquinone-O,O’-diacetic acid was exploited as a linker (Fig. 1 B). As a proof of concept, a thymidine-derived cluster was used as a soluble support for the synthesis of a CTT-trimer by the bisOBTp based phosphotriester approach [4]. The support demonstrated excellent quantitative precipitation in MeOH and the desired cluster bearing CTT-trimer was obtained in high yield (87 %). The hQ-linker is cleaved under very mild basic conditions allowing base protections to stay intact. However, when an analytical sample of the cluster bearing the protected CCT-trimer was treated with the proposed 0.05 M K2CO3 in MeOH, not only the removal of benzoyl protections was observed, but phosphate linkages were cleaved as well. By decreasing the concentration of K2CO3 by a factor of 10, the expected result was achieved. The DMT-COBzTT3’-OH was obtained in a homogeneous form. Two clusters containing purine nucleosides, viz. fully protected 5´-TAT-3´ and 5´-AGT-3´, were then synthesized by the same bisOBTp promoted phosphotriester approach. All three clusters were treated in bigger scale with 0.005 M potassium carbonate in MeOH and the resulted DMTCBzTT, DMT-TABzT, DMT-ABzGiBuT were quantitatively released and isolated by flash column chromatography in very high yields (95-99 %) in hundreds of miligrams scale. To test the applicability of the fully protected trimers as a building blocks in oligonucleotide synthesis, the DMT-TTABz was synthesized by the same phosphotriester method, cleaved with 0,005 M K2CO3 in MeOH, phosphorylated with bisOBTp and allowed to react with 1. The cluster obtained bearing the protected TTTA-tetramer was detritylated and the oligonucleotide was released and precipitated as a sodium salt in absolute ethanol. The nearly homogeneous 5’-ATTT-3’ tetramer obtained in 67 % yield (according to UV) was analysed by RP HPLC and mass spectrometry. The significance of my research for the research group and the whole research field The developed novel soluble supports and synthetic protocols are useful for the production of short oligonucleotides on a scale of hundreds of milligrams without the need for any special equipment. Bearing in mind upcoming purification methods like OSN the methods allow nearly immediate implementation due to proposed very high rejection value for the soluble supports developed. Nowadays the need for fully protected trinucleotide-building blocks has arisen. They are required in oligonucleotide-directed mutagenesis and used to create combinatorial peptide or antibody libraries. Papers to be included in the PhD thesis 1. 2. 3. 4. Molina, A.G.; Kungurtsev, V.; Virta, P.; Lönnberg, H. Molecules 2012, 17, 12102-12120. Kungurtsev, V., Laakkonen, J., Molina, A. G. and Virta, P. (2013), Eur. J. Org. Chem., 2013, 29, 6687–6693. Kungurtsev, V., Virta, P and Lönnberg H. (2013), Eur. J. Org. Chem., 2013, 35, 7886–7890. Kungurtsev, V., Lönnberg H. (2015) Synthesis and application of deoxytrinucleotide building blocks on precipitative soluble support (in progress). 68 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät CHEMICAL MODELS FOR RNA CLEAVAGE Luigi Lain Bioorganic Chemistry Research Group, Laboratory of Organic Chemistry and Chemical Biology, Department of Chemistry, University of Turku luigi.lain@utu.fi Research Director: Prof. Harri Lönnberg Supervisor(s): Dr. Tuomas Lönnberg Funding: Marie Curie ITN, Doctoral Programme in Physical and Chemical Sciences, Department of Chemistry Estimated time of PhD dissertation: 11/2015 Main aims of the PhD research The work is aimed at improving our understanding on the mechanisms of RNA phosphodiester bond transesterification (Figure 1), and clarifying with the aid of chemical models the underlying principles of the catalysis of this reaction by ribozymes and protein enzymes. While the general course of the reaction has been known for decades, and widely studied due to its biological importance, the complex free energy landscape of the reaction is still not completely understood, and even less well as regards interactions with other chemical entities. Figure 1. Reactions of cleavage and isomerization at the RNA phosphodiester bond Main results so far In the first part of the work [1], a structurally modified dinucleotide, 1, was synthesized and its reactions studied over a wide pH-range. It was found that the aminomethyl groups at C4´ of the 3´linked nucleoside by a rich and complex interaction with the phosphate group and/or the phosphorane intermediate resulted in very different rates of cleavage and isomerization for the two isomers, and even different mechanisms depending the protonation state of the amino groups. The highest rate acceleration was achieved with the 3’ isomer at moderately alkaline pH (deprotonated amines), with a thousand-fold increase over the background rate of hydrolysis for the unmodified 69 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät dinucleotide uridylyl-3´,5´-uridine (UpU). Mechanistic explanations for the observed changes in reaction rates were given. The second part [2] dealt with the buffer catalysis of UpU transesterification of amine buffers in 80% DMSO. In water, the hydroxide ion concentration of these buffers is much higher, and the specific base catalysis predominates over the buffer catalysis. DMSO suppresses the autoprotolysis of water, allowing one to study the catalysis by the buffers. Modest rate enhancements on the cleavage have been found. No direct correlation was observed between the pKa of the amines and their catalytical activity, but for the more acidic amines a completely different mechanism takes place. The data was compared to similar studies made on a nucleotide analogue having an aryl leaving group in place of the 5´-linked nucleoside. The third part [3] of the work is rather similar to the first part. For comparative purposes, the modified dinucleotide 2 was prepared and its reactions were studied over the whole pH range. The aim was to learn more about the nature of interaction of hydroxyl, amino and ammonium functions with the phosphorane intermediate: to what extent the observed rate-accelerations were caused by acid-base catalysis, hydrogen bonding, or electrostatic field effects. Surprisingly, the activity of 2 was only marginally different from that of UpU, which seems to rule out hydrogen bonding as the cause of intramolecular catalysis by ammonium groups. The fourth paper is as yet unpublished. The subject is the catalysis of UpU cleavage by cyclenbased cleaving-agents 3a and 3b. These compounds are previously known, but used only for complexing with Zn2+. They turned out to have a surprisingly strong catalytic effect, with rate accelerations over four orders of magnitude. The mechanism hasn’t been fully clarified, but there is strong support for one of the cyclens binding the uracil ring, with the other performing the catalysis; the isolated cyclens are catalytically inactive, and the transesterification is not catalyzed on adenosine. Given the serendipitous nature of the discovery, it is likely that such a catalytical activity can be further enhanced. Figure 2. Structures of some of the compounds used in the PhD work. For 1 and 2, the structural modifications introduced over a regular dinucleotide are marked in red The significance of my research for the research group and the whole research field My work provides new insight on the mechanisms of RNA transesterification catalyzed by acids and bases. It helps establishing how strategically placed amino groups interact with the phosphodiester bond. That knowledge increases our comprehension of how RNA-cleaving enzymes and ribozymes work, and is one more step towards artificial cleaving agents. Of particular impact towards that last goal may be the first and last papers, detailing strong rate accelerations which could have useful applications. Papers to be included in the PhD thesis 1. 2. 3. Lain, L.; Lönnberg, H. and Lönnberg, T. Chem. Eur. J. 2013, 19, 12424. Lain, L.; Lönnberg, H. and Lönnberg, T. Org. Biomol. Chem. 2015, 13, 3484. Lain, L.; Lönnberg, H. and Lönnberg, T. Org. Biomol. Chem. in press. 70 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät PRODRUG STRATEGIES OF ANTIVIRAL NUCLEOTIDES: STUDIES ON ENZYMATICALLY AND THERMALLY REMOVABLE PHOSPHATE PROTECTING GROUPS Anna Leisvuori Bioorganic Chemistry Research Group, Laboratory of Organic Chemistry and Chemical Biology, Department of Chemistry, University of Turku asleis@utu.fi Research Director: Prof. Harri Lönnberg Supervisor(s): Dr. Mikko Ora Funding: Alios BioPharma, Doctoral Programme in Physical and Chemical Sciences, Magnus Ehrnrooth Foundation, Turku University Foundation. Estimated time of PhD dissertation: 2015 Main aims of the PhD research Many viral diseases are efficiently prevented with vaccines. Since it is difficult to develop a vaccine for viruses with high genetic variability, antiviral therapies based on other mechanisms are needed too. Antiviral nucleosides have proved their potential in the treatment of several viral infections, including HIV and hepatitis C virus. Once inside the cell, the antiviral nucleosides need to be phosphorylated to the nucleoside triphosphates by kinases to achieve the antiviral effect. However, the first phosphorylation to the nucleoside monophosphate often is inefficient, which leads to low antiviral activity. The first phosphorylation step can be bypassed by delivering the antiviral nucleoside directly as its protected monophosphate derivative i.e. applying a prodrug strategy. Many prodrug strategies are based on biodegradable protecting groups, esterase labile protecting groups in particular. Yet, several studies have demonstrated that, in case of esterase labile protecting groups, the rate of the removal of the second and subsequent protecting groups is significantly retarded. This is due to the negatively charged phosphodiester intermediate which is formed after the first protecting group is removed. The negative charge on the phosphorus disturbs the active site of the enzyme. The PhD research is aimed at studying biodegradable protecting group strategies of antiviral nucleotides where the issue of retardation could be avoided. Main results so far Several potential prodrug candidates of antiviral nucleosides have been synthesized and the removal rate of the biodegradable protecting groups has been studied. 3-acetyloxy-2,2-bis(ethoxycarbonyl)propyl, 3-acetyloxymethoxy-2,2-bis(ethoxycarbonyl)propyl and pivaloyloxymethyl groups have been studied as biodegradable phosphate protecting groups of L-alanine methyl ester derived phosphoramidates (1, Fig. 1) [1], 5´,5´-dinucleoside monophosphates (3) [2] and 3´,5´-cyclic nucleosides (2) [3]. In the synthesized compounds, the second protecting group is cleaved by some other mechanism than esterase triggered activation or the structure of the prodrug requires only one protecting group. In addition, an esterase labile protecting group that is also thermally removable has been studied as protecting group of oligomeric phosphodiesters by synthesizing thymidine derived oligomers as model compounds (4, Fig. 1) [4]. The underlying idea of this protecting group is that in case the enzymatic removal severely slows down due to the negative charge accumulating on the molecule, the thermal removal mechanism will ensure the removal of the protecting group. All of the protecting groups were shown to undergo conversion to fully deprotected products in the presence of esterase. The enzymatical removal of 3-acetyloxymethoxy-2,2-bis(ethoxycarbonyl)propyl group from nucleoside 5´-phosphoramidate was at least one order of magnitude faster than the removal of 3-acetyloxy-2,2-bis(ethoxycarbonyl)propyl group, thus making it more potential 71 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät biodegradable phosphate protecting group, but the removal rate is nevertheless rather slow. Of the three studied phosphate protecting groups, the 4-acetylthio-2,2-dimethylbutyl group, which is both enzymatically and thermally removable, seems most attractive. The protecting groups were cleaved from the studied oligomeric phosphodiesters enzymatically and were additionally cleavable nonenzymatically. The carboxyesterase catalyzed removal of the protecting group proceeded readily. Accumulation of the negative charge on the intermediates did not markedly retard the nonenzymatic removal of the protecting group. However, the rate of the thermal removal still is too slow to allow efficient protection of longer oligonucleotides and needs optimization. By increasing the electronegativity of substituents at C2, the thermal stability may be decreased. Figure 1. Structures of few of the synthesized compounds. The significance of my research for the research group and the whole research field The research field of the Bioorganic group is nucleic acid chemistry, e.g. studies on recognition and cleavage of RNA, targeting of oligonucleotides by covalent conjugations, large scale synthesis of oligonucleotides and prodrug strategies of nucleotides. Our research is multidisciplinary: the problems originate from biology and the solutions are tried to find with organic chemistry. Thus, understanding of both fields is required. The research included in the thesis is continuation of the previous studies on biodegradable protecting groups done in our laboratory since late 1990’s.The results accomplished in the thesis enable further development of prodrug strategies of nucleotides in our group. The antiviral drug field is highly commercial and the pharmaceutical companies’ interest is to keep their results of their own, but the thesis brings new knowledge for free use to the entire nucleic acid chemistry field and may on its part contribute to the development of more efficient antiviral drugs. Papers to be included in the PhD thesis 1. 2. 3. 4. Leisvuori, A., Aiba, Y., Lönnberg, T., Poijärvi-Virta. P., Blatt, L., Beigelman, L., Lönnberg, H., Org. Biomol. Chem., 2010, 8, 2131-2141. Leisvuori, A., Ahmed, Z., Ora, M., Blatt, L., Beigelman, L., Lönnberg, H., Arkivoc, 2012, 5, 226-243. Leisvuori, A., Ahmed, Z., Ora, M., Blatt, L., Beigelman, L., Lönnberg, H., Helv. Chim. Acta, 2012, 95, 1512-1520. Leisvuori, A., Ora, M., Lönnberg, H., Eur. J. Org. Chem., 2014, 5816-5826. 72 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät SYNTHESIS OF SHORT OLIGONUCLEOTIDES ON A SOLUBLE SUPPORT BY THE PHOSPHORAMIDITE METHOD Alejandro Gimenez Molina Bioorganic Chemistry Research Group, Laboratory of Organic Chemistry and Chemical Biology, Department of Chemistry, University of Turku algimo@utu.fi Research Director: Prof. Harri Lönnberg Supervisor(s): Prof. Harri Lönnberg and Dr. Pasi Virta Funding: 1) Marie Curie FP7; 2) UTUGS. Estimated time of PhD dissertation: 2015. Main aims of the PhD research The increasing demand of oligonucleotides for clinical trials and building blocks in nanotechnology has created a need for their large scale synthesis. Evidently a novel paradigm for the synthesis is needed to fulfil the demand in a cost effective manner. The aim of my PhD research is the solution phase synthesis of oligonucleotides using various methodologies based on chromatographic and precipitation techniques. For this purpose different soluble supports and novel protecting group strategies, including linkers have been developed. Main results so far The applicability of acetylated and methylated β-Cyclodextrins as viable soluble supports for the synthesis of short 2’-oligodeoxyribonucleotides (DNA) in solution [1] was demonstrated by assembling a 3’-TTT-5’ trimer and a 3’-TTCAT-5’ pentamer. To simplify the coupling cycle, the 5’-O-(4,4′-dimethoxytrityl) protecting group was replaced with an acetal that upon acidolytic removal gave easily removable volatile products. Novel 5′-O-(1-methoxy-1-methylethyl)-protected building blocks were synthesized for this purpose and the hydrophobic cyclodextrin support allowed efficient coupling on using only 1.5 equivalent excess of the monomeric building blocks. In addition, rapid flash chromatographic purification after each coupling cycle and extractive removal of the support after ammonolytic deprotection of the oligomer gave nearly homogeneous products. Alternatively, the usefulness of a pentaerythritol-derived core [2] was demonstrated on the solution phase synthesis of various 2’-oligodeoxyribonucleotides trimers (5’-CCT-3’, 5’-GCT-3’, 5’-ACT-3’) and a pentamer (5’-AGCCT-3’). The growing oligonucleotides, which were tetrahedrally branched from a pentaerythritol-derived core, were found to precipitate virtually quantitatively from methanol. This feature was utilized as a purification step in the liquid-phase synthesis: one time upon the oxidation step and another time after the detritylation step. Couplings were carried out on using only a small excess (1.5 equivalents per free 5’-OH group) of commercially available phosphoramidite 5’-O-DMTr protected building blocks. Final ammonolysis gave nearly homogeneous trimers in approximately 70% yield and the pentamer in 43% yield. The precipitative tetrapodal pentaerythritol-derived soluble support was also applied to the solution phase synthesis of oligoribonucleotides (RNA) [3]. Novel 2'-O-(2-cyanoethyl)-5'-O-(1methoxy-1-methylethyl) protected ribonucleoside 3'-phosphoramidites were prepared and their usefulness as building blocks in RNA synthesis demonstrated. As a proof of concept, a pentameric oligoribonucleotide, 3'-UUGCA-5', was synthesized. Similarly as before, couplings were carried out with 1.5 equivalents of the building block. In each coupling cycle, the small molecular reagents and byproducts were removed by two quantitative precipitations from MeOH. After completion of the chain assembly, the pentamer was released in high yields. 73 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät Finally, a workable method for the preparation of short oligoribonucleotides from commercially available 5´-O-(4,4´-dimethoxytrityl)-2´-O-(tert-butyldimethylsilyl)ribonucleoside 3´-(2-cyanoethyl N,N-diisopropylphosphoramidite) building blocks on the tetrapodal soluble support [4] was developed. The coupling cycle consisted of 4,5-dicyanoimidazole promoted coupling in MeCN with 1.5 equiv. of the monomeric building block, conventional iodine oxidation and precipitation from water followed by flash chromatographic purification. Treatment with triethylamine, followed by ammonolysis and desilylation with Et3N(HF)3 afforded the oligoribonucleotide pentamer 3´UUGCA-5´ in 46% overall yield. Figure 1. Structures of the soluble supports used for the synthesis of oligonucleotides in solution. The significance of my research for the research group and the whole research field The work described above contributes in the field of nucleic acid chemistry, in particular in the development of novel protocols for the large-scale solution phase synthesis of oligonucleotides. Since the quantities required for physico-chemical studies are often larger than what can be obtained by solid phase synthesizers, the significance of this work will be valuable for researchers who need to prepare such oligonucleotides in hundreds of mg scale in the laboratory without the use of any special equipment. Papers to be included in the PhD thesis 1. 2. 3. 4. Molina, A. G.; Kungurtsev, V.; Virta, P.; Lönnberg, H. Molecules 2012, 17, 12102-12120. Kungurtsev, V.; Laakkonen, J.; Molina, A. G.; Virta, P. Eur. J. Org. Chem. 2013, 6687–6693. Molina, A. G.; Jabgunde, A. M.; Virta, P.; Lönnberg, H. Beilstein J. Org. Chem. 2014, 10, 2279-2285. Molina, A. G.; Jabgunde, A. M.; Virta, P.; Lönnberg, H. Curr. Org. Synth. 2015, 12, 202-207. 74 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät METAL-ION-BINDING OLIGONUCLEOTIDES: HIGH-AFFINITY PROBES FOR NUCLEIC ACID SEQUENCES Sharmin Taherpour Bioorganic Chemistry Research Group, Laboratory of Organic Chemistry and Chemical Biology, Department of Chemistry, University of Turku shtahe@utu.fi Research Director: Prof. Harri Lönnberg Supervisor: Dr. Tuomas Lönnberg Funding: Academy of Finland and Department of Chemistry Estimated time of PhD dissertation: 9/2015 Main aims of the PhD research This study is aimed at developing modified oligonucleotides with enhanced affinity to their natural counterparts through metal-ion-mediated base pairing. The increasing number of biologically relevant short RNA targets creates demand for agents that are able to bind short nucleic acid sequences with high affinity and selectivity. For example, the single-stranded regions of miRNA are too short for effective hybridization with unmodified oligonucleotides at physiological temperature. One way to achieve the desired strong hybridization could be the replacement of some of the natural Watson-Crick base pairs with stronger metal-ion-mediated base pairs between artificial and natural nucleobases. So far, however, nearly all of the metal-ion-mediated base pairs described in the literature have been formed between either two artificial or two natural nucleosides, making them unsuitable for this task. Main results 2,6-Bis(3,5-dimethylpyrazol-1-yl)purine riboside (1) has been identified as a promising candidate for a metal-ion-carrying artificial nucleoside, both at the monomer level and within oligonucleotide assemblies. The stabilities of metal ion mediated base pairs were first studied by 1H NMR titrations. The modified nucleobase (1) was found to form a highly stable, well-defined ternary complex with uridine and Pd2+ at low micromolar concentrations (Fig. 1).[1] H1´ (complex) H1´(complex) H5 (complex) A H5 and H1´ H5 and (free Urd)H´ (free Urd) D H5(complex) 1.0 x(complex) / a.u. 0.8 B 0.6 0.4 0.2 C 1 : Pd2+ : U 0.0 0.0 5.90 5.90 5.85 5.85 5.80 5.80 5.75 5.75 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 [Urd] = [1] / mmol L 5.70 ppm 5.70ppm 3.0 3.5 4.0 -1 Figure 1. (A-C): 1H NMR spectra of uridine (H5 and H1´) at various concentrations of uridine, the artificial nucleoside (1) and Pd2+ at pH 7.3. (A): [Urd] = [1] = 3.6 mmol L-1, [Pd2+] = 2.52 mmol L1 ; (B): [Urd] = [1] = 0.061 mmol L-1, [Pd2+] = 0.042 mmol L-1 ; (C): [Urd] = [1] = 13.84 mmol L-1, [Pd2+] = 0. (D): Mole fraction of uridine in complex as a function of the concentration of uridine and 1; pH = 7.3. 75 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät Stabilities of various oligonucleotide assemblies between native and modified oligonucleotides in the presence (or absence) of an equimolar concentration of Pd2+, Zn2+ or Cu2+ were determined by the conventional method, viz. by measuring their melting temperatures. Within an oligonucleotide structure, the Cu2+ (and, to a lesser extent, the Zn2+) chelate of the modified nucleoside (1) was found to be stabilizing both at an internal [2-3] and, particularly, at a terminal position of RNA (Fig. 2).[2] All of the duplexes studied were CD-spectropolarimetrically verified to be of the canonical Atype. Figure 2. The effect of the Cu2+-mediated base pair between 1 (X) and uridine on the stability of short oligonucleotides. Biologically relevant RNA targets typically include several double-helical regions, giving rise to exceedingly convoluted UV melting profiles. To avoid this problem, hybridization of the metal-ionbinding oligonucleotides was also studied by incorporating a fluorescent nucleoside analog (pyrrolo-dC) in one strand of the putative duplex and quantifying the fluorescence intensity of this residue. The system was first calibrated with simple short double-helical oligonucleotides, the melting temperatures of which could be measured and interpreted unambiguously. In these duplexes, the drop of fluorescence intensity on hybridization correlated well with the thermal stability of the duplex.[4] To study metal-ion-promoted hybridization in a biologically more relevant system, the affinity of short metal-ion-binding oligonucleotides for the trinucleotide bulge motif of TAR RNA models was quantified by the fluorescence-based method. The fluorescent residue was placed at various sites of the TAR RNA models. The results obtained with these models were not as clear as those obtained with simple duplexes and, therefore, hybridization of the metal-ion-binding oligonucleotides with the desired target site could not be unambiguously established. It seems possible that even with the stabilizing effect of the metal-ion-mediated base pair, the affinity of the modified oligonucleotides for the very short target sequence remains too low. The significance of my research for the research group and the whole research field Metal-ion-mediated base-pairing of nucleic acids is gaining more and more interest owing to its potential applications in bio- and nanotechnology. Our research represents a new and growing field in our laboratory. The results will give tools and knowledge for targeting of short nucleic acid sequences. The intended application is recognition and selective inhibition of small non-coding RNAs but our results could also find use in DNA-based nanotechnology. Papers to be included in the PhD thesis 1. 2. 3. 4. Taherpour, S., Lönnberg, T. J. Nucleic Acids: 2012, 2012, article ID 196485. Taherpour, S., Lönnberg, H., Lönnberg, T. Org. Biomol. Chem., 2013, 11, 991-1000. Taherpour, S., Golubev, O., Lönnberg, T. J. Org. Chem., 2014, 79, 8990-8999. Taherpour, S., Lönnberg, T. RSC Adv., 2015, 5, 10837-10844. 76 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät APPLICATIONS OF HOOGSTEEN-FACE RECOGNITION OF DNA AND RNA DOUBLE HELICES Ville Tähtinen Bioorganic Chemistry Research Group, Laboratory of Organic Chemistry and Chemical Biology, Department of Chemistry, University of Turku vpotah@utu.fi Research Director: Prof. Harri Lönnberg Supervisor(s): Dr. Pasi Virta Funding: Doctoral Programme in Physical and Chemical Sciences Estimated time of PhD dissertation: 2018 Main aims of the PhD research Triplex-forming oligonucleotides (TFOs) have received considerable interest because of their potential as therapeutic agents that sequence-selectively recognize DNA (the basis of the antigene therapy) and double helical RNA. The latter targeting has recently become highly attractive owing to realization of the role of the noncoding RNA in gene expression. In addition to medicinal relevance, the Hoogsteen-face recognition offers an interesting option for molecular biology tools. The goals of this research project are (1) to develop novel oligonucleotide conjugates or oligonucleotide-resembling structures (e.g. modified PNAs) that have high affinity to DNA/RNA duplexes especially under physiological conditions, (2) to provide further information about the mechanism of Hoogsteen-face recognition (obtained mainly by 19F NMR experience in the laboratory) and (3) to develop novel Hoogsteen-face recognition -based molecular biology tools, in which fluorescence and 19F NMR spectroscopy will be applied. Main results so far We have recently synthesized a small library of neomycin-2’-deoxyoligonucleotide conjugates and demonstrated their Hoogsteen-face binding to double helical DNAs (neomycin is a known triplex groove binder). In the best case (with C-5-conjugated neomycin), a notable stabilization was obtained and the stabilization could be doubled by two neomycin units (Figure 1). Stabilization in the pyrimidine interrupt could also be gained. The triplex formation in this study has been characterized, in addition to conventional spectrophotometric methods (UV and CD spectroscopy), by 19F NMR spectroscopy of the corresponding fluorine labelled oligonucleotides. 19F NMR spectroscopic analysis gave additional information about the molar ratios of secondary structural species (triplex/duplex/single strand, Figure 2) and an indication to varying local environment in the target triplex was also observed. Figure 1. Structure of neomycin conjugates (ON2 and ON7) and their influence on the triplex stability (cf. Tm3-values in comparison to unmodified oligonucleotide ON1). 77 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät 1.0 1.0 0.8 0.8 0.6 0.6 0.4 0.4 0.2 0.2 0.0 0.0 30 40 50 60 70 20 30 40 50 60 70 Figure 2. Relative molar fractions of triplexes, duplexes and single strands (19F-duplex 2 + ON1 vs. ON2) upon thermal denaturation obtained by 19F NMR spectroscopy and UV-melting profiles (λ = 295 nm, C) from the mixtures at pH 5.5. Conditions: 50 μmol L-1 of each oligonucleotide in 0.1 mol L-1 NaCl at pH 5.5 or 6.0 (the structure of ON2 in Figure 1). The significance of my research for the research group and the whole research field One of the main interests of the Laboratory of Organic Chemistry and Chemical Biology has been the applications of modified oligonucleotides or oligonucleotide-related oligomers. This together with the 19F NMR spectroscopy experience provide strong basis for the development of new triplex forming oligonucleotides (TFOs) or resembling structures (e.g. PNA). The Hoogsteen-face recognition -based molecular biology tools may have interesting applications, since their functionality does not require strand invasion (or complementary single strands). The new TFOcandidates, detailed information of triplex/duplex/single strand conversion obtained by 19F NMR spectroscopy and novel TFO-based molecular biology tools are all subjects of general interest in the field of organic and bioorganic chemistry. Papers to be included in the PhD thesis 1. Tähtinen, V.; Granqvist, L. and Virta, P. Bioorganic & Med. Chem. 2015, submitted. 78 Kemian kevät 2015 – Erikoistyöt SELECTFLUOR-PREKURSORIN VALMISTUS JA [18F]SELECTFLUORIN RADIOANALYYTTISTEN MENETELMIEN KEHITYS Salla Lahdenpohja1,2*, Anna Kirjavainen2, Sarita Forsback2 ja Olof Solin1,2 1 Orgaanisen kemian ja kemiallisen biologian laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto 2 Radiofarmaseuttisen kemian laboratorio, Valtakunnallinen PET-keskus, 20014 Turun yliopisto *saorla@utu.fi Abstrakti [18F]Selectfluor bis(triflaatti) on erittäin reaktiivisen [18F]fluorikaasun johdos, jota voidaan tehokkaasti käyttää elektrofiilisissä 18F-fluorausreaktioissa. Työn tavoitteena oli syntetisoida Selectfluorin edeltäjämolekyyliä ja löytää analyysimenetelmä [18F]Selectfluor bis(triflaatille) ja sen edeltäjämolekyylille. Työssä kehitetty nestekromatografinen menetelmä soveltuu [18F]Selectfluor bis(triflaatin) tunnistamiseen radioaktiivisuuden avulla. Selectfluor on mahdollista tunnistaa myös massaspektrometrisesti, mutta tämä menetelmänkehitys on vielä kesken. Johdanto [18F]N-F-yhdisteet ovat elektrofiilisiä fluorausreagensseja ja ne olivat kiinnostuksen ja kehityksen kohteena 1980-luvulla. Kiinnostus [18F]N-F-yhdisteisiin laski nukleofiilisen 18F-fluorauksen ylivoimaisuuden takia, mutta on taas noussut takaisin pinnalle N-[18F]fluoribentseenisulfonimidin [1] ja [18F]Selectfluor bis(triflaatin) [2] kehityksen myötä. Molempia yhdisteitä on käytetty 18Fleimausreaktioissa. [18F]Selectfluor bis(triflaatilla) on valmistettu muun muassa neurologisissa tutkimuksissa käytettyä [18F]-6-fluori-3,4-dihydroksi-L-fenyylialaniinia (6-[18F]FDOPA) [2]. Erikoistyössä valmistettiin Selectfluorin edeltäjämolekyyliä, jota leimattiin [18F]F-:sta valmistetulla [18F]fluorikaasulla [2,3]. Työssä pyrittiin kehittämään [18F]Selectfluor bis(triflaatin) radioanalyyttisiä tutkimusmenetelmiä. Koska Selectfluor ei ole ultraviolettikromoforinen, analyysimenetelmien kehitys keskittyi korkean erotuskyvyn nestekromatografiaan (HPLC) ja nestekromatografia-massaspektrometriaan (LC-MS), joissa molemmissa käytettiin hyväksi radioaktiivisuuden tunnistamista. Materiaalit ja menetelmät Selectfluorin edeltäjämolekyyli (1-kloorimetyyli-1,4-diatsabisyklo-[2.2.2]oktaani triflaatti) syntetisoitiin kahdessa vaiheessa. Edeltäjämolekyyli leimattiin [18F]fluorikaasulla automatisoidulla synteesilaitteistolla, joka oli sijoitettu kuumakemiakammioon. Kaaviossa 1 on esitetty Selectfluorin edeltäjämolekyylin synteesi ja sen 18F-leimaus. Kaavio 1. Selectfluorin edeltäjämolekyylin kaksivaiheinen synteesi ja [18F]Selectfluor bis(triflaatin) radiosynteesi. [18F]Selectfluor bis(triflaattia) analysoitiin HPLC- ja LC-MS-laitteistoilla, joihin molempiin oli liitetty radioaktiivisuusdetektori. HPLC-ajot suoritettiin pH-välillä 2,5 – 10 käyttäen erilaisia 79 Kemian kevät 2015 – Erikoistyöt gradientteja ja isokraatisia ajoja. Orgaanisena faasina käytettiin metanolia tai asetonitriiliä ja vesifaasina käytettiin erilaisia puskuriliuoksia. LC-MS:lla tehtiin [18F]Selectfluor bis(triflaatin) analyysimenetelmien kehityksen lisäksi kokeita käyttäen [19F]Selectfluor bis(triflaattia) ja Selectfluor-edeltäjämolekyyliä. Ajoliuoksina käytettiin metanolia ja vettä, joihin oli lisätty 0,1 % muurahaishappoa. Tulokset ja johtopäätökset Selectfluor-edeltäjämolekyyliä valmistettiin 49 ja 64 %:n saannoilla ja sitä leimattiin onnistuneesti [18F]F2-kaasulla, jolloin muodostui [18F]Selectfluor bis(triflaattia). Leimausreaktion onnistuminen ja Selectfluorin edeltäjämolekyylin toimivuus varmistettiin käyttämällä saatua [18F]Selectfluor bis(triflaattia) 6-[18F]FDOPAn valmistukseen. Käyttäen isokraattista HPLC:tä, yhdisteiden erottaminen oli vaikeaa. Gradienttiajoilla tulokset olivat hyvin vaihtelevia. Signaalien erottuminen ja muoto olivat parhaimmat pH:n ollessa 4,9. Näytteet laimennettiin metanoliin, koska asetonitriiliin havaittiin nopeuttavan [18F]Selectfluor bis(triflaatin) hajoamista. LC-MS:ssa [18F]Selectfluor bis(triflaatti) ja [19F]Selectfluor bis(triflaatti) näkyivät spektrissä m/z-arvolla 179, joka vastaa Selectfluorin massaa ilman triflaattiryhmiä. Tämän lisäksi havaittiin edeltäjämolekyylin signaali (m/z 161) ja tunnistamaton signaali (m/z 191). Tunnistamaton signaali on todennäköisesti edeltäjämolekyylin metanoliaddukti. Adduktisignaali onnistuttiin erottamaan [19F]Selectfluor bis(triflaatilla) laskettaessa muista laskemalla metanolipitoisuutta. metanolipitoisuus 90 prosentista 5 prosenttiin, sinisellä kuvattu adduktisignaali erottuu selkeästi tuotteesta ja prekursorista (kuva 1). Tuotesignaalin (punainen) erottuminen edeltäjämolekyylin signaalista (musta) oli vähäistä. Kuva 1. A) m/z-arvot 161, 179 ja 191 90 %:n metanolipitoisuudessa, B) m/z-arvot 161, 179 ja 191 5 %:n metanolipitoisuudessa. Menetelmäkehityksen tuloksena [18F]Selectfluor bis(triflaatti) voidaan erottaa [18F]fluoridista radioHPLC:llä. Selectfluor bis(triflaatti) voidaan erottaa m/z-arvollaan LC-MS:lla edeltäjämolekyylistä ja edeltäjämolekyylin metanoliadduktista. Jatkotutkimuksia radio-LC-MS:lla tarvitaan [18F]Selectfluor bis(triflaatin) erottamiseksi sen valmistuksen yhteydessä muodostuneista muista radioaktiivisista yhdisteistä. Viitteet 1. 2. 3. Teare, H., Robins, E.G., Åstrand, E., Luthra, S.K. ja Gouverneur, V., Chem. Commun. 2007, 23, 2330-2332. Teare, H., Robins, E.G., Kirjavainen, A., Forsback, S., Sandford, G., Solin, O., Luthra, S.K. ja Gouverneur, V., Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 6824-6824. Bergman, J. ja Solin, O., Nucl. Med. Biol. 1997, 24, 677-683. 80 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät HIGH SPECIFIC RADIOACTIVITY 11 C-METHYL IODIDE FOR RADIOLABELLING Eveliina Arponen Radiopharmaceutical Chemistry Laboratory, Turku PET Centre and Laboratory of Organic Chemistry and Chemical Biology, Department of Chemistry, University of Turku evearp@utu.fi Research Director: Prof. Olof Solin Supervisor(s): Doc. Pertti Lehikoinen and Prof. Olof Solin Funding: Turku PET Centre, Finnish Centre of Excellence in Cardiovascular and Metabolic Diseases, Academy of Finland Estimated time of PhD dissertation: 2018 Main aims of the PhD research Modern PET (positron emission tomography) -scanners with high resolution capabilities often require large amounts of radioactivity in order to generate high quality images (data). This increased need of radioactivity in turn demands better specific radioactivity to keep the injected mass at tracer level. This is especially true when imaging small animals, and is at present in many cases the limiting factor in successful preclinical imaging. In the sequence of 11C-radiopharmaceutical production typically most of the stable carbon is introduced from the system and reagents which are used to convert the product into a labelling agent. With present day methods the dilution of 11C with 12C is a thousandfold at best, i.e. for each 11 C atom we have at least 1000 12C atoms. 11 C-Methyl iodide is a useful precursor for incorporating 11C via methylation of compounds containing oxygen, sulphur and nitrogen nucleophiles. Today there are two commonly used production methods for 11C-methyl iodide: the classic LiAlH4/THF/HI wet method or heat initiated gas-phase radical reaction. Both are time-consuming methods constituting ca.10 min step in the synthesis. The 20.4 min half-life of 11C imposes several challenges to the preparation and use of 11 C-labelled compounds. Every saved minute can be seen as an improvement of the final specific radioactivity. The aim of the first study was to develop a PET-tracer for D2C-adrenoceptor imaging and to evaluate it in D2-adrenoceptor knock-out (KO) mice. D2C-Adrenoceptors in the human brain are involved in various neuropsychiatric diseases such as depression, schizophrenia and movement disorders. At present we are investigating options to carry out gas-phase conversion of 11C-methane into 11 C-methyl iodide and further to 11C-methyl triflate. Ideally this will be done on-line while emptying the target and feeding the irradiation product into the labelling synthesis. Alternative initiation methods for on-line halogenations, such as electron discharge will be studied. In addition to the possibility of cutting down synthesis time, a closed system setup in the on-line approach is expected to reduce stable carbon dilution. The aim of this study is to produce high specific activity labelling precursors (11C-methyl iodide, 11C-methyl triflate) for 11C-radiosynthesis. In this work analytical procedures will be established to determine the specific activity of 11C-methane in the target gas using radioGC/MS. 81 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät Main results so far 11 C-ORM-13070 (1-[(S)-1-(2,3-dihydrobenzo[1,4]dioxin-2-yl)methyl]-4-(3-11C-methoxymethylpyridin-2-yl)-piperazine) was synthesized by 11C-methylation of O-desmethyl-ORM-13070 with 11 C-methyl triflate, which was prepared from cyclotron-produced 11C-methane via 11C-methyl iodide. 11C was prepared by the 14N(p,α)11C nuclear reaction using 17 MeV protons, which were produced with an MGC-20 cyclotron, and was obtained as 11C-methane. The target gas was nitrogen, containing 5% hydrogen. The initial radioactivity of 11C-methane was 37 GBq, and the average synthesis time was 32 ± 3 min, including the synthesis of 11C-methyl triflate, methylation, HPLC purification, and formulation. The radiochemical yield, calculated from the initial 11Cmethane (decay-corrected to EOB), was 9.6 ± 2.7%, and the radioactivity of 11C-ORM-13070 was 1210 ± 360 MBq at EOS. Measured by analytical HPLC, the specific activity was 640 ± 390 GBq/μmol at EOS (theoretical maximum specific activity for 11C is 340 000 GBq/μmol). The radiochemical purity of the product exceeded 99% in all syntheses (n = 118). An efficient method for the radiosynthesis of high specific activity 11C-ORM-13070 was developed. 11C-ORM-13070 emerged as a specific and selective tracer for in vivo imaging of brain α2C-adrenoceptors [1]. We have developed a new method and an apparatus to produce 11C-methyl iodide using electron discharge in the gas-phase conversion of 11C-methane into 11C-methyl iodide. 11C-Methyl iodide is synthesized in a single pass through discharge chamber containing iodine crystals. Optimisation of the discharge system for higher and more reproducible 11C-methyl iodide yield is ongoing. . O H O N N O HO N [11C]Methyl triflate H N N O o TBAOH/acetonitrile, 3 min 80 C 11 H3 C 1 N O 2 Figure 1. Synthesis scheme for 11C-ORM-13070. The significance of my research for the research group and the whole research field The present study plan aims to develop a rapid and facile method to produce the most important 11 C-labeling precursors for PET chemistry. If successful, we will have in hand methods that will enable us to speed up the production and increase the amount of tracers in our “tracer library”. Our goal is to apply the obtained knowledge of the labelling agent production to synthesise improved quality PET-tracers with very high specific radioactivity. Papers to be included in the PhD thesis 1. Arponen E, Helin S, Marjamäki P, Grönroos T, Holm P, Löyttyniemi E, Någren K, Scheinin M, Haaparanta-Solin M, Sallinen J, Solin O, J. Nucl. Med. 2014, 55, 1171-1177. 82 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät Electrophilic fluorination and preclinical evaluation of [18F]F-DPA and development of new methodologies for the production of high specific activity electrophilic 18Ffluorination reagents. Thomas Keller tomkel@utu.fi Radiopharmaceutical Chemistry Laboratory, Turku PET Centre and Laboratory of Organic Chemistry and Chemical Biology, Department of Chemistry, University of Turku Research Director: Prof. Olof Solin, PhD Supervisor(s): Adj. Prof. Merja Haaparanta-Solin, PhD, and Dr. Sarita Forsback, PhD Funding: Funding was received from the Marie Curie ITN Radiomi, grant number 316882 and from the Academy of Finland, grant number 266891. Estimated time of PhD dissertation: 2017 Main aims of the PhD research The aim of this project is twofold, the development of a new strategy for the production of high specific activity [18F]F2 and the use of electrophilic 18F-fluorination reagents in the synthesis of novel analogues of [18F]DPA714 a translocator protein (TSPO) specific radioligand. Electrophilic 18F-fluorination can provide a fast and simple synthetic route to a range of target molecules inaccessible by nucleophilic labelling. Reagents such as post-target produced [18F]F2 (Fig. 1) and the more versatile [18F]Selectfluor (derived from post-target produced [18F]F2) can be produced in our facility with high specific activity. However both reagents suffer from the drawbacks associated with the addition of carrier fluorine gas and the consumption of [18F]F2 during the high voltage electric discharge required for the 19F/18F isotopic exchange reaction. Figure 1. Post-target production of [18F]F2 by high voltage discharge Main results so far In collaboration with Dr Frédéric Dollé of the Atomic Energy Commision, Orsay, France, we have been working on the synthesis of [18F]DPA714 and a novel analogue, [18F]F-DPA (Fig. 2), labelled by an electrophilic route. The well-known labelling of [18F]DPA714 served as a good means by which to get acquainted with the world of radiochemistry and some of the custom-built devices used in the radiolabelling process. In addition, the use of this existing tracer in preclinical experiments provided an excellent opportunity learn about the preclinical aspects of the project, gain experience working with laboratory animals and provides a standard for the evaluation of the novel [18F]F-DPA. 83 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät Figure 2. Structures of [18F]F-DPA and [18F]DPA-714 Initial test reactions employing [18F]F2 directly as the electrophilic fluorination reagent were unsuccessful in the production of the desired [18F]F-DPA product. Hence, [18F]Selectfluor, a milder electrophilic 18F-fluorination reagent was chosen for further experiments. This approach proved quite successful and the [18F]F-DPA product was obtained sufficient yield and specific activity for preclinical evaluation. The animal work is ongoing and is yielding promising results that are yet to be published. In addition to the development of novel tracers a large portion of the project is being devoted to research concerning a new approach to the production of high specific activity [18F]F2. As described above, the current methodology employs a high voltage discharge to promote the 19F/18F isotopic exchange reaction and this also consumes a portion of the [18F]F2. The new approach provides the energy in a milder form as high energy Vacuum UV photons with the intention that this will reduce the [18F]F2 consumption. Initial experiments are ongoing and a proof of concept has been obtained, however significant optimization is yet to be performed before the results can be published. The significance of my research for the research group and the whole research field The research group at the Turku PET Centre has particular expertise with the use of electrophilic fluorination as a labelling strategy. This specialized knowledge together with the simplicity of the method itself makes it an attractive approach to synthesize novel radioligands. Translocator protein (TSPO) overexpression in the brain is associated with a range of diseases, amongst them; Alzheimer’s, stroke, sultiple sclerosis and brain injury. As a result TSPO-specific radioligands are routinely used in the imaging of neuroinflammation caused by these diseases. However despite this many of the existing TSPO tracers suffer from certain drawbacks, such as a short half-life of the selected radionuclide or low metabolic stability of the particular labelling position. Hence there is a significant interest in the development of new radio-ligands that may overcome some of these pitfalls. 84 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät ELECTROPHILIC 18F-LABELLING OF MARSANIDINE AND GENERATION OF HIGH SPECIFIC ACTIVITY [18F]F2 GAS WITH VUV PHOTONS Anna Krzyczmonik Radiopharmaceutical Chemistry Laboratory, Turku PET Centre and Laboratory of Organic Chemistry and Chemical Biology, Department of Chemistry, University of Turku anmakrz@utu.fi Research Director: Prof. Olof Solin Supervisors: Prof. Olof Solin, PhD, Adj. Prof. Merja Haaparanta-Solin, PhD, and Dr. Sarita Forsback, PhD Funding: European Union’s 7th Framework Programme for Research, grant number 316882, National Science Centre (Poland), grant number 2011/01/B/NZ4/00520, Academy of Finland, grant number 266891 Estimated time of PhD dissertation: 2017 Main aims of the PhD research My research concentrates on application of electrophilic fluorination in synthesis of radiotracers for Positron Emission Tomography (PET). The first part of my study is to developed a new way of synthesis of [18F]F2 with high specific activity (figure 1). [18F]F2 is produced at Turku PET Centre from [18F]MeF with addition of carrier F2 gas in neon. The 19F/18F isotopic exchange is obtained using high voltage to produce [18F]F2 gas with high specific activity. Figure 1. Synthesis of high specific activity [18F]F2 In my research I am applying vacuum UV photon illumination as a means to promote the 18F/19F isotopic exchange to obtain higher specific activity. The second part of my research concentrates on the synthesis of new PET tracers via electrophilic fluorination. The first tracer I synthetized was a potential subtype selective α2Aadrenoceptor tracer. α2-adrenoceptors (ARs) mediate many actions of adrenaline and noradrenaline and regulate their release. Brain α2-ARs are potential therapeutic targets in various neuropsychiatric disorders, such as depression, schizophrenia, and neurodegenerative diseases. Main results so far [18F]6-fluoro-marsanidine, a potential subtype selective α2A-adrenoceptor tracer, was labelled using electrophilic fluorination. High specific activity [18F]F2 was produced post target from [18F]MeF by using high voltage to obtain 19F/18F isotopic exchange. The [18F]F2 was used for labelling of Selectfluor (figure 2). The crude stock solution of [18F]Selectfluor reacted directly with marsanidine precursor. The product was purified by preparative HPLC to give a radiochemical purity more than 99%. 85 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät Figure 2. Radiosynthesis of [18F]Selectfluor With this method [18F]6-fluoro-marsanidine was produced with sufficient yield for preclinical studies (figure 3). The biodistribution of [18F]6-fluoro-marsanidine in healthy rats and mice was investigated in vivo with PET imaging. Binding in the brain tissue was assessed using ex vivo by autoradiography. The extent of tracer metabolism in the blood and brain tissue was analysed by radio thin layer chromatography. Preclinical studies showed uptake of the tracer in the brain and demonstrated that [18F]6-fluoromarsanidine passes the blood-brain barrier. The parent tracer metabolized relatively fast, with the formation of numerous labelled metabolites. Figure 3. Radiosynthesis of [18F]6-fluoro-marsanidine A new system for generation of high specific activity was built. The utility of vacuum UV photons in production of [18F]F2 gas has been confirmed. Preliminary experiments gave promising results which have to be confirmed in further studies. The significance of my research for the research group and the whole research field In 1997 a research group from Turku PET Centre developed a new method for production [18F]F2 gas with high specific activity. Since this time Turku has been one of the few places in the word which has the possibility to develop new tracers synthetized by electrophilic fluorination and evaluate them in preclinical studies. In my research I am using this opportunity for synthesis of new tracers unattainable with other methods. I also perform the preclinical studies to evaluate the utility of them in small animals. 86 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät SYNTHESIS, ANALYTICS AND EVALUATION OF HIGH SPESIFIC RADIOACTIVITY RADIOTRACERS FOR PET-IMAGING OF PANCREAS pcleht@utu.fi Paula Lehtiniemi Radiopharmaceutical Chemistry Laboratory, Turku PET Centre and Laboratory of Organic Chemistry and Chemical Biology, Department of Chemistry, University of Turku Research Director: Prof. Olof Solin Supervisor(s): Prof. Olof Solin, PhD, Dr. Sarita Forsback, PhD, and Adj. Prof. Merja HaaparantaSolin, PhD Funding: Academy of Finland (grant no. 266811), The Diabetes Research Foundation, The Novo Nordisk Foundation Estimated time of PhD dissertation: 2018 Main aims of the PhD research Main aim of this research is to develop new 18F and 63Zn –labelled positron emission tomography (PET)-radiotracer with high specific radioactivity (SA) for preclinical and clinical studies. The focus is on 18F-labelled exendin-peptide synthesis and determination of its SA. This 18F-peptide can possibly be used for clinical imaging of human pancreatic beta-cells with PET. An additional aim is to develop methods for 63Zn-labelling of peptides and to study the tracer uptake in pancreas with for studying insulin metabolism in vivo. A third aim is to synthetize a suitable radiotracer with high SA for imaging the norepinephrine transporter protein (NET) and to study its suitability for clinical PET imaging of pancreas. For identification and determination of SA of the radiotracers radio-HPLC/MS/MS –methods will be developed. The pharmacokinetics of the new radiotracers is evaluated in various animal models. Main results so far We have developed an 18F-labelling method for the exendin-peptide (figure 1.) Radioactive fluorine, [18F]F-, was produced using the cyclotron. During azeotropic distillation of a mixture of Kryptofix 2.2.2, K2CO3 and 18F-, a complex was formed. Using this complex a tosylate-precursor was labelled with 18F-fluorine and the labelled precursor was used to label the exendin-peptide via click chemistry. 18F-labelling of the exendin-peptide has been successful, radiochemical yield was ̴ 35 % and the synthesis was reproducible. The final product purification and formulation needs further development due to the very adhesive nature of the exendin-peptide. Also the SA of the 18Fexendin is to be improved. We have developed radio-TLC and HPLC -methods for detecting 18F-exendin and we will continue to develop new radio-HPLC/MS/MS-method for the determination of SA. 87 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät Figure 1. Synthesis scheme for 18F-labelling of exendin-peptide. Tosylate- precursor 1, 18F-labelled precursor 2 and 18F-exendin 4. The significance of my research for the research group and the whole research field A reliable method for non-invasive in vivo quantification of beta-cell mass in human pancreas is needed to understand the pathophysiology of type 1 and type 2 diabetes. Based on the animal studies the 18F-labelled exendin-peptide looks promising for imaging pancreatic beta cells but further development of the tracer is still needed. Zinc plays a central role in insulin metabolism. Therefore development of non-invasive Zn-probes is warranted. Papers to be included in the PhD thesis 1. 18 F-labelling of the exendin-peptide via click chemistry, manuscript. 88 Kemian kevät 2015 Toiminnallisten materiaalien tutkimusryhmäesittely ja opiskelijoiden abstraktit 3 kpl FM-erikoistyötä käsitteleviä minijulkaisuja 5 kpl FT-vaiheen etenemisraportteja 89 Kemian kevät 2015 – Tutkimusryhmät FUNKTIONAALISIA MATERIAALEJA JA OHUITA KALVOJA : MOLEKYYLIEN KEMIALLISTEN JA FYSIKAALISTEN OMINAISUUKSIEN KÄYTTÖÄ IHMISEN PARHAAKSI … ELI MITÄ ON MATERIAALIKEMIA Keijo Haapakka, Carita Kvarnström, Jukka Lukkari Toiminnallisten materiaalien tutkimusryhmä, Materiaalikemian ja kemiallisen analyysin laboratorio laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto s-posti: keijo.haapakka@utu.fi, carita.kvarnström@utu.fi ja jukka.lukkari@utu.fi Kemiassa käsitteellä materiaali tarkoitetaan kemiallisia yhdisteitä, joiden yksittäisellä molekyylillä tai makroskooppisella ainemäärällä on ominaisuuksia, joita voidaan hyödyntää joissain sovellutuksissa. Materiaalikemian tutkimusta ohjaavat täten yhdisteiden fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet, ei niinkään niiden kemiallinen luonne. Funktionaaliset (toiminnalliset) materiaalit pystyvät reagoimaan ympäristössä tapahtuviin fysikaalisiin tai kemiallisiin ilmiöihin jollain tavoin, joko muuntamalla ominaisuuksiaan (elektroniset, mekaaniset, optiset jne.) tai tekemällä esimerkiksi mekaanista, kemiallista tai sähköistä työtä. Arkikielessä näistä käytetäänkin usein hieman epämääräistä termiä ”älykkäät materiaalit”. Funktionaalisten materiaalien ryhmässä tutkitaan sekä fysikaalista että sovellettua materiaalikemiaa. Funktionaaliset materiaalit Ryhmässä tutkittavat toiminnalliset materiaalit ovat yleensä sähköä johtavia, valoherkkiä, luminoivia, viskoelastisia, ioniherkkiä tai katalyyttisesti aktiivisia. Yhteistä niille on se, että niiden ominaisuuksia voidaan säädellä ulkoisin keinoin tai ne itse mukautuvat kulloiseenkin fysikaaliseen ja kemialliseen ympäristöönsä. Tutkittavat materiaalit ovat yleensä ”pehmeitä” orgaanisia materiaaleja, esimerkiksi johdepolymeereja, polyelektrolyyttejä tai yleisesti polymeereja sekä hiilen uusia allotrooppeja (fullereenit, grafeeni ja sen johdokset). Johdepolymeerit, redoxpolymeerit, synteettiset ja bioinnoitetut redoksipolyelektrolyytit Johdepolymeerien sähkönjohtavuutta voidaan muuttaa ulkoisen sähköpotentiaalin avulla. Samalla niiden väri muuttuu, mikä voi mahdollistaa niiden käytön orgaanisissa näyttöpaneeleissa. Muita sovellutuskohteita ovat kemialliset anturit, orgaaniset transistorit (ns. orgaaninen elektroniikka) sekä aurinkokennot, joista erityisesti viimeksi mainittuja sovellutuksia ryhmässä tutkitaan. + N Cl O - N - 2 Cl . . S + N + N . . x y Kuva 1. Johdepolymeereja, ionisia johdepolymeereja sekä redoksipolymeereja. Polyelektrolyytit ovat ionisia polymeereja. Ne ovat hyvin vesiliukoisia ja useimmiten erittäin bioyhteensopivia. Ympäröivän liuoksen kemiallinen koostumus ja lämpötila vaikuttaa voimakkaasti polyelektrolyyttien ominaisuuksiin. Erityisiä mielenkiinnon kohteena olevia polyelektrolyyttejä ovat johdepolymeerien vesiliukoiset muodot sekä redoksipolyelektrolyytit. Uutena tutkimusaiheena 90 Kemian kevät 2015 – Tutkimusryhmät ovat bioinnoitetut kinonipohjaiset polyelektrolyytit, jotka rakenteeltaan muistuttavat polyfenolisia luonnonyhdisteitä, sekä melaniininanopartikkelit. Melaniini on luonnossa hyvin yleinen tumma pigmentti, jonka fysikaaliskemialliset ominaisuudet ovat sovellutusten kannalta lupaavia. Polykinonit ovat redoksiaktiivisia polymeereja, jotka voivat toimia sensorimateriaaleina, molekulaarisina liimoina sekä välittäjinä elävän ja elottoman materiaalin välillä. Kuva 2. Polykinoneita ja melaniininanopartikkeleita Hiilen allotroopit. Grafeeni ja sen johdannaiset ovat savuttaneet merkittävän aseman materiaalitutkimuksessa, on puhuttu jopa ihmeaineesta; grafeeni on mm. erinomainen sähkönjohde. Tuiki tavallinen materiaali, grafiitti, koostuu löyhästi toisissaan kiinni olevista yhden hiiliatomin paksuisista grafeenilevyistä. Grafeenia voidaankin valmistaa tavallisesta grafiitista erottelemalla (eksfolioimalla) siitä yksittäisiä levyjä tai hapettamalla grafiitti grafeenioksidiksi, joka muodostuu irrallisista hapettuneista grafeenilevyistä. Grafeenioksidi on eriste, joten useimpia sovellutuksia varten se on pelkistettävä takaisin. Tutkimme erityisesti grafeenin valmistusta suoraan grafiitista mekanokemiallisin menetelmin, grafeenioksidin kemiallista ja sähkökemiallista pelkistystä sekä grafeenilevyjen funktionalisointia ionisilla nesteillä ja foto- tai bioaktiivisilla ryhmillä. Grafeeni- ja grafeenioksidilevyjä käytetään myös lisäkomponetteina komposiittimateriaaleissa lisäämään sähkönjohtavuutta ja mekaanista lujuutta. Materiaali soveltuu erinomaisesti myös anturisovellutuksiin. Ryhmässä on mm valmistettu pelkistetystä grafeenioksidista paperin pinnalle kertakäyttöinen kaasuanturi, joka pystyy havaitsemaan 60 miljardisosan (ppb) typpidioksidipitoisuuden. shear 0 10 ppm NO2 'R/R0 (%) -20 -40 -60 N2 -80 0 N2 UV 5 10 15 Time (min) 20 Kuva 3. Grafiitin mekanokemiallinen eksfoliointi (ylh. vas.); grafeenioksidin kemiallinen pelkistys vanadiinilla (alh. vas.); grafiittia (kiinteä) ja grafeenioksidi-vesi –suspensio ennen ja jälkeen pelkistyksen (ylh. oik.); pelkistetystä grafeenioksidista valmistettu kertakäyttöinen kaasuanturi (alh. oik.) 91 Kemian kevät 2015 – Tutkimusryhmät Fullereenien tutkimus keskittyy C60-fullereeniin ja sen johdannaisiin. Nämä johdannaiset sisältävät kompleksoivia ja itsejärjestymistä edesauttavia ryhmiä. Ne ovat hyviä elektronivastaanottajia ja soveltuvat täten hyvin aurinkokennoihin. Kuva 4. Fullereenin rakenne ja C60-tolueeniliuos sekä pinta-modifioitu fullereenimolekyyli Ioniset nesteet (suolasulat) ovat suurikokoisista ja epäsymmetrisistä orgaanisista kationeista ja anioneista koostuvia suolasulia, jotka ovat huoneenlämmössä nestemäisiä. Ionisilla nesteillä on osoitettu olevan suuri vaikutus johdepolymeerien morfologiaan ja sähkökemialliseen aktiivisuuteen. Niitä voidaan käyttää esimerkiksi malmien erotuksessa, lääkeaineiden valmistuksessa, lämmönsiirrossa, hiilidioksidin talteenotossa, aurinkokennojen ja polttokennojen valmistuksessa sekä eri materiaalien nanorakenteen muokkauksessa. Tutkimuksessa ionisia nesteitä käytetään komposiittien valmistukseen. Kuva 5. Ruokasuola (vas.) ja ioninen neste (oik.) lämpötilassa 25 °C. Funktionaaliset ohutkalvot Sovellutuksia varten on useissa tapauksissa tarkoituksenmukaista valmistaa toiminnallisista materiaaleista ohuita kalvoja. Ohutkalvoilla tarkoitetaan tässä yhteydessä kalvoja, joiden paksuus vaihtelee välillä 1 – 100 nm, toisinaan mikrometriin asti. Tälläisiä kalvoja valmistetaan ryhmässä yleensä kolmella eri menetelmällä, itsejärjestymisen avulla (ohuimmat, yleensä vain yhden molekyylin paksuisia), vaiheittaisen kerrostamisen avulla (paksuus > 1 nm) sekä sähkökemiallisesti polymeroimalla (paksuimmat, jopa mikrometrejä). Itsejärjestyneitä monomolekulaarisia kalvoja käytetään yleensä vain tutkimustarkoituksiin, kun on päämääränä selvittää jonkin yksittäisen komponentin toimintaa ja rakennetta herkillä sähkökemiallisilla ja spektroskooppisilla menetelmillä. Sen avulla myös esikäsitellään kasvatusalustoja kalvojen kasvattamista varten muilla menetelmillä. Vaiheittainen kerrostus on monipuolinen ja helppo menetelmä, jolla voidaan muodostaa lähes mielivaltaisia eri komponentteja sisältäviä monikerroskalvoja lähes mille tahansa alustalle. Menetelmä voidaan käytännössä toteuttaa eri tavoin ja ryhmässä on rakennettu automaattiset kalvonkasvatuslaitteistot ns. kasto-, pyöritys-, ruiskutus-, pyöritys-ruiskutus – ja sumutusmenetelmiä varten. Kaikissa perusperiaatteena on kuitenkin kalvojen muodostaminen adsorboimalla pintaan vuorotellen positiivisesti tai negatiivisesti varautuneita molekyylejä. Automaattisten kasvatuslaitteistojen avulla voidaan valmistaa lähes mielivaltaisen koostumuksen omaavia satojakin kerroksia sisältäviä ohutkalvoja. Käytetyt materiaalit ovat yleensä synteettisiä (ja toiminnallisia), biologisia tai bioinnoitettuja polyelektrolyyttejä, nanopartikkeleita ja 2Dnanomateriaaleja (grafeeni ja sen johdokset sekä analogit). Tällä hetkellä aktiivisen tutkimuksen kohteena ovat hapettavat monikerroskalvot, jotka itsestään muodostavat pinnalleen ohuen johdepolymeeri- tai melaniinikerroksen, kun ne joutuvat kosketuksiin vastaavan monomeerin kanssa. 92 Kemian kevät 2015 – Tutkimusryhmät Kuva 6. Vaiheittainen kerrostus kasto- (vas.) ja pyöritys-ruiskutus –menetelmällä (kesk.), esimerkkinä TiO2-nanopartikkeleita sisältäviä eripaksuisia kalvoja (oik.). Sähkökemiallista polymerointia käytetään erityisesti johdepolymeeri- ja redoksipolymeerikalvojen valmistuksessa. Johdepolymeerit valmistetaan yleensä hapettamalla vastaavaa monomeeria, jolloin polymeerikalvon kasvua voidaan seurata sähkökemiallisesti. Redoksipolymeereja voidaan valmistaa myös pelkistämällä. Ryhmässä tutkitaan esim. syanopyridiinimonomeereista pelkistämällä valmistettuja viologeenipohjaisia redoksipolymeereja. 0.02 I / mA 0.01 0.00 -0.01 -0.02 -0.03 -1.2 -1.0 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 E/V Kuva 7. Ylhäällä pyrrolin ja alhaalla vasemmalla syanopyridiinin sähkökemiallinen polymerointi. Alhaalla oikealla polymerointi syklisellä voltammetrialla. Ohutkalvojen tutkimusmenetelmät Paitsi itse ohutkalvoja ja niiden komponentteja ryhmässä kehitetään myös kalvojen tutkimusmenetelmiä. Pääkohteena ovat tällöin erilaiset sähkökemiallisten ja spektroskooppisten 93 Kemian kevät 2015 – Tutkimusryhmät menetelmien yhdistelmät, spektrosähkökemialliset menetelmät. Erityisesti keskitytään tutkimusmenetelmiin, joissa kalvoja voidaan tarkastella ns. in situ –olosuhteissa, joka tässä tapauksessa yleensä tarkoittaa nesteen alla tapahtuvia mittauksia. Näitä ovat erilaiset värähdysspektroskoopisten ja sähkökemiallisten menetelmien kombinaatiot sekä moduloitu reflektanssispektroskopia. Ryhmässä on myös kehitetty ohutkalvojen mekaanisten ominaisuuksien mittausmenetelmä. FTIR UV-Vis external reflection hole for filling or purging ZnSe window Electroactive film Potentiostat reference electrode bridge Raman Electroactive film FTIR internal reflection Counter electrode Reference electrode Laser beam IR -beam Ge or ZnSe reflection element Kuva 8. Ryhmässä rakennettuja mittauslaitteistoja UV-Vis-Raman– ja FTIR-heijastusspektrosähkökemiaa (vas.) sekä moduloitua reflektanssispektroskopiaa (oik.) varten. Yhteistyökumppaneita ovat mm. ¾ IFW:n tutkimuslaitos, Dresden, Saksa ¾ Kuninkaallinen teknillinen korkeakoulu, Tukholma, Ruotsi ¾ Modenan yliopisto, Modena, Italia ¾ Szegedin yliopisto, Szeged, Unkari ¾ Uppsalan yliopisto, Uppsala, Ruotsi ¾ Institute of Physical Chemistry, University of Linz, Itävalta ¾ University of Cambridge, Wolfson College, Iso-Britannia ¾ University of Copenhagen, Tanska ¾ Changchun Institute of Applied Chemistry, Kiina ¾ University of Tirana, Albania ¾ University of Reims Champagne-Ardenne, Ranska ¾ Jožef Stefan Institute, Ljubljana, Slovenia ¾ University of Urbino, Italia 94 Kemian kevät 2015 – Erikoistyöt KERROS-KERROKSELTA KOOTUT OHUTKALVOT JA LUMINESOIVAT KALVOSENSORIT Hannu Grönberg ja Keijo Haapakka Toiminnallisten materiaalien tutkimusryhmä, Materiaalikemian ja kemiallisen analyysin laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto htmgro@utu.fi Abstrakti Kerros-kerrokselta eli LbL-tekniikalla valmistettuja ohutkalvoja on tutkittu runsaasti viimeiset 20 vuotta. Ohutkalvojen valmistamiseen voidaan käyttää kastamis-, sumutus- tai sumutus-pyöritysmenetelmiä. Kalvoja on rakennettu sekä tasaisten ja epätasaisten pintojen että nanohiukkasten päälle. Luminesenssiin perustuvat sensorit käyttävät hyväksi värinkantajia, kromoforeja. Kromoforit aiheuttavat signaalin, joka voidaan mitata tai on nähtävissä. Johdanto Itsejärjestymiseen verrattuna LbL-menetelmällä valmistetut kalvot ovat paremmin hallittavissa. Niiden käyttö ja tutkimus onkin lisääntynyt vauhdikkaasti 1990-luvun lopulta lähtien. Koska LbLkalvojen valmistukseen on erilaisia menetelmiä, pyrittiin selvittämään, mikä menetelmä on sopivin. Pyrittiin selvittämään rakentumista myös ajallisesti. Valo-opillisiin menetelmiin, kuten luminesenssiin, perustuvat tutkimusmenetelmät ovat eihajottavia ja ei-kajoavia ja niidenkin käyttö on lisääntynyt viime vuosina. Selvitettiin, onko luminesenssiin perustuvilla menetelmillä käyttöä sensoreina, mikä on LbL-kalvojen merkitys sensoreissa ja esiteltiin sensorityyppejä. Erikoistyö on kirjallisuustutkimus. Tulokset ja johtopäätökset Muutaman nanometrin paksuisia ohutkalvoja voidaan valmistaa valtavasta valikoimasta rakennusaineita. Kuvassa 1a on kuvattu kahden ensimmäisen adsorptiovaiheen yksinkertaistettu molekylaarinen periaate. Aluskerros on positiivisesti varattu. Se kastellaan polyanioniliuokseen, joka tarttuu positiiviseen kerrokseen muutamassa sekunnissa. Sen jälkeen tapahtuu 5-20 min kestävä järjestyminen. Tätä seuraa huuhteluvaihe, joka huuhtelee muun kuin yhden lähimmän kerroksen. Seuraavana on kastelu polykationiliuokseen, tarttuminen, järjestyminen ja huuhtelu. Näin voidaan toistaa useita kertoja, tapauksesta riippuen kymmeniä tai satoja kertoja. Kuvassa 1b on kuvattu kastelemista dekanttereissa. Kuvassa 1c on kastelemisen sijasta sumutusmenetelmä. Sumutusmenetelmän etuina ovat pienempi kemikaalin kulutus ja mahdollisuus automatisointiin. Sumutusmenetelmään voidaan yhdistää aluskerroksen pyöritys. Siinä keskipakovoima työntää kemikaalia ulospäin, niin että vain ohut kerros jää jäljelle. Parhaan laadun kalvot, kun ajatellaan rakentumisen toistettavuutta ja kerrospaksuuksien tasaisuutta, luotiin käyttämällä menetelmää, jossa kalvo pidettiin vakioisesti märkänä. Tämä tarkoittaa, että pohjakerros pidetään pyörimässä ja sitä joko sumutetaan polyelektrolyyttiliuoksella tai huuhdellaan vedellä ilman mitään viivettä vaiheiden välillä. Kalvoja voidaan rakentaa monen eri aluskerrostyypin päälle. Kuvassa 2 on esitetty näkyvä muutos. Tasaisen aluskerroksen lisäksi ohutkalvoja voidaan muodostaa nanohiukkasten ja misellien ympärille. Näin muodostetut hiukkaset ovat lupaavia lääkeainejakelun ja bioaistimisen työkaluja. Luminesenssi on säteilyn itsestään tapahtuvaa emissiota elektronisesti kiihdytetyltä lajilta tai värähtelyillä kiihdytetyltä lajilta, joka ei ole lämpötasapainossa ympäristönsä kanssa. Kun molekyyli absorboi valoa, absorptiota seuraava purkautuminen voi tapahtua eri tavoilla. Fluoresenssi ja fosforesenssi ovat luminesenssin erikoistapauksia. 95 Kemian kevät 2015 – Erikoistyöt Värin kantajat eli kromoforit ovat kemiallisia ryhmiä, jotka vaihtavat väriä ja värin voimakkuutta joutuessaan erityisen analyytin ympäristöön. Myös LbL-kalvossa kromoforin ollessa osa polyelektrolyyttiä tämä vaihdos tapahtuu kemian sääntöjen mukaan. Luminesenssia voidaan siis käyttää hyödyksi monikerroskalvosensoreissa oksastamalla polyelektrolyyttiin kromoforeja. Ne aiheuttavat aallonpituusmaksimin muutoksen eli Stokesin siirtymän ja signaalin, joka voidaan mitata tai on nähtävissä. Elektronisesti kiihdytetyt tilat, eksitonit ja niiden liikkuvuus aiheuttavat luminesenssin ja värimuutoksen. Eksitonien liikkuvuuteen voidaan vaikuttaa lisäämällä molekyylien haarautuneisuutta ja siten aggregoitumista. Pääosa kaupallisista sensoreista perustuu orgaanis-polymeeriseen tai epäorgaanis-puolijohtavaan kalvoon, joka absorboi tai reagoi analyyttimolekyylien kanssa. Kuva 1. LbL-tekniikan periaate.[1]. Kuva 2. TiO 2 /polystyreenisulfonaattikalvoja piialuskerrosten päällä. Käsittelemätön pii (ylhäällä vasemmalla), 15 kaksoiskerrosta (ylhäällä oikealla), 20 kaksoiskerrosta (alhaalla vasemmalla) ja 25 kaksoiskerrosta (alhaalla oikealla) [2]. Viitteet 4. 5. G. Decher ja J. B. Schlenoff (toim.): Multilayer Thin Films, Sequential Assembly of Nanocomposite Materials, 2. painos 2012 M. Salomäki, T. Peltonen, J. Kankare: Multilayer films by spraying on spinning surface – Best of both worlds. Thin Solid Films 2012, 520, 5550-5556 96 Kemian kevät 2015 – Erikoistyöt SÄHKÖÄ JOHTAVAT KOMPOSIITIT: KALSIUMKARBONAATIN PÄÄLLYSTÄMINEN JOHDEPOLYMEEREILLÄ Ilkka Palmunen1*, Pia Damlin1, Carita Kvarnström1, Juuso Hakala2 ja Matti Lammela2 *iapalm@utu.fi 1 Toiminnallisten materiaalien tutkimusryhmä, Materiaalikemian ja kemiallisen analyysin laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto 2 Nordkalk Oy Ab, Kehityslaboratorio, Skräbbölentie 14-16, 21600 Parainen Abstrakti Sähköä johtavia materiaaleja voidaan käyttää antistaattisina pinnoitteina estämään esimerkiksi tulipalojen syntyä tai elektronisten komponenttien hajoamista. Tässä työssä valmistettiin uudenlaisia komposiittipartikkeleita päällystämällä täyteaine CaCO3:a eri johdepolymeereillä. Kalkin massaosuutta (25-90 m-%) ja muita parametreja vaihdeltiin näytteiden välillä. Materiaaleja karakterisoitiin käyttäen FTIR-, SEM- ja johtavuusmittauslaitteita. Tulosten perusteella arvioitiin komposiittien antistaattisia ominaisuuksia, jotka vaihtelivat valmistustavasta riippuen paljon. Johdanto Johdepolymeerit ovat herättäneet maailmalla kasvavaa mielenkiintoa vuodesta 1977 asti, jolloin niitä ensimmäisen kerran syntetisoitiin. Niitä voidaan hyödyntää erilaisissa sovelluskohteissa kuten esimerkiksi näytöissä, ladattavissa paristoissa tai sensoreissa [1]. Tavallisimpia ovat kuvassa 1 esitetyt, joita käytettiin myös tässä työssä. polyaniliini poly(3,4-etyleenidioksitiofeeni) polypyrroli Kuva 1. Työssä syntetisoitujen johdepolymeerien rakenteet. Johdepolymeerien huono prosessoitavuus ja mekaaniset ominaisuudet ovat toisaalta rajoittaneet niiden laajaa käyttöä. Nykyisin tutkitaankin paljon uusia komposiittimateriaaleja, joissa orgaanisia tai epäorgaanisia partikkeleita on päällystetty johdepolymeereillä. Tällöin voidaan saada yhdistettyä kunkin osakomponentin hyvät kemialliset ja fysikaaliset ominaisuudet tuotteessa. Kalkki on hyvin yleisesti käytetty halpa täyteaine, jota on tutkittu paljon. Siitä on jalostettu monia erilaisia laatuja, joilla on hyviä mekaanisia ominaisuuksia. Se soveltuu hyvin mm. erilaisiin pinnoitteisiin, ja näistä syistä sitä käytettiin myös tässä työssä täyteaineena. Työn ensisijaisena tarkoituksena oli saada komposiitit staattisia varauksia purkaviksi, mikä edellyttää materiaalilta riittävän hyvää sähkönjohtokykyä. Kalsiumkarbonaatin toivottiin kompensoivan johdepolymeerien mekaanisia puutteita ja laskevan mahdollisten tuotteiden hintaa. 97 Kemian kevät 2015 – Erikoistyöt Materiaalit ja menetelmät Polymeerien synteesejä varten käytettiin niitä vastaavia monomeereja eli aniliinia, 3,4etyleenidioksitiofeenia ja pyrrolia (Sigma-Aldrichilta). Polymerisaatioreaktioissa monomeerit hapetettiin pääasiassa ammoniumpersulfaattia tai rauta(III)kloridia käyttäen. Kalsiumkarbonaattia saatiin erä Nordkalk Oy Ab:lta ja sitä sekoitettiin polymeereihin kahta eri tapaa käyttäen. In-situ menetelmässä kalkkidispersio lisättiin heti polymeerisaatioreaktion alussa reaktioastiaan, kun taas ex-situ menetelmässä se lisättiin vasta polymerisaation jälkeen. Näytteitä analysoitiin Keithley 2400 Source Meter johtavuusmittarilla, Zeiss Supra 55VP pyyhkäisyelektronimikroskoopilla ja Bruker Vertex 70 FTIR-laitteella. Tulokset ja johtopäätökset Työssä onnistuttiin valmistamaan polyaniliinia, poly(3,4-etyleenidioksitiofeenia) ja polypyrrolia (kuva 1) käyttäen kemiallista hapettavaa polymerisaatioreaktiota. Tämä voitiin osoittaa vertailemalla kunkin puhtaan polymeerin FTIR-spektrejä vastaaviin kirjallisuudesta löytyviin spektreihin. Johtavuusmittaukset myös puolsivat onnistuneita polymerisaatioita, kun parhaimmillaan tuloksiksi saatiin konduktiivisuusarvoja odotetusti alueelta 1x10-4 – 1x102 S / cm. Polyaniliinin ja polypyrrolin johtavuusarvot olivat hyvin samaa luokkaa, noin 20 S / cm, kun taas parhaan poly(3,4-etyleenidioksitiofeenin) johtavuus oli noin 2x10-4 S / cm. Varsinaisia CaCO3/johdepolymeeri -komposiitteja pyrittiin valmistamaan ensin in-situ sekoittamalla kalkki ja monomeeri vesidispersioksi ja käynnistämällä reaktio hapettimen lisäyksellä. Komposiitti saatiin näin johtavaksi, mutta kalkille ominaisia värähtelyitä ei nähty enää FTIR-spektreissä. SEM kuvissa näkyi kuitenkin kaksi eri faasia. Tämä voidaan selittää seuraavilla reaktioyhtälöillä (1) ja (2). (1) (2) CaCO3 + H2SO4 CaSO4 + H2CO3 Reaktiossa (1) vapautuvat protonit saavat kalkin hajoamaan (2) monomeerista riippumatta, ja kalsium saostuu anionista riippuen eri suoloina, tässä tapauksessa kalsiumsulfaattina. Protoneista aiheutuvan ongelman ratkaisemiseksi komposiitteja yritettiin myös valmistaa käyttäen ex-situ menetelmää. Siinä tavoitteena oli ensin syntetisoida polymeeri, ja sitten mekaanisesti sekoittaa tämä kalkkiin neutraloinnin jälkeen. Näin saatiinkin säilytettyä kalkin alkuperäinen koostumus, mutta huomattavasti alentuneilla komposiittien konduktiivisuusarvoilla. Komposiiteille, joissa kalkin osuus oli ≥ 50 m-% , saatiin johtavuudeksi arvoja σ < 5x10-6 S / cm. Mahdollisten tuotteiden kehittäjille jää harkittavaksi komposiittien johtavuuden ja mekaanisten ominaisuuksien painoarvot. Sovelluksesta riippuen osa näytteistä voisi riittävän hyvin purkaa staattisia varauksia, omaten samalla kohtuullisen hyvät mekaaniset ominaisuudet. Jatkossa voidaan vielä tutkia kalkin ja polymeerien sekoitussuhteita, jotta löydettäisiin sopiva tasapaino johtavuuden ja mekaanisten ominaisuuksien välille. Lisäksi ex-situ menetelmää voitaisiin kehittää vielä niin, että polymeerit saataisiin paremmin sekoitettua täyteaineeseen tai adsorboitumaan CaCO3-partikkelien pinnalle konduktiivisuusarvojen parantamiseksi. Viitteet 1. Stejskal, J. ja Gilbert, R. G., Pure Appl. Chem. 2002, 74, 857-867. 98 Kemian kevät 2015 – Erikoistyöt HYVÄLAATUISTEN OHUTKALVOJEN KASVATUS GRAFEENIOKSIDILLA JA POLYELEKTROLYYTEILLÄ ULTRAÄÄNINEBULISAATION AVULLA Timo Parviainen*, Mikko Salomäki ja Jukka Lukkari Toiminnallisten materiaalien tutkimusryhmä, Materiaalikemian ja kemiallisen analyysin laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto *tjparv@utu.fi Abstrakti Ultraääninebulisaatio on metodi, joka on kustannustehokas, hellävarainen ja skaalautuva, sekä jolla on mahdollista päällystää vesiliukoisia, biologisia, huokoisia tai muuten herkkiä materiaaleja. Tutkittiin metodin käyttökelpoisuutta ohutkerrosten valmistamiseen kahdella erilaisella materiaalilla; grafeenioksidilla ja polyelektrolyyteillä. Oikeiden parametrien löydyttyä saatiin valmistettua hyvälaatuisia ja ohuita kalvoja. Todettiin metodin olevan tehokas, ja sillä olevan potentiaalia muun muassa sensorien valmistamiseen. Johdanto Ultraääninebulisaatio ei ole teknologiana uusi asia, mutta sen käyttö ohutkalvonkasvatuksessa on. Sen mielenkiintoisin ominaisuus on synnyttämän aerosolisuihkun tippakokojen pienuus. Aerosolin nestefaasi on helposti kuivattavissa ennen sen saapumista päällystettävän materiaalin pinnalle, joten kyseessä on kuiva ja hellävarainen päällystysmetodi. Täten se soveltuu monenlaisen vaikeasti päällystettävän, kuten vesiliukoisen tai biologisen materiaalin päällystämiseen. Pieni hiukkaskoko mahdollistaa myös muun muassa huokoisten materiaalien ja hankalan muotoisten esineiden päällystämiseen, varsinkin jos metodi yhdistetään spinpäällystykseen. [1,2] Ohutkerroksia voi tehdä monenlaisista materiaaleista, joista nanorakenteiset grafeenianalogit ja polyelektrolyytit ovat hyviä esimerkkejä. Polyelektrolyyttien etuna on valtava määrä tieteellisestä kirjallisuudesta löytyvää vertailumateriaalia [3], joiden avulla parametritkin saattavat ovat ennustettavissa. Grafeenianalogit, tässä tapauksessa nanopallot ja nanopalloklusterit taas ovat mielenkiintoisia niiden huokoisen rakenteen ja suuren pinta-alan takia. Tässä työssä tarkoituksena oli tutkia ultraääninebulisaatiopäällystystä grafeenioksidilla ja polyelektrolyyteillä. Odotettavissa oli hyvälaatuisia ohutkalvoja, joiden ominaisuudet olisivat muokattavissa ja vähintään vastaisivat aiemmin eri metodeilla valmistettuja. Onnistuessa löytyisivät sopivat parametrit hyvälaatuiselle päällystykselle, ja saataisiin aikaan nanorakenteinen grafeenioksidipinta, joka voisi jatkossa olla funktionalisoitavissa. Materiaalit ja menetelmät Työssä käytettiin Sonaer Ultrasonicsin valmistamaa ultraääninebulisaattorilaitteistoa, johon päällystyksessä käytetyt nesteet ja pesuneste pumpattiin tietokoneohjatusti. Ultraäänikärjen tuottama aerosolisuihku oli suunnattu ohjauskaasuvirtauksen avustuksella N-trimetoksyylisilaanipropyyli-N,N,N-trimetyylammoniumilla funktionalisoidulle, spinnerilaitteistossa pyörivälle piilevylle. Käytettiin muokatulla Hummersin metodilla valmistettua grafeenioksidia [4], joka oli laimennettu 0,6 mg/ml konsentraatioon. Työssä käytettiin myös natriumpoly(styreenisulfonaatin) ja poly(diallyylidimetyyliammonium)kloridin 10 mM vesiliuoksia, joita suihkutettiin piilevylle vuorotellen siten, että välissä tapahtui vedellä tapahtunut pesusuihkutus. Grafeenioksidipäällystettyjä piilevyjä tutkittiin atomivoimamikroskoopilla, skannaavalla elektronimikroskoopilla ja FT-IR -spektrometrillä. Polyelektrolyyttiohutkerroksilla päällystettyjä piilevyjä tutkittiin ellipsometrialla ja atomivoimamikroskoopilla. 99 Kemian kevät 2015 – Erikoistyöt Tulokset ja johtopäätökset Polyelektrolyyttipäällystys tapahtui pääosin ongelmitta. Tärkeimmät parametrit – nebulisaattoriin saapuvan nesteen virtausnopeus ja kokonaistilavuus – saatiin optimoitua kvalitatiivisessa tarkastelussa riittävällä tarkkuustasolla. Havaittiin myös, että jos ohutkerros pääsee relaksoitumaan tai kuivumaan kaksoiskerrosten välillä, lopputuloksen laatu heikkenee merkittävästi. Grafeenioksidin tapauksessa havaittiin käytetyn laitteiston olevan riittämätön saamaan aikaan täydellinen nanorakenteinen pinta. Ultraäänikärjestä lähtevä aerosoli ei kerennyt kuivua täysin ennen saapumistaan piilevylle, joten parhaimmilla piilevyillä tulos muistutti dropcast-tyylistä kalvonkasvatusta. Kyseiset parhaat valmistetut ohutkalvot olivat muuten laadultaan hyvä- ja tasalaatuisia, hiukkaskokovaihtelun rajoissa. Aerosolin kuivumisongelma on jatkossa helppo ratkaista käyttämällä pidempiä matkoja, sekä mahdollisesti lämmityselementtiä piilevyn ja ultraäänikärjen välillä. Tällöin aerosolin nestefaasi pääsisi kuivumaan tehokkaammin. Kuva 1. Piilevystä 8 (10 mM PSS ja PDADMAC, 10 kerrosta, 1 ml, 1 ml min-1) otettu AFMkorkeusdifferentiaalikuva, 20 * 20 mikrometriä. Taulukko 1. Käytettyjen esiasteliuosten tilavuuden ja virtausnopeuden vaikutus polyelektrolyyttiohutkerrosten kerrospaksuuteen. Piilevy Virtausnopeus / ml min-1 Tilavuus / ml Mittauskerrat a 1 2 3 4 5 6 7 8 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,2 5,0 1,0 1,0 0,2 10,0 0,2 10,0 1,0 1,0 1,0 10 10 10 1 1 1 1 1 a Kerrospaksuus / nm b 7,6 ± 0,1 6,5 ± 0,1 28,8 ± 0,4 3,6 ± 0,2 20,4 ± 0,2 15,6 ± 0,1 c 28,5 ± 3,6 d 13,1 ± 0,3 Ohutkerroksista joko suoritettiin ellipsometriamittaus joka kaksoiskerroksen jälkeen, tai yksi mittaus kymmenen kerroksen jälkeen, b Kymmenen kaksoiskerrosta, kolmen mittauspisteen keskiarvo, c Laskettu vain kahdesta mittauspisteestä, d Suuret RMSE-arvot; tulokset eivät kovin luotettavia Viitteet 1. 2. 3. 4. Stewart-Clark, S. S., Lvov, Y. M. ja Mills, D. K., J. Coat. Technol. Res. 2011, 8, 275-281. Salomäki, M., Peltonen, T. ja Kankare, J., Thin Solid Films 2012, 520, 5550-5556. Schlenoff, J. B., Dubas, S. T. ja Farhat. T, Langmuir 2000, 16, 9968-9969. Hirata, M., Gotou, T., Horiuchi, S., Fujiwara, M. ja Ohba, M., Carbon 2004, 42, 2929-2937. 100 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät STUDIES ON CATIONIC CONJUGATED POLYELECTROLYTES Sergio Ulises Espinosa Domínguez Functional Materials Chemistry Group, Laboratory of Materials Chemistry and Chemical Analysis, Department of Chemistry, University of Turku suesdo@utu.fi Research Director: Prof. Carita Kvarnström Supervisor(s): Dr. Pia Damlin, Prof. Carita Kvarnström Funding: The Mexican National Council for Science and Technology (CONACyT). Estimated time of PhD dissertation: 2016. Main aims of the PhD research Conjugated polyelectrolytes (CPEs) are conjugated polymers (organic molecules with a base structure of alternating single and double/triple bonds) functionalized with ionic groups (cationic or anionic), giving CPEs solubility in polar solvents (e.g. water) but keeping the delocalized electronic structure typical of conjugated polymers, which in solution and solid state generates unique optical and semiconducting properties, tunable by molecular-structure and media. Because of this, since the introduction of the first set of CPEs (almost 30 years ago), these molecules have been applied as fluorescence-based sensors (for temperature, solvent polarity, pH, and chemical or bio-chemical species). Also, CPEs are solution-processable, allowing their use for industrial scale production of different surfaces and devices, using for example layer-by-layer assembly or roll-to-roll printing. Both cationic and anionic CPEs also possess interesting surface-electronic properties (which are not yet well understood), reason why their use as selective layers in electronic and optoelectronic organic devices is a current frontier research field. The aim of this project is to gain understanding on different properties of cationic conjugated polyelectrolytes (CCPE) both in solution (mainly fluorescence-based studies) and solid state (mainly electrochemical and electronic studies), for (i) basic research (e.g. structural and media effects on packing and interactions) and/or (ii) possible applications (e.g. modified electrodes) purposes. The project is currently focused on the analysis of previously experimental data using different experimental and theoretical supporting tools (in collaboration with other research groups), and also generating new experimental results, from studies on composite materials, using mainly the same experimental approaches. Main results so far Figure 1 shows some of the molecules used in this project, while figure 2 shows some experimental results which are specific only for certain molecules, concentration and media. Some of these results are included in the manuscripts currently under preparation (see references), while some others could constitute new manuscripts (this is under evaluation as mentioned before). Figure 2a shows the shifts in oxidation onset (films) and absorption (but not in fluorescence) of solutions of certain homologous CCPEs. Figure 2b shows differences in particle size of homologous CCPEs in function of concentration (this does not affect fluorescence intensity). These two results point into packing differences in function of specific molecular differences and media. On the other hand figure 2c shows the behavior of two homologous CCPEs in presence of increasing concentrations of an anionic quencher (i.e. Stern-Volmer plots) in two different media. The difference observed could be attributed to selective blocking of the charged part of the CCPEs in solution. Finally, figure 2d shows the change in interaction kinetic constants in function of 101 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät temperature (i.e. van ‘t Hoff plots) of two CCPEs in two different media. The difference observed between media could be attributed mainly to hydrogen bonding in solution. (a) (b) Figure 1. Some general molecules used in the PhD work, (a) cationic conjugated polyelectrolytes (spacer length not shown) and (b) some anionic molecules used. (a) Shift CCPE 1 (b) No shift CCPE 2 Shift Media 1 (c) (d) Media 2 Media 1 Media 2 Figure 2. Differences in (a) optical/electrochemical properties and (b) particle size between certain homologous CCPE in common media, and differences in (d) Stern-Volmer and (d) van ‘t Hoff plots between certain CCPE (each curve), due to changes in the media. The significance of my research for the research group and the whole research field The molecules used in this PhD project have been used in this research group during more than 10 years now, however not with the approach of the present project, and therefore this work should generate new and valuable information for the group. On the other hand, as explained in the introduction, several CPEs (similar to those used in this project, however with different functional groups) are currently being studied and applied in electronic and optoelectronic applications, evaluating the effect of molecular structure, solubilizing media and solid-state packing, which means that this contribution should be useful for pure and applied research on CPEs. Papers to be included in the PhD thesis 1. 2. Domínguez, S. E., Meriläinen, M., Ääritalo, T., Damlin, P., Kvarnström, C. “Effect of media and molecular structure on optical-electrochemical properties of cationic polythiophenes”. Manuscript in preparation. Domínguez, S. E., Troshin, P. A., Damlin, P., Kvarnström, C. “Solution interactions between cationic polythiophenes and anionic quenchers in different media”. Manuscript in preparation. 102 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät VIOLOGEN BASED POLYMERS AND COMPOSITES FOR ELECTROCHROMIC DISPLAY APPLICATIONS Bhushan Gadgil Functional Materials Chemistry Group, Laboratory of Materials Chemistry and Chemical Analysis, Department of Chemistry, University of Turku bhraga@utu.fi Research Director: Prof. Carita Kvarnström Supervisor(s): Prof. Carita Kvarnström and Dr. Pia Damlin Funding: Academy of Finland, Graduate School of Chemical Sensors and Microanalytical Systems, Doctoral Programme in Physical and Chemical Sciences, Magnus Ehrnrooth Foundation Estimated time of PhD dissertation: 12/2015 Main aims of the PhD research The main goal of the thesis is to fabricate different viologen/polyviologen (V/PV) materials, V functionalized polymers and composites for their use in electrochromic displays. Electrochromism (EC), an electrically-controlled reversible color change, possesses unique properties for diverse applications including smart optoelectronics, mirrors, displays and solar control windows. In particular, EC windows and mirrors used in automobiles and airplanes have been commercially available for a while. Due to its redox active, intensely colored radical cation formation, (V/PV) materials are ideal candidates for EC applications. Key benefits of viologen (1,1-disubstituted-4,4bipyridinium dications) in electronic displays are low driving voltage for visual changes, high contrast, no need for backlight unit like LCDs, the possibility of large area displays and simple cell constructions. Inspired by these advantages of V/PV systems, we aimed to synthesize different conducting polymers bearing viologen functionalities or composites of V/PV materials with graphene as thin films on transparent conductors for EC applications. Main results so far In the first task, a thiophene monomer with a pendant cyanopyridine group was synthesized (Figure 1). Due to the difficulties in homopolymerization, electrochemical copolymerization method in order to achieve the desired polymer film with viologen functionality. The copolymer films were fully characterized >1@. In order to improve adhesion and insolubility of the above mentioned polymer film, we choose the ionic liquid which dissolves the monomer completely while the polymer film could withstand at the electrode during homopolymerization. We thus successfully achieved the goal of obtaining stable polythiophene film with pendant viologen units. Besides structural characterizations, the EC properties of this film were tested >2@. In the order to fully characterize these viologen based films, an in situ ESR/UV-Vis-NIR spectroelectrochemistry was performed at Spectroelectrochemistry Centre, IFW, Dresden, Germany. As a model compound, we synthesized a simple cyanopyridine based monomer. Its electropolymerization in aqueous electrolyte resulted in an ultimate PV film strongly adhered on the electrode surface. The film was characterized by electrochemistry and ESR/UV-Vis-NIR spectroelectrochemistry in order to study redox processes involved in the film >3@. Similarly, a spectroelectrochemical study was carried out with a polythiophene derivative bearing pendant viologen. A viologen entity has been found to enhance the overall EC contrast in such materials. The EC study of this polymer bearing viologen functionality led to one article >4@. 103 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät Figure 1. Structures of the monomers used in the PhD work. The films in our previous works have showed pleasing EC properties which might be useful in display applications. Working on the enhancement in the EC contrast, we have to consider the parameters like color diversity, memory effect, low cost, easy processibilty, low driving voltage and fast response times. In addition, another factor for enhancing the EC performance is the stability of the electrochrome which must undergo many repeatable color changes between colored and bleached states, thus remain operable over long scanning periods. For this reason, we developed composites of viologens with 2D materials like graphene in order to improve the kinetics as well as the electrochrome durability and high coloration efficiency >5@. The results showed that the composite assembly would work better in terms of long terms performance of the device (Figure 2). (a) (b) (c) Figure 2. (a)Schematic of PV-rGO nanocomposite showing possible interactions. (b) Photographs of the EC switching and (c) Color/bleach characteristics PV-rGO/FTO films at 525 nm. The significance of my research for the research group and the whole research field The afore mentioned research work has been carried out in close collaboration with people working in the functional materials group. Since the mid-eighties, the focus of the research group has been on soft materials like conjugated polymers and macromolecules. My doctoral research work has contributed in developing composites and novel functional polymers for electrochromic applications. In terms of the research field, the contributions are in a way quite broad. The future optoelectronics is in need of flexible and highly stable display materials. This thesis work would certainly offer interesting novel functional materials for ECDs and flexible OLEDs. Papers to be included in the PhD thesis 1. 2. 3. 4. 5. Gadgil, B., Damlin, P., Ääritalo, T., Kankare, J.; Kvarnström, C. Electrochim. Acta 2013, 97, 378-385. Gadgil, B., Damlin, P., Ääritalo, T.; Kvarnström, C. Electrochim. Acta 2014, 133, 268-274. Gadgil, B., Damlin, P., Ääritalo, T.; Kvarnström, C. accepted to RSC adv. 2015. Gadgil, B., Dmitrieva, E., Damlin, P., Ääritalo, T.; Kvarnström, C. J. Solid State Electrochem. 2015, 19, 77-83. Gadgil, B., Damlin, P., Heinonen, M.; Kvarnström, C. Carbon 2015, 89, 53-62. 104 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät EFFECT OF COMPLEX STRUCTURE ON LUMINESCENCE OF LANTHANIDE COMPLEXES Markus Räsänen Functional Materials Chemistry Group, Laboratory of Material Chemistry and Chemical Analysis, Department of Chemistry, University of Turku mpvras@utu.fi Research Director: Prof. Keijo Haapakka Supervisors: Dr. Harri Takalo, Prof. Keijo Haapakka and Prof. Emer. Jouko Kankare (optional supervisor) Funding: Doctoral Programme DIA-NET, Turku University Foundation. Estimated time of PhD dissertation: 2016 Main aims of the PhD research The aim of this research is to study the factors that effect on the luminescence properties of the lanthanide complexes. Depending on the ligand, the complexes are strongly luminescent and thus have wide application area including the usage in the bioanalysis. The next topic of this research are stabile Eu(III) chelates used in the immunoassay. The brightnesses of the luminescence of these chelates are very high, even twofold as compared to the commercial DELFIA enhancement solution used widely in the bioassays. The aim of research is to study the effect of the chelate structure on the luminescence properties of the chelates and also to study the reason for the following phenomenon: some of chelates are much brighter in a dried TLC plate than in solution. Figure 1 shows the schematic representation of the energy flow in the excited lanthanide complex. There is conversation in the literature concerning the roles of the charge transfer (CT) states in the energy flow within the lanthanide complexes. The partially purpose of this research is to study the roles of these states in the energy flow. Figure 1. Schematic representation of energy absorption, migration, emission (plain arrows) and dissipation (dotted arrows) processes in a lanthanide complex. 1S* or S = singlet state, 3T* or T = triplet state, A = absorption, F = fluorescence, P = phosphorescence, k = rate constant, r = radiative, nr = non-radiative, IC = internal conversion, ISC = intersystem crossing, ILCT = intra-ligand charge transfer, LMCT = ligand-to-metal charge transfer. Back transfer processes are not drawn for the sake of clarity. 105 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät Main results so far In the first article [1], the photophysical properties of the series of the substituted aromatic βdiketone complexes of Eu(III) were studied, where the substituents were selected because of their different electron donating ability. The electron donating ability had no straightforward effect on the quantum yield of the complexes, so apparently the ILCT-state does not play a role in the energy transfer from the ligand to Eu(III). Instead, the LMCT-state must have a role of importance, namely it quenches the luminescence. Moreover, the complexation of the ligand to a lanthanide ion seems partly to prevent the formation of the ILCT-state which makes possible to excite the Eu(III) ion via triplet state even in the complexes that have the ILCT (and LMCT) -state. In the second article [2], the blue-light excitable ternary Eu(III) complexes and their encapsulation into the polystyrene nanoparticles were studied. The ternary complexes consisted of the most interesting β-diketones used in the first article, the Lewis base (4’-(4-diethylaminophenyl)2,2':6',2''-terpyridine) and Eu(III). The complexes can be excited even at 450 nm and thus they can be applied to the biological imaging. Unfortunately, they are not stable in aqueous environments. Because of this, we tried to encapsulate them in to the polystyrene nanoparticles. This attempt was successful meaning that the particles loaded with these ternary complexes can be used the biological imaging. In the third article [3], the ternary complexes of EuEDTA with differently substituted dipicolinic acid (dpas) were studied to evaluate the role of dpas in the luminescence brightnesses of these complexes. These ternary complexes mimic the homogeneous duplex polymerase chain reaction assay concepts for which the dpas are synthetized. The aim of this study is to improve the brightness of the ternary complex of Eu(III) used presently in the assay. Eight of the studied dpas had brighter luminescence than in the assay currently used dpa of which one was nearly three times brighter. The significance of my research for the research group and the whole research field I do the experimental works in my group and plan the necessary measurements together with the group. Ligands and partly complexes are synthetized by others. Broadly, my research hopefully increases the understanding of the factors that effect on the lanthanide luminescence and maybe opens new applications. Papers to be included in the PhD thesis 1. 2. 3. Räsänen, M., Takalo, H., Rosenberg, J., Mäkelä, J., Haapakka, K., Kankare, J. J. Lumin. 2014, 146, 211-217. Räsänen, M., Takalo, H., Rosenberg, J., Soukka, T., Haapakka, K., Kankare, J. J. Lumin. 2015, 160, 128-133. Räsänen, M., Takalo, H., Rosenberg, J., Soukka, T., Haapakka, K., Kankare, J. manuscript to be submitted. 106 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät ELECTROACTIVE COMPOSITE MATERIALS FOR SUSTAINABLE ENERGY APPLICATIONS Milla Suominen Functional Materials Chemistry Group, Laboratory of Materials Chemistry and Chemical Analysis, Department of Chemistry, University of Turku milsuo@utu.fi Research Director: Prof. Carita Kvarnström Supervisor(s): Dr. Carita Kvarnström and Dr. Pia Damlin Funding: Kiinteistösäätiö Estimated time of PhD dissertation: 2019 Main aims of the PhD research This research focuses on understanding the electrochemical properties of different grapheneconducting polymer composite materials. The ultimate goal is to utilize these composites as active materials in flexible and sustainable energy applications. We will study the use of different conducting polymers (Fig. 1), different electrolyte solutions, different sources and preparation methods for graphene (GO, electrochemical exfoliation of graphite), and different preparation methods for composites (electrodeposition, spin-spray- and Layer-by-Layer –techniques) on the composite materials’ properties. Environmentally friendly and fully organic energy harvesting devices form a base for this PhD research. Main results so far Electrical double-layer capacitors (EDLC), also known as supercapacitors, are promising energy storage devices which offer long cycle life and high power density. Supercapacitors are used as temporary energy storage devices in renewable energy systems, such as wind power plants, as high peak power sources in vehicles, and as an interim power source in autonomous energy harvesting circuits when the primary source is not available. In their electrical performance they align between conventional capacitors and batteries. Their power density (kW/kg) is typically 10-fold compared with Li-ion batteries, and the charge time of a supercapacitor can be of the order of few seconds. Their cycle life can exceed 1 000 000 cycles, which is superior to battery cycle life (500 – 3000 cycles). In addition, supercapacitors can use aqueous electrolytes, so they do not contain hazardous or toxic materials which make them green energy storage devices. Among the various materials which have been investigated in these devices, carbon based materials are of great interest owing to their abundance, stability and environmental friendliness. Graphene, one of the “newest” available carbon allotropes, is an obvious choice for this application offering high specific surface area, high intrinsic electrical conductivity, and good chemical and thermal stability. Although the characteristics of graphene supercapacitors are very encouraging, there are still issues which must be addressed. In particular, the strong tendency of restacking into bigger graphite agglomerates decreases the active surface area of graphene, which results in low energy densities. The energy density in supercapacitors is only about 10 % of the energy density of a typical Li-ion battery. In addition to high performance supercapacitors there is also a great demand for the development of new inexpensive and flexible energy storage devices for soft portable equipment. Conducting polymers are lightweight, they have good tensile strength and they are flexible. However, swelling during cycling reduces their long term performance. This research will address this issue by utilizing graphene/conducting polymer composite structures. Graphene/conducting polymer composites show improved mechanical and electrical properties. 107 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät Electrochemistry offers a simple, gentle and versatile method for preparing composites. We have successfully prepared a reduced GO/PEDOT-composite material with a simple one-step electrochemical synthesis method in ionic liquids [1]. GO was also completely reduced by an electrochemical method, which doesn’t introduce extra components to the composite that could harm its electrical properties. The composites showed increased electrochemical activity and mechanical stability when compared to pure conducting polymer films. The properties of the composites were also tested in a flexible supercapacitor, and they showed good capacitive behavior and increased stability during cycling [2]. This work was made in collaboration with electronics group in Tampere University of Technology. Figure 1. Structures of conducting polymers that have good capacitive properties. The significance of my research for the research group and the whole research field This PhD research will be performed at Laboratory of Materials Chemistry and Chemical Analysis in the Group of Applied Materials Chemistry. The group has over 20 years of experience in electrochemical and spectroelectrochemical characterization of semiconducting materials. The use of conjugated polymers and other functional materials with potential for applications in sensors and organic solar cells has been the main lines in the research activity for some years. Successful application of organic materials in electronic devices depends on a thorough understanding of the materials electrochemistry, molecular structure and charge-transfer mechanism. Despite these features being closely related, they are often studied separately. By combining independent measuring techniques several parameters can be recorded simultaneously and a more extensive study can be made on the same sample under identical conditions. Such a combination of techniques has been the focus point of the group. Main emphasis has been on developing in situ measuring techniques for simultaneous electrochemical and spectroscopic (FTIR, Raman) studies suitable for thin film analysis. This enables simultaneous analysis of structural and electronic changes in a material. In devices consisting of composite materials it is inevitable to study the changes in the basic properties and performance of the materials as such and when combined with other materials. Here the spectroelectrochemical techniques play an important role. Though there are many publications on different composite materials’ performance in applications, the understanding of their electrical properties is still poor. This PhD research will focus on understanding these basic properties better. As was already mentioned, composites exhibit synergistic effect with enhanced charge density, electrical conductivity, and mechanical stability. In addition to supercapacitors, these composite materials can be utilized as active materials in sensors, organic solar cells and electrochromic displays, to mention a few. Papers to be included in the PhD thesis 1. Damlin, P., Suominen, M., Heinonen, M., Kvarnström, C. Ionic liquids for non-covalent modification of graphene sheets in conducting polymer composite materials, submitted manuscript. 2. Lehtimäki, S., Suominen, M., Damlin, P., Tuukkanen, S., Kvarnström, C., Lupo, D., Electrodeposited graphene-PEDOT composites in printable supercapacitors on plastic substrate, submitted manuscript. 108 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät ELECTROCHEMICAL SYNTHESIS AND CHRACTRIZATION OF POLYVIOLOGENS Nianxing Wang Functional Materials Chemistry Group, Laboratory of Materials Chemistry and Chemical Analysis, Department of Chemistry, University of Turku nianxing.wang @utu.fi Research Director: Prof. Carita Kvarnström Supervisor(s): Dr. Pia Damlin, Prof. Carita Kvarnström Funding: CHEMSEM graduate school, Academy of Finland Estimated time of PhD dissertation: 12/2015 Main aims of the PhD research My research is focused on the electrochemical synthesis of polyviologen materials and the characterization of their properties. In this work, a series of polyviologen materials were synthesized from different cyanopyridine based monomers. The electrochemical properties and structures of the materials were studied by many different techniques, such as electrochemical methods, UV-vis spectroscopy, Atomic Force Microscopy (AFM), FTIR spectroscopy, Raman spectroscopy, Scanning Electron Microscopy (SEM). Polyviologens have unique redox properties and can work as electrochromic materials and redox mediators. An aim of this research is to design different structures of the polyviologen materials, by adjust the structures the polyviologen materials can be applied as redox active matrices materials different molecules or work as functional in various electronics. Main results so far The viologen has got much attention due to its unique redox property, meaning the viologen can undergo two reversible redox processes showing three different forms, which can be seen in Fig. 1a. Additionally, the viologen can undergo intensive color changes upon reduction in the radical cation form, and the color could be violet or blue depending on the substituted groups, so the viologens were widely utilized in electrochromic devices and sensors. In this work, a series of polyviologen materials have been synthesized and characterized in the previous years. The polyviologens have exhibited good redox properties as shown in Fig 1b. Furthermore, by changing the substitute group, the potentials and the colors of the polyviologens can be turned. The structures of the polyviologens/copolyviologens were also studied. It has been proved that the cavities in a network structures of the polyviologens is controlled by the structures of the monomer, furthermore, the cavity size can also be enhanced by employing an additional monomer to form the copolyviologen. The hybrid film basing on the polyviologen and reduced Graphene Oxide have shown unique electrochemical property, which indicated the polyviologen materials with different cavities can be utilized as the host materials for various materials. Additionally, the polyviologens can also be synthesized with well-ordered structure, which give them more opportunities to work under various conditions. 109 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät 2,5 O2 5 mV/s 10 mV/s 20 mV/s 50 mV/s 100 mV/s 2,0 1,5 1,0 O1 I / μA 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5 R1 -2,0 R2 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 E vs Ag/AgCl [V] (a) (b) Figure 1. a) Scheme of viologen in its three redox forms. b) The redox response of a polyviologen film. The significance of my research for the research group and the whole research field The research of viologen materials has been mainly focused on the design of the molecules or supermolecules. Different electrochemical synthesis routes have been studied for film formation of polyviologen derivatives. The redox property can be easily turned in the polyviologen materials and the polymer can also work as the immobilization material for other molecules or particles by modifying the fined structure of the polymer backbone. Papers to be included in the PhD thesis 1. 2. 3. 4. Wang, Nianxing, Pia Damlin, Beatriz Meana Esteban, Timo Ääritalo, Jouko Kankare and Carita Kvarnström. 2013. Electrochemical synthesis and characterization of copolyviologen films. Electrochimica Acta 90.171-78. Wang, Nianxing, Anniina Kähkönen, Pia Damlin, Timo Ääritalo, Jouko Kankare and Carita Kvarnström. 2015. Electrochemical synthesis and characterization of branched viologen derivatives. Electrochimica Acta 154.361-69. Wang, Nianxing, Anniina Kähkönen, Timo Ääritalo, Pia Damlin, Jouko Kankare and Carita Kvarnström. 2015. Synthesis and Characterization of Polyviologen Film on the Linked Self Assembly Monolayer. Submitted to Langmuir. Wang, Nianxing, Zsófi Lukacs, Timo Ääritalo, Pia Damlin and Carita Kvarnström. 2015. Electrochemical Synthesis of Viologen and Reduction of Graphene Oxide as Composite material in Ionic Liquid, manuscript. 110 Kemian kevät 2015 Epäorgaanisen materiaalikemian tutkimusryhmäesittely ja opiskelijoiden abstraktit 2 kpl LuK-tutkielmien abstrakteja 1 kpl FM-erikoistyötä käsitteleviä minijulkaisuja 4 kpl FT-vaiheen etenemisraportteja 111 Kemian kevät 2015 – Tutkimusryhmät EPÄORGAANISTA MATERIAALIKEMIAA Dos. Mika Lastusaari ja Dos. Ari Lehtonen Epäorgaanisen materiaalikemian tutkimusryhmä, Materiaalikemian ja kemiallisen analyysin laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto s-posti: mika.lastusaari@utu.fi ja ari.lehtonen@utu.fi Epäorgaanisessa materiaalikemiassa tutkitaan ns. kovia materiaaleja eli materiaaleja, joissa on mukana myös epäorgaaniselle kemialle tyypillisiä alkuaineita. Epäorgaanisen kemian piiriin Turun yliopistossa kuuluvat sekä Harvinaisten maametallien kemian tutkimusryhmä (johtaja: Mika Lastusaari) että Metalliorgaanisen kemian ryhmä (johtaja: Ari Lehtonen). Harvinaiset maametallit (eli lantanidit + Y ja Sc) eivät nimestään huolimatta ole harvinaisia, vaan yleisempiä kuin esimerkiksi Ag tai Au ja yhtä yleisiä kuin vaikka Cr, Cu, Zn, Ni, V, Mo ja W. Näistä kolmea viimeistä tutkitaan metalliorgaanisen kemian ryhmässä. Epäorgaanisen materiaalikemian ryhmissä (Kuva 1) tutkitaan toki myös muita epäorgaanisia yhdisteitä. Hellen Isabella Is Mika Ari Antti An Tero Emilia Minnea Ik Iko Kuva 1. Epäorgaanisen materiaalikemian ryhmä. Loisteaineet Harvinaisten maametallien kemian tutkimusryhmän tärkein tutkimuskohde ovat loisteaineet. Epäorgaaniset loisteaineet ovat toiminnallisia materiaaleja parhaimmillaan, sillä ne muuntavat monenlaista energiaa näkyväksi valoksi, luminesenssiksi. Loisteaineiden tavallisia käyttökohteita ovat mm. näytöt, lamput, laserit, setelien yms. turvamerkinnät sekä lääketieteellinen kuvantaminen. Harvinaisten maametallien kemian ryhmän tutkimuksen pääkohteet ovat kestoluminesenssimateriaalit, joiden arkipäiväisin käyttö on itsevalaisevissa poistumistiekilvissä sekä up-convertoivat loisteaineet, joilla voidaan muuntaa IR-säteilyä näkyväksi valoksi ja jopa UVsäteilyksi. Näitä jälkimmäisiä materiaaleja ryhmässä tutkitaan erityisesti käytettäväksi lääketieteellisessä diagnostiikassa. Ryhmässä tutkitaan myös kummankin edellä mainitun loisteainetyypin soveltamista auringon energian talteenotossa ja muuntamisessa uusiutuvaksi energiaksi. Kasvit ja aurinkokennot eivät nimittäin pysty käyttämään hyväksi IR- ja UV-säteilyä, joten muuntamalla nämä näkyväksi valoksi, voidaan uusiutuvan energian tuottoa parantaa (Kuva 2). Lisäksi tärkeänä tutkimuskohteena ovat epäorgaaniset luonnonyhdisteet eli mineraalit ja niiden johdannaiset. 112 Kemian kevät 2015 – Tutkimusryhmät Kuva 2. Auringon energian hyväksikäytön parantaminen loisteaineiden avulla. Up-konvertoivat materiaalit Up-konvertoivien materiaalien tutkimiseen ryhmässämme ovat keskittyneet väitöskirja-työntekijät Tero Laihinen, Minnea Tuomisto ja Emilia Palo. Tero tutkii up-konversiota ja sen parantamista käyttämällä eri harvinaisten maametallien yhdistelmiä. Minnean ja Emilian päämääränä taas on saada parannettua IR-energian absorptiota käyttämällä hyväksi d-siirtymämetalleja tai orgaanisia antennimolekyylejä. Tärkein tällä hetkellä tutkittava up-konvertoiva materiaali on NaYF4 (Kuva 3). Up-konversion osalta tehdään yhteistyötä Turun yliopiston Biotekniikan ja Molekulaarisen kasvibiologian kanssa, koska tavoitteena ovat uudenlaiset lääketieteelliseen diagnostiikkaan soveltuvat määritykset sekä auringon energian käytön tehostaminen. Lisäksi uusiutuvan energian osalta yhteistyökumppaneita on Uppsalan (Ruotsi) ja Kööpenhaminan (Tanska) yliopistoissa sekä norjalaisessa Bioforsk-tutkimuskeskuksessa. Ryhmämme on mukana myös eurooppalaisessa COST-verkostossa ”The European upconversion network - from the design of photon-upconverting nanomaterials to biomedical applications”. 113 Kemian kevät 2015 – Tutkimusryhmät Kuva 3. Up-konvertoivat loisteaineet NaYF4:Yb3+,Ho3+ (vas.) ja NaYF4:Yb3+,Tm3+ (kesk.) 980 nm:n IR-laserin säteessä. Näytteet ovat kapillaariputkissa. Oikealla on nanokiteisen NaYF4:Yb3+,Er3+-materiaalin elektronimikroskooppikuva (TEM). Kestoluminesenssimateriaalit Kestoluminesenssissa materiaali luminoi pimeässä vielä pitkän aikaa sen jälkeen, kun virityslähde on sammutettu (Kuva 4). Kestoluminoivia materiaaleja ryhmässämme tutkii tällä hetkellä graduntekijä Isabella Norrbo. Yhteistyötä kestoluminesenssin saralla tehdään erityisesti São Paulon yliopiston (Brasilia) ja Puolan tiedeakatemian kanssa. Tavoitteena on selvittää kestoluminesenssin mekanismi eri materiaaleissa sekä kehittää materiaaleja erilaisiin sensori- ja merkkiainesovelluksiin. Kuva 4. Kestoluminoiva materiaali SrAl2O4:Eu2+,Dy3+ arkipäiväisessä käytössä. Luminoivat luonnonmateriaalit Luminesenssi on melko tavallinen ilmiö epäorgaanisille luonnonmateriaaleille eli mineraaleille. Ryhmässämme väitöskirjatyöntekijä Hellen Santos tutkii sekä luonnon että synteettisten savimineraalien käyttöä loisteaineina aurinkoenergiakeräimissä. Graduntekijä Isabella Norrbo taas tutkii synteettisiä hackmaniittimineraaleja (Kuva 5) sensorisovelluksiin. Hackmaniiteilla tavataan myös tenebresenssiä, mikä tarkoittaa värin palautuvaa muutosta, kun materiaali altistetaan sopivalle säteilylle (esim. UV- tai röntgensäteily). 114 Kemian kevät 2015 – Tutkimusryhmät Kuva 5. Kahden synteettisen Hackmaniitin väri eri lamppujen alla. Metalliorgaaninen kemia ja koordinaatiokemia Metalliorgaanisten yhdisteiden tutkimus tähtää uusien katalyyttien löytämiseen ja entsyymien aktiivisten keskusten mallintamiseen. Tutkittavat yhdisteet ovat pääasiassa monihampaisten organisten ligandien muodostamia vanadiini-, molybdeeni- ja volframikomplekseja. Ryhmässä tehty tutkimus liittyy eurooppalaisen COST-verkoston toimeen ”CMST COST Action CM1003 Biological oxidation reactions - mechanisms and design of new catalysts”. Tämän toimen aihepiiri käsittelee biologisia hapetusreaktioita. Katalyyttisten ominaisuuksien lisäksi kompleksiyhdisteillä on muitakin käyttökohteita. Esimerkiksi monilla siirtymämetallien kompleksiyhdisteillä esiintyy varauksensiirtoa ligandilta metallille. Tämä aiheuttaa voimakkaan absorption näkyvän valon alueella, joten kompleksit saattavat toimia myös aurinkokennoissa herkistiminä. Monihampaisia ligandeja voidaan käyttää lisäksi mm. metalli-ionien uuttamiseen vedestä orgaaniseen faasiin arvometallien kierrätyksessä. Vanadiini on yleinen alkuaine, jota on pieninä määrinä monissa eliöissä. Vanadiini on niissä usein osana jotain entsyymiä ja sen tehtävänä on katalysoida erilaisia hapetus- ja pelkistysreaktioita. Tässä ryhmässä tutkitaan sellaisia vanadiiniyhdisteitä, jotka muistuttavat rakenteeltaan (biomimeettinen) ja toiminnaltaan (biovirikkeinen) luonnossa esiintyviä entsyymejä. Kuva 6. Kloroperoxidaasin rakenne (vasemmalla) ja malliyhdisteitä (oikealla). 115 Kemian kevät 2015 – Tutkimusryhmät Myös molybdeeni ja volframi ovat tärkeitä alkuaineita erilaisten eliöiden aineenvaihdun-nassa. Näiden metallien tärkein rooli biologisissa prosesseissa liittyy erilaisiin hape-tusreaktioita katalysoiviin entsyymeihin. Kyseisten metallien yhdisteitä voidaan käyttää katalyytteinä myös monissa teollisissa prosesseissa. Kuva 7. Kaksiytiminen molybdeenikompleksi katalysoi alkoholien hapetusta ja alkeenien epoksidointia. Yhteistyökumppanit metalliorgaanisen kemian tutkimuksessa löytyvät Jyväskylän yliopistosta (erityisesti kiderakenteiden määritys) sekä Lundin yliopistosta (Ruotsi) ja Karl Franzen – yliopistosta (Graz, Itävalta). Tutkielmien aiheita Epäorgaanisen materiaalikemian syventäviä harjoitustöitä ja erikoistöitä voi tehdä kaikissa yllä esitellyissä aihepiireissä. Myös opiskelijan itsensä ehdottamat aiheet ovat tervetulleita. Pedagoginen tutkimus Epäorgaanisen materiaalikemian ryhmässä tehdään myös pedagogista tutkimusta. Mielenkiinnon kohteena ovat kemiaa yliopistossa opiskelevien opiskelu- ja oppimisstrategiat (Kuva 8). Tutkimuksen tarkoituksena on antaa kemian yliopisto-opetukselle välineitä paremmin suunnattuun opetukseen ja sitä kautta vaikuttaa oppimistuloksiin. Pedagogista tutkimusta tehdään yhteistyössä Turun yliopiston Yliopistopedagogiikan yksikön kanssa. Makro (silmin havaittava) Kemia Submikro (atomitaso ja teoriat) Esityksellinen (kaavat yms.) Kuva 8. Kemian kolmijakoisuus, jonka osaaluiden hallitsemiseen opiskelu- ja oppimisstrategioilla on merkittävä vaikutus. 116 Kemian kevät 2015 – LuK-tutkielmat SIIRTYMÄMETALLI-IONIEN KOMPLEKSEJA NELIHAMPAISTEN AMINOBISFENOLILIGANDIEN KANSSA Ville Eskonen Epäorgaanisen materiaalikemian tutkimusryhmä, Materiaalikemian ja kemiallisen analyysin laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto vijues@utu.fi Siirtymämetallien kompleksit nelihampaisten aminobisfenoliligandien kanssa muodostavat hyvin mielenkiintoisen yhdisteryhmän. Ne koostuvat aminobisfenoliligandista (Kuva 1), jolla on sivuketjunsa päässä jokin donoriatomi sekä siirtymämetallista, joka on useimmiten 4. tai 5. jakson metalli tai lantanoidi. Yhdessä ne muodostavat kompleksin, jolla voi olla mielenkiintoisia katalyyttisiä ominaisuuksia. Aminobisfenoliligandin neljä donoriatomia ympäröivät metalli-ionin muodostaen kuppimaisen rakenteen. Tämä tarkoittaa, että mahdollisille substraateille jää vielä 1–3 sitoutumispaikkaa. Tällaiset metallikompleksit katalysoivat mm. syklisten estereiden polymerisaatiota [1], alkeenien polymerisaatiota [2] ja Tischenkon reaktiota [3]. Metallien aminobisfenolikompleksit ovat usein hyvin yksinkertaisia valmistaa. Tyypillisesti ligandien synteesi tehdään käyttäen Mannichin reaktiota, jossa stoikiometriset määrät fenolia, formaldehydia ja primääristä amiinia reagoivat [4]. Saantoa parantaa, jos systeemiä refluksoidaan, säteilytetään tai lämmitetään [5–7]. Metalli-ionin lähteenä käytetään yleisesti kaupallisesti saatavia metallisuoloja niiden edullisen hinnan ja helpon saatavuuden vuoksi. Itse kompleksinmuodostusreaktio voidaan suorittaa monissa eri liuottimissa, joihin lähtöaineet liukenevat ja valmis tuote voidaan eristää saostamalla se liuoksesta. n Kuva 1 Kuva 1 Nelihampaisen aminobisfenolin yleinen rakenne. Ryhmät R kuvaavat eri fenolien substituentteja ja D on mikä tahansa alkyyliketju, joka sisältää donoriatomin. Viitteet 6. Amgoune, A., Thomas, C.M., Roisnel, T., Carpentier, J., Chem. Eur. J. 12 2006, 169 Tshuva, E.Y., Goldberg, I., Kol, M., Goldschmidt, Z., Chem. Commun. 2001 2120 Pang, M., Yao, Y., Zhang, Y., Shen, Q., Chin. Sci. Bull. 53 2008 1978 Tshuva, E.Y., Versano, M., Goldberg, I., Kol, M., Weitman, H., Goldschmidt, Z., Inorg. Chem. Commun 2 1999 371 10. Toupace, T., Dubberley, S.R., Rees, N.H., Tyrell, B.R., Mountforf, P., Organometallics 21 2002 1367 11. Kerton, F.M., Holloway, S., Power, A., Soper, R.G., Sheridan, K., Lynam, J.M., Whitwood, A.C., Willians, C.E., Can. J. Chem 86 2008 435 12. Riisiö, A., Wichmann, O., Sillanpää, R., Lett. Org. Chem 7 2010 298 7. 8. 9. 117 Kemian kevät 2015 – LuK-tutkielmat UPKONVERTOIVAT NANOPARTIKKELIT BIOLOGISESSA KUVANTAMISESSA Jaakko Oksa Epäorgaanisen materiaalikemian tutkimusryhmä, Materiaalikemian ja kemiallisen analyysin laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto jasaok@utu.fi Materiaalikemiaa voidaan soveltaa monilla aloilla. Eräs yleinen sovellus on biologinen kuvantaminen, jossa halutaan saada informaatiota eloperäisestä aineesta sopivan luminoivan yhdisteen avulla. Tämä yhdiste viritetään säteilyn avulla korkeammalle energiatasolle, jolloin se vuorostaan emittoi sähkömagneettista säteilyä (fotonin) paljastaen tietoa materiaalista. Biologisessa kuvantamisessa on viime aikoina kiinnitetty huomiota erityisesti lantanidia sisältäviin upkonvertoiviin nanopartikkeleihin. Näillä on erikoinen kyky muuntaa infrapunasäteilyä näkyväksi valoksi tai ultraviolettisäteilyksi. Näin ollen biologinen aine ei kärsi säteilyvaurioita, joten upkonvertoivilla nanopartikkeleilla voidaan merkata biomolekyylejä tai lääkeaineita niiden kuvantamisessa. Lisäksi kokeellisesti ei havaita mainittavaa myrkyllisyyttä soluille, kuvanlaadun heikkenemistä autofluoresenssista johtuen tai vaikeuksia elävän kudoksen kuvantamisessa. Osoittautuu, että nämä nanopartikkelit ovat sovelluskelpoisia soluihin käytettävän kaksifotonimikroskopian lisäksi myös elävän kudoksen multimodaalisessa kuvantamisessa, jossa samaa molekyyliä käytetään eri kuvantamismenetelmissä kuten MRI-, PET- tai CT-kuvantamisessa [1]. Viitteet 1. Yong Il Park, Kang Taek Lee, Yung Doug Suh ja Taeghwan Hyeon, Chem.Soc.Rev. 2015, 44, 13021317 118 Kemian kevät 2015 – Erikoistyöt RAKENTEEN VAIKUTUS SODALIITIN TENEBRESENSSIIN JA LUMINESENSSIIN Isabella Norrbo1*, Jari Sinkkonen2 ja Mika Lastusaari1 1 Epäorgaanisen materiaalikemian tutkimusryhmä, Materiaalikemian ja kemiallisen analyysin laboratorio, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto 2 Laitekeskus, Kemian laitos, 20014 Turun yliopisto *tijnor@utu.fi Abstrakti Erikoistyössä tutkittiin väriä vaihtavien sodaliittien (Na8[AlSiO4]6[Cl,S]2, kuva 1) ominaisuuksien muutosta rakenteen muuttuessa. Sodaliittien rakennetta muutettiin ja näytteiden ominaisuudet tutkittiin. Käyttämällä klooria ja rikkiä eri suhteissa sekä muuttamalla pelkistysaikaa valmistusvaiheessa pystyttiin vaikuttamaan värin vaihtumisen voimakkuuteen sekä loisteen kestoon, voimakkuuteen ja väriin. Johdanto Tenebresenssi on määritelmän mukaan reversiibeli fototransformaatio kahden muodon välillä, joilla on erilaiset absorptiospektrit. [1] Tenebresenssissä materiaali muuttaa väriä ulkoisen ärsykkeen vaikutuksesta. Perustilassa oleva materiaali on melko väritön. Värin muutos palautuu normaaleissa olosuhteissa takaisin muutamassa minuutissa, mutta pimeässä tummempi muoto säilyy. [2] Tenebresenssi aiheutuu värikeskuksista, jotka syntyvät, kun elektroni siirtyy ioneilta rakenteen vakansseihin. [2] Työn tarkoituksena oli parantaa sodaliittien (Na8[AlSiO4]6[Cl,S]2, kuva 1) luminesenssia ja tenebresenssiä sekä selvittää, mitkä osat rakenteessa vaikuttavat näihin ominaisuuksiin. Tämän selvittämiseksi valmistettiin sodaliiteja, joiden rakenteet eroavat toisistaan, ja erojen vaikutusta ominaisuuksiin selvitettiin erilaisten mittausten avulla. Tähän mennessä tenebresenssiä on hyödynnetty muun muassa aurinkolaseissa, jotka tummenevat auringon valon vaikutuksesta [2] sekä helposti pyyhittävissä optisissa muisteissa ja foto-optisissa kytkimissä [1]. Tutkimuksen tarkoituksena on selvittää, voidaanko tenebresenssin ja luminesenssin omaavia materiaaleja hyväksikäyttää optisissa sensoreissa. Kuva 2 Sodaliitin rakenne. SiO4- ja AlO4-kehikot, joiden sisässä Cl ja S. Na on kehikon ulkopuolella tasoittamassa varausta [2]. Materiaalit ja menetelmät Näytteet valmistettiin kiinteän olomuodon menetelmällä. Lähtöaineita punnittiin stoikiometrinen määrä, minkä jälkeen niitä jauhettiin 20 minuutin ajan. Lähtöaineet siirrettiin keraamisessa hehkutuslaivassa uuniin ja lämmitettiin 850 °C:ssa 48 h:n ajan. Kun näyte oli jäähtynyt, sitä jauhettiin 10 min. Lopuksi näyte pelkistettiin H2/N2 -kehässä 850 °C:n lämpötilassa useimmiten 2 h ajan. 119 Kemian kevät 2015 – Erikoistyöt Valmiiden näytteiden rakennetta tutkittiin jauheröntgendiffraktiolla, röntgenfluoresenssilla, kiinteän olomuodon NMR:llä ja IR:llä. Näytteen värin vaihtumista tutkittiin reflektiospektrien avulla ja näytteiden loistetta ja viivästynyttä luminesenssia Varian Cary Eclipse spektrometrillä. Tulokset ja johtopäätökset Valmistetut näytteet olivat enimmäkseen puhdasta sodaliittia. Epäpuhtautena joissakin näytteissä havaittiin NaCl:ia, joka oli valmistusprosessissa jäänyt reagoimatta. IR-mittauksissa tunnistettiin AlSiO4-kehikosta aiheutuvat symmetrinen ja asymmetrinen T-O-T -värähdys ja kehyksen taipumisesta aiheutuva heijastus. [3] (T=Si, Al) Röntgenfluoresenssimittauksilla todennettiin näytteen alkuaineiden osuudet massaprosentteina. Tuloksista nähtiin, että rikin määrää lisättäessä näytteissä kloorin määrä vähenee, jolloin voidaan todeta, että rikki korvaa kloorin sodaliitin rakenteen koloissa. Muutettaessa pelkistysaikoja huomattiin myös, että rikin määrä näytteessä vähenee pidemmillä pelkistysajoilla. Rikki siis haihtuu pois näytteestä, kun pelkistysaika pitenee. Näytteiden luminesenssia tutkittiin pääasiassa 254 ja 365 nm:lla viritettäessä. 254 nm:n virityksen jälkeen näytteet emittoivat pääosin sinistä valoa kun taas 365 nm:n virityksen jälkeen emittoitu valo oli punaista. (kuva 2) Kaikki näytteet eivät emittoineet ollenkaan 365 nm:lla viritettynä. Viritysspektreistä huomattiin, että 310 nm:n viritys antaa voimakkaimman luminesenssin, jonka huippu on 460 nm:ssa. Työn aikana raportoitiin ensimmäistä kertaa sodaliiteissa viivästynyttä luminesenssia. Viivästyneen luminesenssin voimakkuus ja kesto vaihtelivat huomattavasti rakenteen muuttuessa. Voimakkain viivästynyt luminesenssi oli Cl1,6S0,1 näytteellä, jota oli pelkistetty 4 h. Myös näytteiden tenebresenssissä huomattiin eroja. Näytteet, jotka eivät sisällä ollenkaan rikkiä, eivät myöskään vaihda väriä. Rikki on siis olennaisessa osassa värikeskusten syntymisessä. Tenebresenssi oli voimakkainta Cl1,6S0,1 näytteellä, jota oli pelkistetty 2 h. Sodaliittien luminesenssi 3000 Cl(1,6)S(0,1) pelkistys 4 h 310 nm 2500 Intensiteetti (a.u.) Cl(1,4)S(0,2) 310 nm 2000 Cl(1,6)S(0,1) 50 % Na:sta korvattuCa:lla 240 nm 1500 1000 Cl(0,0)S(0,5) 350 nm 500 0 350 Cl(1,2)S(0,2) 310 nm 400 450 500 550 600 650 700 750 Aallonpituus (nm) Kuva 3 Sodaliittien luminesenssi eri näytteissä. Viritysaallonpituus on valittu jokaiselle näytteelle parhaiten sopivaksi. Viitteet 1. 2. 3. Irie M., Photochromism: Memories and Switchess – Introduction, Chem. Rev., 100, (2000), 1683–1684. Armstrong J. A., Weller M.T., Structural observation of photochromism, Chem. Commun., 2006, 1094–1096. Buhl J-C., Schuster K., Robben L., Nanocrystalline sodalite grown from superalkaline NaCl bearing gels at low temperature (333 K) and the influence of TEA on crystallization process, Micropor. Mesopor. Mat., 142, (2011), 666-671. 120 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät UP-CONVERSION LUMINESCENCE MATERIALS Tero Laihinen Inorganic Materials Chemistry Group, Laboratory of Materials Chemistry and Chemical Analysis, Department of Chemistry, University of Turku telaih@utu.fi Research Director: Prof. Hölsä Supervisor(s): Dr. Lastusaari Funding: Doctoral Programme in Physical and Chemical Sciences, Nordic Energy Research (AquaFEED project) and Academy of Finland (NOMSEC project). Estimated time of PhD dissertation: 2016 Main aims of the PhD research Our work aims in increasing the efficiency of solar energy usage by using up-converting luminescent materials for energy harvesting and conversion. The first step is to enhance the efficiency of the materials by optimizing the preparation procedure, host material, doping ions and their concentrations. The materials could be used e.g. in solar cells to convert otherwise unusable energy radiation to usable. Main results so far The NaYF4:Yb3+,R3+ (R: none, Pr, Nd, Sm, Eu, Tb or Dy) materials were prepared with selected dopant concentrations, using co-precipitation synthesis, to study the effect of the dopant and its concentration on the structure and luminescence of these materials. The structural details affecting the UPC luminescence intensity in the Na(Y0.76Yb0.20Tb0.04)F4 materials were determined by combining the Rietveld and Williamson-Hall analyses of X-ray powder diffraction data [1]. The overall structures of the materials with drastically different UPC luminescence intensity are very similar, but the material with much higher intensity is somewhat diluted of R3+ in the cation site occupied alternatively by Na and R (Na2/R site). This may increase the UPC luminescence by limiting excess energy migration in the Yb sublattice. The local structural details revealed microstrains in the R sublattice that are relaxed for the material with very high UPC intensity thus decreasing energy losses. The Rietveld results also suggest cation ordering for the material with very high UPC intensity. Highly luminescent up-converting Na(Y0.76Yb0.20Tb0.04)F4 materials were obtained by omitting washing with water in the co-precipitation synthesis route [2, 3]. The synthesis was optimized by reducing the loss of Na+ due to washing with water. Thus, the up-conversion luminescence is now 1–2 orders of magnitude stronger than that of a material washed with water (Fig. 1, left). The local structural details affecting the up-conversion luminescence intensity were successfully determined from EXAFS results. The overall structure of the materials with different up-conversion luminescence intensity was very similar, but the material with enhanced intensity had the Na site partly (ca. 2 % of the total cation amount) occupied by Yb3+ ions resulting in the facilitation of the Yb3+-Tb3+ energy transfer. This increased the up-conversion luminescence intensity further. The enhancement of the up-conversion luminescence was concluded to result from adjusting the Na+/R3+ ratio close to stoichiometric. The hexagonal up-converting NaYF4:Yb3+,Pr3+,Er3+ materials were prepared with different Pr3+ and Yb3+ concentrations [4]. Upconversion luminescence including several visible emissions of Pr3+ was observed with 976 nm NIR excitation. The high efficiency of the Pr3+ upconversion luminescence is difficult to achieve due to the trade-off between the Yb3+–Pr3+ energy transfer and effective de-excitation processes within Pr3+ requiring – at the same time – high and low Pr3+ 121 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät concentrations, respectively. Up-conversion luminescence of the Er3+ impurity was observed with all materials due to the extremely efficient Yb3+–Er3+ energy transfer up-conversion. The presence of Er3+ may finally offer an alternative pathway to boost the Pr3+ upconversion luminescence. This possibility requires, however, a lot of further work to materialize. White up-conversion luminescence was obtained due to a favorable mixture of different emissions. The structure of the NaYF4:Yb3+,R3+ (R: Pr, Nd, Sm, Eu, Tb, Dy or none) materials studied was mainly hexagonal, but trace amounts of the cubic form were present in some materials, as well [5]. The amount of the cubic form, the temperature of the α- to β-NaRF4 transition and the specific enthalpy of this transition are intertwined (Fig. 1, right). The rise in the temperature of the α- to βNaRF4 transition DSC signal indicates that the cubic-to-hexagonal change becomes more difficult requiring a higher temperature or more energy. If the DSC signal weakens at the same time (lower specific enthalpy), even a higher temperature does not help and the structure does not change, at least not completely, to hexagonal. The specific enthalpy of the transition is the key factor. It enables to estimate the amount of cubic form in annealed NaYF4:Yb3+,R3+ materials prior to the annealing, which can save time and work. Finally, up-conversion luminescence was obtained of Pr3+, Nd3+, Eu3+, Tb3+, Er3+, and Tm3+ with the same Yb3+-doped NaYF4 host. Figure 1. Up-conversion luminescence spectra of NaYF4:Yb3+,Tb3+ materials with different washing schemes and Tb3+ concentrations (left) [3]. Correlation between the intensity ratio of the 111 (cubic) and 110 (hexagonal form) reflections of the annealed NaYF4:Yb3+,R3+ (R: Pr, Nd, Sm, Eu, Tb, Dy or none) materials (from the XPD patterns) and the specific enthalpy of the cubic-tohexagonal phase transition (DSC; right) [5]. The significance of my research for the research group and the whole research field The results have been good and the whole group has gained something of them. The importance for the whole research field is still unclear but new results have been discovered which is promising. Papers to be included in the PhD thesis 1. 2. 3. 4. 5. Brito, H.F., Hölsä, J., Laamanen, T., Laihinen, T., Lastusaari, M., Pihlgren, L., Rodrigues, L.C.V., Soukka, T. Powder Diffr. 2013, 28, S41-S50. Brito, H.F., Hölsä, J., Laamanen, T., Laihinen, T., Lastusaari, M., Pihlgren, L., Rodrigues, L.C.V., Soukka, T. J. Rare Earths 2014, 32, 226-229. Hölsä, J., Laihinen, T., Laamanen, T., Lastusaari, M., Pihlgren, L., Rodrigues, L.C.V., Soukka, T. Physica B 2014, 439, 20-23. Hölsä, J., Laamanen, T., Laihinen, T., Lastusaari, M., Pihlgren, L., Rodrigues, L.C.V. Opt. Mater. 2014, 36, 1627-1630. Laihinen, T., Lastusaari, M., Pihlgren, L., Rodrigues, L.C.V., Hölsä, J. J. Thermal Anal. Calorim. 2015, DOI: 10.1007/s10973-015-4609-x. 122 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät LUMINESCENT NANOMATERIALS FOR ENHANCED SOLAR ENERGY CONVERSION Emilia Palo Inorganic Materials Chemistry Group,, Laboratory of Materials Chemistry and Chemical Analysis, Department of Chemistry, University of Turku ekharj@utu.fi Research Director: Prof. Carita Kvarnström Supervisor(s): Adj. Prof. Mika Lastusaari Funding: Nordic Energy Research, AquaFEED project Estimated time of PhD dissertation: 2018 Main aims of the PhD research The idea behind the PhD research is to study the up-conversion nanomaterials and their luminescence properties to see how they can be enhanced and tailored for more suitable solar energy conversion. The increasing total consumption of energy and the decreasing amount of fossil fuels to be used gives a significant role to the development of renewable energy sources. Several issues limit the extent to which terrestrial-based biomass production will be able to contribute towards fuel production. One major factor is that the overall solar energy conversion efficiency is low, but also more than 50 % of the solar energy is unusable by photosynthesis. And though solar cells possess relatively high energy conversion efficiency, even in the best performing solar cells there is still 30 % of the Sun’s spectrum that cannot be used for production of electricity. 1000 0 Intensity 800 0 Ultraviolet Solar Irradiance Visible Vi V i Infrared Up-Conversion 600 400 200 Photosynthesis Solar Cells 0 500 1000 1500 2000 2500 Wavelength / nm Figure 1. Solar irradiance and up-conversion in solar cells and photosynthesis. The up-conversion nanomaterials have been at high interest in developing new solar energy conversion materials because of their possibility to drive photosynthesis and to enhance the performance of solar cells. In photon up-conversion low-energy radiation (NIR) is converted to higher-energy light using different combinations of R3+ sensitizer (e.g. Yb, Er and Sm) and activator (e.g. Er, Ho, Tm, Pr, Tb) in matrices as NaYF4, ZrO2 and Y2O2S. The process involves the sequential absorption of two or more low energy photons and the subsequent emission at higher energy, usually in the visible. 123 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät Main results so far Previously studied and developed up-conversion nanomaterials still have some drawbacks concerning the possibility that they are to be used in the field of solar energy. Such thing is for example the narrow absorption energy window of the most commonly used absorber Yb3+. Also the efficiency of up-conversion is rather poor and usually a very concentrated light source is needed for successful conversion. Presently we are studying the possibility to use organic antenna molecules in combination with the inorganic materials to enhance the absorption of the excitation energy. It is also possible to develop different kinds of core-shell structures and add different R3+ dopants to the host material to improve the energy transfer for example between Yb3+ and Er3+ ions. Figure 2. Basic mechanism of UCP-Antenna up-conversion luminescence. The significance of my research for the research group and the whole research field This PhD study will lead to a deeper understanding of the phenomena of up-conversion luminescence finally enabling the detailed tailoring of the materials for specific applications. As our group has been developing the synthesis method for detailed up-conversion phosphors it is useful to deepen the knowledge about the up-conversion mechanism and improving its properties. The potential of these materials in enhancing the energy production in solar cells and photosynthesis will be shown and thus also great societal impact may be anticipated. Papers to be included in the PhD thesis 1. Palo, E., Pihlgren, L., Arppe, R., Hyppänen, I., Vuojola, J., Kankare, J., Lastusaari, M., Soukka, T. and Hölsä, J., Structure and Up-Conversion Luminescence of the NaYF4:Yb3+,Er3+ Nanomaterials Prepared with the Solvothermal Synthesis, manuscript 124 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät STUDIES OF SMECTITE FUNCTIONALIZED WITH LUMINESCENT NANOPARTICLES FOR APPLICATION IN SOLAR CONVERTERS Hellen Silva Santos Inorganic Materials Chemistry Group, Laboratory of Materials Chemistry and Chemical Analysis, Department of Chemistry, University of Turku hesisa@utu.fi Research Director: Carita Kvarnström Supervisor(s): adj. prof. Mika Lastusaari and prof. emeritus Jorma Hölsä Funding: NOMSEC Project, CNPq, Brazil. Estimated time of PhD dissertation: 01/2019 Main aims of the PhD research The project aims to produce low-cost materials with practical applications in energy production in normal lighting and temperature conditions. This is done by developing new luminescent materials and studying their and mechanisms of energy conversion. Energy up- and down-conversion processes will be optimized to allow better utilization of the solar spectrum thus increasing the efficiency of solar convertors already employed commercially. The production of new host lattices is proposed from the plurality found at layered silicates (LS). LS such as hectorite clays have been used as host matrices for optically functional species due to their tunable structure. Laponite is a synthetic clay that belongs to the hectorite family. It has the composition Na0.7(Si8Mg5.5Li0.3)O20(OH)4. However, the hydroxyl groups are efficient quenchers of luminescence and thus the proposition is to produce laponites whose hydroxyl groups are replaced by halogens. For energy transfer, it is intended to produce gold and silver nanoparticles stabilized by laponite. In this way, the structure of laponite can prevent heat loss due to its high heat capacity and electronic flow is guaranteed from the active sites of Au or Ag. From the intentional modeling of the structure of laponite, it is expected that a material whose interbasal distance is advantageous for the intercalation with rare earth ions will be achieved. Considering the structural similarity between laponite and matrices commonly used for production of material showing luminescence (allowing the up- or down-conversion), this work seeks to obtain matrices that minimize losses by thermalization. We intend to perform first the synthesis of laponite doped with R3+ and, after the evaluation of those systems, a second step will be conducted applying the effect of surface plasmon resonance of gold and silver nanoparticles to improve the luminescence properties. The final goal is to establish a system that ensures the most energy efficient platform for application in solar converters. Main results so far In the first step of the research, anionic layered nanosilicates have been synthetized resulting in the formation of new luminescent non-doped laponites with OH- replaced by F- or Cl-. The physical and chemical properties of these new matrices had been studied through XPD, FTIR, luminescence spectroscopy, TGA-DSC, surface area, XRF and synchrotron VUV-UV spectroscopy. The XPD patterns (Fig. A) showed that all LS have the same structure consistent with the hectorite 16A pattern. All reflections were broad indicating nanoscale crystallites. The FTIR spectra indicated water outside the layers (3600-3630 and 1610-1650 cm-1) as well as the formation of SiCl bonds (470-550) and [ClSiO1,5]x units (1000-1160 cm-1) in LS(Cl-). No signal was found 125 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät compatible with the formation of Si-F bonds or presence of water in LS(F-). For all samples, the SiO-Si bending vibrations were observed at 1010-1090 cm-1. The luminescence measurements of non-doped LS show strong wide band emission between 320 and 660 nm (Fig. B). This is the first time that any emission has been reported for laponite. Figure. A) XPD patterns of the LS materials, B) Luminescence spectra of the LS materials. The results of the thermogravimetric analysis have been studied to do improvements in the synthesis procedure, seeking to know if higher temperatures can be applied in the synthesis. As well, the results of surface area and synchrotron spectroscopy have been investigated aiming: (I) to know how much of the R3+ ions can be applied to doping the systems and, (II) to use the band gap energy of the LS to choose the suitable R3+ dopant system to allow the creation of luminescence persistent [1]. The significance of my research for the research group and the whole research field Nowadays, solar converters are based on silicon (a-Si:H) representing more than 90 % of the world production. The most efficient region of response by this solar cell is obtained in the visible region (between 400 to 700 nm). However, the solar emission spectrum is polychromatic, with about 40 % of the irradiance in the NIR and IR regions (wavelengths above 700 nm) For this reason, a big amount of the solar radiation is not used in these solar cells. The efficiency of solar cells can be enhanced by the modification of the structure of the cells or by the conversion of the solar spectrum to obtain the maximum response associated with the cell. Minimizing losses for spectral incompatibility is a more advantageous approach because it enables improvements in solar converters which are already in commercial use. This work aims in the production of materials that can be deposited in solar cells to provide an up-conversion or down-conversion of energy, optimizing the efficiency of these cells. Therefore, a wide impact is expected in the whole research field. Papers to be included in the PhD thesis 1. Santos, H.S., Lastusaari, M., Laihinen, T., Viinikanoja, A., Mäkilä, E., Brito, H.F., Rodrigues, L., Hölsä, J. Materials Today: Proceedings, 2015, v, pp-pp (to be submitted) 126 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät LUMINESCENT MATERIALS FOR SOLAR ENERGY CONVERSION Minnea Tuomisto Inorganic Materials Chemistry Group, Laboratory of Materials Chemistry and Chemical Analysis, Department of Chemistry, University of Turku mvtuom@utu.fi Research Director: Prof. Carita Kvarnström Supervisor(s): adj. prof. Mika Lastusaari Funding: Academy of Finland, CNBq Brazil project NOMSEC; Nordic Energy Research, project AquaFEED Estimated time of PhD dissertation: 2018 Main aims of the PhD research Solar cells are projected to be one of the most important producers of renewable energy in the future. However, modern solar cells (e.g. a-Si-H) use only a part of the radiation of the Sun leaving 30 % of the Sun’s spectrum outside the range that can be converted to electricity. This range is manly in the infrared area. Luminescent materials can be used to exploit the IR area and further to enhance the solar energy conversion. On this account the main aim of the PhD research is to increase the efficiency of solar energy usage by using luminescent materials, especially up-converting and persistent luminescence (down-converting) materials (Fig. 1). Figure 1. Using up- and down-converting materials to enhance the use of solar energy. Main results so far Up-conversion luminescent materials have matrices (e.g. NaYF4, ZrO2 and Y2O2S) and different combinations of R3+ sensitizer (e.g. Yb, Er, Sm) and activator (e.g. Er, Ho, Tm, Pr, Tb). In the photon up-conversion process, the sensitizer absorbs low-energy radiation (NIR) and converts the energy to the activator that releases the energy as higher-energy radiation (usually light) (Fig. 2). This process involves two or more low energy photon sequential absorption. Although, up-converting materials have been reported to enhance the solar conversion, some serious drawbacks still exist. First, the most commonly used absorber Yb3+ absorbs energy only in narrow area (only a few dozen nm around 980 nm). Next, the up-conversion process is not very efficient, which is why a very concentrated light source (laser) is required for successful conversion. 127 Kemian kevät 2015 – Väitöskirjatyöntekijät The first aim of the PhD research has been to solve these problems by using d transition metal ions in combination with the inorganic luminescent materials. Persistent luminescence materials show luminescence after the excitation source has been removed. The best materials to date (e.g. SrAl2O4:Eu2+,Dy3+ or Sr2MgSi2O7:Eu2+,Dy3+) can emit for more than 24 h after the removal of the external excitation. NIR emitting persistent luminescence materials have been proposed to increase the efficiency of a solar cell. However, using materials that emit in the visible has not been reported. Though, one serious problem with persistent luminescence is the lack of efficient red emitting materials. The PhD research has also aimed to study and develop more efficient red persistent emitters. Materials have been/will be synthetized using solid state reactions as well as different wet chemical routes. Characterization methods are X-ray powder diffraction, FT-IR, Thermal analysis, Raman, EPR, luminescence spectroscopy and synchrotron XANES/EXAFS and VUV-UV spectroscopies. First steps of the PhD research have concentrated to the NaYF4-matrix. Up-converting NaYF4:Yb3+,Er3+-material has been prepared with the co-precipitation method. The up-conversion luminescence of this material (Fig. 2) is not strong enough to be used for solar conversion. The PhD research has given encouraging results that it is possible to enhance the efficiency of the up-conversion luminescence by doping the material with specific d transition metals. Figure 2. The mechanism of the up-conversion luminescence (left) and the up-conversion luminescence spectra of NaYF4:Yb3+,Er3+ -material (right). The significance of my research for the research group and the whole research field The PhD research has a significant role in the Academy of Finland – CNPq Brazil project NOMSEC (Novel Optical materials for Solar Energy Conversion) which is one of the main projects of the Rare Earth Chemistry Group. The PhD research has also role in the Nordic Energy Reasearch project AquaFEED (Conversion of solar energy to infrastructure-ready transport fuels using aquatic photobiological organisms as the hydrocarbon feedstock producer). Luminescent materials have been projected to be capable in enhancing of solar conversion but not many results have been published yet. Thus, the PhD research will give important information to the whole research field. Papers to be included in the PhD thesis 1. Arppe, R., Hölsä, J., Kankare, J., Laamanen, T., Lahtinen, S., Lastusaari, M., Palo, E., Pihlgren, L., Schäferling, M., Soukka, T., Tuomisto, M. Effect of Nanocrystallite Morphology on Up-Conversion Assay Performance of NaYF4:Yb3+,Er3+, manuscript 128 Turun Tu T uru run Ke K Kemistikerho mis i tike is k rh rho ryy Turun Kemistikerho ry on vuonna 1945 perustettu vanhin Suomalaisten Kemistien Seuran (SKS) paikallisseura. Sen pyrkimys on edistää kemiaa alana ja vahvistaa jäsenten identiteettiä kemisteinä. Se tarjoaa mahdollisuuden tutustua kollegoihin ja solmia uusia suhteita sekä akateemiseen maailmaan että teollisuuteen. Kemistikerhoon kuuluu noin 300 jäsentä. Runsaasti toimintaa Kerhon järjestämiä jokavuotisia tapahtumia ovat syys- ja kevätkokoukset, joiden ohjelmaan kuuluu kokousasioiden lisäksi usein kemiaan liittyvä esitelmä tai yrityskierros, Gadolininpäivän kaikille avoimet luennot ja jäsenistön iltajuhla sekä kulttuuri- ja kevätretket. Liity jäseneksi! Turun Kemistikerhon jäsenyyttä voi anoa henkilö, joka kuuluu SKS:aan tai joka samalla anoo SKS:n jäsenyyttä. Henkilöjäseniltä ei kerätä erillistä jäsenmaksua SKS:n maksun lisäksi. Varsinaiseksi jäseneksi voidaan hyväksyä henkilö, joka on osoittanut olevansa pätevä kemisti. Nuoreksi jäseneksi voidaan hyväksyä yliopistossa pääaineenaan kemiaa opiskeleva. www.turunkemistikerho.fi t k i tik h fi
