Estudo Experimental da Interação entre Alendronato e Movimento

20
Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ
Centro de Ciências da Saúde
Faculdade de Odontologia
ESTUDO EXPERIMENTAL DA INTERAÇÃO ENTRE
ALENDRONATO E MOVIMENTO DENTÁRIO ORTODÔNTICO
Adriele Silveira Araújo, CD
Dissertação submetida ao corpo docente da Faculdade
de Odontologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro UFRJ, como parte dos requisitos, para a obtenção do Título
de Mestre em Odontologia (Ortodontia).
Rio de Janeiro
2013
20
ESTUDO EXPERIMENTAL DA INTERAÇÃO ENTRE ALENDRONATO E
MOVIMENTO DENTÁRIO ORTODÔNTICO
ADRIELE SLVEIRA ARAÚJO, CD
Orientador: Profª. Drª. ANA MARIA BOLOGNESE
Dissertação
submetida
ao
corpo docente
da
Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do
Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos, para
obtenção
do
Título
de
Mestre
em
(Ortodontia).
Comissão Examinadora
__________________________________
Profª. Drª. Elisa Souza Camargo, CD
______________________________
Prof. Dr. Lincoln Issamu Nojima, CD
________________________________________
Profª. Drª. Margareth Maria Gomes de Souza, CD
Rio de Janeiro
2013
Odontologia
ii
Ficha Catalográfica
ARAÚJO, Adriele Silveira
Estudo experimental da interação entre alendronato e movimento
dentário ortodôntico. Rio de Janeiro: UFRJ/Faculdade de Odontologia, 2013.
xx, 84 f.
Tese: Mestrado em Odontologia (Ortodontia) – Universidade Federal
do Rio de Janeiro, Faculdade de Odontologia, 2013.
1 Bisfosfonatos
2 Alendronato
3 Tratamento ortodôntico
4 Teses
I Título
II Dissertação (Mestrado - UFRJ/Faculdade de Odontologia)
iii
Aos meus pais, Antônio e Jânia,
pelo amor, dedicação e incentivo constante durante todo o percurso da
minha vida.
Aos meus irmãos, Antônio e Jackeline,
pela amizade e carinho.
Sou o resultado da confiança e da força de cada um de vocês.
COM TODO O MEU AMOR, DEDICO.
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela proteção diária e pela força que me impulsionou em cada
detalhe desta conquista.
À minha família por todo carinho e apoio. Em especial, à minha bisavó
Alzira, pelas orações que à distância podia escutá-las com o coração, e à prima
Ilaíne Matos, pela agradável convivência na Cidade Maravilhosa.
A Paulo, pelo amor, compreensão e consolo nos momentos de saudade
desmensurável.
Ao curso de pós-graduação em Odontologia - Ortodontia e seu corpo
docente, por ter contribuído de maneira ímpar com o meu crescimento
profissional.
À Profa. Dra. Ana Maria Bolognese, com tamanha admiração, pela
orientação precisa e incondicional dedicação, pela confiança e pelo apoio em
todos os momentos da realização desta pesquisa.
Aos professores do Curso de Ortodontia - UFRJ, Dr. Antônio Carlos de
Oliveira Ruellas, Dr. Eduardo Franzotti Sant’Anna, Msc. José Fernando
Stangler Brazalle, Dr. José Vinícius Bolognesi Maciel, Dr. Lincoln Issamu
Nojima, Dra. Margareth Maria Gomes de Souza, Dra. Matilde da Cunha
Gonçalves Nojima, Dra. Maria Evangelina Monnerat e Dra. Mônica Tirre de
Araújo, em reconhecimento aos valiosos ensinamentos transmitidos com
dedicação e sabedoria. À professora Dra. Cláudia Trindade Mattos, pela
indispensável consultoria em estatística.
Aos professores das Disciplinas conexas Dr. André Antonio Monteiro, Dr.
Carlos Nelson Elias, Dr. Fábio Ribeiro Guedes, Dra. Ieda Maria Orioli, Dra.
Isabela Cabral Félix de Sousa, Dra. Maria Cynésia Medeiros de Barros
v
Torres, Dr. Paulo José Medeiros, Dra. Rita Vilanova Prata, Msc. Roberto
Amarante Costa Pinto, Dr. Ronir Raggio Luiz e Dra. Sandra Regina Torres,
por complementar a minha formação profissional.
Aos meus queridos colegas Júlia Sotero Viana, Lara Sigilião, Leonardo
Koerich e Rodrigo Lopes, pelo companheirismo e cumplicidade durante esses
dois anos e pela importante ajuda no desenvolvimento deste trabalho. Dividimos
medo, incertezas e inseguranças; mas somamos entusiasmo, forças e alegrias...
a saudade há de ficar! Agradecimento especial à Ana Carolina e família pela
querida acolhida nos primeiros meses do curso.
Aos colegas da 46ª turma, Carolina Paz Trindade, Daniel Paluto
Brunetto, Geórgia Wain Thi Lau, Ligia Vieira Claudino, Theresa Cristina
Pereira de Oliveira e Thaís Cristina Sobrira da Matta, pela amizade e apoio
concedido. Em especial à Aline Birra Nolasco Fernandes, pela imensa ajuda no
manejo dos animais, e à Dayane Lopes da Silva, pelos registros fotográficos
durante a fase de montagem do aparelho ortodôntico.
Aos colegas da 48ª turma, Amanda Carneiro da Cunha, Ana Paula
Tenório de Sá, Cinthia Candemil Nuernberg e Rowan do Vale Vilar, pela
amizade, agradável convivência e pelas risadas. Agradeço especialmente às
amigas-irmãs sergipanas Carolina Vieira Valadares e Renata de Faria Santos,
por tornarem meu segundo ano muito mais prazeroso. Adoro cada um de vocês e
torço pelo sucesso de todos!
Aos colegas do doutorado, Amanda Osório Ayres de Freitas, Carolina
Mascarenha Baratieri, Hibernon Lopes Filho, Mariana Marquezan e Matheus
Alves Júnior. Em especial, a Lúcio Henrique Maia, pela amizade, carinho e
vi
incentivo, por todo auxílio concedido desde o instante em que decidi prestar prova
para este curso.
Aos funcionários, Diane Esteves de Souza Gomes, Fernanda Ribeiro da
Silva, Mônica Mello do Nascimento Gonçalves, Robson Antônio de França,
Vanilda Antônio Saturnino e Waltencir Silva Ferreira, pela imensa atenção e
disponibilidade. Em especial a Wal, pelos socorros prestados e pela preocupação
constante com nosso bem-estar.
Ao professor Dr. Paulo César Silva e aos funcionários do Centro de
Cirurgia Experimental (CCE) do Departamento de Cirurgia da Faculdade de
Medicina da UFRJ, pela alocação dos animais, ajuda no manuseio e cuidados
dispensados na manutenção dos mesmos.
À professora Dra. Andréa de Castro Domingos Vieira, pela concessão do
aparelho de radiografia digital e pela ajuda durante a análise fractal.
À professora Dra. Lucianne Cople Maia, por permitir utilizar as
dependências da Odontopediatria para a aquisição das imagens radiográficas.
Aos professores Dr. Ricardo Tadeu Lopes e Dra. Inayá Corrêa Barbosa
Lima e a doutoranda Alessandra Silveira Machado, do Laboratório de
Instrumentação Nuclear - COPPE/UFRJ, pela aquisição e análise das imagens
microtomográficas.
Aos professores do Departamento de Patologia e Diagnóstico Oral, Dra.
Aline Corrêa Abrahão, Dra. Márcia Grillo Cabral e Dr. Mário José Romañach
Gonzalez Sobrinho, em especial à professora Msc. Juliana de Noronha Santos
Netto e à técnica de histologia Arminda, pelo auxílio no processamento das
peças, confecção das lâminas e análise microscópica.
vii
Aos alunos da graduação em Odontologia da UFRJ, por terem nos
permitido o exercício da docência.
À Morelli Ortodontia, pela gentil doação das molas de níquel-titânio
utilizadas neste trabalho.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pela bolsa de estudos concedida.
A todos aqueles que, de algum modo, colaboraram para a realização desta
pesquisa. Sem vocês nada disso seria possível.
viii
RESUMO
ARAÚJO, Adriele Silveira. Estudo experimental da interação entre alendronato
e movimento dentário ortodôntico. Orientador: Drª. Ana Maria Bolognese.
Rio de Janeiro: UFRJ/Faculdade de Odontologia, 2013. Dissertação
(Mestrado em Odontologia – Ortodontia). 84 f.
O objetivo desta pesquisa foi verificar a influência do alendronato na
movimentação dentária ortodôntica e a interferência deste movimento na
captação do fármaco. Para tanto, 14 coelhos da raça Nova Zelândia (Oryctolagus
cuniculus), 16 semanas de idade, tiveram seus primeiros molares inferiores do
lado direito inclinados para mesial, sob carga constante de 85 gf. Os sete animais
do grupo experimental receberam, semanalmente, aplicações subcutâneas de 3
mg/Kg de alendronato de sódio. Avaliação métrica do deslocamento dentário foi
realizada a cada sete dias, até o fim do período experimental, e análises
radiográficas (dimensão fractal e intensidade de pixel) e histológicas foram
executadas após 21 dias de movimentação induzida. Os resultados mostraram
inibição do movimento dentário em decorrência da redução da atividade
reabsortiva dos osteoclastos no lado de pressão e aumento da densidade óssea
causados pela ação do alendronato no grupo experimental. A redução da
atividade osteoclástica foi verificada pela menor irregularidade da superfície óssea
ix
e pela redução no número destas células. A movimentação ortodôntica não
elevou a taxa de captação do fármaco como avaliados pelas análises fractal e de
intensidade de pixel do osso trabecular. Estes métodos, entretanto, mostraram-se
apresentar baixa sensibilidade para esta avaliação, sendo necessários estudos
futuros para comprovar esta falta de interação.
x
SUMMARY
ARAÚJO, Adriele Silveira. Estudo experimental da interação entre alendronato
e movimento dentário ortodôntico. Orientador: Drª. Ana Maria Bolognese.
Rio de Janeiro: UFRJ/Faculdade de Odontologia, 2013. Dissertação
(Mestrado em Odontologia – Ortodontia). 84 f.
The purpose of this study was to investigate the influence of alendronate on
orthodontic tooth movement and the interference of this movement in the uptake of
the drug. Fourteen New Zealand rabbits (Oryctolagus cuniculus), 16-week-old,
had their right first molars mesially tipped, under a constant load of 85 gf. In seven
experimental animals, 3 mg/Kg of alendronate sodium was subcutaneously
injected once a week. Evaluation of tooth displacement was held every seven
days, until the end of the experimental period, and radiographic (fractal dimension
and pixel intensity) and histology analyzes were performed after 21 days of
induced movement. The outcomes showed inhibition of tooth movement as a
result of reduced reabsorptive activity of osteoclasts on the pressure side and
increase of bone density caused by the action of alendronate in the experimental
group. The reduction of osteoclastic activity was verified by the lower irregularity of
bone surface and by the decrease of these cells number. The orthodontic
movement did not increase the uptake of the drug as assessed by fractal and pixel
xi
intensity analyzes of the trabecular bone. These methods, however, presented low
sensitivity to this assessment, and future studies are necessary to confirm this lack
of interaction.
xii
LISTA DE FIGURAS
DELINEAMENTO DA PESQUISA
Figura 1
Sequência de procedimentos para montagem do aparelho
ortodôntico. A e B) Confecção de canaletas horizontais nas
superfícies vestibular, distal e lingual dos incisivos inferiores; C)
Adaptação de grampo; D) Grampo adaptado; E) Condicionamento
ácido; F) Aplicação de adesivo; G) Fixação do grampo com
Transbond XT; H) Estiramento da mola até alcançar 10 mm; I)
Vista oclusal do dispositivo ortodôntico montado.............................
Figura 2
Calibração
da
carga
liberada.
O
estiramento
da
16
mola
propriamente dita, até que alcançasse 10 mm de comprimento,
proporcionou liberação de carga de 85 gf........................................
Figura 3
Avaliação métrica do movimento dentário ortodôntico com
paquímetro digital sobre o modelo de gesso....................................
Figura 4
17
17
Padronização da técnica radiográfica. Hemimandíbula sobre o
posicionador radiográfico periapical com o PSP localizado por
lingual da peça anatômica................................................................
18
xiii
ARTIGO 1
Figure 1
Square grid with 3 mm side-length over the histological section. *
Mesial of the first molar where the osteoclast count was
performed. Note the diastema between the lower right first and
second molar after orthodontic movement.......................................
Figure 2
38
A, micrographs with a 10x objective lens of the PDL-bone
interface of the mesial of the lower first molar. B, PDL-bone
interface outlined. C, image used to calculate the fractal
dimension. AB, alveolar bone; PDL, periodontal ligament; C,
cementum; bars = 100 μm………………..........................................
Figure 3
39
Time course of tooth movement on the control and alendronatetreat group showing mean of the amount of OTM (SD) at 7, 14 and
21 days. OTM in the experimental group was significantly lower
than in the control group (p < .001 for the group main effect) and
the amount of OTM increased over the time (p < .001 for the time
main effect).......................................................................................
Figure 4
40
Number of osteoclasts on the mesial of the lower first molar. The
error bars extend one standard deviation away from the means.
Statistical difference was observed between OTM- and OTM+
sides within control group, and between control and experimental
group on OTM+ side at α = .05 (Student’s t-test).............................
Figure 5
PDL-bone interface outlines. A, left and B, right side of a control
animal. C, left and D, right side of an experimental animal. Note
the increase of bone surface irregularity in the control group and
almost no change in the experimental group after 21 days of
40
xiv
induced tooth movement……………………………………………….. 41
Figure 6
Micrograph of the compression side of a right first molar from A,
experimental and B, control group showing the inhibitory effect of
alendronate on osteoclasts (arrows). The number of osteoclastic
cells was significantly lower in the alendronate-treat rabbits
(haematoxylin and eosin staining, x400). AB, alveolar bone; PDL,
periodontal ligament; C, cementum; bars = 50 μm………………….. 41
ARTIGO 2
Figure 1
Fractal analysis. A, selection of the ROI, yellow rectangle; B, the
ROI was duplicated; C, the duplicated image was blurred with a
Gaussian filter (sigma=10); D, the blurred image was then
subtracted from the original image; E, 128 was added to the result
at each pixel location; F, the resultant image was converted to
binary; G, and inverted. With this process, the regions that
represent trabecular bone were set to black and marrow spaces
were set to white; H, finally the image was skeletonized; I,
superimposition of the skeletonized on the original image
demonstrates that the skeletal structure corresponds to the
trabecular bone; J, FD calculation by the box-counting method…...
Figure 2
61
Pixel intensity analysis. A, the blue rectangle corresponds to the
region measured in the periapical radiographic positioner (dashed
red line) and the yellow one is the ROI; B, histogram of the ROI
pixel intensity……………...……………….......................................... 62
Figure 3
Influence of alendronate, orthodontic tooth movement and
xv
alendronate-OTM interaction on fractal dimension and pixel
intensity of the trabecular bone. The numbers above the bars are
the p-values……...............................................................................
Figure 4
63
Microtomography of the right and left hemimandibles. Trabecular
thickness (Tb.Th) and number (Tb.N) were higher in the
experimental rabbit than in the control animal while trabecular
separation (Tb.Sp) was lower……………………..............................
64
DISCUSSÃO
Figura 6
Gráfico de dispersão mostrando a relação entre a densidade
óssea e a magnitude do movimento dentário. Nota-se claramente
que
quanto
maior
a
densidade
(visualizada
no
grupo
experimental), menor a magnitude da movimentação dentária........ 71
xvi
LISTA DE TABELAS
ARTIGO 1
Table I
Weekly rate of orthodontic tooth movement (mm)………….............
42
Table II
Fractal dimension of the PDL-bone interface………………………
42
Descriptive statistic for fractal dimension and pixel intensity............
65
ARTIGO 2
Table I
xvii
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AB
alveolar bone
ANOVA
análise de variância
BIJON
bisphosphonate-induced jaw osteonecrosis
BMU
basic multicellular units
C
cementum
CEUA
Comissão de Ética com Uso de Animais
CG
control group
COBEA
Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
DF
dimensão fractal
dp
desvio padrão
dpi
dots per inch
EG
experimental group
FD
fractal dimension
gf
grama força
HE
hematoxilina e eosina
Intraclass Correlation Coeficiente – índice de correlação
ICC
intraclasse
Kg
quilograma
kV
quilovoltagem
xviii
LP
ligamento priodontal
mA
miliamperagem
mg
miligrama
ml
mililitro
mm
milímetro
OTM
orthodontic tooth movement
OTM-
without orthodontic tooth movement
OTM+
with orthodontic tooth movement
PDL
periodontal ligament
PI
pixel intensity
PSP
photostimulable phosphor plate
PPi
inorganic pyrophosphate
ROI
region of interest
SD
standard deviation
TIFF
Tagged Image File Format
μm
micrômetro
xix
ÍNDICE
1 INTRODUÇÃO...............................................................................
1
2 PROPOSIÇÃO...............................................................................
4
3 DELINEAMENTO DA PESQUISA..................................................
5
3.1
AMOSTRA...........................................................................
5
3.2
APLICAÇÃO DO ALENDRONATO......................................
6
3.3
MONTAGEM DO DISPOSITIVO ORTODÔNTICO.............
7
3.4
AVALIAÇÃO MÉTRICA DO MOVIMENTO DENTÁRIO
ORTODÔNTICO..................................................................
3.5
8
PREPARO DAS PEÇAS HISTOLÓGICAS E AQUISIÇÃO
DAS IMAGENS RADIOGRÁFICAS.....................................
9
3.6
CONTAGEM DOS OSTEOCLASTOS.................................
11
3.7
ANÁLISE FRACTAL DA INTERFACE ENTRE LP E OSSO
ALVEOLAR..........................................................................
12
3.8
ANÁLISE FRACTAL DO TRABECULADO ÓSSEO............
12
3.9
ANÁLISE DA INTENSIDADE DE PIXEL.............................
13
3.10
ANÁLISE ESTATÍSTICA......................................................
14
4 DESENVOLVIMENTO DA PESQUISA..........................................
19
4.1
ARTIGO 1: ARAÚJO, A.S.; NETTO, J.N.S.; MACIEL,
xx
J.V.B.;
BOLOGNESE,
orthodontic tooth
A.M.
movement:
Bisphosphonate
an
evaluation of
and
the
osteoclastic activity by fractal analysis of the PDL-bone
interface. A ser submetido para publicação no American
Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics.........
4.2
ARTIGO
2:
ARAÚJO,
A.S.;
VIEIRA,
20
A.C.D.;
BOLOGNESE, A.M. Does orthodontic treatment increase
the uptake of Bisphosphonate? A pixel intensity and fractal
analyzes. A ser submetido para publicação no American
Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics.........
43
5 DISCUSSÃO..................................................................................
66
6 CONCLUSÃO.................................................................................
76
7 RECOMENDAÇÕES......................................................................
78
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
79
9 ANEXOS.........................................................................................
84
9.1
ANEXO 1: Parecer da Comissão de Ética com Uso de
Animais em Experimentação Científica do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio de
Janeiro.................................................................................
84
20
1 INTRODUÇÃO
Os bisfosfonatos são medicamentos com propriedades antirreabsortivas
amplamente
utilizados
no
tratamento
de
doenças
ósseo-metabólicas
e
complicações associadas às metástases ósseas de certos tipos de câncer
(LICATA, 2005). São análogos sintéticos do pirofosfato inorgânico, regulador
endógeno da mineralização óssea (GHONEIMA et al., 2010), com substituição do
oxigênio da ligação pirofosfato por carbono (SARIN; DEROSSI; AKINTOYE,
2008). A estrutura P-C-P derivada confere a ávida afinidade do composto ao
tecido ósseo (VAN BEEK et al., 2003; LICATA, 2005). Potência e modo de ação
variam com os radicais ligados ao carbono central: os aminobisfosfonatos são
significativamente mais potentes que aqueles sem o nitrogênio na cadeia lateral
(ROGERS, 2003).
O alendronato é um aminobisfosfonato oral comumente prescrito para a
profilaxia e tratamento da osteoporose (EPSTEIN, 2006). Após a administração,
redistribui-se para o osso, particularmente aos locais em remodelação óssea ativa
(KARRAS et al., 2009). A droga é considerada inativa enquanto ligada à
hidroxiapatita, até ser libertada durante a remodelação óssea e ser absorvida
pelos osteoclastos. Internalizado na célula, desordena vias intracelulares
específicas, resultando em ruptura do citoesqueleto e da sinalização intracelular
(ROGERS, 2003; VAN BEEK et al., 2003). As consequências de tais eventos
2
incluem a supressão da atividade osteoclástica, perda da borda em escova e
apoptose celular em última instância (BOIVIN; MEUNIER, 2002). O efeito é a
redução da reabsorção óssea e aumento de sua densidade (FLEISCH, 2002).
É indubitável que a administração do alendronato incorra em efeitos
adversos ao tratamento ortodôntico, visto que a atividade osteoclástica é requisito
substancial à remodelação óssea e, por conseguinte, ao movimento dentário
ortodôntico.
Aumento expressivo dos locais de reabsorção ocorre em consequência de
maior frequência e ativação das células clásticas. A reabsorção frontal na
interface do ligamento periodontal (LP) causa alterações estruturais na superfície
óssea que resultam em incremento de sua irregularidade. Poucas investigações
têm estudado esta região porque sua complexidade inviabiliza a mensuração por
princípios geométricos euclidianos (WAGLE et al., 2005).
Estudos (PIANTANELLI et al., 2005; YOKOYAMA et al., 2005; MARTINLANDROVE et al., 2007) têm avaliado superfícies teciduais irregulares por meio
da análise fractal. Este método propicia a quantificação de morfologias irregulares
(WAGLE et al., 2005) através de sua dimensão fractal (DF). A DF de um objeto
caracteriza a sua auto-similaridade e está intimamente relacionada com o
preenchimento do espaço (UPDIKE; NOWZARI, 2008); quanto maior o espaço
ocupado pelo objeto, maior é a DF. A análise fractal também tem sido
extensivamente utilizada em medições da complexidade do trabeculado ósseo em
imagens radiográficas digitais (LESPESSAILLES et al., 2002; LANE et al., 2005;
TOSONI et al., 2006; UPDIKE; NOWZARI, 2008; YU et al., 2009; KOH; PARK;
KIM, 2012; SOGUR et al., 2013). Alguns estudos tem associado aumento na DF
ao incremento na densidade óssea (SOUTHARD; SOUTHARD; LEE, 2001;
3
JOLLEY; MAJUMDAR; KAPILA, 2006; ALMAN et al., 2012). Outros têm utilizado
a análise da intensidade de pixel para este fim (TOSONI et al., 2006; SOGUR et
al., 2013), avaliando a radiopacidade numa escala de zero (preto) a 255 (branco)
em imagem digital de oito bits.
A captação dos bisfosfonatos está intrinsicamente relacionada à taxa de
remodelação óssea. Isto eleva, de duas a três vezes, a concentração do
alendronato no osso trabecular, local em que o turnover ósseo ocorre de maneira
expressiva (LIN; RUSSELL; GERTZ, 1999). Por mecanismo similar, o movimento
dentário ortodôntico resultaria em aumento da captação da droga no osso alveolar
(ZAHROWSKI, 2007), sucedendo em potencialização dos seus efeitos e do risco
de osteonecrose, complicação associada à administração desta classe de drogas.
Depreender os efeitos do alendronato sobre o movimento dentário
ortodôntico e a influência deste em sua captação justifica-se em virtude da
crescente demanda de pacientes adultos buscando os benefícios da Ortodontia.
Muitos apresentam-se com problemas de saúde e terapia medicamentosa
associada. Os riscos, benefícios e efeitos destes fármacos sobre o tratamento
ortodôntico devem ser integralmente elucidados.
4
2 PROPOSIÇÃO
Verificar a interferência do alendronato na movimentação dentária induzida
em coelhos e a influência deste movimento na captação do fármaco, por meio de:
2.1 avaliação macroscópica da magnitude da movimentação dentária;
2.2 quantificação do número de osteoclastos na superfície óssea;
2.3 avaliação da atividade osteoclástica através da análise fractal da interface
entre osso e ligamento periodontal;
2.4 quantificação da complexidade do trabeculado ósseo através da dimensão
fractal, e
2.5 avaliação da densidade óssea através da análise da intensidade de pixel e
sua influência na taxa de movimentação dentária.
5
3 DELINEAMENTO DA PESQUISA
Nesta pesquisa utilizou-se o método experimental in vivo. Foram
obedecidas as recomendações éticas e legais, previstas na Lei nº 6.638/79,
especificadas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) (2007).
O projeto foi submetido à Comissão de Ética com Uso de Animais (CEUA) em
Experimentação Científica do Centro de Ciências da Saúde da Universidade
Federal do Rio de Janeiro e aprovado sob o número de referência LABCE01
(ANEXO 1, página 84).
3.1 AMOSTRA
O cálculo amostral para diferença entre médias foi realizado com base em
poder do estudo igual a 85% (para a análise das características do osso
trabecular) e 90% (para avaliação da movimentação dentária), e nível de
significância de 5%. Constatou-se que seria necessário o total de sete animais por
grupo. Assim, a amostra foi composta por 14 coelhos da raça Nova Zelândia
(Oryctolagus cuniculus), machos (n=12) e fêmeas (n=2), saudáveis, com
aproximadamente quatro meses de idade e pesando, em média, 2,6 ± 0,3 Kg.
Os animais foram divididos, aleatoriamente, em grupo controle (GC) e
grupo experimental (GE). Em ambos os grupos foi realizada a movimentação
ortodôntica do primeiro molar inferior direito, porém o GE recebeu aplicações
6
subcutâneas de alendronato, enquanto o GC recebeu apenas solução salina de
NaCl 0,9%. Estudo com desenho split-mouth foi realizado, uma vez que no lado
esquerdo da mandíbula não foi montado aparelho, pretendendo-se avaliar apenas
o efeito do alendronato no osso alveolar.
Durante o período experimental, os animais foram mantidos no biotério do
Centro de Cirurgia Experimental do Departamento de Cirurgia da Faculdade de
Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro. Foram acomodados em
gaiolas individuais suspensas, higienizadas diariamente, a fim de permitir
condições
sanitárias
adequadas.
Para
evitar
alterações
metabólicas,
a
luminosidade foi controlada, havendo ciclos claro/escuro de 12 horas. Quanto à
dieta, ração apropriada e água foram disponibilizadas ad libitum. A ração foi
triturada no intuito de prevenir eventuais danos à aparelhagem ortodôntica
durante a função mastigatória. Os animais foram aclimatizados por período
mínimo de sete dias antes do início do experimento.
Todos os animais foram pesados no início da pesquisa e, semanalmente,
até a sua conclusão, a fim de se observar quaisquer alterações de peso
relacionadas à alimentação e/ou às condições experimentais.
3.2 APLICAÇÃO DO ALENDRONATO
Alendronato de sódio triidratado, na forma cristalina e do mesmo lote, foi
obtido junto à Farmácia Universitária da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Sabendo-se que 1,305 mg do sal equivale a 1 mg de ácido alendrônico,
solução de alendronato de sódio foi obtida na proporção de 3,915 mg de
alendronato de sódio triidratado para cada mililitro de água destilada, obtendo-se
solução na concentração de 3 mg/ml de ácido alendrônico. Para garantir
7
dissolução completa da substância, o recipiente contendo o material foi agitado
em vórtex durante 60 segundos. A solução foi preparada a cada semana,
imediatamente antes da administração, a fim de evitar que condições ambientais
e de armazenamento interferissem em sua estabilidade.
Os animais do GE receberam doses semanais de 3 mg de alendronato por
quilograma de peso corporal. Um total de seis aplicações via subcutânea foram
administradas, sendo as três primeiras realizadas antes da montagem do
aparelho ortodôntico e as demais durante a execução do experimento até a
eutanásia dos animais.
3.3 MONTAGEM DO DISPOSITIVO ORTODÔNTICO
O aparelho ortodôntico constituiu-se em adaptação do dispositivo
desenvolvido por Heller e Nanda (HELLER; NANDA, 1979). Este foi composto por
mola de níquel-titânio de secção fechada com 12 mm de comprimento (Dental
Morelli Ltda, Sorocaba, São Paulo, Brasil) distendida entre os incisivos inferiores e
primeiro molar inferior direito, resultando em movimento de inclinação mesial
desta unidade. A sequência de procedimentos, como descrita a seguir, pode ser
visualizada na Figura 1 (página 16).
Previamente à montagem do dispositivo ortodôntico, os animais foram
sedados mediante associação de 0,35 ml/Kg de cloridrato de cetamina 10%
(Syntec, Cotia, São Paulo, Brasil), 0,25 ml/Kg de cloridrato de xilazina 2%
(Syntec, Cotia, São Paulo, Brasil) e 0,1 ml/Kg de maleato de acepromazina 0,2%
(Syntec, Cotia, São Paulo, Brasil), via intramuscular.
Em seguida, confeccionou-se orifício entre os incisivos inferiores e
canaletas horizontais, paralelas entre si, nas superfícies vestibular, distal e lingual,
8
na altura do vértice da papila interdentária, utilizando ponta diamantada esférica
1011 (KG Sorense, São Paulo, São Paulo, Brasil) adaptada ao motor elétrico de
baixa rotação (Beltec LB100). Após os desgastes, grampo confeccionado com fio
de aço redondo 0.016” (Dental Morelli Ltda, Sorocaba, São Paulo, Brasil) foi
adaptado à região. Para impedir seu deslocamento, o grampo foi coberto com
resina composta Transbond XT (3M Unitek, Monrovia, California, USA), precedido
de condicionamento com ácido fosfórico a 37%, lavagem com água e secagem.
A fixação da extremidade posterior da mola ao primeiro molar foi realizada
por meio de fio de amarrilho 0.010” (Dental Morelli Ltda, Sorocaba, São Paulo,
Brasil), adaptado às canaletas horizontais confeccionadas nas superfícies
vestibular e lingual, ao nível da margem gengival. A extremidade anterior foi
amarrada ao grampo adaptado aos incisivos após ter sido distendida até que a
mola propriamente dita, de comprimento inicial de 7 mm, alcançasse 10 mm. O
estiramento da mola foi aferido com auxílio de paquímetro ortodôntico (Odin;
Ortho-pli, Philadelphia, Pennsylvania, USA). Nesta circunstância, a carga liberada
foi de 85 gf (Figura 2, página 17).
Após a montagem do aparelho ortodôntico, os animais foram avaliados a
cada sete dias, quando a integridade dos tecidos e do dispositivo instalado foram
verificadas, higienização bucal realizada e supervisão do estado geral de saúde
pelo veterinário conduzida.
3.4 AVALIAÇÃO MÉTRICA DO MOVIMENTO DENTÁRIO ORTODÔNTICO
A aferição da movimentação dentária induzida foi realizada através da
medida da distância entre a face distal do terceiro molar ao sulco distal da face
lingual do primeiro molar, de forma indireta em modelos de gesso da hemiarcada
9
inferior direita, com auxílio de paquímetro digital de ponta fina (Figura 3, página
17).
Para isto, os animais foram anestesiados e moldados imediatamente antes
da montagem do aparelho e depois a cada sete dias até completar 21 dias de
aplicação de força ortodôntica. O procedimento de moldagem foi realizado com
moldeiras parciais individualizadas, confeccionadas com acrílico autopolimerizável
e fio ortodôntico redondo 0.051”, utilizando hidrocolóide irreversível (Jeltrate;
Dentsply, Milford, Delaware, USA) como material de impressão.
Até o momento da modelagem com gesso pedra especial do tipo IV
(Durone, Dentsply, Milford, Delaware, USA), os moldes foram mantidos em
umidificador para evitar distorção. Concluída a presa do gesso e dado o devido
acabamento aos modelos, as medidas foram, então, realizadas como descrito. Foi
considerada como quantidade de movimento dentário a diferença entre as
medidas realizadas nos diferentes tempos e a inicial.
Medidas foram tomadas por examinador único, treinado, calibrado e cego,
em dois tempos, com intervalo de duas semanas entre as avaliações, obtendo
índice de correlação intraclasse (intraclass correlation coeficiente – ICC) igual a
0,993. A média entre as duas mensurações foi considerada como o valor da
movimentação dentária.
3.5 PREPARO DAS PEÇAS HISTOLÓGICAS E AQUISIÇÃO DAS IMAGENS
RADIOGRÁFICAS
Decorridos 21 dias de movimentação dentária induzida, procedeu-se à
eutanásia dos animais por meio de injeção intracardíaca de dose letal de tiopental
10
sódico (Thiopentax; Cristália, Contagem, Minas Gerais, Brasil), seguida da
administração de fosfato de potássio.
Secções teciduais de interesse foram obtidas após dissecção e osteotomia
da mandíbula. Foram realizados orifícios para a delimitação da área com auxílio
de broca esférica n° 8, montada em micromotor de baixa rotação, sob irrigação
constante com soro fisiológico. Posteriormente, uniu-se os orifícios e as secções
foram destacadas com espátula nº 7. As peças anatômicas dos hemi-arcos direito
(com movimento ortodôntico)
e esquerdo (sem movimentação dentária)
apresentaram o terceiro molar como limite posterior e como limite anterior, 10 mm
mesial ao primeiro molar.
As peças foram armazenadas em solução fixadora de formol tamponado a
10% (pH 7,0), à temperatura ambiente, por 48 horas. Nesse ínterim, as secções
teciduais foram radiografadas, utilizando sistema digital de aquisição indireta de
imagens. Para padronização da técnica, as hemimandíbulas foram apoiadas em
posicionador radiográfico periapical, permitindo incidência ortogonal do feixe de
raios-X e em direção vestíbulo-lingual, com a placa foto-estimulável de fósforo
(photostimulable phosphor – PSP) localizada na face lingual da peça (Figura 4,
página 18). O feixe foi gerado por aparelho de raio-X (Spectro 70X Seletronic;
Dabi Atlante, Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil) calibrado em 8 mA e 70 kV e o
tempo de exposição foi de 0,3 segundos.
O processamento da imagem envolveu o escaneamento a laser do sensor
PSP sensibilizado em equipamento apropriado (Express, Instrumentarium Dental,
Tuusula, Finland) da disciplina de Radiologia da Universidade Federal do Rio de
Janeiro. Os arquivos gerados foram salvos como imagens de 8 bits, em formato
TIFF e resolução de 600 dpi.
11
Em
seguida,
as
peças
foram
descalcificadas
em
ácido
etilenodiaminotetracético (EDTA) a 14% durante 60 dias, com trocas da solução a
cada três dias. Verificada a descalcificação, por método de punção com agulha,
os espécimes teciduais passaram por processamento histotécnico, foram
emblocados em parafina e cortados longitudinalmente, em direção mesiodistal,
com espessura de 6 μm. O primeiro corte que incluísse a altura total do osso
alveolar na mesial do primeiro molar e, em seguida, um a cada 10 cortes
(totalizando três) foram selecionados. Após a coloração com hematoxilina e
eosina (HE), as características histológicas foram observada sob microscopia de
luz.
3.6 CONTAGEM DOS OSTEOCLASTOS
Os osteoclastos presentes na superfície óssea da cortical alveolar da
mesial dos primeiros molares direito e esquerdo foram contados, nos três cortes
selecionados, por um único examinador calibrado e cego para o tipo de
tratamento. A seleção da região de leitura foi realizada mediante a superposição
de grade com quadrados de 9 mm2 sobre o corte histológico, paralelamente ao
longo eixo do primeiro molar, de forma que o lado superior de um desses
quadrados coincidisse com o ponto mais elevado da crista óssea. Os osteoclastos
sobre a superfície óssea alveolar dentro deste quadrado, correspondente ao terço
cervical do molar, foram contados manualmente sob microscopia de luz
(microscópio Nikon Eclipse E600, aumento de 400x). Células grandes e
multinucleadas,
exibindo
citoplasma
eosinofílico,
foram
consideradas
osteoclastos. O número de osteoclastos foi expresso como a média entre a leitura
dos três cortes.
12
Repetição do procedimento foi realizado em todas as lâminas, com
intervalo de uma semana, obtendo-se ICC de 0,976.
3.7 ANÁLISE FRACTAL DA INTERFACE ENTRE LP E OSSO ALVEOLAR
Um dos cortes de cada hemimandíbula direita e esquerda foi selecionado
aleatoriamente para a análise fractal. Fotomicrografias, com lente objetiva de 10x,
da interface entre osso e LP foram capturadas. A borda lateral das imagens
coincidiu com o ápice da crista óssea mesial ao primeiro molar e a borda superior
foi posicionada paralelamente ao cemento. A interface LP-osso dentro desta
imagem foi contornada por linha de um pixel, utilizando o software Photoshop
CS6 (Adobe Systems, San Jose, California, USA) para este fim. Os contornos
correspondentes foram salvos como imagens em TIFF, resolução de 300 dpi e
dimensão de 945x945 pixels. O Imagem J versão 1.46r, software de domínio
público desenvolvido pelo National Institutes of Health (Bethesda, Maryland,
USA), foi utilizado para a mensuração da DF da superfície óssea através do
método automatizado de contagem de caixa (função Fractal Box Count do menu
Analyze), com os tamanhos das caixas definidos em 4, 8, 16, 32, 64, 128 e 356
pixels.
O ICC para as medidas repetidas, após uma semana, foi igual a 0,902.
3.8 ANÁLISE FRACTAL DO TRABECULADO ÓSSEO
A análise fractal do osso trabecular foi realizada para verificar possíveis
alterações em sua estrutura, uma vez que este tecido apresenta padrão de
conectividade com propriedades fractais. O cálculo da DF foi realizado por
metodologia já descrita acima e em região de interesse (region of interest – ROI)
13
devidamente estabelecida. ROI de 50x40 pixels foi selecionada dentro de cada
imagem radiográfica, em região de osso trabecular na mesial do primeiro molar
inferior e abaixo da raiz do incisivo, evitando que estruturas como osso cortical,
lâmina dura e ligamento periodontal fossem incluídas na demarcação.
Para calcular a DF do osso trabecular, as ROI foram submetidas ao
processamento de imagem no mesmo software, através de sequência de
procedimentos modificada a partir do protocolo descrito por White e Rudolph
(1999). A fim de remover variações no brilho da imagem, mantendo apenas as
grandes variações de densidade, a ROI foi duplicada e desfocada utilizando o
filtro gaussiano (sigma = 10 pixels). A imagem desfocada foi, então, subtraída da
imagem original e o valor de 128, centro da faixa de intensidade de imagem em 8
bits, foi adicionado à escala de cinza de cada pixel. Assim, a maior variação do
brilho passaria a ser devido à presença de trabéculas em relação aos espaços
medulares. A imagem resultante foi binarizada e invertida, de forma que as
regiões correspondentes ao trabeculado ósseo apresentaram-se em preto,
enquanto os espaços medulares em
branco. Por
fim,
a
imagem foi
esqueletonizada, reduzindo a área do tecido ósseo a linhas de único pixel central.
A DF da imagem esqueletonizada foi calculada usando a função Fractal Box
Count com os tamanhos das caixas definidos em 2, 3, 4, 6, 8, 12, 16, 32 e 64
pixels.
O procedimento foi repetido com duas semanas de intervalo, obtendo-se
ICC de 0,809.
3.9 ANÁLISE DA INTENSIDADE DE PIXEL
A média de intensidade de pixel da mesma ROI foi mensurada utilizando a
função Histogram do software Image J. A mesma análise foi também realizada em
14
área padronizada (50x40 pixels, 1,5 mm afastada dos bordos) do posicionador
periapical radiográfico para permitir a normalização dos valores da intensidade de
pixel de cada ROI. Este procedimento é essencial para o controle de possíveis
variações na sensibilidade do PSP. Os valores normalizados foram obtidos
através da divisão do valor da intensidade de pixel da ROI pelo valor apresentado
pelo posicionador periapical em cada imagem radiográfica.
A análise foi repedida pelo mesmo examinador, com intervalo de duas
semanas, obtendo-se ICC igual a 0,995.
3.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A média entre as repetições realizadas para o cálculo do ICC foi utilizada
para as análises estatísticas dos dados.
Os testes estatísticos foram processados através dos programas Statistical
Package for the Social Science (versão 17.0, SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA),
Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA) e GraphPad
Prism versão 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, California, USA), a nível de
significância de 5%. A verificação da normalidade e da homogeneidade foi
realizada por meio do teste de Shapiro-Wilk e do teste de Levene,
respectivamente.
Análise de medidas repetidas - ANOVA, com o coelho como sujeito, e a
taxa de movimento dentário induzido aos 7, 14 e 21 dias como as medidas
repetidas, foi utilizada para avaliação do movimento dentário ao longo do tempo.
A influência do alendronato e da interação alendronato-movimentação ortodôntica
na DF e intensidade de pixel, foi avaliada através do teste Two-way ANOVA.
15
Comparações inter e intragrupo foram realizadas por meio do teste t de
Student independente e pareado, respectivamente. Para a taxa semanal de
movimento dentário ortodôntico, o nível de significância foi ajustado para
comparações múltiplas, utilizando a correção de Bonferroni (α = 1,7%).
Análise de correlação, utilizando o coeficiente de correlação de Pearson, foi
realizada entre a DF da interface LP-osso e o número de osteoclastos do mesmo
corte histológico a fim de avaliar a influência da atividade osteoclástica na DF.
Também entre a intensidade de pixel e taxa de movimentação dentária ao 21º dia
para analisar a influência da densidade na quantidade de movimento. Forte
associação entre variáveis foi definida com r ≥ 0,8 (P ≤ 0,01), associação
moderada com 0,56 ≤ r <0,8 (P ≤ 0,05), e fraca associação com r <0,56 (P> 0,05).
16
Figura 1 Sequência de procedimentos para montagem do aparelho ortodôntico. A e B)
Confecção de canaletas h orizontais nas superfícies vestibular, distal e
lingual dos incisivos inferiores; C) Adaptação de grampo; D) Grampo
adaptado; E) Condicionamento ácido; F) Aplicação de adesivo; G)
Fixação do grampo com Transbond XT; H) Estiramento da mola até
alcançar 10 mm; I) Vista oclusal do dispositivo ortodôntico montado.
17
Figura 2 Calibração da carga liberada. O estiramento da mola propriamente dita, até que
alcançasse 10 mm de comprimento, proporcionou liberação de carga de 85 gf.
Figura 3 Avaliação métrica do movimento dentário ortodôntico com paquímetro digital
sobre o modelo de gesso.
18
Figura 4 Padronização da técnica radiográfica. Hemimandíbula sobre o posicionador
radiográfico periapical com o PSP localizado por lingual da peça anatômica.
19
4 DESENVOLVIMENTO DA PESQUISA
4.1 ARTIGO 1 Bisphosphonate and orthodontic tooth movement: an evaluation of
the osteoclastic activity by fractal analysis of the PDL-bone interface. Araújo, A.S.;
Netto, J.N.S.; Maciel, J.V.B.; Bolognese, A.M. A ser submetido para publicação no
American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics.
4.2
ARTIGO
2
Does
orthodontic
treatment
increase
the
uptake
of
Bisphosphonate? A pixel intensity and fractal analyzes. Araújo, A.S.; Vieira,
A.C.D.; Bolognese, A.M. A ser submetido para publicação no American Journal of
Orthodontics and Dentofacial Orthopedics.
20
ARTIGO 1
Bisphosphonate and orthodontic tooth movement: an evaluation of the
osteoclastic activity by fractal analysis of the PDL-bone interface.
Araújo, A.S.; Netto, J.N.S.; Maciel, J.V.B.; Bolognese, A.M.
ABSTRACT
Introduction: Alendronate as a bisphosphonate of third generation is an
antiresorptive drug that interferes with osteoclasts activity and survival, promoting
important side effects during orthodontic treatment. The purpose of this study was
to evaluate the interference of alendronate on orthodontic tooth movement (OTM)
and the osteoclast activity stimulated by mechanical loading. Methods: Fourteen
rabbits had their lower right first molars tipped mesially by a coil spring exerting a
constant 85 gf; in seven experimental rabbits, alendronate (3 mg/Kg) was injected
weekly. OTM was measured indirectly on plaster casts with a fine-tip digital
caliper. Osteoclasts count and fractal analysis by the box-counting method of the
periodontal ligament-bone interface was performed in histological sections of the
right and left sides of the mandible. Results: The rate and magnitude of OTM, and
the number of osteoclasts on the right side of the jaw were significantly lower in
the experimental group. After OTM there was an increase in fractal dimension only
in the control group. Moderate correlations were found between number of
osteoclasts and fractal dimension. Conclusions: Alendronate inhibits the OTM by
an effect on osteoclasts. Osteoclastic activity leads to an increase in the
irregularity of bone surface which can be quantified by its fractal dimension.
21
KEY WORDS: bisphosphonate, alendronate, orthodontic tooth movement, fractal
dimension.
22
INTRODUCTION
Bisphosphonates are antiresorptive agents used to treat both metabolic
bone diseases and complications associated with malignant bone metastases. 1
These drugs are synthetic analogues of inorganic pyrophosphate, an endogenous
regulator of bone mineralization,2 with oxygen replaced by carbon in the
pyrophosphate bond. This exchange forms a phosphate–carbon–phosphate (P-CP) structural backbone,3 which imparts the avid ability of the compound to bind to
hydroxyapatite.1,4 Potency and mode of action vary depending on the side-chain
attached to the central carbon: nitrogen-containing bisphosphonates are several
orders of magnitude more potent at inhibiting bone resorption than those without
nitrogen atom in the side-chain.5
Alendronate is a nitrogen-containing bisphosphonate, orally administered,
commonly prescribed for the prophylaxis and treatment of osteoporosis.6 After
administration, it is redistributed to bone, particularly to areas of increased bone
turnover, and subsequently incorporated into osteoclasts involved in bone
resorption.7 Within these cells, the compound interferes with specific intracellular
pathways, resulting in disruption of cytoskeletal function and intracellular
signaling.4,5 The consequences of these events include the suppression of
osteoclastic activity, loss of osteoclast cytoskeletal integrity and ruffled border, and
ultimately cell apoptosis.8
Reviews9-11 have been published on the effects of bisphosphonates on
bone physiology and the clinical side effects in orthodontics. The osteoclasts
arrival is the requisite first step in orthodontic tooth movement (OTM);12 therefore,
any interference with the function of these cells might result in decreased
efficiency and effectiveness of orthodontic treatment.7
23
The biomechanical and cellular cascades initiated by orthodontic forces
reshape the bony contour of the alveolus.13 After osteoclasts access the
mineralized bone, matrix dissolution occurs and the resorption lacunae is formed.
The frontal resorption of bone may thus cause structural changes at the bone
surface, resulting in an increase of its irregularity. The irregular morphology of this
region makes it difficult to measure. So, few investigations have studied the
periodontal ligament (PDL)-bone interface because its complexity does not allow
for numerical assessment by Euclidean geometrical principles.14
Studies15-17 have evaluated the irregularity of the junctions between the
tissues in order to discriminate normal tissue or benign tumor from malignant one.
Using fractal analysis, a method which provides a tool for characterizing
complexity and thus quantifying morphologies that are generally considered
irregular,14 larger fractal dimension was found with increasing border irregularity.
The fractal dimension of an object characterizes its self-similarity and describes its
space-filling properties;18 the more space the object occupies, the higher the
fractal dimension. Thus, fractal analysis may be a useful method for quantifying
the irregularity of the PDL-bone interface.
Because alendronate’s mechanism of action is to decrease osteoclastic
activity, we hypothesized that this compound, in addition to reducing the number of
osteoclasts and the rate of OTM, would cause a minor irregularity of the PDL-bone
interface. The consequence would be a lower increase in the fractal dimension
than that which would occur with tooth movement under normal conditions. Thus,
the purpose of this study was (1) to evaluate the rate and magnitude of OTM in a
rabbit model, (2) to estimate the degree of bone resorption by osteoclasts count,
24
(3) to analyze the fractal dimension of the PDL-bone interface, and (4) whether
there is a relationship between osteoclastic activity and the fractal dimension.
MATERIAL AND METHODS
Animals and bisphosphonate administration
Before this study, a power analysis based on an estimate of the standard
deviations (0.28 mm) and effect sizes (0.5mm) of OTM previously reported in the
pilot study was performed to estimate the sample size. This analysis showed that
7 rabbits per group were needed to obtain a power of 90% with an alpha at 5%.
On that basis, this in vivo experimental study sample comprised 12 male and 2
female New Zealand white rabbits, 16-week-old, with a mean weight of 2.6 ± 0.3
Kg. The animals were randomly divided into two groups, the control group and the
alendronate-treated experimental group. They were acclimatized for 1 week,
individually housed in cages inside a room with a 12-hour light/dark cycle and fed
with water and powdered commercial pellets (to avoid damage to the orthodontic
appliance) ad libitum. Weights were recorded weekly in order to detect any
changes related to food and/or experimental conditions. The study protocol was
reviewed and approved by the Ethics Commission on Animal Use in Scientific
Research at the Heath Center of the Federal University of Rio de Janeiro.
Alendronate sodium trihydrate (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) in
crystalline form was dissolved in distilled water and vortexed for 60 seconds to
obtain a solution containing 3 mg per milliliter of alendronate. The solution was
prepared immediately before each administration in order to prevent interference
in its stability caused by environmental and storage conditions. The experimental
group received weekly subcutaneous injections of alendronate at a dosage of
25
3mg/Kg for 6 weeks (3 doses before and 3 after appliance activation), whereas
saline solution was injected in the control group under the same protocol.
Experimental tooth movement
The mandibular right first molar of all animals were mesially tipped with a
constant 85 gf for 3 weeks. The orthodontic appliance was composed of a nickel
titanium closed coil spring 12 mm in length (Dental Morelli Ltda, Sorocaba, SP,
BRA) stretched from the cervical area of the molar to a staple inserted into groove
made with a dental handpiece on the vestibular and lingual surfaces of the
mandibular incisors. The coil spring was tied to both sites by a ligature wire.
Composite resin (Transbond XT; 3M Unitek, Monrovia, CA, USA) was placed over
the tie wire of the molar and the staple to prevent dislodgement of the coil spring.
The mandibular left first molars without orthodontic force application served as the
negative controls. All procedures were carried out under general anesthesia using
intramuscular injection of a mixed solution of ketamine hydrochloride (35mg/Kg),
acepromazine maleate (1mg/Kg) and xylazine hydrochloride (5mg/Kg). The
animals were verified weekly to perform the oral hygiene and to evaluate the
physical conditions by a vet, the integrity of tissue and appliance, and the amount
of tooth movement.
Measurements of tooth movement were performed on plaster models.
Impressions of the mandibular right molars were taken under general anesthesia
at day 0 (immediately before appliance placement), 7, 14 and 21, using
irreversible hydrocolloid (Jeltrate; Dentsply, Milford, DE, USA) as impression
material and a custom impression tray. After waiting 3 minutes to allow adequate
alginate gelation, the impression was removed, inspected to ensure that the region
was adequately captured, and stored in a humid environment. Shortly thereafter,
26
the impressions were poured on a vibrating surface using an improved die stone
type IV (Durone, Dentsply, Milford, DE, USA), that was vacuum-mixed for 30
seconds. After 1 hour, the plaster models were separated from the impression.
The amount of induced tooth movement was measured using a fine-tip digital
caliper from the distal surface of the mandibular right third molar to the distolingual
groove of the first molar by a single trained examiner, blinded to the treatment.
The differences between the measurements taken at different times and the
measure of the day 0 were considered the amount of tooth movement.
Microscopic examination
After 21 days of load application, the rabbits were euthanatized by
intracardiac injection of lethal dosage of thiopental, followed by administration of
potassium phosphate. Tissue sections of the left (without OTM / OTM-) and right
(with OTM / OTM+) quadrants of the mandible were obtained after dissection and
osteotomy. They were fixed in 10% neutral buffered formalin for 48 hours,
decalcified in 14% ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) for 60 days and
embedded in paraffin. Longitudinal-sections 6 μm thick, in a mesiodistal direction,
were obtained and the first one that included the entire height of the alveolar bone
on the mesial side of the first molar and then one of every 10 sections (total of 3
sections) were selected. After staining with haematoxylin and eosin, the
histological features were observed by light microscopy.
The number of osteoclasts was counted in all 3 sections on the pressure
side of the PDL by a single and blinded examiner. A square grid with 3 mm sidelength was placed over the sections parallel to the long axis of the first molar, with
the upper side of a square coinciding with the bone crest (Fig 1). The osteoclasts
on the alveolar bone surface within this square, corresponding to the cervical third
27
of the molar, were counted manually under light microscopy (microscope Nikon
Eclipse E600, x400 magnification). Large multinucleated cells displaying
eosinophilic cytoplasm were considered osteoclasts. The number of osteoclast
was expressed as the mean from the 3 sections.
Fractal analysis
One section was randomly selected for fractal analysis. Light micrographs
with a 10x objective lens of the interface between bone and periodontal ligament
were captured. The lateral edge of the images coincided with the top of the mesial
bone crest of the first molar and the top edge was positioned parallel to this tooth
cementum (Fig 2, A). The PDL-bone interface within this image was drawn using
the Photoshop CS6 software (Adobe Systems, San Jose, CA, USA) as 1 pixel-size
line (Fig 2, B). The corresponding PDL-bone interface outlines were saved as a
TIFF file, 300dpi resolution and 945x945 pixels dimension (Fig 2, C). The Image J
version 1.46r software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) was
used to measure the fractal dimension (FD) of the PDL-bone interface by the
automated box-counting method. In this method, the image is covered by square
grids of different box size and, for each box size, the number of squares containing
the outline is counted and plotted against the total number of box in double
logarithmic scale. FD is calculated from the slope of the line fitted on the data
points. Square grids with side-lengths 4, 8, 16, 32, 64, 128 and 356 pixels were
used.
Statistical analysis
Statistical tests were performed using SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL,
USA) and Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA) at a 5%
level of significance. Intraexaminer reliability was evaluated based on comparisons
28
of replicate measurements of all sample in a blinded fashion, with one week
interval. Single measures intraclass correlations were found to be 0.993 for
measurements of tooth movement, 0.976 for osteoclast counting and 0.902 for FD
of the PDL-bone interface. The mean of the 2 measurements was used for further
statistical analysis.
A repeated-measures analysis of variance (ANOVA), with a rabbit as a
subject, and the rate of OTM at 7, 14 and 21 days as the repeated measures, was
used to evaluate the tooth movement over the time.
Intergroup and intragroup comparisons of the weekly rate of tooth
movement, number of osteoclasts, and FD of the PDL-bone interface were
analyzed with unpaired and paired Student’s t-test, respectively. For the weekly
rate of OTM, the level of significance was adjusted for multiple comparisons using
the Bonferroni correction (α = 1.7%).
Correlation analysis, using the Pearson correlation coefficient, was
performed to evaluate relationships between FD of the PDL-bone interface and
number of osteoclasts of the same histological section in order to estimate the
influence of osteoclastic activity on this variable. We defined a strong linear
association as r ≥ 0.80 (P ≤ .01), a moderate association as 0.56 ≤ r < 0.80 (P ≤
.05), and a weak association as r < 0.56 (P > .05).
RESULTS
Figure 3 shows the mean OTM measurements of animals which received
injections of alendronate, and those of the control group. The experimental group
had lower mean OTM measurements, 0.25 mm (SD = 0.12) at 7 days, 0.35 mm
(SD = 0.14) at 14 days and 0.45 mm (SD = 0.15) at 21 days, than the control
29
group, 0.54 mm (SD = 0.14) at 7 days, 0.96 mm (SD = 0.27) at 14 days and 1.36
mm (SD = 0.34) at 21 days. In the repeated-measures ANOVA, the difference in
the amount of OTM between control and experimental group was significant
(group main effect, averaged over the 3 time points, p < .001). Also, the amount of
OTM increased over every time interval (time main effect, averaged over the 2
groups, p < .001) and this increase significantly differed in alendronate and control
group (group-by-time interaction, p < .001). The increment in the amount of OTM
was lower in the alendronate group since it exhibited an initial (baseline-day 7)
tooth movement of 46% of that in the control group (0.25 and 0.54 mm,
respectively), 36,5% (0.35 and 0.96 mm) in the second week (baseline-day 14),
and 33% (0.45 and 1.36 mm) in the third week (baseline-day 21).
The weekly rate of movement within the group did not differ significantly
over the experimental period (Table I). After an initial rate slightly higher (0.54 and
0.25 mm for the control and experimental group, respectively), there was a mean
weekly rate of 0.4 mm for the control group and 0.1 mm for the experimental
group, with significant differences between the groups.
The number of osteoclast on the mesial of the lower first molar is shown in
Figure 4. After induction of tooth movement, there was an increase in this value in
the control group (OTM- = 6.32, SD = 4.85; OTM+ = 27.43, SD = 13.55; p = .008)
and a maintenance in the experimental group (OTM- = 13.36, SD = 8.35; OTM+ =
14.14, SD = 2.75; p = .803). Although the number of osteoclasts on the OTM- side
in the alendronate group was twice that of the control group, there was no
significant difference between the groups (p = .078). However, on the side with
tooth movement, there was a significant reduction of osteoclasts in the
30
experimental group (p = .041), showing the inhibitory effect of alendronate on
these cells.
Similarly as in the number of osteoclasts, tooth movement increased the FD
of the PDL-bone interface in the control group, but did not cause changes in the
experimental group (Fig 5; Table II). This suggests that osteoclast activity may
have been responsible for the increase in FD due to an increment of the boundary
irregularity caused by the presence of more active resorption sites. In the
Pearson’s correlation, the number of osteoclasts was moderately related to FD (r =
0.666, p < .01), and accounted for 44.4% (r2 = 0.444) of the variability in the FD
value.
DISCUSSION
No study has investigated the effect of alendronate on rabbit during
orthodontic tooth movement. In this research, significant inhibitory effect of the
compound on the rate and magnitude of tooth movement was shown, supporting
on published animal experiments7,19-24 and case studies25,26 that have reported a
decrease in orthodontic tooth movement with bisphosphonate administration.
However, the case presented by Krieger et al. 27 contradicts the above papers.
Even with the need for considerable retrusion of the upper anterior teeth, they
related that the orthodontic treatment was successfully accomplished after 13
months. According to the authors, possible explanations would include the shorter
duration of intake (7 months) or lower cumulative dose of the alendronate, and the
tooth mobility due to a significantly reduced periodontal attachment of their patient.
Really, the accumulated pharmacologic effects of bisphosphonates are influenced
31
by dose and potency, route of administration, continuous administration, duration
of treatment and degree of turnover in a specific bone. 28
In comparison to other species, rabbits have faster skeletal change and
bone turnover, with predominant remodeling over the modeling processes.29
Consequently, the effect of alendronate was observed even with a relatively short
experimental period since the uptake of the alendronate was enhanced by the high
bone turnover rate of this animal. Also, a continuous administration of the
compound was performed at a dosage that, based on body-mass conversion
factors, approximates of that used for osteoporosis treatment.
We are in agreement with Karras et al.7 who found a decrease in the OTM
in a rat model after alendronate administration. They stated that this inhibitory
effect is most likely owing to disruption of osteoclast function and survival at
compression side where resorption is required for orthodontic tooth movement to
occur. As expected, the number of osteoclasts on the mesial bone surface of right
first molar was significantly lower in the experimental group (Fig 6, A) than the
control group (Fig 6, B). This result corroborates the finding of other studies 20,23
that also revealed a decline in the number of osteoclasts on the pressure side
along the bone surface. Moreover, osteoclasts with chromatin condensation were
occasionally observed in the alendronate-treat group, suggesting the presence of
cells in apoptosis. These outcomes ratify the mechanism of action of nitrogencontaining bisphosphonates that, after interference with specific intracellular
pathways, culminates with the disappearance of the ruffled border, leading to
inactivity and apoptosis of the osteoclasts.30
Since bisphosphonates act by preventing osteoclast activation and causing
apoptosis, the result is the initiation of fewer active basic multicellular units (BMUs)
32
on bone surfaces,31,32 the most prominent effect of these compound seen in
histological analysis.33
Allen et al.33 showed additional mechanism of
bisphosphonates effect on bone surface through which these drugs slow the rate
of bone resorption. They reported that in addition to reducing the number of active
remodeling units, bisphosphonates decrease the size of these resorption sites,
minimizing the amount of bone resorbed within each BMU. Due to the initiation of
resorption cavities in smaller quantity and size, administration of alendronate could
result in lower bone surface complexity than the control group during tooth
movement since the osteoclastic activity stimulated by the mechanical loading
would be inhibited by bisphosphonate. This complexity was measured in terms of
fractal dimension, and the results showed increase in fractal dimension in the
control group and maintenance of its value in the experimental group after 21 days
of induced tooth movement. Comparing control and alendronate group, the first
showed higher FD of the PDL-bone interface on the OTM+ side. Furthermore,
fractal dimension was moderately related with the number of osteoclasts. Thus, it
is suggested that greater number of resorption sites, produced as a consequence
of increased osteoclasts activation frequency, lead to significant increment in
fractal dimension. This makes the fractal analysis by the box-counting method a
tool of assessment of osteoclastic activity on bone surface in microscopic
examination.
Only one study14 in the literature evaluated fractal dimensional change at
the PDL-bone interface after mechanical stresses produced by orthodontic
appliance. Wagle et al.14 showed an increase in the fractal dimension directly
proportional to the magnitude of force applied. However, unlike this work, the
authors stated that the increase occured apart from mechanisms of bone cell
33
directed remodeling. Actually, cellular interference could not be analyzed since the
force was applied for only 6 hours, not enough time for the manifestation of
significant osteoclastic activity. At 6 hours, many osteoclasts and pre-osteoclastic
cells are yet observed in vascular canals.34 The number of osteoclasts in the
periodontal ligament and adjacent alveolar bones increases only on day 1,34 with a
peak level about 50 hours after orthodontic force application. In this study, the
mechanical loading was applied until day 21 when frontal bone resorption already
occurred significantly and osteoclastic activity could be evaluated. The current
research does not corroborate with the finding of Wagle et al.,14 since the action of
osteoclasts was necessary to increase the FD or, otherwise, would have occurred
an increase in this variable also in the experimental group in which orthodontic
force was applied.
Based on the foregoing, orthodontists should pay careful attention to
patients using alendronate. Owing to a slow rate of bone resorption, the
bisphosphonates intake becomes a risk factor for adverse orthodontic outcomes.
Lotwala et al.,35 in a retrospective cohort study, stated that bisphosphonate use is
associated with longer treatment times among extraction patients and increased
odds of poor space closure and root parallelism. This adverse effect can continue
for years after the drug is discontinued, considering that bisphosphonates have
long
terminal
bone
half-life,
about
10
years
for
alendronate.
As
for
bisphosphonate-induced jaw osteonecrosis (BIJON), a severe adverse side effect
of this therapy, no studies have attributed orthodontic treatment to increased risk
of this pathological process. Nevertheless, orthodontists should monitor for
exposed necrotic bone.
34
As adult patients with underlying medical condition have become more
widely accepted in orthodontic practices, the risks, benefits, and effects of these
medications must be fully understood by the orthodontist to provide the best
treatment for them.
CONCLUSION
In our rabbit model, a short-term alendronate treatment inhibited the activity
and survival of osteoclasts and reduced the bone resorption at the compression
side after the application of orthodontic force. The result was a decrease in the
rate and magnitude of the orthodontic tooth movement.
The action of osteoclasts enhanced the fractal dimension of the PDL-bone
interface as a consequence of increasing irregularity of bone surface. This study
provides bases for the use of fractal analysis by the box-counting method as an
evaluation tool of osteoclastic activity.
35
REFERENCES
1. Licata AA. Discovery, clinical development, and therapeutic uses of bisphosphonates.
Ann Pharmacother 2005;39:668-677.
2. Ghoneima AA, Allam ES, Zunt SL, Windsor LJ. Bisphosphonates treatment and
orthodontic considerations. Orthod Craniofac Res 2010;13:1-10.
3. Sarin J, DeRossi SS, Akintoye SO. Updates on bisphosphonates and potential
pathobiology of bisphosphonate-induced jaw osteonecrosis. Oral Dis 2008;14:277-285.
4. van Beek ER, Cohen LH, Leroy IM, Ebetino FH, Lowik CW, Papapoulos SE.
Differentiating the mechanisms of antiresorptive action of nitrogen containing
bisphosphonates. Bone 2003;33:805-811.
5. Rogers MJ. New insights into the molecular mechanisms of action of bisphosphonates.
Curr Pharm Des 2003;9:2643-2658.
6. Epstein S. Update of current therapeutic options for the treatment of postmenopausal
osteoporosis. Clin Ther 2006;28:151-173.
7. Karras JC, Miller JR, Hodges JS, Beyer JP, Larson BE. Effect of alendronate on
orthodontic tooth movement in rats. Am J Orthod Dentofacial Orthop 2009;136:843-847.
8. Boivin G, Meunier PJ. Effects of bisphosphonates on matrix mineralization. J
Musculoskelet Neuronal Interact 2002;2:538-543.
9. Bartzela T, Turp JC, Motschall E, Maltha JC. Medication effects on the rate of
orthodontic tooth movement: a systematic literature review. Am J Orthod Dentofacial
Orthop 2009;135:16-26.
10. Iglesias-Linares A, Yanez-Vico RM, Solano-Reina E, Torres-Lagares D, Gonzalez
Moles MA. Influence of bisphosphonates in orthodontic therapy: Systematic review. J
Dent 2010;38:603-611.
11. Tyrovola JB, Spyropoulos MN. Effects of drugs and systemic factors on orthodontic
treatment. Quintessence Int 2001;32:365-371.
12. Rody WJ, Jr., King GJ, Gu G. Osteoclast recruitment to sites of compression in
orthodontic tooth movement. Am J Orthod Dentofacial Orthop 2001;120:477-489.
13. Toms SR, Lemons JE, Bartolucci AA, Eberhardt AW. Nonlinear stress-strain behavior
of periodontal ligament under orthodontic loading. Am J Orthod Dentofacial Orthop
2002;122:174-179.
14. Wagle N, Do NN, Yu J, Borke JL. Fractal analysis of the PDL-bone interface and
implications for orthodontic tooth movement. Am J Orthod Dentofacial Orthop
2005;127:655-661; quiz 754.
15. Yokoyama T, Kawahara A, Kage M, Kojiro M, Takayasu H, Sato T. Image analysis of
irregularity of cluster shape in cytological diagnosis of breast tumors: cluster analysis with
2D-fractal dimension. Diagn Cytopathol 2005;33:71-77.
36
16. Piantanelli A, Maponi P, Scalise L, Serresi S, Cialabrini A, Basso A. Fractal
characterisation of boundary irregularity in skin pigmented lesions. Med Biol Eng Comput
2005;43:436-442.
17. Martin-Landrove M, Pereira D, Caldeira ME, Itriago S, Juliac M. Fractal analysis of
tumoral lesions in brain. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc 2007;2007:1306-1309.
18. Updike SX, Nowzari H. Fractal analysis of dental radiographs to detect periodontitisinduced trabecular changes. J Periodontal Res 2008;43:658-664.
19. Hashimoto M, Hotokezaka H, Sirisoontorn I, Nakano T, Arita K, Tanaka M et al. The
effect of bone morphometric changes on orthodontic tooth movement in an osteoporotic
animal model. Angle Orthod 2013.
20. Liu L, Igarashi K, Haruyama N, Saeki S, Shinoda H, Mitani H. Effects of local
administration of clodronate on orthodontic tooth movement and root resorption in rats.
Eur J Orthod 2004;26:469-473.
21. Fujimura Y, Kitaura H, Yoshimatsu M, Eguchi T, Kohara H, Morita Y et al. Influence of
bisphosphonates on orthodontic tooth movement in mice. Eur J Orthod 2009;31:572-577.
22. Choi J, Baek SH, Lee JI, Chang YI. Effects of clodronate on early alveolar bone
remodeling and root resorption related to orthodontic forces: a histomorphometric
analysis. Am J Orthod Dentofacial Orthop 2010;138:548 e541-548; discussion 548-549.
23. Igarashi K, Mitani H, Adachi H, Shinoda H. Anchorage and retentive effects of a
bisphosphonate (AHBuBP) on tooth movements in rats. Am J Orthod Dentofacial Orthop
1994;106:279-289.
24. Sirisoontorn I, Hotokezaka H, Hashimoto M, Gonzales C, Luppanapornlarp S,
Darendeliler MA et al. Orthodontic tooth movement and root resorption in ovariectomized
rats treated by systemic administration of zoledronic acid. Am J Orthod Dentofacial Orthop
2012;141:563-573.
25. Rinchuse DJ, Sosovicka MF, Robison JM, Pendleton R. Orthodontic treatment of
patients using bisphosphonates: a report of 2 cases. Am J Orthod Dentofacial Orthop
2007;131:321-326.
26. Zahrowski JJ. Optimizing orthodontic treatment in patients taking bisphosphonates for
osteoporosis. Am J Orthod Dentofacial Orthop 2009;135:361-374.
27. Krieger E, d'Hoedt B, Scheller H, Jacobs C, Walter C, Wehrbein H. [Orthodontic
treatment of patients medicated with bisphosphonates-a clinical case report.]. J Orofac
Orthop 2013.
28. Zahrowski JJ. Bisphosphonate treatment: an orthodontic concern calling for a
proactive approach. Am J Orthod Dentofacial Orthop 2007;131:311-320.
29. Castaneda S, Largo R, Calvo E, Rodriguez-Salvanes F, Marcos ME, Diaz-Curiel M et
al. Bone mineral measurements of subchondral and trabecular bone in healthy and
osteoporotic rabbits. Skeletal Radiol 2006;35:34-41.
30. Rogers MJ, Gordon S, Benford HL, Coxon FP, Luckman SP, Monkkonen J et al.
Cellular and molecular mechanisms of action of bisphosphonates. Cancer 2000;88:29612978.
37
31. Rodan GA, Fleisch HA. Bisphosphonates: mechanisms of action. J Clin Invest
1996;97:2692-2696.
32. Allen MR, Iwata K, Phipps R, Burr DB. Alterations in canine vertebral bone turnover,
microdamage accumulation, and biomechanical properties following 1-year treatment with
clinical treatment doses of risedronate or alendronate. Bone 2006;39:872-879.
33. Allen MR, Erickson AM, Wang X, Burr DB, Martin RB, Hazelwood SJ. Morphological
assessment of basic multicellular unit resorption parameters in dogs shows additional
mechanisms of bisphosphonate effects on bone. Calcif Tissue Int 2010;86:67-71.
34. Yokoya K, Sasaki T, Shibasaki Y. Distributional changes of osteoclasts and preosteoclastic cells in periodontal tissues during experimental tooth movement as revealed
by quantitative immunohistochemistry of H(+)-ATPase. J Dent Res 1997;76:580-587.
35. Lotwala RB, Greenlee GM, Ott SM, Hall SH, Huang GJ. Bisphosphonates as a risk
factor for adverse orthodontic outcomes: a retrospective cohort study. Am J Orthod
Dentofacial Orthop 2012;142:625-634 e623.
38
Fig 1. Square grid with 3 mm side-length over the histological section. * Mesial of
the first molar where the osteoclast count was performed. Note the diastema
between the lower right first and second molar after orthodontic movement.
39
Fig 2. A, micrographs with a 10x objective lens of the PDL-bone interface of the
mesial of the lower first molar. B, PDL-bone interface outlined. C, image used to
calculate the fractal dimension. AB, alveolar bone; PDL, periodontal ligament; C,
cementum; bars = 100 μm.
40
Fig 3. Time course of tooth movement on the control and alendronate-treat group
showing mean of the amount of OTM (SD) at 7, 14 and 21 days. OTM in the
experimental group was significantly lower than in the control group (p < .001 for
the group main effect) and the amount of OTM increased over the time (p < .001
for the time main effect).
Fig 4. Number of osteoclasts on the mesial of the lower first molar. The error bars
extend one standard deviation away from the means. Statistical difference was
observed between OTM- and OTM+ sides within control group, and between
control and experimental group on OTM+ side at α = .05 (Student’s t-test).
41
Fig 5. PDL-bone interface outlines. A, left and B, right side of a control animal. C,
left and D, right side of an experimental animal. Note the increase of bone surface
irregularity in the control group and almost no change in the experimental group
after 21 days of induced tooth movement.
Fig 6. Micrograph of the compression side of a right first molar from A,
experimental and B, control group showing the inhibitory effect of alendronate on
osteoclasts (arrows). The number of osteoclastic cells was significantly lower in
the alendronate-treat rabbits (haematoxylin and eosin staining, x400). AB, alveolar
bone; PDL, periodontal ligament; C, cementum; bars = 50 μm.
42
Table I. Weekly rate of orthodontic tooth movement (mm)
Control animals
Experimental animals
Days
Mean
SD
Mean
SD
0-7
0.54
0.14
0.25
0.12
7 - 14
0.41
0.25
0.10
0.11
14 - 21
0.40
0.17
0.10
0.11
*Significant (p < .017) change over time.
Group differences
p
.001
.011
.002
Table II. Fractal dimension of the PDL-bone interface
Orthodontic
Control animals
Experimental animals
Group differences
tooth
Mean
SD
Mean
SD
p
movement
No
1.0726
0.021
1.0924
0.028
.161
Yes
1.1491*
0.048
1.0976
0.028
.030
*Significant (p < .05) change in the FD after the orthodontic tooth movement.
43
20
ARTIGO 2
Does orthodontic treatment increase the uptake of bisphosphonate? A pixel
intensity and fractal analyzes.
Araújo, A.S.; Vieira, A.C.D.; Bolognese, A.M.
ABSTRACT
Introduction: Bisphosphonate binds to hydroxyapatite particularly at sites
undergoing bone remodeling, and the amount of drug uptake depends on the rate
of bone turnover. So, it is possible that orthodontic tooth movement (OTM)
increases the levels of bisphosphonates within the jawbone. The aim of this study
was to assess changes in trabecular bone caused by alendronate and
alendronate-OTM interaction. Methods: Fourteen rabbits had their mandibular
right first molars tipped mesially by a closed coil spring releasing a constant 85
g/force. Seven experimental rabbits received subcutaneous injection of 3 mg/Kg
per week of alendronate sodium. Radiographs of the left and right hemimandible
were taken and trabecular bone complexity and density were measured by fractal
dimension (FD) and pixel intensity (PI), respectively. Results: No variation in the
FD values was caused by alendronate, but it increases the PI measures
(p<0.001). No additional changes in FD and PI were observed with the
alendronate-OTM interaction and the reduction in FD occurred due to the OTM
only. Conclusions: Alendronate increases bone density even in healthy animal,
but no additional change was caused by drug-OTM interaction, suggesting that
orthodontic treatment do not increase the alendronate uptake. However, FD and
PI were not sensitive for this evaluation.
44
KEY WORDS: bisphosphonate, alendronate, orthodontic tooth movement, fractal
dimension, pixel intensity.
45
INTRODUCTION
Bisphosphonates are currently the most important class of antiresorptive
agents used in the treatment of metabolic bone diseases,1 such as osteoporosis,
Paget’s disease, and some types of metastatic cancer.2 These drugs are synthetic
analogues of inorganic pyrophosphate (PPi), an endogenous regulator of bone
mineralization,3 with oxygen replaced by carbon in the pyrophosphate bond to
form a phosphate–carbon–phosphate (P-C-P) structural backbone,4 which imparts
the avid ability to bind to hydroxyapatite.2,5
Alendronate is an orally administered bisphosphonate commonly used in
the prophylaxis and treatment of osteoporosis.6 After administration, it is rapidly
cleared from the circulation. About 60% to 70% of the drug is bound to bone
mineral surfaces at sites of active bone remodeling, with the remainder excreted
through the kidneys.7 The drug is considered inactive when bound to exposed
hydroxyapatite until it is released during bone remodeling and absorbed by
osteoclasts. Uptake into osteoclasts inhibits its function and shortens its life
span.2,8
However, more drug can be selectively bound to bone 9 and released from
it10
if more sites of active bone turnover exist during the distribution time.
Orthodontic tooth movement (OTM) increases alveolar bone turnover. Therefore,
orthodontic movement and continuous administration of bisphosphonate could
create an even more exaggerated cycle of uptake and release of the active drug
locally,9 increasing its effect and the risk of osteonecrosis of the jaws, an adverse
effect of bisphosphonate therapy.
As well as reducing bone loss, alendronate can actually enhance the
mineralization density of bone11 and bone mass. It is concentrated 2 to 3 times
46
higher in trabecular bone, since this, accounting for only 20% of the skeleton, has
80% of bone turnover.12
Digital radiographic data can be used to examine trabecular bone patterns.
A digital image is composed of pixels with specific numeric values assigned for
which one. Pixel intensity (PI) analysis is a measure of the blackness or whiteness
on a scale from zero (black) to 255 (white) in an 8-bit digital image. This analysis
could be a simple and useful method to measure mandibular bone mass. 13 Fractal
analysis examines the trabecular bone microarchitecture with a numerical
expression of the fractal dimension (FD). 14,15 A higher fractal dimension indicates a
more complex structure.16 There are many approaches for estimating FD, but the
box-counting method is the most widely used.17
The aim of this study was to evaluate the effect of alendronate and
alendronate-OTM interaction on the trabecular structures, assessing the FD and
PI of bone on digital radiographs. We hypothesized that drug administration alters
FD and PI values and that orthodontic movement increases these changes,
indicating a higher uptake of alendronate.
MATERIAL AND METHODS
Animals and procedures
The study protocol was reviewed and approved by the Ethics Commission
on Animal Use in Scientific Research at the Heath Center of the Federal University
of Rio de Janeiro. A power analysis was performed to estimate the sample size. It
was calculated based on a significance level of 5% and a power of 85% and
showed that 7 animals per group were required. So, this in vivo experimental study
sample comprised 12 male and 2 female New Zealand white rabbits, 16-week-old,
47
with a mean weight of 2.6 ± 0.3 Kg. The rabbits were randomly divided into two
groups, the control group (CG) and the alendronate-treated experimental group
(EG). They were acclimatized for 1 week, individually housed in cages inside a
room with a 12-hour light/dark cycle and fed with powdered commercial pellets, to
avoid damage to the orthodontic appliance, and water ad libitum. Weights were
recorded weekly in order to detect any changes related to food and/or
experimental conditions.
Alendronate sodium trihydrate (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) in
crystalline form was dissolved in distilled water and vortexed for 60 seconds to
obtain a solution containing 3 mg per milliliter of alendronate. The solution was
prepared immediately before each administration in order to prevent interference
in its stability caused by environmental and storage conditions. The experimental
group received weekly subcutaneous injections of alendronate at a dosage of
3mg/Kg for 6 weeks (3 doses before and 3 after appliance activation), whereas
saline solution was injected in the control group under the same protocol.
The mandibular right first molar of all animals were mesially tipped with a
continuous 85 gf for 3 weeks. The orthodontic appliance was composed of a nickel
titanium closed coil spring 12 mm in length (Dental Morelli Ltda, Sorocaba, SP,
BRA) stretched from the cervical area of the molar to a staple inserted into groove
made with a dental handpiece on the vestibular and lingual surfaces of the
mandibular incisors. The coil spring was tied to both sites by a ligature wire.
Composite resin (Transbond XT; 3M Unitek, Monrovia, CA, USA) was placed over
the tie wire of the molar and the staple to prevent displacement of the coil spring.
All procedures were carried out under general anesthesia using intramuscular
injection of a mixed solution of ketamine hydrochloride (35mg/Kg), acepromazine
48
maleate (1mg/Kg) and xylazine hydrochloride (5mg/Kg). The animals were
evaluated weekly to verify the integrity of tissue and appliance and to perform the
oral hygiene.
After 21 days of load application, the rabbits were euthanatized by
intracardiac injection of lethal dosage of thiopental, followed by administration of
potassium phosphate. Tissue sections of the left (without OTM / OTM-) and right
(with OTM / OTM+) quadrants of the mandible were obtained after dissection and
osteotomy and were stored in 10% neutral buffered formalin.
Radiography
Tissue sections were radiographed using digital system of indirect
acquisition of images (Express; Instrumentarium Dental, Tuusula, Finland) within
24 hours after euthanasia. Periapical radiographic positioner was used to
standardize the technique, allowing orthogonal incidence of the X-rays in the
buccolingual direction of the hemimandibles, with the photostimulable phosphor
plate (PSP) located on the lingual surface of the sections. All radiographic
exposures were made using the same x-ray unit (Spectro 70X Seletronic; Dabi
Atlante, Ribeirão Preto, SP, BRA) operating at 70 kV, 8 mA and 0.3 seconds
exposure time. Radiographs were saved as 8-bit images, in TIFF format and
resolution of 600dpi.
Assessment of the fractal dimension
All procedures for calculation of the fractal dimension were performed by
using Image J version 1.46r software (National Institutes of Health, Bethesda, MD,
USA), a public domain program. Region of interest (ROI) was drawn as a 50×40
pixel-sized rectangle, with a pixel size of 0.042 mm, at mesial of the mandibular
first molar, below the root of the incisor, on each left and right hemimandible (Fig
49
1, A). This region contains the largest area of uninterrupted trabecular bone
required by the analysis and less overlapping structures to obscure the data.
Cortical bone, lamina dura, periodontal ligament and tooth roots were avoided in
the ROI.
The image processing, modified from White and Rudolph,18 was performed
as follows: 1) the ROI was cropped and duplicated (Fig 1, B); 2) the duplicated
image was blurred with a Gaussian filter (sigma = 10 pixels) to remove all finescale and medium-scale structure and retain only large variations in density (Fig 1,
C); 3) the blurred image was subtracted from the original image (Fig 1, D); 4) a
value of 128, center of the intensity range for an 8-bit image, was added to the
result at each pixel location, thus the greatest variation of brightness would be due
to the presence of trabeculae in relation to the marrow spaces (Fig 1, E); 5) the
image was converted to a binary format (Fig 1, F); 6) and then inverted, thus the
regions that represent trabecular bone were set to black and marrow spaces were
set to white (Fig 1, G); 7) finally, the image was skeletonized, that is, eroded until
only the central line of pixels remained (Fig 1, H).
Superimposition of the skeletonized on the original image demonstrates that
the skeletal structure corresponds to the trabecular bone (Fig 1, I). The FD of the
skeletonized image was calculated using the box-counting function, from “analyze”
menu. In this automated method, square grids cover the ROI and the resulting
number of the counted tiles containing at least 1 black pixel is plotted against the
total number of the tiles in double logarithmic scale and FD is calculated from the
slope of the line fitted on the data points (Fig 1, J). Square grids with side-lengths
2, 3, 4, 5, 7, 9 and 11 pixels were used, determined by Kaye’s recommendation
that grid size should fall between 2 and 30% of maximal trabeculae projection. 17
50
Pixel intensity analysis
The mean pixel intensity of the same ROI was measured using the
“histogram” function from Image J software (Fig 2). PI measurements were also
performed on a standard area (50x40 pixels, 1.5 mm to the edges) of the
periapical radiographic positioner to enable normalization of the ROI PI values and
control possible variations in the sensitivity of the PSP. The normalized PI values
were then obtained by dividing the mean PI of the bone ROI by the mean PI of the
periapical radiographic positioner.
Statistical analysis
Data evaluation was carried out using the SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago,
IL, USA) and GraphPad Prism Version 5.0 (GraphPad Software, Inc, San Diego,
CA, USA). Reassessment was performed on all sample by the same reviewer with
two weeks interval. The Intraclass Correlation Coefficient (ICC) was computed to
test the intra-rater reliability, which was found to be 0.809 for FD and 0.995 for PI.
The mean of the two measurements was used for further statistical analysis. All
data acquisition and analyses were performed in a blinded fashion.
Descriptive statistics were calculated for both right and left hemimandible of
the control and experimental groups. The Shapiro-Wilk and Levene’s test was
used for normality testing and to assess the equality of variances, respectively.
Two-way ANOVA was used to examine the influence of alendronate and
orthodontic tooth movement on FD and PI. Unpaired Student’s t-test measured
differences between the control and experimental groups while the paired one was
used to comparisons within the group. The level of significance was set at 0.05.
51
RESULTS
The percentage of variation in FD and PI values caused by alendronate,
orthodontic tooth movement and interaction of these two factors are presented in
Figure 3. The analysis of trabecular bone revealed no alteration on FD caused by
alendronate; however, it accounted for 46.31% of the variation in PI (p < .001).
Orthodontic movement associated with alendronate showed no influence on the
variation of FD and PI.
Despite no significant difference between the mean FD values of CG OTM(1.0711 ± 0.041) and CG OTM+ (1.0256 ± 0.043) (Table I), the difference between
CG OTM- and EG OTM- (1.0760 ± 0.046) over EG OTM + (1.0185 ± 0.032) (p =
.021 and .042, respectively) occurred due to orthodontic movement, responsible
for 31.54% of the variation in FD (p = .003), and not due to association
alendronate-OTM.
The PI evaluation revealed that the experimental group presented a higher
bone density than the control group (p < .001). There was no difference between
EG OTM- (4.424 ± 0.473) and EG OTM+ (4.413 ± 0.497), revealing a no increase
in bone density caused by a possible higher alendronate uptake stimulated by
OTM.
DISCUSSION
In the present study, the effects of systemic alendronate administration on
trabecular bone were investigated in presence and absence of OTM. As
alendronate is ingested, it is redistributed to bone and particularly to areas of
increased bone turnover.19 It is possible that the levels of bisphosphonates within
the jaws are selectively elevated when orthodontic treatment is being carried out,
since OTM stimulates more alveolar bone turnover and might further enhance the
52
uptake of bisphosphonates locally.3 So, the probable over-accumulation of these
compounds caused by OTM may increase the drug's effect and can make the
orthodontic treatment a risk factor for bisphosphonate-induced jaw osteonecrosis
(BIJON), a severe adverse side effect of the bisphosphonate therapy.
In comparison to other species, the rabbit has faster skeletal change and
bone turnover, with predominant remodeling over the modeling processes.20 Thus,
the effect of alendronate could be observed even with a relatively short
experimental period of this study since the uptake of the drug would be enhanced
by the high bone turnover rate. Bone resorption was not stimulated experimentally
by ovariectomy or corticosteroid treatment, for example, because it might interfere
with
the
changes
caused
by
alendronate
itself.
Furthermore,
in
vivo,
bisphosphonates inhibit bone resorption both in unhealthy animals in which bone
loss was stimulated as well as in normal animals.11
Image analysis of radiographs has a great potential to be used as a
screening aid for the onset of trabecular pattern changes. 17 Cancellous alveolar
bone is a complex interconnecting of trabeculae varying in thickness and
orientation, but this structure exhibits an underlying geometric regularity that
mathematical fractal patterns may be relevant in order to demonstrate the features
of trabecular bone.21 To quantify this complex morphology of the cancellous bone
by analyzing the trabecular bone and bone marrow interface, FD analysis via box
counting-method was applied in this study. The fractal results indicated that the
alendronate did not alter the trabecular complexity. However, it was expected a
decrease in its value after the compound administration since the pilot study
revealed an increase in trabecular thickness and reduction in trabecular separation
in experimental group by microtomography evaluation (Fig 4). It would be the
53
reverse of the sequence described by Law, Bollen and Chen.13 According to these
authors, when bone mass is lost, bone trabeculae become thinner and lose their
continuity. Thus there is an increment in the number of marrow space and the
alveolar structure becomes more complex, resulting in an increase in the FD
values13. Similarly, Chen and Chen22, studying how a variation of trabecular
diameter affects FD by trabecular models based on cylinders of different
diameters, reported that they are inversely proportional. A higher FD in bone loss
condition was reported by some others studies. 23,24
Apart from these research, there are conflicting reports concerning FDs of
the radiographic images.14 Updike and Nowzari17 described that when the
periodontal health is compromised, alveolar bone loss occurs and trabecular
arrangement becomes less complex and less space-filling, and therefore fractal
dimension decreases. Southard et al.25 studied radiographic textural changes in an
osteoporotic rabbit model and found that the mandibular FD decreased with
cumulative steroid dose. Demirbas et al.14 reported that patients with sickle cell
anemia under age 20 years showed lower FD values than the controls and that
this finding pointed to scarcity of trabecular bone in this group. At this time there is
no consensus on the relationship between changes in trabecular structure and FD.
Some findings support the idea that bone loss increases the FD while others
report the concept that the trabecular complexity is higher in healthy state and
greater values for FD are obtained. It is possible that both may be correct. The
diversity of the results described in the literature may be explained by differences
in the techniques for measuring fractal dimension15,17,26,27 and in the methods used
to obtain bone images15,27, the subject under study,26 and the type of disease that
54
affects trabecular bone and how it destroys the fine trabeculae in different parts of
the body.17
Even though the sensitivity of fractal methods in detecting bone changes in
short-term studies has been previously demonstrated 28-30, the efficacy of FD in
postmenopausal and osteoporotic patients studies has been examined31-34 and the
relationship of the FD of trabecular bone projection texture with its threedimensional microarchitecture has been evidenced 35, there has been no report on
the effectiveness of box-counting method and FD to evaluate the changes of the
mandibular trabecular bone after alendronate administration. Data from this study
suggest a lack of sensitivity of this analysis to assess the effects of alendronate on
trabecular structure. The results of Lane et al. research36 support this possibility.
These authors investigated the effect of bisphosphonate therapy as an adjunct to
non-surgical periodontal treatment in patients with moderate to severe chronic
periodontitis and reported that this therapy was associated with a 50% reduction in
bone turnover, improved the clinical outcomes and prevented further deterioration.
However, there was no difference in the change in periodontal bone mass
between the bisphosphonate and placebo groups as measured by fractal analysis.
The differences observed in FD occurred due to OTM. It is known that living
bones adjust their internal structure to the mechanical load to which they are
subjected.37 Wagle et al.38 examined FD change in response to OTM and reported
that orthodontic force led to an increase in FD, this change was proportional to
loading and this analysis could provide a new parameter for force determination in
OTM. However, they use fractal analysis to quantify the complex morphology of
the periodontal ligament-bone interface, thus their results cannot be compared
with this study since our evaluation was performed on trabecular bone. No reports
55
exist in the literature on changes in FD of trabecular bone caused by orthodontic
force, but the paper of Yaşar and Akgünlü39 provides some insight. These authors
analyzed the FD of trabecular bone of dentate and edentulous regions by the boxcounting method. They observed that differences in occlusal forces (occlusal loads
might be less in edentulous regions) generated during mastication caused some
alterations in trabecular structure which led to lower FD in dentate regions. In this
work, mechanical loading generated by orthodontic device reduced the FD values.
Significant difference was found only in the experimental group, perhaps due to
some additional influence of the higher bone density found in this group. However,
it is believed that a larger sample size also would reveal significant difference
between CG OTM- and CG OTM+ (p = .117). Further research is necessary to
demonstrate the effects of these factors.
PI analysis of a specific ROI in a digital image is a simple method that may
be applicable to analyze bone density. Comparing four methods (FD, PI,
microdensitometry and panoramic analysis of cortical thickness) to detect signs of
osteoporosis, Law, Bollen and Chen 13 reported that PI appeared to distinguish
between the control and the osteoporotic group at the highest levels of
significance. Tosoni et al.15 did not detect osteoporotic changes with box-counting
fractal analysis, but did it with PI analysis. Nonetheless, the sensitivity of PI
measurements was low because they were not sufficiently sensitive to distinguish
the osteopenic group from the normal group.15 Soğur et al.40 postulated that FD
analysis is a more sensitive method than PI analysis for the detection of the
periapical lesions visually indiscernible since the FD was capable of detecting
changes in trabecular pattern earlier than PI.
56
Alendronate caused an increase in PI values, but did not alter the FD
measurements. Results of this study revealed that PI analysis was more sensitive
than FD in detecting changes in trabecular bone caused by alendronate.
Moreover, no association of FD with bone density was observed. This association
was confirmed by some studies41-43 and denied by others.25,34 We agree with
Pornprasertsuk et al.44 who suggested that the FD is more appropriately a
measure of structural complexity than it is of bone density.
No study has directly attributed orthodontic treatment to increased uptake of
alendronate on bone tissue. The OTM did not enhance the uptake of the
compound as measured by FD and PI analyzes in this work. Some circumstances
may have affected this result as a short period of orthodontic movement to cause
an additional effect of the drug and the fact that only one tooth was moved,
generating a lower turnover rate than if more teeth had been moved together. The
ROI cannot be selected in the cervical region of the first molar, where the rate of
bone resorption would be higher, due to the superimposition of the root of the
lower incisor over that region on the radiographic image. Furthermore, although all
images were direct PSP acquisitions by means of the same equipment with the
same exposure factors and have been normalized, some variations of brightness
may have remained. These variations may have reduced the sensitivity of the PI
analysis to reveal this more subtle change.
This is the first study to evaluate the effect of bisphosphonate-OTM
interaction on trabecular bone. Further studies with more sensitive methods and
prolonged tooth movement periods must be carried out to evaluate this interaction
since, depending on the magnitude of this interaction, orthodontic treatment may
increase the risk of osteonecrosis of the jaws.
57
CONCLUSION
There was an increase in bone density promoted by alendronate even in
animal without experimentally induced bone remodeling, but no additional changes
in trabecular structure was detected with the alendronate-OTM interaction. This
result suggests that OTM did not increase the alendronate uptake; however,
further studies with more sensitive methods should be conducted to confirm this
finding.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors would like to express their grateful appreciation to: CAPES
Foundation (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior);
FAPERJ (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro); Dental
Morelli Ltda for the donation of the coil springs; Professor Paulo Cesar Silva for
animal support and Nuclear Instrumentation Laboratory of Federal University of
Rio de Janeiro.
AUTHOR DISCLOSURE STATEMENT
No competing financial interests exist.
58
REFERENCES
1. Roelofs AJ, Thompson K, Gordon S, Rogers MJ. Molecular mechanisms of action of
bisphosphonates: current status. Clin Cancer Res 2006;12:6222s-6230s.
2. Licata AA. Discovery, clinical development, and therapeutic uses of bisphosphonates.
Ann Pharmacother 2005;39:668-677.
3. Ghoneima AA, Allam ES, Zunt SL, Windsor LJ. Bisphosphonates treatment and
orthodontic considerations. Orthod Craniofac Res 2010;13:1-10.
4. Sarin J, DeRossi SS, Akintoye SO. Updates on bisphosphonates and potential
pathobiology of bisphosphonate-induced jaw osteonecrosis. Oral Dis 2008;14:277-285.
5. van Beek ER, Cohen LH, Leroy IM, Ebetino FH, Lowik CW, Papapoulos SE.
Differentiating the mechanisms of antiresorptive action of nitrogen containing
bisphosphonates. Bone 2003;33:805-811.
6. Epstein S. Update of current therapeutic options for the treatment of postmenopausal
osteoporosis. Clin Ther 2006;28:151-173.
7. Porras AG, Holland SD, Gertz BJ. Pharmacokinetics of alendronate. Clin
Pharmacokinet 1999;36:315-328.
8. Van Beek ER, Lowik CW, Papapoulos SE. Bisphosphonates suppress bone resorption
by a direct effect on early osteoclast precursors without affecting the osteoclastogenic
capacity of osteogenic cells: the role of protein geranylgeranylation in the action of
nitrogen-containing bisphosphonates on osteoclast precursors. Bone 2002;30:64-70.
9. Zahrowski JJ. Bisphosphonate treatment: an orthodontic concern calling for a proactive
approach. Am J Orthod Dentofacial Orthop 2007;131:311-320.
10. Gatti D, Adami S. New bisphosphonates in the treatment of bone diseases. Drugs
Aging 1999;15:285-296.
11. Fleisch H. Development of bisphosphonates. Breast Cancer Res 2002;4:30-34.
12. Lin JH, Russell G, Gertz B. Pharmacokinetics of alendronate: an overview. Int J Clin
Pract Suppl 1999;101:18-26.
13. Law AN, Bollen AM, Chen SK. Detecting osteoporosis using dental radiographs: a
comparison of four methods. J Am Dent Assoc 1996;127:1734-1742.
14. Demirbas AK, Ergun S, Guneri P, Aktener BO, Boyacioglu H. Mandibular bone
changes in sickle cell anemia: fractal analysis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol
Endod 2008;106:e41-48.
15. Tosoni GM, Lurie AG, Cowan AE, Burleson JA. Pixel intensity and fractal analyses:
detecting osteoporosis in perimenopausal and postmenopausal women by using digital
panoramic images. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2006;102:235-241.
16. Yu YY, Chen H, Lin CH, Chen CM, Oviir T, Chen SK et al. Fractal dimension analysis
of periapical reactive bone in response to root canal treatment. Oral Surg Oral Med Oral
Pathol Oral Radiol Endod 2009;107:283-288.
59
17. Updike SX, Nowzari H. Fractal analysis of dental radiographs to detect periodontitisinduced trabecular changes. J Periodontal Res 2008;43:658-664.
18. White SC, Rudolph DJ. Alterations of the trabecular pattern of the jaws in patients with
osteoporosis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 1999;88:628-635.
19. Karras JC, Miller JR, Hodges JS, Beyer JP, Larson BE. Effect of alendronate on
orthodontic tooth movement in rats. Am J Orthod Dentofacial Orthop 2009;136:843-847.
20. Castaneda S, Largo R, Calvo E, Rodriguez-Salvanes F, Marcos ME, Diaz-Curiel M et
al. Bone mineral measurements of subchondral and trabecular bone in healthy and
osteoporotic rabbits. Skeletal Radiol 2006;35:34-41.
21. Shrout MK, Potter BJ, Hildebolt CF. The effect of image variations on fractal
dimension calculations. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 1997;84:96100.
22. Chen SK, Chen CM. The effects of projection geometry and trabecular texture on
estimated fractal dimensions in two alveolar bone models. Dentomaxillofac Radiol
1998;27:270-274.
23. Ruttimann UE, Webber RL, Hazelrig JB. Fractal dimension from radiographs of
peridental alveolar bone. A possible diagnostic indicator of osteoporosis. Oral Surg Oral
Med Oral Pathol 1992;74:98-110.
24. Bollen AM, Taguchi A, Hujoel PP, Hollender LG. Fractal dimension on dental
radiographs. Dentomaxillofac Radiol 2001;30:270-275.
25. Southard TE, Southard KA, Krizan KE, Hillis SL, Haller JW, Keller J et al. Mandibular
bone density and fractal dimension in rabbits with induced osteoporosis. Oral Surg Oral
Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2000;89:244-249.
26. Sanchez I, Uzcategui G. Fractals in dentistry. J Dent 2011;39:273-292.
27. Geraets WG, van der Stelt PF. Fractal properties of bone. Dentomaxillofac Radiol
2000;29:144-153.
28. Buckland-Wright JC, Messent EA, Bingham CO, 3rd, Ward RJ, Tonkin C. A 2 yr
longitudinal radiographic study examining the effect of a bisphosphonate (risedronate)
upon subchondral bone loss in osteoarthritic knee patients. Rheumatology (Oxford)
2007;46:257-264.
29. Papaloucas CD, Earnshaw P, Tonkin C, Buckland-Wright JC. Quantitative
radiographic assessment of cancellous bone changes in the proximal tibia after total knee
arthroplasty: a 3-year follow-up study. Calcif Tissue Int 2004;74:429-436.
30. Disini L, Foster M, Milligan PJ, Buckland-Wright JC. Cancellous bone changes in the
radius of patients with rheumatoid arthritis: a cross-sectional quantitative
macroradiographic study. Rheumatology (Oxford) 2004;43:1150-1157.
31. Yasar F, Akgunlu F. The differences in panoramic mandibular indices and fractal
dimension between patients with and without spinal osteoporosis. Dentomaxillofac Radiol
2006;35:1-9.
60
32. Lespessailles E, Poupon S, Niamane R, Loiseau-Peres S, Derommelaere G, Harba R
et al. Fractal analysis of trabecular bone texture on calcaneus radiographs: effects of age,
time since menopause and hormone replacement therapy. Osteoporos Int 2002;13:366372.
33. Benhamou CL, Poupon S, Lespessailles E, Loiseau S, Jennane R, Siroux V et al.
Fractal analysis of radiographic trabecular bone texture and bone mineral density: two
complementary parameters related to osteoporotic fractures. J Bone Miner Res
2001;16:697-704.
34. Koh KJ, Park HN, Kim KA. Prediction of age-related osteoporosis using fractal
analysis on panoramic radiographs. Imaging Sci Dent 2012;42:231-235.
35. Pothuaud L, Benhamou CL, Porion P, Lespessailles E, Harba R, Levitz P. Fractal
dimension of trabecular bone projection texture is related to three-dimensional
microarchitecture. J Bone Miner Res 2000;15:691-699.
36. Lane N, Armitage GC, Loomer P, Hsieh S, Majumdar S, Wang HY et al.
Bisphosphonate therapy improves the outcome of conventional periodontal treatment:
results of a 12-month, randomized, placebo-controlled study. J Periodontol 2005;76:11131122.
37. Geraets WG. Comparison of two methods for measuring orientation. Bone
1998;23:383-388.
38. Wagle N, Do NN, Yu J, Borke JL. Fractal analysis of the PDL-bone interface and
implications for orthodontic tooth movement. Am J Orthod Dentofacial Orthop
2005;127:655-661; quiz 754.
39. Yasar F, Akgunlu F. Fractal dimension and lacunarity analysis of dental radiographs.
Dentomaxillofac Radiol 2005;34:261-267.
40. Sogur E, Baksi BG, Grondahl HG, Sen BH. Pixel intensity and fractal dimension of
periapical lesions visually indiscernible in radiographs. J Endod 2013;39:16-19.
41. Alman AC, Johnson LR, Calverley DC, Grunwald GK, Lezotte DC, Hokanson JE.
Diagnostic capabilities of fractal dimension and mandibular cortical width to identify men
and women with decreased bone mineral density. Osteoporos Int 2012;23:1631-1636.
42. Jolley L, Majumdar S, Kapila S. Technical factors in fractal analysis of periapical
radiographs. Dentomaxillofac Radiol 2006;35:393-397.
43. Southard TE, Southard KA, Lee A. Alveolar process fractal dimension and postcranial
bone density. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2001;91:486-491.
44. Pornprasertsuk S, Ludlow JB, Webber RL, Tyndall DA, Sanhueza AI, Yamauchi M.
Fractal dimension analysis of weight-bearing bones of rats during skeletal unloading.
Bone 2001;29:180-184.
61
Fig 1. Fractal analysis. A, selection of the ROI, yellow rectangle; B, the ROI was
duplicated; C, the duplicated image was blurred with a Gaussian filter (sigma=10);
D, the blurred image was then subtracted from the original image; E, 128 was
added to the result at each pixel location; F, the resultant image was converted to
binary; G, and inverted. With this process, the regions that represent trabecular
bone were set to black and marrow spaces were set to white; H, finally the image
was skeletonized; I, superimposition of the skeletonized on the original image
demonstrates that the skeletal structure corresponds to the trabecular bone; J, FD
calculation by the box-counting method.
62
Fig 2. Pixel intensity analysis. A, the blue rectangle corresponds to the region
measured in the periapical radiographic positioner (dashed red line) and the yellow
one is the ROI; B, histogram of the ROI pixel intensity.
63
Fig 3. Influence of alendronate, orthodontic tooth movement and alendronateOTM interaction on fractal dimension and pixel intensity of the trabecular bone.
The numbers above the bars are the p-values.
64
Fig 4. Microtomography of the right and left hemimandibles. Trabecular thickness
(Tb.Th) and number (Tb.N) were higher in the experimental rabbit than in the
control animal while trabecular separation (Tb.Sp) was lower.
65
Table I. Descriptive statistic for fractal dimension and pixel intensity
FD
PI
Mean(SD)
Min-max
Mean(SD)
OTM1.0711(0.041) a
1.0245-1.1455
3.463(0.418) c
CG
OTM+
1.0256(0.043) a,b
0.9569-1.0715
3.659(0.571) c
OTM1.0760(0.046) a
1.0215-1.1478
4.424(0.473) d
EG
OTM+
1.0185(0.032) b
0.9762-1.0680
4.413(0.497) d
SD, standard deviation; Min-max, minimum-maximum.
Different letters indicate statistical difference at α=0.05% (Student’s t-test): “a”
“c” and “d” for PI.
Group
Min-max
2.923-3.953
2.988-4.645
3.858-5.163
4.009-5.451
and “b” for FD and
66
20
DISCUSSÃO
Nos últimos anos, as grandes mudanças ocorridas na Ortodontia têm
exigido aprimoramento dos profissionais da especialidade, particularmente em
decorrência do crescente número de pacientes adultos à procura de tratamento
ortodôntico. Além do perfil psicológico, a predisposição a estados patológicos
sistêmicos e a terapia medicamentosa associada, são aspectos de relevância
inquestionável que têm estimulado o desenvolvimento de pesquisas neste vasto
campo do conhecimento.
Em busca de respostas acerca dos efeitos de diversos fármacos, entre
estes os bisfosfonatos,
na
movimentação
dentária
ortodôntica,
estudos
experimentais têm sido extensivamente realizados. Apesar de os resultados
obtidos em animais serem aplicáveis aos humanos, com reservas, as
comparações são possíveis uma vez que os mecanismos básicos de
remodelação óssea não diferem, no nível celular, entre as espécies (RYGH,
1976). A possibilidade de melhor controle local e de maior número de repetições,
menor diversidade genética ao se utilizar ninhadas e facilidade na obtenção de
amostra e na execução de análises microscópicas são vantagens oriundas da
utilização de modelos experimentais com animais na pesquisa científica (NETO,
2001).
Neste estudo, o coelho foi selecionado como modelo experimental. Em
comparação com outras espécies, este animal apresenta mudanças esqueletais e
turnover ósseo mais acelerados (CASTANEDA et al., 2006), o que contribuiria
sobremaneira para maior captação do fármaco estudado. Esta característica
67
fisiológica intrínseca à espécie compensaria o período relativamente curto de
administração do fármaco.
O alendronato, apesar de não ser o bisfosfonato de maior potência, foi o
eleito entre os demais para a avaliação da interação dessa classe de drogas com
o tratamento ortodôntico. Tendo em vista a sua indicação para a profilaxia e
tratamento da osteoporose (EPSTEIN, 2006), número imódico de prescrições já
foram realizadas. Siris et al (2011) examinaram registros médicos de mais de 15
milhões de mulheres com idades acima dos 45 anos e encontraram prevalência
de 10% no uso de bisfosfonatos orais. Lotwala et al (2012) relataram que a
maioria dos ortodontistas inicia, anualmente, tratamento ortodôntico em mais de
três mulheres com idade acima de 50 anos, sendo que 35% iniciam mais de 10
destes casos.
Ao somar os resultados desses dois trabalhos, nota-se que o
atendimento de pacientes usuários de tal medicação nos consultórios ortodônticos
é expectável.
Em 2005, as 22,4 milhões de prescrições do alendronato Fosamax (Merck,
Whitehouse Station, New Jersey, USA), tornou o medicamento o 19º mais
prescrito nos Estados Unidos (LEADING [...], 2005). Porém, em 2011, o
alendronato passou a ocupar a 116º posição (TOP [...], 2012). Há tendência atual
de declínio no número total de prescrições, talvez em virtude da crescente
publicação de casos de osteonecrose associada aos bisfosfonatos (AKINTOYE;
HERSH, 2012; CAMPISI et al., 2012; HASEGAWA et al., 2013; TAM et al.,
2013). Ainda assim, o estudo se faz importante em virtude da meia-vida destes
compostos, que é de aproximadamente 10 anos para o alendronato, fazendo com
que seus efeitos perdurem por longo período após a sua suspensão.
68
Este trabalho contemplou avaliações do efeito do alendronato sobre o
movimento dentário ortodôntico e reabsorção óssea, bem como análise da
influência do turnover acelerado pelas forças ortodônticas na captação do
fármaco.
A avaliação métrica do movimento dentário induzido revelou expressivo
efeito inibitório do alendronato sobre a taxa semanal e magnitude do movimento.
Estes resultados suportam e expandem estudos publicados que evidenciaram
redução no deslocamento dentário com a aplicação de outros bisfosfonatos
(IGARASHI et al., 1994; LIU et al., 2004; FUJIMURA et al., 2009; CHOI et al.,
2010;
SIRISOONTORN et al., 2012;
HASHIMOTO et al., 2013). Além deste
trabalho, apenas Karras et al (2009) e Igarashi (1994) utilizaram o alendronato
como droga administrada. Apesar do efeito inibitório constatado, diferenças em
relação à taxa de movimento ao longo do período experimental foram observadas.
Enquanto os resultados da atual pesquisa revelaram incremento menor na
quantidade de movimentação dentária ao longo do tempo no grupo experimental
(46% do movimento do grupo controle na primeira semana, 36,5% na segunda e
33% na terceira), no estudo de Karras et al (2009) essa diferença na quantidade
de movimento reduziu com o passar do tempo (25% na segunda semana e 42%
na quarta semana). Diferenças metodológicas, principalmente relacionada à via
de administração do alendronato, podem ter sido responsáveis pelos resultados
contraditórios. Apesar de a dose administrada por Karras et al (2009) ter sido
significativamente maior (7 mg/Kg), enquanto, nesta pesquisa, a droga foi
aplicada por via subcutânea, aqueles a fizeram por gavagem, em ratos, uma vez
por semana. Segundo Lin et al (1991), a biodisponibilidade oral do alendronato
em ratos é de 0,9% e a administração em presença de alimentos diminui essa
69
biodisponibilidade cerca de seis a sete vezes. Por este motivo, recomenda-se a
ingestão do alendronato pela manhã, pelo menos meia hora antes do primeiro
alimento, para que sua absorção não seja prejudicada (FOSAMAX [...], 2011).
Nenhum controle alimentar foi realizado no experimento de Karras et al (2009), o
que pode ter influenciado a biodisponibilidade semanal do fármaco e ter reduzido
o seu efeito cumulativo. Restrições alimentares, por sua vez, poderiam acarretar
em prejuízos à saúde do animal. Soma-se a isso, o fato de o esvaziamento
gástrico do coelho ser lento e raramente se encontrar livre de alimento, um
obstáculo a mais à absorção do alendronato. Face ao exposto, optou-se pela
administração subcutânea do fármaco nesta pesquisa. A aplicação subcutânea,
além de independer de controle alimentar, é de fácil execução e tem sido utilizada
em diversos trabalhos experimentais com este bisfosfonato (IGARASHI et al.,
1994; CHOU et al., 2009; XIONG et al., 2010; CONTE NETO et al., 2013; LUO
et al., 2013).
Igarashi et al (1994), entretanto, encontraram resultados semelhantes aos
desta pesquisa. Após a administração também subcutânea em ratos, a
quantidade de movimento em relação ao controle reduziu com o decorrer do
tempo. Zahrowski (2007) afirma que a magnitude da inibição do movimento
dentário deve ser dependente da quantidade de droga no local específico. Os
resultados de Igarashi et al (1994) e do atual estudo comprovam o efeito
cumulativo da droga e podem dar indícios de aumento de sua captação, e
consequente maior efeito, promovido pelo turnover ósseo estimulado pelo
movimento dentário.
Uma das indicações dos bisfosfonatos é para o controle de doenças em
que a atividade osteoclástica está acelerada, como na osteoporose. Nesta
70
patologia há aumento da taxa de remodelação óssea, fazendo com que o
movimento dentário ortodôntico ocorra em maior velocidade (MIDGETT; SHAYE;
FRUGE, 1981; ASHCRAFT; SOUTHARD; TOLLEY, 1992). O bisfosfonato, então,
regularia a remodelação óssea e levaria a taxa de movimento dentário para os
níveis de normalidade. Esta hipótese é sustentada pelo trabalho de Sirisoontorn et
al (2012), ao revelar taxas de movimentação ortodôntica semelhantes entre ratos
ovariectomizados + ácido zoledrônico e o grupo controle, e pelo caso clínico
publicado por Krieger et al (2013), no qual o tratamento ortodôntico, segundo os
autores, foi finalizado com sucesso após 13 meses. Torna-se refutável, todavia,
quando se avalia outros quatro casos clínicos com administração de alendronato
(RINCHUSE et al., 2007; ZAHROWSKI, 2009) e o estudo coorte retrospectivo de
Lotwala et al (2012). Possível explicação para estes achados contraditórios está
na duração do tratamento significativamente mais curto nas duas primeiras
situações, quando os efeitos cumulativos do bisfosfonato ainda não sobrepujaram
os da condição patológica sistêmica associada.
O principal mecanismo pelo qual o alendronato inibe o movimento dentário
ortodôntico é através de seus efeitos sobre a função e sobrevivência dos
osteoclastos no lado de compressão do LP, no qual a reabsorção do osso é
necessária para que a movimentação ocorra (KARRAS et al., 2009). Os
resultados deste estudo sustentam a afirmativa, uma vez que o número de
osteoclastos na
superfície
óssea
mesial
ao
primeiro
molar
direito
foi
significativamente menor no grupo experimental, corroborando trabalhos prévios
(IGARASHI et al., 1994; LIU et al., 2004) que constataram, igualmente, redução
no número destas células.
71
A taxa de movimentação dentária também é afetada pela densidade do
osso pelo qual o dente está se deslocando (ROTHE et al., 2006). Os resultados
da análise da intensidade de pixel revelaram densidade significativamente maior
após administração do alendronato, interpretados em decorrência de maior
radiopacidade óssea nas radiografias. O gráfico de dispersão (Figura 6) mostra
que em osso de maior densidade, como verificado no grupo experimental, o
movimento dentário foi menor. O coeficiente de correlação de Pearson (r = -0,661,
p = 0,05) revela que a quantidade de movimento está inversa e moderadamente
relacionada à densidade óssea. Os dois fatores (ação sobre os osteoclastos e
aumento da densidade óssea), portanto, atuaram em conjunto na inibição do
movimento dentário ortodôntico após a administração de alendronato em coelhos.
Figura 6
Gráfico de dispersão mostrando a relação entre a densidade óssea e a
magnitude do movimento dentário. Nota-se claramente que quanto maior a
densidade (visualizada no grupo experimental), menor a magnitude da
movimentação dentária.
Os osteoclastos, através da sua ação enzimática, solubilizam o osso
separando a fase mineral da matriz orgânica (a fase mineral é liberada para a
72
corrente sanguínea e a matriz é absorvida pelo osteoclasto por fagocitose),
formando depressões conhecidas como lacunas de Howship. É certo que, quanto
maior a atividade osteoclástica, maior a irregularidade da superfície óssea que
está sendo reabsorvida, devido a maior número de cavidades iniciadas. Alguns
estudos tem proposto a utilização de análise fractal para a quantificação da
complexidade de superfícies teciduais irregulares (PIANTANELLI et al., 2005;
YOKOYAMA et al., 2005; MARTIN-LANDROVE et al., 2007), obtendo resultados
que apontam incremento na DF do tecido em região de maior irregularidade.
Nenhum trabalho, até o momento, se propôs a avaliar a atividade osteoclástica
através da análise fractal da superfície óssea que está sofrendo a ação destas
células. Os resultados desta pesquisa mostraram aumento da DF da interface LPosso no lado mesial aos primeiros molares após a aplicação de força ortodôntica
apenas no grupo controle, no qual a função e sobrevivência dos osteoclastos
estavam livres da interferência do alendronato. Em adição, foi encontrada
correlação moderada (p < 0,01) entre o número de osteoclastos, valor
representativo do grau de reabsorção óssea, e a dimensão fractal da interface.
Estes achados sugerem a utilização da análise fractal pelo método de contagem
de caixas para a avaliação da atividade osteoclástica estimulada por carga
mecânica aplicada às unidades dentárias.
Apenas um estudo (WAGLE et al., 2005) na literatura avaliou alterações na
dimensão fractal da interface LP-osso decorridas de forças ortodônticas. Wagle et
al (2005) encontraram aumento da DF diretamente proporcional à magnitude da
força aplicada. No entanto, ao contrário deste trabalho, os autores afirmaram que
o aumento ocorreu independentemente de mecanismos celulares. De fato,
interferência celular não poderia ser encontrada uma vez que a força foi aplicada
73
por apenas seis horas, tempo insuficiente para que a atividade osteoclástica se
manifestasse de forma significativa. Dentro de seis horas, osteoclastos e préosteoclastos são ainda observados em canais vasculares (YOKOYA; SASAKI;
SHIBASAKI, 1997). O número de osteoclastos no ligamento periodontal e osso
alveolar adjacente aumenta apenas depois das primeiras 24 horas (YOKOYA et
al., 1997), com pico cerca de 50 horas após a aplicação do estímulo ortodôntico.
Neste trabalho, a carga ortodôntica foi aplicada até o 21º dia, quando o número de
osteoclastos no ligamento periodontal já estava elevado, podendo expressar sua
atividade. A pesquisa atual não corrobora a constatação de Wagle et al (2005),
pois foi necessária a ação destas células para que ocorresse aumento da DF, do
contrário, este incremento teria se expressado no grupo experimental, visto que
carga mecânica também foi aplicada.
As cargas ortodônticas também causaram mudanças na DF do osso
trabecular. Redução da DF estatisticamente significante foi encontrada apenas no
grupo experimental, embora a tendência de menores valores no grupo controle
tenha ficado clara. Sabe-se que o tecido esquelético ajusta sua estrutura interna
em resposta às forças mecânicas a que estão sujeitos (GERAETS, 1998). Estes
ajustes parecem ter ocorrido de forma desprendida dos mecanismos celulares,
uma vez que a função osteoclástica não explicaria a alteração no grupo
experimental. Estudos mais específicos, com aplicação de cargas mecânicas
variáveis e em ossos de diferentes densidades, por exemplo, podem ser
conduzidos na tentativa de elucidar as questões causais.
A aplicação de cargas ortodônticas concomitante à administração contínua
de bisfosfonatos pode emanar em ciclo ainda mais exagerado de captação e
liberação (forma ativa) do fármaco (ZAHROWSKI, 2007), com consequente
74
potencialização dos seus efeitos. Conhecer a magnitude dessa interação é de
suma importância para que se possa avaliar os riscos e benefícios do tratamento
ortodôntico em pacientes que fazem utilização de bisfosfonatos. Nesta pesquisa
avaliou-se os efeitos do alendronato e da associação alendronato-movimento
dentário no osso trabecular através das análises fractal e de intensidade de pixel.
O alendronato e a associação não causaram alterações nos valores da DF.
Apesar de a análise fractal ter se mostrado sensível na detecção de mudanças
sutis no trabeculado ósseo em algumas condições patológicas (WHITE;
RUDOLPH, 1999; SOUTHARD et al., 2000; DEMIRBAS et al., 2008; UPDIKE;
NOWZARI, 2008; YU et al., 2009; ALMAN et al., 2012), parece não ter sido
assim para os efeitos do alendronato. No estudo de Lane et al (2005), alendronato
e residronato também não alteraram a DF do trabeculado, embora os autores
tenham constatado redução de 50% na taxa de remodelação óssea e melhora
dos resultados clínicos de pacientes com periodontite crônica após terapia com
bisfosfonatos como coadjuvante do tratamento periodontal não-cirúrgico. Relatos
sobre a eficácia do método de contagem de caixa e DF para avaliação de
alterações no osso trabecular após a administração de bisfosfonatos são
inexistentes. Os dados desta pesquisa sugerem falta de sensibilidade do método
na avaliação dos efeitos do alendronato sobre a estrutura trabecular. Outros
trabalhos devem ser conduzidos para investigar esta hipótese.
Fleisch (2002) assegurou que os bisfosfonatos, in vivo, inibem a
reabsorção óssea tanto em animais em que a perda óssea fora estimulada, bem
como em animais saudáveis, favorecendo aumento da densidade óssea em
ambas as situações. De fato, a análise de intensidade de pixel revelou aumento
da densidade nos animais deste estudo após administração do alendronato. A
75
reabsorção óssea não foi estimulada neste experimento através de ovariectomia
ou aplicações de corticosteroides, por exemplo, porque isso poderia interferir com
as mudanças provocadas pelo próprio alendronato. A análise de intensidade de
pixel, entretanto, não acusou aumento adicional na densidade óssea com a
associação alendronato-movimento dentário ortodôntico. Este resultado sugere
que a carga ortodôntica não estimulou a captação de maior quantidade do
fármaco para que seus efeitos se expressassem em maior magnitude. Isto pode
deveras ter ocorrido ou, então, o método foi pouco sensível para revelar
alterações mais sutis. Apesar de o protocolo de aquisição das imagens ter sido
rigorasamente controlado e a normalização do valor ter sido executada, algumas
variações de brilho na imagem digital podem ter permanecido, prejudicando a
detecção de pequenas variações.
Apesar dos resultados de trabalhos experimentais não poderem ser
diretamente extrapolados para a situação clínica, estes achados fornecem novos
esclarecimentos nessa área. Porém estudos com métodos mais sensíveis devem
ser conduzidos principalmente para avaliar o efeito do movimento dentário
ortodôntico na captação da droga, pois, dependendo da magnitude, o tratamento
ortodôntico pode representar fator de risco para o desenvolvimento e evolução da
osteonecrose dos maxilares associada ao bisfosfonato.
76
6 CONCLUSÃO
A avaliação dos efeitos da associação alendronato e movimento dentário
ortodôntico possibilitou as seguintes conclusões:
6.1 o alendronato reduziu a taxa e magnitude do movimento dentário;
6.2 a inibição do movimento dentário ortodôntico foi mediado pelo efeito do
alendronato sobre os osteoclastos, constatado pela redução significativa no
número destas células no lado de pressão;
6.3 a atividade absortiva dos osteoclastos aumentou a irregularidade da
superfície óssea. Essa irregularidade pôde ser avaliada pela análise fractal da
interface LP-osso, constituindo-se em novo método para avaliação da
atividade osteoclástica;
6.4 o alendronato e a associação fármaco-movimento dentário não alteraram a
complexidade do osso trabecular. Sugere-se que este método apresenta
sensibilidade reduzida para avaliação das alterações ósseas causadas por
este bisfosfonato. A carga mecânica, entretanto, reduziu os valores de DF por
mecanismo independente da atividade osteoclástica, e
6.5 aumento da densidade óssea foi verificado após administração do
alendronato, o que contribuiu para a redução do movimento dentário.
77
Incremento na captação do fármaco causado pela movimentação dentária
ortodôntica não foi verificado por esta análise.
78
7 RECOMENDAÇÕES
Deve-se avaliar os riscos e benefícios do tratamento ortodôntico em
pacientes que fazem utilização de bisfosfonatos, por isto é recomendável a
condução de anamnese detalhada a fim de conhecer qual a droga e a duração do
tratamento, visto que estes fatores influenciam o efeito do fármaco no
metabolismo ósseo, fator fundamental para o movimento dentário ortodôntico.
Futuras pesquisas devem avaliar a influência do tratamento ortodôntico na
captação da droga com a utilização de métodos de investigação e leitura mais
sensíveis, para que se possa estabelecer o grau em que o tratamento ortodôntico
representa fator de risco para o desenvolvimento e evolução da osteonecrose
associada a bisfosfonatos.
79
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AKINTOYE, S. O.; HERSH, E. V. Risks for jaw osteonecrosis drastically increases after 2
years of bisphosphonate therapy. J Evid Based Dent Pract, v. 12, n. 2, p. 116-8, Jun
2012.
ALMAN, A. C. et al. Diagnostic capabilities of fractal dimension and mandibular cortical
width to identify men and women with decreased bone mineral density. Osteoporos Int,
v. 23, n. 5, p. 1631-6, May 2012.
ASHCRAFT, M. B.; SOUTHARD, K. A.; TOLLEY, E. A. The effect of corticosteroidinduced osteoporosis on orthodontic tooth movement. Am J Orthod Dentofacial Orthop,
v. 102, n. 4, p. 310-9, Oct 1992.
BOIVIN, G.; MEUNIER, P. J. Effects of bisphosphonates on matrix mineralization. J
Musculoskelet Neuronal Interact, v. 2, n. 6, p. 538-43, Dec 2002.
CAMPISI, G. et al. Spontaneous bisphosphonate-related osteonecrosis of the left hemimandible: Similarities with phossy jaw. Indian J Dent Res, v. 23, n. 5, p. 683-5, Sep
2012.
CASTANEDA, S. et al. Bone mineral measurements of subchondral and trabecular bone
in healthy and osteoporotic rabbits. Skeletal Radiol, v. 35, n. 1, p. 34-41, Jan 2006.
CHOI, J. et al. Effects of clodronate on early alveolar bone remodeling and root
resorption related to orthodontic forces: a histomorphometric analysis. Am J Orthod
Dentofacial Orthop, v. 138, n. 5, p. 548 e1-8; discussion 548-9, Nov 2010.
CHOU, M. Y. et al. Modulation of murine bone marrow-derived CFU-F and CFU-OB by in
vivo bisphosphonate and fluoride treatments. Orthod Craniofac Res, v. 12, n. 2, p. 1417, May 2009.
CONTE NETO, N.
et al. Experimental development of bisphosphonate-related
osteonecrosis of the jaws in rodents. Int J Exp Pathol, v. 94, n. 1, p. 65-73, Feb 2013.
DEMIRBAS, A. K. et al. Mandibular bone changes in sickle cell anemia: fractal analysis.
Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, v. 106, n. 1, p. e41-8, Jul 2008.
EPSTEIN, S. Update of current therapeutic options for the treatment of postmenopausal
osteoporosis. Clin Ther, v. 28, n. 2, p. 151-73, Feb 2006.
80
FLEISCH, H. Development of bisphosphonates. Breast Cancer Res, v. 4, n. 1, p. 30-4,
2002.
FOSAMAX: alendronato de sódio. Responsável técnico Fernando C. Lemos. Colonia
Xotepingo: Merck Sharp & Dohme, 2011. Bula de remédio.
FUJIMURA, Y. et al. Influence of bisphosphonates on orthodontic tooth movement in
mice. Eur J Orthod, v. 31, n. 6, p. 572-7, Dec 2009.
GERAETS, W. G. Comparison of two methods for measuring orientation. Bone, v. 23, n.
4, p. 383-8, Oct 1998.
GHONEIMA, A. A. et al. Bisphosphonates treatment and orthodontic considerations.
Orthod Craniofac Res, v. 13, n. 1, p. 1-10, Feb 2010.
HASEGAWA, T. et al. The observational study of delayed wound healing after tooth
extraction in patients receiving oral bisphosphonate therapy. J Craniomaxillofac Surg,
Jan 16 2013.
HASHIMOTO, M. et al. The effect of bone morphometric changes on orthodontic tooth
movement in an osteoporotic animal model. Angle Orthod, Feb 27 2013.
HELLER, I. J.; NANDA, R. Effect of metabolic alteration of periodontal fibers on
orthodontic tooth movement. An experimental study. Am J Orthod, v. 75, n. 3, p. 239-58,
Mar 1979.
IGARASHI, K. et al. Anchorage and retentive effects of a bisphosphonate (AHBuBP) on
tooth movements in rats. Am J Orthod Dentofacial Orthop, v. 106, n. 3, p. 279-89, Sep
1994.
JOLLEY, L.; MAJUMDAR, S.; KAPILA, S. Technical factors in fractal analysis of periapical
radiographs. Dentomaxillofac Radiol, v. 35, n. 6, p. 393-7, Nov 2006.
KARRAS, J. C. et al. Effect of alendronate on orthodontic tooth movement in rats. Am J
Orthod Dentofacial Orthop, v. 136, n. 6, p. 843-7, Dec 2009.
KOH, K. J.; PARK, H. N.; KIM, K. A. Prediction of age-related osteoporosis using fractal
analysis on panoramic radiographs. Imaging Sci Dent, v. 42, n. 4, p. 231-5, Dec 2012.
KRIEGER, E. et al. [Orthodontic treatment of patients medicated with bisphosphonates-a
clinical case report.]. J Orofac Orthop, Jan 10 2013.
LANE, N. et al. Bisphosphonate therapy improves the outcome of conventional
periodontal treatment: results of a 12-month, randomized, placebo-controlled study. J
Periodontol, v. 76, n. 7, p. 1113-22, Jul 2005.
Leading 20 products by total U.S. dispensed prescriptions.
www.imshealth.com >. Acesso em: 8 mar. 2013.
2005.
Disponível em: <
LESPESSAILLES, E. et al. Fractal analysis of trabecular bone texture on calcaneus
radiographs: effects of age, time since menopause and hormone replacement therapy.
Osteoporos Int, v. 13, n. 5, p. 366-72, May 2002.
LICATA, A. A. Discovery, clinical development, and therapeutic uses of bisphosphonates.
Ann Pharmacother, v. 39, n. 4, p. 668-77, Apr 2005.
81
LIN, J. H. et al. Physiological disposition of alendronate, a potent anti-osteolytic
bisphosphonate, in laboratory animals. Drug Metab Dispos, v. 19, n. 5, p. 926-32, SepOct 1991.
LIN, J. H.; RUSSELL, G.; GERTZ, B. Pharmacokinetics of alendronate: an overview. Int J
Clin Pract Suppl, v. 101, p. 18-26, Apr 1999.
LIU, L. et al. Effects of local administration of clodronate on orthodontic tooth movement
and root resorption in rats. Eur J Orthod, v. 26, n. 5, p. 469-73, Oct 2004.
LOTWALA, R. B. et al. Bisphosphonates as a risk factor for adverse orthodontic
outcomes: a retrospective cohort study. Am J Orthod Dentofacial Orthop, v. 142, n. 5,
p. 625-634 e3, Nov 2012.
LUO, Y. et al. Alendronate Retards the Progression of Lumbar Intervertebral Disc
Degeneration in Ovariectomized Rats. Bone, Mar 13 2013.
MARTIN-LANDROVE, M. et al. Fractal analysis of tumoral lesions in brain. Conf Proc
IEEE Eng Med Biol Soc, v. 2007, p. 1306-9, 2007.
MIDGETT, R. J.; SHAYE, R.; FRUGE, J. F., JR. The effect of altered bone metabolism on
orthodontic tooth movement. Am J Orthod, v. 80, n. 3, p. 256-62, Sep 1981.
NETO, J. V. Ética em Pesquisa. In: ESTRELA, C. Metodologia Científica. São Paulo:
Artes Médicas, 2001.
PIANTANELLI, A. et al. Fractal characterisation of boundary irregularity in skin pigmented
lesions. Med Biol Eng Comput, v. 43, n. 4, p. 436-42, Jul 2005.
RINCHUSE, D. J. et al. Orthodontic treatment of patients using bisphosphonates: a report
of 2 cases. Am J Orthod Dentofacial Orthop, v. 131, n. 3, p. 321-6, Mar 2007.
ROGERS, M. J. New insights into the molecular mechanisms of action of
bisphosphonates. Curr Pharm Des, v. 9, n. 32, p. 2643-58, 2003.
ROTHE, L. E. et al. Trabecular and cortical bone as risk factors for orthodontic relapse.
Am J Orthod Dentofacial Orthop, v. 130, n. 4, p. 476-84, Oct 2006.
RYGH, P. Ultrastructural changes in tension zones of rat molar periodontium incident to
orthodontic tooth movement. Am J Orthod, v. 70, n. 3, p. 269-81, Sep 1976.
SARIN, J.; DEROSSI, S. S.; AKINTOYE, S. O. Updates on bisphosphonates and potential
pathobiology of bisphosphonate-induced jaw osteonecrosis. Oral Dis, v. 14, n. 3, p. 27785, Apr 2008.
SIRIS, E. S. et al. Estimating bisphosphonate use and fracture reduction among US
women aged 45 years and older, 2001-2008. J Bone Miner Res, v. 26, n. 1, p. 3-11, Jan
2011.
SIRISOONTORN, I.
et al. Orthodontic tooth movement and root resorption in
ovariectomized rats treated by systemic administration of zoledronic acid. Am J Orthod
Dentofacial Orthop, v. 141, n. 5, p. 563-73, May 2012.
82
SOGUR, E. et al. Pixel intensity and fractal dimension of periapical lesions visually
indiscernible in radiographs. J Endod, v. 39, n. 1, p. 16-9, Jan 2013.
SOUTHARD, T. E. et al. Mandibular bone density and fractal dimension in rabbits with
induced osteoporosis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, v. 89, n. 2,
p. 244-9, Feb 2000.
SOUTHARD, T. E.; SOUTHARD, K. A.; LEE, A. Alveolar process fractal dimension and
postcranial bone density. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, v. 91, n.
4, p. 486-91, Apr 2001.
TAM, Y. et al. Osteonecrosis of the Jaw after Implant Surgery in Patients Treated with
Bisphosphonates - A Presentation of Six Consecutive Cases. Clin Implant Dent Relat
Res, Feb 27 2013.
Top 200 Products of 2011 by total prescriptions.
2012.
Disponível em: <
http://www.pharmacytimes.com/_media/_pdf/Top_200_Drugs_2011_Total_Rx.pdf
>.
Acesso em: 8 mar. 2013.
TOSONI, G. M. et al. Pixel intensity and fractal analyses: detecting osteoporosis in
perimenopausal and postmenopausal women by using digital panoramic images. Oral
Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, v. 102, n. 2, p. 235-41, Aug 2006.
UPDIKE, S. X.; NOWZARI, H. Fractal analysis of dental radiographs to detect
periodontitis-induced trabecular changes. J Periodontal Res, v. 43, n. 6, p. 658-64, Dec
2008.
VAN BEEK, E. R. et al. Differentiating the mechanisms of antiresorptive action of nitrogen
containing bisphosphonates. Bone, v. 33, n. 5, p. 805-11, Nov 2003.
WAGLE, N. et al. Fractal analysis of the PDL-bone interface and implications for
orthodontic tooth movement. Am J Orthod Dentofacial Orthop, v. 127, n. 6, p. 655-61;
quiz 754, Jun 2005.
WHITE, S. C.; RUDOLPH, D. J. Alterations of the trabecular pattern of the jaws in patients
with osteoporosis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, v. 88, n. 5, p.
628-35, Nov 1999.
XIONG, H. et al. Effect of alendronate on alveolar bone resorption and angiogenesis in
rats with experimental periapical lesions. Int Endod J, v. 43, n. 6, p. 485-91, Jun 2010.
YOKOYA, K.; SASAKI, T.; SHIBASAKI, Y. Distributional changes of osteoclasts and preosteoclastic cells in periodontal tissues during experimental tooth movement as revealed
by quantitative immunohistochemistry of H(+)-ATPase. J Dent Res, v. 76, n. 1, p. 580-7,
Jan 1997.
YOKOYAMA, T. et al. Image analysis of irregularity of cluster shape in cytological
diagnosis of breast tumors: cluster analysis with 2D-fractal dimension. Diagn Cytopathol,
v. 33, n. 2, p. 71-7, Aug 2005.
YU, Y. Y. et al. Fractal dimension analysis of periapical reactive bone in response to root
canal treatment. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, v. 107, n. 2, p.
283-8, Feb 2009.
83
ZAHROWSKI, J. J. Bisphosphonate treatment: an orthodontic concern calling for a
proactive approach. Am J Orthod Dentofacial Orthop, v. 131, n. 3, p. 311-20, Mar 2007.
ZAHROWSKI, J. J. Optimizing orthodontic treatment in patients taking bisphosphonates
for osteoporosis. Am J Orthod Dentofacial Orthop, v. 135, n. 3, p. 361-74, Mar 2009.
84
9 ANEXOS
ANEXO 1 Parecer da Comissão de Ética com Uso de Animais em Experimentação
Científica do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio de
Janeiro.