doctorat de l`université de toulouse doctorat de l`université de

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THESE
En vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE
Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier
Discipline ou spécialité : Physiopathologie
Présentée et soutenue par Bertrand MARCHEIX
Le 2010
Titre : Mise au point d'un modèle d'étude de la maladie vasculaire du greffon
JURY
M. Alain CERENE - Professeur Université Paul Sabatier/praticien Hospitalier - Toulouse
M. Marc LASKAR - Professeur Université Limoges/praticien Hospitalier - Limoges
M. Alain PRAT - Professeur Université Lille-2/praticien Hospitalier - Lille
M. Robert SALVAYRE - Professeur Université Paul Sabatier/praticien hospitalier - Toulouse
Membres invités
M. Marcel DAHAN - Professeur Université Paul Sabatier/praticien Hospitalier - Toulouse
M. Mogens THOMSEN - Directeur de Recherche INSERM - Toulouse
Ecole doctorale : Biologie Santé Biotechnologie
Unité de recherche : Centre I2MR - UMR-858 Inserm/UPS - Equipe 10
Directeur(s) de Thèse : Pr Robert SALVAYRE Robert et Dr Mogens THOMSEN
Rapporteurs : Pr Marc LASKAR et Pr Alain PRAT
À tous les miens
LISTE DES ABRÉVIATIONS UTILISÉES
Ag : Antigène
APC : Allophycocyanine
BSA : Sérum d’Albumine Bovine
CD : Cluster of Differentiation
CMH : Complexe Majeur d’Histocompatibilité
CML : Cellules Musculaires Lisses
CPA : Cellules Présentatrices d’Antigène
CRP : C Reactive Protein
DMSO : Diméthylsulfoxide
EFG : Établissement Français des Greffes
EGF : Endothelial Growth Factor
ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
EOPS : Exempt d’Organismes Pathogènes Spécifiques
FGF : Fibroblast Growth Factor
FITC : Fluoroisothiocyanate
GVHD : Graft Versus Host Disease
HLA : Human Leucocyte Antigen
IFN : Interféron
Ig : Immunoglobuline
IGF : Insulin-Like Growth Factor
IL : Interleukine
ISHLT : International Society for Heart and Lung Transplantation
MBL : Mannose Binding Lectine
MCG : Maladie Coronaire du Greffon
NK : Natural Killer
PBMC : Peripheral Blood Mononuclear Cells
PBS : Phosphate Buffered Saline
PDGF : Platelet Derived Growth Factor
PE : Phycoérythrine
RPMI : Roswell Park Memorial Institute (milieu de culture)
RVC : Rejet Vasculaire Chronique
SCID : Severe Combined Immuno Deficiency
SVF : Sérum de Veau Foetal
TGF : Transforming Growth Factor
TLR : Toll Like Receptor
TMB : Triméthylbenzidine
LISTE DES CD (Clusters of Differentiation) UTILISÉS
CD3 : Marqueur des lymphocytes T
CD4 : Marqueur des lymphocytes T auxiliaires
CD8 : Marqueur des lymphocytes T cytotoxiques
CD19 : Marqueur des lymphocytes B
CD20 : Marqueurs des lymphocytes B
CD45 : Marqueurs des leucocytes
CD45RO : Marqueurs des lymphocytes T mémoires
CD56 : Marqueur des cellules NK
Table des matières
Table des matières
PREMIERE PARTIE : Revue générale ……..……………………………………………1
1 Introduction…………………………………………………………………….…2
2 Athérosclérose et rejet vasculaire chronique……………………………………3
3 Physio-pathologie……………………………………………………………….....5
3.1 Mécanismes immunologiques…………………………………………….6
3.1.1 Réponse CD4+………………………...……………………7
3.1.2 Population lymphocytaire CD8+……..…………………….9
3.1.3 Réponse humorale…………………..…………………….10
3.2 Déterminants non immunologiques………………………......................11
3.3 Avancées récentes dans la compréhension des mécanismes impliqués…11
3.3.1 Immunité innée et acquise………..………………………11
3.3.2 Interactions entre facteurs … ……………………………13
3.3.3 Remplacement endothélial au sein du greffon……………15
4 Diagnostic…………………...……………………………………………………16
4.1 Examens invasifs………………………………………………………16
4.1.1 Échographie endo-coronaire………………………………16
4.1.2 Angiographie coronaire…………………………………...17
4.1.3 Évaluation des altérations de la vasomotricité coronaire….17
4.1.4 Analyse moléculaire des biopsies myocardiques………….17
4.2 Examens non invasifs…………………………………………………18
4.2.1 Échographie de stress à la dobutamine…………………....18
4.2.2 Scintigraphie myocardique………………………………..18
4.2.3 Tomodensitométrie………………………………………..18
4.3 Techniques émergentes……………………………………………….19
4.4 Biomarqueurs et génétique……………………………………………19
5 Traitements…………………………………….…………………………………20
5.1 Immunosuppression…………………………………………………..20
5.1.1 Inhibiteurs de la Calcineurine…………………………….21
5.1.2 Myophenolate Mofetil……………………………………21
5.1.3 Inhibiteurs du signal de prolifération……………………..21
5.2 Autres traitements……………………………………………………22
5.2.1 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A Reductase…..22
5.2.2 Vasodilatateurs…………………………………………...23
5.2.3 Protection endothéliale…………………………………...23
5.2.4 Infection et maladie vasculaire chronique du greffon…....24
6 Modèles d’études expérimentaux……………………………………………25
7 Objectifs des travaux………………………………………………………....37
DEUXIEME PARTIE : Travaux expérimentaux…………………………………………38
1 Matériels et méthodes……………………………………………………………..39
1.1 Patients……………………………………………………………………39
1.1.1 Protocole de prélèvement à fins scientifiques....…………………39
1.1.2 Prélèvements de cellules et de greffons vasculaires humains……39
1.2 Animaux…………………………………………………………………..41
1.2.1 Souris CB17.SCID/Beige…………………………………………41
1.2.2 Dépistage des souris « leaky »…………………………………….41
1.3 Reconstitution d’un système immunitaire humain…………………….41
1.3.1 Préparation des cellules humaines …………………………………41
1.3.2 Stratégie expérimentale…………………………………………….42
1.3.3 Procédure d’humanisation………………………………………….42
1.3.4 Suivi et évaluation in vivo de l’humanisation………………………42
1.3.4.1 Suivi des animaux………………………………………42
1.3.4.2 Typage cellulaire par cytométrie en flux……………….42
1.3.4.3 Dosage des immunoglobulines humaines………………44
1.3.5 Évaluation post mortem de l’humanisation…………………………44
1.3.5.1 Sacrifice des animaux………………………………….44
1.3.5.2 Typage cellulaire par cytométrie en flux………………44
1.3.5.3 Histologie standard…………………………………….45
1.3.5.4 Immunohistochimie…………………………………….45
1.3.6 Recherche de lésions de maladie du greffon contre l’hôte…………45
1.3.7 Recherche d’infection………………………………………………45
1.4 Étude de la maladie vasculaire chronique du greffon…………….….46
1.4.1 Technique de greffe…………………………………………………46
1.4.2 Stratégie expérimentale……………………………………………..48
1.4.3 Sacrifice des souris greffées………………………………………...48
1.4.4 Traitement des greffons……………………………………………..48
1.4.5 Histologie standard…………………………………………………48
1.4.6 Immunohistochimie et évaluation qualitative des lésions…………..48
1.4.7 Histomorphométrie et évaluation quantitative des lésions…………49
1.5 Méthode d’analyse statistique…………………………………………….49
2 Résultats…………….……………………………………………………………..51
2.1 Prélèvements de tissus humains…………………………………………51
2.2 Sélection des animaux……………………………………………………51
2.3 Reconstitution d’un système immunitaire humain…………………….53
2.3.1 Cinétique de la reconstitution dans le sang périphériqu……...53
2.3.1.1 Lymphocytes T humains……………………..……53
2.3.1.1.1 Reconstitution à court et moyen termes.…..53
2.3.1.1.2 Reconstitution à long terme….…………...55
2.3.1.2 Lymphocytes B humains circulants...……………...57
2.3.2 Colonisation des organes lymphoïdes murins………………… 59
2.3.2.1 Histologie et immunohistochimie……………….…59
2.3.2.2 Typage cellulaire par cytométrie en flux…………..59
2.3.3 Étude fonctionnelle du système immunitaire humain ………....61
2.3.3.1 Sécrétion d’IgG humaines……………………………61
2.3.3.2 Rejet d’allogreffes humaines…………………………61
2.3.4 Mortalité des souris après injection de splénocytes……………63
2.3.4.1 Taux de mortalité et dose de splénocytes injectée…63
2.3.4.2 Taux de mortalité et taux de cellules humaines ..….63
2.3.5 Maladie du greffon contre l’hôte……………………………….63
2.3.6 Lymphomes…………………………………………………….64
2.3.7 Infections……..………………………………………………...64
2.4 Reconstitution à partir de cellules médullaires humaines….………65
2.5 Étude de la maladie vasculaire chronique du greffon………………74
2.5.1 Greffon mésentérique…………………………………………..74
2.5.2 Composition et caractéristiques des groupes de souris………...74
2.5.3 Mortalité précoce avant injection de cellules humaines………..76
2.5.4 Mortalité tardive au-delà du 7ème jour post-opératoire…...…….76
2.5.5 Résultat de la reconstitution (groupe isogénique).….………….76
2.5.6 Résultat de la reconstitution (groupe allogénique)….………….77
2.5.7 Lésions intimales : évaluation qualitative……………………..79
2.5.8 Lésions intimales : évaluation quantitative…………………81
Figures
Figure 1….……………………………………………………………………………………40
Figure 2……………………………………………………………………………………….43
Figure 3……………………………………………………………………………………….47
Figure 4……………………………………………………………………………………….50
Figure 5……………………………………………………………………………………….56
Figure 6……………………………………………………………………………………….58
Figure 7……………………………………………………………………………………….60
Figure 8……………………………………………………………………………………….52
Figure 9……………………………………………………………………………………….75
Figure 10..…………………………………………………………………………………….78
Figure 11..…………………………………………………………………………………….80
Figure 12..…………………………………………………………………………………….82
Tableaux
Tableau 1……………………………………………………………………………………...52
Tableau 2……………………………………………………………………………………...54
Articles
Article 1……………………………………………………………………………………...27
Article 2……………………………………………………………………………………...66
Article 3……………………………………………………………………………………...83
TROISIÈME PARTIE : Conclusion……………………………………………………….90
QUATRIÈME PARTIE : Références bibliographiques..…………..…………………….98
RÉSUMÉ DE LA THÈSE…………………………………………………………………114
ANNEXE : Liste des publications ….…………………………………………………….116
Première Partie
Revue Générale
1
1 Introduction
Malgré les progrès récents des techniques d’assistance ou de suppléance, la
transplantation reste aujourd’hui le traitement de choix des défaillances fonctionnelles
terminales d’organes. Les deux dernières décennies ont vu une amélioration considérable de
la prévention et du traitement du rejet aigu. Une meilleure compréhension de l’immunologie
de greffe conjuguée à une utilisation de plus en plus efficace et ciblée des traitements
immunosuppresseurs a permis une amélioration de la survie à court terme des patients
transplantés (Morris 1993, Waller 2003, Bourge 1993).
En revanche, le succès à long terme des transplantations d’organes a été peu modifié :
il est toujours compromis par la survenue d’une dysfonction chronique du greffon (Libby
2001). Les facteurs déterminant la survenue d’une dysfonction chronique du greffon sont
multiples, immunologiques ou non immunologiques.
La maladie vasculaire du greffon reste un des facteurs déterminants de l’évolution des
greffes cardiaques pouvant aboutir à une dysfonction chronique du greffon. C’est la principale
cause de perte de greffon après 1 an. Ainsi, le registre de la Société Internationale de
Transplantation Cardiaque et Pulmonaire (ISHLT) indique-t-il des taux de survie des
transplantés cardiaques à 5 et 10 ans de 60 et 45%. Ce registre indique également que des
lésions vasculaires chroniques sont mises en évidence par l’angiographie chez 8% des
survivants à un an, 32% des survivants à cinq ans et 43% des survivants à huit ans (Taylor
2006). Par ailleurs, des travaux récents ont suggéré que l’impact de la maladie vasculaire du
greffon serait sous-estimé en transplantation hépatique (Wiesner 1999) ou rénale (Cosio
1999).
2
2 Athérosclérose et artériosclérose de greffe ou maladie vasculaire du greffon
(histopathologie)
Si les lésions d’athérosclérose sont des lésions focales, proximales et excentriques, les
lésions d’artériosclérose de greffe sont, à l’inverse, un épaississement myointimal diffus et
concentrique qui affecte les artères épicardiques et intra myocardiques ainsi que le réseau
veineux.
Les principaux points communs entre athérosclérose et artériosclérose de greffe sont
une augmentation de l’expression des molécules d’adhésion cellulaire, une infiltration
leucocytaire, des profils cytokiniques proches ou l’accumulation de matrice extra cellulaire
anormale (Rahmani 2006, Lin 1996, McManus 1994). La migration intimale de cellules
musculaires lisses, la dysfonction endothéliale et la présence de phénomènes apoptotiques
anormaux sont également observées dans les deux cas. En revanche, la limitante élastique
interne est rarement rompue dans l’artériosclérose de greffe et les dépôts de calcium ou
l’accumulation de lipides sont également rares.
Les modifications morphologiques observées dans l’artériosclérose de greffe sont
principalement liées à une prolifération des cellules musculaires lisses associée à une
accumulation de matrice extra cellulaire (Billingham 1987, Billingham 1992, Avery 2003,
Rahmani 2006). La présence de leucocytes au sein de la paroi vasculaire est un autre élément
important des lésions d’artériosclérose de greffe (Pober 2001, Hruban 1990, Salomon
1991). Les macrophages et les lymphocytes T peuvent également envelopper l’artère. Les
leucocytes produisent des médiateurs accentuant la lésion vasculaire et la prolifération de la
matrice extracellulaire. Les mécanismes de « cicatrisation vasculaire » peuvent entraîner un
engainement de l’artère entrainant une restriction fixée de la lumière artérielle ou remodeling
négatif (Pethig 1998). Cet engainement explique également l’altération de la vasomotricité
des artères touchées qui perdent leurs capacités de vasodilatation ou de vasoconstriction
(Davis 1996). Les cellules souches circulantes auraient également un rôle important dans les
mécanismes de réparation et de « remodeling » mis en place dans les deux maladies
(Rahmani 2006).
Au niveau cardiaque, l’artériosclérose de greffe est une forme accélérée et diffuse de
maladie coronarienne. L’hyperplasie myointimale entraîne une oblitération progressive de la
lumière vasculaire (Billingham 1987, Billingham 1992, Rahmani 2006).
Le tableau 1 résume les principaux points communs et les principales différences
entre athérosclérose et maladie vasculaire du greffon.
3
Tableau 1 : athérosclérose et maladie vasculaire du greffon (d’après Rahmani et al. Circ
Res 2006)
4
3 Physio-pathologie
Les mécanismes physio-pathologiques exacts impliqués dans la survenue des
dysfonctions chroniques de greffon ne sont pas totalement élucidés (Avery 2003, Shmauss
2008). Il s’agit en fait d’une pathologie multifactorielle avec une véritable intrication de
facteurs et mécanismes mis en jeu dans la survenue d’une maladie vasculaire et
parenchymateuse du greffon.
Les facteurs immunologiques semblent prépondérants dans l’initiation et le
développement des lésions de la maladie vasculaire du greffon (Avery 2003). Ils sont associés
à d’autres facteurs, non immunologiques, concernant le donneur (maladie préexistante,
lésions d’ischémie/ reperfusion) et le receveur (diabète, hypertension, hyperlipidémie)
(Waller 2003, Avery 2003). Les figures 1 et 2 schématisent les principaux mécanismes
impliqués dans le développement des lésions de maladie vasculaire du greffon.
Figure 1 : Mécanismes impliqués dans la genèse des lésions vasculaires du greffon
5
Figure 2 : Mécanismes impliqués dans la genèse des lésions vasculaires du greffon
3.1 Mécanismes immunologiques
La réponse immunitaire à la présence d’alloantigènes est un des composants majeurs
de l’agression initiale et du développement de lésions vasculaires chroniques du greffon.
Deux éléments sont ainsi déterminants dans les mécanismes immunologiques
impliqués :
-
la discordance entre les antigènes d’histocompatibilité dont la sévérité est liée à
l’importance du mismatch HLA en particulier du mismatch HLA-DR (Smith
1995)
-
le nombre d’épisodes de rejet aigu qui renforce ce conflit immunitaire dans un
contexte d’inflammation et d’infiltration lymphocytaire (Hornick 1997)
6
Plus généralement, trois mécanismes immunologiques sont impliqués dans le rejet de
greffe : la reconnaissance d’alloantigènes entraîne la production de cytokines par les
lymphocytes T CD4+ (helper), la cytotoxicité des lymphocytes T CD8+ et la production
d’anticorps par les lymphocytes B (Auchincloss and Sachs 1993).
3.1.1 Réponse CD4+
Les lymphocytes T CD4+ sont activés par la reconnaissance d’alloantigènes. Une fois
activés, ils peuvent contribuer au rejet de trois façons différentes : stimulation de lymphocytes
CD8+ (directement par la sécrétion de cytokines telles que l’IL2, ou indirectement en activant
les cellules dendritiques qui activent la différenciation des lymphocytes CD8+), stimulation
de la différenciation et de l’activation des lymphocytes B pouvant produire des anticorps
contre les alloantigènes ou activation des leucocytes non spécifiques des antigènes (Lowry
1996).
Les plus connus des effecteurs activés par les lymphocytes T CD4+ sont les
macrophages qui libèrent des médiateurs altérant les tissus comme le NO, les produits de
dégradation de l’oxygène ou des enzymes de dégradation. L’activation des macrophages par
les lymphocytes T CD4+ est l’exemple type de mécanisme immunitaire à médiation
cellulaire. Ce mécanisme de défense impliqué notamment dans la lutte contre les infections
par des bactéries intra-cellulaires peut donc entraîner une altération tissulaire lorsque
l’antigène n’est pas celui d’une bactérie mais celui d’une allogreffe. Ces mécanismes étaient
alors classiquement appelés « hypersensibilité retardée » (« hypersensibilité » renvoie aux
dégâts tissulaires et « retardée » au fait que la réaction se déroule sur 24 à 48H). D’un point de
vue histologique, cette hypersensibilité retardée est caractérisée par l’accumulation de cellules
inflammatoires, de neutrophiles, de cellules T et de macrophages. C’est un des mécanismes
impliqués dans le rejet vasculaire chronique (Sirak 1997, Salomon 1991). Dans la mesure où
l’allo-antigène n’est pas éliminé, les lymphocytes T CD4+ et les macrophages restent activés
de façon persistante entraînant la libération de cytokines et de facteurs de croissance qui
agissent sur les cellules mésenchymateuses.
Deux contingents de lymphocytes T CD4+ sont en fait activés. L’un est directement
activé par les cellules du greffon qui présentent les molécules du CMH de classe II du
donneur. L’autre est indirectement activé par l’alloantigène associé à des molécules du CMH
de classe II du receveur qui sont présentés par les cellules dendritiques du receveur. Peu après
la transplantation, ce sont les mécanismes directs qui prédominent et ce, du fait de cellules T
mémoires présentes en rapport avec des stimulations immunes antérieures. Les cellules
7
endothéliales humaines peuvent également présenter ces alloantigènes aux cellules T mémoire
(Pober 1996). Ce type de réponse peut donc être initié au sein même du greffon par le biais
de cellules endothéliales ou de cellules dendritiques.
La réponse des lymphocytes T CD4+ natifs est plus lente que celle des cellules
mémoires. Elle peut être initiée soit par présentation directe de molécules intactes du CMH du
donneur par des cellules dendritiques présentes dans le greffon, soit par présentation indirecte
de peptides dérivés des alloantigènes par les cellules dendritiques du receveur. Ces cellules
naïves ne peuvent être activées qu’au sein des organes lymphoïdes secondaires où ils doivent
proliférer avant de migrer vers le greffon. Les alloantigènes doivent donc migrer vers ces
organes lymphoïdes secondaires. Il a été démontré que les cellules T naïves ne peuvent pas
rejeter une allogreffe en l’absence d’organes lymphoïdes secondaires (Lakkis 2000). Une fois
les cellules T naïves activées et après une expansion clonale, elles peuvent contribuer à la
réponse et même devenir prépondérantes. Les mécanismes de reconnaissance indirecte sont
importants dans les réactions de rejet chronique (Shirwin 1995, Hornick 2000).
Différentes cytokines ont un rôle important, à la fois, dans les mécanismes de rejets
aigu et chronique (Lowry 1996, Black 1999). Ces cytokines incluent des cytokines
proinflammatoires comme le TNF ou la lymphotoxine qui sont nécessaires au développement
d’infiltrats inflammatoires ainsi que des facteurs d’activation des macrophages comme
l’interféron-γ. Ces cytokines sont probablement sécrétées par les leucocytes infiltrant le
greffon et par certaines cellules du greffon telles que les cellules endothéliales.
Les lymphocytes T CD4+ activés chroniquement ou à répétition se répartissent en
plusieurs sous-groupes produisant chacun un type de cytokine. Certains produisent les l’IFNγ et de la lymphotoxine, d’autres de l’IL-4, de l’IL-5 ou de l’IL-13, certains de l’IL-10 ou du
TGF-β. Les cellules effectrices CD4+ indifférenciées produisent un mélange complexe de
cytokines sont appelées TH0, les CD4+ produisant l’IFN- γ et la lymphotoxine sont appelés
TH1, les CD4 produisant l’IL-4, l’IL-5 ou l’IL-13 sont appelés TH2, les CD4 produisant l’IL10 ou le TGF- β sont appelés TH3 ou cellules T régulatrices.
En cas d’inflammation chronique un sous-groupe est souvent amené à l’emporter sur
les autres, ceci étant lié au fait que la production d’un type de cytokine inhibe la
différenciation des autres sous-groupes déterminant ainsi le type de lésion observée. Une
situation dominée par le groupe TH1 ou TH2 aboutit souvent à l’apparition de lésions fibreuses
qui deviennent chroniques. En terme de rejet chronique, tous les facteurs déterminant la
prédominance d’un type de réponse ne sont pas connus. L’attention s’est récemment portée
vers le contexte dans lequel les cellules TH0 ou naïves rencontraient l’antigène. Ce contexte
8
dépend en grande partie du système immunitaire inné basé sur les phagocytes, les cellules NK
ou certaines molécules plasmatiques (Medzhitov et Janeway 2000). Ainsi, les cellules
endothéliales lésées par l’ischémie sont capables de produire un ligand pour la protéine MBL
(Mannose Binding Lectin) pouvant se lier à cette prothéine et activer la voie classique du
complément en se substituant à la protéine C1 (Collard 2000). La protéine C Réactive (CRP)
peut également activer les voies du complément en réponse à une lésion ischémique (Griselli
1999). Certaines immunoglobulines M (anticorps naturels) peuvent également contribuer à
l’activation du complément en interagissant avec des allo-antigènes (Weiser 1996).
De toutes ces façons, des tissus lésés peuvent activer le système immunitaire inné. Ce
système immunitaire inné ne constitue pas seulement la première ligne de défense contre les
infections : il peut également déterminer la nature de la réponse immunitaire qui suivra
(Medzhitov et Janeway 2000). Le meilleur exemple est lié aux monocytes et macrophages
qui peuvent produire l’IL-12 qui stimulera à son tour les lympocytes CD4+ TH0 dans la
production d’IFN-γ et dans leur différenciation en TH1produisant spécifiquement l’IFN-γ et la
lymphotoxine (Trinchieri 1998). Les cytokines pro-inflammatoires comme le TNF
augmentent la production d’IL-12. C’est pourquoi l’activation des voies du complément
aboutissant à la libération de TNF, notamment à partir des mastocytes, favoriseront la
production d’IL-12 et les mécanismes impliquant la population TH1.
En transplantation, les activateurs endogènes du complément peuvent également
favoriser la production d’IL-12 amenant à favoriser la population TH1. En d’autres termes, les
lésions endothéliales locales peuvent diriger la réponse immunitaire vers l’hypersensibilité
retardée expliquant comment les lésions d’ischémie/reperfusion de la paroi vasculaire peuvent
être un facteur de risque pour cette hypersensibilité rétardée et donc pour le développement de
lésions de maladie vasculaire chronique du greffon.
3.1.2 Population lymphocytaire CD8+
Les lymphocytes T CD8+ peuvent également produire des signaux favorisant
l’hypersensibilité retardée (en particulier l’IFN-γ). Cependant, cette population cellulaire
entraîne des lésions tissulaires d’abord et avant tout par leurs propriétés cytolytiques dirigées
contre le parenchyme ou les cellules vasculaires du greffon (Rosenberg et Singer 1992).
Cette cytolyse est initiée par la présentation des molécules de classe I du donneur par
les cellules du greffon. Seules les cellules dendritiques du greffon peuvent activer les cellules
CD8+ pour qu’elles se différencient en cellules cytotoxiques. Les cellules dendritiques du
9
receveur ne peuvent pas présenter les molécules du CMHI à moins que les allèles du CMHI
soient communs entre le donneur et le receveur. Les cellules endothéliales du greffon sont
capables de favoriser la différenciation de certaines cellules TCD8+ (Biedermann et Pober
1998, 1999) mais le rôle précis de cette sous-population reste indéterminé.
En clinique, les cellules CD8+ cytotoxiques sont le principal effecteur du rejet aigu à
médiation cellulaire (Strehlau et al 1997) dans la mesure où les agents immunosuppresseurs
tels que les inhibiteurs de la calcineurine (Cyclosporine A ou Tacrolimus) agissent plus
efficacement sur les lymphocytes T CD4+ que sur les cellules T CD8+.
3.1.3 Réponse humorale
Les allo-anticorps peuvent également être responsables du rejet du greffon (Rose
1994). Ces anticorps reconnaissent généralement les molécules du CMH exprimées par les
cellules endothéliales du greffon. Dans la mesure où les cellules endothéliales sont alors la
principale cible cellulaire, le rejet médié par les anticorps est principalement un rejet
vasculaire. En fait le rejet humoral a d’abord été appelé rejet vasculaire, en particulier du fait
de la précocité des lésions entraînées (Meehan 1997).
Les lésions de l’endothélium du greffon par les alloanticorps dépendent de l’activation
du complément et partagent donc les caractéristiques d’autres formes de lésions vasculaires
comme les lésions liées aux phénomènes d’ischémie/reperfusion qui impliquent également le
complément.
Il existe cependant peu de preuves de l’implication des populations lymphocytaires
cytotoxiques et des anticorps dans le développement de lésions vasculaires chroniques. Reste
que sur ces populations lymphocytaires et ces anticorps qui peuvent entraîner des lésions de
rejet aigu, ces deux facteurs pourraient également contribuer secondairement au rejet
chronique par ces mêmes mécanismes (Hosenpud 1997, Fredrich 1999). Si le rejet humoral
est principalement médié par les anticorps anti-HLA, il peut également l’être par des anticorps
anti-cellules endothéliales, anti-MICA et anti-MICIS.
10
3.2 Déterminants non immunologiques
Si de nombreux mécanismes liés à la réponse immunitaire sont impliqués dans le
développement des lésions vasculaires chroniques, d’autres facteurs, non immunologiques,
contribuent également au développement de ces lésions.
Le phénomène d’ischémie/reperfusion lié au prélèvement du greffon chez le donneur
et à son transport avant son implantation chez le receveur est un autre élément important dans
le déterminisme des lésions vasculaires chroniques. Tout comme les traumatismes vasculaires
mécaniques, l’hypoxie cellulaire est responsable d’une réaction inflammatoire.
L’infection à CMV est également un élément important à prendre en compte.
Plusieurs études ont démontré l’existence d’une association entre infection à CMV et maladie
coronaire du greffon. Le CMV infecte la cellule endothéliale et provoque un effet
cytopathique favorisant l’adhésion des granulocytes et la libération de cytokines (IL-1 et
TNF-α) stimulant ainsi une prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (Kendall
1992, Lautenschlager 1999, Valantine 2003). L’infection à CMV augmente également
l’expression d’antigène HLA de classe I et celle de molécules d’adhésion à la surface des
cellules endothéliales et des cellules musculaires lisses vasculaires (Van Dorp 1989).
Les facteurs de risque cardiovasculaires classiques (hypertension artérielle,
dyslipidémie, hyperglycémie) peuvent également être impliqués chez le receveur et sont
parfois favorisés par le traitement immunosuppresseur mis en place (cyclosporine et
hypertension artérielle).
Des lésions d’athérosclérose progressivement développées par le donneur peuvent
également être présentes au niveau des artères du greffon. Ces lésions peuvent ensuite
présenter une évolution accélérée sous l’effet de mécanismes immunitaires ou non.
L’aggravation de ces lésions sous l’effet de la réponse immunitaire liée au conflit allogénique
a été démontrée dans certains modèles expérimentaux (Tanaka et Sukhova 1994).
3.3 Avancées récentes dans la compréhension des mécanismes impliqués
3.3.1 Immunité innée et acquise
Les mécanismes à médiation cellulaire sont déclenchés lorsque le système
immunitaire du receveur détecte les antigènes présentés par le greffon (Rogers 2001). Trois
types de mécanismes peuvent être alors impliqués : des mécanismes direct, indirect ou semi
direct.
11
Les mécanismes directs consistent en la reconnaissance par les cellules dendritiques
du receveur des molécules du CMH exprimées par le greffon (Rogers 2001). Les mécanismes
indirects sont impliqués lorsque les antigènes du donneur sont internalisés puis présentés
comme peptides à la surface des cellules dendritiques du receveur (Lechler 2001). Les
mécanismes semi directs impliqués dans la genèse des lésions vasculaires chroniques ont été
évoqués récemment (acquisition des molécules du CMH du donneur par les cellules
dendritiques du receveur par contact cellulaire avec réponse cellulaire T). Leur rôle précis est
encore méconnu (Schmauss 2008).
Les concepts classiques suggèrent que les mécanismes directs sont impliqués dans le
rejet aigu alors que les mécanismes indirects sont impliqués dans les lésions de rejet
chronique (Roger 2001, Lechler 2001, Smyth 2006, Weis 2000). Les cellules endothéliales
du greffon peuvent également activer directement les cellules T du receveur par la simple
présentation des molécules HLA du donneur (Choi 2000).
La présence de lésions vasculaires chroniques sévères est associée à une inflammation
persistante et à un mismatch HLA important. Des études récentes ont montré que l’activation
et le dépôt du produit de dégradation du complément C4d étaient associés à la présence
d’alloanticorps circulants spécifiques des molécules HLA du donneur et à une augmentation
des complications cardiovasculaires (Kobashigawa 2005, Diujvestijn 2000). De la même
façon, la présence d’anticorps spéciques dirigés contre les molécules HLA du receveur est
associée à une altération du greffon (Trambur 2005) alors que la compatibilité HLA-DR est
un prédicteur indépendant de survie (Hosenpud 1996, Kaczmarek 2006). En particulier, la
combinaison d’anticorps et de complément jouerait un rôle important dans le développement
de la maladie vasculaire chronique du greffon (Wehner 2007).
Indépendamment des antigènes spécifiques, les cellules dendritiques du receveur
adhèrent fréquemment aux cellules endothéliales du greffon, envahissent ses tissus, capturent
les antigènes du greffon et présentent les alloantigènes aux cellules T naïves du receveur. Les
cellules T activées envahissant le greffon contribuent à l’activation d’une dysfonction
endothéliale médiée par la l’activation de cytokines (Choi 2004, Koh 2004). L’IFN-γ, en
partie par l’induction de la NO synthase est un élément déterminant associé à une dysfonction
vasculaire précoce entraînant des modifications structurelles importantes présentes dans les
lésions de maladie vasculaire chronique du greffon (Choi 2004, Koh 2004).
12
Au delà de l’impact évident de la réponse immunitaire acquise, le système
immunitaire inné semble également jouer un rôle notamment par le biais de recepteurs « tolllike » (Andrade 2005, Obhrai 2006). Par exemple, les lésions d’ischémie-reperfusion et la
libération associée de radicaux libres entraînent la libération de ligands qui pourraient être
détectée par des récepteurs « toll-like » (TLR-4) présents à la surface de cellules
mononucléées (Obhrai 2006). Ainsi, la surexpression du gène TLR-4 dans les monocytes
circulants est associée à une dysfonction endothéliale coronaire du greffon (Methe 2004).
L’activation des récepteurs TLR-4 permettrait la maturation des cellules dendritiques
contribuant ainsi à l’activation d’une réponse immunitaire acquise. Différentes études en
cours cherchent à identifier les ligands responsables de l’activation de la réponse immunitaire
acquise après transplantation cardiaque (Andrade 2005, Obhrai 2006). Différents facteurs
auraient un rôle de renforcement de la réponse immunitaire par le biais de la dysfonction
endothéliale et de l’inflammation vasculaire qu’ils entraînent.
3.3.2 Interactions entre facteurs indépendants des alloantigènes et réponse
immunitaire
La maladie vasculaire chronique du greffon est en fait le résultat de lésions induites
par la stimulation du système immunitaire mais aussi de l’accumulation de lésions
endothéliales liées ou non à la réponse immunitaire (Weis 2000, Vassalli 2003).
Les lésions indépendantes des mécanismes de défense immunitaire sont diverses et
variées, impliquant la mort encéphalique, la préservation du greffon, d’éventuels
traumatismes chirurgicaux, l’ischémie-reperfusion, l’infection à CMV, l’hypertension, la
dyslipidémie, l’hyperglycémie. Tous ces facteurs sont associés à l’activation immunitaire, à
la dysfonction endothéliale et à la maladie vasculaire chronique du greffon (Rahmani 2006,
Vassalli 2003, Weis 2000, Valantine 2003, Sharples 2003, Weis 2004).
L’activation endothéliale induit une activation des molécules d’adhésion endothéliale
et une surexpression de chémokines, de facteurs de croissance à tropisme vasculaire ou autres
molécules thrombogènes et les cellules du système immunitaire envahissent le greffon
(Rahmani 2006, Weis 2000, Valantine 2003).
Un bon exemple d’augmentation d’immunogénicité de greffon par la réponse
immunitaire de l’hôte même en l’absence d’alloantigènes est l’activation de la réponse
immunitaire induite par la mort encéphalique. La mort encéphalique est associée à de
13
nombreuses modifications neurologiques, hormonales et moléculaires entraînant une
agression cellulaire et une réponse inflammatoire (Pratschke 2005). L’expression des
molécules du CMH et de signaux de co-stimulation active les différentes voies du système
immunitaire. L’inflammation non spécifique, liée aux lésions d’ischémie-reperfusion ou à un
désordre métabolique, entraîne la libération de molécules HLA solubles qui activent
l’immunité non spécifique (Pratschke 2005).
Les
facteurs
de
risque
cardiovasculaire
comme
l’hypertension
artérielle,
l’hyperglycémie et les dyslipidémie peuvent augmenter l’inflammation vasculaire en
induisant une dysfonction endothéliale. De la même façon, les LDL et les LDL oxydés sont
capables d’entraîner une augmentation des taux de HLA-DR et de la molécule de
costimulation CD86 au niveau des cellules dendritiques immatures (Zaguri 2007). Les lipides
peuvent également séquestrer les cellules dendritiques activées (Angeli 2004) au sein du
greffon dans lequel ils renforcent localement la réponse immunitaire. Les facteurs
indépendants des allo antigènes peuvent donc directement ou indirectement déclencher des
réponses immunitaires en induisant une dysfonction endothéliale, l’activation du complément,
l’activation des voies de la coagulation, un recrutement des cellules inflammatoires, en
facilitant le passage de cellules dendritiques dans le greffon et en régulant la différenciation
des cellules T.
Suivant le registre de la Société Internationale de Transplantation cardiaque et
pulmonaire (ISHLT), les facteurs de risque de développement de lésion de maladie vasculaire
chronique au cours des 3 premières années sont : les antécédents d’hypertension artérielle
chez le donneur, le sexe et l’âge du donneur, l’index de masse corporelle du receveur et la
survenue d’une infection nécessitant un traitement intraveineux au cours des 2 premières
semaines (Taylor 2006). Kobashigawa et al ont montré que l’hypercholestérolémie et le
diabète étaient des facteurs de risque pour la survenue d’événements cardiovasculaires, que
l’insuffisance rénale et un index de masse corporelle >33Kg/m2 étaient des facteurs de risque
de perte du greffon (Kobashigawa 2006). Finalement, les lésions vasculaires liées ou non à la
réponse immunitaire survenant dans une contexte d’altération des mécanismes de réparation
vasculaire (diminution de l’activité des progéniteurs endothéliaux et activation des
progéniteurs des cellules musculaires lisses (Hu 2003) contrôlent la progression de la maladie
vasculaire chronique du greffon.
14
3.4.3 Remplacement endothelial au sein du greffon
Bien que le rôle du remplacement des cellules endothéliales après transplantation a été
suggéré comme central dans l’adaptation du greffon (hypothèse de Medawar), le
remplacement des cellules endothéliales du greffon par des cellules endothéliales du receveur
est en fait une réponse aux lésions vasculaires (Lagaaij Lancet 2001, Hillebrands Nat Med
2002). Hu et al ont montré que les cellules endothéliales des lésions néo intimales au sein du
greffon dérivent de cellules progénitrices circulantes et que les progéniteurs de la moelle sont
responsables de l’angiogenèse dans le greffon (Hu Circ 2003). En fait, les cellules
progénitrices extracardiaques sont capables de reconstituer la plupart des types cellulaires
dans le cœur humain transplanté (Minami Circ 2005). Les progéniteurs endothéliaux sont
significativement diminués dans la circulation et les cellules endothéliales du receveur sont
augmentées dans les artères coronaires présentant des lésions vasculaires chroniques (Simper
Circ 2003) ce qui soutient le concept selon lequel les cellules progénitrices issues du donneur
participent à la biologie vasculaire du transplant cardiaque (Schmauss Circ 2008).
15
4 Diagnostic
Le diagnostic précoce de la maladie vasculaire chronique du greffon est rendu difficile
par le caractère pauci symptomatique de l’ischémie myocardique lié à l’absence d’innervation
du greffon. L’angiographie des artères coronaires sous-estime les lésions qui impliquent les
gros troncs mais aussi les vaisseaux de petits calibres. Indépendamment des anomalies
morphologiques, la maladie vasculaire chronique du greffon est associée à une altération
fonctionnelle des artères coronaires (Weis 2000).
4.1 Examens invasifs
4.1.1 Échographie endo-coronaire
C’est l’examen le plus sensible qui permet la visualisation de la lumière mais
également la visualisation de la paroi vasculaire (aspect et épaisseur de l’intima et de la
média). Cet examen permet d’évaluer le volume des lésions ce qui lui confère une grande
puissance statistique dans la comparaison de modifications même minimes de la paroi
vasculaire. La plupart des études cliniques reposent sur l’utilisation de l’échographie
endovasculaire pour l’évaluation de l’efficacité des différents traitements sur la maladie
vasculaire chronique.
Il apparaît que la progression de l’épaississement néointimal est la plus rapide au
cours de la première année suivie par un ralentissement mais aussi par une évolution
inexorable dans le temps (Tuzcu 2005). La présence d’un épaississement modéré ou sévère
détecté par l’échographie endovasculaire a une valeur prédictive du développement de lésions
ultérieurement détectables en angiographie. La progression rapide de la malaide vasculaire
chronique est définie par une augmentation d’au moins 0,5mm de l’épaisseur néointimale
maximale au cours de la première année. En cas de progression rapide, le risque de décès
toutes causes confondues, d’infarctus du myocarde ou de lésions angiographiques sévères est
augmenté (Diujvestijn 2000, Tuzcu 2005). C’est pourquoi, la réalisation d’une échographie
endovasculaire à un mois et à douze mois est un élément important afin d’identifier les
patients à risque de façon à modifier la prise en charge thérapeutique.
16
4.1.2 Angiographie coronaire
C’est l’examen de référence encore utilisé par la plupart des équipes de
transplantation. La présence de lésions sténosantes est associée à un mauvais pronostic. Des
lésions vasculaire chroniques sont identifiées dans 30 à 50% des survivants après 5 ans
(Taylor 2006, Costanzo 1998). A l’exception des lésions focales serrées, l’angiographie
coronaire reste un examen relativement peu sensible en comparaison à l’échographie
endovasculaire (St Goar 1992, Tuzcu 1995, Spes 1999, Gregory 2006). La valeur prédictive
positive de l’angiographie serait de 44% (Stork 2006).
4.1.3 Évaluation des altérations de la vasomotricité coronaire
L’activation endotheliale au sein du greffon est un facteur prédictif du développement
de maladie vasculaire chronique. L’apparition et le degré d’activation endothéliale au cours
des 3 premiers mois permettent de prédire la progression de la maladie vasculaire chronique
(Labbarere 97). La présence d’une dysfonction endothéliale au sein du greffon est associée à
une augmentation du taux d’endotheline circulante (Weis 1999), à une activation des
cytokines (Weis 1999), à l’infection au CMV (Petrakopoulou 2004).
La présence d’une dysfonction endothéliale coronaire est un facteur prédictif du
développement d’un épaississement néo intimal (Marti 2001) et de la survenue d’événements
cardiovasculaires (Hollenberg 2001).
Récemment, la présence de lésions de maladie vasculaire chronique au sein de
vaisseaux de petits calibres obtenue par biopsie myocardique est apparue comme étant un
facteur de mauvais pronostic à long terme (Hiemann Circ 2007).
4.1.4 Analyse moléculaire des biopsies myocardiques
Des études récentes se sont intéressées à l’intérêt potentiel de marqueurs endothéliaux,
de protéases de la matrice extracellulaire et de chémokines dans la prédiction de la survenue
de lésions vasculaires chroniques.
Les biopsies myocardiques obtenues au cours des 3 premiers mois après
transplantation cardiaque montrent des modifications artérielles et artériolaires (expression de
HLA-DR, de la molécule d’adhésion intercellulaire 1, diminution de l’activateur tissulaire du
plasminogène) qui sont fortement corrélées au développement de maladie vasculaire
17
chronique et aux résultats à long terme de la transplantation. (Labarrere 1997, Labarrere
2003).
Le marquage à l’anti-thrombine III est un facteur prédictif indépendant de la survenue
de lésions vasculaires chroniques (Stork 2006) de même que l’augmentation persistante de la
glycoprotéine antiangiogénique thrombospondine-1 (Zhao 2001), ou la présence des
chemokines CXCR3 (van Loosdregt 2006, Zhao 2002). De Souza a montré chez les patients
présentant des lésions vasculaires chroniques l’expression de la forme déphosphorylée de
HSP-27 (De Souza 2005).
4.2 Examens non invasifs (Kass 2007)
4.2.1 Échographie de stress à la dobutamine
Sa sensibilité est de 80 à 88% (Ciliberto 1993, Derumeaux 1995, Seps 1996, Spes
1999). La valeur prédictive de progression de la maladie vasculaire chronique a également été
démontrée (Spes 1999, Akosah 1998).
4.2.2 Scintigraphie myocardique
Cet examen a une forte valeur prédictive positive (Carlsen 2000, Wu 2005). La
fréquence des contrôles angiographiques semble pouvoir être raisonnablement fixée par les
résultat de la scintigraphie 201 T1 à la dobutamine ou par la combinaison d’une échographie
de repos et d’une scintigraphie de stress 99mTc sestmibi (Wu 2005, Ciliberto 2001). La
réalisation d’une angiographie est alors réservée aux patients présentant des anomalies de la
cinétique segmentaire au repos ou des défects de perfusion.
4.2.3 Tomodensitométrie
Romeo et al ont rapporté une sensibilité de 83% et une spécificité de 95% de la
tomodensitométrie multi-barette (Kaczmarek 2006) en comparaison avec l’angiographie
coronaire. La valeur prédictive négative était de 95%. Cet examen permet de multiples
reconstructions à différents niveaux des artères coronaires. Iyengar et al (Iyengar 2006) ont
démontré l’intérêt de cet examen et sa supériorité en cas de lésion non sténosante non détectée
par l’angiographie.
18
Les principales difficultés techniques affectant la qualité des images obtenues sont la
fréquence cardiaque souvent élevée chez les transplantés cardiaques même traités par Betabloqueurs et l’obésité fréquemment rencontrée chez les transplantés cardiaques.
Les autres limites de cet examen sont la méconnaissance des artères de petit calibre, le
risque d’insuffisance rénale associé à l’utilisation de produit de contraste et l’irradiation
associée à la tomodensitométrie.
4.3 Techniques émergentes
L’échographie de contraste semble avoir un intérêt dans la détection des patients
porteurs de lésions vasculaires chroniques mais n’évalue par le degré d’extension de la
maladie (Rodrigues 2005). De nouvelles techniques d’IRM pourraient également avoir un
intérêt (Caus 2006).
4.4 Biomarqueurs et génétique
Un taux élevé de Protéine C-Reactive est associé à une progression des lésions
vasculaires chroniques (Pethig 2000, Labarrere 2002). L’élévation persistante de troponine I
est également associée à un risque augmenté de développer des lésions vasculaires chroniques
(Labarrere 2000). L’utilisation du Brain Natriuretic Peptide (BNP) reste controversé (Shaw
2006, Mehra 2006). Des études cellulaires centrées sur les lymphocytes T sont en cours
(Reinsmoen 2002).
Le test d’expression du gène AlloMap initialement utilisé dans la
détection des épisodes de rejet aigu a récemment été évalué dans les lésions vasculaires
chroniques (Yamani 2007). La présence de lésions vasculaires chroniques était associée à une
augmentation du score du test d’expression du gène AlloMap. Des études prospectives sont en
cours.
19
5 Traitements
La progression rapide de la maladie vasculaire du greffon au cours de la première
année est un prédicteur de mortalité toutes causes confondues et d’infarctus du myocarde. A
ce jour, même si de nouvelles pistes thérapeutiques semblent intéressantes (Keogh 2004,
Eisen 2003), aucun traitement n’a fait la preuve de son efficacité, que ce soit sur la prévention
ou le traitement de la maladie vasculaire chronique (Avery 2003). Le rejet chronique
vasculaire reste donc un phénomène mal connu. Le développement de modèles
expérimentaux apparaît indispensable à l’exploration des mécanismes impliqués et à
l’évaluation de nouveaux traitements.
5.1 Immunosuppression
20
5.1.1 Inhibiteurs de la Calcineurine
Les traitements à base de cyclosporine A sont associés à une prévalence élevée de la
maladie vasculaire chronique (Segovia 2006). Différents essais ont montré l’intérêt des
traitements basés sur le tacrolimus avec une meilleure prévention du rejet aigu (Meiser 2004,
Grimm 2006, Kobashigawa 2006). La survie à 5 ans et les contrôles angiographiques étaient
comparables dans les groupes traités par Cyclosporine A et par tacrolimus dans l’étude menée
par Kobashigwa et al (Kobashigawa 2006). Meiser et al indiquaient une prolifération
néointimale plus marquée dans le groupe Cyclosporine A + MMF comparé au groupe
tacrolimus + MMF au cours de la première année (Meiser 2004). La dysfonction endothéliale
présente dans les artères coronaires de petit calibre était plus importante dans le groupe traité
par cyclosporine comparé au groupe traité par tacrolimus et ce, associé à une élévation de
l’endothéline 1 et à une diminution du remodeling vasculaire (Petrakopoulou 2006).
5.1.2 Myophenolate Mofetil
L’association Ciclosporine A et MMF était associée à une réduction de 35% à 3 ans de
la mortalité et des dysfonctions terminales du greffon en comparaison aux patients traités par
ciclosporine A et Azathioprine (Eisen 2005). Aucune différence significative n’apparaissait
sur le contrôle angiographique ; cependant l’épaisseur de la néointima tendait à être moindre
dans le groupe traité par MMF en comparaison avec le groupe traité par azathioprine (Eisen
2005). Le nombre de patients présentant une épaisseur néointimale supérieure ou égale à
0.3mm était moins important dans le groupe traité par MMF (Kobashigawa 2006). En outre,
la diminution du calibre de la lumière des artères coronaires était significativement moindre
dans le groupe traité par MMF comparé au groupe traité par azathioprine (Kobashigawa
2006). Ces résultats ont été confirmés par Kaczmarek et al qui indiquaient que les lésions de
vasculaires chroniques étaient moindre dans le groupe traité par MMF (Kaczmarek 2006).
5.1.3 Inhibiteurs du signal de prolifération
Ces médicaments inhibent la prolifération lymphocytaire T et B principalement
entraînée par les interleukines (Segovia 2006). Un ralentissement de la progression de la
maladie vasculaire chronique sous Sirolimus a été démontré dans des essais non randomisés
(Mancini 2003) et dans des essais randomisés (Keogh 2004).
21
L’étude de Mancini incluait 46 patients et comparait un groupe traité par Sirolimus et
un groupe traité par Azathioprine ou MMF. Les critères de jugement primaires étaient la
survenue de décès du patient, la nécessité de revascularisation, la survenue d’un infarctus du
myocarde ou une aggravation angiographique des lésions de plus de 25% (échelle semi
quantitative sur des angiographies annuelles). 3 patients ont présenté une de ces complications
dans le groupe traité par Sirolimus contre 14 dans le groupe contrôle (p<.001) (109).
L’étude de Keogh a montré l’absence de progression néointimale pendant plus de 2
ans chez les patients traités par Sirolimus. Cette étude comparait le Sirolimus à l’Azathioprine
qui n’est malheureusement plus considéré comme le traitement de référence par la plupart des
équipes de transplantation (Keogh 2004).
L’utilisation de l’Everolimus semble associée à une préservation du calibre de la
lumière des artères coronaires à un an (Eisen 2003). Cette dernière étude, la plus solide,
démontrait que tous les paramètres d’échographie endo-coronaire étaient meilleurs dans le
groupe traité par Everolimus en comparaison avec les patients traités par Azathioprine et ce,
dans les 2 groupes (1,5 ou 3mg d’Everolimus) avec de meilleurs résultats dans le groupe
prenant 3mg d’Everolimus. Ces résultats ont été confirmés à 2 ans (Segovia 2006, Eisen
2006).
L’utilisation de l’Everolimus était également associée à une diminution de l’incidence
des rejets aigus et des épisodes d’infection à CMV, deux facteurs de risque de maladie
vasculaire chronique. A 4 ans, le bénéfice lié à l’utilisation de l’Everolimus était confirmé
avec significativement moins d’événements cardiaques liés à la maladie vasculaire chronique
comparé au groupe traité par Azathioprine (Segovia 2006, Eisen 2006).
5.2 Autres traitements
5.2.1 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A Reductase Inhibitors
(Statine)
Différentes statines ont été associées à une diminution de la progression des lésions de
vasculaires chroniques et l’utilisation de la simvastatine améliore la survie à 8 ans des greffés
cardiaques (Wencke 2003).
L’effet vasoprotecteur des statines est probablement lié à différents mécanismes. La
prise de Simvastatine pendant plus de 12 mois réduit l’activité de l’IL6 et du TNF-α, améliore
la fonction endothéliale coronaire et augmente le calibre de la lumière des artères coronaires
(Weis 2001).
22
5.2.2 Vasodilatateurs
Les inhibiteurs des canaux calciques semblent diminuer la progression des lésions
vasculaires chroniques et améliore la vasodilatation coronaire (Schroeder 1993, Weis 2002).
Les inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine améliorent partiellement la
fonction endothéliale des microvaisseaux, le stress oxydant, l’activation de l’endothéline
(Steinhauff 2004) et ont été associés à une régression des plaques (Bae 2006) et une
amélioration de la survie du greffon (Kobashigawa 2006). Récemment, l’association des
inhibiteurs des canaux calciques et des inhibiteurs de l’enzyme de conversion de
l’angiotensine a montré un effet protecteur contre la maladie vasculaire chronique
indépendamment de leur propriété antihypertensive (Erinc 2005). D’autres études sont
cependant nécessaires pour confirmer l’intérêt de ces médicaments et leur impact sur la survie
après transplantation cardiaque.
5.2.3 Protection endothéliale
Les stratégies d’amélioration de la voie endothéliale du NO résultant dans l’expression
gène et permettant de reduire les lésions d’ischémie/reperfusion en inhibant l’activation
nucléaire du facteur kappaB, l’expression des molécules d’adhésion (intracellular adhesion
molecule-1, vascular cell adhesion molecule-1) et l’infiltration leucocytaire (Iwata 2001).
Lim et al ont démontré que l’administration orale de L-Arginine (un précurseur de la NO
synthase) corrigeait la dysfonction endothéliale et diminuait la pression artérielle après
transplantation cardiaque (Lim 2004, Weis 2003). La L-Arginine aurait une action de tampon
diminuant le stress oxydant au sein du greffon (Weis 2003).
D’autres drogues pourraient avoir un intérêt dans la correction de la fonction
endothéliale. Ces médicaments anti-oxydants seraient les vitamines C et E ou les flavonoids
(Fang 2002, Nickel 2006, Iwanaga 2007).
23
5.2.4 Infection et maladie vasculaire chronique du greffon
Le CMV peut directement (dysrégulation des voies du NO) ou indirectement
(activation de cytokine) affecter la fonction endothéliale du greffon (Petrakopoulou 2004).
Un effet indirect important de l’infection à CMV qui aboutit à l’aggravation des
lésions vasculaires chroniques est l’augmentation de la réponse immunitaire du receveur
contre le greffon et contre le virus qui entraîne le recrutement de cellules inflammatoires et
d’effecteurs de l’inflammation comme les chemokynes et les cytokynes incluant l’IFN-γ, le
TNF-α, IL-4, IL-18, RANTES, monocyte chemotactic protein-1, macrophage inflammatory
protein-1alpha, IL-8 et interferon-inducible protein-10 (Streblow 2007).
Le CMV encode également les homologues des chemokines CC et CXC qui recrutent
une multitude d’infiltrats cellulaires provenant du receveur (Streblow 2007). L’infection à
CMV active l’adhésion des cellules mononuclées et leur migration dans la paroi vasculaire du
greffon, induisant un état procoagulant et affecte des facteurs impliqués dans l’angiogenèse, la
migration de cellules musculaires lisses et le remodelage vasculaire (Streblow 2007).
Le traitement par Ganciclovir semble réduire la progression des lésions vasculaires
chroniques alors que l’absence de traitement prophylactique contre le CMV est associée à une
aggravation de la réduction de la lumière des artères coronaires du greffon (Valantine 2003,
Fearon 2007). Le contrôle de réplication infraclinique du CMV après transplantation par
l’immunité T pourrait réduire le rejet du greffon et la maladie vasculaire chronique (Tu
2006).
24
6 Modèles d’études expérimentaux
Les premiers modèles expérimentaux d’étude de la maladie vasculaire chronique du
greffon ont été développés chez le gros animal tels que le porc ou le lapin. Ces modèles
permettaient la description de lésions de maladie vasculaire chronique. Ils restaient cependant
considérablement limités en terme de compréhension des mécanismes physiopathologiques
(Pober 1999).
Les modèles animaux se sont ensuite dirigés vers les rongeurs et principalement vers
le rat (Rahmani 2006, Plissonnier 1995, Mennander 1991). La plupart des modèles
expérimentaux reposaient sur la réalisation de transplantations cardiaques hétérotopiques. Les
principales limitations étaient liées au fait que seules les artères coronaires étaient perfusées
avec une perte de la fonction de pompe du ventricule gauche qui présentait rapidement une
thrombose responsable de certains artéfacts en particulier au niveau de la région sous
endocardique rendant parfois difficile l’interprétation des analyses histologiques (Pober
1999). Des résultats cependant intéressants ont été rapportés par certaines équipes :
diminution des lésions en cas d’absence de cellules T ou de macrophage chez le receveur,
diminution des lésions en cas de deficit en certaines cytokines (IFN-γ) (Nagano 1997).
Une alternative à la transplantation cardiaque hétérotopique est la transplantation
orthotopique d’un greffon vasculaire au niveau aortique sous rénal (Pober 1999). L’utilisation
du rat a rapidement montré ses limites du fait, en particulier, de la méconnaissance du génome
de ces rongeurs.
Les premiers travaux d’allogreffe aortique chez la souris ont été rapportés en 1995
(Koulack 1995). La souris est rapidement apparue plus intéressante que le rat : outre un
moindre coût et des temps de génération plus courts, la supériorité principale de la souris est
liée à la grande diversité des lignées disponibles et la possibilité d’un recours à des souris
« knock-out ». L’utilisation de souris transgéniques a permis une approche de plus en plus
fine des mécanismes du rejet de greffe : rôles de cytokines ou de leurs récepteurs (IL-2, IL-4,
INF-γ) (Nagano 1997, Gao 2000), de molécules de costimulation ou présentatrices d’antigène
(CMH) (Mandelbrot 1999), des lymphocytes CD4+, CD8+ et des macrophages (Shi 1996).
Malgré ces avancées, le principal facteur limitant des modèles expérimentaux
développés chez le rongeur est la difficulté de transposition des résultats obtenus à une
situation clinique chez l’homme (Ensminger 2003, Karasin 1998), du fait de très
nombreuses différences des systèmes immunitaires murins et humains. La nécessité de
développer de nouveaux modèles expérimentaux était donc impérieuse.
25
En 1999, a été décrit un modèle de greffe vasculaire humaine chez des souris dites
« humanisées », c'est-à-dire chez lesquelles un système immunitaire humain avait été
reconstitué, et ce, dans l’espoir de faciliter la transposition des résultats expérimentaux
(Lorber 1999).
L’intérêt de ces modèles expérimentaux développés chez la souris SCID/Beige
avec reconstitution du système immunitaire humain chez ces animaux est exposé dans le
premier article de cette thèse (Thomsen et al Tissue Antigen 2005).
Les modèles de souris « humanisées » ont été décrits en 1988 (McCune 1988, Mosier
1988, Kamel Reid 1988). Il s’agissait de reconstituer un système immunitaire humain chez
des souris immunodéficientes. Ces modèles ont été largement utilisés dans l’étude de
l’infection à VIH et de maladies hématologiques. Une des lignées de souris les plus
intéressantes pour une reconstitution complète d’un système immunitaire humain semble être
la lignée SCID/Beige (Kamel Reid 1988). Les souris SCID/Beige, résultat du croisement
entre deux lignées mutantes, sont non seulement déficientes en cellules T et B (mutation
SCID), mais aussi en cellules « natural killer » (mutation Beige). Ces souris n’ont aucun
système immunitaire inné ou adaptatif, si bien qu’elles acceptent toute allo- ou xénogreffe
(Leblond 1997).
Ce modèle de souris « humanisées » a été adapté pour l’étude de la maladie vasculaire
chronique du greffon par une équipe de l’université de Yale (Lorber 1999). Un segment
artériel humain était implanté chez des souris qui subissaient une semaine plus tard
l’inoculation de PBMC humains (Lorber 1999). Quatre semaines après l’injection, des
lésions vasculaires chroniques étaient mises en évidence au niveau du greffon. Á ce jour et à
notre connaissance, l’équipe de Yale était la seule à avoir publié des travaux de greffes
d’artères humaines chez des souris « humanisées ».
Ce modèle comportait, toutefois, un certain nombre de limites, au premier rang
desquelles l’impossibilité de réaliser des contrôles isogreffes indispensables à la validation du
modèle, le caractère peu reproductible des greffes, l’utilisation de greffons de taille variable,
mal conservés et, par définition, pathologiques puisque prélevés sur des malades. Surtout, ce
modèle ne permettait pas de connaître le degré d’incompatibilité entre les donneurs de
greffons et de cellules dans la mesure où le typage HLA n’était pas effectué de façon
systématique chez le patient.
26
Review Article
M. Thomsen
H. Yacoub-Youssef
B. Marcheix
Key words:
alloreaction; graft vs host disease; humanized
mice; lymphoid cells; MHC; stem cells; transplantation
Acknowledgments:
Dr Anne Cambon Thomsen and Pr Michel Abbal
are thanked for critical reading of the manuscript. All surgical interventions on mice were
carried out by Mr Denis Calise. We thank Dr Talal
Al Saati, plateau technique d’histopathologie
expérimentale IFR 30, for help with histological
preparations. Houda Yacoub-Youssef is supported
by an educational grant from Novartis.
Reconstitution of a human immune
system in immunodeficient mice: models
of human alloreaction in vivo
Abstract: Rodents have been widely used for studies in transplantation
immunology because of their short reproduction period and the relative ease
of generating inbred mutant or transgenic strains. However, although many
biological mechanisms are similar between rodents and humans, several
features clearly distinguish the immune system in these species.
Consequently, it is rarely possible to extrapolate observations from rodent
models directly into clinical practice. In vitro studies with human cells are
useful for elucidation of basic mechanisms, but in order to study complex
biological phenomena, in vivo studies are indispensable. In later years, a
number of interesting models have been described where immunodeficient
mice have been reconstituted with human cells, so-called humanized mice, in
order to study human immune responses in vivo. This has opened a new field
of experimental immunology that has been applied to areas such as cancer,
autoimmunity, allergy, infections, and transplantation biology. In this review,
we shall concentrate on the use of severe combined immunodeficient mice
reconstituted with human immune or stem cells for studies of human
alloreaction in vivo.
Authors’ affiliation:
M. Thomsen,
H. Yacoub-Youssef,
B. Marcheix
INSERM U466, CHU
Rangueil, Toulouse, France
Correspondence to:
Mogens Thomsen
INSERM U466
Center Hospitalier
Universitaire de Rangueil,
BP 84225
31432 TOULOUSE Cedex 4
FRANCE
e-mail: thomsen@toulouse.
inserm.fr
An earlier review in this journal has dealt with humanized animal
models to study autoimmune diseases (1). The authors referred to
mouse strains transgenic for human genes, for example, major histocompatibility complex (MHC) genes or T-cell receptor (TCR) genes.
In our review, humanized has another meaning. Humanized mice
here designate animals into which human immune cells or human
hematopoietic stem cells have been adoptively transferred. In order
to avoid rejection of the human cells, the mice have to be immunodeficient. Several inbred strains are indeed suitable as recipients, as
shown in the following sections. One may ask why we should bother
Received and accepted for publication 28 February
2005
Copyright ! Blackwell Munksgaard 2005
doi: 10.1111/j.1399-0039.2005.00409.x
Tissue Antigens 2005: 66: 73–82
Printed in Singapore. All rights reserved
to create such complicated chimeric models. It is true that rodents
have been very useful for studies of the immune response in vivo
because of their short reproduction period and the relative ease of
generating inbred mutating or transgenic strains. However, animal
73
27
Thomsen et al : Human immune system in mice
models have their limitations. Although many biological mechan-
SCID/beige mice display in addition to the T and B deficiency of the
isms are similar in mice and humans, there are significant structural
SCID mice a severely reduced NK-cell function and phagocytosis (13).
and functional differences. For example, activated human T cells
The frequency of leakiness is lower in SCID/beige mice than in SCID
express MHC class II while this is not the case in mice (2). Another
mice and does not increase with age.
example of importance for transplantation immunology is the induc-
Another way to invalidate, at least partly, the innate immune
tion of tolerance toward allogeneic cells and tissues. This phenom-
system in SCID mice is the crossing with non-obese diabetic (NOD)
enon implies probably regulatory T cells that have been amply
mice. NOD mice display several anomalies in their immune system,
described in rodents. In vitro studies in humans have shown the
which act together to constitute the diabetes susceptibility pheno-
existence of such cells, but their induction in vivo does not seem to be
type (14). They have a particular MHC type that favors diabetes
easy, and clinical studies are difficult to carry out (3).
development. NOD/SCID mice are not diabetic but have a high
The reconstitution of a human immune system in mice allows
incidence of thymoma (15). This model was further developed by
the study of human immune reactions in vivo, and since the first report
crossing with different mice strains with targeted mutations, so-
of a successful transfer of normal human immune cells to severe
called knock-out (KO) constructs. The first one was the NOD/SCID/
combined immunodeficient (SCID) mice (4), this approach has been
b2Mnull mice (16), where the lack of b2-microglobulin (b2M) prevents
widely applied in the fields of cancer biology, autoimmunity, allergy,
the expression of MHC class I. The absence of MHC class I results in
infections, and transplantation biology (5). In this review, we will con-
a total absence of CD8þ Tab cells and hence implies a more pro-
centrate on the use of models for studies of human alloreaction in vivo.
found immunodeficiency than that of the NOD/SCID mice. The
hemochromatosis (HFE) gene is a non-classical MHC class I gene
Immunodeficient mouse strains
involved in iron transport; due to the non-expression of this gene, the
mice suffer from hemochromatosis and have a reduced life-span (17).
Table 1 summarizes an overview of some of the most used immuno-
In the NOD/SCID/gcnull strain, the g-gene of the interleukin-2 (IL-2)
deficient mouse strains. The first immunodeficient mouse model
receptor is invalidated. The g-chain is also used by the receptors for
was the athymic ‘‘nude’’ mouse, a mutant mouse strain that in
IL-4, IL-7, IL-9, and IL-15, and such mice have a profound immuno-
addition to the lack of a thymus also is hairless (6). These mice
deficiency (18). The KO gene is X-linked and corresponds to the
have in principle functional B cells and natural killer (NK) cells but
deficient gene in X-linked SCID in humans. Finally, other construc-
no T cells, and they do not produce T-dependent antibodies. A
tions have been made using strains KO for the Rag-1 gene that is
certain number of human tumors can be transplanted successfully
responsible for the VDJ recombination necessary for T- and B-receptor
into nude mice (7), but normal human cells are usually rejected.
formation. In contrast to SCID mice, Rag-1-deficient mice do not develop
X-linked immunodeficiency (XID) mice have an X-linked deficiency
leakiness. The first construction was NOD/Rag1null mice which however
of a gene essential for B-cell signaling (8). This defect corresponds to
displayed residual NK activity (19). When adding a KO for the perforin
Bruton’s agammaglobulinemia in humans. Crosses with nude mice
gene (20), the mice (NOD/Rag1null/Pfpnull) lost NK-cell cytotoxic
have been made in order to obtain mice with both T- and B-cell
function. Other strains exist with various incomplete deficiencies
deficiency (9). Later on, mice with SCID gained interest (10). Because
created by KO or knock-in technology (21), but few of these strains
of a mutation in a gene responsible for DNA repair, recombination
have been used for reconstitution with human immune cells.
of variable, diversity and joining (VDJ) segments necessary for the
generation of T- and B-cell receptors is severely inhibited. However,
Reconstitution with human immune cells
these mice have (as nude mice) a functional innate immune system
(NK cells, macrophages, and neutrophils). The DNA-repair defect is
The first successful humanization of SCID mice with immune cells
not only affecting the TCR and immunoglobulins (Ig) but is general,
was described by Mosier and coworkers in 1988 (4). After intra-
and the mice are thus relatively radiosensitive (11). Another drawback
peritoneal injection of 10–90 million of peripheral blood mononuclear
with this strain is that the block of VDJ recombination is not complete.
cells (PBMC), human T and B cells were found to be present in
A significant number of mice become ‘‘leaky’’, i.e., a residual T and B
peripheral blood of the mice, and some human macrophages were
activity may exist. The leakiness increases with age. In order to
found in lymphoid organs. Apparently, T and B cells were func-
invalidate the functional innate immune system in SCID mice, a cross-
tional: immunization of the mice with tetanus toxoid up to 20 weeks
ing was made with mice that had another mutation, the beige mice
after reconstitution resulted in a specific antibody response and an
(12). The beige mutation results in a defect in the lysosomal trafficking
in vitro T-cell proliferative response in most of the animals. Intravenous
and corresponds to the Chediak – Higashi syndrome in humans. The
injection of PBMC did not lead to immunological reconstitution.
74
28
Various immunodeficient mouse strains
Strain
Nude
Mechanism
Immune defect
Reference
Defect in the gene coding for the transcription factor Foxn1 (Chr 11).
T-cell deficiency
(6)
Thymic agenesis and lack of hair
XID
Defect in B-cell signaling due to lack of Bruton’s
Reduced antibody secretion
(8)
tyrosine kinase (Btk, chr X).
Similar to Bruton’s agammaglobulinemia in humans
Beige
NOD
Deficiency of lysosomal trafficking regulator gene (Chr 13).
Impairment of phagocytosis and cytotoxicity.
Similar to Chediak – Higashi syndrome in humans
Reduced NK-cell function
(12)
Interaction between at least 3 genes important for antigen
Autoimmune diabetes
(14)
T- and B-cell deficiency
(10)
(9)
presentation and T-cell function (Chr 3, 9, and 17)
SCID
DNA-repair defect, VDJ recombination defect due to deficiency
of the catalytic subunit of DNA-dependent protein kinase (Chr 16)
XID/Nude
Combined effect of XID and nude mutations
T- and B-cell deficiency
XID/Nude/beige
Combined effect of XID, nude, and beige mutations
T-, B-, and NK-cell deficiency
(58)
SCID/beige
Combined effect of SCID and beige mutations
T- and B-cell deficiency and reduced NK-cell function
(13)
NOD/SCID
VDJ recombination defect added to various NOD anomalies
T- and B-cell deficiency, relative NK deficiency,
(15)
no diabetes
b2Mnull (KO)
No expression of MHC class I due to lack of b2-microglobulin (b2M, chr 2)
Lack of CD8 positive Tab cells, decreased T cytotoxicity
(59)
Pfpnull (KO)
No production of perforin (Pfp) in lytic granules (deletion of
No cytolysis made by T or NK cells
(60)
Severe defect of T and NK function
(61)
No mature T and B cells
(62)
T- and B-cell deficiency, relative NK deficiency,
(16)
Pfp gene on chr 10)
gcnull (KO)
Lack of receptors for IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, and IL-15 (deletion of gene
coding for the common g-chain of the above mentioned receptors,
chr X. Similar to X-linked severe combined immunodeficiency in humans)
Rag1null (KO)
Inability to form VDJ recombination, lack of T- and B-cell receptor,
due to deletion of Rag-1 gene (chr 2)
NOD/SCID/b2Mnull
VDJ recombination defect, no MHC class I. Various NOD anomalies
no diabetes
NOD/Rag1null
Lack of VDJ recombination combined with NOD defects
No T and B cells, deficiency of NK cells
(19)
NOD/SCID/gcnull
Combined effect of SCID and gcnull on NOD background
Severe defect of T-, B- and NK-cell function
(18)
NOD/Rag1nullPfpnull
No VDJ recombination, nor perforin production þ NOD defects
No T and B cells, NK cells non-functional
(20)
NK, natural killer; NOD, non-obese diabetic; SCID, severe combined immunodeficient; XID, X-linked immunodeficiency.
Table 1
It has been shown later that intravenous injection results in rapid
When using human spleen cells, the reconstitution with B cells and
trapping and elimination of human lymphocytes in the lung tissue of
APC improved (31), in particular, when low doses of irradiation
these mice (22). In the following years, many different groups used
(2 Gy) were delivered to the mice before injection of human cells.
the SCID model humanized by PBMC and have shown its limitations
As a general rule, secondary immune responses toward nominal
(23–26). The reconstitution was very variable, probably due to a
antigens could be shown to take place. In contrast, primary immun-
functional innate immune system in the SCID mouse. The take of
ization of the mice was without effect in most cases, although some
human PBMC was improved when treating the mice with antibodies
authors claimed to obtain primary responses after immunization
toward murine NK cells, macrophages, or granulocytes (27–30).
with antigens like keyhole limpet hemocyanin (KLH) (32). It was
Although the T-cell system often was well established, the engraft-
shown that the human T cells in the mice became anergic after a
ment of B cells and antigen presenting cells (APC) was usually poor.
certain time period. Most of the human cells had an activated
75
29
phenotype, probably due to chronic stimulation by mouse xenoanti-
peripheral blood and human macrophages could be detected in the
gens (26).
spleen. The incidence of GVHD was not a problem during the first 4
SCID mice were subsequently crossed with other immunodeficient
weeks, but at higher doses of spleen cells (108 cells), several mice
strains. The SCID/beige double mutant mouse has a combined defect
died with GVHD-like symptoms, although the histology of the
of the T/B-cell system (adaptive immunity) and the innate immune
lesions was different from that observed in allogeneic combinations.
system, affecting NK cells and phagocytosing cells (13). The take of
Usually a large spleen was noted (Fig. 1), and occasionally, we saw
human PBMC is largely improved, and although human B cells are
an infiltration of human cells in tissues like liver and lungs (Fig. 2).
virtually absent from the circulation, they are present in lymphoid
In contrast, as reported by others, no particular lesions were seen in
organs, and significant levels of human IgG are found in the blood (5).
the intestines or in the skin (24).
In addition to the SCID/beige strain, the NOD/SCID mouse has
In conclusion, many immunodeficient mouse strains now exist that
been widely used for transfer of human cells. The engraftment of
can be humanized with PBMC or spleen cells. In most models, however,
NOD/SCID was further ameliorated when additional defects were
the level of engraftment is relatively low, and if high doses of cells are
introduced, for example, after crossing with mice KO for b2M (16) or
given, there is a great risk of GVHD development. Furthermore, the
the g-chain of the IL-2 receptor (18).
functional capacity of the immune system seems to diminish with time,
although some controversy exists regarding this issue. In any case, de
novo generation of lymphoid cells does not seem to take place.
Adverse effects of humanization
A general concern with all the models described was the development of a graft vs host disease (GVHD), whenever the amount of
Use of immature or stem cells for
reconstitution
human immune cells injected was above a certain level (23–25). This
In order to achieve a solid and permanent immune reconstitution and
was in particular the case with the SCID model, probably due to the
avoid the problems of GVHD, several groups have tried to use more
interaction between a functional innate immune system in the mouse
immature cells for injection. McCune and coworkers (35) trans-
and immunocompetent human cells. At lower doses of human
planted human fetal thymus and liver cells into SCID mice, but
PBMC, the human cells were rejected after some weeks while higher
few human cells were detectable in blood and lymphoid tissues of
doses resulted in massive splenomegaly with colonization by human
T and B cells in addition to an expansion of murine hematopoietic
cells (25). The GVHD was atypical in the sense that it was never
acute, and skin or intestinal symptoms were rarely noted. The
GVHD has been observed in all the humanized mouse strains cited,
but it is rather variable; some mice die with wasting symptoms after
3–4 weeks while other remain stable chimeras for many months
without particular symptoms.
An often-cited problem with the humanized mice is the development of Epstein–Barr virus (EBV)þ lymphomas. Mosier and
coworkers (4) reported that most mice receiving larger doses of
PBMC from EBVþ donors developed a lymphoproliferative disease.
However, Berney and coworkers (5) more recently compared differ-
3 cm
ent mouse strains after transfer of up to 108 human PBMC. In NOD/
SCID, NOD/SCID/b2Mnull, SCID/beige, and Rag1null mice, they found
no EBVþ lymphoma development. It has been shown that humanized NOD/SCID mice are resistant to EBVþ proliferative disease due
to the presence of human CD8þ cells. Depletion of CD8þ cells
resulted in the development of EBVþ lymphomas in most of the
mice (33). We have used SCID/beige mice and found no incidence of
lymphoma after humanization (34). After intraperitoneal injection of
30–40 " 106 cells, human T, B, and NK cells were found in
76
Fig. 1. Photomicrograph of an enlarged spleen in a severe combined immunodeficient/beige mouse that suffered from graft vs
host disease 3 weeks after intraperitoneal injection of 108 human
spleen cells. There were no skin or intestinal symptoms.
30
of SCID mice, subcutaneous nodules were formed with epidermis-like
structures (38). When autologous PBMC were given at the same time,
no alteration of the tissue was seen while allogeneic PBMC caused a
GVH reaction in the nodules which was proportional to the degree of
human leukocyte antigen (HLA) incompatibility: SCID mice injected
with skin cells and PBMC from HLA haploidentical siblings
developed only mild GVH reactions while unrelated combinations
resulted in a severe GVH reaction which could be prevented by
immunosuppressive treatment with Cyclosporine A. In another
skin graft model in humanized SCID mice, it was shown that
vascular endothelial growth factor together with interferon g
(IFNg) is responsible for an endothelial production of chemokines
attracting T cells and monocytes (39). It was also shown in humanized SCID/beige mice that non-cytolytic graft-infiltrating CD4þ
T cells specifically promote injury of allogeneic microvessels in the
skin (40). In another more recent study, the action of antibodies
toward human CD2 in humanized NOD/SCID mice grafted with
allogeneic skin was evaluated (41). It was shown that the elimination
Fig. 2. Infiltration of the mouse lung by human T cells with associated occlusions of lung vessels (immunohistochemistry staining
with an antibody towards human CD3, coupled to peroxidase,
·200).
of alloreactive T cells depended upon the action of NK cells that
bound to the Fc part of the antibodies fixed to the T cells. A last
recent example of mechanisms that can be studied is from the group
of Yale (42). Humanized SCID/beige mice with an allogeneic human
the mice after the transfer. Other similar attempts were also rather
skin graft were treated with injections of IL-11, and this cytokine
unsuccessful, but with the availability of new mouse strains with
induced an expression of a cytoprotective protein called survivin in
a more complete immunodeficiency (Table 1), the models improved.
keratinocytes and endothelial cells of the skin graft. From these
A Japanese group reported that CD34þ human cord blood cells given
examples of allogeneic skin grafts into humanized immunodeficient
intravenously into irradiated NOD/SCID/gcnull mice resulted in a
mice, it is evident that such models can be of help to elucidate
massive repopulation of lymphoid tissues with T, B, and NK cells
complex biological mechanisms implicating human cells and tissues.
(36). No human tissues were co-transplanted, and no GVHD was
One of the major problems in clinical organ transplantation is
noted. There seemed to be a generation of new T cells that became
chronic rejection. Most chronic rejections are due to vascular phe-
functionally competent. The main difficulty with such models is,
nomena: T cells from the recipient invade the arteries of the trans-
however, that it may take several months before the human immune
planted organ and provoke an inflammatory reaction (43). By
system becomes fully functional in the mouse.
mechanisms yet poorly understood, a proliferation of smooth muscle
cells takes place in the intima, which increases in size. The thickening of the intima may go on until the lumen of the artery is
Transplantation models
insufficient to ensure a correct blood flow of the organ. No efficient
treatment exists, and it was an important step forward in the under-
Immunodeficient mice reconstituted with human immune cells offer
standing of the pathology when the group of Yale published a model
a unique opportunity to study human alloreactive phenomena
of human arteries transplanted into humanized SCID/beige mice in
in vivo. Murray and coworkers (37) first showed in humanized
the place of the infrarenal aorta (44). Human T cells infiltrated the
SCID mice that human T cells were responsible for the rejection of
grafted artery and caused an intimal thickening similar to that
skin transplants from allogeneic donors. Like skin grafts performed
seen after clinical allotransplantation. No infiltration of human
among humans, the dermal microvessels were destroyed, and the
cells was seen in the murine blood vessels. For humanization,
skin became necrotic after approximately 2 weeks. Many other
3 " 108 PBMC from normal blood donors were injected intraper-
groups have confirmed the first observations and used the models
itoneally. The arteries originated from surgical procedures as
for further studies. It was for example shown that when human
by-pass operations; typically, branches of the internal mammary
epidermal cells and dermal fibroblasts were injected into the flanks
artery were used.
77
31
Our group has confirmed the findings, and we have further
tumor necrosis factor. This is in contrast to the allogeneic situation
developed the model (34). We obtained tissues and cells from cada-
where no specific stimulation of the endothelial cells is needed to
veric organ donors, after relevant institutional authorization and
provoke T-cell infiltration, although the T-cell infiltration is
informed consent from relatives. We had made the assumption that
enhanced when the endothelial cells are stimulated by for instance
a multitude of arteries with the same size as the murine infrarenal
ischemia (46). Other studies showed that infiltrating T cells in an
aorta could be dissected out from the mesentery. Indeed, ramifica-
allograft cause a vascular dysfunction due to IFNg mediated dysre-
tions of the superior mesenteric artery showed to be of a suitable
gulation of NO synthase (47).
dimension, and it was possible to graft up to 8 different mice with
A third model of allotransplantation concerns islet cells.
arteries from the same donor (Fig. 3). For the anastomosis of the
Transplantation of allogeneic islet cells has become a means of
artery, we used the rapid sleeve technique that we have introduced
treating type 1 diabetes. In order to study the rejection in human
earlier for aortic allotransplantation in mice (45). The arteries from
settings, human islet cells were transplanted under the kidney cap-
organ donors are in general of far better quality than arteries that
sule of SCID mice followed by the injection of allogeneic PBMC (48).
can be recovered after surgery for coronary arteriosclerosis. At the
The islet transplantation model has been used by many other
same time, as the segment of the mesentery, a piece of spleen was
groups, and a recent publication reports the use of NOD/Rag1null/
recovered, and if possible, bone marrow aspiration was also done.
Prf null mice humanized with PBMC and grafted by either human
6
allogeneic islets or mouse islets transgenic for an HLA class I
spleen cells gives a sufficient reconstitution to obtain circulating
molecule (49). The authors were able to show that HLA class I is
human T, B, and NK cells and circulating human IgG in SCID/
an important target for islet allograft rejection.
We have shown that the intraperitoneal injection of 30–40 ! 10
beige mice. This amount of cells is 10 times lesser than the amount
Other ways of using immunodeficient mice for studies of human
of PBMC used by the Yale group. GVHD was not a problem during
alloreaction exist; it was for example shown that SCID mice huma-
the observation period of 4 weeks, and a typical chronic rejection of
nized by PBMC from donors immunized toward HLA antigens by
the grafted artery was found at sacrifice (Fig. 4). The lymphoid
previous pregnancy mounted a very significant HLA antibody
organs were colonized by human lymphocytes, and macrophages
response after challenge by allogeneic PBMC (50). A similar model
were also found (Fig. 5). As other groups, we found that intravenous
has been used to evaluate the expression of human cytokines in
injection of the cells did not result in a reconstitution. This is in contrast
spleens of SCID mice humanized by PBMC after challenge by allo-
to the reconstitution by stem cells which are injected intravenously to
geneic PBMC or autologous PBMC plus HLA allopeptides (51). In
mice pretreated by irradiation or other conditioning regimens.
this study, the influence of immunosuppressive treatment on the
The model of transplantation of arteries into humanized mice can
phenomena was also evaluated. A more recent work concerns the
be used in many ways. The Yale group showed for example that pig
response to blood group A (52). NOD/SCID mice were humanized by
arteries grafted into humanized SCID/beige mice were only injured
PBMC from a group O individual and afterwards challenged with
when the endothelial cells expressed E-selectin after treatment with
red blood cells from group A individuals. An IgG response was
(A)
(B)
78
(C)
(E)
(D)
(F)
Fig. 3. (A) Radiophotograph of a human mesentery, showing the multiple branches of the
superior mesenteric artery (from Gray and
Henry, Anatomy of the Human Body, with permission). The section that usually is cut out for further
dissection of arteries is shown. (B) Example of a human
mesenteric artery before transplantation into a severe
combined immunodeficient/beige mouse; the segment is
about 1 cm long. (C – F) Steps of the Sleeve
anastomosis.
32
Fig. 4. Representative
photomicrographs
showing transversal sections of human mesenteric arteries 5 weeks after transplantation into
severe combined immunodeficient (SCID)/beige
mice. (A) A SCID/beige mouse humanized with
40 " 106 autologous spleen cells (Hematoxylin/Eosin,
"100). (B-D) An arterial graft in a SCID/beige mouse
humanized with 40 " 106 allogeneic spleen cells. (B) A
typical thickening of the intima is seen (Hematoxylin/
Eosin, "100). (C) Presence of smooth muscle cells in
the intima (immunostaining for a-actin, "200). (D) T
cells in the intima (immunostaining for human CD3,
"200).
(A)
(B)
(C)
(D)
demonstrated, and it was shown that the B cells responsible
Future developments
belonged to a small CD11bþ CD5þ B-cell subpopulation. The examples mentioned here show that the use of humanized mice for study-
In recent years, several groups have reported that it is possible to
ing alloreaction has been of great value for elucidating complex
achieve a very high degree of chimerism in immunodeficient mice.
in vivo phenomena involving human immune cells.
For this purpose, it is important to select mouse strains that have a
complete immunodeficiency. It is also necessary to irradiate the mice
subletally before the intravenous injection of human stem cells. The
group of Nakahata showed that results obtained in NOD/SCID/
gcnull mice were far superior to those obtained in NOD/SCID or NOD/
SCID/b2Mnull mice (36). From 3 months and onwards after intravenous
infusion of 5 " 106 human CD34þ cord blood cells, increasing concen-
trations of T, B, and NK cells were found in the circulation and in
lymphoid organs. De novo generation of human T cells seemed to occur
in the thymus of the mice, and a diverse T-cell repertoire could be
demonstrated with representation of 24 different Vb chains. No GVHD
was noted. Although it was shown that T, B, and NK cells were
functional, it was, however, not reported if the T cells were restricted
by human or mouse MHC. It is likely that a functional reconstitution
with human MHC restriction would necessitate the co-grafting of
human thymic tissue. Alternatively, it might be possible to create
immunodeficient mouse strains transgenic for human MHC. No reports
exist yet to evaluate the usefulness of mice reconstituted with stem
cells for transplantation studies. But if a normal human T-cell reper-
Fig. 5. Photomicrograph showing engraftment of human leukocytes in the spleen of severe combined immunodeficient/beige
mouse 4 weeks after intraperitoneal transfer of 40 · 106 human
spleen cells (immunostaining for human CD45, ·400).
toire could be developed, it might be feasible to investigate the possibility of inducing tolerance toward alloantigens in vivo with human
cells (3), as it has already been done in mice (53).
79
33
The role of circulating stem cells for the regeneration of different
could coexist for many weeks without any evidence for infection of
tissues has become a controversial subject. In a number of experimen-
human cells by porcine endogenous retrovirus. It remains, however,
tal transplantation models, it has been shown that recipient cells partly
to be seen whether immunosuppressive therapy would facilitate
replaced donor cells, for instance, endothelial or smooth muscle cells
retroviral infection of human cells.
(54). Likewise, after injection of CD34þ human cells into immunodeficient mice, human cells have been shown to differentiate into cardiomyocytes, endothelial cells, or smooth muscle cells after local tissue
injury in the mouse (55). Another group showed that human CD34þ
Conclusion
cells regenerate gastrointestinal epithelial cells in immunodeficient
The reconstitution of immunodeficient mice with a human immune
mice (56). The generation of different human cell types across xeno-
system has become an important tool to investigate complex bio-
geneic barriers is an interesting phenomenon, but these observations
logical phenomena in vivo involving human immune cells. After the
may also serve to further explore the potential of human progenitor
original report nearly 20 years ago where SCID mice were reconsti-
cells for the treatment of different degenerative diseases.
tuted with human PBMC, the models have improved. New mouse
Another interesting possibility for the use of humanized mice is
strains have been developed allowing a higher level of engraftment,
the study of different aspects of xenotransplantation. There is a
and the injection of human spleen cells seems to give a more
chronic shortage of human cadaveric organ donors, and many
complete reconstitution and less GVHD than the injection of
patients die on the waiting list, because no allogeneic organs become
PBMC. The transplantation models have mainly concerned three
available. It is commonly thought that the best xenogeneic donor
areas: transplantation of skin, arteries, and islet cells. In each of
would be the pork. Apart from ethical considerations, there are at
these areas, the models have given important new information on
least two major problems. One is the immunological problem,
alloreactive phenomena in vivo implying human cells. If human
namely, how to avoid the violent rejection reactions that among
CD34þ stem cells are injected intravenously into irradiated severely
other things are caused by preformed antibodies in humans. To
immunodeficient mice, the xenogeneic GVHD is completely avoided.
study immunological reactions, pig arteries have been grafted into
A near complete chimerism has been described in certain mouse
humanized SCID/beige mice, giving hints on a number of important
strains with de novo generation of different compartments of the
mechanisms (46). The second problem is the risk of transfer of
immune system. It will be interesting to see if these models allow
endogenous retrovirus from the pork to the human host. NOD/
obtaining a functional T-cell system restricted to human MHC. Such
SCID mice transgenic for certain porcine cytokines were trans-
models could be used to further explore the possibilities of manipu-
planted by porcine bone marrow cells and human fetal thymus and
lating the human immune system to create tolerance toward allo-
liver tissues (57). It was shown that human cells and porcine cells
geneic cells.
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36
7 Objectifs des travaux
Le but de ces travaux expérimentaux était de développer un modèle d’étude de la
maladie vasculaire chronique du greffon consistant à effectuer une greffe d’un segment
d’artère mésentérique supérieure humaine issu de donneurs d’organes chez la souris
SCID/Beige humanisée.
Ceci sous-entendait la réalisation de quatre objectifs :
- mettre en place un protocole de prélèvement à visée scientifique chez les donneurs
d’organes pour obtenir, à la fois, des greffons vasculaires et des cellules de bonne qualité et en
grande quantité.
- optimiser la reconstitution du système immunitaire humain chez la souris
SCID/Beige en utilisant des splénocytes et des cellules médullaires potentiellement plus
intéressants que les PBMC.
- mettre au point la greffe de collatérales terminales d’artères mésentériques
humaines chez la souris en utilisant une technique d’anastomose originale, rapide et
reproductible : la technique «Sleeve ».
- reproduire des lésions de maladie vasculaire chronique et proposer une
évaluation qualitative et quantitative de ces lésions.
37
Deuxième Partie
Travaux Expérimentaux
38
1 MATERIELS ET METHODES
1.1 Patients
1.1.1 Protocole de prélèvement à fins scientifiques
Après autorisation de l’Etablissement Français des Greffes et avis favorable du
Comité d’Éthique des Hôpitaux de Toulouse, un protocole de prélèvement de tissus humains,
à fins scientifiques chez les donneurs d’organes, a été mis en place à l’échelle régionale. Ce
protocole a été organisé en collaboration avec les services de Coordination de Prélèvements
d’Organes et de Tissus (Dr BOUDET), d’Urologie (Pr. RISCHMANN) et de Chirurgie
Thoracique et Cardio-vasculaire (Pr. CERENE) du C.H.U. de Toulouse.
Ces prélèvements étaient pratiqués au cours des prélèvements multi organes à fins
thérapeutiques, sous réserve d’une non inscription du donneur au Registre National des Refus
pour les prélèvements à fins scientifiques et du recueil d’un consentement « explicite » de
l’entourage (Lois de Bioéthique, Art. L. 1232 – 1 à 5).
1.1.2 Prélèvements de cellules et de greffons vasculaires humains
La moelle osseuse était prélevée après installation du donneur en salle d’opération, par
ponction sternale à l’aide d’un trocart à myélogramme. Elle était conservée dans des tubes
héparinés stériles dans une glacière à 4°C.
La technique opératoire du prélèvement multi organes n’était pas modifiée par le
prélèvement à fins scientifiques. La seule contrainte était liée à la nécessité de perfusion du
mésentère et de la rate par la solution de préservation et donc de ne pas ligaturer les artères
mésentérique supérieure et splénique avant clampage et perfusion du donneur.
Une partie du mésentère (correspondant à environ deux mètres de jéjunum) et la partie
de la rate, non utilisée pour les examens de laboratoire, étaient prélevées après explantation
des différents greffons (Fig. 1.A, B, C). Elles étaient conservées dans une glacière à 4°C, dans
des récipients stériles contenant une solution de conservation identique à celle utilisée pour la
perfusion du donneur.
L’équipe de recherche avait accès à l’ensemble des documents relatifs aux
donneurs sous couvert du secret médical : typage ABO, HLA, sérologies virales, examens
bactériologiques et dossier de l’Etablissement Français des Greffes.
39
A
C
B
D
E
Figure 1 : Mésentère humain et collatérales terminales de l’Artère
Mésentérique Supérieure
A. Vue per-opératoire d’un mésentère humain et représentation de
la zone prélevée (trait pointillé).
B. Représentation d’une opacification de l’artère mésentérique supérieure :
visualisation de la ramification du réseau artériel terminal
(d’après Grays Anatomy).
C. Pièce prélevée.
D. Dissection des collatérales terminales de l’artère mésentérique et
coloration au bleu Trypan (Vue microscopique x18).
E. Comparaison du calibre d’une collatérale terminale de l’artère
mésentérique supérieure humaine (à gauche), d’une aorte de souris
(à droite), et d’un cathéter de ! de millimètre de diamètre (au centre).
(Vue microscopique x18)
40
1.2 Animaux
1.2.1 Souris CB.17 SCID/Beige
Des souris CB.17 SCID/beige (Taconic, Danemark), âgées de 8 à 12 semaines, ont été
utilisées en expérimentation. Les protocoles d’expérimentation pratiqués chez ces souris ont
été approuvés par le Comité Régional d’Éthique pour l’Expérimentation Animale.
Un élevage a été mis en place au sein d’une unité protégée (EOPS) du service de
zootechnie de l’Institut Fédératif de Recherche Toulouse-Rangueil. Les animaux étaient
placés dans des cages à couvercle filtrant et ventilées en surpression. De l’eau filtrée et des
aliments autoclavés irradiés leur étaient fournis à volonté.
1.2.2 Dépistage des souris « Leaky »
Avant toute expérimentation, un dosage des immunoglobulines murines résiduelles
était pratiqué par technique ELISA sur un échantillon de sang périphérique obtenu par
ponction du sinus rétro-orbitaire.
Les plaques ELISA utilisées étaient des plaques 96 puits Maxisorb (Nunc).
L’anticorps primaire était un anticorps polyclonal de chèvre anti-immunoglobulines de souris
(BD). L’anticorps secondaire était un anticorps de chèvre anti-immunoglobulines de souris et
couplé à la peroxydase (BD). Le substrat était un mélange TMB/H2O2 (SFRI Diagnostics). La
gamme était réalisée à partir de différentes dilutions d’un sérum de souris sauvage dont la
concentration en immunoglobulines était connue (64mg/l). Le contrôle négatif (blanc) était
réalisé en l’absence de sérum de souris et saturation par la BSA 1%. Les plaques étaient
analysées par un lecteur de densité optique à 450 nm (Dynatech ImmunoEssay System).
Ce test de « leakyness » permettait d’identifier les souris « leaky », c'est-à-dire ayant
un taux résiduel d’immunoglobulines murines supérieur à 3 µg/ml.
1.3 Reconstitution d’un système immunitaire humain chez la souris CB.17
SCID/Beige
1.3.1 Préparation des cellules humaines
Les splénocytes étaient obtenus par injection de RPMI 1640 Glutamax (Invitrogen)
dans le tissu splénique puis par écrasement des fragments de rate.
Les cellules spléniques et cellules médullaires étaient lavées dans du RPMI et
comptées sur lames de Malassez après coloration au bleu Trypan.
Les cellules étaient ensuite soit utilisées à l’état frais, soit congelées en azote liquide
dans une solution de RPMI 10% SVF (Biomedia) - 10% DMSO (Sigma).
41
1.3.2 Stratégie expérimentale
Des souris mâles ou femelles ont été réparties en 9 sous-groupes permettant une étude
de la reconstitution d’un système immunitaire humain à partir de différentes quantités de
cellules spléniques ou médullaires : 5, 10, 20, 30, 40, 50 ou 100 millions de cellules
spléniques et 5 ou 10 millions de cellules médullaires.
Des souris étaient sacrifiées au 35ème jour, d’autres étaient suivies à moyen et à long
terme.
1.3.3 Procédure d’ « humanisation »
Les cellules fraîches ou décongelées étaient resuspendues dans une solution de PBS,
puis comptées après coloration au bleu Trypan pour évaluer leur viabilité. Les cellules
colorées en bleu étaient des cellules mortes, elles étaient donc exclues.
Splénocytes ou cellules médullaires étaient injectées aux souris par voie intra
péritonéale dans 500µl de PBS.
1.3.4 Suivi et évaluation in vivo de la reconstitution
1.3.4.1 Suivi des animaux
Les souris « humanisées » étaient surveillées quotidiennement (tonicité, aspect du
poil). Elles étaient pesées chaque semaine.
Les souris hypotoniques présentant un amaigrissement de plus de 10% du poids du
corps ou présentant un tableau évocateur de maladie du greffon contre l’hôte étaient sacrifiées
dès l’apparition des signes.
1.3.4.2 Typage cellulaire par cytométrie en flux
Un typage des cellules humaines circulantes était pratiqué chaque semaine par
cytométrie en flux, à partir d’un échantillon de sang périphérique (100 à 200 µl) prélevé par
ponction du sinus rétro-orbitaire.
Un triple marquage du culot cellulaire frais était pratiqué par trois anticorps couplés à
trois fluorochromes différents. Les lymphocytes T humains étaient marqués par un anticorps
anti-CD3-FITC (Immunotech, Beckman Coulter), les lymphocytes B humains par un anticorps
anti-CD19-APC (Dako) et les leucocytes murins étaient marqués par un anticorps anti-CD45PE (Immunotech Beckman Coulter). Les contrôles positifs étaient des splénocytes humains, et
des mélanges de sang de souris SCID/Beige non humanisée et de splénocytes humains. Les
contrôles négatifs étaient du sang de souris SCID/Beige non humanisée et des contrôles
isotypiques de chaque anticorps marqué.
La fluorescence de chaque échantillon était analysée par cytométrie en flux (FACS
Calibur, Becton Dickinson). (Fig.2.A à F)
42
B
C
CD45-PE
CD45-PE
SSC-Height
A
FSC-Height
D
CD3-FITC
F
CD19-APC
CD45-PE
CD19-APC
E
CD3-FITC
CD3-FITC
CD19-APC
CD3-FITC
H
CD45-PE
CD19-APC
G
CD3-FITC
CD3-FITC
Figure 2 : Cytométrie en flux
Examens des populations CD3 et CD19 humaines dans le sang
circulant de souris SCID/Beige humanisées.
A à F : Contrôles
A. Diagramme Taille/granulosité :
Population d’étude dans la fenêtre
B. Splénocytes humains
+ Ac anti-CD3 humain marqué FITC
C. Splénocytes murins
+ Ac anti-CD45 murin marqué PE
D. Splénocytes humains
+Ac anti-CD19 humain marqué APC
E. Splénocytes humains
+ Ac anti-CD19 humain marqué APC
F. Sang de souris SCID/Beige
+Splénocytes humains
+Ac anti-CD3 humain marqué FITC
+Ac anti CD19 humain marqué APC
G,H : Sang de souris SCID/Beige humanisées
G,H. CD3=17,16%
CD19=9,07%
CD45 = 29,19%
43
1.3.4.3 Dosage des immunoglobulines G humaines
Un dosage des immunoglobulines humaines était pratiqué chaque semaine sur le
sérum de chaque souris humanisée par technique ELISA.
Les plaques ELISA utilisées étaient des plaques 96 puits Maxisorb (Nunc).
L’anticorps primaire était un anticorps polyclonal de lapin anti-IgG humaines (Dako).
L’anticorps secondaire était un anticorps polyclonal anti-IgG de lapin couplé à la peroxydase
(Dako). Le substrat était un mélange TMB/H2O2 (SFRI Diagnostics). La gamme était réalisée
à partir de différentes dilutions d’un sérum humain de concentration en IgG connue (5,56g/l).
Le contrôle négatif (blanc) était l’absence de sérum et saturation par la BSA1%.
Les plaques étaient analysées par un lecteur de densité optique à 450 nm (Dynatech
ImmunoEssay System).
1.3.5 Évaluation post mortem de l’humanisation
1.3.5.1 Sacrifice des animaux
Les animaux étaient anesthésiés à l’Isoflurane®. Un lavage péritonéal au sérum
physiologique était pratiqué avant laparotomie. L’animal était ensuite euthanasié par injection
d’une dose létale de barbiturique (Pentobarbital sodique 6%, Sanofi Santé Animale) dans la
veine cave inférieure.
La rate, les ganglions mésentériques, le thymus et les fémurs étaient prélevés. La
moitié de ces tissus était conservée dans une solution de Formol tamponnée à 10%, puis dans
de l’alcool à 70% avant d’être incluse en paraffine. L’autre moitié était broyée, les cellules
lavées dans du PBS puis congelées à -80°C dans une solution de RPMI 10% SVF (Biomedia)
- 10% DMSO (Sigma).
Du foie, du pancréas, de la peau et un fragment de jéjunum étaient prélevés et
conservés dans une solution de Formol tamponnée à 10%, puis dans de l’alcool à 70% avant
d’être inclus en paraffine.
Les cellules de la rate, des ganglions mésentériques, du thymus et de la moelle osseuse
des souris humanisées sacrifiées étaient analysées par cytométrie en flux.
Les cellules de chaque organe étaient réparties dans différents tubes et marquées par
différents anticorps couplés à différents fluorochromes. Les lymphocytes T humains étaient
marqués par un anticorps anti-CD3-FITC (Immunotech, Beckman Coulter) ou par un
anticorps anti-CD3-PE (BD) dans le cas d’un marquage concomitant par les anticorps antiCD4-FITC (Dako) et anti-CD8-APC (Dako). Les lymphocytes B humains étaient marqués
par un anticorps anti-CD19-APC (Dako). Les cellules NK étaient marquées par un anticorps
44
anti-CD56 PE (Dako). Les contrôles positifs étaient des splénocytes humains. Les contrôles
négatifs étaient des cellules d’organes de souris SCID/Beige non humanisées.
Chaque échantillon était analysé par cytométrie en flux (FACS Calibur, Becton
Dickinson).
1.3.5.3 Histologie standard
Un examen histologique standard de la rate, du thymus, et des ganglions était pratiqué
après coloration Hematoxyline/Éosine.
1.3.5.4 Immunohistochimie
La rate, le thymus et les ganglions prélevés étaient examinés en immunohistochimie
suivant le protocole Labelled Streptavidin Biotin (Dako).
Les anticorps utilisés étaient un anticorps polyclonal de lapin anti-CD3 humain
(Microm), des anticorps monoclonaux de souris anti-CD45 (Dako), anti-CD45RO (Dako) et
anti-CD19 humains (Dako). Les tests positifs étaient des coupes de rate humaine. Les
contrôles négatifs étaient des tissus de souris SCID non humanisées.
1.3.6 Recherche de lésions de maladie du greffon contre l’hôte
Un examen histologique standard de la peau, de l’intestin grêle et du parenchyme
hépatique était pratiqué après coloration Hematoxyline-Eosine à la recherche de lésions
caractéristiques.
1.3.7 Recherche d’infection
Pour les animaux suspects d’infection, des hémocultures en milieux aéro- et anaérobie
étaient pratiquées systématiquement (Service de Bactériologie du C.H.U., Pr CHABANON).
45
1.4 Étude de la maladie vasculaire chronique du greffon
1.4.1 Technique de greffe
Il s’agissait de remplacer l’aorte sous rénale de la souris par un fragment d’artère
mésentérique humaine de même calibre. Les collatérales distales de l’artère mésentérique
supérieure étaient disséquées sous microscope dans l’unité de microchirurgie. Seuls les
segments de 7 à 8 mm de long et de 0,25 à 0,5 mm de diamètre étaient utilisés. (Fig.1C,D,E)
L’intervention était pratiquée sous anesthésie générale par injection d’une solution de
Kétamine/Xylazine/Atropine par voie intra péritonéale, complétée par une anesthésie gazeuse
à l’Isoflurane®. La souris était placée sur un plan de travail chauffant.
La voie d’abord était une laparotomie médiane xypho-pubienne. L’intervention était
pratiquée sous microscope opératoire (Karl KAPS, grossissement 18 fois). L’aorte était
disséquée des artères rénales à l’artère mésentérique inférieure, puis clampée par 2 ligatures
de fil de soie tressé 7/0 (Peters) et sectionnée dans sa portion médiane. Le greffon était
interposé entre les deux portions de l’aorte. Les anastomoses étaient réalisées au
monofilament 11/0 (Sinus Point AG Switzerland) selon la technique « Sleeve » [28],
consistant en une invagination de l’aorte de souris dans le greffon à la partie proximale et du
greffon dans l’aorte de souris à la partie distale (Fig.3A,B,C). L’étanchéité était assurée par
deux points de suture transfixiants, proximal et distal.
La visualisation d’un flux à travers la paroi du greffon était un bon signe de
perméabilité du greffon. Après vérification de l’hémostase, rinçage de la cavité péritonéale au
sérum chaud, la fermeture s’effectuait en deux plans. La souris opérée était placée au calme,
sous lampe chauffante, jusqu’à son réveil complet. Une récupération rapide et l’absence de
paralysie du train arrière confirmaient la perméabilité du greffon. Dans le cas contraire, les
animaux étaient anesthésiés et sacrifiés.
Un fragment adjacent à la collatérale d’artère mésentérique supérieure humaine
utilisée pour la greffe était prélevé à la fin de chaque intervention et conservé dans une
solution de Formol de façon à connaître l’état de l’artère au moment de la greffe.
46
- Dissection de l’aorte et
de la veine cave inférieure.
A
-Clampage de l’aorte par
2 fils de soie 7/0.
-Mise en place du greffon
mésentérique humain dont
le calibre est superposable
à celui de l’aorte de souris.
B
-Schématisation de la
Technique « Sleeve »
(à gauche)
-Cliché avant déclampage
(à droite)
- Cliché après déclampage
C
- Le greffon est perméable
Figure 3 : Schémas et clichés per opératoires représentant la greffe d’une
collatérale d’artère mésentérique humaine en position aortique sous rénale
chez la souris SCID/Beige. Les clichés sont des vues microscopiques (x18)
47
1.4.2 Stratégie expérimentale
Les souris greffées étaient réparties en 4 groupes :
- Groupe « Leaky » : souris « leaky » greffées non « humanisées ».
- Groupe « Contrôle » : souris non « leaky » greffées non « humanisées ».
- Groupe « Isogénique » : souris non « leaky » greffées puis « humanisées » avec les
cellules du même donneur.
- Groupe « Allogénique » : souris non « leaky » greffées puis « humanisées » avec les
cellules d’un autre donneur plus ou moins incompatible.
Les souris greffées et humanisées recevaient une injection de 30 millions de
splénocytes par voie intra péritonéale au 7ème jour post-opératoire.
1.4.3 Sacrifice des souris greffées
Les souris greffées étaient sacrifiées au 35ème jour post-opératoire. Les modalités du
sacrifice étaient les mêmes que pour le groupe des souris simplement humanisées.
Du sérum était prélevé pour effectuer un test de « leakiness » après sacrifice. Il
s’agissait de s’assurer que les souris n’étaient pas devenues leaky en cours d’expérimentation.
Le dosage d’Ig murines était effectué par technique ELISA suivant le protocole décrit au
paragraphe concernant la sélection des animaux (§2.2.2.).
En plus des prélèvements des différents tissus murins détaillés au paragraphe 2.3.5.1.,
le greffon mésentérique humain était explanté en prenant soin de prélever les deux zones
anastomotiques. Il était ensuite fixé (en position rectiligne) sur un morceau de polystyrène à
l’aide de deux aiguilles, puis rapidement congelé en azote liquide après inclusion dans du
Tissu-Tek® (Miles).
1.4.4 Traitement des greffons
Des coupes sériées transversales de 10 µm d’épaisseur étaient réalisées au cryostat sur
toute la longueur des greffons congelés (soit environ 8 mm). Une coupe sur dix était
conservée pour l’analyse histomorphométrique après coloration Hématoxyline/Éosine (soit 80
coupes pour 8 mm). Les autres coupes étaient conservées pour les études histologiques.
1.4.5 Histologie standard
Les coupes étaient examinées en histologie standard après coloration Hématoxyline
Eosine.
1.4.6 Immunohistochimie et évaluation qualitative des lésions
Les greffons étaient examinés en immunohistochimie suivant le protocole Labelled
Streptavidin Biotin (Dako).
48
Les anticorps utilisés étaient un anticorps monoclonal de lapin anti-CD3 humain
(Microm) et un anticorps monoclonal de souris anti-alpha-actine de muscle lisse (Sigma).
1.4.7 Histomorphométrie et évaluation quantitative des lésions
L’acquisition de chaque coupe sériée s’effectuait par une caméra. Le logiciel
Cyberview 3 nous permettait d’effectuer des mesures de périmètres (de la lumière, de
l’intima, de la média et de l’adventice) permettant le calcul de rayons (Fig.4A).
À partir de ces périmètres, une modélisation du profil longitudinal du greffon était
effectuée (Fig.4B). Différents paramètres étaient calculés pour une évaluation quantitative des
lésions vasculaires chroniques (Fig.4C).
Le pourcentage d’obturation correspondait au rapport de la circonférence de la
média moins la circonférence de la lumière sur la circonférence de la média multiplié par 100.
Le pourcentage d’obturation était calculé pour chaque coupe, le pourcentage d’obturation
moyen par coupe pouvait en être déduit.
L’index néointimal correspondait au rapport de l’aire de la néointima sur la somme
des aires de la lumière et de la néointima multiplié par 100. L’index néointimal était calculé
pour chaque coupe, l’index néointimal moyen par coupe pouvait en être déduit.
Le volume de la néointima entre chaque coupe (séparées de 10µm) était calculé en
l’assimilant à la soustraction des volumes de deux cônes tronqués, l’un délimité par la
limitante élastique interne, l’autre la face luminale de la néointima. Le volume total était la
somme de ces différences, un volume intimal moyen par coupe pouvait en être déduit.
Le rapport « Volume/obturation » correspondait au rapport du volume de la
néointima sur la somme des volumes de la lumière et de la néointima multiplié par 100. Le
rapport « Volume/obturation » par coupe pouvait en être déduit.
Nous avons retenu comme critère d’évaluation des lésions le volume intimal moyen
par coupe exprimé en µm3/coupe.
1.5 Méthode statistique
Le test de t de Student était utilisé pour l’analyse statistique.
49
Média
LEE
R
r
Néointima
Lumière
=
LEI
LEE : Limitante élastique externe
LEI : Limitante élastique interne
#$!%""
!""
?
!"#$%&'()*&+,-".(#$)(/"'+0+(Rmoyen-rmoyen)/Rmoyen
1',&2+'3"/'(/4)5 0
Aire néointimale/
aire du disque délimité par la LEI
6"5#4&+/'(/4)5+("()5+0+
Somme de Soustractions de Volume de cônes tronqués
H=100µm
R11
r11
R22
6cône tronqué0ABC!DEFGH$GHF$I
r22
F)::"$(+,&+J"5#4&;
@
Rapport Volume de la néointima B
(Volume de la néointima+volume de la lumière)
7/*#$&+8+9 !$/'%/:&;+,&+5-</;("4"$:<"43($/&
=> Coupe transversale d’un greffon, délimitation des périmètres des différentes
régions histologiques et mesure des périmètres.
?> Modélisation longitudinale d’un greffon.
@> Calculs des différents paramètres.
50
2 RÉSULTATS
2.1 Prélèvements de tissus humains
Huit prélèvements de tissus humains à fins scientifiques ont été pratiqués sur des
donneurs d’organes de décembre 2003 à juillet 2004. Sept prélèvements ont été effectués au
sein des Hôpitaux de Toulouse, un à l’hôpital de Tarbes. Les principales caractéristiques des
différents donneurs sont indiquées dans le tableau 1.
La préparation des rates et de la moelle osseuse a permis d’obtenir respectivement
entre 12 et 18 milliards de splénocytes et entre 1,3 et 2,5 milliards de cellules médullaires
pour chaque donneur.
Nous avons estimé à une cinquantaine le nombre de greffons identiques et de calibre
superposable à celui de l’aorte de souris qui pourraient être disséqués à partir du segment de
mésentère prélevé correspondant à une longueur approximative de 2 mètres de jéjunum
(Fig.1.D,E).
Le recours à un protocole de prélèvement de tissus humains à visée scientifique chez
les donneurs d’organes a permis d’obtenir des greffons vasculaires, des cellules spléniques
et médullaires en grand nombre, de bonne qualité et dont nous connaissions le typage ABO
et HLA.
2.2 Sélection des animaux
Deux cent une souris ont subi un test de « leakyness ».
Cinquante-huit souris (28,85%) avaient un taux d’immunoglobulines murines totales
supérieur à 3µg/ml, elles étaient considérées comme « leaky ». Quatre de ces souris ont été
incluses dans le groupe des greffes « Leaky » (souris greffées non humanisées). Les autres
souris « leaky » ont servi pour l’entraînement chirurgical ou de contrôles négatifs pour les
cytométries en flux.
Cent quarante trois souris (71,15%) avaient un taux d’immunoglobulines murines
totales inférieur à 3µg/ml. Ces souris ont été réparties entre les différents groupes
d’expérimentation (humanisation et greffe) et la zone d’élevage pour constituer un noyau de
couples reproducteurs sélectionnés.
Le « test de leakiness » systématiquement pratiqué a permis d’éliminer un tiers des
souris, celles-ci possédaient un système immunitaire murin résiduel.
51
Tableau 1 : Principales caractéristiques des différents donneurs.
Donneur
Age
Sexe
Taille/Poids
Cause du décès
Antécédents
n°1
44 ans
M
170/60
TC
\
n°2
56 ans
F
165/75
AVC
Surpoids
n°3
61 ans
M
168 / 80
Autolyse
\
n°4
42 ans
M
180/85
AVC
\
n°5
42 ans
M
172/105
AVP
Surpoids
HTA
n°6
30 ans
M
180/75
AVC
\
Traitement
Aucun
Aucun
Aucun
Aucun
Aucun
Aucun
Groupe ABO/ Rhésus
Groupe HLA A
Groupe HLA B
Groupe HLA DR
Groupe HLA DQ
Sérologie CMV
Sérologie EBV
Arrêt Cardiaque
Collapsus
CIVD
Oligo anurie
Biologie
Hemodynamique
Drogues
Remplissage
Date de clampage
Heure de clampage
Liquide de perfusion
Constat per op
B+
A3,A11
B7
DRB1*13,15
DQB1*03,06
Neg
Pos ancienne
Non
Non
Non
Non
Normale
Stable
NAD 2,5mg/h
Non
23/12/03
1H25
EuroCollins
\
A+
A2,A68(28)
B52(5),B57(17)
DRB1*11,11
DQB1*03,03
Pos ancienne
Pos ancienne
Non
30 minutes
Non
Non
Normale
Stable
NAD 0,8mg/h
Non
04/02/04
1H15
EuroCollins
\
O+
A2,A11
B35,B62(15)
DRB1*01,13
DQB1*05,06
Pos ancienne
Pos ancienne
Non
Non
Non
Non
Normale
Stable
NAD 0,7mg/h
Colloïdes
04/02/04
11H30
EuroCollins
\
B+
A1,A34(10)
B7,B44(12)
DRB1*01,04
DQB1*03,05
Pos ancienne
Pos ancienne
Non
Non
Non
Non
Normale
Stable
NAD 2,5mg/h
Colloïdes+HEA
23/02/04
7H20
Viaspan
\
A+
A2,A26
B35,B55
DRB1*11,14
DQB1*03,05
Neg
Pos ancienne
Non
Non
Non
Non
Normale
Stable
NAD 1,8mg/h
Colloïdes
04/03/04
3H10
Viaspan
\
A+
A23(9),A24(9)
B45(12),B51(5)
DRB1*0103,04
DQB1*05,04
Neg
Pos ancienne
Non
Non
Non
Non
Normale
Stable
NAD 2mg/h
Non
27/03/04
5H40
Viaspan
Bicuspidie
aortique
n°7
57 ans
M
180/85
AVP
Tabagisme
Coronarien
Beta-bloquant
Aspirine
Dérivé Nitré
OA3,A11
B7,B38
DRB1*15,13
DQB1*06,06
Pos ancienne
Pos ancienne
Non
Non
Non
Non
Normale
Stable
NAD 0,75mg/h
Non
12/05/04
7H05
Viaspan
Athérome diffus
n°8
42 ans
M
180/80
TC
\
Aucun
A+
A1,A2
B8,B18
DRB1*03,07
DQB1*02,02
Pos ancienne
Pos ancienne
Non
Non
Non
Non
Normale
Stable
NAD 3,5 mg/h
PFC et Colloïdes
28/06/04
22H40
Viaspan
Liste des abréviations :
TC : Traumatisme crânien
AVC : Accident Vasculaire Cérébral
AVP : Accident de la voie publique
HTA : Hypertension artérielle
Neg : Sérologie négative
Pos ancienne : Profil sérologique d'une infection ancienne
CIVD : Coagulation Intra Vasculaire Disséminée
NAD : Noradrénaline
HEA : Hydroxyéthylamidon
PFC : Plasma Frais Congelé
52
2.3 Reconstitution d’un système immunitaire humain chez la souris CB17.
SCID/Beige à partir de splénocytes humains
Le second article de cette thèse est la publication des résultats de la reconstitution du
système immunitaire humain chez la souris CB17.SCID/Beige (Yacoub et Marcheix
2005).
Soixante et onze souris ont été humanisées à partir de cellules de huit donneurs
différents. Cinquante-neuf souris ont été humanisées à partir de splénocytes, douze souris à
partir de cellules médullaires. Les cellules de 2 à 3 donneurs différents ont été utilisées dans
chaque groupe. Les principales caractéristiques des différents groupes d’humanisation sont
indiquées dans le tableau 2.
La durée moyenne du suivi des souris ayant subi une injection de cellules spléniques a
été de 81,09 jours (+/-24,26). Il s’agissait d’un suivi « clinique » quotidien et d’un
prélèvement sanguin hebdomadaire.
2.3.1 Cinétique de la reconstitution dans le sang périphérique
2.3.1.1 Lymphocytes T humains circulants
Un système immunitaire humain était considéré comme reconstitué pour un taux de
cellules humaines CD3+ circulantes dans le sang périphérique supérieur ou égal à 0,5% de la
population lymphocytaire totale [23].
Les pourcentages de souris humanisées dans les différentes conditions et les valeurs
extrêmes du taux de cellules CD3+ humaines ont été évalués par cytométrie en flux
(Fig.2.G,H et tableau 2).
2.3.1.1.1 Reconstitution à court et moyen termes
L’étude de la maladie vasculaire chronique nécessitant une période d’humanisation de
4 semaines, nous nous sommes intéressés aux résultats précoces de l’injection de splénocytes
humains.
La figure 5A représente le pourcentage de souris humanisées en fonction de la dose de
splénocytes injectée au cours des 4 semaines suivant l’injection. Dans les groupes 5 et 10
millions de splénocytes, le pourcentage de souris reconstituées a toujours été inférieur à 50%.
A partir de 30 millions de cellules, il atteignait 80% au 14ème jour puis déclinait à 40% à un
53
Tableau 2 :
Dose de splénocytes
n
Nb décès\Date (28 j)
Nb sacrifice\ Date (28j)
Suivi moyen (jour)
Médiane du suivi
Nb donneurs
7 jours
14
21
28
35
63
91
119
147
Mortalité < 5sem.
Mortalité > 5sem.
Résultats de la reconstitution d'un système immunitaire humain par des splénocytes
5 millions
10 millions
6
0
1
J35
120,4 +/- 35,14
112
2
%
0
0
16,6
50
66,6
0
0
0
0
Nb
0|6
0|6
1\6
3\6
4\6
0\5
0\4
0\2
0\2
0%
20%
20 millions
8
6
0
2 \ J30,37
1
J35
1
J35
98,87 +/- 45,74
65,33 +/- 39,02
91
52,5
2
3
% : Pourcentage de souris humanisées
%
Nb
%
Nb
0
0\8
17
1\6
50
4\8
\
\
25
2\8
100
6\6
12,5
1\8
100
6\6
75
6\8
100
5\5
75
3\4
50
1\2
50
2\4
100
2\2
100
2\2
\
\
100
2\2
\
\
16%
16%
16%
33%
30 millions
5 (et 18 greffées)
3 \ J14,14,54
0\5
(18\18)
93,8 +/- 43,6
77
3
%
30,4
82,6
66,6
44,4
40
75
100
50
\
Nb
7\23
19\23
12\18
8\18
2\5
3\4
2\2
1\2
\
9%
13,40%
40 millions
50 millions
100 millions
5
7
4
\ J44 J65
5 \ J15,23,26,31,36
1 \ J45
0
0
0
74,2 +/- 31,15
49 +/- 43,53
66,5 +/- 21
70
28
77
3
3
2
Nb : Nombre de sourishumanisées/Nombre total de souris
%
Nb
%
Nb
%
Nb
40
2\5
71
5\7
50
2\4
80
4\5
71
5\7
100
4\4
80
4\5
100
6\6
100
4\4
60
3\5
100
4\4
100
4\4
80
4\5
100
3\3
100
4\4
100
2\2
0
0\2
66,7
2\3
100
1\1
0
0\2
\
\
\
\
\
\
\
\
\
\
\
\
\
\
0%
57,14%
25%
40%
71,42%
25%
2
54
mois. Dans les groupes 50 et 100 millions de cellules, il atteignait 100% respectivement au 14
et au 21ème jour.
La figure 5B est un exemple de cinétique de reconstitution d’un système immunitaire
cellulaire humain. La courbe représente la moyenne du taux de cellules humaines CD3+
pendant les 4 semaines suivant l’injection de 30 millions de splénocytes. Nous avons observé
une reconstitution progressive de la population T avec un pic à 3 semaines. Le taux de
cellules humaines CD3+ était supérieur ou égal à 0,5% du 14ème au 42ème jours après injection.
Les valeurs élevées des écarts types, comprises entre 0,24 (à 4 semaines) et 1,04 (à 6
semaines) indiquent une variabilité des taux de cellules humaines CD3+ en fonction des
donneurs. La figure 5C illustre cette variabilité en fonction des donneurs, elle représente
l’évolution du taux de cellules humaines CD3+ en fonction du temps pour trois groupes de
souris ayant reçu 30 millions de splénocytes mais de trois donneurs différents.
L’utilisation de splénocytes humains chez la souris SCID/Beige a permis une
reconstitution d’une population lymphocytaire T humaine pendant les 6 semaines suivant
l’injection.
La reconstitution a été précoce pour des doses de splénocytes supérieures ou égales
à 30 millions de cellules puisque au moins 80% des souris étaient humanisées dès le 14ème
jour après l’injection.
Le pourcentage de souris reconstituées augmentait avec la dose de splénocytes
injectée.
La reconstitution était variable en fonction des donneurs.
2.3.1.1.2 Reconstitution à long terme
Sur 38 souris humanisées par des splénocytes et suivies à long terme, 5 souris ont été
humanisées pendant plus de 10 semaines consécutives, soit un taux de réussite de
reconstitution prolongée de 13,15%. Les caractéristiques de ces 5 souris sont décrites dans la
figure 5D.
Quelle que soit la dose de splénocytes injectée, les 33 autres souris n’ont pas été
humanisées de façon prolongée.
Une reconstitution stable et à long terme d’un système immunitaire humain n’a été
observée que pour 13,15% des souris ayant reçu une injection de splénocytes.
L’injection de splénocytes n’a pas permis une reconstitution stable et à long terme
d’un système immunitaire humain.
55
10 0
80
5M
60
10M
30M
40
40M
50M
20
100M
0
1
2
3
B
2 2
2
1,5 1,5
1,5
1 1
1
0,5
0,5
0,5
0
0
0 0
0
1
1
1
2
2
2
3
3
3
4
4
5
4
5
Temps en semaines
D
4
Temps en semaines
5
6
6
6
% cellules humaines CD3+
% de souris ayant un taux
de cellules humaines CD3+> 0,5%
A
C
2,5
2
1,5
1
0,5
0
1
2
3
4
Temps en semaines
Dose
injectée
Donneur
n°
Humanisée
du /au
Durée en
semaines
CD3
%min \ %max
5M
2
J28 à J161
20
0,58 \ 15,2 %
5M
2
J70 à J161
14
0,53 \ 57,63 %
20 M
5
J14 à J112
14
0,94 \ 3,86 %
30 M
3
J56 à J140
13
0,52 \ 3,72 %
40 M
2
J49 à J126
11
0,57 \ 4,35 %
Figure 5 : Proportion de lymphocytes T humains dans le sang circulant après
injection de splénocytes humains par voie intra péritonéale.
A. Pourcentage de souris humanisées en fonction de la dose de splénocytes injectée.
B. Évolution de la population T pendant les 6 semaines suivant l’injection de 30
millions de splénocytes. C. Évolution de la population T pendant 4 semaines pour 3
groupes de souris ayant reçu la même dose de splénocytes (30 millions) provenant de
3 donneurs différents. D. Caractéristiques des 5 souris reconstituées pendant plus de 10
semaines consécutives.
56
2.3.1.2 Lymphocytes B humains circulants
La proportion de lymphocytes B a été évaluée par cytométrie en flux après marquage
des cellules par un anticorps anti-CD19 humain.
La figure 6A représente le pourcentage de souris ayant présenté, dans chaque groupe
d’étude, un taux de cellules CD19 supérieur ou égal à 0,5% pendant les 4 semaines suivant
l’injection. A partir de la dose de 30 millions de splénocytes, plus de 60% des souris ont
présenté un taux de cellules humaines CD19+ supérieur à 0,5%. Plus de 50% des souris ayant
reçu 10 millions de splénocytes ont présenté un taux de cellules humaines CD19+ supérieur à
0,5%.
Les figures 6B et C représentent l’évolution de la moyenne (et les écarts types
correspondants) du taux de cellules CD19 humaines circulantes respectivement dans les
groupes de souris ayant reçu 30 et 100 millions de splénocytes, à partir de 3 et 2 donneurs
différents, et pendant les 6 semaines suivant l’injection.
Dès le 7ème jour, le taux moyen des cellules humaines CD19+ dans le sang
périphérique était supérieur à 2%, l’évolution de la population B semble être, ensuite,
« sinusoïdale », ce que l’on retrouve dans tous les groupes d’étude. La sinusoïde oscille entre
2 et 6% dans le groupe de 30 millions et entre 4 et 8% dans le groupe de 100 millions de
cellules, ce qui suggère que le pourcentage de cellules CD19 humaines retrouvées dans le
sang périphérique augmente avec la dose injectée.
L’injection intra péritonéale de splénocytes humains a permis la reconstitution
d’une population lymphocytaire B dans le sang périphérique des souris dans plus de 60%
des cas, à partir de 30 millions de splénocytes et pendant 6 semaines.
Le taux de cellules humaines CD19+ semblait augmenter avec la dose de
splénocytes injectée.
L’évolution de la population CD19+ semblait être sinusoïdale, ce qui évoquait un
passage périodique des lymphocytes B , des organes lymphoïdes au sang périphérique.
57
% de souris ayant un taux de
cellules humaines CD19+ > 0,5%
A
100
80
10M
30M
40M
100M
60
40
20
0
1
2
3
4
B
12
10
8
6
4
2
0
1
-2
2
3
4
5
Temps en semaines
Temps en semaines
6
Temps en semaines
C
12
12
10
10
88
66
44
22
0
0
0
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
Temps en semaines
Figure 6 : Proportion de lymphocytes B humains dans le sang circulant après
injection de splénocytes humains par voie intra péritonéale.
A. Variations du pourcentage de souris ayant un taux de cellules humaines CD19+
supérieur à 0,5% en fonction de la dose de splénocytes injectée. B. Évolution de la
population B pendant les 6 semaines suivant l’injection de 30 millions de splénocytes.
C. Évolution de la population B pendant les 6 semaines suivant l’injection de 100
millions de splénocytes.
58
2.3.2 Colonisation des organes lymphoïdes murins par les cellules humaines
2.3.2.1 Histologie et immunohistochimie
Seuls les organes lymphoïdes des souris SCID/Beige greffées et humanisées par 30
millions de splénocytes par voie intra péritonéale ont été examinés au 35ème jour postopératoire, soit 28 jours après humanisation.
L’étude histologique standard, après coloration Hématoxyline-Eosine (Fig.7A,B), a
permis de mettre en évidence des îlots cellulaires que l’on ne retrouvait que dans les organes
lymphoïdes des souris humanisées (Fig. 7A ).
En immunohistochimie, ces îlots étaient marqués par les anticorps anti-CD3, antiCD45RO au niveau de la rate (Fig.7C,E) et du thymus (Fig.7D,F) et par l’anticorps antiCD20 humain dans le parenchyme splénique (Fig.7G).
Les études histologiques et immunohistochimiques n’ont pas été pratiquées sur le tissu
osseux.
Des cellules humaines exprimant les marqueurs CD3 (27,27%), CD4 (10,4%), CD8
(13,9%), CD19 (31,77%), CD56 (1,93%) humains et n’exprimant pas le marqueur CD45
murin ont été mises en évidence dans la rate des souris ayant reçu une injection de 30 millions
de splénocytes un mois plus tôt (Fig.7.I,L).
Des cellules humaines CD3+ représentaient 30,7% des cellules thymiques (Fig.7J,M).
Dans les ganglions mésentériques, les cellules humaines se répartissaient en 13,76%
de cellules T, 0,4% de cellules B et 1,7% de cellules NK (Fig.7K).
Une colonisation de la rate et du thymus par des cellules humaines a été mise en
évidence en immunohistochimie.
La cytométrie en flux a permis une évaluation quantitative de la colonisation de la
rate, du thymus et des ganglions mésentériques murins par des cellules humaines. La rate
et les ganglions mésentériques étaient colonisés par des cellules humaines T, B et NK, le
thymus par des cellules T humaines.
59
RATE
THYMUS
A
30
RATE
B
I
HE x 100
20
10
Anti-CD3
humain x 200
C
Anti-CD45 RO
Humain x 200
0
E
CD3
D
C
CD56
THYMUS
30
J
20
F
10
0
CD3
E
G
CD19
CD56
20
GANGLION
MESENTERIQUE
15
H
10
K
5
0
CD3-FITC
CD8-APC
CD3-PE
M
CD4-FITC
L RATE
CD19
CD56
CD19-APC
CD3
CD19-APC
Anti-CD20
Humain x 200
CD19
CD4-FITC
CD3-FITC
M THYMUS
Figure 7 : Colonisation des organes lymphoïdes murins par les cellules humaines
A à H. Histologie et Immunohistochimie de la rate et du thymus d’une souris greffée et humanisée
par 30 millions de splénocytes par voie intra péritonéale. A,B. Rate et Thymus Coloration HE x 100.
La flèche noire indique la présence d’un « ilôt » cellulaire. C,D. Anti-CD3 humain Rate et Thymus x 200.
E,F. Anti-CD45ROhumain Rate et Thymus x 200.G,H. Anti-CD20 humain x 200. I,J,K. Typage
cellulaire par cytométrie en flux : Répartition des cellules humaines CD3, CD19 et CD56+ dans la rate,
le thymus et les ganglions mésentériques murins. L,M. Cytométrie en flux: rate et thymus d’une souris
humanisées par 30 millions de splénocytes. Marquage des cellules spléniques par les anticorps anti-CD3,
CD19, CD4, CD8 humains et des cellules thymiques par les anticorps anti-CD3 et anti-CD19 humains.
60
2.3.3 Étude fonctionnelle du système immunitaire humain reconstitué
2.3.3.1 Sécrétion d’IgG humaines
La sécrétion d’IgG nécessite la coopération de cellules T et B. La mise en évidence
d’une sécrétion d’IgG humaines dans le sang des souris a été retenue comme critère de
fonctionnalité du système immunitaire reconstitué.
La figure 8A représente l’évolution des taux moyens d’IgG humaines (en g/l)
sécrétées par les souris ayant reçu 30 millions de splénocytes au cours des 6 semaines suivant
l’injection.
On remarque que si les lymphocytes B étaient présents à des taux importants dans le
sang périphérique dès le 7ème jour après l’injection (Fig.6B), le pic de sécrétion des IgG
humaines ne survient que 2 semaines plus tard (Fig.8A), alors que le taux de lymphocytes B
humains présents dans le sang périphérique a diminué. La colonisation des organes
lymphoïdes secondaires pourrait expliquer la diminution du taux de lymphocytes B circulants
au cours du temps.
2.3.3.2 Rejet d’allogreffes humaines
Les greffons vasculaires humains explantés après un mois de greffe chez des souris
SCID/Beige non « leaky » non « humanisées » n’ont présenté aucune lésion de rejet (Fig.8B).
Les greffons vasculaires humains explantés après un mois de greffe chez des souris
SCID/Beige non « leaky » présentant des populations lymphocytaires T et B humaines dans le
sang périphérique, suite à l’injection de 30 millions de splénocytes humains dans une
combinaison allogénique, ont présenté des lésions d’hyperplasie intimale évocatrice de
maladie vasculaire chronique du greffon. (Fig.8C).
Ces résultats sont développés dans le paragraphe 3.5.7. concernant la maladie
vasculaire chronique du greffon.
La sécrétion d’IgG humaines et l’apparition de lésions typiques de maladie
vasculaire du greffon en présence d’un système immunitaire humain reconstitué au sein de
souris SCID/Beige, dans une combinaison allogénique, sont des arguments en faveur du
caractère fonctionnel de la reconstitution.
61
Taux d’IgG humaines (mg/l)
A
700
700
600
600
500
500
400
400
300
300
200
200
100
100
00
0
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
Temps en semaines
C
B
Greffe contrôle
Allogreffe
Figure 8 : Étude fonctionnelle du système immunitaire humain reconstitué
A. Évolution de la sécrétion d’IgG humaines pendant les 6 semaines suivant l’injection
de 30 millions de splénocytes humains par voie intra péritonéale
B. Greffon artériel mésentérique humain explanté 1 mois après sa mise en place chez
une souris non « leaky » non « humanisée »
C. Greffon artériel mésentérique humain explanté 1 mois après sa mise en place chez
une souris « non leaky » ayant reçu 30 millions de splénocytes humains par voie
intra péritonéale dans une combinaison allogénique
62
2.3.4 Mortalité des souris après injection de splénocytes humains
2.3.4.1 Taux de mortalité et dose de splénocytes injectée
Nous avons observé une surmortalité des souris « humanisées », au cours du premier
mois, à partir de la dose de 50 millions de splénocytes. Le taux de mortalité au cours du
premier mois a été de 57,14% dans le groupe de souris injectées par 50 millions de
splénocytes, alors que le taux de mortalité était compris entre 0 et 16% dans les groupes ayant
reçu moins de 50 millions de splénocytes.
L’injection de doses supérieures ou égales à 50 millions de splénocytes est associée
à une surmortalité des souris injectées.
La mise en parallèle du pourcentage de souris humanisées en fonction de la dose de
splénocytes injectée (Fig.5A) et du taux de mortalité associé à chaque groupe nous incite à
penser que des doses comprises entre 30 et 40 millions de splénocytes constituent le
meilleur compromis.
2.3.4.2 Taux de mortalité et taux de cellules humaines circulantes
Huit souris ont présenté un taux de cellules humaines CD3+ supérieur à 20% dans le
sang périphérique au cours de leur suivi. Sept souris sur ces huit sont mortes la semaine
suivant ce résultat, soit un taux de mortalité de 87,5% dans les 7 jours suivants.
Le taux de cellules CD19 humaines n’a pas excédé 16,7% quelles que soient les
conditions. Un pourcentage de cellules CD19 supérieur à 15% n’était pas associé à une
surmortalité (n= 5).
La présence dans le sang périphérique d’un taux de lymphocytes humains supérieur
à 20% a été associée à un taux de mortalité élevé.
2.3.5 Maladie du greffon contre l’hôte
Les sept souris mortes ayant un taux de cellules CD3+ humaines supérieur à 20% ont
présenté une perte de poids de plus de 10% du poids du corps, une hypotonie et une chute de
poil évoquant une maladie du greffon contre l’hôte. Au sacrifice, ces souris présentaient une
splénomégalie. Malgré ces considérations, l’examen histologique standard n’a révélé aucune
lésion cutanée, hépatique, pancréatique ou de l’intestin grêle sur les échantillons prélevés.
63
10% des souris ayant reçu une injection de splénocytes (toutes doses confondues)
ont présenté un tableau évocateur de maladie du greffon contre l’hôte, sans qu’aucune
lésion histologique objective n’ait permis de confirmer le diagnostic.
3.3.6 Lymphomes
Malgré les antécédents d’infection à EBV retrouvés chez tous les donneurs prélevés,
aucune lésion évocatrice de lymphome à grandes cellules n’a été mise en évidence sur les
organes lymphoïdes des souris sacrifiées ou mortes.
Aucun lymphome n’a été mis en évidence au cours de l’étude.
3.3.7 Infections
Deux souris mortes, alors que le taux de cellules humaines CD3+ était inférieur à
0,5%, ont présenté des hémocultures positives à Citrobacter Koseri. Ce germe a également
été retrouvé dans les matières fécales des souris évoquant une translocation bactérienne pré
mortem plutôt qu’une contamination exogène des animaux.
Aucune contamination bactérienne exogène n’a été mise en évidence au cours de
l’étude.
64
2.4
Reconstitution
d’un
système
immunitaire
humain
chez
la
souris
CB17.SCID/Beige à partir de cellules médullaires
Douze souris ont été incluses et réparties en 2 groupes de 6 souris. Dans le premier
groupe, les souris ont reçu 5 millions de cellules médullaires, dans le second, 10 millions, par
voie intra péritonéale.
Dans les deux groupes, la durée médiane du suivi des souris a été de 73,5 jours (de 42
à 98 jours), ce qui correspondait à un suivi moyen de 72,3 jours (+/-28,23). Aucune mort n’est
survenue pendant le suivi. Aucune souris n’a été sacrifiée pendant l’étude.
Il s’agissait d’un groupe d’étude préliminaire. Notre objectif était d’obtenir une
reconstitution d’un système immunitaire humain de façon stable et prolongée. Nous nous
sommes limités à une étude de la cinétique d’une éventuelle reconstitution d’un système
immunitaire humain dans le sang périphérique. Aucun test fonctionnel n’a été pratiqué pour
ces souris.
Pour 5 millions de cellules, le taux de reconstitution n’a pas dépassé 50% au cours des
5 premières semaines, avec des valeurs maximales du taux de lymphocytes T CD3+ faibles de
2,71%.
Pour 10 millions de cellules, le taux de reconstitution, pendant les 5 premières
semaines, n’a pas dépassé 66,6%.
Sur une période de 35 jours suivant l’injection de cellules humaines, le pourcentage
de souris ayant présenté un taux de cellules humaines CD3+ supérieur ou égal à 0,5% n’ a
pas excédé 66,6% contre au moins 80% à partir de doses de 30 millions de splénocytes.
Dans les groupes de 5 et 10 millions de cellules médullaires, le pourcentage de souris
présentant un taux de cellules humaines CD3+ supérieur à 0,5% n’a pas dépassé 33,3%, entre
35 et 98 jours. Par ailleurs, la reconstitution n’était pas stable.
L’injection de 5 et 10 millions de cellules médullaires humaines n’a pas permis
d’obtenir une reconstitution stable et prolongée chez les souris SCID/Beige.
65
Transplant Immunology 15 (2005) 157 – 164
www.elsevier.com/locate/trim
Engraftment of human T, B and NK cells in CB.17 SCID/beige mice
by transfer of human spleen cells
Houda Yacoub-Youssef a, Bertrand Marcheix a, Denis Calise c, Jean-Claude Thiers a,
Nicole Therville a, Hervé Benoist a, Nelly Blaes a, Bruno Ségui a,
Camille Dambrin b, Mogens Thomsen a,*
b
a
INSERM U466, University Hospital of Toulouse, France
Department of Cardio-Vascular Surgery, University Hospital of Toulouse, France
c
Laboratory for Microsurgery, University Hospital of Toulouse, France
Received 13 June 2005; accepted 7 July 2005
Abstract
Models of severe combined immuno-deficient (SCID) mice reconstituted with a competent human immune system represent a valuable
tool for the study of human immune responses in vivo. Reconstitution with human cells can be achieved using large numbers of peripheral
blood lymphocytes, but levels of engraftment are poor and graft versus host disease (GVHD) frequently occurs. SCID/beige mice are at the
same time deficient for adaptive and innate immunity and the objective of this study was to develop a safe and efficient way to achieve
human lymphocyte engraftment in these mice using human spleen cells. After institutional authorisations and informed consent of relatives, a
piece of spleen was obtained from cadaveric organ donors and the splenocytes were isolated and cryopreserved for later use. Single
intraperitoneal injections of 5 – 100 ! 106 splenocytes were performed into SCID/beige mice. Reconstitution of a human immune system was
monitored weekly by the presence of human cells and IgG in peripheral blood. The mice were sacrificed 4 weeks after the injection and the
engraftment in lymphoid organs was studied. A reproducible reconstitution was obtained with intraperitoneal injection of 30 – 40 ! 106 spleen
cells. Human T, B and NK cells as well as human IgG were present in peripheral blood. In lymphoid tissues, the same lymphocytic
subpopulations were detected and in addition some antigen presenting cells. The reconstitution was functional because graft rejection was
observed after transplantation of human allogeneic tissues. When less than 30 ! 106 cells were injected, the reconstitution was variable. When
more than 40 ! 106 cells were injected, GVHD occurred with increasing frequency. In conclusion, we show that intraperitoneal injection of
30 – 40 ! 106 human splenocytes into SCID/beige mice induces a quick and functional engraftment of human T, B and NK cells with no risk
of GVHD. This model may be used to study human transplantation immunobiology in vivo.
D 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords: SCID/beige; Immune reconstitution; Human spleen cells; Alloreaction; GVHD
Experimental animal models have been used extensively
to characterise the immunobiology of allotransplantation.
However, many features distinguish human and animal
immune responses and it is rarely possible to apply
experimental results directly to clinical practice. The
* Corresponding author. INSERM U466, University Hospital of Rangueil, Toulouse, BP 84225, 31432 Toulouse Cedex 4, France. Tel.: +33
561322061; fax: +33 561322084.
E-mail address: thomsen@toulouse.inserm.fr (M. Thomsen).
creation of chimeric animal models with a functional human
immune system was a great step forward to study the role of
human immune cells in transplantation biology, autoimmunity, cancer and infectious diseases. Severe combined
immuno-deficiencient (SCID) mice lack functional T and B
cells due to mutation in a gene involved in recombination of
T and B cell receptors [1]. In these mice it is possible to graft
allogeneic or xenogeneic tissues or cells without rejection.
SCID mice can be reconstituted with a human immune
system using human cells from different sources, in
0966-3274/$ - see front matter D 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.trim.2005.07.002
66
158
H. Yacoub-Youssef et al. / Transplant Immunology 15 (2005) 157 – 164
particular human peripheral blood mononuclear cells
(PBMC) [2,3]. However, the usefulness of these chimeric
models has been limited by several factors. First, the level of
engraftment was low because the transplanted cells were
eliminated rapidly by cells of the mouse innate immune
system, such as macrophages, granulocytes, and natural
killer (NK) cells, which are not affected by the SCID
mutation [4 –6]. Second, the injection of human PBMC has
not ensured significant engraftment of human B cells and
macrophages [7]. Additionally, when high levels of engraftment could be achieved, PBMC often induced severe
xenogeneic graft-versus-host-disease (GVHD), leading to
increased animal death [8,9]. Finally, SCID mice inoculated
with human PBMC have been reported to develop EBV
derived lymphomas [9,10].
An improved engraftment was obtained when spleen cells
were used to humanise SCID mice [11]. However, typical
histologic features of GVHD were observed when high levels
of engraftment were achieved. A new experimental model
was introduced when mice with the beige mutation were
crossed with SCID mice. The beige mutation is associated
with neutropenia, lack of NK cytotoxic activity and lack of
functional macrophages [12]. The aim of the present study
was to develop a model of SCID/beige mice inoculated with
human spleen cells in order to ensure significant engraftment
of not only T cells, but also B, NK cells and macrophages,
with a reduced incidence of GVHD. Compared to PBMC,
spleen cells contain an increased fraction of B cells and
antigen presenting cells (APC). Different amounts of human
splenocytes were transferred into SCID/beige mice and
engraftment of T, B, NK cells and macrophages was
characterized in blood and lymphoid organs.
CB.17 SCID/beige mice were purchased from the
Bomholtgaard Breeding and Research Center (Ry, Denmark). The animals used in experiments were from 8 to 12
weeks old. All experimental protocols were approved by the
institutional committee for animal experiments. The animals
were kept in microisolator cages and fed sterilized water and
mouse chow. The level of mouse immunoglobulin (Ig) in
the serum of SCID/beige mice was quantified by ELISA
technique at 4 – 6 weeks of age. Mice with Ig levels superior
to 1 Ag/ml were considered as ‘‘leaky’’ and were not used
for experiments.
All procedures concerning human material were
approved by the French Transplantation Agency (EFG)
and the ethical committee of the University Hospital of
Toulouse. Pieces of human spleen were removed from six
cadaveric organ donors and placed in preservation solution
(Viaspan\) at 4 -C. All these donors were EBV positive.
Three to ten hours later, spleen fragments were mechanically disrupted, spleen cells were isolated and frozen for
later use in 10% DMSO (Sigma, France), 10% fetal calf
serum (Eurobio, France) and medium RPMI 1640 (Invitrogen, France).
After thawing and washing, human spleen cells were
counted and the viability checked by trypan blue exclusion.
Cells were resuspended in 0.5 ml Phosphate Buffered Saline
and administered to the mice by a single intraperitoneal
(i.p.) injection through a 23 G needle. Fifty mice were
injected. Six mice received 5 ! 106 spleen cells, 8 received
10 ! 106, 6 received 20 ! 106, 5 received 30 ! 106, 13
received 40 ! 106, 7 received 50 ! 106 and 5 received
100 ! 106 human spleen cells.
Fifty microliters of peripheral heparinized blood was
obtained weekly by puncture of the retroorbital sinus of the
mice. The kinetics of human cell engraftment as well as the
human IgG secretion were assessed by flow cytometry
(FACS Calibur, Becton Dickinson, France) and ELISA
technique. For flow cytometry, combinations of the following antibodies were used: phycoerythrin (PE) conjugated rat
anti-mouse CD45 (YW62.3, Immunotech, France) and
fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated mouse antihuman CD3 (UCHT1, Immunotech, France); allophycocyanin (APC) conjugated mouse anti-human CD19 (Clone
HD37, Dako, France) and phycoerythrin (PE) conjugated
anti-human CD56 (MOC-1, Dako, France). A live lymphocyte gate was established using Forward and Side Scatter
(FSC and SSC) parameters, and 10,000 events were
analyzed for each sample. Immune reconstitution was
considered successful when human CD3+ T cells were
detected at a level superior to 0.5% of the gated lymphocyte
population in blood samples [13].
ELISA was performed to quantify residual murine
immunoglobulin and to detect circulating human IgG in
the peripheral blood of humanized SCID/beige mice. The
protocols were carried out using Maxisorb plates (Nunc,
France) according to the manufacturer’s recommendation.
For murine Ig determination we used a polyclonal goat antimouse Ig antibody and a peroxydase-conjugated polyclonal
goat anti-mouse Ig antibody (Pharmingen, France). For
human IgG we employed a rabbit polyclonal anti-human
IgG antibody and a peroxydase-conjugated rabbit polyclonal anti-human IgG antibody (Dako, France). Serial
dilutions of control sera with known immunoglobulin
contents were included in order to convert the optical
density (k = 450 nm) into concentration of immunoglobulin.
Mice were sacrificed on day 28 after inoculation of
splenocytes by intraperitoneal lethal injection of pentobarbital (Sanofi, France). The spleen, thymus and lymph nodes
were harvested and analysed by histology and flow
cytometry. For histology, the tissues were fixed in 10%
formalin, embedded in paraffin and studied using H/E
staining and immunohistochemistry. Rabbit anti-human
CD3 (SP-7, Microm), mouse anti human CD45
(2B11 + PD7/26), CD45RO (UCHL1), CD20 (L26n) and
CD68 (PG-M1) were purchased from Dako (France) and
CD57 (NC1) was purchased from Immunotech (France).
Antibodies were used following the Labelled Streptavidin
Biotin protocol. For flow cytometry, human T, B and NK
cell engraftment in lymphoid organs was quantified using
the same antibodies as for detection of human cells in
peripheral mouse blood.
67
159
A
SSC
a
c
b
R1
R1
R1
FSC
e
f
Mouse CD45 -PE
d
Human CD3 -FITC
Human CD56
g
Human CD19
B
Human cells (%)
20
CD3
CD19
CD56
15
10
5
0
7
14
21
28
Days
C
Human IgG
180
120
60
0
7
14
21
28
Days
Fig. 1. (A) Representative dot plots from flow cytometry analysis. The lymphocyte gate (R1) was first determined by FSC and SSC analysis on human spleen
cells, non-reconstituted mice and reconstituted mice (a – c). The following blots show immunolabelling in the lymphocyte gate of the same samples: Human
splenocytes (d), blood from a non-reconstituted mouse (e), blood from a reconstituted mouse 28 days after i.p. transfer of 40 ! 106 human splenocytes (f and g).
Mouse lymphocytes were stained by anti-mouse CD45-PE. Human T, B and NK cells were stained respectively by anti-human CD3-FITC, CD19-APC and
CD56-PE antibodies. (B) Kinetics of reconstitution by human T (CD3+), B (CD19+) and NK (CD56+) cells in peripheral blood of SCID/beige mice after i.p.
transfer of 40 ! 106 human spleen cells. Mean T SD of 12 mice. (C) Human IgG (Ag/ml) secretion in peripheral blood of SCID/beige mice after i.p. transfer of
40 ! 106 human spleen cells. Mean T SD of 12 mice.
68
160
Differences between groups were examined for statistical
significance using the unpaired Student’s t-test. P values
less than 0.05 were considered to indicate significant
differences.
Three distinct human cell populations were present in the
peripheral blood of reconstituted mice: T, B and NK cells
labelled by antibodies towards CD3, CD19 and CD56,
respectively (Fig. 1A). The optimal amount of injected
spleen cells was 30– 40 ! 106 (Table 1). Four out of five
mice which received 30 ! 106 human spleen cells and all 13
mice which received 40 ! 106 cells were reconstituted. One
mouse out of those receiving 40 ! 106 cells died 27 days
after the injection for unknown reasons, there were no
evident signs of GVHD-like syndrome. The T/B cell ratio
increased with time and also with the amount of injected
cells. With doses at or above 50 ! 106 cells, the mortality
increased. Signs of GVHD-like syndrome were observed in
2 out of 7 mice injected with 50 ! 106 cells and 4 out of 5
mice injected with 100 ! 106 cells. The mice presented
enlarged spleens and human cell infiltration in liver and
lung. In agreement with other reports, the xenogeneic
GVHD did not seem to have the same detrimental effect
as an allogeneic GVHD where necrotic areas are usually
found [8,14].
Fig. 1(B, C) shows the kinetics of engraftment after
inoculation of 40 ! 106 splenocytes. After 7 days, human
cells were not always detected, but at 14 days significant
amounts of human T, B and NK cells were found in each
mouse. The level of circulating B and NK cells had a
tendency to increase during the observation period, while
the amount of T cells in most of the mice grew significantly
(Fig. 1B). The concentration of human IgG steadily
increased from day 7 to day 28 (Fig. 1C).
Four weeks after i.p. injection of 40 ! 106 human spleen
cells into SCID/beige mice, lymphoid organs were either
analysed by histology or the lymphocytes were isolated and
analysed by flow cytometry. In non-reconstituted SCID/
beige mice, lymphoid tissues as spleen, thymus and lymph
nodes were atrophic. After reconstitution, the lymphoid
organs were populated by human cells, and their volume
increased. In agreement with previous reports, these organs
did not preserve their structure [3,11] (Fig. 2A – F). Different
types of human leukocytes were observed: B cells (CD20+),
T cells (CD3+, CD45RO+), some NK cells (CD57+) and
macrophages (CD68+); the thymus was mainly populated
by T cells (Fig. 2G – X).
By flow cytometry we analysed quantitatively human
CD3+, CD19+ and CD56+ cells in lymphoid organs (Fig.
3). The B lymphocytes were especially frequent in the
mouse spleen and the lymph nodes whereas NK cells
(CD56+) were present in small amounts. As expected, the
thymus was dominated by human T cells.
Our work reports for the first time the successful
reconstitution of a human immune system in SCID/beige
mice using human spleen cells. Engraftment of T, B and NK
cells was shown in peripheral blood and in lymphoid organs.
In addition, human circulating IgG was detected that
increased steadily within the observation period. A single
intraperitoneal injection of 30– 40 ! 106 human spleen cells
was optimal: when fewer cells were used, the reconstitution
was variable and delayed. When the cell dose was increased,
a number of mice died during the observation period of 28
days, probably due to GVHD. The grafted human cells were
functional because reconstituted mice rejected human allogeneic tissues (Marcheix et al, submitted for publication).
The first reconstitution of SCID mice by human PBMC
was reported in 1988 [2]. However, the success rate was low
and the level of engraftment usually poor [15,16]. Moreover, a good engraftment was associated with a high GVHD
incidence [17]. In 1994, it was demonstrated that spleen
cells gave a better reconstitution of SCID mice than PBMC
[11]. With 100 ! 106 spleen cells, a reproducible T cell
reconstitution was obtained, but the number of human B
cells in peripheral blood or lymphoid tissue remained low;
the level of human IgG in serum or the presence of NK cells
were not mentioned. SCID mice have a functional murine
innate immune system and the engraftment of xenogeneic
cells may thus be more difficult than in SCID/beige mice,
which lack NK cell function. Reconstitution of SCID/beige
mice with human PBMC has been performed by several
groups. Lorber et al. injected 300 ! 106 PBMC into SCID/
beige mice, and obtained a good T cell reconstitution.
However, in spite of a significant production of human IgG,
human B cells were absent from the circulation and the
Table 1
Levels of human cell engraftment in peripheral blood of SCID/beige mice after injection of human spleen cells
Injected cells
(millions)
Number of
injected mice
5
10
20
30
40
50
100
6
8
6
5
13
7
5
a
14 days post injection
28 days post injection
Number of
reconstituted micea
Human T/B cell ratio
Number of
reconstituted micea
Human T/B cell ratio
0
2
4
4
13
7
5
–
0.22
0.45
0.55
1.56
2.71
5
3
2
5
4
12
4
–
0.19
0.36
0.65
2.71
2.8
7.57
17.77
Death rate
GVHD
0
0
0
0
1
3
5
0
0
0
0
0
2
4
Mice with human T cell levels superior to 0.5% were considered as reconstituted.
69
presence of B cells in lymphoid organs was not mentioned
[13,18]. Very few circulating CD56+ cells were found, most
of them stained also for CD3+, so they were probably NKT
cells [19].
Berney et al. compared the reconstitution by PBMC in
four different mouse strains: SCID/beige, NOD/SCID,
NOD/SCID/h2 microglobulin-deficient and Rag1 deficient
mice [3]. After injection of 50 ! 106 human PBMC,
161
reconstitution with circulating human T cells and human
immunoglobulin was obtained in SCID/beige and NOD/
SCID mice. However, circulating B cells were not detected
and the presence of NK cells was not mentioned. SCID/
beige mice and NOD/SCID mice have the SCID mutation in
common [20]. NOD mice display a deficient NK cell system
and are susceptible to development of autoimmune diabetes.
When combined with the SCID mutation, no diabetes
Fig. 2. Representative photomicrographs from spleen, thymus and lymph nodes of SCID/beige mice. (A – C) Hematoxylin/Eosin staining (H/E, !100) in a
non-reconstituted SCID/beige mouse. (D – X) Reconstituted SCID/beige mice, 28 days after i.p. transfer of 40 ! 106 human splenocytes. (D – F) H/E (!100).
(G – X) Immunohistochemical staining; (G – I) anti-human CD45 (! 200), (J – L) anti-human CD20 (!200), (M – O) anti-human CD3 (!200), (P – R) antihuman CD45RO (!200), (S – U) anti-human CD57 (!400) and (V – X) anti-human CD68 (!400).
70
162
Fig. 2 (continued).
occurred in these mice, but NOD/SCID mice tended to
develop thymoma, a feature not described in SCID/beige
mice. When engraftment with PBMC in SCID/beige mice
produced a high level of chimerism, human T cell
infiltration of the liver and lungs was observed, often with
lethality within 30 days of injection [3]. In the present work,
where SCID/beige mice were injected with spleen cells, a
low occurrence of GVHD was observed despite a high level
of engraftment of human T cells, unless the cell dose was
over 40 million cells. All 13 mice which received 40 ! 106
human spleen cells were reconstituted without GVHD-like
60
Human cells (%)
*: p<0.05
CD3
CD19
40
CD56
**
20
0
Human
spleen
Mouse
spleen
Mouse
thymus
Mouse
lymph node
Fig. 3. Distribution of human immune cells subsets in lymphoid compartments of SCID/beige mice reconstituted by 40 ! 106 human splenocytes.
Murine spleen, thymus, and lymph nodes were analysed by flow cytometry
for the proportion of human T (CD3+), B (CD19+) and NK (CD56+) cells.
Results are expressed as mean T SD of 6 mice. The percentage of T, B and
NK cells in human spleens is shown for comparison (n = 5, mean T SD).
syndrome during the observation time, although one of the
mice died for unknown reasons 1 day before the planned
sacrifice. Two out of seven mice that received 50 ! 106 cells
and 4 out of 5 mice that received 100 ! 106 cells showed
GVHD like symptoms. Xenogeneic GVHD in SCID mice is
less severe that allogeneic GVHD, and severe gastrointestinal or skin symptoms have not been reported
[14,17]. We found enlarged spleens and human cell
infiltration in liver and lungs [21]. In earlier reports, B cell
lymphoma have been described in SCID mice, especially
when EBV positive donors were used [2,17]. More recent
articles on SCID mice reconstituted with human cells have
not reported the occurrence of lymphomas [3,13,20]. The
six donors used in our experiments were all EBV positive,
but we did not observe any B cell lymphoma. However,
most of the experiments were not continued beyond 1
month. Thus, we cannot exclude the possibility that EBVderived B cell lymphomas might have developed if the
animals had been followed for longer periods of time.
In contrast to previous models described, the injection of
human splenocytes into SCID/beige mice allows reconstitution of significant levels of B and NK cells in the
circulation and in lymphoid organs. Although T cells
probably are the most important lymphocytes for the
allograft rejection, B and NK cells participate also [22 –
24] and our model is thus relevant for studies of the
physiopathology of rejection. The functional capacity of
human T cells after injection into SCID mice has been
studied by several authors. It is generally reported that the
secondary T cell response works well while a primary
71
response has been found by some authors and not by others
[11,16,25]. We found that the human T cells in lymphoid
organs mainly were of memory type (CD45RO) but we did
not perform specific tests for T cell reactivity. However, the
production of human IgG and rejection of allogeneic tissue
indicate that the T cells are functional. Levels of engraftment
of human cell subsets in the peripheral blood and lymphoid
organs varied somewhat among the animals, even when
identical amounts of cells from the same donor were given.
In addition, inoculation of splenocytes from certain donors
resulted generally in higher engraftment than splenocytes
from others. These variations may be explained by differences in treatment of organ donors before organ harvesting
and in time between harvesting and the isolation and
freezing of spleen cells. However, a variable reconstitution
has been the hallmark of all models described previously
that have been reconstituted with larger amounts of PBMC
or splenocytes. In order to obtain a better reconstitution,
human CD34+ stem cells have been used by some authors
[26,27]. Such cells ensure a complete reconstitution of some
selected immunodeficient mouse strains, without occurrence
of GVHD. However, the time required to obtain the
reconstitution is much longer, at least several months. In
addition it is unknown if the human T cells keep their
repertoire with restriction by human histocompatibility
antigens.
In conclusion we have shown that i.p. injection of human
splenocytes provides a safe and efficient way of adoptive
human immune cell transfer into SCID/beige mice. Significant engraftment of T, B and NK cells was observed in
blood and lymphoid tissues. The model of SCID/beige mice
reconstituted by human splenocytes might be a new tool to
study human transplantation immunobiology and immunoreactivity in vivo.
Acknowledgments
We are grateful for the kind help from Dr. Talal Al Saati
(Plateau technique d’histopathologie expérimentale) for
preparation of histological specimens. We are also indebted
to the families that accepted the use of tissues and cells from
organ donors for scientific research. Our clinical colleagues
were helpful for the recovery of tissues and cells from the
donors. Finally we thank the staff of the animal housing
facilities for their kind assistance.
H.Y-Y was supported by an educational grant from
Novartis, France.
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73
2.5 Étude de la maladie vasculaire chronique du greffon
Les résultats de l’étude portant spécifiquement sur la maladie vasculaire chronique du
greffon sont décrits dans l’article 3 de cette thèse (Marcheix 2006).
2.5.1 Greffon mésentérique
Des greffons du calibre de l’aorte de souris ont toujours été trouvés dans le mésentère
(Fig.1D,E) La technique «Sleeve» a toujours pu être réalisée, que ce soit au niveau de
l’anastomose proximale ou au niveau de l’anastomose distale (Fig.3).
La qualité des greffons était excellente sauf dans un cas (donneur âgé de 57 ans aux
facteurs de risque cardiovasculaires, présentant des lésions d’athérosclérose diffuse y compris
au niveau des collatérales terminales de l’artère mésentérique supérieure).
La portion jéjunale du mésentère a permis d’obtenir des greffons vasculaires de
calibre superposable à celui de l’aorte de souris.
La technique « Sleeve » a été possible dans 100% des cas.
Une cinquantaine de greffons identiques et utilisables chez la souris pourraient être
disséqués à partir d’un segment de mésentère correspondant à une longueur approximative
de 2 mètres de jéjunum.
2.5.2 Composition et caractéristiques des groupes de souris greffées
Trente-neuf souris ont été greffées à partir de 6 donneurs différents, soit une moyenne
de 6,5 greffes par prélèvement. Pour des raisons techniques liées à la disponibilité du poste de
microchirurgie, 5 à 8 greffes ont été pratiquées dans les 48 heures suivant chaque
prélèvement.
La composition des différents groupes de souris greffées est indiquée dans la figure
9A.
Quatre souris « Leaky » ont été greffées sans injection associée de cellules humaines
(Groupe leaky). Le taux moyen d’immunoglobulines murines était de 8,87µg/ml (+/-7,64).
En dehors du groupe « Leaky », toutes les souris greffées avaient un taux
d’immunoglobulines murines inférieur à 3µg/l. Aucune souris greffée n’est devenue
« Leaky » au cours de l’étude.
Quatre souris non « leaky » ont été greffées sans injection associée de cellules
humaines (Groupe contrôle). Six souris ont été greffées et humanisées par 30 millions de
74
splénocytes du donneur de greffon par voie intra péritonéale 7 jours après l’intervention
(Groupe isogénique). Douze souris ont été greffées et humanisées par 30 millions de
splénocytes d’un donneur différent du donneur de greffon, par voie intra péritonéale, 7 jours
après l’intervention (groupe allogénique).
La durée moyenne de l’ischémie froide n’était pas significativement différente entre
les groupes (Test de t de Student).
Nombre de souris par groupe et durée de l’ischémie froide (en
minutes)
A
"Leaky"
Contrôles
Isogreffes
Allogreffes
n
4
4
6
12
Moyenne
1860
1748,75
770,8
1548,75
Ecart type
634,58
845,15
513,24
770,53
Taux de complication
B
%
Mortalité
per op
12,82
Thromboses
précoces
15,38
Thromboses
tardives
2,56
Figure 9 : Souris greffées : caractéristiques des différents groupes et complications
A. Nombre de souris incluses dans chaque groupe, durée moyenne de l’ischémie froide
pour chaque groupe et écart type (différence non significative entre les groupes)
B. Taux de mortalité per opératoire, post opératoires précoce et tardif
75
2.5.3 Mortalité précoce avant injection de cellules humaines
Treize souris greffées sont mortes. Les taux des différentes complications rencontrées
sont indiqués dans la figure 9B.
Cinq souris sont mortes en peropératoire d’une mauvaise tolérance de l’anesthésie (2
souris), ou d’une plaie irréparable de la veine cave inférieure en cours de dissection (3 souris).
Le taux de mortalité opératoire était de 12,82%.
Six souris ont présenté une paralysie du train arrière au réveil. Une thrombose précoce
du greffon a été objectivée dans les six cas lors de la reprise chirurgicale. Ces souris ont été
sacrifiées le jour même. Le taux de thrombose précoce était de 15,38%. Dans le cas où les
greffons étaient de mauvaise qualité (vaisseaux athéromateux) le taux de mortalité précoce a
atteint 50% (4 souris mortes sur 8 greffes pratiquées).
Deux souris sont mortes à distance de l’intervention de causes « chirurgicales », l’une
d’un volvulus au 5ème jour post-opératoire, l’autre d’une thrombose tardive du greffon au 7ème
jour post-opératoire. Le taux de thrombose tardive était de 2,56%.
Le taux de mortalité opératoire a été de 12,82%.
Le taux de thrombose précoce a été de 15,38%. Il a été augmenté en cas de
mauvaise qualité des greffons (vaisseaux athéromateux), ce qui nous incite à une sélection
des donneurs.
3.5.4 Mortalité tardive au-delà du 7ème jour post-opératoire
Aucune souris des groupes « leaky » et « contrôle » n’est morte pendant les 5
semaines de greffe.
Deux souris du groupe isogénique sont mortes pendant l’étude au 14 et au 15ème jours
après injection de splénocytes. La première ne présentait pas de cellules CD3+ circulantes
avant sa mort, la seconde avait un taux de cellules CD3+ humaines de 0,68%.
Une souris du groupe allogénique est morte 12 jours après injection de splénocytes,
son taux de cellules CD3+ humaines circulantes était inférieur à 0,5%.
3.5.5 Résultat de la reconstitution du système immunitaire humain dans le
groupe de greffes isogéniques
L’évolution de la proportion des populations B et T et des IgG humaines sécrétées a
été évaluée respectivement par cytométrie en flux et technique ELISA (Fig.10A,B,C).
76
Un système immunitaire humain a été reconstitué dans 5 cas sur 6 (83,3%). La
souris ayant présenté un taux de cellules humaines CD3+ inférieur à 0,5% pendant les 4
semaines du suivi a été exclue de l’étude.
3.5.6 Résultat de la reconstitution du système immunitaire humain dans le
groupe de greffes allogéniques
Un système immunitaire humain a été reconstitué dans 10 cas sur 12 (83,3%). Les 2
souris ayant présenté un taux de cellules humaines CD3+ inférieur à 0,5% pendant les 4
semaines du suivi ont été exclues de l’étude (Fig.10D,E,F).
Les taux moyens de cellules humaines CD3 et CD19 et d’IgG humaines détectées
dans le sang périphérique n’étaient pas significativement différents entre les groupes
isogreffes et allogreffes (Test de t de Student).
77
A
5
4
3
2
1
8
6
150
5
4
100
3
2
1
J21
J7
J28
8
D
7
6
5
4
3
2
1
J14
J21
14
J28
10
8
6
4
2
0
0
J7
J14
J21
J28
J7
J 14
0
J7
E
12
50
IgG humaines mg/l
J14
C
200
7
CD19 humains %
J7
CD3 humains %
250
B
9
0
0
Allogreffes
10
IgG humaines mg/l
CD19 humains %
CD3 humains %
Isogreffes
6
J21
J28
J14
40
J21
J28
F
35
30
25
20
15
10
5
0
J7
J14
J21
J28
Figure 10 : Reconstitution du système immunitaire humain chez les souris greffées
A,B,C. Évolution des populations lymphocytaires CD3, CD19 et du taux d’IgG
humaines en fonction du temps dans le groupe « isogreffes »
D,E,F. Évolution des populations lymphocytaires CD3, CD19 et du taux d’IgG
humaines en fonction du temps dans le groupe « allogreffes »
Suivant le test de t de Student, les différences des taux de CD3, CD19 et d’IgG entre les
groupe iso- et allogreffes ne sont pas significatives.
78
3.5.7 Lésions intimales : évaluation qualitative
Aucun épaississement intimal n’a été mis en évidence dans le groupe « Contrôle »
(Fig.11.A).
Un épaississement intimal a été mis en évidence dans les groupes « Leaky »
(Fig.12.A), « Isogéniques » et « Allogéniques » (Fig.11.B,C).
Cet épaississement était limité au greffon humain, l’aorte de souris ne présentait
aucune lésion à distance des zones anastomotiques.
Dans le groupe des allogreffes, l’épaississement intimal était associé à une forte
proportion de cellules alpha-actine positives indiquant une prolifération de cellules
musculaires lisses dans l’intima (Fig.11.L). Des cellules humaines CD3+ ont été mises en
évidence dans l’adventice et dans la néointima des greffons humains du groupe de greffes
allogéniques (Fig.11.F,I). Cet infiltrat cellulaire n’a pas été mis en évidence dans les autres
groupes (Fig.11.D,E,G,H).
Les lésions étaient également caractérisées par une conservation de l’épaisseur de la
média et par l’absence de rupture de la limitante élastique interne (Fig.11.C).
Les lésions vasculaires observées dans le groupe « Allogreffes » étaient des lésions
Maladie Vasculaire Chronique typiques.
79
Groupe isogreffe
Marquage
Anti alpha actine
Marquage
antiCD3 humain
Marquage
antiCD3 humain
Hematoxyline
Eosine
Groupe contrôle
Groupe allogreffe
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
Figure 11 : Examens histologique et immunohistochimique de greffons
artériels mésentériques humains
A,D,G,J. Groupe contrôle
B,E,H,K. Isogreffe
C,F,I,L. Allogreffe
A,B,C. Artères mésentériques humaines explantées un mois après la greffe
(Hématoxyline Éosine Grossissement x100). Hyperplasie intimale : C
D,E,F. Immunohistochimie : anti-CD3 humain sur des artères
mésentériques humaines explantées un mois après la greffe
(Grossissement x400, x400, x600). Marquage positif dans l’intima : F
G,H,I. Immunohistochimie : Marquage anti-CD3 humain sur des artères
(Grossissement x400, x400, x400). Marquage positif dans l’adventice : I
J,K,L. Immunohistochimie : Marquage anti alpha actine sur des artères
(Grossissement x400, x400, x400). Marquage positif dans la média :J,K,L.
Marquage positif dans la néo intima : L
80
2.5.8 Évaluation quantitative des lésions intimales
L’évaluation
quantitative
des
lésions
intimales
a
été
réalisée
par
étude
histomorphométrique. À titre d’exemple, la figure 12 représente la modélisation informatique
correspondant à l’analyse des coupes histologiques des greffons dans différentes conditions.
Ainsi le greffon humain un mois après la greffe chez une souris non « leaky » non humanisée
ne présentait-il pas d’épaississement intimal (Fig.12C). À l’opposé, un épaississement
modéré et localisé au tiers moyen du greffon a été observé chez des souris « leaky » non
humanisées (Fig.12B). Après humanisation de souris non « leaky » dans une configuration
isogénique, un épaississement modéré sur toute la longueur du greffon a été mis en évidence,
alors qu’en configuration allogénique, l’épaississement était nettement plus prononcé
(Fig.12E).
L’hyperplasie intimale a été quantifiée par évaluation du pourcentage moyen
d’obturation, de l’index néo intimal moyen, du volume intimal total et du volume intimal
moyen par coupe (Fig.12.E).
L’analyse de ces différents paramètres indique une augmentation significative des
altérations vasculaires chez les souris « leaky » greffées, chez les souris non « leaky »
humanisées dans des configurations isogéniques ou allogéniques par rapport à des greffes
contrôles réalisées chez des souris non « leaky » non humanisées.
Si l’on compare les groupes iso- et allogéniques, le volume intimal total et le volume
intimal moyen par coupe étaient significativement plus élevés pour les allogreffes.
Les différences de volume intimal moyen par coupe entre les groupes « contrôles »,
« isogreffes » et « allogreffes » étaient significatives (Test de t de Student).
81
A
B
C
D
*
*
Volume intimal moyen
en µm3/coupe (x105)
10
1,00E+06
8
8,00E+05
6
6,00E+05
E
*
*
4
4,00E+05
2
2,00E+05
0
0,00E+00
Souris leaky
greffées
Greffes
contrôles
Isogreffes
Allogreffes
Figure 12 : Aspects histologique et histomorphométrique.
A. Artère mésentérique supérieure après 1 mois de greffe chez une souris leaky
(Ig murines=5µg/ml).
B. Artère mésentérique supérieure après 1 mois de greffe chez une souris non
leaky, non humanisée : greffe contrôle
C. Artère mésentérique supérieure après 1 mois de greffe isogénique
D. Artère mésentérique supérieure humaine après 1 mois de greffe allogénique
E. Evaluation quantitative des lésions d’hyperplasie intimale : représentation des
moyennes et écarts types du volume intimal moyen par coupe pour chaque
groupe de souris greffées (* : p < 0,05)
82
CARDIAC REJECTION
Multiple Human Mesenteric Arterial Grafts From the Same
Donor to Study Human Chronic Vascular Rejection
in Humanized SCID/Beige Mice
Bertrand Marcheix, MD,a,b Houda Yacoub-Youssef,a Denis Calise,c Jean-Claude Thiers,a Nicole Therville,a
Hervé Benoist,a Nelly Blaes,a Bruno Ségui,b Xavier Game, MD,d Camille Dambrin, MD,a,b and
Mogens Thomsen, MDa
Background: Chronic vascular rejection (CVR) is a major problem in clinical transplantation. Studies in
experimental animals have been important to understand some of its mechanisms, but they are
hampered by the difficulty of extrapolating the results into clinical practice.
Methods:
We created a new experimental model for the study of human CVR by grafting multiple human
mesenteric arteries from the same human donor into different SCID/beige mice in the infrarenal
aortic position. Twenty-seven different mice were successfully grafted with a human artery from 6
donors. One week later, 23 of the mice received an intraperitoneal injection of 40 million human
spleen cells, either from the same donor (autologous) or from another donor (allogeneic).
Results:
In 81% of the mice an immune reconstitution was obtained, shown by the presence of human T, B
and NK cells and IgG in circulating blood. At the time of sacrifice, 5 weeks after the arterial
transplantation, a typical CVR with infiltration of human immune cells and deposit of human
immunoglobulin was observed in the reconstituted mice that received allogeneic cells, whereas only
minor lesions were noted in autologous combinations. No CVR was observed without injection of
human splenocytes. We did not observe lymphoma or graft-vs-host reactions during the experiment.
Conclusions: We show that it is feasible to graft multiple human arteries from the same donor into SCID/beige
mice, and that a specific and typical CVR is observed after reconstitution with allogeneic spleen
cells. Our method allows for pre-clinical testing of new therapeutics in controlled series. J Heart
Lung Transplant 2006;25:675– 82. Copyright © 2006 by the International Society for Heart and Lung
Transplantation.
Chronic vascular rejection (CVR) is a major cause of late
failure of organ transplants despite progress in the field
of immunosuppressive treatment.1 The pathology of
CVR is characterized by an infiltration of immune cells
into the vessel wall followed by a progressive intimal
thickening.2 To study the pathology of CVR, experiFrom aINSERM U466, bDepartment of Cardiovascular Surgery, cLaboratory for Microsurgery, INSERM U589 and Medical Physiology, and
d
Department of Urology and Renal Transplantation, University Hospital Rangueil, Toulouse, France.
Submitted September 28, 2005; revised December 23, 2005; accepted January 16, 2006.
The first two authors, B.M. and H.Y.-Y., contributed equally to this
work.
Preliminary results of this study were presented at the 20th International Congress of the Transplantation Society, September 2004.
Supported by an educational grant from Novartis, France (H.Y-Y.).
Reprint requests: Mogens Thomsen, INSERM U466, IFR31, University Hospital Rangueil, BP 84225, 31432 Toulouse Cedex 4, France.
Telephone: 00-33-5-61-32-20-61. Fax: 00-33-5-61-32-20-84. E-mail:
thomsen@toulouse.inserm.fr
Copyright © 2006 by the International Society for Heart and Lung
Transplantation. 1053-2498/06/$–see front matter. doi:10.1016/
j.healun.2006.01.005
mental rodent models of orthotopic aortic allotransplants have been established, first in rats3,4 and then in
mice.5 The models were improved by the introduction
of the rapid “sleeve” technique.6 – 8 However, results
obtained in rodent models are often difficult to apply to
clinical settings, because significant structural and functional differences exist between rodent and human
immune systems. For example, human-activated T cells
carry major histocompatibility complex (MHC) Class II
antigens, whereas murine-activated T cells are Class II
negative.9 Endothelial cells, which are important for the
development of CVR, constitutively express both MHC
Class I and II molecules in humans, whereas this is not
the case in rodents.10
To study human immune responses in vivo, models
using “humanized” mice (i.e., mice reconstituted with
human immune cells) have been developed.11 The
severe combined immunodeficiency (SCID) mice lack
functional T and B cells due to mutation in a gene
involved in the recombination of T- and B-cell receptors.12 In these mice it is possible to graft allogeneic or
xenogeneic tissues and cells without occurrence of
rejection and, in particular, it has been shown that the
675
83
676
Marcheix et al.
mice can be reconstituted with a human immune
system.11 In the last 15 years, the use of humanized
SCID mice has become an important tool for the in vivo
study of human immune responses in areas such as
autoimmunity, cancer, allergy and infections.13,14 In the
field of transplantation immunology it has been shown
that allogeneic human skin grafts are rejected by humanized SCID mice and that immunosuppressive treatment allows for prolongation of skin graft survival.15
Lorber and co-workers used SCID/beige mice for the
transplantation of small human arteries into the infrarenal aortic position.16,17 The mice were immunologically
reconstituted by intraperitoneal injection of peripheral
blood mononuclear cells (PBMC) from voluntary blood
donors. SCID/beige mice are not only deficient for T
and B cells but also have a defect in a gene involved in
lysosomal trafficking.18 They display a deficient natural
immunity with a lack of functional natural killer (NK)
cells, antigen-presenting cells and phagocytes.19 Although SCID mice often develop a residual production
of murine immunoglobulin (“leakiness”), this phenomenon is much less pronounced in SCID/beige mice.19
When SCID/beige mice received human PBMC intraperitoneally (IP) after a human arterial graft (usually a
collateral of the internal mammary artery), a CVR
developed.16
In preliminary experiments we confirmed the published observations, but we found that the model had
several drawbacks. First, concerning the donor artery, it
was difficult to obtain more than one suitable artery
from the same donor, and thus controlled studies were
difficult to carry out. The arteries that we used for
grafting were often of poor quality because they were
recovered in the operating room after bypass operations, and their size was difficult to match with the
mouse aorta. Second, the immunologic reconstitution
of the mice after injection of PBMC was rather variable
and few, if any, circulating B and NK cells were
observed. The PBMC we used were always from voluntary donors and it was thus impossible to obtain autologous controls (arteries and PBMC from the same
donor). It has been shown by others that spleen cells
may be superior to PBMC for the reconstitution of SCID
mice,15 and we previously made the same observation
in SCID/beige mice.20
In the present work we describe a new experimental
model based on the use of tissues and cells from
cadaveric organ donors. The mesentery contains a large
number of small arteries permitting the dissection of
multiple arterial segments of excellent quality from one
donor and transplantation into several SCID/beige mice.
The humanization was performed by spleen cells from
the same donor or allogeneic donors. HLA typing was
done systematically and, in addition to autologous
The Journal of Heart and Lung Transplantation
June 2006
controls, allogeneic combinations were tested in the
same experiment.
METHODS
Animals
CB.17 SCID/beige mice were obtained from the Bomholtgaard Breeding and Research Center, Ry, Denmark.
Animals used for the experiments were male, from 8 to
12 weeks of age. They were kept in micro-isolator cages
and fed sterilized water and mouse chow. Only mice
with a residual murine immunoglobulin level of !1
"g/ml were considered for experimentation (“nonleaky”). All experimental protocols were approved by
the institutional committee for animal experiments.
Obtaining Human Mesentery and Spleen Tissue
All procedures concerning human material were approved by the French Transplantation Agency (EFG)
and the ethics committee of the University Hospital of
Toulouse. Before any manipulation, the registry for
refusal of organ donation was consulted and informed
consent was obtained from relatives for the use of
human tissues for medical research. After multi-organ
harvesting for clinical transplantation, a piece of mesentery (15 # 15 cm) and a segment of the spleen were
removed from the cadaveric organ donor. In contrast to
the usual surgical procedure, the superior mesenteric
artery was not clamped at its origin and care was taken
to cut the mesentery as close to the jejunum as possible
without opening the latter (Figure 1A). The recovered
pieces were placed in preservation solution (Viaspan)
at 4°C. Terminal collaterals of the superior mesenteric
artery were dissected out and placed in preservation
solution at 4°C (Figure 1B).
Transplantation of Mesenteric Arteries
Into SCID/Beige Mice
Transplantation was performed within 48 hours after
the multi-organ harvesting procedures. The mice received general anesthesia (ketamine/xylazine/atropine), completed with gaseous anesthesia (isoflurane).
With an operating microscope (#18), a mid-line laparotomy approach was used. The abdominal aorta was
controlled and clamped by means of two 8-0 silk
threads (Peters) just below the renal arteries and above
the iliac arterial bifurcation. The infrarenal aorta was
cut at its mid-portion (Figure 1C). The anastomoses
were performed using the “sleeve” technique by means
of 11-0 monofilament nylon sutures (Sinus Point AG,
Welschenrohr, Switzerland) as described previously for
aortic allografts6 (Figure 1D–F). Although it was always
possible to apply the sleeve technique at the proximal
anastomosis, it was sometimes necessary to perform a
classical point-to-point technique at the distal anastomosis for anatomic reasons. After restoring vascular integ-
84
Volume 25, Number 6
Marcheix et al.
677
(autologous group); and the third group received
spleen cells from a different donor (allogeneic group). A
quantity of 40 ! 106 viable spleen cells suspended in
500 "l of phosphate-buffered saline was administered
to the mice by a single IP injection through a 23G
needle. Heparinized retro-orbital venous blood samples
were obtained weekly. The presence of human cells was
monitored using indirect immunofluorescence flow cytometry (FACScalibur, Becton Dickinson, France) and
human IgG levels quantified by enzyme-linked immunoassay (ELISA). For flow cytometry, leukocytes were
incubated with fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD3 (UCHT1) and phycoerythrin (PE) rat anti-mouse CD45 (YW62.3, Immunotech, France). Mice were considered to be reconstituted
when blood samples contained #0.5% human CD3$
T cells in the lymphocyte gate.16 Human IgG was detected by ELISA using rabbit anti-human IgG and peroxidase-conjugated rabbit anti-human IgG (Dako, France).
Figure 1. Procedures to transplant a human mesenteric artery into a
SCID/beige mouse. (A) Peri-operative view of the piece of mesentery to
be removed. (B) Comparison between the sizes of a mouse aorta (left)
and a terminal branch of the human superior mesenteric artery
(original magnification !18). (C) Schematic drawing of the “sleeve”
anastomosis technique. (D) Peri-operative photomicrograph (original
magnification !18) showing the clamping of the mouse aorta by
means of two 8-0 silk threads (Peters) just below the renal arteries and
above the iliac arterial bifurcation. The mouse aorta has been cut
between the clamps and the human artery posed. (E) Both anastomoses were performed by the “sleeve” technique. In some cases,
however, point-by-point sutures were made at the distal end for
anatomic reasons. (F) The 8-0 silk threads were removed. The blood
flow through the grafted arterial segment confirmed the early patency
of the graft.
rity, hemostasis was ensured and the peritoneal cavity
flooded with warmed sterile saline. After wound closure, animals were kept under heating lights until
complete recovery. Hind-limb function was a reliable
indicator of early graft patency. In case of paralysis, the
mice were sacrificed.
Reconstitution of Grafted SCID/Beige Mice With
Autologous or Allogeneic Human Spleen Cells
Spleen fragments were mechanically disrupted, spleen
cells were isolated and frozen for later use in 10%
dimethysulfoxide (DMSO; Sigma, France), 10% fetal calf
serum (Eurobio, France) and RPMI-1640 medium (Invitrogen, France). An average of 15 ! 109 cells were
isolated from each spleen. Seven days after the arterial
transplantation, spleen cells were thawed and viable
cells counted using trypan blue exclusion.20 The mice
were divided into three groups: the first group did not
receive human spleen cells (control group); the second
group received spleen cells from the donor of the artery
Histologic Analysis
The mice were sacrificed 35 days after the arterial
transplantation. The arterial graft was fixed on a small
support of polystyrene foam, embedded in Tissue-Tek,
and snap frozen in liquid nitrogen. The morphometric
study was performed as described previously.7 Briefly,
sections were made at 10-"m intervals. For every tenth
section, the areas within the lumen and internal and
external elastic lamina were circumscribed manually
and measured using the CYBERVIEW v3 program (Cervus
International, France). A virtual longitudinal section of
the explanted artery was constructed with a homemade program.7 The average neointimal index for the
portion of the graft between the anastomosis was calculated according to a previously described method.21 For
immunohistochemistry, we used rabbit anti-human
CD3 (SP-7, Microm, Francheville, France), mouse anti–
%-actin (1A4, Sigma, France), mouse anti-human CD57
(NC1, Immunotech, France), mouse anti-human CD68
(PG-M1, Dako, France), rat anti-mouse CD45 (30-F11,
Pharmingen, France) and rabbit anti-human & light
chain (Dako). Antibodies were used according to the
labeled streptavidin– biotin protocol.
Data Analysis
Unpaired Student’s t-test was used for comparison of
variables. Differences were considered statistically significant at p ' 0.05.
RESULTS
Transplantation of Human Mesenteric Arteries
Into SCID/Beige Mice
From each donor, a piece of mesentery was dissected
(see Methods) and up to 8 grafts were performed on 2
consecutive days. We estimate that in each piece of
85
678
Marcheix et al.
June 2006
Table 1. Experimental Groups of Mice Transplanted With Human Mesenteric Arteries
Groups
Control
Autologous
Allogeneic
Transplanted mice
Reconstituted mice
Human T cells (%)
Human IgG (!g/ml)
Deaths
4
9
14
—
8
9
—
4.88 ! 0.92
6.17 ! 1.50
—
67.23 ! 9.33
75.40 ! 11.54
0
1
1
The control group did not receive human spleen cells. One week after the arterial transplant, the autologous and allogeneic groups received 40 & 106 spleen cells
intraperitoneally from the same or another donor, respectively. Human T cells and human IgG in the reconstituted mice were measured at time of sacrifice, 5 weeks
after the arterial transplant, and are expressed as mean ! SD. There was no statistically significant difference between the autologous and the allogeneic groups.
harvested mesentery an average of 100 small arterial
segments had a size that matched that of the murine
infrarenal aorta. A total of 41 mice were transplanted
with arteries from 6 different donors by a single operator. The mean cold ischemia time was 20.6 ! 10.3
hours. Ten mice (24.4%) died during the operation and
4 (9.8%) were euthanatized because of thrombosis of
the graft on the day of operation.
Reconstitution of a Human Immune System
by Spleen Cells
One week after arterial transplantation, the 27 grafted
mice were divided into three groups: a control group
that did not receive any human spleen cells (n " 4); an
autologous group that received human spleen cells
from the donor of the transplanted mesenteric artery
(n " 9); and an allogeneic group that received human
spleen cells from another donor (n " 14). One mouse
in the autologous group died the day of injection of
spleen cells and another mouse (allogeneic group) died
2 days after injection (Table 1). Four mice in the
allogeneic group did not show any reconstitution (human CD3 cells #0.5% of circulating lymphocytes16).
There was no significant difference between the reconstituted mice of the autologous and allogeneic groups
with regard to percentage of human T cells or IgG
concentration. In addition to T cells, B and NK cells
were also detected, but at lower levels (results not
shown).
Humanized SCID/Beige Mice Reject Allogeneic Human
Mesenteric Arteries
Arteries transplanted into SCID/beige mice of the control group had no macroscopic or microscopic lesions
(Figure 2A, D and G). The three layers of the arterial
wall were unchanged when compared with arterial
segments before grafting. No neointimal proliferation
and no infiltration by human or murine cells could be
observed. Mesenteric arteries transplanted into SCID/
beige mice of the allogeneic group showed a strong
neointimal thickening with a positive staining for $-actin, suggesting vascular smooth muscle cell proliferation (Figure 2C and F). The media remained intact with
a strong $-actin staining. The neointimal areas showed
infiltration of human CD3% cells (Figure 2I). No lesion
was observed in the adjacent murine aorta (not shown).
Arteries transplanted into SCID/beige mice of the autologous group displayed moderate intimal thickening
(Figure 2B and E). No human CD3% cellular infiltration
was observed (Figure 2H). Additional immunohistochemical stainings were performed on arterial sections
from the allograft group. They showed the presence of
human NK cells (CD57%) and human monocytes/macrophages (CD68%) in the grafted artery (Figure 3A and
B). A diffuse deposit of human immunoglobulin was
found, particularly in the media (Figure 3C). In arteries
of mice that were not reconstituted with splenocytes, no
staining was found (not shown). No murine leukocytes
(CD45%) were found in the grafted arteries (Figure 3D).
Quantitative analysis showed that the neointimal index
(NI) per section was 1.47 ! 1.48% in the control group,
6.59 ! 2.06% in the autologous group and 36.94 !
10.18% in the allogeneic group (Figure 4). The intimal
thickening was significantly higher in the allogeneic
group than in the control and autologous groups (p #
0.01). The highest NI in the allogeneic group was
observed in arteries from donors that also displayed a
high NI in the autologous group. This finding stresses
the importance of using several arteries from the same
donor for comparative studies.
DISCUSSION
In this work we have described how the use of mesenteric arteries from organ donors permits the transplantation of multiple arterial segments from the same
donor into several SCID/beige mice. The grafted mice
received human spleen cells isolated from the same or
a different donor, allowing the creation of autologous as
well as allogeneic immune reconstitutions.
CVR remains the major cause of late failure of cardiac
transplants,1,22 despite recent progress in the field of
immunosuppressive treatment.23 The pathology of CVR
is characterized by an infiltration of immune cells into
the vascular layers associated with an intimal thickening
leading to a progressive obliteration of the vessels.1,2 In
an earlier experimental model, Lorber and co-workers
studied human allogeneic rejection in SCID/beige mice
reconstituted with human PBMC.16 They transplanted
collaterals of human internal thoracic artery or coronary
arteries into the mice and a typical CVR was described.
86
Volume 25, Number 6
Marcheix et al.
679
Figure 2. Morphology of human mesenteric arteries grafted into SCID/beige mice. Representative microphotographs show transversal sections
5 weeks after transplantation. Left column: non-humanized mouse (no injection of spleen cells); middle column: autologous combination; right
column: allogeneic combination. The first row (A–C) shows hematoxylin– eosin staining (original magnification !100), the second row (D–F)
shows staining for smooth muscle !-actin (original magnification !100), and the third row (G–I) immunohistochemical staining for human CD3
in the intima. Original magnifications: (G, H) !100; (I) !150. The size of the intima in the autologous and allogeneic groups is shown by the
vertical bars.
In our experience, vascular grafts obtained from surgical waste were often pathologic, and of variable size. It
was thus difficult to perform the anastomosis with the
sleeve technique and we could rarely obtain more than
one artery from the same patient. Importantly, as PBMC
and vascular grafts were not recovered from the same
donor, autologous controls could not be obtained.
The human mesenteric grafts used were harvested
and preserved under the same conditions as transplanted organs in clinical settings. In the mesentery, we
always found arterial segments that matched the size of
the murine infrarenal aorta. The application of the rapid
sleeve technique permitted an accelerated surgical procedure in the mice. However, the sleeve technique
could not always be applied at the distal anastomosis for
anatomic reasons. When the arterial segment was wide
or too short, a point-to-point suture was made. Even
when the internal diameters of the vessels (lumen)
were the same as the mouse aorta and the segment was
sufficiently long, a traditional anastomosis was sometimes necessary. The mesenteric arteries are muscular
arteries with a media layer that is more pronounced
than the media layer of the mouse aorta. The thickness
of the media varies from one donor to another. When
the media is thick, the distal part of the aorta has to be
stretched extensively to perform the sleeve technique
and cover the distal part of the artery. In such cases a
point-to-point suture is preferable to avoid an arterial
constriction that may provoke turbulence of blood
flow.
In previous models, injection of human PBMC restored human T lymphocytes, but not B cells or NK
cells, in the peripheral blood of the mice.13,24 Generally, an adequate secondary T-cell response in reconstituted mice has been described, whereas only a few
studies have noted that a primary response takes
place.25–27 We have shown previously that human
splenocyte transfer allows for reconstitution of human
T, B and NK populations in SCID/beige mice.20 Injection of 40 ! 106 spleen cells was optimal to obtain a
reproducible reconstitution. Fewer cells gave variable
immunologic reconstitution and higher doses increased
mortality of the mice. We have previously compared
intraperitoneal and intravenous injection of spleen cells
87
680
Marcheix et al.
June 2006
immune system because they supply co-stimulatory
signals necessary to maintain the T-cell response. In the
present study, 4 of the mice in the allogeneic group
were not reconstituted by injection of 40 ! 106 spleen
cells. This may be explained by poor viability of the
cryopreserved spleen cells from the allogeneic donor.
In fact, it was sometimes difficult to ensure optimal
A
a
b
c
1 cm
B
50
**
40
NI (%)
and we have confirmed earlier observations showing
that intravenous injections do not reconstitute the
mice, probably because the cells are trapped in the
pulmonary vascular bed.20
The lymphocyte populations seemed to be functional, as shown by the production of human IgG and
development of typical CVR lesions in the case of
allogeneic conflict. T cells are the most important cells
in the rejection phenomena, but other lymphocyte
populations also participate in allogeneic rejection.28,29
At the time of sacrifice, we found mainly T cells and
only a few human NK cells and monocytes in the graft
(Figures 2 and 3). However, it is likely that, at earlier
timepoints, these cell types have been more abundant
as they are part of the innate immune system that
usually is activated early during the immune response.
The grafts showed a diffuse staining for human immunoglobulin in the case of allografts, and in our study we
could not discriminate between the pathogenic effects
of allogeneic immune cells vs antibodies. Further studies are underway to study the effect of antibodies alone
for development of lesions. We did not stain for mouse
complement, but it is known that SCID/beige mice have
normal levels of complement and that mouse complement binds to human immunoglobulin.
The human spleen also contains antigen-presenting
cells (APC), which are important for a functional human
0.25 cm
Figure 3. Presence of human NK cells, monocytes and immunoglobulin in the arterial graft of mice reconstituted with allogeneic cells.
Representative transversal sections of an artery from the allograft
group at 5 weeks after transplantation. (A) Few human NK cells stained
by anti-CD57 (arrow). (B) Some human monocytes stained by antiCD68. (C) A diffuse deposit of human immunoglobulin is noted. (D) No
infiltration of murine leukocytes (anti-mouse CD45) can be seen.
Staining is by immunohistochemistry (original magnification !150).
30
20
10
0
Control
group
Autologous
group
Allogeneic
group
Figure 4. Quantification of CVR in the different groups of mice.
(A) Examples of virtual longitudinal profiles of grafted human arteries
from the three groups. The black areas represent the neointima.
Calculations were made on the basis of measures performed on
transversal sections (see Methods): (a) control group; (b) autologous
group; and (c) allogeneic group. (B) Morphometric analysis performed
on transplanted human mesenteric arteries. The average neointimal
thickness per section was quantified as neointimal index (NI) and
expressed as a percentage of the neointimal area relative to the area
of lumen " intima (NI # I/[L " I] ! 100).21 Control group: 4 animals;
autologous group: 8 animals; allogeneic group: 9 animals (see Table 1).
The difference between the allogeneic group and the two other groups
was statistically significant (p $ 0.01).
88
Volume 25, Number 6
cryopreservation of cells harvested outside normal
working hours. This observation once more stresses the
importance of controlled studies to reduce variations
between experimental conditions.
The intimal lesions in allogeneic combinations were
remarkably similar to the histopathology observed in
clinical CVR. Lymphocyte infiltration was found in the
intima and in the adventitia of the mesenteric arterial
graft. In addition, it is important to note that the lesions
were specific to the transplanted human arterial segments, and no lesions were observed in the adjacent
murine aorta. In the intima of the CVR lesions we
observed cells positively stained for !-actin, suggesting
smooth muscle cell proliferation. The media was relatively preserved, although the allogeneic group showed
a tendency for thinning of this layer. The conserved
media in this model contrasts with the model of aortic
allografts in rodents, usually showing massive medial
necrosis. This observation has somewhat discredited
the model of aortic transplants in rodents because the
media of arteries in clinical organ transplantation is not
undergoing massive necrosis.30 A mild intimal thickening developed under “autologous” conditions, probably
because of a non-specific inflammatory reaction due to
the prolonged cold ischemia, as observed in other
experimental models.31 In our previous model of orthotopic aortic allografts in mice, cold ischemia was
avoided and we did not observe any intimal thickening
in syngeneic combinations.6,7
In the present series, no animal death was caused by
graft-vs-host disease (GVHD). In other series, however,
we noted an increased incidence of fatal GVHD when
large numbers of spleen cells were injected.20 The
xenogeneic GVHD in SCID mice is not acute, and skin
or intestinal symptoms have been described rarely.32
Compared with SCID mice, SCID/beige mice have no
functional NK cells and macrophages that may interfere
with the injected cells. On the other hand, the presence
of human NK and B cells among the injected human
spleen cells might potentially amplify a GVHD reaction.
It is thus important to choose a dose of injected cells
that reconstitutes the human immune response adequately without increasing the risk of GVHD.
Earlier works on humanized mice reported the frequent incidence of Epstein–Barr virus (EBV)-positive
lymphomas in SCID mice reconstituted with human
PBMC from EBV-positive donors.11,33 More recent articles did not report an elevated rate of lymphoma
development in reconstituted SCID mice,13,16 and it has
been shown that functional human CD8" T cells in
reconstituted SCID mice can prevent the formation of
EBV" lymphoma.34 We found no case of lymphoma
during the observation period (4 weeks after injection
of spleen cells), but we cannot exclude the possibility
that lymphoma would occur later on.
Marcheix et al.
681
In conclusion, the presently described model provides a novel means to study human CVR in vivo. First,
it allows for comparison of autologous and allogeneic
situations. Second, the simultaneous grafting of multiple human arteries from the same donor into different
mice offers the opportunity to compare homogeneous
experimental groups. For instance, mice that do not
receive human spleen cells could be used to study the
influence of humoral factors (antibodies, cytokines) on
CVR occurrence. Mice that receive cells autologous to
the artery donor could be used to study the effect of
cold ischemia and conservation solutions. Studies of
mice receiving allogeneic spleen cells may permit evaluation of new approaches to prevent human allograft
rejection and also offer the possibility of performing
pre-clinical tests for compounds that interfere with
smooth muscle cell proliferation and endothelial cell
activation.
The authors thank Dr Talal Al Saati (Plateau technique
d’histopathologie expérimentale) for the preparation of histologic specimens. We also thank the staff of the animal
housing facilities, particularly Ms Nevoit, for kind assistance.
Finally, the use of tissues and cells from organ donors for
scientific research was made possible thanks to the consent of
the relatives and the cooperation of Dr Boudet and the
transplant coordination group at our hospital.
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90
Troisième Partie
Conclusion
91
La maladie vasculaire chronique reste la première cause de perte de greffon après un
an. En 2004, même si de nouvelles pistes thérapeutiques semblent être intéressantes, au
premier rang desquelles figurent le Sirolimus et l’Everolimus, aucun traitement n’a fait la
preuve de son efficacité (Keogh 2004, Eisen 2003).
Les modèles classiques ont montré leurs limites : les résultats obtenus chez le rongeur
sont difficilement transposables à l’homme, les modèles développés chez le primate sont
intéressants mais coûteux et difficiles à mettre en place, enfin, les essais cliniques chez
l’homme se heurtent à des limites d’ordre éthique.
Le but de ce travail était la mise au point d’un modèle original d’étude de la
maladie vasculaire chronique en reconstituant un conflit allogénique humain, in vivo,
chez des souris immunodéficientes.
Le recours à un protocole de prélèvement de tissus humains à fins scientifiques
chez les donneurs d’organes a permis d’obtenir un grand nombre de greffons vasculaires
utilisables chez la souris et de constituer une banque de cellules humaines.
Les protocoles de prélèvements à fins scientifiques étaient organisés dans le cadre
prévu par la loi, après autorisation de l’Établissement Français des Greffes et avis favorable
du Comité d’Ethique du C.H.U. de Toulouse.
Les prélèvements à fins scientifiques ont été effectués dans le même temps et dans les
mêmes conditions de protection que les prélèvements à fins thérapeutiques. Un autre avantage
était l’accès au typage HLA et à un bilan infectieux exhaustif systématiquement pratiqués
dans le cadre des prélèvements d’organes, garantissant, notamment, une relative innocuité
infectieuse des tissus utilisés pour nos souris immunodéficientes.
Dans ces conditions, nous avons pu constituer une banque de cellules typées, mettre en
place des greffons issus de mêmes donneurs chez des souris différentes. Des contrôles
isogéniques ont pu être effectués. Enfin, le degré d’incompatibilité entre les greffons et les
cellules utilisées dans le cas des allogreffes était connu.
À notre connaissance, l’équipe de Lorber et Pober est la seule à avoir rapporté la
reconstitution d’un conflit allogénique humain chez la souris SCID/Beige pour l’étude de la
maladie vasculaire chronique du greffon (Lorber 1999). Les greffons utilisés par cette équipe
étaient principalement des collatérales d’artère thoracique interne obtenues au cours de
pontages coronaires (« déchets chirurgicaux »). Nos tentatives de greffes de ce type de
vaisseau chez la souris n’étaient pas reproductibles. Il existait une différence importante de
calibre par rapport à l’aorte de souris. Seul un petit nombre de greffons utilisables était
92
prélevé chez la même personne (1 à 2). Ces greffons n’étaient pas indemnes de lésion
d’athérosclérose. Un bilan infectieux complet et un typage HLA étaient inconcevables pour
chaque patient. Enfin, il était impossible d’obtenir différents types cellulaires du même
patient.
Le recours à une procédure de prélèvement à fins scientifiques chez les donneurs
d’organes, nous a permis de surmonter tous ces obstacles. Les principaux inconvénients ont
été le caractère imprévisible et le nombre, aujourd’hui restreint, des procédures.
La reconstitution complète, chez la souris, d’un système immunitaire humain
fonctionnel était un des prérequis à la mise en place d’un modèle d’étude de la maladie
vasculaire chronique basé sur l’étude, in vivo, d’un conflit allogénique humain chez la
souris. Différents protocoles de reconstitution d’un système immunitaire humain chez la
souris ont été proposés (Mc Cune 1988, Mosier 1988, Kamel Reid 1988). Ils comportaient,
pour la plupart, trois inconvénients majeurs : une proportion importante de souris
développaient une maladie du greffon contre l’hôte à court terme (Murphy 1992, Huppes
1992), les lymphocytes T humains détectés dans le sang circulant des souris devenaient
souvent non fonctionnels (Bankert 1989, Tary-Lehman 1992), et la population
lymphocytaire B humaine n’était pas reconstituée (Pober 2003). En réponse à ces trois
inconvénients, la reconstitution d’un système immunitaire humain chez la souris
CB17.SCID/Beige à partir de splénocytes nous a semblé intéressante.
Les souris SCID/Beige sont obtenues par croisement de deux lignées mutantes. Il en
résulte une déficience conjuguée en cellules T et B et en système NK, si bien que ces souris
acceptent sans les rejeter toute greffe allo- ou xénogénique. Des travaux récents ont montré
l’intérêt de cette lignée pour la reconstitution d’un système immunitaire humain (Berney
2001). L’absence de système NK fonctionnel limiterait l’inactivation des cellules T humaines
implantées et les maladies du greffon contre l’hôte à court terme (Lorber 1999, Leblond
1997).
L’injection de splénocytes humains par voie intra péritonéale chez la souris
SCID/Beige a permis la reconstitution d’un système immunitaire humain. La comparaison du
pourcentage de souris présentant une reconstitution et le taux de mortalité au cours du premier
mois, nous incite à penser que la dose optimale à utiliser serait comprise entre 30 et 50
millions de splénocytes.
La reconstitution semble plus précoce et plus complète qu’en cas d’utilisation de
PBMC et pour des doses injectées très inférieures. Cette observation est probablement liée à
93
deux caractéristiques des cellules spléniques : une importante proportion de cellules B et la
présence
de
cellules
présentatrices
d’antigène
(cellules
dendritiques).
L’injection
concomitante de cellules présentatrices d’antigène permet d’expliquer à la fois la précocité de
la reconstitution et les faibles quantités cellulaires nécessaires. L’importante proportion de
cellules B participe certainement au caractère « mixte » de la reconstitution observée : T et B.
Le système immunitaire reconstitué est fonctionnel. Outre une colonisation des organes
lymphoïdes de souris par des cellules humaines, nous avons montré une sécrétion d’IgG
humaines et un rejet de greffe en combinaison allogénique.
Finalement, à court terme, l’utilisation de splénocytes permet une reconstitution rapide
de populations lymphocytaires humaines T et B sécrétant des anticorps humains et induisant
un rejet d’allogreffe humaine.
Les principaux inconvénients liés à l’utilisation de splénocytes sont le caractère
variable des résultats d’un donneur à un autre, l’échec de la reconstitution à long terme d’un
système immunitaire humain par des splénocytes et le risque de développer une maladie du
greffon contre l’hôte avec un chimérisme devenant instable à long terme. D’où l’impossibilité
de constituer un pool de souris reconstituées en attente de greffes, ce qui serait la situation la
plus proche de la transplantation d’organe humaine.
Même si en présence de tableaux cliniques évocateurs nous n’avons pas objectivé de
lésions histologiques confirmant le diagnostic de maladie du greffon contre l’hôte, la présence
d’un certain degré de GVHD est probable. Les cellules injectées étant majoritairement
matures, elles ne peuvent pas être éduquées pour reconnaître les tissus murins comme
éléments du soi. Même en l’absence de lésions histologiques, certains auteurs évoquent une
forme de GVHD chronique atténuée caractérisée par l’expression de certains marqueurs
lymphocytaires (Alegre 1994).
L’injection de 5 à 10 millions de cellules médullaires humaines par voie
intrapéritonéale n’a pas permis de reconstitution fiable d’un système immunitaire. Ces
résultats sont à confirmer sur une série plus importante, mais semblent aller dans le sens de
publications soulignant l’intérêt d’une irradiation préalable des animaux pour faciliter la
colonisation de la moelle osseuse murine par les cellules humaines (Kamel Reid 1988). Le
recours à des cellules médullaires souches sélectionnées (cellules CD34+), injectées par voie
intraveineuse, permettrait une reconstitution stable et prolongée, mais seulement plusieurs
mois après l’injection (Hiramatsu Blood 2003).
94
La reproduction de lésions de maladie vasculaire chronique du greffon en
réponse à un conflit allogénique humain constituait le but ultime de ce travail.
L’utilisation de collatérales d’artère mésentérique supérieure humaine au calibre
parfaitement adapté à l’aorte de souris associée à la technique d’anastomose rapide « Sleeve »
a permis de réaliser 39 greffes. Le taux de complications a été modéré au regard de nos
travaux préliminaires réalisés à partir de collatérales d’artère thoracique interne, lesquelles ne
permettaient pas la réalisation d’une anastomose « Sleeve » au niveau distal.
Nous avons observé qu’en l’absence de reconstitution d’un système immunitaire
humain et pour des taux d’Ig murines inférieurs à 3µg/l, les greffons explantés après un mois
de greffe ne présentaient pas d’épaississement intimal, y compris en cas d’ischémie froide
prolongée. Une sélection des souris par test de « leakiness » nous semble donc indispensable.
La valeur limite du taux d’immunoglobulines murines est à confirmer sur une série plus
importante de souris.
En configuration allogénique, un mois après la greffe, les lésions de maladie
vasculaire chronique étaient typiques, allant dans le sens de publications récentes qui ne
décrivent pas d’amincissement de la média ou de rupture de la limitante élastique interne
(Andriambeloson 2004).
Cependant, nous avons observé, dans le groupe des greffes isogéniques, un certain
degré d’hyperplasie intimale. Ces lésions étaient associées à un marquage alpha-actine positif
en immunohistochimie. En l’absence d’allo-incompatibilité, il est possible que ces lésions
soient dues pour une part à l’ischémie du greffon. L’ischémie froide n’entraînerait
d’épaississement intimal, par le biais d’une lésion endothéliale, qu’en présence d’un système
immunitaire fonctionnel, dans la mesure où les greffons implantés n’ont pas développé
d’hyperplasie après des durées comparables d’ischémie froide mais sans système immunitaire
fonctionnel. L’hyperplasie intimale dans le groupe des isogreffes pourrait être liée à une
sécrétion locale d’IFNγ (Wang 2004). Ces résultats demandent à être confirmés sur une plus
large série de greffes en condition isogénique avec des durées d’ischémie froide variables.
Enfin, nous nous interrogeons sur le caractère possiblement transitoire de ces lésions et nous
envisageons d’étudier ces lésions à court et long termes en sacrifiant les animaux au 15ème et
au 42ème jour post-opératoire.
L’étude histomorphométrique a permis une évaluation quantitative des lésions. Cellesci étaient significativement différentes entre les groupes, notamment entre les groupes iso- et
95
allogreffes. La comparaison des volumes néointimaux moyens par coupe nous a semblé le
critère le plus pertinent.
96
CONCLUSION GENERALE
Le but de cette thèse était de développer un modèle d’étude original de la maladie
vasculaire chronique. Nous avions quatre objectifs principaux : la mise en place d’un
protocole de prélèvements à fins scientifiques chez les donneurs d’organe, l’optimisation de la
reconstitution d’un système immunitaire humain à partir de splénocytes et de cellules
médullaires, la mise au point d’une technique de greffe de collatérales d’artères mésentériques
humaines chez la souris, et la reproduction puis l’évaluation de lésions vasculaires
chroniques.
La mise en place d’un protocole de prélèvement à fins scientifiques chez les
donneurs d’organes a permis d’obtenir des cellules et des greffons vasculaires humains de
bonne qualité, typés et en grand nombre.
Nous avons démontré que la reconstitution d’un système immunitaire humain
fonctionnel était possible chez la souris SCID/Beige par injection de splénocytes humains
par voie intrapéritonéale. Il semblerait que la dose de 40 millions de cellules constitue le
meilleur compromis avec un pourcentage de souris reconstituées supérieur à 80 % et des taux
de mortalité inférieurs à 20%. Cette reconstitution est mixte, associant une population
lymphocytaire B et T. Elle s’accompagne d’une sécrétion d’anticorps humains et d’un rejet de
greffon vasculaire humain en conditions allogéniques évoquant le caractère fonctionnel des
populations lymphocytaires humaines. Toutefois, cette reconstitution est transitoire : elle
s’atténue au-delà du premier mois.
La technique d’anastomose « Sleeve » a pu être transposée à la greffe de
collatérales d’artère mésentérique supérieure humaine. Trente-neuf greffes ont été
réalisées avec des taux de complication modérés.
Des lésions vasculaires chroniques typiques ont pu être observées dans le groupe des
allogreffes. Après implantation d’un greffon isogénique, chez la souris humanisée, un certain
degré d’hyperplasie intimale a été observé au 35ème jour, significativement moins important
par rapport au groupe des allogreffes, et probablement en rapport avec des lésions
endothéliales secondaires à l’ischémie. Des travaux ultérieurs sont nécessaires pour confirmer
ces lésions et observer leur évolution à plus long terme.
Finalement, la possibilité de reproduire le même conflit allogénique humain, in vivo,
chez plusieurs souris en même temps permet d’envisager de nouvelles perspectives dans
l’approche de mécanismes physiopathologiques ou dans l’évaluation préclinique de
substances de perfusion, de conservation ou de nouveaux traitements immunosuppresseurs.
97
La mise en place de ce modèle original d’étude de la maladie vasculaire chronique du
greffon nous permet d’envisager différentes perspectives à plus ou moins long terme. Uun
protocole d’étude du rôle de l’immunité humorale dans le développement des lésions de
rejet de greffe doit être mis en place, en utilisant en particulier des sérums de receveurs
d’organes présentant des anticorps anti-HLA, et ce en configurations « non humanisée » ou
« isogénique ». L’impact de différentes solutions de perfusion et de conservation sur le
développement de lésions intimales en iso- et allogénie pourrait également être étudié. À plus
long terme, ce modèle pourrait se prêter à des études pré cliniques, in vivo, de nouvelles
thérapeutiques immunosuppressives ou immunomodulatrices
(FTY720, Everolimus,
cellules régulatrices...)
98
Quatrième partie
Bibliographie
99
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.
114
RÉSUMÉ
Situation du sujet :
En dépit des progrès réalisés en matière d’immunosuppression, la maladie vasculaire
chronique (MVC) reste la première cause de perte du greffon après un an. Les modèles
expérimentaux apparaissent indispensables pour une meilleure compréhension des
mécanismes impliqués. Les modèles classiques sont limités par des difficultés de
transposition des résultats à des situations cliniques chez l’homme.
Objectif :
Le but de ce travail était de développer un modèle d’étude original de la MVC. Il s’agissait de
reconstituer de façon reproductible un conflit allogénique humain in vivo, chez des souris
immunodéficientes.
La mise au point de ce modèle supposait la réalisation de 4 étapes intermédiaires : 1. La mise
en place d’un protocole de prélèvement à fins scientifiques chez les donneurs d’organes. 2. Le
développement d’une technique assurant une humanisation reproductible de souris immunodéficientes. 3. La mise au point d’une technique chirurgicale de greffe du segment artériel
mésentérique humain chez la souris. 4. La mise en évidence de lésions de RVC dans le groupe
de souris greffées humanisées en combinaison allogénique et l’absence de lésions dans le
groupe contrôle isogénique.
Matériels et méthodes :
Un protocole de prélèvement de tissus humains chez les donneurs d’organes a été mis en
place, à l’échelle régionale après avis favorables de l’Etablissement Français des Greffes et du
Comité d’Ethique du CHU de Toulouse.
Des souris SCID/Beige déficientes pour l’immunité T, B et NK ont été utilisées après
vérification de l’absence d’immunité résiduelle (caractère « leaky »).
Une première partie de ce travail a consisté à la mise au point du protocole d’humanisation :
Des souris ont été réparties en 5 groupes recevant 5 à 100 millions de splénocytes humains et
en 2 groupes recevant 5 ou 10 millions de cellules médullaires. Un prélèvement sanguin
hebdomadaire permettait un typage des cellules humaines circulantes par cytométrie en flux,
et dosage des IgG humaines par technique ELISA. Après sacrifice, les organes lymphoïdes
étaient examinés en immunohistochimie et en cytométrie en flux à la recherche de cellules
humaines.
Dans une deuxième partie du travail, des souris SCID/Beige (non « leaky ») ont subi la greffe
d’un segment d’artère mésentérique humaine issue de donneurs d’organes. Cinq à huit greffes
ont été réalisées dans les 48 heures suivant chaque prélèvement multi organes. Le greffon
était anastomosé en position aortique sous rénale selon la technique d’anastomose « sleeve ».
Pour 6 souris, la greffe a été associée à une humanisation en combinaison isogénique, pour 12
souris en combinaison allogénique. Á titre de contrôle, des souris non « leaky » ont été
greffées sans humanisation associée (n=4). Des souris « leaky » ont par ailleurs été greffées
(n=4).
La reconstitution d’un système immunitaire humain était suivie de la même façon que pour
les souris simplement humanisées. Les souris étaient sacrifiées après 5 semaines. Le greffon
était analysé en histologie, en immunohistochimie et en histomorphométrie.
115
Résultats :
Soixante et onze souris ont été humanisées, avec un suivi moyen de 80,8 jours (+/22,4). L’injection de splénocytes a permis d’obtenir une humanisation des souris SCID/Beige
avec présence de cellules circulantes T (CD3+) et B (CD19+). Une synthèse d’IgG humaine a
été mise en évidence. La dose optimale de splénocyte nous a semblé être comprise entre 30 à
40 millions de cellules. A cette dose, plus de 80% des souris injectées ont présenté une
reconstitution des populations lymphocytaires circulantes. Cependant, cette reconstitution
nous a semblé transitoire : elle s’atténuait après 4 à 6 semaines. Une reconstitution stable et
prolongée n’a été mise en évidence que dans 13% des cas. L’injection de plus de 40 millions
de cellules a été associée à une surmortalité.
L’injection de cellules médullaires n’a pas permis de produire une reconstitution significative
des populations lymphocytaires.
Trente neuf souris ont été greffées, à partir de 8 donneurs différents. Le taux de mortalité peropératoire a été de 12,8%, le taux de thrombose précoce de 15,4%. Les durées d’ischémie
froide n’étaient pas significativement différentes entre les groupes. Pour les groupes iso- et
allogénique, les taux de lymphocytes T et B et d’immunoglobulines humains n’étaient pas
significativement différents entre les groupes.
Les souris non « leaky » non humanisées n’ont développé aucune lésion. Les souris du groupe
allogénique ont développé des lésions typiques de MVC. Les souris du groupe isogénique ont
présenté un épaississement intimal modéré, et significativement moins important que dans le
groupe des allogreffes.
Conclusion :
La mise en place d’un protocole de prélèvement de tissus humains à fins scientifiques chez les
donneurs d’organes nous a permis d’obtenir à la fois des greffons vasculaires et des cellules
humaines utilisables chez la souris. Greffons et cellules humaines étaient disponibles en grand
nombre et systématiquement typés.
Il a été possible de reconstituer des populations lymphocytaires T et B humaines chez la
souris SCID/Beige, à partir de splénocytes injectés par voie intra-péritonéale. La
reconstitution a été limitée à une période de 4 à 6 semaines.
Il a été possible de transposer la technique « Sleeve » à la greffe de collatérales d’artère
mésentérique supérieure humaine, dont le calibre était exactement superposable à celui de
l’aorte de souris.
Des lésions typiques de MVC ont été observées dans le groupe des allogreffes. Un
épaississement intimal modéré, dont le mécanisme reste a préciser, a été observé dans le
groupe des isogreffes.
Au total, la greffe de segments artériels mésentériques humains chez la souris SCID/Beige
humanisée nous semble être un modèle original d’étude du rejet vasculaire chronique.
Ce modèle offre de nombreuses perspectives parmi lesquelles l’étude du rôle du système
immunitaire humoral dans le développement des lésions de RVC, l’évaluation de différentes
solutions de perfusion ou de conservation ou encore l’évaluation préclinique, in vivo, de
nouvelles thérapeutiques immunosuppressives ou immunomodulatrices.
116
ABSTRACT
Background :
In spite of progress in the field of immunosuppressive treatment, the allograft vasculopathy
remains the first cause of graft loss after one year. The expérimental models appear essential
for a better understanding of the implied mechanisms The traditional models are limited
because of difficulties of transposition of the results to clinical situations in human.
Goals :
The goal of this work was to develop an original model to study AV consisting of the in vivo
reconstitution in immunodeficient mice of human allogeneix conflicts. To achieve this goal,
four intermediate stages were necessary : 1. The harvesting of human tissues in human
cadaveric organ donors 2. The reconstitution of complete and functional human immune
system in immunodeficient mice 3. The graft of human arterial grafts in mice 4. The
reconstitution of expérimental groups (control, isogeneic, allogeneic) to valid the
expérimental model of AV in allogeneic group and absence of AV in the control and
isogeneic groups.
Methods :
The harvesting of human tissues in human cadaveric organ donors was organized in the whole
Midi Pyrénées area after authorization of the ethic commitee of our insitution and of the
French Transplantation Agency. Pièces of mesentery and segment of spleen were removed
from the cadaveric organ donors.
Defective SCID/Beige mice for immunity T, B and NK were used qfter checking of the
absence of residual immunity (« leakiness »).
A first part of this work focused on the reconsituttion of the human immune system in
SCID/Beige mice : Mice were divided into 5 groups receiveing from 5 to 100 human illion
splenocytes and into 2 groups receiving 5 to 10 million medullary cells. A weekly blood
sample allowed typing of the circulating human cells (flow cytometry) and détection of
human IgG (ELISA). After sacrifice, the lymphoid bodies were examined in
immunohistochimy and flow cytometru ?
The second part of this work focused on the study of AV. SCID/Beige mice received infra
rénal transplantation of segments of terminal collatéral of human mesenteric arteru using the
« sleeve » anastomosis technique. Five to eight transplantation were carried out af in the 48
hours following each multi-organ harvesting. The transplantation was associated with an
isogeneic immune reconstitution in 6 mice, while 12 mice underwent allogeneic
reconstitution. Control mice underwent simple arterial transplantation without immune
reconstitution (n=4).
The mice were sacrificed after 5 weeks. The grafts were analyzed in histology,
immunohistochemistry and histomorphometry.
117
Results :
Seveenty-one mice underwent human immune reconstitution with a mean follow-up of 80.8
days. We observed successfull human immune reconstitution after intraperitoneal injection of
spleen cells with présence of circulating human T and B cells. Human circulating IgG were
also highlighted. The human immune reconsituttion seemed to be optimal when 30 to 40
million of human splenocytes were injected.
The optimal amount of splenocyte seemed to us to be ranging between 30 to 40 million of
splenocytes with 80% of successfully recosntitutited mice. However, this reconstitution was
transitoyru and variable.
Multiple human vascular grafts were found within the human mesentery. These grafts were
used as vascular grafts in mice : Thirty nine mice underwent vascular transplantation. Peroperational death rate was 12.8%, early thrombosis of the graft was the main complication
encountered in 15.4% of the cases.
The control mice did not develop any lésion. The allogeneic mice of the group developed
typical lésions of AV. The isogeneic micepresented a moderate intimal thickening
significantly less important than in the allogeneic group.
Conclusion :
The harvesting of human tissues was performed in cadaveric organ donors Vascular grafts
and human cells available in gréât number were systematically typdee.
The reconstitution of human T and B population was successfully achieved in SCID/Beige
mouse after intraperitoneal injection of human splenocytes.
The technique of the « Sleeve » anastomosis was successfully transposed to terminal
collatéral of the human Superior mesenteric artery, whose diameter was exactly superposable
with that of the mouse aorta.
Typical lésions of AV were observed in the allogeneic group. A moderate intimal thickening
was observed in the isogeneic group. The vascular grafts in the control group did not présent
any abnormality.
This model offers many prospects amoung which the study of the role of humoral immunity,
the assessment of new perfusion solution and the preclinical assessment of nex
immunosuppressive therapy.
118
ANNEXE
119
Liste des publications
Articles originaux (AO)
AO 1. Use of human mesenteric arteries to study chronic vascular rejection in SCID/Beige
mice reconstituted with human spleen cells
H Yacoub-Youssef, B Marcheix, D Calise, JC Thiers, H Benoist, N Blaes, B Segui, C
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Mugniot, P Soula, V Chabbert, D Roux, P Massabuau, G Meites, T Tran Van, P. Otal.
J Thorac Cardiovasc Surg, 2005;129:1050-5
AO 3. Human immune reconstitution with spleen cells in SCID/Beige mice
B Marcheix, H Yacoub-Youssef, D Calise, J-C Thiers, H Benoist, N Blaes, B Ségui, M
Thomsen and C Dambrin
Transplant Proc, 2005;37(6):2888-9
AO 4. Chronic vascular rejection: histological comparison between two murin experimental
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H Yacoub-Youssef, B Marcheix, D Calise, JC Thiers, H Benoist, N Blaes, B Ségui, C
Dambrin, M Thomsen.
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AO 5. Disruption of the brachial artery following closed posterior elbow dislocation
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J Vasc Surg, 2005 ;42(6):1230-2
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H Yacoub-Youssef, B Marcheix, D Calise, J-C Thiers, N Therville, H Benoist, N Blaes, B
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AO 7. Desensitization of PDGF Receptor-β by oxidized lipids in vascular cells and
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C Vindis, I Escargueil-Blanc, M Elbaz, B Marcheix, M-H Grazide, K Uchida, R Salvayre and
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B Marcheix, H Yacoub-Youssef, D Calise, J-C Thiers, N Therville, H Benoist, N Blaes, B
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J Thorac Cardiovasc Surg 2006;132(5):1037-41
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an alternative to pleural abrasion and pleurectomy.
B Marcheix, L Brouchet, C Renaud, O Garcia, A Mugniot, V Benouaich, J Berjaud and M
Dahan
Eur J Cardiothorac Surg, 2007 ;31(6) :1106-1109
AO 12. Endovascular management of pseudoaneurysm after previous surgical repair of
congenital aortic coarctation
B Marcheix, Y Lamarche, P Perrault, D Bouchard, R Cartier, M Carrier, LP Perrault, P
Demers
Eur J Cardiothorac Surg, 2007 ;31(6) :1004-1107
AO 13. Impact of induction treatment on post operative complications in the treatment of non
small cell lung cancer
L Brouchet, E Bauvin, B Marcheix, L Bigay-Game, C Renaud, J Berjaud, P-E Falcoz, N
Venissac, D Raz, D Jablons, J Mazieres, M Dahan
J Thorac Oncol 2007;2: 626–631
AO 14. Novel therapeutic aspects of percutaneous aortic valve replacement with the
CoreValve Revalving System
C Berry, A Asgar, Y Lamarche, B Marcheix, A Denault, A Basmadjian, A Ducharme, JC
Laborde, R Cartier, R Bonan
Catheter Cardiovasc Interv 2007;70(4):610-616
AO 15. Impact of Vacuum Assisted Venous Return and Cell Saver on post operative
inflammatory response
B Marcheix, M Carrier, C Martel, M Cossette, M Pellerin, D Bouchard, LP Perrault
Ann Thorac Surg, 2008;85(2):530-5
121
AO 16. Role of transoesophageal Echocardiography in percutaneous aortic valve replacement
with the CoreValve RevalvingTM System
C Berry, L Oukerraj, A Asgar, Y Lamarche, B Marcheix, AY Denault, J-C Laborde, R
Cartier, A Ducharme, R Bonan, A Basmadjian
Echocardiography, 2008;25(8):840-8.
AO 17. Comparison of long-term results of off-pump coronary artery bypass graft surgery in
diabetic and non diabetic patients
B Marcheix, F Vanden Eynden, P Demers, D Bouchard, R Cartier
Ann Thorac Surg, 2008 ;86(4) :1181-8.
AO 18. Preoperative autologous blood donation reduces the need for allogeneic blood
products: a prospective randomized study.
D Bouchard, B Marcheix, S Al-Shamary, F vanden Eynden, P Demers, D Robitaille, M
Pellerin, LP Perrault, M Carrier
Can J Surg 2008;51(6):422-427
AO 19. Surgical aspects of endovascular retrograde implantation of the aortic CoreValve
bioprosthesis in high-risk older patients with severe symptomatic aortic stenosis
B Marcheix, Y Lamarche, C Berry, A Asgar, J-C Laborde, A Basmadjian, A Ducharme, A
Denault, R Bonan, R Cartier
J Thorac Cardiovasc Surg, 2007;134:1150-6
AO 20. Stent-grafting of dissected descending aorta in patients with Marfan’s syndrome
B Marcheix, H Rousseau, V Bongard, R Heijmen, C Nienaber, M Ehrlich, P Amabile, JP
Beregi, R Fattori
JACC Cardiovascular Interventions 2008 ;1(6) :673-80.
AO 21. Vers une nouvelle prise en charge des ruptures traumatiques aiguës de l’isthme
aortique
L Richeux, C Dambrin, B Marcheix, V Chabbert, G Meites, M Mazerolles, A Mugniot,
P Massabuau and H Rousseau
J Radiol, 2004;85:101-6
AO 22. One-Year Follow-Up of Nonrandomized Comparison between Coronary Artery
Bypass Grafting Surgery and Drug-Eluting Stent for the Treatment of Unprotected Left Main
Coronary Artery Disease in Elderly Patients (Aged >/=75 Years).
R Ghenim, J Roncalli, AM Tidjane, V Bongard, A Ziani, N Boudou, N Dumonteil, B
Marcheix, B Léobon, D Carrié.
J Interv Cardiol. 2009 ;22 (6) :520-6.
AO 23 Prognosis of perioperative myocardial infarction after off-pump coronary artery
bypass surgery.
F Vanden Eynden, R Cartier, B Marcheix, P Demers, D Bouchard.
J Cardiovasc Surg (Torino). 2009;50(4):535-43
AO 24. TRPC1 is regulated by caveolin-1 and is involved in oxidized LDL-induced apoptosis
of vascular smooth muscle cells
C Ingueneau, U Huynh-Do, B Marcheix, A Athias, P Gambert, A Nègre-Salvayre, R Salvayre
et C Vindis
J Cell Mol Med, 2008; à paraître
122
AO 25. Anatomical bases of recurrent nerve lesions during mediastinoscopy
V Benouaich, B Marcheix, L Carfagna, L Brouchet, J Guitard
Surg Radiol Anat, 2009:31(4):295-9.
AO 26. The anterior intermeniscal ligament of the knee. A comparative anatomic and MR
study
PS Marcheix, B Marcheix, J Siegler, P Bouillet, P Chaynes, D Valleix, C Mabit
Surg Radiol Anat 2009, 31:331-334
AO 27. 30 days outcome and vascular complications after transarterial aortic valve
implantation using both Edwards Sapien™ and Corevalve Revalving™ bioprosthesis in a
mixed population
D Tchetche, N Dumonteil, A Sauguet, F Descoutures, A Luz, O Garcia, P Soula, B Marcheix,
Y Gabiache, B Farah, G Fournial, D Carrie, J Fajadet
EuroIntervention, 2009, sous presse
123
Revues générales (RG)
RG 1. Reconstitution of a human immune system in immunodeficient mice: models of human
allreaction in vivo
M Thomsen, H Yacoub-Youssef, B Marcheix
Tissue Antigen, 2005;66(2) :73-82
RG 2. Stent-grafts repair of the thoracic aortic aneurysms
H Rousseau, JP Bolduc, C Dambrin, B Marcheix, G Canevet, P Otal
Tech Vasc Interventional Rad, 2005;8:61-72
RG 3. Endovascular treatment of thoracic dissection
H Rousseau, O Cosin, B Marcheix, V Chabbert, M Midulla, C Dambrin, C Cron, B Leobon,
C Conil, P Massabuau, P Otal, F Joffre
Semin Intervent Radiol 2007;24:167-179
RG 4. Léiomyosarcome de la veine cave inférieure
B Marcheix, C Dambrin, F Muscari, K Joseph Hein, R Guimbaud, Ph Otal
J Chir, 2003;140(3):140-8
RG 5. Endoprothèses (ou stent-grafts) et pathologies de l’aorte thoracique descendante
H Rousseau, B Marcheix, V Chabbert, C Dambrin, C Cron, B Leobon, C Conil, P Massabuau,
P Otal, F Joffre
Arch Mal Cœur Vaiss 2006 ;99 :12 :1215-1219
RG 6. Les syndromes aortiques aigus
H Rousseau, B Marcheix, V Chabbert, O El Hassan, C Cron, S Lopez, C Conil, P Massabuau,
MA Maracher, J Auriol, F Dedouit, P Otal,
Sang Thrombose Vaisseaux 2009 ;21(3) :112
124
Cas cliniques (CC)
CC 1. Post traumatic pseudo aneurysm of the hepatic artery
C Dambrin, B Marcheix, T Birsan, C Cron, F Muscari, B Suc, A Cérène, H Rousseau
J Trauma, 2005;59:239-42
CC 2. Surgical treatment of an aortic arch aneurysm without cardio-pulmonary bypass :
endovascular stent-grafting after extra-anatomic bypass of supra-aortic vessels
C Dambrin, B Marcheix, L Hollington, H Rousseau
Eur J Cardiothorac Surg, 2005;27(1):159-61
CC 3. Compressive intrapelvic synovial cysts: an early complication of an HA-coated cup.
A Nehme, DA Oakes, B Marcheix, A Gomez-Brouchet, J Puget
Clin Orthop, 2005;430:232-6
CC 4. Survival after spontaneous aortic rupture in a patient with Ehlers-Danlos syndrome
C Dambrin, B Marcheix, T Birsan, MB Delisle
Eur J Cardiothorac Surg, 2005;28(4):650-2
CC 5. Pulmonary angiomyolipoma
B Marcheix, L Brouchet, C Renaud, A Gomez-Brouchet, L Hollington, V Chabbert and M
Dahan
Ann Thorac Surg 2006, 2006;82(4):1504-6
CC 6. Recurrency of secondary hyperparathyroidism: a sixth mediastinal parathyroid gland
B Marcheix, L Brouchet, J Berjaud and M Dahan
Eur J Cardiothorac Surg 2006;30(5):808-10
CC7. Surgical treatment of a rare association: aberrant right coronary origination, coronary
arterio-venous fistula and aortic root aneurysm.
F Vanden Eynden, P Demers, B Marcheix, D Bouchard, R Cartier, M Pellerin
J Thorac Cardiovasc Surg, 2007;133(1):258-259.e2.
CC8. Alternative approach for stent-grafting of the thoracic descending aorta: the antegrade
right axillary approach
B Marcheix, P Demers, F Vanden Eynden, Y Lamarche, E Therasse, R Cartier
J Thorac Cardiovasc Surg 2007;133 :1639-41
CC9. Catheter Ablation of Ventricular Tachycardia in a patient with hindered access to the
left ventricle: surgical approach using left lateral thoracotomy
P Maury, B Marcheix, A Duparc, A Hebrard, C Paquie, P Mondoly, A Rollin, M Delay
Pacing Clin Electrophysiol. 2009;32(4):556-60.
CC 10. Aortoenteric fistula after endovascular abdominal aortic aneurysm repair
C Chenu, B Marcheix, C Barcelo, V Benouaich, G Habanbo, C Cron, X Chauffour, A Cérène,
H Rousseau
Eur J Vasc Endovasc Surg, 2009:37(4) :401-6
125
CC 11. Transfemoral aortic valve implantation with pre-existent mechanical mitral prosthesis:
evidence of feasibility.
N Dumonteil, B Marcheix, P Berthoumieu, P Massabuau, E Dieye, I Decramer, G Fournial, D
Carrié.
JACC, Cardiovascular Interventions 2009;2(9):897-8.
CC 12. Un cas de faux anévrysme post traumatique de l’artère hépatique traité par
embolisation per cutanée transhépatique
B Marcheix, C Dambrin, C Cron, JF Sledzianowski, J Aguirre, B Suc, A Cérène, H Rousseau
Ann Chir, 2004;129(10):603-60
CC 13. Complications tardives d’un faux anévrysme du ventricule gauche : surinfection et
péricardite purulente
V Benouaich, B Marcheix, E Grunenwald, C Dambrin, C Cron, R Ghenin, N Dumonteil,
L Brouchet, M Galinier, A Cérène
Ann Cardiol Angeiol 2007 ;56(6) :316-18
CC 14. Insuffisance mitrale et maladie de Wegener
M Dupuy, B Marcheix, Z Dickson, V Benouaich, E Grunenwald, C Cron, D Chauveau
Ann Cardiol Angeiol, 2009, à paraître
126
Lettres à la rédaction (LR)
LR 1. Surgical aspects of endovascular retrograde implantation of the aortic CoreValve
bioprosthesis in high-risk older patients with severe symptomatic aortic stenosis
Reply to the editor.
B Marcheix, R Cartier
J Thorac Cardiovasc Surg, 2008 ;135(6) :1408
LR 2. Impact of Vacuum Assisted Venous Return and Cell Saver on post operative
inflammatory response. Reply to the editor.
B Marcheix, M Carrier
Ann Thorac Surg, 2008;86(5):1723
127
Publications didactiques
1. La médiastinoscopie.
B Marcheix , L Brouchet, C Renaud, J Berjaud, M Dahan
Encycl Med Chir, Traité de Techniques chirurgicales – Thorax 2004: 42-175
2. Techniques de réparation de la paroi thoracique.
B Marcheix, L Brouchet, C Renaud, J Berjaud, C Renaud, J Giron, A Gomez, M Dahan.
Encycl Med Chir, Traité de Techniques chirurgicales – Thorax 2005:42-472
3. Technique de l’ostéosynthèse costale.
B Marcheix, L Brouchet, C Renaud, J Berjaud, M Dahan.
Encycl Med Chir, Traité de Techniques chirurgicales – Thorax, 2005 :42-473
4. Exérèses pulmonaires partielles.
L Brouchet, B Marcheix, C Renaud, J Berjaud, M Dahan.
Encycl Med Chir, Traité de Techniques chirurgicales – Thorax, 2005 :42-350
5. Réparation par endoprothèse (stent-graft) des anévrismes de l'aorte thoracique.
H Rousseau, JP Bolduc, C Dambrin, B Marcheix, G Canevet, V Chabbert, P Otal, F Joffre
Encycl Med Chir, Radiodiagnostic III - Coeur-poumon 32-210-J-10
6. Tumeurs de la paroi thoracique.
B Marcheix, L Brouchet, C Renaud, J Berjaud, C Renaud, J Giron, A Gomez, M Dahan.
Encycl Med Chir, Traité de Médecine – Pneumologie 2009 : à paraître
128
Chapitres de livres
1. Diagnostic imaging of type B aortic dissection. H Rousseau, JP Bolduc, B Marcheix, G
Canevet, V Chabbert, C Dambrin, C Cron, A Mugniot, P Massabuau, P Otal, F Joffre.
Charring Cross 2005
2. Acute traumatic aortic rupture: Stent-graft repair. H Rousseau, JP Bolduc, C Dambrin, B
Marcheix, G Canevet, B Leobon, C Cron, P Otal, JM Bartoli, G Fournial
Thoracic Aortic Diseases. H Rousseau, JP Verhoye, JF Heautot Editors. Springer 2006: 331340.
3. Stent-grafts repair of the thoracic aortic aneurysms. H Rousseau, JP Bolduc, C Dambrin, B
Marcheix, G Canevet, V Lannareix, C Cron, A Mugniot, P Otal and F Joffre
Vasc Interventional Radiology, Current evidence in endovascular surgery. MG Cowling,
Editor. Medical radiology, Diagnostic imaging AL Baert, M Knauth, K Sartor. Springer. 2006
Chapitre 13, pages 101-112
4. Indications for endovascular treatment: Which treatment for acute traumatic aortic
dissections? H Rousseau, M Midulla, B Marcheix, C Dambrin, V Chabbert, C Cron, B
Leobon, D Roux, P Soula, G Canevet, P Otal, F Joffre. Thoracic Combo – From theory to
practice – Thoracic aortic dissections and their endovascular treatment – Didactic Manual and
Procedures – MEET – Amor, Bergeron, Inglese, Ischinger, Mathias, Raithel Editors. 2007
Chapitre 5.b, pages 192-202
5. Imagerie des flux aortiques par IRM. Application clinique sur la pathologie aortique
thoracique
H Rousseau, R Moreno, M Midulla, B Marcheix, F Nicoud
Syndromes aortiques aigus, Editions Springer, Editeurs : Rousseau-Verhoye-Heautot. P37
6. Stents grafts de l’aorte thoracique ascendante
H Rousseau, B Marcheix, V Chabbert, C Dambrin, C Cron, S Lopez, C Conil, P Massabuau,
MA Maracher, J Auriol, P Otal, F Joffre
Syndromes aortiques aigus, Editions Springer, Editeurs : Rousseau-Verhoye-Heautot. p67
7. Dissections aigues non compliquées. Des stents grafts pour qui ?
H Rousseau, B Marcheix, V Chabbert, C Dambrin, C Cron, S Lopez, C Conil, P MAssabuau,
MA Maracher, J Auriol, P Otal, F Joffre, JP Beregi
8. Rupture traumatique de l’aorte. Traitement endovasculaire.
B Marcheix, V Chabbert, C Cron, S Lopez, J Auriol, C Dambrin, H Rousseau
129
Contributions orales ou affichées à des congrès ayant donné lieu à des actes
Contributions choisies par des comités de sélection
1. Fistule broncho-pleurale après pneumonectomie et longueur du moignon bronchique
A Seguin, E Martinod, V Costache, B Marcheix, X de Kérangal, D Selka, P Bagan, M-D
Destable, M Dahan, J-F Azorin.
Société française de Chirurgie Thoracique et Cardio-Vasculaire (SFCTCV), Marseille, juin
2002, Communication orale
2. Influence pronostique de la date de survenue des thromboses de l’artère hépatique après
transplantation hépatique
F Muscari, B Marcheix, B Suc, J Aguirre, G di Mauro, JP Duffas, G Fourtanier
XVIIIèmes journées de la Société Française de Chirurgie Digestive, Lyon décembre 2003,
Communication affichée
3. Traitement endovasculaire d’un faux anévrysme post-traumatique de l’artère hépatique
B Marcheix, C Dambrin, C Cron, F Muscari, A Cérène, H Rousseau.
SFCTCV, Toulouse Juin 2004 Communication orale
4. Traitement endovasculaire sans circulation extra corporelle d’un anévrysme de la crosse
aortique après pontage extra anatomique des vaisseaux supra aortiques
B Marcheix, C Dambrin, H Rousseau, C Cron, P Soula, JM Carrié, A Cérène.
SFCTCV, Toulouse Juin 2004, Communication orale
5. Chronic vascular rejection in human arteries studied in humanised SCID/beige mice
H Yacoub-Youssef, B Marcheix, L Richeux, D Calise, C Dambrin, N Blaes, B Segui, JC
Thiers, H Benoist, M Thomsen.
18th European Immunogenetics and Histocompatibility Conference, Sofia, Mai 2004
6. Use of human mesenteric arteries to study chronic vascular rejection in SCID/beige mice
reconstituted with human spleen cells.
H Yacoub-Youssef, B Marcheix, D Calise, JC THiers, H Benoist, N Blaes, B Segui, C
Dambrin, M Thomsen.
20th International Congress of the transplantation Society, Vienne, Septembre 2004
7. Human immune reconstitution with spleen cells in SCID/Beige mice
B Marcheix, H Yacoub-Youssef, D Calise, J-C Thiers, H Benoist, N Blaes, B Segui, M
Thomsen, C Dambrin
4ème congrès de la Société Francophone de Transplantation, Bruxelles, 18-20 novembre
8. Chronic vascular rejection: histological comparison between two murin experimental
models
H Yacoub-Youssef, B Marcheix, D Calise, JC Thiers, H Benoist, N Blaes, B Segui, C
Dambrin, M Thomsen
4ème Congrès de la Société Francophone de Transplantation, Bruxelles, 18-20 novembre
130
9. Modèle experimental micro-laparoscopique de prostatectomy radicale avec anastomose
uretro-rectale chez le rat
C Calvet, B Malavaud, B Marcheix, P Rischmann, C Vaessen
98ème Congrès Français d’Urologie (Association Française d’Urologie), Paris, 18 novembre
10. Human allogeneic vascular rejection in CB17.SCID/Beige mice: graft of human
mesenteric arteries combined with lymphoid reconstitution with human spleen cells
B Marcheix, H Yacoub-Youssef, D Calise, X Game, J Thiers, N Therville, N Blaes, H
Benoist, B Ségui, M Thomsen and C Dambrin
American Society of Transplantation 9th Annual Winter Symposium and Canadian Society of
Transplantation 2005 Annual Scientific Meeting, Banff, AB, Canada, 17 au 20 mars 2005,
11. Human allogeneic vascular rejection in CB17.SCID/Beige mice: graft of human
mesenteric arteries combined with lymphoid reconstitution with human spleen cells
B Marcheix, H Yacoub-Youssef, D Calise, X Game, J Thiers, N Therville, N Blaes, H
Benoist, B Ségui, M Thomsen and C Dambrin
American Transplant Congress 2005 meeting, Seattle, WA, USA, 21 au 25 mai 2005
12. Mid-term results of endovascular repair of blunt aortic ruptures
B Marcheix, C Dambrin, V Chabbert, C Cron, A Mugniot, P Otal, A Cérène and H Rousseau
The European Society for Cardiovascular Surgery, 54th International Congress, Greece, May
19-22, 2005, Communication orale
13. Luxation postérieure du coude fermée et ruptures de l’artère brachiale
B Marcheix, X Chaufour, L Casbas, B Saint-Lèbes, A Barret et J-P Bossavy
SFCTCV, Paris, Juin 2005, Communication affichée
14. Transplantation d’artères mésentériques humaines chez la souris CB.17 SCID/Beige
« humanisée » : un modèle original d’étude du rejet vasculaire chronique humain in vivo
B Marcheix, H Yacoub-Youssef, D Calise, J-C Thiers, B Ségui, H Benoist, M Thomsen, C
Dambrin
SFCTCV, Paris, Juin 2005, Communication orale
15. Traitement endovasculaire d’une plaie de l’aorte abdominale par arme blanche
B Marcheix, C Dambrin, C Cron, F Muscari, B Suc, P Barrier, G Canevet, A Cérène et H
Rousseau
SFCTCV, Paris, Juin 2005, Communication affichée
16. Résultats à moyen terme du traitement endovasculaire des ruptures traumatiques de
l’isthme aortique
B Marcheix, C Dambrin, V Chabbert, C Cron, A Mugniot, G Canevet, P Otal, P Soula, G
Fournial, A Cérène et H Rousseau
SFCTCV, Paris, Juin 2005, Communication orale
131
17. Luxation du coude avec lésion vasculaire : à propos de 6 cas
JE Ayel, B Marcheix, X Chaufour, P Mansat et P Bonevialle
Société Française de Chirurgie Orthopédique et Traumatologie, Paris, Novembre 2005
Communication orale
18. Fistule gastropéricardique : une complication tardive de la chirurgie pour obésité morbide
C. Renaud, B. Marcheix, L. Brouchet, B. Suc, A.G. Weber, V. Chabbert, J. Berjaud et M.
Dahan
SFCTCV, Paris, 9-10 décembre 2005, Communication orale
19. Complications des pneumonectomies – Résultats de la base de données thoracique
française : EPITHOR
L. Brouchet, C. Renaud, B. Marcheix, J. Berjaud et M. Dahan
SFCTCV, Paris, 9-10 décembre 2005, Communication orale
20. Hyperparathyroidie récidivante : une 6ème parathyroide médiastinale
B Marcheix, L Brouchet, C Renaud, J Berjaud, M Dahan
SFCTCV, Bordeaux 2006, Communication affichée
21. Symphyses pleurales au nitrate d’argent
B Marcheix, L Brouchet, C Renaud, J Berjaud, M Dahan
SFCTCV, Bordeaux 2006, Communication affichée
22. Anévrysmes Aorte Descendante : résultats à moyen terme du traitement endovasculaire
B Marcheix, C Dambrin, V Chabbert, C Cron, G Canevet, P Otal, P Soula, G Fournial, A
Cérène et H Rousseau
SFCTCV, Bordeaux 2006, Communication orale
23. Desensitization of PDGF Receptor-ß by oxidized lipids in vascular cells and
atherosclerotic lesions. Prevention by aldehyde scavengers
C Vindis, I Escargueil-Blanc, M Elbaz, B Marcheix, M-H Grazide, K Uchida, R Salvayre, A
Nègre-Salvayre
3ème congrès annuel de la NSFA, Biarritz, 15-17 juin 2006, communication orale
24. Endovascular repair of traumatic rupture of the aortic isthmus: medium-term results
O Cosín, H Rousseau, B Marcheix, C Dambrin, C Cron, M Bennaceur, V Chabbert, P Otal, F
Joffre
Cardiovascular and interventional radiological society of Europe, Rome 9-13 septembre 2006,
Communication orale
25. Lessons learned from 103 surgical repairs of periprosthetic leak
Y Lamarche, D Bouchard, B Marcheix, P Demers, A Basmadjian, LP Perrault, Y Hébert, M
Carrier, R Cartier, M Pellerin
Canadian Society of Cardiac Surgeons, Vancouver 21-24 octobre 2006, Poster
Abstract paru dans Can J Surg
132
26. Impact of Vacuum Assisted Venous Return and Cell Saver on post operative
inflammatory response
B Marcheix, M Carrier, C Martel, M Cossette, D Bouchard, M Pellerin, LP Perrault
American Heart Association, Chicago 2006, Poster
Abstract paru dans Circulation
27. Percutaneous retrograde implantation of aortic Corevalve bioprosthesis in elderly high
surgical risk patients with severe symptomatic aortic stenosis
Y Lamarche, B Marcheix, C Berry, J-C Laborde, A Basmadjian, A Denault, R Bonan, R
Cartier
American Heart Association, Chicago 2006, Communication orale
Abstract paru dans Circulation
28. Impact of perioperative myocardial infarction on long-term follow-up in Off Pump
coronary artery bypass
F Vanden Eynden, B Marcheix, Qian Xu, R Cartier
Belgian association for cardio-thoracic surgery, 11th congress on cardio-thoracic surgery, 18
novembre 2006, Bruxelle, Belgique, Communication orale
29. Influence of diabetes on long-term survival in systematic off-pump coronary artery bypass
surgery
B Marcheix, F Vanden Eynden,P Demers, D Bouchard, M Pellerin, R Cartier
European Society of Cardiovascular Surgery, Venise 2007, Communication orale
Abstract paru dans Interactive CardioVascular and Thoracic Surgery 2007;6(1):S1
30. Endovascular management of pseudo-aneurysms after previous surgical repair of
congenital aortic coarctation
B Marcheix, Y Lamarche, P Perrault, R Cartier, D Bouchard, M Carrier, LP Perrault and P
Demers
European Society of Cardiovascular Surgery, Venise 2007, Poster
Poster sélectionné pour une miniprésentation orale
Abstract paru dans Interactive CardioVascular and Thoracic Surgery 2007;6(1):S89
31. Effect of vacuum assisted venous return and of processing of pericardial blood with a cell
saver device on complement pathways during coronary artery bypass graft surgery: a
prospective randomized study
European Society of Cardiovascular Surgery, Venise 2007, Poster
Abstract paru dans Interactive CardioVascular and Thoracic Surgery 2007;(6)1:S142
32. Étude du sinus coronaire en tomodensitométrie multi barrette
B Marcheix, M Bennaceur, T Schlatter, J Rimailho, M Rongière, P Vaysse, P Chaynes
Congrès de l’association des morphologistes, Limoges, Juin 2007, Communication orale
33. Anatomie tomodensitométrique des anomalies congénitales des artères coronaires
T Schlatter, B Marcheix, J Rimailho, M Rongière, P Vaysse, P Chaynes
Congrès de l’association des morphologistes, Limoges, Juin 2007, poster
133
34. Aspects chirurgicaux du remplacement valvulaire aortique percutané par voie rétrograde
(bioprothèse Core Valve) chez les patients âgés à haut rique présentant une sténose aortique
sévère
B Marcheix, Y Lamarche, C Berry, JC Laborde, A Basmadjian, A Ducharme, A Denault, R
Bonan et R Cartier
SFCTCV, Besançon 2007, Communication orale
35. Effets de l’utilisation du cell saver et du retour veineux assisté au cours de la circulation
extracorporelle sur la réaction inflammatoire post opératoire et sur les voies du complément :
une étude prospective randomisée
SFCTCV, Besançon 2007, Poster
36. Abords Abords chirurgicaux des artères fémorales,axillaires,humérales,carotides
M Bennaceur, B Marcheix, H Rousseau
Société Française d’Imagerie Cardiaque et Vasculaire diagnostique et interventionnelle,
Marseille, Juin 2007, Communication orale
37. Stent-grafting of dissected descending aorta in patients with Marfan’s syndrome
B Marcheix, H Rousseau, R Heijmen, C Nienaber, M Ehrlich, P Amabile, JP Beregi, R Fattori
Société Française de Chirurgie Thoracique et Cardiovasculaire, Versailles, Juin 2008
Communication orale
38. Fistule aorto-jéjunale après traitement endovacsulaire de l’aorte abdominale
C Chenu, B Marcheix, C Cron, V Benouaich, G Habanbo, C Dambrin, H Rousseau, A Cérène
Société Française de Chirurgie Thoracique et Cardiovasculaire, Versailles, Juin 2008
Communication orale
39. Etude par IRM dynamique de la biomécanique de l’aorte thoracique
B Marcheix, R Moreno, T Schlatter, H Rousseau
Congrès de l’association des morphologistes, Bordeaux, Juin 2008, communication orale
40. Modifications morphologiques des zones d’implantation des endoprothèses après
traitement endovasculaire des traumatismes aortiques
T Schlatter, B Marcheix, L Carfagna, P Chaynes, P Vaysse
Congrès de l’association des morphologistes, Bordeaux, Juin 2008, poster
41. Brain Death Induces Early Coronary but Not Pulmonary Artery Endothelial Dysfunction.
A. Mommerot, B. Marcheix, M. Carrier, L. Perrault
International Society of Heart and Lung Transplantation, Paris, Avril 2009
Abstract dans J Heart Lung Transplantation 2009, Volume 28, Issue 2, Pages S150-S150
42. Contrast angiography during aortic balloon dilatation
N Dumonteil, B Marcheix, G Fournial, D Carrié
Euro PCR, Barcelone, Mai 2009
Communication orale
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doctorat de l`université de toulouse doctorat de l`université de

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