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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PARMA
Dipartimento di Genetica, Biologia dei Microrganismi, Antropologia, Evoluzione
DOTTORATO DI RICERCA IN BIOTECNOLOGIE
XX CICLO
Studio nel sistema modello Saccharomyces cerevisiae di
mutazioni patologiche nel gene POLG codificante la DNA
polimerasi mitocondriale
Coordinatore:
Prof. Nelson Marmiroli
Docenti guida:
Prof.ssa Iliana Ferrero Fortunati
Prof.ssa Tiziana Lodi
Dottorando:
Enrico Baruffini
Queste tenebre, dunque, e questo terrore dell’animo
occorre che non i raggi del sole né i dardi lucenti del giorno
disperdano, bensì la realtà naturale e la scienza.
Tito Lucrezio Caro, De Rerum Natura (I, 146-148)
Indice
1. Introduzione
1.1 Mitocondri: struttura e funzione
1.2 Il DNA mitocondriale
1.3 Patologie mitocondriali
1.4 DNA polimerasi γ (Pol γ)
1.5 Il lievito S. cerevisiae come sistema modello
1.6 Geni che influenzano l’accumulo di cloni petite
1
2
8
18
24
49
53
2. Scopo della ricerca
67
3. Materiali e metodi
69
3.1 Ceppi di lievito utilizzati
3.2 Ceppi batterici utilizzati
3.3 Terreni di crescita
3.4 Vettori plasmidici
3.5 PCR
3.6 Sequenziamento
3.7 Manipolazione del DNA
3.8 Trasformazioni
3.9 Estrazione di DNA
3.10 Southern blot
3.11 Estrazione di RNA da lievito e Northern blot
3.12 Estrazione di proteine da lievito
3.13 Western blot
3.14 Saggio di gap filling
3.15 Analisi fenotipiche
3.16 Marcatura dell’mtDNA con DAPI
4. Risultati (I parte)
4.1 Costruzione di un ceppo ∆mip1 e clonaggio del gene MIP1
4.2 Analisi in silico e scelta delle mutazioni
4.3 Introduzione delle mutazioni in MIP1 e trasformazione di
Saccharomyces cerevisiae
4.4 Analisi fenotipica dei ceppi DWM-5A
4.5 Studio della dominanza/recessività delle mutazioni G224A e
Y757C
4.6 Rescue genetico del fenotipo: incremento dei dNTP pool
4.7 Rescue chimico del fenotipo: trattamento con l’antiossidante
acido diidrolipoico
4.8 Discussione
5. Risultati (II parte)
5.1 Scelta delle mutazioni
70
72
72
74
76
80
81
82
83
84
84
85
85
85
86
87
88
89
92
95
97
101
102
104
106
111
112
I
5.2 Costruzione degli alleli mip1 mutati e loro introduzione in
Saccharomyces cerevisiae
5.3 Effetto delle mutazioni mip1
5.4 Determinazione della dominanza/ recessività
5.5 Studio dell’associazione di mutazioni in trans
5.6 Livelli proteici e attività di proteine Mip1 selvatica e mutate
5.7 Discussione
6. Risultati (III parte)
6.1 Rescue genetico mediante overespressione di geni coinvolti
nella riparazione dell’mtDNA
6.2 Rescue genetico mediante trattamento con sostanze
antiossidanti
6.3 Conclusioni e prospettive
7. Risultati (IV parte)
7.1 Analisi della mutabilità mitocondriale associata all’allele
MIP1[S] e all’allele MIP1[Σ]
7.2 Confronto in silico fra Mip[Σ] e Mip1[S]
7.3 Analisi della mutabilità mitocondriale associata all’allele
MIP1[S]A661T
7.4 Dominanza/recessività della mutazione T661A
7.5 Efficienza catalitica delle polimerasi Mip1[S], Mip1[Σ] e
Mip1[S]A661T
7.6 Analisi del polimorfismo 661 in ceppi naturali
7.7 Analisi degli altri SNP di MIP1
7.8 Allelismo di MMC1 e MIP1
7.9 Effetto dell’alanina 661 sullo studio di mutazioni associate a
patologie mitocondriali
7.10 Discussione
112
114
115
117
118
120
124
125
133
136
140
141
142
145
146
146
147
149
150
150
152
8. Note Finali
155
Bibliografia
157
Allegato 1: Pubblicazione su Human Molecular Genetics
167
Allegato 2: Pubblicazione su Biochimica et Biophysica Acta 178
Allegato 3: Pubblicazione su Genetics
190
Allegato 4: Pubblicazione su FEMS Yeast Research
196
II
1. Introduzione
1. Introduzione
1
1. Introduzione
1.1 Mitocondri: struttura e funzione
I mitocondri sono organelli intracellulari che svolgono un ruolo chiave nel metabolismo
energetico della cellula eucariotica, in quanto sede della maggior parte delle reazioni di
degradazione ossidativa e della sintesi di adenosina-trifosfato (ATP) mediante fosforilazione
ossidativa. Una caratteristica peculiare dei mitocondri consiste nella presenza di un proprio
genoma, chiamato DNA mitocondriale, o mtDNA.
I mitocondri sono strutture allungate costituite da un doppio sistema di membrane, la
membrana esterna e la membrana interna. Lo spazio compreso fra le due membrane è
chiamato spazio intermembrana, mentre lo spazio racchiuso nella membrana interna è
chiamato matrice mitocondriale. La membrana interna si ripiega più volte all’interno della
matrice, formando strutture che vengono chiamate creste (figura 1.1).
Figura 1. 1: Immagine al microscopio elettronico di un singolo mitocondrio di epatocita.
La membrana mitocondriale esterna ha una composizione simile a quella del reticolo
endoplasmatico e in essa sono presenti dei pori proteici con la funzione di facilitare il
passaggio di metaboliti con peso molecolare inferiore a 10 KDa. La membrana interna, priva
di colesterolo e ricca di un fosfolipide caratteristico, la cardiolipina, ha una permeabilità molto
limitata cosicché possono essere trasportate attraverso di essa solo sostanze per cui esistono
specifici trasportatori di membrana. Sebbene i mitocondri possano essere isolati ed evidenziati
da soli, come nella figura, essi costituiscono, in generale, un network dinamico di fissione e
fusione simile al reticolo endoplasmatico.
Anche il numero dei mitocondri presenti in una singola cellula è variabile, in modo speciespecifico e, per gli eucarioti superiori, in modo tessuto-specifico; anche la condizione
fisiologica in cui si trova la cellula influenza il numero dei mitocondri. Ad esempio nel
muscolo e nel fegato dei mammiferi, dove la respirazione cellulare è intensa, sono presenti
centinaia o migliaia di mitocondri.
2
1. Introduzione
Ogni comparto del mitocondrio svolge un ruolo specifico. In particolare, la degradazione
ossidativa del piruvato derivante dalla glicolisi e degli acidi grassi, catalizzata da enzimi
solubili, avviene nella matrice, mentre la fosforilazione ossidativa, che utilizza complessi
enzimatici transmembrana, avviene attraverso la membrana interna.
1.1.1 Ossidazione del piruvato e degli acidi grassi
Le principali riserve di energia delle cellule sono costituite da zuccheri e da acidi grassi, che,
mediante ossidazione ad anidride carbonica, rilasciano questa energia, che a sua volta viene
immagazzinata sotto forma di ATP. Gli enzimi che catalizzano la degradazione ossidativa di
questi composti sono situati nella matrice mitocondriale.
Per quanto riguarda gli zuccheri, essi vengono dapprima degradati a piruvato mediante
glicolisi, i cui enzimi sono situati nel citoplasma. Il piruvato viene quindi importato nel
mitocondrio, dove subisce una reazione di decarbossilazione ossidativa, ad acetil-coenzima A
(Acetil-CoA) (Ochoa, 1954; Perham, 2000).
Gli acidi grassi, derivanti principalmente dal processo di mobilizzazione dei trigliceridi negli
eucarioti superiori, vengono importati nella matrice mitocondriale mediante il sistema di
trasporto dell’acilcarnitina. Nella matrice mitocondriale l’acido grasso viene convertito ad
acil-coenzima A. Le molecole di acil-coenzima A subiscono il processo della β-ossidazione,
costituito da cicli di quattro reazioni al termine di ciascuno dei quali è rilasciato una molecola
di acetil-CoA più una molecola di acil-coenzimaA con due atomi di carbonio in meno. Mentre
negli eucarioti superiori la β-ossidazione avviene prevalentemente nei mitocondri, e nei
perossisomi avviene la β-ossidazione degli acidi gassi a lunghissima catena, nel lievito la
degradazione degli acidi grassi a gruppo acetile avviene prevalentemente nei perossisomi.
Solo successivamente i gruppi acetile vengono trasportati, attraverso il sistema acetilcarnitina, nei mitocondri.
L’acetil-CoA viene successivamente ossidato ad anidride carbonica attraverso il ciclo degli
acidi tricarbossilici, o TCA, o ciclo di Krebs (figura 1.2). Il ciclo di Krebs è composto da otto
reazioni attraverso le quali da ogni molecola di acetil-CoA, convertita a due molecole di
anidride carbonica, si generano una molecola di ATP, tre molecole di NADH e una molecola
di FADH2 (figura 1.2). La maggior parte dell’energia rilasciata viene pertanto immagazzinata
sottoforma di potere riducente. E’ importante sottolineare che il ciclo di Krebs non è
fondamentale solo per il metabolismo ossidativo ma fornisce sostanze, quali ad esempio
l’ossalacetato e l’α-chetoglutarato, fondamentali per la sintesi degli aminoacidi.
3
1. Introduzione
Figura 1. 2: Rappresentazione schematica del ciclo di Krebs.
1.1.2 Fosforilazione ossidativa
La fosforilazione ossidativa è il principale meccanismo attraverso il quale gli organismi
aerobi sono in grado di convertire l’energia derivante dalla degradazione ossidativa delle
sostanze organica in ATP. Come noto, la fosforilazione ossidativa avviene tramite un
accoppiamento chemiosmotico, che ha come effetto finale la sintesi di ATP nella matrice
mitocondriale.
La sintesi di ATP necessita del rilascio dell’energia immagazzinata come potere riducente
(NADH e FADH2) durante i processi di glicolisi, β-ossidazione e ciclo di Krebs. In
particolare NADH e FADH2 si riossidano cedendo gli elettroni ad una catena respiratoria
situata nella membrana interna, attraverso la quale gli elettroni vengono trasportati secondo
gradiente attraverso trasportatori che, ciclicamente, accettano elettroni, riducendosi, da un
trasportatore con un potenziale di riduzione minore e cedono elettroni, ossidandosi, ad un
trasportatore con un potenziale di riduzione maggiore. Esistono tre classi di trasportatori
presenti nella catena di trasporto mitocondriale:
(1) Centri ferro-zolfo. I centri ferro-zolfo, o Fe-S, sono strutture, complessate all’interno
di proteine chiamate ferredossine, in cui uno o più atomi di ferro sono legati tramite
legami di coordinazione a atomi di zolfo inorganici o a atomi di zolfo di cisteine. Nei
centri ferro zolfo i veri trasportatori di elettroni sono costituiti dagli atomi di ferro che,
ciclicamente, accettano un elettrone riducendosi a ione ferroso (Fe2+) e cedono
l’elettrone riossidandosi a ione ferrico (Fe3+).
(2) Citocromi respiratori. I citocromi respiratori sono proteine a cui è complessata una
molecola di tipo eme, il quale conferisce alla proteina la capacità di assorbire luce
visibile, con un caratteristico spettro variabile da citocromo a citocromo. I citocromi
respiratori vengono divisi in tre classi a seconda del picco di assorbimento nel visibile:
citocromo a, con un picco di assorbimento a 602 nm; citocromo b, con un picco
4
1. Introduzione
d’assorbimento a 560 nm; citocromo c, con un picco d’assorbimento a 550 nm. Tra i
trasportatori di membrana mitocondriali sono presenti tre citocromi b, due citocromi c
(c e c1) e due citocromi a (a e a3). Nei citocromi i veri trasportatori di elettroni sono i
gruppi eme, di cui fanno parte uno ione Fe2+e, nel caso dei citocromi a, anche uno ione
Cu+.
(3) Ubichinone. L’ubichinone, o coenzima Q, è una molecola a struttura chinonica che, a
differenza degli altri trasportatori, non è complessato a proteine. La struttura chinonica
è legata a un numero specifico di unità isoprenoidi (10 nelle cellule di mammifero), le
quali permettono alla molecola di diffondere liberamente nella membrana
mitocondriale esterna. L’ubichinone è in grado di accettare due elettroni in
successione, passando dalla forma ossidata (ubichinone) alla forma parzialmente
ridotta (semichinone), e da questa alla forma ridotta (ubichinolo), come rappresentato
in figura 1.3.
Figura 1. 3: Ossidazione e riduzione del coenzima Q.
La maggior parte dei trasportatori non sono proteine isolate, ma formano complessi
multiproteici che attraversano la membrana interna, chiamati complessi respiratori,
rappresentati in figura 1.4.
5
1. Introduzione
ADP+Pi
NADH NAD+ FADH2 FAD
ATP
2H++½O2 H2O
matrice
II
I
4H+
Q
III
IV
V
spazio
intermembrana
4H+
cytc
2H+
3H+
Figura 1. 4: Complessi enzimatici del sistema OXPHOS mitocondriale. I: NADH-coenzima Q reduttasi;
II: succinato-coenzima Q reduttasi; III: citocromo c-coenzima Q ossidoreduttasi; IV: citocromo c ossidasi;
V: ATP sintasi; Q: coenzima Q; cytc: citocromo c. Le frecce blu rappresentano gli elettroni.
Il complesso I, o NADH-coenzima Q reduttasi, o NADH deidrogenasi, catalizza il
trasferimento di due elettroni dal NADH al coenzima Q. Il complesso I è costituito da una
proteina a cui è legato un gruppo prostetico costituito da flavin mononucleotide (FMN), che
ciclicamente accetta elettroni e protoni dal NADH e cede gli elettroni ai centri ferro-zolfo.
Il complesso II, o succinato-coenzima Q reduttasi, o succinato deidrogenasi, catalizza il
trasferimento di due elettroni dal succinato al coenzima Q. Il complesso II è l’unico
complesso che funge anche da enzima del ciclo di Krebs, in quanto il complesso catalizza
l’ossidazione del succinato a fumarato. In questo caso l’accettore di protoni e di elettroni è il
FAD, che si riduce a FADH2 e che si riossida a FAD cedendo due elettroni al coenzima Q,
attraverso i centri ferro-solfo del complesso II.
Il coenzima Q, a differenza degli altri trasportatori, è in grado di diffondere liberamente
attraverso la membrana interna, e trasferisce elettroni al complesso III.
Il complesso III, o citocromo c-coenzima Q ossidoreduttasi, catalizza il trasferimento di
elettroni dal coenzima Q al citocromo c. Il trasferimento avviene attraverso, nell’ordine, i
citocromi b, centri ferro-zolfo e il citocromo c1.
Il citocromo c si distingue dagli altri citocromi in quanto non fa parte di complessi. Esso
infatti si comporta come proteina debolmente ancorata alla membrana interna, in grado di
diffondere lungo la parte esterna della membrana.
Il complesso IV, o citocromo c ossidasi, catalizza il trasferimento di elettroni dal citocromo c
all’accettore finale, l’ossigeno. Il complesso IV è costituito dai citocromi a e a3.
Il complesso V non è un complesso respiratorio, ma un complesso, chiamato ATP sintasi, che
sintetizza ATP grazie all’energia rilasciata durante il trasporto di elettroni dalle molecole
ridotte all’ossigeno. Il trasporto di elettroni si accompagna infatti ad un pompaggio di protoni
attraverso la membrana interna, dalla matrice allo spazio intermembrana, tramite i complessi
respiratori. Questo pompaggio di protoni crea un gradiente di protoni attraverso la membrana,
che fornisce l’energia per la sintesi di ATP. Il gradiente, chiamato gradiente elettrochimico, è
sia di concentrazione chimica, in quanto la concentrazione di protoni nello spazio
intermembrana è maggiore rispetto a quello della matrice, sia di natura elettrica, in quanto la
carica nello spazio intermembrana è maggiore. La dissipazione di questo gradiente, attraverso
6
1. Introduzione
il complesso V, permette la sintesi di ATP a partire da ADP e fosfato inorganico. E’ inoltre da
ricordare che il gradiente protonico elettrochimico non è fondamentale solo per la sintesi di
ATP, ma anche per la maggior parte delle altre funzioni mitocondriali e per il trasporto di
sostanze attraverso i trasportatori della membrana interna.
1.1.3 Altre funzioni dei mitocondri
Oltre alla sintesi di ATP, i mitocondri svolgono altri ruoli fondamentali nella cellula.
In primo luogo, i mitocondri giocano un ruolo fondamentale in alcune forme di apoptosi, cioè
nella morte cellulare programmata, in particolare nell’apoptosi indotta da stress. L’apoptosi
indotta da stress include l’attivazione, in maniera sequenziale, di numerose proteine, che
vengono chiamati fattori pro-apoptotici. Diversi segnali pro-apoptotici sono in grado di
convergere fino al mitocondrio, stimolando la permeabilità delle membrane mitocondriali e il
rilascio dal mitocondrio al citoplasma di altri fattori pro-apoptotici. Il principale fattore è il
citocromo c, che viene rilasciato attraverso la membrana esterna nel citoplasma (Liu et al.,
1996). Altri fattori rilasciati durante l’apoptosi sono le caspasi 2 e 9 e il complesso SmacDIABLO (Susin et al., 1999; Verhagen et al., 2000)
Il mitocondrio svolge un ruolo fondamentale anche nella segnalazione indotta da calcio.
Grazie al gradiente elettrochimico transmembrana, nella matrice mitocondriale possono essere
trasportate grosse quantità di calcio, mediante uno specifico trasportatore che trasporta calcio
in maniera unidirezionale. La concentrazione intramitocondriale di calcio viene inoltre
regolata da un trasportatore in grado di scambiare calcio e sodio. Il principale ruolo della
regolazione della concentrazione del calcio intramitocondriale consiste nell’attivazione del
ciclo degli acidi tricarbossilici, che è stimolato da un aumento della concentrazione di calcio
(Duchen, 2004).
I mitocondri sono gli organuli in cui viene prodotta la maggior parte delle specie reattive
dell’ossigeno (ROS), fra cui i più comuni sono il perossido di idrogeno, l’anione superossido
e il radicale idrossile. I ROS si generano per lo più durante il trasporto di elettroni lungo la
catena respiratoria, come conseguenza della riduzione parziale dell’ossigeno. In particolare la
maggior parte dei ROS vengono prodotti a partire dagli elettroni che vengono direttamente
ceduti dal complesso I (NADH deidrogenasi) all’ossigeno molecolare, dando origine
all’anione superossido. Questo viene detossificato dall’enzima superossido dismutasi che lo
converte a perossido d’idrogeno. A sua volta l’acqua ossigenata è convertita ad acqua
dall’azione della glutatione perossidasi, ma può essere anche convertita nella specie reattiva
radicale idrossile attraverso la reazione di Fenton (Wallace, 1999). L’esposizione ai ROS
causa l’ossidazione e il conseguente danno delle proteine, dei lipidi e dell’mtDNA. In
particolare, i danni dei ROS sull’mtDNA stanno alla base della teoria mitocondriale
dell’invecchiamento, secondo la quale l’invecchiamento è dovuto principalmente ad un
incremento dei danni sull’mtDNA causato dai ROS con l’aumentare dell’età (reviewed in
Wallace, 2005).
Diversi studi hanno dimostrato che alcuni ROS prodotti nel mitocondrio possono svolgere un
ruolo fisiologico. In particolare, il perossido di idrogeno rilasciato dal mitocondrio nel
7
1. Introduzione
citoplasma può fungere da secondo messaggero in grado di stimolare il trasporto di glucosio,
la sintesi lipidica, il rilascio del calcio dal mitocondrio e l’attività piruvato deidrogenasica, e
di inibire la glicolisi, la lipolisi, la sintesi di ATP e l’attività superossido dismutasica
(reviewed in Valko et al., 2007).
I mitocondri svolgono anche un ruolo importante nei processi biosintetici. In primo luogo,
diversi aminoacidi vengono sintetizzati a partire da intermedi del ciclo di Krebs e mediante
reazioni che avvengono nella matrice mitocondriale. Inoltre i mitocondri partecipano alla
sintesi di steroidi e di eme.
1.2 Il DNA mitocondriale
Come detto in precedenza, i mitocondri contengono un proprio genoma, chiamato DNA
mitocondriale o mtDNA. Ogni mitocondrio contiene più copie di mtDNA, e il numero varia a
seconda della specie, delle condizioni ambientali e, nel caso di organismi multicellulari, del
tessuto. In generale, l’mtDNA è costituito da una molecola circolare la cui lunghezza è
specie-specifica. Alcuni eucarioti inferiori posseggono un mtDNA di tipo lineare. In
particolare, in S. cerevisiae sono presenti sia molecole circolari che lineari, queste ultime sotto
forma di concatenameri (Bendich, 1996; Nosek and Tomoska, 2003).
La lunghezza del DNA mitocondriale, come detto, è specie-specifica, ed è molto variabile,
come riportato in tabella 1.1.
Regno Dimensioni (Kb) Geni codificanti proteine Geni codificanti RNA
Funghi
19-100
8-14
10-28
Protisti
6-100
3-62
2-29
Piante
186-366
27-34
21-30
Animali
16-17
13
4-24
Tabella 1. 1: Dimensioni dell’mtDNA e numero di geni mitocondriali negli organismi dei vari regni (Lang
et al., 1999)
Come emerge dalla tabella, il numero di proteine e RNA codificate dal DNA mitocondriale è
variabile, e in generale non correla con la lunghezza. I mammiferi posseggono un mtDNA di
circa 16,5 Kb, mentre la lunghezza dell’mtDNA in organismi degli altri regni è in generale
maggiore, soprattutto nelle piante, dove la lunghezza dell’mtDNA può superare le 350 Kb.
Per quanto concerne l’organizzazione fisica dell’mtDNA, esso, al contrario del DNA
nucleare, non è legato da istoni. Il DNA non è comunque “nudo”, in quanto è legato da
molteplici proteine, alcune solubili e altre di membrana, che, insieme al DNA, costituiscono
una struttura dinamica chiamata nucleoide, identificato in numerosi organismi (Kaufman et
al., 2000; Meeusen et al., 1999; Miyakawa et al., 1987; Garrido et al., 2003; Bogenhagen et
al., 2003). I nucleoidi consistono una regione distinta situata all’interno dei mitocondri.
(rewieved in Jacobs et al., 2000). Il nucleoide maggiormente caratterizzato e quello di S.
cerevisiae, per le quali sono state identificate 4 classi di proteine che lo compongono:
1) Proteine associate direttamente o indirettamente all’mtDNA, fra cui la proteina Abf2,
coinvolta nel packaging dell’mtDNA e fondamentale per il mantenimento
8
1. Introduzione
dell’mtDNA integro, la proteina Mgm110, coinvolta nella riparazione dell’mtDNA, la
proteina legante il DNA a singolo filamento Rim1, coinvolto nella replicazione, la
proteina Sls1, coinvolta nella trascrizione dell’mtDNA, e in generale tutte le proteine
coinvolte nella trascrizione e nella replicazione dell’mtDNA;
2) Proteine coinvolte nell’importazione delle proteine e nella biogenesi mitocondriale, fra
cui le proteine mtHsp60, mtHsp70, mtHsp10, che sono “chaperons”, e la subunità α
della unità F1 dell’ATPasi;
3) Enzimi coinvolti nel ciclo dell’acido citrico, fra cui l’aconitasi, l’aldeide deidrogenasi
e la piruvato deidrogenasi;
4) Enzimi coinvolti nel metabolismo degli aminoacidi (Chen et al., 2005).
Secondo una teoria sviluppata da Jacobs et al., 2000 ogni nucleoide contiene più copie di
mtDNA identiche, derivanti da una stessa molecola originale, e si comporta come unità di
trasmissione dell’mtDNA.
In una popolazione di cellule possono essere presenti due tipi di molecole di mtDNA, ad
esempio un tipo wt e uno mutato. In questo caso sono possibili due condizioni: omoplasmia
ed eteroplasmia (Dujon, 1981; Grossman and Shoubridge, 1996; Garesse and Vallejo, 2001).
Si parla di omoplasmia quando in una cellula è presente un solo tipo di mtDNA, per cui in
una popolazione di cellule alcune cellule conterranno solo molecole wt di mtDNA e altre
cellule solo molecole mutate. Si parla di eteroplasmia quando le cellule contengono entrambi i
tipi di mtDNA, per cui tutte le cellule della popolazione conterranno entrambi i tipi di
mtDNA, in generale in proporzione variabile. Come verrà spiegato successivamente, mentre i
tessuti umani sono tipicamente eteroplasmici, la condizione naturale di S. cerevisiae è
l’omoplasmia, mentre l’eteroplasmia è solo una fase transeunte che si genera, ad esempio, in
seguito ad una mutazione dell’mtDNA.
1.2.1 Il DNA mitocondriale umano
Il DNA mitocondriale umano è una molecola circolare costituita da 16569 bp (figura 1.5).
Il genoma mitocondriale umano contiene 37 geni: 13 codificano per proteine dei complessi
respiratori, 22 per i tRNA mitocondriali e 2 per gli rRNA mitocondriali. L’organizzazione dei
geni è alquanto diversa da quelli dei geni nucleari. In primo luogo, mentre nella maggior parte
dei geni nucleari sono presenti degli introni, nessun introne è presente nei geni mitocondriali
dei mammiferi. Ne risulta quindi un’organizzazione molto compatta, resa ancora più compatta
dal fatto che alcuni geni sono parzialmente sovrapposti. In secondo luogo, mentre i geni
nucleari sono codificati come mRNA monocistronico, tutti i geni dell’mtDNA sono codificati
come mRNA policistronico. In particolare nell’mtDNA umano sono presenti due promotori: il
light strand promoter (LSP) e l’heavy strand promoter (HSP). Il promotore HSP è situato sul
filamento pesante (i filamenti vengono chiamati leggero o pesante perché presentano diversa
densità), a valle del D-loop. Da esso vengono trascritti come un unico mRNA tutti i geni,
eccetto il gene per la subunità 6 della NADH deidrogenasi e otto geni per tRNA. Dall’LSP,
situato a monte del gene per la subunità 6 della NADH deidrogenasi, vengono trascritti gli
altri geni.
9
1. Introduzione
Figura 1. 5: DNA mitocondriale umano. In rosa i geni per proteine e per gli rRNA, in blu i geni per tRNA
(da IL GENE VIII, Lewin).
Per quanto concerne le proteine codificate dall’mtDNA, tutte fanno parte dei complessi
respiratori o dell’ATP sintasi. La maggior parte delle proteine dei complessi respiratori,
nonché tutte le altre proteine mitocondriali, sono codificate da geni nucleari. Le subunità dei
complessi respiratori codificati da geni mitocondriali e nucleari sono riportati in figura 1.6.
Figura 1. 6: Subunità codificate da geni mitocondriali o geni nucleari dei complessi mitocondriali umani.
In blu le subunità codificate da geni nucleari, in azzurro le subunità codificate da geni mitocondriali, in
verde il coenzima Q. Le frecce azzurre indicano il flusso di elettroni, le frecce rosse il flusso di protoni.
In particolare, il genoma mitocondriale codifica per:
10
1. Introduzione
-
sette subunità del complesso I (NADH deidrogenasi): ND1, ND2, ND3, ND4, ND4L,
ND5, ND6;
- una subunità del complesso III (citocromo c-coenzima Q ossidoreduttasi), in
particolare la componente proteica del citocromo b;
- tre subunità del complesso IV (citocromo ossidasi): COX1, COX2 e COX3;
- due subunità del complesso V (ATP sintasi): ATPasi 6 e ATPasi 8.
I 22 tRNA mitocondriali sono codificati soltanto da geni mitocondriali. A causa del ridotto
numero di geni per tRNA, il DNA mitocondriale ha sviluppato un proprio codice genetico,
differente dal codice genetico universale e variabile a seconda della specie. In particolare il
codice genetico mitocondriale dei vertebrati presenta quattro differenze rispetto al codice
genetico universale. AUA non codifica per isoleucina ma per metionina; UGA non è un
codone di stop ma codifica per triptofano; AGA e AGG non codificano per arginina ma sono
codoni di stop.
Grazie alla scarsa lunghezza dell’mtDNA umano, esso è stato sequenziato in migliaia di
individui. Dal sequenziamento, oltre a mutazioni patologiche, che verranno discusse in
seguito, sono emersi centinaia di polimorfismi, per lo più single nucleotide polymorphism
(SNP) situati nel D-loop (www.mitomap.org).
Come detto in precedenza, ogni mitocondrio contiene più copie di mtDNA, e poiché in una
cellula sono presenti più mitocondri, ogni cellula contiene un numero elevato di copie di
mtDNA. Il numero varia in maniera tessuto specifico, e raggiunge alcune migliaia nel cuore,
nel cervello e nei muscoli sotto sforzo, dove è richiesta un’elevata quantità di ATP. Qualora
siano presenti diversi tipi di mtDNA, nell’uomo vi è una generale tendenza all’eteroplasmia,
ossia nelle cellule coesistono entrambi i tipi di mtDNA. Sebbene non sia noto esattamente
come avviene il trasferimento di mtDNA ai mitocondri durante il processo di divisione
cellulare, è stato ipotizzato che il trasferimento sia casuale, per cui una cellula eredita, in
termini di probabilità, entrambi i tipi di mtDNA. Come verrà descritto in seguito, in caso di
patologie mitocondriali che riducono la stabilità dell’mtDNA, ad esempio associate a
delezioni dell’mtDNA, la frazione di molecole delete tende ad aumentare col progredire
dell’età, fino allo sviluppo dei sintomi, che subentra quando viene superato l’effetto soglia,
cioè la percentuale di molecole mutate sopra la quale si manifesta la patologia. (Novotny et
al., 1986).
Per quanto concerne l’ereditarietà, il DNA mitocondriale viene ereditato soltanto dalla madre
(eredità materna), poiché lo zigote riceve soltanto i mitocondri derivanti dalla cellula uovo.
1.2.2 Il DNA mitocondriale di S. cerevisiae
Organizzazione. Il DNA mitocondriale di S. cerevisiae presenta numerose differenze rispetto
all’mtDNA umano, sotto vari aspetti.
In primo luogo il DNA mitocondriale di lievito presenta una lunghezza maggiore, che è
variabile da 68 Kb (short strain) a 86 Kb (long strain). In figura 1.7 è riportata una
rappresentazione schematica dell’mtDNA di un ceppo long. Il genoma mitocondriale
utilizzato attualmente come riferimento è quello sequenziato da Foury a partire dal long strain
11
1. Introduzione
FY1679, isogenico al ceppo di riferimento S288c (Foury et al., 1998). Il genoma è lungo
85779 bp e, al contrario dell’mtDNA umano, presenta un basso grado di compattamento
(figura 1.7). Diverse regioni non sono codificanti, e tre geni contengono introni. Anche i geni
mitocondriali di lievito sono trascritti per lo più come mRNA policistronici, ma in questo caso
sono presenti più siti di inizio della trascrizione, caratterizzati dalla presenza di una sequenza
consensus (A,T)TATAAGTA.
B
A
Figura 1. 7: (A) Rappresentazione schematica dell’mtDNA di un ceppo long. Le frecce indicano la
direzione della trascrizione (da IL GENE VIII, Lewin); (B) Rappresentazione lineare dell’mtDNA del
ceppo FY1679. In rosso gli esoni dei geni codificanti per proteine, in grigio gli introni; in verde i geni per
tRNA; in giallo i geni per gli rRNA; in blu scuro le origini di replicazione ori; in bianco sequenze non
codificanti; in azzurro regioni mancanti nei short strain; le frecce nere indicano i siti di inizio della
trascrizione e la direzione della trascrizione (da Foury et al., 1998).
12
1. Introduzione
Il genoma mitocondriale del ceppo FY1679 contiene 18 elementi codificanti per proteine, più
9 ORF dubbie o a funzione sconosciuta. Sette delle 18 proteine fanno parte dei complessi
mitocondriali (figura 1.8).
Figura 1. 8: Subunità codificate da geni mitocondriali o geni nucleari dei complessi mitocondriali di S.
cerevisiae. In blu le subunità codificate da geni nucleari, in azzurro le subunità codificate da geni
mitocondriali, in verde il coenzima Q. Le frecce azzurre indicano il flusso di elettroni, le frecce rosse il
flusso di protoni.
Al contrario di quanto si osserva nell’uomo, nessun gene codifica per subunità della NADH
deidrogenasi, che nel lievito non è un complesso, ma una proteina singola codificata da un
gene nucleare. Così come nell’uomo, il genoma mitocondriale di lievito codifica per una
subunità del compleso III, il citocromo b (codificato dal gene COB, detto anche CYTB o BOX)
e per tre subunità del complesso III, chiamate citocromo ossidasi 1 (codificato dal gene COX1
o OXI3), citocromo ossidasi 2 (COX2 o OXI2) e citocromo ossidasi 3 (COX3 o OXI1). Infine
sono codificate dall’mtDNA tre subunità dell’ATP sintasi.
Il gene VAR1 codifica per una proteina ribosomale mitocondriale, mentre tutte le altre
proteine sono codificate da geni nucleari. Le 10 proteine rimanenti sono codificate dagli
introni presenti nei geni 21S rRNA, COB e COX1 e consistono in maturasi, endonucleasi e
trascrittasi inverse.
Il DNA mitocondriale di lievito inoltre codifica per i 24 tRNA mitocondriali. Anche in questo
caso, a causa del ridotto numero di tRNA, il codice genetico presenta delle differenze rispetto
al codice universale: i codoni CUU, CUC, CUA e CUG non codificano per leucina, ma per
treonina; AUA non codifica per isoleucina ma per metionina; UGA non è un codone di stop
ma codifica per triptofano.
Infine il genoma mitocondriale di lievito codifica per 2 rRNA (21S e 15S) e per un RNA (9 S)
facente parte dell’RNasi P, coinvolta nella maturazione dei pre-tRNA mitocondriali.
13
1. Introduzione
Nei ceppi short sono presenti tutti i geni codificanti per tRNA, rRNA, proteine dei complessi
respiratori e la proteina Var1. Mancano invece parti di regioni non codificanti, alcune ORF
putative e alcuni introni, e di conseguenza RNA codificanti per maturasi o endonucleasi.
Per quanto riguarda la composizione in basi, essa è molto eterogenea (Bernardi et al., 1972;
De Zamaroczy and Bernardi, 1986). Le regioni codificanti contengono un contenuto G+C di
circa il 30%, mentre le regioni non codificanti sono costituiti quasi esclusivamente da A e T e
sono interrotte da isole G+C variabili in lunghezza da 10 bp e 80 bp, alcune delle quali sono
fondamentali nei processi di replicazione.
Le cellule di S. cerevisiae contengono diverse copie di mtDNA, il cui numero esatto varia a
seconda del ceppo, dello stato aploide o diploide e delle condizioni di crescita. Tipicamente
una cellula aploide contiene 20-35 copie di mtDNA (De Zamaroczy and Bernardi, 1985).
Come verrà anche discusso successivamente, le cellule di lievito contengono lo stesso tipo di
mtDNA, cioè sono omoplasmiche. Qualora, in seguito a mutazione, si generino due tipi di
mtDNA, nel giro di poche generazioni le cellule saranno di nuovo omoplasmiche, e la
popolazione sarà composta da cellule contenente mtDNA wt e cellule contenente mtDNA
mutato. Attualmente non sono note esattamente i meccanismi che portano all’omoplasmia, ma
questo fenomeno è in parte responsabile di alcuni fenotipi tipici che si riscontrano in S.
cerevisiae, fra cui l’ipersoppressività.
Genetica mitocondriale e petite positività. Il DNA mitocondriale è soggetto a mutazioni
spontanee, che rendono con elevata frequenza un ceppo respiratorio deficiente (RD)
(reviewed in Campbell and Duffus, 1988, Dujon, 1981 e Contamine and Picard, 2000).
Saccharomyces cerevisiae, al contrario della maggior parte degli altri eucarioti, anche aerobi
facoltativi, è una specie petite positive. In questo organismo mutazioni nell’mtDNA che
inibiscono il processo respiratorio non sono letali. Infatti i ceppi che presentano tali mutazioni
sono in grado di crescere su terreni contenente una fonte fermentabile (zuccheri) mediante un
metabolismo esclusivamente di tipo fermentativo. In queste condizioni i ceppi mutati formano
colonie più piccole rispetto a ceppi wt, chiamate petite, a causa dell’incapacità di utilizzare
l’etanolo prodotto durante il processo fermentativo. I petite, essendo respiratorio deficienti,
non sono infatti in grado di crescere su fonti ossidabili, quali l’etanolo, il glicerolo, il lattato o
il succinato.
I ceppi petite possono derivare, in realtà, sia da mutazioni in geni nucleari che portano a
mutazioni o alla perdita di mtDNA (chiamati mutanti pet) sia da mutazioni del genoma
mitocondriale. In quest’ultimo caso si parla di petite citoplasmatici. Mentre i mutanti pet si
generano spontaneamente a bassa frequenza, i petite citoplasmatici si generano
spontaneamente, su una fonte fermentabile, con una frequenza molto elevata, pari a circa l’12%. La frequenza della comparsa dei petite è comunque variabile a seconda del ceppo, dello
stato aploide e diploide e delle condizioni di crescita.
I petite citoplasmatici, o semplicemente petite, si distinguono in due classi: rho- e rho0. I rhopresentano lunghe delezioni dell’mtDNA, mentre i rho0 sono privi di mtDNA.
Fenotipicamente i due tipi di petite non sono distinguibili, in quanto entrambi sono
respiratorio deficienti e dunque incapaci di crescere su fonti ossidabili. Essi si distinguono
14
1. Introduzione
pertanto dai ceppi wt, che, in riferimento allo stato del genoma mitocondriale, vengono
chiamati rho+. I ceppi rho- e rho0 sono respiratori deficienti in quanto in essi non avviene la
sintesi proteica mitocondriale, e di conseguenza l’assemblamento dei complessi respiratori. A
causa delle delezioni infatti i rho- presentano sempre la perdita di alcuni geni per tRNA, e in
generale anche di geni per rRNA e per proteine.
I rho- presentano lunghe delezioni dell’mtDNA, tanto che nella maggior parte dei rho- meno
di un terzo del genoma rimane. Spesso la percentuale rimanente è inferiore, e può raggiungere
valori anche inferiori allo 0,5% del genoma originale. D’altra parte, nei rho-, la quantità totale
di mtDNA è simile a quella dei cloni rho+, indicando che il DNA presente in questi ceppi è
amplificato e, in generale, è tanto più ripetuto quanto maggiore è la regione deleta.
Tipicamente dunque il genoma mitocondriale dei ceppi rho- è costituito da regioni più o meno
lunghe ripetute più volte. In tal senso si distinguono due tipi di ripetizioni, o riarrangiamenti.
Nel primo tipo la regione mantenuta è ripetuta più volte in tandem, così da costituire strutture
circolari o lineari in cui le ripetizioni sono unite in maniera testa-coda. Nel secondo tipo,
chiamato palindromico, l’unità che si ripete è costituita da due regioni legate fra loro in
maniera palindromica, cioè testa-testa. Spesso, è possibile trovare in un'unica molecola
entrambi i tipi di riarrangiamenti. A questo va aggiunto il fatto che spesso i rho- derivano da
delezioni multiple dell’mtDNA, per cui in questo caso si trovano in tandem regioni che
normalmente sono separate su un genoma wt.
I meccanismi con cui si generano i rho- non sono esattamente noti. L’ipotesi più accreditata è
che le delezioni si generino in seguito a ricombinazione fra sequenze simili dell’mtDNA,
tanto che spesso ripetizioni dirette si trovano nei genomi wt nei punti in cui avviene la
delezione. D’altra parte è possibile che numerosi altri fenomeni influenzino la formazione di
petite, come dimostrato dall’elevato numero di geni che, se mutati, incrementano la frequenza
dei petite (Contamine and Picard, 2000). In ogni caso, nella formazione dei petite gioca un
ruolo fondamentale la tendenza all’omoplasmia. Dopo la comparsa della mutazione, la cellula
rimane inizialmente rho+ a causa della presenza di numerose copie di mtDNA, la maggior
parte delle quali sono ancora integre. Nel giro di poche generazioni, i due tipi di mtDNA
tendono a segregare, formando alla fine così cellule che contengono soltanto l’mtDNA
parzialmente deleto, dunque rho-, e cellule che contengono l’mtDNA wt, dunque rho+. Da
questa osservazione si ricava anche che in una popolazione di cellule la frequenza dei petite
tenderebbe ad aumentare, visto che cellule rho+ possono dare origine a petite, ma cellule
petite non possono revertire a rho+. D’altra parte il numero di cellule petite è limitato in una
popolazione dal fatto che essi crescono più lentamente rispetto alle cellule wt. La frazione di
petite è dunque un problema di genetica di popolazione. La frazione infatti deriva da due
fenomeni contrapposti: la tendenza di molecole rho+ a diventare petite e il rapporto fra la
velocità di crescita dei rho+ e la velocità di crescita dei petite. Entrambi i fenomeni sono
influenzati da diversi fattori, fra cui fra cui il background genetico e le condizioni di crescita
(Taylor et al., 2002).
Le proprietà genetiche dei rho- possono essere definite sulla base della stabilità dell’mtDNA e
sulla base degli incroci con ceppi tester. Per quanto concerne la stabilità, la maggior parte dei
15
1. Introduzione
rho- posseggono un’instabilità intrinseca. Nel giro di alcune generazioni a partire da una
popolazione omogenea di rho-, si ottiene una certa percentuale di rho- con una diversa
soppressività rispetto al clone originale, segno di un riarrangiamento del genoma
mitocondriale. Molti di questi cloni diventano nonsoppressivi, segno che sono diventati per lo
più rho0.
Per quanto concerne gli incroci, gli effetti sono diversi a seconda che l’incrocio avvenga con
un rho+ o un mit-. Dall’incrocio di un rho- e un rho+ si formano inizialmente diploidi rho+. A
causa della tendenza all’omoplasmia, nel giro di alcune generazioni si generano due
popolazioni di diploidi, una rho+ e una rho-. La soppressività di un rho- è definita come la
percentuale di rho- sulla popolazione totale dopo almeno 25 generazioni, quando le cellule
sono orami diventate omoplasmiche. Sono detti nonsoppressivi i petite che non producono
diploidi rho-. La maggior parte dei ceppi nonsoppressivi sono rho0, ma anche alcuni rho- si
comportano in modo tale. Sono detti ceppi a bassa, media o alta soppressività i ceppi che
producono petite con una frequenza inferiore al 95%. La maggior parte dei rho- che si
formano spontaneamente ricadono in questa categoria. Sono detti ipersoppressivi i ceppi rhoche producono petite con una frequenza maggiore del 95%. Tipicamente l’ipersoppressività è
legata a due fenomeni, l’omoplasmia e la tendenza ad essere favoriti nella replicazione. I
ceppi rho- ipersoppressivi contengono una piccolissima regione del genoma originario
contenente un’origine di replicazione, spesso soltanto questa regione. Poiché, come detto, la
quantità di mtDNA nei rho+ e nei rho- è simile, la regione in questione è amplificata decine o
centinaia di volte. L’ipersoppressività è dovuta al fatto che le replicazione di questi genomi
rho- è favorita dalla presenza di numerose origini di replicazione, per cui l’apparato
replicativo tenderà preferenzialmente a replicare il genoma rho- rispetto al genoma rho+.
I mutanti mit- sono mutanti respiratorio deficienti che presentano una singola mutazione
puntiforme. Dall’incrocio di un rho- con un mit- si possono avere due tipi di diploidi,
respiratorio deficienti, come i parentali, o respiratorio sufficienti. Dall’incrocio di due ceppi
aploidi, tipicamente nel diploide avviene ricombinazione fra i genomi mitocondriali, a causa
dell’alta frequenza di ricombinazione dei genomi mitocondriali. Qualora il ceppo rhocontenga una regione che, nel mutante mit-, non è mutata, il ceppo rimarrà respiratorio
deficiente. Nel caso il ceppo rho- contenga la regione in cui mappa la mutazione del ceppo
mit-, in seguito a ricombinazione fra i genomi, si genererà un genoma rho+, in cui la regione
presente nel rho- ha complementato la mutazione mit-.
La maggior parte dei rho0 si formano spontaneamente a partire da cellule rho- o mit-. In una
fonte fermentabile, i ceppi rho+ crescono più velocemente rispetto ai petite. Di conseguenza la
perdita del genoma mitocondriale (così come delezioni) è sfavorita, o meglio le cellule che,
dopo una divisione, sono rimaste rho+ tenderanno a crescere più velocemente di cellule che
sono diventate petite. D’altra parte, se una cellula è già respiratorio deficiente e possiede
genoma mitocondriale, la perdita di quest’ultimo non conferisce alcuno svantaggio alla
cellula. In altre parole, non vi è una tendenza legata alle condizioni di crescita che favorisca il
mantenimento di una molecola di mtDNA mutata o deleta.
16
1. Introduzione
La perdita di mtDNA può essere stimolata anche dal trattamento con bromuro d’etidio. Il
bromuro d’etidio è un intercalante in grado di inserirsi fra la doppia elica del DNA. Esso
tende ad intercalarsi quasi esclusivamente nell’mtDNA, e non nel DNA nucleare, a causa del
superavvolgimento dell’mtDNA, che ne favorisce l’intercalazione. Una volta intercalato,
l’etidio bromuro ne modifica la struttura, favorendone la degradazione ad opera di DNasi e
inibendone la replicazione. Nel giro di poche generazioni in un terreno contenente una fonte
fermentabile e bromuro d’etidio, tutta la popolazione è costituita da rho0.
I ceppi rho0, fenotipicamente indistinguibili dai rho-, posseggono due proprietà che li
differenziano da questi ultimi. In primo luogo, i rho0 sono sempre nonsoppressivi, sebbene
questo comportamento sia condiviso con una piccola percentuale di rho- (per cui un
differenziamento basato sull’incrocio con rho+ non è risolutivo). In secondo luogo, i ceppi
rho0 non sono in grado di complementare alcuna mutazione mit-. In tal senso un ceppo non in
grado di complementare una vasta serie di mutanti tester mit- può essere considerati rho0.
Bisogna sottolineare infine che i ceppi rho-, rho0 e mit- sono mutati nell’mtDNA, ma i
mitocondri sono integri. Sebbene essi siano privi della funzionalità respiratoria, sono
comunque presenti e sono in grado di svolgere le altre funzioni del mitocondrio che non
dipendono dalla presenza dell’mtDNA. Affinché sia mantenuta l’integrità dei mitocondri è
necessario che venga mantenuto il gradiente protonico elettrochimico di membrana. Il
potenziale di membrana non è richiesto infatti solo per la sintesi di ATP, ma anche per
l’importazione nel mitocondrio di molte proteine a codificazione nucleare, per il trasporto di
sostanze a basso peso molecolare e per alcune reazioni, quali la sintesi di aminoacidi e lipidi,
che sono vitali per la cellula di lievito (Gbelska et al., 1983; Neupert, 1997).
Quando la respirazione è abolita a causa di mutazioni nell’mtDNA, il gradiente elettrochimico
di membrana è mantenuto sia dalla attività di pompa protonica del complesso V sia
dall’ingresso di ATP4+ in cambio di ADP3+ ad opera dell’ATP/ADP carrier (LefebvreLegendre et al., 2003). Il mantenimento del gradiente protonico è reso possibile dalla
presenza del complesso V. In assenza delle subunità codificate dal mitocondrio, fondamentale
per l’accoppiamento del trasporto di elettroni con la sintesi di ATP, l’ATP sintasi agisce come
ATP idrolasi, o ATPasi, cioè idrolizza ATP ad ADP e fosfato inorganico (Giraud and
Velours, 1997). All’idrolisi di ATP è accoppiato un pompaggio in senso inverso, dalla matrice
allo spazio intermembrana, di protoni, il quale mantiene il gradiente. All’idrolisi di ATP si
accompagna inoltre il trasporto di nuovo ATP nella matrice.
Genoma mitocondriale e antibiotico resistenza. Saccharomyces cerevisiae è sensibile a vari
antibiotici antibatterici, fra cui antibiotici che inibiscono la funzionalità mitocondriale. In
questo caso, la sensibilità è dovuto al fatto che le componenti dell’appartato respiratorio,
trascrizionale e traduzionale dei mitocondri sono molto simili a quelli dei batteri, da cui i
mitocondri derivano. Diversi antibiotici attivi su batteri sono attivi anche su S. cerevisiae,
sebbene a concentrazione più elevate. La sensibilità si osserva solo su fonti respirabili, in
quanto su fonti fermentabili la funzionalità mitocondriale non è necessaria. La resistenza ad
antibiotici avviene tipicamente in seguito a mutazioni puntiformi che alterano la struttura del
prodotto genico, in modo tale che questo mantenga la funzione ma non venga più inibito
17
1. Introduzione
dall’antibiotico. I mutanti resistenti ad un antibiotico vengono chiamati ant-, o Ant-, dove ant
indica la sigla dell’antibiotico. Fra le varie resistenze, quattro sono maggiormente utilizzate
negli studi genetici. La resistenza all’eritromicina (ceppi EryR) è dovuta a specifiche
mutazioni nel gene codificante l’rRNA 21S. La resistenza al cloramfenicolo (ceppi CapR) è
dovuta a mutazioni in specifici nucleotidi sempre nel gene per il 21S rRNA, diverse dalle
mutazioni precedenti. La resistenza all’oligomicina (ceppi OliR) è dovuta a specifiche
mutazioni in due geni codificanti per le subunità dell’ATPasi a codificazione mitocondriale.
La resistenza all’antimicina (ceppi AnaR) è dovuta a mutazioni nel gene per il citocromo b.
Come i mutanti mit-, i mutanti AntR sono dovuti per lo più a mutazioni puntiformi che si
generano durante il processo di replicazione.
La resistenza ad antibiotici è importante dal punto di vista genetico per due motivi. In primo
luogo le varie resistenze possono essere usate come marcatori genetici, utili, ad esempio, per
studiare processi di ricombinazione. In secondo luogo, la variazione della frequenza dei cloni
resistenti ad un antibiotico è indice di una variazione della frequenza di mutazioni
nell’mtDNA. La resistenza agli antibiotici è dunque utile per studiare l’effetto di mutazioni in
geni nucleari sulla mutabilità puntiforme dell’mtDNA.
1.3 Patologie mitocondriali
Le patologie mitocondriali, o malattie mitocondriali, sono state definite inizialmente come
patologie multisistemiche caratterizzate da deficienze delle attività associate alla
fosforilazione ossidativa. Più recentemente sono state definite, per includere anche patologie
che non alterano direttamente la fosforilazione ossidativa, come patologie caratterizzate da
una disfunzione del metabolismo mitocondriale (DiMauro et al., 1998).
Il primo caso di patologia mitocondriale fu descritto nel 1962 in una paziente i cui muscoli
scheletrici presentavano la proliferazione di un ampio numero di mitocondri anomali,
caratterizzati da un meccanismo di dissipazione dell’energia (Luft et al., 1962).
Successivamente furono descritti numerosi altri casi, ma fino agli anni ‘90 le patologie
mitocondriali venivano considerate malattie estremamente rare; recenti studi epidemiologici
hanno invece evidenziato un’incidenza di 1:8000 nelle popolazioni caucasiche, ponendo tali
malattie tra i più frequenti patologie geneticamente determinate (Chinnery et al., 2000;
Skladal et al., 2003; Chinnery and Turnbull, 2001). Secondo la teoria dell’invecchiamento
mitocondriale, anche il processo di invecchiamento può essere considerato alla stregua di una
patologia mitocondriale, poiché è caratterizzato dall’accumulo di mutazioni somatiche
nell’mtDNA (Harmen, 1972).
Le patologie mitocondriali hanno tipicamente un decorso progressivo e comprendono un
ampio spettro di fenotipi clinici associati all’insufficienza della fosforilazione ossidativa, che
rendono la diagnosi difficile e complessa. I tessuti maggiormente colpiti sono quelli con una
più alta richiesta energetica e quindi più dipendenti dal metabolismo ossidativo, quali tessuto
nervoso, tessuto muscolare scheletrico e cardiaco, ma anche reni, fegato, sistema endocrino e
retina (Land et al., 2004). Da questo deriva che le patologie mitocondriali sono per lo più
multisistemiche, e determinano sintomi associabili a più tessuti ed organi. Diversi sintomi
18
1. Introduzione
sono comuni a più malattie, mentre altri sono specifici di alcune patologie. I sintomi generali
delle patologie mitocondriali sono riportati in tabella 1.2.
Tessuti od organi colpiti
Sistema neuro-muscolare
Occhio
Orecchio
Sistema endocrino
Fenotipi clinici
Oftalmoplegia
Miopatia
Intolleranza all’esercizio
Neuropatia sensoriale
periferica
Mielopatia
Mal di testa
Demenza
Attacchi epilettici
Atassia
Distonia
Parkinsonismo
Mioclono
Cecità
Neuropatia ottica
Retinopatia pigmentosa
Cataratta
Sordità
Diabete
Disfunzione pancreatica
Tessuti od organi colpiti
Sistema endocrino
Fenotipi clinici
Ipoparatiroidismo
Endocrinopatia multipla
Bassa statura
Cuore
Cardiomiopatia
Difetti della conduzione
cardiaca
Sangue
Pancitopenia
Anemia sideroblastica
Epatopatia
Nefropatia
Pseudo-ostruzione
intestinale
Organi mesenchimali
Tabella 1. 2: Fenotipi clinici associati alle patologie mitocondriali.
Per quanto concerne i tessuti dei pazienti, essi sono caratterizzati da fenotipi associati a difetti
della fosforilazione ossidativa. In primo luogo, la maggior parte dei pazienti affetti da
disordini mitocondriali presentano fibre muscolari “red ragged”, cioè fibre muscolari
caratterizzate dall’accumulo di mitocondri, spesso anomali, sotto il sarcolemma dei miociti
(Gasser et al., 2001). Le fibre “red ragged” si generano in seguito a proliferazione di
mitocondri che, per supplire alla deficienza della fosforilazione ossidativa, si moltiplicano. Un
altro fenomeno tipico delle malattie mitocondriali è la COX negatività, cioè i muscoli dei
pazienti non presentano attività citocromo ossidasica evidenziata mediante reazione
istochimica. Inoltre sono spesso associati difetti in uno o più dei complessi respiratori, con
una notevole riduzione dell’attività enzimatica.
Sebbene le malattie mitocondriali possano essere classificate sulla base di vari parametri, esse
vengono in generale suddivise sulla base del tipo di ereditarietà, in quattro classi, come
riportato in figura 1.9.
19
1. Introduzione
Disordini mitocondriali
Mutazioni nell’mtDNA
Mutazioni nel DNA nucleare
Sporadiche
Eredità materna
Mendeliana
Mendeliana
Delezioni su larga
scala o duplicazioni
Mutazioni
puntiformi
Associate ad
instabilità
dell’mtDNA
Non associate a
instabilità
dell’mtDNA
Figura 1. 9: Suddivisione delle patologie mitocondriali sulla base dell’ereditarietà.
Una prima classe di patologie è dovuta a mutazioni nell’mtDNA. In questo caso le mutazioni
causanti la patologia possono essere sporadiche oppure ereditate per via materna. Una
seconda classe di patologie sono dovute a mutazioni in geni nucleari codificanti per proteine
mitocondriali, per cui l’eredità è di tipo mendeliana. In questo caso le mutazioni in geni
nucleari possono determinare instabilità dell’mtDNA, oppure difetti biochimici nel
metabolismo mitocondriale senza alterazione della stabilità dell’mtDNA.
1.3.1 Mutazioni sporadiche dell’mtDNA
Le mutazioni sporadiche dell’mtDNA consistono tipicamente in riarrangiamenti su larga scala
dell’mtDNA, quali singole delezioni, duplicazioni o inversioni. Queste mutazioni sono
sporadiche perché non sono di origine ereditaria. Le mutazioni infatti si generano durante
l’oogenesi o le prime fasi dell’embriogenesi. Di conseguenza ciascun paziente presenta un
solo tipo di mtDNA mutato (DiMauro et al., 1998). La maggior parte dei riarrangiamenti
mostrano all’estremità ripetizioni dirette di lunghezza variabile, suggerendo che questi
riarrangiamenti si verifichino mediante ricombinazione omologa illegittima (Mita et al.,
1990). Queste mutazioni non sono, in genere, trasmesse alla progenie, probabilmente perché
le cellule gametiche femminili recanti queste mutazioni non vanno incontro a maturazione e/o
fecondazione.
Le mutazioni possono colpire uno o più tessuti, anche a seconda della fase dell’embriogenesi
durante la quale è avvenuto il riarrangiamento. Ne deriva che le patologie dovute a
riarrangiamenti sporadici dell’mtDNA possono essere più o meno sistemiche. In ogni caso
queste mutazioni sporadiche sono sempre eteroplasmiche, cioè nei tessuti colpiti insieme alle
molecole mutate si trovano anche molecole wt. La percentuale di molecole di mtDNA mutate
varia all’interno di un tessuto, fra tessuti e in diversi momenti temporali. Inoltre tale
percentuale può variare in seguito alla divisione mitotica della cellula, e questo può spiegare
in parte le variazioni temporali di genotipo e fenotipo clinico osservate nelle patologie relative
all’mtDNA, che tipicamente sono progressive (DiMauro et al., 1998). In particolare,
l’espressione fenotipica di un difetto genetico si manifesta solo quando è superato un livello
critico, ovvero la presenza di una certa proporzione di molecole mutate è necessaria per una
20
1. Introduzione
riduzione dell’attività respiratoria e quindi una ridotta funzionalità del tessuto. Una volta
raggiunta questa proporzione compaiono i primi sintomi, che diventano progressivamente più
gravi. Al di sotto di questa proporzione le mutazioni risultano invece fenotipicamente silenti.
Tale minimo livello critico prende il nome di livello soglia o “threshold” (Novotny et al.,
1986). Questa soglia risulta inferiore nei tessuti maggiormente dipendenti dal metabolismo
ossidativo rispetto a quelli in grado di utilizzare la glicolisi anaerobia e costituisce un
elemento di variabilità per il fenotipo clinico (McKenzie et al., 2003). Inoltre vi sono soglie
differenti per differenti mutazioni, ad esempio circa il 60% per delezioni del mtDNA
(Bourgeron et al., 1993). L’effetto soglia può essere in parte spiegato con l’esistenza di
riserve di macromolecole (mRNA, tRNA e proteine), presenti in eccesso rispetto alla quantità
necessaria per garantire una respirazione normale (Rossignol et al., 2003).
Sono note tre patologie causate da riarrangiamenti dell’mtDNA, riassunte in tabella 1.3.
Sindrome
KSS (Sindrome di Kearns-Sayre)
Fenotipi clinici
Atassia, neuropatia, PEO, deaerazione retinale pigmentosa,
cardiomiopatia, bassa statura.
Sindrome di Pearson
Morte frequente nell’infanzia, anemia, vacuolarizzazione dei
precursori del midollo.
Oftalmoplegia esterna progressiva
Ptosi bilaterale, oftalmoplegia, debolezza muscolare e intolleranza
(PEO) sporadica
all’esercizio.
Tabella 1. 3: Malattie da mutazioni sporadiche dell’mtDNA (reviewed in Zeviani and Di Donato, 2004)
1.3.2 Mutazioni dell’mtDNA ad eredità materna
Le mutazioni dell’mtDNA ad eredità materna sono tipicamente mutazioni puntiformi
dell’mtDNA, che vengono trasmesse dalla madre al figlio. Visto il numero elevato di
polimorfismi dell’mtDNA, risulta spesso difficile determinare se una mutazione puntiforme
nell’mtDNA è patologica. Alcune caratteristiche sono presenti generalmente nelle mutazioni
patologiche:
- mutazione che cambia un aminoacido (o un nucleotide) molto conservato
nell’evoluzione, oppure che introduce un codone di stop in un gene mitocondriale
codificante una proteina;
- segregazione col fenotipo patologico;
- correlazione quantitativa fra fenotipo clinico e grado di eteroplasmia (per mutazioni
eteroplasmiche);
- presenza della mutazione in famiglie derivanti da popolazioni etnicamente distinte
(Zeviani and Carelli, 2003)
Le mutazioni più frequenti mappano in geni per i tRNA mitocondriali. Queste mutazioni
riducono l’espressione delle proteine mitocondriali, e portano ad una riduzione di tutte le
attività enzimatiche a codificazione mitocondriale. Altre mutazioni mappano in geni
codificanti proteine, e in questo caso si ha una riduzione dell’attività specifica di quella
proteina (Mariotti et al., 1994).
21
1. Introduzione
Le mutazioni ereditate per via materna sono per lo più eteroplasmiche, e si manifestano in
generale quando viene superato l’effetto soglia, che ad esempio per mutazioni nei geni per
tRNA è dell’80-90%. Alcune mutazioni sono invece omoplasmiche. In contrasto con le
mutazioni eteroplasmiche, le mutazioni omoplasmiche coinvolgono uno o pochi tessuti.
Inoltre la mutazione non è sufficiente di per sé a causare il fenotipo patologico, che è invece
influenzato da fattori ambientali, e dal background genetico, nucleare e/o mitocondriale
(Howell and Mackey, 1998).
Le patologie più comuni associate a mutazioni ad eredità materna sono riassunte in tabella
1.4.
Sindrome da mutazioni eteroplasmiche
Encefalopatia mitocondriale con acidosi lattica
e stroke-like episodes (MELAS)
Epilessia mioclonica con fibre “red ragged”
Debolezza neurogenica, atassia e retinite
pigmentosa (NARP)
Perdita di udito-atassia-mioclono
Sindrome da mutazioni omoplasmiche
Neuropatia ottica ereditaria di Leber (LHON)
Fenotipi clinici
Lesioni del cervello nei lobi parieto-occipitali, acidosi lattica
e fibre “red ragged”
Mioclono, epilessia, debolezza muscolare, affaticamento,
fibre “red ragged”, atassia cerebellare, sordità e demenza
Atassia, retinopatia pigmentosa, neuropatia periferica e
debolezza neurogenica distale
Perdita di udito, mioclono, epilessia, atassia e miopatia
Fenotipi clinici
Perdita della visione centrale e microangiopatia
circumpapillare
Perdita di udito
Perdita di udito sensori neurale non-sindromica
e indotta da amino glicoside (SNLH)
Tabella 1. 4: Malattie da mutazioni eteroplasmiche ed omoplasmiche ad eredità materna (reviewed in
Zeviani and Di Donato, 2004).
1.3.3 Mutazioni ad eredità mendeliana associate ad instabilità dell’mtDNA
Le malattie ad eredità mendeliana associate a instabilità dell’mtDNA sono dovute a mutazioni
in geni nucleari codificanti proteine mitocondriali fondamentali per la stabilità dell’mtDNA.
La scoperta che mutazioni in geni nucleari potessero determinare patologie mitocondriali è
stata fatta nel 1989 da Zeviani (Zeviani et al., 1989). Mutazioni in uno di questi geni causano
instabilità dell’mtDNA, in generale delezioni multiple e/o deplezione, cioè riduzione del
numero di copie.. A differenza di mutazioni mitocondriali, in questo caso le mutazioni in geni
nucleari sono la causa primaria della patologia, mentre la causa secondaria sono le mutazioni
del DNA mitocondriale causate dal difetto del prodotto genico nucleare (Zeviani et al., 1995;
Gasser et al., 2001). La caratterizzazione molecolare delle specie di mtDNA anomale,
mediante analisi di PCR e Southern-blot, ha stabilito che la regione del mtDNA
maggiormente colpita da delezioni è quella compresa tra l’origine di replicazione del
filamento pesante e l’origine di replicazione del filamento leggero (Zeviani et al., 1995). Il Dloop è conservato in tutte le specie mutanti. Inoltre i riarrangiamenti avvengono tra ripetizioni
dirette fiancheggianti di varia lunghezza. Per quanto riguarda la distribuzione delle mutazioni,
le delezioni sono più abbondanti nei tessuti post-mitotici caratterizzati da un’alta dipendenza
dalla produzione energetica aerobica (Zeviani et al., 1995).
22
1. Introduzione
Una caratteristica delle patologie caratterizzate da mutazioni in geni nucleari associate o meno
ad instabilità dell’mtDNA consiste nel fatto che spesso una mutazione può causare un diverso
quadro clinico o addirittura una diversa patologia, e, viceversa, una stessa patologia può
essere causata da mutazioni in geni diversi. Le patologie causate da mutazioni in geni nucleari
associate ad instabilità nell’mtDNA condividono molte caratteristiche con le patologie
sporadiche. Anche in questo caso infatti i sintomi sono multisistemici e progressivi, e la
sintomatologia subentra quando viene superato l’effetto soglia.
I geni responsabili di patologie associate ad instabilità dell’mtDNA e le corrispondenti
patologie sono riportate in tabella 1.5.
Gene
POLG (subunità catalitica
della DNA polimerasi
mitocondriale)
Sindrome
PEO autosomica
dominante (adPEO), PEO
autosomica recessiva
(arPEO), PEO sporadica
Sindrome da atassianeuropatia (ANS)
Neuropatia atassica
sensoriale, disartria e
oftalmoparesi (SANDO)
Sindrome di Alpers
POLG2 (subunità accessoria
della DNA polimerasi
mitocondriale)
C10ORF2 (elicasi Twinkle)
ANT1 (ADP/ATP carrier)
TP (timidina fosforilasi)
TK2 (timidina chinasi
mitocondriale)
DGUOK (guanosina chinasi
mitocondriale)
SUCLA2 (subunità β della
succinil-CoA sintetasi)
MPV17 (funzione
sconosciuta)
Fenotipi clinici
Delezioni multiple dell’mtDNA, PEO, debolezza
muscolare, atassia depressione, ipogonadismo,
perdita di udito, neuropatia periferica
Delezioni multiple dell’mtDNA, neuropatia
periferica, disartria, difetti cognitivi di media
gravità, movimenti involontari, sintomi
psichiatrici, mioclono e attacchi epilettici
Delezioni dell’mtDNA, neuropatia, disartria,
oftalmoparesi, areflessia, depressione, emicrania,
disfagia e nistagmo
Deplezione dell’mtDNA, atrofia del cervello, crisi
epilettiche, regressione psicomotoria,
proliferazione dei dotti biliari, fibrosi, cirrosi, crisi
epatiche croniche, ipotonia, emiparesi e atassia
arPEO
arPEO
adPEO e arPEO
Encefalomiopatia
mitocondriale neurogastointestinale (MNGIE)
dominante o recessiva
Miopatia infantile
Epatopatia infantile
Encefalomiopatia
Delezioni multiple e deplezione dell’mtDNA,
oftalmoparesi, neuropatia periferica,
leucoencefalopatia, sintomi gastrointestinali
Deplezione dell’mtDNA, miopatia congenita
infantile con o senza sindrome renale
Deplezione dell’mtDNA, epatopatia infantile,
difetti epatici progressivi
Ritardo psicomotorio, ipotonia e riduzione
dell’udito
Deplezione dell’mtDNA, ipoglicemia grave, ittero,
Sindrome da deplezione
elevati livelli di lattato nel sangue e fibrosi
dell’mtDNA
progressiva del fegato.
epatocerebrale
Tabella 1. 5: Principali malattie da mutazioni nucleari associate ad instabilità dell’mtDNA (reviewed in
Zeviani and Di Donato, 2004; Alberio et al., 2007; Zeviani and Carelli, 2007).
23
1. Introduzione
1.3.4 Mutazioni ad eredità mendeliana non associate ad instabilità
dell’mtDNA
L’ultima classe di mutazioni che causano patologie mitocondriali comprende mutazioni in
geni nucleari non associate ad instabilità dell’mtDNA. In questo caso la patologia è dovuta
alla mutazione nucleare in sé, che inibisce il processo della fosforilazione ossidativa o, più in
generale, il metabolismo mitocondriale. A seconda della funzione del prodotto genico, questa
classe può essere divisa in quattro sottoclassi:
1) Mutazioni in geni codificanti proteine dei complessi respiratori.
2) Mutazioni in geni codificanti proteine coinvolte nell’assemblaggio dei complessi
respiratori.
3) Mutazioni in geni codificanti proteine coinvolte nella sintesi di componenti non
proteiche della catena respiratoria.
4) Mutazioni in geni codificanti proteine indirettamente coinvolte nella fosforilazione
ossidativa (Zeviani and Di Donato, 2004).
Mutazioni in uno di questi geni causano diverse patologie, fra cui le più comuni sono la
sindrome di Leigh, il paraganglioma ereditario, la sindrome di Barth e l’atassia di Freidreich.
Per i tipi di patologia mitocondriale, i fenotipi clinici e i geni coinvolti nella patologia si
rimanda al database MITOMAP (www.mitomap.org).
1.4 DNA polimerasi γ (Pol γ)
Il DNA mitocondriale, nei funghi e negli animali, è replicato ad opera della DNA polimerasi γ
(Pol γ). Allo stato attuale, la polimerasi γ è l’unica polimerasi eucariotica ad essere stata
identificata nei mitocondri di eucarioti superiori, indicando così che la polimerasi è necessaria
in tutti i processi in cui è necessaria la sintesi di DNA, cioè replicazione, riparazione e
ricombinazione dell’mtDNA. Come spiegato successivamente, la Pol γ è costituita da due
subunità, una subunità catalitica e una subunità accessoria, mentre la Pol γ dei lieviti è
costituita da una sola subunità.
1.4.1 Scoperta e struttura
La DNA polimerasi mitocondriale è stata identificata inizialmente nel 1970 come DNA
polimerasi RNA-dipendente, incapace di utilizzare però RNA naturale come substrato (Temin
and Mizutani, 1970; Baltimore, 1970). Nel 1975 la polimerasi venne ufficialmente chiamata
DNA polimerasi γ, per distinguerle dalle due DNA polimerasi nucleari allora note, la DNA
polimerasi α e β (Weissbach et al., 1975). Soltanto nel 1977 venne identificata come
polimerasi mitocondriale capace di replicare l’mtDNA (Bolden et al., 1977; Hübscher et al.,
1979). Inoltre la polimerasi γ costituisce circa l’1-5%, a seconda dell’organismo, dell’attività
DNA polimerasica totale di una cellula (Fry and Loeb, 1986; Kornberg and Baker, 1992).
Per quanto concerne la sequenza, il gene codificante Pol γ è stato dapprima identificato e
clonato in S. cerevisiae e chiamato MIP1 (Mitochondrial polymerase) (Foury, 1989).
24
1. Introduzione
Successivamente il gene codificante la subunità catalitica è stato identificato anche in Homo
sapiens, in Mus musculus, in Gallus gallus, in Xenopus laevis e in Drosophila melanogaster
(Ropp and Copeland, 1995; Ropp and Copeland, 1996; Ye et al., 1996; Lewis et al., 1996).
Dall’allineamento delle sequenze codificanti, è emerso che le polimerasi mitocondriali sono
conservate, con un alto grado di similarità di sequenza, e che appartengono alla famiglia A
delle polimerasi, a cui appartengono le polimerasi I di E. coli, la polimerasi I di Bacillus
stearothermophilus e le polimerasi di Thermus aquaticus e del fago T7. In particolare le
polimerasi mitocondriali costituiscono, nella famiglia A, una sottofamiglia, la sottofamiglia γ.
Come le polimerasi sopra elencate, la subunità catalitica di Pol γ è costituita da due domini:
un dominio N-terminale con attività 3’-5’ esonucleasica, a cui è affidata l’attività di
proofreading durante la replicazione, e un dominio C-terminale con attività polimerasica (Ito
and Braithwaite, 1990). Più recentemente, nelle polimerasi animali, è stata identificata una
terza attività, la 5’-deossiribosio fosfato (dRP) liasi, coinvolta nella base excision repair (Pinz
and Bogenhagen, 1998; Pinz and Bogenhagen, 2000; Longley et al., 1998a). Inoltre i due
domini sono separati da una regione chiamata regione linker o spacer, di lunghezza variabile,
da 337 residui in lievito a 482 residui nell’uomo.
Dall’allineamento di numerose polimersi γ è emerso inoltre che esistono sei motivi di
sequenza altamente conservati in tutte le polimerasi mitocondriali. Nel dominio esonucleasico
sono presenti i motivi ExoI, ExoII ed ExoIII, mentre nel dominio polimerasico sono presenti i
motivi PolA, PolB e PolC (figura 1.10). I sei motivi svolgono un ruolo diretto nella catalisi
dell’attività esonucleasica e polimerasica.
Figura 1. 10: Sequenze dei motivi ExoI, II e III, e PolA, B e C (da Graziewicz et al., 2006). I motivi sono
evidenziati in colore. In nero i residui conservati, in rosso i residui non conservati. H. s. indica Homo
sapiens, R. n. Rattus norvegicus, M. m. Mus musculus, X. l. Xenopus laevis, D. m. Drosophila melanogaster,
N. c. Neurospora crassa, S. p. Schizosaccharomyces pombe, S. c. Saccharomyces cerevisiae.
25
1. Introduzione
Oltre ai sei motivi sopra riportati, sono stati identificati altri sei elementi, chiamati γ1-γ6,
conservati nei vertebrati, debolmente conservati negli insetti e assenti negli eucarioti inferiori
(Kaguni, 2004) (figura 1.11).
Figura 1. 11: Struttura lineare schematica delle subunità catalitiche di Pol γ di diversi organismi (da
Graziewicz et al., 2006). In rosso i motivi ExoI, II e III, in blu i motivi PolA, B e C, in giallo i motivi γ1-γ6,
in giallo a righe i motivi γ1-γ6 di Drosophila melanogaster.
I motivi γ1-γ4 sono situati nella regione linker, mentre i motivi γ5-γ6 sono situati nel dominio
polimerasico, rispettivamente a monte e a valle del motivo PolC. Come dimostrato
recentemente, i motivi γ1, γ2 e γ4 della Pol γ di Drosophila giocano un ruolo importante
nell’attività polimerasica e mutazioni in questi motivi causano una riduzione dell’affinità di
legame per il DNA, dell’attività polimerasica o della processività (Luo and Kaguni, 2005).
Allo stato attuale non è disponibile la struttura di alcuna polimerasi γ. Copeland ha comunque
sviluppato un modello della struttura del dominio polimerasico della subunità catalitica di Pol
γ umana (residui 871-1145) basato sulle strutture presenti in banche dati del Klenow fragment,
della KlenTaq polimerasi I di T. aquaticus, del frammento largo della polimerasi I di B.
stearothermophilus e della polimerasi del fago T7 (Bienstock and Copeland, 2004;
Graziewicz et al., 2004). (figura 1.12). Dalla struttura emergono chiaramente i tre subdomini
tipici delle DNA polimerasi, i subdomini thumb, fingers e palm.
26
1. Introduzione
Figura 1. 12: Modello della struttura del dominio polimerasico (residui 871-1145) della polimerasi γ
umana (da Graziewicz et al., 2006). In magenta il subdominio thumb, in giallo il subdominio fingers e in
blu il subdominio palm. In grigio il templato e il primer, in rosso il ddGTP entrante e in porpora lo ione
Mg2+.
Come detto in precedenza, le polimerasi animali sono costituiti anche da una subunità
accessoria. La subunità accessoria è stata dapprima clonata in Drosophila, e successivamente
in altri eucarioti superiori (Wang et al, 1997b). L’allineamento di sequenza ha mostrato che la
similarità di sequenza fra le varie subunità accessorie è scarsa. L’unica regione conservata
comprende un frammento di circa 120 residui situato al C-terminale. Recentemente è stata
determinata la struttura della subunità accessoria di topo, che ha mostrato una notevole
somiglianza strutturale con le aminoacil-tRNA sintetasi di classe IIa (Carrodeguas et al.,
2001).
Recentemente è stato dimostrato che l’oloenzima della polimerasi γ umana è un eterotrimero
costituito da una subunità catalitica e due subunità accessorie (Yakubovskaya et al., 2006),
mentre l’oloenzima della polimerasi γ di Drosophila è un eterodimero costituito da una
subunità catalitica e una subunità accessoria (Kaguni, 2004). Studi su mutanti hanno
determinato che la regione linker della subunità catalitica è responsabile del legame con la
subunità accessoria. In particolare, in Droshopila i motivi γ1 e γ4 sono responsabili
dell’interazione con la subunità accessoria (Fan and Kaguni, 2001).
1.4.2 Proprietà biochimiche di Pol γ
La polimerasi γ, al contrario della maggior parte delle altre polimerasi, è in grado di utilizzare
diversi templati: DNA naturale, DNA omopolimerico costituito da poli(dC)-oligo(dG) o
poli(dA)-oligo(dT) e DNA-RNA omopolimerico costituito da poli(rA)-oligo(dT). Ad esempio
la Pol γ umana, su un templato poli(dA)-oligo(dT), possiede in vitro una Km di 4 µM e una
kcat di 0,28 s-1 (Lim et al., 1999), mentre la Pol γ di Drosophila, su un templato di calf thymus
DNA attivato dalla DNasi I, possiede una Km di 12,5 µM e una kcat di 3,1 s-1 (Wernette et al.,
1988). Inoltre l’attività catalitica è più elevata a pH compreso fra 7,5 e 9,5, è stimolata da
concentrazioni medie o elevate di sale (75-200 mM, a seconda delle condizioni e del
templato) e, al contrario delle polimerasi nucleari, è inibita da N-etilmaleiimmide e da
27
1. Introduzione
dideossinucleotiditrifosfato, ma non dall’afidilcolina. Inoltre la polimerasi necessità, per
catalizzare la sintesi di DNA in vitro, di uno ione bivalente, costituito da Mg2+ o Mn2+.
Per quanto concerne la processività, essa è pari, in vitro, a 30 nucleotidi per la subunità
catalitica della Pol γ di Drosophila (Wernette et al., 1988). L’aggiunta della subunità
accessoria aumenta la processività fino a 1000 nucleotidi, dimostrando che una delle funzioni
fondamentali della subunità accessoria è l’incremento della processività (Williams et al.,
1993). Anche la polimerasi umana mostra un incremento della processività in presenza della
subunità accessoria, da 100 nucleotidi a 7000 nucleotidi (Lim et al., 1999).
La subunità catalitica delle polimerasi animali possiede una bassa affinità per il DNA
templato, che è notevolmente incrementata, di 10-100 volte, dalla presenza della subunità
accessoria (Wang and Kaguni, 1999; Lim et al., 1999; Johnson et al., 2000a; Carrodeguas et
al., 1999).
Il DNA mitocondriale deve essere replicato fedelmente, in quanto mutazioni nell’mtDNA
sono responsabili di diverse patologie mitocondriali, nonché dell’invecchiamento. La Pol γ è
una replicasi fedele, con una frequenza di errore in vitro di circa 2-4x10-6 per nucleotide in
condizioni ottimali (Kunkel and Mosbaugh, 1989; Kunkel and Soni, 1988). Un contributo di
circa 100 volte alla fedeltà di replicazione è conferito dal dominio esonucleasico. La subunità
catalitica della polimerasi umana è altamente accurata, con una frequenza di errore di 1 su
500000 nucleotidi (Longley et al., 2001). La fedeltà è influenzata da diversi fattori, fra cui la
concentrazione di sali, la presenza di basi ossidate sul templato e uno sbilanciamento delle
concentrazioni dei dNTP. Inoltre la presenza di regioni omopolimeriche incrementa la
frequenza di frameshift, suggerendo che la presenza di regioni omopolimeriche sull’mtDNA
possa essere fonte di mutazioni. La presenza della subunità accessoria, se da un lato
incrementa la processività e l’affinità per il DNA, dall’altro riduce la fedeltà, sia per quanto
riguarda la frequenza di sostituzioni che di frameshift (Longley et al., 2001).
Per quanto concerne l’attività esonucleasica, essa è in grado di rimuovere l’ultimo nucleotide
incorporato in un templato a doppio filamento che presenta un mismatch in 3’. In particolare il
dominio esonucleasico riconosce un mismatch rispetto ad un appaiamento corretto con una
frequenza da 5 a a 34 volte superiore, a seconda del tipo di mismatch (Longley et al., 1998b;
Kaguni and Olson, 1989; Insdorf and Bogenhagen,, 1989; Longley and Mosbaugh, 1991;
Olson and Kaguni, 1992). Come le polimerasi della famiglia A, è inoltre in grado di degradare
DNA a singolo filamento.
Per quanto concerne l’attività dRP liasica, essa è intrinseca al dominio polimerasico ed è in
grado di rimuovere lo zucchero in 5’ di un sito apurinico precedente tagliato da un’AP
endonucleasi (Longley et al., 1998a). La polimerasi γ svolge dunque un ruolo diretto nella
BER, in quanto dopo la rimozione dello zucchero in 5’ inserisce in 3’ un nuovo nucleotide,
che può essere poi legato al nucleotide in 5’ mediante una reazione catalizzata dalla ligasi.
Anche l’attività liasica viene stimolata dalla subunità accessoria (Pinz and Bogenhagen,
2006).
28
1. Introduzione
1.4.3 Regolazione della polimerasi γ
La replicazione dell’mtDNA, che avviene lungo tutto il ciclo cellulare, richiede la presenza
costante della polimerasi γ. La quantità della polimerasi γ presente nella cellula è
fondamentale. E’ stato dimostrato che se da un lato la delezione del gene codificante la
polimerasi γ in lievito porta alla perdita dell’mtDNA, l’overespressione della Pol γ in
Drosophila e in cellule in coltura porta ad una deplezione dell’mtDNA (Genga et al., 1986;
Lefai et al., 2000, Martínez-Azorín et al., 2007). Anche l’overespressione in lievito porta ad
un notevole incremento dei petite (dati non pubblicati). Poche informazioni sono note circa la
regolazione dei geni codificanti per la Pol γ. E’ noto comunque che la polimerasi, in lievito e
in cellule umane in coltura, è presente sia in presenza che in assenza di DNA, indicando che la
polimerasi è espressa e stabile anche in assenza di mtDNA (Genga et al., 1986; Davis et al.,
1996). Inoltre la polimerasi è presente anche in mitocondri non in replicazione (Davis et al.,
1996).
1.4.4 Replicazione del DNA mitocondriale
La DNA polimerasi γ svolge un ruolo fondamentale nella replicazione del DNA
mitocondriale. D’altra parte la replicazione del DNA mitocondriale, così come la replicazione
di qualsiasi tipo di DNA, richiede la partecipazione di diversi enzimi o proteine strutturali.
Inoltre l’inizio della replicazione necessita sia di specifici elementi di sequenza presenti
sull’mtDNA sia di opportune proteine che permettano alla DNA polimerasi γ di accedere al
templato. Di seguito verrà descritto brevemente il processo di replicazione dell’mtDNA
nell’uomo e nel lievito.
Replicazione dell’mtDNA nell’uomo. La caratteristica peculiare della replicazione
dell’mtDNA di mammiferi consiste nel fatto che essa è continua e asimmetrica, sia nello
spazio che nel tempo. Questo significa in primo luogo che ogni singolo filamento è
sintetizzato in maniera continua, senza la presenza di frammenti di Okazaki, al contrario della
replicazione del DNA nucleare, che è semidiscontinua, in cui, in ogni forca replicativa, un
filamento è sintetizzato in maniera continua (leading strand) mentre l’altro è sintetizzato in
maniera discontinua (lagging strand). In secondo luogo, la sintesi dei due filamenti inizia a
partire da origini diverse (asimmetria spaziale) e in tempi diversi (asimmetria temporale).
I meccanismi della replicazione del DNA mitocondriale di mammifero sono conosciuti,
sebbene recenti osservazioni di cui verrà detto successivamente suggeriscono che la
replicazione possa procedere anche in modo diverso. Il DNA mitocondriale di mammiferi
contiene due regioni che fungono da siti di inizio di trascrizione chiamati HSP (heavy strand
promoter) e LSP (light strand promoter), tra i quali è situata una regione non codificante. Da
ciascun promotore viene sintetizzato un filamento di RNA che funge da primer per la sintesi
del filamento L e H, rispettivamente.
Le caratteristiche della replicazione sono riportate in figura 1.13.
29
1. Introduzione
Figura 1. 13: Rappresentazione schematica della replicazione dell’mtDNA umano. La linee circolari sottili
rappresentano il filamento L, la linee circolari spesse il filamento pesante. Le linee tratteggiate indicano il
primer di RNA processato. Le frecce bianche indicano la direzione della replicazione. Le frecce nere
rappresentano la direzione della trascrizione a partire da HSP e LSP; (A) Inizio della sintesi del filamento
H; (B) Inizio della replicazione del filamento L e continuazione della sintesi del filamento H. (da Lecrenier
and Foury, 2000).
Dapprima viene sintetizzato un nuovo filamento H. Dall’LSP, usando come templato il
filamento L, viene sintetizzato un primer di RNA che, in corrispondenza di OH, l’origine di
replicazione del filamento H, viene opportunamente processato. L’RNA processato funge da
primer per la polimerasi γ che sintetizza un nuovo filamento H usando come templato il
filamento L parentale. Man mano che la sintesi procede, il filamento H parentale emerge
come regione a singolo filamento, nella regione chiamata D-loop o ansa di dislocazione.
Quando la sintesi del nuovo filamento H, e dunque la dislocazione del filamento H parentale,
giunge in corrispondenza di OL, inizia la sintesi del nuovo filamento L. OL consiste di
un’origine di replicazione di circa 30 bp situata in una regione contenente numerosi geni per
tRNA. Come per la sintesi del filamento H da OH, la sintesi del filamento L richiede la
presenza di un primer di RNA. La sintesi del filamento H finisce quando la polimerasi giunge
in corrispondenza di OH, mentre la sintesi del filamento L finisce successivamente quando la
polimerasi giunge in corrispondenza di OL (reviewed in Lecrenier and Foury, 2000).
Nel processo di replicazione, oltre alla polimerasi γ, sono coinvolte numerose proteine:
- la RNA polimerasi mitocondriale, codificata dal gene h-mtRPOL (Tiranti et al., 1997),
sintetizza l’RNA che fungerà da primer in corrispondenza di LSP.
- il fattore di trascrizione mtTFA, codificato dal gene h-mtTFA, è fondamentale
affinché la RNA polimerasi mitocondriale inizi la trascrizione ad alta efficienza.
Infatti mtTFA promuove l’inizio della trascrizione legandosi, piegando e svolgendo il
DNA e reclutando altri fattori di replicazione in corrispondenza del D-loop (Fisher et
al., 1992; Ghivizzani et al., 1994). L’importanza del fattore mtTFA nel mantenimento
dell’mtDNA è dimostrata dal fatto che topi knock out eterozigoti mostrano una
riduzione del numero di copie di mtDNA (Larsson et al., 1998).
30
1. Introduzione
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i fattori di specificità TFB1M e TFB2M sono coinvolti anch’essi nella replicazione e
interagiscono con mtTFA e la RNA polimerasi (Falkenberg et al., 2002; McCulloch et
al., 2002).
endo G è una RNasi che localizza nel mitocondrio dei mammiferi ed è in grado di
degradare l’RNA in un duplex RNA:DNA. L’enzima è necessario per il
rimaneggiamento dell’RNA in corrispondenza delle origini di replicazione(Prats et al.,
1997).
l’RNasi MRP taglia anch’esso l’RNA in un duplex RNA:DNA. Nonostante l’RNasi
MRP localizzi principalmente nel nucleo, essa è presente anche nel mitocondrio (Li et
al., 1994).
mentre l’RNA che funge da innesco per la sintesi del filamento H viene sintetizzato a
partire da LSP dalla RNA polimerasi, l’RNA necessario per la sintesi del filamento L
necessita di una primasi, necessaria per la sintesi di RNA in corrispondenza di OL. Il
gene codificante la primasi non è ancora stato identificato, ma nel 1985 è stata
identificata una primasi putativa mitocondriale con un componente di RNA (Wong
and Clayton, 1985a; Wong and Clayton, 1985b).
la proteina legante il DNA a singolo filamento mitocondriale (mtSSB) è una proteina
che, legando il DNA a singolo filamento ad alta affinità, promuove la
destabilizzazione dell’elica necessaria per il successivo svolgimento ad opera delle
elicasi. In vivo, la mtSSB agisce come tetrametro, ciascuno dei quali è in grado di
legare una regione di 8-17 nucleotidi (Yang et al., 1997; Thömmes et al., 1995).
la 5’-3’ elicasi Twinkle, codificata dal gene C10ORF2 o TWINKLE, è responsabile
dello svolgimento nella direzione 5’-3’ del DNA, necessario per la sintesi
dell’mtDNA. Twinkle condivide un’elevata similarità di sequenza con la regione Cteminale dell’elicasi-primasi del fago T7. Come l’elicasi-primasi del fago T7, Twinkle
possiede cinque motivi di sequenza delle elicasi, ma è assente un dominio primasico.
Twinkle è fondamentale non solo per il mantenimento dell’mtDNA, ma anche per la
regolazione del numero di copie di mtDNA, in quanto topi overesprimenti Twinkle
mostrano un aumento del numero di copie di circa tre volte, mentre cellule in cui
l’espressione di Twinkle viene ridotta mostrano una forte riduzione del numero di
copie di mtDNA (Tyynismaa et al., 2004).
-
le topoisomerasi I e IIIα sono coinvolte nel rilassamento del DNA durante la
replicazione. In particolare la topoisomerasi mitocondriale I rilassa i supercoil negativi
e rimuove i supercoil positivi generati dall’attività elicasica (Zhang et al., 2001).
- la ligasi III, codificata dal gene LIGIII, è fondamentale nel processo di replicazione, in
quanto ha il compito di legare l’estremità 3’ del filamento neosintetizzato con
l’estremità 5’.Cellule umane in coltura con una ridotta espressione di ligasi mostrano
una riduzione del contenuto di mtDNA (Lakshmipathy and Campbell, 2001).
Come detto in precedenza, recenti osservazioni hanno portato ad ipotizzare altri meccanismi
di replicazione (Holt et al., 2002; Yang et al., 2002; Bowmaker et al., 2003). In questi
esperimenti venivano identificati due tipi di intermedi di replicazione. Il primo tipo era
31
1. Introduzione
resistente al taglio con nucleasi che tagliano DNA a singolo filamento e aveva mobilità su gel
tipico di intermedi contenenti un leading e un lagging strand. Questi intermedi sono
incompatibili con la teoria “discontinua e asimmetrica” e prevedono un modello simile a
quello della replicazione nucleare, cioè semidiscontinuo e simmetrico. Secondo questo
modello, esistono diverse origini di replicazione situate in una regione di circa 4 Kb situata a
valle del D-loop (Yasukawa et al., 2005).
Replicazione dell’mtDNA in S. cerevisiae. La replicazione dell’mtDNA di S. cerevisiae, non
ancora del tutto compresa, è semidiscontinua e simmetrica, con la contemporanea sintesi, in
corrispondenza della forca replicativa, di un leading strand e di un lagging strand. La piena
comprensione dei meccanismi di replicazione è resa difficile dal fatto che diversi ceppi di S.
cerevisiae presentano mtDNA di diversa lunghezza, con un numero di origini di replicazione
variabili. Inoltre sono state identificate in cellule in divisione sia molecole circolari di mtDNA
sia molecole lineari, che spesso formano concatenameri (Bendich, 1996; Nosek and Tomaska,
2003).
Sulla base del tipo di ceppo, il genoma mitocondriale di S. cerevisiae contiene sette-otto
origini di replicazione, di cui solo quattro sono funzionali in quanto contengono un sito di
inizio di trascrizione necessario per la sintesi dell’RNA che funge da innesco per la sintesi di
DNA e sono chiamate ori1, ori2, ori3 e ori5 (Baldacci et al., 1984). Le origini di replicazione
sono inoltre bidirezionali. Nello specifico le quattro origini di replicazione funzionali sono
lunghe 300 bp e sono costituite da tre cluster GC ripetuti, chiamati C, B e A e separati da
sequenze ricche in AT. Il cluster C è sempre preceduto nelle origini funzionali da un sito di
inizio trascrizione chiamato r (Foury et al., 1998).
Lo schema della replicazione a partire da un’origine di replicazione e i dettagli della
replicazione sono riportati in figura 1.14.
32
1. Introduzione
Figura 1. 14: Rappresentazione schematica della replicazione dell’mtDNA di S. cerevisiae. Le linee
continue rappresentano filamenti di DNA, le linee tratteggiate filamenti di RNA. La regione compresa fra
il sito r e il cluster A rappresenta l’origine di replicazione. Le frecce bianche rappresentano la direzione in
cui la DNA polimerasi sintetizza nuovo DNA; (A) La RNA polimerasi Rpo41 sintetizza un filamento di
RNA usando come templato lo strand r a partire dal sito di trascrizione r. Il DNA a singolo filamento viene
legata dalla proteina legante il DNA a singolo filamento Rim1; (B) L’RNasi H processa l’RNA sintetizzato
da Rpo41 in corrispondenza del cluster C. Una primasi sintetizza un RNA usando come templato lo strand
non-r; (C) La DNA polimerasi usa gli inneschi di RNA per sintetizzare il DNA; la sintesi è bidirezionale.
(da Lecrenier and Foury, 2000).
Per quanto concerne le proteine coinvolte nel processo di replicazione, diverse proteine sono
omologhe alle proteine umane riportate in precedenza. Come l’inizio della trascrizione a
partire da OH nell’uomo richiede la presenza della RNA polimerasi e di fattori di trascrizione,
così nel lievito l’inizio della trascrizione, necessaria per la sintesi dell’innesco di RNA,
richiede la presenza della RNA polimerasi mitocondriale Rpo41, ortologo funzionale di hmtRPOL, e del fattore ti trascrizione Abf2. Abf2 è una proteina che condivide il 21% di
identità di sequenza con h-mtTFA ed è in grado di legare, piegare e introdurre
superavvolgimenti negativi nel DNA (Fisher et al., 1992). Sebbene le due proteine siano
omologhe, diversi studi hanno dimostrato che Abf2 ha un ruolo limitato nell’inizio della
trascrizione, e che serva piuttosto per la stabilità dell’mtDNA, per il mantenimento del
numero di copie, e per la trasmissione delle molecole alla progenie (MacAlpine et al., 1998;
Zelenaya-Troitskaya et al., 1998). Nell’inizio della trascrizione è inoltre coinvolto il fattore di
specificità mtTFB, necessario per il legame della RNA polimerasi al promotore e dunque per
33
1. Introduzione
la specificità di inizio (Schinkel et al., 1987; Xu and Clayton, 1992). Inoltre, le molecole rhonon necessitano della presenza di Rpo41 per essere replicati, tanto che ceppi rho-, anche
ipersoppressivi, deleti in RPO41 mantengono l’mtDNA (Fangman et al., 1990; Lorimer et al.,
1995). E’ probabile che i ceppi rho- replichino il loro mtDNA in maniera RNA polimerasi
indipendente, ad esempio mediante l’uso di una primasi, come per il filamento non-r, o
mediante processi di ricombinazione.
Come la sintesi a partire dall’origine OL necessita di una primasi per la sintesi dell’innesco di
RNA, la sintesi del filamento non-r in lievito richiede anch’essa la presenza di una primasi
che non è stata ancora clonata (Baldacci et al., 1984). Inoltre, come nell’uomo, l’RNA
sintetizzato dalla RNA polimerasi o dalla primasi deve essere processato. Nel lievito l’RNA
viene processato dalla RNasi MRP, contenente una componente di RNA (Stohl and Clayton
1992; Lee and Clayton, 1998).
Il DNA a singolo filamento che si forma in corrispondenza della forca di replicazione viene
legato, come nell’uomo, da una proteina SSB, codificata, in lievito, dal gene RIM1 (Van Dick
et al., 1992). Come l’ortologo umano, Rim1p agisce come tetrametro.
Come nella replicazione dell’mtDNA umano sono coinvolte topoisomerasi, elicasi e una
ligasi. Per quanto concerne le elicasi, l’elicasi Pif1 sembra essere coinvolta nei processi di
ricombinazione, mentre l’elicasi Hmi1 è direttamente coinvolta nella replicazione (Sedman et
al., 2000). La ligasi Cdc9, che verrà descritta nel dettaglio successivamente, svolge un ruolo
fondamentale nel processo di replicazione, in quanto ha il compito di ligare i frammenti di
Okazaki sul lagging strand.
In conclusione è chiaro che i sistemi di replicazione dell’mtDNA nell’uomo e in S. cerevisiae,
pur presentando elementi di diversità, mostrano numerose similitudini, in particolare la
richiesta di specifiche proteine, la maggior parte delle quali sono omologhe fra lievito e uomo.
1.4.5 Ruolo della polimerasi γ nella riparazione
Poiché la polimerasi γ è l’unica polimerasi identificata nei mitocondri, almeno negli eucarioti
superiori, essa è coinvolta, oltre che nella replicazione, in tutti i processi di riparazione
mitocondriale che necessitano di sintesi ex novo di DNA. Il DNA mitocondriale presenta una
frequenza di mutazioni puntiformi di circa 10 volte superiore rispetto al DNA nucleare
(Brown et al., 1979). Questa maggiore frequenza è dovuta al fatto che il DNA, in primo
luogo, non è protetto da istoni e, in secondo luogo, come detto in precedenza, è maggiormente
soggetto all’azione dei ROS, abbondanti nel mitocondrio. Inoltre il DNA mitocondriale è
soggetto all’azione mutagenica di radiazioni ionizzanti e UV e di prodotti chimici. La
frequenza di mutazioni è comunque ridotta grazie alla presenza di sistemi di riparazione
presenti nei mitocondri, che verranno brevemente descritti (Graziewicz et al., 2006).
BER. La base excision repair, o BER, è il principale meccanismo di riparazione attraverso il
quale basi danneggiate vengono rimosse dal DNA mitocondriale. La BER inizia col
riconoscimento di una base danneggiata ad opera di una specifica DNA glicosilasi. Nei
mitocondri di mammiferi e di lievito sono state identificate diverse DNA glicosilasi, ognuna
delle quali riconosce uno specifico tipo di base danneggiata. L’uracile DNA glicosilasi
34
1. Introduzione
riconosce residui di uracile, derivanti, in generale, dalla deamminazione ossidativa della
citosina, e che potrebbe portare a sostituzioni GCÆAT. La 8-oxoG DNA glicosilasi riconosce
la 7,8-dididro-8-guanina (8-oxo-dG), la base che si forma con maggiore frequenza in seguito a
danni ossidativi del DNA. La timina glicole DNA glicosilasi riconosce la timina glicole,
derivante dall’ossidazione della timina. Inoltre sono state identificate DNA glicosilasi in
grado di rimuovere basi metilate ed etilate. Una volta che la DNA glicosilasi si lega alla base
danneggiata, essa catalizza l’idrolisi del legame N-glicosidico fra il deossiribosio e la base
azotata, portando così alla formazione di un sito apurinico sul DNA.
Il sito apurinico viene riconosciuta da una specifica endonucleasi apurinica (AP endonucleasi)
che catalizza l’idrolisi del legame fosfodiestere fra l’OH in 3’ e il fosfato del sito apurinico.
Nei mitocondri esistono AP endonucleasi specifiche: nei mammiferi, le proteine Ape1 e
Ape2, e, nel lievito, le proteine omologhe Apn1 e Apn2.
All’attività della AP endonucleasi, segue un attività liasica 4’ terminale 2-deossirdibosio-5fosfato (dRP liasi) che catalizza, mediante β-eliminazione, la rimozione dello zucchero
fosfato in 5’. In concomitanza con la reazione di β-eliminazione avviene l’incorporazione del
nucleotide ad opera della polimerasi γ, a cui segue la ligazione ad opera della DNA ligasi
mitocondriale. In particolare la reazione di β-eliminazione può essere catalizzata dalla DNA
polimerasi stessa, che, come detto, almeno nelle polimerasi animali, possiede un attività dRP
liasica. In particolare, è stato dimostrato che, in vitro, la Pol γ di X. laevis è in grado di
rimuovere uracile dal DNA in presenza di una uracile DNA glicosilasi e di un’AP
endonucleasi (Longley et al., 1998a).
La BER può avvenire anche attraverso una via alternativa. Alcune DNA glicosilasi infatti,
come Ngt1, Ngt2 e Ogg1 di lievito, posseggono anche un’attività AP liasica intrinseca. Esse,
dopo la rimozione della base danneggiata, sono in grado di catalizzare la rimozione mediante
β-eliminazione direttamente del 3’ deossiribosio. Anche in questo caso segue direttamente
l’incorporazione del nucleotide ad opera della DNA polimerasi γ e la ligazione.
Mismatch repair. Il mismatch repair (MMR), o riparazione di malappaiamenti, è il
meccanismo attraverso il quale vengono riparati appaiamenti di coppie sbagliate, introdotte in
generale durante la replicazione e non corrette dall’attività esonucleasica della DNA
polimerasi γ. Mentre in tutti gli organismi esistono numerosi enzimi coinvolti nell’MMR del
DNA nucleare, un attività di MMR è stata isolata soltanto in S. cerevisiae e in
Schizosaccharomyces pombe. Il gene MSH1, trattato successivamente, codifica infatti per una
proteina mitocondriale, omologa a MutS di E. coli, in grado di riconoscere mismatch e di
portare avanti la sostituzione mediante il reclutamento di altre proteine. Queste proteine
catalizzano la rimozione del nucleotide sbagliato e di alcuni nucleotidi adiacenti, a cui segue
l’incorporazione di nucleotidi ad opera di Pol γ e la ligazione ad opera della ligasi
mitocondriale.
Recentemente è stata identificata un’attività MMR nei mitocondri di ratto, che, al contrario
dell’attività di lievito, è bidirezionale (cioè sostituisce indipendentemente un nucleotide o il
nucleotide sull’altro filamento) e mismatch selettivo, in quanto ripara soltanto mismatch GG e
GT) (Mason et al., 2003). D’altra parte l’attività di MMR identificata è meno attiva rispetto
35
1. Introduzione
all’attività di mismatch di S. cerevisiae (e in generale dell’attività nucleare) e inoltre non è
stata identificata nessun enzima omologo a MutS, suggerendo che l’attività sia catalizzata da
proteine con una diversa struttura e diversi meccanismi.
Ricombinazione. Nei mitocondri di lievito è presente un pathway di ricombinazione,
coinvolgente numerose proteine e trattato successivamente, grazie al quale vengono anche
riparati tagli a doppio filamento del DNA. Fra le proteine coinvolte vi sono l’endonucleasi
cruciforme Cce1, la DNA elicasi Pif1, la 5’-3’ esonucleasi Din7 e la proteina Mhr1.
Mutazioni in questi geni aumentano la frequenza di mutanti petite, suggerendo che la
ricombinazione è fondamentale per il mantenimento del genoma mitocondriale.
La ricombinazione è stata osservata anche in mitocondri di cellule di mammifero, sia in vitro
che in vivo, sebbene a bassa frequenza, e a tutt’oggi non è noto il ruolo di questo processo di
ricombinazione.
Sintesi translesione. Le polimerasi replicative, come Pol γ, sono in genere bloccate dalla
presenza, sul templato, di danni quali siti apurinici, basi ossidate o alchilate o dimeri di
timina. Nel nucleo, in presenza di questi danni, intervengono polimerasi riparative, quali Pol
zeta e Pol eta, che sono in grado di catalizzare la sintesi translesione, cioè di incorporare
nucleotidi nella regione opposta alla lesione e dopo appaiamenti costituiti da una lesione e un
nucleotide.
E’ stato osservato che Pol γ umana è in grado di catalizzare la sintesi translesione in presenza
di addotti DNA-platino. In presenza di un sito apurinico, la sintesi in vitro si interrompe la
maggior parte delle volte ma, quando procede, porta all’incorporazione preferenziale di
adenosina. Inoltre la polimerasi umana è in grado di compiere sintesi translesione, sebbene
con attività moderata, in presenza di adotti costituiti da benzopirene-DNA.
1.4.6 Patologie mitocondriali causate da mutazioni in POLG
Come detto in precedenza, mutazioni nel gene codificante la subunità catalitica della
polimerasi γ umana causano patologie caratterizzate da delezioni multiple e/o deplezione
dell’mtDNA in specifici tessuti. In particolare le patologie causate da mutazioni in POLG
possono essere suddivise in due classi: patologie dovute a delezioni multiple dell’mtDNA e
patologie dovute a deplezione dell’mtDNA. Le prime colpiscono solo alcuni tessuti, sono
tipicamente ad esordio adulto e non letali. Le seconde sono più o meno multisistemiche e ad
esordio infantile, e portano alla morte nel giro di pochi anni o pochi mesi. Come descritto nel
paragrafo successivo, la maggior parte delle mutazioni patologiche in POLG causano un solo
tipo di patologia, mentre alcune mutazioni causano più patologie, a seconda delle mutazioni
associate in cis o in trans. Di seguito verranno descritte le patologie causate da mutazioni in
POLG.
Oftalmoplegia esterna progressiva (PEO). L’oftalmoplegia esterna progressiva è la
patologia mitocondriale dovuta a mutazioni in POLG più comune. Questa malattia è ad
esordio adulto ed è caratterizzata da ptosi e progressiva paralisi bilaterale dei muscoli oculari
e del muscolo elevatore della palpebra. A questi sintomi principali sono in generale associati
altri sintomi, quali generalizzata debolezza dei muscoli scheletrici con intolleranza
36
1. Introduzione
all’esercizio fisico, atassia, depressione, ipogonadismo, deficit uditivi, neuropatie periferiche,
cardiopatie e cataratta (Biousse and Newman, 2003).
Dal punto di vista molecolare, la PEO è caratterizzata da delezioni singole o multiple
nell’mtDNA (Holt et al., 1988; Moraes et al., 1989; Holt et al., 1989). Tali delezioni sono
solitamente lunghe da 1 a 9 kb, fiancheggiate da sequenze dirette ripetute, probabilmente
importanti nella generazione delle delezioni stesse (Mita et al., 1990). Inoltre non sono
rimosse le origini di replicazione del filamento leggero e di quello pesante, ma viene sempre
perso almeno un gene per tRNA mitocondriali, con conseguente generalizzato difetto della
sintesi proteica mitocondriale, quando il rapporto tra molecole di mtDNA mutate e wild-type
supera il livello soglia, approssimativamente intorno al 75% (Hayashi et al., 1991). Inoltre i
muscoli scheletrici dei malati presentano fibre “red ragged”, espressione della proliferazione
mitocondriale, accumuli di numerose strutture mitocondriali anomale con inclusioni
paracristalline, una ridotta attività degli enzimi della catena respiratoria, espressione della
disfunzione mitocondriale, e ampie delezioni del mtDNA, evidenziabili mediante Southern
blot (Van Gothem et al., 2002; Kaukonen et al., 2000).
La PEO ha due cause principali:
1) il 40-70% dei casi è dovuto a singole delezioni dell’mtDNA avvenute ex novo durante
l’oogenesi o l’embriogenesi. In questi casi sporadici di PEO tipicamente è presente
una sola delezione dell’mtDNA, con un grado più o meno elevato di eteroplasmia.
2) circa il 15-30% dei casi di PEO sono ad eredità mendeliana, dunque dovuti a
mutazioni in geni nucleari (Agostino et al., 2003). In questi casi la causa primaria
della malattia sono le mutazioni nei geni nucleari codificanti proteine fondamentali per
l’integrità dell’mtDNA, mentre le delezioni multiple nell’mtDNA sono la causa
secondaria dovuta agli effetti delle mutazioni nucleari (Hirano and Vu, 2000).
Le delezioni causate da mutazioni in geni nucleari non vengono ereditate, sono
eteroplasmiche e la proporzione di molecole di mtDNA mutate può variare dal 20 al 90% nel
muscolo scheletrico (Biousse and Newman, 2003). La proporzione di copie di mtDNA mutate
nel muscolo scheletrico aumenta anche con l’età e in parallelo alla progressione della
malattia, ma ad oggi non è noto come tali delezioni si generano e quale è la loro rilevanza
nella patogenesi della malattia (Larsson et al., 1990; Chinnery, 2003). L’aumento nel tempo
del numero di molecole di mtDNA mutate è dovuta ad un vantaggio replicativo delle copie di
mtDNA delete rispetto alle copie wt, in quanto sono più corte e quindi preferenzialmente
amplificate (Van Goethem et al., 2002).
Per quanto concerne l’eredità di questi casi di PEO, essa può essere recessiva (arPEO) o
dominante (adPEO). In molti casi non è nota la storia familiare dei pazienti, e in questo caso
si parla di PEO sporadica. L’adPEO, i cui sintomi riguardano principalmente la muscolatura,
è stata descritta la prima volta da Zeviani e collaboratori (Zeviani et al., 1989) ed ha
un’incidenza di 1/100.000 in Italia e Finlandia (Kaukonen et al., 2000).
Allo stato attuale della conoscenza, la PEO ereditaria è causata da mutazioni in almeno
quattro geni nucleari: ANT1, codificante per l’isoforma 1 dell’ADP/ATP carrier; C10ORF2,
codificante per l’elicasi mitocondriale Twinkle; POLG; POLG2, codificante per la subunità
37
1. Introduzione
catalitica della polimerasi γ. Mutazioni in POLG sono responsabili di circa il 50% delle forme
ereditarie di PEO (Van Goethem et al., 2001; Lamantea et al., 2002). Una percentuale del 1035% dei casi sono dovuti a mutazioni negli altri tre geni, ma la percentuale rimanente di casi è
dovuta a mutazioni in geni non ancora identificati.
Sindrome da atassia-neuropatia (ANS). La sindrome da atassia-neuropatia è una patologia
recessiva caratterizzata da delezioni multiple nell’mtDNA ad esordio adulto (dalla pubertà
fino ai quarant’anni in generale). Questa patologia, e le sue varianti sindrome atassica
associata ai mitocondri (MIRAS) e sindrome epilettica-atassica spino-cerebellare (SCAE), è
causata specificatamente da mutazioni in POLG, che causano delezioni multiple come effetto
secondario. I sintomi includono neuropatia periferica, disartria, difetti cognitivi di media
gravità, movimenti involontari, sintomi psichiatrici, mioclono e, eventualmente, attacchi
epilettici (Hakonen et al., 2005).
Neuropatia atassica sensoriale, disartria e oftalmoparesi (SANDO). La SANDO è una
sindrome recessiva dovuta a mutazioni nel gene POLG o C10ORF2. I sintomi classici, oltre a
neuropatia, includono disartria, oftalmoparesi, areflessia, depressione, emicrania, disfagia,
nistagmo. Dal punto di vista molecolare, i pazienti presentano delezioni multiple
nell’mtDNA, di lunghezza variabile dalle 4 alle 10 Kb, nel muscolo e nel sistema nervoso
periferico. Il muscolo inoltre presenta fibre “red ragged” (Fadic et al., 1997; Rantamäki et al.,
2001).
Sindrome di Alpers. La sindrome di Alpers, o sindrome di Alpers-Huttenlocher, è una
malattia da deplezione dell’mtDNA ad esordio infantile. Le malattie da deplezione
dell’mtDNA, o MDS, sono caratterizzate da una forte riduzione del numero di copie di
mtDNA in specifici tessuti, che colpiscono tipicamente i bambini e sono ad esito fatale. La
sindrome di Alpers rientra nelle forme epatocerebrali di MDS, e tipicamente colpisce il
sistema nervoso centrale, il fegato e il tessuto muscolare. I sintomi tipici della sindrome di
Alpers includono atrofia del cervello, crisi epilettiche, regressione psicomotoria,
proliferazione dei dotti biliari, fibrosi, cirrosi, crisi epatiche croniche, ipotonia, emiparesi e
atassia (Gordon, 2006; Alberio et al., 2007).
I tessuti muscolari dei soggetti affetti da Alpers sono caratterizzati dalla presenza di fibre “red
ragged”, a cui sono associate deficienze dei complessi respiratori, in particolare della NADH
deidrogenasi, della succinato deidrogenasi e della citocromo c ossidasi (Schwabe et al., 1997).
La deficienza dei complessi respiratori è presente in genere anche nel fegato.
La sindrome di Alpers è causata da mutazioni in POLG ed è ereditata come malattia
autosomica recessiva. Mutazioni in POLG sono state associate ad altre forme di MDS
caratterizzate da un coinvolgimento del cervello e del fegato (sindrome epatocerebrale
infantile) oppure dal coinvolgimento di numerosi tessuti e organi (grave disordine
multisistemico dell’infanzia) (de Vries et al., 2007; Ferrari et al., 2005).
Altre patologie. Oltre alle patologie sopra riportate, vi sono altre patologie causate da
mutazioni in POLG non riconducibili direttamente a delezioni o deplezione dell’mtDNA. In
particolare casi di infertilità maschile sono associate ad una specifica mutazione in POLG.
All’estremità 5’ di POLG è presente un tratto costituito da 13 codoni CAG ripetuti. Due studi
38
1. Introduzione
hanno dimostrato che la riduzione del numero dei codoni CAG è responsabile di casi di
infertilità o subfertilità maschile (Rovio et al., 2001; Jensen et al., 2004). Studi recenti
sembrano però smentire questa osservazione (Krausz et al., 2004; Aknin-Seifer et al., 2005;
Brusco et al., 2006)
Sebbene il parkinsonismo sia un sintomo spesso associato a forme di PEO, soltanto nel 2004
sono stati riportati casi che cosegregano con specifiche mutazioni in POLG (Luoma et al.,
2004). I soggetti presentavano perdita di neuroni dopaminergici e di neuroni pigmentati., ma
non presentavano corpi di Levy, tipici della forma classica di sindrome di Parkinson. Gli
autori hanno ipotizzato che il parkinsonismo dovuto a mutazioni in POLG è dovuto ad un
pathway alternativo rispetto ai casi classici, in cui mutazioni, per lo più puntiformi,
nell’mtDNA causano una riduzione della produzione di ATP oppure un maggiore danno
ossidativo. Recentemente numerose mutazioni in POLG sono state identificate in individui
affetti da parkinsonismo (Luoma et al., 2007).
Mutazioni in POLG sono associati a casi di menopausa precoce in donne affette da PEO
(Luoma et al., 2004).
Recentemente due mutazioni in POLG sono state associate a casi di Charcot-Marie Tooth
(CMT), un tipo di atassia cerebellare diemelinizzante (Harrower et al., 2008).
Infine è noto che la polimerasi γ è inibita dagli analoghi dei deossinucleotidi utilizzati come
farmaci anti-HIV, tanto che soggetti trattati con inibitori nucleosidici della trascrittasi inversa
(NRTI) hanno presentato sintomi simili a quelli dei soggetti affetti da patologie mitocondriali,
quali miopatie con fibre”red ragged”, riduzione dell’mtDNA e acidosi lattica (reviewed in
Graziewicz et al., 2006). Recentemente è anche stata identificata una mutazione in POLG che
incrementa la sensibilità della polimerasi al trattamento con NRTI (Yamanaka et al., 2007).
Meccanismi molecolari delle delezioni. Allo stato attuale il meccanismo molecolare
responsabile per la generazione e l’accumulo di delezioni del mtDNA nei pazienti affetti da
PEO rimane sconosciuto e non è noto come le mutazioni nel gene POLG causino delezioni
nell’mtDNA (Van Goethem et al., 2003). In tal senso sono state formulate varie ipotesi.
1) Le delezioni osservate nell’mtDNA potrebbero essere una conseguenza dell’aumento
delle mutazioni puntiformi. Diverse mutazioni causanti PEO, come la mutazione
Y955C, incrementano la frequenza di mutazioni puntiformi (Ponamarev et al, 2002).
Nel DNA mitocondriale esistono regioni con un’elevata similarità. L’introduzione di
mutazioni puntiformi potrebbe aumentare la similarità di sequenza, favorendo un
processo di ricombinazione omologa illegittima. Più precisamente, secondo la teoria
dello strand slippage, la presenza di un non corretto appaiamento, dovuto ad un errore
per sostituzione di base, tra sequenze dirette ripetute può promuovere, dopo la sintesi
del frammento, uno scivolamento di un filamento del DNA rispetto all’altro e causare
in conseguenza una delezione, come riportato in figura 1.15 (Ponamarev et al, 2002).
Questa teoria non ha trovato però dimostrazione pratica. E’ invece stato dimostrato
che non tutte le mutazioni patologiche in POLG causano un aumento delle mutazioni
puntiformi, e quando si osserva un aumento delle mutazioni puntiformi questo è
presente sia in molecole wt che in molecole delete, suggerendo che non siano le
39
1. Introduzione
mutazioni puntiformi a causare la comparsa di delezioni multiple (Wanrooij et al.,
2004).
Figura 1. 15: Rappresentazione schematica dell’ipotesi dello strand slippage (da Ponamarev et al., 2002).
2) E’ noto che alcune mutazioni nel gene POLG riducono notevolmente l’attività
catalitica e/o la processività dell’enzima. Una riduzione dell’attività catalitica potrebbe
portare ad uno stallo della replicazione, cioè al blocco, o al rallentamento, della sintesi
del DNA, con la conseguente comparsa di delezioni. In particolare alcune polimerasi
mutate posseggono la stessa affinità per il DNA templato, o un affinità maggiore. Le
polimerasi mutate dunque potrebbero legarsi al DNA templato, bloccando la
replicazione e impedendo allo stesso tempo alla polimerasi selvatica di legarsi al
DNA. Anche una riduzione della processività potrebbe essere responsabile
dell’accumulo di delezioni dell’mtDNA, poiché potrebbe determinare una
terminazione precoce della replicazione dell’mtDNA (Graziewicz et al., 2004).
3) Alcune mutazioni potrebbero inibire l’interazione e/o la cooperatività della DNA
polimerasi γ con altre proteine coinvolte nella replicazione, impedendo che questa
possa procedere correttamente (Lamantea et al., 2002).
4) Un eventuale incremento dell’attività enzimatica della DNA polimerasi mutata
potrebbe causare un depauperamento del pool dei dNTP mitocondriali, presenti in
quantità limitante (Lamantea et al., 2002).
1.4.7 Mutazioni patologiche associate a POLG
Allo stato attuale (dicembre 2007) sono state identificate 89 mutazioni patologiche nel gene
POLG, più 16 SNP (Figura1.16).
40
1. Introduzione
Figura 1. 16: Mutazioni patologiche e SNP nella subunità catalitica della DNA polimerasi γ (dallo “Human
DNA Polymerase Gamma Mutation Database”, http://tools.niehs.nih.gov/polg/index.cfm curato da W.
Copeland).
Dalla figura emergono chiaramente alcune osservazioni. In primo luogo, mutazioni in POLG
causano diversi tipi di patologie, le cui caratteristiche sono state riportate in precedenza. La
patologia a cui è associato un maggior numero di mutazioni è l’oftalmoplegia esterna
progressiva (PEO), sia sporadica sia recessiva (arPEO) sia dominante (adPEO). In particolare
le mutazioni che causano forme di adPEO sono situate tutte nel dominio polimerasico, con
l’eccezione di due mutazioni recentemente scoperte, la S511N e la G517V (Hudson et al.,
2006; Horvath et al., 2006), situate nella regione linker. Nessuna forma di adPEO è associata
al dominio esonucleasico, sebbene per la mutazione W312R diverse osservazioni fanno
supporre che possa essere dominante. In secondo luogo, sebbene la maggior parte delle
mutazioni sia associata ad un’unica patologia, alcune mutazioni sono associate a più
patologie, soprattutto quando sono in cis o in trans con diverse mutazioni. In tal senso non
sono ancora noti i meccanismi attraverso cui medesime mutazioni possono dare origine a
patologie diverse, caratterizzate da insorgenza e sintomi molto differenti. In terzo luogo, è
41
1. Introduzione
emerso recentemente che alcuni SNP, in particolare lo SNP E1143G, possa influenzare il tipo
e la gravità del fenotipo patologico.
Di seguito vengono riportate le patologie associate alle mutazioni analizzate in questo studio.
G268A. La sostituzione G268A è stata associata a casi sporadici di PEO in omozigosi o in
eterozigosi con la mutazione A467T (Del Bo et al., 2003; Di Fonzo et al., 2003; GonzalezVioque et al., 2006). Il residuo G268 è situato nel motivo ExoII ed è altamente conservato in
diversi organismi. La mutazione è stata identificata dapprima in due pazienti, per la quale non
era nota la storia familiare (Di Fonzo et al., 2003). Un paziente era affetto da PEO, e il
sequenziamento di POLG ha mostrato la presenza della mutazione G268A in eterozigosi con
la mutazione recessiva A467T. L’altra paziente era invece affetta da PEO, retinopatia
pigmentosa, intolleranza all’esercizio e amenorrea; l’analisi molecolare ha mostrato la
presenza della mutazione G268A in omozigosi. Sulla base del fatto che in entrambi i casi la
mutazione era in trans con una seconda mutazione ha fatto ipotizzare che la mutazione fosse
recessiva, sebbene la recessività non fosse dimostrata dalla storia familiare. Successivamente
è stato dimostrato che nei fibroblasti della paziente omozigote la mutazione G268A era
associata ad un incremento significativo delle mutazioni puntiformi dell’mtDNA, sia nel Dloop che nella regione codificante (Del Bo et al., 2003).
Uno studio successivo ha mostrato che un paziente affetto da PEO con neuropatia sensoriale
era eterozigote per la mutazione G268A, suggerendo che la mutazione G268A potesse essere
dominante (Gonzalez-Vioque et al., 2006). D’altra parte la mutazione era in associazione con
un polimorfismo, la sostituzione Q1236H, indicando che il fenotipo potesse essere mediato
dalla presenza di questo polimorfismo. Anche in questo caso, l’assenza della storia familiare
non ha permesso di determinare la dominanza/recessività della mutazione.
A conferma del ruolo patologico della mutazione, la mutazione non è stata trovata in 200
soggetti sani (Di Fonzo et al., 2003; Gonzalez-Vioque et al., 2006).
G848S. La mutazione G848S è stata associata a casi di arPEO e di sindrome di Alpers. Il
residuo G848, molto conservato durante l’evoluzione, è situato nel dominio polimerasico, a
monte del motivo PolA. La mutazione è stata riportata in diversi casi di Alpers e di arPEO in
associazione con diverse mutazioni, ed è un esempio di come una mutazione possa essere
responsabile di diverse patologie, a seconda delle mutazioni che vi sono associate. La storia
familiare, disponibile per diversi pazienti, ha dimostrato che la mutazione è recessiva.
Per quanto concerne il coinvolgimento nella PEO, è stato riportato solo in due casi (Lamantea
et al., 2002; Kollberg et al., 2005) La mutazione è stata osservata in un paziente affetto da
PEO recessiva, in eterozigosi con la mutazione recessiva T251I nel dominio esonucleasico,
mentre non è stata osservata in 100 soggetti di controllo sani (Lamantea et al., 2002). La
mutazione è stata osservata anche in un paziente affetto da PEO sporadica in eterozigosi con
la doppia mutazione T251I-P587L (Kollberg et al., 2005).
La mutazione G848S è stata riportata in numerosi casi di Alpers (Ferrari et al., 2005;
Davidzon et al., 2005; Nguyen et al., 2005; de Vries et al., 2007; Horvath et al., 2006;
Kollberg et al., 2006). La mutazione è stata descritta dapprima in eterozigosi con la mutazione
A467T, una delle mutazioni più comuni riscontrate nei casi di Alpers (Ferrari et al., 2005). Il
42
1. Introduzione
soggetto, a conferma dell’insorgenza in età infantile di Alpers, ha mostrato i primi sintomi già
a sette mesi, caratterizzati successivamente da allargamento del fegato, ipoglicemia, acidosi
lattica, fibrosi del fegato, epilessia, strutture spongiformi nel cervello e cirrosi epatica. La
biopsia ha mostrato la presenza di mitocondri anomali nel fegato, nel cervello e nel muscolo.
Successivamente la mutazione è stata riscontrata in quattro pazienti, morti prima dei sei anni,
che presentavano il classico quadro clinico di Alpers, associato con una deplezione di mtDNA
nel fegato superiore all’85% (Davidzon et al., 2005). In tutti e quattro i casi la mutazione era
associata in eterozigosi con il doppio allele mutato W748S-E1143G. In tutti i casi di Alpers
descritti successivamente la mutazione è stata identificata in eterozigosi sempre con le
mutazioni A467T o W748S-E1143G (Nguyen et al., 2005; de Vries et al., 2007; Horvath et
al., 2006; Kollberg et al., 2006).
A889T. La mutazione A889T è stata associata a due casi di PEO, uno di PEO recessiva,
l’altra di PEO dominante, rendendo difficile comprendere l’ereditarietà della mutazione. Il
residuo A889, anch’esso molto conservato durante l’evoluzione, è situato nel dominio
polimerasico, all’interno del motivo PolA.
La mutazione è stata descritta per la prima volta nel 2003, in una paziente affetta da PEO con
ptosi progressiva, limitazione dei movimenti oculari, atassia, areflessia, cataratta e dismotilità
intestinale, e riduzione delle attività enzimatiche di tutti i complessi di trasporto di elettroni
(Filosto et al., 2003). In questa paziente la mutazione è stata osservata in associazione con la
mutazione R579W, sebbene non fosse noto dal sequenziamento se le mutazioni fossero in cis
o in trans. La recessività della mutazione A889T (e R579W) è stata confermata dal fatto che i
parenti sani della paziente erano eterozigoti per l’una o per l’altra mutazione. In questo studio
inoltre, la mutazione non è stata riscontrata in 120 controlli sani.
Successivamente la mutazione è stata identificata in due fratelli affetti da sindrome da atassianeuropatia con PEO (Hisama et al., 2005). I soggetti erano affetti da ptosi, oftalmoplegia
progressiva, nistagmo, areflessia, tremori e grave atassia. I soggetti presentavano soltanto la
mutazione A889T, in cis con lo SNP E1143G, mentre l’altro allele era selvatico, così da
suggerire che la mutazione fosse dominante. Gli autori hanno ipotizzato che la dominanza
potesse essere dovuta a due alternative: la mutazione A889T era dominante di per sé oppure la
presenza dello SNP E1143G rendeva la mutazione dominante, indicando che quest’ultimo
non si comportava come SNP neutrale. A questo va aggiunto che la madre e due prozii dei
pazienti, portatori obbligati dell’allele A889T-E1143G, erano affetti da un fenotipo molto
meno grave, caratterizzato da tremori, suggerendo che il fenotipo patologico fosse influenzato
da altri fattori, ambientali o genetici.
H932Y. La sostituzione H932Y è stata identificata in un caso di PEO sporadica e a casi di
arPEO con SANDO (Filosto et al., 2003; Mancuso et al., 2004). Il residuo H932 è situato nel
dominio polimerasico fra il motivo PolA e PolB ed è altamente conservato durante
l’evoluzione.
Dapprima è stato riportato il caso di una paziente con PEO sporadica associata a disfagia, che
era eterozigote per la mutazione H932Y e per la mutazione recessiva T251I, facendo
presupporre che la mutazione fosse recessiva, sebbene la recessività non potesse essere
43
1. Introduzione
confermata dalla storia familiare (Filosto et al., 2003). La mutazione non è stata osservata in
100 controlli sani.
Successivamente è stata riportata la storia di una famiglia, in cui due soggetti erano affetti da
SANDO con PEO e vari sintomi. Il primo soggetto presentava debolezza progressiva delle
palpebre, disfunzioni erettili, parestesia, ptosi bilaterale, oftalmoplegia progressiva, perdita di
udito, disartria, debolezza dei muscoli distali, areflessia, atassia, deficit cognitivi,
deterioramento mentale, depressione, polineuropatia sensorimotoria, demielinizzazione delle
fibre nervose, degenerazione assonale, e presenza nei muscoli di fibre “red ragged” citocromo
c ossidasi negative. Il secondo soggetto, sorella del primo, presentava una sintomatologia
simile, ma meno pronunciata. I due soggetti erano eterozigoti per le mutazioni H932Y e
G1051R. La determinazione della dominanza/recessività della mutazione era complicata dal
fatto che numerosi parenti eterozigoti per l’una o per l’altra mutazione non erano
completamente asintomatici, ma presentavano fenomeni di emicrania ricorrente e/o problemi
psichiatrici. In particolare tre soggetti su cinque portatori della mutazione H932Y
presentavano fenomeni di emicrania, che erano assenti in soggetti con alleli wt, suggerendo
che la mutazione potesse essere parzialmente dominante. La mutazione non è stata riscontrata
in 120 soggetti sani.
Y955C. La sostituzione Y955C è responsabile del fenotipo più grave di adPEO, ed è stata
riportata in numerosi casi (Van Goethem et al., 2001; Lamantea et al., 2002; Luoma et al.,
2004; Kollberg et al., 2005; Pagnamenta et al., 2006)
La mutazione è stata descritta originariamente da Van Goethem, come prima mutazione in
POLG associata ad una patologia mitocondriale (Van Goethem et al., 2001). In questo studio,
una famiglia presentava soggetti affetti da una grave forma di PEO dominante, con debolezza
muscolare, fibre “red ragged”, abbondanti mitocondri subsarcolemmali con strutture
paracristalline e delezioni multiple dell’mtDNA. I soggetti erano eterozigoti per la mutazione
Y955G. La mutazione era assente in 432 controlli. Successivamente altri casi sono stati
descritti in cinque famiglie, i cui soggetti eterozigoti per la mutazione Y955C erano affetti da
una grave forma di adPEO (Lamantea et al., 2002).
Sono stati poi identificati vari soggetti affetti da adPEO eterozigoti per la mutazione Y955C
(Luoma et al., 2004). In questo studio emerge come la mutazione sia associata a sintomi non
riconducibili all’oftalmoplegia esterna progressiva. In particolare, la maggior parte delle
donne presentavano una menopausa precoce, prima dei 35 anni, osservazione
successivamente confermata da altri (Pagnamenta et al., 2006). In secondo luogo, diversi
soggetti erano affetti da parkinsonismo non classico. I soggetti presentavano perdita di
neuroni dopaminergici e di neuroni pigmentati., ma non presentavano corpi di Levy, tipici del
Parkinson. Questo studio ha dimostrato per la prima volta una correlazione fra mutazioni in
POLG e parkinsonismo. La mutazione inoltre non era presente in 1640 soggetti sani.
A causa della severità del fenotipo associato alla mutazione Y955C sono stati condotti
numerosi studi in vitro ed in vivo per comprendere i meccanismi attraverso i quali la
polimerasi mutata agisce.
44
1. Introduzione
Mediante predizione della struttura tridimensionale del dominio polimerasico basato sulla
struttura di proteine della famiglia A di cui era nota la struttura, è stato determinato che il
residuo Y955, situato nel motivo PolB e conservato in tutte le polimerasi della famiglia A, è
situato nelle vicinanze del dNTP entrante (Ponamarev et al., 2002). In particolare il residuo di
tirosina è coinvolto nel riconoscimento e nel legame del dNTP entrante. Il legame del dNTP
necessita probabilmente della stabilizzazione mediante un legame idrogeno a cui partecipa il
gruppo idrossile della tirosina e mediante interazione idrofobica a cui partecipa l’anello
aromatico (Ponamarev et al., 2002). Studi biochimici sulle polimerasi priva del dominio
polimerasico, wt o recante la mutazione Y955, hanno dimostrato che:
- la polimerasi mutata mostra una Km 45 volte superiore a quella della polimerasi wt;
- la kcat è simile fra le due polimerasi;
- l’affinità per il DNA templato è simile fra le due polimerasi;
- la polimerasi mutata mostra un incremento dell’incorporazione di basi sbagliate di
circa 42 volte;
- in presenza del dominio esonucleasico, la polimerasi mutata mostra una riduzione
della fedeltà di circa 2 volte;
- la polimerasi mostra un incremento di circa 4 volte di mutazioni di frameshift +1 o -1
(Ponamarev et al., 2002).
Sulla base di queste osservazioni è stato ipotizzato che la comparsa di delezioni multiple fosse
dovuta, almeno in parte, all’incremento di mutazioni puntiformi, ad esempio attraverso il
meccanismo dello strand slippage.
Uno studio successivo ha dimostrato che, in presenza della subunità accessoria, i valori di Km
della polimerasi mutata è più elevata di circa 300 volte, mentre la kcat è ridotta di circa 10
volte (Graziewicz et al., 2004). Queste variazioni risultano in una riduzione dell’efficienza
catalitica di circa 3000 volte. Alla riduzione dell’attività è associata una riduzione di circa
l’80% della processività in vitro (Graziewicz et al., 2004). Sulla base di queste osservazioni è
stato ipotizzato che delezioni nell’mtDNA siano dovute in vivo ad uno stallo della
replicazione, dovuto al fatto che la polimerasi mutata, che mostra la stessa affinità per il DNA
templato rispetto a quella selvatica, è in grado di legare il DNA, ma, una volta legatosi,
impedisce o rallenta la sintesi.
Recentemente è stato dimostrato in vitro che la polimerasi recante la mutazione Y955C
potrebbe essere più sensibile, indirettamente, agli effetti dei ROS, cosa che potrebbe spiegare
il suo coinvolgimento nel parkinsonismo (Graziewicz et al., 2007). Infatti la polimerasi
Y955C tende ad incorporare con maggiore frequenza la base ossidata 8-oxo-dG. In
particolare, a parità di concentrazione di dGTP e 8-oxo-dGTP, la polimerasi wt ha un potere
discriminante di circa 10000 volte, cioè incorpora 8-oxo-dGTP una volta su 10000, di cui
l’80% delle volte opposto a C, e il 20% delle volte opposto ad A, attraverso un appaiamento
di tipo Hoogsteen. La polimerasi mutata invece mostra un potere discriminante di sole 45
volte, e il 50% delle volte che incorpora 8-oxo-dG lo incorpora opposto ad A. Questo
determina un incremento delle sostituzioni puntiformi, in quanto nei cicli successivi la 8-oxodG tenderà ad appaiarsi a C, causando transizioni CGÆTA. Quando invece la 8-oxo-dG è
45
1. Introduzione
presente nel templato, la polimerasi incorpora quasi il 5% delle volte C e quasi mai A, mentre
il 95% delle volte la replicazione è bloccata. La polimerasi mutata incorpora il 39% delle
volte C e, sebbene i valori siano bassi, essa incorpora A con una frequenza di circa 100 volte
superiore a quella della polimerasi selvatica. Anche in questo caso perciò la polimerasi mutata
favorisce le transizioni GCÆAT. I fenomeni di parkinsonismo associati alla mutazione
Y955C potrebbero essere dovuti ad un maggiore accumulo di 8-oxo-dG nel DNA
mitocondriale. Infatti molti soggetti che presentano parkinsonismo presentano un accumulo di
8-oxodG nell’mtDNA (Nakapebbu et al., 2007).
L’effetto della mutazione Y955C è stata studiata anche in vivo mediante l’utilizzo di sistemi
modello. Mediante l’utilizzo di S. cerevisiae è stato dimostrato che la mutazione equivalente
alla mutazione Y955C determina la perdita totale dell’mtDNA e rende il ceppo rho0. La
mutazione è dominante, e ceppi eterozigoti per la mutazione equivalente mostrano un
incremento di petite e un incremento del danno sul DNA (Stuart et al., 2006).
L’espressione della polimerasi umana wt o mutata nel cuore di topi transgenici ha portato
invece ad un aumento della mortalità nei topi recanti la versione mutata, accompagnata da un
allargamento atriale del cuore, da una riduzione del numero di copie di mtDNA, da
un’incorporazione 3 volte maggiore di 8-xo-dG nell’mtDNA, da variazioni della densità della
matrice mitocondriale e dalla dissoluzione delle creste mitocondriali (Lewis et al., 2007).
G1051R. La mutazione G1051R è stata riportata in una sola famiglia con pazienti affetti da
SANDO con PEO, in associazione con la mutazione H932Y, di cui detto prima (Mancuso et
al., 2004). Il residuo G1051 è situato nel dominio polimerasico, fra i motivi PolB e PolC ed è
conservato durante l’evoluzione. La storia dei pazienti affetti dalle mutazioni H932Y e
G1051R in eterozigosi è stata riportata in precedenza. E’ da notare che la mutazione G1051R
è associata, nella famiglia, a diversi casi di problemi psichiatrici, ma poiché questi sono
diffusi anche in soggetti non portatori di mutazioni, è probabile che la causa sia imputabile ad
altri fattori. La mutazione sembra pertanto recessiva. La mutazione non è stata identificata in
120 controlli sani.
E1143G. La sostituzione E1143G viene classificata in banche dati come SNP, con una
frequenza nella popolazione caucasica del 2-4% e assente nelle altre popolazioni (GeneSNP,
http://www.genome.utah.edu/genesnps/). Il residuo E1143G, moderatamente conservato
durante l’evoluzione, è situato nel dominio polimerasico, appena a valle del motivo PolC. Un
“single nucleotide polymorphism”, o SNP, è definito, in accordo con lo “Human Genome
Project Information”, come una variazione di sequenza che avviene quando un singolo
nucleotide nella sequenza genomica è alterata. Una variazione può essere definita come uno
SNP se è presente in almeno l’1% della popolazione. Inoltre, per definizione, uno SNP non
causa direttamente una patologia, sebbene la presenza di uno SNP possa alterare l’effetto di
mutazioni patologiche nonché, ad esempio, la risposta a farmaci.
Lo SNP E1143G è stato osservato in numerosi casi patologici, fra cui casi di PEO, di atassianeuropatia e di Alpers (Di Fonzo et al., 2003; Van Goethem et al., 2004; Hisama et al., 2005;
Ferrari et al., 2005; Davidzon et al., 2005; Nguyen et al., 2005; Winterthun et al., 2005;
Horvath et al., 2006; Kollberg et al., 2006). Nella maggior parte dei casi, lo SNP è stato
46
1. Introduzione
trovato in cis con la mutazione W748S e in trans con un’altra mutazione. La sostituzione
W748S, una delle mutazioni maggiormente riscontrata nei casi di Alpers, è sempre presente in
cis con lo SNP E1143G, probabilmente per un effetto del fondatore (Hakonen et al., 2005).
Nonostante la SNP sia stato riscontrato in vari casi patologici, esso non è patologico di per sé.
Vari studi hanno identificato infatti soggetti sani omozigoti per lo SNP E1143G. Nonostante
ciò, sulla base di diverse osservazioni di seguito riportate, è stato ipotizzato che lo SNP
E1143G non sia neutrale, ma si comporti come modificatore fenotipico in grado di modulare
gli effetti patologici di mutazioni in cis o in trans.
1) Come detto in precedenza, lo SNP E1143 è stato identificato in cis con la mutazione
A889T in due fratelli affetti da adPEO (Hisama et al., 2005). Poiché la mutazione
A889T sembra essere recessiva, è stato ipotizzato che la dominanza della mutazione
sia dovuta alla concomitante presenza dello SNP E1143G.
2) Lo SNP E1143G è stato riscontrato con una frequenza significativamente maggiore in
soggetti malati rispetto a soggetti sani (Horvath et al., 2006).
3) In una famiglia di tre generazioni i cui soggetti erano affetti da adPEO dovuta alla
mutazione dominante G517V, il fenotipo più grave si osservava in una paziente che, in
trans con questa mutazione, presentava lo SNP E1143G (Horvath et al., 2006).
4) Lo SNP E1143G è stato identificato in pazienti recanti su un allele la mutazione
patologica, A467T o S433C, e sull’altro lo SNP E1143G. Mentre non sono note le
caratteristiche della mutazione S433C, che potrebbe essere dominante, è noto che la
mutazione A467T è recessiva. Questa osservazione suggerisce che lo SNP E1143G
possa contribuire in maniera decisiva al manifestarsi del fenotipo clinico. Non è però
escluso che nel soggetto studiato la patologia fosse dovuta a mutazioni in altri geni
(Horvath et al., 2006).
Gli effetti dello SNP E1143G sono anche stati saggiati in vitro (Chan et al., 2006). In questo
studio sono state determinate le proprietà biochimiche della polimerasi umana wt, della
polimerasi recante la mutazione E1143G (polimerasi E1143G), e delle polimerasi W748S e
W748S-E1143G. La finalità dell’esperimento era determinare se la presenza della sola
mutazione E1143G alterasse le proprietà biochimiche della polimerasi e se la mutazione
alterasse le proprietà della polimerasi recante la mutazione W748S. E’ stato osservato che,
sorprendentemente, la polimerasi E1143G ha un’attività catalitica di circa 1,3 volte superiore
a quella della polimerasi wt, e questo incremento è dovuto ad una maggiore stabilità della
polimerasi. Inoltre la polimerasi W748S-E1143G mostra una maggiore efficienza catalitica e
una maggiore affinità per il DNA rispetto alla polimerasi W748S. D’altra parte la polimerasi
W748S-E1143G risulta meno stabile rispetto alla polimerasi W748S. Questi dati dimostrano
che, almeno in vitro, E1143G non si comporta come SNP neutrale, ma è in grado di
comportarsi come modificatore fenotipico di una mutazione in cis.
1.4.8 DNA polimerasi γ di S. cerevisiae
La polimerasi γ di S. cerevisiae è costituita da una sola subunità catalitica, codificata dal gene
MIP1 (Mitochondrial DNA Polymerase). Il gene MIP1 è situato sul cromosoma XV e
47
1. Introduzione
codifica per una proteina di 1254 aminoacidi. Mip1 mostra un’elevata identità di sequenza
con le DNA polimerasi γ animali: in particolare, essa mostra un’identità di sequenza del 43%
con la polimerasi umana. L’identità di sequenza non è distribuita uniformemente lungo la
sequenza primaria, ma si concentra nelle regioni codificanti per il dominio polimerasico e il
dominio esonucleasico, in particolare nei motivi ExoI, II e III, e nei motivi PolA, B e C.
Rispetto alle polimerasi animali, la polimerasi γ di S. cerevisiae, e in generale le polimerasi γ
fungine, posseggono una regione linker decisamente più corta rispetto a quella delle
polimerasi animali. La Pol γ di S. cerevisiae possiede inoltre una lunga coda C-teminale,
caratteristica del genere Saccharomyces, che è fondamentale per la stabilità della polimerasi
stessa.
Il gene MIP1 è stato clonato da Foury nel 1989 (Foury, 1989). In questo studio, un mutante
termosensibile con una ridotta attività polimerasica mitocondriale è stato trasformato con una
banca genomica di S. cerevisiae. Il mutante presentava una ridotta attività catalitica in vitro a
28°C e soprattutto a 37°C, fenomeno dovuto ad una mutazione di stop all’estremità Cterminale di Mip1 (Foury, comunicazione personale). Ne risultava, in vivo, un fenotipo
termosensibile caratterizzato dalla perdita dell’mtDNA a 37°C e di conseguenza
dall’incapacità di crescere su fonti ossidabili a questa temperatura. La trasformazione con una
banca genomica derivante dal ceppo Σ1278b ha permesso di identificare un clone in cui era
presente il gene MIP1 in grado di complementare il fenotipo di crescita a 37°C. La successiva
delezione del gene MIP1 ha portato invece alla perdita totale dell’attività polimerasica
mitocondriale e alla perdita dell’mtDNA.
Nel 1990 è stato dimostrato, per similarità di sequenza, che Mip1 appartiene alla famiglia A
delle DNA polimerasi, a cui appartengono la polimerasi I di E. coli e la polimerasi del fago
T7 (Blanco et al., 1991).
Studi successivi hanno portato all’identificazione di alleli mutatori, cioè alleli mutati di MIP1
che portavano all’incremento della frequenza di mutazioni puntiformi dell’mtDNA e, spesso,
anche ad un aumento della mutabilità estesa dell’mtDNA (Foury and Vanderstraeten, 1992;
Hu et al., 1995). Nel primo di questi studi, mediante mutagenesi sito-specifica, sono stati
creati mutanti con una ridotta attività 5’-3’ esonucleasica, ai quali erano associati un aumento
della frequenza di mutazioni puntiformi dell’mtDNA. In particolare la sostituzione di tre
residui di aspartato conservati situati nei motivi ExoI, II e III con alanina o glicina portava
all’incremento di centinaia di volte della frequenza di mutanti EryR. Le polimerasi mutate
mostravano una attività 5’-3’ esonucleasica in vitro 100-500 volte minore rispetto a quella del
wt. Alla forte riduzione dell’attività esonucleasica era associata una blanda riduzione
dell’attività polimerasica, di circa il 20%, e una notevole riduzione della processività, che ha
portato ad ipotizzare che le due attività non siano completamente indipendenti, o meglio che
mutazioni nel dominio esonucleasico possano portare ad una riduzione dell’attività catalitica e
soprattutto della processività della polimerasi. Questo spiegherebbe perché le mutazioni nel
dominio esonucleasico portavano ad un incremento di circa 5-10 volte della frequenza di
petite a 30°C e alla ridotta crescita su glicerolo a 37°C. Nel secondo studio, mediante
mutagenesi casuale sono stati identificati 10 alleli mutatori di MIP1. La maggior parte degli
48
1. Introduzione
alleli mutatori erano mutati nel dominio esonucleasico, mentre tre mutazioni mappavano nel
dominio polimerasico. In questo modo è stato dimostrato che anche l’attività polimerasica è
responsabile dell’accuratezza e dunque della fedeltà della replicazione. A tutte le mutazioni
era inoltre associato un maggiore accumulo di petite, almeno a 37°C, ma l’accumulo di
mutanti petite non correlava con l’aumento di mutazioni puntiformi. La maggior parte inoltre
delle mutazioni aveva una carattere dominante. In uno studio successivo, mediante l’utilizzo
di alleli mutatori mutati nel dominio esonucleasico, è stato dimostrato che l’attività
esonucleasica della polimerasi corregge principalmente trasversioni, mentre l’attività di
mismatch repair associata a Msh1 ripara principalmente transizioni (Vanderstraeten et al.,
1998).
E’ stato inoltre dimostrato che la sintesi di mtDNA è notevolmente sensibile alla temperatura,
fenomeno che spiega il motivo per cui ad alte temperature la frequenza di mutanti petite è più
elevata. La riduzione della sintesi dell’mtDNA dopo heat shock a temperature superiori a
40°C è imputabile ad una inattivazione per denaturazione della DNA polimerasi γ
(Duchniewicz et al., 1999; Germaniuk et al., 2002). In questi studi è stato dimostrato che
l’incremento della temperatura inattiva la DNA polimerasi, determinandone un misfolding. La
proteina è in grado di riattivarsi dopo inattivazione termica, ma la riattivazione necessita di
chaperoni mitocondriali, in particolare il cochaperone Mdj1, il chaperone Hsp70, costituito
dalle subunità Ssc1 e Mge1, e il chaperone Hsp78. Mutazioni in questi geni incrementano la
frequenza di petite ad alte temperature, e inibiscono il refolding di Mip1 dopo heat shock.
E’ inoltre stato dimostrato che una proteina del nucleoide, Sed1, situata nella membrana
interna, è importante nel mantenimento dell’mtDNA. La proteina Sed1 infatti interagisce con
Mip1, e questa interazione è fondamentale per la stabilità dell’mtDNA. La delezione in Sed1
riduce infatti la quantità di Mip1, e porta ad un incremento di circa 4 volte sia della mutabilità
puntiforme che della mutabilità estesa dell’mtDNA (Phadnis and Sia, 2004). Infine è stato
recentemente dimostrato che la parte prossimale al dominio polimerasico della coda Cterminale di Mip1 è fondamentale per la stabilità della proteina (Young et al., 2006).
1.5 Il lievito S. cerevisiae come sistema modello
Il lievito S cerevisiae è stato utilizzato in numerosissimi studi come sistema per studiare la
biologia di base, la fisiologia e la patologia degli eucarioti superiori, in particolare dell’uomo.
L’utilizzo di S. cerevisiae come sistema modello dello studio della fisiopatologia umana pone
diversi vantaggi.
1) S. cerevisiae possiede una struttura molto simile a quella delle cellule di eucarioti
superiori; in particolare possiede tutte le strutture intracellulari presenti anche negli
eucarioti superiori, fra cui i mitocondri (Botstein, 1991).
2) Sebbene l’organizzazione sia simile a quella delle cellule degli eucarioti superiori, il
lievito possiede alcuni vantaggi tipici degli organismi unicellulari. In primo luogo è in
grado di crescere velocemente su terreni semplici, cosa che rende più veloce e più
economico lo studio in questo sistema. In secondo luogo, il lievito esiste sia allo stato
aploide che allo stato diploide, con l’evidente vantaggio di studiare l’effetto di
49
1. Introduzione
mutazioni sia dominanti che recessive. Inoltre, mediante la costruzione di ceppi
emizigoti, cioè diploidi distrutti in uno solo dei due alleli, trasformati con un allele
mutato, è possibile determinare la natura della dominanza, in particolare se la
dominanza è dovuta ad un’aploinsufficienza oppure ad una acquisizione di funzione
negativa. In terzo luogo, sono stati sviluppati semplici tool di ingegneria genetica
applicabili sul lievito, fra cui la trasformazione con plasmidi monocopia o multicopia
ad alta efficienza, e metodi di distruzione genica. In particolare la distruzione genica è
facilitata, in S. cerevisiae, dall’alta frequenza di ricombinazione omologa, che
favorisce l’inserimento della cassetta di distruzione al corretto locus. In quarto luogo,
possono essere applicati sul lievito semplici protocolli di biologia molecolare, quali
l’estrazione di acidi nucleici e di proteine.
3) Il lievito è il primo organismo eucariotico il cui genoma è stato completamente
sequenziato e pubblicato (Goffeau et al., 1996). Il cosiddetto “progetto genoma” ha
portato alla identificazione di circa 6300 geni in lievito, un numero circa cinque volte
più piccolo rispetto alla stima dei geni umani (Venter et al., 2001). Il genoma si è
dimostrato molto compatto, con poche sequenze intergeniche e la presenza di pochi
introni. L’analisi comparativa delle sequenze aminoacidiche ricavate dal
sequenziamento del genoma di S. cerevisiae ha suggerito che molte funzioni
biologiche di base della cellula eucariotiche siano svolte da un set di proteine
ortologhe; questi studi quindi indicano che l’analisi delle proteine di lievito possa
fornire conoscenze utili alla comprensione degli eucarioti superiori (Barrientos, 2003).
In particolare, è interessante notare che il 46% delle proteine umane note ha omologhi
in lievito , fra cui principalmente proteine coinvolte nei meccanismi di base della vita
cellulare, quali replicazione, ricombinazione e riparazione del DNA, trascrizione,
traduzione, e enzimi del metabolismo basale, del traffico tra i compartimenti cellulari
e della biogenesi mitocondriale (Venter et al., 2001). La conoscenza completa del
genoma, insieme all’efficacia dei sistemi di ingegneria genetica, ha permesso di
portate a termine efficacemente l’analisi su larga scala del genoma e del proteoma
(Foury and Kucej, 2001). Questo ha reso possibile a un consorzio internazionale la
costruzione di una collezione di 5943 ceppi deletanti di lievito, in ciascuno dei quali
un gene, nel contesto aploide o diploide, è stato distrutto (Winzeler et al., 1999).
Inoltre il lievito è il solo organismo nel quale l’efficienza delle nuove tecnologie (in
particolare two-hybrid, chip di DNA e proteine, delezione sistematica) sia stata testata
a livello dell’intero genoma (Foury and Kucej, 2001). Questi studi su scala genomica
sono invece estremamente difficoltosi nell’uomo, a causa della maggiore dimensione
del genoma e della presenza di introni.
1.5.1 Il lievito S. cerevisiae come sistema modello per lo studio delle
patologie mitocondriali
Il lievito è un ottimo modello anche per studiare la biologia di base e la patofisiologia dei
mitocondri. La similarità tra i mitocondri di lievito e umani ha permesso prima di tutto di
50
1. Introduzione
utilizzare studi di genomica funzionale di S. cerevisiae per identificare geni umani coinvolti in
patologie; per esempio sono state individuate mutazioni in cinque geni nucleari responsabili
di miopatie mitocondriali caratterizzate da deficienza della citocromo c ossidasi, grazie a studi
che ne hanno prima dimostrato in lievito la funzione essenziale nel processo di assemblaggio
(Barrientos, 2003). L’identificazione di vari ortologhi umani di proteine mitocondriali di
lievito, ad esempio i geni BCS1 e COX10 necessari all’assemblaggio delle componenti della
catena respiratoria e responsabili di sindromi ereditarie, è stata possibile mediante l’approccio
della complementazione funzionale, ottenuta quando il prodotto genico di un organismo è in
grado di compensare la mancanza di un gene di un altro organismo (Valnot et al., 2000; De
Lonlay et al., 2001).
Un consorzio internazionale di laboratori ha svolto una screening sistematico funzionale
utilizzando la collezioni di deletanti di lievito di cui detto prima per identificare proteine
mitocondriali. Questo ha permesso l’identificazione di 466 geni la cui delezioni abbatte la
respirazione mitocondriale, dei quali 265 non ancora noti. Invece, 255 geni associati a difetti
di crescita in substrati non fermentabili possiedono ortologhi nell’uomo e di questi 21 sono
geni noti per essere coinvolti in malattie mitocondriali ereditate come tratti mendeliani
(Steinmetz et al., 2002).
L’utilizzo di un modello per lo studio delle malattie mitocondriali ha diverse finalità. In primo
luogo mediante l’utilizzo di un sistema modello è possibile “validare” una mutazione, cioè
stabilire se una mutazione in un gene è responsabile effettivamente della patologia in
questione. Il notevole incremento delle conoscenze relative a geni nucleari implicati in
malattie classificate come patologie mitocondriali è il risultato dello sviluppo della tecnica del
clonaggio posizionale, che prevede la mappatura della regione cromosomica contenente il
gene associato alla malattia, mediante analisi di linkage condotte nelle famiglie dei pazienti
(Collins, 1995). L’analisi di linkage è possibile solo se si hanno a disposizione famiglie
numerose, con più membri affetti dalla malattia, e consiste nell’individuazione di
polimorfismi vicini al locus patologico che pertanto vengano ereditati con il gene mutato.
L’affidabilità dell’analisi dipende da quanto è stretta l’associazione tra polimorfismo e locus
della malattia. L’identificazione di geni nucleari associati a patologie mitocondriali attraverso
il clonaggio posizionale è limitata da vari problemi. Innanzitutto la maggior parte delle
famiglie sono piccole e spesso solo un membro è colpito dalla malattia, e inoltre il fenotipo
clinico è solitamente complesso. Mutazioni nello stesso gene possono generare sintomi
diversi e mutazioni in differenti geni possono portare al medesimo fenotipo patologico, quindi
anche quando è possibile trovare diverse famiglie con componenti che presentano i medesimi
sintomi, non ci sono garanzie che essi presentino lo stesso difetto genetico (Chinnery, 2003).
Secondariamente, il clonaggio posizionale identifica delle regioni cromosomiche che
dovrebbero contenere il difetto genetico, le quali in generale contengono più geni. E’ possibile
dunque che vi sia un solo gene candidato, ad esempio un gene codificante un componente
della catena respiratoria, o una proteina necessaria al mantenimento del DNA mitocondriale,
ma è possibile che via siano più geni, di cui magari nessuno è noto codificare proteine
mitocondriali (Chinnery, 2003). Pertanto al clonaggio posizionale segue, in generale, il
51
1. Introduzione
sequenziamento di uno o più geni per identificare mutazioni potenzialmente patologiche.
L’identificazione di una mutazione patologia è complicato da due problemi. In primo luogo,
fra diversi individui sono presenti polimorfismi, che rendono difficoltosa l’identificazione di
una mutazione patologica. Anche qualora vi sia un solo polimorfismo, non è detto che questo
sia effettivamente la mutazione patologica. In secondo luogo, anche qualora vi fosse una
mutazione deleteria, quale la presenza di un codone di stop, non è detto che essa sia la vera
causa della patologia, e non piuttosto una mutazione non correlata. Da qui nasce la necessità
della validazione, definita come lo studio in un sistema modello degli effetti di una mutazione
il cui ruolo patologico è ignoto. Se si dimostra che la mutazione, introdotta nel sistema
modello, causa difetti del metabolismo mitocondriale, è possibile affermare che essa è una
mutazione patologica. La validazione è inoltre ancora più necessaria nei casi sporadici,
quando non è disponibile la storia familiare del paziente. Il lievito è un ottimo modello per
studiare gli effetti di mutazioni recessive e per determinare la dominanza/recessività di una
mutazione..
Un sistema modello è utile per la sola validazione ma può portare alla comprensione dei
meccanismi molecolari attraverso cui la mutazione agisce. Anche in questo caso S. cerevisiae
si dimostra un buon modello, grazie alla semplicità con cui possono essere effettuati
esperimenti di biochimica e di biologia molecolare.
Infine, l’utilizzo di un sistema modello permette anche la ricerca e lo studio degli effetti di
“molecole” in grado di riportare parzialmente il fenotipo patologico al fenotipo wt. In primo
luogo, è possibile testare l’effetto di sostanze. S. cerevisiae si dimostra un buon modello in
quanto la sostanza da testare può essere direttamente aggiunta al terreno di coltura e, se
possiede opportune proprietà, è in grado di entrare nella cellula per diffusione o trasporto
facilitato, e svolgere così la sua attività In secondo luogo, è possibile cercare e valutare
l’effetto di soppressori multicopia, mediante l’overespressione di un gene nel ceppo recante la
mutazione patologica. Soppressori possono essere cercati mediante la trasformazione del
ceppo con una banca multicopia, oppure mediante clonaggio in un plasmide multicopia di un
gene che si pensi possa sopprimere il fenotipo attraverso meccanismi più o meno noti.
In particolare però, il grande vantaggio di S. cerevisiae nello studio delle patologie
mitocondriali consiste nel fatto che fenotipi correlati alla disfunzione del metabolismo
mitocondriale possono essere facilmente osservabili. Infatti, mutazioni che inibiscono la
funzionalità mitocondriale possono determinare uno di questi semplici fenotipi:
- riduzione o inibizione della crescita su fonti ossidabili;
- alterazione dei degli spettri di assorbimento dei citocromi respiratori;
- alterazione dell’attività respiratoria.
In seconda istanza, indipendentemente dai fenotipi precedenti, è possibile determinare se ad
una mutazione patologica è associata instabilità dell’mtDNA o un incremento della mutabilità
puntiforme. Un eventuale incremento della mutabilità estesa dell’mtDNA, o mutabilità petite,
può essere facilmente valutata grazie alla petite positività di S. cerevisiae di cui detto prima.
Mediante crescita per un certo numero di generazioni su fonti fermentabili, è possibile
quantificare l’accumulo di mutanti petite. Inoltre, mediante incrocio, è possibile determinare
52
1. Introduzione
se le colonie petite sono rho- oppure rho0, dunque se alla mutazione patologica è associato un
incremento della frequenza di delezioni e/o un aumento della perdita dell’mtDNA. Per quanto
concerne la valutazione della mutabilità puntiforme dell’mtDNA, essa può essere determinata
facilmente mediante la valutazione della frequenza di mutanti resistenti a antibiotici quali
eritromicina.
Grazie all’utilizzo del lievito come sistema modello sono stati studiati gli effetti sul
metabolismo mitocondriale di mutazioni in numerosi geni, sia mitocondriali che, soprattutto,
nucleari. Un esempio, riportato in tabella 1.6, concerne lo studio di mutazioni in geni nucleari
che determinano instabilità del DNA nucleare.
Gene
umano
ANT1
Gene ortologo di
lievito
AAC2
Funzione del prodotto genico
Bibliografia
ADP/ATP carrier, trasporto di ATP e ADP
attraverso la membrana mitocondriale interna
POLG
MIP1
DNA polimerasi mitocondriale, replicazione
dell’mtDNA
MPV17
EFG1
SYM1
MEF1
Fontanesi et al., 2004
Palmieri et al., 2005
Lodi et al., 2006
Stuart et al., 2006
Baruffini et al., 2006
Baruffini et al., 2007
Spinazzola et al., 2006
Valente et al., 2007
Incognita
Fattore di elongazione mitocondriale G1,
traduzione degli mRNA mitocondriali
BCS1L
BCS1
Proteina coinvolta nell’assemblaggio del
Fernandez-Vizarra et al.,
complesso III
2007
Tabella 1. 6: Geni umani e ortologhi di lievito che determinano instabilità dell’mtDNA. Mutazioni nei geni
MEF1 e BCS1 causano una riduzione della stabilità dell’mtDNA solo in lievito.
1.6 Geni che influenzano l’accumulo di cloni petite
La frequenza dei cloni petite è influenzata da decine di geni, le cui mutazioni, delezione o
overespressione influenzano notevolmente l’accumulo di petite (reviewed in Contamine and
Picard, 2000). Fra i vari geni nucleari che influenzano l’accumulo di petite vale la pena di
ricordare i geni PET, così chiamati perché, se mutati, rendono i ceppi petite (reviewed in
Dujon, 1981). Fra i vari geni che influiscono sul mantenimento del DNA mitocondriale,
verranno di seguito indicate le caratteristiche dei geni testati in questo studio. Come riportato,
la maggior parte dei geni sono coinvolti nella ricombinazione e/o nella riparazione
dell’mtDNA, essendo replicazione, ricombinazione e riparazione profondamente legati nel
processo di trasmissione dell’mtDNA in S. cerevisiae.
1.6.1 Geni che influenzano la concentrazione dei deossinucleotiditrifosfato:
RNR1 e SML1
Il gene RNR1 codifica per la subunità maggiore della ribonucleotide reduttasi che catalizza lo
step limitante nella sintesi dei dNTP.
Le ribonucleotide reduttasi, presenti in tutti gli organismi, catalizzano, attraverso un processo
di tipo radicalico, la riduzione del gruppo 2’-OH in gruppo 2’-H nei ribonucleosididifosfato o
53
1. Introduzione
nei ribonuclelosiditrifosfato, che così vengono ridotti, rispettivamente, a dNDP o dNTP. La
reazione catalizzata dalla ribonucleotide reduttasi è pertanto fondamentale per la sintesi e la
replicazione del DNA (Nordlund and Reichard, 2006). Dal punto di vista strutturale le
ribonucleotide reduttasi sono eterotetrameri costituiti da due subunità maggiori R1 e due
subunità minori R2.
S. cerevisiae possiede una ribonucleotide reduttasi di classe Ia (Nordlund and Reichard,
2006). RNR1 e RNR3 codificano per due versioni distinte della subunità R1 (Elledge and
Davis, 1990). RNR2 e RNR4 codificano invece per due subunità minori R2 (Elledge and
Davis, 1987; Hurd et al., 1987; Huang and Elledge, 1997; Wang et al., 1997a). RNR3 è
espresso scarsamente e il mutante nullo non ha fenotipo, neanche in seguito ad induzione del
danno sul DNA quando RNR3 è fortemente espresso (Domkin et al., 2002). Al contrario, la
distruzione di RNR1 è letale, ma il fenotipo può essere salvato dall’overespressione di RNR3.
RNR2 e RNR4 sono fondamentali entrambi per l’attività ribonucleotide reduttasica, come
dimostrato dal fatto che la distruzione di un singolo gene è letale. In particolare Rnr4 e Rnr2
formano un eterodimero ββ’ che, associato con due subunità R1, forma il tetrametro α2ββ’
della ribonucleotide reduttasi di lievito.
La regolazione della concentrazione dei dNTP è fondamentale per il corretto progredire del
ciclo cellulare. Alte concentrazioni costitutive di dNTP durante tutto il ciclo cellulare
inibiscono il passaggio alla fase S, la sintesi del DNA e i checkpoint del danno al DNA
(Chabes and Stillman, 2007). Di conseguenza la sintesi dei dNTP deve essere finemente
regolata e poiché lo step limitante è la reazione reduttasica, la regolazione avviene a livello di
RNR1. In primo luogo, RNR1 è regolato durante il ciclo cellulare, in modo tale che l’attività
massima si raggiunga nel passaggio dalla fase G1 alla fase S e venga mantenuta nella fase S
(Elledge and Davis, 1990). In secondo luogo il gene RNR1 è indotto in seguito al trattamento
con agenti che danneggiano il DNA (Elledge et al., 1993). La regolazione di RNR1 avviene
attraverso tre meccanismi.
1) RNR1 è regolato a livello trascrizionale (Elledge and Davis, 1990; Huang et al., 1998),
attraverso il checkpoint Mec1/Rad53. In particolare, in condizioni di danno al DNA o
di passaggio dalla fase G1 alla fase S, il checkpoint Mec1/Rad53, attraverso la chinasi
Dun1, inattiva, mediante iperfosforilazione, la proteina Ctr1. Ctr1 è un fattore di
trascrizione che, normalmente, lega una regione a monte di RNR1, inibendone la
trascrizione attraverso il reclutamento del complesso inibitore Ssn6/Tup1. Durante il
passaggio dalla fase G1 alla fase S o in seguito a danno sul DNA, attraverso un
processo a cascata che coinvolge le chinasi Rad53 e Dun1, Ctr1 viene iperfosforilata e
diventa incapace di legare la regione a monte di RNR1, permettendone così la
trascrizione. In tal senso l’overespressione RNR1 è in grado di sopprimere la letalità di
un ceppo ∆mec1 ∆rad53 (Desany et al., 1998).
2) L’attività di Rnr1p è regolata attraverso il legame con l’inibitore Sml1. SML1 codifica
per una proteina che si lega Rnr1, inibendone l’attività (Zhao et al. 2000a; Chabes et
al., 1999; Chabes et al., 2003). SML1 è stata identificata per la capacità di sopprimere
la letalità in un ceppo ∆mec1 (Suppressor of Mec Lethality) (Zhao et al., 1998). In
54
1. Introduzione
particolare il deleto ∆sml1∆mec1 è vitale in quanto la proteina Rnr1, in assenza di
Sml1, svolge la sua attività anche in assenza della cascata attivata dal checkpoint
Mec1/Rad53. Come dimostrato da Chabes et al., 1999, la proteina Sml1 lega in vitro
la proteina Rnr1 in un rapporto molare 1:1, inibendone quasi completamente l’attività
catalitica. In condizioni normali, la proteina Sml1 lega Rnr1, impedendo alla
ribonucleotide reduttasi di catalizzare la sintesi di dNTP. Nel passaggio dalla fase G1
a S o in caso di danni al DNA, la proteina Sml1 viene fosforilata attraverso un
processo a cascata che coinvolge il checkpoint Mec1/Rad53 e le proteine Rad9,
Rad17, Rad54, Mec3 e Dun1 (Zhao et al., 2001; Zhao and Rothstein, 2002). La
fosforilazione inibisce il legame della proteina Sml1 a Rnr1 e ne induce la
degradazione, in modo tale che durante la fase S la quantità di proteina è sei volte
inferiore rispetto alla fase G1 e più di 10 volte inferiore in presenza di sostanze che
danneggiano il DNA. Recentemente è anche stato dimostrato che la quantità di Sml1 è
influenzato da una via Mec1-indipendente, che coinvolge il complesso
Mre11/Rad50/Xrs2 e la proteina Rad9. In seguito a danni sul DNA, questo pathway
converge col pathway Mec1/Rad53/Dun1 e porta alla degradazione di Sml1 (Corda et
al., 2005).
3) L’attività ribonucleotide reduttasica è regolata dalla localizzazione delle subunità Rnr2
e Rnr4 (Yao et al., 2003). Infatti durante il ciclo cellulare Rnr1 e Rnr3 sono localizzati
prevalentemente nel citoplasma, mentre Rnr2 e Rnr4 sono localizzati nel nucleo. In
seguito a danno al DNA, Rnr2 e Rnr4 migrano nel citoplasma, dove possono legare le
subunità Rnr1 e Rnr3 per formare il tetrametro della ribonucleotide reduttasi. Così
come gli altri meccanismi di regolazione, la ridistribuzione di Rnr2 e Rnr4 passa
attraverso il checkpoint Mec1/Rad53/Dun1.
L’attività ribonucleotide reduttasi influenza profondamente la stabilità dell’mtDNA,
essenzialmente incrementando la concentrazione dei dNTP, che, a seconda delle condizioni,
aumenta di 2,5-8 volte overesprimendo RNR1 o distruggendo SML1 (reviewed in Nordlund
and Reichard, 2006). La prima osservazione che RNR1 influenza la stabilità dell’mtDNA è
stata fatta da Lecrenier e Foury, che hanno identificato RNR1 come soppressore multicopia di
una mutazione termosensibile in MIP1 (mip1-1) e di altri alleli mutanti mip1. Non solo RNR1
in multicopia ripristinava la crescita a 37°C dei ceppi mip1 termosensibili, ma riduceva del
50% la frequenza dei petite a 37°C di un ceppo diploide MIP1/∆mip1 (Lecrenier and Foury,
1995). Studi successivi hanno dimostrato che l’overespressione di RNR1 riduce la frequenza
di mutanti petite in un ceppo selvatico, nonché in un ceppo ∆pif (O’Rourke et al., 2005). PIF1
codifica per una elicasi mitocondriale coinvolta nella riparazione e nella ricombinazione
dell’mtDNA e la sua delezione, come noto, porta ad un accumulo del 60-70% di petite (Foury
and Lahaye, 1987; Lahaye et al., 1991). Inoltre è stato dimostrato che l’overespressione di
RNR1 in un contesto wt porta ad un incremento del numero di copie di mtDNA pari a circa
2,5 volte (Taylor et al., 2005).
Effetti simili sono stati osservati mediante la distruzione di SML1. In particolare la distruzione
di SML1 sopprime il fenotipo termosensibile del mutante mip1-1 e riduce di circa due volte la
55
1. Introduzione
frequenza dei petite (Zhao et al., 1998). Inoltre la delezione di SML1 riduce la frequenza dei
petite e incrementa di circa 2 volte il numero di copie di mtDNA in un contesto wt o ∆pif1, in
modo del tutto analogo all’overespressione di RNR1 (Taylor et al., 2005).
Da questi risultati emerge chiaramente come l’attività ribonucleotide reduttasica influisca
profondamente, in lievito, sulla stabilità dell’mtDNA. Sulla base dei meccanismi di
regolazione sopra riportati, la stabilità dell’mtDNA è dunque profondamente influenzata dal
checkpoint Mec1/Rad53.
La ribonucleotide reduttasi è presente ovviamente anche nei mammiferi e dunque nell’uomo.
Nei mammiferi è presente un gene codificante la subunità maggiore R1 e un gene codificante
la subunità minore R2. Le due subunità interagiscono due subunità formando l’eterotetramero
α2β2. Il grado di conservazione delle subunità minori e maggiori è molto elevata: ad esempio
l’identità di sequenza fra lievito e mammiferi è del 60-70%.
Per quanto concerne la regolazione, nei mammiferi così come nel lievito l’espressione della
ribonucleotide reduttasi è indotta nel passaggio dalla fase G1 a S e in seguito a danni sul DNA
(reviewed in Nordlund and Reichard, 2006). Mentre nel lievito è regolata essenzialmente la
sintesi e l’attività di Rnr1, nei mammiferi è la subunità R2 ad essere regolata, essendo questa
la subunità limitante per l’attività enzimatica. In primo luogo il gene R2 è regolato a livello
trascrizionale, attraverso varie sequenze situate a monte del gene R2 (Chabes et al., 2004).
Una delle sequenze è legato dal repressore E2F4, che reprime la sintesi della subunità R2
durante la fase G1 (DeGregori et al., 1995). In secondo luogo la subunità R2 è degradata
durante la mitosi, attraverso un processo di ubiquitinazione seguito dalla proteolisi (Chabes
and Thelander, 2000). In terzo luogo, in seguito a danni sul DNA, viene indotta la sintesi di
una subunità R2 alternativa, la subunità p53R2, la cui sintesi è indotta dalla proteina p53, che
induce anche l’overespressione della subunità R1, in seguito a danni sul DNA (Lin et al.,
2004). E’ da notare che sebbene i meccanismi di regolazione mostrino alcune differenze,
entrambi dipendono dal checkpoint Mec1/Rad53. Nei mammiferi infatti esistono le due
proteine omologhe, ATM/ATR e CHK2, che agiscono come trasduttori del segnale e, come
effetto finale, regolano la sintesi di numerosi geni coinvolti nella sintesi e nella riparazione del
danno sul DNA (reviewed in Rotman and Shiloh, 1999). Ad esempio ATM/ATR e CHK2
stabilizzano p53, inducendo di conseguenza la sintesi di p53R2 e di R1 (Tanaka et al., 2000;
Zhao et al., 2000b; reviewed in Caspari, 2000).
I mammiferi mancano invece di un omologo della proteina SML1. E’ interessante notare che
la proteina Sml1 di lievito è però in grado di inibire, legandosi ad essa, anche la subunità R1
di topo e uomo (Zhao et al., 2000a), suggerendo come anche la struttura della subunità Rnr1
sia altamente conservata fra lievito e mammiferi.
1.6.2 Geni che influenzano la trasmissione dell’mtDNA: CCE1
Il gene CCE1 codifica per la Cutting Cruciform Endonuclease, un enzima a localizzazione
mitocondriale che catalizza la risoluzione delle giunzioni di Holliday durante i processi di
ricombinazione.
56
1. Introduzione
Il gene CCE1 è allelico a MGT1 (da Mitochondrial Genome Transmission), identificato nel
1991 (Zweifel and Fangman, 1991). In questo studio venne dimostrato come mutazioni in
MGT1 influenzino la trasmissione dell’mtDNA, favorendo la trasmissione delle molecole rho+
in un diploide derivato dall’incrocio di un ceppo aploide rho+ e di un ceppo aploide rhoipersoppressivo. Come detto precedentemente, un ceppo rho- ipersoppressivo è definito tale
se, incrociato con un aploide rho+, produce una progenie diploide al 95% rho-. In mutanti
mgt1 la percentuale scende sotto l’1%, dimostrando come la trasmissione di diverse specie di
mtDNA sia influenzata da geni nucleari. Successivamente, il gene CCE1/MGT1 è stato
identificato con un approccio completamente differente come gene codificante una
endonucleasi cruciforme (Kleff et al., 1992). In questo studio è stato dimostrato come
mutazioni nel gene CCE1 rendano il ceppo resistente a ceppi rho- ipersoppressivi, e,
parallelamente, come mutazioni nel gene MGT1 riducano l’attività endonucleasica
cruciforme, dimostrando che i due geni sono allelici. Successivamente è stato dimostrato che:
- la proteina Cce1 è situata nel mitocondrio ed è associata alla membrana mitocondriale
interna (Ezekiel and Zaussenhaus, 1993);
- la mancanza di Cce1 porta ad un incremento delle molecole associate tramite
giunzioni di Holliday in modo tale da formare un numero minore di nucleoidi
all’interno del mitocondrio rispetto ad ceppo wt (Lockshon et al., 1995);
- l’overespressione di Cce1 riduce la frequenza di strutture ramificate fra diverse
molecole di DNA e favorisce la trasmissione di genomi rho- non soppressivi rispetto a
genomi rho+ (Lockshon et al., 1995);
- la delezione di CCE1 favorisce il trasferimento alla progenie di molecole di DNA rho+
che presentano delezioni nelle regioni intergeniche rispetto a molecole wt. Tuttavia, le
due specie di molecole vanno ancora incontro a ricombinazione. (Piskur, 1997)
- la delezione del gene CCE1 causa un incremento, seppure moderato, nell’accumulo di
mutanti rho- (Kleff et al., 1992)
- l’incremento di rho- in un mutante cce1 è ulteriormente incrementato dalla delezione
del gene NUC1, codificante la maggiore endonucleasi mitocondriale. La sola
delezione di NUC1 non ha effetto sulla produzione di petite (Zassenhaus et al., 1988).
Studi circa la funzionalità di Cce1p hanno dimostrato che essa si trova sottoforma di dimero.
Il dimero Cce1p è in grado di riconoscere diverse sequenze, probabilmente interagendo con
strutture del backbone di DNA. Le sequenze devono però necessariamente essere organizzate
come strutture a quattro-braccia, così come nelle giunzioni di Holliday. Strutture lineari o
loop non vengono riconosciuti e tagliati da Cce1p, mostrando il suo coinvolgimento soltanto
nei processi di ricombinazione. Da questi studi è emerso come Cce1p, legandosi al substrato,
ne modifichi la struttura, che deve essere in una forma rilassata per poter essere tagliata dalla
proteina. Infine, è emerso che Cce1p è in grado solo di tagliare strutture cruciformi che stanno
andando incontro a branch migration (White and Lilley, 1996; White and Lilley, 1997;
Schofield et al., 1997; Schofield et al., 1998).
Il gene CCE1 non ha omologhi umani. In uno studio recente però è stato espresso il gene
CCE1 in colture di cellule umane contenente duplicazioni dell’mtDNA (Sembongi et al.,
57
1. Introduzione
2007). Lo scopo era di incrementare l’attività della ricombinazione omologa intramolecolare
già presente a livello di cellule di mammifero, come descritto di seguito. In particolare la
finalità era valutare se Cce1p promuovesse la ricombinazione intramolecolare della molecola
parzialmente duplicata così da dare origine a molecole wt. Sembongi et al. hanno osservato
che, in presenza di una bassa espressione di CCE1, tendono a formarsi molecole wt, che
possono essere anche la popolazione prevalente. Un’elevata espressione di CCE1 porta invece
alla perdita irreversibile dell’mtDNA. Quest’ultimo fenomeno viene interpretato col fatto che
un eccesso di mtDNA può distorcere l’mtDNA così da bloccare vari processi, fra cui la
replicazione dell’mtDNA.
1.6.3 Gene MHR1, coinvolto nella ricombinazione e nella riparazione del
DNA
Nel 1996 Ling et al. hanno identificato un mutante, chiamato mhr1-1, incapace di portare
avanti il processo di ricombinazione fra due molecole rho+ a 30°C (Ling et al., 1995). Nello
studio veniva dimostrato anche come la mutazione incrementasse la frequenza di petite in
seguito a trattamento con raggi UV a 30°C, e spontaneamente a 37°C. In particolare, la
frequenza di petite raggiungeva valori elevati, pari all’80% a 37°C. Fra questi petite vi erano
sia cloni rho- che cloni rho0. Studi successivi hanno dimostrato come l’accumulo di specie
rho- oppure rho0 sia dovuto a meccanismi diversi in cui è coinvolta la proteina Mhr1.
In particolare è stato dimostrato come l’accumulo di danni ossidativi sul DNA dovuti a ROS
siano uguali a 30°C in un ceppo MHR1 e in un ceppo mhr1-1, ma a 37°C il danno ossidativo è
molto più esteso nel ceppo mhr1-1 (Ling et al., 2000). Inoltre il trattamento con acido
malonico, un inibitore del ciclo di Krebs che ha come effetto finale la riduzione dello stress
ossidativo spontaneo, a 37°C riduce di circa 2 volte la frequenza di petite nel ceppo mhr1-1.
In secondo luogo è stato dimostrato che l’attività di Mhr1 nel processo di ricombinazione è
fondamentale per il trasferimento alla progenie di molecole di DNA intatte, spiegando così
l’accumulo di rho0 a 37°C nei mutanti mhr1 (Ling and Shibata, 2002). In particolare mutanti
mhr1, a 37°C, non mostrano alcuna molecola di mtDNA nella gemma nascente.
In terzo luogo, mutanti mhr1-1 mostrano a 30°C un ritardo della segregazione vegetativa che
ha, come conseguenza, un ritardo nella comparsa di cellule omoplasmiche (Ling and Shibata,
2004). Al contrario l’overespressione aumenta di circa 2,5 volte la velocità di comparsa di
cellule omoplasmiche. Questa osservazione dimostra come Mhr1 svolga un ruolo importante
nella segregazione vegetativa delle varie forme di DNA mitocondriale in cellule
eteroplasmiche così da formare cellule omoplasmiche. Questo fenomeno è legato alla
formazione di concatenameri, cioè di molecole lineari di mtDNA legate l’una all’altra che, nel
mutante mhr1-1, sono ridotti, mentre nel ceppo overesprimente MHR1 sono prodotti in
quantità maggiori, suggerendo che Mhr1 svolga anche un ruolo nella formazione di
concantameri, probabilmente promovendo un meccanismo di replicazione rolling circe. (Ling
and Shibata, 2004)
Dal punto di vista funzionale, è stato osservato come la proteina Mhr1 favorisca
l’appaiamento heteroduplex, almeno in vitro. In presenza di un DNA a singolo filamento e di
58
1. Introduzione
un DNA circolare a doppio filamento omologo, la proteina Mhr1 promuove l’appaiamento del
DNA singolo filamento sul DNA a doppio filamento, così da formare un heteroduplex a
doppia elica più una parziale regione a singolo filamento (Ling and Shibata., 2002).
L’appaiamento heteroduplex è noto per essere un intermedio nei processi di ricombinazione.
L’appaiamento heteroduplex è indipendente dalla sequenza, sebbene ovviamente le due
sequenze debbano essere omologhe. La proteina mutata Mhr1-1 non presenta invece alcun
appaiamento heteroduplex, e la mancanza è dovuta all’incapacità della proteina mutata di
legare il DNA substrato.
Visto il ruolo di Mhr1 nel processo di ricombinazione, è stato creato un doppio mutante mhr1
∆cce1 per valutare l’effetto sull’accumulo di petite (Ling and Shibata, 2002). Il doppio
mutante è respiratorio deficiente e inoltre non mostra la presenza di mtDNA, risultando
pertanto rho0. Questo risultato dimostra come i processi di ricombinazione dell’mtDNA di S.
cerevisiae siano fondamentali per il mantenimento dell’mtDNA. Questo dato è supportato
anche dall’osservazione che i ceppi distrutti in PIF1, come precedentemente detto, mostrano
un forte accumulo di mutanti petite (Foury and Lahaye, 1987; Lahaye et al., 1991).
Per quanto concerne l’uomo non è stato trovato alcun omologo alla proteina Mhr1, così come
a Cce1. Questa osservazione non sorprende, visto che nei mitocondri un’attività di
ricombinazione, sebbene presente, è comunque bassa rispetto all’attività di ricombinazione
omologa presente in S. cerevisiae.
1.6.4 Gene MSH1, coinvolto nel mismatch repair e nella ricombinazione
Il gene MSH1 codifica per l’unica proteina omologa a MutS presente nel mitocondrio (MutS
Homologue). Come sottolineato in precedenza, la proteina MutS di E.coli, insieme alle
proteine MutL e MutH, è coinvolta nella riparazione dei mismatch che si generano in seguito
a errori di replicazione oppure durante ricombinazione. Nel lievito sono presenti sei geni
omologhi a MutS coinvolti nella riparazione dei mismatch e di piccoli loop a singolo
filamento (MSH1-2-3-6) e nel crossino over meiotico (MSH4-5) (Hollingsworth et al., 1995).
MSH1 codifica per una proteina che presenta una similarità del 29% con E. coli MutS (Chi
and Kolodner, 1994a). Strutturalmente, essa possiede due domini: un dominio di legame al
DNA e un dominio ATPasico. Il dominio di legame al DNA si lega specificatamente a
strutture che presentano uno o più mismatch e a strutture che presentano un loop a singolo
filamento di 2-3 nucleotidi (Chi and Kolodner, 1994b). Msh1 lega qualsiasi tipo di mismatch,
ma il legame è più forte per coppie pirimidina-purina, e più debole per coppie purina-purina e
pirimidina-pirimidina. Per quanto concerne il dominio ATPasico, Msh1 è in grado di
idrolizzare ATP e dATP (Chi and Koldner, 1994b). L’attività ATPasica è inoltre stimolata dal
legame al DNA heteroduplex. Inoltre Msh1, come MutS, agisce come dimero (Mookerjee and
Sia, 2006).
Mutazioni nel gene MSH1 hanno effetti sulla mutabilità sia estesa che puntiforme del DNA
mitocondriale. Per quanto concerne la mutabilità estesa, la delezione di MSH1 induce in breve
tempo la formazione di petite (Reenan and Kolodner, 1992). In particolare dopo
sporificazione di un ceppo MSH1/∆msh1, le due spore ∆msh1 mostrano un fenotipo petite se
59
1. Introduzione
fatte crescere in terreno addizionato di glucosio, suggerendo che il fenotipo respiratorio
deficiente subentri nel giro di poche generazioni. Su terreno massimo addizionato di glicerolo,
alcune spore invece mantengono la capacità di crescere, sebbene molto lentamente, indicando
che la delezione in MSH1 non è incompatibile col mantenimento dell’mtDNA (Reenan and
Kolodner, 1992). Inoltre, mentre la maggior parte dei petite spontanei che si formano in un
contesto wt presentano soppressività intermedia, il 60-70% dei petite che si formano in un
contesto ∆msh1 sono ipersoppressivi. La delezione in MSH1 altera anche la morfologia e/o la
distribuzione mitocondriale. Infatti ceppi ∆msh1 incubati in presenza di DAPI, anziché
mostrare il caratteristico pattern costituito da strutture puntiformi nella periferia del
citoplasma, presentano solo due-tre agglomerati che raggiungono una grandezza pari a circa il
20% del nucleo (Reenan and Kolodner, 1992). Anche l’overespressione di MSH1 aumenta
l’accumulo di petite (Koprowski et al., 2002; Dzierzbicki et al., 2004). L’aumento di petite
sembra non essere però correlato all’attività di riparazione di mismatch, ma piuttosto alla
capacità di Msh1 di influire sulla ricombinazione omologa (Dzierzbicki et al., 2004).
Per quanto concerne la mutabilità puntiforme, essa è stata dapprima misurata in un contesto
diploide MSH1/∆msh1. Questi diploidi producono mutanti EryR con una frequenza sette volte
maggiore rispetto a ceppi wt, suggerendo non solo che Msh1 è coinvolto in processi di
riparazione, ma che la proteina è presente in quantità limitanti (Chi and Kolodner, 1994b).
Successivamente è stato dimostrato che ceppi che presentano mutazioni puntiformi in MSH1 e
mantengono il DNA mitocondriale presentano una frequenza di mutanti EryR dovuti a
transizioni nel gene per il 21S rRNA e una frequenza di mutanti OlyR dovuta a transizioni nel
gene OLI1 maggiore (Vanderstraeten et al., 1998). Al contrario, mutazioni nel dominio
esonucleasico di Mip1 incrementano la frequenza di mutazioni EryR e OliR per trasversione,
suggerendo che l’attività di proofreading di Mip1 sia coinvolta nella riparazione soprattutto di
trasversioni, mentre l’attività di riparazione di mismatch di Msh1 sia coinvolta soprattutto
nella riparazione di transizioni. Questa osservazione è in accordo con l’osservazione che
Msh1 lega preferenzialmente mismatch costituiti da un errato appaiamento pirimidina-purina.
A conferma del fatto che la proteina Msh1 è presente in quantità limitanti, è stato dimostrato
che una blanda overespressione di Msh1 in un contesto aploide riduce la frequenza di mutanti
EryR (Koprowski et al., 2002). La riduzione di mutanti EryR è dipendente dall’attività
ATPasica, in quanto mutazioni nel dominio ATPasico che inibiscono l’idrolisi di ATP
inibiscono la riduzione di mutanti EryR (Koprowski et al., 2002; Mookerjee et al., 2005).
Inoltre, alcune mutazioni nel dominio ATPasico e altre nel dominio di legame di mismatch
sono dominanti e incrementano in seguito a overespressione la frequenza di mutanti EryR
(Koprowski et al., 2002; Mookerjee et al., 2005).
E’ stato inoltre dimostrato che MSH1 è coinvolto nella riparazione di danni ossidativi
(Dzierzbicki et al., 2004). Infatti mutazioni in OGG1, codificante la 8-oxo-dG DNA
glicosilasi coinvolta nella riparazione mediante BER di 8-oxoG, induce un aumento della
frequenza di mutanti OliR. L’overespressione di MSH1, anche in singola copia, riduce la
frequenza di mutanti OliR in un contesto ogg1. Come la riparazione dei mismatch, l’attività di
60
1. Introduzione
riparazione di danni ossidativi ad opera di Msh1 dipende dall’attività ATPasica, in quanto
mutazioni nel dominio ATPasico inibiscono il rescue da parte della proteina Msh1.
Recentemente è stato anche chiarito il ruolo di Msh1 nella ricombinazione (Moockerjee and
Sia, 2006). In questo studio sono stati analizzati gli effetti di tre mutazioni differenti: la
mutazione F105A, situata nel dominio di legame al DNA, inibisce l’interazione col DNA
heteroduplex e ha come effetto la riduzione dell’affinità di legame col DNA e l’inibizione
della riparazione di mismatch; la mutazione G776D, situata nel dominio ATPasico, inibisce il
legame di ATP, l’idrolisi di ATP e la riparazione; la mutazione R813W, situata nel dominio
ATPasico, inibisce l’idrolisi di ATP, ma non il legame al DNA. Mutazioni omologhe in
MSH2 e MSH6 alterano il ruolo delle proteine nel processo di inibizione di ricombinazione fra
heteroduplex. Le proteine mutate mostrano un aumento della frequenza di mutazioni
puntiformi, ma allo stesso tempo un notevole aumento di delezioni mediate da ripetizioni
mediante ricombinazione. Questa osservazione dimostra che Msh1 è coinvolta, in maniera
mismatch indipendente, nell’inibizione della ricombinazione. E’ stato dimostrato inoltre che
Msh1 è coinvolto in un pathway diverso da quello in cui sono coinvolte le proteine Mhr1 e
Cce1. La delezione di questi due geni non altera la frequenza di delezioni mediate da
ripetizioni nell’mtDNA, suggerendo che ci sia un altro pathway coinvolto nella
ricombinazione (Phadnis et al., 2005). La delezione di MHR1 o CCE1, in associazione con
l’allele msh1-G776D, aumenta invece la frequenza di delezioni, indicando che i geni sono
coinvolti in pathway diversi. Infine è stato dimostrato che Msh1, come Mhr1, svolge un ruolo
importante nella segregazione vegetativa che porta all’omoplasmia. Infatti i ceppi recanti gli
alleli msh1 mutati presentano un forte ritardo nella segregazione vegetativa dell’mtDNA
(Phadnis et al., 2005).
Dai risultati sopra esposti emerge chiaramente come Msh1 svolga diversi ruoli nel processo di
mantenimento dell’mtDNA, e questo spiega perché singole mutazioni in MSH1 presentano
effetti pleiotropici.
Così come CCE1 e MHR1, MSH1 non ha omologhi che funzionano nei mitocondri di
mammiferi.
1.6.5 Gene CDC9
Il gene CDC9 codifica per una DNA ligasi I presente nel nucleo e nel mitocondrio. Le DNA
ligasi I sono enzimi coinvolti nel processo di replicazione, nel quale hanno il ruolo di ligare i
frammenti di Okazaki sul filamento ritardato, e in vari processi di riparazione (Petrini et al.,
1995; Prigent et al., 1994, reviewed in Tomkinson et al., 2006). Cdc9 è un gene fondamentale
per la sintesi di DNA, per cui la delezione è letale (Barker et al., 1985). Mutanti condizionali
cdc9 sono deficienti nella ligazione dei frammenti di Okazaki, sono ipersensibili a sostanze
che danneggiano il DNA e mostrano un elevata frequenza di ricombinazione mitotica. Per
quanto concerne la regolazione, CDC9 è espresso in maniera ciclo dipendente e raggiunge la
sua massima espressione durante il passaggio dalla fase G1 alla fase S (Peterson et al., 1985).
Inoltre l’espressione di CDC9 è indotta da agenti che danneggiano il DNA (Johnson et al.,
1986).
61
1. Introduzione
Willer et al., 1999 hanno dimostrato che CDC9 codifica, a partire da due codoni di inizio
diversi, due isoforme di DNA ligasi I. La forma più corta è presente nel nucleo, dove è anche
presente l’altra DNA ligasi di S. cerevisiae, Dnl4, coinvolta nel processo di non-homologous
end joining. La forma più lunga, recante anche una sequenza target mitocondriale, è presente
nel mitocondrio, dove costituisce l’unica attività DNA ligasica. In particolare, la sostituzione
del primo codone d’inizio inibisce la sintesi della forma mitocondriale e porta la cellula ad un
fenotipo petite. La ligasi I mitocondriale è inoltre associata alla membrana, mentre la forma
nucleare si trova in soluzione (Willer et al., 1999).
Studi successivi hanno dimostrato come una forma termosensibile di Cdc9 mitocondriale
determini una riduzione del numero di copie di mtDNA di circa il 50% (Donahue et al.,
2001), dimostrando come Cdc9 sia fondamentale per il mantenimento dell’mtDNA. Cdc9 è
fondamentale per il mantenimento dell’mtDNA anche durante la fase stazionaria e pertanto
sembra essere richiesta anche per stabilizzare mtDNA che non si sta replicando. Un’ipotesi è
che Cdc9 sia coinvolta, come nel nucleo, nel BER, ad esempio legandosi ad estremità di DNA
formate durante il BER al fine di proteggerle dall’immediata degradazione ad opera di
endonucleasi mitocondriali. Inoltre è stato dimostrato come Cdc9 sia fondamentale per la
riparazione di tagli a doppio filamento. In seguito infatti ad espressione transiente nel
mitocondrio dell’endonucleasi EcoRI, la forma Cdc9 wt ripara i danni a doppio filamento
indotti da EcoRI, mentre la forma termosensibile mitocondriale determina la comparsa di un
fenotipo respiratorio deficiente (Donahue et al., 2001).
Nell’uomo la DNA ligasi I omologa a Cdc9 è presente solo nel nucleo. Nel mitocondrio è
però presente la ligasi III, l’unica DNA ligasi mitocondriale umana. La ligasi III umana e
Cdc9, nonostante presentino differenze nella struttura, hanno molte caratteristiche in comune,
in modo tale da poter considerare le due ligasi ortologhi funzionali. In primo luogo il gene
LIG3 codifica, come CDC9, per due isoforme di DNA ligasi III. L’isoforma più breve,
tradotta dal secondo codone di inizio, localizza nel nucleo. La forma più lunga, tradotta dal
primo codone di inizio, localizza nel mitocondrio (Lakshmipathy and Campbell, 1999). Per la
funzionalità della ligasi nucleare è necessaria l’interazione con la proteina XRCC1,
fondamentale per la stabilità e l’attività della ligasi III (Caldecott et al., 1995). D’altra parte la
proteina XCRR1 è assente nel mitocondrio, suggerendo che la ligasi III possa funzionare
senza di essa (Lakshmipathy and Campbell, 2000). In secondo luogo, la ligasi III, come Cdc9,
è fondamentale per il mantenimento dell’mtDNA (Lakshmipathy and Campbell, 2000;
Lakshmipathy and Campbell, 2001). In particolare cellule con un ridotto contenuto di ligasi
III mitocondriale hanno un ridotto numero di copie di mtDNA e presentano vari tagli a
singolo filamento sull’mtDNA (Lakshmipathy and Campbell, 2001). In terzo luogo la ligasi
III svolge un ruolo fondamentale nella riparazione dei tagli a singolo filamento e, come Cdc9,
nel BER (Caldecott et al., 1996).
Uno studio recente ha dimostrato come nel mitocondrio vi sia un’interazione fra DNA ligasi
III e polimerasi γ fondamentale per la stabilità dell’mtDNA (De and Campbell, 2007). In
questo studio è stato dimostrato che le due proteine interagiscono sia in vitro che in vivo.
L’interazione coinvolge il dominio centrale della ligasi, in cui è situato il sito attivo, e il
62
1. Introduzione
dominio C-terminale della polimerasi contenente il sito catalitico. Inoltre forme mutate della
ligasi III, non in grado di catalizzare la ligazione ma in grado di interagire con pol γ,
diminuiscono di circa il 20% il numero di copie di mtDNA in cellule esprimenti solo la forma
mutata o anche la forma selvatica di ligasi III. Questo risultato viene interpretato in termini di
sequestro di pol γ: le DNA ligasi mutate legano pol γ e impediscono che questa possa
replicare correttamente l’mtDNA. Inoltre l’interazione di ligasi III e pol γ è fondamentale
affinché quest’ultima possa partecipare al BER. Infatti, mentre in presenza di ligasi III
selvatica la polimerasi può legare DNA con tagli a singolo filamento, in presenza di DNA
ligasi III priva del dominio di legame al DNA, il legame di pol γ al DNA viene meno.
Pertanto il riconoscimento e il legame di pol γ al DNA a singolo filamento non sembra essere
diretto, ma mediato dalla DNA ligasi III. Come conseguenza, in presenza della DNA ligasi
mutata, l’attività BER è ridotta di circa il 50%.
1.6.6 Geni REV3 e REV7
I geni REV3 e REV7 codificano rispettivamente per la subunità catalitica e la subunità
accessoria della polimerasi zeta, una polimerasi ripartiva coinvolta nella sintesi translesione
del DNA.
Come detto in precedenza, la sintesi translesione è fondamentale per la replicazione del DNA
in presenza di una base danneggiata sul templato. Normalmente danni sul templato vengono
riparati da opportuni meccanismi di replicazione quali la BER e la nucleotide excision repair.
Qualora il danno non venga riparato, è necessaria una sintesi translesione in corrispondenza
del danno, per impedire che la polimerasi vanga rilasciata dalla forca replicativa e che la
replicazione si arresti, cosa che porterebbe alla morte della cellula (Lawrence, 2004). In tal
senso la sintesi translesione fa parte dei cosiddetti sistemi di tolleranza dell’errore, che si
distinguono dai sistemi di riparazione in quanto non riparano il danno, ma permettono
comunque che la replicazione possa procedere. In generale, alcuni danni sul templato, quali
basi ossidate, basi alchilate, dimeri di timina e siti apurinici, bloccano la replicazione, in
quanto le polimerasi replicative non sono in grado di incorporare un nucleotide opposto alla
lesione e soprattutto di estendere il DNA a partire da un mismatch costituito da una lesione
opposta ad un nucleotide (reviewed in Murakumo, 2002). La sintesi translesione è invece
affidata ad opportune polimerasi riparative, che sono in grado di portare a termine la sintesi di
DNA in presenza di un danno sul templato. Nel nucleo sono coinvolte diverse polimerasi
nella sintesi translesione, fra cui Pol zeta, che è coinvolta nella sintesi translesione erroreprone, che è responsabile dell’incremento della mutabilità puntiforme spontanea e indotta.
Rev3 costituisce la subunità catalitica della polimerasi zeta, mentre Rev7 codifica per una
subunità accessoria fondamentale per il mantenimento del complesso e che aumenta l’attività
polimerasica di Rev3 di circa 200 volte (Morrison et al., 1989; Nelson et al., 1996a; Torpey et
al., 1994; Nelson et al., 1996b). REV3 codifica per una DNA polimerasi che appartiene alla
famiglia B delle polimerasi, a cui appartengono anche le polimerasi replicative eucariotiche.
Rispetto a queste ultime Rev3, come altre polimerasi riparative, manca di un dominio 3’-5’
esonucleasico. Inoltre essa è scarsamente processiva, in quanto il 50% della polimerasi zeta
63
1. Introduzione
(compresa Rev7) si stacca dal templato dopo l’incorporazione di 3 nucleotidi (Nelson et al.,
1996a).
Nella sintesi translesione Pol zeta ha due ruoli. Un ruolo minore, l’attività di bypass, consiste
nell’incorporazione di un nucleotide opposto ad una lesione, ruolo che è svolto principalmente
da altre polimerasi riparative. In particolare Pol zeta può incorporare nucleotidi, sebbene a
bassa efficienza, opposti ad un dimero TT cis-syn ciclobutano e ad un dimero di timina (6-4)
derivante dal trattamento con UV (reviewed in Prakash et al., 2005; Johnson et al.,2000b;
Guo et al., 2001). Essa non è in grado invece di inserire nucleotidi in opposizione ad un sito
apurinico e a 8-oxo-dG (Haracska et al., 2001). Come detto, la polimerasi zeta svolge soltanto
un ruolo minore nell’attività di bypass, in cui giocano un ruolo più importanti altre polimerasi
replicative, quali la DNA polimerasi eta e Rev1p (reviewed in Prakash et al., 2005; Gibbs et
al., 2005). Ad esempio, la polimerasi eta gioca un ruolo fondamentale nel bypass del dimero
TT cis-syn ciclobutano, Pol32, una subunità della polimerasi delta, nel bypass del fotoaddotto
(6-4), e Pol32, o Rev1, sono coinvolti nel bypass di un sito apurinico (Gibbs et al., 2005).
Il maggior ruolo di Pol zeta consiste invece nell’estensione di mispair. Dopo l’incorporazione
opposta ad una base danneggiata di un nucleotide ad opera delle polimerasi sopra riportate, è
necessario che una polimerasi replicativa estenda il mispair costituito da un nucleotide
opposto alla lesione. Le polimerasi replicative non sono grado di svolgere questo compito, a
causa della struttura distorta del templato. Fra le polimerasi riparative, soltanto Pol zeta è in
grado di catalizzare questa reazione. Grazie a Pol zeta, ciascuna copia nucleotide-lesione di
cui detto prima, viene estesa efficacemente da Pol zeta (Nelson et al., 1996a; Johnson et al.,
2000b; Haracska et al., 2001; Guo et al., 2001). Da questo emerge che la translesione,
necessita, in generale, di due polimerasi riparative, uno per il bypass della lesione e una per
l’estensione del mispair. In secondo luogo, la replicazione di Pol zeta è error prone. Essa
infatti, qualora incorpori un nucleotide opposto alla lesione, incorpora spesso un nucleotide
sbagliato. Allo stesso modo, a causa della distorsione del templato, spesso inserisce basi non
corrette a partire da un’estremità mispair. L’effetto determina un aumento della frequenza di
sostituzioni puntiformi o di frameshift (reviewed in Lawrence and Maher, 2001). A questo va
aggiunta l’osservazione che la polimerasi zeta è in grado di estendere anche mispair costituiti
da due nucleotidi non complementari, con una frequenza da 2 alle 1000 volte superiore, a
seconda del tipo di mismatch, rispetto all’estensione portata avanti dalla polimerasi alfa
(Lawrence et al., 2000). La capacità di estendere mismatch, dovuta anche al fatto Pol zeta non
possiede un dominio esonucleasico, incrementa ulteriormente la frequenza di errori associati
all’attività di Pol zeta stessa.
L’attività di Pol zeta necessita dell’attività di Rev1, identificata inizialmente come un
deossicitidil trasferasi. La proteina è in grado di incorporare sul DNA in crescita uno o pochi
residui di citidina. Esso tende ad incorporare preferenzialmente in vitro un residuo dC opposto
ad un sito apurinico (circa 60%) rispetto ad un dG (20%), a un dA o un dU (10%) e a un dT o
un dC (1%) (Nelson et al., 1996b). In tal senso Rev1 gioca direttamente un ruolo
fondamentale nella sintesi translesione di un sito apurinico, ovviamente in maniera error
prone, in quanto incorpora sempre in opposizione al sito apurinico un residuo dC. Studi più
64
1. Introduzione
recenti hanno dimostrato che Rev1 svolge una seconda funzione, indipendente dalla prima, e
che consiste nell’interazione con la subunità Rev7 di Pol zeta responsabile del mantenimento
del complesso Rev3-Rev7 (Nelson et al., 2000; Acharya et al., 2005; D’Souza and Walker,
2006; Acharya et al., 2006). Questa seconda funzione è indipendente dalla prima, in quanto
mutazioni che inibiscono l’attività trasferasica permettono a Rev1 di partecipare comunque
alla sintesi translesione (Haracska et al., 2001). L’interazione coinvolge il dominio PAD
(dominio associato alla polimerasi di Rev1) e, probabilmente, anche la regione C-terminale di
Rev1 (Acharya et al., 2005; D’Souza and Walker, 2006). L’interazione non è fondamentale
solo per il mantenimento, ma la presenza di Rev1 rende Pol zeta più efficiente, sia nel
processo di bypass di lesioni sia nel processo di estensione di mispair (Acharya et al., 2006).
Per quanto concerne i fenotipi, mutazioni o delezione di REV3 e di REV7, nonché di REV1,
rendono il ceppo maggiormente sensibile al trattamento con UV e con agenti chimici che
danneggiano il DNA, riducendo il numero di cellule sopravvissute al trattamento, conferendo
d’altra parte un fenotipo reversionless, cioè in cui non si osservava reversione di specifiche
mutazioni (Lawrence et al., 1985; Lemontt, 1971). Infatti delezioni in questi geni, se da una
parte aumentato la sensibilità a sostanze che danneggiano il DNA, dall’altra riducono
notevolmente la frequenza di mutazioni del DNA, in quanto la sintesi translesione di Pol zeta
e Rev1 è error prone. Diversi studi hanno dimostrato che l’attività di Pol zeta è responsabile
del 98% delle mutazioni per sostituzione e del 95% delle mutazioni di frameshift indotte dal
trattamento con UV, mentre l’attività di Rev1 è responsabile del 95% delle mutazioni per
sostituzione sempre in seguito a trattamento con UV (reviewed in Lawrence and Maher,
2001). Pol zeta è anche responsabile del 50%-75% della mutabilità spontanea, non indotta da
agenti esterni (Quah et al., 1980).
Recentemente è stato dimostrato che Pol zeta, e Rev1, sono presenti e funzionano nel
mitocondrio di S. cerevisiae (Zhang et al., 2006; Kalifa and Sia, 2007). Zhang et al. hanno
dimostrato, mediante fusione dell’estremità N-terminale di Rev3, Rev7 e Rev1 con la proteina
GFP, che le proteine localizzano nei mitocondri. Hanno inoltre dimostrato che la delezione di
REV3 e di REV7 riduce notevolmente la frequenza reversioni per frameshift di un nucleotide
nell’mtDNA, di circa 30-40 volte in assenza di trattamenti mutageni e di 5-6 volte in seguito a
trattamento con UV. Inoltre queste frequenze non sono alterate dall’introduzione di mutazioni
in MIP1, indicando che Pol γ e Pol zeta appartengono allo stesso gruppo epistatico e
suggerendo che fra le due proteine, e fra le proteine e Rev1, vi siano complesse interazioni.
Kalifa and Sia, 2007 hanno dimostrato per la prima volta che la polimerasi zeta e Rev1
contribuiscono alla comparsa di mutanti petite in seguito a trattamento con UV. Il ceppo
∆rev1 mostra una riduzione della frequenza di petite di 5 volte rispetto al wt in seguito a
trattamento con UV, mentre i ceppi deleti in REV3 o in REV7 mostrano una riduzione di circa
60 volte rispetto al wt. In assenza di trattamento con raggi UV, però, le frequenze sono simili.
Inoltre è stato dimostrato che la delezione di uno dei tre geni incrementa la frequenza di
mutazioni puntiformi per sostituzione dell’mtDNA, come dimostrato da un aumento della
frequenza di mutanti EryR, sia in presenza che in assenza del trattamento con UV. Questi
risultati sono opposti a quelli osservati nel nucleo, e suggeriscono che Pol zeta e Rev1 siano
65
1. Introduzione
coinvolti nella riparazione dei danni indotti da UV, ma in maniera error free. D’altra parte
pone in evidenza che nei mitocondri deve esserci un sistema di riparazione error prone che, in
assenza di Pol zeta e Rev1, incrementa la frequenza di mutazioni puntiformi in seguito a
trattamento UV. Questo sistema di riparazione error prone potrebbe essere costituito da Mip1
stesso.
Pol zeta è presente e conservata nella maggior parte degli eucarioti, e in tutti i mammiferi. In
particolare sono state identificate nell’uomo le proteine omologhe Rev3 e Rev7 (Morelli et
al., 1998; Lin et al., 1999; Gibbs et al., 2000; Murakumo et al., 2000; Murakumo et al.,
2001). Come nel lievito, la polimerasi zeta umana, insieme a Rev1, è coinvolta nella sintesi
translesione error prone. Anche in questo caso Rev1 è fondamentale per il mantenimento del
complesso Rev3-Rev7 e per la funzionalità della polimerasi. Al contrario della polimerasi zeta
umana di lievito, Pol zeta umana sembra non localizzare nel nucleo, sebbene la dimostrazione
non si possa considerare definitiva (Zhang et al., 2006).
66
2. Scopo della ricerca
2. Scopo della ricerca
67
2. Scopo della ricerca
Nel presente studio, mutazioni equivalenti a mutazioni nel gene umano POLG sono state
introdotte nelle posizioni corrispondenti del gene MIP1 di Saccharomyces cerevisiae. Gli
alleli mutanti mip1 sono stati inseriti in un ceppo aploide deleto in MIP1 e in un diploide
eterozigote (MIP1/∆mip1). La ricerca si propone un duplice scopo:
1) Studiare i fenotipi mitocondriali associati a mutazioni in MIP1. In particolare verrà
studiata la crescita su fonti ossidabili, indicativa della respiratorio sufficienza del
ceppo mutato, e verranno determinati i profili dei citocromi respiratori e l’attività
respiratoria, indicativi della funzionalità mitocondriale. In secondo luogo, verrà
determinato l’accumulo dei petite, indice della mutabilità estesa dell’mtDNA, e la
frequenza dei rho0, indice della perdita dell’mtDNA. Le analisi verranno condotte a
28°C e a 36°C, per valutare un eventuale fenotipo termosensibile. In terzo luogo verrà
determinata la frequenza dei mutanti EryR, misura della frequenza delle mutazioni
puntiformi e dunque della fedeltà della polimerasi mutata. Verrà poi determinata la
dominanza/recessività delle mutazioni, mediante analisi dei fenotipi prima elencati in
ceppi eteroallelici recante una copia selvatica e una copia mutata di MIP1. Verrà
inoltre studiato il fenotipo dovuto alla presenza di più mutazioni in cis o in trans come
osservato nei pazienti umani. Infine, per alcune mutazioni, verranno determinati i
livelli di espressione della polimerasi mutata, i livelli proteici solubili mitocondriali e
l’attività catalitica in vitro.
2) Identificare e valutare l’effetto di sostanze o di soppressori genici multicopia su
fenotipi mitocondriali dovuti alle mutazioni in MIP1. L’identificazione di molecole o
soppressori ha una doppia finalità. In primo luogo, attraverso le proprietà di queste
“molecole”, si vogliono comprendere meglio i meccanismi attraverso cui le polimerasi
mutate agiscono. In secondo luogo, si vogliono gettare le basi per studi in vivo e
eventuali terapie basate sull’utilizzo di sostanze o geni in grado di ridurre il danno
causato dalle mutazioni patologiche ripristinando almeno parzialmente, i fenotipi
mitocondriali selvatici.
68
3. Materiali e metodi
3. Materiali e metodi
69
3. Materiali e metodi
3.1 Ceppi di lievito utilizzati
Nello studio sono stati utilizzati i seguenti ceppi di Saccharomyces cerevisiae:
Ceppi aploidi
Ceppo
W303-1A
W303-1B
Genotipo
Mata ade2-1 leu2-3 ura3-1 trp1-1 his3-11 can1-100
OF1
Matα ade2-1 leu2-3 ura3-1 trp1-1 his3-11 can1-100
mip1::KANR
DWM-5A
Matα ade2-1 leu2-3 ura3-1 trp1-1 his3-11 can1-100
mip1::KANR
Mata ade2-1 leu2-3 ura3-1 trp1-1 his3-11 can1-100
mip1::KANR
Mata ade2-1 leu2-3 ura3-1 trp1-1 his3-11 can1-100
sml1::HIS3 adh4::URA3
DWM-1A
YG855
YO81-4B
YO81-3A
YO81-5D
DYY-4C
Matα ade2-1 leu2-3 ura3-1 trp1-1 his3-11 can1-100
Matα ade2-1 leu2-3 ura3-1 trp1-1 his3-11 can1-100
mip1::KANR sml1::HIS3
Mata ade2-1 leu2-3 ura3-1 trp1-1 his3-11 can1-100
sml1::HIS3
Matα ade2-1 leu2-3 ura3-1 trp1-1 his3-11 can1-100
sml1::HIS3
Mata ade2-1 leu2-3 ura3-1 trp1-1 his3-11 can1-100
mip1::KANR sml1::HIS3
Mata ade1 cox2
Mata ade1 cob
Mata ade1 cob
Mata ade1 cox3
Origine
Thomas and Rothstein, 1989
Thomas and Rothstein, 1989
Questo lavoro: ceppo
mip1::KANR derivato da W3031B
Questo lavoro: sporulazione del
ceppo diploide DWM
Questo lavoro: sporulazione del
ceppo DWM
Rodney Rothstein
Questo lavoro: sporulazione del
ceppo diploide YO81
Questo lavoro: sporulazione del
ceppo diploide YO81
Questo lavoro: sporulazione del
ceppo diploide YO81
Matα met cox2
Questo lavoro: sporulazione del
ceppo diploide DYY
Françoise Foury
Françoise Foury
Françoise Foury
Françoise Foury
Françoise Foury
M9-3/A3
Matα met cox3
Françoise Foury
M7-40/A1
Matα met cob
Françoise Foury
M17-162
Matα met cob
Françoise Foury
S288c
Matα gal2 mal mel flo1 flo8-1 hap1
Mortimer and Johnston, 1986
BY4741
BY4742
Mata his3∆1 leu2∆0 met15∆0 ura3∆0
Matα his3∆1 leu2∆0 lys2∆0 ura3∆0
Brachmann et al., 1998
Brachmann et al., 1998
Σ1278b
Matα
Grenson at al., 1966
FL100
D273-10B/A1
Mata
Matα met6
Lacroute, 1968
Sherman, 1964
D273-CD3
Matα met6 ura3 mip1∆::KanR
Questo lavoro
K8-6c
Matα ade2 leu2 trp5 mmc1
Collezione di Parma
10022
Matα met4 mmc1
Collezione di Parma
5595/4c
Matα phe2 met4
Collezione di Parma
5595/8c
Matα phe2 leu2
Collezione di Parma
5594/4a
Matα leu2-1
Collezione di Parma
M9-94-4B
M7-40-5B
M17-162-4D
M9-3-5B
M9-94/A1
70
3. Materiali e metodi
Ceppi diploidi
Ceppo
W303
Genotipo
DWW
Mata ade2-1 leu2-3 ura3-1 trp1-1 his3-11 can1-100/ Matα ade2-1
leu2-3 ura3-1 trp1-1 his3-11 can1-100
W303-1A X W303-1B
DWM
W303-1A X OF1
YO81
Mata ade2-1 leu2-3 ura3-1 trp1-1 his3-11 can1-100/ Matα ade2-1
leu2-3 ura3-1 trp1-1 his3-11 can1-100 mip1::KANR
Mata ade2-1 leu2-3 ura3-1 trp1-1 his3-11 can1-100 sml1::HIS3
YG855 X OF1
DYY
adh4::URA3/ Matα ade2-1 leu2-3 ura3-1 trp1-1 his3-11 can1-100
mip1::KANR
Mata ade2-1 leu2-3 ura3-1 trp1-1 his3-11 can1-100 sml1::HIS3/
YO81-3A X YO81-4B
DMM
Matα ade2-1 leu2-3 ura3-1 trp1-1 his3-11 can1-100 mip1::KAN
sml1::HIS3
Mata ade2-1 leu2-3 ura3-1 trp1-1 his3-11 can1-100 mip1::KANR/
DWM-1A X DWM-5A
Mata ade2-1 leu2-3 ura3-1 trp1-1 his3-11 can1-100/ Matα ade2-1
leu2-3 ura3-1 trp1-1 his3-11 can1-100
Origine
Thomas and Rothstein,
1989
R
Matα ade2-1 leu2-3 ura3-1 trp1-1 his3-11 can1-100 mip1::KANR
SK1
Mata HO gal2 cupS can1R/ Matα
Kane and Roth, 1974
Ceppi naturali
Ceppo
Origine
EM93
M28
Isolato da fichi marci in California
Isolato da un grappolo d’uva in una vigna toscana
(Montalcino)
Isolato da un grappolo d’uva in una vigna toscana
(Montalcino)
Isolato da un grappolo d’uva in una vigna toscana
(Montalcino)
Isolato da un grappolo d’uva in una vigna toscana
(San Giovese)
Isolato da un grappolo d’uva in una vigna toscana
(San Giovese)
Isolato da un grappolo d’uva in una vigna toscana
(San Giovese)
Isolato da un grappolo d’uva in una vigna toscana
(San Giovese)
Isolato da un grappolo d’uva in una vigna toscana
(San Giovese)
Isolato da un grappolo d’uva in una vigna toscana
(San Giovese)
Isolato da un grappolo d’uva in una vigna toscana
Isolato da un grappolo d’uva in una vigna sarda
Isolato da un grappolo d’uva in una vigna sarda
Isolato da un grappolo d’uva in una vigna sarda
Ceppo enologico commerciale
Ceppo enologico commerciale
Ceppo enologico commerciale
Ceppo enologico commerciale
M12
M57
SGU60
SGU 89
SGU90
SGU114
SGU406
SGU407
1014
M25
A43
V19
IT512
NWS Sauvignon
NWS Merlot
NWS Chardonnay
Mortimer and Johnston, 1986
Cavalieri et al., 2000
Townsend et al., 2003
Townsend et al., 2003
Duccio Cavalieri
Duccio Cavalieri
Duccio Cavalieri
Duccio Cavalieri
Duccio Cavalieri
Duccio Cavalieri
Duccio Cavalieri
Budroni et al., 2005
Budroni et al., 2005
Budroni et al., 2005
Collezione INTEC srl Verona
Collezione INTEC srl Verona
Collezione INTEC srl Verona
Collezione INTEC srl Verona
71
3. Materiali e metodi
L2056
Ceppo enologico commerciale
B150
Ceppo per panificazione
Collezione Lallemand, Montreal
(Canada)
Collezione di Parma
3.2 Ceppi batterici utilizzati
Per i clonaggi sono stati utilizzati i seguenti ceppi di Escherichia coli:
Ceppi
DH10B
Genotipo
F-mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80d DlacZ ∆M15 ∆lacX74 deoR recA1 endA1 araD139
∆(ara, leu)7697 galU galKλ-rpsL hupG
®
XL10-Gold
JM109
TetR ∆(mcrA)183 ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac
Hte [F´ proAB lacIqZ∆M15 Tn10 (TetR) Amy CamR]
e14–(McrA–) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 (rK– mK+) supE44 relA1 ∆(lac-proAB)
[F´ traD36 proAB lacIqZ∆M15]
3.3 Terreni di crescita
Per la crescita di S. cerevisiae sono stati utilizzati i seguenti terreni:
•
Terreno massimo YP: bacto-peptone (DIFCO) 2%, estratto di lievito (DIFCO) 1%.
•
Terreno massimo YPA: terreno YP addizionato di adenina 75 mg/l.
•
Terreno massimo N1: bacto-peptone (DIFCO) 1%, estratto di lievito 1%, etanolo
2%, tampone K-fosfato pH 6,3 50 mM, eritromicina (SIGMA) 4 g/l.
•
Terreno massimo YPAGE-Ery: bacto-peptone (DIFCO) 2%, estratto di lievito
(DIFCO), 1%, adenina 100 mg/l, glicerolo 3%, etanolo 3%, tampone K-fosfato pH 6,5
25 mM, eritromicina (SIGMA) 3 g/l.
•
Terreno minimo sintetico definito (SD): Yeast Nitrogen Base without aminoacids
(DIFCO) 0,67%, eventuali aminoacidi e basi necessari per complementare le
auxotrofie (adenina 25 mg/l, istidina 50 mg/l, leucina 100 mg/l, triptofano 50 mg/l,
uracile 50 mg/l, metionina 50 mg/l).
•
Terreno sintetico completo (SC): terreno minimo sintetico SD addizionato di dropout, secondo la formula di Kaiser (Kaiser et al., 1994).
•
Terreno minimo 5-FOA: terreno minimo sintetico YNB addizionato di acido 5fluoroorotico (Melford) 1 g/l, uracile 50 mg/l, eventuali aminoacidi e basi per
complementare le auxotrofie.
• Terreno di sporificazione: acetato di potassio 2%, yeast extract (DIFCO) 0,25%.
Se non specificato altrimenti, ogni terreno veniva addizionato di una o più fonti di
carbonio (glucosio 2%, etanolo 2%, glicerolo 3%, glucosio 0.3% più etanolo 2%,
galattosio 2%, raffinosio 2%)
I terreni venivano all’occorrenza solidificati aggiungendo Bacto-Agar (DIFCO) 2%, Agar
(SIGMA) 2% o Agar (FORMEDIUM) 2%.
Se non specificato altrimenti, le colture di lievito venivano fatte crescere in condizioni di
aerazione a 28°C.
72
3. Materiali e metodi
Per la crescita di E. coli sono stati utilizzati i seguenti terreni:
•
Terreno LB: bacto-triptone (DIFCO) 1%, estratto di lievito (DIFCO) 0.5%, NaCl
0.5%, pH 7,2-7,5
•
Terreno LBA: terreno LB addizionato di ampicillina (SIGMA) 100 mg/l.
•
Terreno SOB: bacto-triptone (DIFCO) 2%, estratto di lievito (DIFCO) 0,5%, NaCl
0,5 g/l, KCl 186 mg/l, acqua distillata.
•
Terreno SOC per elettroporazione: terreno SOB addizionato di MgCl2 20 mM e
glucosio 20 mM.
I terreni venivano all’occorrenza solidificati aggiungendo Bacto-Agar (DIFCO) 2%, Agar
(SIGMA) 2% o Agar (FORMEDIUM) 2%.
Le colture di E. coli venivano fatte crescere in condizioni di aerazione a 37°C.
3.4 Vettori plasmidici
In questo studio sono stati utilizzati i seguenti vettori plasmidici:
Plasmide
pUC19
pFL38
Marcatori in
S. cerevisiae
URA3
pFL39
TRP1
pRS425
LEU2
pWJ841
LEU2
YEplac195
URA3
pLGALZ3
leu2D, URA3
pLGALMIP1
leu2D, URA3
Tipo e numero di copie
Origine
Figura
Vettore di E. coli
Vettore shuttle,
centromerico
Vettore shuttle,
centromerico
Vettore shuttle,
multicopia
pRS425 contenente il
gene RNR1
Vettore shuttle,
multicopia
Vettore multicopia
d’espressione di S.
cerevisiae
pLGALZ3 contenente il
gene MIP1 (ceppo
Σ1278b)
Yanisch-Perron et al., 1985
Bonneaud et al., 1991
3.1
3.2 A
Bonneaud et al., 1991
3.2 B
Christianson et al., 1992
3.3 A
Zhao et al., 2001
3.3 B
Gietz and Sugino, 1988
3.4
Foury and Vanderstraeten, 1992
3.5 A
Foury and Vanderstraeten, 1992
3.5 B
73
3. Materiali e metodi
Figura 3. 1: Plasmide pUC19.
Figura 3. 2: (A) Plasmide pFL38; (B) Plasmide pFL39.
74
3. Materiali e metodi
Figura 3. 3: (A) Plasmide pRS425; (B) Plasmide pWJ841, derivante dall’inserzione in pRS425 del
frammento digerito con SacI contenente il gene RNR1.
Figura 3. 4: Plasmide YEplac195.
75
3. Materiali e metodi
Figura 3. 5: (A) Vettore d’espressione pLGALZ3. Il plasmide contiene il promotore del gene GAL1
inducibile da galattosio, sotto il cui controllo si trova il gene LacZ. (B) Vettore d’espressione pLGALMIP1.
Il vettore deriva dal plasmide pLGALZ3, in cui il gene LacZ è stato sostituito dal gene MIP1 del ceppo
Σ1278b. La regione codificante del gene MIP1 è situato 45 bp a valle del sito SalI, sotto il controllo del
promotore GAL1.
3.5 PCR
Tutte le reazioni di PCR sono state condotte utilizzando un termociclatore “Perkin Elmer
GeneAmp PCR System 2400”.
3.5.1 Amplificazione di MIP1
Per l’amplificazione di MIP1 è stata utilizzata la “Platinum®Pfx DNA polymerase”
(Invitrogen) e i primer MIPC e MIPE (vedere allegato 1). La PCR è stata condotta seguendo il
protocollo fornito dalla casa produttrice, utilizzando 500 ng di DNA genomico estratto dal
ceppo W303-1B e 1 unità di Pfx in un volume totale di 50 µl. Per l’amplificazione sono state
usate le seguenti condizioni:
- 94°C per 2’
- 30 cicli:
- 94°C per 15’’
- 55°C per 30’’
- 68°C per 10’
3.5.2 PCR per la distruzione di MIP1
Per la distruzione del gene MIP1 nel ceppo W303-1B con la cassetta KANR, è stata utilizzata
la “Platinum®Pfx DNA polymerase” (Invitrogen) e i primer S1MIP e S2MIP (vedere allegato
1). Sono stati utilizzati 300 ng di DNA templato (plasmide con cassetta KanMX4) e 1 unità di
Pfx in un volume totale di 100 µl. Per l’amplificazione sono state usate le seguenti condizioni:
- 94°C per 2’
- 30 cicli:
- 94°C per 30’’
76
3. Materiali e metodi
- 54°C per 30’’
- 72°C per 3’20’’
- 72°C per 7’
Per la distruzione del gene MIP1 nel ceppo D273-10B/A1 con la cassetta KANR, è stata
utilizzata la “Biotools Taq” (Biotools) e i primer MIPF e NgoRv (vedere allegato 1 e 2). Sono
stati utilizzati circa 10 ng di DNA templato (DNA genomico del ceppo DWM-5A) e 2,5 unità
di Taq in un volume totale di 100 µl. Per l’amplificazione sono state usate le seguenti
condizioni:
- 94°C per 2’
- 30 cicli:
- 94°C per 30’’
- 52°C per 40’’
- 72°C per 3’
- 72°C per 7’
3.5.3 Mutagenesi sito-specifica
Le mutazioni G224A e Y757C sono state introdotte in MIP1 utilizzando il kit “QuikChange®
XL Site-Directed Mutagenesis Kit” (Stratagene), utilizzando come templato 12 ng del
plasmide pUC19-MIP1. Rispetto al protocollo fornito dalla casa produttrice, sono state
apportate delle modifiche:
- la denaturazione iniziale è stata condotta per 1 minuto;
- sono stati condotti 16 cicli di amplificazione con le seguenti condizioni:
- 95°C per 50’’
- 55°C per 1’
- 68°C per 14’
Per la mutazione G224A sono stati utilizzati i primer mutagenici G249A1 e G249A1, mentre
per la mutazione Y757C sono stati utilizzati i primer mutagenici Y783C1 e Y783C2 (vedere
allegato 1)
Le mutazioni G651A, A661T, A692T, H734Y G807R e E900G sono state ottenute mediante
la tecnica “overlap extension PCR” (Ho et al., 1989; Aiyar et al., 1996). Nella prima PCR è
stato usato il primer AVRFw come primer forward e i primer mutagenici G651ARv,
A661TRv, A692TRv, H734YRv G807Rv o E900GRv come primer reverse (vedere allegato
2), nella seconda i primer mutagenici G651AFw, A661TFw, A692TFw, H734YFw, G807Fw
o E900GFw e il primer BsrRv come primer reverse, eccetto per la mutazione H734Y per il
quale è stato utilizzato il primer NgoRv (vedere allegato 2). Le PCR sono state condotte
utilizzando la “PfuUltra™ High-Fidelity DNA Polymerase” (Stratagene), utilizzando 5 ng di
templato (pUC19-MIP1 linearizzato con SalI) e 2,5 unità di PfuUltra™, in un volume di 50
µl. Sono state utilizzate le seguenti condizioni:
- 95°C per 2’
- 30 cicli:
- 95°C per 30’’
77
3. Materiali e metodi
- 52°C per 30’’
- 72°C per 1’30’’
- 72°C per 10 minuti
La terza reazione di PCR è stata condotta utilizzando la precedente coppia di amplificati sia
come primer che come templato. La PCR è stata condotta utilizzando la “PfuUltra™ HighFidelity DNA Polymerase” (Stratagene), utilizzando circa 100 ng di ciascun amplificato (dopo
purificazione mediante escissione da gel) e 5 unità di PfuUltra™, in un volume di 100 µl.
Sono state utilizzate le seguenti condizioni:
- 95°C per 2’
- 10 cicli:
- 95°C per 30’’
- 62°C per 1’
- 72°C per 2’
- pausa, durante i quali ad ogni reazione sono stati aggiunti i primer esterni AvrFw e
BsrRv (o NgoRv)
- 25 cicli:
- 95°C per 30’’
- 52°C per 30’’
- 72°C per 2’20’’
- 72°C per 10’
3.5.4 Amplificazione di REV7, REV3, CCE1, MHR1, MSH1 e CDC9
Il gene REV7 è stato amplificato mediante l’utilizzo dei primer REV7-Fw e REV7-Rv, situati
rispettivamente a –609 a +994 rispetto al codone di inizio, così da ottenere un amplificato di
circa 1600 bp. Il gene REV3 è stato amplificato mediante l’utilizzo dei primer REV3-Fw e
REV3-Rv, situati rispettivamente a –304 a +4734 rispetto al codone di inizio, così da ottenere
un amplificato di circa 5000 bp. Il gene CCE1 è stato amplificato mediante l’utilizzo dei
primer CCE1-Fw e CCE1-Rv, situati rispettivamente a –372 a +1223 rispetto al codone di
inizio, così da ottenere un amplificato di circa 1600 bp. Il gene MHR1 è stato amplificato
mediante l’utilizzo dei primer MHR1-Fw e MHR1-Rv, situati rispettivamente a –628 a +1365
rispetto al codone di inizio, così da ottenere un amplificato di circa 2000 bp. Il gene MSH1 è
stato amplificato mediante l’utilizzo dei primer MSH1-Fw e MSH1-Rv, situati
rispettivamente a –323 a +3189 rispetto al codone di inizio, così da ottenere un amplificato di
circa 3500 bp. Il gene CDC9 è stato amplificato mediante l’utilizzo dei primer CDC9-Fw e
CDC9-Rv, situati rispettivamente a –504 a +2393 rispetto al codone di inizio, così da ottenere
un amplificato di circa 2900 bp.
L’amplificazione dei geni inferiori a 3000 bp è stata effettuata mediante l’utilizzo della “Pwo
DNA Polymerase” (Roche), utilizzando circa 40 ng di DNA genomico del ceppo W303-1B in
100 µl e utilizzando il seguente programma di PCR:
- 94°C per 2’
- 10 cicli:
78
3. Materiali e metodi
- 94°C per 15’’
- 51°C per 30’’
- 72°C per 45’’/Kb
- 20 cicli:
- 94°C per 15’’
- 51°C per 30’’
- 72°C per 45’’/Kb più 5’’/ciclo
- 72°C per 7’
L’amplificazione dei geni superiori a 3000 bp è stata effettuata mediante l’utilizzo della
“PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase” (Stratagene), utilizzando circa 20 ng di DNA
genomico del ceppo W303-1B in 50 µl e utilizzando il seguente programma di PCR:
- 95°C per 2’
- 30 cicli:
- 95°C per 20’’
- 51°C per 30’’
- 72°C per 20’’/Kb
- 72°C per 3’
3.5.5 PCR da colonia di lievito
Le PCR da colonia di lievito su DNA plasmidico sono state condotte utilizzando la “Biotools
Taq” (Biotools). Per l’amplificazione del frammento di MIP1 compreso fra i primer AvrFw e
BsrRv, cellule cresciute overnight in terreno minimo selettivo SC sono state sospese in 25 µl
di acqua milliQ e bollite a 95°C per 6 minuti. A freddo sono stati aggiunti i vari componenti
(1,2 unità di Taq), fino ad arrivare ad un volume di 50 µl. Per l’amplificazione sono state
utilizzate le seguenti condizioni:
- 94°C per 3’
- 30 cicli:
- 94°C per 30’’
- 50°C per 40’’
- 72°C per 2’’
- 72°C per 6’
Le PCR da colonia di lievito su DNA genomico sono state condotte utilizzando la “Platinum®
Taq DNA polymerase” (Invitrogen), utilizzando 1 unità di polimerasi in 50 µl. Cellule di
lievito da testare cresciuto in terreno SC o YPD sono state risospeso in 10 µl di acqua. 3 µl
sono stati addizionati a 42 µl di mix di reazione contenente tutto tranne la polimerasi. La mix
è stata bollita a 95°C per 15 minuti. Successivamente sono stati aggiunti 5 µl di acqua
addizionati di polimerasi a freddo. La miscela è stata sottoposta al seguente programma di
PCR:
- 95°C per 2’
- 35 cicli:
79
3. Materiali e metodi
-
- 94°C per 30’’
- 50-52°C per 1’
- 72°C per 2’-5’
72°C per 7’
3.5.6 Primer
I primer utilizzati per la distruzione di MIP1, la mutagenesi sito-specifica di MIP1 e le PCR
analitiche sono riportati negli allegati 1, 2 e 3. Per l’amplificazione dei geni REV7, REV3,
CCE1, MHR1, MSH1 e CDC9 sono stati utilizzati gli oligonucleotidi riportati nella seguente
tabella:
Gene
REV7
REV3
CCE1
MHR1
MSH1
CDC9
REV7-Fw
REV7-Rv
REV3-Fw
REV3-Rv
CCE1-Fw
CCE1-Rv
MHR1-Fw
MHR1-Rv
MSH1-Fw
MSH1-Rv
CDC9-FW
CDC9-RV
Primer
gcgccgtcgacgatgaatgggaaaagaagtgc
gcgcgggtacccatggaaccagacagaagacc
gcgcgggtaccggatccaagaatccctgtgg
gcgccgaattccttagaggatacgaagattcc
cgccgggatccgtgttaaagcatgctgaagatgg
gcccggagctcctgcaaacttaacgttgacc
cgggcggatccgaaattgggttagcgttacagg
cgggggaattcgcagttgcattcgatgttacg
ggccggcatgcgtggagcacctaattgtaaagg
cccgcggatcccactcatggacgaaagatgc
cgggcgtcgacccctttcaccaaattcttcg
cggcgggtaccgtaaggtagacagagaaacg
3.6 Sequenziamento
Il sequenziamento di MIP1 e delle sue varianti alleliche è stato condotto esternamente
utilizzando il servizio di sequenziamento della MWG-Biotech oppure internamente
utilizzando il sequenziatore CEQ-8000, secondo il protocollo fornito dalla casa produttrice.
Per il sequenziamento venivano utilizzati i primer riportati nell’allegato 1, 2 e 3.
Il sequenziamento dei geni REV7, REV3, CCE1, MHR1, MSH1 e CDC9 è stato effettuato
mediante il servizio MWG-Biotech utilizzando i primer universali M13-Uni e M13-Rv, più
eventualmente specifici primer, come riportato nella seguente tabella:
80
3. Materiali e metodi
Gene
REV3
MSH1
CDC9
Primer
REV3S1 ggatgttcatggataaacgtg
REV3S2 cttagatcatctgtttctgc
REV3S3 gacattgtcagggaacttgc
REV3S4 gaatgtcacctacggttatac
REV3S5 ggttctgctctatggtcttc
REV3S0 gttaccacgttggctggaatc
MSHS1 cagagaaatgcctgaaaacac
MSHS2 ctcttgaaacctctagtgaac
MSHS3 ctcccattcactacttctag
CDC9S1 gacggctgttacacatactg
CDC9S2 gttatctgagtcgcgtattg
3.7 Manipolazione del DNA
3.7.1 Digestione con endonucleasi di restrizione
Le digestioni analitiche di DNA venivano condotte digerendo 100-2000 ng di DNA in
presenza di 5-10 unità di endonucleasi di restrizione specifica (Amersham, NEB, Fermentas o
Roche) in un volume totale di 20 µl, per 2 ore a 37°C.
Per il clonaggio di MIP1, 2 µg di amplificato (sezione 3.5.1) e 3 µg di vettore sono stati
digeriti dapprima con SacI (Fermentas) e SalI (Roche) per 3 ore a 37°C. I subclonaggi di
MIP1 o delle sue varianti alleliche da un vettore ad un altro venivano condotte come nel caso
precedente, utilizzando 2,5-3 µg di vettore.
Per le reazioni di mutagenesi mediante “overlap extension PCR”, 500 ng di amplificato di
PCR e 2 µg di vettore (pFL39-MIP1) venivano digeriti con AvrII (NEB) e con BsrGI (NEB) o
con NgoMIV (NEB) per 3 ore a 37°C.
Per i subclonaggi delle varianti alleliche di MIP1 in pLGALMIP1, 2,5-3 µg di DNA venivano
dapprima digeriti con NotI (Roche) per 3 ore a 37°C e, dopo purificazione mediante kit “High
Pure PCR Product Purification Kit”, con NgoMIV (NEB) per 3 ore a 37°C.
Per il clonaggio dei geni REV7, REV3, CCE1, MHR1 e CDC9 in YEplac195, sono state
condotte le seguenti digestioni, sia dell’amplificato che del plasmide:
- REV7: KpnI e SalI;
- REV3: KpnI e EcoRI;
- CCE1: SacI e BamHI;
- MHR1: SacI e EcoRI;
- CDC9: KpnI e SalI.
Dopo digestione i prodotti venivano purificati.
2-3 µg di vettore YEplac195 è stato digerito allo stesso modo.
REV7 è stato subclonato nel plasmide YEplac195REV3 digerendo YEplac195REV7 e
YEplac195REV3 con KpnI e SalI.
CCE1 è stato subclonato in pFL38 digerendo YEPlac195CCE1 e pFL38 con SacI e BamHI.
Il gene MSH1 è stato clonato in pFL38 digerendo amplificato e plasmide con SphI e BamHI.
81
3. Materiali e metodi
3.7.2 Elettroforesi su gel d’agarosio e escissione da banda
L’elettroforesi dei frammenti di DNA veniva eseguita su gel d’agarosio 0,8%-1,2% in
tampone TAE 1X (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM) ed etidio bromuro 0,5 µg/ml. Ai
campioni veniva aggiunto 1/10 di volume di tampone di caricamento (glicerolo 30%, bromo
fenolo blu 0,25%, xilene cianolo 0,25%).
Per l’escissione da banda, 100-500 mg di gel venivano escissi con una lama. L’estrazione da
gel veniva condotta col kit “Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System” (Promega) o col kit
“High Pure PCR Product Purification Kit” (Roche), risospendendo in un volume finale di
acqua pari a 40-50 µl.
3.7.3 Purificazione del DNA
Se necessario, i prodotti di PCR e i prodotti di digestione venivano purificati col kit “High
Pure PCR Product Purification Kit” (Roche) o col kit “Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up
System” (Promega).
3.7.4 Defosforilazione del DNA
La defosforilazione dell’estremità 5’ dei vettori digeriti veniva condotta utilizzando la
fosfatasi alcalina (Roche). 0,5-1 pmol di DNA venivano digeriti con 2 unità di enzima in un
volume totale di 100 µl, per 1 ora a 37°C, dopodiché la fosfatasi alcalina veniva inattivata
scaldando 20 minuti a 65°C. Il DNA defosforilato veniva poi purificato col kit “High Pure
PCR Product Purification Kit”.
3.7.5 Ligazione
Le reazioni di ligazione venivano condotte mantenendo un rapporto molare vettore:inserto
pari a 1:5 per ligazioni “sticky ends” e 1:6-1:8 per ligazioni “blunt ends” e utilizzando la T4
DNA ligasi (NEB) o la T4 DNA ligasi (Invitrogen), secondo i protocolli forniti dalla casa
produttrice.
3.8 Trasformazioni
3.8.1 Trasformazione di E. coli mediante elettroporazione
I ceppi di E. coli venivano resi elettrocompetenti secondo il protocollo di Dower et al., 1988.
Le cellule elettrocompetenti venivano trasformate aggiungendo all’eppendorf 1-3 µl di DNA
plasmidico (1-10 ng) o di ligazione. L’elettroporazione veniva condotta utilizzando una
cuvetta da 2 mm, settando i valori di 2 KV, 25 µF e 200 Ω, oppure utilizzando una cuvetta da
1 mm, settando i valori di 1,75 KV, 25 µF e 200 Ω.
3.8.2 Trasformazione di S. cerevisiae
La trasformazione di S. cerevisiae veniva condotta con la tecnica del litio acetato (Gietz and
Woods, 2002). Le cellule venivano trasformate con 100-1000 ng di DNA. In alternativa,
82
3. Materiali e metodi
veniva utilizzato il protocollo per la trasformazione rapida di S. cerevisiae (Gietz and Woods,
2002).
Per la distruzione, prima del piastramento le cellule venivano fatte rigenerare in 2 ml di
YPAD per 4 ore e piastrate successivamente su piastre YPD addizionate di geneticina 200
µg/ml. La conferma della distruzione veniva condotta per crescita fenotipica, per PCR e per
Southern blot.
3.8.3 Plasmid shuffling in S. cerevisiae
I ceppi DWM-5A recanti il plasmide pFL38MIP1 e un allele mutato su pFL39 sono stati
sottoposti a plasmid shuffling per selezionare ceppi privi di pFL38MIP1.
Cellule di ciascun ceppo sono stati inoculate in terreno SD addizionato di glucosio 2% e
uracile, ma non triptofano, in modo che le cellule potessero perdere il plasmide pFL38MIP1
ma non il plasmide derivato da pFL39. Dopo 16 ore di crescita, 1000 cellule sono state
piastrate su piastre di acido 5-fluororotico (5-FOA), su cui potevano crescere solo le cellule
che avevano perso il plasmide pFL38MIP1, essendo il 5-FOA tossico in presenza del prodotto
genico del gene URA3. In alternativa il medesimo plasmid shuffling è stato fatto in solido
mediante repliche successive, dapprima in terreno SC addizionato di uracile, due volte in
terreno contenente 5-FOA e infine su terreno SC privo di uracile.
3.9 Estrazione di DNA
3.9.1 Minipreparazione di DNA plasmidico da E. coli
L’estrazione di DNA plasmidico da E. coli veniva eseguito col metodo della lisi alcalina
partendo da 1,5 ml di coltura in fase stazionaria, come descritto da Sambrook and Russel,
2001. Il DNA veniva risospeso in 20-30 µl di acqua più RNasi 20 µg/ml.
In alternativa il DNA plasmidico veniva estratto da 5 ml di coltura col kit “Wizard® Plus SV
Minipreps DNA Purification System” (Promega) o col kit “High Pure Plasmid Isolation Kit”
(Roche), risospendendo il DNA in 100 µl di acqua.
3.9.2 Estrazione di DNA genomico da lievito
Il DNA usato come templato nelle PCR per i clonaggi veniva estratto da lievito secondo il
protocollo di Nasmyth and Reed, 1980, partendo da 10 ml di coltura di lievito in YPD e
risospendendo il DNA estratto in 50-100 µl di acqua.
3.9.3 Estrazione rapida di DNA totale da lievito
Per le PCR analitiche, per le trasformazioni di E. coli con DNA plasmidico totale e per i
Southern blot, il DNA totale veniva estratto col metodo di Hoffman and Winston, 1987. Il
materiale di partenza era costituito da 8 ml di terreno YPD per ceppi privi di DNA plasmidico
o contenente un plasmide monocopia, o 10 ml di terreno minimo SC addizionato di glucosio e
di opportuni aminoacidi per ceppi contenenti plasmidi multicopia. Il DNA veniva risospeso in
50 µl di acqua più RNasi.
83
3. Materiali e metodi
3.9.4 Estrazione di DNA mitocondriale da lievito
Il DNA mitocondriale veniva estratto secondo il metodo rapido di estrazione dei mitocondri
dopo crescita in terreno SC addizionato di glucosio 2%, e risospendendo il DNA in 100 µl di
TE più RNasi (Defontaine et al., 1991).
3.10 Southern blot
I Southern blot su DNA genomico sono stati condotti digerendo 3 µg di DNA totale estratto
col protocollo di Hoffman and Winston, 1987 in 100 µl di reazione con 60 unità di enzima
(NEB). Dopo 6 ore di digestione, il DNA veniva precipitato, risospeso in 15 µl di acqua,
caricato su gel d’agarosio 0,8% e lasciato correre overnight a 15 volt. I lavaggi del filtro e il
blot sono stati condotti utilizzando metodi standard (Sambrook and Russell, 2001). Il
trasferimento veniva condotto su filtro di nylon Hybond-N+ (Amersham). L’ibridazione
radioattiva è stata condotta marcando 100 ng di sonda mediante il kit "Rediprime II DNA
Labeling System" (GE Healthcare) e 5 µl di "Redivue deoxycytidine 5'-[α-32P]triphosphate
370 MBq/ml” (GE Healtccare). Dopo i lavaggi, il filtro veniva esposto per un tempo variabile
su lastre Kodak. Per la quantificazione, il filtro veniva esposto per 15 minuti al
PhosporImager (Molecular Dynamics) e le bande venivano quantificate mediante il software
fornito dalla casa produttrice.
I Southern blot su DNA mitocondriale sono stati condotti digerendo 1 µg di DNA
mitocondriale estratto col protocollo di Defontaine et al., 1991 in 100 µl con 60 unità di
enzima EcoRV (NEB). Dopo 6 ore di digestione, il DNA veniva precipitato, risospeso in 15
µl di acqua, caricato su gel d’agarosio 0,8% e lasciato correre overnight a 15 volt. I lavaggi
del filtro e il blot sono stati condotti utilizzando metodi standard (Sambrook and Russell,
2001). L’ibridazione radioattiva è stata condotta marcando 2 pmol di sonda 5CTCCTTTCGGGGTTCCGGCTCCCGTGGCCGGGCCCCGG-3’ mediante l’utilizzo della
T4 chinasi (NEB) e 5 µl di "Redivue adenosine 5'-[γ-32P]triphosphate 370 MBq/ml” (GE
Healtccare) (Ausubel et al., 1994).
3.11 Estrazione di RNA da lievito e Northern blot
Gli RNA totali venivano preparati mediante estrazione con fenolo acido (Ausubel et al.,
1994).
Per l’analisi Northern venivano utilizzati 30 µg di RNA, che venivano caricati su gel
d’agarosio denaturante e fatti correre per circa tre ore a 100 V. Il blot veniva condotto come
descritto precedentemente da Sherman et al., 1986. L’ibridazione radioattiva veniva condotta
in maniera analoga all’ibridazione per i Southern blot. Come controllo, veniva ibridato
l’mRNA del gene ACT1, codificante per i monomeri della’actina.
84
3. Materiali e metodi
3.12 Estrazione di proteine da lievito
3.12.1 Estrazione totale di proteine mediante TCA
I ceppi trasformati con gli alleli mip1 clonati in pLGALZ3 venivano fatti crescere in 5 ml di
terreno SC addizionato di raffinosio 2% per circa 24 ore. Dopo conteggio, 108 cellule
venivano inoculate in 10 ml totali di terreno SC addizionato di galattosio 2% per permettere
l’induzione del gene mip1. Dopo 6, 9 e 15 ore di crescita le cellule venivano raccolte e al
pellet venivano aggiunti 2 ml di NaOH 2M e β-mercaptoetanolo 8%. Dopo incubazione in
ghiaccio per 10 minuti, le proteine venivano precipitate mediante aggiunta di 1 ml di acido
tricloroacetico 50% e incubazione di 10 minuti in ghiaccio. Dopo centrifugazione, il pellet
veniva lavato 2 volte con etanolo 100% e una volta con etanolo/etere 1:1, e asciugato
mediante speed-vac. Il pellet veniva risospeso in 400 µl di loading buffer (Tris-HCl 240 mM
pH 6,8, SDS 6%, glicerolo 30%, blu di bromo fenolo 0,125%).
3.12.2 Estrazione di proteine solubili mitocondriali
I ceppi trasformati con gli alleli mip1 clonati in pLGALZ3 venivano fatti crescere in 5 ml di
terreno SC addizionato di raffinosio 2% per circa 24 ore. Dopo conteggio, le cellule venivano
inoculate in terreno SC addizionato di galattosio 2% alla concentrazione finale di 5x106 per
permettere l’induzione del gene mip1. Dopo 15 ore di crescita le cellule venivano raccolte, e
gli estratti solubili venivano estratti come riportato in precedenza (Foury, 1989; Foury and
Vanderstraeten, 1992).
3.13 Western blot
Il Western blot veniva condotto con tecniche classiche (Sambrook and Russell, 2001). La
corsa elettroforetica veniva condotta su gel di poliacrilammide all’8%. Il trasferimento era
condotto mediante elettroblotting, per 75 minuti a 60-70 V. L’ibridazione con l’anticorpo
primario veniva fatto mediante l’utilizzo di 5 µl di anticorpi policlonali anti Mip1 di coniglio
(forniti da F. Foury) in un volume complessivo di 5 ml, a temperatura ambiente per due ore e
overnight a 4°C. L’ibridazione secondaria veniva condotta con 4 µl di anticorpi secondari
legati a perossidasi di rafano in un volume complessivo di 50 ml, per un’ora a temperatura
ambiente. La reazione di chemiluminescenza veniva condotta mediante aggiunta del kit per
chemiluminescenza Amersham.
3.14 Saggio di gap filling
L’attività di gap filling sugli estratti solubili mitocondriali è stata condotta in una reazione
contenente 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 5 mM ditiotreitolo, 50 mM MgCl2, 25 µM di ogni dNTP
(dATP, dCTP, dGTP), 6 µM [3H]-dTTP, 150 mg/ml calf thymus DNA attivato e gli estratti
mitocondriali, come descritto in Foury and Vanderstraeten, 1992. I campioni venivano
prelevati dopo sei minuti a 30°C. L’attività veniva espressa come nanomoli di dTTP
85
3. Materiali e metodi
incorporato nel materiale precipitabile con acido tricloroacetico e per milligrammo di proteina
presente nell’estratto.
3.15 Analisi fenotipiche
3.15.1 Spettri dei citocromi respiratori
200 ml di cellule cresciute in terreno minimo addizionato di glucosio 0,5% ad esaurimento
venivano raccolte, lavate due volte con acqua bidistillata e risospese in acqua in un volume
complessivo di circa 3 ml, in modo tale che la concentrazione cellulare fosse almeno del 50%.
Gli spettri sono stati condotti utilizzando uno spettrofotometro a doppio raggio Cary 219
(Varian) e misurando l’assorbanza fra 540 e 630 nm.
3.15.2 Misurazione dell’attività respiratoria
L’attività respiratoria veniva determinata mediante l’utilizzo dell’ossigrafo Hansatech,
diluendo 100 µl di cellule ottenute come nel paragrafo precedente in 1 ml di tampone di
respirazione (0,1M ftalato-NaOH, pH 5,0) saturo di ossigeno e addizionato di glucosio 2%.
Su 1 ml della sospensione originale veniva misurato il peso secco, che doveva essere attorno
ai 40-60 mg. I valori venivano espressi come microlitri di ossigeno consumato per ora per
milligrammo di cellule.
3.15.3 Determinazione della frequenza dei petite
Nella prima fase degli esperimenti (capitolo 4) la frequenza dei petite era misurata inoculando
dapprima cellule da testare in 10 ml di terreno SC addizionato di etanolo 2% per
controselezionare le cellule respiratorio deficienti. Dopo 48 ore, le cellule venivano inoculate
in 10 ml di SC addizionato di glucosio 2% ad una concentrazione finale di 2x105 cell/ml e
fatte crescere a 28°C o a 36°C. Dopo circa 7-8 generazioni, le cellule venivano reinoculate in
10 ml di terreno SC addizionato di glucosio 2% ad una concentrazione finale di 2x105 cell/ml
e fatte crescere a 28°C o a 36°C. Dopo 7-8 generazioni, le cellule venivano diluite e 200
cellule venivano piastrate su terreno SC addizionato di etanolo 2% e glucosio 0,3%. Le cellule
venivano contate dopo 5 giorni.
In una seconda fase degli esperimenti (capitolo 5, 6 e 7) le cellule da testare venivano
strisciate su terreno solido addizionato di etanolo 2%. Dopo 48-60 ore, le cellule venivano
replicate su terreno SC addizionato di glucosio 2% e fatte crescere a 28°C o a 36°C. Dopo
circa 24 ore, le cellule venivano replicate su terreno SC addizionato di glucosio 2% e fatte
crescere a 28°C o a 36°C. Dopo circa 24 ore, le cellule venivano recuperate in acqua e diluite,
e 200 cellule venivano piastrate su terreno SC addizionato di etanolo 2% e glucosio 0,3%. Le
cellule venivano contate dopo 5 giorni. Per testare la capacità di varie sostanze di ridurre la
frequenza dei petite, l’analisi veniva condotta in liquido come nei casi precedenti.
86
3. Materiali e metodi
3.15.4 Determinazione della natura dei petite
Per discriminare se i cloni petite erano rho- o rho0, i cloni sono stati incrociati con quattro
cloni mit- di sesso opposto che presentavano mutazioni cox2, cox3, e due distinte mutazioni
cob. L’analisi era condotta strisciando 100 cloni petite su terreno YPAD. Dopo 24 ore, i cloni
erano replicati su terreno YPAD su cui erano stati distribuiti circa 107 cellule del ceppo tester
cresciuto anch’esso in YPAD. Dopo tre giorni, i cloni erano replicati su terreno YPAG. La
percentuale di cloni rho0 è definita come rapporto fra il numero di diploidi respiratorio
sufficienti e il numero di diploidi ottenuti.
3.15.5 Determinazione della frequenza dei mutanti EryR
Nella prima fase degli esperimenti la frequenza dei mutanti EryR è stata determinata facendo
crescere, per ogni ceppo da testare, 10 cloni in terreno liquido SC addizionato di glucosio 2%.
Dopo circa 24 ore di crescita, le cellule erano lavate due volte con acqua bidi, e circa 5x107
cellule erano piastrate su terreno N1. Per determinare il numero esatto di cellule piastrate,
un’opportuna diluizione di cellule veniva piastrata su terreno YPAE. La frequenza di mutanti
è definita come il rapporto di colonie EryR rispetto al numero totale di cellule piastrate.
Nella seconda fase degli esperimenti la frequenza dei mutanti EryR è stata determinata
facendo crescere, per ogni ceppo da testare, 10 cloni in terreno liquido YPAG. Dopo circa 48
ore di crescita, circa 6-8x107 cellule erano piastrate su terreno YPAEG-ery. Per determinare il
numero esatto di cellule piastrate, un’opportuna diluizione di cellule veniva piastrata su
terreno YPAEG. Nel caso di ceppi contenenti due plasmidi, la crescita iniziale veniva
condotta in terreno SC addizionato di etanolo 2%.
3.16 Marcatura dell’mtDNA con DAPI
Dopo circa 36 ore di crescita in terreno solido SD addizionato di glucosio 2%, le cellule
venivano stemperate in 200 µl di Tris-HCl 50 mM pH 7,5 e sottoposte a separazione fisica
mediante sonicazione per 5 s ad ampiezza del 30% con sonicatore VibraCell..
Successivamente veniva aggiunto il DAPI (4’,6-diamidino-2-fenilindolo) ad una
concentrazione finale di 1 µg/ml, e le cellule venivano incubate in ghiaccio per 15 minuti. 20
µl di sospensione cellulare venivano posti sopra uno strato di agarosio low melting point 1,5%
e osservate con un microscopio ottico Leica DMR con un obiettivo 100X in immersione.
87
4. Risultati (I parte)
4. Risultati (I parte):
Rescue genetico e chimico del fenotipo
di Saccharomyces cerevisiae indotto da
mutazioni nella DNA polimerasi
mitocondriale associate a casi di
oftalmoplegia
esterna
progressiva
umana*
*I risultati discussi in questa sezione sono stati oggetto della seguente pubblicazione:
Baruffini E., Lodi T., Dallabona C., Puglisi A., Zeviani M. and Ferrero I. (2006). Genetic
and chemical rescue of the Saccharomyces cerevisiae phenotype induced by mitochondrial
DNA polymerase mutations associated with progressive external ophthalmoplegia in humans.
Hum Mol Genet. 15, 2846-2855.
La pubblicazione è riportata come allegato 1.
88
4. Risultati (I parte)
4.1 Costruzione di un ceppo ∆mip1 e clonaggio del gene MIP1
Al fine di poter introdurre e studiare l’effetto di mutazioni equivalenti a mutazioni patologiche
umane nel gene MIP1 di Saccharomyces cerevisiae, è stato necessario costruire un ceppo di
lievito recante l’allele mip1 nullo. D’altra parte, come sottolineato nell’introduzione, un ceppo
deleto in MIP1 è rho0, dunque privo di DNA mitocondriale. Un ceppo rho0 sarebbe inutile ai
fini del lavoro, in quanto la DNA polimerasi mitocondriale, mutata o meno, non avrebbe
substrato su cui agire. Come conseguenza, non sarebbe possibile studiare l’effetto delle varie
mutazioni sul processo di replicazione dell’mtDNA. La costruzione di un ceppo deleto in
MIP1, ma rho+, ha reso necessario la costruzione di un diploide eterozigote al locus MIP1
(MIP1/∆mip1) così da preservare il mantenimento del DNA mitocondriale.
Come sottolineato nell’introduzione, uno dei vari vantaggi offerti da S. cerevisiae consiste
nell’aver a disposizione una collezione di deletanti, una collezione di ceppi in cui tutti i geni
non vitali di S. cerevisiae sono stati deleti singolarmente (collezione EUROSCARF). La
collezione EUROSCARF è stata costruita utilizzando i ceppi aploidi BY4741 e BY4742 e il
ceppo diploide BY4743, che presentano lo svantaggio di avere un traspostone Ty1 nel gene
HAP1 (Gaisne et al., 1999). Il gene HAP1 codifica per un fattore di trascrizione emedipendente che attiva la trascrizione di numerosi geni coinvolti nel metabolismo di tipo
ossidativo, fra cui il citocromo c (Zitomer and Lowry, 1992). I mutanti hap1 presentano
pertanto alterazioni del metabolismo ossidativo, fra cui una riduzione di circa due volte del
citocromo c, che rappresentano una situazione assolutamente svantaggiosa per lo studio di
fenotipi/genotipi legati alla funzionalità mitocondriale (Gaisne et al., 1999). Sulla base di
questi dati, è stato deciso di non utilizzare il background BY47 per lo studio degli effetti di
mutazioni in MIP1, ma il background W303 (Thomas and Rothstein, 1989). Il ceppo diploide
W303 e la progenie aploide W303-1B e W303-1A, fra loro isogenici, presentano un’efficiente
competenza respiratoria.
4.1.1 Costruzione del ceppo W303-1B ∆mip1
Il gene MIP1 è stato distrutto nel ceppo aploide W303-1B, mediante la tecnica “gene
disruption”, che consiste nell’interruzione della ORF del gene mediante l’inserzione del
marcatore di selezione KanR che conferisce resistenza alla geneticina (vedi Materiali e
metodi).
La selezione dei potenziali distrutti è avvenuta su terreno addizionato di geneticina 200 µg/ml.
I 16 cloni crescenti sono stati replicati su terreno addizionato di glicerolo 2% come unica
fonte di carbonio. Sei dei 16 cloni sono risultati incapaci di crescere su glicerolo, ed erano
dunque probabili deleti in MIP1. Come conferma sono state eseguite due reazioni di PCR da
colonia, ciascuna delle quali è stata condotta utilizzando un primer interno al costrutto usato
per l’integrazione e un primer esterno al costrutto. Solo se il costrutto si era integrato al locus
MIP1 si sarebbe ottenuto un amplificato (figura 4.1). Tutti e sei i cloni analizzati presentavano
il corretto pattern di bande.
89
4. Risultati (I parte)
Figura 4. 1: (A) Schema dell’amplificazione mediante i primer MIPF e K2 (amplificato 1), o MIPE e K3
(amplificato 2); (B) Amplificati di due cloni deleti in MIP1: amplificato 1 (lane 1 e 3) e amplificato 2 (lane
2 e 4).
Come ulteriore conferma sul clone 1 è stato condotta un’analisi Southern, digerendo il DNA
genomico estratto da questo ceppo e da W303-1B con l’enzima di restrizione HindIII. La
digestione con questo enzima produce una banda di circa 14400 bp sul DNA non distrutto,
mentre se la distruzione è avvenuta correttamente al locus la banda attesa è di circa 1200 bp
(figura 4.2 A). Come sonda è stato utilizzato un frammento di circa 800 bp a monte della ORF
MIP1, in grado di ibridare il DNA indipendentemente dall’avvenuta distruzione. Il clone 1
mostrava la banda attesa di 1200 bp (figura 4.2 B) ed è stato rinominato OF1.
Figura 4. 2: (A) Schema del Southern blot sul DNA di W303-1B e OF1; (B) Southern blot sui ceppi W3031B e OF1.
4.1.2 Costruzione e analisi fenotipica del diploide MIP1/∆mip1
Il ceppo diploide MIP1/∆mip1 è stato ottenuto mediante incrocio del ceppo OF1 con il ceppo
W303-1A. Il diploide ottenuto è stato chiamato DWM. In contemporanea è stato anche
ottenuto il ceppo isogenico non deleto mediante incrocio di W303-1B e W303-1A, chiamato
DWW.
90
4. Risultati (I parte)
Sui ceppi DWW (MIP1/MIP1) e DWM (MIP1/∆mip1) è stata condotta un’analisi fenotipica
per valutare la funzionalità mitocondriale. In particolare, sono stati determinati gli spettri di
assorbimento dei citocromi respiratori (figura 4.3) e l’attività respiratoria (tabella 4.1), una
misura diretta della capacità delle cellule di respirare.
Figura 4. 3: Spettri dei citocromi respiratori dei ceppi DWW e DWM dopo crescita in terreno YP
addizionato di glucosio 0,5% dopo esaurimento di quest’ultimo. Il picco a 602 nm rappresenta i citocromi
aa3, facenti parte della citocromo c ossidasi, il picco 560 rappresenta il citocromo b e il picco a 550 nm
rappresenta il citocromo c.
Ceppo
DWW
DWM
Attività respiratoria (µl/h/mg)
28,8
29,0
Tabella 4. 1 Attività respiratoria dei ceppi DWW e DWM. L’attività è espressa per microlitro di ossigeno
consumato per ora per milligrammo di peso secco di cellule. I valori sono le medie di due esperimenti
indipendenti.
Come mostrato, i due ceppi non presentano differenze per quanto riguarda la struttura e la
funzione respiratoria.
La polimerasi γ è presente in quantità limitante nel mitocondrio in quanto è stato osservato
che la corretta replicazione del mtDNA dipende dal dosaggio genico di MIP1. E’ stato infatti
rilevato un accumulo di circa il 45% di mutanti petite in un ceppo diploide MIP1/∆mip1
cresciuto a 37°C (Lecrenier and Foury, 1995). Per stabilire se anche a 28°C la corretta
replicazione del mtDNA dipendesse dal gene dosage, è stata determinata la frequenza di
petite dopo quindici generazioni in terreno YPD a questa temperatura. Mentre il ceppo DWW
presenta una frequenza pari allo 0,5%, il ceppo DWM presenta una frequenza pari all’1.6%,
indicativa di una maggiore instabilità del DNA mitocondriale e pertanto di una dipendenza dal
dosaggio genico.
4.1.3 Clonaggio del gene MIP1
Per introdurre le mutazioni equivalenti alle mutazioni patologiche in MIP1, nonché per
ottenere un ceppo aploide deleto in MIP1 ma rho+, è stato necessario clonare il gene MIP1. Il
gene è stato clonato nel plasmide centromerico di S. cerevisiae pFL38, che ha come marcatore
91
4. Risultati (I parte)
il gene URA3. Il clonaggio è stato condotto amplificando una regione di 5110 bp
comprendente la regione codificante di MIP1 più la regione a monte e inserendo il frammento
entro i siti SacI-SalI di pFL38.
4.1.4 Isolamento del ceppo aploide ∆mip1 rho+
Per ottenere un ceppo aploide deleto in MIP1 e rho+ è stato dapprima necessario trasformare il
ceppo diploide DWM con pFL38MIP1, ottenendo così il ceppo DWM/pFL38MIP1. Dopo
sporificazione e dissezione di 10 tetradi, la tetrade 5 era costituita da tre spore vitali, di cui
una sicuramente con il genotipo desiderato. Sui tre aploidi sono state condotte due PCR da
colonia utilizzando i primer MIPF e K2 oppure MIPE e K3 (figura 4.4).
Figura 4. 4: Profilo elettroforetica dei prodotti di amplificazione con i primer MIPE e K3 (lane 1, 3, 5, 7) e
MIPF e K2 (lane 2, 4, 6, 8) delle spore DWM-5A (lane 1, 2), DWM-5B (lane 3, 4) e DWM-5C (lane 5, 6) e
del diploide DWM (lane 7, 8). Tutti i ceppi contenevano il plasmide pFL38/MIP1.
Come mostrato, uno dei ceppi, DWM-5A/pFL38MIP1, mostrava il pattern di bande atteso,
uguale a quello del diploide parentale DWM. Come ulteriore controllo, è stato osservato che,
dopo perdita plasmidica, i singoli cloni del ceppo DWM-5A erano respiratorio deficienti,
indicando che la presenza di MIP1 portato dal plasmide pFL38 è fondamentale per il
mantenimento del DNA mitocondriale.
4.2 Analisi in silico e scelta delle mutazioni
Come detto, il fine dello studio è quello di inserire nel gene MIP1 di S. cerevisiae alcune
mutazioni del gene umano POLG che determinano una o più patologie mitocondriali, e di
utilizzare il lievito come sistema modello, in vivo, per analizzare le eventuali alterazioni dei
fenotipi legati alla stabilità del DNA mitocondriale.
4.2.1 Allineamento di Polg e Mip1p
Per potere introdurre mediante mutagenesi sito-specifica mutazioni in MIP1 equivalenti alle
mutazioni in POLG, si è proceduto inizialmente con l’allineamento delle due sequenze
proteiche, utilizzando il programma ClustalW (figura 4.5).
92
4. Risultati (I parte)
Polg
Mip1
MSRLLWRKVAGATVGPGPVPAPGRWVSSSVPASDPSDGQRRRQQQQQQQQQQQQQPQQPQ 60
MTKLMVR------------------------------SECMLRMVRRRPLRVQFCARWFS 30
*::*: *
.:
: ::: : * .: .
Polg
Mip1
VLSSEGGQLRHNPLDIQMLSRGLHEQIFGQGGE----MPGEAAVRRSVEHLQKHGLWGQP 116
TKKNTAEAPRINPVGIQYLGESLQRQVFGSCGGKDEVEQSDKLMELSKKSLKDHGLWGKK 90
. .. .
* **:.** *...*:.*:**. *
.: :. * : *:.*****:
Polg
Mip1
AVPLPDVELRLPPLYGDNLDQHFRLLAQKQSLPYLEAANLLLQAQLPPKPPAWAWAEGWT 176
TLITDPISFPLPPLQGRSLDEHFQKIGRFNSEPYKSFCEDKFTEMVAR-PAEWLRKPGWV 149
::
:.: **** * .**:**: :.: :* ** . .: :
:. *. *
**.
Polg
Mip1
RYGPEGEAVPVAIPEERALVFDVEVCLAEGTCPTLAVAISPSAWYSWCSQRLVEERYSWT 236
KYVPGMAPVEVAYPDEELVVFDVETLYNVSDYPTLATALSSTAWYLWCSPFICGG----- 204
:* *
.* ** *:*. :*****.
. ****.*:*.:*** *** :
Polg
Mip1
SQLSPADLIPLEVPTGASSPTQRDWQEQLVVGHNVSFDRAHIREQYLIQGSRMRFLDTMS 296
--DDPAALIPLNTLN----------KEQVIIGHNVAYDRARVLEEYNFRDSKAFFLDTQS 252
.** ****:. .
:**:::****::***:: *:* ::.*: **** *
Polg
Mip1
MHMAISGLSSFQRSLWIAAKQGKHKVQPPTKQGQKSQRKARRGPAISSWDWLDISSVNSL 356
LHIASFGLCSRQRPMFMKNNKKKEAEVESEVHPEISIEDYDDP-------WLNVSALNSL 305
:*:* **.* **.::: :: *.
. : : * ..
**::*::***
Polg
Mip1
AEVHRLYVGGPPLEKEPRELFVKGTMKDIRENFQDLMQYCAQDVWATHEVFQQQLPLFLE 416
KDVAKFHCK-IDLDKTDRDFFASTDKSTIIENFQKLVNYCATDVTATSQVFDEIFPVFLK 364
:* :::
*:* *::*..
. * ****.*::*** ** ** :**:: :*:**:
Polg
Mip1
RCPHPVTLAGMLEMGVSYLPVNQN-WERYLAEAQGTYEELQREMKKSLMDLANDACQLLS 475
KCPHPVSFAGLKSLSKCILPTKLNDWNDYLNSSESLYQQSKVQIESKIVQIIKDIVLLKD 424
:*****::**: .:. . **.: * *: ** .::. *:: : :::..:::: :*
* .
Polg
Mip1
G-ERYKEDPWLWDLEWDLQEFKQKKAKKVKKEPATASKLPIEGAGAPGDPMDQEDLGPCS 534
KPDFYLKDPWLSQLDWTTKPLRLTKKG--------------------------------- 451
: * :**** :*:* : :: .*
Polg
Mip1
EEEEFQQDVMARACLQKLKGTTELLPKRPQHLPGHPGWYRKLCPRLDDPAWTPGPSLLSL 594
------------------------VPAKCQKLPGFPEWYRQLFPSKDT-----VEPKITI 482
:* : *:***.* ***:* * *
. :::
Polg
Mip1
QMRVTPKLMALTWDGFPLHYSERHGWGYLVPGRRDNLAKLPTGTTLESAGVVCPYRAIES 654
KSRIIPILFKLSWENSPVIWSKESGWCFNVP----------------------------- 513
: *: * *: *:*:. *: :*:. ** : **
Polg
Mip1
LYRKHCLEQGKQQLMPQEAGLAEEFLLTDNSAIWQTVEELDYLEVEAEAKMENLRAAVPG 714
-------------HEQVETYKAKNYVLADS-----------VSQEEEEIRTHNLGLQCTG 549
*: *::::*:*.
: * * : .**
.*
Polg
Mip1
QPLALTARGGPKDTQPSYHHGNGPYNDVDIPGCWFFKLPHKDGNSCNVGSPFAKDFLPKM 774
---------------------------------VLFKVPHPNGPTFNCTNLLTKSYNHFF 576
:**:** :* : * . ::*.:
:
Polg
Mip1
EDGTLQAGPGGASGPRALEINKMISFWRNAHKRISSQMVV---WLPRSALPRAVIRHPDY 831
EKGVLKSES--ELAHQALQINSSGSYWMSARERIQSQFVVPSCKFPNEFQSLSAKSSLNN 634
*.*.*:: .
. :**:**. *:* .*::**.**:**
:*.. . :.
:
Polg
Mip1
DEEGLYGAILPQVVTAGTITRRAVEPTWLTASNARPDRVGSELKAMVQAPPGYTLVGADV 891
EKTNDLAIIIPKIVPMGTITRRAVENAWLTASNAKANRIGSELKTQVKAPPGYCFVGADV 694
:: . . *:*::*. ********* :*******:.:*:*****: *:***** :*****
Polg
Mip1
DSQELWIAAVLGDAHFAGMHGCTAFGWMTLQGRKSRGTDLHSKTATTVGISREHAKIFNY 951
DSEELWIASLVGDSIFN-VHGGTAIGWMCLEGTKNEGTDLHTKTAQILGCSRNEAKIFNY 753
**:*****:::**: * :** **:*** *:* *..*****:*** :* **:.******
Polg
Mip1
GRIYGAGQPFAERLLMQFNHRLTQQEAAEKAQQMYAATKGLRWYRLSDEGEWLVRELNLP 1011
GRIYGAGAKFASQLLKRFNPSLTDEETKKIANKLYENTKGK------------------- 794
******* **.:** :** **::*: : *:::* ***
Polg
Mip1
VDRTEGGWISLQDLRKVQRETARKSQWKKWEVVAERAWKGGTESEMFNKLESIATSDIPR 1071
---------------------------TKRSKLFKKFWYGGSESILFNKLESIAEQETPK 827
.* . : :: * **:** :******** .: *:
Polg
Mip1
TPVLGCCISRALEPS-AVQEEFMTSRVNWVVQSSAVDYLHLMLVAMKWLFEEFAIDGRFC 1130
TPVLGCGITYSLMKKNLRANSFLPSRINWAIQSSGVDYLHLLCCSMEYIIKKYNLEARLC 887
****** *: :* .
:.*:.**:**.:***.******: :*::::::: ::.*:*
Polg
ISIHDEVRYLVREEDRYRAALALQITNLLTRCMFAYKLGLNDLPQSVAFFSAVDIDRCLR 1190
93
4. Risultati (I parte)
Mip1
ISIHDEIRFLVSEKDKYRAAMALQISNIWTRAMFCQQMGINELPQNCAFFSQVDIDSVIR 947
******:*:** *:*:****:****:*: **.**. ::*:*:***. **** **** :*
Polg
Mip1
KEVTMDCKTPSNPTGMERRYGIPQGEALDIYQIIELTKGSLEKRSQPGP----------- 1239
KEVNMDCITPSNKT------AIPHGEALDINQLLDKSNSKLGKPNLDIDSKVSQYAYNYR 1001
***.*** **** *
.**:****** *::: ::..* * .
Polg
Mip1
-----------------------------------------------------------EPVFEEYNKSYTPEFLKYFLAMQVQSDKRDVNRLEDEYLRECTSKEYARDGNTAEYSLLD 1061
Polg
Mip1
-----------------------------------------------------------YIKDVEKGKRTKVRIMGSNFLDGTKNAKADQRIRLPVNMPDYPTLHKIANDSAIPEKQLL 1121
Polg
Mip1
-----------------------------------------------------------ENRRKKENRIDDENKKKLTRKKNTTPMERKYKRVYGGRKAFEAFYECANKPLDYTLETEK 1181
Polg
Mip1
-----------------------------------------------------------QFFNIPIDGVIDDVLNDKSNYKKKPSQARTASSSPIRKTAKAVHSKKLPARKSSTTNRNL 1241
Polg
Mip1
------------VELERDITISREY 1254
Figura 4. 5: Allineamento della DNA polimerasi γ umana (Polg) e di Mip1. L’allineamento è stato condotto
utilizzando il programma ClustalW al sito http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw mantenendo i valori di
default. In giallo i siti ExoI, ExoII ed ExoIII. In verde i siti PolA, PolB e PolC. In azzurro le due
sostituzioni studiate.
Dall’allineamento emerge che le due sequenze hanno una identità del 31% e una similarità del
43%. L’allineamento è stato necessario per individuare il residuo di Mip1p che occupa la
posizione corrispondente al residuo mutato di Pol γ umana. E’ necessario che i residui siano
conservati nelle due polimerasi, e, in secondo luogo, cadano in uno stretch conservato, per
garantire così la correttezza dell’allineamento.
In questo studio sono state scelte due mutazioni, la mutazione G224A, nel dominio
esonucleasico, e la mutazione Y757C, nel dominio polimerasico. La mutazione G224A
corrisponde alla mutazione umana G268A. Come riportato nell’introduzione, questa
sostituzione cade nel motivo ExoII, coinvolto nella catalisi del processo esonucleasico di
proofreading (figura 4.6), ed è responsabile, associata ad altre mutazioni in trans, a forme di
arPEO. Questa mutazione è stata scelta per tre motivi:
- validare la mutazione, cioè dimostrare che il fenotipo é dovuto alla mutazione G268A;
- verificare che la mutazione sia effettivamente recessiva, poiché avendo a disposizione
solo casi sporadici di pazienti questo non può essere determinato;
- avere a disposizione una mutazione nel dominio esonucleasico al fine di testare
soppressori o sostanze in grado di ridurre l’eventuale mutabilità petite e/o puntiforme.
94
4. Risultati (I parte)
Figura 4. 6: A sinistra l’allineamento del motivo ExoII di Polg umana, di Mip1 e del Klenow fragment. In
verde la glicina 224 di Mip1, corrispondente a Gly418 sul Klenow fragment. A destra la struttura del
motivo ExoII del Klenow fragment, in bianco, associato con DNA a singolo filamento, in rosso; in blu la
glicina 418. La figura è stata elaborata con Rasmol utilizzando la struttura 1kfs del Protein Data Bank.
La mutazione Y757C corrisponde alla mutazione umana Y955C, situata nel dominio
polimerasico. Come detto precedentemente, la mutazione si trova nel motivo PolB, coinvolto
nel riconoscimento e nel legame del dNTP entrante (figura 4.7), ed è associato ad una forma
grave di adPEO. La sostituzione, data la gravità del fenotipo, è una di quelle maggiormente
caratterizzate, in particolare a livello biochimico, come sottolineato nell’introduzione.
Figura 4. 7: A sinistra l’allineamento del motivo PolB di Polg umana, di Mip1 e del Klenow fragment. In
verde la tirosina 757 di Mip1, corrispondente a Tyr955 su hPolg. A destra la struttura predetta del
motivo PolB di hPolg, associato con DNA templato a singolo filamento, col primer e con ddGTP; in blu la
tirosina 955 (da Ponamarev et al., 2002).
4.3 Introduzione delle mutazioni in MIP1 e trasformazione di
Saccharomyces cerevisiae
Le mutazioni G224A e Y757C sono state introdotte nel gene MIP1 mediante mutagenesi sitospecifica, utilizzando il kit “QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis Kit”. Come templato
è stato utilizzato il plasmide pUC19MIP1, ottenuto mediante subclonaggio in pUC19 del gene
MIP1 precedentemente clonato in pFL38. I plasmidi ottenuti sono stati chiamati
95
4. Risultati (I parte)
rispettivamente pUC19mip1G224A e pUC19mip1Y757C. Successivamente i due alleli sono stati
subclonati in pFL38, ottenendo i plasmidi pFL38mip1G224A e pFL38mip1Y757C, e in pFL39,
avente come marcatore TRP1, ottenendo i plasmidi pFL39mip1G224A e pFL39mip1Y757C.
Per studiare l’effetto del mutazioni nel gene MIP1, è necessario l’utilizzo di un background in
cui l’allele selvatico sia assente. Come detto in precedenza, è stato creato il ceppo DWM5A/pFL38MIP1, in cui il locus MIP1 è stato deleto, ma in cui il mantenimento del DNA
mitocondriale è garantito dalla presenza del gene MIP1 sul plasmide pFL38. D’altra parte lo
studio degli effetti delle mutazioni implica che l’allele selvatico venga perso, non prima di
aver inserito nel ceppo l’allele mutato mip1, al fine di evitare la perdita irreversibile
dell’mtDNA. Per l’inserimento degli alleli mutati mip1G224A e mip1Y757C è stata perciò usata
una tecnica di plasmid shuffling, descritta in Materiali e metodi e rappresentata
schematicamente in figura 4.8.
Figura 4. 8: Rappresentazione schematica del plasmid shuffling sul ceppo DWM-5A/pFL38MIP1. X indica
gli alleli MIP1, mip1G224A, mip1Y757C o il plasmide pFL39 vuoto. In grigio il nucleo, contente il plasmide
pFL38MIP1, in nero, e/o il plasmide pFL39X, in rosso. In verde chiaro i mitocondri contenti il DNA
mitocondriale wt, in verde scuro i mitocondri privi di DNA mitocondriale wt.
Dapprima il ceppo DWM-5A/pFL38MIP1 è stato trasformato con i vari alleli su pFL39,
ottenendo
rispettivamente
i
ceppi
DWM-5A/pFL38MIP1/pFL39MIP1,
DWMG224A
Y757C
,
DWM-5A/pFL38MIP1/pFL39mip1
e
DWM5A/pFL38MIP1/pFL39mip1
5A/pFL38MIP1/pFL39, che sono stati privati del plasmide pFL38MIP1 dopo plasmid
shuffling. Dopo la perdita di pFL38MIP1, per quanto concerne lo stato del DNA
mitocondriale, come riportato in figura 4.8 due condizioni erano possibili. Se la polimerasi
mutata fosse stata in grado di replicare correttamente il DNA mitocondriale, le cellule
96
4. Risultati (I parte)
sarebbero state rho+. Al contrario, se la polimerasi mutata non fosse stata in grado di replicare
correttamente il DNA mitocondriale le cellule sarebbero state petite. Pertanto le colonie sono
state saggiate per la crescita su fonte ossidabile. Mentre le colonie contenenti pFL39MIP1 e
pFL39mip1G224A erano respiratorio sufficienti, tutte le colonie contenenti pFL39mip1Y757C e
pFL39 erano respiratorio deficienti. Già dal plasmid shuffling è pertanto emerso che la
polimerasi mutata Mip1Y757C non era in grado di replicare correttamente il DNA
mitocondriale e dunque di mantenere lo stato rho+ delle cellule. Per tutti i ceppi, chiamati
DWM-5A/pFL39MIP1, DWM-5A/pFL39mip1G224A, DWM-5A/pFL39mip1Y757C e DWM5A/pFL39, sono stati analizzati successivamente due cloni.
Per quanto concerne lo studio della dominanza/recessività delle mutazioni, il ceppo diploide
DWM, che possiede una sola copia MIP1, è stato trasformato con i plasmidi pFL38MIP1,
pFL38mip1G224A, pFL38mip1Y757C e pFL38, ottenendo rispettivamente i ceppi eteroallelici
DWM/pFL38MIP1, DWM/pFL38mip1G224A, DWM/pFL38mip1Y757C e DWM/pFL38.
4.4 Analisi fenotipica dei ceppi DWM-5A
L’analisi della funzionalità mitocondriale è stata condotta mediante un’analisi fenotipica al
fine di determinare la capacità dei mitocondri di respirare, la capacità della polimerasi mutata
di mantenere lo stato rho+ delle cellule e di replicare correttamente il DNA mitocondriale.
4.4.1 Spettri dei citocromi e attività respiratoria
Sono stati dapprima determinati gli spettri dei citocromi respiratori dei ceppi DWM-5A
trasformati con i vari alleli mip1 dopo crescita in terreno SC addizionato di glucosio 0,5% ad
esaurimento (allegato 1, figura 1). Come mostrato, il ceppo DWM-5A/pFL39mip1G224A
mostrava uno spettro indistinguibile rispetto a quello del ceppo DWM-5A/pFL39MIP1. Al
contrario il ceppo DWM-5A/pFL39mip1Y757C presentava uno spettro privo dei citocromi aa3 e
b, codificati parzialmente (aa3) o totalmente (b) dal DNA mitocondriale, mentre il picco del
citocromo c, codificato dal DNA nucleare, era normale.
E’ inoltre stata misurata l’attività respiratoria dei diversi ceppi DWM-5A (tabella 4.2)
Ceppo DWM-5A/ Attività respiratoria (µl/h/mg) % rispetto a pFL39MIP1
PFL39MIP1
26,4
100
G224A
pFL39mip1
26,1
98,9
pFL39mip1Y757C
0,61
2,3
PFL39
0,68
2,6
Tabella 4. 2: Attività respiratoria dei ceppi DWM-5A/pFL39MIP1, DWM-5A/pFL39mip1G224A, DWM5A/pFL39mip1Y757C e DWM-5A/pFL39. L’attività è espressa per microlitro di ossigeno consumato per ora
per milligrammo di peso secco di cellule. I valori sono le medie di due esperimenti indipendenti su due
cloni indipendenti.
Come mostrato in tabella, il ceppo DWM-5A/pFL39mip1G224A possiede un’attività
respiratoria non significativamente differente rispetto al ceppo DWM-5A/pFL39MIP1. Al
contrario il ceppo DWM-5A/pFL39mip1Y757C presenta un’attività respiratoria quasi nulla. Il
97
4. Risultati (I parte)
consumo di ossigeno residuo è dovuto ad altre attività, ad esempio ossigenasiche, come
dimostrato dal fatto che il consumo residuo si osservava anche nel ceppo DWM-5A/pFL39
sicuramente rho0 e dunque privo di attività respiratoria.
4.4.2 Determinazione della frequenza dei petite
In lievito, è facile valutare se mutazioni patologiche inserite in MIP1 causano la delezione
dell’mtDNA, misurando la frequenza dei petite. In particolare abbiamo determinato la
frequenza dei petite dei ceppi DWM-5A/pFL39MIP1 e DWM-5A/pFL39mip1G224A a 28°C
(tabella 4.3) e a 36°C (tabella 4.3 e allegato 1, figura 2 A). La determinazione a 36°C è stata
condotta per amplificare le differenze, poiché è noto che ad alte temperature i ceppi
producono una maggiore percentuale di cloni petite.
Ceppo DWM-5A/ Frequenza dei petite a 28°C Frequenza dei petite a 36°C
%
Incremento
%
Incremento
PFL39MIP1
1,9
1,0
9
1,0
pFL39mip1G224A
4,2
2,2
21
2,3
Tabella 4. 3: Frequenza e incremento dei petite nei ceppi DWM-5A/pFL39MIP1 a DWM5A/pFL39mip1G224A a 28°C e a 36°C. La deviazione standard è inferiore in tutti i casi al 15%.
A entrambe le temperature la presenza della mutazione G224A ha causato un incremento
della frequenza dei petite di circa 2,2 volte rispetto al wt. Le frequenze risultavano, come
atteso, più alte a 36°C (tabella 4.3).
4.4.3 Determinazione della natura dei petite
I petite ottenuti possono essere rho- oppure rho0. Fra le varie tecniche a disposizione per
determinare la natura dei petite è stata utilizzata la tecnica dell’incrocio con mutanti tester mitdi sesso opposto, come descritto nell’introduzione. Incrociando un ceppo petite e un ceppo
mit- si ottiene un diploide che può essere respiratorio sufficiente o deficiente, come riportato
in figura 4.9. In particolare se il ceppo petite da testare è rho-, in seguito a fusione dei
mitocondri derivanti dai due ceppi e ricombinazione, molto frequente nel DNA mitocondriale
di lievito, si otterrà un diploide respiratorio sufficiente, purché la regione di mtDNA presente
nel rho- comprenda la regione che, nel mit-, è mutata. Al contrario, se il ceppo petite da
testare, è rho0, non avverrà alcuna ricombinazione e il ceppo diploide sarà respiratorio
deficiente. Per avere un’elevata confidenza che un ceppo sia effettivamente rho- è necessario
incrociarlo con diversi mit-, così da avere un elevata garanzia che venga coperto gran parte del
DNA mitocondriale.
98
4. Risultati (I parte)
Figura 4. 9: Rappresentazione schematica dell’incrocio fra ceppi rho- e ceppi tester mit-.
In particolare, i cloni petite precedentemente ottenuti sono stati incrociati con quattro ceppi
mit- di sesso opposto, mutati rispettivamente in due esoni del gene COB (chiamate cob1 e
cob2), nel gene COX2 e nel gene COX3 e scelti perché queste regioni sono maggiormente
conservate mantenute nei rho- originatesi spontaneamente (Fukuhara and Wesolowski, 1977;
Mathews et al., 1977). Per ogni ceppo sono stati saggiati almeno 200 cloni fra quelli cresciuti
a 36°C. Sono stati anche testati 200 cloni del ceppo DWM-5A/pFL39mip1Y757C ottenuti
direttamente dopo perdita plasmidica su 5-FOA del gene MIP1 selvatico (tabella 4.4 e
allegato 1, tabella 1).
Ceppo DWM-5A/ Frequenza dei rho0 tra i petite
PFL39MIP1
46%
G224A
pFL39mip1
44%
Y757C
pFL39mip1
100%
Tabella 4. 4: Frequenza dei rho0 tra i petite. L’esperimento è stato condotto incrociando almeno 200 cloni
per ceppo.
Dalla tabella emergono due chiare evidenze:
99
4. Risultati (I parte)
la polimerasi mutata Mip1Y757C non è in grado di replicare il DNA mitocondriale,
essendo tutti i cloni petite privi di mtDNA
- la presenza della mutazione G224A non incrementa la frequenza dei rho0 tra i petite,
dimostrando che la mutazione G224A non è associata ad un aumento della deplezione
di mtDNA.
Per confermare che i cloni valutabili come rho0 in base agli esperimenti di incrocio con in
mutanti mit- fossero effettivamente privi di mtDNA, i cloni petite precedentemente ottenuti
sono stati analizzati mediante altre due tecniche che permettono la distinzione fra rho- e rho0,
il DAPI staining dell’mtDNA e il Southern blot sul DNA mitocondriale. Per quanto concerne
il DAPI staining, 50 cloni petite, dei quali 10 risultati rho- e 40 risultati rho0, sono stati
incubati in presenza di DAPI, che si lega preferenzialmente, soprattutto a basse
concentrazioni, al DNA mitocondriale. Mentre i cloni rho+ di controllo presentavano cellule
per lo più contenenti DNA mitocondriale e i cloni rho0 mostravano un segnale solo
proveniente dal nucleo, i cloni rho- mostravano una percentuale variabile fra il 10% e il 50%
in cui il DNA mitocondriale era visibile (figura 4.10).
-
Figura 4. 10: DAPI staining di un clone rho+ (a sinistra), rho0 (al centro) e rho- (a destra).
Dei 40 cloni presunti rho0, una percentuale del 92% non mostrava effettivamente la presenza
di DNA mitocondriale, dimostrando che l’incrocio con i ceppi mit- utilizzati era stato efficace
per distinguere la natura dei petite.
Come ulteriore controllo, su 20 cloni rho0 è stato condotto un’analisi Southern sul DNA
mitocondriale digerito con EcoRV. Come sonda è stato utilizzato un oligonucleotide situato
all’interno delle origini di replicazione dell’mtDNA di S. cerevisiae. La maggior parte dei rhopossiede almeno un’origine di replicazione, su cui può ibridare la sonda. Una percentuale pari
al 90% (18 cloni su 20) si è dimostrata effettivamente essere rho0, confermando ulteriormente
la bontà del test precedentemente utilizzati. Il Southern blot su 10 dei 25 cloni e su opportuni
controlli è riportato nell’allegato 1, figura 3.
100
4. Risultati (I parte)
4.4.4 Determinazione della mutabilità puntiforme del DNA mitocondriale
Successivamente è stato determinato se le mutazione G224A incrementasse la mutabilità
puntiforme del DNA mitocondriale. La mutabilità puntiforme è stata determinata mediante
misurazione della frequenza di mutanti resistenti all’antibiotico eritromicina (mutanti EryR).
La resistenza all’eritromicina è dovuta a specifiche mutazioni in tre posizioni del gene
mitocondriale codificante l’RNA ribosomale 21S (GAA, nucleotidi 59965-59967 sulla mappa
dell’mtDNA dell’SGD database http://www.yeastgenome.org/) (Sor and Fukuhara, 1984). In
particolare è stato osservato che la presenza della mutazione G224A incrementava la
frequenza EryR di circa 10 volte (allegato 1, tabella 2).
4.5 Studio della dominanza/recessività delle mutazioni G224A e
Y757C
Per stabilire la dominanza/recessività delle mutazioni sono stati costruiti i ceppi eteroallelici
DWM/pFL38MIP1, DWM/pFL38mip1G224A, DWM/pFL38mip1Y757C e DWM/pFL38 e su di
essi è stata condotta la stessa analisi fenotipica condotta sui ceppi aploidi DWM-5A.
I ceppi non mostravano alcuna differenza per quanto concerneva la crescita su fonti ossidabili,
i profili dei citocromi respiratori e l’attività respiratoria (dati non mostrati).
E’ stata misurata la frequenza dei petite, riportata in tabella 4.5 e in allegato 1, figure 2 B e 4
B. La misurazione è stata condotta anche sul ceppo contenente una sola copia di MIP1 per
stabilire il tipo di recessività.
Ceppo DWM/
pFL38MIP1
pFL38mip1G224A
pFL38mip1Y757C
pFL38
%
0,9
1,0
8,1
2,5
28°C
Incremento %
1,0
1,5
1,1
2,0
9,0
32,1
2,8
8,0
36°C
Incremento
1,0
1,3
21,4
5,3
Tabella 4. 5: Frequenza dei petite a 28°C e a 36°C nei ceppi DWM/pFL38MIP1, DWM/pFL38mip1G224A,
DWM/pFL38mip1Y757C e DWM/pFL38. L’incremento si riferisce al ceppo DWM/pFL38MIP1.
Dai dati sono emerse diverse osservazioni:
1) Il ceppo recante due copie di MIP1 produceva meno petite rispetto al ceppo con una
sola copia di MIP1, sia a 28°C che a 36°C, a . Questo conferma che la polimerasi
mitocondriale è prodotta in quantità limitante.
2) Il ceppo eteroallelico DWM/pFL38mip1G224A presentava una frequenza di petite non
significativamente diversa dal ceppo DWM/pFL38MIP1, indicando che la mutazione
G224A è recessiva e che inoltre la polimerasi mutata mantiene gran parte della sua
attività, essendo i valori inferiori a quelli del ceppo DWM/pFL38.
3) La mutazione Y757C è dominante. La frequenza dei petite del ceppo
DWM/pFL38mip1Y757C non solo è superiore a quella del ceppo DWM/pFL38MIP1,
101
4. Risultati (I parte)
ma anche a quella del ceppo DWM/pFL38, mostrando così una chiara interferenza
della polimerasi mutata con la polimerasi selvatica nella replicazione dell’mtDNA.
4) La mutazione Y757C determina termosensibilità, essendo l’incremento della
frequenza dei petite superiore a 36°C rispetto a 28°C.
Per quanto concerne la determinazione della natura dei petite, in questo caso non può essere
utilizzata direttamente la tecnica dell’incrocio con i mit-, in quanto i ceppi DWM sono
diploidi. Per ovviare a questo problema, l’analisi dei petite è stata condotta su ceppi aploidi
W303-1B trasformati con i plasmidi pFL38MIP1 e pFL38mip1Y757C. La determinazione della
frequenza dei petite è stata fatta solo per la mutazione Y757C in quanto la mutazione G224A
si è dimostrata recessiva.
In primo luogo i ceppi aploidi W303-1B/pFL38MIP1 e W303-1B/pFL38mip1Y757C
presentavano frequenze di petite del tutto simili a quelle, rispettivamente, dei ceppi diploidi
DWM/pFL38MIP1 e DWM/pFL38mip1Y757C, segno che la frequenza dei petite è scarsamente
influenzata dalla ploidia, cioè dalla presenza di una copia oppure di due copie di genomi
(allegato 1, figura 2 B e tabella 1). Si è potuto procedere pertanto alla analisi dei rho0,
incrociando almeno 200 cloni petite dei ceppi W303-1B/pFL38MIP1 e W3031B/pFL38mip1Y757C ottenuti in precedenza dopo analisi a 36°C con ceppi mit-. I valori sono
riportati in tabella 4.6 e in allegato 1, tabella 1.
Ceppo W303-1B/ Frequenza dei rho0 tra i petite
PFL38MIP1
26%
pFL38mip1Y757C
51%
Tabella 4. 6: Frequenza dei rho0 tra i petite. L’esperimento è stato condotto incrociando almeno 200 cloni
per ceppo.
Come è possibile osservare dalla tabella, la presenza della mutazione Y757C non solo portava
ad un incremento delle delezioni, ma induceva anche una maggiore perdita dell’mtDNA,
mostrando un valore doppio di colonie rho0 rispetto al ceppo contenente l’allele selvatico.
Infine sui ceppi DWM è stata determinata la frequenza dei mutanti EryR. I valori sono
riportati in allegato 1, tabella 2. Come è possibile osservare, la mutazione G224A si comporta
come una mutazione recessiva, in quanto il ceppo eteroallelico DWM/pFL38mip1G224A
mostrava una frequenza simile a quella del ceppo contenente due copie di MIP1. Al contrario
la mutazione Y757C si comporta come una mutazione dominante, in quanto il ceppo
eteroallelico DWM/pFL38mip1Y757C mostrava una frequenza di mutanti EryR 11 volte
superiore al ceppo contenente due copie di MIP1 e 3,5 volte superiore al ceppo contenente
una sola copia di MIP1.
4.6 Rescue genetico del fenotipo: incremento dei dNTP pool
La seconda parte di questo studio si è concentrata sulla ricerca di geni o di sostanze in grado
di ridurre gli effetti deleteri sulla stabilità mitocondriale delle mutazioni G224A e Y757C.
Questi esperimenti di rescue hanno una doppia finalità:
102
4. Risultati (I parte)
1) Aiutare, attraverso i meccanismi con cui agiscono i geni o le sostanze saggiate, a
comprendere i meccanismi con cui le mutazioni patologiche portano a delezioni e/o
deplezione dell’mtDNA.
2) Gettare le basi per successivi esperimenti di rescue in organismi superiori, con la
finalità di progettare opportuni trattamenti delle malattie.
In particolare è stato saggiato se l’aumento dei dNTP pool mitocondriali portasse ad una
riduzione della mutabilità petite o puntiforme. L’incremento dei dNTP pool è stato ottenuto in
due modi complementari: overesprimendo il gene RNR1 è distruggendo il gene SML1. Come
riportato nell’introduzione, il gene RNR1 codifica per la subunità catalitica della
ribonucleotide reduttasi, che catalizza lo step limitante nella sintesi dei dNTP. In particolare è
stato precedentemente dimostrato che l‘overespressione di RNR1 incrementa il pool
nucleotidico, sia citosolico che mitocondriale. Un effetto analogo è stato ottenuto mediante la
delezione del gene SML1, codificante un inibitore della proteina Rnr1.
4.6.1 Effetto dell’overespressione del gene RNR1
Dapprima i ceppi DWM-5A trasformati con gli alleli MIP1 wt e mip1G224A sono stati
trasformati col plasmide pWJ841, un plasmide multicopia derivante dal plasmide pRD425 al
cui interno è stato clonato il gene RNR1. Sui ceppi trasformati è stata determinata, utilizzando
come controlli gli stessi ceppi contenenti il plasmide pRS426 vuoto, la frequenza di petite e di
rho0 a 36°C (allegato 1, tabella 1 e figura 1.4 A). Come mostrato in figura, l’overespressione
di RNR1 ha ridotto di circa 6 volte la percentuale dei petite in entrambi i ceppi. Inoltre
l’overespressione di RNR1 ha ridotto la frequenza di rho0 dal 44% al 32% nel ceppo
contenente l’allele selvatico e dal 44% al 34% nel ceppo contenente l’allele mip1G224A.
Inoltre sono stati trasformati col plasmide pWJ841 i ceppi diploidi DWM recanti i diversi
alleli mip1 e, per la determinazione della frequenza dei rho0, i ceppi aploidi W303-1B recanti i
diversi alleli mutanti (come nel caso precedente le differenze fra le frequenze dei petite nei
ceppi diploidi e aploidi sono risultate non significative). La frequenza di petite e di rho0 a
36°C per i vari ceppi sono riportati in allegato 1, tabella 1 e figura 4 B. Come mostrato,
l’overespressione di RNR1 ha ridotto la frequenza dei petite di circa 3 volte,
indipendentemente dalla presenza, sul plasmide pFL38, dell’allele selvatico, o delle due
varianti mutate. Invece, l’overespressione di RNR1 ha ridotto dal 51% al 35% la frequenza di
rho0 tra i petite nel ceppo W303-1B/pFL38mip1Y757C, mentre la riduzione non è significativa
nel ceppo W303-1B/pFL38MIP1.
4.6.2 Effetto della delezione del gene SML1
Come ulteriore conferma che l’incremento dei dNTP pool sia responsabile di una riduzione
della frequenza di delezioni nell’mtDNA, sono stati analizzati gli effetti sulla mutabilità
mitocondriale della delezione del gene SML1.
Dapprima è stato necessario creare un ceppo aploide deleto in MIP1 e in SML1, ma rho+. Il
ceppo è stato ottenuto incrociando il ceppo OF1 (∆mip1) con un ceppo isogenico a W3031A, ma deleto in SML1 con la cassetta HIS3, gentilmente messoci a disposizione da Rodney
103
4. Risultati (I parte)
Rothstein. Dalla sporificazione del diploide YO81 è stata ottenuta una spora ∆mip1 ∆sml1
(rho0), chiamata YO81-4B, e due spore MIP1 ∆sml1, chiamata YO81-3A e YO81-5D.
Il ceppo YO81-4B era deleto in entrambi i geni, ed era rho0, per cui non poteva direttamente
essere utilizzato per l’analisi della funzionalità mitocondriale. Per ottenere un ceppo ∆mip1
∆sml1 rho+, il ceppo YO81-3A è stato trasformato col plasmide pFL38MIP1 e incrociato con
YO81-4B. Il diploide così ottenuto, DYY/pFL38MIP1 è stato fatto sporificare, ottenendo la
spora DYY-4C/pFL38MIP1 (∆mip1 ∆sml1 rho+).
Il ceppo è DYY-4C/pFL38MIP1 è stato trasformato con i plasmidi pFL39 contenenti i vari
alleli e, come controllo, col plasmide pFL39, ottenendo i ceppi DYYDYY4C/pFL38MIP1/pFL39MIP1,
DYY-4C/pFL38MIP1/pFL39mip1G224A,
Y757C
4C/pFL38MIP1/pFL39mip1
e DYY-4C/pFL38MIP1/pFL39. Come per i corrispettivi
ceppi DWM-5A, è stata indotta la perdita del plasmide pFL38MIP1, ottenendo i ceppi DYY4C/pFL39MIP1, DYY-4C/pFL39mip1G224A, DYY-4C/pFL39mip1Y757C e DYY-4CpFL39. In
primo luogo è stato osservato che tutte le colonie del ceppo DYY-4C/pFL39mip1Y757C erano
petite, da cui è emerso che l’attività della polimerasi Mip1Y757C non era sufficiente a replicare
l’mtDNA neanche in presenza di un aumento del pool nucleotidico.
Sui ceppi DYY-4C/pFL39MIP1 DYY-4C/pFL39mip1G224A sono state determinate le
frequenze dei petite e dei rho0 a 36°C, riportate in allegato 1, tabella 1 e figura 4 A. Come
mostrato, si osserva nuovamente una riduzione della frequenza dei petite e dei rho0, del tutto
paragonabile a quella ottenuta per i ceppi che overesprimevano RNR1.
L’analisi sui ceppi eteroallelici è stata ottenuta utilizzando il ceppo DYY (MIP1/∆mip1
∆sml1/∆sml1) trasformato con i plasmidi pFL38 recanti i diversi alleli mip1 e il plasmide
vuoto. La frequenza dei petite a 36°C, riportata in allegato 1, figura 4 B, è risultata essere
paragonabile a quella ottenuta per i ceppi diploidi overesprimenti RNR1. Un’eccezione è
costituita dal ceppo recante l’allele mip1Y757C, che, in presenza della delezione del gene SML1,
presenta una riduzione doppia rispetto a quella ottenuta con l’overespressione di RNR1.
Anche la frequenza dei rho0, condotta nel ceppo aploide YO81-5D (MIP1 ∆sml1), non ha
mostrato differenze rispetto ai ceppi W303-1B overesprimenti RNR1.
Sui ceppi deleti in SML1 è stata anche determinata la frequenza dei mutanti EryR. Come è
possibile osservato in allegato 1, tabella 2, la delezione del gene SML1 non riduceva la
frequenza dei mutanti EryR. L’unica accezione è rappresentata dal ceppo DYY recante l’allele
mip1Y757C, per il quale si osserva una riduzione di circa due volte della mutabilità puntiforme.
4.7 Rescue chimico del fenotipo: trattamento con l’antiossidante
acido diidrolipoico
E’ noto che il DNA mitocondriale è soggetto all’azione di agenti ossidanti, in particolare
specie reattive dell’ossigeno (ROS) quali l’acqua ossigenata, l’anione superossido e il radicale
ossidrile che si formano come prodotti della riduzione parziale dell’ossigeno durante la
respirazione a livello della membrana interna. Il DNA mitocondriale, essendo attaccato alla
membrana interna tramite proteine del nucleoide, è molto vulnerabile all’azione dei ROS,
104
4. Risultati (I parte)
come sottolineato nell’introduzione. In particolare, danni ossidativi sull’mtDNA hanno come
conseguenza finale riarrangiamenti dell’mtDNA o la perdita dell’mtDNA (reviewed in Stuart
and Brown, 2006). Per valutare se l’incremento delle delezioni dell’mtDNA in presenza degli
alleli mutati mip1 fosse in parte dovuta all’azione dei ROS, ceppi aploidi e diploidi contenenti
i vari alleli sono stati trattati con l’acido diidrolipoico. L’acido diidrolipoico è uno scavenger
dei ROS, è in grado cioè di ridurre, ossidandosi, le specie reattive a specie ridotte non
tossiche.
L’acido diidrolipoico è formato da una catena di otto atomi di carbonio, fra cui il carbonio 6 e
8 legano gruppi tiolici. L’acido diidrolipoico è coinvolto in processi di ossidoriduzione. Infatti
i gruppi tiolici dell’acido diidrolipoico, donando due elettroni e due protoni, possono ossidarsi
formando un legame disolfuro e di conseguenza un anello a cinque termini chiamato anello
ditiolato. La forma ossidata dell’acido diidrolipoico è chiamata acido α-lipoico, o acido
lipoico (figura 4.11).
Figura 4. 11: struttura dell’acido lipoico e diidrolipoico.
Il processo è ciclico, infatti, in presenza di un agente meno ossidante, l’acido lipoico può
ossidare il composto accettando due atomi di idrogeno, e ritornare alla forma ridotta acido
diidrolipoico. Come scavenger dei ROS, l’acido diidrolipoico può ridurre diverse specie
radicaliche, fra cui radicali perossidi, idrossilici, superossidi e idroperossidi.
Per testare la capacità dell’acido diidrolipoico di ridurre la mutabilità petite, durante la
crescita per 15 generazioni in terreno SC addizionato di glucosio 2%, i vari ceppi recanti gli
alleli mutati mip1 sono stati trattati con acido diidrolipoico 30 µM.
Nei ceppi aploidi, si è osservato che la presenza di acido diidrolipoico riduceva di circa 6
volte la frequenza di petite nel ceppo recante l’allele mutato mip1G224A. Anche nel ceppo
105
4. Risultati (I parte)
recante l’allele selvatico si osservava una riduzione della frequenza di petite, ma soltanto di
circa 3 volte (allegato 1, figura 5 A).
Anche nei ceppi diploidi si osservava, in tutti i casi, una riduzione della frequenza dei petite.
La riduzione maggiore, pari a circa 6 volte, si osservava per il ceppo recante l’allele
mip1Y757C.
4.8 Discussione
Nel presente lavoro sono state introdotte in MIP1 due mutazioni equivalenti a mutazioni
patologiche in POLG causanti forme di PEO.
La mutazione G224A equivale alla mutazione umana G268A. L’allele G268A è stato trovato
per la prima volta in un soggetto omozigote per questo allele, che presentava un fenotipo
caratterizzato da PEO con retinopatia pigmentosa e amenorrea, e da delezioni multiple e
mutazioni puntiformi nell’mtDNA (Del Bo et al., 2003). Nei fibroblasti isolati dal paziente si
riscontrava un numero di mutazioni puntiformi significativamente più alto sia nel D-loop che
nelle regioni codificanti dell’mtDNA. Il carico di mutazioni inoltre era superiore non solo ai
controlli recanti un allele selvatico, ma anche a cellule di pazienti recanti mutazioni nel
dominio polimerasico di Polg. Sulla base di questa osservazione i ricercatori concludevano
che, almeno per mutazioni nel dominio esonucleasico, riarrangiamenti e delezioni
dell’mtDNA erano mediati da un incremento di mutazioni puntiformi, secondo il modello
dello strand slippage descritto nell’introduzione (Ponamarev et al., 2002). Il soggetto era
omozigote per l’allele G268A, facendo supporre che la mutazione fosse recessiva, sebbene
non ve ne fosse la certezza visto che non era disponibile la storia familiare del paziente.
Inoltre tale mutazione è stata osservata in un paziente, con PEO sporadica, eterozigote
G268A/A467T, facendo supporre nuovamente che la mutazione fosse recessiva (Di Fonzo et
al., 2003). Infine, la mutazione è stata identificata in un paziente affetto da PEO, che,
contrariamente ai casi precedenti, era caratterizzato dalla presenza della mutazione G268A in
eterozigoti senza altre mutazioni (Gonzalez-Vioque et al., 2006).
Dal nostro studio emerge chiaramente che la sostituzione equivalente in MIP1, G224A,
incrementa sia la frequenza di delezioni sia la frequenza di mutazioni puntiformi dell’mtDNA.
In particolare si osserva un aumento della frequenza di mutanti EryR rispetto al wt di circa 10
volte. Questo incremento può essere attribuito a una ridotta attività esonucleasica della
polimerasi Mip1G224A. In primo luogo la mutazione cade in uno stretch molto conservato del
dominio esonucleasico, il motivo ExoII. Questo motivo è presente e conservato anche negli
altri membri della classe A delle polimerasi, come ad esempio la polimerasi I di E. coli. In
secondo luogo, la sostituzione G224D è stata identificata come mutazione che conferisce un
fenotipo alto mutatore, incrementando la frequenza di mutanti EryR di circa 270 volte (Hu et
al., 1995).
Alla mutazione G224A è associato inoltre un incremento di circa 2,5 volte della frequenza di
mutanti petite sia a 28°C che a 36°C, cui peraltro non è associato un incremento della perdita
dell’mtDNA. Sulla base di precedenti osservazioni, è possibile ipotizzare che l’accumulo di
106
4. Risultati (I parte)
delezioni sia mediato dall’incremento delle mutazioni puntiformi, in accordo con il modello
dello strand slippag, come precedentemente ipotizzato. Questa ipotesi è pero contrastata dal
fatto che un incremento del pool nucleotidico riduce in maniera altamente significativa
l’accumulo di delezioni mentre non riduce la frequenza di mutazioni puntiformi. I nostri
risultati pertanto sono in accordo con i dati di Wanrooij e collaboratori che mostrano
chiaramente che non vi è correlazione fra mutazioni puntiformi e delezioni, ma che piuttosto
le delezioni siano mediate da altri meccanismi, quali ad esempio uno stallo della polimerasi
durante la replicazione (Wanrooij et al. 2004).
Le delezioni indotte dalla presenza della mutazione G224A sono ridotte sia da un incremento
dei dNTP pool che dal trattamento con l’antiossidante acido diidrolipoico. Nel primo caso, la
riduzione delle delezioni può essere interpretato come un aumento dell’attività cinetica, cioè
della velocità con cui la polimerasi catalizza l’allungamento del DNA, dovuto ad un aumento
del suo substrato. Il trattamento con acido diidrolipoico riduce di circa 6 volte la frequenza dei
mutanti petite, contro le circa 3 volte in presenza dell’allele MIP1 selvatico, mostrando come
il danno ossidativo sia importante nella comparsa di delezioni.
La mutazione G224A è recessiva, per quanto concerne sia la mutabilità puntiforme che quella
estesa. In particolare le frequenze dei mutanti nel diploide eteroallelico MIP1/mip1G224A
risultano uguali a quelle del diploide omoallelico MIP1/MIP1 e inferiori a quello del diploide
MIP1/∆mip1. La ridotta frequenza dei mutanti petite rispetto al ceppo emizigote dimostra
come la polimerasi mutata Mip1G224A mantenga gran parte della sua attività. La frequenza
ridotta dei mutanti EryR è indicativa di una complementazione ad opera dell’allele selvatico
ed è dovuto probabilmente alla capacità della polimerasi selvatica di correggere gli errori non
corretti dalla polimerasi mutata.
La mutazione Y757C equivale alla mutazione umana Y955C, cui è associato il fenotipo più
grave di PEO autosomica dominante. La mutazione Y955C è stata la prima mutazione in
POLG identificata come causa di patologie mitocondriali (Van Goethem et al., 2001).
Successivamente è stata identificata in cinque famiglie i cui soggetti presentavano un grave
fenotipo di adPEO (Lamantea et al., 2002). Studi recenti hanno dimostrato che la mutazione
Y955C é associata ad altre patologie, fra cui PEO associata a parkinsonismo, menopausa
prematura e ipogonadismo in quattro famiglie si diversa origine (Luoma et al., 2006; Melberg
et al., 2005; Pagnamenta et al., 2006).
Sono stati condotti diversi esperimenti per chiarire i meccanismi attraverso cui agisce la
mutazione Y955C, sia in silico sia in vitro sia in vivo, come già riportato nell’introduzione. Il
residuo Y955 è situato nel motivo PolB e studi di modeling hanno dimostrato come questa
regione formi una tasca idrofobica a livello della quale avviene il riconoscimento e il legame
del dNTP entrante (Ponamarev et al., 2002; Graziewicz et al., 2004). I risultati degli studi in
vitro sono già stati discussi nell’introduzione (Ponamarev et al., 2002; Graziewicz et al.,
2004). I nostri risultati, in accordo con quelli di Stuart et al., 2006 hanno dimostrato
chiaramente che la mutazione Y757C in Mip1 è incompatibile con una corretta replicazione
dell’mtDNA: la presenza della sola polimerasi Mip1Y757C determina infatti la deplezione
107
4. Risultati (I parte)
totale dell’mtDNA. Questo risultato non è sorprendente vista la ridotta attività catalitica della
polimerasi umana mutata. Ovviamente la perdita totale dell’mtDNA impedisce ogni ulteriore
analisi sugli effetti della mutazione in un contesto aploide. Gli effetti della mutazione sono
stati pertanto studiati in un contesto eteroallelico, da cui è emerso chiaramente come la
mutazione sia dominante, per quanto concerne sia la frequenza di delezioni e la perdita di
mtDNA, sia la frequenza di mutazioni puntiformi.
In primo luogo, il diploide eteroallelico MIP1/mip1Y757C mostra un incremento di circa 12
volte della mutabilità EryR rispetto al diploide selvatico e di circa 3 volte rispetto al diploide
emizigote. Sulla base delle osservazioni precedenti, questo incremento è dovuto
probabilmente ad un effetto diretto. La polimerasi mutata, pur avendo un’attività ridotta,
potrebbe inserire nucleotidi sbagliati, incrementando così la frequenza delle sostituzioni. In
particolare, l’incremento potrebbe essere così elevato da non essere complementato, come per
la polimerasi Mip1G224A, dalla polimerasi selvatica, spiegando così la dominanza del fenotipo.
Le mutazioni potrebbero essere però dovute anche ad un effetto indiretto causato da danni
ossidativi. Stuart et al., 2006 hanno infatti osservato in lievito che la mutazione Y757C
determina in eterozigosi un forte incremento del danno ossidativo sull’mtDNA. Inoltre,
utilizzando il topo come sistema modello, è stato dimostrato che la polimerasi recante la
mutazione Y955C determina un incremento di tre volte del contenuto di 8oxodeossiguanidina (8-oxo-dG) nell’mtDNA (Lewis et al., 2007). Danni ossidativi sul DNA
vengono spesso convertiti in mutazioni puntiformi dai processi di riparazione error prone.
Inoltre è stato recentemente dimostrato che la polimerasi recante la mutazione Y955C
incrementa in vitro l’incorporazione di 8-oxo-dG nell’mtDNA, nonché l’appaiamento a
residui di 8-oxo-dG presenti nel templato di adenosina, mediante appaiamento di tipo
Hogsteen (Graziewicz et al., 2007).
In secondo luogo il diploide eteroallelico mostra un incremento della frequenza di petite di
circa 9 e 22 volte, rispettivamente a 28°C e a 36°C. Diversi meccanismi possono spiegare
l’incremento di delezioni. Le delezioni potrebbero essere mediate da mutazioni puntiformi.
Questo meccanismo sembra però improbabile in quanto la delezione di SML1 nel diploide
eteroallelico riduce di due volte la frequenza di mutanti EryR ma di 8 volte della frequenza di
mutanti petite. Come ipotizzato da Graziewicz et al., 2004, è probabile che l’incremento di
delezioni sia mediato da uno stallo della replicazione in corrispondenza della forca replicativa,
dovuto a sua volta alla forte riduzione dell’attività catalitica della polimerasi. Lo stallo
potrebbe determinare un incremento di delezioni e anche della perdita di mtDNA attraverso
diversi meccanismi. Lo stallo della replicazione:
- potrebbe determinare un’interruzione prematura della replicazione, che potrebbe
promuovere una ricombinazione intramolecolare illegittima attraverso strand invasion,
che porterebbe alla formazione di molecole delete.
- potrebbe lasciare il DNA per maggiore tempo a singolo filamento in corrispondenza
della forca di replicazione. E’ noto che il DNA a singolo filamento è soggetto a danni
ossidativi indotti dai ROS 1000 volte di più rispetto al DNA a doppio filamento
(Frederico et al., 1990). E’ noto inoltre che l’accumulo di basi ossidate porta ad un
108
4. Risultati (I parte)
incremento del danno esteso del DNA, quale riarrangiamenti e delezioni, che culmina
nella perdita dell’mtDNA (Wallace, 2001; Wei and Lee, 2002; Wallace, 2005;
Doudican et al., 2005; Van Houten et al., 2006). Un coinvolgimento del danno
ossidativo ad opera dei ROS sembra essere confermato dalla riduzione di circa 8 volte
della frequenza dei petite in presenza dell’antiossidante acido diidrolipoico.
- potrebbe indurre la formazione di rotture a doppio filamento sul DNA. E’ stato infatti
dimostrato che ad uno stallo della replicazione del DNA possono seguire rotture a
doppio filamento (Michel et al., 1997; Lewis and Resnick, 2000). Meccanismi di
riparazione per ricombinazione potrebbero a loro volta portare a delezioni
dell’mtDNA. A conferma di questa ipotesi vi è l’osservazione che diversi pazienti con
PEO dovuta a mutazioni in POLG posseggono DNA spontaneamente linearizzato
(Van Goethem et al., 1997).
A conferma dell’ipotesi dello stallo vi è l’osservazione che l’incremento dei dNTP pool riduce
la frequenza dei petite, probabilmente aumentando la velocità di replicazione ad opera della
polimerasi.
La mutabilità estesa, così come quella puntiforme, è inoltre dominante. La dominanza può
essere spiegata col fatto che la polimerasi mutata si leghi al DNA templato determinando uno
stallo e impedendo che si possa legare la polimerasi selvatica, ipotesi supportata
dall’osservazione che la polimerasi umana Y955C mostra una costante di dissociazione per il
DNA templato molto simile a quella della polimerasi wt, per cui le due polimerasi possono
competere per il legame col substrato.
In terzo luogo il diploide eteroallelico mostra un incremento della frequenza dei rho0, dunque
della perdita dell’mtDNA. Sebbene nei soggetti affetti da adPEO non si osservi una riduzione
sostanziale dell’mtDNA, uno studio recente su topi recanti l’allele mutato Y955C mostra una
riduzione dell’mtDNA copy number, in accordo con i nostri risultati (Lewis et al., 2007).
E’ noto che il pool nucleotidico influenza la stabilità dell’mtDNA: mutazioni che riducono il
pool nucleotidico determinano una maggiore instabilità dell’mtDNA, sia nell’uomo che nel
lievito (Saada, 2004; O’Rourke et al., 2005). Come riportato nell’introduzione, lo step che
limita la sintesi dei dNTP è costituito dalla reazione catalizzata dalla ribonucleotide reduttasi.
La subunità catalitica della ribonucleotide reduttasi è codificata dal gene RNR1 e la sua
attività è finemente regolata, attraverso diversi meccanismi, durante il ciclo di replicazione di
S. cerevisiae. (Lowdon and Vitols, 1973;b Elledge and Davis, 1990; reviewed in Nordlund
and Reichard, 2006). L’attività codificata dal gene RNR1 influenza notevolmente la stabilità
del DNA mitocondriale. Infatti è stato osservato che mutazioni in RNR1 aumentano la
frequenza di petite e l’overespressione di RNR1 diminuisce la frequenza di petite e aumenta il
numero di copie di mtDNA (O’Rourke et al., 2005; Taylor et al., 2005). RNR1 è inoltre stato
identificato come soppressore multicopia di mutazioni mip1, in grado di ripristinare la crescita
dei mutanti termosensibili a 37°C (Lecrenier and Foury, 1995)
L’attività di Rnr1 è influenzata dalla proteina Sml1, una proteina che legandosi a Rnr1
inibisce l’attività della ribonucleotide reduttasi (Zhao et al., 1998; Chabes and al., 1999). La
109
4. Risultati (I parte)
delezione di SML1 ha effetti simili all’overespressione di RNR1 sulla stabilità mitocondriale:
diminuisce la frequenza di petite, incrementa il numero di copie dell’mtDNA e complementa
il fenotipo termosensibile della mutazione mip1-1 (Taylor et al., 2005; Zhao et al., 1998).
Abbiamo analizzato se un incremento dei dNTP potesse ridurre la frequenza dei petite e dei
rho0 indotta dalle mutazioni patologiche studiate. A tal fine i ceppi aploidi e diploidi recanti le
mutazioni in mip1 sono stati dapprima trasformati con RNR1 in multicopia. L’overespressione
riduceva la frequenza dei petite e dei rho0 sia in presenza della mutazione G224A sia in
presenza della mutazione Y757C in eterozigosi. Gli stessi effetti si ottenevano mediante la
delezione di SML1. E’ probabile che la riduzione della frequenza dei petite sia dovuta ad un
incremento dell’attività delle polimerasi mutate che, in presenza di una maggiore
concentrazione di dNTP, catalizzano la sintesi del DNA con una maggiore velocità. Nel caso
della mutazione Y757C, è noto che, nella polimerasi umana la mutazione equivalente riduce
l’affinità per il nucleotide entrante di 45 volte. Una ridotta affinità potrebbe determinare uno
stallo della replicazione soprattutto in regioni ricche di uno stesso nucleotide, ad esempio
omopolimeriche. In questo caso si potrebbe avere una carenza del nucleotide complementare,
che renderebbe impossibile per una polimerasi difettosa l’inserimento del successivo
nucleotide e che determinerebbe un blocco totale della replicazione. Prevenendo lo stallo della
replicazione, un incremento dei dNTP potrebbe diminuire la frequenza dei riarrangiamenti e
la conseguente frequenza di mutanti petite. Non è comunque escluso che un incremento dei
dNTP, anziché agire direttamente sul processo di polimerizzazione, incrementi l’efficienza
degli eventi di riparazione del DNA, che sono noti essere importanti per il mantenimento del
DNA mitocondriale (reviewed in Contamine and Picard, 2000).
Abbiamo osservato che la delezione di SML1 determina la riduzione della frequenza di
mutazioni estese ma non della frequenza di mutazioni puntiformi (eccetto una blanda
riduzione registrata nel diploide eteroallelico MIP1/mip1Y757C). Questo risultato porta a
concludere che riarrangiamenti, delezioni e deplezione dell’mtDNA non siano correlate ad un
aumento della frequenza di mutazioni puntiformi. I nostri risultati giungono alle medesime
conclusioni di studi precedenti e confermano che i meccanismi che inducono delezioni
dell’mtDNA sono diversi, almeno per le due mutazioni studiate, da quelli che inducono
l’incremento di mutazioni puntiformi (Wanrooij et al., 2004; Kollberg et al., 2005).
Infine, mediante l’uso di acido diidrolipoico, uno scavenger dei ROS, è stato chiaramente
dimostrato come nell’insorgenza di delezioni e nella deplezione dell’mtDNA abbia un ruolo il
danno ossidativo ad opera di agenti ossidanti. In particolare il trattamento con acido
diidrolipoico riduce la frequenza di petite di circa 6 volte nell’aploide mip1G224A e di circa 8
volte nel diploide MIP1/mip1Y757C.
L’overespressione di RNR1 e il trattamento con acido diidrolipoico non solo ha permesso di
chiarire alcuni meccanismi con cui agiscono le polimerasi mutate, ma apre anche la strada ad
un possibile trattamento dei soggetti affetti da PEO con sostanze in grado di ridurre
l’accumulo di delezioni.
110
5. Risultati (II parte)
5. Risultati (II parte):
Difetti del DNA mitocondriale di
Saccharomyces cerevisiae causati da
interazioni funzionali tra mutazioni
nella DNA polimerasi γ associate a
malattie mitocondriali umane*
*I risultati discussi in questa sezione sono stati oggetto della seguente pubblicazione:
Baruffini E., Ferrero I. and Foury F. (2007). Mitochondrial DNA defects in
Saccharomyces cerevisiae caused by functional interactions between DNA polymerase
gamma mutations associated with disease in human. Biochim Biophys Acta. 1772, 1225-1235.
La pubblicazione è riportata come allegato 2.
111
5. Risultati (II parte)
5.1 Scelta delle mutazioni
Sebbene alcuni pazienti presentino una sola mutazione in un allele POLG (tipicamente i
pazienti affetti da adPEO), in molti pazienti uno o entrambi gli alleli presentano due
mutazioni, per cui è difficile determinare se solo una delle mutazioni sia responsabile del
fenotipo patologico oppure se entrambe diano un contributo. Scopo di questa analisi è
determinare quale sia il contributo al fenotipo patologico di due mutazioni normalmente
associate.
Le mutazioni sono state scelte in base ai seguenti parametri:
1) conservazione del residuo nelle polimerasi di diversi organismi (POLG umana e MIP1
sono state allineate con geni codificanti la polimerasi mitocondriale di diversi
organismi, allegato 2, figura 1);
2) associazione, in cis o in trans, con altre mutazioni;
3) localizzazione della mutazione nel dominio polimerasico.
Sulla base di queste caratteristiche, sono state scelte cinque mutazioni. Il fenotipo patologico
associato a queste mutazioni è riassunto in allegato 2, tabella 1. Le caratteristiche delle varie
mutazioni sono state descritte nell’introduzione. Di particolare interesse è la mutazione
E1143G, classificata in banche dati come SNP (Single Nucleotide Polymorphism) presente nel
2-4% della popolazione caucasica. Sebbene soggetti omozigoti per lo SNP E1143G siano
sani, sulla base di diverse osservazioni, riportate nell’introduzione, è stato ipotizzato, e
dimostrato in vitro, che lo SNP E1143G non sia neutrale, ma si comporti come modificatore
fenotipico di mutazioni in cis o in trans.
Le mutazioni G848S, A889T, H932Y, G1051R e E1143G di POLG equivalgono, in MIP1,
alle mutazioni G651S, A692T, H734Y, G807R e E900G. Le mutazioni in MIP1 sono state
studiate singolarmente e in associazione come osservato nei pazienti, per determinare il
contributo di ogni mutazione al fenotipo. In particolare le mutazioni H734Y e G807R, e le
mutazioni G651S e E900G, sono state studiate in trans. Le mutazioni A692T e E900G sono
state studiate in cis.
5.2 Costruzione degli alleli mip1 mutati e loro introduzione in
Saccharomyces cerevisiae
I vari alleli mutati sono stati ottenuti mediante mutagenesi sito-specifica, utilizzando la
tecnica della overlapping PCR descritta nei dettagli in Materiali e metodi e schematizzata
nella figura 5.1.
112
5. Risultati (II parte)
Figura 5. 1: Schema della overlapping PCR. La tecnica si basa sull’utilizzo di tre reazioni di PCR. Nelle
prima reazione viene amplificato un frammento di gene mediante un primer forward e un primer
mutagenico reverse. Nella seconda PCR si amplifica un altro frammento di gene utilizzando un primer
mutagenico forward e un primer reverse. I due primer mutagenici sono complementari l’uno all’altro, in
modo tale che i due frammenti abbiano in comune una regione alle estremità. La terza PCR si basa
sull’utilizzo, sia come templato che come primer, dei due amplificati precedenti. Poiché i due amplificati
hanno una regione in comune, dopo denaturazione, l’estremità di un filamento di un amplificato si
appaierà all’estremità di un filamento dell’altro amplificato, e fungerà da primer per la sintesi
dell’amplificato finale.
Mediante mutagenesi sito-specifica sono stati ottenuti i plasmidi pFL39mip1G651S, mip1A692T,
mip1H734Y, mip1G807R, mip1E900G e pFL39mip1A692T-E900G.
I plasmidi pFL39mip1 sono stati inseriti nel ceppo DWM-5A/pFL38MIP1 e, attraverso il
plasmid shuffling, il plasmide pFL38MIP1 è stato perso, ottenendo i ceppi DWM5A/pFL39mip1G651S, DWM-5A/pFL39mip1A692T, DWM-5A/pFL39mip1H734Y, DWM5A/pFL39mip1G807R, DWM-5A/pFL39mip1E900G e DWM-5A/ pFL39mip1A692T-E900G. Inoltre
sono stati ottenuti i rispettivi ceppi contenenti anche il plasmide pFL38MIP1 utilizzati per
studiare la dominanza/recessività.
Lo studio degli effetti di due mutazioni in trans è stato studiato sia nel ceppo DWM-5A che
nel ceppo diploide DMM/pFL38MIP1 (∆mip1 ∆mip1). Il ceppo DMM è stato ottenuto
mediante incrocio del ceppo DWM-5A/pFL38MIP1 (∆mip1) col ceppo DWM-1A (∆mip1).
Dapprima DMM/pFL38MIP1 è stato trasformato con i vari plasmidi pFL39mip1, ottenendo
ceppi anch’essi utilizzati per studiare la dominanza/recessività. Successivamente, mediante
113
5. Risultati (II parte)
plasmid shuffling, è stato rimosso il plasmide pFL38MIP1. I diversi alleli sono stati clonati
anche in pFL38, ottenendo i plasmidi pFL38mip1, con cui sono stati trasformati i vari ceppi
DMM/pFL39mip1.
In
questo
modo
sono
stati
ottenuti
i
ceppi
G651S
G651S
H734Y
DMM/pFL39mip1
/pFL38mip1
,
DMM/pFL39mip1
/pFL38mip1H734Y,
DMM/pFL39mip1G807R/pFL38mip1G807R,
DMM/pFL39mip1G807R/pFL38mip1H734Y,
DMM/pFL39mip1E900G/pFL38mip1G651S e DMM/pFL39mip1E900G/pFL38mip1E900G.
5.2.1 Stima del numero di copie dei plasmidi pFL39mip1
Dapprima è stato determinato il numero di copie dei plasmidi pFL39mip1 nei ceppi DWM5A, per valutare se effettivamente il numero di copie sia prossimo a uno e che dunque i livelli
di Mip1 non siano influenzati da un maggior numero di copie del gene Per determinare il
numero di copie plasmidiche, è stata condotta sul DNA totale estratto dai ceppi DWM-5A
un’analisi Southern, utilizzando come riferimento il DNA genomico.
Come sonda è stato utilizzato il gene TRP1, che, in seguito a digestione del DNA totale con
EcoRI, ibridizza con un frammento genomico di circa 1200 bp e con una banda plasmidica di
circa 4700 bp, pari alla lunghezza di pFL39 più un frammento di mip1. Il plasmide vuoto
pFL39 produce una banda linearizzato di circa 4300 bp. L’analisi Southern è stata eseguita in
doppio, e i risultati sono riportati in allegato 2, figura 2. La quantificazione deriva dalla media
dei rapporti, per ciascun Southern, del segnale del DNA plasmidico rispetto al segnale del
DNA genomico. Tutti i valori sono leggermente superiori a uno, come atteso visto che
mediamente pFL39 è presente in una cellula in 1-2 copie. I valori risultano inoltre simili fra
loro. I valori più alti non sono significativamente differenti, poiché la deviazione standard
risulta pari a 0,3. Da questa analisi emerge che i risultati, in particolare i valori delle frequenze
dei mutanti rispetto al wt, non sono influenzati dal numero di copie effettive del plasmide in
cui sono stati clonati gli alleli mutati mip1.
5.3 Effetto delle mutazioni mip1
5.3.1 Crescita su fonti respirabili
Dapprima è stata saggiata la capacità di crescere su fonti ossidabili dei ceppi DWM-5A
trasformati con i vari alleli mip1, a 28°C e 36°C. La crescita è stata misurata su terreno SC
addizionato di etanolo 2% a 28°C e su terreno YPE addizionato di etanolo 2% a 36°C. Le
crescite sono riportate in allegato 2, figure 3 A e 3 B. Il ceppo mip1G651S è incapace di
crescere su etanolo, indicando che il ceppo è respiratorio deficiente. I ceppi mip1G807R e
mip1E900G non mostrano alcun difetto di crescita rispetto al ceppo MIP1 a 28°C, mentre la
crescita è ridotta per i ceppi mip1A692T e mip1H734Y. Inoltre si nota come la crescita del ceppo
mip1A692T-E900G sia inferiore rispetto alla crescita del ceppo mip1A692T, suggerendo che la
mutazione E900G non sia neutrale. A 36°C la crescita di tutti i ceppi mutanti risulta inferiore
rispetto alla crescita del ceppo wt, indicando che ad alte temperature il fenotipo di crescita è
notevolmente influenzato dalla presenza di mutazioni in MIP1
114
5. Risultati (II parte)
5.3.2 Determinazione della frequenza e della natura dei petite
Come per le mutazioni studiate nel capitolo precedente, è stata determinata la frequenza e la
natura dei petite per i ceppi DWM-5A trasformati con gli alleli mutanti (allegato 2, tabella 2).
A 28°C tutti gli alleli mutanti aumentano la frequenza dei petite, sebbene in misura diversa. In
particolare la mutazione G651S impedisce una corretta replicazione dell’mtDNA, poiché tutte
le cellule sono petite. La mutazione E900G non risulta neutrale, in quanto determina un
aumento di circa due volte della frequenza dei petite. Inoltre, come osservato già per la
crescita su fonti respirabili, la mutazione E900G si comporta come modificatore fenotipico
della mutazione A692T in cis, incrementando l’accumulo di petite da circa l’80% a circa il
97%. A 36°C la frequenza dei petite è ulteriormente incrementata, suggerendo che le
polimerasi mutate, in particolare la mutazione G807R e E900G, siano termosensibili.
Per quanto concerne la natura dei petite tutte le mutazioni incrementano la frequenza dei rho0,
sia a 28°C che a 36°C. Inoltre si osserva come la frequenza dei rho0 sia proporzionale alla
frequenza dei petite, suggerendo che mutazioni in MIP1 che determinano un aumento delle
delezioni dell’mtDNA incrementino anche la perdita dell’mtDNA.
5.3.3 Determinazione della mutabilità puntiforme
Mediante valutazione dei cloni resistenti a eritromicina, è stata determinata la frequenza delle
mutazioni puntiformi dell’mtDNA. Come si osserva in allegato 2, tabella 2, tutti gli alleli
mutanti mip1 incrementano la frequenza dei mutanti EryR, da circa 2 volte per la mutazione
E900G a circa 10 volte per la mutazione G807R. E’ interessante notare inoltre che la
frequenza dei mutanti EryR non è proporzionale alla frequenza dei petite. Ad esempio nel caso
della mutazione G807R, a fronte di un moderato aumento dei petite a 28°C, si osserva un
forte incremento di mutanti EryR. Inoltre la mutazione E900G non aumenta ulteriormente la
frequenza dei mutanti EryR quando associata alla mutazione A692T.
5.4 Determinazione della dominanza/ recessività
La dominanza delle mutazioni è stata determinata valutando la frequenza di insorgenza di
cloni petite in ceppi aploidi (DWM-5A) e diploidi (DMM) trasformati con l’allele MIP1 su
pFL38 e con l’allele mip1 mutato su pFL39. Le frequenze dei mutanti petite nei ceppi aploidi
DWM-5A e nei ceppi diploidi DMM sono riportate nella tabella 5.1 e 5.2 rispettivamente.
115
5. Risultati (II parte)
28°C
Ceppo DWM-5A
% petites
% rho0
MIP1/MIP1
1.0 ± 0.1
11
MIP1/pFL39
2.7 ± 0.3
24
G651S
MIP1/mip1
2.4 ± 0.3
22
MIP1/mip1A692T
3.8 ± 0.4
21
H734Y
6.7 ± 0.7
22
G807R
1.7 ± 0.3
21
E900G
MIP1/mip1
1.1 ± 0.1
12
MIP1/mip1A692T-E900G
3.6 ± 0.3
21
MIP1/mip1
MIP1/mip1
0
Tabella 5. 1: Frequenza dei mutanti petite e dei mutanti rho fra i petite nei ceppi eteroallelici DWM-5A.
28°C
Ceppo DMM
% petites
MIP1/MIP1
0,8 ± 0,1
MIP1/pFL39
2,1 ± 0,1
MIP1/mip1G651S
1,8 ± 0,2
MIP1/mip1A692T
2,6 ± 0,1
H734Y
7,4 ± 0,9
G807R
MIP1/mip1
1,6 ± 0,1
MIP1/mip1E900G
0,8 ± 0,1
MIP1/mip1A692T-E900G
2,5 ± 0,1
MIP1/mip1
Tabella 5. 2: Frequenza dei mutanti petite nei ceppi eteroallelici DMM.
La mutazione E900G risulta recessiva, poiché la frequenza dei petite e dei rho0 risulta simile
alla frequenza osservata nel ceppo contenente i due alleli selvatici MIP1. Questo suggerisce
che la polimerasi Mip1E900G mantenga gran parte della sua attività. La frequenza dei petite del
ceppo eteroallelico contenente la mutazione G807R è intermedia fra quella del ceppo
contenente due copie di MIP1 e quello contenente una copia. Il ceppo contenente la
mutazione G651S mostra la stessa frequenza di petite del ceppo contenente un solo allele
MIP1, suggerendo che mip1G651S si comporti come un allele nullo. La mutazione A692T
risulta invece debolmente dominante, poiché la frequenza è leggermente, ma
significativamente, superiore alla frequenza di un ceppo contenente una sola copia di MIP1.
La presenza della mutazione E900G non altera la dominanza della mutazione. Infine la
mutazione H734Y risulta dominante.
La frequenza dei mutanti EryR è stata determinata nei ceppi DWM-5A (tabella 5.3).
116
5. Risultati (II parte)
Frequenza EryR
Ceppo DWM-5A
EryR (x 108) Incremento
MIP1/MIP1
2.2 ± 0.4
1.0
MIP1/pFL39
8.0 ± 0.8
3.6
G651S
MIP1/mip1
2.7 ± 0.6
1.2
MIP1/mip1A692T
4.0 ± 0.9
1.8
H734Y
3.5 ± 0.3
1.6
G807R
6.2 ± 0.5
2.8
E900G
3.1 ± 0.7
1.4
3.9 ± 0.5
1.8
MIP1/mip1
MIP1/mip1
MIP1/mip1
MIP1/mip1A692T-E900G
R
Tabella 5. 3: Frequenza dei mutanti Ery fra i petite nei ceppi eteroallelici DWM-5A.
Tutti i ceppi eteroallelici mostrano una frequenza di mutanti petite compresa fra la frequenza
osservata in ceppi contenenti due copie e in ceppi contenenti una copia di MIP1, indicando
che tutte le mutazioni sono recessive per questo carattere. Le polimerasi mutate, anche la
polimerasi Mip1G651S, mantengono almeno parzialmente la capacità di correggere copie di
nucleotidi non appaiati correttamente durante la replicazione grazie all’attività esonucleasica.
5.5 Studio dell’associazione di mutazioni in trans
Come descritto all’inizio, per determinare l’effetto di due mutazioni in trans, i ceppi DWM5A e DMM sono stati trasformati con due alleli mip1 mutati come osservato in pazienti
umani.
Le crescite dei ceppi eteroallelici contenenti gli alleli mip1H734Y e mip1G807R sono riportati in
allegato 2, figura 3. Il ceppo eteroallelico recante i due alleli presenta una crescita ridotta
rispetto ai ceppi contenenti una o due copie dell’allele mip1G807R, suggerendo che la presenza
della polimerasi Mip1H734Y interferisca con la replicazione catalizzata da Mip1G807R.
I risultati delle frequenze dei mutanti petite, dei rho0 e dei mutanti EryR sono riportati in
allegato 2, tabella 4 e nella tabelle 5.4 e 5.5.
Ceppo DWM-5A
mip1H734Y/mip1H734Y
mip1G807R/mip1G807R
mip1H734Y/mip1G807R
mip1G651S/mip1G651S
mip1E900G/mip1E900G
mip1G651S/mip1E900G
% petites
97.8 ± 0.2
8.7 ± 1.8
70.7 ± 4.8
100±0
1.9±0.1
6.0±0.9
% rho0
91
29
82
100
17
29
EryR (x 108)
ND
48.6 ± 3.6
41.2 ± 4.4
ND
4.2±0.4
6.9±0.7
Tabella 5. 4: Frequenza dei mutanti petite, rho0 ed EryR nei ceppi aploidi eteroallelici DWM-5A.
117
5. Risultati (II parte)
Ceppo DMM
mip1H734Y/mip1G807R
mip1G651S/mip1E900G
% petites
83.9 ± 2.7
6.9 ± 0.5
Tabella 5. 5: Frequenza dei mutanti petite nei ceppi diploidi eteroallelici DMM.
Per quanto concerne l’associazione H734Y/G807R, si osserva che i ceppi contenenti i due
alleli producono più petite e più rho0 dei ceppi contenenti una o due copie dell’allele
mip1G807R, confermando che la polimerasi Mip1H734Y interferisce con la replicazione effettuata
da Mip1G807R, in accordo col carattere dominante della mutazione H734Y.
Per quanto concerne l’associazione G651S/E900G, la presenza di Mip1G651S non influenza la
replicazione di Mip1E900G, perché i ceppi contenenti l’allele mip1E900G presentano la stessa
frequenza di petite indipendentemente dalla presenza dell’allele mip1G651S, pari a circa il 67%. Questo risultato conferma che mip1G651S si comporta come un allele nullo.
5.6 Livelli proteici e attività di proteine Mip1 selvatica e mutate
Per chiarire meglio i meccanismi attraverso i quali le polimerasi mutate riducono la stabilità
dell’mtDNA, è stata condotta un’analisi di folding e di attività in vitro sulle polimerasi. La
ridotta capacità di una polimerasi mutata di catalizzare la replicazione del DNA può essere
dovuta a due fattori: incremento del misfolding, che riduce i livelli proteici funzionali;
riduzione dell’attività catalitica intrinseca.
Per valutare il ruolo di questi due parametri, è stato necessario overesprimere la proteina Mip1
wt e le sue varianti mutate, poiché la proteina prodotta da una singola copia del gene non è
sufficiente per svolgere le analisi. L’overespressione è stata ottenuta subclonando gli alleli
mip1 mutati nel plasmide pLGALMIP1, un derivato del vettore d’espressione di lievito
pLGALZ3, che contiene un promotore GAL1 inducibile da galattosio, sotto il cui controllo è
stata posta la regione codificante di MIP1.
I plasmidi pLGALMIP1 e pLGALmip1 sono stati inseriti nel ceppo W303-1B. E’ stato scelto
il ceppo W303-1B, contenente una copia endogena di MIP1, per evitare che i ceppi potessero
perdere l’mtDNA, e che i risultati fossero influenzati dalla riduzione di mtDNA.
5.6.1 Espressione degli alleli mip1
I ceppi W303-1B/pLGALmip1 sono stati dapprima fatti crescere per 24 ore in terreno SC
addizionato di raffinosio 2% per evitare che la presenza di glucosio nelle fasi successive
causasse inibizione dell’espressione a partire dal promotore GAL1, reprimibile da glucosio.
Successivamente le cellule sono state poste in SC addizionato di galattosio 2%, per indurre
l’espressione di mip1. Per ogni allele mip1, sono state estratte le proteine totali dopo 6, 9 e 15
ore, mediante il metodo dell’acido tricloroacetico. Con questo metodo vengono precipitate
tutte le proteine, anche le proteine eventualmente misfoldate e non solubili, sì da poter
determinare la quantità totale di Mip1, e pertanto il livello di espressione.
Stesse quantità di proteine sono state sottoposte ad analisi Western, utilizzando come
controllo negativo le proteine estratte dal ceppo trasformato con pLGALZ3 vuoto. Per ogni
118
5. Risultati (II parte)
ceppo e ogni condizione (6, 9 e 15 ore di induzione) l’esperimento è stato fatto in doppio. In
figura 5.2 è riportato il Western dopo 15 ore di induzione.
Figura 5. 2: Western blot di Mip1 wt e mutate dopo 15 ore di induzione.
Come si osserva in figura, tutte le proteine, selvatiche e mutate, mostrano lo stesso segnale,
indicando che il livello di espressione delle proteine non è influenzato dalla presenza delle
mutazioni. Come atteso, il controllo negativo non mostra alcun segnale apprezzabile, poiché
in presenza di una sola copia del gene non viene prodotta abbastanza proteina per osservare
un segnale tramite Western blot.
5.6.2 Determinazione dei livelli proteici mitocondriali solubili
Mediante estrazione con acido tricloroacetico vengono estratte le proteine totali, comprese le
proteine eventualmente precipitate. E’ noto che il misfolding di Mip1 dovuto a mutazioni,
come nel caso di altre proteine mutate, produce aggregati non solubili e ovviamente non
funzionali (Foury, comunicazione personale). Per saggiare se la presenza delle mutazione
riducesse i livelli proteici mitocondriali solubili, e pertanto funzionali, l’analisi Western è
stata inoltre condotta su estratti grezzi mitocondriali dopo 15 ore di induzione in terreno SC
addizionato di galattosio 2%, come riportato in Materiali e metodi. Sugli estratti grezzi è stata
condotta, come in precedenza, l’analisi Western. La quantificazione degli estratti solubili di
Mip1 è stata fatta utilizzando una curva di taratura ottenuta a partire dagli estratti di Mip1 wt.
I risultati sono riportati in allegato 2, figura 4 e tabella 5. Come è possibile osservare, tutte le
mutazioni, eccetto la mutazione A692T, riducono i livelli solubili funzionali. La riduzione è
moderata per la mutazione E900G, e elevata, superiore all’80%, per le rimanenti mutazioni.
Inoltre, l’associazione di E900G alla mutazione A692T, riduce notevolmente i livelli proteici.
Da questa analisi emerge che, per la maggior parte delle mutazioni, la riduzione della capacità
di mantenere in vivo l’mtDNA è dovuta, almeno in parte, alla riduzione dei livelli proteici
funzionali.
5.6.3 Misurazione dell’attività catalitica
Sugli estratti solubili ottenuti in precedenza è stata misurata l’attività catalitica, mediante
saggio di gap-filling su calf timus DNA attivato dalla DNasi I. Il taglio con la DNasi I
produce frammenti con estremità 5’ protrudenti, che possono essere riempite mediante la
polimerasi Mip1. La misurazione è stata condotta come descritta in Materiali e metodi. La
119
5. Risultati (II parte)
polimerasi wt produceva un valore di 456 ± 50 nmol di TTP/mg di estratto proteico/ora in
materiale precipitabile con acido tricloroacetico.
I valori ottenuti sono riportati in allegato 2, tabella 5. In tabella i valori sono stati normalizzati
sulla base dei livelli proteici solubili e espressi come percentuale rispetto all’attività della
polimerasi wt. Le polimerasi Mip1G651S, Mip1A692T e Mip1H734Y mostrano una notevole
riduzione dell’attività di gap-filling specifica. L’attività della polimerasi Mip1G807R è
debolmente ridotta, mentre l’attività della polimerasi Mip1E900G non è differente da quella
della proteina wt. Inoltre, quando la mutazione E900G è associata alla mutazione A692T,
l’attività non è ulteriormente ridotta.
5.7 Discussione
Nel presente studio sono state introdotte in MIP1 cinque mutazioni equivalenti a mutazioni
patologiche presenti in POLG. Tutte le mutazioni studiate riducono la crescita, almeno a
36°C, su fonti ossidabili, e incrementano la frequenza dei petite, la frequenza dei rho0 e la
frequenza dei mutanti EryR, sebbene a diversi livelli.
La mutazione G651S corrisponde alla mutazione umana G848S. Questa mutazione è stata
osservata in casi molto gravi di Alpers, in trans con le mutazioni A467T o con la doppia
mutazione W748S-E1143G. Dal nostro studio emerge chiaramente che la polimerasi
Mip1G651S non è in grado di replicare correttamente il DNA mitocondriale, in quanto tutte le
colonie sono petite, e tutte rho0. L’incapacità di replicare l’mtDNA non sorprende, in quanto
la presenza della mutazione G651S riduce notevolmente sia i livelli proteici solubili
mitocondriali sia l’attività polimerasica. Il fenotipo osservato correla dunque col fenotipo
patologico osservato nei pazienti. In particolare è noto che le mutazioni A467T e W748S
riducono notevolmente l’attività catalitica (Chan et al., 2005; Chan et al., 2006). Il fenotipo
così grave osservato nei pazienti sembra pertanto dovuto alla presenza di due polimerasi
mutate con attività fortemente ridotta. La mutazione G651S risulta inoltre recessiva, e in
particolare l’allele mip1G651S si comporta come allele nullo. Questi risultati sono in accordo
con l’osservazione che la mutazione G848S è recessiva nell’uomo.
La mutazione A692T corrisponde alla mutazione umana A889T. La mutazione A889T è stata
osservata in casi di PEO, in trans con la mutazione R579W o in cis con lo SNP E1143G. Nel
primo caso, la mutazione sembra essere recessiva, poiché un genitore del paziente, portatore
obbligato della mutazione, era sano. Nel secondo caso, la mutazione sembra essere
dominante, perché l’altro allele non presenta mutazioni. In questo caso sono possibili due
spiegazioni. E’ possibile che la mutazione A889T sia dominante in sé, oppure che lo SNP
E1143G la renda dominante. La mutazione A692T in MIP1 riduce fortemente la stabilità
dell’mtDNA, in quanto si osserva un incremento della frequenza dei petite (circa 80% a 28°C)
e dei rho0 (circa 86% a 28°C). La riduzione della capacità di replicare l’mtDNA non è dovuta
ad una riduzione dei livelli proteici solubili, del tutto simili a quelli della proteina wt, ma
piuttosto alla riduzione di circa il 70% dell’attività polimerasica. All’aumento della mutabilità
120
5. Risultati (II parte)
estesa è associato anche un aumento della mutabilità puntiforme, di circa 4 volte. Per quanto
concerne la dominanza, la mutazione risulta debolmente, ma significativamente in termini di
incremento di petite, dominante. Questa osservazione suggerisce che la mutazione umana
A889T sia anch’essa dominante, ma a causa dello scarso effetto dominante il fenotipo può
essere variabile, da non patologico a patologico con tremori fino a patologico con PEO, come
nei soggetti eterozigoti osservati.
La mutazione H734Y corrisponde alla mutazione umana H932Y, osservata in un’unica
famiglia i cui soggetti affetti da PEO con atassia-neuropatia erano eterozigoti per le mutazioni
H932Y e G1051R. I parenti dei due soggetti, omozigoti per l’una o per l’altra mutazione,
avevano fenotipi complessi, da non patologici ad oligosintomatici con problemi psichiatrici o
emicranie. In particolare tre soggetti su cinque portatori dell’allele recante la mutazione
H932Y presentavano una patologia caratterizzata da emicranie frequenti. Al contrario, alcuni
soggetti portatori dell’allele G1051R, non presentavano per lo più sintomi. Alcuni mostravano
problemi psichiatrici, che tuttavia erano presenti anche in soggetti omozigoti wt, suggerendo
che i problemi psichiatrici fossero dovuti, nella famiglia, ad altri fattori. La mutazione H734Y
in MIP1 riduce fortemente la capacità della polimerasi di replicare l’mtDNA, poiché a 28°C
quasi il 100% dei cloni sono petite e rho0. La ridotta capacità di mantenere l’mtDNA è dovuta
sia ad una ridotta quantità dei livelli proteici, pari a circa il 10-20%, sia un una ridotta attività
catalitica, pari al 30-40% rispetto alla polimerasi wt. La mutazione risulta inoltre parzialmente
dominante e questa dominanza potrebbe spiegare le ragioni per cui tre soggetti eterozigoti per
la mutazione H932Y non sono completamente sani, ma oligosintomatici. Il fenotipo osservato
in lievito correla perfettamente con ciò che è stato osservato nell’uomo, e suggerisce
fortemente che la mutazione H932Y sia dominante.
La mutazione G807R corrisponde alla mutazione umana G1051R, descritta precedentemente.
La mutazione G807R riduce la capacità della polimerasi di mantenere l’mtDNA in vivo,
sebbene moderatamente, poiché a 28°C la frequenza di petite è pari a circa il 27%. I mutanti
risultano inoltre termosensibili, poiché la frequenza dei petite e dei rho0 sale quasi al 100% a
36°C, suggerendo che la proteina presenti dei problemi di folding. I risultati sono confermati
dalle analisi in vitro, che dimostrano come la ridotta capacità della polimerasi di replicare
l’mtDNA sia dovuta alla forte riduzione dei livelli proteici solubili, pari a circa il 10% del wt.
L’attività catalitica, sebbene parzialmente ridotta, risulta simile a quella della polimerasi non
mutata, indicando dunque che l’aumento dei petite è dovuto soprattutto alla riduzione dei
livelli proteici. Alla mutazione è associato anche un forte incremento, di circa 10 volte, della
frequenza di mutazioni puntiformi sull’mtDNA. Infine la mutazione risulta recessiva, poiché
la mutabilità estesa dell’mtDNA è simile in un ceppo contenente una copia wt e una copia
mutata rispetto al ceppo contenente due copie selvatiche.
La mutazione E900G corrisponde allo SNP E1143G. Apparentemente lo SNP E1143G non è
neutrale, ma è in grado di comportarsi come modificatore fenotipico di mutazioni patologiche.
121
5. Risultati (II parte)
Oltre alle osservazioni nei pazienti che portano lo SNP, è stato recentemente dimostrato da
studi in vitro che lo SNP E1143G si comporta come modificatore fenotipico della mutazione
W748S (Chan et al., 2006). Per quanto concerne il nostro studio, abbiamo osservato che la
presenza della mutazione aumenta di circa 2 volte la frequenza di petite rispetto al wt a 28°C,
indicando che la mutazione per se non ha un effetto neutrale. Inoltre la frequenza di petite sale
a 90% a 36°C, indicando che i mutanti sono termosensibili e suggerendo che la proteina
presenti una riduzione dei livelli funzionali. Questa osservazione è stata confermata
dall’analisi dei livelli proteici funzionali, che sono ridotti a circa il 30-40% rispetto al wt.
L’attività catalitica è invece simile rispetto a quella della polimerasi wt, indicando come
l’incremento dei petite sia dovuto alla riduzione dei livelli proteici. Alla mutazione E900G è
associato anche un blando ma significativo incremento della frequenza di mutazioni
puntiformi. Infine la mutazione risulta recessiva.
Le mutazioni A889T e E1143G sono state osservate in cis in due casi di adPEO, come
sottolineato in precedenza. In lievito, è stato osservato che la presenza della mutazione E900G
incrementa la frequenza dei petite, dall’80% al 97%, indicando che la mutazione E900G si
comporta come modificatore fenotipico di una mutazione patologica in cis. L’aumento della
frequenza di mutanti petite non è dovuto alla riduzione dell’attività catalitica, che risulta
simile per la polimerasi Mip1A692T e per la polimerasi Mip1A692T-E900G, ma alla riduzione dei
livelli proteici solubili che, mentre sono normali per la proteina Mip1A692T, sono ridotti a circa
il 5% per la proteina Mip1A692T-E900G. Gli effetti che si osservano nel ceppo recante l’allele
mip1A692T-E900G sembrano essere dovuti in parte alla riduzione dell’attività catalitica dovuta
alla mutazione A692T in parte alla riduzione dei livelli proteici solubili dovuti sia alla
mutazione A692T sia alla mutazione E900G. La presenza della mutazione E900G non
incrementa invece la frequenza di mutazioni puntiformi dovute alla mutazione A692T. Infine
la presenza della mutazione E900G non altera la dominanza della mutazione A692T, che
risulta dominante già per se.
Per quanto concerne l’effetto di due mutazioni in trans, è stato osservato in primo luogo che
la presenza della mutazione G651S non influenza la replicazione ad opera della proteina
Mip1E900G, in accordo con l’osservazione che mip1G651S si comporta come allele nullo. Al
contrario, la presenza della mutazione H734Y, che è dominante, influenza la replicazione
della polimerasi Mip1G807R. Mentre il ceppo recante solo l’allele mip1G807R presenta una
frequenza di petite di circa il 27°C, il ceppo recante gli alleli mip1G807R e mip1H734Y mostra una
frequenza di petite pari a circa l’80%. In tal senso si può ipotizzare che il grave fenotipo
osservato nei soggetti eterozigoti per le mutazioni H932Y e G1051R e caratterizzato da
atassia-neuropatia con PEO non sia dovuto alla presenza di due polimerasi con scarsa attività,
bensì al fatto che una polimerasi recante una mutazione dominante interferisca con la
replicazione di una polimerasi mutata che, di per sé, ha un’attività poco inferiore a quella del
wt.
122
5. Risultati (II parte)
E’ stato inoltre osservato, come negli esperimenti condotti sulle mutazioni G224A e Y757C,
che non vi è correlazione fra incremento di delezioni o deplezione di mtDNA e incremento
della frequenza di mutazioni puntiformi. In particolare:
1) la frequenza di mutanti petite e rho0 non è proporzionale alla frequenza di mutanti
EryR per le varie mutazioni. Ad esempio la mutazione G807R produce relativamente
pochi petite, ma determina un forte incremento dei mutanti EryR.
2) la mutazione E900G incrementa la frequenza di petite in associazione con la
mutazione A692T, ma non la frequenza di mutazioni puntiformi.
3) le mutazioni A692T e H734Y sono dominanti per quanto concerne la mutabilità
estesa, ma sono recessive per quanto concerne la mutabilità puntiforme.
Queste osservazioni confermano che le delezioni dell’mtDNA sembrano essere dovute a
meccanismi diversi da quelli che producono mutazioni puntiformi, quali stallo della
replicazione, ridotta attività polimerasica o, come dimostrato in questo studio, ridotti livelli
proteici funzionali dovuti a problemi di folding.
123
6. Risultati (III parte)
6. Risultati (III parte):
Rescue
genetico
mediante
overespressione di geni codificanti
enzimi di riparazione e rescue chimico
mediante trattamento con antiossidanti
del fenotipo indotto da mutazioni in
MIP1
124
6. Risultati (III parte)
6.1 Rescue genetico mediante overespressione di geni coinvolti
nella riparazione dell’mtDNA
Scopo dell’esperimento consiste nella ricerca di geni coinvolti nella riparazione che,
overespressi, riducano la frequenza di mutanti petite dovuti a mutazioni in MIP1. Sono stati
overespressi, mediante clonaggio nel plasmide multicopia YEplac195 o nel plasmide
monocopia pFL38, i geni CCE1, MHR1, MSH1, CDC9, REV3 e REV7, le cui caratteristiche
sono state descritte nell’introduzione.
Dopo clonaggio, i geni sono stati inseriti nei ceppi aploidi DWM-5A (∆mip1) recanti gli alleli
mip1A692T, mip1G807R, mip1E900G e nel ceppo diploide DWM (MIP1/∆mip1) recante l’allele
mip1Y757C su pFL39. Le quattro mutazioni elencate sono state scelte fra le varie mutazioni a
disposizione a causa delle loro diverse caratteristiche.
- La mutazione A692T produce un’alta frequenza di petite, è debolmente dominante e la
polimerasi mutata mostra una riduzione dell’attività catalitica, ma non dei livelli
solubili mitocondriali.
- La mutazione G807R produce petite con una frequenza vicino al 25%, è recessiva e la
polimerasi mostra una riduzione dei livelli solubili mitocondriali, mentre l’attività è
simile a quella del wt.
- La mutazione E900G produce petite a bassa frequenza, è recessiva e la polimerasi
mostra una riduzione di circa il 60% dei livelli solubili mitocondriali.
- La mutazione Y757C, in eterozigosi, determina un accumulo di petite maggiore
rispetto a quello del ceppo recante un solo allele selvatico.
Di seguito sono descritti gli effetti dell’overespressione dei vari geni sulla mutabilità estesa.
6.1.1 Overespressione di CCE1
Il gene CCE1, codificante per una endonucleasi coinvolta nella risoluzione delle giunzioni di
Holliday, è stato dapprima clonato nel plasmide multicopia YEplac195, con cui sono stati
trasformati i ceppi aploidi DWM-5A recanti le mutazioni A692T, G807R e E900G, oppure
l’allele selvatico. La frequenza dei petite è riportata in figura 6.1.
125
6. Risultati (III parte)
Figura 6. 1: Frequenza dei mutanti petite nei ceppi aploidi DWM-5A recanti l’allele selvatico MIP1 o gli
alleli mutanti mip1 trasformati con YEplac195 vuoto, in giallo, o con YEPlac195CCE1, in blu.
L’overespressione di CCE1 incrementa la frequenza dei mutanti petite. E’ possibile ipotizzare
che l’overespressione di Cce1 destabilizzi il DNA, ad esempio legandosi ad esso fino a
saturazione, e inibendo così altre reazioni che avvengono sull’mtDNA. Il fatto che
l’overespressione di una proteina mitocondriale incrementi la frequenza di petite non
sorprende, in quanto è noto che alcune proteine, quando overespresse, possono incrementare
l’accumulo di cloni respiratorio deficienti. Lo stesso MIP1, se overespresso, determina un
incremento della frequenza dei petite (Foury, comunicazione personale). In contemporanea a
questo studio altri ricercatori hanno overespresso CCE1 in cellule umane il coltura e, in quei
cloni in cui l’espressione di CCE1 era maggiore, si assisteva alla deplezione di mtDNA
(Sembongi et al., 2007).
Per evitare gli effetti deleteri dovuti ad overespressione su un plasmide multicopia, il gene
CCE1 è stato clonato in un plasmide monocopia, pFL38, per analizzare gli effetti dovuti alla
presenza di una sola copia soprannumeraria del gene (figura 6.1).
Come mostrato in figura, la presenza di una copia genica in più non altera in maniera
significativa la frequenza di petite.
126
6. Risultati (III parte)
Figura 6. 2: Frequenza dei mutanti petite nei ceppi aploidi DWM-5A recanti l’allele selvatico MIP1 o gli
alleli mutanti mip1 trasformati con pFL38 vuoto, in giallo, o con pFL38CCE1, in blu.
6.1.2 Overespressione di MHR1
Il gene MHR1, codificante una proteina coinvolta nella ricombinazione mitocondriale, è stato
clonato nel vettore multicopia YEplac195 e successivamente inserito nei ceppi aploidi DWM5A recanti le varie mutazioni. La frequenza dei mutanti petite è riportata in figura 6.3.
Figura 6. 3: Frequenza dei mutanti petite nei ceppi aploidi DWM-5A recanti l’allele selvatico MIP1 o gli
alleli mutanti mip1 trasformati con YEplac195 vuoto, in giallo, o con YEPlac195MHR1, in blu.
L’overespressione di MHR1 non altera significativamente la frequenza dei petite in alcun
mutante esaminato.
L’analisi è stata condotta anche a 37°C, visto che è noto che la delezione di MHR1 aumenta la
frequenza di petite soltanto ad alte temperature (Ling et al., 1995). L’analisi a 37°C, non
mostrata, non ha determinato alcuna variazione della frequenza di petite.
127
6. Risultati (III parte)
6.1.3 Espressione in monocopia di MSH1
Il gene MSH1, codificante per la proteina omologa a MutS di E. coli e coinvolta nella
riparazione di mismatch, nella BER e nella ricombinazione omologa, è stato clonato nel
plasmide monocopia pFL38. La scelta è caduta su un plasmide monocopia in quanto
l’overespressione di MSH1 determina instabilità dell’mtDNA (Koprowski et al., 2002;
Dzierzbicki et al., 2004). L’effetto della presenza di una copia genica soprannumeraria di
MSH1 è riportata in figura 6.4.
Figura 6. 4: Frequenza dei mutanti petite nei ceppi aploidi DWM-5A recanti l’allele selvatico MIP1 o gli
alleli mutanti mip1 trasformati con pFL38 vuoto, in giallo, o con pFL38MSH1, in blu.
L’espressione di una copia in più di MSH1 produce sui ceppi aploidi recanti l’allele mip1A692T
e mip1G807R una riduzione che, sebbene significativa, risulta molto blanda. A causa della
scarsa riduzione della frequenza dei petite, gli effetti del gene MSH1 non sono stati analizzati
ulteriormente.
6.2.4 Overespressione di CDC9
Il gene CDC9, codificante per l’unica isoforma mitocondriale, è stato clonato nel plasmide
multicopia YEplac195. L’effetto dell’overespressione sulla mutabilità puntiforme nei ceppi
aploidi è riportato in figura 6.4 A, mentre l’effetto sul ceppo DWM/pFL39mip1Y757C è
riportato in figura 6.4 B.
128
6. Risultati (III parte)
A
B
Figura 6. 5: (A) Frequenza dei mutanti petite nei ceppi aploidi DWM-5A recanti l’allele selvatico MIP1 o
gli alleli mutanti mip1 trasformati con YEplac195 vuoto, in giallo, o con YEplac195CDC9, in blu; (B)
Frequenza dei mutanti petite nel ceppo diploide eterozigote DWM/mip1Y757C.
L’overespressione di CDC9 riduce la frequenza di mutanti petite di circa il 25%-30% per tutte
le mutazioni studiate, a eccezione della mutazione Y757C, per la quale non si osserva alcuna
riduzione.
Dei ceppi aploidi recanti le varie mutazioni è stata misurata anche la mutabilità puntiforme. In
questo caso non è stata osservata alcuna differenza fra la frequenza di mutanti EryR nei ceppi
trasformati col plasmide vuoto o col plasmide recante il gene CDC9 (dati non mostrati).
Una analisi di Northern blot ha confermato un alto livello di espressione del gene CDC9
(figura 6.6).
Figura 6. 6: Northern blot sul ceppo DWM-5A/MIP1 trasformato con YEplac195 vuoto, a destra, o con
YEplac195CDC9, a sinistra. In alto l’mRNA del gene CDC9, in basso l’mRNA del gene ACT1.
6.2.5 Overespressione di REV3 e REV7
REV3 e REV7 codificano rispettivamente per la subunità catalitica e la subunità accessoria
della polimerasi zeta. I due geni sono stati clonati separatamente nel plasmide YEplac195.
129
6. Risultati (III parte)
Inoltre, il gene REV7 è stato sub clonato nel plasmide YEplac195REV3, così da ottenere un
plasmide recante entrambi i geni. Gli effetti sulla mutabilità estesa mitocondriale sono
riportati in figura 6.7.
A
B
Figura 6. 7: (A) Frequenza dei mutanti petite nei ceppi aploidi DWM-5A recanti l’allele selvatico MIP1 o
gli alleli mutanti mip1 trasformati con YEplac195 vuoto, in giallo, con YEPlac195REV3, in verde, con
YEplac195REV7, in rosso, e con YEplac195REV3-REV7, in blu; (B) Frequenza dei mutanti petite nel
ceppo diploide eterozigote DWM/mip1Y757C.
L’overespressione di REV3 riduce significativamente la frequenza dei petite, in modo
mutazione-specifico. La riduzione è pari a circa il 25% nel ceppo recante la mutazione
A692T, di circa il 45% nel ceppo recante la mutazione G807R, e di circa il 30% nel ceppo
recante la mutazione E900G. Non si osserva alcuna riduzione della frequenza dei petite nel
ceppo diploide eteroallelico recante la mutazione Y757C.
L’overespressione di REV7 riduce la frequenza di petite in maniera significativa, ma lieve, nei
ceppi aploidi recanti le mutazioni A692T e G807R.
La contemporanea overespressione di entrambi i geni REV3 e REV7 riduce la frequenza dei
petite allo stesso modo dell’overespressione del solo gene REV3, indicando che i livelli della
proteina Rev3 sono limitanti per la riduzione della frequenza di petite.
E’ stata inoltre determinata la frequenza dei mutanti EryR che, come nel caso
dell’overespressione di CDC9, non mostra alcuna differenza fra i ceppi trasformati con il
plasmide vuoto o con i geni REV3 e/o REV7 (dati non mostrati).
Per confermare l’overespressione di REV3 e REV7, sul ceppo aploide DWM-5A/MIP1
trasformato con i vari plasmidi è stato condotto un Northern blot, utilizzando sonde contro
REV3 e REV7 (figura 6.8). Il Northern blot ha confermato l’overespressione genica.
130
6. Risultati (III parte)
Figura 6. 8: Northern blot sul ceppo DWM-5A/MIP1 trasformato con YEplac195 vuoto (lane 1), con
YEplac195REV3 (lane 2), con YEplac195REV7 (lane 3) e con YEplac195REV3-REV7 (lane 4). In alto
l’mRNA del gene CDC9, in mezzo l’mRNA del gene REV7, in basso l’mRNA del gene ACT1.
6.2.6 Rescue mediante incremento dei dNTP pool
L’incremento dei dNTP mediante overespressione di RNR1 o delezione di SML1 si è
dimostrato efficace nel ridurre la frequenza dei petite, sia nel ceppo recante l’allele MIP1
selvatico sia nei ceppi recanti le mutazioni G224A e Y757C (capitolo 4). Per valutare se un
incremento del pool dei dNTP fosse efficace per tutte le mutazioni in MIP1, tutti gli alleli
mutati a disposizione sono stati inseriti nel ceppo DYY-4C, deleto in SML1. Gli effetti sulla
mutabilità estesa sono riportati in figura 6.9.
Figura 6. 9: Frequenza dei mutanti petite nei ceppi DWM-5A (SML1) recanti i vari alleli mip1, in giallo, e
nei ceppi DYY-4C (∆sml1), in blu.
131
6. Risultati (III parte)
L’incremento dei dNTP si è dimostrato efficace nel diminuire la frequenza dei petite associata
ad ogni mutazione in MIP1. La riduzione è comunque mutazione-specifica, e va dal 15% per
la mutazione H734Y all’80% per la mutazione G807R.
6.2.7 Associazione fra incremento dei NTP pool e overespressione di CDC9
o REV3 e REV7
Sulla base dei risultati ottenuti, si sono valutati gli effetti di un doppio meccanismo di rescue:
l’incremento della concentrazione dei dNTP e l’overespressione di CDC9 o REV3 o REV7.
L’analisi aveva un doppio scopo. In primo luogo, si voleva determinare se gli effetti della
riduzione fossero additivi, così da poter ridurre in maniera significativa la frequenza di petite,
risultato potenzialmente importante dal punto di vista terapeutico. In seconda istanza, si
volevano comprendere meglio i meccanismi attraverso cui l’overespressione di Cdc9 e Pol
zeta agissero.
La frequenza dei petite è stata determinata per i ceppi DYY-4C, deleti in SML1, recanti gli
alleli mip1A692T e mip1G807R trasformati col gene CDC9 (figura 6.10 A e B) o coi geni REV3 e
REV7 (figura 6.10 C e D). Sono state analizzate solo le mutazioni mip1A692T e mip1G807R in
quanto nel contesto ∆sml1 il ceppo recante l’allele mip1E900G presentava una frequenza di
petite troppo bassa (1,4%) per studiare gli effetti dell’overespressione di CDC9, REV3 e
REV7.
A
B
132
6. Risultati (III parte)
C
D
Figura 6. 10: (A) Frequenza dei mutanti petite nei ceppi aploidi SML1 o ∆sml1 recanti la mutazione A692T
trasformati con YEplac195, in giallo, o con YEplac195CDC9, in blu; (B) Frequenza dei mutanti petite nei
ceppi aploidi SML1 o ∆sml1 recanti la mutazione G807R trasformati con YEplac195, in giallo, o con
YEplac195CDC9, in blu; (C) Frequenza dei mutanti petite nei ceppi aploidi SML1 o ∆sml1 recanti la
mutazione A692T trasformati con YEplac195, in giallo, con YEplac195REV3, in verde, con
YEplac195REV7, in rosso, o con YEplac195REV3-REV7, in blu. NT: non testato; (D) Frequenza dei
mutanti petite nei ceppi aploidi SML1 o ∆sml1 recanti la mutazione A807T trasformati con YEplac195, in
giallo, con YEplac195REV3, in verde, con YEplac195REV7, in rosso, o con YEplac195REV3-REV7, in blu.
Come si osserva nelle figura 6.10 A e 6.10 B, gli effetti dell’incremento dei dNTP e
dell’overespressione di CDC9 sono additivi. Infatti, sia nel ceppo SML1 che nel ceppo ∆sml1
si osserva una riduzione della frequenza di petite di circa il 25-30%. Questo risultato
suggerisce che l’azione di ciascuno dei due sistemi considerati sia indipendente da quella
dell’altro.
Al contrario, gli effetti dell’overespressione di REV3 o di REV3-REV7, sono più che additivi
nel contesto ∆sml1 rispetto ad un ceppo SML1. Per quanto concerne la mutazione A692T, se
nel ceppo SML1 si osserva una riduzione del 25% in seguito ad overespressione di Pol zeta,
pari ad una riduzione di 1,3 volte, nel ceppo ∆sml1 la riduzione è del 45%, pari a 1,8 volte.
Per quanto riguarda la mutazione G807R, nel ceppo SML1 si osserva una riduzione del 45%
in seguito ad overespressione di Pol zeta, pari ad una riduzione di 1,8 volte, mentre nel ceppo
∆sml1 la riduzione è del 65%, pari a 2,8 volte. Nel complesso le frequenze dei petite sono
ridotte di circa 8 volte per la mutazione A692T e di circa 16 volte per la mutazione G807R.
6.2 Rescue genetico
antiossidanti
mediante
trattamento
con
sostanze
I ceppi recanti le mutazioni A692T, G807R e Y757C sono stati trattati con sostanze
antiossidanti, per valutare il coinvolgimento di ROS nella formazione dei petite.
6.2.1 Trattamento con acido diidrolipoico e con resveratrolo
L’acido diidrolipoico, le cui caratteristiche sono state spiegate nel capitolo 4, è un
antiossidante naturale. Il trattamento del ceppo DWM/mip1Y757C con acido diidrolipoico 30
µM si è dimostrato in grado, come detto nel capitolo 4, di ridurre di circa 6 volte la frequenza
dei mutanti petite.
133
6. Risultati (III parte)
La frequenza dei mutanti petite in seguito a trattamento con acido diidrolipoico è riportato in
figura 6.11.
Figura 6. 11: Frequenza dei mutanti petite nei ceppi aploidi DWM-5A recanti gli alleli mutanti mip1
trattati con acido diidrolipoico 30 µM, in blu, o non trattati, in giallo.
Il trattamento con acido diidrolipoico non ha sortito alcun effetto sulla mutabilità estesa
associata alle mutazioni A692T e G807R.
Il resveratrolo è un antiossidante naturale prodotto da diverse piante ed è abbondante sulla
buccia dell’uva e nel vino. Strutturalmente il resveratrolo è un fenolo modificato (3,5,4’triidrossistilbene) che possiede due gruppi alcolici su un anello aromatico, che sono in grado
di ossidarsi così da dare origine ad una struttura chinonica.
Il trattamento con resveratrolo dei ceppi aploidi DWM-5A a diverse concentrazioni non ha
mostrato alcuna riduzione della frequenza dei petite (dati non mostrati).
6.2.2 Trattamento con mitochinone
Il mitochinolo/mitochinone, o MitoQ, è una sostanza antiossidante di sintesi ottenuto nel 2001
(Kelso et al., 2001). Il MitoQ deriva dalla modificazione chimica dell’ubichinone, in cui è
stato inserito un catione trifenilfosfonio lipofilico legato ad una catena alifatica, come
mostrato in figura 6.12.
134
6. Risultati (III parte)
Figura 6. 12: Struttura chimica del mitoQ nella forma ridotta (mitochinolo).
Grazie al gruppo cationico, la molecola entra specificatamente nei mitocondri grazie al
potenziale di membrana, e il gruppo ubichinonico rimane immerso nella membrana
mitocondriale interna, dove, riducendo i ROS, protegge il mitocondrio dal danno ossidativo.
Inoltre la forma ossidata (mitochinone) viene di nuovo trasformata, dalla catena respiratoria
mitocondriale, nella forma ridotta (mitochinolo) che è in grado di riossidarsi in presenza di
ROS e continuare così il processo ciclico che protegge il mitocondrio dall’ossidazione dei
ROS. Nello specifico la forma ossidata può essere ridotta dal complesso I, in grado di cedere
elettroni al mitochinone grazie alla somiglianza strutturale con l’ubichinone (Kelso et al.,
2001).
Dopo misurazione della minima concentrazione inibente, pari a 50 µM, i ceppi aploidi DWM5A recanti i diversi alleli mutanti e il ceppo DWM/mip1Y757C sono stati trattati con MitoQ 5
µM, 10 µM e 25 µM. I risultati sono riportati in figura 6.13.
A
135
6. Risultati (III parte)
B
Figura 6. 13: (A) Frequenza dei mutanti petite nei ceppi aploidi DWM-5A recanti l’allele selvatico MIP1 o
gli alleli mutanti mip1 trattati con MitoQ 10 µM, in blu, o non trattati, in giallo; (B) Frequenza dei
mutanti petite nel ceppo diploide eterozigote DWM/mip1Y757C trattato con MitoQ 5 µM, in azzurro, con
MitoQ 10 µM, in blu, o non trattato, in giallo.
Il trattamento con MitoQ riduceva la frequenza dei petite nei ceppi aploidi recanti gli alleli
mutanti, sebbene la riduzione fosse poco significativa, pari a circa il 15% sia per la mutazione
A692T sia per la mutazione G807R. La riduzione risulta significativa, e maggiore del 50%,
nel ceppo aploide recante l’allele selvatico MIP1. Il trattamento con MitoQ 5 µM non
riduceva la frequenza in maniera significativa (dati non mostrati).
Il trattamento con MitoQ riduceva la frequenza del ceppo eterozigote MIP1/mip1Y757C di circa
il 45% in presenza di MitoQ 5 µM e di circa il 65% in presenza di MitoQ 10 µM, indicando
che nella formazione dei petite ad opera della mutazione Y757C gioca un ruolo rilevante la
presenza di sostanze ossidanti.
Il trattamento dei vari ceppi con MitoQ 25 µM si è dimostrato dannoso per la stabilità
dell’mtDNA, poiché la frequenza dei petite era significativamente maggiore. E’ possibile
ipotizzare che, a concentrazioni troppo elevate, il MitoQ sia sbilanciato verso la forma
chinonica, e si comporti come ossidante, oppure che, interferendo con l’ossidazione
dell’ubichinone ad opera del complesso I, porti ad una maggiore formazione di ROS, anche
tenendo conto che la maggior parte dei ROS, come detto nell’introduzione, si formano proprio
a partire dal complesso I.
6.3 Conclusioni e prospettive
Nel presente studio sono stati overespressi, in ceppi recanti alleli mutanti mip1, geni coinvolti
nella riparazione. La scelta di questa strategia si basa sull’osservazione che gli enzimi
coinvolti nella riparazione dell’mtDNA influenzano profondamente la stabilità del DNA,
tanto che delezioni nei geni codificanti questi enzimi portano, in generale, a un aumento della
mutabilità estesa e/o puntiforme dell’mtDNA.
Fra i vari geni analizzati, tre, CDC9, REV3 e REV7, si sono dimostrati in grado, quando
overespressi, di ridurre la mutabilità estesa dovuta a mutazioni in MIP1.
136
6. Risultati (III parte)
Per quanto concerne CDC9, è in grado di ridurre la frequenza dei mutanti petite di circa il
25%-30% nei ceppi aploidi deleti in MIP1 e recanti gli alleli MIP1, mip1A692T, mip1G807R e
mip1E900G. CDC9 non è invece in grado di ridurre la frequenza nel ceppo diploide
MIP1/mip1Y757C, suggerendo che le delezioni mediate dalla mutazione Y757C si generino
attraverso meccanismi diversi da quelli dovuti alle mutazioni precedentemente elencate.
Le ipotesi per spiegare come un aumento della concentrazione della DNA ligasi possa ridurre
la mutabilità estesa sono varie. In prima istanza, è noto che mutazioni in CDC9 che rendono
la ligasi termosensibile riducono di circa il 50% il numero di copie di mtDNA (Donahue et
al., 2001). La riduzione si osserva anche in fase stazionaria, suggerendo che la DNA ligasi sia
importante nel mantenimento dell’mtDNA non solo per il suo ruolo nella replicazione. In tal
senso è possibile che l’overespressione di CDC9 determini un aumento del numero di copie di
mtDNA, favorendo dunque la trasmissione di genomi integri alla progenie. Inoltre la DNA
ligasi è coinvolta nei processi di riparazione, in particolare nella BER e nella riparazione di
tagli a doppio filamento. E’ possibile che forme mutate di polimerasi, oltre ad avere
un’attività catalitica ridotta, possano favorire l’insorgenza di danni sul DNA, la cui
riparazione potrebbe essere favorita da un’overespressione di Cdc9. In terzo luogo, è stato
dimostrato che nell’uomo la DNA polimerasi mitocondriale, e la DNA ligasi III, ortologo
funzionale di Cdc9, interagiscono fisicamente in vivo. Questa interazione favorisce l’attività
replicativa di Pol γ e permette a quest’ultima di partecipare alla BER. E’ possibile che anche
Mip1 e Cdc9 interagiscano in vivo, e che questa interazione favorisca l’attività di MIP1.
Per valutare queste ipotesi verranno condotti successivamente diversi esperimenti.
1) Verrà valutato, mediante real-time PCR e/o Southern blot, se l’overespressione di
CDC9 determini un aumento del numero di copie di mtDNA.
2) Verrà valutato se fra Cdc9 e Mip1 vi sia interazione fisica. Per questa analisi verrà
utilizzato un ceppo recante una versione di MIP1 modificata codificante per la
proteina Mip1 legata ad un tag. Il ceppo verrà trasformato con un plasmide multicopia
contenente il gene CDC9 codificante per una versione modificata, legata ad un tag
diverso dal precedente. La determinazione dell’interazione avverrà mediante
coimmunoprecipitazione, utilizzando come anticorpo per la coimmunoprecipitazione
l’anticorpo anti-Mip1, e per la determinazione della presenza di Cdc9 un anticorpo
anti-Cdc9
3) Poiché CDC9 è espressa anche nel nucleo, si valuterà se un overespressione di Cdc9 è
deleteria per il DNA nucleare. In particolare verrà valutato se l’overespressione
determina un aumento di retromutazioni, di crossing over mitotico, di conversioni
geniche, di aneuploidia e di delezioni mediante l’uso del ceppo YHE2, un derivato del
ceppo D7 (Zimmerman et al., 1975).
E’ stato inoltre osservato che l’incremento dei dNTP pool riduce la frequenza dei mutanti
petite per ogni mutazione testata, sebbene in modo fortemente mutazione-dipendente. Questo
suggerisce che un incremento della concentrazione dei dNTP possa essere utile per
contrastare gli effetti di numerose mutazioni in MIP1. Sono stati inoltre studiati gli effetti di
137
6. Risultati (III parte)
un doppio meccanismo di rescue: incremento dei dNTP e overespressione di CDC9. Sulle
mutazioni testate, gli effetti si sono dimostrati additivi, suggerendo che i due meccanismi
agiscano diversamente, e che dunque un incremento dei dNTP non influenzi l’attività di Cdc9.
L’overespressione di REV3 e REV7 determina una riduzione della frequenza di petite nei
ceppi recanti gli alleli MIP1, mip1A692T, mip1G807R e mip1E900G. L’overespressione di REV3
riduce la frequenza di petite in maniera mutazione dipendente, determinando una riduzione
del 25% nel ceppo recante la mutazione A693T e del 45% nel ceppo recante la mutazione
G807R. Gli effetti sono ancora maggiori nel ceppo deleto in SML1, dove si osserva una
riduzione della frequenza di petite rispettivamente del 45% e del 65%. Da questi risultati
emerge chiaramente che l’incremento dei dNTP favorisce il meccanismo con cui agisce Rev3.
Anche in questo caso si possono formulare diverse ipotesi per spiegare il rescue ad opera di
Pol zeta. In primo luogo, è possibile che Pol zeta, se overespresso, possa complementare
parzialmente la funzione di Mip1. Sebbene la polimerasi zeta sia poco processiva, una sua
overespressione potrebbe aumentare la velocità di replicazione dell’mtDNA, qualora Pol zeta
fosse in grado di sostituirsi parzialmente a Mip1. In secondo luogo, è possibile che Mip1
mutata presenti dei problemi nella sintesi translesione, cioè che in presenza di una lesione
Mip1 mutata sia maggiormente inibita rispetto alla polimerasi wt. La presenza di una
maggiore concentrazione di Pol zeta, coinvolta nella sintesi translesione, potrebbe favorire
indirettamente la polimerizzazione di Mip1, che non verrebbe più bloccata in corrispondenza
di danni sul DNA. In tal senso è anche possibile che Mip1 e Pol zeta interagiscano
fisicamente. Nel nucleo infatti le polimerasi replicative e una polimerasi riparativa, Pol eta,
interagiscono fisicamente. L’interazione non è diretta, ma mediata da una proteina chiamata
PCNA che, quando modificata mediante ubiquitinazione e/o sumoilazione, favorisce lo switch
delle due polimerasi. In presenza di un templato non danneggiato infatti, la polimerasi
replicativa sintetizza nuovo DNA. Quando vi è un danno, il PCNA, dopo modificazione,
determina uno switch per cui la polimerasi riparativa, sintetizza il DNA in corrispondenza del
templato danneggiato. Infine, in seguito ad un nuovo switch, la polimerasi replicativa riprende
la sintesi del DNA (Prakash et al., 2005). E’ stato ipotizzato che anche Pol zeta possa
interagire col PCNA (McHugh and Sarkar, 2006). Sebbene il PCNA non sia presente nel
mitocondrio, è possibile che le due polimerasi siano comunque in grado di interagire
attraverso altre proteine.
Diversi esperimenti verranno condotti per valutare la validità di queste ipotesi.
1) Verrà valutato, mediante real-time PCR e/o Southern blot, se l’overespressione di Pol
zeta determini un aumento del numero di copie di mtDNA.
2) Verrà valutato se fra Pol zeta e Mip1 vi è interazione fisica. Verrà utilizzata la
medesima tecnica già spiegata per CDC9, ma in questo caso verranno overespressi
REV3 e REV7.
3) Poiché Pol zeta è espressa anche nel nucleo, si valuterà se l’overespressione di Pol
zeta è deleteria per il DNA nucleare.
138
6. Risultati (III parte)
4) Verranno studiati gli effetti della delezione di REV3 sulla mutabilità mitocondriale per
valutare se tali effetti siano complementari rispetto a quelli osservati nel caso
dell’overespressione di REV3.
5) Nei ceppi già overesprimenti Pol zeta, verrà overespresso anche il gene REV1. Come
detto, Rev1 interagisce con Rev7 e favorisce il mantenimento del complesso Rev3Rev7 e l’attività di Pol zeta. Il gene REV1 verrà clonato nel plasmide multicopia
YEplac181, contenente il marcatore LEU2, con cui verranno trasformati i ceppi
aploidi recanti gli alleli mutanti mip1 e il plasmide YEplac195REV3-REV7. Su questi
ceppi verrà misurata la frequenza di petite e, nel caso di risultati positivi, si procederà
anche con le analisi sopra riportate.
I ceppi aploidi recanti gli alleli mip1 mutati sono stati trattati con diversi agenti antiossidanti
in grado di ridurre l’accumulo dei ROS. Nessuna di queste sostanze si è dimostrata efficace
nel ridurre la frequenza di petite, se non il MitoQ che, a concentrazione 10 µM, ha
determinato una debole riduzione, di circa il 15%, della mutabilità estesa. Questa analisi
suggerisce che nella mutabilità estesa dell’mtDNA dovuta alle mutazioni A692T, G807R ed
E900G non giochino un ruolo cruciale i ROS. Al contrario, il trattamento con MitoQ 10 µM
ha ridotto di più di due volte la frequenza dei mutanti petite nel ceppo diploide
MIP1/mip1Y757C. Sulla base di questa osservazione, e della riduzione della frequenza dei
mutanti petite anche in seguito a trattamento con acido diidrolipoico (capitolo 4), è lecito
pensare che l’accumulo di delezioni nell’mtDNA in presenza della mutazione Y757C sia
mediato parzialmente dall’accumulo di ROS. Questi risultati sono coerenti con i risultati
riportati da Graziewicz et al., 2007, che hanno mostrato come la polimerasi umana Y955C
tenda ad accumulare nel DNA la base ossidata 8-oxo-dG.
139
7. Risultati (IV parte)
7. Risultati (IV parte):
Studio di uno SNP nel gene MIP1
codificante
la
DNA
polimerasi
mitocondriale
di
Saccharomyces
cerevisiae presente nei ceppi di
laboratorio*
*I risultati discussi in questa sezione sono stati oggetto della seguente pubblicazione:
Baruffini E., Lodi T., Dallabona C. and Foury F. (2007). A single nucleotide
polymorphism in the DNA polymerase gamma gene of Saccharomyces cerevisiae laboratory
strains is responsible for increased mitochondrial DNA mutability. Genetics. 177, 1227-1231.
La pubblicazione è riportata come allegato 3.
140
7. Risultati (IV parte)
7.1 Analisi della mutabilità mitocondriale associata all’allele
MIP1[S] e all’allele MIP1[Σ]
In tutti gli esperimenti realizzati in questo studio è stato utilizzato il ceppo W303 o suoi
derivati. Nell’analogo studio condotto da Stuart et al., 2006 circa gli effetti delle mutazioni
equivalenti a mutazioni patologiche inserite in MIP1 è stato usato un diverso ceppo, ma
isogenico a W303 per quanto riguarda l’allele MIP1 selvatico. Poiché l’allele MIP1 del ceppo
W303 ha la stessa sequenza del ceppo S288c, utilizzato per la determinazione della sequenza
dell’intero genoma (riportata in banche dati al sito www.yeastgenome.org), tale allele verrà
chiamato in seguito MIP1[S].
MIP1 è stato clonato per la prima volta da Foury et al., 1989, mediante trasformazione con
una banca genomica di un ceppo mip1-1. La banca genomica era stata costruita utilizzando il
DNA del ceppo Σ1278b, per cui l’allele MIP1 identificato da Foury et al. verrà in seguito
chiamato MIP1[Σ].
Negli studi in cui sono stati utilizzati ceppi contenenti l’allele MIP1[S] si osservavano nel
wild type frequenze di petite del 2-6% a 28°C (questo studio, capitolo 4; Stuart et al., 2006) e
frequenze del 10% a 36°C (questo studio, capitolo 4). Al contrario, l’accumulo di petite che si
osservava utilizzando l’allele MIP1[Σ] erano inferiori allo 0.5% sia a 28°C che a 37°C (Hu et
al., 1995). Sebbene la stima dei petite fosse stata fatta utilizzando diverse tecniche, i valori
sono estremamente diversi soprattutto ad alte temperature. Queste differenze sono
difficilmente imputabili a differenze del background genetico, visto che anche negli studi
condotti utilizzando l’allele MIP1[Σ], questo era inserito nel ceppo W303-1B.
Per approfondire la causa di queste differenze è stata misurata la frequenza di petite nel ceppo
DWM-5A (∆mip1) trasformato alternativamente con l’allele MIP1[S] o con l’allele MIP1[Σ],
ottenendo così i ceppi DWM-5A/pFL39MIP1[S] e DWM-5A/pFL39MIP1[Σ]. Sui ceppi è
stato dapprima misurato l’accumulo di mutanti petite dopo crescita su terreno solido, a 28°C,
a 36°C, a 37°C e a 38,5°C. I risultati sono riportati in allegato 3, figura 1 A.
Come mostrato, il ceppo DWM-5A trasformato con l’allele MIP1[S] presentava un accumulo
di petite 4 volte superiore al ceppo trasformato con l’allele MIP1[Σ]. Inoltre il ceppo recante
l’allele MIP1[S], a differenza del ceppo trasformato con l’allele MIP1[Σ], mostrava un
accumulo di petite dipendente dalla temperatura, raggiungendo valori del 21% a 36°C, del
35% a 37°C e del 64% a 38,5°C. E’ stata successivamente misurato, mediante incrocio con
ceppi mit- (capitolo 4), la frequenza dei cloni rho0 tra i petite. Mentre a 28°C la percentuale di
rho0 non risulta differente, a 36°C la percentuale di cloni rho0 è 2,5 volte maggiore per il
ceppo recante l’allele MIP1[S] rispetto al ceppo recante l’allele MIP1[Σ] (allegato 3, figura 1
B). Infine, anche la frequenza di mutazioni puntiformi è risultata di 6 volte maggiore nel
ceppo recante l’allele MIP1[S] (allegato 3, figura 1 C).
Da questi risultati è emerso che all’allele MIP1[S] è associato un maggior accumulo di petite,
soprattutto ad alte temperature, e una maggiore infedeltà. Poiché il background genetico in cui
141
7. Risultati (IV parte)
è stata condotta l’analisi è lo stesso, si è concluso che le differenze devono essere dovute alle
differenze amminoacidiche fra la proteina Mip1[S] e la proteina Mip1[Σ].
7.2 Confronto in silico fra Mip[Σ] e Mip1[S]
Le sequenze delle due ORF MIP1[Σ] e MIP1[S] sono state allineate mediante il programma
ClustalW. L’allineamento completo è riportato in figura 7.1.
MIP1[Σ] : ATGACGAAATTGATGGTTAGATTTGAATGCATGCTGCGAATGGTGCGGCGGCGGCCGCTGCGTGTGCAGTTTTGTGCTCG :
MIP1[S] : ATGACGAAATTGATGGTTAGATCTGAATGCATGCTGCGAATGGTGCGGCGGCGGCCGCTGCGTGTGCAGTTTTGTGCTCG :
80
80
MIP1[Σ] : ATGGTTCTCCACAAAGAAGAATGCCGCAGAAGCACCCAGGATTAATCCTGTGGGGATACAGTATTTAGGTGAGTCTTTGC :
MIP1[S] : ATGGTTCTCCACAAAGAAGAATACCGCAGAAGCACCCAGGATTAATCCTGTGGGGATACAGTATTTAGGTGAGTCTTTGC :
160
160
MIP1[Σ] : AAAGACAGGTATTTGGTAGTTGCGGTGGTAAAGATGAGGTGGAGCAAAGCGACAAACTGATGGAGTTATCGAAAAAGTCG :
MIP1[S] : AAAGACAGGTATTTGGTAGTTGCGGTGGTAAAGATGAGGTGGAGCAAAGCGACAAACTTATGGAGTTATCGAAAAAGTCG :
240
240
MIP1[Σ] : CTAAAGGACCATGGGTTGTGGGGGAAGAAGACGCTCATCACGGATCCAATATCGTTTCCTCTGCCGCCACTACAAGGCAG :
MIP1[S] : CTAAAGGACCATGGGTTGTGGGGGAAGAAGACGCTCATCACGGATCCAATATCGTTTCCTCTGCCGCCACTACAAGGCAG :
320
320
MIP1[Σ] : GTCGCTAGATGAGCATTTCCAGAAGATTGGGCGTTTCAATTCTGAACCGTACAAGAGTTTTTGCGAGGACAAGTTCACGG :
MIP1[S] : GTCGCTAGATGAGCATTTCCAGAAGATTGGGCGTTTCAATTCTGAACCGTACAAGAGTTTTTGCGAGGACAAGTTCACGG :
400
400
MIP1[Σ] : AGATGGTGGCACGACCGGCGGAATGGCTGCGGAAGCCAGGCTGGGTTAAATACGTACCTGGAATGGCACCCGTCGAAGTG :
MIP1[S] : AGATGGTGGCACGACCGGCGGAATGGCTGCGGAAGCCAGGCTGGGTTAAATACGTACCTGGAATGGCACCCGTCGAAGTG :
480
480
MIP1[Σ] : GCATACCCAGACGAAGAGCTGGTGGTGTTTGATGTAGAAACACTCTATAACGTCTCTGACTATCCGACTTTGGCCACGGC :
MIP1[S] : GCATACCCAGACGAAGAGCTGGTGGTGTTTGATGTAGAAACACTCTATAACGTCTCTGACTATCCGACTTTGGCCACGGC :
560
560
MIP1[Σ] : CTTGTCATCGACGGCGTGGTACCTTTGGTGTTCGCCGTTCATATGTGGTGGTGATGATCCTGCTGCGCTGATACCCCTAA :
MIP1[S] : CTTGTCATCGACGGCGTGGTACCTTTGGTGTTCGCCGTTCATATGTGGTGGTGATGATCCTGCTGCACTGATACCCCTAA :
640
640
MIP1[Σ] : ACACATTGAATAAAGAGCAAGTAGTAATTGGTCACAATGTTGCGTATGATAGGGCACGGGTTCTCGAAGAATACAACTTC :
MIP1[S] : ACACATTGAATAAAGAGCAAGTAATAATTGGTCACAATGTTGCGTATGATAGGGCACGGGTTCTCGAAGAATACAACTTC :
720
720
MIP1[Σ] : AGGGACTCGAAGGCGTTTTTCCTCGACACTCAATCTCTGCATATTGCATCTTTCGGGCTGTGTTCAAGACAGCGTCCGAT :
MIP1[S] : AGGGACTCGAAGGCGTTTTTCCTCGACACTCAATCTCTGCATATTGCATCTTTCGGGCTGTGTTCAAGACAACGTCCGAT :
800
800
MIP1[Σ] : GTTCATGAAGAATAACAAGAAAAAAGAGGCAGAAGTGGAATCGGAAGTACATCCAGAAATTTCCATAGAAGATTATGACG :
MIP1[S] : GTTCATGAAGAATAACAAGAAAAAAGAGGCAGAAGTGGAATCGGAAGTACATCCAGAAATTTCCATAGAAGATTATGACG :
880
880
MIP1[Σ] : ACCCTTGGTTAAATGTGTCTGCTTTAAACTCGCTAAAGGATGTAGCGAAATTTCACTGCAAGATAGATCTTGATAAGACT :
MIP1[S] : ACCCTTGGTTAAATGTGTCTGCTTTAAACTCGCTAAAGGATGTAGCGAAATTTCACTGCAAGATAGATCTTGATAAGACT :
960
960
MIP1[Σ] : GATAGAGATTTCTTTGCTTCCACAGATAAATCAACGATAATAGAAAATTTCCAAAAACTGGTCAACTACTGCGCCACTGA : 1040
MIP1[S] : GATAGAGATTTCTTTGCTTCCACAGATAAATCAACGATAATAGAAAATTTCCAAAAACTGGTCAACTACTGCGCCACTGA : 1040
MIP1[Σ] : CGTAACGGCCACAAGCCAAGTGTTTGATAAGATTTTCCCTGTTTTCCTGAAAAAGTGTCCTCATCCAGTTTCGTTTGCAG : 1120
MIP1[S] : CGTAACGGCCACAAGCCAAGTGTTTGATGAGATTTTCCCTGTTTTCCTGAAAAAGTGTCCTCATCCAGTTTCGTTTGCAG : 1120
MIP1[Σ] : GTTTAAAGTCCTTAAGCAAATGCATTCTGCCGACGAAGCTTAACGACTGGAATGATTACTTGAACAGCTCTGAGTCTTTG : 1200
MIP1[S] : GTTTAAAGTCCTTAAGCAAATGCATTCTGCCGACGAAGCTAAACGACTGGAATGATTACTTGAACAGCTCTGAGTCTTTG : 1200
MIP1[Σ] : TACCAACAGTCCAAAGTCCAAATAGAATCCAAAATTGTTCAAATCATAAAAGATATCGTCCTGTTGAAGGACAAACCAGA : 1280
MIP1[S] : TACCAACAGTCCAAAGTCCAGATAGAATCCAAAATTGTTCAAATCATAAAAGATATCGTCCTGTTGAAGGACAAACCAGA : 1280
MIP1[Σ] : TTTTTATCTCAAGGATCCTTGGTTATCACAATTGGATTGGACCACCAAACCTTTAAGATTGACAAAGAAAGGTGTTCCTG : 1360
MIP1[S] : TTTTTATCTCAAGGATCCCTGGTTATCACAATTGGATTGGACCACCAAACCTTTAAGATTGACAAAGAAAGGTGTTCCTG : 1360
MIP1[Σ] : CAAAGTGTCAAAAGCTGCCCGGCTTTCCAGAATGGTATAGACAACTTTTTCCCTCAAAGGACACTGTAGAACCTAAGATC : 1440
MIP1[S] : CAAAGTGTCAAAAGCTGCCCGGCTTTCCAGAATGGTATAGACAACTTTTTCCCTCAAAGGACACTGTAGAACCTAAGATC : 1440
MIP1[Σ] : ACTATTAAATCAAGAATAATTCCGATTTTGTTCAAGTTATCGTGGGAGAATTCCCCCGTAATATGGTCGAAGGAGTCTGG : 1520
MIP1[S] : ACTATTAAATCAAGAATAATTCCGATTTTGTTCAAGTTATCGTGGGAGAATTCCCCCGTAATATGGTCGAAGGAGTCTGG : 1520
MIP1[Σ] : ATGGTGCTTCAACGTGCCCCATGAACAAGTAGAAACATACAAGGCTAAAAATTATGTTTTGGCAGATAGTGTATCTCAAG : 1600
MIP1[S] : ATGGTGCTTCAACGTGCCCCATGAACAAGTAGAAACATACAAGGCTAAAAATTATGTTTTGGCAGATAGCGTATCTCAAG : 1600
MIP1[Σ] : AGGAAGAGGAAATAAGGATGAATAACCTAGGATTGCAATGCACAGGTGTTCTTTTCAAAGTACCTCATCCTAATGGGCCC : 1680
MIP1[S] : AGGAAGAGGAAATAAGAACGCATAACCTAGGATTGCAATGCACAGGTGTTCTTTTCAAAGTACCTCATCCCAATGGGCCG : 1680
MIP1[Σ] : ACTTTTAATTGTACTAATCTTTTAACCAAATCGTATAACCATTTTTTTGAAAAGGGCGTACTAAAATCTGAGTCAGAATT : 1760
MIP1[S] : ACTTTTAATTGCACTAATCTTTTAACCAAATCGTATAACCATTTTTTTGAAAAGGGCGTACTAAAATCTGAGTCAGAATT : 1760
MIP1[Σ] : GGCTCATCAGGCTTTACAAATTAACTCTTCAGGTTCTTATTGGATGTCAGCAAGGGAAAGAATCCAATCCCAATTTGTAG : 1840
MIP1[S] : GGCTCATCAGGCTTTACAAATTAACTCTTCAGGGTCTTATTGGATGTCAGCAAGGGAAAGAATCCAATCCCAATTTGTAG : 1840
MIP1[Σ] : TCCCCAATTGTAAATTCCCTAATGAGTTCCAGTCTTTGTCCGCAAAATCGTCGTTAAATAATGAGAAGACAAATGATCTT : 1920
MIP1[S] : TCCCCAGTTGTAAATTCCCTAATGAGTTCCAGTCTTTGTCCGCAAAATCGTCGTTAAATAATGAGAAGACAAATGATCTT : 1920
MIP1[Σ] : GCCATAATTATACCGAAAATCGTCCCCATGGGCACAATCACTAGAAGAGCTGTGGAAAATACGTGGTTAACCGCATCCAA : 2000
MIP1[S] : GCCATAATTATACCGAAAATCGTCCCCATGGGCACAATCACTAGAAGAGCTGTGGAAAATGCGTGGTTAACCGCATCCAA : 2000
MIP1[Σ] : TGCAAAAGCAAATAGGATAGGTTCCGAATTGAAAACTCAAGTCAAAGCTCCTCCAGGTTATTGTTTTGTTGGGGCGGACG : 2080
MIP1[S] : TGCAAAAGCAAATAGGATAGGTTCCGAATTGAAAACTCAAGTCAAAGCTCCTCCAGGTTATTGTTTTGTTGGGGCGGACG : 2080
MIP1[Σ] : TGGATAGTGAGGAATTGTGGATAGCATCTTTAGTCGGTGACTCCATTTTCAATGTTCATGGTGGTACCGCCATTGGTTGG : 2160
142
7. Risultati (IV parte)
MIP1[S] : TGGATAGTGAGGAATTGTGGATAGCATCTTTAGTCGGTGACTCCATTTTCAATGTTCATGGTGGTACCGCCATTGGTTGG : 2160
MIP1[Σ] : ATGTGCTTAGAAGGCACTAAAAACGAAGGTACAGATTTGCACACGAAGACTGCTCAAATTTTGGGGTGTTCTCGTAATGA : 2240
MIP1[S] : ATGTGTTTAGAAGGCACTAAAAACGAAGGTACAGATTTGCACACGAAGACTGCTCAAATTTTGGGGTGTTCTCGTAATGA : 2240
MIP1[Σ] : GGCGAAAATTTTTAATTATGGTAGAATTTACGGCGCTGGTGCTAAATTTGCGAGTCAGTTACTTAAAAGGTTTAACCCAT : 2320
MIP1[S] : GGCGAAAATTTTTAATTATGGTAGAATTTACGGCGCTGGTGCTAAATTTGCGAGTCAGTTACTTAAAAGGTTTAACCCAT : 2320
MIP1[Σ] : CTCTAACTGATGAAGAGACAAAAAAAATTGCGAATAAGTTATATGAAAATACGAAAGGTAAAACGAAAAGATCAAAATTA : 2400
MIP1[S] : CTCTAACTGATGAAGAGACAAAAAAAATTGCGAATAAGTTATATGAAAATACGAAAGGTAAAACGAAAAGATCAAAATTA : 2400
MIP1[Σ] : TTCAAAAAATTTTGGTATGGTGGATCTGAGTCAATTCTATTCAATAAATTAGAAAGCATCGCGGAACAAGAAACTCCAAA : 2480
MIP1[S] : TTCAAAAAATTTTGGTATGGTGGATCTGAGTCAATTCTATTCAATAAATTAGAAAGCATCGCGGAACAAGAAACTCCAAA : 2480
MIP1[Σ] : GACACCGGTACTGGGATGTGGTATTACCTATTCACTTATGAAGAAAAATCTGAGGGCGAATTCCTTTCTACCTTCAAGAA : 2560
MIP1[S] : GACACCGGTACTGGGATGTGGTATTACCTATTCACTTATGAAGAAAAATCTGAGGGCGAATTCCTTTCTACCTTCAAGAA : 2560
MIP1[Σ] : TCAATTGGGCCATCCAGTCATCTGGAGTGGATTATCTACATCTTCTTTGTTGCTCCATGGAATATATTATTAAGAAATAT : 2640
MIP1[S] : TCAATTGGGCCATCCAGTCATCTGGAGTGGATTATCTACATCTTCTTTGTTGCTCCATGGAATATATTATTAAGAAATAT : 2640
MIP1[Σ] : AACCTTGAGGCAAGGCTTTGCATTTCCATCCATGATGAGATTAGATTTTTGGTGAGCGAAAAGGACAAATACAGAGCTGC : 2720
MIP1[S] : AACCTTGAGGCAAGGCTTTGCATTTCCATCCATGATGAGATTAGATTTTTGGTGAGCGAAAAGGACAAATACAGAGCTGC : 2720
MIP1[Σ] : TATGGCTTTGCAAATCAGCAACATATGGACGAGAGCAATGTTTTGCCAGCAAATGGGGATAAATGAATTACCGCAAAACT : 2800
MIP1[S] : TATGGCTTTGCAAATCAGCAACATATGGACGAGAGCAATGTTTTGCCAGCAAATGGGGATAAATGAATTACCGCAAAACT : 2800
MIP1[Σ] : GTGCCTTTTTCTCGCAAGTAGATATTGATTCTGTCATACGTAAAGAAGTCAATATGGACTGCATAACCCCCTCGAACAAA : 2880
MIP1[S] : GTGCCTTTTTCTCGCAAGTAGATATTGATTCTGTCATACGTAAAGAAGTCAATATGGACTGCATAACCCCCTCGAACAAA : 2880
MIP1[Σ] : ACCGCCATTCCTCATGGGGAGGCGCTTGATATCAATCAACTGCTAGACAAACCCAATAGTAAATTGGGTAAACCAAGTCT : 2960
MIP1[S] : ACCGCCATTCCTCATGGGGAGGCGCTTGATATCAATCAACTGCTAGACAAATCCAATAGTAAATTGGGTAAACCAAATCT : 2960
MIP1[Σ] : CGATATCGACAGCAAAGTATCACAATATGCCTATAACTACAGAGAACCTGTATTTGAAGAATATAATAAATCTTATACTC : 3040
MIP1[S] : CGATATCGACAGCAAAGTATCACAATATGCCTATAACTACAGAGAACCTGTATTTGAAGAATATAATAAATCTTATACTC : 3040
MIP1[Σ] : CAGAGTTCTTAAAATATTTTCTTGCGATGCAAGTCCAGTCAGATAAGCGCGATGTGAATCGGCTAGAAGATGAGTATCTG : 3120
MIP1[S] : CAGAGTTCTTAAAATATTTTCTTGCGATGCAAGTCCAGTCAGATAAGCGCGATGTGAATCGGCTAGAAGATGAGTATCTG : 3120
MIP1[Σ] : CGGGAGTGTACATCCAAAGAATACGCTAGAGATGGGAACACTGCAGAGTACAGCCTCCTAGACTATATAAAGGATGTCGA : 3200
MIP1[S] : CGGGAGTGTACATCCAAAGAATACGCTAGAGATGGGAACACTGCAGAGTACAGCCTCCTAGACTATATAAAGGATGTCGA : 3200
MIP1[Σ] : GAAGGGCAAAAGGACTAAAGTACGTATTATGGGATCCAATTTTTTAGATGGTACCAAAAATGCCAAAGCTGATCAACGAA : 3280
MIP1[S] : GAAGGGCAAAAGGACTAAAGTACGTATTATGGGATCCAATTTTTTAGATGGTACCAAAAATGCCAAAGCTGATCAACGAA : 3280
MIP1[Σ] : TCAGATTACCTGTCAATATGCCAGATTATCCCACACTTCATAAAATTGCTAACGATTCAGCAATTCCAGAAAAGCAATTG : 3360
MIP1[S] : TCAGATTACCTGTCAATATGCCAGATTATCCCACACTTCATAAAATTGCTAACGATTCAGCAATCCCAGAAAAGCAATTG : 3360
MIP1[Σ] : CTGGAGAACAGGAGAAAGAAGGAGAACAGGATAGATGACGAAAATAAGAAAAAATTAACCAGAAAAAAGAATACCACGCC : 3440
MIP1[S] : CTGGAGAACAGGAGAAAGAAGGAAAACAGGATAGATGACGAAAATAAGAAAAAATTAACCAGAAAAAAGAATACCACGCC : 3440
MIP1[Σ] : TATGGAAAGGAAGTACAAAAGAGTGTATGGTGGCAGGAAGGCATTTGAAGCGTTCTATGAATGTGCAAATAAACCATTAG : 3520
MIP1[S] : TATGGAAAGGAAGTACAAAAGAGTGTATGGTGGCAGGAAGGCATTTGAAGCGTTCTATGAATGTGCAAATAAACCGTTAG : 3520
MIP1[Σ] : ACTATACTTTGGAGACAGAAAAACAATTCTTTAATATTCCTATAGATGGAGTGATTGACGACGTTCTGAACGACAAATCT : 3600
MIP1[S] : ACTATACTTTGGAGACAGAAAAACAATTCTTTAATATTCCTATAGATGGAGTGATTGACGACGTTCTGAACGACAAATCT : 3600
MIP1[Σ] : AATTATAAAAAGAAACCATCACAAGCAAGAACGGCATCATCATCGCCAATAAGAAAGACTGCGAAAGCAGTACATTCCAA : 3680
MIP1[S] : AATTATAAAAAGAAACCATCACAAGCAAGAACGGCATCATCATCGCCAATAAGAAAGACTGCGAAAGCAGTACATTCCAA : 3680
MIP1[Σ] : AAAATTGCCGGCAAGGAAGTCAAGCACTACAAATAGAAATTTGGTTGAGCTGGAAAGGGACATTACTATTTCTAGAGAGT : 3760
MIP1[S] : AAAATTGCCGGCAAGGAAGTCAAGCACTACAAATAGAAATTTGGTTGAGCTGGAAAGGGACATTACTATTTCTAGAGAGT : 3760
MIP1[Σ] : ACTAG : 3765
MIP1[S] : ACTAG : 3765
Figura 7. 1: Allineamento degli alleli MIP1[S] e MIP1[Σ]. In verde gli SNP silenti, in giallo gli SNP non
silenti.
Dall’allineamento emerge che fra le due sequenze sono presenti 26 SNP. 16 di questi SNP
sono silenti, e dunque non provocano sostituzioni nella sequenza aminoacidica. 10 SNP sono
non silenti e causano altrettante sostituzioni nella sequenza aminoacidica. Le sostituzioni sono
riportate in allegato 3, tabella 1, in cui il primo aminoacido si riferisce a Mip1[Σ].
Le due isoforme proteiche sono state allineate con tutte le pol γ note di funghi e animali
mediante il programma ClustalW al sito http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/. Sette dei 10
residui identificati come polimorfici nell’allineamento fra Mip1[Σ] e Mip1[S] (F8, A35,
M540, N541, N616, P978 e S986, in cui l’aminoacido si riferisce alla sequenza di Mip1[Σ])
erano scarsamente o non erano affatto conservati nelle varie polimerasi, suggerendo che
questi residui probabilmente non svolgono un ruolo importante nella catalisi ad opera di
143
7. Risultati (IV parte)
Mip1. Il residuo V222 è alternativamente occupato da valina, come in Mip1[Σ], o da
isoleucina, come in Mip1[S], in quasi tutte le polimerasi fungine e animali, suggerendo che
sia valina che isoleucina, che hanno caratteristiche fisiche e di ingombro simili, possano
sostenere al meglio la catalisi (figura 7.2).
S.cerevisiae S288C
218:KEQVIIGHN
353:QVFDEIFPV
657:AVENAWLTA
S.cerevisiae Σ1278b
Kluyveromyces lactis
Candida albicans
Candida glabrata
Eremothecium gossypii
Pichia pastoris
Debaryomyces hansenii
Yarrowia lipolytica
Schizosaccharomyces pombe
Neurospora crassa
Aspergillus fumigatus
Aspergillus terreus
Aspergillus oryzae
Aspergillus nidulans
Phaeosphaeria nodorum
Coccidioides immitis
Gibberella zeae
Magnaporthe grisea
Chaetomium globosum
Cryptococcus neoformans
Drosophila melanogaster
Drosophila pseudoobscura
Anopheles gambiae
Tribolium castaneum
Apis mellifera
Strongylocentrotus purpuratus
Xenopus laevis
Mus musculus
Rattus norvegicus
Canis familiaris
Bos taurus
Macaca mulatta
Pan troglodytes
Homo sapiens
218:KEQVVIGHN
220:RPKLIVGHN
248:KPKVIIGYN
232:KEKLIIGHN
221:RPQVIIGHN
194:TEKFIVGHN
229:NPKLIIGYN
222:EPRVIVGHN
217:KGALFVGHN
237:VDRIIVGHN
241:QPRIVVGHN
236:QPRIVIGHN
236:QPRIVVGHN
236:KPRIIVGHN
233:QHRIIVGHN
240:NSRIVVGHN
222:KDRIIVGHN
275:KDRIIVGHN
244:KERVIVGHN
291:IPRIVIGHN
251:GPGLVVGHN
256:GPGLVVGHN
198:RPRVVIGHN
190:KPKIIIGHN
200:KPKIIVGHN
292:TERLIVGHN
236:TERLVVGHN
245:QEQLVVGHN
245:QEQLVVGHN
261:QEQLVVGHN
246:QERLVVGHN
251:QEQLVVGHN
259:QEQLVVGHN
262:QEQLVVGHN
353:QVFDKIFPV
359:KVFDEVFPK
424:EVTKKLFPV
372:KVFDKVFPS
356:KVFDKVYPL
346:KVFQKVYPK
381:SVTAKLFSQ
374:QVFKKILPL
361:QVFKKVFPQ
383:QVYQVVFPN
387:RVYKKVFPN
384:RVYKKVFPN
384:RVYKKVFPN
384:RVYKKVFLN
381:RVYQKVFPL
386:RVYRKVFPN
367:RVYQIVFPN
421:RVYSIVFPN
390:RVYQVVFPN
457:DVYAKVFPL
372:RILRVLYPL
377:RVLRVLYPM
319:AVLQRLWPL
300:SVLNELFPM
319:NVLCKLFPI
432:KVISKLLPM
379:EVFQEQFPL
388:EVFQQQLPL
387:EVFQQQLPL
403:EIFQQQLPL
388:EVFQQQLPL
394:EVFQQQLPL
402:EVFQQQLPL
405:EVFQQQLPL
657:AVENTWLTA
648:SVENTWLTA
731:ATENTWLTA
683:AVESTWLTA
645:AVENTWLTA
627:AVENTWLTA
695:ATENTWLTA
666:CVENTWLTA
645:AVENTWLTA
704:AVERTWLTA
682:AVENTWLTA
676:AVENTWLTA
676:AVENTWLTA
678:AVENTWLTA
679:SVENTWLTA
684:AVENTWLTA
763:AVENTWLTA
727:AVENTWLTA
693:AVENTWLTA
958:AVEATWLTA
772:AMEPTWMTA
777:AMEPTWMTA
704:AMEPTWMTA
681:AVEPTWMTA
717:AVEPTWMTA
797:AVEPTWLTA
824:AVEPTWLTA
833:AVEPTWLTA
831:AVEPTWLTA
855:AVEPTWLTA
838:AVEPTWLTA
843:AVEPTWLTA
851:AVEPTWLTA
854:AVEPTWLTA
Figura 7. 2: Allineamento di DNA polimerasi γ di S. cerevisiae, fungine e animali. Vengono riportate le
regioni attorno al residuo V222, K357 e T661. In grassetto i residui conservati in più polimerasi.
Il residuo K357 è alternativamente occupato da lisina, come in Mip1[Σ], o da glutammato,
come in Mip1[S], in quasi tutte le polimerasi fungine, suggerendo che sia una carica positiva
che negativa viene accettata in questa posizione, almeno nelle polimerasi fungine (figura 7.2).
Al contrario, il residuo T661 è occupato da treonina in tutte le polimerasi, eccetto che in
Mip1[S], dove è presente alanina (figura 7.2). Anche lo stretch attorno a T661 è altamente
conservato, suggerendo che questa regione svolga un ruolo importante nel processo catalitico.
In particolare la perdita di un gruppo alcolico in seguito alla sostituzione di treonina con
alanina potrebbe essere deleteria per la catalisi.
144
7. Risultati (IV parte)
7.3 Analisi della mutabilità mitocondriale associata all’allele
MIP1[S]A661T
Per valutare se la sostituzione T661A fosse responsabile di una ridotta capacità della
polimerasi Mip1[S] di replicare correttamente il mtDNA è stata creata una variante allelica in
cui l’alanina 661 di Mip1[S] è sostituita con treonina, chiamata MIP1[S]A661T. L’allele
MIP1[S]A661T è stato ottenuto mediante mutagenesi sito-specifica mediante la tecnica
dell’overlap delle estremità (Ho et al.,1989).
L’analisi ha mostrato che il ceppo DWM-5A contenente l’allele MIP1[S]A661T mostrava la
stessa frequenza di petite e di rho0 del ceppo contenente l’allele MIP1[Σ] (allegato 3, figura 1
A e B). Questo dimostra che l’alta mutabilità estesa associata all’allele MIP1[S] è dovuta alla
presenza di alanina in posizione 661. Dalla misurazione della frequenza dei mutanti EryR
(allegato 3, figura 1 C) è emerso che la sostituzione A661R riduceva la frequenza delle
mutazioni puntiformi, sebbene non come si era osservato nel ceppo recante l’allele MIP1[Σ].
Quindi la presenza di Ala661 è deleteria anche per la fedeltà della replicazione, sebbene
probabilmente altri residui influenzino la fedeltà.
L’analisi precedente dimostra chiaramente che l’alta mutabilità dell’mtDNA associata
all’allele MIP1[S], soprattutto ad alte temperature, è dovuta alla sostituzione A661T nella
proteina. Questo risultato è stato confermato da due set di esperimenti.
1) La frequenza dei petite è stata misurata a 28°C e a 36°C in cinque ceppi di laboratorio,
W303-1B, BY4742, D273-10B/A1, FL100 e Σ1278b (Sherman, 1964). Come
mostrato in allegato 3, tabella 2, i ceppi D273-10B/A1, FL100 e Σ1278b producono
petite a bassa frequenza, sia a 28°C che a 36°C. Al contrario i ceppi W303-1B e
BY4742 producono alti livelli di petite, soprattutto a 36°C. Mentre la sequenza di
BY4742, isogenico a S288c, contiene alanina, la sequenza degli altri ceppi, che è stata
determinata mediante sequenziamento e presenta gli stessi residui di MIP1[Σ],
contiene treonina. Di conseguenza, l’alta mutabilità mitocondriale è sempre associata
alla presenza di alanina in posizione 661.
2) Gli alleli MIP1[S] e a MIP1[S]A661T, clonati nel plasmide centromerico pFL38, sono
stati introdotti nel ceppo D273-10B/A1, uno dei ceppi che mostra la minore frequenza
di petite spontanei (Sherman, 1964). E’ stato quindi deleto l’allele MIP1[Σ] al locus
genomico e analizzata la frequenza di petite a 28°C e a 36°C. Sono stati ottenuti
risultati molto simili a quelli ottenuti nel ceppo DWM-5A (allegato 3, tabella 3). In
particolare a 28°C l’allele MIP1[S] determinava un frequenza di circa 3 volte
maggiore rispetto alla frequenza dei petite dovuti all’allele pFL38MIP1[S]A661T.
Inoltre, mentre l’accumulo di petite era insensibile alla temperatura nel ceppo
contenente l’allele MIP1[S]A661T, nel ceppo contenente l’allele MIP1[S] si osserva un
incremento di circa 5 volte a 36°C rispetto a 28°C.
7.4 Dominanza/recessività della mutazione T661A
145
7. Risultati (IV parte)
E’ stata determinata la frequenza dei mutanti petite e dei mutanti EryR nel ceppo DWM-5A
trasformato con due copie dell’allele MIP1[S], con una copia dell’allele MIP1[S] e con una
dell’allele MIP1[S]A661T, oppure con due copie dell’allele MIP1[S]A661T (tabella 7.1):
Ceppo
DWM-5A/MIP1[S]/MIP1[S]
DWM-5A/MIP1[S]/MIP1[S]A661T
DWM-5A/MIP1[S]A661T/MIP1[S]A661T
Frequenza dei petite
(%)
28°C
36°C
1,0
5,2
0,7
1,0
0,4
0,5
Frequenza
EryR
2,2 x 108
1,2 x 108
ND
Tabella 7. 1: Frequenza dei mutanti petite e dei mutanti EryR nel ceppo DWM-5A trasformato con due
copie dei diversi alleli MIP1[S] e MIP1[S]A661T. ND: non determinato.
Dall’analisi emerge che la sostituzione T661A è recessiva, poiché il ceppo DWM5A/MIP1[S]/MIP1[S]A661T mostra valori molto vicini a quelli del ceppo DWM5A/MIP1[S]A661T/MIP1[S]A661T, soprattutto a 36°C.
Inoltre è possibile osservare un effetto di dosaggio genico. Il ceppo recante due copie di
MIP1[S] (allegato 3, figura 1) mostra una riduzione della frequenza di petite di circa 4 volte a
36°C rispetto al ceppo con una sola copia di MIP1[S]. Lo stesso vale per l’allele
MIP1[S]A661T, ma in questo caso le differenze sono molto più scarse visto i bassi valori basali
del ceppo recante una sola copia di MIP1[S]A661T.
7.5 Efficienza catalitica delle polimerasi Mip1[S], Mip1[Σ] e
Mip1[S]A661T
E’ facilmente ipotizzabile che l’aumento della mutabilità estesa in presenza dell’allele
MIP1[S] sia dovuto ad una ridotta efficienza dell’attività catalitica della polimerasi Mip1[S].
Pertanto è stata misurata l’attività catalitica delle tre isoforme polimerasiche. Come nel caso
precedente (capitolo 5), i tre alleli sono stati inseriti nel plasmide pLGALZ3 sotto il controllo
del promotore inducibile GAL1. I ceppi W303-1B/plGALMIP1[Σ], W3031B/plGALMIP1[S]A661T, W303-1B/plGALMIP1[S] e W303-1B/plGALZ3 sono stati fatti
crescere in galattosio per 15 ore per indurre l’espressione della proteina. Successivamente,
sono state estratte le proteine solubili totali, sulle quali è stata fatta un’analisi Western per
determinare la quantità relativa di Mip1 (figura 7.3 A).
146
7. Risultati (IV parte)
Figura 7. 3: (A) Western blot sulla proteina Mip1 estratta dai ceppi W303-1B/plGALMIP1[Σ], W3031B/plGALMIP1[S]A661T, W303-1B/plGALMIP1[S] e W303-1B/plGALZ3 dopo induzione da galattosio; (B)
gap filling activity sugli estratti dei ceppi W303-1B/plGALMIP1[Σ], W303-1B/plGALMIP1[S]A661T, W3031B/plGALMIP1[S]. I valori sono stati normalizzati in base alla quantità relativa di proteina Mip1
presente negli estratti. I valori derivano da due esperimenti indipendenti.
L’immagine indica che le proteine sono presenti in quantità equivalenti. (E’ stato condotto in
parallelo un Western, non mostrato, con diverse quantità di Mip1p così da risalire alla quantità
esatta di ciascuna lane mediante confronto). E’ da notare che, in questo caso, sono osservabili
due bande distinte, riconducibili la più alta alla proteina Mip1 intera, cioè contenente il
segnale MTS per l’entrata nei mitocondri, e l’altra alla proteina tagliata e funzionale.
L’efficienza catalitica è stata misurata attraverso saggi di gap filling su calf thimus DNA
attivato come incorporazione dei dNTP in strutture duplex con gap alle estremità a 30°C.
Come mostrato in figura 7.3 B, l’efficienza catalitica di Mip1[S] era inferiore di circa il 20%
rispetto all’efficienza catalitica di Mip1[Σ] e di Mip1[S]A661T, che risultava simile. Questi
risultati dimostrano come la sostituzione della treonina in posizione 661 con alanina riduca
l’attività catalitica della proteina.
7.6 Analisi del polimorfismo 661 in ceppi naturali
E’ stata condotta un’analisi del polimorfismo del residuo Mip1661 in una serie di ceppi
naturali: 20 ceppi enologici o per la panificazione di origine italiana, un ceppo enologico di
riferimento di origine canadese (L1056) e il ceppo EM93, un ceppo isolato in California da
147
7. Risultati (IV parte)
fichi marci (Mortimer and Johnston, 1986). Questo ceppo è il progenitore di S288c, che ha
ereditato l’88% del suo genoma. E’ stato analizzato se i ceppi naturali posseggono in
posizione 661 alanina o treonina. Alla T661 è associata in posizione 1981 di MIP1 una A,
mentre alla A661 è associata in posizione 1981 di MIP1 una G. Alla presenza di A in
posizione 1981 è associato un sito per l’enzima di restrizione BsaAI. In presenza di G in
posizione 1981, questo sito di restrizione è perso.
Una regione di 1234 bp contenente il polimorfismo è stata amplificata mediante PCR su
colonia sui 22 ceppi naturali. I 22 amplificati sono stati digeriti con BsaAI e tutti, tranne
EM93, mostravano un pattern di digestione costituito da una banda di 937 bp e una di 347 bp,
che in allegato 3, figura 2 A è rappresentato dal pattern del ceppo M28. Tutti i ceppi naturali,
eccetto EM93, posseggono pertanto treonina in posizione 661. EM93 mostrava un pattern
costituito dalle due bande di 937 bp e 347 bp, ma anche da una banda non digerita di 1234 bp
(allegato 3, figura 2 A). Questa osservazione suggeriva che in EM93, che è diploide, sono
presenti due alleli MIP1, uno contenente treonina e l’altro alanina.
Per escludere che la banda non digerita osservata in EM93 derivasse da una digestione
parziale, la regione attorno alla posizione 1981 di MIP1 è stata sequenziata nel ceppo EM93.
Come controlli sono stati inoltre sequenziati il DNA del ceppo S288c, che possiede G in
posizione 1991, e Σ1278b, che possiede A. Come mostrato in allegato 3, figura 2 B, il ceppo
EM93 mostra in posizione 1981 due picchi, uno corrispondente ad A e l’altro a G. Questa
osservazione ha dimostrato che in EM93 sono presenti due alleli.
Il ceppo EM93 è stato fatto sporificare e 20 aschi sono stati dissezionati, Le 20 tetradi erano
costituite solo da due colonie crescenti, facendo supporre che in EM93 sia presente in
eterozigosi una mutazione letale recessiva. Su otto spore di quattro tetradi è stata fatta l’analisi
di restrizione con BsaAI, riportata in figura 7.4.
Figura 7. 4: Analisi di restrizione su otto spore di quattro tetradi derivanti dalla sporificazione di EM93.
La regione amplificata con i primer MIPH e MIPL è stata digerita con BsaAI. Lane 1 e 2: spore della
tetrade A; lane 3 e 4: spore della tetrade B; lane 5 e 6: spore della tetrade C; lane 7 e 8: spore della tetrade
D; lane 9: EM93.
148
7. Risultati (IV parte)
Come mostrato chiaramente in figura, il 50% delle spore possedeva l’allele codificante per
Mip1 contenente alanina e il 50% delle spore possedeva l’allele codificante per Mip1
contenente treonina.
Recentemente l’istituto Sanger ha rilasciato pubblicamente le sequenze parziali di 37 ceppi di
S. cerevisiae (http://www.sanger.ac.uk/Teams/Team71/durbin/sgrp/index.shtml), di cui 32
naturali isolati in varie parti del mondo, e cinque di laboratorio. Fra questi ultimi vi sono
W303, S288c, YPGM, probabilmente isogenico a S288c, SK1 e Y55. Mediante analisi
bioinformatica, sono stati cercati quei ceppi per i quali MIP1, o parte di MIP1, è stato
sequenziato. 25 dei 37 ceppi mostravano la sequenza di MIP1 attorno alla posizione 1981. I
21 ceppi naturali mostravano la presenza di A in posizione 1981, a cui corrisponde treonina.
W303, S288c, YPGM, come atteso, mostravano la presenza di una G, a cui corrisponde
treonina, mentre SK1 mostrava la presenza di A.
Questa analisi, insieme alla precedente analisi di restrizione, ha dimostrato che i ceppi naturali
contengono treonina in posizione 661, eccetto EM93 che possiede un isoforma con alanina e
una con treonina.
7.7 Analisi degli altri SNP di MIP1
E’ stato valutato quali polimorfismi sono presenti nelle altre posizioni di MIP1 nei ceppi
naturali. In primo luogo il gene MIP1 è stato sequenziato nei ceppi enologici M55, NWS
Chardonnay e L1056. Tutti e tre i ceppi mostravano gli stessi polimorfismi osservati
nell’allele MIP1[S], eccetto per la presenza di alanina in posizione 661. La sequenza dei tre
ceppi è uguale pertanto alla sequenza dell’allele MIP1[S]A661T. Sebbene siano stati sequenziati
solo tre ceppi, questa osservazione sembra far ipotizzare che nella maggior parte dei ceppi,
compreso EM93, sia presente la stessa sequenza osservata in S288c (eccetto ovviamente
l’alanina). I 21 ceppi naturali per cui è disponibile la sequenza all’istituto Sanger mostravano
invece diverse combinazioni di polimorfismi, come riportato in tabella 7.2.
Ceppo
Origine
BC187
Napa Valley, USA S
SNP Ceppo
UWOPS83-787.3 Bahamas
SeΣ
DBVPG1373
Olanda
UWOPS87-2421 Hawaii
SeΣ
?
Origine
SNP
DBVPG1788
Finlandia
S
Y12
Africa
S
DBVPG1853
Etiopia
S
Y9
Giappone
SeΣ
DBVPG6040
Olanda
S
YIIc17-E5
Sauternes, Francia
S
DBVPG6044
Africa occidentale S
YJM975
Bergamo, Italia
?
K11
Giappone
S e Σ YJM981
Bergamo, Italia
?
L-1528
Cile
S
YPS128
Pennsylvania, USA ?
NCYC361
Irlanda
S
YPS606
Peensylvania, USA ?
UWOPS05-217.3 Malesia
S e Σ YS9
UWOPS05-227.2 Malesia
Singapore
S
?
Tabella 7. 2: SNP presenti nei ceppi dell’istituto Sanger. S significa che gli SNP sono gli stessi di quelli
presenti in MIP1[S]; S e Σ significa che parte degli SNP sono di MIP1[S] e parte di MIP1[Σ].
149
7. Risultati (IV parte)
La maggior parte dei ceppi mostravano gli stessi polimorfismi presenti in MIP1[S],
confermando l’ipotesi precedente. Alcuni ceppi, in particolare di origine orientale,
mostravano combinazioni di SNP di MIP1[S] e di SNP di MIP1[Σ]. Sebbene non mostrato, i
diversi ceppi “misti” presentano combinazioni diverse le une dalle altre e ceppo-specifiche. In
nessuno dei ceppi naturali sono stati identificati gli stessi SNP di MIP1[Σ].
7.8 Allelismo di MMC1 e MIP1
Negli anni ’80 nel nostro dipartimento è stato identificato un gene, MMC1, la cui mutazione
incrementava l’accumulo dei petite (Marmiroli et al., 1980). In questo studio venne
dimostrato come alcuni ceppi aploidi di laboratorio, fra cui S288c, presentassero alte
frequenze di petite (8-10%), a cui era associata anche una maggiore produzione di mutanti
EryR e CapR, e vennero chiamati “alto produttori” (di petite). Quando venivano incrociati con
ceppi di laboratorio “basso produttori” i diploidi che si formavano erano “basso produttori”,
indicando che la mutazione/le mutazioni presenti nei ceppi “alto produttori” erano recessive.
Mediante l’analisi delle tetradi è stato dimostrato inoltre che era mutato un solo allele, che
venne chiamato mmc1 (Mitochondrial Mutability Control): i ceppi MMC1 erano “basso
produttori”, i ceppi mmc1 “alto produttori”, e i ceppi MMC1/mmc1 erano “basso produttori”.
Studi successivi hanno dimostrato come all’allele mmc1 sia associato ad un maggiore
accumulo di cloni petite in seguito a trattamento con sostanze mutagene o UV (Donnini et al.,
1983).
Molte delle caratteristiche dei ceppi mmc1 sono simili a quelle dei ceppi di laboratorio recanti
l’allele MIP1[S]:
- entrambi i ceppi producono petite ad alta frequenza;
- ad entrambi gli alleli è associata una maggiore infedeltà di replicazione;
- i due alleli sono recessivi sia per quanto concerne la mutabilità estesa che quella
puntiforme;
Per analizzare se mmc1 fosse allelico a MIP1[S], e MMC1 a MIP1[Σ], o MIP1[S]A661T, è stato
determinato mediante amplificazione e analisi di restrizione con BsaAI quale nucleotide fosse
presente in posizione 661 del gene MIP1 dei ceppi K8-6C e 10022 (mmc1) e dei ceppi
5595/4c, 5595/8c e 5594/4a (MMC1).
E’ stato trovato che i ceppi mmc1 “alto produttori” posseggono G in posizione 1981 di MIP1,
dunque alanina in posizione 661, mentre i ceppi MMC1 “basso produttori” posseggono A in
posizione 1981, dunque treonina. Questa osservazione, sebbene non conclusiva, depone
fortemente a favore dell’allelismo fra i geni MMC1 e MIP1.
7.9 Effetto dell’alanina 661 sullo studio di mutazioni associate a
patologie mitocondriali
Nel capitolo 5 sono stati studiati gli effetti delle mutazioni G651S, A692T, H734Y, G807R e
E900G da sole o in associazione. Come allele wt, in cui sono state inserite le mutazioni, è
150
7. Risultati (IV parte)
stato utilizzato l’allele clonato da W303-1B, dunque MIP1[S], contenente alanina in posizione
661. Per valutare se i fenotipi osservati potessero essere influenzati dalla presenza dell’alanina
in posizione 661, tutte le mutazioni sono state inserite anche nel background MIP1[S]A661T. La
frequenza di petite e di mutanti EryR, misurata in presenza di questi alleli, è riportata in
allegato 2, tabella 6 e in tabella 7.3.
Mutazione
MIP1
mip1G651S
mip1A692T
mip1H734Y
mip1G807R
mip1E900G
mip1A692T–E900G
Contesto MIP1[S]
Contesto MIP1[S]A661T
% petite a 28°C % petite a 36°C % petite a 28°C % petite a 36°C
2,7 ± 0,3
21,0 ± 2,4
0,8 ± 0,1
1,0 ± 0,1
100 ± 0
–
45,7 ± 4,9
99,7 ± 0,2
80,3 ± 1,7
99,7 ± 0,1
17,1 ± 1,6
40,1 ± 0,3
99,7 ± 0,1
100 ± 0
97,8 ± 0,4
98,8 ± 0,3
25,5 ± 2,8
99,2 ± 0,2
2,1 ± 0,2
9,5 ± 0,8
6,0 ± 0,6
91,7 ± 3,9
1,3 ± 0,1
5,0 ± 0,1
96,6 ± 1,5
100 ± 0
35,5 ± 2,0
78,1 ± 3,2
Figura 7. 3: Frequenza dei petite degli alleli mutanti MIP1, mip1G651S, mip1A692T, mip1H734Y, mip1G807R,
mip1E900G e mip1A692T–E900G nel background MIP1[S] o MIP1[S]A661T.
Per quanto concerne l’accumulo di petite, tutte le frequenze sono spostate verso valori più
bassi nel contesto MIP1[S]A661T, sia a 28°C che a 36°C. In particolare l’allele mip1G651S
determina una frequenza di petite non più del 100%, ma di circa il 40% a 28°C e di circa il
99% a 36°C. La frequenza è decisamente più bassa per la mutazione G807R (27% contro
2,1% a 28°C), con un incremento rispetto al wt di 10 e 3 volte circa. La frequenza è minore
anche per la mutazione E900G, ma in questo caso l’incremento rispetto al wt è 2 in entrambi i
contesti. Anche nel contesto MIP1[S]A661T, la mutazione E900G si comporta come
modificatore fenotipico della mutazione A692T in cis, in quanto raddoppia la frequenza di
petite, sia a 28°C che a 36°C. Infine tutti i mutanti, esclusi i mutanti recanti la mutazione
H734Y, mostravano un fenotipo termosensibile, come già osservato nel contesto MIP1[S].
Per quanto concerne la frequenza di mutanti EryR, tutte le mutazioni incrementavano la
frequenza di mutazioni puntiformi, ma anche in questo caso verso valori più bassi. Inoltre nel
contesto MIP1[S]A661T è stato possibile studiare l’effetto della mutazione G651S, che
determinava un incremento di mutanti EryR di circa 15 volte.
Inoltre è stata studiata la dominanza/recessività delle mutazioni nel contesto MIP1[S]A661T per
quanto concerne l’accumulo di petite (tabella 7.4).
151
7. Risultati (IV parte)
Ceppo DWM-5A
% petites
(28°c)
MIP1/MIP1
0,54
MIP1/pFL39
0,81
G651S
MIP1/mip1
0,68
MIP1/mip1A692T
1,42
MIP1/mip1H734Y
4,32
G807R
0,52
E900G
MIP1/mip1
0,49
MIP1/mip1A692T-E900G
1,58
MIP1/mip1
Tabella 7. 4: Frequenze dei petite nei ceppi aploidi eteroallelici DWM-5A contenenti gli alleli mutati nel
contesto MIP1[S]A661T.
Come nel contesto MIP1[S], le mutazioni G651S, G807R e E900G sono recessive, mentre le
mutazioni A692T e H734Y sono dominanti.
7.10 Discussione
E’ noto che diversi ceppi di S. cerevisiae accumulano cloni petite con diversa frequenza.
Questo non è sorprendente visto l’elevato numero di geni in grado di influenzare la stabilità
dell’mtDNA (Contamine and Picard, 2000). E’ inoltre generalmente riconosciuto che i ceppi
naturali producano petite a bassa frequenza, inferiore all’1%. Per quanto concerne invece i
ceppi di laboratorio, le percentuali sono molto variabili: alcuni ceppi presentano frequenze
comprese fra 0,5-1%, altri presentano frequenze anche molto superiori a questi valori
(Sherman 1964; Marmiroli et al., 1980).
In questo studio è stato dimostrato che nei ceppi di laboratorio più utilizzati sono presenti due
alleli MIP1, uno chiamato MIP1[S], in quanto presente nel ceppo S288c, l’altro MIP1[Σ], in
quanto presente nel ceppo Σ1278b. I due alleli posseggono 26 SNP e codificano per due
isoforme di Mip1 che presentano 10 differenze aminoacidiche. L’elevato numero di
polimorfismi in MIP1 non sorprende visto che i genomi dei due ceppi sono altamente
divergenti (Schacherer et al., 2007). I ceppi Σ1278b, D273-10B/A1 e FL100, che posseggono
l’allele MIP1[Σ], posseggono un genoma mitocondriale relativamente stabile, producendo
petite spontanei con una frequenza inferiore all’1%, anche a 36°C. Al contrario i ceppi S288c,
W303-1B e BY4742, che posseggono l’allele MIP1[S], mostrano un elevata produzione di
petite, soprattutto ad alte temperature, e una ridotta fedeltà della replicazione dell’mtDNA.
E’ stato poi dimostrato come un singolo SNP, la transizione AÆG in posizione 1981 di MIP1,
fosse responsabile della ridotta stabilità dell’mtDNA nel ceppo S288c e nei ceppi da esso
derivati. La transizione A1981ÆG determina la sostituzione della treonina 661, estremamente
conservata nelle polimerasi γ fungine e animali, con alanina. Questa sostituzione ha profonde
conseguenze sulla mutabilità mitocondriale:
152
7. Risultati (IV parte)
1) Alla presenza di alanina è associato una maggiore frequenza di petite (circa 3-4 volte)
a 28°C.
2) I ceppi recanti l’allele MIP1 codificante per l’isoforma proteica contenente alanina
mostrano un elevato incremento di petite a temperature elevate, a fronte di un
incremento molto limitato nei ceppi recanti l’allele MIP1 codificante per l’isoforma
contenente treonina.
3) Ad alte temperature l’allele MIP1 codificante per l’isoforma contenente alanina induce
una maggiore perdita di mtDNA, come dimostrato dall’aumento di cloni rho0.
4) La proteina Mip1 contenente alanina è meno fedele, come dimostrato da un maggiore
comparsa di mutanti EryR.
Anche lo stretch attorno alla posizione 661 è estremamente conservato, suggerendo che
questa regione svolga un ruolo importante nel processo catalitico. Per valutare questa ipotesi è
stata misurata mediante saggio di gap filling l’attività delle diverse isoforme di Mip1.
Dall’analisi in vitro è emerso chiaramente che la polimerasi contenente alanina possiede una
capacità di incorporare dNTP in un DNA attivato ridotta di circa il 20% rispetto alla
polimerasi contenente treonina. L’analisi è stata fatta a 30°C, poiché a temperature più elevate
la polimerasi è instabile (Francoise Foury, comunicazione personale). Questo risultato
chiarisce perché in presenza di alanina a 28°C si osservi una maggiore frequenza di petite.
L’elevato incremento che si osserva a temperature più alte può essere interpretato in termini
di unfolding. E’ infatti probabile che ad alte temperature, per le quali è noto un parziale
unfolding di MIP1, la quantità di Mip1 sia ridotta, per cui l’effetto di mutazioni è più
evidente. Non è escluso inoltre che la stessa sostituzione T661A favorisca l’unfolding della
proteina ad alte temperature.
Per cercare l’origine della mutazione A1981ÆG un elevato numero di ceppi enologici o
naturali isolati da diverse fonti in diverse aree è stato analizzato per la presenza di A o G in
posizione 1981. Tutti i ceppi mostrano A in posizione 1981, dunque treonina in posizione
661. L’unica eccezione è il ceppo EM93, un ceppo diploide che presenta un allele contenente
A1981 e un allele contenente G1981. EM93 è il ceppo da cui è stato ottenuto il ceppo S288c,
che ha in comune l’88% del genoma con EM93 (Mortimer and Johnston, 1986). E’ dunque
molto probabile che S288c abbia ereditato l’allele mutato MIP1[S] da EM93, insieme ad
un'altra serie di mutazioni (gal2, mal, mel) (Mortimer and Johnston, 1986).
Su diversi isolati naturali le cui sequenze parziali sono disponibili al sito dell’istituto Sanger è
stata condotta anche un’analisi degli altri polimorfismi presenti in MIP1. Da questa analisi è
emerso che la maggior parte dei ceppi posseggono gli stessi polimorfismi del gene MIP1[S].
Alcuni ceppi posseggono alcuni polimorfismi di MIP1[S] e altri di MIP1[Σ]. Le combinazioni
fra i due tipi di polimorfismi sono diversi da ceppo a ceppo, presentando una sorta di struttura
a mosaico. E’ molto probabile dunque che i diversi alleli MIP1 si siano originati non solo
attraverso comparsa e selezione di mutazioni, ma anche attraverso processi di ricombinazione.
E’ interessante poi notare che i ceppi “ibridi” sono per lo più di origine orientale (Giappone,
Malesia, Hawaii). L’organizzazione a mosaico di MIP1 solleva la questione dell’origine dei
153
7. Risultati (IV parte)
ceppi orientali, per i quali si è dimostrato un’origine filogenetica diversa da quella dei ceppi
occidentali (Fay and Benavides, 2005; Ayoub et al., 2006). Nessuno dei ceppi invece
possiede esattamente gli stessi SNP presenti in MIP1[Σ], per cui rimane ancora l’incertezza su
quale ceppo progenitore abbia trasmesso a questi ceppi l’allele MIP1[Σ].
La scoperta che i ceppi derivati da S288C posseggono un allele MIP1 mutato che incrementa
l’instabilità dell’mtDNA ha almeno due profonde conseguenze sullo studio della funzionalità
mitocondriale.
In primo luogo, in studi precedenti e in questo studio (capitolo 4, 5 e 6) mutazioni equivalenti
a mutazioni patologiche umane sono stati introdotti nell’allele MIP1[S]. Ci siamo chiesti se
gli effetti fenotipici delle mutazioni potessero essere influenzati dal background genetico, cioè
dalla presenza di alanina in posizione 661. Per rispondere a questa domanda le cinque
mutazioni studiate nel capitolo 5 sono state introdotte nell’allele MIP1[S]A661T ed è stata
condotta la stessa analisi sulla funzionalità mitocondriale condotta in precedenza nel contesto
MIP1[S]. Sebbene nel contesto MIP1[S]A661T tutti i valori legati alla mutabilità mitocondriale
siano spostati verso valori più bassi, le conclusioni a cui si giunge sono le medesime.
Sulla base di queste osservazioni, emerge chiaramente che entrambi gli alleli possono essere
utilizzati come modelli per lo studio di mutazioni corrispondenti a mutazioni patologiche
umane. La presenza di due alleli offre anzi uno strumento in più per lo studio delle mutazioni.
Utilizzando l’allele MIP1[S]A661T le frequenze dei petite sono spostate verso valori più bassi.
Questo è utile quando gli effetti di una mutazione sono così deleteri che, nel contesto
MIP1[S], non possono essere analizzati. Ad esempio la mutazione G651S nel contesto
MIP1[S] determina la perdita totale di mtDNA, prevenendo ogni altra analisi. Nel contesto
MIP1[S]A661T, sebbene vi sia un forte incremento dei mutanti petite, una certa percentuale dei
cloni rimane rho+, permettendo, ad esempio, l’analisi della fedeltà della replicazione mediante
il saggio su eritromicina. Inoltre, la frequenza dei mutanti petite associati alla mutazione
A692T è più bassa nel contesto MIP1[S]A661T che nel contesto MIP1[S], in modo tale che, nel
primo caso, gli effetti della mutazione E900G in cis vengono meglio evidenziati. Utilizzando
l’allele MIP1[S], le frequenze dei petite sono spostati verso valori più alti. Questo è utile
quando gli effetti di una mutazione sono così blandi che difficilmente sono significativi nel
contesto MIP1[S]A661T, mentre nel contesto MIP1[S] il divario fra allele wt e allele mutato è
maggiore e più significativo. Inoltre, essendo i valori più alti, l’utilizzo dell’allele MIP1[S]
favorisce studi di rescue chimico o genetico.
In secondo luogo e di interesse più generale, è degno di nota che la collezione dei deletanti
dell’EUROSCARF utilizzati nell’analisi funzionale su larga scala è stata fatta nei ceppi
BY4741, BY4742 e BY4743, che contengono l’allele MIP1[S]. Questa scoperta deve essere
tenuta in considerazione per analisi che concernono la funzionalità mitocondriale. E’ possibile
infatti che le osservazioni sul metabolismo mitocondriale, ad esempio crescita su fonti
ossidabili a 28°C o a 36°C o frequenza di mutanti petite, siano influenzate dalla presenza della
sostituzione T661A.
154
8. Note finali
8. Note finali
155
8. Note finali
Nel presente studio sono state introdotte nel gene MIP1 di S. cerevisiae, codificante per la
DNA polimerasi mitocondriale, sette mutazioni equivalenti a mutazioni patologiche umane
nel gene ortologo POLG. Sono stati determinati gli effetti di queste mutazioni sul
metabolismo del DNA e sulla stabilità dell’mtDNA ed è stato osservato, fra i risultati più
importanti, che tutte le mutazioni determinano un incremento della mutabilità estesa
dell’mtDNA. Inoltre sono state identificate sostanze, in particolare antiossidanti, in grado di
ridurre la mutabilità mitocondriale dovuta a specifiche mutazioni in MIP1. Infine sono stati
identificati geni codificanti per enzimi coinvolti nel metabolismo dell’mtDNA che, se
overespressi, sono in grado di ridurre la mutabilità petite dovuta alle mutazioni in MIP1. I
risultati sono già stati discussi alla fine dei capitoli 4, 5 e 6. S. cerevisiae si è dimostrato
dunque essere un ottimo modello per lo studio degli effetti di mutazioni nel gene codificante
la polimerasi mitocondriale, sia per la “validazione” delle mutazioni sia per l’identificazione
di sostanze o geni in grado di ripristinare, almeno parzialmente, la stabilità dell’mtDNA.
Parallelamente a questa analisi, è stato scoperto che i ceppi di laboratorio maggiormente usati
(S288c, serie BY47 e serie W303) contengono un allele mutato di MIP1, ereditato dal
progenitore EM93, che incrementa la mutabilità estesa dell’mtDNA, soprattutto ad alte
temperature. Questa osservazione, discussa alla fine del capitolo 7, spiega, almeno in parte,
come mai la maggior parte dei ceppi di laboratorio producono spontaneamente una
percentuale di petite maggiore rispetto ai ceppi naturali, nei quali è presente un allele MIP1
selvatico.
156
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Allegato 1:
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Genetic and chemical rescue of the Saccharomyces
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1
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Received June 20, 2006; Revised and Accepted August 2, 2006
The human POLG gene encodes the catalytic subunit of mitochondrial DNA polymerase g (pol g). Mutations
in pol g are associated with a spectrum of disease phenotypes including autosomal dominant and recessive
forms of progressive external ophthalmoplegia, spino-cerebellar ataxia and epilepsy, and Alpers –
Huttenlocher hepatocerebral poliodystrophy. Multiple deletions, or depletion of mtDNA in affected tissues,
are the molecular hallmarks of pol g mutations. To shed light on the pathogenic mechanisms leading to
these phenotypes, we have introduced in MIP1, the yeast homologue of POLG, two mutations equivalent
to the human Y955C and G268A mutations, which are associated with dominant and recessive PEO, respectively. Both mutations induced the generation of petite colonies, carrying either rearranged (r2) or no (r0)
mtDNA. Mutations in genes that control the mitochondrial supply of deoxynucleotides (dNTP) affect the
mtDNA integrity in both humans and yeast. To test whether the manipulation of the dNTP pool can modify
the effects of pol g mutations in yeast, we have overexpressed a dNTP checkpoint enzyme, ribonucleotide
reductase, RNR1, or deleted its inhibitor, SML1. In both mutant strains, the petite mutability was dramatically
reduced. The same result was obtained by exposing the mutant strains to dihydrolipoic acid, an anti-oxidant
agent. Therefore, an increase of the mitochondrial dNTP pool and/or a decrease of reactive oxygen species
can prevent the mtDNA damage induced by pol g mutations in yeast and, possibly, in humans.
INTRODUCTION
Different mutations in POLG, the gene encording the catalytic
subunit of the mitochondrial DNA polymerase (polymerase
gamma, pol g) (1) are associated with a spectrum of
human mitochondrial disorders, including autosomal dominant (ad) and autosomal recessive (ar) progressive external
ophthalmoplegia (PEO), juvenile spino-cerebellar ataxia and
epilepsy (2) and infantile hepatopatic poliodystrophy, or
Alpers– Huttenlocher syndrome (AHS) (3). Adult-onset
adPEO and arPEO syndromes are characterized by the
accumulation of multiple mtDNA deletions in affected
tissues (4), whereas the most severe syndrome, AHS, shows
marked reduction in the mtDNA copy number in liver (5)
and, possibly, brain. Beside mutations in POLG, adPEO can
also be caused by heterozygous mutations in ANT1, encoding
the ADP/ATP translocator (6), and TWINKLE, encoding a
mitochondrial helicase (7). ANT1 and POLG genes,
*To whom correspondence should be addressed at: Division of Molecular Neurogenetics, National Neurological Institute ‘C. Besta’ Via Temolo 4,
20126 Milano, Italy, Tel: þ390 22394633; Fax: þ390 22394619; Email: zeviani@istituto-besta.it
{
The authors wish it to be known that, in their opinion, the first two authors should be regarded as joint First Authors.
# The Author 2006. Published by Oxford University Press. All rights reserved.
For Permissions, please email: journals.permissions@oxfordjournals.org
Human Molecular Genetics, 2006, Vol. 15, No. 19
but not TWINKLE, are highly conserved from humans to the
facultative budding yeast Saccharomyces cerevisiae: the yeast
AAC2 gene corresponds to ANT1 (8), whereas MIP1 corresponds to POLG (9). This makes it possible to
introduce and study in AAC2 and MIP1 the mutations
that are equivalent to those affecting mtDNA stability in
humans (10 – 12).
Human pol g is composed of a 140 kDa catalytic subunit
A and a 55 kDa accessory subunit B, which increases the
processivity of mtDNA synthesis. Pol gA comprises a
polymerase domain and an exonuclease proofreading
domain, separated by a linker region of 482 amino acids.
Over 60 PEO-associated mutations have been found in
POLG (13,14). Most of the dominant POLG mutations
are in the polymerase domain, whereas most of the
recessive mutations are in the exonuclease or in the
spacer domains. Only one mutation has been found in
pol gB (14).
In the present work, we have introduced in MIP1 two
mutations that are equivalent to two pathogenic mutations
in pol gA, the Y955C and the G268A. The first mutation is
associated with adPEO (1), and the second is associated
with arPEO (15). We have demonstrated that the equivalent
yeast mutations behave as dominant and recessive traits,
respectively, and, by inducing severe damage to, or the
loss of mtDNA, determined an increase of either r2 or r0
petite colonies. We have also shown that the yeast phenotype
can be suppressed by increasing the mitochondrial dNTP pool,
through the overexpression of RNR1, encoding the ribonucleotide reductase (RNR1) (16,17), or the deletion of its
inhibitor, SML1 (18,19). Finally, we have studied the
effect of a reactive oxygen species (ROS) scavenger on our
mutants. Our results indicate that ROS damage contributes
to mtDNA instability in yeast.
RESULTS
Effect of MIP1 alleles equivalent to PEO-associated
hPOLG mutants on oxidative growth phenotype
Phenotypic analysis showed that the haploid mip1 Y757C
mutant strain (Dmip1//mip1 Y757C) was unable to grow on 2%
ethanol, indicating the absence of respiration. As exemplified
by the experiment shown in Figure 1, the spectrum profile of
mitochondria isolated from this strain consistently lacked
the peaks specific to cytochromes b and aa3, which are part
of the mtDNA-dependent complexes III and IV of the
respiratory chain, whereas the peak specific to cytochrome c,
a nucleus-encoded protein, was normal. Contrariwise, the
haploid mip1 G224A mutant strain (Dmip1//mip1 G224A) was
able to grow on ethanol, displayed a normal cytochrome
profile (Fig. 1) and retained a normal respiratory activity (data
not shown). The MIP1/Dmip1 heterozygous diploid strain, carrying either the mip1 Y757C or the mip1 G224A mutant alleles
(MIP1/Dmip1//mip1 Y757C and MIP1/Dmip1//mip1 G224A) both
failed to show a significant growth defect; the cytochrome
profile and respiration were normal in both strains.
2847
Figure 1. Oxidized versus reduced cytochrome spectra of the Dmip1 strain
(DWM-5A), transformed with wt MIP1, pFL39 plasmid (no insert),
mip1 G224A and mip1 Y757C mutant alleles cloned in pFL39. The peaks at 550,
560 and 602 nm (vertical bars) correspond to cytochromes c, b and aa3,
respectively. The height of each peak relative to the baseline of each spectrum
is an index of cytochrome content.
Determination of petite frequency and evaluation
of the nature of the petite mutations
In humans, both G268A and Y955C mutations induce the
accumulation of multiple deletions of mtDNA. In S. cerevisiae,
deletions of mtDNA are known as petite mutations.
Conditions that increase mtDNA mutability also increase the
frequency of petites (20). In order to evaluate whether an
effect similar to that observed in humans was produced by
the equivalent mutations in yeast, we measured the frequency
of petite mutants in haploid Dmip1 strains carrying either
the mip1 G224A or the mip1 Y757C mutant allele. The results
reported in Figure 2 indicate that, in the mip1 Y757C haploid
strain, the petite frequency was 100%, as previously described
(12). In the mip1 G224A haploid strain, the petite frequency was
~2.5-fold the frequency determined in Dmip1 haploid strains
transformed with the MIP1 wild-type allele.
In the MIP1/Dmip1 diploid strain carrying the mip1 G224A
mutant alleles, the petite frequency was equivalent to that
of the background level observed in the same diploid
strain carrying the MIP1 allele. This result indicates that
mip1 G224A behaves as a recessive allele in yeast, like the corresponding G268A mutation does in humans. In the same
strain carrying the mip1 Y757C mutant allele, the petite
frequency was ~21-fold, indicating that the mutation is dominant in yeast, as it is in humans.
Petite mutants can be either r2 (that is, cells in which the
mtDNA is partially deleted) or r0 (that is, cells in which the
mtDNA is completely lost). When r2 mutants are crossed
with a mit 2 mutant carrying a point mutation, rþ cells are
produced by recombination, provided that the mit 2 point
mutation maps in a region conserved in the r2 mtDNA.
Contrariwise, r0 mutants, which are completely devoid of
2848
Human Molecular Genetics, 2006, Vol. 15, No. 19
Table 1. Percentage of petite (r0 þ r2) and percentage of r0 mutants produced
in different genetic backgrounds
Relevant genotype wt
% petites % r0
Haploid strains
Dmip1//MIP1
Dmip1//
mip1 G224A
Heteroallelic
strains
MIP1//MIP1
MIP1//
mip1 Y757C
RNR1
% petites % r0
Dsml1
% petites % r0
9
21
4
10
1.9
3.2
0.6
1.1
1.8
3.9
0.9
1.3
1.5
32
0.4
16
0.5
9.3
0.1
3.2
0.5
4.5
0.1
1.3
Petite frequencies were defined as the percentage of colonies showing the
petite phenotype after 5 days incubation at 288C. More than 4000 colonies/strains were scored. All values are means of three independent
experiments. In no case the variation was higher than 15%. r0 frequencies
were calculated as the percentage of clones unable to complement any of
mit 2 mutants tested.
Figure 2. Determination of petite frequency in (A) haploid Dmip1 strain
transformed with wt MIP1, pFL39 plasmid without insert, mip1 G224A
and mip1 Y757C mutant alleles cloned in pFL39; (B) heterozygous diploid
MIP1/Dmip1 transformed with wt MIP1, pFL38 plasmid without insert,
mip1 G224A and mip1 Y757C mutant alleles cloned in pFL38. More than 4000
colonies/strain were scored. All values are means of three independent experiments. In no case, the variation was higher than 15%. RD, respiratory
deficient cells; RS, respiratory sufficient cells.
mtDNA, are unable to produce rþ cells. In order to evaluate
the nature of the petite colonies produced by our
mutant strains, we crossed 200 petite clones from the
Dmip1//MIP1 strain and 200 petite clones from Dmip1//
mip1 G224A with four mit 2 mutants. Each mit 2 mutant harbours
a different deleterious point mutation, namely, in the first and
sixth exons of the cob gene, in the cox2 gene and in the cox3
gene (see Methods). The diploid clones resulting from the
crosses were tested for their ability to grow on glycerol.
Approximately 56% of the Dmip1//MIP1 and 54% of the
Dmip1//mip1 G224A petite clones were able to complement at
least one of the mit 2 mutations, indicating that these clones
were r2 (Table 1). None of the clones derived from the
Dmip1//mip Y757C strain was able to complement any of the
mit 2 mutations, indicating that they were r0. This was consistently confirmed by Southern-blot analysis, as exemplified in
Figure 3 (see also Methods).
The complementation test cannot be used to evaluate the
nature of the petite mutants in wt/mutant diploid strains. To
mimic the diploid condition, we have constructed heteroallelic
strains by introducing the wt MIP1 or the mutated mip1 Y757C
alleles in the haploid wt strain W303-1B. We first established
that the heteroallelic MIP1//mip1 Y757C and the homoallelic
MIP1//MIP1 strains produced petite colonies with a frequency
similar to that observed in diploid strains carrying the corresponding mip1 Y757C and MIP1 alleles (data not shown). The
transformants were then crossed with the mit 2 testers.
Approximately 74% of 200 MIP1//MIP1 homoallelic petite
clones was able to complement each of the mit 2 mutations
but only 49% of 500 heteroallelic MIP1//mip1 Y757C petite
clones was able to do so, again indicating that the Y757C
mutation induces the loss of mtDNA (Table 1).
Determination of mtDNA point mutations
We next analysed whether our mip1 mutations increased the
mtDNA point mutagenesis, as demonstrated by an increase
in the frequency of erythromycin-resistant (EryR) mutants.
Resistance to the drug erythromycin in yeast is acquired
through specific point mutations in the mtDNA-encoded
rRNA genes and therefore is a convenient, direct measurement
of mtDNA point mutagenesis in vivo (21). Using this assay,
we have measured mtDNA mutation frequencies in the
haploid strain Dmip1//mip1 G224A and in the diploid strains
MIP1/Dmip1//mip1 G224A and MIP1/Dmip1//mip1 Y757C. Both
mip1 G224A in haploid, and mip1 Y757C in diploid conditions
showed a 10-fold and a 20-fold increase, respectively, in
mtDNA point mutagenesis, compared with that observed in
the wild-type strain. However, the MIP1/mip1 G224A heterozygous diploid strain failed to show any increase of EryR mutant
frequency (Table 2), again indicating that this mutation
behaves as a recessive trait also for this phenotype.
Effect of increasing dNTP pool on mitochondrial
mutability
We next tested whether an increase in the level of the dNTP
pool could rescue the mitochondrial mutability observed in
the presence of the two pathological mip1 mutations. The
increase of the dNTP pool was obtained either by overexpressing the RNR1 gene, which encodes the large subunit of the
Human Molecular Genetics, 2006, Vol. 15, No. 19
2849
Figure 3. Southern-blot analysis of mtDNA isolated from petite clones unable to complement any of the mit 2 mutants tested (lanes 1–10). mtDNA was prepared
and analysed as described in Materials and Methods from cells grown on YNB medium supplemented with 2% glucose. mtDNA (1 mg) was digested with
EcoRV and hybridized with an mtDNA-specific probe. Lane 7 corresponds to an mtDNA-rearranged r2 clone; lanes 1–6 and 8–10 correspond to mtDNA-less
r0 clones. The mtDNA hybridization pattern of a respiratory sufficient rþ strain is shown as a normal control; examples of abnormal hybridization patterns were
obtained from a respiratory-deficient mtDNA-less r0 strain, and from two respiratory-deficient, mtDNA-rearranged r2 strains.
Table 2. Frequency of EryR mutants
Relevant genotype
Haploid strains
Dmip1//MIP1
Dmip1//mip1 G224A
Diploid strains
MIP1/Dmip1//MIP1
MIP1/Dmip1//pFL38
MIP1/Dmip1//mip1 Y757C
MIP1/Dmip1//mip1 G224A
wt
Dsml1
1.1 1028
9.8 1028
1.2 1028
11.5 1028
1.0 1028
3.2 1028
11.4 1028
1.1 1028
0.9 1028
3.5 1028
5.6 1028
1.1 1028
The frequency of erythromycin resistant mutants was calculated as
number of EryR colonies/total number of colonies, as described in
Materials and Methods.
to 35% in the presence of overexpressed RNR1 and to 29%
in the presence of Dsml1, whereas no reduction was observed
in the MIP1//MIP1 homoallelic strain. The 4 –5-fold decrease
of petite mutability and the 7 – 10-fold decrease of r0 frequency suggest that the increase of the dNTP pool contributed
to maintain mtDNA integrity and stability.
Since the effects obtained by RNR1 overexpression were
similar to those obtained with SML1 deletion, we evaluated
the effect on mtDNA point mutability only in the Dsml1 background. The number of EryR mutants was unchanged in the
presence of the mip1 G224A mutation, but decreased by
~2-fold in the presence of the mip1 Y757C mutation (Table 2).
Role of ROS in mtDNA mutability
ribonucleotide reductase (22) or by deleting the SML1 gene,
which encodes an inhibitor of the latter activity (18).
We transformed haploid and diploid strains harbouring the
mip1 G224A or the mip1 Y757C alleles with a multicopy plasmid
carrying the RNR1 gene (plasmid pWJ841). We also
constructed a haploid Dsml1, Dmip1 strain and a diploid
Dsml1/Dsml1 MIP1/Dmip1 strain, which were transformed
with either one of three different plasmids: the first plasmid
carried the wt MIP1 allele, the second the mip1 G224A
allele and the third the mip1 Y757C allele. The results reported
in Figure 4 indicate that both conditions caused dramatic
decreases of the petite frequencies in the mutant strains. The
petite mutability was reduced approximately to the same
extent, suggesting that the protective effect on mtDNA is
likely due to the increase of the dNTP pool and not to an
unrelated effect of the RNR1 overexpression or of the SML1
deletion.
Decreased petite mutability was associated with decreased
r0 frequency (Table 1). In the presence of RNR1 overexpression, the proportion of haploid Dmip1//MIP1 r0 clones was
reduced from 46 to 33% and in the presence of the SML1 deletion was reduced to 28%. Similar results were obtained in the
haploid Dmip1//mip1 G224A strain. The heteroallelic strain,
MIP1//mip1 Y757C showed a reduction of r0 clones from 51
Increased production of ROS is associated with an increase in
the accumulation of mtDNA rearrangements (23,24). To
address this issue in our system, we analysed the effect of
the ROS scavenger dihydrolipoic acid on the petite mutability
of the heterozygous MIP1/Dmip1 diploid strain carrying the
mip1 Y757C allele, as well as of the Dmip1 haploid strain
carrying the mip1 G224A allele. Exposure to dihydrolipoic
acid decreased significantly the petite mutability in both
cases by a factor of six to eight. A clear, albeit less prominent,
effect was also observed in the mip1 and MIP1/mip1 strains
carrying the wild-type MIP1 allele (Fig. 5).
DISCUSSION
The human Y955C pol g mutation is located in the polymerase
domain. Its fidelity is 42-fold decreased in an exonucleasedeficient background and 2-fold decreased in an exonucleaseproficient background (25); its polymerase activity is
3000-fold decreased (26). The yeast mutation mip1 Y757C, corresponding to Y955C, behaved like the mip1 null mutation
when introduced into a Dmip1 haploid strain. It induced a dramatic loss of mitochondrial DNA, as shown by the production
of 100% petite mutants that were all r0, that is, mtDNA-less
cells. In a MIP1/mip1 heterozygous diploid strain, the
2850
Human Molecular Genetics, 2006, Vol. 15, No. 19
Figure 4. Determination of petite frequency in the presence of RNR1 overexpression and SML1 deletion. Relevant genotypes of different strains are indicated on top of the bars. Bars indicate transformants with MIP1 or different
mip1 mutant alleles, as indicated. (A) Haploid strains transformed with wt
MIP1 and mip1 G224A mutant allele cloned in pFL39; (B) diploid transformed
with wt MIP1, pFL38 plasmid without insert, mip1 G224A and mip1 Y757C mutant
alleles cloned in pFL38. More than 4000 colonies/strains were scored. All
values are means of three independent experiments. In no case the variation
was higher than 15%.
mip1 Y757C mutation caused a 20-fold increase in petite mutability compared with the MIP1 wt allele and a 4-fold increase
compared to the mip1 null allele. The mip1 Y757C mutation
caused also an increase of point mutability of mtDNA, leading
to a 10-fold increase of EryR mutations compared with the
MIP1 wt allele and a 3-fold increase compared with the
Dmip1 null allele. These results indicate that the mip1 Y757C
behaves as a dominant allele, since its presence is more
deleterious to mtDNA than the absence of the MIP1 gene itself.
This behaviour mimics exactly what is observed in humans.
The human G268A is a missense mutation in the
proofreading exonuclease domain of pol gA. In homozygous
conditions, the human G268A mutation causes the accumulation of both mtDNA deletions and point mutations (27). We
have observed reduced fidelity of the homologous mutation
also in yeast, where the equivalent mip1 G224A allele was associated with a 2.5-fold increase in the frequency of petite clones
and a 10-fold increase in the point mutability of mtDNA.
Therefore, the phenotype is recessive in yeast as it is in humans.
Figure 5. Determination of petite frequency in the presence/absence of 30 mM
dihydrolipoic acid (A) haploid Dmip1 strain transformed with wt MIP1 and
mip1 G224A mutant allele cloned in pFL39; (B) heterozygous diploid MIP1/
Dmip1 transformed with wt MIP1, pFL38 plasmid without insert, mip1 G224A
and mip1 Y757C mutant alleles cloned in pFL38. More than 4000 colonies/
strains were scored. All values are means of three independent experiments.
In no case the variation was higher than 15%. 2L, cells untreated with
dihydrolipoic acid; þL, cells treated with dihydrolipoic acid.
The recessive phenotype is formally indicative of a
complementation exerted by the wild-type allele and is possibly due to the ability of the wild-type MIP1 polymerase to
proofread errors introduced by the mutant polymerase.
Mutations in genes that control the mitochondrial supply of
deoxynucleotides (dNTP) affect the mtDNA integrity in both
humans (28) and yeast (29).
The level of dNTP pools is under an evolutionary conserved
surveillance system that maintains genomic stability. One
important checkpoint of this control system is the RNR1. In
yeast, mutations in RNR1 increase petite mutations (30).
In both yeast and humans, the transcription of RNR1 is
induced after DNA damage. In addition, the yeast
mtDNA-damage-checkpoint proteins also regulate the RNR1
inhibitor Sml1p. After DNA damage or at S phase, the
MEC1 and RAD53 gene products control the phosphorylation
and the subsequent degradation of the Sml1 protein (31).
This control contributes to increase the synthesis of dNTPs,
necessary for DNA replication and repair. Overexpression of
RNR1 (32) or deletion of SML1 (18), both are able to rescue
the petite-inducing phenotype of a specific point mutation in
yeast pol g (mip1-1).
Human Molecular Genetics, 2006, Vol. 15, No. 19
Here we show that either RNR1 overexpression or SML1
deletion, two conditions that increase the dNTP pools of the
cell, including the mitochondrial pool (19), induced a
4 –8-fold reduction in the production of petite colonies of
our recombinant mutant strains. However, neither RNR1 overexpression nor SML1 deletion decreased the frequency of EryR
clones, which is an index of the propensity of mtDNA to
accumulate point mutations. This result is similar to previous
data (33) and indicates that induction of large-scale rearrangements, rather than increased point mutagenesis, is responsible
for the petite mutability induced by the two mip mutations
considered in our work. The human Y955C mutation displays
a 45-fold reduction in affinity for the incoming nucleotide
(25). Reduced affinity could determine a stalling on homopolymeric runs due to frequent reiteration of a single nucleotide.
This could result in local depletion of that nucleotide and
make it difficult for a defective polymerase to incorporate
the subsequent nucleotide (34). By preventing pol g stalling,
an increase of the dNTP pool could decrease the generation
of mtDNA rearrangements, and thereby reduce the number
of petite clones. However, the increase of the dNTP pool
could also induce the rescue of petites by improving the efficiency of mtDNA repair, especially in the presence of the
D268A mutation, which is an error-prone mutation, being contained in the proofreading domain of pol gA. The existence of
mtDNA repair is supported by the recent demonstration that
mitochondria share several repair systems with the nucleus,
in both yeast (35) and humans (36).
MtDNA is attached to the mitochondrial inner membrane in
close proximity to the respiratory chain. Mitochondrial respiration
is a major source of ROS, which makes mtDNA vulnerable to oxidative damage (23). The latter effect can lead to the production of
more ROS by impairing the electron transport chain (37), which
can in turn determine further mtDNA damage (38,39).
To evaluate whether the mitochondrial mutability consequent to POLG mutations could result from ROS damage on
mtDNA, we analysed the effect of a ROS scavenger, dihydrolipoic acid. Exposure to dihydrolipoic acid caused a 6-fold
decrease in the petite mutability of the heterozygous MIP1/
mip1 diploid carrying the mip1 Y757C dominant allele and of
the Dmip1 haploid strain carrying the mip1 G224A recessive
allele. However, we could not establish whether the polymerase mutations increase the amount of ROS or whether they
make the mtDNA more sensitive to ROS.
We have previously reported that the presence of ROS scavengers reduced significantly the consequences of a mutation equivalent to an arPEO mutation in the human ANT1 gene (11). Likewise,
the data presented in this paper ushers in the development of a
rational anti-ROS strategy for patients with pol gA mutations.
MATERIALS AND METHODS
Yeast strains and media
Yeast strains are listed in Table 3. YP medium contained 1%
Bacto-yeast extract and 2% Bacto-peptone (Difco). Minimal
medium (YNB) contained 7 g/l yeast nitrogen base without
amino acids (Difco) supplemented with appropriate amino acids
and bases for auxotrophy. Various carbon sources were added at
the indicated concentrations. N1 medium contained 1%
2851
peptone, 1% yeast extract, 2% ethanol in 50 mM phosphate
buffer at pH 6.3, supplemented with 4 g/l erythromycin (SIGMA).
Construction of yeast strains carrying mip1 mutations
Saccharomyces cerevisiae strain W303-1B (40) was used for
the construction of a null Dmip1 mutant by one step gene disruption using KanMX expression cassette (41). MIP1 ORF
was completely deleted and substituted by the Kanr marker,
whose correct target of at MIP1 locus was verified by PCR.
Oligonucleotides used for MIP1 disruption and verification
are listed in Table 3. Dmip1 mutant strain (strain OF1), r0,
was then crossed with the isogenic strain W303-1A (40),
giving rise to the diploid DWM MIP1/Dmip1 rþ. This strain
was transformed with wt MIP1 or mip1 Y757C or mip1 G224A
mutant alleles, cloned in the centromeric vector pFL38 or
with the empty plasmid. Diploid clones obtained will be
named: MIP1/Dmip1//MIP1, MIP1/Dmip1//mip1 Y757C, MIP1/
Dmip1//mip1 G224A, MIP1/Dmip1//pFL38, respectively.
Absence of MIP1 determines the complete and irreversible
loss of mtDNA. For this reason, we maintained wt MIP1
expressed by a plasmid during the construction of the
haploid mutant strains and eliminated it by plasmid shuffling
once the mutant allele was already into the cell. For the construction of haploid strains, DWM strain transformed with the
pFL38MIP1 plasmid was sporulated. By tetrad analysis
the haploid spore DWM-5A, carrying the Dmip1 disruption
and the pFL38MIP1, and therefore rþ, was selected. This strain
was the host for wt MIP1 or mip1 Y757C or mip1G224A mutant
allele, cloned in the pFL39 centromeric vector. By plasmid shuffling in the presence of 5-fluoro orotic acid (5FOA, SIGMA), it
was then possible to isolate DWM-5A strain devoid of
pFL38MIP1. Haploid clones obtained will be named: Dmip1//
MIP1, Dmip1//mip1Y757C, Dmip1//mip1 G224A respectively.
Strains carrying Dsml1 mutation were derived from strain
YG855, kindly obtained from Rodney Rothstein. This strain
was crossed with DWM-5A (Dmip1) thus obtaining the
diploid YO81 heterozygous at Dsml1 and Dmip1 loci. By sporulation and tetrad analysis of this strain, we selected the spores
YO81-3A (Dsml1) and YO81-4B (Dmip1Dsml1). These clones
were then crossed to obtain the diploid DYY MIP1/Dmip Dsml1/
Dsml1, used as the host for wt MIP1 or mip1 Y757C or mip1 G224A
mutant alleles cloned in pFL38. For the construction of haploid
strains, DYY diploid strain, transformed with the pFL38MIP1
plasmid, was sporulated. By tetrad analysis, the haploid spore
DYY-4C Dmip1 Dsml1 carrying pFL38MIP1, therefore being
rþ, was selected. This strain was transformed by mip1 G224A
mutant allele, cloned in the centromeric vector pFL39. By
plasmid shuffling in the presence of 5-fluoro orotic acid, it
was then possible to isolate the DYY-4C strain (Dmip1
Dsml1) carrying mip G224A allele and devoid of pFL38MIP1.
The same has been done also with MIP1 wt allele in order to
obtain strains transformed with the same plasmid pFL39 and
consequently carrying the same selectable marker, TRP1.
Construction of mutant alleles
The mip1 G224A and mip1 Y757C mutant alleles were produced by
site-directed mutagenesis, using the QuikChange Kit (STRATAGENE). The template DNA was the wt MIP1 cloned in
2852
Human Molecular Genetics, 2006, Vol. 15, No. 19
Table 3. List of yeast strains
Haploid strains
Genotype
Origin
W303-1B
W303-1A
OF1
DWM-5A
YG855
Mata ade2-1 leu2-3, 112 ura3-1 trp1-1 his3-11, 15 can1-100
Mata ade2-1 leu2-3, 112 ura3-1 trp1-1 his3-11, 15 can1-100
Mata ade2-1 leu2-3, 112 ura3-1 trp1-1 his3-11, 15 can1-100 mip1::KanR
Mata ade2-1 leu2-3, 112 ura3-1 trp1-1 his3-11, 15 can1-100 mip1::KanR
Mata ade2-1 leu2-3, 112 ura3-1 trp1-1 his3-11, 15 can1-100 sml1::HIS3
adh4::URA3
Mata ade2-1 leu2-3, 112 ura3-1 trp1-1 his3-11, 15 can1-100 mip1::KanR
sml1::HIS3
Mata ade2-1 leu2-3, 112 ura3-1 trp1-1 his3-11, 15 can1-100 sml1::HIS3
Mata ade2-1 leu2-3, 112 ura3-1 trp1-1 his3-11, 15 can1-100 sml1::HIS3
Mata ade2-1 leu2-3, 112 ura3-1 trp1-1 his3-11, 15 can1-100 mip1::KanR
sml1::HIS3
Mata ade1cox2
Mata ade1cob
Mata ade1cob
Mata ade1cox3
Mata met cox2
Mata met cox3
Mata met cob
Mata met cob
Genotype
Thomas and Rothstein (41)
Thomas and Rothstein (41)
mip1:KanR derived from W303-1B
Sporulation of DWM diploid strain
Rodney Rothstein
Mata ade2-1 leu2-3, 112 ura3-1 trp1-1 his3-11, 15 can1-100/
Mata ade2-1 leu2-3, 112 ura3-1 trp1-1 his3-11, 15 can1-100
Mata ade2-1 leu2-3, 112 ura3-1 trp1-1 his3-11, 15 can1-100/
Mata ade2-1 leu2-3, 112 ura3-1 trp1-1 his3-11, 15 can1-100 mip1::KanR
Mata ade2-1 leu2-3, 112 ura3-1 trp1-1 his3-11, 15 can1-100 sml1::HIS3
adh4::URA3/
Mata ade2-1 leu2-3, 112 ura3-1 trp1-1 his3-11, 15 can1-100 mip1::KanR
Mata ade2-1 leu2-3, 112 ura3-1 trp1-1 his3-11, 15 can1-100 sml1::HIS3/
Mata ade2-1 leu2-3, 112 ura3-1 trp1-1 his3-11, 15 can1-100 mip1::KanR
sml1::HIS3
W303-1B W303-1A
YO81-4B
YO81-3A
YO81-5D
DYY-4C
M9-94-4B
M7-40-5B
M17-162-4D
M9-3-5B
M9-94/A1
M9-3/A3
M7-40/A1
M17-162
Diploid strains
DWW
DWM
Y081
DYY
pUC19 vector. To obtain this construction, we PCR-amplified a
DNA fragment of 5110 bp, containing the ORF and the 5’ and 3’
flanking regions (851 and 441 bp, respectively), using genomic
DNA of strain W303-1B as template and the forward primer
MIP1C (containing a SacI site at the 5’ end) and the reverse
primer MIP1E (containing a SalI site at the 5’ end).
The list of base changes, and corresponding modified
primers used to generate mutated vectors, is reported in
Table 4. In order to maximize the expression of these variants,
the preferred yeast codons (42) were used in the oligonucleotide sequences used for mutagenesis: GCT for Alanine and
TGT for Cysteine. Mutagenized inserts for each different construct were sequence-verified on both strands. The sequences
of the oligonucleotide primers used for cloning and sequencing MIP1 are also listed in Table 3.
Plasmids
MIP1 gene and mutant alleles were cloned in both the centromeric vectors pFL38 and pFL39 (43) at SacI and SalI sites.
These vectors carry URA3 and TRP1 markers, respectively.
RNR1 gene, cloned in the multicopy vector pRS425 (plasmid
pWJ841), was kindly obtained from Rodney Rothstein.
Mitochondrial DNA mutation frequency
Analysis of petite frequencies. Diploid and haploid strains
transformed with wt or mutated mip1 alleles were pregrown
Sporulation of YO81 diploid strain
Sporulation of YO81 diploid strain
Sporulation of YO81 diploid strain
Sporulation of DYY diploid strain
Françoise Foury
Françoise Foury
Françoise Foury
Françoise Foury
Françoise Foury
Françoise Foury
Françoise Foury
Françoise Foury
Cross
W303-1A OF1
YG855 OF1
YO81-3A YO81-4B
overnight in YNB medium supplemented with 2% ethanol
and then inoculated in the same medium supplemented with
2% glucose. After 15 generations of growth at 368C, cells
were plated on YNB agar plates supplemented with 2%
ethanol and 0.25% glucose at a dilution that gave approximately 200 cells/plate. Petite frequencies were defined as
the percentage of colonies showing the petite phenotype
after a 5 day incubation at 288C.
To test the effect of dihydrolipoic acid, cells were grown in
YNB medium supplemented with 2% glucose in the presence
or in the absence of 30 mM dihydrolipoic acid (SIGMA) for 15
generations at 288C. These experiments were performed at
288C because lipoic acid at 378C determined high level of
cells lethality.
Evaluation of the nature of petite clones
In order to evaluate the nature of the petite mutants produced
by pathologic mutations, petite clones were crossed with mit 2
strains harbouring point mutations in genes encoding respiratory proteins. The four mit 2 mutations used for this analysis
map in the first and in the sixth exons of cob gene, in the
cox2 gene and in the cox3 gene, respectively. This choice
was based on the observation that in the petite r2 mutants,
the fragments that are most frequently retained encompass
cytochrome b, cox2 and cox3 genes (44,45). The petite
clones unable to complement any of the mit 2 mutants could
be either r0 (no mtDNA) or r2 carrying rearranged mtDNA
Human Molecular Genetics, 2006, Vol. 15, No. 19
2853
Table 4. List of oligonucleotides used
Amino acid change
Oligonucleotides used for site directed mutagenesisa
Y783C
Fw:GGTAGAATTTGTGGCGCTGGTGCTAAATTTGCGAGTCAGTTAC
Rv:GTAACTGACTCGCAAATTTAGCACCAGCGCCACAAATTCTACC
Fw:GAATAAAGAGCAAGTAATAATTGCTCACAATGTTGCGTATGATAG
Rv: TATCATACGCAACATTGTGAGCAATTATTACTTGCTCTTTATTC
Oligonucleotides used for cloning and sequencing MIP1 a
G250A
MIP1C
MIP1E
MIPF
MIPG
MIPH
MIPI
MIPL
MIPM
MIPN
GGGGGAGCTCCAATCTGATGGCGGGCAATGC
GGCGCGTCGACCTGGAATCATGTGGAGCAGCAG
CGT GGC CTG TTC TGT GCC TC
GGG CGT TTC AAT TCT GAA CC
CGG CCA CAA GCC AAG TGT TTG
CGA AGG TAC AGA TTT GCA C
CAG TTA GAG ATG GGT TAA ACC
GGG AAC ACT GCA GAG TAC AGC C
CGA CCC TTG GTT AAA TGT GTC
Oligonucleotides used for the disruption of MIP1 a
S1MIP
S2MIP
K2
K3
GCC GCC ACT ACA AGG CG GTC GCT AGA TGA GCA TTT CCA GAA GCG TAC GCT GCA GGT CGA C
CTC CTG TTC TCC AGC AAT TGC TTT TCT GGG ATT GCT GAA TCG ATC GAT GAA TTC GAG CTC G
GAA AGA AGA ACC TCA GTG GC
CTG CCT CGG TGA GTT TTC TCC
molecules which lack the three mutant genes. To distinguish
between these two possibilities, we evaluated the presence/
absence of mtDNA in a set of these clones by Southern analysis. Mitochondrial DNA was extracted by rapid mitochondrial
preparation (46) from clones unable to complement any of the
mit 2, grown in YNB supplemented with 2% glucose. Aliquots
of 1 mg of DNA were digested with EcoRV (Amersham).
Southern-blot analysis was carried out as previously described
(47). mtDNAs extracted from three rþ, three r2 and from
three r0 independent strains were also hybridized as a
control. Hybridization was performed by standard methods,
with a 50 -[g-32P]ATP end-labelled yeast mtDNA-specific
sequence repeat (50 -CTCCTTTCGGGGTTCCGGCTCCCG
TGGCCGGGCCCCGG-30 ) as a probe. Among the 25 putative
ro clones that were analysed with this method, no mtDNA was
observed in all but two clones, in which the mtDNA was likely
not to encompass any of the mit 2 mutations (Fig. 3). These
results indicate that the absence of mit 2 complementation is
a good indicator of a r0 condition.
Miscellaneous
Transformation of yeast strain was obtained by the lithium
chloride method (48). Restriction enzyme digestions, E. coli
transformation and plasmid extractions were performed
using standard methods (47). Cytochrome spectra and respiration were determined as described previously (10).
ACKNOWLEDGEMENTS
We are indebted to Luigi Palmieri for suggestions in the
experimental design and procedure. We thank Françoise
Foury for critical discussion; Antonietta Cirasolo and
Roberto Silva for their skilful technical assistance; Rodney
Rothstein for the generous gift of strain YG855 and
plasmid pWJ841. This work was funded by grants from
Fondazione Telethon-Italy no. GGP030039, Fondazione
Pierfranco and Luisa Mariani, and the European
Community’s sixth Framework Programme for Research
(EUMITOCOMBAT
consortium,
contract
no.
LSHM-CT-2004-503116).
Conflict of Interest statement. None declared.
Erythromycin resistance assays
Fifteen independent colonies from each strain were inoculated
in separate 10 ml cultures of YNB þ glucose and allowed to
reach the stationary phase. After 24 h, a small sample was
removed to determine the total number of respirationcompetent cells by plating onto YP supplemented with 2%
ethanol. The remainder of each culture was plated onto solid
N1 medium containing 4 mg/ml erythromycin (SIGMA) and
grown at 288C for 8 days until drug-resistant colonies
formed. The experiment was carried out in duplicate. The
mutation frequency was calculated as number of EryR colonies/total number of colonies.
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Mitochondrial DNA defects in Saccharomyces cerevisiae caused by
functional interactions between DNA polymerase gamma mutations
associated with disease in human
Enrico Baruffini a,b , Iliana Ferrero a , Françoise Foury b,⁎
a
Department of Genetics, Biology of Microorganisms, Anthropology, Evolution, University of Parma, 43100 Parma, Italy
b
Institut des Sciences de la Vie, Université Catholique de Louvain, 1348 Louvain-la-Neuve, Belgium
Received 27 August 2007; received in revised form 1 October 2007; accepted 2 October 2007
Available online 14 October 2007
Abstract
The yeast mitochondrial DNA (mtDNA) replicase Mip1 has been used as a model to generate five mutations equivalent to POLG mutations
associated with a broad spectrum of diseases in human. All mip1 mutations, alone or in combination in cis or in trans, increase mtDNA instability as
measured by petite frequency and EryR mutant accumulation. This phenotype is associated with decreased Mip1 levels in mitochondrial extracts and/
or decreased polymerase activity. We have demonstrated that (1) in the mip1G651S (hG848S) mutant the high mtDNA instability and increased
frequency of point EryR mutations is associated with low Mip1 levels and polymerase activity; (2) in the mip1A692T–E900G (hA889T–hE1143G)
mutant, A692T is the major contributor to mtDNA instability by decreasing polymerase activity, and E900G acts synergistically by decreasing Mip1
levels; (3) in the mip1H734Y/mip1G807R (hH932Y/hG1051R) mutant, H734Y is the most deleterious mutation and acts synergistically with G807R as a
result of its dominant character; (4) the mip1E900G (h1143G) mutation is not neutral but results in a temperature-sensitive phenotype associated with
decreased Mip1 levels, a property explaining its synergistic effect with mutations impairing the polymerase activity. Thus, the human E1143G
mutation is not a true polymorphism.
© 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords: POLG; Mutation; Disease; Yeast; mip1 mutant; mtDNA
1. Introduction
The mitochondrial genome is replicated by a specific DNA
polymerase called DNA polymerase gamma (pol g) [1].
The catalytic subunit of pol g is phylogenetically related to
the prokaryotic PolA family and its amino acid sequence has
been well conserved during evolution from yeast to human. The
N-terminal part of the protein contains two domains endowed
with dRP-lyase and 3′–5′ exonuclease proofreading activities,
respectively, and is separated from the C-terminal polymerase
domain by a linker region whose length and complexity have
increased from yeast to human. While yeast pol g contains a
single catalytic polypeptide of ∼ 140 kDa encoded by the MIP1
gene [2], human pol g is a heterotrimer [3] formed by the
⁎ Corresponding author. Tel.: +32 010474691; fax: +32 010473872.
E-mail address: foury@fysa.ucl.ac.be (F. Foury).
0925-4439/$ - see front matter © 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.bbadis.2007.10.002
140 kDa catalytic subunit encoded by the POLG gene and two
identical 55 kDa accessory subunits which increase the activity
and processivity of the enzyme.
The first POLG mutations associated with an autosomal
dominant form of progressive external ophtalmoplegia (adPEO)
were reported in 2001 [4]. Six years later more than 80 exonic
mutations have been identified. (Human DNA Polymerase
Gamma Mutation Database at http://dir-apps.niehs.nih.gov/
polg). They are associated with a broad spectrum of mitochondrial disorders [5,6] including PEO, myopathy, Parkinsonism,
premature menopause, psychological disorders, ataxia, encephalopathy, and the fatal Alpers syndrome. The affected tissues are
characterized by multiple deletions or depletion of mtDNA.
POLG mutations are often pathogenic as compound heterozygous. However, the mechanisms underlying symptom variability are not understood. Moreover, as several POLG mutations
are often simultaneously present in the patients, it is difficult to
1226
E. Baruffini et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1772 (2007) 1225–1235
distinguish between single nucleotide polymorphisms (SNPs)
and pathogenic mutations. For instance, the E1143G substitution
identified in 2–3% of the Northern population and met in healthy
homozygous individuals has been considered as a SNP. However, it is also very often associated with pathogenic mutations in
cis or in trans [7–11].
The MIP1 gene has previously been used in Saccharomyces
cerevisiae as a model to study pathogenic POLG mutations
[12,13]. Moreover, S. cerevisiae appears as an appropriate organism to search for genes and mechanisms rescuing the defects generated by deleterious POLG mutations [13,14]. In the
present study five human POLG mutations mapping to the
polymerase domain and associated with a large range of clinical
symptoms, from mild PEO to severe neurological manifestations and Alpers syndrome, were introduced at the homologous
positions in the MIP1 gene, and compound heterozygous yeast
strains as found in human patients were constructed. The effects
of the mip1 mutations on mtDNA stability and point mtDNA
mutation rate, dominance/recessivity of the phenotypes and
DNA polymerase activity were analysed. We found a good
correlation between mtDNA maintenance in yeast and disease
severity in humans.
2. Materials and methods
2.1. Yeast strains and media
The S. cerevisiae strains used in this work are W303-1B (Matα ade2-1 leu23, 112 ura3-1 trp1-1 his3-11, 15 can1-100), DWM-5A (Matα ade2-1 leu2-3,
112 ura3-1 trp1-1 his3-11, 15 can1-100 mip1::KanR) and DWM-1A, its
isogenic Mata counterpart. DWM-1A and DWM-5A are meiotic segregants
derived from W303 [13].
The diploid DMM was obtained by crossing DWM-5A which harbours
plasmid pFL38MIP1 (see below) and is rho+ with DWM-1A which harbours
plasmid pFL39 (see below) and is rho0. A diploid that has lost pFL39 and
retained pFL38MIP1 was then selected.
YP medium contained 1% Bacto-yeast extract and 2% Bacto-peptone
(Difco). YPA medium was YP medium supplemented with 40 mg/l adenine.
Synthetic defined (SD) medium contained 6.7 g/l yeast nitrogen base without
amino acids (Difco) supplemented with appropriate amino acids and bases.
Synthetic complete (SC) medium contained 6.7 g/l yeast nitrogen base without
amino acids (Difco) and supplemented with 1 g/l of drop-out powder [15]
containing all amino acids except those required for plasmid maintenance.
Carbon substrates were added at the indicated concentration. YPAEG-ery
contained 1% Bacto-yeast extract, 2% Bacto-peptone (Difco), 40 mg/l adenine,
3% ethanol, 3% glycerol, 3 g/l erythromycin (SIGMA) and 25 mM potassium
phospate buffer at pH 6.5.
2.2. Construction of yeast mip1 strains
The mip1 mutations were obtained by site-directed mutagenesis of a MIP1
gene fragment, using the overlap extension technique [16] and after appropriate
restrictions the MIP1 and mip1 alleles were subcloned in the SacI and SalI sites
of the centromeric pFL38 (URA3 marker) or pFL39 (TRP1 marker) plasmids
[17]. The pFL39 plasmid-borne MIP1 and mip1 genes were transformed in the
DWM-5A strain deleted for the MIP1 gene and harbouring the pFL38 plasmidborne MIP1 gene to allow mtDNA maintenance. The plasmids were named
pFL39MIP1 (or mip1 followed by the name of the mutation) and pFL38MIP1
(or mip1). In a second step, the pFL39-borne MIP1 or mip1 alleles were
selected through plasmid shuffling using 5-fluoroorotic acid as previously
described [13]. Heteroallelic haploid strains were obtained by transformation
of the pFL39MIP1 or pFL39mip1 plasmid-bearing strains with pFL38-based
plasmids.
The plGALmip1 plasmids containing the desired mutation were constructed
by replacing the NotI–NgoMIV fragment of the wild-type MIP1 gene borne by
the plGALMIP1 plasmid [18] with the corresponding mutated fragment. Strain
W303-1B was transformed with plGALZ3 (the empty plasmid), wild-type
plGALMIP1 and plGALmip1 mutant plasmids. The presence of the mip1 mutation was verified by DNA sequencing.
2.3. Nomenclature
DWM-5A strains harbouring mip1 mutations were named as follows. The
mip1 symbol was followed by the residue number preceded by the one-lettercode symbol of the wild-type amino acid followed by the symbol of the mutant
residue. Thus mip1G651S means mip1 mutant harbouring a mutation from
glycine to serine at position 651 of the amino acid sequence. Heteroallelic strains
harbouring pFL38 plasmid-borne MIP1 and pFL39 plasmid-borne MIP1 (or
mip1) alleles, or empty pFL39 plasmid were designated as MIP1(or mip1)/
MIP1, or MIP1/pFL39 strains. Strain mip1H734Y/mip1G807R was obtained by
transforming the DWM-5A strain harbouring the pFL39 plasmid-borne G807
mutation with the pFL38 plasmid bearing the H734Y mutation. Strain mip1G651S/
mip1E900G was obtained by the same procedure.
2.4. Determination of petite frequency and mtDNA retention
Strains containing MIP1 or mip1 alleles were grown on solid SC medium
supplemented with 2% ethanol at 28 °C to counterselect the petite cells that
could be present in the population. After approximately 60 h, strains were
replica-plated on SC medium supplemented with 2% glucose and grown at
28 °C or 36 °C. After 24 h, strains were replica-plated on SC medium
supplemented with 2% glucose and grown at 28 °C or 36 °C. After 24 h cells
were diluted in water and plated on SC agar plates supplemented with 2%
ethanol and 0.3% glucose at a dilution giving approximately 200 cells per plate.
Petite frequency was defined as the percentage of colonies showing the petite
phenotype after a 5 day-incubation at 28 °C. For each strain at least 4000 clones
were analysed. When 100% petites were obtained, 104 and 105 cells were
directly plated on YP plates supplemented with 3% glycerol to confirm that the
cell population was only composed of petites and did not grow on glycerol.
To determine whether petites had retained mtDNA fragments, the clones in
the DWM-5A background were crossed with mit− mutants, M9-94-4B (Mata
ade1 cox2), M7-40-5B (Mata ade1 cob), M17-162-4B (Mata ade1 cob) and
M9-3-5B (Mata ade1 cox3) [19] as previously described [13]. Mit− mutations
are mtDNA point mutations conferring respiratory deficiency and loss of growth
on a respiratory carbon source [20]. Briefly, for each haploid mip1 mutant, at
least 200 independent petite clones were crossed with the mit− mutants of
opposite mating type on YP plates supplemented with 2% glucose and replicaplated on YP plates supplemented with 3% glycerol to select rho+ diploid
strains. For the mip1G651S mutant, 200 independent clones were crossed with
mit− mutants immediately after isolation of the mutant strain.
2.5. Frequency of erythromycin resistant (EryR) mutants
Two independent series of 10 independent colonies grown on YP plates
supplemented with 3% glycerol were inoculated in 2.5 ml cultures of YPA
supplemented with 3% glycerol. After 48 h at 28 °C, 1.5 ml of each culture,
corresponding to 6–8 × 107 cells, were plated on YPAEG-ery medium and
incubated at 28 °C for 9 days. A small aliquot of each culture was spread for
single colonies on YP plates supplemented with 3% glycerol to determine the
number of rho+ cells initially present in the cultures. The mutation frequency
was calculated as the number of EryR colonies per 108 rho+ cells. For
heteroallelic strains containing both pFL39- and pFL38-derived plasmids, the
same test was carried out, except that colonies were grown on SD plates
supplemented with 2% glucose and then inoculated in 2.5-ml cultures of SC
medium supplemented with 2% ethanol to avoid loss of one plasmid.
2.6. Southern hybridisation
Cells pre-grown on SC medium supplemented with 2% ethanol (except for
mutant mip1G651S which was supplemented with 2% glucose) were inoculated
E. Baruffini et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1772 (2007) 1225–1235
1227
Fig. 1. Position and conservation of mutated amino acids associated with mitochondrial diseases in several DNA polymerases gamma and E. coli DNA polymerase
I. A. Linear representation of human pol g and Mip1 polymerases. I, II and III refer to the ExoI, ExoII, and ExoIII conserved motifs of the 3′–5′ exonuclease domain,
and A, B and C refer to the polA, polB and polC conserved motifs of the polymerase domain. B. Multiple amino acid alignment of regions encompassing the mutated
residues. Numbers refer to the position of the residues in the amino acid sequence. Mutated residues are in bold characters and underlined in H. sapiens and
S. cerevisiae. Alignment of DNA was carried out by using CLUSTAL W program [37].
in 10 ml of SC medium supplemented with 2% glucose and grown overnight.
Total DNA was extracted by standard procedures, digested with EcoRI, and
subjected to electrophoresis in a 0.8% agarose gel. The TRP1 alleles harboured
by the pFL39MIP1 plasmid and the genome are contained within DNA
fragments of 4.8 and 1.45 kb, respectively. Hybridisation was performed by
standard procedures with the TRP1 gene as a probe using [α-32P]dCTP and the
kit ‘Rediprime II DNA Labeling System’ (GE Healthcare). The TRP1 probe was
obtained by BglII digestion of the pFL39 plasmid. The signals were quantified
after a 15-min exposure with a PhosphorImager (Molecular Dynamics).
MgCl2, 25 μM each dATP, dCTP, dGTP, 6 μM [3H]-dTTP, 150 μg/ml calf
thymus activated DNA and the mitochondrial extract. Samples were taken after
6 min of incubation at 30 °C. The activity was expressed in nmol dTTP
incorporated into trichloroacetic precipitable material per h and per mg protein
present in the extract or was reported to an arbitrary amount of Mip1 (100 for the
wild-type).
2.7. DNA polymerase assay
3.1. Choice of POLG mutations and construction of mip1
mutants
Mitochondrial extracts were obtained from strain W303-1B overexpressing
the MIP1 (mip1) alleles under the control of the GAL1 promoter in a 2%
galactose-containing SC medium for 15 h at 30 °C as previously reported [18].
The W303-1B strain harbouring the empty GALZ3 plasmid was taken as the
negative control. The gap-filling activity assay was carried out in a reaction
mixture containing 20 mM Tris–HCl pH 8.0, 5 mM dithiothreitol, 50 mM
3. Results
Positions of the mutations studied in this work are shown in
Fig. 1A.
The recessive G848S mutation which affects a conserved
glycine residue upstream of motif polA (Fig. 1B) in the
Table 1
Relevant pathologies, human POLG mutations and yeast mip1 equivalents studied in this work
Human POLG mutations
Allele 1
a
G848S
G848S
G848S
A889T–E1143G
A889T
H932Y
a
b
c
Equivalent mip1 mutations
Allele 2
a
T251I–P587L
A467T
W748S–E1143G
Wt c
R579W
G1051R
Alleles 1 and 2 are borne in trans by different chromosomes.
NC, not conserved.
Wt, wild-type.
Pathology
Allele 1
Allele 2
G651S
G651S
G651S
A692T–E900G
A692T
H734Y
NC b
NC
NC-E900G
Wt
NC
G807R
PEO [25,26]
Alpers [9,21,23,24]
Alpers [22,23]
Tremor or adPEO/neuropathy [8]
PEO/neuropathy [27]
PEO/neuropathy [28]
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E. Baruffini et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1772 (2007) 1225–1235
polymerase domain is involved in diseases of variable severity,
from PEO to the Alpers syndrome, according to the associated
mutations in trans [9,21–26] (Table 1). The A889T mutation
affects a conserved residue immediately upstream of motif polA
(Fig. 1B). This mutation associated in cis with the SNP E1143G
(Fig. 1B) has been reported as dominant in two brothers with
PEO and severe neurological manifestations [8] (Table 1). Their
mother and two grand-uncles, obligate mutation carriers,
showed only tremors, suggesting that genetic or environmental
factors modulate the severity of the phenotype. The A889T
mutation has also been reported to be associated in trans with the
R579W mutation in a brother and a sister with PEO, sensory
ataxia, areflexia, and gastrointestinal dysmotility [27]. Since in
this case parents were healthy A889T seems, when alone, to be a
recessive mutation. However, since one POLG mutation in
different families and individuals may cause different kinds of
disorders it cannot be excluded that A889T alone is dominant.
Nevertheless, the most likely hypothesis is that E1143G
modifies the pathogenic effect of A889T.
The H932Y mutation affects a strictly conserved residue
slightly upstream of motif polB (Fig. 1B). The G1051R
mutation affects a residue located between motifs polB and
polC within a region poorly conserved in prokaryotic DNA
polymerases (Fig. 1B). H932Y/G1051R compound heterozygous patients developed a complex syndrome including PEO,
polyneuropathy, ataxia, hearing loss and psychiatric disorders
[28] (Table 1).
The equivalent mip1 mutations G651S (hG848S), A692T
(hA889T), H734Y (hH932Y), G807R (hG1051R) and E900G
(hE1143G) obtained by site-directed mutagenesis (Fig. 1A)
were introduced in the MIP1 gene borne by a low copy
centromeric vector and the mip1 alleles were cloned in a yeast
strain whose chromosomal MIP1 gene was deleted. The MIP1
allele used in this work is found in several commonly used
laboratory strains including the S288c reference strain and
W303. It contains an alanine at position 661. However, T661 is a
strictly conserved residue from fungi to human, and all natural
S. cerevisiae strains contain a threonine at this position. We have
recently shown that the T661A substitution is a mutation
increasing mtDNA instability in a temperature-dependent
manner [29]. Here, the choice of the A661 context is based on
two previous reports on the effect of pathogenic POLG
mutations which were using the Ala661-containing MIP1 gene
as a model [12,13]. In the last section we present a comparison of
the mutant phenotypes obtained in the A661 and T661 contexts.
Southern blotting experiments were performed to estimate
the average copy number of pFL39 plasmid-borne MIP1 (mip1)
gene. Even though it was not excluded that mutants mip1G651S
and mip1H734Y contained on average slightly more than one
copy per cell, chromosomal and plasmid DNAs were grossly in
stoichiometric amounts in all mutants (Fig. 2), indicating that
the copy number of the mip1 alleles was not influenced by their
presence on a centromeric vector.
Fig. 2. Estimation of the copy number of pFL39-borne MIP1 (mip1) genes in
wild-type and mutants. The MIP1 (mip1) genes were borne by the pFL39
plasmid. The standard deviation of the ratio of the plasmid to genomic DNA was
in the range of 0.1–0.3. Southern blotting was performed as described in
Materials and methods.
3.2. Effect of mip1 mutations on oxidative growth phenotype
The analysis of cellular growth on an obligatory respiratory
carbon source such as ethanol or glycerol is a simple method to
test mitochondrial function. All mutants except mip1G651S were
able to grow on ethanol at 28 °C (Fig. 3A). Whereas mutants
mip1G807R and mip1E900G were growing like the wild-type,
cellular growth of mutants mip1A692T and mip1H734Y, and to a
greater extent that of mutant mip1A692T–E900G, was impaired. In
all mutants the growth defect was more pronounced at 36 °C
(Fig. 3B).
3.3. Effect of single mip1 mutations on petite accumulation
The patients harbouring the mutations studied here present
multiple deletions or depletion of mtDNA. While in human cells
deleted and intact mtDNA molecules are coexisting, S.
cerevisiae has the unique property to produce cells with
homoplasmic deleted mtDNA molecules, which are referred
to as petites or rho− mutants [30]. These mutants do not grow
on respiratory carbon sources but they can grow on glucose
thanks to the energy produced by fermentation. In all mip1
mutants the frequency of petites was increased at 28 °C, being
quite low in mip1E900G (6%), moderate in mip1G807R (25%) and
high in mip1A692T and mip1H734Y (80 and 99%, respectively)
(Table 2). In all strains petite frequency was increased at 36 °C.
The temperature-sensitive trait was specially marked for the
G807R and E900G mutations, which yielded 99% and 92%
petites, respectively (Table 2). No rho+ colony was obtained
for mutant mip1G651S , suggesting that mtDNA maintenance
was incompatible with the G651S mutation. Petite cells either
contain amplified mtDNA fragments mapping to various
positions of the mtDNA molecule, and are referred here to as
rho−, or are completely devoid of mtDNA and referred to as
rho0. To distinguish between rho− and rho0 clones we used a
genetic test based on the capacity of the mtDNA fragments
Fig. 3. Oxidative growth phenotype of wild-type, mip1 and heteroallelic strains. Cell growth was tested on SC medium supplemented with 2% ethanol at 28 °C, and on
YP medium supplemented with 2% ethanol at 36 °C (cells were unable to grow on ethanol supplemented SC medium at 36 °C). For each strain, 105, 104, 103 and 102
cells were spotted. Pictures were taken after 4 days. A. mip1 mutants at 28 °C. B. mip1 mutants at 36 °C. C. Heteroallelic haploid strains at 28 °C.
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1230
E. Baruffini et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1772 (2007) 1225–1235
Table 2
Petite and EryR mutant frequency in mip1 mutants
Haploid
strain a
MIP1
mip1G651S
mip1A692T
mip1H734Y
mip1G807R
mip1E900G
mip1A692T–E900G
28 °C
EryR mutant
frequency b
36 °C
%
petites c
%
rho0 d
%
petites
%
rho0
EryR
(×108)
Fold
increase
2.7 ± 0.3
100 ± 0
80.3 ± 1.7
99.7 ± 0.1
25.5 ± 2.8
6.0 ± 0.6
96.6 ± 1.5
13
100
86
94
55
33
96
21.0 ± 2.4
–
99.7 ± 0.1
100 ± 0
99.2 ± 0.2
91.7 ± 3.9
100 ± 0
37
–
100
100
99
88
100
6.0 ± 0.4
ND e
22.2 ± 2.7
ND
61.6 ± 6.1
11.6 ± 1.3
20.4 ± 1.3
1.0
–
3.7
–
10.2
1.9
3.4
a
The DWM-5A strain contains the MIP1 (or mip1) gene borne by the pFL39
plasmid.
b
The frequency of EryR mutants was calculated as the ratio of the number of
R
Ery mutants to the number of rho+ cells plated on the Petri dish. The ‘fold
increase’ was calculated by normalization of the wild-type MIP1 strain relative
frequency to 1.
c
In this work ‘petites’ designates both rho− clones with mtDNA deletions and
0
rho clones. For each MIP1 (mip1) strain the data are averages obtained from
three independent experiments and two independent transformants.
d
Although not formally demonstrated a petite mutant which does not restore
any of the four mit-tester strains is referred to as rho0. Rho0 frequencies are
calculated as the ratio of the number of rho0 to the number of petite cells.
e
ND, not determined.
retained by petite clones to rescue mit− mutations by homologous recombination [31]. The mit − mutations were
selected in the cox2, cox3 and cob genes, because these
correspond to the most frequently retained loci in rho− mutants
[32]. Absence of restoration of these mit− mutants to wild-type
by a large number of petite clones provides good evidence that
the mip1 mutation leads to a total loss of mtDNA. Our data
show that there was a good correlation between petite frequency
and the loss of mtDNA (Table 2). In particular, they strongly
suggest that the mip1G651S mutant is not able to maintain a
fragment of mtDNA, implying a severe defect in mtDNA
replication.
3.4. Effect of single mip1 mutations on EryR mutant frequency
The fidelity of mtDNA replication was estimated by the
frequency of erythromycin (EryR) mutants. EryR mutations are
caused by mutations in the mtDNA 21S rRNA gene (nucleotides 59965−59967 on the mtDNA map in SGD database http://
www.yeastgenome.org/) [33]. All types of substitutions can be
obtained. An increased frequency of EryR mutants was
observed in all tested mip1 mutants, but there was no
relationship between Ery R and petite mutant frequencies
(Table 2).
3.5. Dominance/recessivity of mip1 mutations
Dominance/recessivity of each mip1 mutation was determined in diploids in which both chromosomal MIP1 genes were
deleted and replaced by a pFL38-borne wild-type MIP1 gene
and a pFL39-borne wild-type MIP1 or mutant mip1 gene
(Table 3). A diploid strain containing two copies of the MIP1
gene produced less than 1% petites at 28 °C. When one MIP1
copy was replaced by the empty plasmid (pFL39), the petite
frequency was two-fold higher at 28 °C and further increased at
36 °C. Petite accumulation in the presence of a single copy of
MIP1 is a sign of haploinsufficiency suggesting that Mip1 is a
limiting factor in mtDNA replication.
At 28 °C, the percentage of petites was similar in the
MIP1/mip1E900G and MIP1/MIP1 strains, indicating that the
mip1E900G allele is functional. All other MIP1/mip1 strains
showed haploinsufficiency, to various extents, suggesting that
the mip1 alleles in diploids are poorly functional. In the MIP1/
mip1H734Y strain petite accumulation was significantly higher
(7.4%) than in a strain bearing a single copy of wild-type MIP1
(2.1%), indicating that the mip1H734Y allele is dominant
(Table 3). In all strains EryR mutant accumulation was recessive
(data not shown).
3.6. Functional interactions of mip1 mutations in cis or in trans
In order to simulate human situations, mutants carrying
several mutations in cis or in trans were constructed both in
diploid (Table 3) and haploid states (data not shown). In the
latter context, the frequency of rho0 clones could be determined
in crosses with mit− mutants. The presence of the E900G
mutation in cis with the A692T mutation exacerbated the
mtDNA defects produced by the A692T mutation, but did not
further increase the frequency of EryR mutants (Table 2). No
difference was observed between the MIP1/mip1A692T and
MIP1/mip1A692T−E900G diploid strains (Table 3), leading to the
conclusion that the presence of the E900G mutation in cis does
not result in a dominant phenotype, as suggested in human for
the E1143G substitution associated in cis with the A889T
mutation.
When two plasmid-borne MIP1 (or mip1) genes were
introduced into a haploid instead of a diploid strain, petite
frequency was quite similar (compare MIP1/MIP1, mip1/
pFL39, MIP1/mip1G807R, MIP1/mip1H734Y in Tables 3 and 4).
Strains mip1H734Y/mip1H734Y and mip1G807R/mip1G807R produced 97.8% and 8.7% petites, respectively (Table 4). Petite
accumulation in the heteroallelic haploid mip1H734Y/mip1G807R
strain reached 70.7% (versus 83.9 in a diploid strain in Table 3),
Table 3
Petite mutant frequency in heteroallelic diploid strains
Diploid strains
% petites at 28 °C
MIP1/MIP1
MIP1/pFL39
MIP1/mip1G651S
MIP1/mip1A692T
MIP1/mip1H734Y
MIP1/mip1G807R
MIP1/mip1E900G
MIP1/mip1A692T–E900G
mip1H734Y/mip1G807R
mip1G651S/mip1E900G
0.8 ± 0.1
2.1 ± 0.1
1.8 ± 0.2
2.6 ± 0.1
7.4 ± 0.9
1.6 ± 0.1
0.8 ± 0.1
2.5 ± 0.1
83.9 ± 2.7
6.9 ± 0.5
The DWM-5A strain contains pFL38 and pFL39 plasmid-borne MIP1 and mip1
genes, respectively, as reported under Materials and methods. Experimental
conditions were as described in Table 2.
E. Baruffini et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1772 (2007) 1225–1235
1231
supporting further the hypothesis that mip1G651S behaves like a
null allele.
Table 4
Synergistic effects of the G807R and H734Y mutations
Haploid heteroallelic
strain
% petites
% rho0
EryR mutant
frequency (×108)
MIP1/MIP1
MIP1/pFL39
MIP1/mip1G807R
MIP1/mip1H734Y
mip1H734Y/mip1H734Y
mip1G807R/mip1G807R
mip1H734Y/mip1G807R
1.0 ± 0.1
2.7 ± 0.3
1.7 ± 0.3
6.7 ± 0.7
97.8 ± 0.2
8.7 ± 1.8
70.7 ± 4.8
11
24
21
22
91
29
82
2.2 ± 0.4
8.0 ± 0.8
6.2 ± 0.5
3.5 ± 0.3
ND
48.6 ± 3.6
41.2 ± 4.4
The DWM-5A strain contains pFL38 and pFL39 plasmid-borne MIP1 and mip1
genes, respectively, as reported under Materials and methods. Experimental
conditions were as described in Table 2. ND, not determined.
with a high frequency of cells devoid of mtDNA (Table 4),
indicating that the mild G807R mutation was unable to
compensate for the deleterious effects of the H734Y mutation.
In agreement with these data the mip1H734Y/mip1G807R strain
grew on ethanol-containing medium slightly better than the
mip1H734Y/mip1H734Y strain but more slowly than the MIP1/
pFL39 and MIP1/mip1G807R strains (Fig. 2C). The dominant
trait of the H734Y mutation was thus confirmed, providing
support to the view that the human equivalent H932Y is
dominant. The frequency of EryR mutants was hardly
decreased in the compound heterozygous strain compared to
the mip1G807R/mip1G807R strain (Table 4), implying that the
contribution of Mip1H734Y polymerase to the fidelity of
mtDNA replication was small.
In haploid or diploid mip1E900G/mip1G651S strains petite
frequency reached 6−6.9%, a percentage higher than in the
strain homozygous for the E900G mutation (∼ 2%) and similar
to that of a strain bearing a single copy of the E900G mutation,
3.7. Levels and gap-filling activity of wild-type and mutant
Mip1p
POLG mutations in the polymerase domain can be ranged
into two broad classes. a) Mutations altering protein conformation, as a result of an intrinsic folding defect or an alteration of
protein interactions with the DNA substrate. b) Mutations
impairing polymerase activity, and altering, or not, the protein
structure.
Mip1 is naturally poorly expressed and gives a very faint
signal in Western blots (Fig. 4A). Therefore, soluble mitochondrial extracts were prepared from cells overexpressing the MIP1
gene from the strong inducible GAL1 promoter. We first
verified that MIP1 gene expression was similar in all strains
(data not shown). However, in all mutants, the amount of Mip1
in the mitochondrial extracts was lower than that in the wildtype (Fig. 4B and C, and Table 5), but to various extents.
Whereas the amounts of Mip1A692T were quite comparable to
that of the wild-type, those of Mip1G651S, Mip1G807R and
Mip1A692T−E900G were very low (b10% of wild-type Mip1),
and those of Mip1H734Y and Mip1E900G were substantially
reduced (Fig. 4B and C and Table 5). By comparison, the
extracts of a strain expressing the chromosomal MIP1 gene
contained 1.5−2% of the amount present in the overproducing
wild-type strain (Table 5).
Gap-filling activity measures the capacity of incorporating
nucleotides into short gaps of excess duplex DNA and is thus
independent of the processivity of the enzyme. A decrease in
this activity reflects mainly a defect in catalysis or a decrease in
Fig. 4. Estimation of wild-type and mutant Mip1 levels in mitochondrial extracts. The extracts prepared as reported in Materials and methods were subjected to SDSPAGE in a 7% polyacrylamide gel and Mip1 was detected by Western blotting using a polyclonal antibody raised against Mip1. For each strain, 30 μl of extract in the
solubilisation buffer were loaded onto the gel and the intensity of the signal was compared to that obtained by increasing amounts of the standard wild-type Mip1
expressed under the control of the GAL1 promoter. The wild-type mitochondrial extract contained 2 mg/ml protein. Western blots A, B and C were run independently.
A. Mip1 was expressed from the chromosomal MIP1 gene in cells containing the empty GALZ3 plasmid and its level was estimated by using a standard Mip1 curve
from 0.25 to 1 μl of extract. B and C. The levels of Mip1A692T–E900G, Mip1G807R, Mip1G551S, Mip1H734Y and Mip1, Mip1E900G and Mip1A692T expressed under the
control of the GAL1 promoter were estimated by using a standard curve from 1 to 4 μl (B) or 1 to 30 μl (C).
1232
E. Baruffini et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1772 (2007) 1225–1235
Km (dNTP). In all strains data were normalized to a same
amount of Mip1 protein in the assay. Gap-filling activities of
Mip1E900G and Mip1G807R were not modified (Mip1E900G) or
close (Mip1G807R) to that of the wild-type (Table 5). Together
with the observation that in these mutants Mip1 levels are
decreased, these data suggest that the mtDNA replication
defects of these mutants mainly result from limiting amounts of
Mip1. In contrast, the activity of Mip1A692T reached only 30%
of that of the wild-type. Since Mip1A692T levels were close to
that of wild-type, it could be concluded that the mtDNA
replication defects produced by the A692T mutation are mainly
caused by an intrinsic defect in the polymerase activity of the
enzyme. The gap-filling activity of Mip1A692T−E900G was
similar to that of Mip1A692T (Table 5). Since the major effect
of the E900G mutation in the presence of the A692T mutation
was a dramatic decrease of Mip1 levels in the extracts (Fig. 4
and Table 5), the low mtDNA replication capacity of the
mip1A692T−E900G mutant was better explained by the cumulative
effects of low polymerase activity caused by A692T and low
protein levels caused by E900G. The Mip1G651S, and to a lesser
extent, Mip1H734Y polymerases combined decreased gap-filling
activity and lower expression.
3.8. Comparison of the MIP1T661 and MIP1A661 alleles
As mentioned earlier in this paper the T661A substitution
present in the MIP1 gene used in this work decreases mtDNA
stability of ‘wild-type’ laboratory strains [29]. To determine the
influence of the T661A substitution, the mutant phenotypes
were compared in the A661 and T661 contexts (Tables 2 and 6).
Although mutability and temperature sensitivity were remarkably more pronounced in the presence of A661, there was no
fundamental discrepancy in the two genetic contexts. (1) G651S
and H734Y strongly increased petite frequency; (2) E900G
increased petite frequency approximately by two-fold; (3) A692T
Table 5
Mip1 levels and gap-filling activity in mitochondrial extracts
Strain
Mip1 level a (% wt)
Specific gap-filling b activity (% wt)
GALMip1
GALZ3 c
G651S
A692T
H734Y
G807R
E900G
A692T–E900G
100
1.5–2.0
7–10
100
10–20
9–15
20–50
3–6
100
100–130 d
42–55
29–30
30–46
65–86
107–139 d
30–40
a
The amounts of Mip1 in the mitochondrial extracts were estimated by using
Mip1 standard curves as reported in Fig. 4. For each strain the extreme ranges
obtained for mitochondrial extracts from different cultures are indicated.
b
Wild-type GALMip1 incorporates 456 ± 50 nmol dTTP/mg extract protein/
h into trichloroacetic acid precipitable material. The gap-filling activity was
normalized to the same amount of Mip1 for all strains and expressed as a
percentage of wild-type activity (100%).
c
GALZ3 corresponds to the wild-type strain containing the empty GALZ3
plasmid.
d
These values are not significantly different from those reported for
GALMip1.
Table 6
Petite and EryR mutant frequency in mip1 mutants in the T661 context
Haploid strain
MIP1
mip1G651S
mip1A692T
mip1H734Y
mip1G807R
mip1E900G
mip1A692T–E900G
EryR mutant frequency
% petites
28 °C
36 °C
EryR (×108)
Fold increase
0.8 ± 0.1
45.7 ± 4.9
17.1 ± 1.6
97.8 ± 0.4
2.1 ± 0.2
1.3 ± 0.1
35.5 ± 2.0
1.0 ± 0.1
99.7 ± 0.2
40.1 ± 0.3
98.8 ± 0.3
9.5 ± 0.8
5.0 ± 0.1
78.1 ± 3.2
2.4 ± 0.4
37.3 ± 4.7
3.2 ± 0.2
ND
7.9 ± 0.8
3.8 ± 0.2
3.3 ± 0.2
1.0
15.5
1.3
–
3.3
1.6
1.4
All experimental conditions were the same as in Table 2 except that a threonine
instead of an alanine is present at position 661 of the Mip1 amino acid sequence.
ND, not determined.
and G807R increased petite frequency at an intermediate level;
(4) E900G behaved as a phenotypic modifier of A692T in cis; (5)
in all mutants the frequency of point EryR mutants was increased.
(6) The dominant or recessive character of the mutations, and more
specifically H734Y dominance, were not influenced by the A661
or T661 context (data not shown). However, the haploinsufficiency observed in the presence of a single MIP1 copy instead of
two had disappeared in the T661 context (data not shown).
Moreover, whereas in mip1G651S mutant mtDNA was not
maintained in the A661 context, preventing further analysis of
point mutant accumulation, in the T661 context almost half of the
cell population was still rho+ at 28 °C and showed an increased
rate of EryR point mutations (Table 6).
4. Discussion
The question addressed in this work was: Is S. cerevisiae a
good model to determine the effect of each individual mutation
in patients harbouring several POLG mutations in cis or as
compound heterozygous? Indeed, except in the case of
dominant PEO, the patients often carry more than one POLG
mutation in cis or in trans, and thus the specific contribution of
each mutation to the disease cannot easily be established.
In this work we have shown that all the single substitution
mip1 mutations studied here cause mtDNA defects, increasing
the frequency of deletions and in some cases the frequency of
point mutations. We have found a good correlation between
decreased cellular oxidative growth, petite frequency and loss
of mtDNA. In contrast, there is no clear relationship between
petite and point mutation frequencies. Although the two MIP1
alleles used in our study, T661 and A661, confer very different
levels in mtDNA instability, the classification of these
mutations is similar. From the highest to lowest severity the
ranking is G651S (hG848S) and H734Y (hH932Y) N A692T
(hA889T) N G807R (hG1051R) N E900G (hE1143G).
The extreme severity of the G651S mutation fits with the
observation that patients who compound heterozygous for
G848S and A467T, or G848S and W748S-E1143G mutations,
present with the fatal Alpers syndrome [22–24].
Whereas the relative contribution of mutations H932Y and
G1051R in trans could not be established in the patients,
comparison of the severity of the yeast H734Y and G807R
E. Baruffini et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1772 (2007) 1225–1235
mutations strongly suggests that the major contributor to the
disease is H932Y, and moreover, our data show a strong
synergistic deleterious effect of the two mutations associated in
trans. In addition, the family history shows that individuals
heterozygous for the H932Y mutation were developing mild
symptoms or were asymptomatic, but conclusions were
obscured by the presence of migraines and psychiatric disorders
of unknown origin in several members of the family [28]. Our
data in yeast have demonstrated that both in the A661 and T661
contexts, H734Y is dominant, suggesting that heterozygosity
for H932Y has potential to cause symptoms in human.
Because A889T, the human equivalent of yeast A692T, was
associated either with R579W in trans [27] or with E1143G in
cis (the equivalent of yeast E900G), it was not possible to determine the individual contribution of A889T to the disease. Our
data in yeast show that, when alone, A692T increases mtDNA
instability significantly and E900G has a very mild phenotype.
Therefore, it can be concluded that A889T significantly contributes to the disease. However, the association of E900G and
A692T in cis has a strong deleterious synergistic effect resulting probably from the combination of a folding defect produced by E900G which decreases pol g levels and an intrinsic
polymerisation defect produced by A692T. Therefore, it is
possible that in humans symptoms are worsened by E1143G.
Since in the carrier family the A692T–E900G mutations were
dominant, though to different severity levels, it was concluded
that E900G could be responsible for the dominant character.
Our data show that the very weak dominant phenotype detected in the mip1A692T mutant is not further increased in the
mip1A692T–E900G mutant, demonstrating that E900G does not
confer a dominant phenotype and suggesting that the strong
dominant phenotype observed in some members of the family
[8] was not caused by E1143G but more likely by other factors
interacting with POLG.
As discussed above our data show that E900G is not a silent
mutation. When alone, it confers a strong temperature-sensitive
phenotype in the A661 context, and even in the T661 context, a
5-fold increase in petite frequency is observed at 36 °C. This
temperature-sensitive trait associated with the observation that
Mip1 levels are decreased in mitochondrial extracts suggests that
the E900G mutation acts on Mip1 structure. Thus, the
deleterious synergistic effect of E900G mutation would be
better explained by the combination of decreased amounts of
protein caused by E900G and decreased polymerase activity
caused by A692T. In contrast with these data, it has been
reported that when associated with the W748S mutation in cis as
found in patients, E1143G partially rescues the deleterious
defects of the W748S mutation in vitro by improving the
catalytic activity and the affinity for DNA of the mutant protein
[34]. As this is the case in yeast for E900G associated with
A692T, the E1143G substitution increases instability of W748SE1143G pol g, and thus its unfolding propensity at body
temperature. However, we do not think that these data, obtained
in yeast and human for different mutations, are necessarily
contradictory. They rather suggest that the effect of E1143G, by
modifying protein structure, may depend on the second mutation
it is combined with. The effect of the combination of the W748S
1233
and E1143G equivalents in yeast could not be studied since
Trp748 is not conserved in Mip1.
A matter of debate is whether accumulation of point
mutations in mtDNA contributes to the disease. It has been
postulated that point mutations near direct repeats are an early
event in PEO which contributes to the formation of deletions
[35]. On the other hand, muscle sample analysis of PEO patients
with enhanced levels of point mutations and deletions [36]
revealed that in young patients deletions were observed before
any point mutation accumulation (point mutations occurring in
an age-dependent manner). In addition, point mutation overload
was specifically observed in the control region of mtDNA,
whereas deletion break-points were mainly produced close to
homopolymeric runs, suggesting that replication stalling was the
primary cause of deletions [36]. Moreover, no point mutations
were found in 136 single COX-negative fibres from biopsies of
PEO patients harbouring multiple deletions [26]. It was
concluded that the clonal expansion of mtDNA deletions
accounts solely for the pathogenesis of mitochondrial diseases.
The frequency of point EryR mutations is increased in all mip1
mutants, suggesting that fidelity of mtDNA replication is
decreased or mutation fixation is increased. However, each
mutant behaves differently, with no correlation between the
frequency of point mutations and deletions. The mip1A692T
mutant produces a greater number of petites than the mip1G807R
mutant, but a smaller number of EryR mutations. The percentage
of petites is substantially increased in the mip1A692T–E900G
mutant, compared to the single substitution mip1A692T mutant,
but the frequency of EryR mutants is unchanged. The mip1H734Y
allele is dominant with regards to petite frequency, but it is
recessive for EryR mutant frequency. This suggests that mtDNA
instability is caused in general by different mechanisms from
those producing single point mutation, although it cannot be
excluded that increased point mutability could be involved for
some POLG mutations. For example, the G651S mutation in the
T661 context leads to the highest accumulation of rho− clones
and point mutations. A better understanding of the role of the
mutated pol g residue and mechanisms leading to mtDNA
instability will allow to establish the relationship between point
mutations and deletions in the different mutants.
Finally, we would like to discuss reasons for using A661 or
T661 alleles. The present work has been centred on the A661
allele in order to facilitate comparisons with two previous works
on POLG mutations [12,13], and also because the reference S.
cerevisiae strain used for large scale functional analyses contains
Ala661. In all mutants, except mip1H734Y, mtDNA defects were
dramatically increased in the A661 background. This was
particularly marked for the G651S and E900G mutations. When
borne by the A661 allele the G651S mutation results in a null
rho0 phenotype whereas in the T661 context it allows mtDNA
maintenance in almost half of the cells at the permissive
temperature. Similarly, the temperature-sensitive properties of
the E900G mutation in the A661 context are remarkably less
pronounced in the T661 context. Thus, although the A661 allele
may introduce bias in interpretation of the data, it can also
emphasize subtle phenotypes and facilitate a systematic search
for phenotypic suppressors.
1234
E. Baruffini et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1772 (2007) 1225–1235
Acknowledgements
This work was funded by the Belgian National Fund
for Scientific Research, the Interuniversity Attraction Programme, Belgian Science Policy and the Association Française
contre les Myopathies (to FF), and by Fondazione TelethonItaly no. GGP030039 and no. GGP07019, and MIUR, no.
2006069034_003 (to IF).
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Copyright Ó 2007 by the Genetics Society of America
DOI: 10.1534/genetics.107.079293
Note
A Single Nucleotide Polymorphism in the DNA Polymerase Gamma
Gene of Saccharomyces cerevisiae Laboratory Strains Is Responsible
for Increased Mitochondrial DNA Mutability
Enrico Baruffini,*,† Tiziana Lodi,† Cristina Dallabona† and Francxoise Foury*,1
*Unité de Biochimie Physiologique, Université Catholique de Louvain, 1348 Louvain-la-Neuve, Belgium and
†
Department of Genetics, Biology of Microorganisms, Anthropology, Evolution,
University of Parma, 43100 Parma, Italy
Manuscript received July 25, 2007
Accepted for publication August 5, 2007
ABSTRACT
In the Saccharomyces cerevisiae strains used for genome sequencing and functional analysis, the mitochondrial DNA replicase Mip1p contains a single nucleotide polymorphism changing the strictly conserved
threonine 661 to alanine. This substitution is responsible for the increased rate of mitochondrial DNA point
mutations and deletions in these strains.
T
HE yeast Saccharomyces cerevisiae is one of the few
eukaryotic organisms that can survive in the absence of mitochondrial DNA (mtDNA). When grown
on glucose-containing medium, S. cerevisiae produces
respiratory-deficient mutants that form small colonies
and thus are referred to as ‘‘cytoplasmic petites’’ (Slonimski
and Ephrussi 1949). They either contain deletions
in their mtDNA (rho) or are devoid of mtDNA (rho0)
(Dujon 1981). petite frequency varies within a large
range among laboratory strains (Marmiroli et al. 1980),
a not surprising feature with regards to the numerous
genes that control petite accumulation (Contamine and
Picard 2000). One of these is MIP1, which encodes the
mitochondrial polymerase (DNA polymerase gamma)
(Foury 1989). Previous studies using the MIP1 gene
isolated from a genomic library constructed with strain
S1278b (Grenson at al.1966), referred to as MIP1½S, have
shown that Mip1p is an accurate replicase (Foury and
Vanderstraeten 1992; Hu et al. 1995; Vanderstraeten
et al. 1998). However, recent works using the MIP1 allele from S288c-related strains, referred to as MIP1½S,
have pointed to higher mutation rates of the mitochondrial genome (Baruffini et al. 2006; Stuart et al. 2006).
Here we show that this increase in mtDNA instability
results from a single nucleotide substitution in the MIP1
gene, changing a strictly conserved threonine at position 661 to alanine.
1
Corresponding author: Unité de Biochimie Physiologique, Croix du Sud
5-15, 1348 Louvain-la-Neuve, Belgium. E-mail: foury@fysa.ucl.ac.be
Genetics 177: 1227–1231 (October 2007)
MIP1½S allele increases mtDNA instability: petite mutant frequency was determined in the DWM-5A-Dmip1
strain (Baruffini et al. 2006) carrying pFL39 plasmidborne versions of either MIP1½S or MIP1½S. A fourfold
increase in petite accumulation was observed at 28° in
the presence of MIP1½S compared to MIP1½S (Figure
1A). Moreover, in the MIP1½S context, and in contrast
to the MIP1½S context, petite accumulation was highly
dependent on temperature (Figure 1A). On the basis
of the capacity of independent petite clones to restore
mit mutations to wild type (Slonimski and Tzagoloff
1976), it was concluded that, in both MIP1 contexts,
most petites had retained mtDNA fragments and were
rho, even though, in the MIP1½S context, the fraction
of rho0 clones at 36° was significantly higher (Figure 1B).
The frequency of EryR mutants, which are caused by
mtDNA mutations in the 21S rRNA gene (Sor and
Fukuhara 1984), gives an estimate of the frequency of
mtDNA point mutations. A sixfold increase in EryR mutants was observed in the MIP1½S context compared to
the MIP1½S context (Figure 1C). These data show that
in the same nuclear background the mitochondrial genome is less stable in the presence of the MIP1½S allele,
suggesting that this trait could be ascribed to differences
in the amino acid sequence of the two Mip1p isoforms.
T661A substitution in the MIP1½S allele is the cause
of temperature-sensitive petite accumulation: DNA
sequence analysis revealed 26 single nucleotide polymorphisms (SNPs) between MIP1½S and MIP1½S alleles
(Table 1). The MIP1 sequence was identical in W303-1B
and S288c, confirming the close origin of these strains
1228
E. Baruffini et al.
(Schacherer et al. 2007). Sixteen SNPs were silent and
10 produced nonsynonymous substitutions. Multiple
amino acid alignments with several fungi and animal pol
g sequences showed that these modifications affected
mostly poorly conserved residues (data not shown).
However, Thr661, which is found in Mip1p½S and is
strictly conserved in all species from yeasts to humans, is
changed to alanine in Mip1p½S due to an A-to-G transition at position 1981 of the MIP1 sequence. Moreover,
Thr661 has been found in two recently sequenced
S. cerevisiae strains, YJM789 (Gu et al. 2005) and RM11-1a
(Lee et al. 2006), which have a MIP1½S-like allele.
To determine whether the T661A substitution was the
cause of petite accumulation in the MIP1½S context, a
MIP1½SA661T variant was constructed. In the presence of
this new allele, petite frequency was similar to that
observed with the MIP1½S allele and, moreover, the
temperature-sensitive trait had disappeared (Figure
1A). The frequency of EryR mutants was also reduced
(Figure 1C). In a heteroallelic MIP1½SA661T/MIP1½S
strain, petite and EryR mutant frequencies were similar
to those observed in a strain containing MIP1½SA661T
only, indicating that the MIP1½S allele is recessive (data
not shown).
We measured petite frequency in several laboratory
strains. S1278b, D273-10B/A1 (Sherman 1964), and
FL100 (Lacroute 1968), which possess the MIP1½S
allele (E. Baruffini, unpublished data), had low levels
of petites (Table 2). W303-1B (Thomas and Rothstein
1989) and BY4742 (Brachmann et al. 1998), which
possess the MIP1½S allele (and thus Ala661), accumulated petites at higher levels and in a temperaturedependent manner (Table 2). To further demonstrate
that increased instability of the mitochondrial genome
could be ascribed to Ala661 rather than to the genetic
background of these strains, the pFL38 plasmid-borne
MIP1½SA661T and MIP1½S alleles were introduced in a
mip1D derivative of D273-10B/A1. petite frequency was
low in the presence of MIP1½SA661T and increased in the
presence of MIP1½S (Table 3). Altogether, these data
demonstrate that the T661A substitution in Mip1p is the
cause of the higher accumulation of petites in S288c,
BY4742, and W303-1B strains.
Natural isolates contain a threonine residue at
position 661: To determine whether T661A was a widespread mutation, we analyzed 20 strains isolated from
grapes of different Italian regions or used as industrial
starters for wine or bread production. Adenine at position
Figure 1.—Mitochondrial DNA mutation frequency with
different MIP1 alleles. DWM-5A-Dmip1, an haploid W303 derivative (Baruffini et al. 2006), was transformed with different
MIP1 alleles. The MIP1 alleles were inserted into the SacI
and SalI sites of the centromeric pFL39 plasmid (Bonneaud
et al. 1991). The MIP1½SA661T allele was produced by sitedirected mutagenesis using the PCR overlap extension technique (Ho et al. 1989). (A) petite mutant frequency. Cells were
pregrown at 28° on solid SC medium (6.7 g/liter yeast nitrogen
base supplemented with a mixture of amino acids) supplemented with 2% ethanol. After 60 hr, the strains were replica
plated on SC medium supplemented with 2% glucose and
grown at the specified temperature. After 24 hr, strains were
replica plated again on this medium. After 24 hr, cells were
plated for single colonies on SC medium supplemented with
2% ethanol and 0.3% glucose. petite frequency was defined as
the percentage of colonies showing the petite phenotype after
5 days at 28°. For each strain, at least 4000 clones were analyzed.
Values are means of three independent experiments. (B) Percentage of rho0 mutants. The rho clones containing mtDNAdeleted molecules and the rho0 clones devoid of mtDNA were
distinguished as follows. At least 200 independent petite clones
from each haploid mip1 strain were crossed with cox2, cox3, and
two cob mit mutants of opposite mating type on YPA plates (1%
yeast extract, 2% bacto-peptone, and 40 mg/liter adenine) supplemented with 2% glucose, and after 2 days at 28° they were
replica plated on YPA plates supplemented with 3% glycerol
to identify rho1 diploids. In this work, a clone unable to complement any of the mit mutants was arbitrarily defined as rho0. (C)
EryR mutant frequency. Two independent series of 10 independent colonies grown on YPA plates supplemented with 3% glycerol were inoculated in 2.5 ml YPA medium. After 48 hr at 28°,
5–8 3 107 cells were plated on YPAEG-ery medium (YPA supplemented with 3% ethanol, 3% glycerol, 3 g/liter erythromycin, and 25 mm potassium phospate buffer at pH 6.5) and
grown at 28° for 9 days. An aliquot of each culture was plated
for single colonies on YPA plates supplemented with 3% glycerol to determine the exact number of rho1 cells present in
the culture.
Note
1229
TABLE 1
SNPs and amino acid substitutions in MIP1[S] and MIP1[S] alleles
SNPa
T23 / C c
G103 / A
G219 / T
G627 / A
G664 / A
G792 / A
A1069 / G
T1161 / A
A1221 / G
Amino acid
substitutionb
SNP
Amino acid
substitution
F8 / S
A35 / T
Silent (L73)
Silent (A209)
V222 / I
Silent (Q264)
K357 / E
Silent (L387)
Silent (Q407)
T1299 / C
T1590 / C
G1617 / A
T1519 / C
A1521 / C
T1671 / C
C1680 / G
T1692 / C
T1794 / G
Silent (P433)
Silent (S530)
Silent (R539)
M540 / T
N541 / H
Silent (P557)
Silent (P560)
Silent (C564)
Silent (G598)
SNP
Amino acid
substitution
A1847 / G
A1981 / G
C2166 / T
C2932 / T
G2957 / A
T3345 / C
G3384 / A
A3516 / G
N616 / S
T661 / A
Silent (C722)
P978 / S
S986 / N
Silent (I1115)
Silent (E1128)
Silent (P1172)
a
The first nucleotide refers to MIP1½S, the second to MIP1½S.
The first amino acid refers to Mip1½S, the second to Mip1½S.
c
Nonsynonymous SNPs and corresponding amino acid substitutions are in italics.
b
1981 of the MIP1 gene is associated with a BsaAI site
while with guanine the BsaAI site is lost. To distinguish
these polymorphisms, a DNA fragment encompassing
nucleotides 1046–2329 was amplified and digested by
BsaAI. The presence of adenine at position 1981 generates two DNA fragments of 937 and 347 bp, whereas
guanine generates a single DNA fragment of 1284 bp
(Figure 2A). In all strains, the MIP1 gene possessed the
BsaAI site and thus Thr661.
On the other hand, the partial genome sequence of
haploid segregants from 36 strains of different origins
has recently been published (Saccharomyces Genome
Resequencing Project at the Sanger Institute, http://
www.sanger.ac.uk/Teams/Team71/durbin/sgrp/index.
shtml). Most Western isolates have the MIP1½SA661T
allele; the MIP1 gene of Asian isolates is a complex
mosaic of the MIP1½SA661T and MIP1½S alleles, but none
of the strains has the MIP1½S allele, raising the question
of the origin of this allele. However, all isolates have a
threonine at position 661.
In contrast, analysis of the MIP1 gene of the diploid
EM93 strain, which is the progenitor of S288c and
derivative strains and has been estimated to share 88%
of its genome with S288c (Mortimer and Johnston
1986), revealed that, in addition to the two DNA frag-
ments generated by the BsaAI digest, an undigested
fragment of 1284 bp was also present (Figure 2A), a sign
of heterozygosity at the BsaA1 site. MIP1 gene sequencing and tetrad analysis (data not shown) confirmed that
both A and G were present at position 1981 (Figure 2B).
Therefore, EM93 is heterozygous for the MIP1 allele.
These data led to the conclusion that the T661A substitution is unique and specific to EM93, the founder of
several commonly used laboratory strains.
Concluding remarks: This work provides an explanation for the high frequency of mtDNA deletions and
point mutations occurring in commonly used laboratory strains: a missense mutation in the mitochondrial
DNA replicase brought about by EM93, the founder
strain (Mortimer and Johnston 1986). The fact that
S288c and its derivatives BY4741, BY4742, and BY4743,
the strains used in the genome sequencing and largescale functional analysis projects, contain the MIP1½S
allele should be taken into consideration in genomic
studies focused on alterations of the mitochondrial
metabolism. Moreover, the MIP1½S allele has previously
been used to establish the impact of human pathological
POLG mutations on the stability of mtDNA (Baruffini
et al. 2006; Stuart et al. 2006). It must be stressed that
TABLE 3
TABLE 2
petite accumulation in different laboratory strains
% petites
% petites
Strains
D273-10B/A1
FL100
S1278b
W303-1B
BY4742
28°
0.8
0.5
0.7
2.3
2.1
6
6
6
6
6
Amino acid at
position 661
36°
0.1
0.1
0.1
0.2
0.2
petite accumulation in strain D273-CD3-Dmip1 transformed
with different MIP1 alleles
0.9
0.8
0.8
15.1
11.3
6
6
6
6
6
0.2
0.1
0.2
2.1
1.1
Experimental conditions are as in Figure 1A.
Threonine
Threonine
Threonine
Alanine
Alanine
D273-CD3-Dmip1
MIP1½S
MIP1½SA661T
28°
36°
5.1 6 0.4
2.2 6 0.2
22.6 6 3.4
2.6 6 0.3
D273-CD3-Dmip1 is a spontaneous ura3 mutant of D27310B/A1 in which the MIP1 gene has been replaced by a KanR
deletion cassette in the presence of the pFL38 (Bonneaud
et al. 1991) plasmid-borne MIP1½S or MIP1½SA661T to keep
mtDNA. Experimental conditions are as in Figure 1A.
1230
E. Baruffini et al.
Figure 2.—Analysis of the polymorphism at
position 1981 of the MIP1 nucleotide sequence.
(A) BsaAI restriction analysis of the DNA fragment from nucleotides 1046 to 2329. All natural
isolates analyzed produced the same pattern as
the M28 strain, an isolate from grapes in a Tuscan
vineyard (Cavalieri et al. 2000). (B) DNA sequence of the segment encompassing position
1981.
even though this allele, which exacerbates certain defects,
can be useful in detecting subtle effects of mip1 mutations, it may also cause unreliable phenotypes.
We thank I. Ferrero (University of Parma) for stimulating discussion,
D. Cavalieri, M. Polsinelli (University of Florence, Italy), and M. Budroni
(University of Sassari, Italy) for providing natural wine strains, and G. Liti
and E. J. Louis (University of Nottingham, UK) for useful information
about the S. cerevisiae strains sequenced at the Sanger Institute. We thank
Roberto Silva for his skillful technical assistance. This work was funded by
the Belgian National Fund for Scientific Research (to F.F.), the Interuniversity Attraction Programme, Belgian Science Policy (to F.F.), the
Association Franc
xaise contre les Myopathies (to F.F.), and the Fondazione
Telethon-Italy no. GGP030039 and National Benefit Research Project
2006 2006069034_003 (to E.B. and T.L.).
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Communicating editor: A. Nicolas
Allegato 4:
Baruffini E., Goffrini P., Donnini C. and Lodi T. (2006). Galactose
transport in Kluyveromyces lactis: major role of the glucose permease
Hgt1. FEMS Yeast Res. 6, 1235-1242.*
* Il lavoro oggetto di questa pubblicazione è stato condotto durante il I anno di dottorato in
parallelo allo studio degli effetti di mutazioni in MIP1.
196
Galactose transport in Kluyveromyces lactis : major role of the
glucose permease Hgt1
Enrico Baruffini, Paola Goffrini, Claudia Donnini & Tiziana Lodi
Dipartimento di Genetica Antropologia Evoluzione, University of Parma, Parma, Italy
Correspondece: Tiziana Lodi, Dipartimento
di Genetica Antropologia Evoluzione,
University of Parma, Parco Area delle Scienze
11/A, 43100 Parma, Italy. Tel.: 139 0521
905494; fax: 139 0521 905604;
e-mail: gftiziana.lodi@unipr.it
Received 17 January 2006; revised 16 March
2006; accepted 30 March 2006
First published online 8 June 2006.
DOI:10.1111/j.1567-1364.2006.00107.x
Editor: Monique Bolotin-Fukuhara
Keywords
HGT1 ; galactose transport; hexose permease;
Kluyveromyces lactis ; yeast.
Abstract
In Kluyveromyces lactis, galactose transport has been thought to be mediated by the
lactose permease encoded by LAC12. In fact, a lac12 mutant unable to grow on
lactose did not grow on galactose either and showed low and uninducible galactose
uptake activity. The existence of other galactose transport systems, at low and at
high affinity, had, however, been hypothesized on the basis of galactose uptake
kinetics studies. Here we confirmed the existence of a second galactose transporter
and we isolated its structural gene. It turned out to be HGT1, previously identified
as encoding the high-affinity glucose carrier. Analysis of galactose transporter
mutants, hgt1 and lac12, and the double mutant hgt1lac12, suggested that Hgt1 was
the high-affinity and Lac12 was the low-affinity galactose transporter. HGT1
expression was strongly induced by galactose and insensitive to glucose repression.
This could explain the rapid adaptation to galactose observed in K. lactis after a
shift from glucose to galactose medium.
Introduction
The first and essential step in the utilization of sugars is their
transport into cells, mediated by specific permeases belonging to the major facilitator superfamily (MFS) (TC2.1,
according to the ‘transporter classification system’) (De
Hertogh et al., 2002). These proteins possess a common
structure: a central hydrophobic core of 10–12 membranespanning domains flanked by hydrophilic domains. They
catalyse the transport of sugars across the membrane by
facilitated diffusion down a concentration gradient, or by
coupling with proton symport or antiport operating against
a concentration gradient (André, 1995).
Recently, the genome sequences of several ascomycetes
were completed (Dujon et al., 2004), allowing structural and
phylogenetic comparison between sugar porter systems in
closely related organisms. In the genomic sequences of
Kluyveromyces lactis, about 20 ORFs show a similarity to the
genes of known sugar permeases. Only six of them have been
functionally characterized. Two encode glucose transporters:
RAG1, which encodes a low-affinity glucose transporter (RAG
means ‘resistance to antimycin A on glucose’) (Goffrini et al.,
1990; Wésolowski-Louvel et al., 1992), and HGT1, which
encodes a high-affinity glucose transporter (Billard et al.,
1996). Some strains, such as JA6 and CBS6315, do not possess
RAG1 and HGT1: in their place, they have two genes, called
FEMS Yeast Res 6 (2006) 1235–1242
KHT1 and KHT2, arranged in tandem at the RAG1 locus
(Weirich et al., 1997). FRT1 encodes a specific fructose
permease with a very high affinity for this sugar. It is a proton
symport system (Diezemann & Boles, 2003).
In K. lactis, the transport of galactose has been thought to
be mediated by the lactose permease encoded by LAC12. A
lac12 mutant, the 11D304 strain isolated by Riley et al.
(1987), was unable to grow on lactose, and did not grow on
galactose either (or grew very slowly). The mutant indeed
showed a low and uninducible galactose uptake activity. The
existence of other galactose transporters had, however, been
hypothesized (Boze et al., 1987; Riley et al., 1987). In
particular, an analysis of galactose uptake kinetics (Boze
et al., 1987) suggested that there are two different galactose
transport systems: a low-affinity system, inhibited by lactose, and a high-affinity system, competitively inhibited by
glucose. Recent results obtained in our laboratory confirmed
the existence of a second galactose transporter: disruption of
the LAC12 gene in several laboratory strains, including
CBS2359, did not lead to a galactose-negative phenotype,
in contradiction to the original report on the lac12 mutant
11D304. Recently, a hexose transporter gene, KHT3, was
found whose overexpression improved the growth of a lac12
mutant on galactose. However, the activity of this galactose
transporter seems to be minor, and its physiological role
remains to be established (Wiedemuth & Breunig, 2005).
2006 Federation of European Microbiological Societies
Published by Blackwell Publishing Ltd. All rights reserved
c
1236
E. Baruffini et al.
In the present work, we searched for and isolated the
second galactose permease of K. lactis. It turned out to be
Hgt1p, previously identified as the high-affinity glucose
carrier identified by Billard et al. (1996).
Materials and methods
Yeast strains, media and genetic procedures
The yeast strains are listed in Table 1. The YP medium
contained 1% Bacto-yeast extract and 2% Bacto-peptone
(Difco). The minimal medium (YNB) contained 7 g L 1
Yeast Nitrogen Base without amino acids (Difco) supplemented with appropriate amino acids and bases for auxotrophy. Various carbon sources were added at the indicated
concentrations. Galactose 0.2% was the condition at which
the hgt1 and lac12 phenotype was scored better. Genetic
procedures have been described previously (Wésolowski
et al., 1982).
DNA manipulation
Published procedures were used for transformation of K.
lactis (Bianchi et al., 1987) and Escherichia coli (Mandel &
Higa, 1970), isolation and purification of plasmids from E.
coli, and agarose gel electrophoresis (Sambrook & Russel,
2001). Escherichia coli strain JM83 (araD(lac-proAB) rpsL
( = strA) f80 lacZD M15) was used for plasmid propagation.
DNA sequencing was carried out using a Beckman CEQ2000
automatic sequencer. Sequence data analysis was performed
with the BLASTP (Altshul et al., 1990) program.
Northern analysis
Total RNA was prepared by extraction with hot acidic
phenol (Ausubel et al., 1994). Northern analysis was carried
out according to the protocol of Sherman et al. (1986). The
HGT1 probe was the 2.4-kb EcoRI–HindIII segment corresponding to the complete ORF. The amount of RNA loaded
onto the gel was estimated by hybridization with a K. lactis
actin probe (Deshler et al., 1989). The probes were labelled
with [a-32P]dCTP by the rediprime DNA-labelling system
(Amersham).
Galactose uptake measurement
Uptake experiments were carried out using the method
described by Bisson & Fraenkel (1983), with a few modifications. Cells grown in YP medium supplemented with 2%
galactose plus 0.1% glucose were harvested at the early
stationary phase of growth (OD600 nm 1, about 0.45 mg dry
cell mass mL 1), washed twice with ice-cold 0.1 M potassium phosphate buffer, pH 6.5, and resuspended in the same
buffer at OD600 nm 90. A 30-mL aliquot of cell suspension was
used for each measurement. The uptake experiments were
done at 30 1C. Uptake was initiated by addition of 30 mL of a
buffered (pH 6.5) aqueous solution of [1-14C]D-galactose at
the indicated concentration. Aliquots of 13.5 mL were taken
at different time intervals as indicated, and uptake was
stopped by dilution with 5 mL of ice-cold water. The
reaction mixture was immediately filtered through a GF/C
membrane (Whatman) and washed twice with 5 mL of icecold water. Radioactivity was measured in a Tricarb liquid
scintillation counter (Packard). 14C-Labelled galactose was
obtained from Amersham Pharmacia Biotech.
HGT1 gene disruption
The 2.4-kb EcoRI–HindIII fragment of HGT1 was first
cloned in the pUC19 vector. The 1.14-kb KpnI–PstI region
was then deleted and replaced by the 1.2-kb S. cerevisiae
URA3 marker (a BglII–BglII fragment derived from the
pFL38 vector, previously cloned at the BamHI site of the
pUC19 vector). URA3 complements the uraA mutation of
K. lactis. The construction was linearized by EcoRI and
HindIII and used to transform 2359/152F and 2359/
152FDL12/5F strains. The latter was a uraA mutant isolated
from 2359/152FDlac12 as a spontaneous clone resistant to 5fluoroorotic acid (5FOA). Transformation was performed
according to the protocol of Kooistra et al. (2004). Correct
targeting of the URA3 module into the HGT1 locus was
verified by PCR on whole yeast cells and by Southern
analysis. In this way, we deleted 70% of the HGT1 ORF.
Table 1. List of yeast strains
Strains
Genotype
Origin
11D304
11D304/5F
PM6-7A/35
PM6-7A/35DL12
2359/152F
2359/152FDlac12
2359/152FDL12/5F
2359/152FDH1
2359/152FDH1L12
MATa his lac12
MATa his uraA lac12
MATa adeT-600 uraA1–1 hisA5–1
MATa adeT-600 uraA1–1 hisA5–1 lac12:URA3
MATa metA1–1 ura3–20
MATa metA1–1 ura3–20 lac12:URA3
MATa metA1–1 ura3–20 lac12:ura3
MATa metA1–1 ura3–20 hgt1:URA3
MATa metA1–1 ura3–20 lac12:ura3 hgt1:URA3
Riley et al. (1987)
This study
H. Fukuhara, Institut Curie Orsay
This study
Ferminan & Dominguez (1998)
Lodi et al. (2005)
This study
This study
This study
2006 Federation of European Microbiological Societies
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c
FEMS Yeast Res 6 (2006) 1235–1242
1237
Galactose transport in Kluyveromyces lactis
Results
In order to determine the genetic basis of the difference in
phenotypes between the lac12 mutants, we crossed 11D304
(lac12) and 2359/152FDlac12. The diploids showed a galactose-positive phenotype, and their ascosporal progeny segregated 21 : 2 on 0.2% galactose (22 tetrads analysed). A
cross between 11D304 (lac12) and the wild-type 2359/152F
led to an ascosporal progeny that did not show a tetrad
segregation of 21 : 2 for the growth on galactose, suggesting that more than one gene was required for the efficient
growth on galactose. In particular, we obtained two parental
ditypes (in which two spores grew well on galactose and two
spores did not), three nonparental ditypes (in which the
four spores displayed an intermediate phenotype) and 11
tetratype asci. In this last case, tetrad spores were one
positive, one negative and two intermediate for growth on
Phenotype of lac12 mutation in different
genetic backgrounds
Disruption of LAC12 in wild-type laboratory strains (PM67A/35 and 2359/152F) led to a lactose-negative phenotype,
which was not accompanied by a galactose-negative phenotype. The mutants were grown on YNB medium supplemented with either lactose or galactose at different
concentrations (0.2, 0.5 and 1.0%). Their phenotype is
shown in Fig. 1a. The 2359/152FDlac12 disruptant grew well
on galactose, but the 11D304 lac12 mutant did not. In
accordance with this, the 2359/152FDlac12 disruptant
showed active galactose transport (Fig. 1b), whereas strain
11D304 barely incorporated [14C]galactose.
(a)
10 5
10 4
10 5
10 4
10 5
10 4
10 4
10 5
10 5
10 4
10 5
10 4
11D304
∆lac12
2359/152F∆
2359/152F
0.2%
Galactose uptake
nmol min−1mg dry weight −1
(b)
0.5%
1%
0.2%
LACTOSE
0.5%
1%
GALACTOSE
3
2359/152F∆lac12
11D304
2
1
0
0
10
20
time (s)
30
Fig. 1. Phenotype of lac12 mutants. (a) Growth tests. The lac12 mutants 11D304 (lac12) and 2359/152FDlac12, as well as the wild type 2359/152F,
were spotted onto YNB agar plates supplemented with indicated carbon sources and incubated for 3 days at 30 1C. The number of plated cells is
indicated at the top. (b) Galactose uptake in strains 11D304 (lac12) and 2359Dlac12. Cells were grown in YP medium supplemented with 2% galactose
plus 0.1% glucose. Uptake of radiolabelled galactose was determined at a concentration of 5 mM. The values are means of three independent
experiments. In no case was the variation higher than 15% of the mean.
FEMS Yeast Res 6 (2006) 1235–1242
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1238
E. Baruffini et al.
galactose (data not shown). Therefore, it was concluded that
the original lac12 mutant 11D304 (Riley et al., 1987),
contained a second mutation, unlinked to lac12, responsible
for the galactose-negative phenotype.
This interpretation was also supported by isolation of
spontaneous galactose-positive revertants from 11D304. We
plated 107, 108 and 109 cells of 11D304 on 0.2% galactose
YNB medium. After incubation for 72 h, we found seven
galactose-positive colonies: two of them also grew on
lactose, indicating that they were probably LAC12 revertants; five clones were unable to grow on lactose, suggesting
that they were reversions of the putative galactose-negative
mutation of 11D304. A possible interpretation of the results
is that in K. lactis, LAC12 encodes the lactose/galactose
permease, but an additional permease transports galactose.
This permease is present in strains PM6-7A/35 and 2359/
152F, but not in strain 11D304, due to a second mutation
unnoticed in the pioneer work of Riley et al. (1987). The
supposed galactose transporter is distinct from the recently
identified Kht3p (Wiedemuth & Breunig, 2005). This was
shown by the following experiment. The original 11D304
lac12 mutant was converted to ura3 (11D304/5F, a 5FOAresistant clone), and transformed with the KHT3 gene
carried by a centromeric URA3 vector. None of the Urapositive transformants recovered a galactose-positive phenotype. Moreover, disruption of KHT3 in strain 2359/
152FDlac12 did not affect its growth on galactose (data not
shown). Therefore KHT3 does not encode the putative
galactose permease inactive in the 11D304 strain.
Isolation of the galactose permease gene
Kluyveromyces lactis assimilates galactose following a metabolic scheme similar to that of Saccharomyces cerevisiae. We
may expect K. lactis to possess an orthologue of the galactose
permease gene GAL2 of S. cerevisiae (Tschopp et al., 1986).
Indeed, GAL2, in single copy, could restore the galactosepositive phenotype in strain 11D304/5F (Fig. 2a). The
(a)
10 4
10 3
10 4
10 3
11D304/KCp491
11D304/HGT1
11D304/GAL2
2% GLUCOSE
(b)
0.2% GALACTOSE
2
Galactose uptake
nmol min−1mg dry weight −1
11D304/KCp491
11D304/HGT1
11D304/GAL2
1
0
0
10
20
time (s)
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30
Fig. 2. Phenotype of strain 11D304 (lac12)
transformed with GAL2 or HGT1. The transforming genes were carried by the centromeric vector
KCp491. The control was the vector without
insert. (a) Growth test. Conditions were similar
to those in Fig. 1a. (b) Galactose uptake. Conditions were similar to those in Fig. 1b.
FEMS Yeast Res 6 (2006) 1235–1242
1239
Galactose transport in Kluyveromyces lactis
supposed new galactose permease of K. lactis might be a GAL2
equivalent. To identify such a gene, we tried to complement
the galactose-negative phenotype of the lac12 mutant
(11D304/5F) with a genomic library constructed on the
centromeric vector KCp491, carrying a URA3 marker (Betina
et al., 2001). The DNA source of this library was the CBS2359
strain, which should contain the gene responsible for the
galactose-positive phenotype of strain 2359/152FDlac12.
Among 400 000 URA3 transformants, we found approximately 300 clones growing on 0.2% galactose YNB medium.
To exclude transformants that received a LAC12 gene, we
replica-plated all galactose-positive clones on lactose. The
majority were able to grow on this substrate, but 13 clones
grew only on galactose. In eight of them the Ura-positive
phenotype cosegregated with the galactose-positive phenotype. Seven of the eight clones contained identical inserts
and one contained a rearranged version of the same insert.
Terminus sequencing of the inserts revealed a sequence that
is present upstream of the HGT1 gene in the genome. HGT1
encodes the high-affinity glucose transporter (Billard et al.,
1996). The insert, 8 kb long, also contained another ORF
downstream of HGT1. This ORF was removed by subcloning HGT1 as a 7.1-kb BglII–BglII fragment into the KCp491
centromeric vector. This monocopy plasmid (pEB34) was
able to fully restore the growth on galactose of the 11D304/
5F strain, as efficiently as GAL2, as shown in Fig. 2a.
Moreover, the HGT1 gene restored the galactose uptake
activity in the 11D304/5F strain (Fig. 2b).
It has been found that some K. lactis strains do not possess
HGT1. To find whether HGT1 is nonfunctional or absent in
the 11D304 strain, we PCR-amplified HGT1 (a DNA region
including the ORF and flanking regions) using 11D304
genomic DNA as template. We obtained an amplification
band whose size and restriction pattern were identical to
those of the published one, demonstrating that HGT1 is
present in the genome of the 11D304 strain (data not shown).
Phenotypic analysis of galactose transporter
mutants
A null hgt1 mutant and a double Dhgt1Dlac12 mutant were
constructed in the 2359/152F genetic background (see
Materials and methods). The wild-type strain 2359/152F
and the strain 2359/152FDlac12 were transformed by the
linearized plasmid carrying the HGT1 deletion cassette.
Transformant colonies were screened for growth on 0.2%
galactose. The growth of the single mutants Dhgt1 and
Dlac12 and of the double mutant Dhgt1Dlac12 was analysed
on galactose over a concentration range of 0.05–2.0%. As
shown in Fig. 3a, the double mutant grew poorly at all
concentrations tested. The Dhgt1 mutant displayed reduced
growth at low galactose concentration, and the Dlac12
mutant at high galactose concentration. In the Dhgt1
FEMS Yeast Res 6 (2006) 1235–1242
mutant, the galactose uptake was severely affected, as in the
double Dhgt1Dlac12 mutant, suggesting a major role of Hgt1
permease in galactose transport in the experimental conditions tested (5 mM galactose) (Fig. 3b). Interestingly, the
Dlac12 mutant had a much higher galactose uptake activity
than the wild-type strain. This suggested that a loss of LAC12
may induce HGT1 expression at transcriptional or posttransductional level. We therefore examined HGT1 transcription in a Dlac12 background. We observed increased intensity
of the Northern signals for HGT1 transcription (Fig. 3c). This
explains, at least in part, the observed increase in galactose
uptake of the Dlac12 mutant. The logic and the molecular
basis of this regulation remain to be clarified.
Induction of HGT1 expression by galactose
In the upstream region of HGT1, there are three sequence
motifs that are similar to UASGAL, the putative binding sites
of the Lac9p transcriptional factor (Godecke et al., 1991)
(Fig. 4a). The presence of these sequences and the HGT1dependent galactose transport activity prompted us to
analyse HGT1 expression in galactose. The expression of
HGT1 has previously been studied in glucose and glycerol by
Billard et al. (1996). These authors found that on these
carbon sources, HGT1 was constitutively expressed.
Hybridization of total RNA with an HGT1 probe revealed
two mRNA species, as previously shown by Billard et al.
(1996). In the wild-type strain, both mRNA species were
expressed on glucose and their level strongly increased on
galactose (Fig. 4b). Addition of glucose did not affect the
galactose induction.
Discussion
In this article, we demonstrated a new function of the
glucose transporter gene HGT1: the function of a galactose
transporter. Hgt1 is known to be a high-affinity glucose
transporter, as shown by Billard et al. (1996). The sequencededuced structure of the HGT1 product was typical of a
hydrophobic transmembrane protein, sharing approximately 25–30% identity with S. cerevisiae glucose permeases
of the Hxt family, which includes the galactose carrier Gal2p,
and with the low-affinity glucose carrier Rag1p of K. lactis.
In the present work, we showed that Hgt1 permease plays a
major role in galactose transport. This deduction was based
on the following observations: (1) in the null hgt1 mutant,
the galactose uptake was strongly reduced; (2) the null hgt1
mutant displayed reduced growth on galactose; (3) HGT1
expression was highly induced by galactose.
Riley et al. (1987) have previously reported that, in K.
lactis, galactose transport is mediated by the lactose permease encoded by LAC12, because lac12 mutants (11D304
strain) displayed a reduced growth rate on galactose and
reduced galactose uptake activity. We found that in other
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1240
E. Baruffini et al.
(a)
∆ hgt1
wt
10
10
10
10
∆ lac12
10
∆ hgt1 ∆ lac12
10
10
10
2% glucose
2% galactose
0.5% galactose
0.2% galactose
0.1% galactose
0.05% galactose
(b)
Galactose uptake
nmol min−1mg dry weight −1
3
HGT1 LAC12
HGT1 lac12
hgt1 LAC12
hgt1 lac12
2
1
0
0
(c)
wt
10
20
time (s)
30
∆ lac12
HGT1
KlACT1
genetic backgrounds, the deletion of LAC12 did not affect
growth on galactose. However, our results do not exclude a
role of Lac12p in galactose transport. In fact, among
galactose-positive revertants that we isolated from the
11D304 strain, some displayed a lactose-positive phenotype,
indicating that they were LAC12 revertants. Also, in the
transformation of the 11D304 strain by a K. lactis genomic
library, the majority of galactose-positive transformants
obtained were lactose-positive, suggesting that they contained LAC12. These results, together with the growth
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Fig. 3. Phenotype of Dlac12 and Dhgt1 mutants. We compared strains 2359/152F (wild
type), 2359/152FDH1 (Dhgt1) and 2359/
152FDlac12, and double mutant 2359/
152FD1L12Dlac12 (Dhgt1). (a) Growth test. Conditions were similar to those in Fig. 1a. (b)
Galactose uptake. Conditions were similar to
those in Fig. 1b. (c) Transcription of HGT1 in
2359/152F (wild type) and 2359/152FDlac12.
Total RNA was prepared from cells grown on
2% galactose plus 0.1% glucose. Northern blot
hybridization was carried out using probes of
labelled HGT1 and KlACT. KlACT was included
as a reference because of its relatively constant
level of transcription. Each lane contained 20 mg
of total RNA.
phenotypes of the single and double deletion mutants in
the two permeases, support the hypothesis that, in K. lactis,
galactose uptake is mediated by two different permeases,
and that in the 11D304 strain the two mutations in lac12
and hgt1 are responsible for the galactose-negative
phenotype. The presence of two galactose permeases was
originally hypothesized by Boze et al. (1987). On the basis of
galactose uptake kinetics, they suggested that two galactose
transport systems exist in the K. lactis strain CBS2359: a lowaffinity system, inhibited by lactose, and a high-affinity
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1241
Galactose transport in Kluyveromyces lactis
(a)
AATCCATTGCTATCAAAGTGCTAAGTGTCAATATCAAGTTAAACATTTGTTTTCGGCTAAAAGAAAGAGA
AGAAAAAAAAAAGATGATAGCGGGCGGACCACAGTGGTCCGCCCTCCAGGCACACACATATCACCTTCCT
CCGGTTTAATCGACCAATATATGGCCAGGGTAACGACATGGACCACCGTCCGCAGTGCATGTACGTGGCA
CTCTAATCGGAACATAGTGGTCCGAAACCGCCATGTTCACGGCATACAATGCTCCGCTACTAATCTTCTG
GGCACAGAACCATGAGGGTATCATTTGGTGATCGGATTAACAAAGCCCACTTTTTCTAACACATCCCGCA
GAGCTCCGGTATGGTCTGCCACAGTAACAGTCGTGGAAGGCACACGATAATCTGGGGTTAATCCATCATG
AAGGAAAACAAATACACAAAAACGCAAACAAAAATATCTGGAGATACCTACCATTCGTCCTTGACCCTGT
CCATTACGGCCATAACACTGAAGATGTCGCGGACCCCGCACTAAAAAAAAAACTGGAGGAGAAGAAGTGC
TGAACTAAACTCAAAAATTTTAGTAAGGAAATATTCCGACTGGCTATTTCCTCGGTCCCCATCTGACATG
TCACGGAAAAACTGTTCCCCAGAAATTTTTCTTTCCCCGCCAGATTCTTTTAAGACGTAACAAATATGAG
AAAATGACTTTGCACACAGAAACATTTGCAGAGCAGTTTTCCGAAGACATACAGCAAAACCGCCATCTCA
GAAATGAAAAAGTAATTTCAGGGAACTGAAAAAGTTCGACGATTCGTAATTTACATTTCGTATCACTTTC
ATCAGCAGACCGACAGACAGGCTAGTGATTGTTCCGTATTGCTAATTTGGTGTCATTGTTGCAACTCGGT
TCATTATTACACCTTGAAGGGGTGCTGGTTTCGTTAGTTCATGGAGTATCATACTCCGGTCAGCGGAATG
TAACGCCATTTACAAACGATATTATCAATGGTATAGTTGGGCTGGAAGAAAAGTGACAGGACCCAGAATT
CCGAGCAGTGAGTGAGAACGGTAATGTTGAGGATTGTAGTGTTTTTCTTTTATTGATAGAAGATGCTCAT
CGCATCGTCGTGTTCCGTGAAAGCTCTCCATGTTAGAAAGTCCACCGTTGCCAGTTGGCAGGCTGTATCC
TCCCCGCTCTTCCTTGGTGCCGGATTTTCTTTAGCTCCTTACACAATGACGCTTTGGGACAATGTTTCGT
TATTCCATCGACGATGTTGCCCCAGACTAATTAATCAACGGGCTAAGAAATTAGCGTAACTGATGTAGAA
TGATCAGAGGGTTTTTTTTTCTTTCTTAGTTCTATTTACACTATTTTCCAGCTTGAATGGTTTAAGATTT
AATCCGTTGTTTCTGATATAAAAGCCAGGTAATAAACCTTCTAACTTGCCTCTTCTTGGTGTCGATTCGA
AAACACTTTTCGGTTGTTTGTTTCTGTTTTTTTCCCTTTCGATTCAATAACCCAATTAAAAAACGTATTA
TAACAAACTATAACAAACATCAACTTTAGCTAATAACAACAAAATGTCATTGAAAAATTGGCTTTTGCTA
(b)
2%GL
2%GA
0.2%GA
2%GA+
2%GL
Fig. 4. (a) Nucleotide sequence of the upstream
region of HGT1. Sequences that match with
UASGAL are boxed. (b) Transcription of HGT1.
Total RNA was prepared from strain 2359/152F,
grown on 2% glucose, 2% galactose, 0.2%
galactose, or 2% galactose plus 2% glucose.
Northern blot hybridization was carried out as in
Fig. 3c, using probes of labelled HGT1 and KlACT.
Each lane contained 20 mg of total RNA. GL,
glucose; GA, galactose.
system, competitively inhibited by glucose. Our results
favour the hypothesis that Hgt1p mediates the high-affinity
galactose transport and Lac12p the low-affinity transport. In
fact, at low galactose concentration (the condition that we
used in our galactose uptake experiments), the hgt1LAC12
mutant displayed strongly reduced uptake, barely higher
than that of the double mutant hgt1lac12. This suggests that
Lac12p plays a minor role at this galactose concentration.
Moreover, the growth test of single and double mutants
showed that at high galactose concentration the hgt1LAC12
mutant can grow better than the HGT1lac12 mutant. At low
galactose concentration, the presence of HGT1 was crucial
for efficient growth. However, it cannot be excluded that the
growth pattern shown by the mutants could be ascribed to
the specific induction of LAC12 at high galactose concentration, irrespective of the affinity of the two permeases.
In the upstream region of HGT1, c. 1400 with respect to
the start codon, one finds three sequences that perfectly
match the UASGAL present in several promoters of the
lactose/galactose regulon. The UASGAL mediate binding of
the transcriptional activator Lac9 in response to galactose
(Godecke et al., 1991). Consistent with the presence of these
UASGAL, HGT1 expression is strongly activated by galactose.
Whether or not this induction actually involves Lac9p
FEMS Yeast Res 6 (2006) 1235–1242
HGT1
KlACT1
binding is not known at this time. The galactose induction
was not repressed by glucose, as is known for the other genes
of the lactose/galactose regulon of K. lactis in the genetic
background of the strains used here. Kluyveromyces lactis is
generally less sensitive than S. cerevisiae to glucose repression. This is particularly so for the genes encoding respiratory enzymes, which are completely insensitive to glucose
repression. Genes encoding the enzymes required for galactose catabolism are expressed at low levels on glucose, but
reach high levels in the simultaneous presence of galactose
and glucose, indicating that galactose induction is epistatic
to glucose repression (Breunig, 1989; Goffrini et al., 1995).
Moreover, in contrast to S. cerevisiae, in which the induction
of the GAL1–GAL10 promoter takes many hours after a shift
from a glucose to a galactose medium, the induction of the
lactose/galactose regulon in K. lactis is rapid (WésolowskiLouvel et al., 1996). We propose that HGT1 could be
responsible for the rapid adaptation to galactose. In fact, in
S. cerevisiae the galactose permease is completely absent
when the organism is grown on glucose, and the galactose
uptake is visible only after GAL2 transcriptional activation.
In contrast, K. lactis HGT1 is expressed on glucose and the
organism can efficiently take up galactose, even at low
concentrations, because of the high affinity for galactose.
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1242
This adaptation mechanism might be related to the natural
habitat of K. lactis. Many strains were originally isolated
from milk-derived products, rich in galactose, due to
hydrolysis of lactose by natural microbial communities,
especially lactic acid bacteria.
Acknowledgements
We are grateful to Dr R. C. Dickson for providing the
11D304 strain. We thank Dr Hiroshi Fukuhara for stimulating discussion and critical reading of the manuscript. We
thank Roberto Silva for skilful technical assistance.
References
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FEMS Yeast Res 6 (2006) 1235–1242
Ringraziamenti
La ricerca è stato finanziata da
- Fondazione Telethon, progetti GGP030039 e GGP07019
- Fondazione Pierfranco e Luisa Mariani
- Consorzio EUMITOCOMBAT, contratto LSHM-CT-2004-503116
- Fondo nazionale belga per la ricerca scientifica
- Politica scientifica belga
- Associazione francese contro le miopatie
- MIUR, progetto di ricerca nazionale (PRIN) 2006 2006069034_003
Un profondo ringraziamento va alle mie docenti guida, Prof.ssa Iliana Ferrero Fortunati e
Prof.ssa Tiziana Lodi, per i suggerimenti e le proficue discussioni avute durante tutto il
mio periodo di ricerca.
Ringrazio particolarmente la Prof.ssa Françoise Foury per avermi ospitato per un anno nel
dipartimento FYSA dell’Università cattolica di Louvain, sede di Louvain-la-Neuve
(Belgio).
Ringrazio il coordinatore del corso Prof. Nelson Marmiroli.
Ringrazio Antonietta Cirasolo e Roberto Silva per il supporto tecnico, e tutto il personale,
strutturato e non strutturato, del Dipartimento di Genetica, Biologia dei Microrganismi,
Antropologia ed Evoluzione. Un particolare ringraziamento alla Dott.ssa Cristina
Dallabona per l’aiuto sperimentale.
Ringrazio infine:
- il Prof. Massimo Zeviani e il Dott. Pugliesi per le stimolanti discussioni
- il Prof. Rodney Rothstein per il ceppo YG855 e per il plasmide pWJ841
- il Prof. Duccio Cavalieri, il Prof. Mario Polsinelli e la Prof.ssa Marilena Budroni per i
ceppi enologici.