VARIACIÓN ONTOGÉNICA DEL VENENO DE Bothrops

UNIVERSIDAD DE ORIENTE
NÚCLEO ANZOÁTEGUI
ESCUELA DE CIENCIAS DE LA SALUD
DEPARTAMENTO DE MEDICINA INTERNA
VARIACIÓN ONTOGÉNICA DEL VENENO DE Bothrops
colombiensis
(SERPENTES,
VIPERIDAE);
ESTUDIO
COMPARATIVO ENTRE UNA MADRE Y SUS CRÍAS
Asesor
Prof. Demetrio Kiriakos
Realizado por:
Astudillo Nuñez, Heira de los Ángeles
Osuna González, Judiel Carolina
TESIS PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR AL TÍTULO DE
MÉDICO CIRUJANO
Barcelona, Mayo de 2010.
UNIVERSIDAD DE ORIENTE
NÚCLEO ANZOÁTEGUI
ESCUELA DE CIENCIAS DE LA SALUD
DEPARTAMENTO DE MEDICINA INTERNA
VARIACIÓN ONTOGÉNICA DEL VENENO DE
Bothrops
colombiensis
(SERPENTES,
VIPERIDAE);
ESTUDIO
COMPARATIVO ENTRE UNA MADRE Y SUS CRÍAS
Asesor
Prof. Demetrio Kiriakos
Realizado por:
Astudillo Nuñez, Heira de los Ángeles
Osuna González, Judiel Carolina
TESIS PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR AL TÍTULO DE
MÉDICO CIRUJANO
Barcelona, Mayo de 2010.
RESUMEN
Variación Ontogénica del veneno de Bothrops colombiensis (Serpentes,
Viperidae); Estudio comparativo entre una madre y sus crías. Astudillo N.,
Heira; Osuna G., Judiel y Kiriakos, Demetrio. Universidad de Oriente, Núcleo
Anzoátegui, 2009.
Se determinó la DL50 del veneno de un ejemplar adulto de Bothrops
colombiensis y de sus crías, en el modelo múrido C57bl/6, hembra, inyectados por vía
intraperitoneal y para una hora de observación, por el método secuencial de Dixon y
Mood (1948) modificado por Sevcik (1987). Los resultados obtenidos para la DL50
del veneno del ejemplar adulto fue 15,85 mg/kg y la del veneno de las crías
28,37 mg/kg. Los signos clínicos más frecuentes, observados luego de la inyección
del veneno del ejemplar adulto Bothrops colombiensis fueron: taquipnea,
hipoactividad, postración y períodos de apnea, con frecuencias que variaron entre
68,65% y 100%, con un promedio de tiempo de aparición entre 1 y 53 minutos.
Mientras que las manifestaciones observadas tras la inyección del veneno de las crías
de Bothrops colombiensis, en múridos C57bl/6, en 60 minutos de observación fueron
taquipnea, hipoactividad, postración y posición antálgica, apareciendo antes de los 20
minutos de observación. En conclusión, existen diferencias significativas en cuanto a
la potencia del veneno de Bothrops colombiensis con relación a sus estadios
ontogénicos, siendo el de las crías menos potente que el veneno de la madre mientras
que las manifestaciones tóxicas agudas, en el modelo múrido C57bl/6, inyectados vip
fueron
similares
en
ambos
estadios
ontogénicos.
INDICE
AGRADECIMIENTOS ................................................................................................ii
DEDICATORIA ..........................................................................................................iii
LISTA DE TABLAS…….. ........................................................................................vii
LISTA DE GRAFICOS .............................................................................................viii
INTRODUCCIÓN. ....................................................................................................... 1
OBJETIVOS. .............................................................................................................. 10
JUSTIFICACIÓN ....................................................................................................... 11
METODOLOGÍA ....................................................................................................... 12
RESULTADOS........................................................................................................... 17
DISCUSION ......................................................................................................... …288
CONCLUSIONES .................................................................................................... 333
RECOMENDACIONES ........................................................................................... 344
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS...................................................................... 355
ANEXOS .................................................................................................................... 43
i
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad De Oriente, la casa más alta, y a todos nuestros profesores por ser
pilares fundamentales en este proceso de enseñanza aprendizaje.
Al Centro de Investigaciones de Ciencias de la Salud y en especial al Dr. Demetrio
Kiriakos por su valiosa ayuda y colaboración en la realización de este estudio.
Al Dr. Leonardo De Sousa por su asesoría en el procesamiento de los datos
estadísticos.
Al Sr. Luis Fernando Navarrete, porque sin su ayuda no habría sido posible culminar
la parte experimental de nuestra tesis.
A nuestra compañera Alejandra Rodríguez por su gran ayuda y orientación durante la
última etapa de este trabajo de investigación.
Por último a nuestros padres, amigos, y demás personas que día a día estuvieron a
nuestro lado apoyándonos y, de alguna u otra manera brindándonos su colaboración
para que pudiésemos culminar esta etapa en nuestras vidas.
GRACIAS!!!
ii
DEDICATORIA
A Dios, ser sublime que estás presentes en todo momento, por haberme dado el
regalo de la vida y por permitirme alcanzar una de mis metas más anheladas.
A mi papá, José Luis porque sé que no ha sido fácil ser padre y madre a la vez, por
haber estado siempre que necesité de tus consejos y abrazos, has hecho un excelente
trabajo, ¡Te amo!. Gracias por tanta lucha, amor, dedicación y esfuerzo; este triunfo
es tuyo.
A mi mamá, Heira porque a pesar de que Dios te llamo a su lado antes de que me
tocara emprender este viaje, te aseguraste de enseñarme todo lo necesario para
alcanzar mis metas, se que siempre estuviste y estás conmigo, lloraste y reíste
conmigo a lo largo de estos 7 años, así que este triunfo también es tuyo, eres la luz
que guía mis pasos. ¡Te extraño mami!
A mis hermanos: Gaby, Isis, José Luis, Rafa y Sofi, que este triunfo les sirva de
ejemplo para seguir adelante y no tener miedo a soñar, con dedicación, constancia y
perseverancia se pueden alcanzar todas las metas, gracias por haberme apoyado
durante todo este tiempo, son los mejores hermanos del mundo.
A mi Carmelin, gracias por todos los lindos momentos que me has regalado, por
respirar hondo y contar hasta diez cada vez que mi malhumor aparece y por haberme
acompañado en la última etapa de mi carrera, sin tu apoyo, todo habría sido mucho
más difícil, ¡Te adoro puchi!.
A mis tíos y tías porque de una u otra forma constituyen parte de este largo camino,
especialmente a mi tía Maritza por el apoyo y ayuda que me has brindado de manera
incondicional.
iii
A la familia Osuna González, por haberme acogido en su seno y hacerme sentir un
miembro más de su familia, Diosita eres la mejor.
A mis primos y primas, en especial a Yulimar, Eder, Dayana, Manuel, Junior y
Génesis, porque de alguna manera han estado conmigo en las buenas y malas, durante
toda mi carrera.
A mis amigos, a todos los que han formado parte de mi vida, especialmente a los que
me han acompañado en esta larga travesía Anita, Alejandra, Yamira, María Laura,
Ana María, Mary Gaby, Alberto, Boris, Edgardo, Tomás y Luis Alfredo, porque aún
cuando cada uno tome rumbos diferentes, siempre exista un tiempito en nuestras
agendas para reencontrarnos y seguir riéndonos de las tantas anécdota que
compartimos, ¡¡lo logramos muchachos!!. Y a los que en este momento no logro
recordar, gracias igual.
A mi hermana perdida y compañera de tesis, Judiel porque más que amigas ya
formamos parte de la misma familia, gracias por saber estar, porque a pesar de que en
los últimos tiempos no hemos compartido tanto como al principio, aún me sigues
dedicando tiempo de calidad, sólo tu y yo sabemos cuanto esfuerzo fue necesario para
la culminación de esta tesis, eres la hermanita que Dios me permitió escoger, ¡Yupi,
terminamos!.
A la Universidad de Oriente y a nuestros profesores, a todos los que han formado
parte de esta gran travesía, gracias por habernos dado las herramientas para que, de
hoy en adelante, sigamos labrando nuestro futuro y cosechando éxitos, especialmente
a los Drs. Kiriakos y De Sousa porque más que profesores, cumplieron el papel de
padres para nosotras durante la realización de esta investigación.
A todas aquellas personas que, de de alguna u otra forma han formado parte de mi
vida y en algún momento influyeron en mi crecimiento personal.
Heira De Los Ángeles Astudillo Nuñez
iv
DEDICATORIA
Primeramente a mi Santísima Trinidad por darme el regalo de la vida y por guiarme
en cada uno de mis pasos, porque todo lo que soy proviene de su voluntad.
Mi madre, porque más allá de los momentos difíciles siempre tuviste una palabra
sabía para reconfortarme, y por no dejarme caer cuando a mis alas se les olvidaba
como volar. Mami gracias por tu ayuda incondicional por estar siempre ahí. Mi vida
entera no bastara para pagarte todo lo que has hecho, sin ti me habría sido imposible
alcanzar esta meta, y como dices este triunfo es tuyo, todavía me queda mucho
camino por recorrer y estoy segura de que de tu mano siempre será más fácil…. TE
AMO.
Al ser que Dios designó como mi padre, sin duda alguna la mejor decisión. Porque
más que eso fuiste mi mejor ejemplo de lucha, y constancia, y siempre has sido mi
ejemplo a seguir, demostrando que a pesar de las adversidades todo es posible, solo
hay que soñar. TE QUIERO PAPI
Mis hermanos: Juan José, y Judibel, por siempre apoyarme en el momento en que
más los necesité, siempre recibí una palabra de aliento por parte de ustedes que me
daban fuerza para continuar. Los quiero mucho.
A Brian, esa personita tan especial que ha estado conmigo durante toda esta etapa de
mi vida, dándome su apoyo incondicional, gracias por entenderme y por darme esas
palabras de aliento en los momentos cuando más los necesité, siempre ahí estuviste,
enseñado que el amor se fortalece ante las dificultades. Gracias por ser mi compañero
de viaje en esta larga travesía. Esta meta que hoy veo cumplida deseo te sirva de
ejemplo para entender que soñar y ver los sueños cristalizados es posible cuando nos
esforzamos y somos capaces de continuar aún ante los obstáculos.
v
A mis amigos: Samira, Daibells, Jesús, Alejandra, Carmen, Yettzica, Alicia, Ricardo,
Tomás, y a todos los que junto conmigo han compartido la experiencia maravillosa de
estudiar
medicina, amigos si regresara en el tiempo y hoy tuviese que decidir
nuevamente que carrera tomar, sin duda alguna volvería a estudiar medicina y le
pediría a Dios brindarme la oportunidad de coincidir con ustedes nuevamente, los
quiero mucho!
A mi incondicional amiga, hermana y compañera de tesis, gracias por siempre estar a
mi lado y por brindarme la oportunidad de conocer el significado de la palabra amiga.
Este triunfo hoy lo compartimos y espero sea el primero de los muchos que Dios nos
tenga en nuestro camino.
A la familia Contreras Martínez; gracias por acogerme en su hogar y más que eso en
sus corazones, a todos muchísimas gracias los tendré siempre presente.
Al Dr. Demetrio Kiriakos, mi mejor ejemplo de que con esfuerzo y dedicación se
logran las metas. Dr. Muchas gracias por ser más que nuestro asesor de tesis, por
estar siempre allí brindándonos lo mejor que todo ser lleva en sí. Infinitamente
gracias.
Y por último pero no menos importante a la Universidad De Oriente la casa más alta
y a todos mis profesores por ser pilares fundamentales en este proceso de enseñanza
aprendizaje, de cada uno me llevo grandes experiencias, este triunfo es gracias a
ustedes.
Judiel Carolina Osuna González
vi
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Datos para el cálculo de la Dosis Letal (DL50) del veneno del ejemplar adulto
de Bothrops colombiensis en ratones C57bl/6 (♀), administrado por VIP para 60
minutos de observación.-----------------------------------------------------------------------18
Tabla 2. Frecuencia de muerte inducida por el veneno del ejemplar adulto de
Bothrops colombiensis en el modelo múrido C57bl/6 (♀) según la dosis administrada
por VIP------------------------------------------------------------------------------------------20
Tabla 3. Datos para el cálculo de la Dosis Letal (DL50) del veneno de las crías de
Bothrops colombiensis en ratones C57bl/6 (♀), administrado por VIP para 60
minutos de observación-----------------------------------------------------------------------22
Tabla 4. Frecuencia de muerte inducida por el veneno de las crías de Bothrops
colombiensis en el modelo múrido C57bl/6 (♀) según la dosis administrada por VIP,
para 60 minutos de observación--------------------------------------------------------------24
Tabla 5. Signos clínicos de toxicidad observados en ratones C57bl/6, en un lapso de
60 minutos, posterior a la administración intraperitoneal del veneno del ejemplar
adulto de Bothrops colombiensis-------------------------------------------------------------26
Tabla 6. Signos clínicos de toxicidad observados en ratones C57bl/6, en un lapso de
60 minutos, posterior a la administración intraperitoneal del veneno de las crías de
Bothrops colombiensis-------------------------------------------------------------------------27
vii
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfica 1. Dosis Letal (DL50) del veneno del ejemplar adulto de Bothrops
colombiensis en ratones C57bl/6 (♀), administrado por VIP para 60 minutos de
observación-------------------------------------------------------------------------------------19
Gráfica 2 Dosis Letal (DL50) del veneno de las crías de Bothrops colombiensis en
ratones C57bl/6 (♀), administrado por VIP para 60 minutos de observación---------23
Gráfica 3. Comparación de las Dosis Letales 50 (DL50) del veneno del ejemplar
adulto y de las crías de Bothrops colombiensis en ratones C57bl/6 (♀), administrado
por VIP para 60 minutos de observación---------------------------------------------------25
viii
INTRODUCCIÓN
Las serpientes son animales vertebrados de cuerpo flexible, alargado y
cilíndrico, cubierto de escamas, desprovistas de extremidades y oído externo;
pertenecientes a la clase reptilia, orden de los escamados y al suborden serpentes
(Arellano, 1987).
Estos reptiles poseen distintos tipos de dentición, clasificándose en: 1. Aglifas:
serpientes que presentan dientes en hilera, pequeños, en forma de sierra, carentes de
colmillos inoculadores de veneno, sin glándulas venenosas; 2. Opistoglifas: tienen
uno o más pares de colmillos en la parte posterior del maxilar superior; 3.
Proteroglifas: poseen un par de colmillos fijos y pequeños en la parte anterior del
maxilar superior; 4. Solenoglifas: poseen un par de colmillos grandes, fuertes y
retractiles, que al estar provistos de articulación, son móviles en su base y pueden
disponerse sobre el paladar en posición de reposo, irguiéndose cuando el reptil desea
morder, lo cual, constituye un carácter taxonómico de gran importancia (Colimodio y
Aguilar, 1993; Gutiérrez y Lomonte, 1989), dichos colmillos pueden ser
reemplazados por el lado medial o lateral al hueso; cabe destacar que este recambio
no necesariamente es sincrónico, los colmillos nuevos pueden sobreponerse o
superponerse a los viejos y algunas serpientes, eventualmente, pueden tener dos pares
de colmillos funcionantes durante el proceso de reemplazo (Campbell y Lamar,
2004).
En Venezuela existen 8 familias (Anomalepididae, Leptothiphlopidae,
Tiphlopidae,
Aniliidae,
Boidae,
Colubridae,
Viperidae
y
Elapidae)
con
aproximadamente 150 especies. Desde el punto de vista médico, las que causan
1
2
mayor cantidad de accidentes ofídicos pertenecen a la familia Viperidae (Rodríguez –
Acosta y Rengifo, 2004).
Las serpientes de la familia Viperidae se subdividen en tres subfamilias, de las
cuales la única representada en América es Crotalinae. Las serpientes de esta
subfamilia poseen como característica común un órgano termorreceptor o foseta
loreal, que se corresponde con un orificio situado entre las narinas y el ojo de la
serpiente, son solenoglifas y de colores sobrios, cabeza grande y triangular
(Rodríguez-Acosta y col., 1995).
En nuestro país, pertenecen a esta subfamilia las serpientes llamadas
coloquialmente "mapanares", "cascabeles" y "cuaimas", con un total de 26 especies y
subespecies, ubicadas en los géneros: Bothriechis, Bothriopsis, Bothrops y
Porthidium (Mapanares), Crotalus (Cascabel) y Lachesis (Cuaima) (Campbell y
Lamar, 2004).
Dentro de los rasgos característicos de Bothrops colombiensis se encuentra
una cabeza grande, lanceolada y alargada, marrón obscura y que en la región occipital
presenta una mancha o línea y otra a nivel retroocular, de color negro; ojos
amarillentos o grises con pupilas elípticas y verticales, su cuerpo tiene una leve forma
triangular. La coloración de fondo de ésta serpiente es muy variable, pudiendo ir
desde un tono canela, pasando por el marrón grisáceo hasta llegar al pardo negruzco.
En su dorso se dibujan de 18 a 25 triángulos en forma de sierra o trapezoidales, cuyos
ápices se oponen o se yuxtaponen con los del lado contrario; su cara ventral es
amarillenta o gris blancuzco, con un moteado obscuro que aumenta hacia la parte
posterior del cuerpo. La cola tiende a ser corta y puntiaguda. Los ejemplares juveniles
3
son de tonalidad más clara que los adultos y su cola suele ser amarilla o anaranjado
claro. La totalidad de cuerpo se encuentra cubierto por escamas, las rostrales son más
altas que anchas y apenas se visualizan, las cefálicas son pequeñas y carenadas;
poseen 7 u 8 supralabiales, la segunda de éstas, forma el borde anterior de la foseta
loreal, entre 9 y 10 infralabiales, 2 preoculares y varias postoculares, pequeñas. Las
escamas ventrales varían de 199 a 218 y las subcaudales 59 a 81, en dos series; las
dorsales son lanceoladas, carenadas y dispuestas en 23 a 27 filas. En cuanto a su
longitud pueden alcanzar hasta los 180 cm (Lancini, 1986).
Se encuentran ampliamente distribuidas por todo el territorio nacional,
predominando en la región Costa–Montaña y al norte del Río Orinoco, desde el nivel
del mar hasta aproximadamente 1500 mt de altura, con temperaturas promedio de
23°C, ocupando regiones húmedas del piso tropical y subtropical, sabanas y bosques
de galería, piedemontes y áreas circundantes a ríos y quebradas (Lancini, 1979;
Rodríguez – Acosta y col., 1998). Son de hábitos nocturnos, aunque han sido vistas
recorriendo bosques durante el día. En regiones tropicales, los picos de mayor
actividad usualmente corresponden con los períodos lluviosos, durante los cuales se
alimentan más y aumentan su actividad reproductiva; las hembras son muy prolíficas
y pueden llegar a tener más de treinta (30) crías en un parto (Rosenfeld, 1971).
Con respecto a la alimentación, estas víboras exhiben un marcado y
consistente comportamiento predador. Las juveniles se alimentan frecuentemente de
reptiles y anfibios y en menor proporción, de roedores pequeños, mientras los adultos
prefieren mamíferos y otras presas de sangre caliente (Holycross y col., 2002;
Andrade y Abe, 1999).
4
El envenenamiento ofídico resulta de la inyección accidental de veneno por
parte de serpientes (Viperidae y Elapidae) que poseen glándulas productoras de
venina y que son capaces de depositarlas en un organismo a través de su aparato
inoculador (Mota y Mendoza, 1999). Representa un gran problema médico, social y
económico en muchas partes del mundo, siendo los más afectados los países
subdesarrollados y en vías de desarrollo de Asia, África y las Américas, y es
considerado un problema de salud pública en áreas tropicales y subtropicales
(Montilla y cols, 2007).
Según estimaciones de la OMS anualmente ocurren aproximadamente
5.400.000 accidentes con serpientes en el mundo, de los cuales, aproximadamente
2.500.000 producen envenenamiento y por esta causa mueren 125.000 personas
aproximadamente (Chippaux y Goyffon, 1998).
Las especies del género Bothrops han sido las responsables de la mayoría de
los envenenamientos por mordedura de serpientes en Latinoamérica (Costa Cardoso y
Fan, 1995; Russell y col., 1997; Araujo y col., 2003). En la actualidad, en Argentina
se comunican a las autoridades sanitarias alrededor de 7.000 accidentes anuales por
serpientes y de éstos, más del 95% son causados por especies del género Bothrops
(Ministerio de Salud y Acción Social, 1998; García, 2003). En Brasil, las mordeduras
por este género representan cerca del 90% de los casos de envenenamiento ofídico
(Ministerio de Saude, 1999; Araujo y cols, 2003). En Colombia, cada año se reportan
2000 a 3000 mordeduras, de las cuales 90 - 95% son causadas por éstas (Pineda y
col., 2002) y en general, en Centroamérica son las responsables de la mayoría de los
accidentes (Rojas y cols, 1997; Russell y cols, 1997; Sasa y Vázquez, 2003).
5
Venezuela, por ser un país tropical y poseedor de una rica herpetofauna,
distribuida en todas las regiones de la nación, con un importante número de serpientes
venenosas, que para el año 2005 causaron 4.230 casos de accidentes ofídicos y una
mortalidad cercana al 2% según datos obtenidos del Centro Nacional de Estadística
del Ministerio de Salud (MPPS, 2005). Debido a que las condiciones
socioeconómicas en nuestro país son deficientes, los datos epidemiológicos que se
obtienen sobre el ofidismo no escapan de ser escasos e incompletos, de manera que la
magnitud real del problema es muy difícil de determinar.
Para el periodo 1980 – 1990, el número de defunciones por accidentes
ofídicos fue de 586, ocupando el primer lugar de mortalidad (66,8%) por
envenenamientos causados por plantas y animales. En el estado Monagas desde
1980–2000 se registraron 20 decesos por mordeduras de serpientes (42,6 %), 16 de
estas muertes ocurrieron en hombres y en mayores de 60 años (De Sousa y col.,
2005). En el Hospital Universitario de Los Andes - Mérida, para el lapso de 19901998, se reportaron 115 casos de envenenamiento ofídico, de los cuales 75,7%
ocurrió en el género masculino, aquellos con edades comprendidas entre 45 – 64 años
resultaron los más afectados, encontrándose un aumento de 75% entre los años
iniciales y finales del estudio, siendo el género Bothrops el implicado en el 99,1% de
los casos. Con respecto a la ubicación anatómica de la mordedura, un 73,9% se
localizó en miembros inferiores (Araujo y Rivas, 1999). En el estado Bolívar, desde
Enero 2003 hasta Diciembre del 2004, fueron
registraron 85 casos, el género
masculino resultó afectado en un 74,1%, con un rango de edad 21 y 60 años (55,9%)
y 67% de estos casos fueron provocados por serpientes del género Bothrops (Rivero y
col., 2005). En el año 2000, ingresaron al Hospital Universitario de Caracas 17 niños
por envenenamiento ofídico, 94,11% de ellos sufrieron el accidente cuando
realizaban o acompañaban a sus padres en labores agrícolas, en 76,47% de los casos
las responsables, al igual que en los estudios antes mencionados, fueron serpientes del
6
género Bothrops; 52,94% presentaron mordeduras en el área de los pies (Navarro y
col., 2000) pudiendo observarse que la distribución de casos por edad, sexo y sitio de
la lesión fueron consistentes entre sí y con otros estudios.
Anzoátegui, a pesar de no ser uno de los estados más afectados por el
envenenamiento ofídico, posee una tasa de mordeduras importante, presentando para
el quinquenio 2000-2004 un total de 916 casos con un promedio de 183 por año
(MPPS, 2004); aquí el accidente crotálico es mucho más frecuente que el bothrópico,
a diferencia de lo que ocurre en el resto del país, sin embargo, los casos más graves
son los causados por envenenamiento bothrópico, provenientes en su mayoría de la
región de Sabana de Uchire (Kiriakos, 1993).
El mayor número de accidentes ofídicos en nuestro estado prevaleció en el
segundo semestre del año, coincidiendo con el periodo lluvioso, donde se observaron
dos picos de mayor incidencia, los cuales, se presentaron uno entre Junio y Julio y el
otro entre Octubre y Noviembre, lo que sería el inicio y el final del período. Las más
afectadas son personas del género masculino y menores de 30 años, quienes con
frecuencia, trabajan en el área rural. La mayor incidencia, con respecto al momento
del día durante el que ocurrió el envenenamiento, se observó entre las 8:00 am y
10:00 am, momento en que la actividad agrícola es mayor y por ende aumenta la
interacción entre humanos y serpientes, y otro pico (mayor que el anterior) entre las
5:00 pm y 8:00 pm, que representa el período de actividad propio de la serpiente.
Estas serpientes, por lo general, son cazadores pasivos que esperan a su presa
agazapadas y camufladas con su ambiente por lo que son difíciles de ver y las
personas las pisan o acercan sus manos inadvertidamente ocurriendo el accidente.
Esto explica el hecho de que el mayor número de mordeduras por serpiente afecten
pies y piernas en primer lugar y manos en segundo lugar (Kiriakos, 1993).
7
En un estudio realizado en el Hospital Universitario de Los Andes, en el
estado Mérida, se encontró que las principales manifestaciones clínicas fueron edema
duro y eritematoso en el sitio de la lesión y en áreas adyacentes en aproximadamente
un 90% de los pacientes, dolor de carácter urente (63,5%), equimosis (56,1%),
necrosis de tejidos blandos (16,5%), cianosis y limitación funcional del miembro
afectado (19,1%); se evidenció además salida de sangre incoagulada a través de los
orificios de inoculación, flictenas hematuria y prolongación de los tiempos de
coagulación (Araujo y Rivas, 1999). Estas manifestaciones coinciden con otros
estudios realizados en el país (Rodríguez – Acosta y col., 2000; Rivero y col., 2005) y
en el exterior (Kamiguti y col., 1996; Acosta y col., 1997)
Los accidentes botrópicos representan en nuestro país alrededor del 70% de
los envenenamientos por mordedura de serpientes, esto debido a su amplia
distribución en el territorio nacional, su agilidad y a la toxicidad de su veneno;
seguidos por los accidentes crotálicos y otros, siendo la serpiente predominante
Bothrops colombiensis (Pifano y Rodríguez - Acosta, 1989).
Los venenos de serpientes dan pie a múltiples investigaciones, debido a los
efectos patológicos que éstos producen en el ser humano (Bolaños, 1984; Lomonte,
1994). Son secreciones de naturaleza sero–mucosa o saliva modificada, como
también se le considerada, constituidas por elementos proteicos entre los cuales se
encuentran la fosfolipasa A2, fosfatasa, acetilcolinesterasa, hialuronidasa, enzimas
proteicas y coagulantes, como la enzima semejante a la trombina y toxinas de gran
importancia, como las neurotoxinas, cardiotoxinas y citotoxinas. Dentro de los
elementos no proteicos es importante mencionar las aminas biogénicas, entre ellas la
histamina, bradicinina, serotonina y acetilcolina (Angel, 1989; Pineda y col., 2002).
Las proteínas y péptidos representan el 90% – 95% del peso seco del veneno
8
(Rodríguez – Acosta, 1998). El catión predominante es el sodio, cuyo efecto aún no
se conoce con exactitud. El zinc y el calcio están presentes en muchas de las
metaloproteasas. La representación de los carbohidratos está dada por las
glicoproteínas
(Markland, 1998).
Cabe destacar que no todas las enzimas ni toxinas están presentes en todos los
venenos (Markland, 1998), teniendo así que el veneno crotálico es principalmente
neurotóxico y rabdomiolítico, el lachésico es necrotizante, procoagulante y
moderadamente neurotóxico, el veneno micrurus es neurotóxico y levemente
miotóxico y el veneno bothrópico posee gran poder procoagulante y necrotizante, con
ninguna acción neurotóxica (Colimodio y Aguilar, 1993).
La severidad de la lesión está determinada por el volumen de veneno
inyectado, pero en el caso de accidentes ofídicos por el género Bothrops, siempre se
presenta necrosis de tejidos blandos (Toro y cols, 1983). La cantidad de veneno
inyectada está directamente relacionada con el tamaño de la serpiente y con el hecho
de si ha mordido recientemente (Filho, 1997)
La venina inyectada por Bothrops es una mezcla compleja de elementos
enzimáticos y no enzimáticos, como la batroxobina, reptilasa, proteinasas y
particularmente, la enzima semejante a la trombina y fosfolipasa A2 (Gutierrez y col.,
1990; Kamiguti y col., 1991; Zaganelli y col., 1996) con actividad proteolítica,
procoagulante, hemorrágica y miotóxica que actúan sobre los tejidos desencadenando
cuadros graves de necrosis tisular, trastornos de la coagulación y daño endotelial
(Rodríguez – Acosta y col., 1995).
9
La interacción entre los componentes biológicamente activos del veneno,
como son las proteínas y los péptidos y los elementos del sistema hemostático
humano producen alteraciones de la coagulación sanguínea, plaquetas y células
endoteliales siendo la hemotoxina más importante la enzima tipo trombina,
responsable en gran medida de la coagulopatía por consumo, no obstante, se han
descrito varias otras enzimas y mecanismos por los cuales se ve alterada la
coagulación sanguínea, las plaquetas y el endotelio vascular (Markland, 1998).
Además de las variaciones interespecíficas de los venenos, las serpientes
muestran variaciones intraespecíficas en la potencia y en las actividades de sus
venenos. Entre los factores que determinan estas variaciones está la edad de la
serpiente siendo el veneno de los juveniles, en general, más potente que el de los
adultos (Furtado y col., 1991; Málaga y col., 2000; Gutierrez y Sasa, 2002). Siendo
Bothrops colombiensis, la mapanare más frecuente en el norte de nuestro país, resulta
indispensable conocer si estas variaciones ontogénicas también ocurren en esta
especie. Es por eso que nos planteamos esta investigación con el fin de responder las
siguientes interrogantes: ¿Es el veneno de los ejemplares juveniles de B. colombiensis
más potente que el de sus progenitores? ¿Hay relación entre la actividad biológica de
los venenos y la posible variación en su potencia?
OBJETIVOS
GENERAL:
•
Estudiar los efectos biológicos y la dosis letal 50 (DL50) del veneno de una
hembra adulta de Bothrops colombiensis y de sus crías en el modelo múrido
C57bl/6.
Específicos
•
Calcular la DL50 del veneno de la hembra adulta de Bothrops colombiensis y de
sus crías, en el modelo múrido C57bl/6, por vía intraperitoneal y para una hora
de observación.
•
Determinar los efectos procoagulantes sobre el plasma humano de venenos de
ejemplares adultos y juveniles de Bothrops colombiensis.
•
Identificar las manifestaciones clínicas inducidas por la inyección
intraperitoneal del veneno de ejemplares adultos y juveniles de Bothrops
colombiensis en ratones C57bl/ 6.
10
JUSTIFICACIÓN
En el laboratorio del Centro de Investigaciones en Ciencias de la Salud (CICS)
de la Universidad de Oriente, se han realizado varios experimentos comparando la
potencia del veneno, según el estadio ontogénico, de por lo menos tres especies de
Crotalus y dos de Bothrops
(Blanco y Rojas, 2005; Baldi y Chalhoub, 2007;
Valerio, 2007; Acosta, Cayamo y Graziani, 2008; Astudillo y Bejarano, 2008)
encontrándose que el veneno de las juveniles fue más letal, coincidiendo esto con un
efecto procoagulante más intenso. Sin embargo, en el estudio realizado por Astudillo y
Bejarano (2008) se observó que no hubo variación significativa ni en la potencia ni en
el efecto procoagulante del veneno de especímenes adultos y juveniles de Bothrops
colombiensis, lo que hizo pensar que podría existir variabilidad geográfica
intraespecífica, puesto que las mapanares adultas de las cuales se obtuvo el pool de
veneno procedían de distintas áreas geográficas del país y que la mezcla de éstos
podrían promediar el de los juveniles utilizados, que provenían de una misma
localidad. Dicha variabilidad geográfica fue confirmada por Ruiz y Ruiz (2009) al
comparar el veneno de cuatro ejemplares adultas de Bothrops colombiensis
provenientes de Barinas, Yaracuy y Miranda.
Considerando lo anterior, se decide comparar el veneno de las crías de B.
colombiensis con el de la madre, con el objeto de ver si existen diferencias relevantes
que avalen o difieran de lo antes expuesto y completar, de este modo, la información
al respecto.
11
METODOLOGÍA
Tipo de Investigación
La presente investigación fue de tipo experimental y comparativa. En este
trabajo se compararon y describieron algunos efectos biológicos inducidos por el
veneno de una hembra adulta de Bothrops colombiensis y sus crías en el múrido
C57bl/6 por vía intraperitoneal y para una hora de observación.
Variables
Independientes: El veneno de los ejemplares adultos y juveniles de
Bothrops
colombiensis.
Dependientes: La reacción del plasma sanguíneo humano ante el veneno de B.
colombiensis.
La evolución clínica de la toxicidad aguda en el modelo múrido C57bl/6.
Materiales
•
Veneno de los Bothrops colombiensis (Hembra adulta y sus crías).
•
Ratones negros homocigotos de la cepa C57bl/6.
•
Plasma humano.
12
13
•
Cristalería de laboratorio (microjeringas de 50 microlitros de capacidad, vasos de
precipitado, tubos de ensayo, micropipetas graduadas de volumen variable,
jeringas de 10 y 20cc, piceta plástica, microgoteros, tubos Eppendorf®)
•
Liofilizador Labconco®, modelo Freezone 4.5.
•
Balanza analítica Sartorius®, modelo Handy.
•
Balanza digital Denver Instrument®, modelo XS-300.D
•
Cloroformo.
•
Anticoagulante: citrato de sodio
•
Centrífuga.
•
Solución salina (0,9%).
•
Baño de maría.
•
Papel parafilm®
•
Refrigerador marca Whirpool de -20ºC
•
Gancho para serpientes
•
Agua destilada
•
Trombo Hacina C Plus®, de laboratorios Dade.
14
Procedimiento
• Extracción del Veneno
Para la obtención del veneno, se procedió a ordeñar a cada ejemplar de Bothrops
colombiensis en el serpentario de la Universidad de Oriente. Las serpientes fueron
extraídas de su terrario con un gancho cuya punta es en forma de “S”. Se tomó al
animal disponiendo el dedo pulgar en un lado, el índice sobre la cabeza y el dedo
medio del otro lado de la cabeza; de ésta forma se evitó que la víbora girara y
mordiera. Se tomó un vaso de precipitado de 50 o 150 mL de capacidad, cubierto
previamente con Parafilm®, adherido a la boca del vaso. Seguidamente, se acercó la
cabeza de la serpiente a la boca del vaso, de manera que ésta mordió el plástico
mientras se realizaba masaje sobre las glándulas productoras de veneno, dejando así
en el recipiente una pequeña cantidad del mismo. El veneno extraído fue colocado en
vasos de precipitado, lo más pequeños posibles (20 – 50 cc), y se refrigeró.
Posteriormente, el veneno se desecó al frío (Liofilizador Labconco®) y antes de ser
utilizado, fue pesada una fracción en una balanza analítica (Sartorius®) y se
reconstituyó en solución salina (0,9%), de donde se tomaron las dosis que fueron
inyectadas en los ratones.
• Determinación de la dosis letal 50
La DL50 del veneno de Bothrops colombiensis fue determinada por el método
secuencial de Dixon y Mood (1948) modificado por Sevcik (1987). El veneno se
inyectó con una microjeringa de 50 microlitros (Hamilton®) por vía intraperitoneal
(VIP) en ratones C57bl/6 hembras, previamente pesados en balanza digital (Denver
Instrument®, modelo XS – 300 D). Para dar inicio al experimento, se administró al
primer ratón el anti – log de una dosis inicial X1, arbitraria y modificada por un factor
15
arbitrario constante (d= 0,05) y se procedió a observar la respuesta en un tiempo
definido de observación (una hora).
Si el primer ratón respondió con la muerte, el segundo recibió un anti–log de la
dosis X2, donde X2 = X1 – d. Si por el contrario el primer ratón sobrevivió, al segundo
se le administró un anti – log de la dosis X2’, siendo X2’= anti – log (X1 + d). Se
continuó con el experimento hasta encontrar el primer fenómeno vida – muerte o
muerte – vida, que sería el punto de inflexión a partir del cual inició la corrida válida
para el experimento. La dosis que recibieron lo múridos siguientes fueron el anti – log
de Xm – d si el ratón “m” murió con la dosis anti – log Xm o bien, anti – log Xm + d
si el ratón “m” sobrevivió a la dosis anti – log Xm. El muestreo se detuvo al obtener
una secuencia similar a †0†0†0†0†* ó 0†0†0†0†*, donde la cruz (†) indicó muerte,
cero (0) indicó sobrevivencia y asterisco (*), la dosis que debió administrarse al
siguiente ratón. Se consideró completa la corrida válida al obtener cuatro ciclos de
muerte – no muerte.
Para el cálculo de la DL50, según la mediana y sus límites de confianza, se tomaron
en cuenta las dosis de la corrida válida más la del punto final.
Las manifestaciones clínicas inducidas por la inyección intraperitoneal del veneno
de los ejemplares de Bothrops colombiensis en múridos C57bl/6, se observaron
durante una hora de experimentación y se registraron cronológicamente en un formato
preexistente (Anexo 1). Se usó también un ratón control al que se le administró 50
microlitros de solución salina al 0,9%.
16
La determinación del efecto procoagulante en ambos estadios ontogénicos no pudo
ser realizada, debido a que fue necesaria la inyección de gran número de ratones para
el cálculo de la DL50 del veneno de las crías, lo que requirió el uso de poco menos de la
totalidad del veneno, valga la redundancia, obtenido; siendo imposible realizar otras
extracciones debido a que los ejemplares con los que contábamos (crías) fallecieron
antes de la culminación de este trabajo de investigación.
• Procesamiento de los datos.
Se utilizó el programa Excel V – 5.1 (Microsoft Corporation, 2003) para
automatizar los cálculos y elaborar la gráfica de la DL50.
Todos los datos experimentales se procesaron por métodos estadísticos no
paramétricos o de libre distribución.
Se calcularon las medianas según Hodges y Lehman y sus límites de confianza
al 95%.
Las diferencias entre los cálculos de la DL50, de adultos y juveniles fueron
probadas por la técnica de análisis de variancia de Kruskall – Wallis. Se tomó un nivel
de significancia p<0,05.
Para el procesamiento de los datos por el método estadístico no paramétrico se
utilizó el programa V- 8.2 (Sevcik, 1987) Laboratorio de Neurofarmacología Celular,
Centro de Biofísica y Bioquímica, IVIC, Miranda.
RESULTADOS
En la tabla 1 se presentan los datos necesarios para el cálculo de la DL50 del
veneno del ejemplar adulto de Bothrops colombiensis, en ratones C57bl/6 hembra,
inyectados por VIP y observados durante 60 minutos.
El total de ratones utilizados para la determinación de la DL50 del ejemplar
adulto fue de n = 16, con pesos comprendidos entre 20,58 y 26,74 g. El punto de
inflexión se ubicó en R2., a partir de este punto se consideró la corrida válida para la
determinación de la DL50; ésta comprendió desde R2 hasta R16 + R17 (punto final).
La cantidad de veneno utilizado fue de 5271,6 µg (Tabla 1).
La DL50, del veneno del ejemplar adulto de Bothrops colombiensis en ratones
C57bl/6 hembra, inyectados por VIP y para 60 minutos de observación, se presenta
en la gráfica 1, donde se observa una mediana de 15,85 (14,99 -15,95) mg/kg de ratón
con un índice de variabilidad de 6,1%.
En la tabla 2 se muestra la frecuencia de muerte causada por la administración
del veneno en estos ratones. La mayor frecuencia de muerte, fue de 42,86% (n = 3) y
se observó con las dosis C y D (15,85µg/g-1 y 17.78 µg/g-1) respectivamente. Con la
dosis B (14,13 µg/g) la frecuencia fue de 14,29 % (n = 1). Todos los ratones
sobrevivieron al aplicar la dosis A (12,58 µg/g-1).
17
18
Tabla 1. Datos para el cálculo de la Dosis Letal (DL50) del veneno del ejemplar adulto
de Bothrops colombiensis en ratones C57bl/6
(♀),
administrado por VIP para
60 minutos de observación.
Ratón
Peso
Dosis
Dosis
Dosis total
Muerte
(n)
(g)
(anti-log)
(µg-g -1)
(µg)
(Min)
390,27
† :34
Corrida no valida
1
21,95
1,25
17,78
Corrida válida
2
21,65
1,20
15,85
343,15
-
3
22,00
1,25
17,78
391,16
† :42
4
20,95
1.20
15,85
332,06
† :42
5
21,70
1,15
14,13
306,62
† :45
6
20,58
1,10
12,58
258,90
-
7
23,95
1,15
14,13
338,41
-
8
21,56
1,20
15,85
341,73
† :51
9
24,45
1,15
14,13
345,48
-
10
23,24
1,20
15,85
368,35
-
11
22,50
1,25
17,78
400,05
† :56
12
23,26
1,20
15,85
368,67
† :29
13
26,74
1,15
14,13
377,84
-
14
21,07
1,20
15,85
333,96
-
15
22,15
1,25
17,78
393,83
† :36
16
23,43
1,20
15,85
371,37
-
⊗
17
22,62
Ratones válidos: R2
15,56
R16+ R17
†: Muerte; ⊗ Punto final;
Promedio; ∑ Sumatoria
∑ 5271,6
43
19
Gráfica 1. Dosis Letal 50 (DL50) del veneno del ejemplar adulto de Bothrops
colombiensis en ratones C57bl/6 (♀), administrado por VIP para 60 minutos de
observación.
En la figura 1, se muestra la representación gráfica de los datos para el cálculo
de la DL50, del veneno del ejemplar adulto de Bothrops colombiensis en el modelo
múrido C57bl/6 hembra, las cuales fueron inyectadas VIP y para 60 minutos de
observación. La flecha indica el primer punto de inflexión (anti-log 1,20) e inicio de
la corrida válida para el cálculo de la DL50. El resultado se expresa como la mediana
y sus límites de confianza al 95%. La DL50 fue de 15,85 mg.K -1 de ratón, con límites
de confianza entre 14,99 y 15,95 mg.K
-1
de ratón. Se determinó el índice de
variabilidad (IV= (Límite superior – Límite inferior/ Mediana) x100) el cual fue de
6,1%.
20
Tabla 2. Frecuencia de muerte inducida por el veneno del ejemplar adulto de
Bothrops colombiensis en el modelo múrido C57bl/6 (♀) según la dosis administrada
por VIP.
Nº de ratón
Dosis A
12,58
1
-
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
0
-
17
Datos válidos
0
Anti-Log dosis (mg.kg-1 de ratón)
Dosis B
Dosis C
14,13
Corrida no válida
Corrida válida
†: 45
0
0
0
Punto Final
1
Dosis D
15,85
17,78
-
0
0
†: 42
†: 51
0
†: 29
0
0
†: 42
†: 56
†: 36
-
3
⊗
3
42,86
42,86
N= 7 [†]
Fc de muerte
-
[†]= 100%
†: Tiempo de muerte en minutos.
0: Sobrevivencia.
: Punto final.
14,29
21
En la tabla 3 se presentan los datos para el cálculo de la DL50 del veneno de
las crías de Bothrops colombiensis, en ratones C57bl/6 hembras, inyectados por VIP
y observados durante 60 minutos.
El total de ratones utilizados para la determinación de la DL50 de este veneno
fue de n = 14 con pesos comprendidos entre 21,18 y 26, 36 g. El punto de inflexión
se ubicó en R5. A partir de este punto se inició
la corrida válida, ésta estuvo
comprendida desde R5 hasta R14 + R15 (punto final). La cantidad de veneno utilizado
fue de 6.693 µg (Tabla 3).
En la gráfica 2 se presenta la DL50 del veneno de las crías de Bothrops
colombiensis administrado por vía intraperitoneal en ratones hembra de la cepa
C57bl/6, para 60 minutos de observación, en ésta se evidencia una mediana de 28,37
(25,12 -31,62) mg/kg de ratón y un índice de variabilidad de 22,9%.
La frecuencia de muerte causada por la administración del veneno se presenta
en la tabla 4. Con este veneno, se observó que la muerte de los ratones ocurrió con la
administración de las dosis E (Anti – log. 1,40) y la dosis H (Anti – log. 1,55),
obteniéndose, con cada una de ellas, una frecuencia de muerte de 50%. Cuando se
aplicaron el resto de las dosis todos los ratones sobrevivieron.
22
Tabla 3. Datos para el cálculo de la Dosis Letal (DL50) del veneno de las crías de
Bothrops colombiensis en ratones C57bl/6 (♀), administrado por VIP para 60
minutos de observación
Ratón
Peso
Dosis
Dosis
Dosis total
Muerte
(n)
(g)
(anti-log)
(µg-g -1)
(µg)
(Min)
Corrida no válida
1
22,70
1,20
15,85
359,80
-
2
24,30
1,25
17,78
432,05
-
3
21,66
1,30
19,95
432,12
-
4
22,90
1,35
22,39
512,73
-
Corrida válida
5
22,87
1.40
25,12
574,49
† :57
6
21,18
1,35
22,39
474,92
-
7
20,24
1,40
25,12
558,67
† :31
8
23,98
1,35
22,39
536,91
-
9
25,86
1,40
25,12
649,60
-
10
21,47
1,45
28,18
605,02
-
11
21,86
1,50
31,62
691,21
-
12
23,90
1,55
35,48
847,97
† :40
13
26,36
1,50
31,62
833,50
-
14
25,95
1,55
35,48
920,71
† :35
⊗
15
23,37
Ratones válidos: R5
28,25
R14+ R15
†: Muerte; ⊗ Punto final; Promedio; ∑ Sumatoria
∑ 6693
40,75
23
Gráfica 2. Dosis Letal (DL50) del veneno de las crías de Bothrops colombiensis en
ratones C57bl/6 (♀), administrado por VIP para 60 minutos de observación.
En la figura 2, se muestra la representación gráfica de los datos para el cálculo
de la DL50, del veneno de las crías de Bothrops colombiensis en el modelo múrido
C57bl/6 hembras, las cuales fueron inyectadas VIP y para 60 minutos de observación.
La flecha indica el primer punto de inflexión (anti-log 1,40) e inicio de la corrida
válida para el cálculo de la DL50. El resultado se expresa como la mediana y sus
límites de confianza al 95%. La DL50, fue de 28,37 mg.K
-1
de ratón, con límites de
confianza entre 25,12 y 31,62 mg.K-1 de ratón. El índice de variabilidad (IV= (Límite
superior – Límite inferior/ Mediana) x100) fue de 22,9%.
24
Tabla 4. Frecuencia de muerte inducida por el veneno de las crías de Bothrops
colombiensis en el modelo múrido C57bl/6 (♀) según la dosis administrada por VIP,
para 60 minutos de observación.
Nº de ratón
Anti-Log dosis (mg·kg¯¹de ratón)
Dosis A
Dosis B
Dosis C
Dosis D
Dosis E
Dosis F
Dosis G
Dosis H
1,20
1,25
1,30
1,35
1,40
1,45
1,50
1,55
Corrida no válida
1
0
-
-
-
-
-
-
-
2
-
0
-
-
-
-
-
-
3
-
-
0
-
-
-
-
-
4
-
-
-
0
-
-
-
-
Corrida
Válida
5
-
-
-
-
† :57
-
-
-
6
-
-
-
0
-
-
-
-
7
-
-
-
-
† :31
-
-
-
8
-
-
-
0
-
-
-
-
9
-
-
-
-
0
-
-
-
10
-
-
-
-
-
0
-
-
11
-
-
-
-
-
-
0
-
12
-
-
-
-
-
-
-
† :40
13
-
-
-
-
-
-
0
-
14
-
-
-
-
-
-
-
† :35
Punto final
15
-
-
-
-
-
-
⊗
-
Datos validos
0
0
0
0
2
0
0
2
0
0
0
0
50
0
0
50
n=4 [†]
Frecuencia de
muerte
[†]=100%
†= Indica tiempo de muerte en minutos.
0: Indica sobrevivencia.
= Indica punto final
25
Gráfica 3. Comparación de las Dosis Letales 50 (DL50) del veneno del ejemplar
adulto y de las crías de Bothrops colombiensis en ratones C57bl/6 (♀), administrado
por VIP para 60 minutos de observación.
Al comparar los resultados de las DL50 obtenidas para el veneno del ejemplar
adulto y las crías de Bothrops colombiensis, sobre las hembras C57bl/6, administrado
por VIP para 60 minutos de observación, se evidenció una potencia
significativamente mayor (p= 0,000001) para el veneno del ejemplar adulto.
26
Tabla 5. Signos clínicos de toxicidad observados en ratones C57bl/6, en un lapso de
60 minutos, posterior a la administración intraperitoneal del veneno del ejemplar
adulto de Bothrops colombiensis.
Tiempo
Signos Clínicos
% Aparición
(Minutos)
Taquipnea
1–5
100
Hipoactividad
3 – 10
100
Postración
27 – 40
100
Períodos de apnea
14 – 53
68,75
Posición antálgica
1–5
50
Muerte
29 – 56
50
Movimientos inefectivos
20 – 40
43,75
Respiración abdominal forzada
11 – 50
43,75
Cianosis Peribucal
27 – 50
43,75
Extensión del tren posterior
25 – 40
31,25
Respiración oral
27 – 40
31,25
Las manifestaciones de toxicidad aguda observadas con mayor frecuencia tras
la administración del veneno del ejemplar adulto de Bothrops colombiensis, en
múridos C57bl/6, para 60 minutos de observación fueron taquipnea, hipoactividad,
postración, períodos de apnea, posición antálgica y muerte, notándose así que la
taquipnea, posición antálgica e hipoactividad aparecieron en un breve período de
tiempo, posterior a la inyección del veneno; se presentaron otros signos clínicos como
respiración abdominal forzada, cianosis peribucal, movimientos inefectivos,
movimientos de extensión del tren posterior y respiración oral pero con menor
frecuencia.
27
Tabla 6. Signos clínicos de toxicidad observados en ratones C57bl/6, en un lapso de
60 minutos, posterior a la administración intraperitoneal del veneno de las crías de
Bothrops colombiensis.
Signos Clínicos
Tiempo (Min)
% Aparición
Taquipnea
1–3
100
Hipoactividad
2 – 14
100
Postración
7 – 20
100
Posición antálgica
1–8
92,86
Movimientos inefectivos
10 – 49
35,71
Muerte
31 – 57
28,57
Períodos de apnea
20 – 51
28,57
Extensión del tren posterior
30 – 56
28,57
Los principales signos clínicos evidenciados, posterior a la inyección del
veneno de las crías de Bothrops colombiensis, en múridos C57bl/6, en 60 minutos de
observación fueron taquipnea, hipoactividad, postración y posición antálgica,
apareciendo antes de los 20 minutos de observación; otros signos clínicos observados
fueron movimientos inefectivos, períodos de apnea, movimientos de extensión del
tren posterior y muerte, cabe destacar que estos se presentaron a mayor tiempo de
observación. Las crías de B. colombiensis fueron muriendo progresivamente durante
la realización de ésta investigación, por lo que limitó el uso del veneno obtenido para
el cálculo de las DL50, y por no contar con suficiente cantidad del mismo, no se
llevaron
a
cabo
los
experimentos
de
actividades
biológicas.
DISCUSION
El envenenamiento ofídico sigue representando un grave problema médico,
social y económico en Venezuela, particularmente en las áreas rurales. Según el
MPPS, en el período 2001 – 2003, se registraron 16.764 casos en todo el país, de los
cuales 492 ocurrieron en el estado Anzoátegui. Las serpientes involucradas en la
mayoría de estos casos pertenecían a la familia Viperidae, siendo el género Bothrops
el responsable del mayor número de muertes ocurridas en nuestro estado y en el país
en general (MPPS, 2005; Costa Cardoso y Fan, 1995; Rodríguez – Acosta y González,
2004).
Para estandarizar la letalidad de los venenos y antivenenos de origen natural, es
necesario el cálculo de la Dosis Letal 50 (DL50), que no es más que la cantidad
requerida de una droga o toxina que es capaz de producir la muerte en el 50% de una
población de animales experimentales, en un tiempo determinado (Ross,1996).
La mayoría de las especies de víboras exhiben diferencias ontogénicas en la
potencia de sus venenos, tales diferencias son frecuentes, asociadas con el tipo de
presa y según el estadio ontogénico. El veneno de juveniles de Crotalus willardi
obscurus, fue significativamente más tóxico en lagartos que el de ejemplares adultos,
el cual resultó 3 veces menos letal que el de los juveniles cuando se compararon las
DL50 (Holycross y col., 2002). Gutierrez y col. (1990), compararon la cantidad de
crotoxinas presentes en veneno de adultos y juveniles de Crotalus simus, en Costa
Rica, y encontraron que ésta fue mucho mayor en el veneno de los juveniles, siendo
mucho más letal para los roedores que el veneno de ejemplares adultos.
28
29
Se han observado variaciones ontogénicas en la letalidad del veneno de
Bothrops atrox. Las serpientes recién nacidas poseen un veneno más letal
(DL50 51,8 mg) en comparación con los adultos (DL50 81,4 mg) (Otero y col, 2000).
En otro estudio, el veneno de las juveniles de Bothrops jararaca resultó más tóxico
que el de los adultos, en presas de sangre fría; por el contrario, el veneno de los
adultos fue más tóxico en presas de sangre caliente que el de juveniles (Andrade y
Abe, 1999).
En el Centro de Investigaciones en Ciencias de la Salud (CICS), de la
Universidad de Oriente, Núcleo de Anzoátegui se han realizado investigaciones
previas, en las que comparan el veneno de ejemplares adultos y juveniles de varias
especies de víboras. Blanco y Rojas (2005), estudiaron el veneno de Bothrops
venezuelensis, en la cepa de ratones C57bl/6, hembras homocigotas, demostrando que
el veneno de los juveniles fue significativamente más potente que el de las adultas. En
un estudio similar, realizado con veneno de Crotalus durissus cumanensis hubo
resultados parecidos, el veneno de las serpientes adultas fue menos potente que el de
juveniles (Baldi y Chalhoub, 2007). De igual forma, se observó que en C. durissus
pifanorum y C. durissus vegradis, el veneno de los juveniles fue siempre más letal que
el de los adultos (Valerio, 2007; Acosta, Cayamo y Graziani, 2008). Astudillo y
Bejarano (2008), al comparar ontogénicamente, las DL50 del veneno de Bothrops
colombiensis, no encontraron diferencias significativas en cuanto a la letalidad del
veneno, lo que hizo pensar en la posibilidad de variabilidad intraespecífica, puesto que
las mapanares adultas de las cuales se obtuvo el pool de veneno, procedían de distintas
áreas geográficas del país y que la mezcla de éstos podrían promediar el de los
juveniles utilizados, que eran todos de la misma localidad. Dicha variabilidad
geográfica fue confirmada por Ruiz y Ruiz (2009) al comparar ejemplares de
Bothrops colombiensis, provenientes de distintas zonas del país.
30
A diferencia de las investigaciones antes mencionadas, en el presente estudio se
observó diferencias significativas (p=0,000001) al comparar el veneno de un ejemplar
adulto de Bothrops colombiensis con el de sus crías, siendo la DL50 del ejemplar
adulto (15,85 mg.K-1) significativamente menor al de las crías (28,37 mg.K-1),
evidenciándose así, la menor toxicidad del veneno de las crías; hecho éste, que podría
correlacionarse con los resultados obtenidos por Astudillo y Bejarano (2008).
Los signos de toxicidad aguda fueron observados durante 60 minutos, después
de la inyección intraperitoneal del veneno de la madre y sus crías de Bothrops
colombiensis, predominando la taquipnea, hipoactividad, postración, movimientos
inefectivos y posición antálgica; efectos éstos que podrían ser explicados por la
acción coagulante y proteolítica del mismo.
Entre otros signos, menos frecuentes, se pudieron observar pausas respiratorias,
movimientos de extensión del tren posterior, respiración oral, cianosis peribucal y
respiración abdominal forzada. El tiempo de aparición de las manifestaciones clínicas
fue paulatino y variable pero, en general, no hubo mayores diferencias entre los dos
estadios ontogénicos. Estos resultados corresponderían con los observados por Blanco
y Rojas (2005) quienes evidenciaron que el 100% de los ratones de la cepa C57bl/6,
que fueron inyectados por VIP con veneno de Bothrops venezuelensis adultas y
juveniles, presentaron hipoactividad, debilidad muscular, hiperextensión de la cola,
marcha atáxica y alteraciones de la respiración caracterizadas por períodos de apnea.
31
Las semejanzas de las manifestaciones clínicas sugieren que ambos estadios
ontogénicos presentan composiciones químicas similares en sus venenos y que las
diferencias en las DL50 se fundamentarían más bien en la concentración diferente de
alguno de sus componentes.
Las actividades hemorrágicas de serpientes suramericanas existen, casi
exclusivamente en los venenos botrópicos y lachésicos. No obstante, se han descrito
estas actividades en algunas especies de crótalos venezolanos (Rodríguez – Acosta,
1998; Aguilar y col., 2001). A pesar de no haber cumplido con
el objetivo de
comparar el efecto procoagulante del veneno de ambos estadios ontogénicos, este
hecho no invalida el presente trabajo, debido a que dicha actividad ha sido
ampliamente estudiada en investigaciones previas, donde se realizaron estudios
comparativos con el veneno de juveniles y adultos, como las llevadas a cabo por López
y Lozano (2002), quienes trabajaron con el veneno de Bothrops atrox y observaron
que la actividad coagulante del plasma fue mayor al ser inducida por el veneno de
juveniles que por el veneno de adultos.
En otro estudio, en el que se utilizó veneno de Bothrops venezuelensis, las
diferencias entre las distintas velocidades a las que coaguló el plasma con el veneno de
adultos y juveniles indicó que en el caso de las juveniles fue un poco más coagulante
que el de los adultos (Blanco y Rojas, 2005). Por otro lado, Furtado y col. (1991),
estudiaron los venenos de siete subespecies de Bothrops, donde encontraron
variaciones en el contenido de proteínas, toxinas y actividad fibrinolítica y trombótica,
notando también que la actividad procoagulante del veneno de juveniles, en
comparación con los adultos, fue siempre mayor. Resultados similares se encontraron
en investigaciones realizadas con venenos de las subespecies C. d. vegrandis, C. d.
32
cumanensis y C. d. pifanorum, los cuales reiteran que el efecto coagulante del plasma
fue más potente en los juveniles (Valerio, 2007; Baldi y Chalhoub, 2007; Acosta,
Cayamo y Graziani, 2008). En todos estos estudios, el veneno con mayor acción
procoagulante (el de los juveniles) fue siempre el más tóxico, por lo que queda claro
que éste es uno de los efectos biológicos más relacionados a la potencia del veneno.
Por el contrario, en un trabajo realizado con veneno de adultos y juveniles de
Bothrops colombiensis, no se evidenciaron diferencias significativas en cuanto al
efecto procoagulante, y en consecuencia, no hubo diferencias en las DL50 (Astudillo y
Bejarano, 2008). La actividad del veneno en la coagulación de la sangre está dada,
principalmente, por la acción procoagulante que éste ejerce sobre el plasma sanguíneo
al actuar sobre el factor I y X de la coagulación.
Con respecto a los efectos proteolíticos del veneno de Bothrops colombiensis,
en otras investigaciones se ha demostrado que éste se encuentra directamente
relacionado con la edad de la serpiente, siendo mayor en ejemplares adultos (Astudillo
y Bejarano, 2008). Resultados que coinciden con los hallados al estudiar el veneno de
Bothrops atrox y Bothrops venezuelensis (Málaga y col., 2000; Blanco y Rojas, 2005)
y otras subespecies de la familia Crotalidae, descritos por Valerio (2007), Baldi y
Chalhoub (2007), Acosta, Cayamo y Graziani (2008) en C. d. vegrandis, C. d.
cumanensis y C. d. pifanorum, respectivamente. Cabe destacar que la letalidad del
veneno de Bothrops colombiensis depende principalmente de su acción hemotóxica, no
estando relacionada con los efectos proteolíticos del mismo.
CONCLUSIONES
•
La DL50 del ejemplar adulto fue de 15,85 mg.K-1 y la de los juveniles de
28,37 mg.K-1.
•
Existen diferencias significativas en la potencia del veneno de Bothrops
colombiensis con relación a sus estadios ontogénicos, siendo el de las crías
menos potente que el veneno de la madre.
•
El tiempo de muerte en los ratones C57bl/6 inyectados con el veneno de las crías
es muy cercano al tiempo de muerte de los inyectados con el veneno de la
madre.
•
En el modelo múrido C57bl/6, inyectados vip con el veneno de Bothrops
colombiensis, las manifestaciones de toxicidad aguda fueron similares en ambos
estadios ontogénicos.
33
RECOMENDACIONES
•
Utilizar el método de Dixon y Mood (1948) modificado por Sevcik (1987) para el
cálculo de la Dosis Letal Cincuenta, debido a que permite la utilización de un
menor número de animales de experimentación, ahorro de material biológico y
mayor facilidad para el análisis estadístico de los resultados.
•
Completar esta investigación con el estudio comparativo de las distintas
actividades biológicas de los venenos (proteolítica, procoagulante, hemorrágica,
fosfolipasas, etc).
•
Estudiar los diferentes componentes de los venenos de adultos y juveniles de las
distintas especies encontradas en el territorio nacional, para precisar cual de ellos
es el responsable de las variaciones encontradas a nivel ontogénico.
•
Fomentar la producción de sueros antiofídicos con mayor especificidad y eficacia.
34
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(Serpentes, Viperidae); Estudio comparativo entre ejemplares adultos y juveniles.
Trabajo de Grado (no publicado). Universidad de Oriente.2007.
ANEXOS
43
44
Anexo 1
UNIVERSIDAD DE ORIENTE
NÚCLEO DE ANZOÁTEGUI
ESCUELA DE MEDICINA
CENTRO DE INVESTIGACIONES EN CIENCIAS DE LA SALUD
LABORATORIO DE TOXINOLOGÍA
Anexo 1
FICHA DE RESULTADOS
EXPERIMENTO:
DL50 MÉTODO:
VENENO (ESPECIE, SEXO):
(Número del animal, peso, vía de inyección)
ANIMAL EXPERIMENTAL:
Factor
Dosis
(volúmen)
CÁLCULO DE DOSIS:
Tabla de Resultados:
Tiempo
01.
02.
03.
04.
05.
06.
07.
08.
09.
10.
11.
Manifestaciones clínicas
45
12.
Anexo 2. Morbilidad registrada por mordeduras de serpientes. SaludAnz - Venezuela
2001– 2003.
ESTADO
2001
2002
2003
Amazonas
88
86
84
Anzoátegui
175
135
182
Apure
109
223
337
Aragua
64
90
110
Barinas
281
294
405
Bolívar
290
283
383
Carabobo
480
257
380
Cojedes
79
119
198
Delta Amacuro
101
54
117
Falcón
336
301
286
Guárico
162
81
193
Lara
126
689
582
Mérida
363
162
352
Miranda
136
325
377
Monagas
248
143
399
Nueva Esparta
49
55
24
Portuguesa
336
462
507
Sucre
91
109
98
Táchira
375
192
521
Trujillo
225
210
284
Vargas
16
36
54
Yaracuy
25
162
285
Zulia
680
586
717
TOTAL
4835
5054
6875
46
Anexo 3. Casos por mordeduras de serpientes. Semana Epidemiológica 1-48.
SaludAnz. Estado Anzoátegui, 2005.
UBICACIÓN GEOGRÁFICA
NÚMERO DE CASOS
Anaco
13
Aragua de Barcelona
49
Bolívar
37
Bruzual
26
Cagigal
6
Carvajal
39
Freites
15
Guanta
2
Independencia
3
Libertad
4
Mac-Gregor
14
Miranda
17
Monagas
6
Peñalver
2
Píritu
16
San Juan de Capistrano
16
Santa Ana
9
Simón Rodríguez
11
47
Inyección VIP del veneno
Hipoactividad
48
Postración
Posición Antálgica
49
Muerte
METADATOS PARA TRABAJOS DE GRADO, TESIS Y
ASCENSO
TÍTULO
VARIACIÓN ONTOGÉNICA DEL VENENO DE
Bothrops colombiensis (SERPENTES, VIPERIDAE);
ESTUDIO COMPARATIVO ENTRE UNA MADRE Y
SUS CRÍAS
SUBTÍTULO
AUTOR (ES):
APELLIDOS Y NOMBRES
CÓDIGO CULAC / E MAIL
CVLAC: 17.212.661
Astudillo Nuñez, Heira de los Ángeles
E MAIL: puchiheira@hotmail.com
CVLAC: 18.274.372
Osuna Gonzalez, Judiel Carolina
EMAIL: Judiel_cog@hotmail.com
PALÁBRAS O FRASES CLAVES:
Envenenamiento ofídico, DL50, Bothrops colombiensis, variación ontogénica
METADATOS PARA TRABAJOS DE GRADO, TESIS Y ASCENSO:
ÀREA
Ciencias de la Salud
SUBÀREA
Medicina
RESUMEN (ABSTRACT): Variación Ontogénica del veneno de Bothrops
colombiensis (Serpentes, Viperidae); Estudio comparativo entre una madre y sus
crías. Astudillo N., Heira; Osuna G., Judiel y Kiriakos, Demetrio. Universidad de
Oriente, Núcleo Anzoátegui, 2009.
Se determinó la DL50 del veneno de un ejemplar adulto de Bothrops
colombiensis y de sus crías, en el modelo múrido C57bl/6, hembra, inyectados por vía
intraperitoneal y para una hora de observación, por el método secuencial de Dixon y
Mood (1948) modificado por Sevcik (1987). Los resultados obtenidos para la DL50
del veneno del ejemplar adulto fue 15,85 mg/kg y la del veneno de las crías
28,37 mg/kg. Los signos clínicos más frecuentes, observados luego de la inyección
del veneno del ejemplar adulto Bothrops colombiensis fueron: taquipnea,
hipoactividad, postración y períodos de apnea, con frecuencias que variaron entre
68,65% y 100%, con un promedio de tiempo de aparición entre 1 y 53 minutos.
Mientras que las manifestaciones observadas tras la inyección del veneno de las crías
de Bothrops colombiensis, en múridos C57bl/6, en 60 minutos de observación fueron
taquipnea, hipoactividad, postración y posición antálgica, apareciendo antes de los 20
minutos de observación. En conclusión, existen diferencias significativas en cuanto a
la potencia del veneno de Bothrops colombiensis con relación a sus estadios
ontogénicos, siendo el de las crías menos potente que el veneno de la madre mientras
que las manifestaciones tóxicas agudas, en el modelo múrido C57bl/6, inyectados vip
fueron similares en ambos estadios ontogénicos.
METADATOS PARA TRABAJOS DE GRADO, TESIS Y ASCENSO:
CONTRIBUIDORES:
APELLIDOS Y NOMBRES
Dr. De Sousa José
ROL / CÓDIGO CVLAC / E_MAIL
ROL
CA
AS
TU
JU X
CVLAC:
14.214.493
E_MAIL
leonardodesousa@yahoo.com
E_MAIL
Dra. Ovalles María
ROL
CVLAC:
CA
AS
TU
JU X
TU
JU
TU
JU
4.004.630
E_MAIL
E_MAIL
Dra. Kiriakos Demetrio
ROL
CVLAC:
CA
AS X
5.698.723
E_MAIL
E_MAIL
ROL
CVLAC:
E_MAIL
E_MAIL
FECHA DE DISCUSIÓN Y APROBACIÓN:
10
05
21
AÑO
MES
DÍA
LENGUAJE. SPA
CA
AS
METADATOS PARA TRABAJOS DE GRADO, TESIS Y ASCENSO:
ARCHIVO (S):
NOMBRE DE ARCHIVO
TESIS_HEIRA_Y_JUDI_DEFIITIVO
TIPO MIME
Application/msword
CARACTERES EN LOS NOMBRES DE LOS ARCHIVOS: A B C D E F G H I
J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z. a b c d e f g h i j k l m n o p q r s t u v w x y
z. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9.
ALCANCE
ESPACIAL: Centro de Investigaciones en Ciencias de la Salud.
TEMPORAL:
TÍTULO O GRADO ASOCIADO CON EL TRABAJO:
CIRUJANO GENERAL
NIVEL ASOCIADO CON EL TRABAJO:
PREGRADO
ÁREA DE ESTUDIO:
ESCUELA DE CIENCIAS DE LA SALUD
INSTITUCIÓN:
UNIVERSIDAD DE ORIENTE. NÚCLEO DE ANZOÁTEGUI
METADATOS PARA TRABAJOS DE GRADO, TESIS Y ASCENSO:
DERECHOS
De acuerdo al articulo 44 del Reglamento de Trabajos de Grado:
“Los trabajos de Grado son exclusiva propiedad de la Universidad de Oriente y solo
podrán ser utilizados a otros fines con el consentimiento Del Consejo de Núcleo
respectivo, quién lo participará al Consejo Universitario”
Astudillo Nuñez, Heira de los Ángeles
Osuna González, Judiel Carolina
AUTOR
Dr. De Sousa José
JURADO
AUTOR
Dra. Ovalles María
JURADO
Dr. Kiriakos Demetrio
ASESOR
Dra. Villegas, Rosibel
POR LA SUBCOMISION DE TRABAJOS DE GRADO,
TESIS Y ASCENSO