Auswirkungen einer protrahierten Geburtseinleitung beim Rind auf
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Auswirkungen einer protrahierten Geburtseinleitung beim Rind auf
Tierärztliche Hochschule Hannover Auswirkungen einer protrahierten Geburtseinleitung beim Rind auf die Plazentareife, den uterinen Blutfluss sowie Steroidhormone im Plasma INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) vorgelegt von Desiree Hartmann Nagold Hannover 2011 Wissenschaftliche Betreuung: 1. Univ.-Prof. Dr. Heinrich Bollwein Klinik für Rinder 2. Univ.-Prof. Dr. Christiane Pfarrer Anatomisches Institut 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Heinrich Bollwein 2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. Dr. Sabine Meinecke-Tillmann Tag der mündlichen Prüfung: 20.09.2011 Meiner Familie INHALTSVERZEICHNIS Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ....................................................................................................... 5 Abkürzungsverzeichnis............................................................................................... 8 1. Einleitung................................................................................................................ 9 2. Literaturübersicht.................................................................................................. 11 3. Material und Methoden ......................................................................................... 18 3.1 Tiere................................................................................................................ 18 3.2 Versuchsaufbau .............................................................................................. 18 3.3 Probennahme und -fixation ............................................................................. 19 3.4 Histologie und Immunhistochemie .................................................................. 19 3.5 Auswertung mittels Lichtmikroskopie .............................................................. 21 3.6 Ultrasonographische Untersuchungen ............................................................ 22 3.7 Plasmagewinnung und hormonanalytische Untersuchung.............................. 23 3.8 Statistische Auswertungen.............................................................................. 24 4. Chapter 1:............................................................................................................. 25 Protracted induction of parturition enhances placental maturation, but does not influence incidence of placental retention in cows .................................................... 25 4.1 Abstract........................................................................................................... 25 4.2 Introduction ..................................................................................................... 26 4.3 Material and Methods...................................................................................... 28 4.3.1 Experimental Design ................................................................................ 28 4.3.2 Tissue sampling and fixation .................................................................... 29 4.3.3 Histology and Immunohistochemistry ....................................................... 29 4.3.4 Light Microscopy....................................................................................... 30 4.3.5 Statistical analysis .................................................................................... 31 4.4 Results ............................................................................................................ 31 4.4.1 Clinical findings......................................................................................... 31 4.4.2 Placental Histology (Masson´s Trichrome staining).................................. 32 4.4.3 Height of Maternal Epithelium (Pan-Cytokeratin Immunohistochemistry). 33 4.4.4 Apoptosis (Caspase-3 Immunohistochemistry) ........................................ 33 4.4.5 iNOS and eNOS in placental tissue.......................................................... 33 4.4.6 Endothelin-1 (ET-1) in placental tissue..................................................... 34 4.5 Discussion....................................................................................................... 34 4.6 Figures and Tables ......................................................................................... 39 5. Chapter 2:............................................................................................................. 42 Effects of a protracted induction of parturition on the incidence of retained placentae and uterine blood flow in cattle ................................................................................. 42 5.1 Abstract........................................................................................................... 42 5.2 Introduction ..................................................................................................... 43 5.3 Materials and Methods.................................................................................... 45 5.3.1 Cattle ........................................................................................................ 45 5.3.2 Study design............................................................................................. 46 5.3.3 Measurement of uterine blood flow........................................................... 46 5.3.4 Determination of steroid hormones........................................................... 47 5.3.5 Statistical analyses ................................................................................... 48 5.4 Results ............................................................................................................ 49 5.4.1 Clinical findings......................................................................................... 49 5.4.2 Uterine blood flow..................................................................................... 50 5.4.3 Steroid hormones ..................................................................................... 50 5.4.3.1 Progesterone ......................................................................................... 50 5.4.3.2 Total estrogens...................................................................................... 51 5.4.3.3 Cortisol .................................................................................................. 51 5.5 Discussion....................................................................................................... 51 5.6 Figures and Tables ......................................................................................... 57 6. Übergreifende Diskussion..................................................................................... 67 Schlussfolgerungen .............................................................................................. 70 7. Zusammenfassung ............................................................................................... 71 8. Summary .............................................................................................................. 74 9. Literaturverzeichnis .............................................................................................. 77 10. Abbildungsverzeichnis ........................................................................................ 85 11. Tabellenverzeichnis ............................................................................................ 87 12. Histologische und Immunhistochemische Färbungen ........................................ 88 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS Abkürzungsverzeichnis a.m. ante meridiem Az. reference number (33.9-42502-04-07/1394) BFV blood flow volume bzw. beziehungsweise c contralateral ºC degree Celsius cm centimeter CV coefficient of variation D vessel diameter EDF end-diastolic frequency shift EDTA ethylenediaminetetraacetic acid EIA enzyme-immunoassay eNOS endothelial nitritoxid-synthase ET-1 endothelin-1 Etot total estrogens f female fe fetal chorionic epithelium Fig. figure H2O2 hydrogen peroxid i ipsilateral IgG immungloblulin G i.m. intramuscular iNOS inducible nitritoxidsynthase kg kilogram L liter m male M mol me maternal crypt epithelium ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS mg milligram MHz megahertz min minutes mL milliliter n number ng nanogram nmol nanomolar NO nitritoxid NOS nitritoxid-synthase P4 progesterone PBS phosphate buffered saline pg picogram PIP protracted induction of parturition p.m. post meridiem PSF peak systolic frequency shift r correlation coefficient REL release placenta RET retained placenta RI resistance index s.c. subcutaneous SD standard deviation s second SIP singular induction of parturition SPON spontaneous parturition Tab. table TAMV time average maximum velocity tBFV total blood flow volume TE total estrogene µL mycroliter EINLEITUNG 1. Einleitung Die gezielte, medikamentöse Geburtseinleitung bei der Kuh kann aus medizinischen und/oder ökonomischen Gründen indiziert sein. Medizinische Indikationen für einen vorzeitigen Trächtigkeitsabbruch stellen zum Beispiel eine verlängerte Graviditätsdauer, Eihautwassersucht, mumifizierte Früchte oder eine zu frühe, ungewollte Belegung von Jungrindern dar (GRUNERT 1995). Aus ökonomischer Sicht kann es zudem gewünscht sein, Abkalbungen und damit die Laktation saisonal zu konzentrieren, um eine optimale Weideausnutzung im Frühjahr zu erzielen. Dieses Vorgehen wird überwiegend in Neuseeland und Australien praktiziert (WELCH et al. 1977; MACDIARMID and COOPER 1983; MACMILLAN 2002). Konventionell wird die Geburt bei Kühen mit einer hohen Dosis eines Glukokortikoids und/oder eines Prostaglandinpräparates eingeleitet. Dies führt jedoch, abhängig vom Zeitpunkt der Einleitung während der Gravidität, zu einer hohen Inzidenz an Nachgeburtsverhaltungen mit Werten zwischen 60 % und 100 % (GRUNERT et al. 1976; PELISSIER 1976; WELCH et al. 1977; WILHELM 1989; SCHULZ 1990). In Folge einer Retentio secundinarum kommt es vielfach zu einer reduzierten Milch- und Fruchtbarkeitsleistung und damit zu hohen wirtschaftlichen Verlusten (WILHELM 1989; LAVEN and PETERS 1996; BEAGLEY et al. 2010). Aus diesem Grund wurden in den letzten Jahrzehnten zahlreiche Studien zur Ätiologie und Pathogenese der Retentio secundinarum durchgeführt (WILLMS 1986; LAVEN and PETERS 1996; MCNAUGHTON and MURRAY 2009; BEAGLEY et al. 2010), jedoch konnten diese bis heute nicht vollständig geklärt werden. Es hat sich jedoch gezeigt, dass der graduelle Anstieg des fetalen Kortisols im letzten Trächtigkeitsmonat und vor allem in den letzten Tagen vor der Geburt (HUNTER et al. 1977) für den Abgang der Nachgeburt von entscheidender Bedeutung zu sein scheint (BO et al. 1992). Diese Hypothese wird gestützt durch die signifikante Abnahme von Nachgeburtsverhaltungen, wenn langwirkende Kortikosteroidpräparate zur Geburtseinleitung bei der Kuh verwendet werden (WELCH et al. 1973; WELCH et al. 1977; DISKIN et al. 1982; BO et al. 1992). In der EU sind jedoch aufgrund der Gefahr systemischer Nebenwirkungen langzeitwirkende Kortikosteroide bei lebensmittelliefernden Tieren 9 EINLEITUNG nicht zugelassen. Eine mögliche Alternative könnte jedoch die Anwendung kurzwirksamer Kortikosteroide darstellen, welche über mehrere Tage vor der geplanten Geburtseinleitung verabreicht werden (im Folgenden als protrahierte Geburtseinleitung bezeichnet). Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Auswirkungen einer konventionellen und einer protrahierten Geburtseinleitung auf die Plazentareifung und den Abgang der Nachgeburt zu untersuchen. Hierfür wurde in den letzten sieben Tage der Gravidität ein Hormonprofil für Kühe mit verschieden Geburtseinleitungschemata erstellt. Der Ausprägungsgrad der Plazentareifung sollte zudem anhand histologischer und immunhistochemischer Methoden untersucht werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war zudem die Analyse des uterinen Blutflusses in den letzten Tagen vor der Geburt mithilfe der transrektalen Dopplersonographie, um Veränderungen der uteroplazentaren Perfusion zu evaluieren und die Möglichkeit zu testen, die transrektale Dopplersonographie als nicht-invasive Methode für die Beurteilung der Plazentareife zu etablieren. 10 LITERATURÜBERSICHT 2. Literaturübersicht Die Plazenta des Rindes sorgt für die fortlaufende Bereitstellung von Nährstoffen für den Fetus, für den Abtransport von Abfallprodukten über die Mutter und für den fetomaternalen Gasaustausch (FERRELL 1991; REYNOLDS and REDMER 1995). Beim Rind ist die Plazenta aus 80 - 150 kissenförmigen Plazentomen aufgebaut, die sich aus den mütterlichen Krypten, die auch als Karunkel bezeichnet werden und den fetalen Chorionzotten, den Kotyledonen, zusammensetzen. Das Rind besitzt mit einer Placenta synepitheliochorialis eine Sonderform der Placenta epitheliochorialis (SCHNORR 2006), da schwach invasive Trophoblastriesenzellen mit einzelnen Karunkelepithelzellen zu fetomaternalen Hybridzellen fusionieren (WOODING 1992). Die Plazenta ist im Laufe der Trächtigkeit zahlreichen Auf- und Abbauvorgängen unterworfen (REYNOLDS et al. 1990; FERRELL 1991). Die maternalen Karunkel wachsen während der Gravidität kontinuierlich, wobei dieses Wachstum hauptsächlich auf Zellproliferation beruht, während sich das interplazentare Gewebe vor allem durch Hypertrophie vergrößert (REYNOLDS et al. 1990). Im Gegensatz dazu stagniert das Wachstum der Kotyledonen ab dem 7. Monat der Trächtigkeit und scheint sogar an Masse abzunehmen (REYNOLDS et al. 1990; FERRELL 1991). Die physiologische Ablösung der Plazenta nach der Geburt unterliegt einem Reifungsprozess, welcher bereits einige Wochen vor der Geburt beginnt und in den letzten Tagen der Gravidität seine volle Ausprägung erfährt (SCHULZ 1956; SCHOON 1989). Dieser Prozess ist durch eine Vielzahl an morphologischen Veränderungen charakterisiert. Auf zellulärer Ebene kommt es zu Umbauprozessen an den feto-maternalen Grenzflächen, was sich in einer Abflachung des maternalen Kryptenepithels manifestiert und zu einer numerischen Reduktion der maternalen Epithelzellen führt (SCHULZ 1956; BJORKMAN 1969; WILLMS 1986). Die Abflachung des maternalen Kryptenepithels führt zum Kontakt mit einer zunehmenden Anzahl sowohl von Chorionepithel, als auch mit dem sich anschließenden maternalen Gewebe. SCHOON (1989) 11 spricht hier von einer Placenta LITERATURÜBERSICHT syndesmochorialis. Auch der Bindegewebsanteil steigt zur Geburt hin deutlich an (WILLMS 1986). Es handelt sich hierbei um eine zunehmende Kollagenisierung des Gewebes, gefolgt von einer Lockerung des maternalen Bindegewebes im Zuge der geburtsvorbereitenden Maßnahmen mit einer hochgradigen Ödematisierung (SCHOON 1989). Zeitnah zur Geburt sinkt die zelluläre Proliferation, während die Apoptoserate, sowohl im Chorionepithel, als auch in den maternalen Krypten steigt, was den Ablösungsprozess der fetalen Membranen begünstigt (BJORKMAN 1954; WOICKE et al. 1986; WILLIAMS et al. 1987; BOOS et al. 2003). Es wird vermutet, dass die Phagozytose der apoptotischen maternalen Kryptenepithelzellen dem Feten zur histiotrophen Ernährung dient (BOOS et al. 2003). Ein weiteres morphologisches Reifekriterium der Plazenta sind die binukleären Trophoblastriesenzellen, auch Diplokaryozyten genannt, die im Laufe der Trächtigkeit kontinuierlich vom Chorionepithel in das maternale Epithel wandern und dort mit den uterinen Epithelzellen verschmelzen, wodurch die oben erwähnten feto-maternalen Hybridzellen gebildet werden. Mit fortschreitender Trächtigkeit nimmt die Zahl der fetalen binukleären Riesenzellen deutlich ab (WILLMS 1986; TOLHUYSEN 1990). Für eine mangelhafte oder ungenügende Plazentareifung konnten bislang mehrere allgemeine Ursachen ermittelt werden: Einerseits eine Insuffizienz und/oder Unausgewogenheit der Hormone im Zeitraum um den Geburtstermin (GRUNERT et al. 1989; ZHANG et al. 1999; WISCHRAL et al. 2001; KINDAHL et al. 2004) sowie peripartale Faktoren, wie Sectio caesaria oder Torsio uteri, welche den Blutdruck in den Chorionzotten aufrechterhalten (GRUNERT 1986). Weiterhin wird eine Dysfunktion auf zellulärer Ebene diskutiert (BJORKMAN 1969; WOICKE et al. 1986). So zeigten sich, je nach Gestationsstadium, ein weitgehend intakter maternaler Kryptenepithelverband unterschiedlichem (SCHOON 1989) Degenerationsgrad oder (WILLMS Zotten 1986). und Dadurch Krypten mit bildet das Chorionepithel weiterhin eine feste Verbindung mit dem maternalen Kryptenepithel und der physiologische Lösungsprozess zur Geburt hin entfällt. Auch die Diplokaryozyten bleiben vorwiegend intakt (SCHOON 1989). 12 LITERATURÜBERSICHT Einige Autoren sehen die Ursache für eine Retentio secundinarum vor allem in einer Imbalanz oder einer Insuffizienz der hormonellen Veränderungen zur Geburt hin (GARVERICK et al. 1974; GRUNERT et al. 1989; WISCHRAL et al. 2001). Physiologisch wird die Geburt eingeleitet, indem das Adrenokortikotrope Hormon (ACTH) aus der fetalen Hypophyse die Freisetzung von Kortisol aus der fetalen Nebennierenrinde initiiert. Bei Schweinen und Schafen wurde festgestellt, dass sich die Rezeptorendichte für Glukokortikoide im fetalen Kortex zur Geburt hin stark erhöht. Damit nimmt auch die positive Feedback - Sensitivität zu, was die exponentielle Zunahme von ACTH und Kortisol im fetalen Plasma erleichtert (KAPOOR et al. 2006). Das fetale Kortisol induziert in der Plazenta ein Enzym, das aus einem Progesteronmetaboliten Östrogen synthetisiert. Dies reduziert das maternale Progesteron und steigert die Östrogenproduktion. Dadurch wird der Progesteronblock des Myometriums aufgehoben, das Myometrium wird für Oxytocin sensibilisiert und im Endometrium wird die Freisetzung von Prostaglandin F2α induziert. Durch letzteres nimmt die Uteruskontraktilität zu, das Corpus luteum bildet sich zurück und die Geburt wird eingeleitet (LINDELL et al. 1977; KINDAHL et al. 2004). Die Bedeutung der Kortikosteroide liegt somit in der Induktion einer Vielzahl von Enzymen in der Spätträchtigkeit, wodurch es zu dem typischen Verlauf der Hormonprofile ante partum kommt (KRAWCZYNSKI 1999). Als Schlüsselhormone für die Plazentareifung scheinen in dieser Hormonkaskade neben den Kortikosteroiden die Östrogene eine wichtige Rolle zu spielen. So wird vermutet, dass der zelluläre Umbau der feto-maternalen Kontaktzone an den sich erhöhenden Plasmaöstrogenspiegel des Muttertieres gebunden ist (GARVERICK et al. 1974; GRUNERT et al. 1989; BOOS et al. 2000). Aus diesem Grund wurde in mehreren Studien versucht, die Inzidenz an Nachgeburtsverhaltungen zu senken, indem bei mit Kortikosteroiden eingeleiteten Kühen zusätzlich Östrogene verabreicht wurden (LAVOIE and MOODY 1973; BEARDSLEY et al. 1974; GARVERICK et al. 1974; SCHMITT et al. 1975). Die Ergebnisse sind jedoch widersprüchlich. So konnten einige Autoren eine Abnahme der Inzidenz an Nachgeburtsverhaltungen feststellen (BEARDSLEY et al. 1974; GARVERICK et al. 1974), andere fanden jedoch kei- 13 LITERATURÜBERSICHT nen Einfluss auf den Abgang der Eihäute (LAVOIE and MOODY 1973; SCHMITT et al. 1975). Ein weiterer entscheidender Faktor für den plazentären Lösungsprozess scheint die Kontraktilität des Uterus und die Austreibung des Fetus zu sein. Dies führt zu Blutdruckschwankungen im uterinen Gewebe und damit zu alternierenden hyperämischen und ischämischen Bedingungen innerhalb der Chorionzotten (GRUNERT 1986). Folge des reduzierten uterinen und plazentaren Blutflusses sind apoptotische zelluläre Veränderungen, welche wiederum essentiell für die Plazentareifung und den Abgang der fetalen Membranen sind (JOOSTEN and HENSEN 1992; BOOS et al. 2003). Es konnte gezeigt werden, dass der uterine und der umbilikale Blutfluss Indikatoren für die Perfusion der Plazenta sind und damit ein Maß für die Perfusion des uteroplazentaren Gewebes (FERRELL 1991). Im Laufe der Gravidität steigt der uterine Blutfluss kontinuierlich an und erreicht vor allem im letzten Drittel der Trächtigkeit seine volle Ausprägung (FERRELL 1991; REYNOLDS and REDMER 1995; PANARACE et al. 2006). Diese Beobachtung deckt sich mit der Vaskularisation des maternalen plazentaren Gewebes, welche langsam und kontinuierlich während der Gravidität zunimmt, während sie in den fetalen Kotyledonen bis zur Mitte der Trächtigkeit relativ konstant und im letzten Drittel exponentiell an Wachstum zunimmt (PFARRER et al. 2001; REYNOLDS and REDMER 2001; SCHULER et al. 2002). Die Plazenta bildet somit ein hochkompliziertes fetomaternales Zotten – Krypten Austauschsystem, um den wachsenden Ansprüchen des Feten gerecht zu werden (REYNOLDS and REDMER 1995; PFARRER et al. 2001). Der Einfluss von Kortikosteroiden auf die Durchblutung der Plazenta ist bislang vor allem an Schafen untersucht worden. So wurde der maternale Blutfluss an dieser Spezies mithilfe von implantierten elektromagnetischen Strömungssonden, die um die uterinen Arterien angebracht wurden, gemessen (BURD et al. 1976). Bei allen Tieren gab es eine signifikante Erhöhung des maternalen Blutflusses (97 ml/min zu 365 ml/min) in der letzten Woche der Trächtigkeit. Die Geburt wurde mit einer Dexa- 14 LITERATURÜBERSICHT methason - Infusion (1mg/24 h) direkt in eine fetale Vene und bei einer zweiten Gruppe in eine maternale Vene eingeleitet. Nach der Dexamethason - Infusion in die fetale Vene nahm der maternale Blutfluss signifikant zu, während die Infusion in die maternale Vene zu keiner signifikanten Erhöhung des Blutflusses führte. In einer anderen Studie sank bei einer Behandlung der Mutterschafe mit Dexamethason die Durchblutung der umbilikalen Gefäße und der Fetus war in der Folge nicht mehr in der Lage auf eine akute Hypoxämie mit einer Erhöhung des Blutflusses zu reagieren (JELLYMAN et al. 2004). Weiterhin sollen chronische Veränderungen im maternalen Kortikosteroidspiegel sowohl den uterinen Blutfluss als auch das plazentare und fetale Wachstum beeinflussen (JENSEN et al. 2005). So war der Blutfluss bei den mit Dexamethason (1 mg/kg/Tag von Tag 120 bis 130 der Gravidität) behandelten Mutterschafen am Tag 130 der Trächtigkeit höher als in der unbehandelten Kontrollgruppe (2000 ml/min vs. 1750 ml/min). Die Autoren vermuten hier eine positive Korrelation zwischen der Konzentration von Kortikosteroiden und der endothelialen Nitritoxid-Synthase, welche die Vasodilatation im uterinen Gefäßsystem bestimmt (BURD et al. 1976; JENSEN et al. 2005). Stickstoffmonoxid (NO), welches aus L-Arginin durch die Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS) synthetisiert wird, ist als Schlüsselregulator der plazentaren Angiogenese während der Gravidität bekannt (FARINA et al. 2001; KWON et al. 2004). Es existieren drei Isoformen der Stickstoffmonoxid-Synthase: die neuronale NOS (nNOS oder Typ I), die induzierbare NOS (iNOS oder Typ II) und die endotheliale NOS (eNOS oder Typ III) (KWON et al. 2004). An Ratten konnte gezeigt werden, dass vor allem iNOS und eNOS im tragenden Uterus präsent sind, während nNOS nicht nachgewiesen werden konnte (FARINA et al. 2001). Die höchste Syntheserate von Stickstoffmonoxid in der Plazenta und im Endometrium konnte bei Schafen in der ersten Hälfte der Gravidität festgestellt werden (KWON et al. 2004). Ein zweiter Gipfel erfolgte zeitgleich mit dem Ansteigen des feto-plazentaren Blutflusses in der späten Trächtigkeit und spielt daher vermutlich eine wichtige Rolle in der Zunahme des Nährstoff- und Sauerstoffaustausches zwischen fetalem und maternalen Blut. NO ist somit bei Schafen ein Hauptmediator im plazento-fetalen Blutfluss während 15 LITERATURÜBERSICHT der Trächtigkeit (ROSENFELD et al. 1996). Allerdings vermuten die Autoren, dass Estradiol-17ß, ebenfalls ein potenter Vasodilatator, hauptsächlich für das Ansteigen des uterinen Blutflusses im Laufe der Gravidität verantwortlich ist bzw., dass beide Mediatoren bei der Regulation des feto-maternalen Blutflusses eng zusammenspielen. Dies deckt sich mit Studien, die zeigen konnten, dass plazentare Blutgefäße auch direkt von Steroidhormonen beeinflusst werden können, was vermuten lässt, dass sowohl Östrogene, als auch Glukokortikoide an der Regulation des Blutflusses beteiligt sind (WELCH et al. 1977; DERKS et al. 1997; BOOS et al. 2000). Der graduelle Anstieg des fetalen Kortisols im letzten Trächtigkeitsmonat und vor allem in den letzten Tagen vor der Geburt scheint somit für die Plazentareifung und den Abgang der Nachgeburt von entscheidender Bedeutung zu sein. So wird vermutet, dass die vor allem im letzten Drittel der Trächtigkeit ansteigende Expression von Glukokortikoidrezeptoren in den Kryptenepithelzellen, in den maternalen Diplokaryozyten und im interplazentaren uterinen Gewebe, den Beginn der Geburt und den sich anschließenden physiologischen Abgang der Nachgeburt anzeigen (Boos 2000). Diese Hypothese wird zudem gestützt durch die signifikante Abnahme von Nachgeburtsverhaltungen, wenn langwirkende Kortikosteroidpräparate zur Geburtseinleitung bei der Kuh verwendet werden (WELCH et al. 1973; DISKIN et al. 1982; BO et al. 1992). So wurden in einer Studie 85 Tiere am Tag 270 der Gravidität mit einem Langzeitkortikosteroid (Dexamethason Trimethylacetat, 1 mg/25 bzw. 50 kg KGW) prämediziert und erhielten sieben Tage später eine hohe Dosis Dexamethason (25 mg/kg i.m), mit der die eigentliche Geburt eingeleitet wurde. Die Studie ergab eine deutliche Senkung an Nachgeburtsverhaltungen (13 % vs. 79 %) (BO et al. 1992). Der Vorteil einer Kombination eines langwirkenden Kortikosteroids mit einem einige Tage später applizierten hoch dosierten kurzwirkenden Kortikosteroids liegt in der Nachahmung der natürlichen geburtsvorbereitenden Maßnahmen der Kuh, einschließlich der Relaxation der Beckenbänder und der Dilatation der Zervix und des Geburtskanals (DISKIN et al. 1982). Zudem konnte gezeigt werden, dass mithilfe dieser Einleitungsmethode eine bessere Vorhersagbarkeit des Geburtszeitraumes möglich ist (BO et al. 1992). Die Inzidenz von Nachgeburtsverhaltungen 16 LITERATURÜBERSICHT war in den Studien umso niedriger, je länger das Intervall zwischen Prämedikation mit einem Langzeitkortikosteroid und der eigentlichen Geburtseinleitung war (4 bzw. 6 Tage). Erklärt wurde dies mit einer besseren endokrinologischen Vorbereitung der Kühe (BO et al. 1992). Da in der EU aufgrund der Gefahr systemischer Nebenwirkungen langzeitwirkende Kortikosteroide bei lebensmittelliefernden Tieren nicht zugelassen sind, muss man auf ein Alternativschema zurückgreifen. Eine mögliche Variante stellt die Frühgeburtseinleitung nach ZERBE (2008) dar. Sie wurde entwickelt, um die Lungenreife des Kalbes bei indikationsbezogener Geburtseinleitung zu stimulieren. Das Prinzip der Methode beruht in der ersten Phase auf wiederholten Gaben von Dexamethason über mehrere Tage in vergleichsweise niedriger Dosierung, die zur Reifung der fetalen Lunge beitragen, jedoch in der Regel nicht zur Geburtsinduktion führen. In der zweiten Phase wird die Dexamethason Dosierung gesteigert, um die Geburt einzuleiten (ZERBE 2008). Untersuchungen zur Plazentareifung und den Abgang der Nachgeburt bei dieser Form der protrahierten Geburtseinleitung, sind beim Rind bislang nicht durchgeführt worden. 17 MATERIAL UND METHODEN 3. Material und Methoden 3.1 Tiere Die Untersuchungen wurden an primi- und pluriparen klinisch gesunden Kühen der Rasse Holstein Friesian (n = 24), Deutsche Schwarzbunte (n = 8), Deutsche Rotbunte (n = 1) und Deutsches Fleckvieh (n = 1) auf dem Versuchsgut des Friedrich-Löffler-Institutes in Mariensee, Niedersachsen, zwischen Juni 2007 and Dezember 2008 durchgeführt. Die Tiere waren 3,2 ± 1,2 (xmin - xmax 2,0 - 8,0) Jahre alt und hatten eine Abkalbungsrate von 1,7 ± 1,0 (xmin - xmax 1.0 - 5.0). Zwölf Tage vor dem errechneten Abkalbetermin (280. Tag der Gravidität) wurden die Tiere in Tiefstreuställe verbracht und mit einer gemischten Ration aus Getreide, Gras- und Maissilage und einem Mineralfutter gefüttert. Zugang zu frischem Wasser war unbegrenzt möglich. 3.2 Versuchsaufbau Nach dem Zufallsprinzip wurden die Kühe in drei Gruppen eingeteilt: Tiere, bei welchen eine protrahierte Geburtseinleitung durchgeführt wurde (PIP, n = 13), Tiere mit konventioneller Geburtseinleitung (SIP, n = 10) und eine nicht behandelte Kontrollgruppe (SPON, n = 11). Der Gruppe PIP wurden ab Tag 268 der Trächtigkeit zweimal täglich über sechs Tage 1,3 mg Dexamethason (Dexamethason-Lösung®, cppharma, Burgdorf, Germany) i.m. verabreicht. Am Tag 274 erhielten sie 40 mg Dexamethason i.m. zur Geburtseinleitung. Die Gruppe SIP erhielt am Tag 274 der Trächtigkeit eine einmalige Dosis von 40 mg Dexamethason i.m. zur Einleitung der Geburt. Die Kontrollgruppe kalbte spontan ohne Behandlung (Figure 4). Alle vier Stunden wurden die Tiere auf Anzeichen der bevorstehenden Geburt kontrolliert. Sofern zwei Stunden nach den ersten Geburtsanzeichen kein Voranschreiten des Geburtsverlaufes zu erkennen war, wurde eine vaginale Untersuchung durchgeführt, um die Lage, Stellung und Haltung sowie die Größe des 18 MATERIAL UND METHODEN Kalbes zu überprüfen. Abhängig von der vaginalen Befunderhebung wurde daraufhin Geburtshilfe geleistet. Die neugeborenen Kälber wurden als vital eingestuft, wenn sie in der Lage waren, in den ersten zwei Lebensstunden zu Stehen und zu Trinken. Von 23 Kälbern konnte das Geschlecht und das Gewicht festgehalten werden. Abhängig vom Nachgeburtsabgang, welcher festgelegt innerhalb von 12 Stunden post partum erfolgen sollte, wurden die Tiere als Kühe mit Nachgeburtsabgang (REL) oder Kühe mit Nachgeburtsverhaltung (RET) bezeichnet. Bei allen Tieren mit Nachgeburtsverhaltung entwickelte sich in den Folgetagen eine Metritis, welche nach den von SHELDON et al. (2009) erstellten Kriterien in die Grade I, II oder III eingestuft wurden. Die betroffenen Tiere wurden über fünf Tage mit 1,0 mg/kg KG Ceftiofur (Excenel® RTU, Pfizer AG, Zürich, Swiss) s.c. behandelt und täglich hinsichtlich des Abgangs der Eihäute kontrolliert. 3.3 Probennahme und -fixation Von insgesamt 26 Tieren wurden innerhalb von zwei Stunden post partum zwei Plazentome mit dem Effeminator nach Reisinger, modifiziert nach Richter (Fa. Hauptner, Solingen, Germany), transvaginal aus dem Uterus entnommen. Die gewonnenen Plazentome wurden senkrecht in schmale Scheiben von 1,0 x 1,0 x 0,5 cm geschnitten, in neutralem, phosohatgepufferten 4 %igen Formaldehyd nach LILLIE (1976) für 24 Stunden fixiert und anschließend mithilfe eines Einbettautomaten (Tissue-Tek III, Shandon, Pittsburgh, PA, USA) in Paraplast Plus ® (Shandon, Pittsburgh, PA, USA) eingebettet. 3.4 Histologie und Immunhistochemie Von 26 Tieren (SPON, n = 8; SIP, n = 8; PIP, n = 10) konnten für die histologischen und immunhistologischen Untersuchungen im Institut der Pathologie der Stiftung Tierärztlichen Hochschule Hannover je zwei Paraffinblöcke (n = 52) angefertigt werden. Mit Hilfe eines Schlittenmikrotoms wurden anschließend im Anatomischen Institut der Stiftung Tierärztlichen Hochschule Hannover 5 µm dicke Serienschnitte 19 MATERIAL UND METHODEN angefertigt, von denen mit einer Trichromfärbung nach Masson (Anhang 1) zunächst histologische Übersichtsfärbungen angefertigt wurden. Für die immunhistochemischen Untersuchungen wurden die Paraffinschnitte bei 37 ºC über Nacht getrocknet, in Xylol entparaffiniert und in einer Alkoholreihe bei Zimmertemperatur rehydratisiert. Alle Inkubationsschritte erfolgten in einer feuchten Kammer. Die Verdünnungen der Erstantikörper erfolgte mit PBS (0.1 M, pH 7.2) und 1 %igem bovinen Serumalbumin. Nach Hemmung der endogenen Peroxidase mit 4 %igem Wasserstoffperoxid in 80 %igem Alkohol wurden die Schnitte mit PBS gespült und für 20 Minuten mit inaktiviertem Ziegen-Normalserum überschichtet, um unspezifische Bindungen zu blockieren. Anschließend wurde der verdünnte Erstantikörper aufgetragen und die Schnitte bei 4°C über Nacht im Kühlschrank inkubiert. Zur Visualisierung der immunhistochemischen Färbungen wurden die Schnitte für 45 Minuten mit dem Zweitantikörper EnVision-Kaninchen (Dako REAL EnVision Detection System, Glostrup, Denmark) bei Zimmertemperatur inkubiert, mit PBS gespült (3 x 5 min) und mit Diaminobenzidin (DAB) Chromogensubstrat (Dako REAL EnVision Detection System, Glostrup, Denmark) gefärbt. Nach anschließender Spülung mit PBS (5 min) und Leitungswasser (10 min) wurden die Schnittpräparate zur Gegenfärbung für 30 Sekunden in Hämatoxylin getaucht. Abschließend wurden die Schnitte mit Eukitt® (Kindler GmbH & Co., Freiburg, Germany) eingedeckelt. Für eine eindeutige Identifizierung des maternalen Kryptenepithels und des Chorionepithels wurde der Erstantikörper Pan-Cytokeratin Antikörper CK102 mit den Klonen AE1 und AE3 (Bioprime, DNA Labeling System, Gibco BRL Grand Island, NY, USA, CK102) in einer Verdünnung von 1:100 verwendet (Anhang 2). AE1 und AE3 sind Maus IgG1-Antikörper, welche immunogen gegen humane epitheliale Keratine wirken. Apoptotische Zellen wurden mit Hilfe eines polyklonalen Kaninchen-Antikörpers gegen ein Peptid des p17-Fragmentes der humanen Caspase-3 (Abcam, Cambridge, MA, USA, ab4051) ermittelt. Der Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:50 bei Zimmertemperatur verwendet (Anhang 3). 20 MATERIAL UND METHODEN Zum Nachweis der induzierten Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) wurde ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen den N-terminus von iNOS (Millipore, Billerica, MA, USA, 06-573) in einer Verdünnung von 1:500 verwendet (Anhang 4). Für die endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS) diente ebenfalls ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper (Alpha Diagnostic, San Antonio, TX, USA, ENOS32-A), der gegen das bovine eNOS32-P-Peptid gerichtet war und in einer Verdünnung von 1:2000 bei Zimmertemperatur aufgetragen wurde (Anhang 4). Für das vasokonstriktorische Peptid Endothelin-1 (ET-1) wurde ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper (Biologo, Kronshagen, Germany, EDN001) in einer Verdünnung von 1:300 gegen das bovine ET-1 verwendet (Anhang 5). Um die Existenz unspezifischer Bindungen beurteilen zu können, wurden Negativkontrollen durchgeführt. Statt des Erstantikörpers wurde hierfür inaktiviertes Ziegen-Normalserum verdünnt mit PBS und 1%igem bovinen Serumalbumin eingesetzt. 3.5 Auswertung mittels Lichtmikroskopie Insgesamt konnten pro histologische und immunhistologische Färbung 49 Plazentomschnitte angefertigt und ausgewertet werden. Die Übersichtsfärbung mit Masson’s Trichrom und die immunhistochemisch gefärbten Präparate wurden mit einem Olympus Lichtmikroskop BX51, ausgestattet mit einer Olympus DP72 Digitalkamera (Olympus Europa GmbH, Hamburg, Germany) untersucht. Nach ihrer Morphologie wurden die Schnitte anhand der von SCHOON (1989) beschriebenen Kriterien in drei Klassen eingeteilt: reife Plazenta, unreife Plazenta und eine Mischform mit reifen und unreifen Anteilen in einem Präparat. Die Klassifizierung erfolgte durch eine Person (D.H.), die gegenüber der Gruppeneinteilung geblindet war. Um den Anteil an Caspase-3 positiven Zellen pro Präparat zu bestimmen, wurde in zwölf definierten Schnittlokalisationen pro Objektträger in 200facher Vergrößerung die immunopositive braune Färbung mithilfe eines speziellen Bildanalyseprogramms 21 MATERIAL UND METHODEN (Olympus, analySIS® Soft Imaging System 3.2, Hamburg, Germany) quantifiziert. Aus der ermittelten Gesamtzahl positiver Zellen wurde der Median gebildet. 3.6 Ultrasonographische Untersuchungen Für die transrektalen farbdopplersonographischen Untersuchungen erhielten die Tiere 10 Minuten vor der Untersuchung 70 mg Procainhydochlorid (Procasel 2%®; Selectavet, Weyarn-Holzolling, Germany) epidural, um rektale Kontraktionen zu minimieren. Die Untersuchungen erfolgen an den contra- und ipsilateral zum Fetus gelegenen Arteriae uterinae mit Hilfe eines Ultraschallgerätes (Toshiba SSH 370A, Toshiba Co., Tokyo, Japan), welches mit einer 7,5 MHz Mikrokonvexsonde ausgestattet war. Die Untersuchungen dauerten im Durchschnitt 30 Minuten pro Tier und wurden immer von derselben Person (D.H.) zur gleichen Tageszeit (zwischen 8 und 11 Uhr) durchgeführt. Die Blutflussmessungen wurden nach der von BAUMGARTNER (1998) beschriebenen Methode durchgeführt. Die Arteria uterina wurde so angeschnitten, dass die Ultraschallwellen in einem Winkel zwischen 20° und 60° zum Blutstrom auftrafen. Aufgezeichnet wurden die Videosequenzen mit Hilfe eines DVD-Rekorders (DVRW260S; Sharp Electronics, Hamburg, Germany) und zur weiteren Bearbeitung auf einen Computer übertragen. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe der Software Pixelflux (Chameleon-Software, Leipzig, Germany). Dafür wurden zwei aufeinanderfolgende, möglichst ähnliche Dopplerwellen herangezogen mit maximalem Verhältnis der Diastole zur Systole. Es wurde jeweils der Mittelwert aus den Werten beider Dopplerwellen berechnet. Nach jeder Blutflussmessung wurde der Durchmesser des Gefäßes bestimmt, indem der Mittelwert aus drei hintereinender durchgeführten Messungen berechnet wurde. Das Blutflussvolumen (blood flow volume = BFV) wurde aus der mittleren maximalen Frequenzverschiebung über den Herzzyklus (time averaged maximum frequency shift = TAMF) und dem Gefäßdurchmesser (D) nach folgender Formel bestimmt: BFV (mL/min) = TAMV (cm/min) x (D/2 (cm))² x π. Der Resistance Index (RI) wurde aus dem Quotienten der Differenz zwischen maximaler systolischer 22 MATERIAL UND METHODEN Frequenz-verschiebung (PSF) und enddiastolischer Frequenz-verschiebung (EDF) zu PSF bestimmt: RI = (PSF - EDF) / PSF (Figure 5). 3.7 Plasmagewinnung und hormonanalytische Untersuchung Zur Bestimmung des Gehaltes an Progesteron (P4), Gesamtestrogen (Etot) und Kortisol im Blutplasma wurde den Kühen nach jeder Ultraschalluntersuchung eine Blutprobe aus der A./V. sacralis mediana entnommen. Zur Plasmagewinnung wurde die Probe innerhalb von 20 Minuten nach der Entnahme für 10 Minuten bei 4000 x g zentrifugiert und bis zur Analyse bei -20 ºC gelagert. Die Hormonanalytischen Untersuchungen wurden im Endokrinologischen Labor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt. Die Progesteronkonzentration im Blutplasma wurde mittels eines sequenziellen kompetitiven Immunoassays (IMMULITE® 1000; Siemens, Los Angeles, USA) bestimmt. Dieser wies eine Sensitivität von 0,6 nmol/L auf. Es wurden Intra- und Interassay-Varianzen von 16,0 %, 8,1 % und 6,3 % für Kontrollsera mit niedrigen (< 1 ng/mL), mittleren (4 ng/mL), und hohen (8 ng/mL) Progesteronkonzentrationen ermittelt. Die Bestimmung des Gesamtestrogengehalts im Blutplasma erfolgte in Doppelbestimmungen nach der von MEYER et al. (1990) beschriebenen Methode mittels Enzym-Immoassay. Für die Analyse wurde ein Antikörper (Antigen: Estradiol17β-Hemisuccinat bovines Serumalbumin) verwendet, welcher mit Estradiol-17β (100%), Estron (100%) und Estradiol-17α (66%) reagiert und mit Estradiol-17βHemisuccinat Meerrettichperoxidase kombiniert wurde. Die Nachweisgrenze lag bei 8,0 pg/mL und die Intra- und Interassay-Varianzen bei < 10 % bzw. < 12 %. Die Kortisolkonzentration im Blutplasma wurde mittels eines kompetitiven Festphasen Chemilumineszenz-Immunoassays (IMMULITE® 1000; Siemens, Los Angeles, USA) mit einer Nachweisgrenze von 5,5 nmol/L bestimmt. Es wurden Intraund Interassay-Varianzen von < 8,8 % und < 10 % ermittelt. Laut Herstellerangaben gibt es keine Kreuzreaktionen zwischen dem Kortisol im Blutplasma und Dexamethason. 23 MATERIAL UND METHODEN 3.8 Statistische Auswertungen Die statistische Auswertung wurde mit Hilfe der Programme SAS 9.1 (SAS Institute Inc., Cary/North Carolina, USA, 1988) und StatView Version 5.0 (SAS Institute Inc., Cary, North Carolina, USA) durchgeführt. Die Daten wurden mit dem Shapiro-WilkTest positiv auf Normalverteilung getestet und als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt. Die Werte für BFV, RI und die Hormonkonzentrationen wurden mit Hilfe des Student’s t-Test sowohl zwischen den Gruppen als auch zwischen den einzelnen Tagen miteinander verglichen. Auch Unterschiede hinsichtlich der Anzahl an Caspase-3 positiven Zellen und Unterschiede in den BFV - und RI - Werten zwischen den uterinen Arterien ipsi- und contralateral zum Fetus und zwischen Tieren mit bzw. ohne Nachgeburtsverhaltung wurden mittels Student’s t-Test auf Signifikanz untersucht. Die Beziehung zwischen BFV und RI, und zwischen BFV, RI und dem Geburtsgewicht der Kälber wurde mittels Pearson Korrelation ermittelt. Ergebnisse mit Korrelationskoeffizienten (r) von ≤ 0,20 wurden als sehr geringe Zusammenhänge zwischen zwei Parametern gewertet, jene von 0,21 bis 0,50 wurden als geringe Beziehungen interpretiert, jene von 0,51 bis 0,80 indizierten mittelgradige Zusammenhänge und jene über 0,81 gute Zusammenhänge. Es waren nur die Korrelationskoeffizienten von Interesse, die statistisch signifikant waren. Ergebnisse mit P ≤ 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. 24 CHAPTER 1 4. Chapter 1: Protracted induction of parturition enhances placental maturation, but does not influence incidence of placental retention in cows D. Hartmann¹*, H. Bollwein¹, Ä. Honnens¹, D. Rath³, H. Niemann³, C. Pfarrer² ¹Clinic for Cattle, University of Veterinary Medicine Hannover, Germany ²Department of Anatomy, University of Veterinary Medicine Hannover, Germany ³Institute of Farm Animal Genetics, Friedrich-Loeffler-Institute, Mariensee, Germany 4.1 Abstract As the etiopathology of retained placenta is still not resolved in cattle, we compared the effects of protracted and conventional induction of parturition on placental maturation and the occurrence of retained placenta. Protracted induction of labor (PIP) was precipitated in 13 cows by administration of 1.3 mg dexamethasone i.m. twice daily between Days 268 and 273 of gestation, and 40 mg dexamethasone i.m. on Day 274 of gestation. For conventional induction of labor (SIP), 10 cows received 40 mg dexamethasone on Day 274 of gestation. A third group (SPON, n = 11) served as a non treated control group. Within two hours after birth, two placentomes were extracted from the uterus and used for assessment of placental maturation by histology and immunohistochemistry. Incidence of retained placenta was lower (P < 0.05) in group SPON (9 %) compared to group PIP (54 %) and SIP (70 %). Staining with Masson-trichrome and pan-cytokeratin indicated a higher degree of atrophy and flatness of the maternal crypt epithelium in cows without retained placentae (REL) compared to cows with retained placentae (RET). Staining with anti-caspase-3 ratified the observations as more apoptotic cells were detected in group SPON and 25 CHAPTER 1 PIP compared with group SIP, however data were not statistically significant. To test the hypothesis of ‘functional’ placenta maturation, the expressions of the potent vasodilators endothelial (eNOS) and inducible (iNOS) nitric oxide synthase were evaluated. Both, eNOS and iNOS, were only expressed in chorionic tissue. Endothelin-1 (ET-1) as main vasoconstrictor showed a positive staining in maternal crypt epithelium as well as in chorionic epithelium. No differences (P > 0.05) were found for both NOS as well as ET-1 neither among the experimental groups nor between RET and REL cows. These findings indicate that a protracted induction of parturition results in a better placental maturation, but does not influence the incidence of placental retention. Key Words: placental retention; placental maturation, induction of parturition, dexamethasone; cattle *Address for Correspondence: desiree.hartmann@tiho-hannover.de 4.2 Introduction Retention of fetal membranes is still a common problem in dairy cattle which negatively affects fertility and reproduction (GRUNERT et al. 1976; PELISSIER 1976; WILLIAMS et al. 1987; LAVEN and PETERS 1996; PETERS and LAVEN 1996; MCNAUGHTON and MURRAY 2009). Approximately five to ten per cent of dairy cows suffer from placental retention (PELISSIER 1976; MCNAUGHTON and MURRAY 2009). If induction of parturition is indicated for medical and/or economical reasons, the incidence of retained placenta increases even further to 80 - 95 per cent (GRUNERT et al. 1976; PELISSIER 1976). Although there are many studies concerning retained placentae in cows, the etiology and pathogenesis of this problem are not fully understood. Many factors have been implicated in the development of placental retention, all of them leading to/involving an incomplete placental maturation (WOICKE et al. 1986; BOOS et al. 2003). The 26 CHAPTER 1 maturation of the bovine placenta is usually completed three to five days before parturition (WOICKE et al. 1986). Histologically, it is characterised by flattening of the maternal crypt epithelium and a decrease in height and number of these cells (BJORKMAN 1969; WOICKE et al. 1986). Furthermore, an increase in the number of apoptotic cells in maternal and fetal epithelial cells is found during the maturation process (BJORKMAN 1954; WOICKE et al. 1986; WILLIAMS et al. 1987; BOOS et al. 2003). Additionally, placental separation might be facilitated by alternating ischemic and hyperaemic conditions within the placentomes based on impaired attachment of fetal and maternal adherence (GRUNERT 1986). Glucocorticoids have been identified to play a central role in the placental maturation process (BO et al. 1992; BOOS et al. 2000). As fetal cortisol levels gradually increase in the course of pregnancy, placental maturation seems to require exposure to elevated cortisol levels prior to calving (BO et al. 1992). Conventional methods of induction of parturition, involving a single application of corticosteroids in the attempt to mimic the natural endocrine events, result in an incomplete placental maturation and therefore in a high incidence of retained placentae (BEARDSLEY et al. 1974; WELCH et al. 1977; WILHELM 1989; SCHULZ 1990). Several attempts to modify the induction schedule had no significant effect on placental maturation (BEARDSLEY et al. 1974; BARTH et al. 1978; DISKIN et al. 1982; CLAYDON 1984). The first promising results in relation to reduce the incidence of retained placentae came from New Zealand (WELCH et al. 1973). These authors demonstrated that a pretreatment with long-acting corticosteroids had a positive effect on placental release. However, the laws in the European Union prohibit the exogenous application of long-acting corticosteroids in food animals. As an alternative, the injection of low dosages of short-acting corticosteroids for several days followed by a single application of a high dosage of this hormone has been proposed (ZERBE 2008). In the present study a conventional (single high dose of glucocorticoids) and a protracted (repeated applications of low doses of glucocorticoids followed by a single high dose of glucocorticoids) induction of parturition were compared to determine whether or not repeated applications of low dosages of short-acting corticosteroids for several days result in an improved placental maturation and therefore in a 27 CHAPTER 1 reduced incidence of retained placentae in cows. Placental maturation was assessed histologically and by immunohistochemistry with markers for epithelial cells, apoptosis, vasodilators and vasoconstrictors. 4.3 Material and Methods 4.3.1 Experimental Design Twenty-four Holstein Friesian, eight German Black Pied, one German Fleckvieh and one Red Holstein cow were used in this study between June 2007 and December 2008. Cows were 3.2 ± 1.2 years old (range, 2 to 8), with a parity of 1.7 ± 1.0 (range, 1 to 5). These 34 animals with known breeding dates (Day 0 = day of insemination) were randomly selected for a protracted induction of parturition (PIP, n = 13) and a conventional induction of parturition (SIP, n = 10), while the remaining 11 cows served as the non treated controls (SPON). On Day 268 of gestation group PIP received 1.3 mg dexamethasone (Dexamethason®, cp-pharma, Burgdorf, Germany) i.m. twice a day for six days. On Day 274, 40 mg dexamethasone i.m. for induction of labor was administered. Group SIP received only a single injection of 40 mg dexamethasone i.m. on Day 274 for birth induction. The control group calved spontaneously without any treatments. Within two hours after birth, two placentomes were extracted from the uterus and used for assessment of placental maturation by histology and immunohistochemistry. The end point variables recorded were the date of parturition, interval from calving to placental release and incidence of placental retention. Cows that expelled the placenta within the first 12 hours were defined as cows with released placentae (REL). Cows that had not expelled their placenta within the first 12 hours after calving were defined as cows with a retained placenta (RET) and were treated every 24 hours with 1.0 mg Ceftiofur per kg body weight s.c. (Excenel® RTU, Pfizer AG, Zürich, Swiss) for five days. In the following days time of separation of the placenta in RET cows was controlled daily and recorded. 28 CHAPTER 1 Treatment of the cows and removal of placentomes after birth was approved by the local authority (LAVES Az: 33.9-42502-04-07/1394). 4.3.2 Tissue sampling and fixation Within two hours after birth two placentomes were collected per vaginam by an effeminator according to Richter, modified by Reisinger (Hauptner, Solingen, Germany). The collected placentomes were cut into radial slices, which were further cut into small pieces of about 1.0 x 1.0 x 0.5 cm. The specimens were immersed in 4 % neutral phosphate-buffered formaldehyde solution according to LILLIE (1976) for 24 hours and afterwards embedded in Paraplast Plus ® (Shandon, Pittsburgh, PA, USA) using a tissue embedding machine (Tissue-Tek III, from Shandon, Pittsburgh, PA, USA). 4.3.3 Histology and Immunohistochemistry For histology and immunohistochemistry, sections with a thickness of about 5 µm were produced from a total of 26 cows (CON, n = 8; SIP, n = 8; PIP, n = 10). The sections were stained with Masson´s trichrome. For immunohistochemical examinations paraffin sections were dried at 37 º C overnight, deparaffinized in xylene and rehydrated in a series of graded alcohols at room temperature. All incubation steps were performed in a moist chamber and all dilutions were carried out with self-made PBS (0.1 M, pH 7.2). After quenching the activity of endogenous peroxidase with 4 % H2O2 in 80 % alcohol for 30 min the sections were rinsed and incubated with normal goat serum for 20 min at room temperature in order to block unspecific binding sites. After draining of the blocking serum the slides were incubated with the primary antibody at 4 º C overnight. For visualisation of the immunostaining, the sections were incubated with EnVision rabbit (Dako REAL EnVision Detection System, Glostrup, Denmark) at room temperature for 45 min, rinsed with PBS (3 x 5 min) and stained with diaminobenzidine (DAB) chromogenic substrate (Dako REAL EnVision Detection 29 CHAPTER 1 System, Glostrup, Denmark). Finally, the sections were rinsed in PBS and tap water and counterstained with hematoxylin for 30 seconds. For Cytokeratin detection a Pan-Cytokeratin antibody, consisting of clones AE1 and AE3 (Bioprime, DNA Labeling System, Gibco BRL Grand Island, NY, USA, CK102) were used as primary antibody in a dilution of 1:100 to identify maternal crypt epithelium and chorionic epithelium respectively. AE1 and AE3 are murine IgG1 antibodies elicited against human epithelial keratins. Apoptotic cells were identified by a rabbit polyclonal antibody in a dilution of 1:50 against Caspase 3, elicited against recombinant full length of human protein (Abcam, Cambridge, MA, USA, ab4051). To localise inducible nitric oxide synthase (iNOS) a polyclonal rabbit antibody against the N-terminus of murine iNOS in a dilution of 1:500 (Millipore, Billerica, MA, USA, 06-573) was used. Endothelial nitric oxide synthase (eNOS) was localised by a rabbit anti-bovine eNOS IgG antibody in a dilution of 1:2000 (Alpha diagnostic, San Antonio, TX, USA, ENOS 32-A). The vasoconstrictor Endothelin-1 (ET-1) was detected in placental tissue, using a primary polyclonal rabbit antibody in a dilution of 1:300 (Biologo, Kronshagen, Germany, EDN001). Negative controls were set up with the antibody diluent instead of the primary antibodies. 4.3.4 Light Microscopy Massons´s trichrome stained sections and all immunohistochemistry stainings were evaluated using an Olympus light microscope BX51 equipped with Olympus DP72 Digital Camera (Olympus Europa GmbH, Hamburg, Germany). They were assigned into three classes according to SCHOON (1989): mature placenta, immature placenta and a hybrid form with mature and immature parts in one section. The classification was done by one person (D. H.) who was blinded to the animals. For Caspase-3 in each section (n = 52) the immunopositive brown staining of 12 defined images was quantified for particle size (200x magnification), using analySIS® Soft Imaging System 3.2 (Build 635, Olympus Europa GmbH, Hamburg, Germany). 30 CHAPTER 1 4.3.5 Statistical analysis Statistical analysis for immunopositive brown staining of Caspase-3 was carried out using SAS® computer program (SAS Inst. Inc., Version 9.1, Cary, NC). Means ± SD were calculated for all measurements (PROC MEANS). For comparison between the experimental groups and between RET and REL data were subjected to Student´s t - test. Incidence of retained placentae was compared between groups using Chi square distribution. Differences were considered statistically significant when P values were ≤ 0.05. 4.4 Results 4.4.1 Clinical findings Cows of group SPON showed a gestation length of 282 ± 4.1 days (range 278 to 289 days, n = 11). Group SIP had a gestation length of 276 ± 0.4 days (range 276 to 277 days; n = 10) and calved 30 to 70 (46.2 ± 6.9) hours after the injection of 40 mg dexamethasone. Cows of group PIP showed a gestation length of 275 ± 0.95 days (range 272 to 276 days, n = 13). Out of these, nine cows calved between 24 and 36 (27.9 ± 4.8) hours after the last injection of 40 mg dexamethasone. Three cows calved before the last injection of 40 mg dexamethasone was given between Day 272 and 274 and one cow calved on Day 276. Obstetrical assistance was required in two cows of groups SPON, SIP, and PIP, respectively. Four cows (SPON: 1, SIP: 2, PIP: 1) needed slight (traction force of one person) and one cow (SPON) tight assistance (traction force of two people). In one cow (PIP), the position of the calf with the head tucked back had to be corrected. One out of 11 cows in group SPON (9 %), seven out of 10 (70 %) in group SIP and seven out of 13 cows (54 %) in group PIP had retained placentae. Incidence of retained placenta was significantly lower in group SPON compared with group PIP and SIP (P < 0.05). No differences (P > 0.05) were found between group PIP and 31 CHAPTER 1 SIP. Separation of the placenta in RET cows occurred 3 to 8 days after parturition. All cows with RET showed a metritis of grade I as defined by SHELDON et al. (2009). In group SPON two calves died, one during the calving process because of a prolonged and difficult labor (traction force of two people for more than 30 minutes) and one was already dead, when the cow was examined to check the presentation of the calf in the birth canal. In groups SIP and PIP no calf died, but two and one, respectively, needed nursing assistance. At birth, ten of the weighted calves were male (m) and 13 female (f). The average birth weight was 42.5 ± 3.9 kg, while the male calves were heavier than females (range 36 to 52 kg; m: 44.5 ± 3.8, f: 41.1 ± 3.4, P < 0.05). Birth weight of calves in group SPON (39.1 ± 1.0; m = 1, f = 4) was lower (P < 0.05) compared with calves in groups SIP (42.7 ± 3.3; m = 6, f = 2) and PIP (44.2 ± 4.3; m = 3, f = 7), respectively. 4.4.2 Placental Histology (Masson´s Trichrome staining) Eighteen of 49 analyzable sections were assigned to/identified as a mature placenta form, with obvious signs of loosening of the fetomaternal adherence. In addition, most of the maternal crypt epithelium appeared flattened or was partly inconsistent (Fig.1 A). In 18 of 49 sections, the placentae were clearly immature as the cotyledonary villous trophoblast cells were in intimate contact with an intact maternal caruncular epithelium (Fig.1 B). Thirteen of 49 sections had a hybrid placenta form, where both forms appeared aside each other. Decoding of the assigned sections revealed that most of the sections (68 %) from animals of group SPON were classified into the mature form, whereas most of the SIP cows had an immature placental structure (71 %). Cows of group PIP predominantly had a hybrid form (42 %) (Fig. 3). Sixty-seven percent of cows with RET had an immature placenta, eight percent a mature placenta and 25 % showed a hybrid form. In REL cows, 66 % had a mature placenta, 21 % an immature and 14 % a hybrid placenta form. 32 CHAPTER 1 4.4.3 Height of Maternal Epithelium (Pan-Cytokeratin Immunohistochemistry) In tissue sections the intensity of the immunopositive brown staining differed between the chorionic and the maternal crypt epithelium, thus a clear identification of the maternal epithelium was possible (Fig.1 C and D). The assignment to mature and immature placentae coincided with the classification of the Masson trichrome sections. Sections, which were classified as mature in Masson trichrome staining, showed an almost flat and broad maternal crypt epithelium with partly atrophic areas (Fig. 1 C). Cows with an immature placenta showed an almost cuboidal maternal epithelium (Fig. 1 D). 4.4.4 Apoptosis (Caspase-3 Immunohistochemistry) In tissue sections Caspase-3 positive cells were found in the fetal and the maternal compartment and showed a brown staining which was mostly localised to the cytoplasm (Fig.1 E and F). In sections, which were classified as mature in Masson’s trichrome, a greater number of apoptotic cells was detected (Fig.1 E), whereas cows with an immature placenta showed only a few apoptotic areas (Fig.1 F). The quantification revealed that cows of the control group had a drift to higher numbers of apoptotic cells (2.31 ± 0.45 %) compared to the conventional induction group (1.68 ± 1.13 %), whereas cows with a protracted induction of birth showed numbers between the controls and the conventional induction group (1.93 ± 0.67 %). However, the differences were not statistically significant. No differences (P > 0.05) were seen in the number of apoptotic cells between REL and RET cows. 4.4.5 iNOS and eNOS in placental tissue Positive staining for iNOS and eNOS was detected in all three groups, but exclusively in fetal placental tissue (Fig. 2 A and B). No positive staining was present in maternal crypt epithelium and maternal stroma cells. Endothelial cells of blood vessels were 33 CHAPTER 1 also positive for eNOS, whereas they were negative for iNOS. No differences (P > 0.05) were found between the experimental groups and RET and REL cows. 4.4.6 Endothelin-1 (ET-1) in placental tissue In tissue sections a positive staining for ET-1 was found in maternal crypt epithelium as well as in chorionic epithelium (Fig. 2 C). No differences (P > 0.05) were found for ET-1 among the experimental groups nor between RET and REL cows. 4.5 Discussion For the first time we have shown that a protracted induction of parturition leads to an accelerated placental maturation if short acting corticosteroids are administered in short intervals over a period of six days. In our study 54 % of the group with protracted induction of parturition had a retained placenta compared to the group with conventional induction of birth with 70 % of retained fetal membranes. Parturition is normally induced by the release of cortisol from the fetus in the last month of gestation, particularly in the last week (GARVERICK et al. 1974; HUNTER et al. 1977). Cortisol stimulates the enzyme 17αhydroxylase in the fetal membranes to catalyze the conversion of progesterone to estrogens (MCDIARMID 1983; KINDAHL et al. 2004). It is recognized that the magnitude of the prepartum surge in estrogens greatly influences the placental maturation process (GRUNERT et al. 1989). Conventional induction of parturition by dexamethasone injection is thought to mimic the physiological mechanisms by which the fetus induces parturition. But it seems to have no effect on the incidence of retained placentae in cows (LAVOIE and MOODY 1973; SCHMITT et al. 1975). To obtain an improved placental separation fractionate doses of corticosteroids over three days followed by an injection of prostaglandin have been tested (WILHELM 1989). However, previous studies determined a minimum pretreatment time of five days with corticosteroids to obtain a positive effect on the seperation process 34 CHAPTER 1 (HUNTER et al. 1977; WELCH et al. 1977; DAVIS et al. 1979; CLAYDON 1984; BO et al. 1992). The delivery of the placenta post partum is a physiological process, involving the loss of fetomaternal adherence (BJORKMAN and SOLLEN 1960). This loss of adherence occurs only after the placentome has undergone a process of maturation, which is initiated several weeks before parturition and not completed until the last days before term (WOICKE et al. 1986). In the present study, the degree of bovine placental maturation, assessed by general histology and immunohistochemistry for pan-cytokeratin and caspase-3, was obvious by separation of fetal and maternal tissues, flattening and disappearance of maternal crypt epithelium, and abundance of apoptosis. Masson´s trichrome staining showed that most of the SPON and the PIP cows had a mature placenta with a flattened and discontinuous maternal crypt epithelium. This observation concurred to most of REL cows. In contrast most of the animals of the SIP and RET group showed an incomplete maturation. These observations were confirmed by an immunohistochemical staining with PanCytokeratin, which not only stained epithelial cells, but allowed also a clear differentiation between maternal crypt epithelium and chorionic epithelium. Maternal and fetal epithelial cells differed clearly in their staining intensity permitting an assessment of the cell height. Cytokeratins are a group of water soluble filament proteins, which are components of the cytoskeleton of epithelial cells and can be used to define different cell phenotypes (MOLL et al. 1982). Obviously, bovine maternal crypt epithelium and chorionic epithelium are characterized by a different composition of cytokeratins. It has been suggested before that the maturation process involves the flattening of the maternal crypt epithelium and a decrease in the number of maternal epithelial cells (HOLM et al. 1964; WOICKE et al. 1986). In the present study the extent of apoptosis between the experimental groups was evaluated semiquantitatively in caspase-3 immunohistochemically stained sections. No differences between REL and RET cows were found, but animals of Group SPON 35 CHAPTER 1 had an increased occurrence of apoptotic cells compared to Group PIP. Fewest apoptotic cell areas were found in cows of Group SIP. Normal pre-term maturation of the bovine placenta has also been associated with apoptosis within the maternal crypt as well as in the chorionic epithelium (BJORKMAN 1969; WILLIAMS et al. 1987; AL-SADI et al. 1994; BOOS et al. 2003). However earlier studies are partly contradictory in the occurrence of apoptotic and necrotic cells in placental tissues. Some studies found that placental necrosis was not directly related to normal placental separation of the fetal membranes from the maternal caruncle (WILLIAMS et al. 1987; AL-SADI et al. 1994). Others detected an increase in the number of apoptotic cells in maternal and fetal epithelium immediately after the expulsion of the fetus and correlated these observation with the placental maturation process (BJORKMAN 1969). Whereas BOOS et al. (2003) found more apoptotic cells in animals retaining their fetal membranes than in cows with placental release. Another cause of fetal membranes retainment is assumed to be the maintenance of blood pressure within the chorionic villi. Contractions of the uterine muscle leads to alternating hyperaemic and ischaemic conditions within the fetal villi (GRUNERT 1986). Thus the constantly changing uterine pressure after maturation impairs the feto-maternal junctions and seems to be of great importance for separation of the bovine placenta (LAVEN and PETERS 1996). For this reason we examined the presence of a vasoconstrictor as well as vasodilatators on the basis of immunohistochemistry investigations. In the present study antibodies against iNOS and eNOS were used to detect NO production in the bovine placenta in the last days of pregnancy. We found that iNOS and eNOS are expressed in all bovine placental tissue sections. But differences were found neither in the exhibition of iNOS and iNOS among the experimental groups nor between REL and RET cows. As expected eNOS staining was observed in the endothelium of any blood vessels, whereas iNOS was not expressed. Surprisingly, unlike in sheep where iNOS was localized in intercotyledonary chorioallantoic membrane and intercaruncular maternal endometrium and eNOS was present in 36 CHAPTER 1 cotyledonaryl and caruncular of the placentome as well as in intercotyledonary and intercaruncular placental tissue (ZHENG et al. 2000), positive staining for iNOS and eNOS was only detected in fetal placental tissue. This finding implicates that the fetal chorionic tissue of the bovine placenta has a more active part in placental vasodilatation than previously thought. Nitric oxide (NO) is a potent vasodilator and plays an active role in regulating placental function including reducing vascular tone during human (MONCADA et al. 1991) and ovine (ROSENFELD et al. 1996) pregnancy. Close to term NO-production was found to decrease in humans promoting effective contractions resulting in labor (MAUL et al. 2003). In the present study the localization of ET-1 peptide in bovine placentomes was described for the first time. ET-1 was found in maternal crypt epithelium as well as in chorionic epithelium. Like for iNOS and eNOS no differences in the expression of ET1 were found between the experimental groups or between REL and RET cows. Therefore ET-1 and NOS could not be correlated with placental maturation and placental retention, which is in accordance with previous studies (TAKAGI et al. 2002; TAKAGI et al. 2008). Endothelins are the counterparts to the vasodilatation system and belong to a family of vasoconstrictor peptides, mainly produced by endothelial cells of mammalian species (YANAGISAWA et al. 1988). ET-1 has been shown to be involved in the regulation of uterine and placental perfusion (THAETE et al. 2004) and in the stimulation of the uterine contraction during labor and delivery in rats (MCGOVERN et al. 1992). In bovine caruncles and cotyledons ET-1 mRNA is expressed during the entire pregnancy. However the authors found no correlation between ET-1 expression in placental tissues and placental retention (TAKAGI et al. 2008). The finding that vasoconstrictive ET-1 and vasodilatory iNOS and eNOS did not differ between the groups examined is corroborated/supported by results of parallel uterine blood flow studies, which showed no differences in blood flow volume and resistance index in the last days before parturition (Hartmann et al., unpublished data). 37 CHAPTER 1 In conclusion a protracted induction of parturition with repeated applications of low dosages of dexamethasone over six days as a pretreatment for a conventional induction treatment might mimic the physiological mechanisms by which the fetus induces parturition in cattle. This leads to a better cellular placental maturation, but does not influence incidence of retained placenta. Acknowledgements The authors wish to thank H.-G. Sander and his team in Mariensee for the help in handling and observation of the cows. Further thanks to M. Gähle and D. Walter from the Department of Anatomy and B. Buck and V. Herder from the Institute of Pathology for the excellent technical assistance. 38 CHAPTER 1 4.6 Figures and Tables Figure 1: Illustration of mature (REL) and immature (RET) bovine placentomes. A, B Masson trichrome staining in mature (A) and immature (B) placental formation. A Asterisks (*) illustrate the loosening of the feto-maternal adherence. B In immature placentae the fetal and maternal part are tightly adhered to each other. C, D Immunohistochemical staining with Pan-Cytokeratin. C The maternal crypt epithelium appears flattened or is partly inconsistent (arrows). D Illustration of an almost cuboidal maternal crypt epithelium in RET cows (arrowheads). E, F Immunohistochemical staining with Caspase-3 evidenced a greater number of 39 CHAPTER 1 immunopositive brown staining cells in mature (E) and only scattered positive cells in immature (F) placental tissue sections. fe: fetal chorionic epithelium, me: maternal crypt epithelium. Bars 100 µm. Fig. 2: Formation of nitric oxide synthase (NOS) and Endothelin-1 (ET-1) in bovine placentomes. A, B Immunohistochemistry staining with eNOS (A) and iNOS (B) showed a clear appearance of positive staining only in fetal chorionic tissue. C Positive staining for ET-1 is present in fetal chorionic tissue as well as in maternal crypt epithelium in bovine placental tissue. D Negative immunohistochemistry control. fe: fetal chorionic epithelium, me: maternal crypt epithelium. A-C Bars 50µm, D Bars 100µm. 40 CHAPTER 1 80 mature hybrid-form 70 immature placentomes in % 60 50 40 30 20 10 0 SPON SIP PIP Fig. 3: Classification of placental formation in the experimental groups at delivery: control (SPON, n = 8), conventional induction of parturition (SIP, n = 8) and protracted induction of parturition (PIP, n = 10). 41 CHAPTER 2 5. Chapter 2: Effects of a protracted induction of parturition on the incidence of retained placentae and uterine blood flow in cattle D. Hartmann¹, Ä. Honnens¹, J. Lüttgenau¹, M. Piechotta¹, D. Rath², H. Niemann², H. Bollwein¹ ¹ Clinic for Cattle, University of Veterinary Medicine Hannover, Germany ² Institute of Farm Animal Genetics, Friedrich-Loeffler-Institute, Mariensee, Germany 5.1 Abstract The objectives of the present study were to compare the effects of a protracted and a conventional induction of parturition on the incidence of retained placentae, and to evaluate the suitability of transrectal Doppler sonography of the uterine arteries as a non-invasive method for the assessment of placental maturation. Protracted induction of labor (PIP) was precipitated in 13 cows by the administration of 1.3 mg dexamethasone i.m. twice daily between Days 268 and 273 of gestation, and 40 mg dexamethasone i.m. on Day 274 of gestation. For conventional induction of labor (SIP), 10 cows received 40 mg dexamethasone on Day 274 of gestation. A third group (SPON, n = 11) was not treated and served as control. Blood flow volume (BFV) and resistance index (RI) in the uterine arteries were measured with Doppler sonography once a day from Day 268 of gestation until labor (= Day 0). After each ultrasonographic examination, blood samples for determination of steroid hormones were taken. Incidence of retained placenta was lower (P < 0.05) in group SPON (9 %) compared to group PIP (54 %) and SIP (70 %). In the last seven days before parturition uterine BFV and RI did not change (P > 0.05) and did not differ between groups SPON, PIP and SIP (P > 0.05). Resistance index was higher (P < 0.001) in 42 CHAPTER 2 RET compared to REL cows, whereas BFV did not differ (P > 0.05) between them. Total estrogen (Etot) concentrations increased by 283 % (P < 0.001) in group PIP and by 60 % (P < 0.05) in group SPON between Days -7 and -1. They stayed constant (P > 0.05) until Day -2 in group SIP, but increased after the high dosage of dexamethasone within one day by 140 %. Total estrogen levels were higher (P < 0.05) in REL than in RET cows. In conclusion, a protracted compared to a short induction of labor results in higher estrogen levels before term, but does not affect incidence of placental retention. Neither alterations in placental maturation nor changes in steroid hormones influenced uterine blood supply. Therefore, Doppler sonography of uterine arteries is unsuitable to investigate the process of placental maturation induced by glucocorticoids in cows. Nevertheless, disturbances in the placental maturation process in cows with retained fetal membranes after parturition can already be detected before parturition by a higher uterine blood flow resistance in the uterine arteries. 5.2 Introduction On large dairy farms, there is an increasing incidence of stillbirths due to difficulties with calving management (GUNDELACH et al. 2009; KAUSCH 2009). One method to reduce this problem is to terminate labor via hormonal induction of parturition. Conventionally used methods for the induction of parturition are single treatments with short-acting corticosteroids and prostaglandins, respectively, to mimic the naturally occurring endocrine events that trigger the onset of parturition in cattle (MCDIARMID 1983; BO et al. 1992). Spontaneous parturition is induced by the release of cortisol from the fetus. Cortisol stimulates the enzyme 17α-hydroxylase in the fetal membranes to catalyze the conversion of progesterone (P4) to estrogens. The increasing concentrations of estrogens lead to a higher expression of oxytocin receptors, followed by a release of prostaglandins, which in turn induce luteolysis and parturition (MCDIARMID 1983; KINDAHL et al. 2004). It is also well documented that sexual steroid hormones play 43 CHAPTER 2 an important role in placental development (AGTHE and KOLM 1975; BOOS et al. 2000; WISCHRAL et al. 2001; TAKAGI et al. 2002; KINDAHL et al. 2004). The maturation process of the placentomes is very important for normal placental separation, and it is suggested that a disturbance of the placental maturation is caused by a multifactorial event including morphological, functional and endocrinological processes (SCHOON 1989). Exogenous induction of parturition by using a single treatment with either dexamethasone or prostaglandin causes a high incidence of retained fetal membranes (MACDIARMID and COOPER 1983; WILHELM 1989; KORNMATITSUK et al. 2000), which relies on the failure to raise estrogens to concentrations similar to those measured during spontaneously occurring parturitions in cows (BEARDSLEY et al. 1974). This perinatal imbalance or deficiency of hormones results in an incomplete placental maturation (AGTHE and KOLM 1975; GRUNERT et al. 1989; SCHULZ 1990). Several attempts to modify the induction schedule achieved no effect on placental maturation (BEARDSLEY et al. 1974; BARTH et al. 1978; DISKIN et al. 1982; CLAYDON 1984). The first auspicious results in reducing the incidence of retained fetal membranes in cows were observed in New Zealand (WELCH et al. 1973). It was demonstrated that a pretreatment with long-acting corticosteroids had a positive effect on placental release. By using this method, a lower incidence of retained fetal membranes was observed (WELCH et al. 1973; DAVIS et al. 1979; DISKIN et al. 1982; BO et al. 1992; NASSER et al. 1994). Treatment with long-acting corticosteroids gained wide acceptance in New Zealand, where dairy farming is highly seasonal and lactation needs to coincide with the maximum availability of pasture (HUNTER et al. 1977). In Germany and other European countries, this procedure is not popular because, according to European law, the exogenous application of long - acting corticosteroids is not allowed in food animals. An alternative in these countries is the treatment with low doses of short-acting corticosteroids twice daily for six days, followed by a single treatment with a high dose of this hormone (ZERBE 2008). 44 CHAPTER 2 However, in previous studies it was noticed that the repeated application of corticosteroids during late pregnancy decreased ovine uterine and umbilical blood flow and consequently placental and fetal growth (JELLYMAN et al. 2004; JENSEN et al. 2005). Although there were some studies measuring uterine blood flow in the last period of pregnancy in cattle (LEIDL 2000; NISHIDA et al. 2006; PANARACE et al. 2006), until now there are no data about uterine blood flow in the last few days of pregnancy. It has been shown that the large increase in transplacental exchange during the second half of gestation depends primarily on uterine blood flow (REYNOLDS and REDMER 2001; SCHULER et al. 2002). Placental maturation in the last term of pregnancy is characterised by the formation of new vessels via angiogenesis (BOROWICZ et al. 2007) mainly by new fetal villious trees in the centre of the placentomes (SCHULER et al. 2002). The objectives of the present study were to examine the effects of a short and a protracted induction of parturition with exogenous corticosteroids during the end of pregnancy on the release of the placenta and on uterine blood supply. 5.3 Materials and Methods 5.3.1 Cattle Thirty-four primi- and pluriparous (n = 17 each), clinically healthy Holstein Friesian (n = 24), German Black Pied (n = 8), Simmenthal (n = 1), and Red Holstein (n = 1) cows with known breeding dates were examined at a research farm in Lower Saxony, Germany, between June 2007 and December 2008. These cows were 3.2 ± 1.2 years old (range, 2 to 8), with a parity of 1.7 ± 1.0 (range, 1 to 5). Twelve days before their expected calving date, cows were brought into stables with deep-straw bedding and fed a mixed ration (corn, grass silage, ground corn, vitamins and minerals), with ad libitum access to water. 45 CHAPTER 2 5.3.2 Study design Cows were randomly allocated into three groups with spontaneously occurring parturition (SPON, n=11), serving as control group, or short (SIP, n=10) and protracted (PIP, n=13) inductions of parturition, respectively. Cows in group SIP received a single treatment with 40 mg dexamethasone (Dexamethason-Lösung®, cp-pharma, Burgdorf, Germany) on Day 274 (Day 0 = day of insemination), whereas cows in PIP received 1.3 mg dexamethasone twice daily on Days 268 to 273, followed by a single treatment with 40 mg dexamethasone on Day 274 (all treatments were given i.m.; Figure 4). In group SPON, ultrasonographic examinations were performed every second day from Days 268 to 276, and starting on Day 276, once daily until the day of parturition (Day 0). Cows of groups SIP and PIP were examined once daily between Day 268 and parturition. All cows were controlled every 4 h for signs of an imminent parturition. If cows did not deliver the fetus within 2 h after the first visible signs of labor, the position and size of the fetus was examined by transvaginal manual exploration of the birth canal. If indicated due to the obstetric findings, assistance of parturition was provided. Calves were judged as vital if they were able to stand and drink within the first 2 h after parturition. The birth weight of 23 calves was determined. Depending on if cows expelled the fetal membranes within the first 12 h after calving or not, they were defined as cows with released (REL) and retained (RET) placenta, respectively. During the first 5 d, the latter were treated once daily with 1.0 mg Ceftiofur per kg body weight s.c. (Excenel® RTU, Pfizer AG, Zürich, Swiss) and were examined once daily to record the time of placental separation. 5.3.3 Measurement of uterine blood flow Ten minutes before each ultrasonographic examination, cows were treated epidurally with 70 mg procaine hydrochloride (Procasel 2%®; Selectavet, Weyarn-Holzolling, Germany) to reduce rectal contractions. Transrectal ultrasonographic examinations of blood flow in the main uterine arteries ipsi- and contralateral to the localization of 46 CHAPTER 2 the fetus were performed using an ultrasound device (Toshiba SSH 370A, Toshiba Co., Tokyo, Japan), equipped with a 7.5 MHz microconvex transducer. All examinations lasted approximately 30 min per cow and were performed always by the same person (DH) at the same time of the day (between 8 and 11 a.m.). Uterine blood flow was investigated as described earlier (BOLLWEIN et al. 2002). All blood flow velocity waveforms were obtained at an interrogation angle between Doppler ultrasonic beam and blood flow direction of 20 to 60 degrees. The observations were displayed on-line and recorded on a DVD recorder (DV-RW260S; Sharp Electronics, Hamburg, Germany). For the off-line evaluation of blood flow parameters an image analysis software (Pixelflux; Chameleon-Software, Leipzig, Germany) was used. Two uniform consecutive waveforms with a maximum ratio between diastolic and systolic frequency shift were selected for each investigation. Immediately after the Doppler measurements the vessel diameters were calculated as the mean of three diameters measured on frozen two-dimensional grey scale images. Blood flow volume (BFV) was calculated by using the time-averaged maximum velocity over the cardiac cycle (TAMV) and the vessel diameter (D), according to the following equation: BFV (mL / min) = TAMV (cm / min) x (D / 2 (cm))² x π. The resistance index (RI) was calculated as the ratio of the difference between peak systolic frequency shift (PSF) and end-diastolic frequency shift (EDF) to PSF: RI = (PSF – EDF) / PSF (Figure 5). 5.3.4 Determination of steroid hormones Blood samples were collected from the coccygeal blood vessels into tubes containing potassium-EDTA (S-Monovette®; Sarstedt, Nümbrecht, Germany). Plasma was separated by centrifugation (4000 x g, 10 min) of blood samples within 20 min after collection. Samples were stored frozen at -20 °C un til analyses of endocrine parameters. Plasma progesterone concentrations were measured using a sequential competitive chemiluminescence enzyme immunoassay (IMMULITE® 1000; Siemens, Los Angeles, USA), with a lower detection limit of 0.6 nmol/L. The intra- and interassay 47 CHAPTER 2 coefficients of variation (CV) were 16.0%, 8.1%, and 6.3% for control sera with low (<1 ng/mL), medium (4 ng/mL), and high (8 ng/mL) progesterone levels. Total estrogens (Etot) were determined in duplicates using an enzyme immunoassay as published earlier (MEYER et al. 1990). For analysis of Etot, an antibody (antigen: estradiol-17β-hemisuccinate bovine serum albumin) reacting with estradiol-17β (100 %), estrone (100 %) and estradiol-17α (66 %), was combined with estradiol-17β -hemisuccinate horseradish peroxidase. The suitability of using total estrogens for reliable monitoring of estradiol-17β activity was documented previously (MEYER et al. 1990). The lower detection limit was 8.0 pg/mL, and the intra- and interassay CVs were < 10 % and < 12 %, respectively. Plasma cortisol concentrations were measured using a competitive chemiluminescent enzyme immunoassay (IMMULITE® 1000 Cortisol, Siemens, Los Angeles, USA) with a lower detection limit of 5.5 nmol/L and intra- and interassay CVs of < 8.8 % and < 10 %, respectively. According to the information of the manufacturer, there is no cross - reaction between plasma cortisol and dexamethasone. 5.3.5 Statistical analyses All statistical analyses were done with the Statistical Analysis System V9.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Since data of BFV, RI and hormone concentrations were normally distributed (Shapiro-Wilk test), they were presented as means ± SD. Blood flow volume, RI and hormone concentrations as well as changes in timeinterval of progesterone were compared between groups and days and between RET and REL cows using the Student´s t-test. Also differences in BFV and RI in uterine arteries ipsi- and contralateral to the fetus and between cows with retained and released fetal membranes, respectively, were evaluated by Student’s t-test. Furthermore, the relationships between BFV and RI, BFV and birth weight of the calves, as well as RI and birth weight were investigated by calculating Pearson´s correlation coefficients (r). Results with positive or negative correlation coefficients of ≤ 0.20 were interpreted as low or no correlation, between 0.21 and 0.50 as weak correlation, between 0.51 and 0.80 as moderate correlation and correlations of ≥ 0.81 48 CHAPTER 2 as good correlations. The variability of plasma progesterone and cortisol concentrations between groups was expressed as the coefficient of variation (CV). Incidence of retained placentae was compared between groups using Chi-square distribution. Differences and relationships with P ≤ 0.05 were considered significant. 5.4 Results 5.4.1 Clinical findings Gestation length in cows of group SPON was 282 ± 4.1 d (range 278 to 289 d, n = 11). In group SIP, eight cows calved on Day 276 and two cows on Day 277 (30 to 70 hours after treatment with 40 mg dexamethasone). In group PIP, nine cows calved on Day 275 (24 to 36 hours after treatment with 40 mg dexamethasone), three cows between Days 272 and 274, and one cow on Day 276. Parturition of all cows in group PIP that calved on Day 275 was during daytime (6 a.m. to 8 p.m.), whereas cows in groups SPON and SIP calved during daytime (n = 9) or nighttime (8 p.m. to 6 a.m.; n = 12). Obstetrical assistance was required in two cows of groups SPON, SIP, and PIP, respectively. Four cows (SPON: 1, SIP: 2, PIP: 1) needed slight (traction force of one person) and one cow (SPON) tight assistance (traction force of two people). In one cow (PIP), the position of the calf with the head tucked back had to be corrected. Retained fetal membranes were observed in 1 of 11 (9 %) cows of group SPON, 7 of 10 (70 %) of group SIP and 7 of 13 (54 %) of group PIP. Incidence of retained placenta was lower (P < 0.05) in group SPON compared with group PIP and SIP. No differences (P > 0.05) were found between group PIP and SIP. All cows with RET showed within two days after parturition a metritis of grade I according to SHELDON et al. (2009). The abruption of placenta occurred 3 to 8 d after parturition. In group SPON two calves died, one during the calving process because of a prolonged and difficult labor (traction force of two people for more than 30 minutes) and one was already dead, when the cow was examined to check the presentation of 49 CHAPTER 2 the calf in the birth canal. In groups SIP and PIP no calf died, but two and one, respectively, needed nursing assistance. At birth, ten of the weighted calves were male (m) and 13 female (f). The average birth weight was 42.5 ± 3.9 kg, while the male calves were heavier than females (range 36 to 52 kg; m: 44.5 ± 3.8, f: 41.1 ± 3.4, P < 0.05). Birth weight of calves in group SPON (39.1 ± 1.0; m=1, f=4) was lower (P < 0.05) compared with calves in groups SIP (42.7 ± 3.3; m=6, f=2) and PIP (44.2 ± 4.3; m=3, f=7), respectively. 5.4.2 Uterine blood flow Blood flow volume and RI during the last seven days before parturition did not change (P > 0.05), neither in group SPON, nor in groups SIP and PIP. In all groups, BFV was lower (P < 0.001) and RI was higher (P < 0.003) in the ipsi- compared to the contralateral uterine arteries. There were no differences (P > 0.05) in BFV and RI between groups SPON, SIP, and PIP (Table 2). Resistance index was higher (P < 0.05) in RET compared to REL cows, whereas BFV did not differ (P > 0.05) between RET and REL cows (Table 3). There were moderate negative correlations between BFV and RI (r = -0.54; P < 0.001) between Days -7 and -1. No correlation (P > 0.05) was observed between BFV and the birth weight of the calves (Fig. 6a), but there was a weak positive correlation (r = 0.46, P < 0.05) between RI and birth weight (Fig. 6b). 5.4.3 Steroid hormones 5.4.3.1 Progesterone Plasma P4 concentrations decreased between Days -7 and -1 (P < 0.05) in cows of groups SPON, SIP, and PIP by 46, 20 and 59 %, respectively (Figure 7). During this time period P4 concentrations were higher (P < 0.05) in PIP than in SPON and SIP. The relative changes between Days -7 and -1 did not differ between groups 50 CHAPTER 2 (P < 0.05). The CV for P4 concentrations ranged between Days -7 and -1 from 17 to 64 %. 5.4.3.2 Total estrogens Concentrations of Etot in group SPON increased (P < 0.05) between Days -7 and -1 by 60 %. In group SIP, Etot did not change (P > 0.05) between Days -7 and -2, but increased (P < 0.05) after treatment with dexamethasone by 140 % between Days -2 and -1. In group PIP, Etot increased (P < 0.001) continuously between Days -7 and -1 by 283 % (Figure 8). Between Days -4 and -2, Etot was higher (P < 0.05) in SPON than in SIP cows. Concentrations of Etot in PIP were higher (P < 0.05) than in SIP between Days -3 and -1 and higher (P < 0.05) than in SPON on Day -1. Etot concentrations were higher (P < 0.05) in REL than in RET cows. 5.4.3.3 Cortisol There were high variabilities of cortisol concentrations in between groups ranged between Days -7 and -1 from 7 to 83 %. Plasma cortisol concentrations in cows of group SIP decreased (P < 0.05) between Days -2 and -1 (following treatment with dexamethasone) by 22 %. In cows of group PIP it decreased (P < 0.05) by 21 % between Days -7 and -6 and stayed on a low level during dexamethasone treatment (Figure 9). Between Days -6 and -1 cortisol concentrations were lower (P < 0.05) in PIP cows compared to SPON and SIP cows. On Day -1, cortisol was lower (P < 0.05) in SIP than in SPON cows. 5.5 Discussion In group PIP, 70 % of cows calved 24 to 36 h after the last treatment with dexamethasone on daytime between 6 am and 8 pm. Similarly, in a previous study, the use of a long-acting corticosteroid 4 to 6 days before the induction of parturition by a 51 CHAPTER 2 short-acting glucocorticoid resulted in a more predictable calving time compared to the induction of parturition by a single treatment using one shot of a high dosage of a glucocorticoid (BO et al. 1992). Therefore, a protracted induction of parturition allows a better calving management and may therefore lead to a lower stillbirth rate of calves. In the control group, the incidence of stillbirth was 5.8 %, being within the normal range in dairy cows (KAUSCH 2009). Furthermore, the average birth weight of the calves in the present study was consistent with results in untreated cows (KAUSCH 2009), probably due to the temporal coincidence of the day of birth induction (Day 274 of parturition) and to the normal ending of the gestation period. However, calves of group SPON had a significant lower birth weight than calves of groups SIP and PIP. This was probably due to the fact that there were predominantly female calves in group SPON, which weighed less than the male calves. In the present study, 54 % of cows in group PIP had a retained placenta compared to 70 % in group SIP. Previous studies found that a conventional induction of parturition with a single application of corticosteroids or prostaglandin resulted in a high incidence of retained placenta up to 93 % (BEARDSLEY et al. 1974; WELCH et al. 1977; WILHELM 1989; SCHULZ 1990), which has detrimental effects on postpartum fertility (GRUNERT et al. 1976; BO et al. 1992) and milk yield (SIMERL et al. 1992). Therefore, subsequent studies aimed to reduce the high incidence of retained placenta in induced animals. It was found that in late pregnancy the application of a long acting corticosteroid formulation followed by the administration of short acting corticosteroid several days later resulted in a lower incidence of retained fetal membranes (WELCH et al. 1973; DISKIN et al. 1982; CLAYDON 1984; BO et al. 1992; NASSER et al. 1994). The decisive factor for placental separation seems to be the variable interval from application of a long acting corticosteroid and the subsequently administered short acting corticosteroid. Some studies have shown that a minimum pre-treatment period of six days with corticosteroids is necessary to obtain a significant effect on placental maturation and therefore on placental release 52 CHAPTER 2 (WELCH et al. 1973; HUNTER et al. 1977; CLAYDON 1984; BO et al. 1992). In this period of time the placenta required exposure to exogenous corticosteroids to ensure the physiological maturation process that would allow induction of parturition without retention of the fetal membranes (NASSER et al. 1994). Therefore, a pre-treatment interval of six days was chosen in the present study. The results obtained by this study showed only numerical differences between groups PIP and SIP, but data were not significant, which may be caused by the temporal coincidence of the normal ending of the gestation period and therefore to a beginning of the physiological placental maturation process in group SIP. Blood flow volume and RI did not change in the last seven days of pregnancy. In previous studies, significant increases in blood flow of both uterine arteries throughout gestation (FERRELL 1991; REYNOLDS and REDMER 1995; PANARACE et al. 2006), steeping mainly during the last two-thirds of pregnancy (PANARACE et al. 2006), as well as no differences in uterine blood flow during the last third of pregnancy (NISHIDA et al. 2006) were observed. The large increases in uterine blood flow during the last half of gestation were explained by the continuously increasing demands of the fetus (REYNOLDS and REDMER 1995). We hypothesize that the constant uterine blood flow during the last days of pregnancy in the present study was due to a maximum blood flow capacity of uterine arteries. Therefore, it seems that the considerable increase in transplacental exchange at the end of pregnancy is not maintained by an increase in uterine blood flow, but by an increase in placental function associated with a vast growth of placental vascularity (REYNOLDS and REDMER 1995; REYNOLDS and REDMER 2001). In addition, a limitation of blood flow capacity and therefore of the fetal supply could be a possible stress factor that may be jointly responsible for the induction of birth. Mean BFV values in the last days before parturition were consistently higher and RI values lower in the uterine artery located ipsilateral to the pregnant uterus horn compared to values measured in the uterine artery contralateral to the fetus. These results are in agreement with findings of previous studies (BAUMGARTNER 1998; NISHIDA et al. 2006; PANARACE et al. 2006). They may be associated with the 53 CHAPTER 2 increasing demands of the fetus during the last two-thirds of pregnancy (REYNOLDS and REDMER 1995). Another study attributed these observations to the fact that the pregnant horn contains more and larger placentomes than the non-pregnant horn (LAVEN and PETERS 2001). Resistance index was significantly higher in the last days of pregnancy in RET compared to REL cows. This is probably due to the fact that the physiological ablation process of the fetomaternal adherence in cows with retained placentae failed. Physiologically, this loss of adherence occurs only after the placentome has undergone a process of maturation (BJORKMAN and SOLLEN 1960; WOICKE et al. 1986). During this maturation process, vasculo-syncytial configurations are formed (SCHOON 1989), which may result in a lower resistance index, and consequentially lead to a reduced incidence of retained fetal membranes. In a previous study, a good correlation between BFV and birth weight of the calves was noticed in the last third of pregnancy (HERZOG et al. 2011). In the present study, however, no correlation between BFV and birth weight, which is probably due to the fact that there was no increase in uterine blood flow in the last seven days of gestation. Surprisingly, a positive correlation was detected between RI and birth weight in the last days before parturition. In contrast, studies in women found a high negative relationship between resistance index in the uterine arteries and birth weight of babies during the first trimester and during 19 to 23 weeks of pregnancy, respectively (HOLLIS et al. 2003; BROWNE et al. 2011). This finding may be associated with the size of the uterus in the last stage of pregnancy; a heavier and therefore larger calf may lead to stretching of uterine vessels and thus create a higher resistance to blood flow. In the present study, progesterone levels in group PIP declined during the glucocorticoid treatment by 59 % until parturition. The fact, that progesterone concentrations between Days -7 and -1 were higher in PIP than in SPON and SIP could not be clarified. A possible explanation might be the high inter-individual variability between animals. Nevertheless, the relative changes in this time interval did not differ between groups. During the normal cascade of parturition, two distinct 54 CHAPTER 2 phases of a decrease in plasma P4 concentrations could be observed. The first gradual and continuous decrease was seen during the last 60 days of parturition and was due to the utilization of P4 in the fetal-placental unit, most likely due to the conversion of progesterone to estrogens, which is catalyzed by the inducible enzyme 17α-hydroxylase. This gradual decrease was followed by a second phase with a more abrupt decline of P4 occurring 24 to 48 hours prior to parturition (EDQVIST et al. 1978). Dexamethasone treatment during protracted induction of parturition probably induces 17α-hydroxylase, initiating the processes that lead to normal placental maturation and parturition (KINDAHL et al. 2004). Total estrogen concentrations in group SPON increased by 60 % between Days -7 and -1. Physiologically, estrogen concentrations in the maternal peripheral circulation start to increase in the last few days before parturition and decline rapidly to zero level post partum (KINDAHL et al. 2004). Total estrogens in group PIP increased by 283 % between Days -7 and -1, whereas Etot in group SIP increased by 140 % within one day (Day -2 to -1). It was noticed that estrogens play an important role in the maturation of placentomes (GRUNERT et al. 1989; ZHANG et al. 1999; WISCHRAL et al. 2001; KINDAHL et al. 2004). In agreement with previous studies we found that estrogen concentrations were lower in RET compared to REL cows (ZHANG et al. 1999; WISCHRAL et al. 2001). Plasma cortisol concentrations showed a high variability in group SPON and SIP, which may be due to handling stress, since cortisol is recognized as a stress hormone (KINDAHL et al. 2004). In group PIP plasma cortisol concentrations decreased after the first application of dexamethasone and remained on a low level during dexamethasone treatment. This phenomenon is based on the negative feedback on hypothalamo-pituitary-adrenal function (KAPOOR et al. 2006). Moreover, maternal exposure to exogenous glucocorticoids can lead to permanent modification of fetal hypothalamo-pituitary-adrenal function (KAPOOR et al. 2006). Other studies have shown that the exogenous administration of glucocorticoids has been associated with increased susceptibility to infectious diseases in cattle (ROTH 55 CHAPTER 2 and KAEBERLE 1982; BURTON and ERSKINE 2003). However, the immunosuppressive effect is dependent upon the dose of dexamethasone administered. Thus, the authors found little variations in haematological parameters when a dose of 0.3 mg/kg for three days was applied (PRUETT et al. 1987). In the present study 0.004 mg/kg over six days followed by a single dose of 0.07 mg/g was given. Further investigations are necessary to evaluate the effects of a protracted administration of glucocorticoids on the immune system and on the hypothalamo-pituitary-adrenal function in cattle. In conclusion, a protracted induction of parturition with the use of repeated treatments with low doses of short-acting corticosteroids for six days followed by one single treatment with a high dose of this hormone will result in higher estrogen levels before term, but does not affect uterine blood flow and the incidence of retained placentas. 56 CHAPTER 2 5.6 Figures and Tables Table 1. Blood flow volume (BFV in L/min) in the uterine arteries ipsi- (i) and contralateral (c) to the location of the fetus of cows with spontaneous parturition (SPON; n = 11), as well as short (SIP; n = 10) and protracted induction of parturition (PIP; n = 11), respectively, on Days -7 to -1 (Day 0 = parturition). Values are means ± SD. Group Side Day -7 -5 -4 -3 -2 -1 Mean i 9.72 ± 10.62 ± 3.36 4.00 9.77 ± 10.15 ± 10.33 ± 10.57 ± 10.63 ± 10.30 ± 2.90 3.00 3.73 4.16 4.07 3.52 c 5.74 ± 2.60 4.64 ± 0.76 4.77 ± 1.78 i 9.83 ± 2.90 9.74 ± 2.55 9.64 ± 10.35 ± 10.19 ± 10.49 ± 10.30 ± 10.07 ± 2.41 2.97 2.44 2.17 2.67 2.50 c 3.54 ± 1.44 3.59 ± 1.31 3.79 ± 1.19 SPON SIP i PIP c 5.05 ± 2.97 4.00 ± 2.06 5.07 ± 2.20 3.72 ± 1.12 5.26 ± 3.10 3.69 ± 1.43 4.50 ± 2.71 3.90 ± 1.22 4.99 ± 2.38 3.74 ± 1.38 12.89 ± 12.84 ± 13.72 ± 12.42 ± 12.86 ± 12.85 ± 13.02 ± 12.92 ± 2.89 3.45 4.78 3.44 4.25 4.41 3.94 4.83 2.88 ± 2.22 2.58 ± 1.83 2.67 ± 1.78 2.78 ± 1.47 2.69 ± 1.67 2.66 ± 1.63 2.96 ± 1.94 2.74 ± 1.71 i 10.78 ± 11.04 ± 11.09 ± 11.05 ± 11.13 ± 11.35 ± 11.36 ± 11.12 ± 3.26 3.76 3.73 3.93 3.60 3.95 3.42 3.38 c 3.95 ± 2.30 i/c 14.72 ± 14.46 ± 14.73 ± 14.91 ± 14.91 ± 15.36 ± 15.15 ± 14.90 ± 3.87 4.13 4.61 3.80 3.80 3.26 3.74 3.28 Mean Sum -6 3.52 ± 1.58 3.67 ± 1.73 3.87 ± 3.32 57 3.78 ± 1.91 3.78 ± 2.31 3.78 ± 2.13 3.77 ± 2.04 CHAPTER 2 Table 2. Resistance index (RI) of the uterine arteries ipsi- (i) and contralateral (c) to the location of the fetus of cows with spontaneous parturition (SPON; n = 11), as well as short (SIP; n = 10) and protracted induction of parturition (PIP; n = 11), respectively, on Days -7 to -1 (Day 0 = parturition). Values are means ± SD. Group Side -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 Mean i 0.45 ± 0.04 0.44 ± 0.08 0.46 ± 0.03 0.43 ± 0.06 0.44 ± 0.05 0.43 ± 0.05 0.44 ± 0.06 0.44 ± 0.05 c 0.46 ± 0.06 0.51 ± 0.07 0.48 ± 0.03 0.47 ± 0.06 0.50 ± 0.05 0.50 ± 0.06 0.52 ± 0.09 0.49 ± 0.07 i 0.46 ± 0.06 0.45 ± 0.07 0.46 ± 0.06 0.46 ± 0.04 0.45 ± 0.05 0.43 ± 0.07 0.41 ± 0.07 0.45 ± 0.06 c 0.51 ± 0.09 0.52 ± 0.08 0.50 ± 0.08 0.50 ± 0.04 0.49 ± 0.05 0.49 ± 0.07 0.45 ± 0.05 0.49 ± 0.07 i 0.49 ± 0.05 0.47 ± 0.04 0.50 ± 0.04 0.45 ± 0.06 0.48 ± 0.04 0.47 ± 0.07 0.45 ± 0.05 0.47 ± 0.05 c 0.58 ± 0.14 0.58 ± 0.10 0.59 ± 0.09 0.61 ± 0.11 0.63 ± 0.11 0.59 ± 0.10 0.60 ± 0.07 0.60 ± 0.10 i 0.47 ± 0.05 0.45 ± 0.07 0.47 ± 0.05 0.45 ± 0.06 0.45 ± 0.05 0.44 ± 0.07 0.43 ± 0.06 0.45 ± 0.06 c 0.52 ± 0.11 0.53 ± 0.09 0.53 ± 0.09 0.53 ± 0.10 0.54 ± 0.10 0.53 ± 0.09 0.53 ± 0.09 0.53 ± 0.09 i/c 0.49 ± 0.09 0.49 ± 0.09 0.50 ± 0.07 0.49 ± 0.09 0.50 ± 0.09 0.49 ± 0.09 0.48 ± 0.09 0.49 ± 0.09 SPON SIP PIP Mean Mean Day 58 CHAPTER 2 Table 3. Blood flow volume (BFV) and resistance index (RI) of the uterine arteries ipsi(i) and contralateral (c) to the location of the fetus during the last 7 d before parturition of cows with released (REL, n = 19) and retained placentae (RET, n = 14), respectively. On Days -7 to -1 (Day 0 = parturition). Values with different small (a,b) and capital (A,B) letters differ (P < 0.05) and are means ± SD. Para- Plameter centa Day Side -6 -5 -4 -3 -2 -1 Mean REL i/c 14.72 ± 4.39 14.62 14.68 ± 14.77 15.36 15.90 ± 3.62 3.32 ± 3.09 ± 3.22 ± 4.41 14.75 ± 4.78 14.99 ± 3.81 RET i/c 14.73 ± 3.31 14.25 ± 4.17 14.78 15.10 14.37 14.66 ± 3.34 ± 4.58 ± 3.41 ± 3.78 15.76 ± 4.51 14.79 ± 3.80 REL i REL c RET i RET c 0.46 a 0.44 a 0.44 a ± 0.05 ± 0.05 ± 0.04 0.50 A 0.51 A 0.52 ± ± 0.08 ± 0.08 0.09 0.49 b 0.46 b 0.47 b ± 0.04 ± 0.06 ± 0.05 0.56 B 0.56 B 0.56 ± ± 0.08 ± 0.11 0.11 0.44 ± 0.05 0.52 ± 0.10 0.43 ± 0.07 0.54 ± 0.10 0.44 ± 0.05 0.51 ± 0.08 0.47 ± 0.06 0.56 ± 0.10 RI RI BFV [L/min] -7 0.45 a ± 0.06 0.47 A ± 0.09 0.50 b ± 0.04 0.44 a ± 0.07 0.49 A ± 0.07 0.47 b ± 0.06 B 0.58 B 0.58 <± 0.11 ± 0.08 59 0.44 ± 0.05 0.51 ± 0.07 0.45 ± 0.08 0.56 ± 0.10 CHAPTER 2 Days of pregnancy SPON 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 ... parturition 277 - 289 40 mg dexamethasone SIP 268 269 270 271 272 273 274 parturition 276 - 277 1.3mg mgdexamethasone dexamethasone twice daily 1.3 twice daily PIP 268 269 270 271 272 273 40 mg 274 parturition 275 Figure 4. Treatment schedule of cows with spontaneous parturition (SPON, n = 11), as well as short (SIP, n = 10) and protracted (PIP, n = 13) induction of parturition. 60 CHAPTER 2 Figure 5. Doppler flow mapping of blood flow in the uterine artery ipsilateral to the conceptus in a cow of group PIP on Day 272 of pregnancy; left: spectral Mode showing pulse waves; right: blood flow shown in colour Mode. 61 CHAPTER 2 24 sum of BFV (L/min) 22 20 18 SPON (n=11) SIP (n=10) 16 PIP (n=13) 14 12 10 8 0 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 Birth weight (kg) Figure 6 a: Relationship between birth weight of calves (n = 24) and BFV (L/min) of uterine blood flow in 24 cows with spontaneous parturition (SPON), short (SIP) and protracted (PIP) induction of parturition. The sum of BFV values of the uterine arteries ipsi- and contralateral to the conceptus are used. 62 CHAPTER 2 ,63 ,6 ,57 SPON (n=11) mean RI ,55 SIP (n=10) ,52 PIP (n=13) ,5 ,47 ,45 ,43 ,4 ,38 0 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 Birth weight (kg) Figure 6 b: Relationship between birth weight of calves (n = 24) and RI of uterine blood flow in 24 cows with spontaneous parturition (SPON), short (SIP) and protracted (PIP) induction of parturition. Mean RI values of the uterine arteries ipsi- and contralateral to the conceptus are used. 63 CHAPTER 2 9 Progesterone (ng/mL) 8 7 6 SPON (n=11) SIP (n=10) PIP (n=13) 5 4 3 2 1 0 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 Days ante partum Figure 7. Plasma progesterone concentrations in cows with spontaneous parturition (SPON), as well as short (SIP) and protracted (PIP) induction of parturition. Between Days -7 and -1, P4 concentrations were higher (P < 0.05) in PIP than in SPON and SIP. 64 CHAPTER 2 25 * Total estrogens estrogen (ng/mL) * 20 * # 15 SPON (n=11) # SIP (n=10) # PIP (n=13) 10 5 0 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 Days ante partum Figure 8. Plasma concentrations of total estrogens in cows with spontaneous parturition (SPON), as well as short (SIP) and protracted (PIP) induction of parturition. * Difference between group PIP (P < 0.05) and SPON (Day -1) and SIP (Day -3 to -1) on the day indicated. # Difference between group SPON (P < 0.05) and SIP on the day indicated. 65 CHAPTER 2 20 Cortisol (ng/L) 16 12 SPON (n=11) SIP (n=10) 8 PIP (n=13) * 4 * * * * * # 0 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 Days ante partum Figure 9. Plasma cortisol concentrations in cows with spontaneous parturition (SPON), as well as short (SIP) and protracted (PIP) induction of parturition. * Difference between group PIP (P < 0.05) compared with SPON (Day -6 to -1) and SIP (Day -6 to -2) on the day indicated. # Difference between group SIP (P < 0.05) and SPON on the day indicated. 66 DISKUSSION 6. Übergreifende Diskussion Eine vorzeitige medikamentelle Geburtseinleitung beim Rind ist mit einer hohen Inzidenz an Nachgeburtsverhaltungen verbunden (BEARDSLEY et al. 1974; WELCH et al. 1977; WILHELM 1989; SCHULZ 1990). Die wirtschaftlichen Verluste durch eine reduzierte Milchleistung und Fertilitätseinbußen belaufen sich dabei auf mehrere hundert Euro pro Tier (ESSLEMONT and PEELER 1993). Aus diesem Grund hatten zahlreiche Studien in den letzten Jahrzehnten zum Ziel, durch verschiedene medikamentelle Einleitungsmethoden die physiologischen Bedingungen der Geburt zu imitieren und damit den Abgang der Nachgeburt zu beeinflussen. Am erfolgversprechendsten hat sich dabei die Gabe von Glukokortikoiden über einen längeren Zeitraum erwiesen (WELCH et al. 1973; WELCH et al. 1977; BO et al. 1992). In der vorliegenden Dissertationsarbeit wurden daher eine konventionelle und eine protrahierte Geburtseinleitung bei der Kuh im Hinblick auf die Plazentareifung und die Nachgeburtsverhaltung untersucht. In der vorliegenden Studie entwickelten 54 % der Tiere mit einer protrahierten Geburtseinleitung eine Retenio secundinarum verglichen mit 70 % der Tiere, die konventionell mit einer einmaligen hohen Dosis Dexamethason eingeleitet wurden. Obgleich bei numerischer Betrachtung die Inzidenz an Nachgeburtsverhaltungen bei Tieren mit protrahierter Geburtseinleitung niedriger zu sein scheint, sind die Unterschiede nicht signifikant verschieden. Grund hierfür könnte der nah am Ende der physiologischen Tragezeit gewählte Zeitpunkt der Geburtseinleitung sein, so dass der physiologische Reifungsprozess der Plazenta auch bei konventionell eingeleiteten Tieren bereits eingesetzt hat. Im letzten Trächtigkeitsstadium kommt es beim Rind zu einer Reifung der Plazenta, die zur Auflösung der feto-maternalen Kontaktzone und damit zur Lösung der fetalen Membranen post partum führt (BJORKMAN and SOLLEN 1960; WOICKE et al. 1986). Der Ausprägungsgrad der plazentaren Reifungsprozesse wurde in der vorliegenden Arbeit anhand von histologischen 67 und immunhistologischen DISKUSSION Untersuchungen beurteilt. Dabei konnte gezeigt werden, dass der Großteil der Tiere aus der Gruppe SPON eine reife Plazenta aufwies. Die Mehrzahl der Kühe aus der SIP Gruppe zeigte dagegen eine unreife Plazenta mit einer nahezu intakten fetomaternalen Verbindung. Diese Beobachtungen stimmten weitgehend mit dem Auftreten von Nachgeburtsverhaltungen der Tiere überein. Die Gruppe PIP zeigte sowohl reife als auch unreife Plazenten und mehrfach konnten in einem Plazentom sowohl reife als auch unreife Areale nebeneinander dargestellt werden. Für das Ausbleiben der plazentaren Reifungsvorgänge ante partum und der damit verbundenen Entstehung einer Nachgeburtsverhaltung wird ein multifaktorielles Geschehen vermutet, das neben den morphologischen Veränderungen, endokrinologische und funktionelle Prozesse mit einschließt. Vor allem der peripartale Östrogenanstieg scheint für die zellulären Umbauprozesse von entscheidender Bedeutung zu sein (GRUNERT et al. 1989; ZHANG et al. 1999; WISCHRAL et al. 2001; KINDAHL et al. 2004). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Östrogenkonzentration in der Gruppe PIP während der sechstägigen Glukokortikoidgabe deutlich ansteigt. In der SIP Gruppe dagegen war der Östrogenanstieg erst nach der einmalig hohen Dexamethasongabe zu beobachten. Dieser kurze Zeitraum zwischen konventioneller Einleitung und Geburt ist jedoch für eine Ausreifung der Plazenta zu kurz (WOICKE et al. 1986). Dies bestätigen auch andere Studien, die zeigten, dass die Östrogenkonzentration bei Kühen mit Nachgeburtsverhaltung niedriger ist als bei Kühen mit zeitgerechtem Nachgeburtsabgang (ZHANG et al. 1999; WISCHRAL et al. 2001). Ein bislang nur wenig untersuchter funktioneller Aspekt der Plazentareifung ist die Veränderung des Blutdruckes im Bereich der Chorionzotten. So führen die Kontraktilität des Uterus und die Austreibung der Frucht zu alternierenden hyperämischen und ischämischen Bedingungen in den Chorionzotten (GRUNERT 1986) und beeinflussen damit die plazentare feto-maternale Verbindung und somit den Abgang der Nachgeburt (LAVEN and PETERS 1996). Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Dissertation erstmals mittels Immunhistologie die Präsenz von Vasodilatatoren und -konstriktoren in der bovinen Plazenta untersucht. Zusätzlich wurde täglich der uterine Blutfluss mittels transrektaler Dopplersonographie in den 68 DISKUSSION letzten sieben Tagen vor der Geburt gemessen. Die Vasodilatatoren iNOS und eNOS konnten in allen plazentären Gewebsproben nachgewiesen werden. Dabei wurden keine Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen oder zwischen RET und REL Kühen festgestellt. Überraschend war der Befund, dass iNOS und eNOS anders als bei Schafen in der vorliegenden Arbeit nur im Choriongewebe nachzuweisen waren. Bei Schafen sind diese sowohl im fetalen als auch im maternalen Gewebe lokalisiert (ZHENG et al. 2000). Dies lässt vermuten, dass der fetale Anteil in der Plazenta eine aktivere Rolle bei der Vasodilatation und damit dem Blutdruckgeschehen einnimmt, als bislang angenommen. Der Vasokonstriktor ET-1 konnte sowohl im fetalen als auch im maternalen Plazentagewebe nachgewiesen werden. Auch hier waren keine Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen und zwischen REL und RET Kühen nachzuweisen. Jedoch war ein signifikanter Unterschied zwischen RET und REL Kühen im RI zu finden. So hatten Tiere mit Nachgeburtsverhaltung in den letzten Tagen vor der Geburt einen deutlich höheren RI als Tiere mit physiologischem Abgang der Secundinae. Grund hierfür könnten die interepitelialen Änderungen der fetalen Kapillaren sein, welche sich mit zunehmender Reduktion des maternalen Epithels der Placenta maternalis annähern und dadurch vaskulo-synzytiale Konfigurationen bilden (SCHOON 1989). Ein Ausbleiben der plazentaren Reifungsvorgänge hat möglicherweise bei Kühen, die von einer Retentio secundinarum betroffen waren, zu einem höheren Blutflusswiderstand geführt als bei Tieren mit physiologischem Abgang der Secundinae. Frühere Studien an Schafen haben ergeben, dass wiederholte Gaben von Glukokortikoiden den uterinen und umbilikalen Blutfluss direkt beeinflussen können (BURD et al. 1976; JENSEN et al. 2005). In der vorliegen Arbeit konnten in den letzten sieben Tage vor der Geburt jedoch keine Veränderungen des Blutflussvolumens innerhalb und zwischen den Tieren der verschiedenen Gruppen festgestellt werden. Dieses Ergebnis deckt sich mit einer früheren Studie, die bereits ab dem 225. Tag der Gravidität keine signifikante Erhöhung des Blutflusses in den uterinen Arterien mehr nachweisen konnte (NISHIDA et al. 2006). Andere Studien sprechen jedoch von einem kontinuierlichen Anstieg des uterinen Blutflusses während der gesamten Gravidität (FERRELL 1991; REYNOLDS and REDMER 69 DISKUSSION 1995; PANARACE et al. 2006) und von einer deutlichen Erhöhung im letzten Trächtigkeitsdrittel (PANARACE et al. 2006). Eine protrahierte Geburtseinleitung mit wiederholten Gaben kurz wirksamer Kortikosteroide über sechs Tage als Prämedikation einer konventionellen Einleitung führt somit zu einem verbessertem Östrogenanstieg und dadurch zu einer verbesserten Plazentareifung, was sich jedoch nicht anhand einer reduzierten Inzidenz an Nachgeburtsverhaltungen belegen ließ. Aufgrund des hohen Arbeitsaufwandes wird diese Einleitungsmethode zudem auf Einzeltiere beschränkt bleiben, sollte jedoch bei geplanten Einleitungen auch im Hinblick auf die verbesserte Lungenreifung des Kalbes (ZERBE 2008) immer der konventionellen Geburtseinleitung vorgezogen werden. Schlussfolgerungen In den vorliegenden Studien konnte gezeigt werden, dass eine protrahierte Geburtseinleitung bei der Kuh die Reifung der Plazenta stimuliert. So steigt durch eine mehrtägige, niedrig dosierte Gabe von Glukokortikoiden vor der eigentlichen konventionellen Geburtseinleitung die Östrogenkonzentration deutlich an und stimuliert somit die morphologischen Umbauprozesse in der Plazenta. Die funktionelle Plazentareifung spiegelt sich aber nicht am uterinen Blutfluss wieder. Folglich eignet sich die transrektale Doppler-Sonographie der Arteria uterina nicht als Untersuchungsmethode zur Beurteilung der mittels Glucuorticoiden induzierten Plazentareifung beim Rind. Jedoch scheint letztgenannte Methode Störungen in der Plazentareifung, die zu einer Retentio secundinarum führen, bereits präpartal anzuzeigen. 70 ZUSAMMENFASSUNG 7. Zusammenfassung Desiree Hartmann (2011) Einfluss einer protrahierten Geburtseinleitung beim Rind auf die Plazentareifung, den uterinen Blutfluss sowie Steroidhormone im Blutplasma Ziel der Dissertation war es, die Auswirkungen einer protrahierten und einer konventionellen Geburtseinleitung bei der Kuh in Bezug auf das Vorkommen von Nachgeburtsverhaltungen zu vergleichen. Dabei wurden an postpartal gewonnenen Plazentomen vergleichende histologische und immunhistologische Untersuchungen hinsichtlich der Merkmale der Plazentareifung durchgeführt. Weiterhin wurden die Änderungen in der Steroidhormonkonzentration bei Anwendung verschiedener Methoden zur Geburtseinleitung untersucht. Ferner wurde zusätzlich die transrektale Dopplersonographie der Arteriae uterinae daraufhin überprüft, ob sie sich als nichtinvasive Methode zur Beurteilung der Plazentareife eignet. Dreizehn Kühe erhielten eine protrahierte Geburtseinleitung (PIP), indem ihnen zwischen dem 268. und 273. Tag der Gravidität zweimal täglich 1,3 mg Dexamethason i.m. verabreicht wurden. Am 274. Tag der Gravidität wurde abschließend eine hohe Dosis von 40 mg Dexamethason i.m. injiziert. Für eine konventionelle Geburtseinleitung (SIP) erhielten 10 Kühe einmalig 40 mg Dexamethason i.m. am Tag 274 der Gravidität. Eine dritte Gruppe (SPON, n = 11) diente als unbehandelte Kontrollgruppe. Die Inzidenz von Nachgeburtsverhaltungen unterschied sich nicht (P > 0.05) zwischen den Gruppen PIP (54 %) und SIP (70 %). Kühe der Gruppe SPON lagen mit einer Inzidenz von 9 % Nachgeburtsverhaltungen im erwarteten Bereich und damit deutlich niedriger (P < 0,05) als die Gruppen PIP und SIP. Die Gruppe SPON hatte eine durchschnittliche Tragezeit von 282 ± 4,1 Tagen (278 bis 289 Tage, n = 71 ZUSAMMENFASSUNG 11). In der Gruppe SIP kalbten acht Tiere am Tag 276 und zwei an Tag 277 der Gravidität (30 bis 70 Stunden nach Applikation von 40 mg Dexamethason). Neun Tiere aus der Gruppe PIP kamen zwischen 24 und 36 Stunden nach der letzten Applikation von 40 mg Dexamethason an Tag 275 der Gravidität in Geburt. Drei Kühe kalbten während der protrahierten Einleitung zwischen Tag 272 und 274 und ein Tier an Tag 276 der Trächtigkeit. Alle Tiere der Gruppe PIP, welche am Tag 275 der Gravidität kalbten, kamen tagsüber zwischen 6 und 20 Uhr in die Geburt. Im Gegensatz dazu kamen neun Tiere aus der Gruppe SPON und SIP tagsüber (6 bis 20 Uhr) und 12 Tiere während der Nacht (20 bis 6 Uhr) zum Kalben. In der ersten Studie zeigten die Färbungen mit Masson Trichrom und Pan-Zytokeratin einen höheren Grad an reduzierten und abgeflachten Arealen im maternalen Kryptenepithel bei Tieren mit (REL) im Vergleich zu Tieren ohne Nachgeburtsabgang (RET) innerhalb von 12 Stunden post partum. Eine immunhistologische Färbung mit Caspase-3 bestätigte die Vermutung von mehr apoptotischen Zellen in der Gruppe SPON und PIP, verglichen mit Tieren der Gruppe SIP. Um die Hypothese einer „funktionellen“ Plazentareifung zu verifizieren, wurden die endotheliale (eNOS) und die induzierte (iNOS) Nitritoxid-Synthase, beides potente Vasodilatatoren, auf ihr Vorkommen in der bovinen Plazenta untersucht. Sowohl eNOS als auch iNOS konnten ausschließlich im Choriongewebe, nicht jedoch im maternalen Gewebe, nachgewiesen werden. Endothelin-1 (ET-1), als Vasokonstriktor, war dagegen sowohl im Choriongewebe, als auch im maternalen Kryptenepithel nachzuweisen. Keine Unterschiede waren in den Lokalisationen von NOS und ET-1 zwischen den Gruppen SPON, SIP und PIP noch zwischen den Gruppen RET und REL festzustellen. Ferner wurde das Hormonprofil von in den letzten sieben Tag vor der Geburt gewonnenen Blutproben bestimmt. In der Gruppe SPON fiel die Konzentration von Progesteron (P4) zwischen den Tag -7 und -1 vor der Geburt um 46 % (P < 0,05). In der Gruppe SIP sank diese nur um 20 %, während bei den PIP Tieren eine Abnahme von P4 von 59 % zu verzeichnen war (P < 0,05). Der Östrogen-Level in der Gruppe 72 ZUSAMMENFASSUNG PIP stieg während der kontinuierlichen Glukokortikoidgabe deutlich um 283 % an (P < 0,05), während er bei den SIP Tieren in den letzten sieben Tagen vor der Geburtseinleitung konstant blieb (P > 0,05) und sich erst mit der hohen Einleitungsdosis sprunghaft innerhalb eines Tages um 140 % erhöhte (P < 0,05). Die Plasma Kortisolkonzentration fiel in der Gruppe PIP während der niedrig dosierten Dexamethason Applikation um 21 % ab und war geringer (P < 0,05) als bei den SPON und SIP Kühen. Die beiden letztgenannten Tiergruppen zeigten eine hohe Variabilität im Kortisolspiegel. Der uterine Blutfluss, beurteilt anhand des Blutflussvolumens (BFV) und des Resistance Index (RI), änderte sich in den letzten sieben Tagen vor der Geburt bei keiner der drei Tiergruppen (P > 0,05) und differierte auch nicht zwischen den Gruppen (P > 0,05). Der RI-Wert war jedoch bei den RET-Kühen höher (P < 0,001) als bei den REL Kühen. Die Ergebnisse beider Studien zeigen, dass eine protrahierte Geburtseinleitung mit wiederholten, niedrig dosierten Glucocorticoidgaben zu einem erhöhten Östrogenspiegel und damit zu einer Stimulation der Plazentareifung führt. Kein signifikanter Unterschied konnte in der Inzidenz an Nachgeburtsverhaltungen zwischen protrahierter und konventioneller Geburtseinleitung festgestellt werden. Die Durchblutung der Aa. uterinae änderte sich in den letzten sieben Tagen vor der Geburt nicht. Somit eignet sich die transrektale Dopplersonographie dieser Gefäße nicht, um glucocorticoidbedingte Änderungen in der Plazentareife zu erfassen. Es sind jedoch bereits präpartal Unterschiede im uterinen Blutflusswiderstand in Abhängigkeit vom zeitgerechten Abgang der Nachgeburt post partum festzustellen. 73 SUMMARY 8. Summary Desiree Hartmann (2011) Effects of a protracted induction of parturition on placental maturation, uterine blood flow and plasma steroid hormones in cattle The objectives of this study were to compare the effects of a protracted and a conventional induction of parturition on the incidence of retained fetal memebranes in cattle. For comparison of placental maturation between experimental groups, histological and immunohistochemical studies on placentomes obtained after parturition were performed. Furthermore, analysis of steroid hormone levels prior to parturition were carried out to compare the hormone profiles among the groups. Another aim of the present study was to test the usefulness of transrectal Doppler sonography of the Arteriae uterinae as a non-invasive method for the evaluation of placental maturation. Protracted induction of labor (PIP) was precipitated in 13 cows by administration of 1.3 mg dexamethasone i.m. twice daily between Days 268 and 273 of gestation, and 40 mg dexamethasone i.m. on Day 274 of gestation. For conventional induction of labor (SIP), 10 cows received 40 mg dexamethasone on Day 274 of gestation. A third group (SPON, n=11) served as a non treated control group. There was no difference (P > 0.05) in incidence of retained placenta between groups PIP (54%) and SIP (70%). As expected 9 % of cows of group SPON showed a retained placenta, distinctly lower (P < 0.05) compared to groups PIP and SIP. Gestation length of cows of group SPON was 282 ± 4.1 days (range 278 to 289 days, n = 11). In group SIP eight cows gave birth on Day 276 and two cows on Day 277 (30 to 70 hours after the injection of 40 mg dexamethasone). Nine cows of group PIP calved between 24 and 36 hours after the last injection of 40 mg dexamethasone on 74 SUMMARY Day 275, three cows between Day 272 and 274 and one cow on Day 276. All cows of group PIP, which calved on Day 275, gave birth during daytime between 6 a.m. and 8 p.m., whereas nine cows of group SIP and SPON calved during daytime (n = 9, 6 a.m. to 8 p.m.) and 12 cows during nighttime (n = 12, 8 p.m. to 6 a.m.). In the first study, staining with Masson-trichrome and pan-cytokeratin indicated a higher degree of atrophy and flatness of the maternal crypt epithelium in cows without retained placenta (REL) compared to cows with retained placentae (RET). After staining with anti-caspase-3 ratified more apoptotic cells were detected in the SPON and PIP group compared with group SIP. To test the hypothesis of a ‘functional’ placenta maturation, the expression of the potent vasodilators endothelial (eNOS) and inducible (iNOS) nitric oxide synthase was evaluated. Both eNOS and iNOS are only expressed in chorionic tissue. Endothelin-1, one of the main vasoconstrictors, was detected in maternal crypt epithelium as well as in chorionic epithelium. No differences were noticed for NOS and ET-1 among the experimental groups nor between RET and REL cows. In the second study blood samples for hormone analyses were taken in the last seven days prior to parturition. Progesterone concentrations (P4) in group SPON declined between Days -7 and -1 by 46 %, in group SIP by 20 % and in group PIP by 59 % (P < 0.05). The levels of total estrogens raised consistently during glucocorticoid applications by 283 % in group PIP (P < 0.05), whereas in group SIP they remained constant (P > 0.05) and increased within one day by 140 % (P < 0.05) after the high dosage of dexamethasone. In group PIP cortisol concentrations decreased during glucocorticoid applications by 21 % (P < 0.05) and were lower (P < 0.05) compared to groups SPON and SIP. Cortisol concentrations in group SPON and SIP showed a high variabilitiy. Examinations of uterine perfusion in the last seven days prior to parturition by using transrectal Doppler sonography showed no differences (P > 0.05) in uterine blood flow voume (BFV) and resistance index (RI) between the three groups. Furthermore, 75 SUMMARY BFV did not differ (P > 0.05) between RET and REL cows. However, RI was higher (P < 0.05) in RET compared to REL cows. Results of both studies indicate that a protracted induction of parturition by using repeated slow doses of glucocorticoids induces higher estrogen levels before term and consequently stimulates placental maturation. No differences were found on the incidence of retained placenta between a protracted and a conventional induction of parturition. Blood flow in the main uterine arteries remains constant in the last seven days of pregnancy. Therefore, alterations in placental maturation induced by glucocorticoids cannot be detected by transrectal Doppler sonography of these vessels. However, already before parturition differences in uterine blood flow resistance can be observed depending on the release of the fetal membranes in due time after parturition. 76 LITERATURVERZEICHNIS 9. Literaturverzeichnis AGTHE, O. and H. P. KOLM (1975): Oestrogen and progesterone levels in the blood plasma of cows with normal parturition or with a retained placenta. J Reprod Fertil 43, 163-6 AL-SADI, H. I., A. F. MAJEED and A. M. RIDHA (1994): Histopathology of retained bovine fetal membranes. Theriogenology 42, 273-8 BARTH, A. D., W. M. ADAMS, J. C. MANNS and N. C. RAWLINGS (1978): Induction of parturition in beef cattle using estrogens in conjunction with dexamethasone. Can Vet J 19, 175-80 BAUMGARTNER, U. 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MAGNESS (2000): Expression of endothelial and inducible nitric oxide synthases and nitric oxide production in ovine placental and uterine tissues during late pregnancy. Placenta 21, 516-24 84 ANHANG 10. Abbildungsverzeichnis Figure 1: Illustration of mature (REL) and immature (RET) bovine placentomes……………………………………………………………….38 Figure 2: Formation of nitric oxide synthase (NOS) and Endothelin-1 (ET-1) in bovine placentomes……………………………………………39 Figure 3: Classification of placental formation between the experimental groups: control (SPON, n = 8), conventional induction of parturition (SIP, n = 8) and protracted induction of parturition (PIP, n = 10)……………………………………………………………….40 Figure 4: Treatment schedule of cows with spontaneous parturition (SPON, n = 11), as well as short (SIP, n = 10) and protracted (PIP, n = 13) induction of parturition…………………………………….58 Figure 5: Doppler flow mapping of blood flow in the uterine artery ipsilateral to the conceptus on Day 272 of pregnancy………………..59 Figure 6a: Relationship between birth weight of calves (n = 24) and BFV (L/min) of uterine blood flow in 24 cows………………………………..60 Figure 6b: Relationship between birth weight of calves (n = 24) and RI of uterine blood flow in 24 cows…………………………………………61 Figure 7: Plasma progesterone concentrations in cows with spontaneous parturition (SPON, n = 11), as well as short (SIP, n = 10) and protracted (PIP, n = 13) induction of parturition…..62 85 ANHANG Figure 8: Plasma concentrations of total estrogen in cows with spontaneous parturition (SPON, n = 10) as well as short (SIP, n = 10) and protracted (PIP, n = 13) induction of parturition…..63 Figure 9: Plasma cortisol concentrations in cows with spontaneous parturition (SPON, n = 11), as well as short (SIP, n = 10) and protracted (PIP, n = 13) induction of parturition………………………..64 86 ANHANG 11. Tabellenverzeichnis Table 1: Blood flow volume (BFV) in the uterine arteries ipsi- (i) and contralateral (c) to the location of the fetus of cows with spontaneous parturition (SPON; n = 11), as well as short (SIP; n = 10) and protracted induction of parturition (PIP; n = 11), respectively, on Days -7 to -1 (Day 0 = parturition).………………………………………………………………..55 Table 2: Resistance index (RI) of the uterine arteries ipsi- (i) and contralateral (c) to the location of the fetus (means ± SD) of cows with spontaneous parturition (SPON; n = 11), as well as short (SIP; n = 10) and protracted induction of parturition (PIP; n = 11), respectively………………………………………………56 Table 3: Blood flow volume (BFV; sums ± SD) and resistance index (RI; means ± SD) of the uterine arteries ipsi- (i) and contralateral (c) to the location of the fetus during the last 7 d before parturition of cows with released (REL, n = 19) and retained placentae (RET, n = 14), respectively……………………….......................................................57 87 ANHANG 12. Histologische und Immunhistochemische Färbungen Anhang 1: Trichrom - Färbung nach Masson-Goldner 1. Entparaffinisierung mit 2 x 10 Min. Xylol und je 2 min. Isopropanol, 96 % Alkohol, 80 % Alkohol und 70 % Alkohol. 2. Spülen mit Aqua dest. 3. Färbung mit 8 min. filtriertem Hämalaun nach DELAFIELD. 4. Kurz tauchen in 0,1 % HCl in Aqua dest. 5. 15 min. unter fließendem Leitungswasser spülen. 6. 5 min. Säurefuchsin-Ponceau (0,2 g Ponceau de Xyline + 0,1 g Säurefuchsin + 300 mL Aqua dest. + 0,6 mL Eisessig), 7. 5 min. 0,1 % Essigsäure und 8. 10 min. Phosphorwolframsäure-Orange G (10 g Phosphorwolframsäure + 5 g Orange G + 250 mL Aqua dest.). 9. 5 min. 1 % Essigsäure. 10. 5 min. Lichtgrün (0,5 g Lichtgrün + 250 mL Aqua dest. + 0,5 mL Eisessig). 11. 5 min. 0,1 % Essigsäure. 12. Entwässerung mit je 3 min. 80 % Alkohol, 96 % Alkohol, Isopropanol und 2 x 5 min. Xylol. 13. Eindecken mit Eukitt ohne vorheriges Abtrocken direkt aus dem Xylol 88 ANHANG Anhang 2: Immunhistochemische Färbung mit Pan-Cytokeratin Antikörper: Pan-Cytokeratin Antikörper CK102 mit den Klonen AE1 und AE3 (Bioprime, DNA Labeling System, Gibco BRL Grand Island, NY, USA) 1. Tag 1. Entparaffinierung mit 2 x 10 min. Xylol, 3 Min. Isopropanol und 3 min. absoluter Alkohol. 2. 30 min. Hemmung der endogenen Peroxidase in 80 % Alkohol (196 mL) mit H2O2 (4 mL). 3. 3 min. 70 % Alkohol. 4. 3 x 5 min. spülen in PBS. 5. 30 min. Vorbehandlung mit TEC (Tris-EDTA-Citrat-Puffer, pH = 7,8) Puffer bei 96 - 99 °C. 6. 20 min. Überschichten mit 1:5 verdünntem inaktivierten Ziegen- Normalserum in PBS bei Raumtemperatur. 7. Erstantikörper: 1:100 in PBS mit 1 % bovinem Serumalbumin. Inkubation über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank. 2. Tag 8. 3 x 5 min. spülen in PBS. 9. Zweitantikörper: Anti-Kaninchen-IgG (Envision Rabbit), 45 min. bei Raumtemperatur in Feuchtkammer. 10. 3 x 5 min. Spülen in PBS. 11. Detektion mit 3,3’-Diaminobenzidin (DAB) Envision (1 ml DAB-Puffer + 1 Tropfen DAB Chromogen), 5 min. 12. 5 min. spülen in PBS und 10 min. unter fließendem Leitungswasser. 13. Gegenfärbung: 30 s. in Hämalaun nach DELAFIELD. 14. 15 min. spülen mit fließendem Leitungswasser. 89 ANHANG 15. Entwässerung mit je 3 min. in 70 % Alkohol, 80 % Alkohol, absolutem Alkohol und Isopropanol. 16. 2 x 5 min. Xylol und Eindecken mit Eukitt. Anhang 3: Immunhistochemische Färbung mit Caspase-3 Antikörper: Polyklonaler Kaninchen - Antikörper gegen ein Peptid des p17 Fragmentes der humanen Caspase - 3 (Abcam, Cambridge, MA, USA) 1. Tag 1. Entparaffinierung mit 2 x 10 min. Xylol, 3 min. Isopropanol und 3 min. absoluter Alkohol. 2. 30 min. Hemmung der endogenen Peroxidase in 80 % Alkohol (196 mL) mit H2O2 (4 mL). 3. 3 min. 70 % Alkohol. 4. 3 x 5 min. spülen in PBS. 5. 20 min. Überschichten mit 1:5 verdünntem inaktivierten Ziegen- Normalserum in PBS bei Raumtemperatur. 6. Erstantikörper: 1:50 in PBS mit 1 % bovinem Serumalbumin. Inkubation über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank. 2. Tag 7. 3 x 5 min. spülen in PBS. 8. Zweitantikörper: Anti-Kaninchen-IgG (Envision Rabbit), 45 Min. bei Raumtemperatur in Feuchtkammer. 9. 3 x 5 min. Spülen in PBS. 10. Detektion mit 3,3’-Diaminobenzidin (DAB) Envision (1 ml DAB-Puffer + 1 Tropfen DAB Chromogen), 5 min. 11. 5 min. spülen in PBS und 10 min. unter fließendem Leitungswasser. 12. Gegenfärbung: 30 s. in Hämalaun nach DELAFIELD. 90 ANHANG 13. 15 min. spülen mit fließendem Leitungswasser. 14. Entwässerung mit je 3 min. in 70 % Alkohol, 80 % Alkohol, absolutem Alkohol und Isopropanol. 15. 2 x 5 min. Xylol und Eindecken mit Eukitt. Anhang 4: Immunhistochemische Färbung mit iNOS/eNOS Antikörper iNOS: Polyklonaler Kaninchen - Antikörper gegen den N-terminus von iNOS (Millipore, Billerica, MA, USA). Antikörper eNOS: Polyklonaler Kaninchen - Antikörper (Alpha diagnostic, San Antonio, TX, USA) gegen das bovine eNOS32-P Peptid. 1. Tag 1. Entparaffinierung mit 2 x 10 min. Xylol, 3 min. Isopropanol und 3 min. absoluter Alkohol. 2. 30 min. Hemmung der endogenen Peroxidase in 80 % Alkohol (196 mL) mit H2O2 (4 mL). 3. 3 min. 70 % Alkohol. 4. 3 x 5 min. spülen in PBS. 5. 30 min. Vorbehandlung mit TEC (Tris-EDTA-Citrat-Puffer, pH = 7,8) Puffer bei 96 - 99 °C. 6. 20 min. Überschichten mit 1:5 verdünntem inaktivierten Ziegen- Normalserum in PBS bei Raumtemperatur. 7. Erstantikörper iNOS: 1:500 in PBS mit 1 % bovinem Serumalbumin. Erstantikörper eNOS: 1: 2000 in PBS mit 1 % bovinem Serumalbumin. Inkubation über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank. 91 ANHANG 2. Tag 8. 3 x 5 min. spülen in PBS. 9. Zweitantikörper: Anti-Kaninchen-IgG (Envision Rabbit), 45 min. bei Raumtemperatur in Feuchtkammer. 10. 3 x 5 min. Spülen in PBS. 11. Detektion mit 3,3’-Diaminobenzidin (DAB) Envision (1 ml DAB-Puffer + 1 Tropfen DAB Chromogen), 5 min. 12. 5 min. spülen in PBS und 10 min. unter fließendem Leitungswasser. 13. Gegenfärbung: 30 s. in Hämalaun nach DELAFIELD. 14. 15 min. spülen mit fließendem Leitungswasser. 15. Entwässerung mit je 3 min. in 70 % Alkohol, 80 % Alkohol, absolutem Alkohol und Isopropanol. 16. 2 x 5 min. Xylol und Eindecken mit Eukitt. Anhang 5: Immunhistochemische Färbung mit Endothelin-1 Antikörper: Polyklonaler Kaninchen - Antikörper gegen das bovine ET-1 (Fa. Biologo, Kronshagen, Germany). 1. Tag 1. Entparaffinierung mit 2 x 10 min. Xylol, 3 min. Isopropanol und 3 min. absoluter Alkohol. 2. 30 min. Hemmung der endogenen Peroxidase in 80 % Alkohol (196 mL) mit H2O2 (4 mL). 3. 3 min. 70 % Alkohol. 4. 3 x 5 min. spülen in PBS. 5. 20 min. Überschichten mit 1:5 verdünntem Normalserum in PBS bei Raumtemperatur. 92 inaktivierten Ziegen- ANHANG 6. Erstantikörper: 1:50 in PBS mit 1 % bovinem Serumalbumin. Inkubation über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank. 2. Tag 7. 3 x 5 min. spülen in PBS. 8. Zweitantikörper: Anti-Kaninchen-IgG (Envision Rabbit), 45 min. bei Raumtemperatur in Feuchtkammer. 9. 3 x 5 min. Spülen in PBS. 10. Detektion mit 3,3’-Diaminobenzidin (DAB) Envision (1 ml DAB-Puffer + 1 Tropfen DAB Chromogen), 5 min. 11. 5 min. spülen in PBS und 10 min. unter fließendem Leitungswasser. 12. Gegenfärbung: 30 s. in Hämalaun nach DELAFIELD. 13. 15 min. spülen mit fließendem Leitungswasser. 14. Entwässerung mit je 3 min. in 70 % Alkohol, 80 % Alkohol, absolutem Alkohol und Isopropanol. 15. 2 x 5 min. Xylol und Eindecken mit Eukitt. 93 Aus dieser Arbeit sind bisher folgende Veröffentlichungen hervorgegangen: Vorträge D. HARTMANN, Ä. HONNENS, C. PFARRER, D. RATH, H. NIEMANN, H. BOLLWEIN (2010): Effects of a protracted induction of parturition on placental maturation in cattle. In: 43. Jahrestagung Physiologie und Pathologie der Fortpflanzung, München, Februar 2010 D. HARTMANN, H. BOLLWEIN, Ä. HONNENS, C. PFARRER, D. RATH, H. NIEMANN, C. PFARRER (2010): Effects of a protracted induction of parturition on placental maturation in cattle. In: XXVIIIth Congress of the European Association of Veterinary Anatomists, Paris, Juli 2010 94 Danksagung An erster Stelle möchte ich meinem Doktorvater Herrn Prof. Bollwein für die Vergabe des Themas und das in mich gesetzte Vertrauen bedanken, aber auch für die Geduld und den Raum, den er mir bei der Anfertigung dieser Arbeit gelassen hat. Ein großer Dank geht zudem an Frau Prof. Pfarrer, die spontan und mit großer Begeisterung in das Thema eingestiegen ist, als es fast schon zu kippen drohte. Die Versuche zu dieser Arbeit wurden im Rinderstall des Friedrich-Löffler-Institutes in Mariensee durchgeführt. Ohne den unermüdlichen Einsatz und die Begeisterung der dortigen Mitarbeiter wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen. Tee und Kuchen hat uns Doktoranden so manches Mal den Tag versüßt und werden unvergessliche Stunden bleiben. Stellvertretend für alle möchte ich hier besonders Hans-Georg Sander, Rolf Poppinga, Grit Möller, „Jonny“ und Uwe danken. Ein großes Dankeschön geht an Dr. Änne Honnens für die Einführung in das wissenschaftliche Arbeiten und die Dopplersonographie und die Betreuung meiner Arbeit. Bettina Buck aus dem Institut für Pathologie danke ich für die Einbettung meiner Proben. Großer Dank geht an Marion Gähle und Doris Walter vom Institut für Anatomie für die Anleitung und Beratung bei der Anfertigung der histologischen und immunhistologischen Schnitte. Anfangs war nur ein kurzer Aufenthalt bei euch geplant, am Ende war ich über ein Jahr bei euch, welches mir Dank eurer Herzlichkeit nicht schwer gefallen ist. Ein herzliches Danke geht an alle Korrekturleser: Dr. Johannes Lüttgenau, Dr. Jenny Offinger, Hannah Ruhm und Kathrin Müller. 95 Dr. Johannes Lüttgenau ein zusätzliches großes Dankeschön für die Hilfe bei der Statistik und die spontane Übernahme der wissenschaftlichen Betreuung. Auch Kathrin Müller gilt ein extra und herzliches Dankeschön für das unermüdliche Zuhören meiner Vorträge, Sorgen und Nöte und das Lesen dieser Arbeit. Als NichtTiermedizinerin ist sie inzwischen eine Expertin auf dem Gebiet der Nachgeburtsverhaltung beim Rind. Zuletzt geht mein größter Dank an meine Familie. Ihr Vertrauen und ihre Anerkennung sind mit ein stetiger Auf- und Antrieb. Vor allem meiner Mutter, Christel Hartmann, danke ich für den stetigen Ansporn und die Aufmunterung. Meinem Vater, Karl-Heinz Hartmann verdanke ich die Liebe zur Wissenschaft, die er mir schon als Kind mit Begeisterung und leuchtenden Augen anschaulich vermittelte. Wo immer du auch sein magst, in meinem Herzen bleibst du immer lebendig. 96