Tetrazoliumreduktionstest EZ4U Inter-Species Variation

_L_IN_Z_20_0_0_/_P_O_ST_ER
~~--~
Poster
Bewertung yon Industriechemikalien auf
augenreizende Wirkung mit dem XTTTetrazoliumreduktionstest EZ4U
Rene Aschenbach', Renate Klocking' und Hans-Peter Klocking'
Friedrich-Schiller-Universitat
Jena, 'Institut filr Pharmakologie
und Toxikologie/Bereich Erfurt und 2Institut fur Antivirale Chemotherapie,
D-Erfurt
E-mail: hpkloeck@zmkh.ef.uni-jena.de
Die zytotoxische Wirkung von 19 Industriechemikalien,
die auf der Grundlage
des Augenirritationstests
nach Draize den
Klassen
"Nicht
kennzeichnungspflichtig", .Reizt die Augen" (R 36) bzw.
"Gefahr ernster Augenschaden"
(R 41)
angehoren, wurde in humanen U937 -Zellen mit Hilfe des XTT-Tetrazoliumreduktionstests EZ4U untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die halbmaximalen zytotoxischen Konzentrationen
(CCso) nach
1- und 24-stiindiger Exposition positiv
(r=0,760) mit den Scorewerten der KonjunktivaJchemosis
des Augenirritationstests korrelieren. Auch die Rangkorrelation erwies sich als signifikant positiv.
Weiterhin
korrelierten
die im XTTTetrazoliumreduktionstest
ermittelten
CCso-Werte mit denen des NeutralrotAufnahme (NRU)-Tests (r=0,884 fur die
24-stiindige Exposition) und mit den Minimal toxischen Substanzkonzentrationen
(MTK) des l[H]Arachidonsaure-Freisetzungs- Tests (r=0,705). Dagegen bestand
keine
Korrelation
zu den an der
Chorionallantoismembran
des bebruteten
Huhnereis erhaltenen
Ergebnissen
des
HET-CAM- Tests.
Urn die Klassifizierung der Substanzen
in "augenreizend"
bzw. .nicht augenreizend" auf der Grundlage des ChemosisScores (Score- Werte ez bedeuten "augenreizend") und der CCso-Werte des XTTTetrazoliurnreduktionstests
vergleichen zu
konnen, wurde die Grenzkonzentration
fur
die beiden Expositionsintervalle
nach
Chiba et al. (Toxic in Vitro 13 (1999), 189198) berechnet. Danach lie Ben sich mit
Hilfe des XTT- Tests mit einer Sensitivitat
von bis zu 90,9% die in vivo als augenreizend eingestuften Substanzen auch in vitro als so1che erkennen. Die Rate an
.falsch negativ" eingestuften Testsubstanzen lag bei 5%, die der sogenannten
.falsch positiv" eingestuften betrug 34%.
Ursache fur die vom Augenirritationstest
abweichende Bewertung waren im Faile
der .falsch negativen" Befunde entweder
die zu hohe Aziditat in vivo oder die
Schwerloslichkeit
der betreffenden Testsubstanzen in wassrigen Medien, im Faile der .falsch positiven" Befunde eine
generell hohere Empfindlichkeit
des in
vitro Tests gegeniiber dem in vivo Test.
Gerade letztere weist den Test aber als eine
hochpotente alternative Testmethode zum
Augenirritationstest
aus. Falsch negative
Bewertungen von Substanzen lassen sich
vermeiden, wenn bei der Anwendung des
Tests klar definierte Kriterien beriicksichtigt werden, die z.B. den pH-Wert verandernde und schwerlosliche
Substanzen
von der Testung ausschlieBen, mindestens
aber Anlass sind, das Ergebnis kritisch zu
hinterfragen.
Poster
Inter-Species Variations in Ochratoxin A Protein
Binding and Uptake
Daniel R. Dietrich', Evelyn O'Brien', Alexandra Heussner', Michael Stock', Klaus
Hochberg' and Billy W Dal
'Environmental
Toxicology, University of D-Konstanz, 2Food and Drug Administration, USA-Washington
DC, lUrology, Klinikum D-Konstanz, "Department of Occupational Health, University of Pittsburgh, USA-Pittsburg, PA
E-mail: Daniel.Dietrich@uni-konstanz.de
Chronic dietary intake of ochratoxin A
(OTA) via contaminated
food (bread,
beer, coffee, wine, meat) has been associated with increased
incidences
of
urothelial tumors and nephropathy in humans (e.g. Balkan Endemic Nephropathy,
BEN). It has also been demonstrated
to
be carcinogenic in rodents, with distinct
species- and sex-differences
in susceptibility. Despite several acute, sub-acute
and chronic whole animal studies in diverse species, the basis for these sensitivity differences remains to be elucidated.
Such differences could arise from variations in cellular OTA uptake and/or bind-
102
ing characteristics. Therefore, the aims of
this study were to investigate these parameters in vitro using relevant tissue
homogenates and cell culture models for
comparison with in vivo and epidemiological observations. Protein binding studies were carried out using a classical competitive
assay
using
lH-OTA
and
homogenates
from human, porcine, rat
and mouse renal cortex tissue. Speciesspecific binding capacities were observed:
human » rat> pig> mouse. OTA bound
human and porcine homogenates
with
higher
affinity
than rat and mouse
with
regard
to competition
with
bromosulfophthalein
(BSP). This binding
could be inhibited in a concentration-dependent manner by piroxicam, indomethacin, nalidixic acid, ethacrynic acid, furosemide and probenecid,
but not with
fumonosin
B 1, para-aminohippurate
(PAH) and several bile acids. lH-OTA
uptake was measured over 60 mins in human (HKC) and porcine (PKC) primary
renal epithelial cells and in the NRK52E
and LLC-PK 1 cell lines. Uptake over time
remained relatively constant, however,
distinct differences were observed in the
amount of lH-OTA taken up by the different cell types. Both HKC and PKC displayed a 10-15 fold higher uptake than
that observed in LLCPK-l and NRK-52E
cells. The species-differences
observed in
this study reflect those observed by previous authors in whole animal studies and
therefore, provide a good basis for further mechanistic investigations.
Keywords: Cell culture, Renal carcinogenesis, Inter-species variation
ALTEX 18, 2/01
~~
LINZ
2000 /
MULLER ET AL. / POSTER
--~~----------------------------~~
enhance UVA-induced
Photochem. Photobiol.
174-18l.
skin tumors. 1.
B: Biology, 37,
Loprieno, N. (1991). PREAMBLE In vitro
assay systems for testing photomutagenic chemicals. Mutagenesis 6, 331-333,
with reference to: SCC Guideline CSC/
803-5/90 Commission of the European
Communities Scientific Committee for
Cosmetology. Guidelines for assessing
the potential for toxicity of compounds
used as sunscreen agents in cosmetics.
Snyder, R. D. and Cooper, C. S. (1999). Photogenotoxicity of fluoroquinolones in Chinese hamster V79 cells: dependency on active topoisomerase Il, Photochem. Photobioi. 69, 288-293.
Stem,R. S. and Laird, N. (1994). Thecarcinogenic risk of treatment for severe Psoriasis.
Cancer 73, 2759-2764.
Stern, R. S., Nichols, K. T. and Vakeva,
L. H. (1997). Malignant melanoma in
patients treated for psoriasis with methoxsalen (psoralen) and ultraviolet A
radiation (PUVA). New Eng. 1. Med.
336,1041-1045.
Korrespondenzadresse
Dr. Lutz MUlIer
Novartis Pharma AG
WSH 288l.228
CH-4002 Basel
Tel. +41 61 3241 797
Poster
ATLA, 27, 471-484). ESC based reporter
A New Transgenic Embryonic Stem Cell Clone with
Endodermal GFP Expression as Part of a Reporter
Gene Test Battery for Embryotoxicity
gene assays are currently being developed. They should allow quantification
of the effects of chemicals on the development of germ layers and main target
tissues. In this study we describe the establishment of an ESC clone transfected
with the GFP reporter gene under the control of alpha fetoprotein (AFP) regulatory
regions. AFP is used as a marker for visceral and definitive endodermal in vitro
differentiation. GFP expressing cells were
characterised and chemical effects on the
ESC differentiation into endodermal cells
were analysed. The relevance of the new
clone for in vitro embryotoxicity
testing
is discussed.
Martin Paparella and Susanne Bremer
ECVAM, Institute for Health and Consumer
Research Centre, I-Ispra
E-mail: martin.paparella@jrc.it
The capability of pluripotent embryonic
stem cells (ESC) to differentiate in vitro
into different tissues provides an opportunity to develop an in vitro assay for
screening
chemicals
for
their
embryotoxic
potential. Several groups
Protection,
European
Commission,
Joint
have reported attempts to identify the
most suitable toxicological
endpoints.
(1991,5,5764, Laschinsky et al., 1991,
Reproductive.
Toxicology,
5, 57-64;
Spielmann et al., 1997, In Vitro Toxicology, 10, 119-126; Bremer et al., 1999,
Poster
Comparison of Cytotoxic Effects of Ochratoxin A and
B on Human, Rat and Porcine Renal Cells
Heussner', Michael Stack', Klaus Hochberg' and Daniel R. Dietrich'
'Environmental Toxicology, University of D-Konstanz, 2Food and Drug Administra-
Alexandra
tion, USA-Washington
D.C, 3Urology, KJinikum Konstanz,
D-Konstanz
E-mail: Danie1.Dietrich@uni-konstanz.de
Chronic ingestion of the ubiquitous mycotoxin ochratoxin A (OTA) via contaminated
food (bread, beer, coffee, wine, meat) has
been associated with increased incidences of
urothelial tumors and nephropathy in humans
(e.g. Balkan Endemic Nephropathy, BEN).
It has also been demonstrated to cause nephropathies in pigs and to be carcinogenic in
rodents. Susceptibility to OTA toxicity displays large species- and sex-differences, the
cause(s) of which are unknown but could
ALTEX IS, 2/01
relate to differences in cytotoxic responses.
This study investigated the cytotoxic effects
of OTA and its less toxic structural analogue
OTB on primary renal cortex cells from humans (biopsy material), both sexes of F344
rats, and from improved German hybrid pigs
and a porcine renal cell line, LLC-PKI, in
an attempt to characterise the observed in vivo
differences using in vitro test systems. Cells
were exposed to OTA and OTB at concentrations ranging from 1 nM to 100 /..IM for
24 to 96 hours. Following incubation several standard cytotoxicity endpoints were
assessed: Neutral red uptake, MIT reduction and cell number analyses (Coulter COUDter) to show differences in proliferation. Supravital fluorescent staining techniques as
well as electron microscopy were employed
to detect toxin-induced
morphological
changes. A range of fluorescent labeled antibodies to cytoskeletal proteins (e.g. vimentin,
cytokeratins, actin, talin, tubulin) were used
to demonstrate OTA- and OTB-induced
morphological changes. Although all ceJls
showed similar toxin-induced alterations,
distinct species-differences were observed
with respect to their relative sensitivities:
porcine kidney cells> human kidney cells>
rat kidney cells/ LLCPK - I.Therefore some
of the observed species-differences in sensitivity to OTA (and OTB) toxicity in vivo can
be demonstrated using in vitro models.
121
_L_IN_Z_2_0_00_1
~!~--
P_O_S_TE_R
~,c'
Poster
Die erste "Catch-Up" Validierungsstudie: Die EU
akzeptiert den Epiderm'?" Haut-Korrosivitatstest
Manji'ed Liebsch', Dieter Traue', Christa Barrabas', Horst Spielmann',
Patricia Uphill", Susan Wilkins2, Janet Me Pherson',
Christiane Wiemann3, Tanja Kaufmann), Martina Remmele' und
Hans-Georg Holzhiater'
IZEBET, BgVV, D-Berlin, 2Huntingdon Life Sciences, UK-Huntingdon,
D-Ludwigshafen,
"Humboldt Universitat, D-Berlin
E-mail: zebet@bgvv.de
Am 8. Juni 2000 hat die EU Kommission
im Amtsblatt der EU zwei experimentell
erfolgreich validierte in vitro Tests zur PrUfung auf Atzwirkung an der Haut als neue
offizielle Prufmethoden veroffentlicht und
fur behordliche Zwecke in den EU Mitgliedsstaaten akzeptiert, die ab I. Oktober
2001 in allen EU Mitgliedsstaaten anstelle
von Tierversuchen durchgeflihrt werden
mussen, In einem der beiden in vitro Tests
wird Rattenhaut eingesetzt und im zweiten das kommerziell, biotechnologisch hergestellte EPISKINTM Modell der menschlichen Haut. Leider steht das EPISKINTM
Kunsthautmodell nicht mehr kommerziell
zur VerfUgung. Deshalb hat ZEBET mit
dem EpiDerm ™ Kunsthautmodell, das von
der Finna MatTek in den USA hergestellt
wird, entspreehend
der von der EU fur
EPISKINTM akzeptierten Methode einen in
vitro Test zur Priifung auf Atzwirkung entwickelt und erfolgreieh international validiert. In dieser ersten erfolgreiehen "CatchUp" Validierungsstudie konnten wir in drei
Laboratorien und mit einer begrenzten Zahl
3BASF AG,
yon Prufsubstanzen zeigen, dass fur EpiDerm ™ die Ergebnisse, die bei Priifung mit
dies em Hautmodell erzielt werden, mit
den en ubereinstimmen, die mit dem EPISKINTM Modell erzielt werden. Aufgrund
dieses Ergebnisses hat ESAC (ECVAM
ScientificAdvisory Committee), der wissensehaftliehe Beirat des EU Validierungszentrurns ECV AM, auf seiner Sitzung im Marz
2000 besehlossen, dass der in vitro Toxizitatstest auf Atzwirkung an der Haut auch
mit dem EpiDerm ™ Hautmodell durehgeflihrt werden kann, da dieser Test die wissensehaftliehen Akzeptanzkriterien erfullt,
die in del' EU Priifrichtlinie fur den EPISKINTM Test auf Atzwirkung definiert sind.
Die von ZEBET koordinierte Catch-Up
Studie wurde mit dem EpiDennTM Hautmodell in 3 Laboratorien
unter blinden
Bedingungen durchgefuhrt, Es wurden fur
diese begrenzte Validierungsstudie
yon
ECVAM 24 Stoffe ausgewahlt, die bereits
in der "ECVAM Skin Corrosivity Validation Study" gepriift worden waren. Es wurde jedoeh auf die Testung aller 50 Stoffe,
Poster
Ergebnisse des Ernbryonalen Starnrnzelltests (EST) in
einer ECVAM Validierungsstudie
Elke Genschow', Gabriele Scholz', Klaus Becker, Susanne Bremer', Nicole Clemann':
und Horst Spielmann I
IZEBET, BgVV, D-Berlin, 2Sehering AG, D-Berlin,
Novartis, CH-Basel
E-mail: zebet@bgvv.de
1m Rahmen der ECVAM Pravalidierungsund Validierungsstudie wurden unter blinden Bedingungen 20 Testsubstanzen in vier
Laboratorien
getestet. Es wurden seehs
stark embryotoxisehe
Stoffe mit hohem
zytotoxischen Potential, sieben sehwaeh
embryotoxisehe
Substanzen und sieben
nieht embryotoxisehe
Substanzen unter-
122
3ECVAM, IRC, I-Ispra, "Pharma
sueht. Ein Kriterium ftir die Wahl der Chemikalien bestand in der hohen Qualitat der
in vivo Daten sowohl beirn Mensehen als
aueh irn Tierversueh.
FUr den EST konnte mit Hilfe der Diskriminanzanalyse
ein Pradiktionsmodell
entwiekelt werden, wobei Daten aus einer
parallel laufenden Studie zur Modellbil-
die in der ECVAM Studie gepruft wurden,
verzichtet, urn die Studie zu verkiirzen,
ohne die Aussage einzuschranken.
Jeder
Stoff wurde 2-mal in jedem Labor getestet
und an der Humboldt Universitat biometrisch ausgewertet. Die Analyse des Biometrikers
zeigte eine Sensitivitat
yon
87.5% und eine Spezifitat von 86.1 % im
neuen EpiDennTM Test. Dabei unterschieden sich die Einstufungen in den einzelnen Laboratorien nieht signifikant von einander.
Mit diesem Erfolg hat ZEBET beweisen
konnen, daB es mit Hilfe begrenzter Validierungsstudien moglich ist zu zeigen, dass
ein neuer in vitro Toxizitarstest, bei dem
neue Zellen oder Gewebe eingesetzt werden, dieselben Ergebnisse liefem kann, wie
ein bereits erfolgreieh validierter in vitro
Test. Da in einer solchen begrenzten Studie nur das Ergebnis einer frUheren Validierungsstudie bestatigt werden soil, wird
sie engliseh "Catch-Up" Studie genannt.
Eine solche Studie ist sehr vie] billiger, und
sie fuhrt raseher zum Erfolg als eine umfangreiche formale Validierungsstudie. Die
Catch-Up Validierungsstudie mit einer neuen in vitro Methode zur Prufung auf Atzwirkung an der Haut mit dem EpiDerm™
Hautmodell ist die erste erfolgreiehe CatchUp Studie.
Aufgrund dieses Erfolges wird ECVAM
in Zukunft die Anforderungen an den Umfang einer Validierung auf eine Catch-Up
Studie beschranken, wenn nachgewiesen
werden soll, dass neue ZeJlen oder Gewebe in einem bereits ausfuhrlich validierten
in vitro Test verwendet werden konnen.
dung herangezogen wurden, in der zehn
Stoffe untersucht wurden. FUr das Pradiktionsmodell wurden die drei Endpunkte:
IC50 (Zytotoxizitat) in 3T3 Zellen, IC50 (Zytotoxizitat) in ES-Zellen und die relative
Differenz zwischen IClO in 3T3 Zellen und
IDlO in der Differenzierung von ES-Zellen
mit der Diskriminanzanalyse
ennittelt.
Bei der Untersuchung der Intra- und Interlaborvarianz wurden einige wenigeAusreiBer (Cochran und Grubbs Test) nachgewiesen. Die Anwendung des Pradiktionsmodells auf die Ergebnisse der Validierung
erbraehte fur die vier Laboratorien
im
Schnitt eine etwa 80%ig riehtige Zuordnung aller 20 Stoffe. Hervorzuheben ist die
100%ig korrekte Vorhersage (Pradiktion)
ftir stark embryotoxisehe Substanzen.
ALTEX 18,2/01
wn
LINZ
2000 /
POSTER
--~~-------------------------~c~
Poster
High Correspondence of Botulinum Neurotoxin Cl
(BoNtCl) Detection by Mouse Bioassay and
Corresponding Gene Detection by PCR after
Enrichment with Cooked Meat Medium: An
Alternative for the Mouse Bioassay Investigating the
Presence of Viable BoNtCl Toxigenic Clostridia
Thomas Christian Zechmeister', Alexander Konrad Theodor Kirschner', ALexander
Eiler', Sylvia Kolbl', ALois Herzig", Friedrich Pittner', Renate Rosengarten', Robert
Ludwig Mach" and Andreas Herbert Farnleitner"
'Inst, of Bacteriology, Mycology and Hygiene, University of Veterinary Medicine, AVienna; 2Inst. of Medical Biology, University A-Vienna; 3Federal Institute for Veterinary Medical Examination, A-Moedling; "Biological Research Institute of Burgenland,
A-Illmitz; 5Inst. of Biochemistry and Molecular Cell Biology, Vienna Biocenter, University A-Vienna; "lnstitute of Biochemical Technology and Microbiology, Technical
University, A-Vienna
E-mail: thomas.zechmeister@vu-wien.ac.at
Avian botulism, a paralytic and most often fatal disease, is considered an intoxication of birds caused by the active ingestion of pre-formed botulinum neurotoxin from the surrounding environment
and can be a critical factor in the protection of species especially for endangered
ones. The toxin is produced by BoNt-toxigenic clostridia cells/spores under suitable anaerobic conditions. Among the
seven well known BoNt types designated
from A to F, avian botulism
is
predominatly caused by type Cl toxin
(BoNtCl). Toxin detection is performed
Poster
Antiproliferative and Cell Cycle Specific Effects of
Ochratoxin A in LLCPK.l, NRK·52E and Porcine
Primary Proximal Kidney Cells
Stefanie B. Dreger, Evelyn 0' Brien and Daniel R. Dietrich
Environmental Toxicology, University of D-Konstanz
E-mail: DanieI.Dietrich@uni-konstanz.de
Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin produced as a secondary metabolite by certain Aspergillus and Penicillium species.
It is commonly found as a contaminant of
both human and animal foodstuffs. All
human blood samples tested to date have
proved positive for OTA. Average daily
intake in humans is estimated to be approximately 5-10ng/kg. OTA has been
demonstrated to induce nephropathy as
well as to be immunotoxic in pigs
(antiproliferative effect in T-cells), teratogenic in several species and to cause renal tumours in rodents following chronic
ALTEX 18, 2/01
dietary intake. A disruption in the normal
cellular proliferation control could contribute to the observed induction of nephropathy, imrnunotoxicity and teratogenicity of
OTA as well as to its carcinogenic effects.
Therefore, we investigated the effect of
OTA on proliferation rates of LLCPK-l,
NRK-S2E and porcine primary proximal
kidney cells (PKC) following acute exposure. Cells were exposed to increasing concentrations of OTA over 24,48 and 72hrs.
Antiproliferative effects were determined
using a Coulter counter. The concentration
producing a 50% proliferative arrest (GIso)
by means of the only available and appropriate mouse bioassay, an expensive,
laborious and increasingly ethically questionable technique. In this work, an alternative based on PCR investigating the
presence of toxigenic of viable BoNtCl
toxigenic clostridia was developed and
evaluated.
The potential of BoNtCl production of
environmental and avian samples after
enrichment with cooked meat media
(CMM) was detected by the conventionally used mouse bioassay. In order to
evaluate alternatives, a nested PCR targeting the corresponding BoNtCl gene
was adapted for gene detection before and
after the CMM enrichment step. A
(highly) significant correlation between
the mouse bioassay and the PCR after
CMM enrichment could be observed. In
contrast, PCR BoNtCl of unamended
samples (no CMM enrichment) showed
low correlation with mouse bioassay.
We suggest the PCR technique, using
CMM enriched samples, as an alternative
for the currently used mouse bioassay for
testing the presence of viable BoNtCl
toxigenic Clostridia in environmental and
veterinary samples.
in LLCPK-I and NRK-53E cells lines was
211lM, with PKCs displaying a GI50 of
lSIlM. Standard flow cytometric analysis
of propidium iodide stained DNA was used
to investigate the nature of this growth inhibitory effect. OTA was found to increase
the percentage of cells residing in the G2/
M phases of the cell cycle. More detailed
analysis, (fluorescence-microscopic mitotic index ofHoechst-stained DNA) demonstrated no increased numbers of cells in
M-phase thus suggesting an OTAmediated
specific blockade of the cell cycle located
to the G2 phase in all three cell types. As
the G2 phase of the cell cycle is where
proof-reading of replicated DNA and intracellular protein expression (cyclins,
cdks) occur before entry into mitosis, an
increased residency of cells in this cell
cycle phase could indicated dysregulated
proliferative control which could be a factor in disease development.
Keywords: Cell cycle, Renal carcinogenesis
131
_L_m_Z_~2_0_0_0_/_P_O_ST_ER
~~
_
~c'~,
Poster
Ermittlung der Startdosis aus Zytotoxizitatsdaten vor
der Bestimmung der akuten oralen Toxizitat
Willi Halle, Horst Spielmann, Elke Genschow und Manfred Liebsch
ZEBET (BgVV), D-Berlin
E-mail: zebet@bgvv.de
Zum Zwecke der Reduzierung von Tierversuchen zur Bestimmung der akuten oralen Toxizitat entwickelten wir auf praktische Belange zugeschnittene
Verfahren,
urn mit Hilfe von in vitro Zytotoxizitatsdaten die Startdosis eines Stoffes fur die
nachfolgenden
in vivo Tests vorherzusagen. Dazu dienen die Daten im Register
der Zytotoxizitat (RC), in dem von 347
Stoffen neben der mittleren IC50 (IC5o)
auch die akuten oralen LDso-Werte (LD50
p.o.) fur Ratte/Maus verzeichnet sind (HaIle, 1998). Mit dem einfachen linearen Regressionsmodel! wurde fur die log-transformierten 347 Wertepaare ICsox-LDsop.o.
eine Standardregressionsgerade
mit den
Parametem Intercept a=0,625 und Regressionskoeffizient b=0,435 erstellt. Yon den
347 Stoffen liegen 252 Stoffe (72,6%) in
einem Dosisbereich urn die Regressionsgerade, der durch den empirischen Faktor
F G :::; log 5 mit der oberen und unteren Pradiktionsgrenze definiert ist.
Im nachsten Schritt wurden die Daten
im RC zusammen mit dem Regressionsmodel! ICsox aufLDsop.o. zur Einstufung
der 347 Stoffe des RC in die vier EU-Toxizitatsklassen fur die akute orale Toxizitat und fur vergleichende Untersuchungen
von neun Stoffen aus einer Arbeit von Lipnick et al. (1995) verwendet, die im RC
registriert sind und von denen die Autoren
im Tierversuch mit der "Up and DownProcedure" (UDP) die orale LDso in mg/
kg ermittelten.
Mit den Daten des RC
konnte fur sieben der neun Stoffe der gleiche LDso-Dosisbereich vorhergesagt werden, der auch fur die LDso-Werte gilt
(Spielmann et al., 1999). Nur zwei der neun
Stoffe weichen mehr als eine Grobenordnung einer Dosiseinheit von den in vivo
Werten ab. Diese zwei Stoffe sind demnach auberhalb der durch den Faktor F G
definierten Pradiktionsgrenzen
lokalisiert.
Die Ergebnisse mit den neun Stoffen
lassen eine weitere Moglichkeit erkennen,
Poster
Permanent Female and Male EG-Cell-Lines of Balbi
CJ Mice - an Alternative Concept for Reproductive
Toxicity Testing?
Martina Klemm, Elke Genschow, Manfred Liebsch and Horst Spielmann
ZEBET (BgVV), D-Berlin
E-mail: zebet@bgvv.de
While several in vitro tests are available
for replacing animal experiments in baselevel screening of new substances, few
have been defined adequately for quantitative studies in reproductive toxicology.
In order to offer a sensitive and predictive
in vitro method to assess the genotoxic
potential of chemical agents on male and
female reproduction, we established primordial germ (PG) cell-derived permanent
female and male embryonic germ (EG) and
embryonic
stem (ES) cell lines of the
mouse (strain Balb/cl). All EG and ES cell
132
lines were characterised
(by PCR and
karyotype) and periodically checked for
quality criteria like alkaline phosphatase
activity and mean generation time (MGT)
to ensure clone stability.
The differences in developmental sensitivity of EG cells, ES cells and differentiated fibroblast cells of the mouse cell line
3T3 regarding genotoxicants were comparatively tested under identical test conditions. Cytotoxicity assay was based upon
determination of growth inhibition (MTTtest) and genotoxic effects were determined
mit den RC-Daten die LD50 vorherzusagen. Fur diesen Zweck wird ein schrittweises in vitro! in vivo Verfahren vorgeschlagen. Irn ersten Schritt wird eine laboreigene Zelllinie (z.B. 3T3) an die Bedingungen des Regressionsmodells
im RC
angepasst. Anschlielsend kann mit dieser
Zelllinie von neuen Stoffen, fur die Tierversuche vorgeschrieben sind (z.B. Industriechernikalien),
die Starke der Zytotoxizitat (ICso) bestimmt werden. Aus den
ICso-Werten lasst sich dann die LDso in mg!
kg vorhersagen. Das hier vorgestellte Verfahren kann prinzipiell auch zur Pradiktion der intravenosen LDso (LDso i.v.) bei
der Neuentwicklung
von Arzneistoffen
iibemommen werden (Halle, 1998).
Literatur
Halle, W. (1998). Toxizitdtsprufungen in
Zellkulturen fur eine Vorhersage der
akuten Toxizitdt (LDso)zur Einsparung
von Tierversuchen. Julich: Schriften des
Forschungszentrums
Jiilich: Reihe Lebenswissenschaften/
Life Sciences,
Band 1,92 Seiten.
Spielmann, H., Genschow, E., Liebsch, M.
et al. (1999). Determination of the starting dose for acute oral toxicity (LDso)
testing in the up and down procedure
(UDP) from cytotoxicity data. ATLA 27,
957-966.
by sister chromatid exchanges (SCE) induced by standard reference mutagens like
Ethylnitrosourea (ENU), Methylnitrosourea
(MNU), Methylmethansulfonate
(MMS),
Hydroxyurea
(HU) and Mitomycin
C
(MMC). After calibrating the in vitro EG
cell assay by testing positive and negative
control substances, we are now starting to
clarify if our in vitro test system can reliably and reproducibly discriminate between
known genotoxic and non toxic agents.
Furthermore, a distinction between different degrees of genotoxic effects is mandatory for our assay. To classify the genotoxic
potential of all tested chemicals we will
develop a biostatistical prediction model on
the basis of concentration-response
curves
and exclusion of a major impact of cytotoxicity. Finally, we would like to establish an additional in vitro test focusing on
EG cell progression
through meiotic
prophase as predictive endpoint for sexspecific genotoxicity testing.
ALTEX 18, 2!01