Journal Club - BIOspektrum

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WISSENSCHAFT · JOURNAL CLUB
ÿ Ligninspaltung durch Nickelkatalyse
ÿ Genetik der Schizophrenie – hohe de novo-Mutationsrate
ÿ Salmonellen: die dunkle Seite des Salats?
ÿ Agrobakterien-analoges DNA-Transfersystem beim Menschen
Lothar Jaenicke1
Jochen Graw2
Nadine Hertrich3
Ligninspaltung durch Nickelkatalyse
Lignine sind Polymere auf Basis von
hydroxy(methy)lierten Zimtalkoholen,
aber so dreidimensional vernetzt, dass
sie praktisch unlöslich und unspaltbar
sind. Nur einige holzzerstörende Pilze
haben ligninolytische Mangan(III)-Peroxidasen entwickelt, die mithilfe von Wasserstoff- und Mn-Peroxid-Radikal langsam
in die Netzmaschen eingreifen und sie als
Oxalat oder Malat dem Stoffwechsel
zugänglich machen. Man sucht nach Verfahren, diese Vorratsquelle an potenzieller Bioenergie technisch anzuzapfen. Als
praktikabler Vorschlag erscheint die
selektive katalytische Hydrogenolyse der
Arylether-Strukturen mittels Nickelkomplex-Katalysatoren unter milden Bedingungen (120 °C/1 bar H2) von A. G. Ser-
geev und J. F. Hartwig (Science (2011)
332:439–443).
ó Das Grundkonzept ist, in homogener Lösung einen löslichen Komplex aus einem billigen Übergangsmetall (bis-1,5-CyclooctadienylNickel, Ni(COD)2) mit einem gut zugänglichen
Carbenliganden-Vorläufer (N,N’-2,5-Diisopropyl-imidazoliumchlorid) in die aromatische CO-Bindung einzusetzen und die entstehende
Zwischenverbindung mit H2 zu Aren und Alkohol zu spalten. Verwendet werden 20 Molprozent des Ni-Komplexes. Unter diesen milden
homogenen Bedingungen ist die konkurrierende Hydrierung der aromatischen Systeme
zu Cycloalkanen und -alkanolen sehr langsam.
Im obigen Versuchsansatz werden (substituierte) Diphenylether quantitativ, Alkylarylether ebenfalls, aber signifikant langsamer, zu
mehr als 90 Prozent in Aren und Alkohol hydrogenolysiert. Zusatz von nachhelfenden Lewissäuren, wie Al(CH3)3, ist überflüssig. Hg2+ konkurriert nicht. Das weist bestätigend auf eine
homogene Katalysereaktion des Ni-Komplexes
hin.
Y Da alle Arten von intermonomeren Bindungen in Lignin in guter Ausbeute mit ausreichender und ähnlicher Geschwindigkeit
gespalten werden, scheint sich das Verfahren
grundsätzlich zum reduktiv-chemisch-katalytischen Aufschluss von Lignin anzubieten. Nun
sind die Chemie- und Verfahrensingenieure aufgerufen, den Mechanismus zu optimieren, die
Biotechnologen, Organismen schöpferisch-kombinatorisch zu kreieren oder von Grund auf
synthobiologisch zu inventieren, die mit dieser
Nahrung fertigwerden. Lothar Jaenicke ó
Genetik der Schizophrenie – hohe de novo-Mutationsrate
Schizophrenie ist eine komplexe psychiatrische Erkrankung mit einem weiten
Spektrum klinischer Manifestationen. Die
Erblichkeit wird mit 80 Prozent angegeben, wobei die klassische Mendel’sche
Genetik kaum Antworten geben kann,
sondern eher ein komplexer genetischer
Ansatz mit einer Reihe von Anfälligkeitsgenen: Die Online-Datenbank menschlicher Erbkrankheiten listet heute
26 Gene auf, die mit Schizophrenie verbunden sind (OMIM 181500; http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/omim). Simon Girard
aus Montreal hat nun mit 21 Ko-Autoren
einen neuen Ansatz gewählt: In 14 kleinen
Familien („Trios“: Vater, Mutter, Kind mit
Schizophrenie) haben sie alle Exons
sequenziert (Exom-Sequenzierung) und
dabei 15 Mutationen gefunden, die zwar
in den Probanden, nicht aber in den Eltern
vorkamen (Girard SL et al., Nat Genet
(2011) 43:860–863).
ó Einige der Probanden wiesen dabei drei
neue Mutationen auf, andere gar keine; vier von
diesen de novo-Mutationen führen zu vorzeitigen Stopp-Codons. Die Autoren betonen, dass
diese Zahlen jeweils signifikant über dem Erwartungswert liegen. Allerdings ist unter den
Genen, die von diesen Neumutationen betroffen sind, keines, das bisher zu den Kandidatengenen für Schizophrenie gezählt worden wäre. Insgesamt ist über die betroffenen Gene wenig bekannt und es gibt nur in einem Fall Mausmutanten dazu – aber die Kpna1-Knockout-Mutanten zeigen keinerlei Auffälligkeiten, auch
nicht in Verhaltenstests. Diese Studie zeigt einen Weg, wie in sporadischen Fällen genetische
Aspekte berücksichtigt werden können.
Y Die Exom-Sequenzierung ermöglicht relativ
kostengünstig die komplette Sequenzierung
aller codierenden Regionen, da diese nur etwa
ein Prozent des Genoms ausmachen. Man
nimmt aber an, dass man dadurch etwa 85
Prozent aller krankheitsrelevanten Mutationen finden kann. Die obige Arbeit zeigt die
Stärke dieser Methode: die Identifikation neuer Mutationen. Was aber offenbleibt, ist ihr
Beitrag zu der jeweiligen Krankheit: Das Gen
muss in neuen Mausmodellen getestet und
Funktionsanalysen müssen durchgeführt werden – und man kann Wechselwirkungen untersuchen, z. B. eine Dreifachmutante herstellen,
um die Kombinationen der drei Neumutationen zu untersuchen, die man in einigen Patienten gefunden hat.
Jochen Graw ó
1 Institut f. Biochemie, Universität zu Köln, Zülpicher Straße 47, D-50674 Köln
2 Helmholtz Zentrum München – Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt GmbH, Ingolstädter Landstraße 1, D-85764 Neuherberg,
graw@helmholtz-muenchen.de
3 Department für Infektiologie, Parasitologie, Universitätsklinikum Heidelberg, Im Neuenheimer Feld 324, D-69120 Heidelberg, Nadine.Hertrich@med.uni-heidelberg.de
4 Falkenstraße 87, D-58553 Halver, jtmsander@gmx.de
5 Lehrstuhl für Ökologische Mikrobiologie, Universität Bayreuth, Dr.-Hans-Frisch-Straße 1–3, D-95440 Bayreuth, katharina.palmer@uni-bayreuth.de
6 Zentralinstitut für Ernährungs- und Lebensmittelforschung, Abteilung Mikrobiologie, Weihenstephaner Berg 3, D-85350 Freising, thilo.fuchs@wzw.tum.de
7 Medizinische Hochschule Hannover, Carl-Neuberg-Straße 1, D-30625 Hannover, seifert.roland@mh-hannover.de
8 MPI für terrestrische Mikrobiologie, Karl-von-Frisch-Straße 10, D-35043 Marburg, liesack@mpi-marburg.mpg.de
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Johannes Sander4 Katharina Palmer5 Thilo M. Fuchs6
Roland Seifert7
Werner Liesack8
Salmonellen: die dunkle Seite des Salats?
EHEC in Gurken? Listerien in der Melone?
Salmonellen im Salat? Pathogene Bakterien können sich durchaus in kritischer
Zahl auf Gemüse und Früchten befinden,
innerhalb derselben sind diese Krankheitserreger in aller Regel jedoch nicht zu
finden. Denn anders als phytopathogene
Mikroben, so die herrschende Lehrmeinung, infizieren sie keine Pflanzen und
vermehren sich nicht innerhalb des
pflanzlichen Gewebes.
ó Die gute Nachricht lautet deshalb: Verbraucher können sich durch Beachtung der üblichen Küchenhygiene vor Infektionen schützen. Die schlechte Nachricht: Dieses Dogma
wird in den letzten Jahren zunehmend durch
Studien herausgefordert, die die Infektion von
Arabidopsis thaliana, Salat oder Sprossen
durch humanpathogene Bakterien beschreiben und beispielsweise die Induktion und
Überwindung des pflanzlichen Immunsystems
und einen intrazellulären Lebenszyklus der
Bakterien postulieren. Teilnehmer einer fran-
zösisch-österreichischen Kooperation glauben,
weitere Details aufgedeckt zu haben (Schikora A et al., PloS One (2011) DOI:10.1371/journal.pone.0024112): Das Typ-3-Sekretionssystem von S. enterica Serovar Typhimurium spiele bei Tieren wie bei Pflanzen eine gleich wichtige Rolle und aus pflanzlichen Zellen isolierte
Salmonellen behielten ihre Virulenz gegenüber
Tieren bei.
Y Hätten die Autoren recht, kämen beträchtliche Konsequenzen auf die Lebensmittelsicherheit, das Risikomanagement und die Etablierung von Nachweisverfahren zu. Allerdings
zeigen diese und andere Publikationen erhebliche Schwächen: Das methodische Vorgehen
ist artifiziell und die Statistik lückenhaft, wichtige Kontrollen fehlen und alternative Hypothesen werden nicht geprüft. Eine Infektion von
Pflanzen durch humanpathogene Bakterien
unter natürlichen Bedingungen wurde bislang
nicht zweifelsfrei nachgewiesen.
Thilo M. Fuchs ó
Agrobakterien-analoges DNA-Transfersystem
beim Menschen
Typ-IV-Sekretionssysteme (T4SS) wurden
ursprünglich für den konjugativen Transfer der DNA zwischen Bakterien entwickelt. Im Lauf der Evolution erwarben sie
auch die Fähigkeit für den Proteintransport in Bakterien- und Eukaryotenzellen.
Das Paradebeispiel für ein T4SS ist das
VirB/VirD4-System, mit dem Agrobacterium tumefaciens seine T-DNA sogar in
Pflanzenzellen einschleusen kann.
ó G. Schröder et al. (Proc Natl Acad Sci USA
(2011) 108:14643–14648) wiesen bei Bartonella henselae, einem Erreger der Katzenkratzkrankheit beim Menschen, nach, dass
dessen T4SS in der Lage ist, ein um ein Reportergen erweitertes Bartonella-spezifisches,
kryptisches Plasmid (pBGR1) in die menschliche Endothelzelllinie Ea.hy926 zu übertragen.
Wurde an die plasmidcodierte Relaxase zudem
das Sekretionssignal des normalerweise von
dem T4SS transferierten BepD-Protein fusioniert, so führte dies zu einer 100fachen Transfereffizienzsteigerung. Southern Blots und ein
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Neomycin-Resistenzgen zeigten, dass das Plasmid teilweise oder vollständig in das Genom
der Wirtszelle integrieren kann. In den Zellkern
gelangt die Plasmid-RNA wahrscheinlich, wenn
sich bei der Mitose die Kernmembran auflöst,
denn ein Kernimportsignal wie die VirD2-Relaxase von Agrobacterium tumefaciens besitzt
die Relaxase des pBGR1-Plasmids nicht.
Y Es ist möglich, dass auch bei einer Infektion
mit Bartonella henselae DNA in Wirtszellen
übertragen wird und dieses System so den zweiten bekannten Fall eines natürlichen Reichübergreifenden DNA-Transfers repräsentiert.
Vielleicht handelt es sich aber auch nur um ein
evolutionäres Relikt. Dafür spricht, dass das
pBGR1-Plasmid nur für seine eigene Replikation und Mobilisation codiert sowie das Fehlen
von Kernimportsignalen für die Relaxase. Doch
selbst in diesem Fall besitzt das bei Humanzellen anwendbare Bartonella-System großes
Potenzial für Gentherapie, Impfung und Forschung.
Johannes Sander ó
Kurz gefasst
ó Kristallstruktur des β2-Adrenozeptors
im Komplex mit dem G-Protein Gsαα
Der β2-Adrenozeptor (β2AR) ist der Prototyp
eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors. Die
Bindung eines Agonisten an den β2AR stabilisiert einen aktiven Zustand R*, der es dem
Rezeptor ermöglicht, die GDP-Dissoziation von
Gsα zu katalysieren. Die strukturelle Grundlage
für die Rezeptor-vermittelte G-Protein-Aktivierung war bislang unbekannt. Die Gruppe von
Brian Kobilka hat die Kristallstruktur des aktivierten β2AR im Komplex mit Gsα aufgelöst
(Rasmussen SGF et al., Nature (2011) 477:549–
555). Überraschend ist vor allem die große
Rotation der konservierten ras-ähnlichen
Domäne des G-Proteins gegenüber der weniger
gut konservierten α-helikalen Domäne.
Roland Seifert
ó Casparystreifen sind die tight junctions
der Pflanzenwurzelendodermis
Die Wurzeln der Landpflanzen haben mit dem
Casparystreifen (CS) eine spezifische Struktur
entwickelt, die als extrazelluläre Diffusionsschranke zur Kontrolle von Nährstoffaufnahme und Stressbelastung dient (Roppolo D et
al., Nature (2011) 473:380–383). Die Arbeitsgruppe identifizierte bei Arabidopsis thaliana
eine Familie von Transmembrandomänenproteinen, die die Ausbildung der CS zwischen den
Endodermiszellen koordinieren und in der
Membran fixiert werden. Das von Wurzelhaaren aufgenommene Wasser fließt durch die
Interzellularen bis zur Endodermis. Dort hindert die Barriere der CS den weiteren Fluss,
der nun durch die Endodermzellen gezwungen
wird, wo Schadstoffe eliminiert werden können.
Lothar Jaenicke
ó Isolierung von Mikroorganismen aus
der Umwelt
Im Zeitalter der molekularen Mikrobenökologie sind Ansätze zur Isolierung von Mikroorganismen aus der Umwelt in Vergessenheit geraten, da mit klassischen Verfahren allenfalls 5
bis 10 % der Mikroflora aus Proben zu kultivieren sind. Allerdings lässt sich die (Öko)physiologie von Organismen nicht ausschließlich
anhand von Genomsequenzen beschreiben.
Daher werden (meta)genomische Daten nur
dann verwertbar sein, wenn wir in der Lage
sind, verbesserte Verfahren zu entwickeln,
Mikroorganismen aus der Umwelt zu isolieren.
In einem Reviewartikel hat Dedysh die wenigen Ansätze, die in den letzten Jahren entwickelt wurden, um schwer kultivierbare Mikroorganismen aus Boden zu isolieren, zusammengefasst und interessante Forschungsperspektiven abgeleitet (Front Microbiol (2011) 2:184).
Michael Schloter
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WISSENSCHAFT · JOURNAL CLUB
ÿ Toleranzmechanismen des Sichelzell-Hämoglobins gegenüber Malaria
ÿ Dynamische Methylierungslandschaft – genomweite Übersicht über Methylierungen von CpG-Inseln
in Oozyten
ÿ Reverse Metagenomik – ein neues Werkzeug zur gezielten Isolierung nicht-kultivierter
Mikroorganismen
ÿ Aufklärung der Struktur des Histamin H1-Rezeptors, einer wichtigen pharmakologischen Zielstruktur
für Antiallergika
Toleranzmechanismen des Sichelzell-Hämoglobins gegenüber Malaria
Die Erbkrankheit Sichelzellenanämie wird
durch verschiedene Mutationen im Gen
der β-Kette von Hämoglobin, dem Farbstoff der roten Blutkörperchen, verursacht. Die Erythrozyten der Betroffenen
verformen sich zu sichelförmigen Gebilden und können kleine Blutgefäße verstopfen. Während homozygote Träger
kaum das Erwachsenenalter erreichen,
verschafft diese Mutation heterozygoten
Trägern einen Vorteil im Kampf gegen
Malaria. Die molekularen Mechanismen
dieses Schutzes gegen die schwerwiegenden Folgen einer Infektion mit dem Malariaerreger Plasmodium wurden nun von
einem Forscherteam der Universitäten in
Oeiras (Portugal), Leipzig und Paris aufge-
klärt (Ferreira A et al., Cell (2011) 145:
398–409).
ó Vor allem Kleinkinder in den (Sub-)Tropen
sterben an den Folgen von Malaria, meist
durch die cerebrale Malaria (CM), bei der die
Plasmodium-infizierten Erythrozyten ins Gehirn
gelangen. In C57BL/6-Mäusen kann dieses
Szenario durch die Infektion mit Plasmodium
berghei ANKA künstlich induziert werden (experimental cerebral malaria, ECM). Dieses Modell nutzte das Forscherteam, um die genauen Mechanismen des Schutzes der Sichelzellenanämie gegen CM aufzuklären. Plasmodien
replizieren in roten Blutkörperchen und bringen diese zum Platzen. Dadurch gelangt toxisches Häm in den Blutkreislauf und löst die für
Malaria typischen Fieberschübe und Entzün-
dungsreaktionen aus. Bei Mäusen mit Sichelzell-Hämoglobin bewirkt das mutierte Hämoglobin über die Aktivierung des Transkriptionsfaktors Nrf2 eine kontinuierliche Produktion des Enzyms Hämoxidase 1 in hämatopoetischen Zellen. Dieses baut das toxische
Häm zu Biliverdin und Kohlenmonoxid (CO) ab.
CO verhindert durch Bindung an Hämoglobin
die Freisetzung von neuem Häm und reduziert
somit die Entzündungsreaktion, sodass ECM
nicht auftritt.
Y Diese Erkenntnisse wollen die Wissenschaftler nun nutzen und den natürlichen
Gewebeschutzmechanismus durch CO künstlich nachahmen, um so Malaria-Erkrankten,
insbesondere Kindern, das Leben zu retten.
Nadine Hertrich ó
Dynamische Methylierungslandschaft – genomweite Übersicht über
Methylierungen von CpG-Inseln in Oozyten
Methylierung von DNA-Abschnitten ist ein
wichtiges globales epigenetisches Steuerungsinstrument zum Abschalten von
Genen. Es unterliegt mannigfaltigen Veränderungen im Lauf der Entwicklung
eines Organismus, aber auch während
der Differenzierung einzelner Gewebe.
Von besonderem Interesse ist dabei die
unterschiedliche Methylierung des
Genoms in den Keimzellen, die dazu beiträgt, dass nach der Befruchtung mütterliches und väterliches Erbmaterial von
der Zelle unterschieden werden kann
(„Kampf der Geschlechter im Genom“).
Sébastian Smallwood und seine Kolleginnen und Kollegen aus Cambridge und
Tokio haben nun bei der Maus Methylierungsmuster in den CpG-Inseln von
Oozyten und Spermien bestimmt (Smallwood SA et al., Nat Genet (2011) 43:811–
814).
ó Sie identifizierten 1.062 methylierte CpGs
in reifen Oozyten, aber nur 185 in Spermien –
davon sind 58 ausschließlich in Spermien methyliert. Die Methylierung ist zu 92 bis 96 Prozent von den beiden DNA-Methyltransferasen
DNMTA3 und DNMT3L abhängig, wie die
Untersuchung der Methylierungsmuster in den
entsprechenden Knockout-Mutanten gezeigt
hat. Trotz detaillierter Untersuchungen konnten die Autoren keine Sequenzabhängigkeit
des Methylierungsmusters in den Keimzellen
feststellen; sie sahen vielmehr einen Zusammenhang zwischen Methylierungsgrad und
aktiver Transkription der jeweiligen Gene (zumindest in Oozyten am Tag E10–E15) und ei-
nem geringen Anteil an trimethyliertem Histon
H3 (Position Lys4–H3K4me3), einem Marker
für aktives Chromatin.
Y Die vorliegende Arbeit unternimmt den Versuch, ein genomweites Muster der Methylierungsgrade in Keimzellen darzustellen, um so
die Frage nach den „geprägten Genen“ (imprinting) präziser beantworten zu können. Zumindest bei einigen maternalen Genen geht die
Methylierung während der Löschungsphase
(zwischen der Befruchtung und der Morulaphase) nur auf etwa 50 Prozent herunter. Es
gibt also deutliche Hinweise, dass keine vollständige Löschung des Methylierungsmusters
erfolgt. Es wird deshalb noch mehrerer Experimente bedürfen, bis der Mechanismus des
imprinting genau verstanden ist.
Jochen Graw ó
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Reverse Metagenomik – ein neues Werkzeug zur gezielten Isolierung
nicht-kultivierter Mikroorganismen
Kängurus und Wallabys besitzen ähnlich
dem Pansen der Wiederkäuer eine Fermentationskammer, in der Pflanzennahrung durch ein zuvor wenig erforschtes
Mikrobiom fermentiert wird. Pope et al.
(Science (2011) 333:646–648) konnten
einen Schlüsselorganismus dieses Mikrobioms vom Tammar Wallaby gezielt isolieren. Das Isolat WG-1 gehört zu den Succinivibrionaceae. Sein Stoffwechsel könnte
erklären, warum Kängurus und Wallabys
deutlich weniger Methan produzieren als
Wiederkäuer. Entscheidend für die erfolgreiche Kultivierung von WG-1 war reverse
Metagenomik.
ó Phylogenetische Analysen und die Hochdurchsatz-Sequenzierung metagenomischer
Fragmente identifizierten eine WG-1-Population als wichtige Komponente des untersuchten Mikrobioms. PhyloPythia ist ein BinningAlgorithmus, der Metagenom-Fragmente
unterschiedlicher Länge auf Basis ihrer Oligonukleotidmuster taxonomisch zuordnet. Dieser Algorithmus erlaubte die Rekonstruktion
großer Genomabschnitte der WG-1-Population
und somit die Vorhersage spezifischer Stoffwechseleigenschaften. Ein davon abgeleitetes
Nährmedium mit Stärke und Harnstoff als einzige C- bzw. N-Quelle führte unter Zugabe des
Antibiotikums Bacitracin zur selektiven Anreicherung und mittels dieses, als reverse Metagenomik bezeichneten Ansatzes letztendlich
zur Isolierung von Stamm WG-1. Das Isolat
zeigte, wie vorhergesagt, typische Eigen-
schaften der Succinivibrionaceae, insbesondere Wachstum durch CO2-abhängige Fermentation pflanzlicher Kohlenhydrate mit Succinat als wesentlichem Endprodukt.
Y Reverse Metagenomik ist ein vielversprechender Ansatz zur gerichteten Isolierung nichtkultivierter Mikroorganismen, vorausgesetzt,
genomische Fragmente der Zielgruppe können
zweifelsfrei identifiziert werden und diese enthalten Informationen, welche eine selektive
Kultivierung möglich machen. Detaillierte
Kenntniss zur Ökophysiologie von WG-1 könnte Strategien eröffnen, die mikrobielle Aktivität
im Pansen der Wiederkäuer gezielt in Richtung
geringere Methanproduktion zu lenken.
Werner Liesack ó
Aufklärung der Struktur des Histamin H1-Rezeptors, einer wichtigen
pharmakologischen Zielstruktur für Antiallergika
Histamin ist ein wichtiger Entzündungsmediator bei der allergischen Rhinitis
(Entzündung der Nasenschleimhaut) und
Konjunktivitis (Augenbindehautentzündung). Histamin entfaltet dabei einen großen Teil seiner Wirkungen über den Histamin H1-Rezeptor (H1R). Dementsprechend stellen H1R-Antagonisten effektive
Pharmaka zur Behandlung der allergischen Rhinitis und Konjunktivitis dar.
Man unterscheidet H1R-Antagonisten der
ersten Generation, die ins ZNS penetrieren und zahlreiche andere Rezeptoren
beeinflussen, von H1R-Antagonisten der
zweiten Generation, die spezifischer den
H1R blockieren und weniger stark ins ZNS
penetrieren.
BIOspektrum | 07.11 | 17. Jahrgang
ó Shimamura et al. (Nature (2011) 475:6570) klärten die Kristallstruktur des humanen
H1R im Komplex mit einem H1R-Antagonisten
der ersten Generation (Doxepin) auf. Doxepin
taucht tief in die Ligandbindungstasche des
H1R ein und interagiert über hydrophobe
Wechselwirkungen mit einer in G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) hochkonservierten Aminosäure, dem Trp428 in der sechsten Transmembrandomäne. Dieses Tryptophan
ist Bestandteil des toggle switch, über den
GPCRs im inaktiven (R) oder aktiven (R*) Zustand stabilisiert werden. H1R-Antagonisten
der zweiten Generation unterscheiden sich von
H1R-Antagonisten der ersten Generation durch
eine zusätzliche Carboxylgruppe. Die Carboxylgruppe geht Ionenpaarbindungen mit
Lys191 in der fünften Transmembrandomäne
und/oder Lys179 in der zweiten extrazellulären Schleife ein. Dies erklärt die höhere H1RSelektivität der H1R-Antagonisten der zweiten
Generation.
Y Die Arbeit von Shimamura et al. leistet fundamentale Beiträge zum Verständnis der
Mechanismen der GPCR-Aktivierung sowie zur
differenziellen Interaktion verschiedener Ligandenklassen mit einem GPCR. Die Publikation reiht sich in eine Serie exzellenter Arbeiten
über die Aufklärung der Struktur des β1- und
β2-Adrenorezeptors, Adenosin A2A-Rezeptors,
Dopamin D3-Rezeptors und Chemokinrezeptors
CXCR4 ein. Die Aufklärung von GPCR-Kristallstrukturen verbessert die Entwicklung von
therapeutisch wichtigen Agonisten und Antagonisten.
Roland Seifert ó
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WISSENSCHAFT · JOURNAL CLUB
ÿ Antibiotikaresistenz – ein alter Hut?
ÿ Der pH-abhängige Formiat-(Im/Trans)porter FocA arbeitet normostatisch ausgleichend
ÿ Guanabenz hemmt GADD34, PPP1-Anlagerung und Proteinmissfaltung
ÿ Kinetik der Lyse einer Einzelzelle
Antibiotikaresistenz – ein alter Hut?
Mit steigender Verwendung von Antibiotika nimmt auch die Zahl der resistenztragenden Bakterien in der heutigen Zeit
beständig zu. Da die Antibiotika-Produktion ein natürliches Phänomen und als
solches schon sehr alt ist, stellt sich die
Frage, wie alt Resistenzen gegen diese
Antibiotika sind. Denn obwohl das Auftreten resistenter Bakterienstämme vermehrt beobachtet wird, ist die Wahrscheinlichkeit groß, dass die Resistenzen
ähnlich alt sind wie die Antibiotika selbst.
ó V. M. D’Costa et al. (Nature (2011)
477:457–461) untersuchten Bohrkerne aus
dem Permafrostboden des kanadischen YukonGebiets. Der Boden der untersuchten Tiefe
wurde auf ca. 30.000 Jahre datiert. In DNA-
Extrakten konnten sie Sequenzen von Vertebraten und Pflanzen des späten Pleistozäns,
jedoch keine Sequenzen häufiger rezenter
Arten nachweisen. Den Forschern gelang die
Amplifikation von Genen, die für diverse Antibiotika-Resistenzen codieren. So wurden u.
a. Gene für Beta-Laktamasen (Penicillin-inaktivierend) und das Ribosom-schützende Protein TetM detektiert. Im besonderen Fokus der
Studie standen die Gene, die für VancomycinResistenz codieren (vanHAX). Die Sequenzen
der vanHAX-Gene aus dem Permafrost waren
mit Genen rezenter Aktinobakterien verwandt.
Untersuchungen der Enzymaktivität nach Expression in E. coli und röntgenkristallografische Analyse der erhaltenen Proteine bestätigten große Ähnlichkeiten zwischen prähis-
torischen und modernen VanA. Kleinere Abweichungen in der Proteinstruktur hatten keinen Einfluss auf die Enzymfunktion.
Y Die Autoren der Studie konnten eindrucksvoll zeigen, dass Antibiotika-Resistenzen keine Erfindung der Neuzeit sind, jedoch
überrascht diese Erkenntnis nicht. Wieso auch
sollten Antibiotika-Produzenten über Jahrtausende einen Vorteil gegenüber ihrer Konkurrenz erhalten können, ohne dass diese die entsprechenden Abwehrmechanismen entwickelt?
Was wir heutzutage beobachten können, ist
allerdings die rasche Verteilung der Resistenzen
über alle Arten von Bakterien – und das ist das
wirklich Besorgniserregende.
Katharina Palmer ó
Der pH-abhängige Formiat-(Im/Trans)porter FocA arbeitet normostatisch
ausgleichend
Enterobakterien haben sich ihrem anaeroben, an Abbauprodukten von Energieträgern (zu Pyruvat) reichen Darmmilieu
angepasst. Statt das Pyruvat zu CO2 zu
oxidieren, haben sie die Pyruvat:Formiatlyase (PFL) entwickelt, die das Pyruvat zu
Formiat und Acetyl-CoA spaltet. Formiat
(HCO2– = F–) ist eines der stärksten organischen Anionen. Seine Anhäufung würde
das Zytoplama tödlich ansäuern. Es muss
daher unschädlich gemacht werden. Der
Export von F– geht über den F-Kanal FocA.
Oberhalb pH 6,8 arbeitet er als Exporter,
darunter als Importer, der an einen zytoplasmatischen Formiat/Wasserstoff-Lyase-Komplex angeschlossen ist. Mit dessen Hilfe disproportioniert F– zu CO2 und
H2. F-Verschiebung durch FocA bei hohem
pH ist ein passiver Vorgang, bei niedrigem
ein aktiver F–/H+-Symport. Das Protein
muss also funktionell umschalten.
ó Diesem Problem sind W. Lü et al. (Science
(2011) 332:352–354) durch Strukturuntersuchung mit 2,8 Å-Auflösung an kristallisiertem
FocA nachgegangen. Es ist ein dichtes Pentamer-Aggregat mit engem zentralen Durchlass.
Die Kettenenden liegen auf der zytoplasmatischen Seite der Membran. Die N-Termini der
Monomeren im Fünferaggregat sind bei pH 4,0
wohlgeordnet, weisen aber eine Asymmetrie
und Flexibilität bis zu einer Helixbildung auf,
die in den Trichter ragt, also einen Schleusenmechanismus nahelegt. Bei pH 7,5 sind sie ungeordnet. Die C-Enden zeigen ähnliches Muster vom offenen zum Zwischen- und geschlossenen Zustand, wobei jeweils eine vom N-Ter-
minus-abhängige omega-Schlinge der fluktuierenden Ordnung folgt. FocA bildet, konzertierend über die N-Enden der Untereinheiten
und in pH-Abhängigkeit, unterhalb von pH 7,5
einen spezifischen Kanal für F–.
Y Ein möglicher Mechanismus für die aktive
Aufnahme von F– bei niedrigem pH kann ein
konzertiert-kooperativer Kreislauf zwischen den
drei Konformationszuständen der Protomeren –
offen/neutral/geschlossen – sein. F– im Periplasma durchtritt die Membran und erreicht
die Öffnung des Kanals, die nur durch die N-terminale Helix verschlossen ist. Vorübergehendes
Öffnen des Zytoplasmatrichters entlässt das F–.
Den passiven Export bei hohem Außen-pH kontrolliert die geschwindigkeitsbegrenzende Selektivität des Trichters.
Lothar Jaenicke ó
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Guanabenz hemmt GADD34, PPP1-Anlagerung und Proteinmissfaltung
Der Stressantwort-Signalweg unfolded
protein response (UPR) hält die Proteostase von Sekretionsproteinen im ER-Lumen
aufrecht: Proteinkinase PERK, eines der
Transmembran-Stressfühlerproteine, vermindert durch Phosphorylierung des
α die
Eukaryonten-Initiationsfaktors eIF2α
Gesamtsynthese von globulären Proteinen im ER-Lumen, verstärkt aber die
Translation des Transkriptionsfaktors
ATF4, der spezifisch auf Stress-empfindliche Gene wie den Transkriptionsfaktor
CHOP gerichtet ist. Letzterer induziert die
Transkription der PPP1R15A-KontrollUntereinheit der Proteinphosphatase1
(= GADD34). Ein Heterodimer aus der
katalysierenden Untereinheit von PPP1
und der Kontrolleinheit GADD34 dephosα-P und führt
phoryliert selektiv eIF2α
dadurch eine negative Rückkopplungsschleife ein. Mit ihr kann die PERK-Signalkaskade abgeschaltet und die ribosomale
Translation nach einem Stress wiederhergestellt werden. UPR-Versagen ist Ursache vieler pathologischer (Stress-)Zustände. Liganden aus der Chemotherapie-Apotheke können diese durch entsprechende
Verstärkung des auslösenden Reizes korrigieren.
ó P. Tsaytler et al. (Science (2011) 332:91–
94) durchstöberten den Akronymensalat nach
Bindestellen für einen solchen niedermolekularen Binder an GADD34 und fanden ihn in
dem α2-adrenergen Rezeptoragonisten Guanabenz, das zur Behandlung von Hypertonie bewährte Acetat der Schiffbase aus 2,6-Dichlorbenzaldehyd mit Aminoguanidin, von dem neuerdings auch Antiprionen-Aktivität gezeigt wur-
de. Tatsächlich schützt Guanabenz auch gegen
andere sich anhäufende Proteinmissfaltungen,
z. B. von InsulinAkita in Langerhans-β-Pankreasoder zytotoxischen ER-Faltungen in HeLa-Zellen. Guanabenz bindet nicht an die konstitutiv exprimierte Kontrolluntereinheit CReP
(=PPP1R15B) von eIF2α und ist per se, im
Gegensatz zu Calyculin A, nicht zytotoxisch.
Y Die von mehreren Aspekten inspirierte systematische Suche nach Ligandenzielen im UPR
hat hier durch Per- und Transpiration zu einem
eleganten Erfolg geführt: Guanabenz moduliert
die Translation als Antwort auf einen ER-Stress,
indem es das Verhältnis Chaperone/Proteinsubstrat erhöht. Dadurch sorgt es für korrekte
Proteinfaltungen im ER-Lumen.
Lothar Jaenicke ó
Kinetik der Lyse einer Einzelzelle
Die instant-Sequenzierung von Nukleinsäuren und die höchstauflösende Immunfluoreszenzmikroskopie sind aktuelle Beispiele für kombinatorische Probleme aus
den Biowissenschaften, in denen molekulare Wechselwirkungen höherer Ordnung
hergestellt und ausgenutzt werden, um
Zeit- und Ortauflösungen zu dokumentieren. Eindrucksvoll ist hier die ingeniöse
Kombination von makromolekularen Bindern und Liganden zur sukzessiven Sichtbarmachung von (Protein)bestandteilen
bei der Lyse einer einzelnen Zelle, die
A. Jain et al. vorschlagen (Nature (2011)
473:484–488).
ó Während man standardweise ein Antigen
nach dem anderen durch spezifische Antikörper aus einem Lysat fischt, Westernblot-
BIOspektrum | 07.11 | 17. Jahrgang
reinigt und MS-analysiert, werden hier Trennund Reinigungsschritte überflüssig: Bei der
Immunfluoreszenzmikroskopie fließen die Proteinkomponenten eines (Einzel)zelllysats
durch eine Art feuchter Kammer zwischen mit
Methoxypropylenglykol (mPEG) passiviertem,
aber mit Biotinyl-PEG/Streptavidin aktiviertem Objektträger und Deckglas, die „Beutefische“ gehen darin ins Biotinnetz. Man fixiert
mit biotinyliertem, jeweils selektiv-spezifischem Antikörper, wäscht und analysiert die
gesuchten Makromoleküle modo Immunfluoreszenzmikroskopie und ihren technischen
Details. Bei Multiprotein-Komplexen werden
Mehrfarbenfluoreszenzen genutzt. Zur Quantifizierung zählt man die Fluoreszenzflecke auf
dem Träger. Diese elegante en miniature-Abkürzungsmethode erspart die anfälligen und
mühsamen Stufen von Westernblot und Massenanalyse.
Y Mithilfe dieser single molecule pulldown(SiMPull)-Methodik ließen sich nacheinander Organellen, endogene Protein/Proteinkomplexe, markierte Einzelproteine unterschiedlicher – aber bekannter – Binde(Kinase!)aktivitäten sowie Enzyme des Makromolekül(DNA)-processings nicht nur routinemäßig
und rascher nachweisen als bisher, sondern
bei ingeniöser Nutzung von spezifischen Techniken auch in ihrer Dynamik analysieren, aber
nicht neue Aktivitäten entdecken. Vermutlich
wird die Methodik die exakte Aussagekraft der
MS nicht aushebeln können, aber in die kombinatorische Serienanalytik eingehen.
Lothar Jaenicke ó