Assay-Technologien

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Assay-Technologien

laborwelt
Nr. 4 / 2009 – 10. Jahrgang
Assay-Technologien
Zelltypspezifisches Screening
von Membranprotein-Targets
ohne Antikörper
ht:
Marktübersic e
s
DNA-Synthe
Analyse der Proteinfunktion,
-Interaktion und -Lokalisation
in lebenden Zellen
Toxizitäts/Funktionstests
von Leitstrukturen an nicht
proliferierenden Zellen
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Editorial | Inhalt
Assays: Schneller,
kleiner, genauer...
Mit dem Einzug zellbasierter Assays und des High-Content-Screenings
(vgl. Seite 33) in die Wirkstoffentwicklung erlebt die Biologie seit einiger
Zeit eine regelrechte Renaissance in der Arzneimittelforschung. Großangelegte Projekte, die auf die Identifikation und Validierung prädiktiver
Toxizitäts- und Funktionsmarker abzielen, zeugen von dem Glauben, das
biologische Geschehen hinreichend genau in Modellsystemen nachstellen und auf dieser Basis fundiertere Entscheidungen über Wirkstoff-Entwicklungsprogramme treffen zu können. Es ist ein regelrechter Markt rund
um die Biomarkerforschung entstanden, wie aktuelle Ankündigungen des
Aufbaus einer Biobank in Luxemburg unter Leitung von HZI-und VBioChef Prof. Dr. Rudi Balling dokumentieren. Den Fortschritt bei den immer
physiologischeren Assays beleuchtet diese LABORWELT-Themenausgabe
„Assay-Technologien“.
Humane mononukläre periphere Blutzellen sind zwar nicht ganz so
einfach zu beschaffen, bieten aber gegenüber Tiermodellen deutliche
Vorteile bei der Erfassung toxischer Effekte (vgl. Seite 4). Wissenschaftler
des Berliner Start-ups MedInnovation stellen ein Diagnoseverfahren vor,
das die Konformation des Bluttransportproteins Serumalbumin nutzt,
um hochempfindlich und spezifisch Krebsmarker im Blut nachzuweisen (vgl. Seite 22). Statt auf Endpunktbestimmungen setzen Göttinger
Forscher auf nicht-invasive Langzeitmessungen infizierter Zellen, um
den Pathogenitätsmechanismen von Viren auf die Spur zu kommen
(vgl. Seite 19). Mit zeitaufgelöstem Biolumineszenz-Imaging verfolgen
Mediziner des Herzzentrums Hamburg das Schicksal transplantierter
Stammzellen, um die Faktoren zu finden, die Immuntoleranz bei der
Transplantation von Herzzellen vermitteln (vgl. Seite 16). Ganz ohne die
teuren Antikörper vermessen schließlich Schweizer Wissenschaftler das
Oberflächenproteom verschiedenster humaner Zelltypen auf der Suche
nach neuen Targets (vgl. Seite 13).
Unabhängig vom Thema dieser Ausgabe finden Sie in diesem Heft aus
aktuellem Anlass auch einen Report des Hannoverischen Herzspezialisten
Axel Haverich, dem die DFG nach Denominierung seiner Arbeit vom Deutschen Zukunftspreis wissenschaftlich einwandfreie Arbeit bescheinigt
hat – viel Lesevergnügen!
Thomas Gabrielczyk
In diesem Heft
Inhalt
4
Blitzlicht Toxizitäts-Assays
Unterstützung der Identifizierung von Leitstrukturen
mit PBMCs
Jan Eickhoff et al., Lead Discovery Center, Dortmund
8
Blitzlicht Funktionelle Proteomanalyse
SNAP-tags: Neue Tools zur Untersuchung der Proteinfunktion
Kai Johnsson, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne
Titel: Assay-Technologien
Nach einer Ära biochemischer Endpunkttests drängt derzeit eine
neue Generation zellbasierter Assays in die Forschung, die die
Bedingungen in der menschlichen Zelle besser nachstellen.
Foto: fotolia
13
Wissenschaft Targetsuche
Proteomanalyse der Zelloberfläche
Bernd Wollscheid et al., Institut für Molekulare Systembiologie, ETH Zürich
16
Blitzlicht Biolumineszenz-Imaging
Analyse der Tumorigenität, des Überlebens und der Migration
von Stammzellen
Sonja Schrepfer et al., Universitäres Herzzentrum Hamburg
19
Blitzlicht Dynamisches Zellmonitoring
Echtzeit-Monitoring der Virus-vermittelten Zytopathogenität
Martin Spiegel, Universität Göttingen
22
Blitzlicht Tumordetektion
Krebsdiagnose durch Funktionsanalyse von Serumalbumin
Kerstin Schnurr et al., MedInnovation GmbH, Berlin
24
Blitzlicht Immuno-Assays
Waschschritt-freie Immunoassays für die Laborforschung
Michael Lässle, Perkin Elmer LAS (Deutscheland) GmbH, Rodgau
28
Report Regenerative Medizin
Einsatz von Matrix-Transplantaten in der Herzklappenchirurgie
Axel Haverich et al., Medizinische Hochschule Hannover
31
Blitzlicht PCR
Zelllinien-Authentifikation mit Genetic Fingerprinting
Jill Dunham, Emory University, Altanta, USA
33
Blitzlicht Laborautomation
Automatisierte Wirkstoffsuche mittels High-Content-Screening
Jens Peter von Kries et al., Institut für Molekulare Pharmakologie, Berlin
35
Service Marktübersicht
Oligo- und Gensynthese
40
Stellenmarkt
45
Verbände
Marktübersicht: Oligo- & Gensynthese
46
Produktwelt
Der ohnehin knallharte Preiskampf unter den Anbietern für die Synthese von Oligonukleotiden und synthetischen Genen hat sich durch die
Verknappung des Lösungsmittels Acetonitril im Zuge der Finanzkrise
noch einmal verschärft. Ihre Dienstleistungspalette präsentieren die
Anbieter ab Seite 35.
49
Termine
50
Ausblick/ Impressum
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10. Jahrgang | Nr. 4/2009 | 3
Blitzlicht Toxizitätsassays
Unterstützung der
Identifizierung von
Leitstrukturen mit PBMCs
Dr. Peter Habenberger, Dr. Axel Choidas, Dr. Bert Klebl und Dr. Jan Eickhoff,
Lead Discovery Center GmbH, Dortmund
Um die in vivo -Effizienz von Leitstrukturkandidaten vorherzusagen, werden in der Regel zelluläre Modellsysteme herangezogen, die den angestrebten pharmakologischen Effekt abbilden.
Da in vivo jedoch nicht nur der gewünschte phänotypische Effekt, sondern auch ein mehr
oder weniger großes therapeutisches Fenster erreicht werden soll, wird häufig versucht, die
in vivo -Toxizität über zelluläre Modellsysteme vorherzusagen. Ein aussagekräftiges System
zur Prädiktion der nicht systemisch bedingten Toxizität stellen mononukleäre periphere
Blutzellen (PBMCs) dar, die vergleichsweise einfach aus Spenderblut isoliert werden können.
Für die Untersuchung der Wirkmechanismen und der Vorhersage der Toxizität bietet dieses
System die Vorteile, dass sich die ex vivo untersuchten Zellen in einem in vivo -ähnlichen
Zustand befinden, zugleich Toxizitäts- und Funktionstests durchgeführt werden können
und dass sich – anders als bei den meisten konventionellen Toxizitätsassays – auch nichtproliferierende Zellen testen lassen. Der erhöhte Aufwand für die Beschaffung von PBMCs
im Vergleich zu etablierten Zelllinien ist in vielen Fällen durch die höhere Aussagekraft mehr
als gerechtfertigt.
Während der Hit-to-Lead-Phase der Wirkstoffentwicklung wird in der Regel erst auf
Aktivität gegenüber dem isolierten Target in
vitro, auf Hemmung des Targets in Zelllinien
und gegebenenfalls auf Inhibition eines
Signalweges (sowie einen funktionellen Readout) gescreent. Oft wird die Toxizität nicht
oder erst vergleichsweise spät ermittelt, so
A
dass toxische Substanzen erst spät aus dem
Optimierungsprozess entfernt und so unnötig
Ressourcen gebunden werden. Um toxische
Substanzen während des Optimierungsprozesses zu identifizieren, stehen verschiedene
Optionen zur Verfügung:
I Toxizitätstestung im zellulären System, in dem
der funktionelle Readout generiert wird,
C
B
Abb. 1: Charakterisierung antimitotischer Wirkstoffe in PBMCs. A: Vergleich der Wirkung von
antimitotischen Substanzen auf ruhende und proliferierende PBMCs. B: IC50-Werte
[µM] bekannter CDK-Inhibitoren. C: Vergleich der Toxizität von CDK-Inhibitoren auf
ruhende PBMCs und Krebszelllinien (abgebildet sind die Mediane der Toxizität in verschiedenen Zelllinien).
4 | 10. Jahrgang | Nr. 4/2009
I Verwendung funktioneller Readouts mit Sig
nalzunahme nach Substanzzugabe, so dass
zytotoxische Substanzen (falsch-)negative
Readouts ergeben,
I Messung der Toxizität in speziellen Zell
linien.
Für phänotypische Assays werden oft genetisch veränder te oder transformier te
Zelllinien verwendet, die vergleichsweise
unempfindlich gegenüber toxischen Effekten
sein können. Geeignet für die Vorhersage der
Toxizität sind zum Beispiel spezielle, auch
genetisch veränderte Zelllinien wie beispielsweise NIH3T3-Zellen, die wegen ihrer leichten
Kultivierbarkeit gerne für Toxizitätsassays herangezogen werden. Um eine bessere Vorhersage der Toxizität in vivo zu erreichen, sollten
hier weitgehend „wenig transformierte“ Zelllinien (wie IMR90) oder primäre Zelllinien wie
HFFs (Human Foreskin Fibroblasts) eingesetzt
werden. Ideal ist die Verwendung mehrerer
Zelllinien aus verschiedenen Gewebetypen.
Zu beachten ist hierbei jedoch, dass die Zellsysteme in Kultur in der Regel proliferieren,
während sich die Zellen in vielen Geweben in
vivo im nicht-proliferierenden (G0-)Zustand
befinden, und dass proliferierende Gewebe
oft empfindlicher auf bestimmte Substanzklassen reagieren. Auch hier gibt es Möglichkeiten der Abhilfe. So können beispielsweise
die Zellen durch Kontaktinhibition an der
Proliferation gehindert (sofern dieser Prozess
in den gewählten Zellen noch intakt ist),
oder es kann durch genetische Manipulation
und/oder bestimmte Agenzien ihr Zellzyklus
arretiert werden.
All diese Methoden haben jedoch den
Nachteil, dass pro Assay nur einzelne Zell
linien/Zelltypen betrachtet werden können,
dass die Arretierung der Zellen oft unphysiologisch ist (je nach Art des Zellzyklusarrests
können die Zellen unterschiedlich auf Agenzien reagieren) und dass die eingesetzten
Zellen oft weit vom physiologischen Zustand
entfernt sind. Eine praktikable Alternative zu
Assays in diesen Systemen bietet der Einsatz
von frisch isolierten (ex vivo-) Blutzellen, sogenannten PBMCs (mononukleäre periphere
Blutzellen). Die Beschaffung ist vergleichsweise einfach, und die Zellen können bei
Bedarf eingefroren werden.
Der Zustand der Zellen ist weitgehend
physiologisch, zudem werden die Substanzen
in diesem System nicht auf einer einzelnen
Zelllinie getestet, sondern in einer Population verschiedener Zelltypen (wenn auch auf
das hämatopoetische System beschränkt).
Ein besonderer Vorteil dieses Systems ist,
dass sich die Zellen natürlicherweise im
nicht-proliferierenden Zustand befinden,
die Proliferation (zumindest einer Subpopulation) jedoch einfach induziert werden
kann. Darüber hinaus kann in diesem System
parallel zur Toxizitätsmessung eine Reihe
funk tioneller Readouts er fasst werden.
PBMCs ermöglichen die Detektion toxischer
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Blitzlicht Toxizitätsassays
A
B
Fig. 2: PBMCs als Testsystem für antiinflammatorische Substanzen. A: Messung der
Cytokinfreisetzung und Toxizität. B: Der Vergleich der Cytokinfreisetzung mit der
Toxizität erlaubt die Abschätzung des möglichen therapeutischen Fensters.
Effekte in humanen Zellen, die aufgrund von
Speziesunterschieden im Tiermodell verborgen bleiben.
Beim Einsatz von PBMCs sind jedoch auch
einige Besonderheiten zu berücksichtigen.
Zum Beispiel sind die Beschaffung und Logistik schwieriger als bei stabilen Zelllinien, und
die Ausbeute an Zellen aus einer Spende ist
begrenzt, so dass mit vergleichsweise kleinen
Chargen gearbeitet werden muss. Zur Gewinnung der PBMCs werden die Zellen durch
Zentrifugation über einen Ficoll-Gradienten
von Plasma und Erythrozyten abgetrennt und
Verunreinigungen durch Erythrozyten über
hypotonische Lyse entfernt. Nach der Isolation
können die Zellen sofort eingefroren oder für
das Experiment verwendet werden. Die frisch
gewonnenen Zellen sollten sich überwiegend
im arretierten Zustand befinden, können
jedoch bei Bedarf mit Agenzien wie Phytohämagglutinin oder durch Mischen von Zellen
verschiedener Spender zur Zellteilung angeregt oder nach Bedarf stimuliert werden.
PBMC-Anwendung: Testung
antimitotischer Agenzien
Ein Beispiel für den Nutzen der PBMCs zur
Charakterisierung von Wirkstoffen in der
Hit-to-Lead-Phase ist das Testen antimitotischer Reagenzien. Wir haben Inhibitoren der
Aurora-Kinase und der Zyklin-abhängigen
Kinasen (CDKs) auf antimitotische Wirkung
getestet. Dabei lautete die Arbeitshypothese: Substanzen, die selektiv Zellzyklusregulierende CDKs oder Aurora inhibieren,
sollten auf proliferierende Zellen toxisch
wirken, ruhende Zellen jedoch nicht beeinflussen. Auf dieser Basis wurde eine Reihe
von CDK-Inhibitoren entwickelt, die derzeit
in klinischen Studien erprobt werden. Die
Eignung des Testsystems aus ruhenden/replizierenden PBMCs wurde zunächst mittels
bekannter Substanzen mit antimitotischer
Wirkung validiert. Dabei konnte gezeigt
werden, dass bekannte Substanzen wie Doxorubicin oder Taxol auf sich teilende Zellen
6 | 10. Jahrgang | Nr. 4/2009
toxischer wirken als auf ruhende Zellen, ebenso wie Inhibitoren der Aurora-Kinase (Abb. 1A
oben), zu denen es bereits wissenschaftlich
publizierte Daten gibt. Für Inhibitoren aus
dem internen Aurora-Projekt ermöglicht das
System eine deutliche Rangfolge hinsichtlich
der Selektivität gegenüber proliferierenden
Zellen und liefert eine Entscheidungsgrundlage für die Auswahl der aussichtsreichsten
Verbindungen.
Überraschend ist jedoch die Wirkung
bekannter sowie intern entwickelter CDKInhibitoren. Lediglich der publizierte CDKInhibitor PD-332991 ist selektiv gegenüber
proliferierenden PBMCs, während alle übrigen
Inhibitoren auf ruhende Zellen genauso toxisch
wirken wie auf proliferierende. Tatsächlich
ist dieser Toxizitätsmechanismus mit großer
Wahrscheinlichkeit der Hauptgrund für den
mäßigen Erfolg der diversen CDKis in präklinischen und klinischen Studien. Eine Korrelationsanalyse der CDKi-vermittelten Aktivitäten
auf ruhende/replizierende Zellen sowie biochemische Aktivitätsbestimmungen ergaben
eine deutliche Korrelation der Toxizität zur
Hemmung von CDK7 und/oder CDK9 und/
oder weiteren unbekannten Targets (Abb. 1B).
Dabei ist bekannt, dass die selektive Hemmung
von CDK9 pharmakologisch toleriert wird. Tatsächlich ist diese Erkenntnis zur Toxizität von
Bedeutung, da bis heute in der Medizinalchemie wenig Wert auf die Selektivität der CDKis
innerhalb der CDK-Familie gelegt wurde. Sehr
interessant ist hier der Befund, dass der CDK4und CDK6-spezifische CDK-Inhibitor PD332991
selektiv auf proliferierende PBMCs wirkt, was
auf ein wichtiges pharmazeutisches Prinzip
zur Hemmung von proliferierenden Zellen
hindeuten könnte.
Ein weiterer mechanistischer Aspekt der
selektiven Wirkung von CDK-Inhibitoren auf
Tumorzellen ist nicht nur die Hemmung von
proliferierenden Zellen per se, sondern eine
durch Mutationen bedingte besondere Abhängigkeit der Tumorzelllinien von einzelnen
CDKs („oncogene addiction“). Dies könnte
eine selektive Inhibition von Tumorzellen
gegenüber ruhenden Zellen bedingen, aber
auch gegenüber nicht transformierten proliferierenden Zellen, so dass tumorselektive
CDK-Inhibitoren im Testsystem der ruhenden/replizierenden PBMCs nicht auffallen
würden.
Um entsprechend wirksame CDK-Inhibitoren zu identifizieren, wurden diese auf
Toxizität in einer Reihe von Tumorzelllinien
getestet und die so erhaltenen Daten mit
der Toxizität gegenüber ruhenden PBMCs
verglichen (Abb. 1C). Auffallend ist hier, dass
Ro-0506220 selektiv auf proliferierende Tumorzelllinien wirkt, sowohl verglichen mit
ruhenden als auch proliferierenden PBMCs.
PBMCs als Testsystem für
antiinflammatorische Substanzen
Eine weitere Einsatzmöglichkeit für PBMCs
ist die Charakterisierung antiinflammatorischer Substanzen. Eine Alternative zu
den verbreiteten NF-κB Reportergenassays
bietet das Screenen in PBMCs auf Inhibition
der Zytokinfreisetzung. Bei diesem Assay
wird nach Stimulation der PBMCs mit LPS
die Freisetzung von Zytokinen gemessen.
In dem in Abbildung 2A dargestellten Beispiel ist die Inhibition der Freisetzung der
Zytokine IL1β, IL6, IL8 und TNFα dargestellt,
die zum Beispiel problemlos per ELISA- oder
MesoScale-Technologie im 96-oder 384-wellFormat quantifiziert werden kann. Die Vorhersagekraft dieses Assays ist mit anderen
in vitro-Systemen kaum zu erreichen, da alle
relevanten humanen Blutzelltypen beteiligt
sind und verschiedene Zytokine gleichzeitig
gemessen werden können. Das System bietet
eine noch bessere Grundlage zur Auswahl aktiver Substanzen, wenn parallel (bzw. zeitlich
nachgeschaltet) zur Zytokinfreisetzung die
Toxizität der Verbindungen gemessen wird.
Der Quotient aus Toxizität und Inhibition der
Zytokinfreisetzung kann zur Abschätzung des
therapeutischen Fensters in vivo eingesetzt
und als Auswahlkriterium für aktive Substanzen herangezogen werden (Abb. 2B).
Der logistische Aufwand für den Einsatz
von PBMCs ist zwar höher als beim Einsatz
von etablierten Zelllinien, wird jedoch durch
die wesentlich höhere Aussagekraft mehr als
ausgeglichen. Bei geeigneter Logistik eignet
sich das PBMC-System auch für primäre
Screeningkampagnen.
Korrespondenzadresse
Dr. Jan Eickhoff
Lead Discovery Center GmbH
Emil-Figge-Str. 76A
44226 Dortmund
Tel.: +49-(0)231-9742-7005
+49-(0)163-656-7005
Fax: +49-(0)2231-9742-7039
eickhoff@lead-discovery.de
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Blitzlicht Funktionelle Proteinanalyse
SNAP-tags: Neue Tools
zur Untersuchung von
Proteinfunktionen
Dr. Kai Johnsson, Ecole Poytechnique Fédérale de Lausanne, Schweiz
Die Analyse von Proteinfunktionen beginnt meist mit den ganz grundlegenden Fragestellungen
nach der Lokalisation eines Proteins, seinen Interaktionspartnern und den Bedingungen, unter
denen es aktiv ist. Die passenden Antworten für ein spezielles Protein zu finden, kann allerdings
zu einem schwierigen Unterfangen werden. Denn oft ist die Menge geeigneter Untersuchungsverfahren begrenzt. Mit der SNAP-tag-Technologie stellt New England Biolabs jetzt ein breit
anwendbares Sortiment von Werkzeugen zur Proteinfunktionsanalyse vor, das die spezifische
Markierung von Fusionsproteinen mit synthetischen Substraten gestattet.
Die Expression eines Zielproteins als Fusionsprotein mit einem Polypeptid-tag wurde
erstmals 1980 von Jon Beckwiths Arbeitsgruppe eingesetzt 1. Um die Aufreinigung zu
erleichtern, fusionierte er beta-Galaktosidase
mit MalF, einem E. coli-Membranprotein.
Seither werden Protein-tags zunehmend
in verschiedensten Bereichen der Biologie
eingesetzt. Eine moderne zellbiologische
Forschung ist ohne die Anwendung fluoreszierender Proteine kaum denkbar, und auch
die Affinitätsaufreinigung rekombinanter
Proteine mit Hilfe von Tags hat sich als Standardmethode etabliert.
Trotz ihres breiten Einsatzes in der Proteinanalyse zeigen klassische Tags zwei grundsätzliche Einschränkungen:
I Sie weisen nur Eigenschaften auf, die genetisch kodiert werden können. So sind etwa
die spektroskopischen Eigenschaften der
derzeit verfügbaren Fluoreszenzproteine
(wie etwa GFP) modernen synthetischen
Fluorophoren, die nicht genetisch kodierbar
sind, oft deutlich unterlegen.
ClaI, EcoRV, EcoRI
Gene of Interest
pSNAPm
1.
2.
SbfI, AscI, BamHI
XhoI, NotI, BstXI
4.
S
S-
X
3.
Abb. 1: Imaging mit SNAP-tags: 1. Klonieren des Zielgens in einen Expressionsvektor,
2. Transfektion und Expression in der Wirtszelle, 3. Zugabe des Substrates, 4. Das
markierte Substrat wird an den SNAP-tag gebunden und damit kovalent an das Targetprotein gekoppelt.
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I Klassische Tags sind auf bestimmte Applikationen zugeschnitten (z.B. Affinitätschromatographie) und dadurch nicht imstande,
verschiedene Facetten der Proteinfunktion
zugleich zu analysieren, wie etwa die Expression, den Transport, Protein-Interaktionen
und die Degradation.
Ein flexibel einsetzbarer Ansatz, der diese Limitationen überwindet, basiert auf
neuartigen Tags, die mit verschiedensten
synthetischen Substraten – zum Beispiel Fluorophoren, Affinitätsmarkierungen oder Beads
– markiert werden können. New England Biolabs stellt hier ein Portfolio verschiedenster
Tagging-Technologien vor, das zur Untersuchung einer Vielzahl von biochemischen und
zellbiologischen Fragestellungen eingesetzt
werden kann.
Kovalente Proteinmarkierung mit
SNAP-, CLIP-, ACP- und MCP-tags
Das vielseitigste dieser Markierungspeptide
ist der SNAP-tag, eine 20 kDa-Mutante des
DNA-Reparaturproteins O6-Alkylguanin-DNAAlkyltransferase. Der SNAP-tag reagiert schnell
und hochspezifisch mit Benzylguanin-Derivaten (Abb. 1, 2). Diese Benzylguanin-Derivate
sind kovalent an synthetische Markermoleküle,
zum Beispiel Fluorochrome, gekoppelt2. Das
Benzylguanin-gebundene Markermolekül Bebezeichnet man als SNAP-tag-Substrat.
SNAP-tags weisen verschiedene Eigenschaften auf, die in verschiedensten Anwendungen
der Proteinmarkierung nützlich sind. So ist etwa
die Bindungsgeschwindigkeit des SNAP-tags
an sein Substrat weitgehend unabhängig von
der chemischen Natur der Markierung. Dies
gestattet die Markierung der Fusionsproteine
mit einer großen Auswahl verschiedenster
SNAP-tag-Substrate. Zweitens unterliegt der
SNAP-tag weder hinsichtlich seiner Lokalisation
in der Zelle noch mit Blick auf den Organismus,
in dem er exprimiert wird, irgendwelchen Einschränkungen. Drittens kommt hinzu, dass die
SNAP-tag-Substrate chemisch inert gegenüber
anderen Proteinen sind – eine unspezifische Proteinmarkierung in der Zelle ist daduch geradezu
ausgeschlossen. Nicht zuletzt sind zahlreiche
SNAP-tag-Substrate membrangängig. Dies
ermöglicht die Markierung intrazellulärer Proteine in vivo.
Als zweites Markierungswerkzeug hat New
England Biolabs den CLIP-tag entwickelt, ein
Schwesterprotein des SNAP-tags3, das spezifisch
mit O2-Benzylcytosin-Derivaten reagiert (Abb.
2). Da beide Tags jeweils hochspezifisch mit
ihren Substraten reagieren, können SNAP- und
CLIP-Fusionsproteine gleichzeitig und spezifisch
mit unterschiedlichen Substraten in vivo markiert werden. Der CLIP-tag wird in erster Linie
für Doppelmarkierung von Fusionsproteinen in
Verbindung mit dem SNAP-tag genutzt.
Eine dritte angebotene Methode unterscheidet sich konzeptionell von der Markierung
LABORWELT
der bisher beschriebenenen SNAP- und CLIPFusionsproteine – sie basiert auf einer enzymatischen, posttranslationalen Modifikation.
Das zu untersuchende Protein wird zunächst
mit einem Acyl-Carrier Protein (ACP) fusioniert und kann anschließend spezifisch mit
CoenzymA (CoA)-Derivaten markiert werden.
Dies geschieht durch das Enzym ACP-Synthase
(AcpS) aus E. coli 4 . Erwähnenswert erscheint
in diesem Zusammenhang die geringe Größe
des ACP-tags von nur etwa 8 kDa5.
Das ACP-Schwesterprotein MCP wird anstatt
durch AcpS ausschließlich vom Enzym SFPSynthase (SFP) aus Bacillus subtilis modifiziert.
Dies ermöglicht die selektive Markierung von
ACP- und MCP-Fusionsproteinen mit verschiedenen Substraten in der gleichen Probe. Im Gegensatz zu diversen Substraten der SNAP- und
CLIP-tags sind die Substrate der ACP/MCP-tags
nicht zellpermeabel und somit ausschließlich
für die selektive Markierung extrazellulärer
Proteine an der Zelloberfläche geeignet, wie
etwa von Rezeptoren.
Die hier vorgestellten, voneinander un
abhängigen neuen Tools (SNAP-tags, CLIP-tags,
MCP-tags und ACP-tags) von New England Biolabs lassen sich für die selektive und irreversible
Markierung von Fusionsproteinen mit synthetischen Substraten und zur bildgebenden ZellAnalyse in vivo sowie in vitro einsetzen.
Untersuchung der
Proteinlokalisierung
Die korrekte Lokalisierung und Translokation eines Proteines ist wesentlich für
seine Funktion in der Zelle. Die Markierung
von SNAP- und CLIP-Fusionsproteinen mit
synthetischen Fluorophoren ermöglicht es,
mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie die
Lokalisierung des Zielproteins in der lebenden Zelle zu untersuchen, zum Beispiel im
Rahmen zellbasierter Assays (Abb. 3). Da
die SNAP- und CLIP-tags mit verschiedenen
Fluorophoren markiert werden können, ist
auch die gleichzeitige Lokalisation mehrerer Proteine möglich – zum Beispiel als
SNAP- und CLIP-Fusionsproteine oder in
Kombination mit Fluoreszenzproteinen wie
etwa GFP. Die Markierung der SNAP- und
CLIP-Fusionsproteine mit dem gewünschten Substrat wird dabei häufig in lebenden
Zellen durchgeführt. Bei Bedarf kann die
Markierung aber auch an fixierten Zellen
erfolgen, denn der Fusionstag bindet auch
nach Fixierung sein Substrat.
Live Cell Imaging-Analysen gestatten darüber hinaus eine Echtzeit-Untersuchung der
Proteintranslokation. Ein bereits publiziertes
Beispiel hierfür ist die Visualisierung der
nukleären Relokalisation des via SNAP-tag
markierten humanen Östrogenrezeptorsalpha nach Inkubation der Zellen mit dessen partiellem Antagonisten 4-Hydroxy
tamoxifen6,7.
10 | 10. Jahrgang | Nr. 4/2009
Abb. 2: Funktionsprinzip des SNAP-tags und des CLIP-tags. Der mit dem Targetprotein fusionierte SNAP-tag oder CLIP-tag bindet an das gewählte Markermolekül „X“ und setzt
Guanin beziehungweise Cytosin frei.
Zudem kann die Markierung von SNAP- oder
CLIP-tag-Proteinen auf bestimmte Bereiche in
der Zelle beschränkt werden. Mit nicht mem
brangängigen SNAP-tag- oder Zelloberflächen-spezifischen ACP/MCP-Sonden können
zum Beispiel gezielt membranständige Rezeptorproteine (wie GPCRs), Proteindomänen an
der Zelloberfläche oder extrazelluläre Proteine visualisiert werden8. Dieser Ansatz erlaubt
– im Gegensatz zu konventionellen Methoden
– auf einfache Weise die Unterscheidung verschiedener Populationen ein- und desselben
Zelloberflächenproteins. So kann etwa im
Rahmen von Proteintranslokationsstudien
zwischen Proteinpopulationen unterschieden werden, die bereits zur Plasmamembran
transportiert und korrekt integriert wurden,
und solchen, die sich noch im Sekretionsweg
befinden oder nach Ligandenbindung bereits
wieder re-internalisiert wurden. In diversen
Studien wurde die Fähigkeit des SNAP-tags
ausgenutzt, ausschließlich an korrekt gefaltete und damit funktionell intakte Subpopulationen der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren
(GPCRs) zu binden9-10.
Zeitaufgelöste Studien
Da der Zeitpunkt der Markierung eines bestimmten Proteins im Experiment beliebig
gewählt werden kann, lässt sich mit Hilfe der
neuen Tags das Verhalten von Zielproteinen
auch zeitaufgelöst und unter dem Einfluss
potentieller Effektoren untersuchen. Insbesondere können Fragen zum intrazellulären
Proteintransport, Proteinumsatz, der Dynamik von Organellen und zur Anordnung von
von Makromolekülen genauer untersucht
werden. Die Stabilität der kovalenten Mar-
kierung bietet die Möglichkeit, verschiedene
Farbstoffe zu unterschiedlichen Zeitpunkten
des Experimentes einzusetzen, um so zwischen älteren und neu synthetisierten Proteinen in der lebenden Zelle unterscheiden zu
können. Mit Hilfe solch mehrfarbiger Pulse/
Chase-Markierungen kann eindeutig zwischen Populationen ansonsten identischer
Proteine unterschieden werden.
Dieser Ansatz wurde genutzt, um die Synthese und Umsetzung von Phospholamban
zeitaufgelöst zu untersuchen. Durch die
mehrfarbige Pulse/Chase-Markierung des
Proteins über einen Zeitraum von 24 Stunden
konnte zwischen bereits vorhandenen und
neugebildeten Molekülen unterschieden und
eine mögliche neue Rolle in der Differenzierung von Myoblasten aufgedeckt werden11.
Jansen et al. markierten Proteine, die in einem bestimmten Zeitfenster des Zellzyklus
translatiert werden, um die Rolle des Centromerproteins A (CENP-A) – eine Variante des
Histons H3 – in der Centromerausbildung
und der Zellteilung zu überprüfen. Überraschenderweise zeigten die Experimente, dass
CENP-A nur in der G1-Phase in Histone der
Centromere eingebaut wurde 12. McMurray
und Thorner nutzten unlängst MehrfarbPulse/Chase-Experimente, um zwischen
alten und neugebildeten Molekülen der
Septine Cdc10 und Cdc12 zu differenzieren
und so ihre Stabilität und Wiederverwertung
während der dynamischen strukturellen
Veränderungen bei Zellteilung und -ent
wicklung im Zuge der Hefe-Knospung zu
untersuchen. Nach ihren Ergebnissen sind
die den Septin-Einbau regulierenden Mechanismen für jede Untereinheit und den
jeweiligen Entwicklungsstand der Zelle
spezifisch13.
LABORWELT
CO2 - Abfall oder Rohstoff?
Möglichkeiten und Grenzen
der CO2-Sequestrierung
3.-4.11.2009, Zentrum für Umweltkommunikation, Osnabrück
Im Rahmen dieser zweitägigen Konferenz zum Thema Abscheidung von CO2 soll unter technologischen, ökologischen und wirtschaftlichen Aspekten diskutiert werden, ob CO2 als Industrieabfall entsorgt oder als Rohstoff
zum Aufbau komplexer Kohlenstoffverbindungen genutzt werden kann. Dazu werden erste Ergebnisse der
angewandten CO2-Abscheidungs-, Transport- und Lagerungstechnologien verschiedener deutscher Pilotanlagen vorgestellt sowie Möglichkeiten der biologisch-chemischen Fixierung und Nutzung von CO2 aus aktuellen
Forschungsprojekten in Deutschland aufgezeigt.
Unter anderem werden als Referenten sprechen
Prof. Dr. Hartmut Graßl, Max-Planck-Institut für Meteorologie, Meteorologisches Institut der Universität Hamburg
Prof. Dr. Manfred Fischedick, Vizepräsident, Wuppertal Institut für Klima, Umwelt, Energie
Dr. Thomas Haas, Leiter Science-to-Business Center Biotechnologie, Creavis Technologies & Innovation,
Evonik Degussa GmbH
Prof. Dr. Walter Leitner, Leiter Institut für Technische Chemie und Makromolekulare Chemie, RWTH Aachen
Dr. Wolfgang Rolland, Leiter Bergwirtschaft/Bergbaustrategie, Vattenfall Europe Mining AG
Prof. Dr. Walter Trösch, Abteilungsleiter Umweltbiotechnologie und Bioverfahrenstechnik, Fraunhofer IGB
Dr. Hilke Würdemann, Leiterin Bio-Geoengineering, Deutsches GeoForschungszentrum
Registrierung und weitere Informationen unter www.biocom.de/events.
Medienpartner:
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verschiedener Generationen zweier unterschiedlicher Proteine in einer Zelle, was das
Potential dieses Versuchsansatzes noch
weiter erhöht3.
Protein-Protein-Interaktionsstudien
Abb. 3: In vivo-Markierung von COS-7Zellen. Transfizierte COS-7-Zellen
exprimieren mitochondrial codiertes
Cytochrom-8A als SNAP-tag-Fusionsprotein (eingesetzter Vektor: pSNAPCox8A). Das fluoreszierende Substrat
TMR-Star passiert die Zellmembran
und markiert das Zielprotein (rot).
Blau: Zellkern-Markierung mit
Hoechst 33342
Auch eine sequenzielle Markierung mit mehr
als zwei Fluorophoren ist mit den neuen Tags
möglich. Solche Mehrfarb-Markierungsexperimente wurden beispielsweise für die Untersuchung der Zellwandsynthese während der
Hefeknospung eingesetzt 14 . Darüber hinaus
eröffnet die nicht überlappende Substratspezifität der SNAP- und CLIP-tags gleichzeitige
Pulse/Chase-Experimente zur Visualisierung
Protein-Protein-Interaktionen spielen eine
Schlüsselrolle in den meisten biologischen
Prozessen. Die SNAP-Tag-Technologie bietet auch hier vielfältige Möglichkeiten,
relevante Wechselwirkungen zwischen dem
Fusionsprotein und putativen Liganden
zu charakterisieren. Proteine können dazu
mit Fluorophoren markier t werden, die
speziell auf FRET-Experimente (FluoreszenzResonanz-Energie-Transfer) ausgelegt sind,
und mit denen bereits Untersuchungen zur
Homo- und Heterodimerisierung von GPCRs
durchgeführt wurden9-10. Verglichen mit der
klassischen Fluoreszenzmarkierung zeigen
sich auch hier Vorteile der neuen Markierungstechnologie. Neben der Möglichkeit,
Fluorophor-Paare zu selektieren, die für
FRET-Experimente optimal geeignet sind,
bieten die SNAP/CLIP-tag-Markierungen den
Vorteil, dass unreife oder fehlgefaltete – also
noch im Sektretionsweg steckende – Proteine
nicht zum beobachteten Signal beitragen.
Außerdem können die FRET-Experimente
mit traditionellen biochemischen Versuchsansätzen kombinier t werden: MagnetBeads, die mit dem Substrat des SNAP-tags
gekoppelt wurden, können etwa für PullDown-Experimente zur Identifizierung und
Charakterisierung von Interaktionspartnern
des zu untersuchenden Proteins eingesetzt
werden.
Daneben erweisen sich SNAP-tag-Fusionen
auch als interessant für Hochdurchsatz-Experimente zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktion in vitro: entweder FRET-basiert
in der Ober flächen-Plasmon-Resonanz 15
oder auch bei der Entwicklung von ProteinMicroarrays 16-17. Die Möglichkeit, einzelne
wissenschaftliche Fragestellungen durch
eine Vielzahl verschiedener experimenteller
Ansätze zu untersuchen, macht die SNAP-tagTechnologie besonders interessant für die
Analyse von Protein-Protein-Interaktionen.
„optical switches“ genannt, die die Sensitivität bei FRET-Experimenten erhöhen18. Auch
der Einsatz von Farbstoffen, die auf Einflüsse
aus ihrer Umgebung reagieren19, sollte nicht
unerwähnt bleiben. Mit Hilfe vorgefertigter
aktivierter Benzylguanin-Derivate („Building
Blocks“) kann der Experimentator unkompliziert auch eine Markierung seiner Wahl
ankoppeln. Dadurch kann er ein SNAP-TagSubstrat – zum Beispiel mit Farbstoffen oder
Beads – erzeugen, das auf seine spezifische
wissenschaftliche Fragestellung zugeschnitten ist.
Während der Einsatz von Fluoreszenzproteinen den Experimentator auf eine
Wellenlänge festgelegt und eine Änderung
des Versuchsansatzes stets zu neuen Klonierungen mit anschließender Charakterisierung
führt, bietet die SNAP-tag-Technologie mehr
Flexibilität – durch einfachen Wechsel des
Substrats lassen sich verschiedene Fluorochrome oder Markierungen rasch und ohne
großen Aufwand einbringen.
Literatur
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Ausblick
Abb. 4: COS-7-Zellen exprimieren den SNAPTransferrin-Rezeptor. Pulse/ChaseExperiment mit SNAP-Surface 547
(rot) und anschließender SNAP-488Markierung (grün).
12 | 10. Jahrgang | Nr. 4/2009
Eine zunehmende Zahl wissenschaftlich publizierter Studien dokumentiert das Potential
insbesondere der SNP-tag- und Clip-tag-Technologie zur Untersuchung zellbiologischer
und biochemischer Fragestellungen mit den
derzeit verfügbaren Substraten. Fortschritte
in der Chemie eröffnen die Synthese vollkommen neuartiger SNAP/CLIP-tag-Markierungen
und damit ganz neue Wege in der Analyse
von Proteinfunktionen. Als Beispiele seien
an dieser Stelle die vor kurzem eingeführten
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-Chem-biochem 7, 908.
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Brüningstr. 50 Geb.G810
65926 Frankfurt am Main
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LABORWELT
Proteom-Analyse
der Zelloberfläche
Damaris Bausch-Fluck, Thomas Bock, Andreas Hofmann und Dr. Bernd Wollscheid,
NCCR Neuro Center für Proteomics, Institut für Molekulare Systembiologie, ETH Zürich
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Zelloberflächenproteine sind interessante diagnostische und therapeutische Targets. Um die
Expression dieser Proteine an der Zelloberfläche zu untersuchen, werden in der Regel Antikörper eingesetzt. Dieser Ansatz erlaubt zur Zeit die Analyse von etwa 12 Zelloberflächenproteinen
zugleich, vorausgesetzt die entsprechenden Antikörper sind vorhanden. Für die Mehrzahl der
etwa 3.000 prognostizierten Zelloberflächenproteine gibt es allerdings noch keine adäquaten
Antikörper. Die neu entwickelte Cell Surface Capturing (CSC)-Technologie ermöglicht es nun,
unabhängig von Antikörpern die Expression hunderter Zelloberflächenproteine gleichzeitig
in systembiologischen Experimenten zu untersuchen.
Die Proteine der Zelloberfläche haben als
entscheidende Nahtstelle für den Informationsaustausch der Zelle mit ihrer Umgebung eine zentrale Bedeutung. Sie sind
der der Ausgangspunk t hochkomplexer
Signalaufnahme-, Signalverarbeitungs- und
Signalweiterleitungsmechanismen. Die
verschiedenartigen Funktionalitäten der
einzelnen Zelloberflächenproteine ermöglichen den Zellen einerseits den Austausch
von Informationen, andererseits müssen
die Zellen den Informationsfluss aber auch
regulieren. Verschiedene Zelltypen, wie etwa
Nerven- oder Immunzellen, unterscheiden
sich deshalb in der qualitativen und quantitativen Zusammensetzung ihrer Zelloberflächenproteine, also in ihrem charakteristischen
Zelloberflächenphänotyp. Deshalb können
verschiedene Zelltypen anhand ihrer Oberflächenproteine charakterisiert und klassifi-
ziert werden, wie zum Beispiel anhand der
Cluster-of-Differentiation(CD)-Antigene 1 in
der Immunologie. Kommt es im Zuge einer
Erkrankung, zum Beispiel an Krebs, zu einer
Deregulierung der komplexen Informationsübertragungssysteme, offenbart sich eine
weitere wichtige medizinische Bedeutung der
Zell-Phänotypisierung: Weil die Entartung der
Zelle meist mit einer Veränderung des Zell
oberflächenphänotyps einhergeht, eröffnet
dieser Ansatzpunkte für neue Diagnoseund Therapieansätze. Die Identifizierung
phänotypisch veränderter Zellpopulationen
ermöglicht bereits heute die gezielte Eliminierung von Blutkrebszellen, die frühzeitige
Einstufung der Krankheit (Staging) sowie
Auswahl der adäquaten Therapie.
Allerdings konnte das volle Potential der
Zelloberflächenphänotypisierung bisher
nicht ausgeschöpft werden, da das derzeitige Wissen über das Oberflächenproteom
spezifischer Zellen noch sehr begrenzt ist.
Grund ist vor allem der Mangel an geeigneten
Technologien, mit denen die Vielfalt der Zell
oberflächenproteine zu einem bestimmten
Zeitpunkt simultan, qualitativ und quantitativ
erfasst werden kann2.
Limitationen in der Analyse
von Oberflächenproteinen
Abb. 1: Mit der CSC-Methode werden hunderte Oberflächenproteine von Zellen
gleichzeitig analysiert. Für dieses Bild
wurden die biotinylierten Glykane der
Zelloberflächenproteine grün eingefärbt, um sie sichtbar zu machen. Die
Zellkerne sind blau.
LABORWELT
Die bisher limitierte Fähigkeit, das Zelloberflächenproteom zu charakterisieren, hängt
vor allem mit der Schwierigkeit zusammen,
Zelloberflächenproteine gezielt aufzureinigen und zu identifizieren. Geringe absolute
Proteinmengen der Oberflächenproteine in
Relation zu Proteinen des Zellinneren und
spezielle biochemische Eigenschaften der
(oft wasserunlöslichen) Proteine bereiten
hier Probleme und erschweren die Analyse
mit gängigen biochemischen Methoden ungemein. Dazu kommen verschiedenartigste
post-translationale Modifikationen wie zum
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10 Jahrgang | Nr. 4/2009 | 13
Abb. 2: Mit der CSC-Technologie werden glykosylierte Peptide von Zelloberflächenproteinen in
mehreren Schritten aufgereinigt. Die Protokollschritte beinhalten: 1. Biotinylierung von
glykosylierten Oberflächenproteinen, 2. Zelllyse und Trypsinverdau, 3. Affinitätsaufreinigung der biotinylierten Peptide, 4. Enzymatische Elution der Peptide, 5. Massenspektrometrische Analyse, 6. Identifizierung des Peptids und Proteins.
Beispiel Glykosylierungen und das Vorhandensein hydrophober Transmembrandomänen.
Deshalb sind sowohl die Identität als auch
die Funktion vieler Zelloberflächenproteine
heute wenig bis gar nicht bekannt.
Während bioinformatisch derzeit ein Anteil
von rund 3.000 Zelloberflächenproteinen am
Gesamtproteom prognostiziert wird, sind mit
knapp 400 verlässlich CD-annotierten Oberflächenmolekülen erst ein Bruchteil davon
experimentell bestätigt und durch Antikörper
auf der Zelloberfläche detektierbar.
Die Cell Surface CapturingTechnologie
Mit der Entwicklung der Cell Surface Capturing (CSC)-Technologie am Institut für
Molekulare Systembiologie der ETH Zürich
(www.imsb.ethz.ch/researchgroup/wbernd)
und dem Institut für Systems Biology (www.
systemsbiology.org/) in Seattle/USA wurde
eine neue Technologie geschaffen, um diese
Schwierigkeiten bei der Analyse von Oberflächenproteinen zu umgehen3,4 . Sie ermöglicht
die gezielte Anreicherung von Peptiden, die
aus extrazellulären Proteindomänen von
Zelloberflächenproteinen stammen.
Die CSC-Technologie basiert auf der Biotinylierung der Glykane von Zelloberflächenproteinen (Abb. 1) und der anschließenden
Affinitätsanreicherung der biotinylierten
Glykopeptide (Abb. 2). Die kovalente Biotinylierung der Glykoproteine, die auf der
lebenden Zelle erfolgt, ermöglicht es, eine
Momentaufnahme des zellulären Glykoproteoms der Zelloberfläche zu gewinnen. Im
Anschluss an die Biotinylierung der Glykoproteine erfolgt die Zellhomogenisierung, der
Trypsinverdau der Mikrosomenfraktion und
schließlich die Affinitätsaufreinigung mittels immobilisiertem Streptavidin, welches
anschließend stringent mit Lösungsmitteln
14 | 10. Jahrgang | Nr. 4/2009
gewaschen wird. Die enzymatische Elution
der Peptide mit N-Glykosidase F (PNGase F)
katalysiert die hydrolytische Abspaltung der
Asparagin-gebundenen Glykanketten von
den Peptiden. Diese Abspaltung führt zur
Desamidierung des Asparagins – die daraus
resultierende Massendifferenz von einem
Dalton zwischen Asparagin und Aspartat
lässt sich mittels LC-MS-Analyse nachweisen5.
Somit erlaubt der Nachweis der modifizierten
Glykosylierungsmotive auch eine zuverlässige Identifizierung der genauen Position
der N-Glykosylierungsstellen von Zelloberflächenproteinen. Beispielsweise sind die
Ergebnisse der CSC-Analyse einer Schwannzelllinie (MSC80) in Abbildung 3 visualisiert.
In dieser CSC-Analyse wurden mehr als 291
Oberflächenglykoproteine identifiziert, darunter 45 CD-annotierte Moleküle. Insgesamt
wurden 1.033 Glykopeptide identifiziert, bei
denen jeweils ein desamidiertes NXS/TGlykosylierungsmotiv bei der massenspektrometrischen Analyse nachgewiesen werden
konnte. Die CSC-Technologie erlaubt somit
die Erkundung der Zelloberfläche aus der Vogelperspektive und zeigt deren Komplexität
ohne vorgängige Hypothesen3.
Quantifizierung von Expressions
veränderungen an der Zelloberfläche
Die CSC-Technologie ermöglicht es, eine
umfassende Zelloberflächenanalyse ohne
Zuhilfenahme von Antikörpern innerhalb
eines einzigen Experimentes durchzuführen.
Kombiniert mit quantitativen massenspektrometrischen Methoden lassen sich nicht
nur die Identität der Oberflächenproteine,
sondern auch deren Expressionsmengen
genauer definieren. Eine vergleichende
Proteinquantifizierung kann mit oder ohne
Isotopenmarkierung er folgen 6 . Um die
Peptidmengen ohne zusätzliche Isotopen-
markierung zu bestimmen, werden Peptide
unterschiedlicher Proben getrennt voneinander massenspektrometrisch analysiert und
anschließend aufgrund ihrer Eigenschaften
wie Masse und Elutionszeit einander zugeordnet und in den unterschiedlichen Proben
miteinander verglichen7.
Eine Proteinquantifizierung ohne Isotopen
markierung wurde angewandt, um veränderte Expressionsmuster von Oberflächenproteinen während der Dif ferenzierung
embryonaler Stammzellen der Zelllinie 159-28
in neuronale Vorläuferzellen zu bestimmen.
Insgesamt wurden in diesem Experiment 341
Oberflächenproteine quantifiziert, wovon 53
annotierte CD-Moleküle waren. Die quantifizierten Proteine deckten verschiedene
molekulare Funktionensgruppen ab, wie
zum Beispiel Rezeptoren, Ionenkanäle und
Adhäsionsmoleküle. Jede Funktionsgruppe
war von Veränderungen betroffen. Bekannte
Veränderungen, wie die verminderte Expression des LIF-Rezeptors oder die verstärkte
Expression des FGF-Rezeptors 2 während der
Differenzierung, konnten bestätigt werden.
Zudem wurden noch eine Vielzahl an Neuentdeckungen gemacht3. Die CSC-Technologie
ermöglichte es umfassend und detailliert,
die weitreichenden Veränderungen der Zell
oberfläche während der Differenzierung
quantitativ zu erfassen.
Vergleich von Zelltypen mit
dem Zelloberflächen-Proteinatlas
Eine ganze Reihe von Forschungsgruppen
wendet mittlerweile die CSC-Technologie
an, um die Zusammensetzung der Proteine
an der Zelloberfläche bestimmter Zelltypen
aufzuschlüsseln. Dabei können 300 bis 400
Oberflächenproteine pro Zelltyp identifiziert
werden. Viele Fragestellungen zielen darauf
ab, aus den identifizierten Proteinen ein Set
von wenigen Markern zu definieren, eine
Art Zellsignatur, welche für die diagnostische Identifizierung einer Zelle ausreichen.
Aus einigen hundert Proteinen diejenigen
auszuwählen, die spezifisch für eine Zelle
sind, ist nicht trivial. Es wäre hilfreich zu
wissen, welche Proteine auch auf anderen Zell- oder Gewebetypen identifiziert
worden sind. Um solche ZelloberflächenSignaturen zu vergleichen und mögliche
zellspezifische Markerproteine in einem
subtraktiven Verfahren auszuwählen, wurde der Zelloberflächenatlas entwickelt, der
momentan (Stand Juni 2009) Informationen
über das Zelloberflächenproteom von mehr
als 40 Zelltypen enthält. Mit Hilfe dieses
Zello ber f lächenproteinatlas‘ ist es nun
möglich, schnell zu bestimmen, welche Proteine schon auf anderen Zellen identifiziert
wurden und welche vielversprechend für
eine weitere Validierung mit komplementären Methoden wie Durchflusszytometrie,
LABORWELT
immunhistochemischen Färbungen oder
RNAi-Experimenten erscheinen.
Der Zelloberflächenproteinatlas schafft
die Grundlage, zellspezifische Proteinsignaturen zu definieren, die als diagnostisches
Set zur Zellidentifizierung dienen können.
Um die Reproduzierbarkeit der massenspektrometrischen Identifikationen zu erhöhen
und die Analyse auf jene Peptide zu lenken,
deren Signale eher schwächer, aber potentiell interessanter sind, müssen neuentwickelte, sogenannte gezielte MS-Methoden
ver wendet werden 9 . Im Gegensatz zur
Shotgun-Methode wird dabei zuerst eine
Liste an interessierenden Peptiden und deren
Charakteristiken, wie Masse, Ladungszustand
und Elutionszeit, erstellt, um danach in einer
gezielten Analyse nur noch diese Peptide vom
Massenspektrometer detektieren zu lassen.
Somit ist es möglich, in jeder Probe die gleichen Peptide zu messen, falls sie vorhanden
sind. In Bezug auf die Zelloberfläche sind vor
allem die sogenannten CD-Moleküle interessant, wegen ihrer oft guten funktionellen
Charakterisierung. Der Zelloberflächenatlas
enthält mittlerweile Informationen über
MS-detektierbare Peptide von mehr als 240
CD-Molekülen und von mehreren hundert
Nicht-CD-Oberflächenproteinen, die nun
gezielt und gleichzeitig gemessen werden
können, ohne in der Entdeckungs- und Validierungsphase von der Verfügbarkeit passender
Antikörper abhängig zu sein.
Zusammenfassend gesagt, ermöglicht es
die CSC-Technologie, Proteine an der Zell
oberfläche simultan in systembiologischen
Experimenten zu erfassen. Fragen, wie eine
Zelle etwa über ihre Oberflächenproteine
qualitativ und quantitativ mit ihrer Mikroumgebung interagiert, können nun modelliert
werden. Diese Modelle sind die Grundlage
für die Entwicklung neuer diagnostischer und
therapeutischer Ansätze in der Zukunft.
Go FishinG!
Literatur
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Dr. Bernd Wollscheid
Institute of Molecular Systems Biology
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Abb. 3: CYTOSCAPE-Oberflächenproteom einer Schwannzelle (gelb). Mittels CSC identifizierte
Proteine sind mit grünen Kreisen dargestellt, die blauen Dreiecke symbolisieren die identifizierten Glykopeptide. In der gezeigten CYTOSCAPE-Spiralperspektive haben die Proteine nach außen hin mehr identifizierte N-Glykosylierungsstellen (www.cytoscape.org/).
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10 Jahrgang | Nr. 4/2009 | 15
Blitzlicht Molekulares Imaging
Tumorigenität,
Überleben und Migration
von Stammzellen
Prof. Dr. med. Sonja Schrepfer und PD Dr. med. Tobias Deuse,
TSI Lab, Universitäres Herzzentrum Hamburg
Bei Herzinfarkt abgestorbenes Myokard kann bisher durch kein Therapieverfahren wiederhergestellt werden. Neue Hoffnung versprechen jedoch Ansätze auf der Basis der Stammzelltherapie. Die Transplantation von Stammzellen soll den ischämischen Myokardschaden verringern,
eine Regeneration des Herzmuskelgewebes unterstützen und helfen, eine Verbesserung der
Herzfunktion zu erzielen.
Ein grundsätzliches Problem der Stammzelltherapie des akuten Myokardinfarktes stellt
die Verfügbarkeit ausreichender Mengen
geeigneter Stammzellen zum Zeitpunkt der
Akuttherapie dar. Ansätze, die eine Isolierung,
Aufreinigung und Expansion spezifischer
autologer adulter Stammzellpopulationen
beinhalten, scheiden daher aus. Allogene embryonale oder adulte Stammzellen könnten
zwar jederzeit bereitgestellt werden, werden
jedoch nach Transplantation vom EmpfängerImmunsystem abgestoßen. Dieses Problem
wurde in den letzten Jahren unterschätzt,
da Stammzellen aufgrund ihrer reduzierten
Expression Antigen-wirksamer MHC-Moleküle
weitgehend als immunpriviligiert angesehen
wurden1,2. Wir und andere Arbeitsgruppen
konnten jedoch kürzlich zeigen, dass Stammzellen abgestoßen werden und dass eine starke
Immunsuppression des Empfängers notwendig wäre, um diese Abstoßung zu verringern3-6,
Wegen ihrer erheblichen Nebenwirkungen bei
der Therapie des akuten Myokardinfarktes ist
eine derartige Immunsuppression jeoch nicht
zu vertreten.
Unser Labor erforscht transplantationsimmunologische Fragestellungen in der
adulten, fetalen und embryonalen Stammzelltransplantation mit aktuellsten Methoden der Molekular- und Zellbiologie und
Immunologie 7. Das Ziel dieser Studien ist
es, die immunologische Barriere zu überwinden und geeignete Zellen verfügbar zu
machen. Dabei ist die in-vivo-Darstellung
transplantierter Stammzellen im Wirtsorganismus von großer Bedeutung, um das
Überleben der Stammzellen und ihre funktionelle Reorganisation sensitiv, akkurat
und nicht-invasiv überwachen zu können.
Die Biolumineszenz-Bildgebung eignet sich
hervorragend für die Visualisierung der
Zellwanderung und des Zellüberlebens in
lebenden Organismen. Basierend auf dem
Nachweis von Reportergenen ist die Mehrfachuntersuchung ein- und desselben Tieres
und damit der dynamische Nachweis der
Effektorzell-Migration möglich. Die Möglichkeiten dieser hochinnovativen Technik sind
für viele medizinische Anwendungsbereiche
von Bedeutung, so zum Beispiel in der Onko-
Laborwelt Hintergrund
Lumineszenz und Luciferase-Reaktion
Luciferasen sind strukturell unterschiedliche
Enzyme, in deren Anwesenheit Luciferine
mit Sauerstoff zu energiereichen, instabilen
Dioxetanen oder Dioxetanonen reagieren
(Oxidation). Beim Zerfall dieser Substanzen
kommt es zur Biolumineszenz. Unterschieden
werden unter anderen Firefly-Luciferasen (aus
dem Leuchtkäfer Photinus pyralis, vgl. Foto),
bei denen Luciferol, ATP und Sauerstoff zu
Kohlendioxid, AMP und Licht reagieren und
Renilla-Luciferasen (aus der Seefedernart Renilla reniformis), die nur Luciferol und Sauerstoff
(kein ATP) zur Reaktion benötigen12.
16 | 10. Jahrgang | Nr. 4/2009
logie, Inflammation, dem Metabolismus und
der Toxikologie, Neurologie, Gentherapie und
vielen anderen8-10.
Biolumineszenz-Bildgebung
in der Stammzelltransplantation
Humane embryonale Stammzellen (hESCs),
die ausschließlich allogen transplantiert
werden können, haben ein deutlich größeres
regeneratives Potential als adulte Stammzellen. Ihr größter Vorteil ist die Pluripotenz,
die ihnen zum Beispiel die Differenzierung
in Herzmuskelzellen ermöglicht und somit
enormes regeneratives Potential verleiht.
Aufgrund ihres frühen Entwicklungsstandes und der postulierten fehlenden Expression immunologisch relevanter Oberflächenmarker wurden Stammzellen als immunpriviligierte Zellen betrachtet 1,2. Mittlerweile ist
nachgewiesen, dass embryonale Stammzellen
eine zwar geringe, aber dennoch hinreichend
starke MHC-I-Expression aufweisen, um eine
allogene Immunreaktion auszulösen und
abgestoßen zu werden3-6.
Diese immunologische Barriere und die zur
Abstoßung führenden Mechanismen müssen
genauer definiert werden, um Ansätze zu finden, um die Abstoßung zu umgehen. Hierbei
wird die in-vivo-Darstellung transplantierter
Stammzellen im Wirtsorganismus einen
erheblichen Einfluss auf die Akzeptanz zellbasierter Therapiestrategien haben.
Das TSI-Lab ist im Universitären Herzzentrum Hamburg (Herz- und Gefäßchirurgie;
Ärztlicher Leiter: Prof. Dr. med. H. Reichenspurner) angesiedelt. Die Zielsetzung unserer Arbeitsgruppe ist unter anderem die
Charakterisierung der Immunbiologie embryonaler Stammzellen in Abhängigkeit von
ihrem Differenzierungsgrad. In vivo sollen
Stammzellmigration, Zellüberlebensrate und
funktionelle Reorganisation nicht invasiv
überwacht werden, um die Grundlagen der
Stammzellimmunbiologie mit Blick auf eine
spätere klinische Translation zu verstehen.
Eine vielverwendete Möglichkeit, Stammzellen in vivo zu darzustellen, ist die magnetische Markierung der Zellen für die Magnetresonanztomographie (MRT)11. Mittels
der MRT-Technologie wurden stabile Überlebensraten von transplantierten Stammzellen
nachgewiesen. Mittlerweile ist jedoch belegt,
dass die Stammzellen – und mit ihnen die
Eisenpartikel – von Makrophagen aufgenommen wurden, so dass letztendlich die Makrophagenmigration visualisiert wurde11.
Die moderne Biolumineszenz-Bildgebung
(Biolumineszenz-Imaging, BLI) basiert auf
der hochempfindlichen Messung von in
vivo emittiertem Licht 12. Generiert wird dies
durch transgene Expression lumineszierender Enzyme (Luziferase) oder passiv durch
äußere Anregung fluoreszenter Proteine (vgl.
Kasten). Mittels einer hochempfindlichen
LABORWELT
Zellen als Photonen pro Sekunde nicht-invasiv
mittels eines Luciferase-Detektionssystems
gemessen wird (Xenogen, CA, USA). Da das
Entstehen des Lichtsignals ATP-abhängig ist,
erlischt das Signal bei Zelltod, und es kann
nicht auf andere Zellen übertragen werden –
weder durch Fusion noch durch Aufnahme in
Makrophagen. Diese neue, elegante Methode
erlaubt außerdem wiederholte Messungen im
gleichen Tier und ist signifikant sensitiver als
herkömmliche Methoden wie die Histologie,
lacZ-Färbungen, etc. (Abb. 1).
A
B
Methode
Die stabile Transduktion der undifferenzierten
Stammzellen erfolgt retroviral mittels Lentiviren unter Kontrolle eines CMV-Promotors.
Die Zellen können nach Transduktion durch
ihre Puromycin-Resistenz aufgereinigt und
weiter expandiert werden. Wir haben eine gute
Transduktionseffizienz bei hoher Zellviablilität
beobachtet. Mittels des IVIS200 können bis zu
fünf Mäuse simultan gemessen werden. Hierfür wird anästhesierten Mäusen 200µl Luciferin i.p. appliziert, das entstehende Lichtsignal
mittels IVIS200 quantifiziert und anschließend
als Photonen pro Sekunde (total flux) und als
Log[photons/sec] dokumentiert.
C
Abb. 1: A:Biolumineszenz-Bildgebung zum Nachweis der Tumorigenität von Stammzellen: In
immuninkompetente Mäuse transplantierte humane embryonale Stammzellen (hESC)
am Transplantationstag (d0) und am dritten bzw. fünften postoperativen Tag (d3, d5).
Nach 80 Tagen hat sich am Transplantationsort ein Tumor (Teratom) entwickelt, der
makroskopisch und mittels BLI nachweisbar ist. Das Teratom wurde durch Nachweis
von Zellen aller drei Keimblätter histologisch bestätigt. B: Biolumineszenz-Bildgebung
zum Nachweis der Abstoßungskinetik: hESCs wurden in Balb/C-Mäuse transplantiert
und mittels BLI am Transplantationstag (d0) und am dritten bzw. fünften postoperativen Tag (d3, d5) überwacht. An Tag 5 waren die hESCs abgestoßen. Eine Woche
später wurden hESCs in die kontralaterale Seite der gleichen Mäuse transplantiert und
mittels BLI eine akzelerierte und somit adaptive Immunantwort nachgewiesen, da
die Zellen bereits am dritten Tag abgestoßen waren. Der Elispot für die IFNγ-Sekretion
von TH1-Zellen der gleichen Tiere deutet auf eine zellulär vermittelte Abstoßung hin
und bestätigt die mittels BLI nachgewiesene adaptive Immunantwort. C: Biolumineszenz-Bildgebung zum Nachweis der Stammzellmigration: Intravenös applizierte
Stammzellen wurden bereits fünf Minuten nach Injektion mittels BLI in der Lunge
nachgewiesen. Aufgrund ihrer Größe bleiben sie in den Lungenkapillaren hängen. Dies
wurde mittels Histopathologie bestätigt. Hierfür wurden hESCs vor Injektion mit dem
grünfluoreszierenden Farbstoff CSFE gefärbt (oben: H+E; unten: CSFE).
CCD-Kamera wird das für das menschliche
Auge nicht wahrnehmbare Licht detektiert,
gemessen und in Echtzeit auf ein Bild des
Modells projiziert.
Reportergen-Imaging ermöglicht die Dokumentation der Anzahl, Lokalisation, Proliferation und des Zelltodes transplantierter
Stammzellen in vivo, indem der ATP-Gehalt der
Nachweis der Tumorigenität
embryonaler Stammzellen
Als Kontrollgruppe unserer Transplantatstudien dienten T-Zell-defiziente und somit immuninkompetente Balb/C nude-Mäuse (Abb. 1A).
In diesem Wirtorganismus fand aufgrund der
fehlenden T-Zellen keine zelluläre Abstoßung
der undifferenzierten hESC statt. Aufgrund
der fehlenden Immunreaktion bilden transplantierte undifferenzierte hESC Teratome9,
die mittels BLI longitudinal in vivo überwacht
werden können (Abb. 1A). Nach einigen Wochen wird der Tumor auch makroskopisch
sichtbar und kann mittels Histologie und dem
Nachweis von Zellen aller drei Keimblätter
dokumentiert werden.
Nachweis der Abstoßungskinetik
Mittels BLI haben wir die Abstoßungskinetik
von hESC dokumentieren und die Rolle der
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LABORWELT
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10. Jahrgang | Nr. 4/2009 | 17
A
B
C
Abb. 2: Firefly Luciferase-Markierung und Zellbiologie. A: Undifferenzierte humane embryonale Stammzellen (hESC). B: Embryoid bodies (hEB).
C: Kardiomyozyten (hCM), gefärbt mit Troponin und DAPI.
angeborenen versus adaptiven Immunität
in vivo untersuchen können. Erstmals kann
nun longitudinal in vivo nachgewiesen werden, wie lange die Stammzellen überleben.
Hierdurch ist es möglich, bei wiederholter
Stammzelltransplantation zu dokumentieren,
ob ein toleranter Status erreicht wird oder
eine akzelerierte Abstoßung stattfindet (Abb.
1B). Hierfür wurden fluc-markierte hESCs
intramuskulär in den rechten Oberschenkel
von Balb/C-Mäusen transplantiert. Die Zellen
wurden innerhalb von sieben Tagen abgestoßen. Bei Re-Transplantation der gleichen
Zellen wurde eine akzelerierte Abstoßung
innerhalb von drei Tagen dokumentiert, was
für eine adaptive Immunantwort spricht (Abb.
1B: Reinjektion). Die BLI-Daten korrelierten mit
unseren unidirektionalen ELISPOT-Daten für
Interferon γ-produzierende TH1-Zellen. Hierfür
wurden 1x107 Mitomycin-inhibierte hESCs mit
1x106 Milzzellen der transplantierten Mäuse
inkubiert und die Interferon γ-Sekretion (TH1Antwort) anhand der Spotanzahl mittels
ELISPOT-Reader gemessen.
Nachweis der Zellmigration
Die beste Applikationsart für Stammzellen zur
Myokardregeneration nach einem Herzinfarkt
ist bisher nicht definiert. In Frage kommen intravenöse, intrakoronare und intramyokardiale
Applikationsformen. Mittels BLI haben wir dokumentiert, dass die intravenöse Applikation
von Stammzellen zur Myokardregeneration
ungeeignet ist (Abb. 1C). Nach intravenöser
Injektion von 1x105 Stammzellen wurden mittels BLI die Mehrzahl der Zellen in der Lunge
gefunden. Aufgrund der Größendiskrepanz
von Stammzellen und dem Durchmesser
der Lungenkapillaren, blieb die Mehrzahl der
Stammzellen im Gefäßbett der Lunge hängen.
Dieses Ergebnis haben wir mittels Histologie
bestätigt. Hierfür wurden die Stammzellen vor
Injektion mittels CSFE gefärbt und anhand ihrer Grünfluoreszenz im Fluoreszenzmikroskop
nachgewiesen.
18 | 10. Jahrgang | Nr. 4/2009
Onkologie, Autoimmunerkrankungen,
inflammatorische und metabolische Erkrankungen).
Firefly Luciferase-Markierung
und Zellbiologie
Da undifferenzierte hESCs nicht für die klinische Anwendung in Frage kommen, müssen sie vor Transplantation in spezialisierte
Zellen, wie zum Beispiel Kardiomyozyten zur
Myokardregeneration, differenziert werden.
Hierfür ist es von großer Bedeutung, dass
Firefly-Luciferase-transduzierte hESCs nicht
ihr pluripotentes Potential verlieren und
sich nach Transduktion weiterhin in spezialisierte Zellen wie etwa Kardiomyozyten
differenzieren können. Mittels der AggreWell
400-Technik (Stemcell Technologies) wurden
undifferenzierte hESC über Embryoid Bodies
(hEB) zu Kardiomyozyten (hCM) differenziert
(Abb. 2). Als Differenzierungsprotokoll nutzen
wir das etablierte Protokoll von Keller et al.13.
Für die ersten 12 Tage werden die Zellen bei
5% CO2/5% O2/90% N2 kultiviert und anschließend bei a 5% CO2 weiterkultiviert. Durch den
Differenzierungssprung zu hEBs verlieren die
Zellen ihre Marker für Pluripotenz (SSEA-4,
Oct3/4, TRA1-60) und zeigen eine positive
SSEA-1-Expression.
Literatur
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
Fazit
Der herausragende Vorteil der Biolumineszenz
ist die Freiheit von Hintergrundsignalen und
die zellspezifische Markierung von lebenden
Zellen. BLI kann unter anderem für folgende
Studien sinnvoll eingesetzt werden:
I Nicht-invasives in vivo-Imaging der Zellmigration, Bewegung von Effektor- und
Zielzellen.
I Echtzeit-Evaluation metabolischer Prozesse
(z. B. Sepsis und Enzymfunktionen).
I Echtzeit-Beobachtungen von Tumorwachstum und -regression.
I Beobachtungen von Implantaten und Medizinprodukten in vivo.
I Entwicklung therapeutischer Anwendungen für verschiedenste Indikationen (z.B.
[13]
Fändrich F, Dresske B, Bader M, Schulze M. J Mol Med
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Prof. Dr. Sonja Schrepfer
Universitäres Herzzentrum Hamburg
Transplant and Stem Cell Immunobiology
Lab (TSI)
Herzchirurgie
Campus Forschung, N27
Martinistr. 52
20246 Hamburg
s.schrepfer@uke.de
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Echtzeit-Monitoring
der Virus-vermittelten
Zytopathogenität
Dr. Martin Spiegel, Institut für Virologie, Universität Göttingen
Virusinfektionen lassen sich aufgrund der genetischen Flexibilität der Erreger bis heute – nicht
zuletzt wegen der raschen Resistenzentwicklung von Viren gegenüber Wirkstoffen – schwer
dauerhaft kontrollieren. Um die Mechanismen der viralen Infektivität, der Virusprogression
und des Krankheitsausbruchs besser zu verstehen, sind detaillierte Untersuchungen der durch
Viren hervorgerufenen zytopathischen Effekte unerlässlich. Abhängig vom untersuchten
Virus- beziehungsweise Zelltyp, dem Zeitpunkt der Infektion (Wachstumsphase) und der
Virusmenge können unterschiedliche zytopathische Effekte beobachtet werden.
Das neue xCELLigence System (Roche Diagnostics, Penzberg) ermöglicht auf Basis seiner
mikroelektronischen Biosensor-Technologie
eine dynamische, markierungsfreie, nichtinvasive Analyse zellulärer Ereignisse2 wie der
Zytopathogenität. Das System basiert auf
der Messung der elektronischen Impedanz.
Sobald adhärente Zellen sich an die Sensoroberfläche der Elektrodenarrays anheften,
kann die Veränderung der Impedanz and der
Grenzfläche von Zelle und Elektrode erfasst
und verfolgt werden. Die Elektroden sind
dabei in den Boden einer speziellen Zellkulturplatte („E-Plate 96“) integriert und gestatten
Experimente im 96-Well-Format. Das System
erlaubt die kontinuierliche Überwachung der
Veränderung wichtiger Zellparameter, wie der
Zellzahl, Stärke der Anheftung, Viabilität, Zellmorphologie und -motilität. Das xCELLigence
System ermöglicht so Untersuchungen, die
zur Beantwortung eines weiten Spektrums
wissenschaftlicher Fragestellungen in diver-
Eine der am weitesten verbreiteten Methodnen, die lysogene oder lytische Aktivität
von Viren zu ermitteln, ist der sogenannte
Plaque-Test. Bei diesem Assay werden konfluent bewachsene Kulturplatten1 mit Zellen
besät, die sensitiv gegenüber dem zu untersuchenden Virustyp oder -isolat sind. Die
lytische Aktivität wird durch makroskopische
Inspektion der Plaques in dem zuvor (z.B. mit
Kristallviolett) angefärbten konfluenten Zellrasen ermittelt. Diese Endpunktbestimmung
ist gut geeignet, um Virustiter zu ermitteln.
Allerdings liefert der Plaque-Test keinerlei
Information über den Beginn und zeitlichen
Verlauf der Virusreplikation. Hinzu kommt,
dass die Infektion mit einer ganzen Reihe
von Viren – zum Beispiel mit attenuierten
Viren – zur Bildung nur kleiner, schlecht
sichtbarer, trüber Plaques führt, die schwierig
zu detektieren sind – zum Teil werden sogar
gar keine Plaques gebildet, obgleich das Virus
erfolgreich repliziert.
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Abb. 1: Dynamisches Monitoring der Zellproliferation. Zellen wurden in der E-Plate 96 ausgesät und kontinuierlich via Cell Index überwacht, um geeignete Zeitpunkte für eine
Virusinfektion (während der Wachstums- und stationären Phase) zu identifizieren.
Der Fortgang der Adhäsion, Ausbreitung und Proliferation von (A) Vero E6- und (B)
HEK293-Zellen wurde mit Hilfe des RTCA SP-Instrumentes in 30-Minuten-Intervallen
überwacht. Die farbigen Kurven zeigen unterschiedliche Zellzahlen pro Well an.
Kalkulierte Zellzahlen auf Basis von Verdünnungsreihen (von rechts nach links:) rot:
50.000, grün 25.000, blau: 12.500, magenta: 6.250, cyan: 3.125, korallrot: 1.562, dunkelgrün: 786, oliv: Kontrolle (nur Medium)
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Blitzlicht Dynamisches Zellmonitoring
sen Forschungsfeldern beitragen können,
zum Beispiel in der Arzneimittelentwicklung,
Toxikologie, Krebsbiologie, medizinischen
Mikrobiologie und Virologie 2 . Das System
wurde bereits für Zellproliferations- und
Zytotoxizitäts-Assays eingesetzt sowie zur
Untersuchung der Zelladhäsion und -ausbreitung3, der Qualitätskontrolle von Zellkulturen4,
der Bestimmung der Aktivierung von Rezeptortyrosinkinasen5, von MAST-Zellen6 und
G-Protein-gekoppelten Aktivierung 7.
Das xCELLigence System umfasst mehrere
Komponenten: die RTCA Single Plate (SP)Station, den RTCA Analyzer und die RTCAControl Unit mit integrierter Software. Die
RCTA SP Station passt in jeden Standardinkubator für Zellkulturen und gewährleistet bei
jedem Experiment kontrollierte Umgebungsbedingungen hinsichtlich der Temperatur,
Luftfeuchte und CO2-Konzentration. Die RCTA
SP Station nimmt eine E-Plate 96 auf. Der
Boden jedes Wells der E-Plate 96 enthält die
Sensor-Elektroden-Arrays. Die an der Elektrode
gemessene Impedanz wird dimensionslos als
Cell Index (CI)-Wert ausgedrückt und genutzt,
um phänotypische Veränderungen einer Zellpopulation in einem bestimmten Zeitraum
graphisch darzustellen.
Dieser Bericht beschreibt einen Aufbau zum
Studium der Virus-vermittelten Zytopathogenität mit dem xCELLigence System. Dieser
Assay addressiert verschiedene Limitationen
des Plaque-Assays und bietet eine einfache
Plattform zur Identifikation und weiteren
Charakterisierung von Virus-vermittelten,
zytopathischen Effekten.
Meerkatze abgeleitete Zelllinie mit einer Defizienz der Interferongene. Hek293 (Microbix
Biosystems) ist eine humane embryonale
Nierenzelllinie mit intaktem Interferonsystem.
Beide adhärenten Zelllinien wurden in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) erhalten,
das mit 10%-igem fetalen Kälberserum, 2mM
Glutamin und 1% Penicillin/Streptomycin supplementiert war.
Virus: Das Vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV),
Serotyp Indiana, wuchs in Vero E6-Zellen bei
37°C/5%CO2-Sättigung.
Zellproliferations-Assays: Zur Bestimmung
des Hintergrundes wurde zunächst 100 µl
Wachstumsmedium in die Wells der E-Plate
96 gegeben. Danach wurden 100µl in die
RCTA SP Station im Inkubator plaziert. Das
Anheften, Ausbreiten und die Proliferation
der Zellen wurden in 30-Minuten-Intervallen
mit dem RTCA SP Instrument verfolgt. Die
gemessene Impedanz in den individuellen
Wells wurde automatisch in Cell Index (CI)Werte konvertiert.
Beurteilung der Virus-vermittelten
Zytopathogenität
Zu Beginn wurden 25.000 und 12.500 Zellen
jeder Zelllinie pro Well in E-Plates 96 ausgesät.
Nach 20,5 (Vero E6-Zellen) beziehungsweise
68,5 Stunden (HEK293-Zellen) – wenn die
Zellen die Konfluenz erreicht hatten (25.000
Zellen/Well) oder sich noch in der Wachstumsphase befanden (12.500 Zellen/Well) – wurden die Zellen mit VSV infiziert. Dann wurde
die E-Plate 96 aus dem RCTA SP-Instrument
genommen und 800.000 (hohe Multiplizität der Infektion, MOI) beziehungsweise
80.000 (niedrige MOI) Plaque-formende
Einheiten (PFU) VSV, resuspendiert in 10µl
Wachstumsmedium, den Wells zugegeben.
Als Kontrolle dienten acht Wells, die nur
Wachstumsmedium (10 µl) enthielten. Die
E-Plate 96 wurde danach unmittelbar in die
Materialien & Methoden
Zellen: Die im Rahmen dieser Studie verwendeten Zellen wurden in einem Standard-befeuchteten Inkubator bei 37°C und 5% CO2-Sättigung
kultiviert. Vero E6 (erhalten vom ATCC) ist eine
aus Nierenzellen der Afrikanischen Grünen
A
B
Abb. 2: Dynamisches Monitoring von Vero E6-Zellen während der VSV-Infektion. A: Normalisierte Cell Index-Werte wachsender Zellen. B: Normalisierte Cell Index-Werte
konfluenter Zellen. Die Virus-vermittelte Wirkung auf die Adhäsion, Ausbreitung und
Proliferation der Zellen wurde mittels des RTCA SP-Instrumentes im 15-Minuten-Takt
dynamisch verfolgt. Die Zeit der Viruszugabe (bei etwa 20,5 Stunden) ist durch die
vertikale schwarze Linie angezeigt. Die Zeit, zu der der CI auf 50% des Maximalwertes
(CI50) abgesunken war, ist durch die orange gepunktete Linien angedeutet. Grüne
Kurven: Kontrollen (ohne Virusinfektion), blaue Kurven: 80.000 PFU, rote Kurven:
800.000 PFU.
20 | 10. Jahrgang | Nr. 4/2009
im Inkubator befindliche RCTA SP Station
plaziert, und die CI-Werte wurden für 190
Stunden im 15-Minuten-Takt erfasst.
Dynamisches Monitoring
der Zellproliferation
Um den optimalen Zeitpunkt für die Infektion
zu ermitteln, wurde eine Zellproliferationsanalyse mit Vero E6- und HEK 293-Zellen
durchgeführt. Als geeignete Zeitpunkte für
die Infektion wurden 20,5 Stunden für Vero
E6-Zellen und 68,5 Stunden für HEK-293Zellen definiert. Abhängig von der Zahl der
ausgesäten Zellen wurde die virale Zytopathogenität entweder in der Wachstumsphase
oder der darauffolgenden stationären Phase
ermittelt.
VSV-Zytopathogenität-Profil
mit Vero E6-Zellen
Basierend auf den Ergebnissen des dynamischen Monitorings der Zellproliferation
wurden respektive 12.500 (Wachstumsphase)
und 25.000 (frühe stationäre Phase) Vero
E6-Zellen nach 20,5 Stunden mit VSV infiziert
(Abb. 2).
Wenn Vero E6-Zellen während ihrer Wachstumsphase infiziert wurden, gab es eine klare
Korrelation zwischen der zur Infektion eingesetzten Virusmenge und dem Beginn des Virusvermittelten zytopathischen Effektes. Nach
Infektion mit einem niedrigen MOI wuchsen
die Zellen für 15 Stunden weiter (Abb. 2A, blaue
Kurve) wie Zellen der Kontrolle (Abb. 2A, grüne
Kurve). Danach begann der CI abzusinken – ein
Hinweis darauf, dass die Zellen infolge der VSVInfektion abstarben. Die Kontrollzellen dagegen wuchsen weiter. 24 Stunden nach Infektion
war der CI auf 50% des Maximalwertes (IC50)
abgefallen und sank weiter, bis ein CI von 0 das
vollständige Absterben der Kultur anzeigte.
Dagegen begann bei Vero E6-Zellen, die mit
hohem MOI infiziert worden waren, der CI bereits vier Stunden nach Infektion (Abb. 2A, rote
Kurve) abzusinken, und der CI50 wurde bereits
nach 11 Stunden erreicht. Auch hier fiel der CI bis
auf 0 ab, die Kultur starb vollständig ab.
Ganz ähnliche Resultate wurden erzielt,
wenn konfluente Vero E6-Zellen infiziert
wurden (Abb. 2B). Der CI50 wurde 10 Stunden
post-Infektion (hoher MOI, Abb 2b, rote Kurve)
beziehungsweise 19 Stunden nach Infektion
(niedriger MOI, Abb. 2B, blaue Kurve) erreicht
und danach wieder ein vollständiges Absterben der Kultur beobachtet.
VSV-Zytopathogenitäts-Profil
mit HEK 293-Zellen
Basierend auf den Ergebnissen des dynamischen Monitorings der Zellproliferation
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wirklich aussagekräftig?
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Abb. 3: Dynamisches Monitoring von HEK 293-Zellen während der VSV-Infektion. A: Cell
Index-Werte wachsender Zellen. B: Cell Index-Werte konfluenter Zellen. Die Virusvermittelte Wirkung auf die Adhäsion, Ausbreitung und Proliferation der Zellen
wurde mittels des RTCA SP-Instrumentes im 15-Minuten-Takt dynamisch verfolgt. Die
Zeit der Viruszugabe (bei etwa 68,5 Stunden) ist durch die vertikale schwarze Linie
angezeigt. Die Zeit, zu der der CI auf 50% des Maximalwertes (CI50) abgesunken war,
ist durch die orange gepunktete Linien angedeutet. Grüne Kurven: Kontrollen (ohne
Virusinfektion), blaue Kurven: 80.000 PFU, rote Kurven: 800.000 PFU
wurden 12.500 (Wachstumsphase) beziehungsweise 25.000 (frühe stationäre Phase)
HEK 293-Zellen nach 68,5 Stunden mit VSV
infiziert.
HEK 293-Zellen zeigten nach Infektion mit
VSV ein anderes Verhalten als Vero E6-Zellen.
HEK 293-Zellen, die sich in der Wachstums
phase befanden, reagierten wesentlich sensitiver gegenüber einer VSV-Infektion, wenn
ein hoher MOI eingesetzt worden war (Abb
3A, rote Kurve), wie das Absinken des CI auf
den CI50 -Wert bereits sechs Stunden nach
Infektion anzeigte. Zellen, die mit niedrigem
MOI infiziert worden waren, erreichten den
CI50 12 Stunden post-Infektion (Abb. 3A, blaue
Kurve). Interessanterweise ergab sich ein
komplett anderes Bild, wenn konfluente HEK
293-Zellen infiziert wurden (Abb. 3B). Während
konfluente Zellen, die mit hohem MOI infiziert
worden waren, ein Absinken des CI analog zu
Zellen in der Wachstumsphase zeigten (Abb.
3B, rote Kurve), erwiesen sich mit niedrigem
MOI infizierte Zellen als vollständig resistent
gegenüber einer VSV-Infektion und zeigten
einen CI, der dem der Kontrollen sehr ähnelte
(Abb 3B, blaue und grüne Kurven).
Hinsichtlich ihrer Reaktion auf virale Infektionen besteht der Hauptunterschied zwischen
Vero E6- und Hek 293-Zellen in ihrer Fähigkeit,
Typ-1-Interferone herzustellen. Vero E6-Zellen
sind frei von entsprechenden Interferongenen8. Daher können sie als Antwort auf Virusinfektionen auch nicht die Expression von durch
Interferon kontrollierten antiviralen Proteinen,
wie etwa MxA oder OAS/RNase L, hochregulieren. HEk 293-Zellen verfügen dagegen
über ein intaktes Interferon-System. Bei einer
Virusinfektion produzieren sie Interferone, die
den JAK/STAT-Signalweg sowohl autokrin als
auch parakrin aktivieren, was die Expression
antiviraler Proteine und damit einen antiviralen Status nach sich zieht.
Es erscheint daher naheliegend zu vermuten, dass die beobachtete VSV-Resistenz der
konfluenten HEK 293-Zellen bei niedrigem MOI
einer durch das Interferon-System bedingten
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antiviralen Antwort zuzuschreiben ist. Dazu
mag kommen, dass konfluente Zellen aufgrund
ihrer wohlbekannten reduzierten metabolischen Aktivität eine suboptimale Umgebung
für die VSV-Replikation darstellen. Gestützt
wird diese Hypothese durch die Beobachtung,
dass wachsende HEk 293-Zellen sehr sensitiv
auf VSV reagieren – ganz unabhängig vom
bei der Infektion eingesetzten MOI. Andererseits sollte nicht übersehen werden, das das
M-Protein von VSV dem Interferon-System
entgegenwirkt, indem es durch das Herunterfahren der gesamten Wirts-Transkription
die RNA- und Proteinsythese stoppt9. Daher
lassen sich die unterschiedlichen Reaktionen
auf eine VSV-Infektion und deren Abhängigkeit
von der Zellzahl und der MOI eventuell auf
das Wechselspiel des antiviralen Systems der
Wirtszelle und den viralen Ausweichstrategien
zurückführen. Im Gegensatz zu konventionellen Endpunkt-Assays bietet das xCELLigence
System die Möglichkeit, diese Virus-Wirt-Interaktionen zu verfolgen und Bedingungen zu
definieren, unter denen entweder die zelluläre
oder die virale Komponente dominiert.
Literatur
[1]
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Ferran MNC, Lucas-Lenard JM (1997) J Virol 71: 371-377
Dr. Burkhard Ziebolz
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Die Diagnose des aktiven Wachstums von Tumoren im Körper ist schon in sehr frühen Stadien
der Krebserkrankung möglich: Mit einer speziell entwickelten Technologie, die auf der Elek
tronen-Spin-Resonanz-Spektroskopie (ESR) basiert, lassen sich die Transporteigenschaften
des Proteins Serumalbum in einer Blutprobe charakterisieren. Die funktionelle Albuminanalyse mit Hilfe des MMS(Mobilität der molekularen Struktur)-Tests ermöglicht die Messung
spezifischer Veränderungen der Transport- und Detoxifikationseigenschaften des Proteins
in frühen Krankheitsstadien, denn die Transporteigenschaften des Albumins werden durch
niedermolekulare, von Tumorzellen sezernierte Substanzen spezifisch beeinflusst. Mit der
ESR-Albuminanalyse ist es uns gelungen, diese Veränderungen mit hoher Sensitivität und
Spezifität nachzuweisen und daraus diesen einfachen und schnellen in-vitro-Test abzuleiten.
Studien zum Proof-of-Principle haben wir erfolgreich abgeschlossen, und erste Validierungsstudien wurden durchgeführt 1. Das Verfahren eröffnet neben der Krebs-Diagnose auch eine
frühzeitige Beurteilung des Erfolges der Tumortherapie (z.B. Operation, Chemotherapie,
Strahlentherapie) sowie die Früherkennung eines Rezidivs.
Das Krankheitsstadium in dem Tumorerkrankungen erkannt werden, spielt eine entscheidende Rolle für den Erfolg ihrer Therapie. Für
die meisten Tumorarten gilt: je früher ein
Tumor diagnostiziert werden kann, desto
größer die Heilungschancen. Eine Möglichkeit
zur Erkennung sehr frühen malignen Geschehens im Organismus bietet die Analyse der
Transport- und Detoxifizierungseigenschaften von Serumalbumin. Das Serumalbumin
ist eines der wichtigsten Transportproteine
im Blutplasma. Es transportiert wasserunlösliche Stoffe wie Fettsäuren, Bilirubin,
Spurenelemente oder Arzneimittel, wobei
es durch die Bindung dieser Substanzen
zu Veränderungen in der Konformationsmobilität des Albuminmoleküls kommt. In
zahlreichen Studien konnte gezeigt werden,
dass niedermolekulare Substanzen im Blut
(als Surrogatmarker) den Status von Zellen
und Geweben hinsichtlich pathologischer
Veränderungen anzeigen können und dass
diese durch das Albumin gebunden werden2,3.
Die daraus resultierende Anreicherung am
Albumin kann die freie Konzentration dieser niedermolekularen Substanzen im Blut
um das bis zu 500-fache übersteigen4,5 . Die
Analyse solcher Biomarker findet zunehmend
Anwendung bei der Diagnostik verschiedener
Krebserkrankungen.
Abb. 1: Arbeitsschritte von der Probe zum Ergebnis
22 | 10. Jahrgang | Nr. 4/2009
Seit dem Jahr 2005 steht mit dem MMS-Test
steht ein neues CE-zertifiziertes Verfahren
zur Verfügung, das zur Diagnose und/oder
Überwachung von Krebserkrankungen eingesetzt werden kann – ganz unabhängig
von der Krebsart. Der MMS-Test auf Basis
der Elektronen-Spin-Resonanz-Spektroskopie
(ESR) misst anhand der Beladungskapaziät
von Serumalbumin mit Fettsäuren, in welcher Konformation das Transportprotein
vorliegt und ob krebsspezifische Liganden
daran gebunden wurden.
Der MMS-Test
Für den Test wird einer albuminhaltigen Probe
(Serum bzw. EDTA-Plasma) zunächst eine spezifische, mit einem stabilen Radikal gekoppelte,
langkettige Fettsäure als „Reportermolekül“
zugesetzt. Durch Zugabe unterschiedlicher
Konzentrationen eines polaren Agens werden
in vitro Konformationsänderungen im Serumalbumin induziert und damit die verschiedenen
in vivo-Zustände der Albuminkonformation
(Beladung, Transport und Entladung) simuliert. Die gemessenen Parameter reflektieren
dabei die Konformationsänderungen des
Serumalbumins.
Zum Vergleich werden drei Aliquots des
Patientenserums oder -plasmas mit drei
verschiedenen Sondenlösungen inkubiert
(Abb. 1). Diese Sondenlösungen enthalten
unterschiedliche Konzentrationen der spinmarkierten Fettsäure und des polaren Agens.
Die in Kapillaren gefüllten Lösungen werden
anschließend in dem eigens dafür entwickelten MMS-(ESR) Analysator vermessen und die
ESR-Spektren mit einer speziellen Software
analysiert. Die Auswertung der Spektren
gestattet eine Interpretation der Konformationsmobilität sowie Transport- und Detoxifikationseigenschaften des Serumalbumins.
Um die Konformationsmobilität des Albumins zu charakterisieren, werden die ESRSpektren der am Serumalbumin gebundenen
spinmarkier ten Fettsäure mithilfe einer
quantenmechanischen Funktion analysiert.
Diese, auf dem Hamiltonoperator basierende Simulation, ermöglicht eine detaillierte
Beschreibung des Bindungsverhaltens der
Fettsäure. Die so gewonnenen Informationen
werden mit mathematischen Modellen in
einen Entscheidungsparameter (DR – Diagnostisches Resultat) umgewandelt6.
Es zeigen sich signifikante Unterschiede
in der Konformationsmobilität des Serumalbumins zwischen gesunden Probanden und
Tumorpatienten (Abb. 2a). Die tumorspezifische Veränderung der Zusammensetzung
niedermolekularer Substanzen im Blut ist
die wahrscheinlichste Ursache für diesen
Befund. Mit dem MMS-Test können nach
bisherigem Erkenntnisstand alle Arten von
Krebserkrankungen im Organismus schnell
und zuverlässig, mit einer hohen diagnosLABORWELT
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A
B
C
Abb.2: A: Vergleich der ESR-Spektren von einer gesunden Person (blau) und einem Tumorpatienten (rot); B: Punktdiagramm der ROC-Analyse
zur Differenzierung von gesunden Personen (Gruppe B, N=311) und Tumorpatienten (Gruppe A, N=367) mit Sensitivität und Spezifität
des angegebenen cut-off-Wertes; C: Verlauf des DR-Wertes während der Tumortherapie: (A) kurativer Verlauf, (B) Tumorwachstum
mit starker Progression (Patient verstorben), (C) Tumorwachstum mit geringer Progression
tischen Sensitivität (92,6%) und Spezifität
(98,1%) im Sinne einer Ja-Nein-Entscheidung
mit einer Interlaborreproduzierbarkeit von
98,3% aufgedeckt werden. Ein positiver MMSTest zeigt ein aktives malignes Geschehen an.
Aussagen zur Lokalisation des Tumors sind
derzeit allerdings erst ansatzweise möglich.
In Abbildung 2b sind 367 Tumorpatienten
mit verschiedenen Krebsarten (A-Gruppe) 311
gesunden Personen (B-Gruppe) gegenübergestellt. Die beiden Gruppen sind sowohl in
ihrer Geschlechts- als auch in der Altersstruktur analog. Mit Hilfe des DR-Wertes ist eine
Differenzierung von gesunden Personen und
Tumorpatienten mit hoher diagnostischer
Sicherheit möglich. Im Falle von aktivem Tumorwachstum ist der DR-Wert kleiner als 1.
Der MMS-Test ist ein geeigneter Kandidat für
einen allgemeinen Krebstest zur Krebsfrühdiagnostik: Bei mehr als 75 Blutspendern (30-65
Jahre), die nach ihrer letzten Spende über eine
gesicherte Krebserkrankung berichteten, waren retrospektiv krebsbedingte Albuminveränderungen in deren Plasmarückstellproben
durchschnittlich bis zu 12 Monaten vor der
Krebsdiagnose zu diagnostizieren3.
Kontrolle des Therapieverlaufes
Die Eignung des MMS-Tests zum TherapieMonitoring bei Krebserkrankungen resultiert
aus der relativ kurzen Halbwertszeit des Serumalbumins von 19 Tagen. Untersuchungen
bei Patienten während und nach der Therapie
zeigten eine sehr gute Korrelation mit dem
Therapieergebnis (Abb. 2c). Ist der aktive
maligne Herd beseitigt, kommt es nach zwei
bis drei Wochen zu einer Normalisierung der
Transport- und Detoxifikationsfunktionen
des Serumalbumins. Der DR-Wert eignet sich
damit zur Kontrolle des Therapieverlaufes,
da der DR-Verlauf den Erfolg der Therapie
widerspiegelt.
24 | 10. Jahrgang | Nr. 4/2009
In Abbildung 2c sind drei exemplarische
Therapieverläufe dargestellt. Im Falle einer
64-jährigen Frau mit einem Sigma-Karzinom
(Patient A) zeigt der ansteigende DR-Wert,
dass der Tumor durch die Operation und
anschließende Chemotherapie erfolgreich
behandelt werden konnte. Eine deutliche
Progression des Tumors zeigt dagegen der
Verlauf des DR-Wertes eines 84-jährigen
Mannes mit einem Magen-Karzinom (Patient
B), der an der Krebserkrankung verstarb. Bei
einem 70-jährigen Mann mit einem RektumKarzinom (Patient C) konnte der Tumor durch
die Operation und anschließende Chemotherapie nicht geheilt werden, es folgte
eine palliative Therapie. Der Verlauf des
DR-Wertes spiegelt bei allen drei Patienten
die klinischen Befunde wider und ist somit
sowohl für die Kontrolle des Therapieerfolges
als auch das Erkennen des Auftreten eines
Rezidivs geeignet.
Weiterentwicklung der Diagnostik
Da mit dem MMS-Test zurzeit nur eine allgemeine Aussage zum Tumorwachstum im Körper erfolgen kann, ist es ein dringliches Ziel
der aktuellen Forschung der MedInnovation
GmbH, zusätzlich die Information zur Tumorlokalisation in den Test zu integrieren. Erste
Untersuchungen haben gezeigt, dass sich
signifikante Unterschiede in den ESR-Spektren verschiedener Tumorarten zeigen. Die
aus der ESR-Spektrenanalyse gewonnenen
biophysikalischen Parameter des Bindungsverhaltens der spinmarkierten Fettsäure
werden zukünftig mit Hilfe mathematischer
Methoden zur Bestimmung der Tumorlokalisation beitragen. Eine prospektive Studie zur
Validierung der bisherigen Ergebnisse wird
baldmöglichst angestrebt.
Desweiteren zeigten Untersuchungen
an Patienten mit sowohl benignen als
auch malignen Darmerkrankungen, dass
mit der dem MMS-Test zugrundeliegenden
Technologie Vorstufen des kolorektalen
Karzinoms, die Adenome, in Abhängigkeit
von ihrem Entartungsrisiko unterschieden
werden können. So wurden 32 von 41 villösen Adenomen (hohes Entartungsrisiko)
als tumor-positiv und 14 von 17 tubulären
Adenomen bzw. Polypenknospen (geringes
Entartungsrisiko) als tumor-negativ eingestuft. Dies ermöglicht die Neuentwicklung
einer auf dieser Technologie basierenden
Analyse hinsichtlich einer DarmkrebsFrüherkennung im Rahmen eines einfachen
Bluttests.
Zur Weiterentwicklung der MMS-Technologie ist eine enge Zusammenarbeit mit
anderen Firmen oder Instituten unerlässlich. Deshalb haben wir großes Interesse an
Kooperationen sowohl mit industriellen als
auch mit klinischen Partnern, zum Beispiel
auf dem Gebiet der Identifizierung der am
Albumin gebundenen Substanzen.
Literatur
[1] [2] [3] [4]
[5] Gelos M, et al. submitted
Lowenthal M.S., et al., Clin. Chem. 51 (2005), 1933-1945
Lopez M.F., et al., Clin. Chem. 51 (2005), 1946-1954
Mehta A, et al., Dis. Markers 19 (2004), 1-10
Belluco C, et al., Annals of Surgical Oncology 14(9)
(2007), 2470-2476
[6] Seidel P, et al., Z. Med. Phys. 15 (2005), 265-272
Dr. Kerstin Schnurr
MedInnovation GmbH
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Waschschritt-freie
Immunoassays für die
Laborforschung
Dr. Michael Lässle, PerkinElmer LAS (Germany) GmbH, Rodgau
Die Bead-basierten AlphaLisa®-Immunoassays wurden von PerkinElmer speziell auf die
Detektion von Analyten in biologischen Proben und die Anwendung in der akademischen
Forschung und Arzneimittelentwicklung zugeschnitten. Die Chemilumineszenz-Assays, die
– anders als ELISAs – völlig ohne Waschschritte auskommen, sind speziell auf Automation
und Miniaturisierung ausgelegt und zeigen neben einem weiten dynamischen Bereich zugleich eine Sensitivität und Robustheit, die im Vergleich zu konventionellen ELISAs Vorteile
bietet.
ELISAs (Enzyme-linked Immunosorbent
Assays) sind die am weitesten verbreitete
Detektionsplattform zur Quantifizierung von
Analyten in biologischen Proben. Aufgrund
der vielen erforderlichen Waschschritte lassen sich diese Assays aber nur unter Schwierigkeiten an Automationsbedingungen und
einen hohen Durchsatz anpassen. Daher ist
der Bedarf für ein einfaches und robusteres
Alternativ verfahren zur Quantifizierung
von Biomarkern im Hochdurchsatz groß.
Die neue AlphaLisa®-Plattform von Perkin
Elmer wurde genau auf diese Anwendung in
der Grundlagen- und Arzneimittelforschung
zugeschnitten.
Die Bead-basierte AlphaLISA®-Technologie
baut auf PerkinElmers proprietärem homogenen Lumineszenz-Assay AlphaScreen (Amplified Luminescence Proximity Homogeneous
rose von
ad
Assay) auf und basiert aufPorvair
der Erzeugung
Lumineszenz durch den Transfer von angeregten Singulett-Sauerstoffmolekülen1.
AlphaLisa®-Protokolle können als Sandwich- oder kompetitive Immunoassays
durchgeführ t werden. Beim SandwichAssay (Abb. 1) wird der Analyt durch einen
biotinylierten Antikörper gebunden, der an
einen Streptavidin-beschichteten DonorBead andockt, sowie einen zweiten Antikörper, der an den AlphaLisa®-Akzeptor-Bead
direkt gekoppelt ist. Die Bindung der beiden
Antikörper an den Analy ten bring t den
Donor- und den Akzeptorbead in räumliche
Nähe zueinander. Durch Laserbestrahlung
des photosensitiven Donor-Beads mit einer
Wellenlänge von 680 nm kommt es zur
Entstehung von Singulett-Sauerstoff. Nur
wenn sich Donor- und Akzeptor-Bead im
Rahmen der Antikörper-Antigen-Sandwich
Bildung nahe genug sind, kann der kurzlebige
Singulett-Sauerstoff an den Akzeptor-Bead
binden und über eine Kaskade chemischer
Reaktionen eine Emission des Akzeptor-Beads
im Bereich von 615 nm hervorrufen. Diese
ist zum Beispiel messbar mit PerkinElmers
EnVision- oder EnSpire-Readern.
Bei kompetitiven AlphaLisa®-Immuno
assays, wird ein biotinylierter Analyt eingesetzt, der an den Streptavidin-Donor-Bead
gebunden ist, zusammen mit einem Antikörper, der an den AlphaLisa®-Akzeptor-Bead
Laborwelt
konjugiertDE
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10. Jahrgang | Nr. 4/2009 | 25
Abb. 1: Prinzip der AlphaLISA®-Technologie. Ein biotinylierter Antikörper gegen den Analyten
bindet an den Streptavidin-beschichteten Donor-Bead, und ein zweiter Antikörper gegen den Analyten ist direkt an den Akzeptor-Bead konjugiert. Ist der Analyt zugegen,
geraten die beiden Beads in so enge Nachbarschaft, dass vom Donor-Bead erzeugter
Singulett-Sauerstoff an den Akzeptor-Bead binden kann. Diese Bindung setzt eine Reihe von chemischen Reaktionen in Gang, die zur Emission eines scharfen Lichtpeaks bei
615 nm am Akzeptor-Bead führen.
Schnelle und einfache Quantifizierung
von Analyten
AlphaLisa®-Assays werden gemäß „Mix &
Measure“-Protokollen durchgeführt, die die
Arbeits- und Gesamt-Assay-Zeit verglichen
mit ELISAs deutlich reduzieren (Abb. 2). Homogene AlphaLisa®-Assays benötigen nicht
länger die bislang erforderlichen multiplen
Waschschritte, um gebundene von nicht gebundenen Assay-Komponenten zu trennen.
Miniaturisierung und Automation
Miniaturisierung ist ein wichtiges Grundprinzip, wenn es darum geht, innerhalb des
Prozesses der Wirkstofffindung Screeningkosten zu senken und den Durchsatz zu steigern.
AlphaLisa®-Assays sind ohne Sensitivitätsverlust miniaturisier- und automatisierbar. Auch
ganz generell wenn wertvolles Probenmaterial limitierend ist (auch im akademischen
Umfeld oder in der präklinischen Forschung),
wirkt sich diese Eigenschaft nützlich aus.
AlphaLisa®-Assays sind sehr robust bis hinab zu Probenvolumina von 1 µl in einem
Gesamtvolumen des Assays von 10 µl. Die
Assays können routinemäßig im 96- oder
384-Well-Mikroplattenformat durchgeführt
oder auf das 1536 Well-Format miniaturisiert
werden. Vollständig validierte AlphaLisa®Protokolle sind für PerkinElmers Janus®
Automatisierungs-Plattform erhältlich.
Flexibilität von AlphaLisa®-Assays
AlphaLisa®-Assays eignen sich zur Messung
von Analyten in einer Vielzahl verschiedener
26 | 10. Jahrgang | Nr. 4/2009
Probenmaterialien. Diese reichen von Zellkul
turüberständen über Zelllysate bis hin zu
Serum und Plasma2-3. Die Assays gestatten die
Quantifizierung von sekretierten, intrazellulären und membrangebundenen Proteinen. Vier
Assays, die diese Vielseitigkeit dokumentieren
sind in Abbildung 3 gezeigt.
Abbildung 3a zeigt AlphaLISA®-Standard
kur ven bei der Messung von humanem
Amyloid-beta-Peptid Ab 1-40 und Ab 1-42.
Das untere Detektionslimit für die Amyloidbeta-Peptide Ab 1-40 und Ab 1-42 lag bei 50
beziehungsweise 110pg/ml, bei einem weiten
dynamischen Bereich von drei Größenordnungen. Abbildung 3b zeigt eine Standardkurve
für einen therapeutischen Antikörper. Hierzu
wurde ein AlphaLISA® OnPointTM -Custom
Assay entwickelt, der die Quantifizierung
des therapeutischen Antikörpers während
der Wirkstoff- und klinischen Entwicklung
ermöglicht. Dieser Assay im Kundenauftrag
erzielte eine Sensitivität von 0,5 ng/ml.
AlphaLisa®-Assays können zudem eingesetzt werden, um post-translationale Modifikationen intrazellulärer Targets zu detektieren.
Abbildung 3c zeigt den Einfluss eines Krebswirkstoffes auf den Phosphorylierungsstatus
des intrazellulären Target-Moleküls. In diesem
Custom-Assay nutzten wir einen biotinylierten
Antikörper zur Detektion einer spezifischen
Phosphorylierung und einen an den AkzeptorBead gekoppelten zweiten Antikörper, der alle
Formen des Targets erkannte. Dabei zeigte der
Assay mit einem z‘-Wert=0,9 eine bemerkenswerte Robustheit 4.
Die AlphaLisa®-Technologie kann auch genutzt werden, um integrale Membranproteine
zu detektieren. Wir erfassten die Expression
des Epidermalen Wachtumsfaktors EGF in
A431-Zellen (humane Epidermoid-Karzinom
Zelllinie) und HEK293-Zellen (humane emb
ryonale Nierenzelllinie)(Abb. 3d). In diesem
Assay wuschen wir die Zellen mit PBS, um die
sekretierte extrazelluläre EGFR-Domäne aus
dem Medium zu entfernen, und fügten dann
die AlphaLISA®-Reagenzien in einem einfachen
„All-in-one-well“-Assay direkt zur Kultur hinzu.
Wir erhielten LDLs von 42 und 1.624 Zellen für
die A431- bzw. die HEK293-Zelllinien – ein Beleg
für die Sensitivität des Assays. Die relative Expression von EGFR in beiden Zelllinien befand
sich in Übereinstimmung mit publizierten
Daten5.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass AlphaLisa®Assays hochselektiv und sensitiv sind. Diese
Selektivität lässt sich der sorgfältigen Auswahl von Paaren Analyt-spezifischer Antikörper zuschreiben. AlphaLisa®-Protokolle
benötigen nur geringe Probenvolumina von
in der Regel 1 bis 5 µl, wobei ihr Detektionslimit vergleichbar oder sogar unter dem von
ELISAs liegt, die mit Probenvolumina von
200µl arbeiten. Die hohe Sensitivität ist der
Art der AlphaLisa®-Detektionsplattform
zuzuschreiben. Der Fluss vom SingulettSauerstoff, der im Zuge der Anregung der
Donor-Beads gebildet wird, führt zu einer
bemerkenswerten Signalamplifikation in
den benachbarten Akzeptorbeads. Darüber
hinaus führt die hohe Antikörperdichte auf
den Beads zu einem Aviditätsphänomen, das
die Sensitivität erhöht. Tatsächlich zeigte ein
direkter Vergleich der AlphaLISA®-Assays mit
ELISAs bei der Messung von Human-Insulin
in Plasmaproben, dass mit dem AlphaLisa®Assay 15-mal weniger Analyt als mit dem ELISA
detektierbar war6.
Abb. 2: AlphaLISA®-Assay-Protokoll.
AlphaLISA®-Assays werden unter Nutzung eines „Mix&Read“-Protokolls
durchgeführt, das die Assayentwicklungs- und Hands-on-Zeit substanziell
reduziert und zugleich den Durchsatz
und den Automationsaufwand verbessert.
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Blitzlicht
Immuno-Assay
Assay ready. Top
performance.
Every day. Every user.
B
1 000 000
LDL
Aß1-40: 58 pg/mL
Aß1-42: 110 pg/mL
100 000
10 000
1 000
-°
-12 -11 -10
-9
-8
-7
-6
AlphaLISA Signal (counts)
A
1 000 000
LDL: 0.5 ng/mL
100 000
10 000
1 000
-° -10
Log [Amyloid β peptide] (g/mL)
D
25 000
Control cells
(CV=3%)
20 000
15 000
Z' = 0.90
10 000
Stimulated cells
(CV=5.6%)
5 000
0
0
10
20
30
40
50
Well #
C
-9
-8
-7
-6
Log [Therapeutic antibody] (g/mL)
1 000 000
LDL
A431: 42 cells
HEK-293: 1624 cells
100 000
10 000
1 000
0
1
2
3
4
5
Log [Number of cells]
Abb. 3: Detektion einer Vielzahl von Analyten mit der AlphaLISA®Technologie. A: Die AlphaLISA-Plattform wurde genutzt,
um die untere Detektionsgrenze für Amyloid-beta 1-40 und
Amyloid-beta 1-42 zu ermitteln. B: Detektion eines rekombinant exprimierten Antikörperwirkstoffs. C: Evaluation
der Dephosphorylierung eines intrazellulären Targets nach
Stimulation mit einem Anti-Krebs-Wirkstoff. D: Bestimmung der EGFR-Expression in der epidermoiden Krebszelllinie A431 und in HEK-Zellen mit einem „All-in-one-well“Assay.
Infinite® M1000
Schlussfolgerung
AlphaLisa®-Assays sind homogene Immunoassays mit hoher
Sensitivität und einem weiten dynamischen Bereich, die ohne jegliche Waschschritte auskommen. Verglichen mit ELISAs erhöhen
AlphaLisa®-Assays den Durchsatz und reduzieren die Arbeits- sowie
Gesamt-Assayzeit.AlphaLISA®-Assays sind vielseitig einsetzbar, zum
Beispiel zur Messung von Analyten, die sekretiert werden, intrazellulär
oder membrangebunden vorliegen. Zudem sind AlphaLisa®-Assays
schnell und einfach zu optimieren. Sie lassen sich miniaturisieren und
automatisieren und bieten dadurch eine gesteigerte Labor-Produktivität.Die AlphaLisa®-Plattform ist daher ideal für die Immundetektion
von Biomarkern geeignet. Derzeit entwickelt sie sich zur kommenden
Assay-Generation für die Wirkstoffentwicklung, präklinische Studien
und für die Grundlagenforschung.
Literatur
[1] Ullman, E.F. et al. Luminescent oxygen channeling assay (LOCI): sensitive, broadly applicable
homogeneous immunoassay method. Clin. Chem. 42, 1518–1526 (1996).
[2] Szekeres, P.G. et al. Development of homogeneous 384-well high-throughputscreening assays
for Ab1-40 and Ab1-42 using AlphaScreen technology. J. Biomol. Screen. 13, 101–111 (2008).
[3] McGiven, J.A. et al. A new homogeneous assay for high throughput serological diagnosis of
brucellosis in ruminants. J. Immunol. Methods. 337, 7–15 (2008).
[4] Zhang, J.-H. et al. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high
throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4, 67–73 (1999).
[5] Kimura, H. et al. Antibody-dependent cellular cytotoxicity of cetuximab against tumor cells with
wild-type or mutant epidermal growth factor receptor. Cancer Sci. 98, 1275–1280 (2007).
[6] Poulsen, F. & Jensen, K.B. A luminescent oxygen channeling immunoassay for the determination of insulin in human plasma. J. Biomol. Screen. 12, 240–247 (2007).
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10. Jahrgang | Nr. 4/2009 | 27
Die Verwendung von
Matrix-Transplantaten in
der Herzklappenchirurgie
Michael Harder1, Serghei Cebotari2, Axel Haverich1,2,
1
corlife GbR, Hannover; 2 Medizinische Hochschule Hannover
In Deutschland werden pro Jahr ca. 25.000 Herzklappen ersetzt. In der überwiegenden Anzahl der
Fälle ist dabei die Aortenklappe betroffen. Die Anforderungen an die Qualität der HerzklappenSubstitute steigen stetig, da deren Funktionalität über immer längere Zeiträume gewährleistet
sein muss, da die allgemeine Lebenserwartung steigt. Künstliche Herzklappen aus Metall oder
Karbon sind ausgesprochen funktionsstabil. Nachteilig ist die begleitende Antikoagulation, die
bei biologischen Herzklappen (auf Basis Glutaraldehyd-fixierter, xenogener Matrices) in der Regel
entfällt. Allerdings verkalken diese Herzklappen nach ca. 10 bis 15 Jahren, so dass diese re-substituiert
werden müssen. Eine besondere Anforderung stellt der Ersatz von Herzklappen bei Kindern und
Jugendlichen dar, da im wachsenden Organismus auch die Herzklappen mit dem Größenwachstum Schritt halten müssen. Bisher wird dies durch Re-Implantation immer größerer Herzklappen
gewährleistet – Eingriffe, die die Patienten stark belasten. Auch allogene Klappentransplantate (Homografts) sind nur bedingt geeignet. Zwar entfällt auch hier die Antikoagluation, jedoch verkalken
auch diese Klappen nach zwei bis zehn Jahren. Eine hoffnungsvolle Alternative stellen Herzklappen
auf Basis dezellularisierter Herzklappenmatrices (MTx) dar. Die mechanische Funktionalität ist von
Anfang an gegeben, und die Eigenschaft zur Regeneration basiert auf der Re-Besiedlung der MTx
mit Empfänger-eigenen Zellen (Autologisierung).
Die mechanische Funktion einer Herzklappe
wird im Wesentlichen durch das Herzklappenskelett determiniert, eine mehrschichtige
Bindegewebsstruktur auf Basis von Kollagenen
und elastischen Fasern. Bei der Dezellularisierung kommt es darauf an, alle Spenderzellen
zu entfernen und gleichzeitig die komplexe
Bindegewebsstruktur zu erhalten. Insbesondere
scheint der Erhalt der Basalmembran wichtig für
die weitere, erfolgreiche Verwendung der Matrix
zu sein. Während enzymatische Methoden, zum
Beispiel mittels Trypsin, den Strukturerhalt nicht
gewährleisten, scheinen verschiedenen Methoden auf Basis von Detergenzien die Ansprüche
zu erfüllen1,2. Dabei werden überkritisches CO23,
nahezu wasserunlösliche Desoxycholsäure 4
in Kombination mit Ethanol5, wie auch wasserlösliche Detergenzien2 oder hypotonische
Lösungen verwendet6; entsprechend komplex
und unterschiedlich gestalten sich auch die
Spülschritte mit hypo-, iso- und hypertonischen
Lösungsmitteln oder die Verwendung von weiteren Zusatzstoffen.
Neben der Abreicherung der Spenderzellen,
dient die Dezellularisierung auch der Sterilisation der MTx und der Abreicherung von Viren,
die potentiell mit der MTx übertragen werden
können. Bei der Verwendung porciner MTx
ist insbesondere auf das endogene porcine
Retrovirus (PERV) zu achten, das jedoch mit beschriebenen Methoden quantitativ abgereichert
werden kann7,8,9.
Beschichtungen
Die Beschichtung der dezellularisierten Matrices
soll deren Re-Endothelialisierung beschleunigen.
Ähnliche Ansätze sind aus der Verwendung
von Stents bekannt. Ein Target ist das Epitop
CD34, welches auf Endothelzellen vorkommt.
Eine Beschichtung mit Anti-CD34-Antikörpern
soll zu einer spezifischen Absorption von Endothelzellen oder deren Vorläuferzellen (EPC) aus
der Blutbahn führen und so die Kolonisierung
fördern. In der Tat konnten Rotmans et al. diesen
Effekt beobachten: Beschichtete und unbeschichtete ePTFE-Grafts wurden bei Schweinen
als AV-Shunt zwischen A. carotis und V. jugularis
implantiert. Bis zu 95% der beschichteten Fläche waren nach 28 Tagen besiedelt. Allerdings
beobachteten die Autoren auch eine intimale
Hyperplasie10.
Die spezifische Bindung von EPCs kann auch
mit Aptameren gelingen11. Aptamere sind kurze
einzelsträngige Nukleinsäuren, die Tertiärstrukturen ausbilden. Diese Strukturen sind geeignet
spezifische Bindungen zu ermöglichen, ähnlich
denen von Antikörpern. Hoffmann et al. ist es gelungen, Aptamere zu isolieren, die spezifisch an
EPCs binden. Auf entsprechend beschichtetem
Prothesenmaterial aus PTFE konnten nach Inkubation mit Vollblut EPCs nachgewiesen werden;
unbeschichtetes Material blieb unbesiedelt12.
Calistru et al. verwenden als Beschichtung
das Chemokin CCN1 (alias CYR61). CCN1 ist ein
Cystein-reiches Polypeptid mit proangiogenetischen Eigenschaften. CCN1-beschichtete ovine
PK-MTx konnten im Bioreaktor fast vollständig
re-besiedelt werden. Dies schließt die Oberfläche der Klappen, den Sinus und die Gefäßwand
ein. Die Zellen des luminalen endothelialen
Monolayer waren entsprechend der angelegten
Mediumströmung ausgerichtet. Die PK-MTx
der Kontrollgruppe waren wesentlich weniger
re-besiedelt13.
Autologisieren im Bioreaktor
Vor Implantation können die Herzklappen ex
vivo autologisiert werden. Dazu werden mittels Venenbiopsie gewonnene Endothelzellen
expandiert und in einem Bioreaktor auf die
Matrices aufgesiedelt. Die Herzklappe wird
in einer Vorrichtung fixiert und mit Medium
durchströmt, wobei nach und nach die hämodynamischen Verhältnisse im Rechten Ventrikulären Ausflusstrakt (PK) oder die des Linken
Ventrikulären Ausflusstraktes (AK) nachgeahmt
werden1. Dieser Aufbau ist auch geeignet die Kinetik der Re-Endothelialisierung zu bestimmen14.
Abb. 1: Dezellularisierte Pumonalklappen
28 | 10. Jahrgang | Nr. 4/2009
LABORWELT
Abb.2: Segel einer dezellularisierten Aortenklappe
Während Schlauchpumpen den pulsatilen Fluß
zuverlässig sicherstellen und einfach zu handhaben sind, haben sich alternative technische
Lösungen, wie die Kolbenhubpumpe15, nicht
durchgesetzt. Eine ausreichende Sauerstoffversorgung der Endothelzellkultur kann durch
eine Oberflächenbegasung realisiert werden1.
Weitere Aspekte zur Bioreaktor-Technologie
auf dem Gebiet des kardiovaskulären Tissueengineering haben Mertsching und Hausmann
kurz zusammengefasst16.
Zumindest für die Implantation von PK-MTx
scheint eine vorherige Autologisierung nicht erforderlich. Dies zeigen eine Reihe von klinischen
Befunden (siehe unten). Das erleichtert nicht nur
die praktische Handhabung der Transplantate,
sondern auch in erheblichem Maß deren Zulassung als Medizinprodukt (xenogene Matrices)
oder Arzneimittel (allogene Matrix).
In vivo-Daten
Zahlreiche Studien im Schaf zeigen grundsätzlich die Verwendbarkeit von Herzklappen-MTx.
Das Schaf hat sich als Tiermodell durchgesetzt,
da es sehr schnell Degenerationen (Verkalkungen) an Herzklappen-Substituten zeigt
und somit einen empfindliches Modell für die
Bewertung vor einer klinischen Anwendung
darstellt. Sowohl bei allogenen PK-MTx (ovin
in Schaf)1,17,18, als auch bei xenogenen PK-MTx
(porcin in Schaf)17 konnte die Rezellularisierung
der Transplantate mit Empfängerzellen nachgewiesen werden.
Klinische Daten; Xenogene Klappen
LABORWELT
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035/1.09-2009-08
Wenig ist über die klinische Anwendung von
xenogenen MTx publiziert. Die ersten vier Implantationen porciner PK-MTx der Cryolife Inc.,
USA, endeten desaströs. Von vier Empfängern
starben drei, eine weitere Klappe musste ausgetauscht werden. Die Analyse der Explantate
lässt vermuten, dass zumindest mangelnde
Dezellularisierung eine Ursache für das negative
Ergebnis war19.
Insgesamt drei Berichte von klinischen Studien an der Charité wurden publiziert:
Christiane Koch aus der Arbeitsgruppe von
Prof. Konertz berichtet von einer fünfarmigen
Studie (vom 18.07.2002 bis 10.04.2003) mit 28
Patienten – darunter vier Neonaten (2 bis 33
Wochen), 6 Heranwachsende (4 bis 15 Jahre)
und 18 Erwachsene (17 bis 67 Jahre) – denen
in verschiedenen Indikationen porcine PK-MTx
implantiert wurden. Bis September 2004 wurden bei insgesamt neun Patienten die Klappen
wieder explantiert20. Das finale Studienergebnis
wurde nicht publiziert.
Konertz et al. berichten von einer Studie
in einem ähnlichen Zeitraum (18.07.2002 –
03.05.2004) am gleichen Institut, in der 50
Patienten im Alter von 17 bis 70 Jahren (Durchschnitt 46 Jahre) eine PK-MTx in Rahmen von
Ross-Operationen erhielten. Im Beobachtungszeitraum (n=28: 3 Mon., n=19: 6 Mon., n=11: 12
Mon., n=1: 24 Mon.) starb ein Patient an Multiorganversagen, und ein weiterer Patient musste
an der PK-MTx reoperiert werden21. Die Autoren
bestätigten, dass anfängliche Probleme mit den
Transplantaten22 behoben wurden23.
Erdbrügger et al.9 berichten von einer Studie
mit 103 Patienten im Zeitraum vom 18.07.2002
bis 31.12.2004. Das durchschnittliche Alter der
Patienten betrug 46 Jahre (17-70 Jahre). Im Beobachtungszeitrum starben zwei Patienten an
Multiorganversagen, und ein weiterer Patient
musste 10 Monate nach dem initialen Eingriff
reoperiert werden.
Inzwischen sind mehr als 1.000 Herzklappen
dieser Bauart implantiert worden. Die mechanische Stabilität der porcinen PK-MTx wird
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Tel: +49 (0)30 5304 2260
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10 Jahrgang | Nr. 4/2009 | 29
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Picture: Museum Wiesbaden and Kevin Clarke, The Invisible Body, Wiesbaden 1999 (Portrait of Miguel Algarin, page 28)
durch eine Manschette aus equinem Perikard
unterstützt, in die die PK-MTx eingehüllt ist24.
Widersprüchlich ist, dass der Hersteller AutoTissue GmbH einerseits damit wirbt, kein Glutaraldehyd bei der Herstellung zu verwenden24,
andererseits die Information der französischen
Gesundheitsbehörde darauf hinweist, dass das
Conduit aus equinem Perikard mit Glutaraldehyd fixiert ist25.
Vorgaben wurden beachtet33,34. Unter anderem
willigten Ethikkommissionen in Deutschland
und Moldawien sowie die Eltern und die Patienten in die Vorhaben ein. Ein Junge und ein
Mädchen (11 und 13 Jahre) erhielten im Mai
2002 je eine PK-MTx. Der Klappendurchmesser
vergrößerte sich im Laufe des Wachstums der
Patienten; gleichzeitig konnten regelmäßige
echokardiographische Untersuchungen keine
Allogene Klappen
Allogene PK-MTx werden von verschiedenen
Arbeitsgruppen klinisch eingesetzt: Die ersten
Studien gehen auf Elkins et al. aus dem Jahr 2001
zurück18,19,26, die kumulativ etwa einhundert Patienten allogene PK-MTx (SynerGraft) einschlossen. Bechtel et al. berichten von 23 Patienten (37,0
bis 10,8 Jahre), die im Zeitraum von Dezember
2000 bis Juli 2002 das Produkt Synergraft im
Rahmen von Ross-Operationen oder zur RVOTRekonstruktion nach Fallotscher Tetratlogie
erhielten27. Verglichen mit einer Kontrollgruppe
(n=49; 46,4 ± 11,4 Jahre), die konventionell kryokonservierte Allografts erhielt, zeigten sich nach
etwa fünf Jahren keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Regurgitationsströmung und
dem mittleren Druckgradienten. Der maximale
Druckgradient war bei Synergraft-Empfängern
signifikant erhöht (p=0,049).
Inzwischen wurden mehr als 1.700 „Syner
Grafts“ implantiert, die alle humanen Ursprungs
sind[28]. Das Unternehmen erhielt am 07.02.2008
die Marktzulassung in den USA (FDA-510(k)Clearance). Für die Zulassung wurde nachgewiesen, dass SynerGrafts verglichen mit Homografts
keine Nachteile bezüglich biomechanischer
und hämodynamischer Eigenschaften zeigen.
Die Untersuchungen von Cryolife zeigen ferner,
dass allogene PK-MTx in größerer Stückzahl zur
Verfügung gestellt werden können.
DaCosta et al. wenden das Dezellularisierungsverfahren von Konertz et al.29 für die
Herstellung allogener PK-MTx an. In einer 2004
veröffentlichten Studie30 aus 2003 wurden
immunologische und echokardiographische
Daten von 11 PK-MTx mit neun zytokonservierten
Allografts nach Ross-Operation verglichen. Das
Alter der Patienten betrug 23,0 bis 9,0 Jahre (PKMTx), oder 24,3 bis 8,1 Jahre (Allografts). Nach 90
und 180 Tagen traten HLA I oder -II-Antikörper
bei Patienten mit PK-MTx signifikant seltener auf,
verglichen mit den Empfängern kryokonservierter Allografts. Ähnliches berichten auch Hawkins
et al. für die Verwendung von Synergrafts31. Im
Gegensatz zu den Allografts konnte daCosta bei
den PK-MTx keinen postoperativen Anstieg des
Druckgradienten im RVOT messen.
Als erste berichteten Cebotari et al.32 über die
Implantation und ein 42-monatiges follow-up
von allogenen PK-MTx in Kindern. Die Eingriffe
wurden im Rahmen einer Kooperation zwischen der Medizinischen Hochschule Hannover und dem Herzzentrum in Chisinau, Moldawien, durchgeführt. Alle medizin-ethischen
30 | 10. Jahrgang | Nr. 4/2009
sterilisierend. Gleichzeit wird die Chance auf
eine Re-Kolonisierung des Implantates durch
Empfänger-eigene Zellen gewahrt, und damit
das Potential zur Regeneration.
Die Quelle für die Matrix kann verschieden
sein. Eine xenogene Matrix ist fast in unbegrenztem Maße verfügbar, eine allogene Matrix ist
limitiert durch die Bereitschaft zur Gewebespende. Auf der anderen Seite ist es naheliegend, dass
eine allogene Matrix weniger immunkompetent
ist als eine xenogene – mithin also eher einen
klinischen Erfolg verspricht. Welches Konzept
sich in den unterschiedlichen Indikationen und
zum Wohle der Patienten durchsetzen wird, ist
zurzeit noch nicht absehbar.
Literatur
Abb. 3: Segel einer dezellularisierten Aortenklappe (1000x)
Anzeichen von Dilatation festgestellen; die
Regurgitation reduzierte sich von Grad 2 auf
Grad 1. Die Patienten erfreuen sich bislang
bester Gesundheit. Nach den ersten beiden
Implantationen wurde zunächst ein Memorandum von drei Jahren eingehalten, um den
Erfolg der Operation abzuwarten. Erst nach
weiterer Auswertung wurden weitere Patienten – inzwischen rund 30 – mit allogenen PKMTx behandelt. Ein Patient verstarb 13 Monate
nach dem Eingriff infolge von Vorhofflimmern
und einer mesenteralen Embolie. Die histopathologische Untersuchung des explantierten
PK-MTx zeigte keinerlei Auffälligkeiten – die
Klappe war teilweise mit Patienten-eigenem
Endothel re-besiedelt. Ein weiterer Patient
erschien aus unbekannten Gründen nicht zu
den Nachuntersuchungen. Alle anderen Patienten werden regelmäßig nachuntersucht und
zeigen bisher keinerlei Auffälligkeiten.
[1]
[2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15]
[16] [17] [18] [19] [20]
[21] [22] [23] [24]
[25] [26] Ausblick
Es zeichnet sich ein Paradigmenwechsel ab.
Die Auffassung, dass die Qualität von Klappentransplantaten umso höher ist, je mehr
Zellen des Spenders konserviert werden
können, weicht der Erkenntnis, dass Matrixtransplantate gegebenenfalls die bessere
Alternative darstellen. Die Fallzahlen bei MTx
sind insgesamt noch sehr gering, und auch
die Langzeiterfahrung, wie wir sie aus der
Verwendung von Homografts kennen, fehlt
vollständig. Dennoch überzeugen das Konzept
der Regenerationsfähigkeit und die ersten
klinischen Erfahrungen. Das Risiko, dass mit
einer MTx einhergeht, ist nicht höher als bei
der Transplantation eines Homografts, sondern
eher niedriger: Durch die Dezellularisierung
wird die Immunkompetenz verringert. Ferner
wirkt das Verfahren Virus-abreichernd und
[27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] Lichtenberg et al., Biomaterials 2006;27:4221-4229
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Cebotari et al., Circulation. 2006 Jul 4;114(1 Suppl):I132-7
Schöne-Seifert, Frankfurter Allgemeine Zeitung vom
30.10.2008
Kliemt, Hannover Allgemeine Zeitung 03.11.2008
Dr. Michael Harder
corlife GbR
Feodor-Lynen-Str. 21
30625 Hannover
Tel.: +49-(0)511-563 539-56
Fax: +49-(0)511-563 539-55
michael.harder@corlife.eu
www.corlife.eu
LABORWELT
Cell Culture
Blitzlicht PCR
Zelllinien-Authentifikation
mit Genetic Fingerprinting
Jill Harley Dunham, Emory University, Department of Pharmacology, Atlanta, Georgia, USA;
Adam Petterson, Katie Oostdik, Terri Sundquist und Pam Guthmiller, Promega Corporation,
Madison, Wisconsin, USA
Wissenschaftlichen Schätzungen zufolge sind etwa 15% bis 20% der in Experimenten verwendeten Zellkulturzellen nicht korrekt bezeichnet oder mit einer weiteren Zelllinie kreuzkontaminiert1-3. Sowohl bei der American Type Culture Collection (ATCC), dem Coriell Institut
for Medical Research, der European Collection of Cell Cultures, der Deutschen Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen (DMSZ) als auch der Japanese Collection of Research Ressources wurden Zelllinien eingereicht, die sich nach Authentifizierung als Fehlidentifikation
seitens der einreichenden Institutionen erwiesen4,5 . Insbesondere Stammzelllinien verunreinigen leicht mit Mauszellen, auf denen sie meist kultiviert werden. Deshalb testen viele
Zellkultursammlungen ihre Zellen vor dem Versand auf Kreuzkontaminationen und deren
Identität. Weniger als die Hälfte der Forscher testen dagegen – einer 2004 durchgeführten
Umfrage unter 500 Biologen zufolge6 – regelmäßig die Identität der von ihnen eingesetzten
Zelllinien mittels Standardmethoden, wie etwa dem DNA-Fingerprinting von Short Tandem
Repeats (STR). Laut DMSZ-Wissenschaftlern verweigern oder ignorieren zudem etwa 90%
der Forscher Anfragen von Zellbanken nach dem genetischen Profil neu etablierter Zelllinien.
Dies verhindert nachfolgende systematische Kontrollen der Zelllinien-Authentizität mittels
DNA-Fingerprinting5,7. Zelllinienkontaminationen und Fehlcharakterisierungen stellen indes
die Qualität wissenschaftlicher Publikationen und Ergebnisse in Frage. Ein einfacher und verlässlicher Weg, die Authentizität von Zelllinien sicherzustellen ist das STR-Profiling, eine in der
forensischen DNA-Identifikation etablierte Analysemethode, die zusätzlich Informationen über
Kreuzkontaminationen liefert.
A
B
C
Abb. 1: Detektion einer Kontamination einer Zelllinie mit einer fremden Zelllinie. A: STRProfil der Zelllinie HEK 293 B: STR-Profil von HEK 293-Zellen kontaminiert mit 29%
HeLa-Zellen C: STR- Profil der Zelllinie HeLa. DNA extrahiert aus 104 Zellen mit dem
Maxwell® 16 Cell LEV-DNA Purification-Kit und amplifiziert mit dem Cell ID™-System.
Detektion mittels Kapillarelektrophorese. Zur Vereinfachung werden nur JOE-markierte Allelprofile gezeigt.
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Jahrgang | Nr.Lab
4/2009
| 31
Particle Characterization10 Bioseperation
Automation
Peak Height (Relative Fluorescent Units)
Blitzlicht PCR
Average STR peak height
Average mouse peak height
3,000
2,500
2,000
1,500
1,000
500
0
0
5
10
15
20
25
30
Percent Mouse
Abb. 2: Detektion einer Kontamination einer Zelllinie mit Mauszellen. Immortalisierte humane Zellen (HEK 293) wurden mit zunehmendem Anteil an Mauszellen (NIH 3T3) gemischt. DNA isoliert mit Maxwell® 16 Cell LEV-DNA Purification Kit und quantifiziert
mit Quant-iT™ PicoGreen® ds DNA-Reagenz (Invitrogen). Amplifizierung und Analyse
mit StemElite™ ID gemäß Technical Manual14 .
STR-Loci sind Regionen in den hypervariablen
Abschnitten der DNA, die sich aus kurzen repititiven Sequenzen von 3 bis 7 Basenpaaren
zusammensetzen8-11. Sie verteilen sich über das
gesamte humane Genom und sind reich an
hochpolymorphen Markern. Die verschiedenen
Allele eines STR-Locus unterscheiden sich in
der Anzahl an Wiederholungen der Sequenz.
Zur Erstellung eines STR-Profils werden mittels
PCR multiple STR-Loci zugleich amplifiziert und
ihrer Größe nach auf einem Polyacrylamidgel
oder mittels Kapillarelektrophorese gemeinsam mit einem Allelmarker aufgetrennt. Der
Allelmarker enthält dabei alle Hauptallele eines
Locus und ermöglicht dadurch die eindeutige
Identifikation der vorhandenen Allele. Als
Kontrolle dient ein interner Längenstandard,
der Unterschiede in den Gelläufen anzeigt.
Eine spezielle Allel-Analysesoftware macht
die visuelle Zuordnung der Allele unnötig.
Das Auslesen der Ergebnisse erfolgt dadurch
einfach, präzise und schnell. Im Abgleich des
genetischen Profils der Zelllinie mit dem Profil
der Standard-Zelllinie erfolgt eine eindeutige
Zuordnung des Ursprungs. Allerdings muss
hierfür das genetische Profil der Zelllinie zum
Zeitpunkt der Entstehung vorliegen.
verhindert werden, die einer weiblichen
Ursprungslinie entstammten, in denen aber
Y-Chromsom-Marker nachgewiesen werden
konnten.
Das PowerPlex® 1.2 System ist die Standardmethode zahlreicher Zellkulturbanken bei der
Authentifizierung von Zelllinien. Mit den Cell
ID™- und StemElite™ ID-Systemen (Promega)
stehen seit kurzem auch zusätzliche Methoden für die Bestimmung von Zelllinien zur
Verfügung. Im Gegensatz zum PowerPlex®
1.2 System enthalten beide Systeme eine HotStart Taq DNA-Polymerase zur Amplifikation
bei Raumtemperatur. Das Cell ID™ System
gestattet die simultane Amplifikation und
Detektion von neun STR-Loci plus Amelogenin
mit drei Fluoreszenzfarbstoffen. Rechnerisch
ergibt sich durch die Anzahl der Loci eine
Wahrscheinlichkeit von 1 zu 2,92 x 109 für eine
zufällige Übereinstimmung des DNA-Musters
zweier Individuen oder Zelllinien.Diese Zahl
entspricht auch der Anzahl an Individuen, die
untersucht werden können, bis eine zufällige
Übereinstimmung erhalten wird. Erfolgreich
angewandt wurde das Cell ID™ System bereits zur Detektion einer Kontamination einer
HEK293 Zellkultur durch HeLa-Zellen (Abb. 1).
Zellbanken setzen auf DNA-Profiling
STR-Analyse hilft Stammzellforschung
Der Einsatz des STR-Profiling verhindert bereits die Verbreitung falscher Zelllinien durch
die American Type Culture Collection (ATCC).
Die ATCC nutzt dazu eine STR-Analyse, in
der acht humane STR-Loci plus Amelogenin
in einer Multiplex-PCR simultan amplifiziert
werden (Promega PowerPlex® 1.2 System)12,13.
Amelogenin ist kein STR-Locus, zeigt jedoch
X- und Y-Chromosom-spezifische Banden
und ermöglicht so die Bestimmung des
Geschlechts. Durch diese Methode konnte
die Weiterverbreitung von sechs Zelllinien
Kreuzkontamination und falsch ermittelte
Zellidentitäten bedrohen zudem eine Vielzahl
an wissenschaftlichen Experimenten und Untersuchungen, die auf den späteren Einsatz von
embryonalen Stammzellen in medizinischen
Anwendungen, wie Organersatz, Blindheit,
Verletzungen der Wirbelsäule oder der Behandlung der Parkinsonkrankheit abzielen. Die Kultivierung der embryonalen Stammzellen erfolgt
hierbei derzeit noch überwiegend auf MausFeederzellen. Diese können leicht während
des Passagierens der Stammzellen transferiert
32 | 10. Jahrgang | Nr. 4/2009
werden und die Stammzellen kontaminieren.
Das StemElite™ ID-System (Promega) berücksichtigt diese Möglichkeit. Es beinhaltet neun
humane STR-Loci plus Amelogenin zur Bestimmung der Identität der Stammzelllinie sowie
einen Maus-Locus, um eine Kontamination
durch die Feederzellen nachzuweisen. Kontaminierte Zelllinien zeigen hierbei einen einzelnen
mausspezifischen Peak im Gegensatz zu reinen
Zelllinien schon bei einer Verunreinigung mit
nur 1% Mauszellen (Abb. 2). Durch den Einsatz
eines einfachen Tests zur Bestätigung der Reinheit und Identität einer Stammzelllinie kann
der Verlust wertvoller Ressourcen und Zeit bei
der Entwicklung medizinischer Anwendungen
durch die Verwendung unreiner Materialien
verhindert werden.
Zusammenfassung
Kreuzkontaminationen und falsche Zellidentifizierungen beeinträchtigen die Arbeiten
in Labor und Klinik; von wissenschaftlichen
Veröffentlichungen mit fragwürdigen Ergebnissen bis hin zu Anwendungen von Stammzellen in der medizinischen Forschung. Deshalb
ist eine eindeutige Zelllinienbestimmung von
allgemeinem Interesse. Dennoch existieren
bedeutende Lücken in der grundsätzlichen
Kontrolle von neuen und etablierten Zelllinien.
Ohne eine gemeinsame Anstrengung aller Beteiligten im Bereich der Authentifizierung von
Zelllinien werden diese Probleme zukünftig
stärker an Bedeutung gewinnen.
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[14] StemElite™ ID System Technical Manual, TM307, Promega
Corporation
Dr. Jan Adam
Promega GmbH
Schildkrötstr. 15
68199 Mannheim
Tel.: +49-(0)621-8501-278
jan.adam@promega.com
LABORWELT
Automatisierte
Wirkstoffsuche mittels
High-Content-Screening
Jens Peter von Kries, Leibniz-Institut für Molekulare Pharmakologie, Berlin;
Roland Durner, Tecan Schweiz AG.
Am Leibniz-Institut für Molekulare Pharmakologie (FMP) in Berlin werden mit Hilfe von
Roboter-Mikroskop-Systemen große Wirkstoffbanken nach bioaktiven Molekülen durchsucht.
Die Plattform ist Teil einer umfangreichen Einrichtung für Hochdurchsatz-Anwendungen, der
Screening-Unit. Diese bietet auch externen Wissenschaftlern die Möglichkeit, automatisierte
Technologien in ihre Forschungsprojekte einzubinden. Eine Berliner Arbeitsgruppe hat unlängst mittels High-Content-Screening an automatisierten Mikroskopen einen vielversprechenden Wirkstoff charakterisiert, der die Tyrosinphosphatase Shp2 spezifisch hemmt 1, die
Wachstumssignale downstream von Rezeptor-Tyrosinkinasen weiterleitet. Die niedermolekulare Verbindung erscheint vielversprechend für die Entwicklung neuer Medikamente im
Kampf gegen Krebs.
Die Screening-Unit des Leibniz-Institutes für
Molekulare Pharmakologie (FMP) in Berlin
verwaltet die Substanzen der ChemBioNet
Screening Collection (www.chembionet.info).
Außerdem wird sie von Forschergruppen
genutzt, um große Wirkstoffsammlungen
automatisiert und systematisch nach pharmakologisch interessanten Verbindungen
zu durchsuchen. Den Wissenschaftlern steht
unter anderem eine Plattform zum HighContent-Screening mit automatisierten Mikroskopsystemen zur Verfügung. Damit können
Zellpräparate im Hochdurchsatzverfahren
mikroskopisch analysiert werden.
Nachdem die Berliner Wissenschaftler ein
Computermodell des ak tiven Zentrums
von Shp2 erstellt hatten, führten sie ein
In Silico-Docking mit etwa 2,7 Millionen Sub-
stanzen aus einer Wirkstoffbibliothek durch.
Insgesamt 235 der getesteten Substanzen
wurden als spezifisch erachtet. Davon besaßen
acht Verbindungen die Fähigkeit, das Auswandern von Madin-Darby Canine Kidney-Zellen
(MDCK-Zellen) aus dem Zellverbund in Kolonien (Scattering), das durch den Wachstumsfaktor HGF/SF (Hepatocyte Growth Factor/
Scatter Faktor) induziert wird, zu blockieren.
Dieser Scattering-Prozess, der der Metastasierung von Tumorzellen entspricht, war
bereits in vorangegangenen Publikationen als
Shp2-abhängig identifiziert worden2. Aus den
acht Verbindungen wurde PHPS1 schließlich
als Wirkstoffkandidat ausgewählt, weil es die
Shp2-Aktivität und den Scattering-Prozess am
spezifischsten hemmte.
Mittels High-Content-Screening (Abb. 1)
überprüften die Wissenschaftler die Ergebnisse des In Silico-Dockings experimentell.
Herzstück der Plattform zum automatisierten Mikroskopieren sind FluoreszenzMikroskope (Axiovert 200M, Carl Zeiss, Jena),
die mit einem ArrayScan VTI Live-Reader
verknüpft sind (Cellomics Inc., Pittsburgh).
Die Mikroskope sind in eine Freedom EVO®
200 Workstation (Tecan AG, Schweiz) mit
384-Spitzen-Pipettierkopf, flexiblem AchtKanal-Pipettierer, Robot-Arm und Inkubatoren eingebettet. Die gesamte Anlage wird in
High-Content-Screening
in der Krebsforschung
Mithilfe der High-Content-Screening-Plattform identifizierten Wissenschaftler des MaxDelbrück-Centrums für Molekulare Medizin in
Berlin (MDC) und des Institutes für Chemie
und Biochemie der Freien Universität Berlin
einen erstmals Wirkstoff, der das Onkogen
Shp2 – nicht aber die nahe verwandten Tyrosin-Phosphatasen Shp1 and PTP1B – spezifisch
hemmt. Der zellpermeable, nichttoxische
Wirkstoff (Phenylhydrazonopyrazolonsulfonat, PHPS1) könnte nach Optimierung für die
Therapie diverser Krebsarten von Interesse
sein: Er inhibiert die hochkonservierte katalytische Einheit der nicht-membranständigen
Rezeptor-Phosphotyrosin-Phosphorylase
Shp2, die eine zentrale Rolle in mehreren Signaltransduktionswegen von Wachstumshormonen spielt. Mutationen von Shp2 können
spezielle Formen der Leukämie bei Kindern
und andere Krebsarten, darunter auch solide
Tumore, hervorrufen.
LABORWELT
Abb. 1: Arbeitsablauf des High-Content-Screenings mit automatisierten Mikroskopen. Zellen
werden in Zellkulturflaschen kultiviert und danach auf 384-Well-Mikrotiterplatten übertragen. Es folgt die Immunfluoreszenzpräparation zur „Dead-Cell“-Analyse und das Mikroskopieren mit Fluoreszenzmikroskopen. (Alternativ kann auch eine „Live Cell“-Analyse
durchgeführt werden.) Alle Arbeitsschritte werden mit Hilfe der Liquid Handling-Workstation Freedom EVO 200 automatisiert durchgeführt. Die Plattform zum automatisierten Mikroskopieren kann pro 384 Well-Platte bis zu 7.000 Bilder aufnehmen.
10. Jahrgang | Nr. 4/2009 | 33
Abb. 2: Hemmung des HGF/SF-induzierten Zell-Scatterings von MDCK-Kolonien am Metastase-Modell. Aktin wurde mit Phalloidin B (rot) gefärbt, ganze Zellen mit CMFDA
(grün) und Zellkerne mit dem Farbstoff Hoechst 3342 (blau) behandelt. Die Bilder
wurden mit dem ArrayScan VTi-System dokumentiert. In Abwesenheit von HGF/SF
(–SF, links) bildeten die Zellen Kolonien. Nach Zugabe des Hepatozyten-Wachstumsfaktors HGF (+SF, 3 Units, 24 Stunden) vereinzelten sich die Zellen der Kolonien und
wurden mobil. Dieser Prozess ist ein Modell für die Metastasierung von Tumorzellen
bei der Krebsentwicklung. In Gegenwart des Shp2-Inhibitors PHPS1 wurde der Prozess unterdrückt.
einer Sterilbank der Firma BDK betrieben, um
mögliche Kontaminationen auszuschließen
(vgl. Infokasten).
Prozessautomatisierung
beim Mikroskopieren
Die Prozessautomatisierung beim High-Content-Screening beinhaltet die Anzucht der Zellen
und die Ernte aus Zellkulturflaschen (RoboFlask,
Corning INC, Corning), die Aussaat auf 384-WellMikrotiterplatten, den Transfer der Wirkstoffe
und die „Dead-Cell“-Analyse durch Immunfluo-
reszenzpräparation und anschließendes Mikroskopieren. Alternativ können Lebendzellanalysen
durchgeführt werden. Das Mikroskop fokussiert
automatisch die richtige Bildebene und nimmt
in der Regel drei Felder pro Well auf. So entstehen
pro 384-Well-Platte bis zu 7.000 Bilder, die in
Multiparametertabellen mit einer Software der
Firma Cellomics dokumentiert und ausgewertet
werden (vgl. Abb. 1).
Zur experimentellen Verifizierung der Ergebnisse des In Silico-Dockings wurden kultivierte MDCK-Zellen zwecks Aktin-Färbung
mit Phalloidin B (rot) behandelt, ganze Zellen
wurden mit CMFDA grün und Zellkerne mit
dem Farbstoff Hoechst 3342 blau gefärbt. Die
Proben wurden mikroskopiert und analysiert.
In Abwesenheit von HGF/SF (–SF, links) bildeten
die Zellen wie erwartet Kolonien. Nach Zugabe
des Hepatozyten Wachstumsfaktors HGF (+SF,
3 Units, 24 Stunden) vereinzelten sie sich und
wurden mobil. Gaben die Forscher den Shp2Inhibitor PHPS1 zur Probe hinzu, konnten sie den
Scattering-Prozess unterdrücken (Abb. 2).
Die nähere Charakterisierung der Verbindung
PHPS1, die das Wachstum von Tumorzelllinien
spezifisch hemmt, ergab, dass der Wirkstoff
zellpermeabel und nicht-zytotoxisch ist. Er ist
spezifisch für Shp2-abhängige Signalwege und
besitzt sehr gute pharmakologische Eigenschaften. Das Potential von PHPS1 als Therapeutikum
für Shp2-abhängige Krankheiten wird derzeit
eingehender untersucht.
Literatur
[1] Hellmuth K., Grosskopf S., Lum C. T., Würtele M., Röder
N., von Kries, J. P., Rosario M., Rademann J., Birchmeier
W.: „Specific inhibitors of the protein tyrosine phosphatase Shp2 identified by high-throughput docking“. PNAS
105:20, 7275-7280 (2008).
[2] Kodama A., Matozaki T., Fukuhara A, Kikyo M., Ichihashi
M., Takai Y.: “Involvement of an SHP-2-Rho Small G Protein
Pathway in Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor-induced
Cell Scattering”. Mol Biol Cell 11:8. 2565-2575 (2000).
Tobias Häßner
Tecan Deutschland GmbH
Theodor-Storm-Str. 17
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Tel.: 07951-9417-655
Fax: 07951-9417-555
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www.tecan.com
Laborwelt Hintergrund
Automation an der Screening-Unit
Zur Screening-Unit des Leibniz-Institutes für
Molekulare Pharmakologie (FMP) gehören neben dem automatisieren Mikroskopiersystem
für das High-Content-Screening zwei weitere
Anlagen zur Laborautomation. Eine dieser
Plattformen ist die RNAi-Workstation, die zusammen mit dem Max Delbrück Centrum für
Molekulare Medizin und dem Berlin Institute
for Medial Systems Biology betrieben wird. Sie
wird genutzt, um menschliche Zelllinien oder
den Fadenwurm C. elegans zu untersuchen,
der in der Genomforschung häufig als Modellorganismus genutzt wird. Allein die humane
RNAi-Bank umfasst etwa 20.000 Gene und
wird in erster Linie im Rahmen von Krebsforschungsprojekten eingesetzt. Vor allem für
Projekte in der Systembiologie wurde eine C.
elegans-Bank angelegt, die 16.500 Stämme
34 | 10. Jahrgang | Nr. 4/2009
enthält und insgesamt 87 % der bekannten
Gene umfasst. Die RNAi-Workstation schließt
unterschiedliche optische Methoden ein, wie
zum Beispiel Fluoreszenz- und Chemilumineszenzverfahren. Auch hier dient eine Freedom
EVO® Liquid Handling-Plattform (Tecan, Männedorf, Schweiz) zur Automatisierung. Mit ihrer
Hilfe können verschiedene Reader-Technologien
in die Anlage integriert werden.
Zusammen mit einem REMP Small-Size StoreTM
(SSS) (REMP, Oberdiessbach, Schweiz) verwendet
das FMP eine weitere Freedom EVO-Plattform
für die Verwaltung und das Screening chemischer Verbindungen (vgl. Bild). Diese Einrichtung
ist auch die Grundlage für das CompoundManagement der ChemBioNet Screening
Collection, die von zahlreichen akademischen
Hochdurchsatz-Plattformen innerhalb Europas
genutzt wird. Die Plattform, die auch gekühlte
Proben bevorratet, funktioniert wie eine kleine
Fabrik: Sie durchsucht die Substanzen für
Screening-Anwendungen, arbeitet dabei zeit
effizient und kann alle Proben rückverfolgen
und zuordnen.
LABORWELT
LABORWELT
Oligo Bulk Synthesis Service
Gene Expression Profiling, Gene Silencing etc.
10 Werktage
Lieferung in 96-well Platten (lyophilisiert)
Oligomenge: 5 nmol entsalzte Oligos
Oligolänge: 20 - 80-mere (>80-mere auf Anfrage)
Electrospray-Massenspektrometrie (ESI-MS)
Umfassende Beratung und Information über alle
Schritte
Außerdem möglich:
Oligomenge: > 5 nmol/Oligo
Oligolänge: >80-mere
Lieferung in 384-well-Platten (mind. 192 Oligos)
I 3‘- und 5‘-Modifikationen wie Phosphat, Biotin,
Amino, FAM, TET, HEX, TAMRA, CAL Fluor, Quasar
und BHQ Farbstoffe I RPC-Aufreinigung
Lieferung in Lösung/Puffer I Normalisierung bezügl. Volumen oder KonzentrationI HPLC-Analyse
und/oder Massenspektrometrie
Name der
Dienstleistung
Einsatzgebiete
Lieferzeiten
Beschreibung des
Services
Qualitätskontrolle
Kundenunter
stützung
Besonderheiten/
Extras
10. Jahrgang | Nr. 4/2009 | 35
* Datenbasis: Rücklauf aus Befragung der Anbieter
Preis
BioCat GmbH
Im Neuenheimer Feld 584
D-69120 Heidelberg
Tel.: +49-(0)6221-71415-16
Fax: +49-(0)6221-71415-29
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www.biocat.com
Dr. Elke Gamer
Firma/Kontakt
Alle regulatorisch geforderten Methoden/
Analyse
Herstellung von Oligonukleotiden im large
scale-Maßstab (g bis kg), alle Arten von
Oligonukleotiden und Modifikationen I
Produktion nach cGMP in Reinräumen I
Sequenzspezifische Validierung der Analysemethoden (ICH) I Stabilitätsstudien und
Freigabe nach ICH-Richtlinien I Analysen
von Arzneitmittel auf Basis von Oligonukleotidwirkstoffen
Wird mit Kunden jeweils definiert
Wirkstoffe für Toxikologiestudien, klinische
Studien, Therapie
Large scale Synthese (g bis kg) und cGMP
Oligonukleotid-Produktion
BioSpring GmbH
Alt Fechenheim 34
D-60386 Frankfurt
www.biospring.de
Tel.: +49-(0)69-4260-3717
Fax: +49-(0)69-4260-3718
Dr. Hüseyin Aygün
oligo@biospring.de
Verschiedene Formate, z.B. TaqMan Probes, BHQPlus Probes, Black Hole Scorpion
Primer-Probes I Amplifluor Primer I Große
Auswahl an Farbstoffen/Quenchern mit
sehr gutem Signal/Hintergrund-Verhältnis
I Black Hole Quencher besitzt keine native
Fluoreszenz I CAL Fluor- und Quasar-Farbstoffe und Black Hole Quencher sind ideal
für Multiplex-PCR.
Europaweit einziges GMP-zertifiziertes
Unternehmen für die Herstellung therapeutischer Oligonukleotide I Einziger Auftragshersteller in Europa mit Kapazitäten im
kg-Maßstab I Begleitung des Kunden von
der Forschung (small scale) bis zu klinischen
Studien (large scale & cGMP) I Duplex
Massenbestimmung
Umfassende Beratung und Information über Unterstützung bei regulatorischen u. techalle Schritte
nischen Fragestellungen I Erfahrung mit
Oligonukleotiden in klinischen Phasen I
Unterstützung bei Erstellung IND/IMPD
Electrospray - Massenspektrometrie (ESIMS)
Primer/Probe-Synthese inkl. Markierung
mit Fluorophoren wie FAM, TET, HEX, JOE
oder CAL Fluor- und Quasar-Farbstoffen
und einem Quencher (Black Hole Quencher
Farbstoffe)
10 Werktage
Real-time qPCR, Gene Expression Profiling,
and SNP Genotyping
Primer & Probe Synthesis Service
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Tel.: +49-(0)6221-71415-16
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Dr. Elke Gamer
Begleitung der Kunden von Forschung
bis zur Klinik. I Große Bandbreite an
Modifikationen, lange Oligonukleotide
bis ca. 250-mere I Maßgeschneiderte
Reinheit für die jeweilige Anwendung
Fachliche Unterstützung zu Applikationsfragen I Durchführung sehr komplexer Syntheseanfragen
IEX-, RP-, denat.-, SEC-HPLC, MS
(MALDI oder ESI), LC-MS, CE, Gel, UV,
Sequenzierung, Tm, Endotoxin, u.a.
Oligonukleotide: DNA, RNA, OMe,
Thioate, Chimere, 5`-Modifikationen,
3`-Modifikatonen, Zuckermodifikationen, Farbstoffe, High-throughput RNA,
einzelsträngige und doppelsträngige
Oligonukleotide mit und ohne Nukleaseschutz
Abhängig von der Oligonukleotidart,
kürzeste Lieferzeit: unmodifizierte
Oligonukleotide über Nacht
Diagnostik, Target-Validierung, Molekularbiologie, Gene Silencing, Entwicklung Therapie, Tierexperimente
Small scale & mid scale Oligonukleotidsynthese
BioSpring GmbH
Alt Fechenheim 34
D-60386 Frankfurt
www.biospring.de
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Fax: +49-(0)69-4260-3718
Dr. Carolin Ahlborn
oligo@biospring.de
Marktübersicht DNA-Synthese
Marktübersicht: Oligo- und Gensynthese
Mit der Verbesserung der gentechnischen Tools wächst neben dem Tagesgeschäft der Oligonukleotidsynthese auch der Markt für die Synthese
ganz neuer DNA-Sequenzen. Die Vision der Synthetischen Biologie ist es , die Stoffwechselleistungen von Mikroorganismen oder die Ausbeute
von Produktionsorganismen für die biopharmazeutische Industrie zu verbessern oder aber ganz neue Produkte zu generieren. Dazu werden
künstlich optimierte Gene benötigt. Einen Überblick* über angebotene Dienstleistungen gibt die folgende Marktübersicht.
36 | 10. Jahrgang | Nr. 4/2009
RNA/DNA-Oligo-Synthese
PCR, Sequenzierung I Mutagenese-Studien,
Hybridisierung, Klonierungen, Gen-Synthese
I In vitro-Diagnose I Antisense-Studien
I RNAi-Applikationen I Real-Time-PCRAnwendungen I DNA-Chip-Technologien
Abhängig von der Art der Oligos: Unmodifizierte Oligos: 2 Tage Synthese und ein
Tag Lieferzeit I Modifizierte Oligos: 3 Tage
Synthese und ein Tag Lieferzeit
Kundenorientierte hochqualitative RNA/
DNA-Oligo-Synthese mit großem Focus I
auf modifizerte Oligos, wie farbstoffmarkierte Sonden für Real-Time-PCR oder I
spezielle Oligos (z.B.: Antagomirs,...) für
Antisense-Studien. I Sämtliche unmodifizierte Oligonukleotide werden routinemäßig mit HPLC gereinigt. I Ein Großteil
der modifizierten Oligos werden mit PAGE
aufgereinigt.
online-Monitoring sämtlicher Syntheseschritte I HPLC-bzw. PAGE-Reinigung sämtlicher
Oligos I Analytische PAGE
Design von Primern/Sonden
Beratung in Anwendungsfragen
Aliquotierungen von Oligos
Erstellung von Analysenzertifikaten
Lieferung in Mikrotiterplatten-Format
Name der Dienstleistung
Einsatzgebiete
Lieferzeiten
Beschreibung des
Services
Qualitätskontrolle
Kundenunter
stützung
Besonderheiten/
Extras
Preis
Biozym Scientific GmbH
Steinbrinksweg 27
31840 Hessisch Oldendorf
Tel.: +49-(0)5152-9020
Fax: +49-(0)5152-902290
oligo@biozym.com
www.biozym.com
Dr. Monika Burbach
Firma/Kontakt
Gensynthese: Doppelstrang-DNASequenzierung des klonierten Gens
Gensynthese:
Design und Synthese von Standard
Genen, komplexen Genen und GenBibliotheken
Sequenz-Optimierung, Codon Usage
Adaption, Persönliche Beratung
Gensynthese: Abhängig von Art, Umfang und Komplexität der zu synthetisierenden Gene - ab 10 Werktage.
Gensynthese: Alternative zur Klonierung, PCR / qPCR Standards, Promotor-& Enhancer Elemente, Anpassung
der Codon Usage, Sequenzoptimierung, Konstruktion von Hybridgenen,
Gen-Bibliotheken, etc.
Gensynthese
Eurofins MWG Operon
Anzinger Str. 7a
85560 Ebersberg
Tel.: +49-(0)8092-8289-77
Fax: +49-(0)8092-21084
support@eurofinsdna.com
Synthese-Report, QC-Report und Lieferscheine werden online übermittelt I Auswahl an unterschiedlichen Etikettentypen pro Auftrag wählbar I Anlegen und Verwalten von Gruppen (Group Administration Tool) I Einfache
und flexible Guthabenverwaltung mit der EVOcard I Spezialisiert auch im Bereich DNA-Sequenzierung
Einfaches, übersichtliches und SSL-kodiertes Online-Bestellsystem, I Einzeleingaben, Copy & Paste und .xls
Upload möglich I Bestellhistorie mit einfacher Such- und Nachbestellungsmöglichkeit I Online Tracking von
Produktions- und Lieferstatus, I Oligo Design Tools, I Oligo Kalkulations- und Analyse-Tools, I Individuell
anzulegende Präferenzen für einzelne Aufträge (Personal Preferences) I Flexible Adressenverwaltung I Online
Angebotsanfrage und Erstellung für Gensynthesen I Persönliche Beratung, Projektunterstützung
Oligonukeotide/siRNA: Trityl-Monitoring, Messung der Konzentration
(OD) I MALDI-TOF-Massenspektroskopie bzw. Kapillar-Gel-Elektrophorese (CGE-Analyse)
Oligonukleotide: Abhängig von der Kundenanforderung bietet Eurofins MWG Operon: I Applikations-optimierte Oligos/Sonden für Standard PCR, Sequenzierung, qPCR und RAPD-Analysen I Unmodifizierte
Oligos in unterschiedlichen Synthese-Maßstäben und einer Auswahl
and unterschiedlichen Aufreinigungsarten I Salt Free, HPSF® , HPLC
und HYPUR® (PAGE) I Modifizierte Oligos mit einer großen Auswahl
an Fluoreszenzfarbstoffen, Basen-, Zucker- und PTO-Modifikationen I
Large Scale Synthesen
siRNA-Synthese: I In Tubes, 96 well- oder 384 well-Platten I Modifiziert und unmodifiziert I Desalted oder HPLC aufgereinigt I Lyophilisiert, Normalisiert und/oder Aliquotiert
Oligonukleotide: Abhängig von Syntheseart, Synthese Scale, Aufreinigungsart und Modifikation - 24 Std. und 5 Werktage
Oligonukleotide: PCR, qPCR, RT-PCR, Sequenzierung, Klonierung,
Mutagenese, SNP-Analyse & Detektion, Hybridisierung, Arrays, Gensynthese, sonst. molekularbiologische Anwendungen
Oligonukleotide, siRNA
Eurofins MWG Operon
Anzinger Str. 7a
85560 Ebersberg
Tel.: +49-(0)8092-8289-77
Fax: +49-(0)8092-21084
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DNA bases: starting from 0,25 Euro
Double-Dye probes starting from 115 Euro
siRNA duplexes: starting from 135 Euro
Since 2000, EUROGENTEC has maintained a Quality Management System that is certified for ISO 9001:2000. In
2009, Eurogentec received ISO 13485:2003 certification
for the production and sales of In Vitro Diagnostic (IVD)
oligonucleotides. EUROGENTEC maintains production facilities in the USA, Japan, and Singapore, with increasing
redundancy in equipment, methods, procedures and QMS.
Staffed by qualified and experienced scientists in Molecular Biology and Chemistry. Oligonucleotide design service
available. Contact info@eurogentec.com.
Oligonucleotides are 100 % QC controlled by routine
Maldi-Tof Mass Spectrometry (MS). Additional QC include
analytical HPLC, Capillary Gel Electrophoresis (CGE), ESI MS,
Maldi-Tof MS Sequencing, Fluorescence analysis.
Since 1987, Eurogentec has provided oligonucleotides
of the highest quality whatever the application. Our
Oligonucleotide Synthesis Service offers a large variety of
synthesis scales (from µg to grams), more than 100 modifications, and an extensive range of purifications, formats
and packaging’s. cGMP grade also available.
Custom primers: 2-3 wd; Real-Time qPCR probes: 5-7
wd; siRNA duplexes: 5 wd (wd: working days, may vary
according to the oligonucleotide specifications). Fast
turnaround time. Same Day shipping option available.
PCR, Sequencing, Cloning, Real-Time qPCR, SNP genotyping, FRET, Structural studies (X-ray crystallography,
NMR), FISH, Antisense, Gene silencing, RNAi, In Vitro
diagnostics, In Vivo use.
Custom oligonucleotides (eg. PCR primers, all types of RealTime qPCR probes, siRNA, simple to highly complex modified
sequences incl. LNA®, PNA, PSO, 2’O-Methyl, aptamers…)
EUROGENTEC Deutschland GmbH
Cäcilienstraße 46
50667 Köln
Tel.: +49-(0)221-258-94-55
Fax: +49-(0)221-258-94-54
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info@eurogentec.com
Dr. Anthony Meunier
LABORWELT
LABORWELT
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RNA optimisation, Codon optimisation, cDNA
Design, Microarray-Ready cDNA, Recombinant
antibodies, DNA Vaccines and Vectors, Predicted
Genes.
Starting from 15 wd for a 2 kb sequence (wd:
working days, may vary according to the gene
specifications).
Any gene in any vector, Gene Optimisation included, Synthesis of complex genes (up to 50 kb),
100 % guaranteed sequence, Fast turnaround
times, Trusted quality.
Size of the inserted fragment (by digestion and
PCR), 100 % sequence of your Custom Genes
checked by sequencing, Reading frame (if requested), Flanking regions of the chosen vector by sequencing, DNA quality and quantity (spectrometry).
Staffed by qualified and experienced scientists
in Molecular Biology and Chemistry. Contact
custom.gene@eurogentec.com.
Per gene: 4 µg of lyophilised plasmid DNA provided. Each Custom Gene is accompanied by a
printout of the sequence alignment; a plasmid map
to locate the flanking regions and restrictions sites;
general information and instructions to directly use
your Custom Genes, Quality Assurance Certificate.
Einsatzgebiete
Lieferzeiten
Beschreibung des
Services
Qualitätskontrolle
Kundenunterstützung
Preis
Starting from 0,45 Euro per bp for custom genes without complex sequence and secondary structures.
Custom Genes
Name der
Dienstleistung
Besonderheiten/
Extras
EUROGENTEC Deutschland GmbH
Cäcilienstraße 46
50667 Köln
Tel.: +49-(0)221-258-94-55
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Dr. Anthony Meunier
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Gensynthese: ab 0,49 €/BP
Weltweit führende Anbieter für Gensynthese mit einer
Produktionskapazität von 3 Mio. Basenpaaren/Monat
Stabile und verbesserte Proteinexpression I Bereitstellung von Genbibliotheken I Bereitstellung von
Plasmid-DNA I Bereitstellung stabiler Zelllinien
DIN EN ISO 9001:2000 zertifiziert. Jeder Kunde/jedes
Unternehmen und jede Gensequenz werden entsprechend der gesetzlichen Vorgaben überprüft. GENEART
ist Vorstandsmitglied in der International Association
of Synthetic Biology IASB
Genoptimierung u. Gensynthese: In silico-Optimierung v.
Gensequenzen; Herstellung der Gene I Directed Evolution Services: Gezieltes Design u- Produktion von Genvarianten und Genbibliotheken mit bis zu 1011 Varianten,
Auslieferung in Plasmiden oder in rekombinanten Bakterien I Plasmid Services: Klonierung von synthetisierten
Genen in Kundenvektoren I komplexe Vektorkonstruktionen (bis zu 1 g), auch in cGMP-Qualität I ProteinServices: I Expressions-Verifizierung I Protein-Expression
und -Aufreinigung I Herstellung stabiler Zelllinien
Gensynthese: 1,8 kb ab 5 Werktage
Entwicklung, Verbesserung u. Herstellung von Biopharmazeutika, Impfstoffen und DNA basierten Wirkstoffen
I Verbesserung von Biokatalysatoren/Industrieenzymen
I Konstruktion von Operons für die zielgerichtete Modifikation von Mikroorganismen zur Synthese komplexer
Biopolymere oder zum Abbau chemischer Verbindungen
Genoptimierung und Gensynthese I Directed Evolution
Services I Plasmid Services I Proteine und Zelllinien
GENEART AG
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93053 Regensburg
Tel.: +49-(0)941-942 76-0
Fax: +49-(0)941-942 76-711
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Volker Metzger
central@geneart.com
Möglichkeit zur OnlineWebbestellung I Liefertracking I Erweiterungen
für Batch-Management
und interne ServiceAbteilungen
Durch unser ExpertenTeam und die dazugehörige Experten-Hotline:
07071-976188
Zertifizierter Prozess
nach DIN EN ISO 9001
Steuerung des gesamten
Produktionsablauf nach
Vorgaben des Kunden I
Integration der Laborgeräte, damit die Daten in
der Software verfügbar
sind I Vollständige Dokumentation sämtlicher
Arbeitschritte
Je nach Aufwand/nach
Absprache
Unternehmen die OligoSynthese betreiben
Bereitstellung einer
Produktions-Software für
die Oligo-Synthese
Hölle & Hüttner AG
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dsRNA), Chimere (DNA/RNA), LNA (Locked
Nucleic Acids, Lizenz von Exiqon), mit mehr als
40 Modifikationen und mehr als 150 FarbstoffMarkierungen erhältlich.
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Spezielle DNA und RNA-Synthesen
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37079 Göttingen
Tel.: +49-(0)551-50672-0
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business days for standard desalt and 4 to 7 business days when PAGE
purified. I miniGENES (up to 500 bp) – 6-12 business days I Genes
(501+ bp) – 20-25 business days
Standard DNA Synthesis - Desalted custom synthesized DNA oligos are
shipped lyophilized or hydrated with LabReady Oligo Service. Synthesis
scales range from 25 nmole up to multi-gram scale. I SameDay® Oligo
Service – 2-OD minimum guarantee (sufficient for >250 PCR reactions),
15-45 bases, deprotected and desalted I HOTplates™ - Expedited 96well plate oligo synthesis service I Ultramers - High-fidelity synthesis of
very long DNA oligos (up to 200 bases) I miniGENES (up to 500 bp)/
Genes (501+ bp) - Confidential and guaranteed gene synthesis service,
ready for use in a variety of applications.
DNA Synthesis - Every oligo is deprotected and desalted to remove small
molecule impurities, quantitated twice by UV spectrophotometry to
provide an accurate measure of yield, and quality control (QC) checked
by mass spectrometry. Free QC traces online. I miniGENES (up to 500
bp)/ Genes (501+ bp) - Guaranteed sequence verification through use of
double-stranded DNA sequencing.
Customer and technical support representatives are available Monday
through Friday. Technical and educational materials, including oligo
design and analysis tools, are available online.
Oligonucleotide purification, including PAGE, HPLC, IE HPLC, RNase-Free
HPLC, Dual HPLC and Dual PAGE & HPLC. A wide variety of modifications is available.
Einsatzgebiete
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Verschiedene Modifikationen (5’, 3’ sowie interne Modifikationen)
können gewählt werden, Spezieller Service für Platten (auf Nachfrage),
kundenspezifische Synthese von speziellen Oligonukleotiden möglich
(z. B. andere Fluoreszenzfarbstoffe, Linker etc. ), viele ergänzende
Klonierungsvektoren (Gateway®) und Kits (TOPO®) für den Workflow
(Klonierung, Sequenzierung, Expression, Mutagenese und andere ) vorhanden. ASR/ GMP Oligo-Synthese nach FDA-Vorgaben für verschiedene
Mengen (25nmol bis 10 µmol) vorhanden;
Minimum-Mengen-Garantie, Oligo-Reinheitsgrad-Guide zur Auswahl des
besten Reinheitsgrad, 100% Synthese-Kontrolle) durch LIMS-Tracking
und Prozess-Monitoring (z.B. Trityl-Monitoring, OD260nm, Full length
Kontrolle), ASR / GMP Oligo-Service nach FDA Vorgaben vorhanden
Verschiedene Design Tools sind auf der Homepage vorhanden, OligoPerfect™, LUX™-Primer, Kundensoftware Vector-NTI™ und Vektor-Design,
Unterstützung bei größeren Design-Projekten (für Support einfach Email
senden ), Kunden-Support und Technischer Service unter 0800 1815450
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verschiedene Längen, Größen und Modifikationen in Platten und Tubes
mit verschieden Reinheitsgraden. Fertige Oligo Set und auch ein RNA &
RNAi-Synthese Service vorhanden
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auf Anfrage, Zertifizierung nach ISO 9001:2000 und Akkreditierung
nach EN ISO 17025 für DNA-Sequenzierung, GMO-Analytik und Genotyping (STS 429)
Synthese von Primern und langen DNA-Oligonucleotiden bis 125 Basen,
doppelt oder einfach markierte fluoreszenzgelabelte Sonden mit großer
Farbstoffpalette I Spezialsynthesen mit 5’-, 3’- oder interner Modifikation, Aptamere, Phosphorothioate I RNA bis 80 Basen, siRNAs & RNAi,
2’-OMe-RNA, DNA-RNA-Hybride I Gensynthese-Service I Aufreinigungen von „desalted“ für Standard-Oligonucleotide bis HPLC oder PAGE
mit Dialyse für höchste Ansprüche in Zellkultur oder Diagnostik
Lieferung von Standard-Oligos (desalted) nach 2 Arbeitstagen, HPLCund PAGE-aufgereinigten Oligos nach 3 Arbeitstagen, siRNAs nach
4 Arbeitstagen, doppelt modifizierte Sonden für die Real-Time PCR
nach 4-5 Arbeitstagen,Spezialsynthesen nach 5-6 Arbeitstage (alle
Zeiten jeweils inkl. Transport), Gensynthesen und HT-OligonucleotidSynthesen in Abhängigkeit von der Länge bzw. Anzahl variierend
Oligonucleotide und Gensynthesen für die Diagnostik, Forschung und
Entwicklung, z.B. für PCR, Real-Time PCR, Sequenzierung, Genotyping, Klonierung und Protein-Expression, Mutagenese, Gene-Silencing, Micro-Arrays, nicht-radioaktive Markierung von Biomolekülen
Synthese von DNA- und RNA-Oligonucleotiden, Gensynthesen
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Einsatzgebiete
Reproduzierbare Qualität der Plasmid-DNA durch Anlegen einer individuellen Zellbank I Kultivierung im Bioreaktor ohne Zusatz komplexer
Medienbestandteile tierischen Ursprungs I Auf Wunsch komplett tierfreie
Herstellung, d.h. ohne den Einsatz jeglicher Substanzen tierischen Ursprungs im gesamten Produktionsprozess I DNA-Herstellung in unseren
Plasmid-Laboratorien durch standardisierte Herstellungs-verfahren einschließlich LPS-Endotoxin-Entfernung I Exakt definierte Qualität (mehr
als 7 QC-Kontrollen) I DNA-Konzentration im Bereich 0,5 bis 5,0 mg/mL
frei wählbar I Abfüllung der Plasmid-DNA in einem Puffer der Wahl
Individuelle Abstimmung der Produktspezifikationen im Hinblick auf
die Anwendung des Kunden
Mehr als 7 Standard-QCs bei jeder Plasmidproduktion ohne Aufpreis
enthalten, weitere optional I DNA-Analysen erfolgen nach dokumentierten Prüfverfahren I Durchführung der QCs mit validierten Verfahren und nach GLP / GMP ebenfalls möglich (High Quality Grade
Qualität für z.B. Virusproduktion nach GMP)
Herstellung kundenspezifischer Plasmid-DNA I Sofort lieferbare In StockProdukte I AAV Helper & Packaging Plasmide (pDG-Familie, diverse
Serotypen) I Plasmide mit Reportergenen (z.B. luc, GFP,…) I pEpi-Plasmide (mit S/MAR-Elementen) I McBoxluc mit Luziferase-Minicircle und
korrespondierendem Plasmid I Gensynthese, Vektoroptimierung (z.B.
Codon-Gebrauch, CpG-Gehalt) und Klonierung I Plasmid DNA-Produktion nach GMP I High Quality Grade DNA in Anlehnung an das EMEADokument CHMP/BWP/2458/03, z.B. für GMP-Virusproduktionen I
Bestimmung der Plasmidtopologieverteilung (Plasmidformenverteilung)
in DNA Proben mittels kapillargelelektrophoretischer Auftrennung (CGE)
I Prüfung der Plasmid-Stabilität per Kapillargelelektrophorese (CGE) I
Vektor-Logistik: Lagerung Ihrer Plasmid DNA nach ICH-Richtlinien unter
GMP und Lieferung nach Anforderung auf Trockeneis per Kurierdienst
Medizinische, biotechnologische und bio-chemische Einsatzgebiete:
Transiente Transfektion I DNA-Vakzine I Gen- und Zelltherapie I
Virus-Produktion (z.B. AAV, LV) I Antikörperproduktion
Auftragsherstellung und Analytik von Plasmid DNA, Gensynthese,
Genvektor-Logistik
Gensynthese und Genoptimierung
Name der
Dienstleistung
PlasmidFactory GmbH & Co.KG
Meisenstraße 96
33607 Bielefeld
Tel.: +49-(0)521-299 73 50
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vorkonfigurierte Mikrotiterplatten für die LightCycler® 480- und LightCycler® 1536-Systeme,
z.B. zur Analyse von Apoptosemechanismen,
Zellproliferation, G-Protein-Zellrezeptoren, Zellzyklusregulation, ABC-Transporter-, Referenzgenen
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Mikrotiterplatten für den Einsatz in den LightCycler® 480 und LightCycler® 1536 Systemen (ab
Herbst 2009 verfügbar) I customized Einzelassays,
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Nukleinsäuren auf Real-Time-PCR-Basis I Analyse
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Ingrid Hajek-Schinkenberger
10. Jahrgang | Nr. 4/2009 | 39
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Akademischer Stellenmarkt
Veröffentlichen Sie Ihre Stellenanzeigen zielgruppengerecht in unserem akademischen Stellenmarkt (auch online), der allen nicht-kommerziellen Instituten für ihre Stellenausschreibungen kostenlos zur Verfügung steht. Bitte senden Sie dazu Ihre Anzeige (1/4 Seite 90 mm breit x 122,5 mm hoch, Logo –
jpg oder tiff, 300 dpi Auflösung) an a.macht@biocom.de. Annahmeschluss für die nächste Laborwelt-Ausgabe „Krebs: Analyse von Signalwegen“
(BIOTECHNICA-AUSGABE, Erscheinungstermin 24.09.2009) ist der 11. September 2009.
technician
We are seeking a
to join our small research group with
the focus on Bacterial-Artificial-Chromosome Technology (BACs), a technique
used for generating transgenic mice (Genetic Targeting of Dendritic Cells). The
successful candidate will be responsible for generating BAC transgenic and
knock-out mice (BAC recombination, ES-Cell culture) and mouse husbandry
(embryo transfer, genotyping, breeding of transgenic founder lines, etc.).
Die Abteilung Innere Medizin I, Schwerpunkt Hämatologie und Onkologie, sucht
ab sofort eine/n
med.-techn. Assistentin / einen med.-techn. Assistenten
für das Teilprojekt "Control of graft-versus-host disease for enhanced immune
reconstitution following allogeneic hematopoietic cell transplantation" im Rahmen
des Sonderforschungsbereichs 620 Immundefizienz. Voraussetzung für die Bewerbung ist eine abgeschlossene MTA-Ausbildung und einschlägige Berufserfahrung, vor allem Kenntnisse im Bereich Zellkultur, Durchflusszytometrie, PCR,
ELISA und Immunhistologie. Von Vorteil sind Erfahrung im Umgang mit Mausexperimenten und Interesse an der Forschung im Bereich Immunologie. Die Stelle
ist zunächst auf 2 Jahre befristet. Die Vergütung erfolgt nach Tarif.
Bitte bewerben Sie sich mit den üblichen Unterlagen bis spätestens 03.08.2009
unter folgender Adresse: Herrn, Dr. Robert Zeiser, Abt. Innere Medizin I, (Laboratorien Nothnagel), Med. Univ.-Klinik, Hugstetter Str. 55, 79106 Freiburg, oder
robert.zeiser@uniklinik-freiburg.de. Für nähere Informationen steht Ihnen Dr.
Robert Zeiser unter E-Mail robert.zeiser@uniklinik-freiburg.de zur Verfügung.
Vollzeitstellen sind grundsätzlich teilbar, soweit dienstliche oder rechtliche Gründe
nicht entgegenstehen. Schwerbehinderte werden bei gleicher Eignung bevorzugt
eingestellt. Für den Inhalt dieses Angebots ist die jeweils ausschreibende Einrichtung verantwortlich. Einstellungen erfolgen durch die Personalabteilung des Klinikums.
In der Abteilung Chemische Ökologie (Fakultät Biologie) der Universität Bielefeld
ist ab sofort eine
wissenschaftliche Mitarbeiterstelle
(E 13, ehemals BAT IIa)
zunächst auf drei Jahre zu besetzen.
Die Aufgabengebiete liegen auf der Untersuchung der chemischen und/oder
molekularen Variabilität innerhalb von Pflanzenarten, insbesondere von Neophyten, sowie der Untersuchung der Mechanismen, die zu deren Etablierungserfolg
führen. Zu den Aufgaben gehören außerdem die Wahrnehmung von Lehre und
die Übernahme von organisatorischen Aufgaben am Lehrstuhl.
Voraussetzungen sind eine einschlägige Promotion im Bereich Biologie sowie
fundierte praktische Erfahrungen mit Untersuchungen (zu Pflanzen-InsektenWechselwirkungen) an invasiven Pflanzen und Publikationserfahrung. Eine solide
Kenntnis multivariater statistischer Analysemethoden ist essentiell.
Bewerbungen von Frauen sind ausdrücklich erwünscht; Frauen werden bei
gleicher Eignung, Befähigung und fachlicher Leistung bevorzugt berücksichtigt,
sofern nicht in der Person eines Mitbewerbers liegende Gründe überwiegen.
Die Bewerbung geeigneter Schwerbehinderter ist erwünscht.
Elektronische Bewerbungen mit Lebenslauf, Forschungsinteressen, Zeugnissen, Publikationsverzeichnis und Namen und Anschriften von zwei
Referenzen bitte per e-mail an:
Prof. Dr. Caroline Müller: caroline.mueller@uni-bielefeld.de
40 | 10. Jahrgang | Nr. 4/2009
Onsite training will be provided to acquire and/or maintain a high degree of
technological and laboratory expertise.
Qualifications and Experience:
Applicants are required to have qualifications in the field of molecular biology/
immunology. The work will involve molecular biology, cell culture and manipulation of murine pronuclei. Experience with protein biochemistry, immunoblotting, antibody staining of tissues, PCR, FACS and mouse genetics would
be valuable. The desire to acquire new skills and develop new methods and
techniques is essential. Fluent knowledge of the English language is required.
Ideally, candidates should have experience with ES-Cell culture and should be
highly qualified individuals, who can take significant responsibility for design
and performance of complex experiments.
Applicants should submit a detailed CV and covering
letter (PDF-files as email attachments preferred) to:
Prof. Dr. Tim Sparwasser
Institute of Infection Immunology, TWINCORE, Centre for Experimental and
Clinical Infection Research, Feodor-Lynen-Str. 7, 30625 Hannover
Phone: +49 511 220027-201, Email: tim.sparwasser@twincore.de
Ph.D. position in
Bacterial Genetics
Institute for Genetics, University of Cologne
In frame of a DFG-funded project a Ph.D. position (1/2 E13 TV-L) is available to
study mechanisms controlling transcriptional silencing by the global regulator
and nucleoid-associated protein H-NS in Escherichia coli, and to elucidate the
role of LuxR-type transcription factors in antagonistic control of H-NS in response
the stress conditions and environmental stimuli.
Experience in bacterial genetics and/or microbiology as well as knowledge
of standard molecular and biochemical techniques is advantageous. Applicants should hold a Diploma or Masters-Degree in Biology or Biochemistry.
Applicants are requested to send a full curriculum vitae, a statement of
interest, correspondence addresses of two referees by August 20, 2009
(preferably by email), to Prof. Dr. Karin Schnetz, Institute for Genetics,
University of Cologne, Zülpicher Str. 47, 50674 Köln, schnetz@uni-koeln.de
http://www.uni-koeln.de/math-nat-fak/genetik/groups/Schnetz/
The University of Cologne is an equal opportunity employer in compliance with
German disability laws. Applications from women and disabled persons are
particularly welcome.
LABORWELT
UNIVERSITÄT DES SAARLANDES
Medizinische Fakultät
FACHBEREICH THEORETISCHE MEDIZIN &
BIOWISSENSCHAFTEN
Uniklinikum des Saarlandes
Institut für Molekulare Zellbiologie
Naturwissenschaftliche(r)
Doktorandin/Doktorand
Am Institut für Molekulare Zellbiologie der Medizinischen Fakultät der
Universität des Saarlandes ist zum nächstmöglichen Zeitpunkt eine
Doktorandenstelle zu besetzen.
Das Institut konzentriert seine wissenschaftlichen Aktivitäten auf die
Erforschung der zellulären und molekularen Grundlagen von
Herzkrankheiten wie Herzrhythmusstörungen und Herzmuskelschwäche. Hierzu wird ein breites Spektrum von Techniken
angewandt, das von zellulärer Elektrophysiologie über
Konfokalmikroskopie und Zwei-Photonen Mikroskopie bis hin zu invivo viralem Gentransfer in Tiermodellen humaner Herzkrankheiten
reicht.
Das Institut ist an zahlreichen Projekten der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB, klinische Forschergruppe, internationalem
Graduiertenkolleg), des BMBF (Biophotonic III) und BfR
(Tierversuchsersatzmethoden) beteiligt.
Voraussetzungen sind:
Abgeschlossenes Hochschulstudium vorzugsweise im Bereich
Biologie oder Humanbiologie. Gute Kenntnisse der englischen
Sprache in Wort und Schrift sind wünschenswert.
Solide methodische Kenntnisse in der zellulären Elektrophysiologie,
in bildgebenden Verfahren und/oder molekularbiologischen
Verfahren wären ein zusätzlicher Gewinn.
Weitere Informationen erhalten Sie auch auf unserer Homepage
„www.lipplab.de“ oder per Telefon (s.u.).
Promotionsstelle
in der Abteilung „Molekulare Phylogenetik“ ab 1. August 2009 oder später zu
vergeben:
CyTOL (Cyanobacterial Tree Of Life): Genomdatenverarbeitung und Phylogenetik
in den Cyanobakterien
Themengebiete: Genomik, Phylogenetik,
Bioinformatik, Cyanobacteria
postgraduate
DerDistance
Wissensstand über
die Evolution der Cyanobakterien ist trotz der immensen
studies
ökologischen Bedeutung dieser Gruppe immer noch sehr lückenhaft, und bis
heute fehlt darüber eine umfassende, vollständig aufgelöste und gleichzeitig
statistisch abgesicherte phylogenetische Hypothese.
Nanobiotechnology
Ziel der Promotion ist es, mit bioinformatischen und phylogenetischen Methoden
die bestgeeignetsten genetischen Loci zu identifizieren und phylogenetisch zu
analysieren. Dies soll mit Hilfe einer modular aufgebauten Pipeline erreicht wer• Nanobioanalysis
den, welche es erlaubt, die einzelnen Arbeitsschritte
(Suche nach ORFs, Locus
Clustering, Alignment, phylogenetische Analyse,•Locus-Evaluierung)
zu variieren,
Chemical
um so Ergebnisse verschiedener Algorithmen zuNanotechnologies
vergleichen, unterschiedliche
Arten von Eingabedatensätzen zu verarbeiten•(z.Chip
B. eukarytotische
Genome),
Technologies
oder neue Algorithmen bzw. Softwaretools zu implementieren. Eine Anzahl der
Nanomaterials
voraussichtlich am besten geeigneten Gene wird• schließlich
für zusätzliche Taxa
•
Nanodevices
in
sequenziert, um dann durch eine umfassende phylogenetische Multi-Gen-Analyse
erstmals einen fundierten Einblick in die Evolution Medicine
dieser wichtigen Organismengruppe zu gewinnen.
• Molecular Biology
Voraussetzung ist ein abgeschlossenes Studium (Content,
der Biologie.
Im Rahmen der
Excerpt)
Promotion wird erwartet, dass innerhalb des Projekts eigenständig weitere
Online programme
near the job!Themengebieten bearbeitet werden.
Fragestellungen
aus den entsprechenden
Duration:
1
year
InteressentInnen benötigen Kenntnisse in einer Programmiersprache und im
Start:mitOctober
2008
Umgang
Computern
sowie solides Grundlagenwissen in Systematik und/
oder Phylogenetik.
www.zfuw.de
Bewerbungen
mit den üblichen Unterlagen (CV, Referenzen) an:
J.-Prof Dr. Frank Kauff
Box 3049 FB Biologie,
TU P.O.
Kaiserslautern,
Kaiserslautern
Abt.D-67653
Molekulare
Phylogenetik,
Phone: +49 (0) 631/205-4925
Postfach
3049,
67653
Kaiserslautern
Fax:
+49 (0)
631/205-4940
fkauff@biologie.uni-kl.de
E-Mail: zfuw@zfuw.uni-kl.de
UNIVERSITY OF SAARLAND, DEPARTMENT OF PHYSIOLOGY
PhD position, application deadline: not specified
Ihre Bewerbung (auch elektronisch) mit den üblichen Unterlagen
richten Sie bitte an:
Prof. Dr. Peter Lipp
Institut für Molekulare Zellbiologie
Medizinische Fakultät
Universität des Saarlandes
66424 Homburg/Saar
Tel.: +6841 162 6103
email: peter.lipp@uks.eu
Open Postdoc and doctoral Student
positions
The collaborative research centre „Functional biomaterials for controlling healing
processes in bone and skin – from material science to clinical application“
(TRR 67) established by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) at the
University of Leipzig, the Technical University of Dresden, the Helmholtz Centre
for Environmental Research Leipzig the INNOVENT e. V. Jena and the Leibniz
Institute of Polymer Research Dresden is announcing open PhD and postdoc
positions for pharmacists, biochemists, biologists, chemists, medical students
and molecular biologists.
For further information see www.TRR67.de.
LABORWELT
PhD position
A
at the Department of Physiology, University of Saarland
in the group of Prof. Frank Zufall is available in the project
“Olfactory coding mechanisms in a novel olfactory subsystem of the mouse
main olfactory epithelium”.
The project is funded within the DFG priority program 1392 “Integrative Analysis
of Olfaction”. The studies include high-resolution confocal calcium imaging and
patch clamp recording in genetically altered olfactory sensory neurons of the
mouse to understand coding and signaling mechanisms in a novel olfactory
subsystem. The project is in close collaboration with Peter Mombaerts’ lab (http://
www.mpibp-frankfurt.mpg.de) at the Max Planck Institute for Biophysics in Frankfurt, and PhD students in both labs are expected to closely interact. The PhD student based in Homburg will have her/his main focus on state-of-the-art imaging
methods. Previous experience in live-cell imaging or electrophysiology is required.
The Department of Physiology in Homburg houses strong and interactive
groups in molecular, cellular and systems physiology. Working facilities at the
Department are excellent, and PhD students are affiliated with the International
Graduate School GRK 1326 “Calcium Signaling and Cellular Nanodomains”.
Funding of the PhD project is for 3 years. Homburg is a lovely town in southwest
Germany’s wine country, with fast connections to both Frankfurt and Paris.
For more information see: http://physiology.uni-saarland.de
Contact address: Prof. Dr. Frank Zufall
University of Saarland School of Medicine, Department of Physiology
Kirrberger Strasse, Bldg. 58, 66421 Homburg/Saar, Germany
frank.zufall@uks.eu, phone: +49-6841-1626450, fax: +49-6841-1626655
10. Jahrgang | Nr. 4/2009 | 41
Im Sonderforschungsbereich 571:
„Autoimmunreaktionen: Von den Manifestationen über die Mechanismen zur
Therapie“ („Autoimmune Reactions: From Manifestations and Mechanisms
to Therapy“) ist im Teilprojekt A2: “Charakterisierung der psoriatischen
Autoantigene mittels T-Zell-Rezeptor-Transfektanten”
(“Characterization of the psoriatic autoantigens using recombinant T-cell
receptor transfectants”)
die Stelle eines
wissenschaftlichen
Mitarbeiters/Molekularbiologen
(Besoldungsgruppe E13)
zu besetzen.
Dauer der Beschäftigung: baldmöglichst zunächst bis zum Ende der Förderung
(31.12.2011)
Voraussetzungen: abgeschlossenes Hochschulstudium in Biologie oder Humanbiologie; abgeschlossene Promotion zu einem molekularbiologischen Thema;
experimentelle molekular- und zellbiologische Erfahrungen.
Geboten wird eine relevante wissenschaftliche Fragestellung mit gut etablierten
Vorarbeiten in einem interessanten wissenschaftlichen Umfeld.
Interessenten wenden sich bitte mit ihren Bewerbungsunterlagen an:
Univ.-Prof. Dr. Jörg C. Prinz
Klinik und Poliklinik für Dermatologie und Allergologie
Frauenlobstr. 9-11, 80337 München
Tel.: 089-5160-6010; Fax: 089-5160-6064
joerg.prinz@med.uni-muenchen.de
http://www.klinikum.uni-muenchen.de/SFB571/en/index.html
PhD student position
We are offering one
(Early-stage Researcher) in the field of infection-immunology. Applicants should have a strong interest in immunology (dendritic cells, regulatory T cells). Experience in cellular and
molecular biology would be favourable. The project requires laboratory animal
(mouse) work. The Institute offers the opportunity to work in an international,
highly stimulating and competitive scientific environment.
Postdoc position
We are offering one
in the field of infectionimmunology. Applicants should have a strong interest in immunology (dendritic
cells, regulatory T cells). Experience in cellular and molecular biology would be
favourable. The project requires laboratory animal (mouse) work. The Institute
offers the opportunity to work in an international, highly stimulating and competitive scientific environment.
Die Chirurgische Klinik (Direktor: Prof. Dr. Dr. h.c. Werner Hohenberger)
sucht im Rahmen einer durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) geförderten Studie zur klinischen Etablierung molekularer
Prognosefaktoren bei Darmkrebs eine/n:
Studienärztin/Studienarzt
Die Studie wird im Rahmen einer Zusammenarbeit der Universitätskliniken
Erlangen und Frankfurt mit Siemens Healthcare Diagnostics Products
GmbH durchgeführt. Ihre Aufgabe besteht in der verantwortlichen Betreuung der Studie (Organisation der Patientenaufnahme, SOP-gesteuerter
Probengewinnung/-analyse und des Datenflusses zwischen den beteiligten
Zentren). Sie werden zusammen mit den Instituten der Biostatsistik und
Bioinformatik am Aufbau einer neuen Interaktionsplattform mitarbeiten
und die Zusammenarbeit des Verbundes im Rahmen von Arbeitstreffen
und Tagungen organisieren.
Wir erwarten Leistungsbereitschaft, freundliche Persönlichkeit, Organisationstalent und Interesse für molekulare Mechanismen der Tumorgenese.
Erfahrungen im Umgang mit EDV und solide Englisch Kenntnisse sind
erwünscht.
Eine Teilnahme am Dienstbetrieb der Chirurgischen Klinik ist möglich.
Die Stelle ist zunächst auf drei Jahre befristet. Die Bezahlung erfolgt nach
TVL. Die Besetzung der Stelle erfolgt unter Beachtung der Bestimmungen
des Schwerbehindertengesetzes und des Allgemeinen Gleichbehandlungsgesetzes.
Senden sie ihre Bewerbung mit Lebenslauf, Zeugnissen, zwei Referenzen
und kurzer Beschreibung der Motivation für ihre Bewerbung an:
Frau Elke Daughtery
Abteilung Molekulare und Experimentelle Chirurgie
Schwabachanlage 10, 91054 Erlangen
Tel.: 09131 8 53 31 09, e-mail: elke.daughtery@uk-erlangen.de
For further information about the Institute of Infection Immunology please visit
our institute / lab homepage (http://twincore.de/infektionsimmunologie.html ).
Mitarbeiter gesucht?
Applicants should send a CV, a brief outline of their research experience and
interests and two letters of reference by email to:
Nutzen Sie die Möglichkeit, zielgruppengerecht in unserem
akademischen Stellenmarkt kostenlos zu werben.
Prof. Dr. Tim Sparwasser
Institute of Infection Immunology
TWINCORE, Centre for Experimental and
Clinical Infection Research
Feodor-Lynen-Str. 7, 30625 Hannover
Phone: +49 511 220027-201, Email: tim.sparwasser@twincore.de
42 | 10. Jahrgang | Nr. 4/2009
Auch online unter www.laborwelt.de
Informationen erhalten Sie unter:
a.macht@biocom.de
oder
Tel.: 030-264 921-54
LABORWELT
Im Institut für Experimentelle und Klinische Pharmakologie, Campus Kiel, ist zum 01.08.2009 die Stelle
eines/einer
A position is available for a
Postdoctoral scientist (wiss. Mitarbeiter/in, BAT IIa)
or a
Postgraduate scientist (Doktorand/in, BAT IIa/2)
in molecular plant cell physiology / phytochrome biology
at the Department of Plant Physiology, JLU Giessen for research in the DFG-funded
project “Physcomitrella-based studies of phytochrome cytoplasmic signalling”.
The successful candidate will have completed his/her doctoral or Diplom/BSc-MSc
studies in Biology, Biochemistry or a related field, be interested and ideally have
experience in phytochrome physiology and/or studies of intracellular signalling, show
enthusiasm for new methods and ideas, be able to express themselves effectively
in English and/or German and be expected to contribute enthusiastically to the
teamwork of the Department.
Project overview
Phytochrome photoreceptors play a central role in regulating plant development. In
its ground state (Pr) phytochrome is cytosolic but red light absorption induces the Pfr
signalling state which then moves into the nucleus to regulate transcription. Clearly,
however, some phytochrome effects occur far too quickly for such a mechanism.
Moreover, in lower plants phytochrome provides vectorial information for directional
responses such as photo- and polarotropism of individual cells: this certainly cannot
be based on transcription regulation. Thus phytochrome has a second, much more
rapid signalling system which transmits the directional signal within the cytoplasm.
The goal of the project is to elucidate this system.
We have studied the directional light responses and cloned the phytochrome genes
in the moss Physcomitrella. As, uniquely amongst plants, high rates of homologous
recombination in mosses allow specific genes to be targeted for mutation, we could
identify the specific Physcomitrella phytochrome - PP4 - responsible for direction
sensing (see Mittmann et al. 2005, PNAS). The proposed project aims to identify
potential PP4 partners using both conventional and cytoplasmic yeast two-hybrid
methods. The particular genetic advantages of Physcomitrella - now enhanced by
the complete genome sequence (see Rensing et al. 2008, Science) - will then be exploited to characterise these partners. Parallel studies in Arabidopsis and biophysical
approaches at the cellular and molecular levels are also envisaged.
Please apply via e-mail as soon as possible: Professor
Jon Hughes, Pflanzenphysiologie, Justus Liebig Universität, Giessen
jon.hughes@uni-giessen.de
The laboratory of Pharmaceutical Biology at Saarland University is inviting
applications for a
Postdoctoral position (TV-L)
The successful candidate will work on a joint research project with an industrial
partner funded by the federal ministry of economics. The project focuses on
the mechanisms of blood and lymphoid vessel permeability. We will use an
ethnopharmacological approach in order to identify substances, which can
influence endothelial permeability. The methods in the project are confocal
microscopy and different cell biological as well as biochemical techniques.
We are looking for a highly motivated candidate with a strong background
in cell culture techniques and (confocal) microscopy. Experience in in vitro
phytopharmacological investigations as well as mechanisms in cell barrier
functions are appreciated.
The position is availabe for 24 months. Women and handicapped people are
explicitly invited to apply.
Please send your application to: Prof. Dr. Alexandra K. Kiemer
Campus C2 2, P. O. box 15 11 50, D-66041 Saarbrücken
pharm.bio.kiemer@mx.uni-saarland.de
reference number: W115
Please send your application documents as copies (no originals) since we
cannot send documents back.
LABORWELT
Wissenschaftlichen
Mitarbeiters/in
Kennziffer K110.16 / W24
vorerst befristet für die Dauer von zwei Jahren mit der Option der Verlängerung
zu besetzen. Einstellungsvoraussetzung ist ein abgeschlossenes Studium der
Humanmedizin oder Naturwissenschaft mit Promotion. Erwartet werden ein
hohes Engagement und Teamgeist sowie die Beherrschung eines breiten Spektrums molekulargenetischer und zellbiologischer Methoden. Erfahrung in der
Planung und Durchführung klinisch-pharmakologischer Studien ist erwünscht.
Die Aufgaben umfassen die aktive Mitarbeit in translationalen Forschungsansätzen der Pharmakogenomik sowie Beteiligung in der Lehre. Die Möglichkeit der
Weiterbildung zum Facharzt für Klinische Pharmakologie ist gegeben.
Die Vergütung erfolgt bei Erfüllung der tariflichen Voraussetzungen bis zur
Entgeltgruppe 14 TV-L. Vollzeitbeschäftigung zzt. 38,5 Stunden.
Bewerbungen Schwerbehinderter werden bei entsprechender Eignung bevorzugt
berücksichtigt. Frauen werden bei gleichwertiger Eignung, Befähigung und
fachlicher Leistung vorrangig berücksichtigt.
Nähere Auskünfte erhalten Sie von Herrn Prof. Dr. Dr. Ingolf Cascorbi (Tel.
0431/597-3500, cascorbi@pharmakologie.uni-kiel.de). Für tarifliche Fragen
steht Ihnen Frau Bendig (Tel. 0431/597-2703) zur Verfügung. Weitere Informationen über das UK S-H, Campus Kiel, erhalten Sie auch unter www.uk-sh.de.
Ihre Bewerbung mit aussagefähigen Unterlagen richten Sie bitte unter
Angabe der Kennziffer an das
UNIVERSITÄTSKLINIKUM Schleswig-Holstein
Campus Kiel – Dezernat Personal
Arnold-Heller-Str. 3 (Haus 31), 24105 Kiel
Das Zentrum für Biologische Signalstudien (bioss) der Universität Freiburg
sucht eine / einen
Technische/n Angestellte/n (MTA / BTA)
Wir suchen hoch motivierte und forschungsinteressierte Bewerber(innen),
die sich mit Begeisterung und Flexibilität in ein junges Team einbringen. Die
geplanten Tätigkeiten umfassen Molekularbiologie, Genetik inkl. der Erzeugung
von transgenen Tieren, Zellbiologie/Zellkulturhandling, in situ-Hybridisierung
und Immunfluoreszenz so wie moderne hochauflösende Mikroskopie in eigenständiger Bearbeitung.
Wir erwarten eine abgeschlossene Lehre als Biologisch Technische/r Assistent/
in oder Medizinisch Technische/r Assistent/in, idealerweise mit Berufserfahrung.
Solide molekularbiologische Kenntnisse sind wünschenswert. Zebrafisch- oder
Mikroskopiekenntnisse sind ein Plus. Sie sind gewohnt, zuverlässig und verantwortungsvoll zu arbeiten. Selbstständiges Arbeiten ist erwünscht und wird
gefördert. Gute Grundkenntnisse in Englisch werden benötigt.
Die Stelle wird nach TVL vergütet und ist zunächst bis zum 30.10.2012 befristet.
Die Universität strebt eine Erhöhung des Anteils der Frauen in Forschung und Lehre an und bittet deshalb qualifizierte Wissenschaftlerinnen nachdrücklich um ihre
Bewerbung. Schwerbehinderte werden bei gleicher Eignung bevorzugt eingestellt.
Bitte richten Sie Ihre vollständigen Bewerbungsunterlagen unter Angabe
der Kennziffer 6254 bis zum 01.08.2009 an:
kontakt@bioss.uni-freiburg.de
10. Jahrgang | Nr. 4/2009 | 43
Als europaweit führendes Forschungszentrum mit der Ausrichtung „Environmental Health“
(Verknüpfung von Biomedizin und Umweltforschung) analysieren die Forscherinnen und
Forscher des Helmholtz Zentrums München grundlegende Prozesse der Krankheitsentstehung, der Schädigung sowie der Abwehr- und Kompensationsfähigkeit des Organismus.
Wir sind eine Forschungseinrichtung des Bundes und des Freistaats Bayern mit Sitz in Neuherberg, im Norden Münchens, und sind Mitglied der Helmholtz-Gemeinschaft Deutscher Forschungszentren e.V., der größten öffentlichen Forschungsorganisation Deutschlands.
Das Helmholtz Zentrum München als Träger des Bayerischen Frauenförderpreises sowie des Total E-Quality Zertifikates strebt eine Erhöhung des Frauenanteils an und fordert
deshalb qualifizierte Interessentinnen auf, sich zu bewerben. Schwerbehinderte werden bei gleicher Eignung bevorzugt.
Das EuMMCR (European Mouse Mutant Cell Repository) am Institut für Entwicklungsgenetik sucht zum nächstmöglichen Zeitpunkt eine/n
BTA/CTA/MTA/VMTA m/f - Kultivierung von
embryonalen Stammzellen (88/2009)
Ihre Aufgaben
– Beurteilung und Kultivierung von embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) der Maus
– Isolierung von ES-Zell-DNA, Analyse der ES-Zellen mittels
molekularbiologischer Techniken
– Validierung von Targeting-Vectoren, Versand von ES-Zell-Klonen an
Wissenschaftler weltweit
Ihre Qualifikation
– Ausbildung als BTA, CTA, MTA, VMTA oder vergleichbare Ausbildung
– Erfahrung mit Zellkultur und molekularbiologischen Techniken
– Kenntnisse mit ES-Zellkultur sind wünschenswert
– hohe Flexibilität und Teamgeist
Unser Angebot
– Tätigkeit in einem innovativen, zukunftsorientierten Unternehmen
– umfangreiches Fortbildungsangebot
– zunächst für zwei Jahre befristetes Arbeitsverhältnis und eine Vergütung nach TVÖD
Das Institut für Grundwasserökologie sucht zum 01.09.2009 eine/n
Wissenschaftliche/n Mitarbeiter/in anaerober Schadstoffabbau (139/2009)
Ihre Aufgaben
– Identifizierung und Aufklärung von neuen Enzymreaktionen im anaeroben Abbau von aromatischen Kohlenwasserstoffen
– Untersuchung von physiologischen Grundlagen des anaeroben Abbaus von aromatischen Schadstoffen in kontaminierten Grundwasserleitern
Damit leisten wir einen Beitrag zum Verständnis der Selbstreinigungsprozesse
im Grundwasser und tragen zur Reinhaltung unserer wichtigsten Trinkwasserressource bei.
Ihre Qualifikation
– Hochschulstudium in Biologie/Biochemie
– Erfahrung in Proteinbiochemie, Enzymreinigung und
Enzymcharakterisierung
– Kenntnisse im Umgang mit anaeroben Enzymen sind von Vorteil
– ausgeprägte Teamfähigkeit
Unser Angebot
– Tätigkeit in einem innovativen, zukunftsorientierten Unternehmen
– exzellentes Forschungsumfeld mit erstklassiger Ausstattung
– umfangreiches Fortbildungsangebot
– zunächst für drei Jahre befristetes Arbeitsverhältnis und eine Vergütung nach TVöD
Wir freuen uns auf Ihre Bewerbung online. Dr. Andreas Hörlein
E-Mail: andreas.hoerlein@helmholtz-muenchen.de, Tel.: 089 3187-2431
Wir freuen uns auf Ihre Bewerbung online. Prof. Rainer Meckenstock
E-Mail: rainer.meckenstock@helmholtz-muenchen.de, Tel.: 089 3187-2560
Helmholtz Zentrum München
Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt GmbH
Institut für Entwicklungsgenetik, Postfach 11 29, 85758 Neuherberg
Helmholtz Zentrum München
Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt GmbH
Institut für Grundwasserökologie, Ingolstädter Landstr. 1, 85764 Neuherberg
Promotion (Dr.rer.nat.): „RNA EDITING AND HYPEREXCITABILITY DISORDERS“
1 Doktorand/-in
gesucht.
Tätigkeitsbeschreibung: D
ie ausgeschriebene Stelle ist im Rahmen einer Helmholtz-Hochschul-Nachwuchsgruppe am Max-Delbrück-Zentrum für molekulare Medizin
(MDC), die sich mit der Entwicklung alternativer Epilepsietherapien befasst, zu besetzen.
Project description: In a healthy organism, a balance is maintained between the excitation and inhibition of electrical impulses generated by neurons in the brain.
Deregulation of this balance results in nervous system disorders. A core aspect of our work concerns the study of the brain at the molecular level, by investigating a
post-transcriptional enzymatic process known in research as “RNA editing” or “splicing”. We search for disease-associated alterations in post-transcriptional processes in the nervous system. Within this context, we are more closely scrutinizing glycine and GABA(A) receptors and gephyrin – key components of the molecular
machine responsible for inhibition of electrical impulses in the brain.
The open position focuses on identification and characterization of the brain GlyR RNA editing enzyme complex.
Voraussetzungen: Abgeschlossenes Studium, Erfahrung im Umgang mit DNA/RNA, mit molekularbiologischen Techniken, primären Zellkulturen, Zellinien, Transfektion
und Genexpression, Immunzyto-/histochemie; Darüberhinaus sind EDV-Kenntnisse (MS-Office, Photoshop, Statistik) sowie gute Englischkenntnisse vorteilhaft.
VergütungsgruppePromotions-übliche Vergütung, Eintrittstermin: Sofort
Die Stelle ist befristet bis: Zunächst auf 1 Jahr.
Nähere Auskünfte über die Aufgaben erteilt: Prof. Dr. Jochen Meier, Tel: (030) 94063062
http://www.mdc-berlin.de/en/research/research_teams/rna_editing_and_hyperexcitability_disorders/index.html
Bitte richten Sie Ihre Bewerbungen mit den üblichen Unterlagen (CV mit Bild, Zeugniskopien) an: jochen.meier@mdc-berlin.de
44 | 10. Jahrgang | Nr. 4/2009
LABORWELT
Service Verbände
Seite bitte abtrennen – per Fax an 030-264921-11
Kontakt zu Verbänden
Die Mitglieder der nachfolgenden Fachgesellschaften erhalten LABORWELT regelmäßig mit
freundlicher Empfehlung ihrer Organisationen. Wer sich darüber hinaus für eine Mitarbeit‚ oder
einen Beitritt interessiert, erreicht die Fachgesellschaften unter den folgenden Kontaktdaten:
und Laboratoriumsmedizin e.V. (DGKL)
Proteomforschung
Fax
E-Mail
Gesellschaft für Genetik
AFT FÜ
H
GENE
Deutsche Gesellschaft für
Tel.
R
Geschäftsstelle der DGKL
Im Mühlenbach 52 b
53127 Bonn
Tel.: +49-(0)-228-92-68-9522
Fax: +49-(0)-228-92-68-9527
geschaeftsstelle@dgkl.de
www.dgkl.de
Firma
ELLSC
S
Dt. Ver. Gesell. f. Klinische Chemie
Name
GE
Verband (siehe unten, bitte ankreuzen)
Bitte kontaktieren Sie mich
K
TI
Ich interessiere mich für
den Beitritt
Unterstützung für Jungwissenschaftler
Interessenvertretung
eine Spende
Fachgruppen im Bereich
Gesellschaft für Signaltransduktion
c/o Prof. Dr. Ralf Hass
Med. Hochschule Hannover
AG Biochemie u. Tumorbiol.
30625 Hannover
Tel.: +49-(0)-511-532-6070
Fax: +49-(0)-511-532-6071
www.sigtrans.de
c/o MPI für Biochemie
Am Klopferspitz 18a
82152 Martinsried
Tel.: +49-(0)-89-1897-9007
Fax: +49-(0)-89-1897-9009
c.kleinhammer@dgpf.org
www.dgpf.org
BIO Deutschland
Gesellschaft für Pharmakologie und
Toxikologie
Geschäftsstelle der DGPT
Achenbachstraße 43
40237 Düsseldorf
Tel.: +49-(0)-211-600-692-77
Fax: +49-(0)-211-600-692-78
mitglieder@dgpt-online.de
www.dgpt-online.de
Tegeler Weg 33/
berlinbiotechpark
10589 Berlin
Tel.: +49-(0)-30-3450593-30
Fax: +49-(0)-30-3450593-59
info@biodeutschland.org
www.biodeutschland.org
Deutsche Gesellschaft für Hygiene
und Mikrobiologie (DGHM)
Nationales Genomforschungsnetz
c/o DKFZ
69120 Heidelberg
Tel.: +49-(0)-6221-424-743
Fax: +49-(0)-6221-423-454
S.Argo@dkfz-heidelberg.de
www.ngfn.de
c/o Institut für Hygiene und
Med. Mikrobiologie
Carl-Neuberg-Straße 1
30625 Hannover
Tel.: +49-(0)-511-532-4655
Fax: +49-(0)-511-532-4355
www.dghm.org
bts (Biotechnologische Studenten
initiative e.V.)
c/o BIOCOM
Stralsunder Straße 58–59
13355 Berlin
Tel.: +49-(0)-2649-21-21
Fax: +49-(0)-2649-21-11
www.bts-ev.de
LABORWELT
c/o HZM – Deutsches
Forschungszentrum für
Gesundheit/Inst. of Developmental Genetics
Tel.: +49-(0)-89-3187-2610
Fax: +49-(0)-89-4620
www.gfgenetik.de
Deutsche Gesellschaft für
Neurogenetik
Institut für Humangenetik
Calwer Straße 7
72076 Tübingen
Tel.: +49-(0)-7071-2977692
Fax: +49-(0)-7071-295171
peter.bauer@
med.uni-tuebingen.de
www.hih-tuebingen.de/dgng/
Netzwerk Nutrigenomik
Netzwerk Nutrigenomik
Arthur-Scheunert-Allee 114
14558 Nuthetal
Tel.: +49-(0)-33200-88-301
Fax: +49-(0)-33200-88-541
mail@nutrigenomik.de
www.nutrigenomik.de
RNA-Netzwerk
c/o Prof. Dr. Volker A. Erdmann
Freie Universität Berlin
Thielallee 63, 14195 Berlin
Tel.: +49-(0)-30-8385 6002
Fax: +49-(0)-30-8385 6413
erdmann@chemie.fu-berlin.de
www.rna-network.com
FA Life Science Research im VDGH
c/o VDGH im VCI
Mainzer Landstraße 55
60329 Frankfurt am Main
Tel.: +49-(0)-69-2556-1730
Fax: +49-(0)-69-236650
vdgh@vdgh.de
www.vdgh.de
Österreichische
Reinraumgesellschaft (ÖRRG)
ÖRRG
Neudorf 41
A-8262 Ilz
Tel.: +43-(0)-3385-8117
Fax: +43-(0)-3385-8117
office@oerrg.at
www.oerrg.at
Österreichische Ges. f. Laboratoriums-
medizin & Klinische Chemie
ÖGLMKC Geschäftsstelle
Infomedica-KEG, Xenius Behal
Tullnertalgasse 72
A-1230 Wien
Tel./Fax: +43-(0)-1889-6238
office@oeglmkc.at
www.oeglmkc.at
10. Jahrgang | Nr. 4/2009 | 45
Service Produktwelt
Millipore
Anagnostics Bioanalysis
Millipore expandiert
in Zellbiologie
Weltweit erstes zylindrisches Microarray:
Neue Möglichkeiten für Multiplexed Assays
Nach der Akquisition von Guava Technologies
plant der global aktive Life Science-Anbieter
Millipore, in der Zellbiologie zu expandieren.
Dazu sollen Guavas kompakte MikrokapillarDurchflusszytometer mit Millipores breitem
Angebot an validierten Reagenzienkits kombiniert und an Zellbiologie-Labore verkauft
werden. Millipore und Guava integrieren dazu
Geräte, Reagenzienkits, validierte Protokolle
und technische Unterstützung. Millipore
plant, durch das Angebot optimierter Kits
für Stammzellforschung, Krebsbiologie, Zellgesundheit oder Biomarker-Forschung eine
Marktlücke in der Zellbiologie zu schließen,
wo bislang oft mit selbstentwickelten Kits gearbeitet wird. Zudem soll Guavas kompaktes
Tischgerät an Zelbiologie-Labore verkauft werden, die derzeit viele Flow Cytometer-Analysen
in zentralen Labors durchführen lassen. Die
Durchflusszytometrie ist eine leistungsfähige
Analysenmethode, die zur Messung von Änderungen in der Proteinexpression einzelner
Zellen eingesetzt wird.
Das Biotech-Start-up-Unternehmen Ana
gnostics Bioanalysis hat eine innovative, auf
Microarrays basierende Technologie entwickelt, die neue Möglichkeiten im Bereich der
„Multiplexed Assays“ eröffnet. Ein zylindrisches Array – die patentierte hybcell – ist das
Herzstück der Technologie. Die äußerst flexible
Arrayoberfläche erlaubt die Belegung mit Protein- oder DNS-Detektormolekülen. Je nach
Anforderung können die hybcells in beladener
und unbeladener Form geliefert werden.
Die vollautomatische Abarbeitung der Assays erfolgt im soganannten hyborg. Dieses
Analysengerät integriert das Probenhandling,
Thermocycler und Hybridierungsstation,
Laserfluoreszenz-Scanner sowie ein Reagenzienmodul.
Alle Parameter wie Zeit, Temperatur, Reagenzienfluss sind frei variierbar, was eine
höchstmögliche Flexibilität im Assaydesign
erlaubt. Eine Besonderheit ist die Möglichkeit
der kinetischen Messung. Diese ermöglicht
zum Beispiel die schnelle und vollautomatische Schmelzpunktbestimmung aller Oligonukleotide auf dem Array oder die Messung
der Off-Rate von Proteinen.
Durch die äußerst einfache Bedienung
und die große Flexibilität findet die hybcell-
Millipore Bioscience Division
78054 SaintQuentin-Yvelines Cedex
Tel.: +33-(0)1-3012-7037
ulrike_baer-chardot@millipore.com
Hochsensitiver RNANachweis mit neuem Kit
Mit dem Transcriptor One-Step RT-PCR Kit
bietet Roche Applied Science jetzt die bewährte Transcriptor Reverse Transcriptase im
One-Step-Format. Der neue Kit wurde für die
schnelle, sensitive und spezifische EndpunktRT-PCR-Analyse mittels genspezifischer Primer
auf Standard-Blockcyclern entwickelt. Mithilfe
thermostabiler Enzyme und einem innovativen
Hot-Start Puffer können sowohl schwierige
Templates wie GC-reiche RNA-Sequenzen als
auch lange Fragmente bis 6,5 kb umgeschrieben und zuverlässig amplifiziert werden. Mit
dem Zwei-Komponenten-Mastermix, der
bereits den Protector RNase-Inhibitor enthält,
spart der Anwender zudem Pipettierschritte
und damit Arbeitszeit.
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Straße 116
68305 Mannheim
Tel.: +49-(0)621-759-8568
Fax: +49-(0)621-759-4083
mannheim.biocheminfo@roche.com
46 | 10. Jahrgang | Nr. 4/2009
Technologie sowohl im Forschungsbereich
als auch in der klinischen Diagnostik ihre
Anwendung. Dezidierte Assays und Arrays
für beide Anwendungsbereiche sind derzeit
in Vorbereitung.
Anagnostics Bioanalysis GmbH
Hafenstraße 47-51
A-4020 Linz
Österreich
Tel.: +43-(0)732-9015-6080
info@anagnostics.com
www.anagnostics.com
CyBio
Intelligente Zeitplanung zur Optimierung der
Wirkstoffsuche mit dem CyBio® Scheduler
Die CyBio AG hat ihre Zeitplanungssoftware
CyBio® Scheduler zur Steuerung von Automatisierungsplattformen im Labor grundlegend
überarbeitet. Der Scheduler bedient verschiedenste Aufgaben, von der Automatisierung
von Abläufen und Laborgeräten bis hin zur
autonomen, vollautomatischen Steuerung
komplexer Laboranlagen.
Das System verfügt über einen leicht zu
bedienenden, übersichtlichen Arbeitsablauf
editor mit Drag-and-Drop-Unterstützung.
Zudem wurde ein Optimierungsverfahren
entwickelt, das für höchste Effizienz und
Zeitstabilität während der Ausführung sorgt.
Spezielle Zeitoptimierungsverfahren verringern den Einfluss von Temperaturänderungen,
Kristallisations- und Ausfällungseffekten
während der Ausführung der Assays.
Mit dem Plate Tracking-Modul verfügt die
CyBio® Scheduler-Software über eine besonders leistungsfähige Datenverwaltung. Dazu
gehören neben der Verwaltung der auszuführenden Arbeitsliste auch die Bereitstellung
aller mikroplattenspezifischen Informationen
wie Barcodes, Volumen und Lagerpositionen.
CyBio AG
Göschwitzer Str. 40
07745 Jena
Deutschland
Tel.: +49-(0)3641351-0
Fax: +49-(0)3641351-409
productinfo@cybio-ag.com
www.cybio-ag.com
LABORWELT
Service Produktwelt
Porvair
Genevac
Schnelle Konstruktion und Herstellung
von OEM-Mikrotestplatten
Der Mikroplattentechnologie-Spezialist Porvair
Sciences Ltd. hat einen nordamerikanischen
Chromatographie-Spezialisten bei der Entwicklung einer neuen Produktreihe unterstützt.
Durch Porvairs weitreichende Erfahrung bei der
OEM-Produktion von Mikrotestplatten sowie in
Chromatographie-Anwendungen konnte der
Kunde in gut sechs Wochen ein umfassendes
Sortiment an neuen Geräten zur Festphasenextraktion mit 96 und 48 Vertiefungen auf den
Markt bringen. Dabei stellte Porvair Services
im Rahmen des Vertrages kundenspezifische
Versionen der Microlute-Geräte zur Festphasenextraktion bereit. Die wichtigsten Kriterien für
die Lieferantenauswahl waren Porvairs nachweisliche Erfahrung in der Zusammenarbeit mit
Blue-Chip-Unternehmen sowie die Fähigkeit zur
Bereitstellung von Polypropylen-Verbrauchsprodukten, die garantiert frei von Auslaugungen
und extrahierbaren Stoffen sind – ein entscheidender Punkt in der LC-MS-Analyse.Ermutigt
vom Erfolg der ersten Zusammenarbeit beschloss das Chromatographie-Unternehmen, in
Zusammenarbeit mit Porvair eine eigene Reihe
an Polypropylenplatten mit großen Vertiefungen am Markt einzuführen.
Porvair ist aufgrund zahlreicher Patente zur
Herstellung von Mikrotestplatten Marktführer
beim Formen ultrareiner Kunststoffmaterialien
wie zum Beispiel Polystyren, Polypropylen und
Polykarbonat. Expertise besteht zum Beispiel
beim Überschallschweißen von Polymeren, in
der Plasmaoberflächenbehandlung, beim Cosintern von Polymeren bzw. Kieselerden und
dem Spritzgießen mit Zeitversatz.
Porvair Sciences Ltd.
Dorset House, Regent Park, 267 Kington
Rd, Leatherhead, GB
Surrey KT22 7 PL
sknight@porvair-sciences.com
www.porvair-sciences.com
SFR Shake Flask Reader – Sauerstoff- und
pH-Messungen in Schüttelkolben
LABORWELT
Die Genevac Ltd. hat eine neue Option zur
Steigerung der Effizienz bei der Trocknung
von Proben für ihre Zentrifugalevaporatoren
HT-4X, HT-8, HT-12 und HT-24 vorgestellt.
„Auto-Defrost and Drain“ ermöglicht neben
dem automatischen Ausleiten flüchtiger
Lösungsmittel aus dem Kondenser auch
die vollständige Enteisung und Spülung des
Systems und kann dadurch ohne AnwenderEingrif f durchgeführ t werden. Dadurch
werden die zuerst abdampfenden, flüchtigen Lösungsmittel im Kondenser gesammelt und können leicht entfernt werden.
Genevac Ltd.
Farthing Road
Ipswich, Suffolk, IP1 5AP - UK
Tel.: +44-(0)1473 240000
salesinfo@genevac.co.uk
PreSens
Ein neues System für das Messen von Sauerstoff und pH-Werten in Schüttelkolben hat
die Presens GmbH vorgestellt. Der mit fast
allen Standardschüttlern kompatible SFR –
Shake Flask Reader misst schnell, präzise und
parallel in bis zu neun Schüttelkolben, wie
bei der mikrobiellen Kultivierung und bei
Zellkulturen genutzt. Das drahtlose System
misst on-line, nicht-invasiv durch den transparenten Boden des Kolbens. Die Lumineszenz
der eingefärbten Sensoren wird durch das
SFR angeregt. Seine Software visualisiert
in Echtzeit den Sauerstoff- und pH-Verlauf
während der gesamten Kultivierung. Die Ergebnisse werden in verschiedenen grafischen
Darstellungen am Bildschirm sichtbar und
ermöglichen somit den sofortigen Vergleich
unterschiedlicher Kultivierungen. Das Gerät
überzeugt durch einen zuverlässigen Abgleich
der Messergebnisse. Alle Messdaten können
nach Excel oder ASCII für weitere Auswertungen exportiert werden.
Es sind Kolben von 125 ml bis 2.000 ml
erhältlich. Die Plastikkolben enthalten vor-
Neue
Abtrennungsoption
kalibrierte Sauerstoff- und pH-Sensoren. Sie
sind gebrauchsfertig für die Kalibrierung. Die
Glaskolben sind mit autoklavierbaren Sauerstoffsensoren bestückt. Detailinformation
unter www.PreSens.de/sfr.
PreSens Precision Sensing GmbH
Josef-Engert-Str. 11, 93053 Regensburg
Tel.: +49 941 942 72 109
nathalie.voelkel@presens.de
www.PreSens.de
PromoCell
Große Auswahl an
zellbasierten Assays
PromoKine bietet in seinem aktuellen Zellbiologie-Katalog eine Vielzahl fluorometrischer,
kolorimetrischer und biolumineszenter Kits
und Reagenzien zum sensitiven Nachweis der
Zellviabilität, Zytotoxizität, Signaltransduktion,
Seneszenz, Zellstress und Zellmetabolismus
an. Ein breites Sortiment an Apoptose-Kits
(z. B. zur Detektion und Quantifizierung von
Caspase- und Kinase-Aktivität, Annexin VBindung, DNA-Fragmentierung) sowie zellbasierter Reportergen-Assays (GFP, β-Gal, Luziferase) steht ebenfalls zur Verfügung. Zahlreiche
Fluoreszenzfarbstoffe und Kits zum Anfärben
von Zellstrukturen, zum Nachweis zellulärer
Prozesse und Markieren von Biomolekülen
(Proteine, Antikörper, Nukleinsäuren) ergänzen
PromoKines Angebot an zellbasierten Assays.
Weiterhin finden sich im neuen PromoKineKatalog Transfektionsreagenzien, Kits und
Reagenzien zur Klonierung, Expression und
Repression von Genen, Klonierungs-, Expressions- und Reporterplasmide, primäre und
sekundäre Antikörper, rekombinante Proteine
(z. B. Zytokine, Kinasen), ELISA-Kits sowie Produkte zum Nachweis und zur Eliminierung von
Mykoplasmen. Kostenloses Katalogexemplar
anfordern – oder pdf-Version herunterladen
unter www.promokine.info/catalog.
PromoCell GmbH
Tel.: +49 6221 649 34 0
info@promokine.info
www. promokine.info
10. Jahrgang | Nr. 4/2009 | 47
Service Produktwelt
Bioscan
Velocity
Selbstlernender Direct Drive Robot erhöht
Produktivität und spart Zeit
Neue Systeme für die
Blutgas-Analyse
Der Automationsspezialist Velocity11 hat
unlängst ein neues Produkt zur Erhöhung der
Produktivität und zur Kostensenkung im Labor
präsentiert, den Direct Drive Robot (DDR). Das
kompakte System nutzt die konfigurierbare ZBewegungstechnik für eine höhere Reichweite
und damit höhere Stapelkapazität von Geräten
sowie eine verbesserte Funktionalität. Das System lässt sich mit einem einzigen Knopfdruck
rasch konfigurieren.
Im Teaching-Modus und bei Verwendung
der Teaching-Funktion kann der Roboter mit
der Hand einfach zu jedem Ort im System
bewegt werden. Einmal in der richtigen
Position, wird der Knopf an der Greifhand gedrückt und durch Aufleuchten des TeachingLichtes wird signalisiert, dass die Position
einprogrammiert ist. Die Bedienung des
System der Agilent-Tochter erfordert nicht
länger den Einsatz eines Joysticks, um den
Arm in Position zu bringen – deshalb wird
weniger Zeit für die Repositionierung und
Feinabstimmung benötigt, und neue Geräte
können schnell über den Roboter in das System integriert werden. Zwei neue Blutanalysesysteme für den geringen bis mittleren Durchsatz hat Siemens
Healthcare auf den Markt gebracht. Die mit
LIMS- und Krankenhaussystem-Schnittstellen
ausgestatteten, tragbaren RapidPoint 340und RapidPoint 350-Systeme messen den
Blut-pH des Blutes sowie Sauerstoff und
Kohlendioxid in Volumina von 75-120 µl. Mit
RapidPoint 350 lassen sich zusätzlich die
Elektrolyte Na+, K+, Ca2+, Cl – sowie der Hämatokritwert bestimmen.
Siemens AG _ DX Division
Henkestr. 127
91052 Erlangen
Tel.: +49-(0)9131-84-3292
marion.bludszuweit@siemens.com
Bioscan
Agilent Automation Solutions Uglitscher Str. 8
65510 Idstein Tel.: +49-(0)151-1555-9934 anthony.zerlin@agilent.com
Waters
Schnelles Massenspektrometer der nächsten
Generation
Die Waters Corporation hat ein neues Massenspektrometer vorgestellt. Das Waters®
SYNAPT™ G2-System nutzt die neue QuanTof™Technologie sowie eine erweiterte High
Definition MS™ Technologie. Qualitative und
quantitative Quadrupol-Time-of-Flight MS-
Analysen werden damit leistungsfähiger zum
Beispiel für Anwendungen in der Biopharmazie, Metabolom- oder Proteomforschung, bei
Biomarkerstudien sowie in Anwendungen im
Lebensmittel- und Umweltbereich. Das SYNAPT G2 System bietet neben einer Auflösung
von mehr als 40.000 FWHM eine sehr hohe
Empfindlichkeit, Datenerfassungsraten von
20 Spektren/Sekunde, massengenaue Daten
(RMS 1 ppm) und einen dynamischen Bereich
über fünf Größenordnungen. Das SYNAPT G2Massenspektrometer nutzt, wenn es mit der
ACQUITY® UltraPerformance LC®-Technologie
(UPLC®) von Waters kombiniert wird, die Leistungsfähigkeit und Geschwindigkeit der UPLC
voll aus und überzeugt gegenüber anderen LC/
MS- und LC/MS/MS-Systemen. Waters wird die
ersten SYNAPT G2-Geräte voraussichtlich im
Herbst 2009 ausliefern.
Waters GmbH
Marketing Communications Specialist
Central Europe
Julia Conrad
Hellfmann-Park 10
65760 Eschborn
Julia–conrad@waters.de
48 | 10. Jahrgang | Nr. 4/2009
Translationales PET-,
SPECT- and CT-imaging
Die proprietären PET-, SPECT- und CT-Technologien, die in die neuen NanoPET/CT- und NanoSPECT/CT-Imager von Bioscan eingebettet
wurden, bieten mit picomolarer Sensitivität
und nanomolarer Auflösung Einblicke in das
biologische Geschehen komplexer lebender
Organismen – ob Maussystem oder Großtiermodell, die quantitativen Imaging-Lösungen
empfehlen sich für Forschung am Übergang
der Präklinik zu klinischen Studien.
BioScan Europe Ltd.
ZAC Croix St Nicolas
1 rue de Lorraine, BAT. L´Eden ALBV
Tel./Fax: +33-(0)383-636-267
mguillemin@bioscan.com
www.bioscan.com
LABORWELT
Service Kalender
August 2009-Oktober 2009
Veranstaltungskalender
28.-30.09.09
German Conference on Bioinformatics 2009,
Halle/Saale
Info: Kathleen Kletsch, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
(E-Mail: gcb@informatik.uni-halle.de,
Web: www.gcb2009.de)
29.08.-01.09.09
EMBO Meeting 2009, Amsterdam
Info: EMBO (Tel.: +49-6221-8891-108,
E-Mail: communications@embo.org,
Web: www.embo.org)
07.-12.09.09
Medical Physics and Biomedical Engineering
– World Congress 2009, München
Info: VDE/DGMBT (Web: www.wc2009.org)
10.-11.09.09
1. bionisches Symbiosium, Saarbrücken
Info: Wolfgang Pfeifer, bionic engineering
network BEN e.V.,
(E-Mail: w.pfeifer@b-e-n.eu,
Web: www.b-e-n.eu)
06.-08. Oktober 2009
BIOTECHNICA, Hannover
Unter dem Motto „Turning ideas into value“ diskutieren und informieren Experten,
hochkarätige Referenten und Investoren
im Rahmen der derzeit größten europäisch
ausgerichteten Biotechnologie-KongressMesse in Hannover über aktuelle Produkte,
Innovationen, Forschungsergebnisse und
Marktchancen. Info: www.biotechnica.de.
20.-24.09.09
ECCO 15 – 34th ESMO Multidiscplinary
Congress, Berlin
Info: (Web: www.ecco-org.eu)
24. – 25. September 2009
Structural Systems Biology
Zum „1st International Symposium on Structural Systems Biology“ treffen sich führende Strukturforscher in Hamburg. Thematisch liegt der Fokus auf Neuerungen in der
Röntgenkristallographie, Elektronenmikroskopie, Zell- und Molekularbiologie. Info:
www.conventus.de/cssb2009.
13.-16.09.09
2nd European Congress of Immunology,Berlin
Info: European Federation of Immunological
Societies (efis)
(E-Mail: eci2009registration@kit-group.org,
Web: www.eci-berlin2009.com)
16.09.09
Innovationsforum: Personalisierte Medizin –
wirtschaftliche Chancen der Gendiagnostik,
Frankfurt am Main
Info: (Web: www.hessen-biotech.de)
LABORWELT
20.-23.09.09
2 nd German-French DNA Repair Meeting,
Konstanz
Info: Ges. für DNA-Reparaturforschung/
Société Française de Toxicologie Génétique
(Web: www.dna-rep-net.de)
28.-30.09.09
Nanotech Europe 2009, Berlin
Info: Maria Sipilä
(E-Mail: maria.sipila@spinverse.com,
Web: www.nanotech.net)
05.-06.10.09
7 th Symposium on Text Mining in Life
Sciences, Bonn
Info: Prof. Dr. Martin Hofmann-Apitius,
SCAI Fraunhofer,
(E-Mail: textmining-symposium@scai.
fraunhofer.de, Web: www.scai.fraunhofer.de)
06.-08.10.09
BIOTECHNICA 2009, Hannover
Info: Deutsche Messe AG
(Web: www.biotechnica.de)
07.-10.10.09
6. Jahrestagung der Deutschen Vereinten
Gesellschaft für Klinische Chemie und
Laboratoriumsmedizin (DGKL), Leipzig
Info: Claudia Mittelbach, Conventus
(E-Mail: claudia.mittelbach@conventus.de,
Web: www.conventus.de/dgkl2009)
20.-23.09.09
61. Jahrestagung der DGHM, Göttingen
Info: Martin Singer, Conventus
(E-Mail: dghm2009@conventus.de,
Web: www.dghm2009.de)
21.-23.09.09
1. Jahrestagung der ÖGMBT, Innsbruck
Info: Jacob Troppmair, Medical University
Innsbruck (Web: www.oegmbt.at)
24.-25.09.09
Structural Systems Biology, Hamburg
Info: Prof. Dr. Dirk Heinz, HZI Hamburg
(E-Mail: Dirk.Heinz@helmholtz-hzi.de,
Web: www.conventus.de/cssb2009)
27.-30.09.09
Molecular Biology of Fungi, Münster
Info: Paul Tudzynski, Universität Münster
(E-Mail: tudzyns@uni-muenster.de,
Web: www.uni-muenster.de/MBF2009)
26. – 28. Oktober 2009, Berlin
Immunogenität b. Biologicals
Die Minimierung unerwünschter Immunreaktionen steht im Fokus des Meetings
„Immunigenität bei Biopharmazeutika“
– Branchenexperten aus Firmen, Forschung
und Zulassungsbehörden erörtern die analytische Methodik, Sicherheitsprofile und
Zulassung: www.immunogenitaet.de.
10. Jahrgang | Nr. 4/2009 | 49
Ausblick
Qualitätsparameter
für gute Wissenschaft
Thomas Gabrielczyk
Hochschul- und Wissenschaftler-Rankings erfreuen sich großer Beliebtheit – jeder liest sie gerne
und stöbert darin nach sich und anderen Gruppen. Allerdings sind die Statistiken oft nicht ausreichend belastbar, ihre Bewertungsparameter und Datenbasis durchaus in der Kritik. Daher gibt es
zahlreiche Vorschläge, die Datenbasis und Kriterien zur Bewertung wissenschaftlicher Leistungen
anhand der wissenschaftlichen Publikationen zu verbessern, Parameter für gute Wissenschaft zu
etablieren sowie Plagiatoren zu enttarnen, zum Beispiel via fraktionellem Zählen von Referenzen.
Als bibliometrischer Standard galt jahrelang die umfassende Datensammlung von ThomsonReuters (ISI Web of Science). Doch längst haben Anbieter wie Elsevier mit ihrer Scopus-Datenbank
das einstige Monopol gebrochen. Im Juni startete ein ambitioniertes Projekt im Auftrag des BMBF:
Von Forschern des Bonner Instituts für Forschungsinformation und Qualitätssicherung (iFQ), die
schon die Exzellenzinitiative evaluiert haben, wird jetzt federführend eine Datenbank mit eigenen Bewertungsparametern aufgebaut. Ziel des neuen „Kompetenzzentrums Bibliometrie“: Die
Leistungen der deutschen Forscher sollen besser evaluiert, Topforscher leichter erkannt und der
Erfolg von Forschungsprogrammen kritisch überprüft werden können.
Das Ergebnis des mit 6 Mio. Euro vom Bundesforschungsministerium geförderten Projektes
ist gleichermaßen für die Forschungsförderer
als auch die Forschungsgruppen selbst interessant – orientiert sich doch die Vergabe von
Fördermitteln, Evaluation ganzer Institute
und Ausrichtung der Forschungspolitik nach
Abschluss des Projektes 2012 an den neuen
Parametern.
Publikationen made in Germany
In den ersten zwei Jahren etablieren die Bibliometrie-Experten am Bonner iFQ eine In-HouseDatenbank auf Basis der Scopus-Datenbank
(Elsevier) sowie relevanten Teilen des Web of
Science (Thomson Reuters), in denen rund 35%
aller Einträge auf Life Sciences und Medizin
entfallen. Darauf aufbauend wollen die iFQForscher Qualitätskontrollen, Fehlerlehren und
komplexere Indikatoren sowie einen Index mit
bis zu 150.000 Suchbegriffen entwickeln. Korrekturen, Ergänzungen und Verknüpfungen mit
anderen Datenbeständen sollen den Datenbestand speziell für die Anwendung auf deutsche
Forschungsteams optimieren.
Stehen die technische Infrastruktur und
der Datenbestand erst einmal, sollen konkrete
Fragestellungen untersucht werden. Forschungspolitisch interessant: Wo entwickeln
sich Karrieren von Forscherinnen, wer arbeitet
mit wem zusammen, wie wirken Fördermaßnahmen, wie unterscheiden sich Topforscher
von guten Forschern und welche Publikationsstrategien verfolgen sie, aber auch: wer spielt
sich gegenseitig Bälle zu? Spannend dabei: Es
soll auch versucht werden, die Qualität von
Einzelpublikationen anhand von Parametern
zu bewerten.
Das Konsortium wird vom Institut für Forschungsinformation und Qualitätssicherung
(iFQ) geleitet und arbeitet mit dem FraunhoferInstitut für System- und Innovationsforschung
(ISI), dem Institut für Wissenschafts- und Technikforschung (IWT) der Universität Bielefeld
und dem Fachinformationszentrum Karlsruhe
(FIZ) zusammen.
Impressum
LABORWELT (ISSN 1611-0854)
erscheint zweimonatlich im
BIOCOM Verlag GmbH
Stralsunder Straße 58–59
13355 Berlin, Germany
Tel./Fax: 030/264921-0 / 030/264921-11
laborwelt@biocom.de
www.biocom.de
Redaktion
Dipl.-Biol. Thomas Gabrielczyk
Tel.: 030/264921-50
Anzeigenleitung
Oliver Schnell
Tel. 030/264921-45,
o.schnell@biocom.de
50 | 10. Jahrgang | Nr. 4/2009
Inserentenverzeichnis
Agowa GmbH…………………………………………… 29
Beckman Coulter GmbH…………………………… 31
BIOCOM Projektmanagement GmbH… ……11
BIOCOM AG… ………………………………………… 23,25
BioGenes GmbH… ……………………………………… 19
BIO-NRW…………………………………………………………9
BioSpring GmbH………………………………………… 17
Deutsche Messe AG…………………………………… 13
EBD Group, BioEurope… …………………………… U3
Eurofins MWG GmbH…………………………………… 7
Febit Holding GmbH… ……………………………… 15
Merck Chemicals Ltd.………………………………… 21
New England Biolabs GmbH… ……………… U4
PerkinElmer… ……………………………………………… U2
Porvair Science Ltd.… ………………………………… 25
Thermo Fisher Sicentific…………………………… 5
Tecan GmbH………………………………………………… 27
Vorschau Heft 5/2009
Thema
Krebs & Signalwege
Seit Paul Ehrlich das Konzept der „Magic
Bullet“ vorstellte, hat sich in der Krebsforschung vieles bewegt, ein allgemeiner
Therapieansatz ist aber nicht in Sicht. Der
molekularbiologische Fortschritt eröffnet
aber den lange benötigten Einblick in die
relevanten Krebs- und MetastasierungsSignalwege. Das LABORWELT-Themenheft
„Krebs & Signalwege“ berichtet über Fortschritte des Cancer Genome Projects, beleuchtet wie die Metabolom-Forschung zu
neuen Therapien führt und informiert über
das Auffinden neuer Proteintargets mit
nicht-invasiven Imaging- und zellbasierten
in vitro-Strategien.
Marktübersicht: PCR
Leserservice
Angelika Werner
Tel. 030/264921-40
Bildtechnik und Layout
Heiko Fritz
Graphik-Design
Michaela Reblin
Druck:
Druckhaus Humburg GmbH, 28325 Bremen
Für einen regelmäßigen Bezug von LABORWELT
ist eine kostenlose Registrierung unter www.
biocom.de oder per Fax erforderlich. Namentlich
gekennzeichnete Beiträge stehen in der
inhaltlichen Verantwortung der Autoren.
Alle Beiträge sind urheberrechtlich geschützt.
Ohne schriftliche Genehmigung des BIOCOM
Verlages darf kein Teil in irgendeiner Form
reproduziert oder mit elektronischen Systemen
verarbeitet, vervielfältigt oder verbreitet werden.
Diese Ausgabe enthält eine Verlagsbeilage.
Die Druckauflage von 20 000 Exemplaren ist IVW geprüft (Stand I/09):
© BIOCOM Verlag GmbH, Berlin
® BIOCOM ist eine geschützte Marke der
BIOCOM AG, Berlin
BIOCOM
Werbekunden bietet diese Ausgabe mit einer
garantierten Auflage von 20.000 Exemplaren
(IVW-geprüft) eine optimale Plattform
für ihre Produkt- und Imageanzeigen.
Reservieren Sie Ihren Werbeplatz in der
LABORWELT-Themenausgabe bis spätestens
zum 11. September 2009. Ergänzend zu dem
Themenschwerpunkt veröffentlichen wir
eine Marktübersicht „PCR“. Informationen
zu Ihrer möglichen Teilnahme gibt Oliver
Schnell (Tel.: +49-30-264921-45, eMail:
o.schnell@biocom.de).
LABORWELT
Building Value Through ParTnershiPs
BIO-EurOpE
15TH ANNUAL INTERNATIONAL
PARTNERING CONFERENCE
2009
November 2–4, 2009
vieNNa, austria
messe WieN exhibitioN & CoNgress CeNter
BIO-Europe is Europe’s largest partnering conference, serving the global biotechnology
industry. The conference annually attracts international leaders from biotech, pharma and
finance along with the most promising start-ups and emerging companies. It is the “must
attend” event for getting business done in the biotech industry.
For further information, please view our conference website at
www.ebdgroup.com/bioeurope
© 2009 EBD Group AG
Background image © Wien Tourismus/MAXUM
Register
t 31
before Augus
to save
200 euro!
Innovative Discovery Tools for Signal Transduction Research
COX IV (top)
Phospho-p44/42 MAPK (bottom)
AMPKb1/2 (top)
Phospho-NF-kB p65 (bottom)
Phospho-Akt (top)
Phospho-S6 (bottom)
Akt (top)
LC3B (bottom)
Cleaved Caspase-3 (top)
Phospho-Histone H3 (bottom)
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© 2009 Cell Signaling Technology, Inc. / DRAQ5® is a registered trademark of Biostatus Limited. / Alexa Fluor® is a registered trademark of Molecular Probes, Inc. /
Selected Rabbit Monoclonals are produced under license (granting certain rights, including those under U.S. Patent Nos. 5,675,063 and 7,429,487) from Epitomics, Inc.
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