Whitepaper Komplementtests mit Dynex DS2

validierung VON komplement ELISA-TESTS AUF DEM DS2
AUTOMATISIERUNG UND VALIDIERUNG
VON KOMPLEMENT ELISA-TESTS AUF DEM DS2-GERÄT VON DYNEX
KLASSISCHER WEG / AlternativeR WEG / LeKtin-WEG
Dr. Kristel Boonen,
General Clinical Laboratory, Catharina Hospital, Eindhoven, Niederlande
in Zusammenarbeit mit Euro Diagnostica, BV, Nijmegen, Niederlande.
DeZEMBER 2012
ABSTRACT
Dieser Artikel beschreibt die Validierung von ELISA-Tests
für die Gesamt-Komplement-Aktivität auf dem DS2 ELISAProzessor. Euro Diagnostica hat zur funktionellen Beurteilung
der drei verschiedenen Wege des Komplement-Systems
diagnostische Tests entwickelt. Diese funktionellen Tests
sind im ELISA-Format erhältlich.
Seit 2011 ist Euro Diagnostica Partner von Dynex und adaptiert alle ELISA-Tests auf die Dynex Automaten-Systeme DSX
und DS2. Dr. Kristel Boonen aus dem Klinischen Zentrallabor
des Catharina-Krankenhauses Eindhoven hat eine Validierung
von drei Komplement ELISA-Tests (klassischer, alternativer
und Lektin-Weg) des Herstellers Euro Diagnostica auf dem
DS2 System durchgeführt.
Die Validierung zeigt, dass die ELISA-Tests auf dem DS2 den
Anforderungen hinsichtlich Reproduzierbarkeit, Übereinstimmung mit anderen Tests sowie der Linearität entsprechen. Die
Tests laufen nun in der Routine, nachdem die Kliniker über die
geänderten Referenzwerte informiert wurden.
EINFÜHRUNG
Frau Dr. Kristel Boonen ist klinische Chemikerin in der
Ausbildung am Zentrallabor des Catharina-Krankenhauses
in Eindhoven. Es handelt sich hierbei um ein Peripherie-Krankenhaus mit starker regionaler Bedeutung im Südosten der
Niederlande. Rund 100 Personen arbeiten in diesem Labor;
neben anderen Gebieten ist es in den Bereichen Klinische
Chemie, Hämatologie und Immunologie tätig. In der Sparte
Immunologie wird eine ganze Reihe von Tests eingesetzt,
wie z.B. ANA, ENA, anti-CCP und anti-tTG Test. Verwendete
Methoden sind ImmunoCAP (Phadia), Immunfluoreszenz und
ELISA. Zur Durchführung von ELISAs wird das DS2 System von
Dynex eingesetzt.
Funktionelle Komplement-Tests ließ man früher außer Haus
durchführen, aber in 2011 beschloss die Laborleitung, die
Möglichkeit der Durchführung im eigenen Labor zu untersuchen. Die Vorgaben waren Kosteneffizienz und die Möglichkeit der Automatisierung auf dem DS2. Weiterhin mußte die
Reproduzierbarkeit, die Übereinstimmung mit anderen Tests
sowie die Linearität akzeptabel sein.
Das Euro Diagnostica Komplement-Testsystem setzt sich
zusammen aus der funktionellen Beurteilung aller drei Wege
im einfachen und genauen ELISA-Format. Die Beurteilung der
drei Wege (klassisch, alternativ und Lektin) kann mit separaten ELISA-Kits oder in einem kombinierten Testkit erfolgen.
Euro Diagnostica hat als Partner von Dynex alle ELISA-Tests
für die Nutzung auf der DSX- und DS2-Plattform harmonisiert.
Die Euro Diagnostica Komplement ELISA-Tests gewinnen
an Popularität in den Niederlanden und immer mehr Laboratorien beginnen diese Tests automatisiert einzusetzen. Die
Gründe hierfür sind kürzere Durchführungszeiten, verbesserte
Verlässlichkeit und Reproduzierbarkeit, die direkte Weitergabe
der Informationen in das LIS-System sowie Kostenersparnis.
Die interne Kostenanalyse des Catharina-Krankenhauses
zeigte Einsparungen bei der Durchführung der KomplementTestung im Hause – daher entschloss man sich zur
Validierung der Tests.
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validierung VON komplement ELISA-TESTS AUF DEM DS2
VALIDIERUNG
VERGLEICH
Die Ergebnisse, der an das Sanquin Labor in Amsterdam
gesendeten Proben, wurden verglichen mit den Ergebnissen
der ELISA-Tests, die auf dem DS2 durchgeführt wurden.
Bei Sanquin wird die Aktivität des alternativen (AP50) und ­
des klassischen (CH50) Weges mit markierten Kaninchenund Schaf-Erythrozyten gemessen. Die freigesetzte
Markier­ung wird gemessen und sie verhält sich linear zur
Komplement-­Aktivität. Mannose-bindendes Lektin (MBL)
wird in einem ELISA quantitativ gemessen (mg/l).
Bei den Euro Diagnostica ELISA-Tests sind die Wells der
Mikrotiterplatten-Streifen mit spezifischen Aktivatoren des
klassischen, Lektin- oder alternativen Weges beschichtet.
Das Patientenserum wird mit Inhibitoren-haltigen Puffern
verdünnt, um sicherzustellen, daß nur der jeweilige Weg aktiviert wird. Während der Inkubation des Patientenserums wird
das Komplement durch die spezifische Beschichtung aktiviert.
Abschließend wird das Neoepitop von C5b-9 nachgewiesen.
Die Menge dieses generierten Epitopes ist proportional zur
funktionellen Aktivität des Komplement Weges, das Ergebnis
wird als Verhältnis zur Positivkontrolle berechnet.
Tabelle 1 zeigt den Vergleich von 19 Proben, getestet für den
klassischen Weg (CP), 17 Proben für den alternativen Weg
(AP) und 15 Proben für den Lektin-Weg (MP). Die Klassifikation der Ergebnisse (defizient versus nicht-defizient) ist
für den größten Teil aller drei Tests übereinstimmend. Des
weiteren wurden 6 Proben der Dutch Foundation for Quality
Assessment in Medical Laboratories (SKML) getestet und mit
den Konsensus-Ergebnissen der SKML verglichen. Trotz eines
negativen Trends bei den höheren Werten war die Klassifikation der Proben gleichwertig.
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Tabelle 1: Klassifikation der Ergebnisse
(defizient vs normal)
AP
Normal (alt)
Defizient (alt)
Normal (Wieslab)
17
0
Defizient (Wieslab)
0
0
CP
Normal (alt)
Defizient (alt)
Normal (Wieslab)
17
0
Defizient (Wieslab)
1
1
MP
Normal (alt)
Defizient (alt)
Normal (Wieslab)
9
3
Defizient (Wieslab)
0
3
Reproduzierbarkeit
Die Proben wurden als Intra- und Inter-Assay Duplikate
gemessen. Der Variationskoeffizient (VK) wird aus der
Komplement-Aktivität der Inter-Assay-Ergebnisse und
den OD-Werten der Intra-Assay-Ergebnisse berechnet.
Tabelle 2 zeigt die erhaltenen Ergebnisse. Die durchschnittlichen VK-Werte entsprachen den vorgegebenen
Kriterien. Es gab einige relativ hohe VK-Werte bei dem
Inter-Assay-Lauf, dennoch zeigten diese Proben gleiche
Klassifikationen (defizient/nicht-defizient).
Tabelle 2: Intra-Assay- und Inter-Assay VKs
Inter-Assay VK
durchschnittl. und (max)
Intra-Assay VK
durchschnittl. und (max)
CP
10% (17%)
1% (2%)
AP
4% (8%)
2% (6%)
MP
6% (25%)
2% (5%)
Linearität
Abbildung 1: Linearität der drei Komplement-Wege
Zur Untersuchung der Linearität aller drei Wege wurde eine
Probe mit normaler Komplement-Aktivität mit inaktiviertem
Serum verdünnt. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in
Abbildung 1 gezeigt. Alle Wege zeigen partiell eine Linearität
bis zu einem bestimmten Punkt, an dem wahrscheinlich einige
Komponenten der Wege verbraucht sind.
Gemessen
Erwartet
CP50 run 4
Gemessen
Die ELISA-Tests für alle drei Komplementwege, die auf dem
DS2 durchgeführt wurden, zeigten akzeptable Ergebnisse
bezüglich der Reproduzierbarkeit, der Übereinstimmung mit
anderen Tests sowie eine Linearität. Um diese Tests in der
täglichen Laborroutine anwenden zu können, wurden die
Kliniker von den Mitarbeitern der Klinischen Chemie über die
geänderten Referenzwerte informiert. Die Tests laufen nun
seit mehreren Monaten zur Zufriedenheit des Personals, der
Verantwortlichen der Klinischen Chemie, der Laborleitung
und der Kliniker.
AP50 run 4
Erwartet
MBL
Gemessen
ZUSAMMENFASSUNG
AP = Alternativer Weg
CP = Klassischer Weg
MBL = Lektin-Weg
Erwartet
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validierung VON komplement ELISA-TESTS AUF DEM DS2
VERANTWORTLICHE PERSONEN
Dr. K.J.M. Boonen
Klinisch Chemicus i.o.
Catharina Ziekenhuis
Algemeen Klinisch Laboratorium
Michelangelolaan 2
5623 EJ Eindhoven
Niederlande
kristel.boonen@cze.nl
Dr. J. Curvers
Klinisch Chemicus
Catharina Ziekenhuis
Algemeen Klinisch Laboratorium
Michelangelolaan 2
4523 EJ Einhoven
Niederlande
joyce.curvers@cze.nl
Dr. V. Scharnhorst
Klinisch Chemicus
Catharina Ziekenhuis
Algemeen Klinisch Laboratorium
Michelangelolaan 2
5623 EJ Eindhoven
Niederlande
volkher.scharnhorst@cze.nl
Dr. Yngve Sommarin
R&D Director
Euro Diagnostica AB
P.O. Box 50117
Lundavägen 151
SE-202 11 Malmö
Schweden
yngve.sommarin@eurodiagnostica.com
EURO DIAGNOSTICA
Euro Diagnostica bietet automatisierte Lösungen für die Untersuchung und Diagnose
von Autoimmun-Erkrankungen an. Unsere diagnostischen Testkits und Reagenzien
sind für die automatisierten Dynex-Systeme harmonisiert und außerdem auf der
Mehrzahl im Markt erhältlichen Instrumentenplattformen weltweit verfügbar. Unsere
Tests werden für die Bereiche klinische Autoimmunologie, Mikrobiologie und Immunchemie entwickelt. Dank der langjährigen Erfahrung und der kontinuierlichen
Weiterentwicklung unseres Personals wie der Produktionsprozesse bietet Euro
Diagnostica zudem einen hochwertigen, kosteneffizienten Beschichtungsservice im
Kundenauftrag an.
Unser hauseigenes Service-Labor, Wieslab Laboratory Services, ermöglicht durch
qualifizierte Diagnostik-Spezialisten die klinische Testung und Bewertung von
Erkrankungen auf dem Gebiet Autoimmunität - an jedem Tag des Jahres. Wieslab
Laboratory Services bietet ein umfassendes Angebot von Einzel- und Panel-Tests und
gewährleistet genaue und schnelle Ergebnisse. Testungen hinsichtlich der meisten
Autoimmun-Erkrankungen sind verfügbar.
LITERATUR
Chen M, Daha MR, Kallenberg CGM. The complement system in systemic autoimmune disease. J Autoimmunity, 34 (2009), J276-J286
Seelen MA, Roos A, Wieslander J et al. Functional analysis of the classical, alternative, and MBL pathways of the complement system:
standardization and validation of a simple ELISA. J Immunol Meth 296 (2005), 187-198
Sjöholm AG, Jönsson G, Braconier JH et al. Complement deficiency and disease: An Update. Mol Immunol 43 (2006), 78-85
Euro Diagnostica. A unique diagnostic solution for functional assessment of the complement system. E-028-BG00
Euro Diagnostica. All-in-one Diagnostic Solution. E-025-GB-00
Doc No: E-066-DE00, Februar 2013
Euro Diagnostica AB
Vita Diagnostika GmbH
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