Haltungsbedingungen für Zebrabärblinge - EuFishBioMed

Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed
Haltungsbedingungen
für Zebrabärblinge
Stand:
September 2014
Langflossige Zebra- und Tüpfelstämme des Zebrabärblings
Foto: R. Schorner, MPI f. Neurobiologie
1
Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed
Inhalt
1.
Synopsis .................................................................................................... 3
2.
Zebrabärblinge als experimentelle Modelle ............................................... 4
3.
Die Biologie des Zebrabärblings (Danio rerio) ........................................... 5
4.
Haltung, Züchtung und Fütterung ............................................................ 11
4.1
Aquariensysteme, Wasser, Temperatur, Licht ......................................... 11
4.2
Besatzdichten .......................................................................................... 13
5.
Anästhesie und Euthanasie ..................................................................... 15
6.
Krankheitsprophylaxe .............................................................................. 17
7.
Autoren .................................................................................................... 18
2
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1.
Synopsis
Fisch-Modelle haben in den vergangenen Jahrzehnten für die biomedizinische
Forschung zunehmend an Bedeutung gewonnen. Insbesondere die TeleostierSpezies Zebrabärbling (Danio rerio) hat sich zu einem unverzichtbaren Modellsystem
für die Untersuchung von Genfunktionen in der biomedizinischen Forschung
entwickelt. Ihre Verfügbarkeit für eine zukunftsorientierte Genetik, insbesondere ihre
geringe Körpergröße, die Transparenz ihrer Embryos und deren extra-uterine
Entwicklung macht sie zu idealen Systemen für systematische Untersuchungen von
Entwicklungsprozessen. Inzwischen ist es offensichtlich, dass diese Fischart für die
biomedizinische Forschung eine Vielzahl von Krankheitsmodellen bereithält, die das
Studium pathophysiologischer Prozesse am intakten Embryo in Echtzeit und unter
hoher zellulärer Auflösung ermöglichen.
Der Zebrabärbling wird in der Forschung in mehr als 350 Laboren allein in Europa
und
von
mehr
als
1000
Forschergruppen
weltweit
eingesetzt
(http://zfin.org/action/profile/lab/search). Im Rahmen der Forschungsarbeiten wurde
in den letzten 20 Jahren die Haltung von Zebrabärblingen durch systematische
Studien auf exzellente und artgerechte Haltungsbedingungen optimiert, welche die
Gesundheit und Reproduktionsfähigkeit garantieren, die wir für unsere Forschung
brauchen. Nur so kann die Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit unserer
Forschungsergebnisse gewährleistet werden. Die zugrundeliegenden Studien
umfassen Untersuchungen der natürlichen Lebensräume in Indien und Bangladesch
sowie die Laborhaltung und behandeln z.B. die Bandbreite der Lebensbedingungen
(Temperatur, Art des Gewässers, Pflanzenbewuchs etc.), Verhaltensmuster
(Aggression,
Ortspräferenz,
Gruppenbildung,
Territorialverhalten
etc.),
Stressbedingungen (Messung von Cortisonspiegel), Reproduktionsverhalten,
Parasiten und Krankheiten in der Laborhaltung sowie Futter, Wasserbedingungen,
Aquariensysteme und Besatzdichten. Alle diese Arbeiten wurden in „peer-reviewed“
internationalen Journalen veröffentlicht und erfüllen somit die Qualitätsstandards
zeitgemäßer wissenschaftlicher Forschung. Diese neueren Erkenntnisse zeigen,
dass Zebrabärblinge unter einem breitem Spektrum von Haltungsbedingungen
gesund und stressfrei gehalten werden können. Diese von vielen Gruppen weltweit
erarbeiteten Haltungsbedingungen sind im Einklang mit dem 3R Konzept, da die
Belastung der Tiere minimiert und somit die Reproduzierbarkeit der
Forschungsergebnisse gewährleistet wird.
3
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2.
Zebrabärblinge als experimentelle Modelle 1
Der kleine Süßwasserfisch Zebrabärbling („Zebrafisch“, Danio rerio) wird in
zunehmendem Maße als Modellsystem für die biomedizinische Forschung benutzt.
Er bietet ein sequenziertes Genom und ein großes Repertoire an genetischen,
molekularen und zellulären Methoden. Vor allem die einzigartige Kombination von
Eigenschaften (kleine Körpergröße, zahlreiche Nachkommen, optische Transparenz
der Embryonen, Zugänglichkeit für genetische und chemische Screens) hat dieses
Wirbeltiermodel unter den biomedizinischen Forschern populär gemacht. Der Vorteil
dieses Fischmodels im Vergleich zu konventionellen Modellen wie z. B. Maus und
Ratte ist die Möglichkeit, im großen Maßstab phänotypische Screens durchzuführen
und die Funktion von Genen oder den Effekt kleiner Moleküle zu charakterisieren.
Zusätzlich zu den klassisch genetischen Ansätzen erlaubt ein weites Spektrum an
Methoden von der Transgenese bis zum gezielten Gen-Knockout, in diesen Tieren
Genfunktionen im Zusammenhang des ganzen Organismus zu untersuchen, häufig
unter Einsatz nicht-invasiver Bildgebungsverfahren. Zebrabärblinge können daher
signifikant dazu beitragen, die Herausforderung der modernen Biologie in Angriff zu
nehmen, Genfunktionen in einem umfassenden Maßstab zu verstehen. Ihr Wert als
Model wird weiterhin signifikant durch parallele Fortschritte in der Mikroskoptechnik
gesteigert, die es jetzt erlauben, ganze lebende Embryonen mit subzellulärer
Auflösung zu analysieren.
Es ist auch klar geworden, dass das Potential dieses Fischmodells weit über das
Gebiet der Zell- und Entwicklungsbiologie hinausgeht und dass seine Nutzung zu
Innovationen in nahezu allen Bereichen der biomedizinischen Forschung führen
kann. Das wurde von Wissenschaftlern und Wissenschaftsförderern weltweit erkannt
und beträchtliche finanzielle Ressourcen wurden zur Entwicklung fischrelevanter
Technologien und Infrastruktur zur Verfügung gestellt2. Zebrafischmodelle wurden z.
B. für polyzystische Nierenerkrankungen, Arrhythmien des Herzens,
Kardiomyopathien und Myopathien der Skelettmuskulatur, Anämien,
Cholesterinverarbeitung, Glaukom, Netzhautdegeneration, Krebs,
Suchterkrankungen, Depression und andere psychiatrische Erkrankungen,
Geweberegeneration, Hörschädigungen, Nervendegeneration sowie
Infektionskrankheiten beschrieben3. In manchen Fällen wurde ein neues
Krankheitsgen zuerst im Zebrabärbling entdeckt und dann erst als Ursache einer
menschlichen Krankheit erkannt, wie z.B. der Eisentransporter Ferroprotein in
Hämochromatosis Typ 4, einer Anämie im Menschen oder CCBE1 im Hennekam
Syndrome.
Der Zebrabärbling zieht auch in zunehmendem Maße als Modell für die
pharmazeutische Industrie Aufmerksamkeit auf sich – sowohl mit dem Ziel, neue
Wirkstoffe zu entdecken, als auch um den Zebrabärblingsembryo als ein
Ganztiersystem für toxikologische Studien zu verwenden. Die ersten Beispiele dafür,
1
Lieschke GJ and Currie PD (2007) Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet.
8, 353-67
Zon LI and Peterson RT (2005) In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery 4, 35-44.
2
Zebrafish – A Practical Approach, Dahm and Nüsslein-Volhard eds. OUP 2002, 2005
3
Ablain, J., and Zon, L.I. (2013). Of fish and men: using zebrafish to fight human diseases. Trends Cell Biol 23,
584–586.
Phillips, J.B., and Westerfield, M. (2014). Zebrafish models in translational research: tipping the scales toward
advancements in human health. Disease Models & Mechanisms 7, 739–743.
4
Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed
in denen Chemikalien erfolgreich darauf gescreent wurden, genetische Defekte zu
unterdrücken, sind bereits in der Literatur erschienen 4 . Die ersten PharmastoffKandidaten, die an Zebrabärblingsembryonen entwickelt wurden, sind in der
klinischen Testphase 5 (Len Zon, pers. Mitteilung). In Deutschland ist der
Zebrabärblingsembryo-Toxizitätstest
ein
DIN-Standard
zur
Prüfung
der
Wasserqualität aus Klärwerken geworden 6. Weiterhin zeigten molekulare Studien,
dass der Zebrabärblingsembryo ein geeignetes Modell für die systematische Testung
von Chemikalien im Rahmen des Europäischen REACH-Programms 7 und anderer
systematischer Toxizitätsstudien ist, die das Ziel haben, Toxizitätsmechanismen zu
verstehen 8.
3.
Die Biologie des Zebrabärblings (Danio rerio)9
Der Zebrabärbling ist ein populärer Süßwasser-Aquarienfisch, der aus dem indischen
Subkontinent stammt. Er ist leicht zu züchten und sehr widerstandsfähig, was ihn
besonders für Aquarienanfänger geeignet macht. Diese Eigenschaften haben auch
dazu beigetragen, dass der Zebrabärbling in zunehmendem Maße in der Forschung
als Tiermodell eingesetzt wurde. Sie ergänzen seine experimentellen Vorteile, wie
die geringe Größe und die Durchsichtigkeit seiner Embryonen und Larven sowie ein
wachsendes Repertoire an Methoden für genetische Studien.
Morphologie
Erwachsene Zebrabärblinge sind ungefähr 3 – 5 cm lang und zeigen ein
charakteristisches Muster von blau-schwarzen horizontalen Streifen, die entlang des
Körpers und der Anal- und Schwanzflossen verlaufen. Diese schwarz-blauen Streifen
werden durch melaninhaltige Melanophorenzellen gebildet. Die Streifen sind
voneinander durch Xanthophoren getrennt, die Pteridin- und Carotinoid-Pigmente
enthalten und eine orangegelbe Farbe bewirken. Der dritte Typ von Pigmentzellen,
die Iridophoren, enthält guaninreiche Plättchen, die eine irisierende Erscheinung
bewirken. Zebrabärblinge zeigen einen sexuellen Dimorphismus. Das Weibchen ist
durch einen dickeren Bauch und das Männchen durch eine im Vergleich schlankere
Körperstruktur sowie eine gelblichere Färbung charakterisiert.
4
Peterson, R.T., et al., Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation.
Nature biotechnology, 2004. 22(5): p. 595-9.
5
Martin, C.S., A. Moriyama, and L.I. Zon, Hematopoietic stem cells, hematopoiesis and disease: lessons from the
zebrafish model. Genome medicine, 2011. 3(12): p. 83.
6
DIN (2001) German standard methods for the examination of water, waste water and sludge – Subanimal
testing (group T) – Part 6: Toxicity to fish. Determination of the non-acute-poisonous effect of waste water to fish
eggs by dilution limits (T 6). DIN 38415-6; German Standardization Organization.
Lammer, E., et al., Is the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio) a potential alternative for
the fish acute toxicity test? Comparative biochemistry and physiology. Toxicology & pharmacology : CBP, 2009.
149(2): p. 196-209.
7
Yang, L., et al., Zebrafish embryos as models for embryotoxic and teratological effects of chemicals.
Reproductive toxicology, 2009. 28(2): p. 245-53.
8
http://www.epa.gov/ncct/download_files/chemical_prioritization/padillaSept28presentation.pdf
9
Nüsslein-Volhard, C. and Dahm R., 2002, Zebrafish , A practical approach
Spence R et al., 2008; The behavior and ecology of the zebrafish, Danio rerio
Westerfield M., 1993; The Zebrafish Book, A guide for the laboratory use of zebrafish
5
Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed
Systematik
Wie die meisten Knochenfische gehören die Zebrabärblinge zu den Teleostei oder
Echten Knochenfischen und sind damit Teil der größten Gruppe innerhalb der
strahlenflossigen Fische oder Actinopterygii. Zebrabärblinge sind Cypriniden, d.h. sie
zählen zu der Familie Cyprinidae (Elritzen und Karpfen), die eine der größten
Familien der Teleostei und daher der Vertebraten im Allgemeinen sind10. Auch der
gemeine Karpfen und der Goldfisch gehören zu dieser Familie. Von seinem
Entdecker Hamilton im Jahre 1822 ursprünglich „Danio rerio“ benannt 11 , war der
Zebrabärbling für viele Jahre als Brachydanio rerio in der Wissenschaftsliteratur
bekannt, bevor er aufgrund neuerer phylogenetischer Analysen unter Einschluss von
DNA-Sequenzdaten wieder der Gattung Danio zugeordnet wurde12. Heute werden
ungefähr 45 Arten zur Gattung Danio gerechnet 13. Der Name Danio ist von dem
bengalischen Wort ‚Dhani‘ abgeleitet, das sich auf grüne Reisfelder bezieht.
Laborstämme und Varianten
Mehrere Forschungslabors haben eine Reihe von verschiedenen WildtypLaborstämmen etabliert, die in Gefangenschaft bereits über längere Zeiträume
gezüchtet worden sind. Populäre Stämme sind z.B. der AB- und der Tübingen (TÜ) Stamm, die auch in den ersten großen Mutagenese-Screens benutzt wurden14.
Der AB-Stamm wurde von G. Streisinger in Eugene, Oregon, USA, etabliert,
während der Tübingen-Stamm im Laboratorium von C. Nüsslein-Vollhard, Tübingen,
Deutschland, generiert wurde15. Diese Stämme wurden ausgehend von Fischen, die
in Zoohandlungen gekauft wurden, gezüchtet, während ein anderer wichtiger Stamm,
WIK, 16 direkt von einem Wildfang in Indien abstammt (daher sein Name: Wildtyp
India Calcutta). Dieser Stamm diente als ein hochpolymorpher Referenzstamm für
die Kartierung von Mutationen, die im TÜ-Hintergrund erzeugt wurden17. Zusätzlich
zu den Wildtyp-Stämmen werden in Kreuzungsexperimenten häufig Fische genutzt,
die Pigmentierungsmutationen tragen oder andere morphologische Variationen
zeigen. Die rezessive Mutation Leopard (leo) zum Beispiel führt zu einer
Unterbrechung des Streifenmusters 18 . Diese Fische wurden ursprünglich als eine
10
Nelson JS. 2006. Fishes of the World. John Wiley and sons, New York, NY.
Hamilton F. 1822. An Account of the Fishes Found in the River Ganges and its Branches. Archibald
Constable and Co., Edinburgh and London.
12
Mayden RL, Tang KL, Conway KW, Freyhof J, Chamberlain S, Haskins M, Schneider L, Sudkamp M, Wood
RM, Agnew M et al. 2007. Phylogenetic relationships of Danio within the order Cypriniformes: a framework for
comparative and evolutionary studies of a model species. J Exp Zool B Mol Dev Evol 308: 642-654.
13
Fang F, Douglas ME. 2003. Phylogenetic Analysis of the Asian Cyprinid Genus Danio (Teleostei, Cyprinidae).
Copeia 2003: 714-728.
14
Driever W, Solnica-Krezel L, Schier AF, Neuhauss SC, Malicki J, Stemple DL, Stainier DY, Zwartkruis F,
Abdelilah S, Rangini Z et al. 1996. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.
Development 123: 37-46.
Haffter P, Granato M, Brand M, Mullins MC, Hammerschmidt M, Kane DA, Odenthal J, van Eeden FJ, Jiang YJ,
Heisenberg CP et al. 1996. The identification of genes with unique and essential functions in the development of
the zebrafish, Danio rerio. Development 123: 1-36.
15
Dahm R, Geisler R, Nüsslein-Volhard C. 2006. Zebrafish (Danio rerio) Genome and Genetics. in Encyclopedia
of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.
16
Rauch GJ, Granato M, Haffter P. 1997. A polymorphic zebrafish line for genetic mapping using SSLPs on highpercentage agarosegels. Technical Tips Online T01208.
17
Geisler R, Rauch GJ, Geiger-Rudolph S, Albrecht A, van Bebber F, Berger A, Busch-Nentwich E, Dahm R,
Dekens MP, Dooley C et al. 2007. Large-scale mapping of mutations affecting zebrafish development. BMC
Genomics 8: 11.
18
Kirschbaum F. 1975. Untersuchungen über das Farbmuster der Zebrabarbe Brachdanio rerio (Cyprinidae,
Teleostei). Wilhelm Roux's Archives 177: 129-152.
Watanabe M, Iwashita M, Ishii M, Kurachi Y, Kawakami A, Kondo S, Okada N. 2006. Spot pattern of leopard
Danio is caused by mutation in the zebrafish connexin41.8 gene. EMBO Rep 7: 893-897.
11
6
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eigene Art beschrieben (Danio frankei) 19 . Fische, die homozygot für die goldenMutation sind, haben stark reduzierte Melaninspiegel in ihren Melanophoren und
erscheinen daher gelblich 20 . Das Gen, das in golden-Fischen mutiert ist, ist ein
mutmaßlicher Kationenaustauscher, der ebenfalls mit Pigmentunterschieden im
Menschen in Verbindung gebracht wurde21.
Der „Tübingen (auch Tüpfel“) Langflossen“-(TL)-Stamm 22 trägt sowohl die leo t1Mutation als auch eine dominante Mutation lof dt2 (Longfin) 23 , die gesteigertes
Wachstum der Flossen verursacht. Die casper-Mutanten24, die eine Doppelmutante
im nacre/mitfa 25 -Locus sowie im roy (Roy Orbison)-Locus sind, haben keine
Melanozyten und Iridophoren. Deshalb sind sie selbst als Adulte transparent, was sie
sehr geeignet für die Anwendung bildgebender Verfahren im lebenden Tier macht.
Habitat und Ökologie
Zebrabärblinge kommen in ganz Indien in einer Reihe von Habitaten vor 26 .
Gemeinsame typische Eigenschaften dieser Habitate sind geringer Wasserfluss, ein
Bodengrund mit Sand, Schlamm, Kieseln oder Felsen, sowie überhängende
Vegetation. Solche Habitate werden häufig in Sekundär- und Tertiär-Zuläufen eines
Flusses oder angrenzend an Sumpfland und Reisfelder aber auch in Straßengräben,
temporären Gewässern und Überschwemmungsbiotopen gefunden. Physikalische
und chemische Parameter dieser Habitate variieren sehr: In zwei kürzlich
erschienenen Studien wurden ein Temperaturbereich von 6°C bis 38,6°C, pH-Werte
von 5,9 bis 9,8 und Leitfähigkeiten von 10 µS bis 271 µS gefunden27 . Diese Befunde
passen zu der großen Toleranz gegenüber Umweltbedingungen, die Zebrabärblinge
in Laborhaltung zeigen.
19
Meinken H. 1963. Mitteilungen der Fischbestimmungsstelle des VDA XLII: Brachydanio frankei spec. nov., der
Leopard-Danio. . Monatsschrift für Ornithologie und Vivarienkunde 42: 39-43.
Spence R, Gerlach G, Lawrence C, Smith C. 2008. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol
Rev Camb Philos Soc 83: 13-34.
20
Lamason RL, Mohideen MA, Mest JR, Wong AC, Norton HL, Aros MC, Jurynec MJ, Mao X, Humphreville VR,
Humbert JE et al. 2005. SLC24A5, a putative cation exchanger, affects pigmentation in zebrafish and humans.
Science 310: 1782-1786.
Streisinger G, Walker C, Dower N, Knauber D, Singer F. 1981. Production of clones of homozygous diploid zebra
fish (Brachydanio rerio). Nature 291: 293-296.
21
Lamason RL, Mohideen MA, Mest JR, Wong AC, Norton HL, Aros MC, Jurynec MJ, Mao X, Humphreville VR,
Humbert JE et al. 2005. SLC24A5, a putative cation exchanger, affects pigmentation in zebrafish and humans.
Science 310: 1782-1786.
22
Dahm R, Geisler R, Nüsslein-Volhard C. 2006. Zebrafish (Danio rerio) Genome and Genetics. in Encyclopedia
of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.
http://zfin.org/cgi-bin/webdriver?MIval=aa-ZDB_home.apg
23
Iovine MK, Johnson SL. 2002. A genetic, deletion, physical, and human homology map of the long fin region
on zebrafish linkage group 2. Genomics 79: 756-759
Tresnake I. 1981. the long-finned zebra Danio. Trop Fish Hobby 29: 43-56.
van Eeden FJ, Granato M, Schach U, Brand M, Furutani-Seiki M, Haffter P, Hammerschmidt M, Heisenberg CP,
Jiang YJ, Kane DA et al. 1996. Genetic analysis of fin formation in the zebrafish, Danio rerio. Development 123:
25524
White RM, Sessa A, Burke C, Bowman T, LeBlanc J, Ceol C, Bourque C, Dovey M, Goessling W, Burns CE et
al. 2008. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell 2: 183-189.
25
Lister JA, Robertson CP, Lepage T, Johnson SL, Raible DW. 1999. nacre encodes a zebrafish microphthalmiarelated protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development 126: 3757-3767.
26
Arunachalam M, Raja M, Vijayakumar C, Malaiammal P, Mayden RL. 2013. Natural history of zebrafish (Danio
rerio) in India. Zebrafish 10: 1-14.
Engeszer RE, Patterson LB, Rao AA, Parichy DM. 2007. Zebrafish in the wild: a review of natural history and new
notes from the field. Zebrafish 4: 21-40.
Spence R, Gerlach G, Lawrence C, Smith C. 2008. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol
Rev Camb Philos Soc 83: 13-34.
27
Engeszer RE, Patterson LB, Rao AA, Parichy DM. 2007. Zebrafish in the wild: a review of natural history and
new notes from the field. Zebrafish 4: 21-40.
7
Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed
Zebrabärblinge teilen ihr Habitat mit einer Reihe von anderen Fischen, die
Konkurrenten um Futter sein können; dazu gehören andere Cypriniden wie
Puntiusbarben, andere Danio-Spezies und besonders Esomus danricus, der eine
ähnliche Größe und Maulspannweite hat und in ähnlichen Wassertiefen vorkommt.
Die Analyse von Darminhalten deutet darauf hin, dass Zebrabärblinge hauptsächlich
Futter fressen, das nicht aus ihrem Habitat stammt (sog. „allochthones“ Material), wie
z.B. rote Ameisen oder andere Insekten, die in das Wasser gefallen sind, sich aber
auch von aquatischen Insektenlarven und Krebsen, sowie von Zooplankton und
Phytoplankton ernähren 28 . Das nach oben gerichtete Maul von Zebrabärblingen
deutet darauf hin, dass das Futter hauptsächlich an der Wasseroberfläche
aufgenommen wird 29, wie es auch im Aquarium beobachtet werden kann; jedoch
wird auch Lebendfutter wie z. B. Artemienlarven eifrig aktiv gejagt. Größere
Fischspezies wie z. B. Schlangenkopffische (Channa sp.) oder der SüßwasserHornhecht (Xenentodon cancila), die in denselben Habitaten vorkommen, könnten
adulte Zebrabärblinge fressen, während Libellenlarven Zebrafischlarven jagen
könnten30.
Verhalten
Zebrabärblinge sind Tagtiere und zeigen daher die höchste Aktivität während des
Tages. Bei Nacht erhöhen sich die Häufigkeit und die Dauer von Ruhephasen.
Schlafphasen können wenige Minuten dauern und zeichnen sich oft durch eine
charakteristische Position mit hängenden Schwanzflossen der Fische aus, die dabei
entweder nahe an der Wasseroberfläche oder am Grund des Aquariums ruhen31 .
Interessanterweise ist das Paarungsverhalten auf den Beginn der Lichtphase
begrenzt32. Indem Verhaltenstests aus Nagermodellen auf Adulte und sogar Larven
des Zebrabärblings angewandt werden, wird jetzt auch zunehmend das Verhalten
dieser Tiere untersucht, insbesondere bezüglich Lernen und Belohnung, aber auch
im Zusammenhang mit Aggression und Furcht.33.
Zebrabärblinge sind soziale Tiere, die mit ihren Artgenossen Gruppen bilden. Dieses
Gruppenverhalten wird bei vielen Teleostiern gefunden und erhöht die
Wahrscheinlichkeit eines Individuums, Futterquellen und Räuber zu entdecken („viele
Augen sehen mehr als zwei“). Es erhöht auch die Entkommenschance bei der Flucht
vor einer Räuberattacke, aufgrund einer Verwirrung des Räubers durch den
28
Spence R, Gerlach G, Lawrence C, Smith C. 2008. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio.
Biol Rev Camb Philos Soc 83: 13-34.
Arunachalam M, Raja M, Vijayakumar C, Malaiammal P, Mayden RL. 2013. Natural history of zebrafish (Danio
rerio) in India. Zebrafish 10: 1-14.
McClure MM, McIntyre PB, McCune AR. 2006. Notes on the natural diet and habitat of eight danionin fishes,
including the zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology 69: 553-570.
29
Gerlai R. 2013. Antipredatory behavior of zebrafish: adaptive function and a tool for translational research. Evol
Psychol 11: 591-605.
30
Spence R, Gerlach G, Lawrence C, Smith C. 2008. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio.
Biol Rev Camb Philos Soc 83: 13-34.
Engeszer RE, Patterson LB, Rao AA, Parichy DM. 2007. Zebrafish in the wild: a review of natural history and new
notes from the field. Zebrafish 4: 21-40.
31
Yokogawa T, Marin W, Faraco J, Pezeron G, Appelbaum L, Zhang J, Rosa F, Mourrain P, Mignot E. 2007.
Characterization of sleep in zebrafish and insomnia in hypocretin receptor mutants. PLoS Biol 5: e277.
32
Darrow KO, Harris WA. 2004. Characterization and development of courtship in zebrafish, Danio rerio.
Zebrafish 1: 40-45.
33
Norton W, Bally-Cuif L. 2010. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. BMC Neurosci 11:
90.
8
Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed
Schwarm oder einer „Verdünnung“ des Individuums in der Masse34. Die Signale, die
für die Bildung von Zebrabärblingsschwärmen verantwortlich sind, sind noch wenig
verstanden, aber sie scheinen sowohl visuelle als auch Geruchsmerkmale zu
beinhalten. Zebrabärblinge bevorzugen bei der Schwarmbildung Artgenossen
gegenüber anderen Arten, verwandte Zebrabärblinge gegenüber nichtverwandten
und bekannte gegenüber unbekannten Partnern35.
Zebrabärblinge zeigen auch hierarchisches und territoriales Verhalten. In einer
kürzlich erschienenen Studie wurde interessanterweise gefunden, dass dominante
Unterordnungsbeziehungen mit zunehmender Zahl der Fische in einem Tank
aufgehoben werden 36. Die Zahl der Attacken reduzierte sich, wenn die Dichte von
zwei auf sechs Männchen pro Liter erhöht wurde und keine Attacken wurden
beobachtet, wenn zehn Individuen in einem Liter gehalten wurden. Andere Studien
haben die Cortisol-Pegel bei 2, 5, 10 und 20 Fischen pro Liter gemessen und keine
statistisch signifikanten Unterschiede festgestellt. Erst bei 50 Fischen pro Liter war
„Dichtestress“ in Form von erhöhtem Cortisol messbar 37 . Übereinstimmend mit
diesen Ergebnissen untersuchte eine kürzlich erschienene Laborstudie den Effekt
der Besatzdichte auf das Reproduktionsverhalten, das ebenfalls durch Stress
beeinflusst werden kann. Kein negativer Effekt war bei Besatzdichten von bis zu 12
Fischen pro Liter zu beobachten 38. Somit hat Schwarmbildung offensichtlich einen
positiven Effekt sowohl in der Interaktion mit der Umgebung als auch mit
Artgenossen.
Paarungsverhalten
Zebrabärblinge sind Gruppenlaicher, bei denen mehrere Männchen und Weibchen in
das Fortpflanzungsverhalten eingebunden sind 39 . In der freien Natur scheint die
Fortpflanzung saisonal unterschiedlich zu sein, wobei die Paarungszeit mit der
Monsunperiode einhergeht. Jedoch kommen bei in freier Wildbahn gefangenen
Weibchen reife Eier über das ganze Jahr hinweg vor, was darauf hindeutet, dass die
beobachtete Saisonalität des Paarungsverhaltens eher mit dem zur Verfügung
stehenden Futter zu tun hat und nicht ein endogenes saisonales Verhalten reflektiert.
In Übereinstimmung damit legen Zebrabärblinge in Laborhaltung Eier das ganze Jahr
hindurch unter verschiedenen Photoperioden (8-14 Stunden Licht).
Während es nach wie vor wenig verstanden ist, welche Signale die Wahl des
Paarungspartners beeinflussen, wurde eine typische Abfolge von Verhaltensmustern
während der Paarung beschrieben40. Dementsprechend schwimmen Männchen und
34
Miller NY, Gerlai R. 2011. Shoaling in zebrafish: what we don't know. Rev Neurosci 22: 17-25.
Miller NY, Gerlai R. 2011. Shoaling in zebrafish: what we don't know. Rev Neurosci 22: 17-25.
Spence R, Gerlach G, Lawrence C, Smith C. 2008. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol
Rev Camb Philos Soc 83: 13-34.
36
Pavlidis M, Digka N, Theodoridi A, Campo A, Barsakis K, Skouradakis G, Samaras A, Tsalafouta A. 2013.
Husbandry of zebrafish, Danio rerio, and the cortisol stress response. Zebrafish 10: 524-531.
37
Kühn und Baier, Manuskript in Vorbereitung, Daten stehen auf Anfrage zur Verfügung.
38
Castranova D, Lawton A, Lawrence C, Baumann DP, Best J, Coscolla J, Doherty A, Ramos J, Hakkesteeg J,
Wang C et al. 2011. The effect of stocking densities on reproductive performance in laboratory zebrafish (Danio
rerio). Zebrafish 8: 141-146.
39
Spence R, Gerlach G, Lawrence C, Smith C. 2008. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio.
Biol Rev Camb Philos Soc 83: 13-34.
40
Darrow KO, Harris WA. 2004. Characterization and development of courtship in zebrafish, Danio rerio.
Zebrafish 1: 40-45.
Sessa AK, White R, Houvras Y, Burke C, Pugach E, Baker B, Gilbert R, Thomas Look A, Zon LI. 2008. The effect
of a depth gradient on the mating behavior, oviposition site preference, and embryo production in the zebrafish,
Danio rerio. Zebrafish 5: 335-339.
35
9
Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed
Weibchen in der gesamten Wassersäule „auf und nieder“, und das Männchen „jagt“
das Weibchen, indem es dieses häufig mit der Schnauze berührt. Es „eskortiert“ es
dann zur Laichstelle, wo sie „umeinander herumschwimmen“ in einer Kopf- zu
Schwanzorientierung. Das Männchen fängt dann an zu „zittern“, d. h. sein Körper
oszilliert mit hoher Frequenz und niedriger Amplitude in der Nähe des Weibchens im
Laichbereich. Er kann auch seinen Körper um das Weibchen herumschlingen. Die
Eiablage geschieht dann in Schüben von 5 bis 20 Eiern.
Beobachtungen in der Wildbahn deuten darauf hin, dass Zebrabärblinge bevorzugt
im flachen Uferbereich ihres Habitats laichen und dass sie Kiesuntergrund Schlamm
vorziehen – wahrscheinlich, weil die Eier besser vor Räubern geschützt werden
(inklusive Kannibalismus), wenn sie zwischen die Spalten eines Kiessubstrats
fallen 41 . Dieses Verhalten kann man zur Eiproduktion im Labor ausnutzen. Eine
klassische Methode für die kontinuierliche Eierproduktion in Aquarien besteht darin,
mit Murmeln gefüllte Schachteln in den Tank zu stellen. Die Fische paaren dann
bevorzugt über dem Murmeleinsatz und die Eier können leicht jeden Morgen nach
Entfernen der Murmeln geerntet werden. Eine andere Methode benutzt die Präferenz
für sehr flaches Wasser, um die Eierproduktion zu erhöhen42. Typische Legekästen
für einzelne Pärchen oder Gruppen zur Paarung bestehen in der Regel aus einem
Aquarium mit einem Einsatz, dessen Boden durch ein Netz gebildet wird. Die Eier
fallen durch das Netz in das untere Kompartiment und können daher von den
Fischen nicht gefressen werden. Wenn die Einsätze nun so gekippt werden, dass sie
einen Gradienten an Wassertiefe produzieren, bevorzugen die Fische die flacheren
Bereiche für die Paarung. Von Bedeutung ist, dass diese Methode, die auch als
„Sex-am-Strand“-Methode bezeichnet wurde, signifikant die Eiproduktion im
Vergleich mit nicht-geneigten Einsätzen erhöhte. Es wurden Apparate entwickelt, die
diese Stimulation der Eiablage und des Paarungsverhaltens durch flaches Wasser
benutzen, um sich synchron entwickelnde Eier im großen Maßstab zu gewinnen43.
Lebenszyklus
Ein Grund für die Popularität des Zebrabärblings unter Entwicklungsbiologen ist die
schnelle Entwicklung der transparenten Embryonen. Bald nach Befruchtung
beginnen die Teilungen der Blastodisc (Keimscheibe), die auf der großen Dotterzelle
sitzt. Es folgen morphogenetische Bewegungen wie Epibolie, Gastrulation und
Konvergenz-Extension, die die Hauptachsen des Embryos bis ungefähr 10 Stunden
nach der Befruchtung geformt haben44. Die hauptsächlichen Organsysteme bilden
sich über die nächsten 24 bis 36 Stunden, und nach 48 bis 72 Stunden erfolgt das
Schlüpfen. Die geschlüpften Embryonen, die nun als Eleuthero-Embryonen
bezeichnet werden, beziehen nach wie vor ihre Nahrung aus dem Dotter45. Nach 120
Stunden (5 Tage nach Befruchtung, TnB) kann erstes Fressverhalten beobachtet
werden. Bis zu 9 TnB kann sich die Fischlarve noch von ihrem mitgebrachten Dotter
ernähren und muss nicht gefüttert werden. Danach ist das frei-fressende
41
Spence R, Ashton R, Smith C. 2007. Oviposition Decisions Are Mediated by Spawning Site Quality in Wild and
Domesticated Zebrafish, Danio rerio. Behaviour 144: 953-966
42
Sessa AK, White R, Houvras Y, Burke C, Pugach E, Baker B, Gilbert R, Thomas Look A, Zon LI. 2008. The
effect of a depth gradient on the mating behavior, oviposition site preference, and embryo
43
Adatto I, Lawrence C, Thompson M, Zon LI. 2011. A new system for the rapid collection of large numbers of
developmentally staged zebrafish embryos. PLoS ONE 6: e21715.
44
Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, Ullmann B, Schilling TF. 1995. Stages of embryonic development of the
zebrafish. Dev Dyn 203: 253-310.
45
Strahle U, Scholz S, Geisler R, Greiner P, Hollert H, Rastegar S, Schumacher A, Selderslaghs I, Weiss C,
Witters H et al. 2012. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments--a commentary on the definition
of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reprod Toxicol 33: 128-132.
10
Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed
Larvenstadium erreicht 46. Nach weiteren 25 Tagen (30 TnB) ist die Metamorphose
erfolgt 47 . Die Flossenfalten der Larve wurden in das adulte Flossenschema
umgewandelt und auch das Pigmentmuster entspricht nun dem eines erwachsenen
Zebrabärblings. Dieses Stadium wird als das Juvenil-Stadium bezeichnet. Ungefähr
zur gleichen Zeit (23 bis 25 TnB) gibt es die ersten Anzeichen von sexueller
Differenzierung auf histologischem Niveau in den Gonaden.
Die juvenile Gonade beginnt sich bei den Männchen in den Hoden umzuwandeln48. 3
Monate nach der Befruchtung (in der Wildnis kann dies auch bis zu 6 Monate
dauern49) ist die sexuelle Reife erreicht und der Fisch ist ein voll ausgewachsenes
adultes Tier geworden. Die maximale Lebensspanne von einzelnen „Methusalem“Fischen unter Laborbedingungen kann zwischen 4 und 6 Jahren betragen, in
Abhängigkeit vom Stamm 50 . Wie bei allen Lebewesen lassen auch bei
Zebrabärblingen die Abwehrkräfte gegen Infektionskrankheiten im Alter nach. Daher
wird nicht empfohlen, Fische länger als 2 Jahre zu halten, um die Entstehung und
Ausbreitung von Alterskrankheiten zu verhindern.
4.
Haltung, Züchtung und Fütterung
4.1
Aquariensysteme, Wasser, Temperatur, Licht
Zebrabärblinge können leicht im Labor gehalten werden. Für Forschung, die Fische
in kleinen Kolonien benötigt, können Fischtanksysteme (inklusive Filtersystem, Lichtund Hitzeregulation) kommerziell erworben werden. Ein professionelles
Aquariumssystem ist vonnöten, wenn größere Mengen an Mutanten und transgenen
Linien gehalten werden sollen. Es gibt einige Firmen, die solche Systeme vertreiben
(zum Beispiel Müller & Pfleger, Rockenhausen/Deutschland; AquaSchwarz,
Göttingen/Deutschland;
Tecniplast,
Buguggiate/Italien;
AquaticHabitats,
Apopka/USA). Diese Systeme können auf fest installierten Aquarien beruhen, aber
auch flexible Elemente einsetzen, bei denen Plastiktanks auf Regalen an das
Wassersystem angeschlossen werden können. Alle diese Systeme besitzen einen
zirkulierenden Wasserfluss, bei dem das Wasser in die Aquarien geleitet und über
einen Überlauf gesammelt wird. Abfälle wie Fäkalien, Ammoniak und Nitrit werden
über ein mehrstufiges Filtersystem bestehend aus biologischen und mechanischen
Filtern entfernt. In diesen Systemen wird das gereinigte Wasser auch mit UV-Licht
bestrahlt, um Pathogene und Algenwuchs zu minimieren. Das so aufbereitete
Wasser wird wieder in die Tanks zurückgeleitet. Normalerweise wird pro Tag 5-20%
frisches Wasser hinzugefügt, um Verdunstung zu kompensieren und Abfälle zu
verdünnen. Zirkulierende Wassersysteme brauchen keine speziellen Vorkehrungen
zur Sauerstoffzufuhr, da die permanente Wasserbewegung dafür sorgt, dass genug
46
Clift et al., 2014. High-throughput analysis of behavior in zebrafish: Effects of feeding. Zebrafish DOI:
10.1089/zeb.2014.0989
47
Parichy DM. 2003. Pigment patterns: fish in stripes and spots. Curr Biol 13: R947 950.
48
Orban L, Sreenivasan R, Olsson PE. 2009. Long and winding roads: testis differentiation in zebrafish. Mol Cell
Endocrinol 312: 35-41.
Takahashi H. 1977. Juvenile Hermaphroditism in the Zebrafish, Brachydanio rerio. Bull Fac Fish Hokkaido Univ
28: 57-65.
49
Engeszer RE, Patterson LB, Rao AA, Parichy DM. 2007. Zebrafish in the wild: a review of natural history and
new notes from the field. Zebrafish 4: 21-40.
50
Gerhard, G.S., et al., Life spans and senescent phenotypes in two strains of Zebrafish (Danio rerio).
Experimental gerontology, 2002. 37(8-9): p. 1055-68
11
Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed
Sauerstoff gelöst wird, um die Gesundheit der Fische zu erhalten.
Je nach örtlicher Wasserqualität benutzen einige Labore Leitungswasser ohne
spezielle Aufbereitung. Allerdings sind Spuren von Chlor in Leitungswasser sehr
giftig für Fische. Meistens ist es daher notwendig, Chlor durch einen Aktivkohlefilter
großer Kapazität zu entfernen. Falls das Wasser zu viel Kalziumkarbonat enthält,
muss es mit entsalztem Wasser gemischt werden. Für optimale Wasserbedingungen
wird eine Leitfähigkeit von 250 bis 1000 µS und ein pH-Wert von 6,5 bis 8 (Tab.2)
gebraucht. Alternativ setzen einige Einrichtungen deionisiertes Wasser ein, dem eine
definierte Salzmischung zugesetzt ist. Eine regelmässige Überwachung der
Parameter (Nitrit, Nitrat, pH, Leitfähigkeit) ist zu empfehlen
Lichtzyklus
14/10 Stunden hell/dunkel
Wasseraufbereitung
Zirkulierendes
Wassersystem, mit
mechanischen Filtern,
Biofilter und UV- Einheit
Parameter müssen
geprüft werden: pH-Wert,
Nitrit, Nitrat, NH3/NH4+
und Leitfähigkeit
Wasserqualität
Besatzdichten
Bis zu 10 erwachsene
Zebrabärblinge pro Liter
Für Besatzdichten für
Larven und juvenile
Fische siehe Tabelle 2
und Kapitel 4.1)
Gestaltung des
Aquariums
Ausgestaltung wird nicht
als wichtig angesehen
(Pflanzen etc.)
Fütterung
Mischung aus trockenem
Futter und frisch
geschlüpften
Salinenkrebschen,
Rotiferen, (Paramecia,
Tetrahymena und
Rotiferen für die Anzucht)
Aber auch 12:12
bis 8:16
hell/dunkel
Täglicher
Wasseraustausch
von 5-20% ist
üblich
pH-Wert: 6,5-8
Leitfähigkeit: 2501000µS
Nitrat (≤50 mg/L)
Nitrit (≤0,1 mg/L)
Ammonium (≤0,2
mg/L)
In gerade angelaufenen
Aquariensystemen täglich,
Nitrat, Nitrit, pH-Wert und
Leitfähigkeit überprüfen
sonst wöchentlich.
Die Haltung von einzelnen
erwachsenen Fischen ist
möglich. (siehe Kapitel 4.2)
Im natürlichen
Lebensraum
scheinen
Freiwasser-Zonen
bevorzugt
Eine Ausgestaltung der
Tanks mit natürlichen oder
künstlichen Pflanzen kann
hygienische Probleme
erzeugen sowie tägliches,
unkontrolliertes Laichen
provozieren, dessen
Auswirkungen auf die
Fische unklar sind. Die
Fütterung von
Salinenkrebschen (Artemia
salina), Rotiferen
(Branchionus sp.) oder
anderem Lebendfutter wird
jedoch vorgeschlagen, da
dies natürliches
Jagdverhalten stimuliert
Salinenkrebschen oder
anderes Lebendfutter (z. B.
Rotiferen) werden zur
Fütterung empfohlen
12
Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed
Temperatur
24,5-29°C für alle
Fischstadien
Laichen
Laichen erfolgt mit Beginn
der Lichtphase. Trennung
der Geschlechter am Tag
vor dem Laichen und
Zusammensetzen am
nächsten Morgen
ermöglicht genauere
Kontrolle der
Paarungsaktivität. Die
Benutzung von
Laichtanks, und
Flachwasserzonen kann
das Laichen begünstigen
und die Eizahl erhöhen.
Zebrafische können höhere
und niedrigere
Temperaturen ohne
Probleme ertragen. Unter
23oC entwickeln sich die
Embryonen nicht mehr.
Tabelle 1: Zusammenfassung der Haltungsbedingungen
Der Zebrafisch stammt aus den Tropen, daher sollte die Wassertemperatur zwischen
24,5 und 29°C liegen und nicht unter 23°C fallen. (Wassertemperaturen in der
natürlichen Umgebung können bis zu 38,5°C erreichen.) Um die Wassertemperatur
aufrechtzuerhalten, kann es notwendig sein, den Raum zu heizen; Heizstäbe können
in den Wasserreservoirs eingesetzt werden.
Da der Zebrabärbling in der Wildnis offenes Wasser ohne Vegetation bevorzugt, ist
es nicht notwendig, die Tanks mit Pflanzen oder ähnlichem auszugestalten.
Zebrabärblinge werden in den meisten Laboren unter einem 14 Stunden Licht- / 10
Stunden Dunkelzyklus gehalten. Sie tolerieren aber auch Abweichungen bei denen
der Lichtzyklus um bis zu 6 Stunden verkürzt wird. Sie laichen problemlos unter
Laborbedingungen. Das Laichen wird gewöhnlich initiiert, sobald morgens das Licht
angeht, und dauert ein paar Stunden. Da Zebrabärblinge oft ihre eigenen Eier
auffressen, sammelt man befruchtete Eier am Besten in einer Laichschale. Diese
enthält ein Bodengitter, durch das die Eier in den unteren Teil des Tanks fallen
können. Dort können sie von den Eltern nicht mehr erreicht werden. In diesen Tanks
können die Fische paarweise oder in Gruppen verpaart werden.
Unter den in Tabelle 1 angegebenen Bedingungen erreichen Zebrabärblinge ihre
Geschlechtsreife bei einem Alter von 2,5 bis 3 Monaten und können leicht 2-3 Jahre
alt werden. Allerdings verlieren sie meist ihre Fruchtbarkeit nach Erreichen eines
Alters von 2 Jahren.
4.2
Besatzdichten
In der kommerziellen Fischzucht wird für Besatzdichten die Anzahl der Fische auf die
Fischgröße in Zentimeter Länge oder auf das Fischgewicht pro Liter Wasser
bezogen. In wissenschaftlichen Zebrabärbling-Zuchten sind diese Maße für die
Festlegung von Besatzdichteempfehlungen unpraktisch, da die Fische als Larven
sehr klein sind und Messungen ohne Handhabung der Larven und juvenilen Fische
13
Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed
nicht genau durchgeführt werden können. Andererseits sind in wissenschaftlichen
Zebrabärbling-Zuchten die Haltungsbedingung so optimiert, dass innerhalb von 3
Monaten geschlechtsreife Tiere heranwachsen. Deswegen wird hier vorgeschlagen,
die Besatzdichten in Abhängigkeit vom Alter der Zebrabärbling zu empfehlen. Das
Alter wird hier in "Tage nach Befruchtung" (TnB) angegeben. Die korrelierenden
Standard-Körperlängen (SL) sind entsprechend entsprechend Parichy et al.,
angegeben. Der Zebrafish-Informations-Server51 gibt Gesamtlängen an, welche die
Schwanzflosse einschließen. Dies ist hier aber nicht ein sinnvolles Maß, da
verschiedene Zuchtformen sehr unterschiedliche Schwanzflossenlängen haben.
Stadium
(SL)
Alter
(TnB)
Embryonen 0-5
(bis ca. 3.8
mm)
Frühe
6-10
Larven
(ca. 3.9 bis
4.5 mm)
Larven
11-30
(ca. 4.5 bis
8 mm)
31-60
Juvenile
Fische (ca.
8 bis 12
mm)
Junge
Adulte
12 bis
mm)
Adulte
25 bis
mm)
60-90
Zebrabärblinge Anmerkungen
pro
Liter
Wasser
bis zu 1000
Embryonen sollten in flachen Schalen mit ca. 50
Embryonen in 15 - 25 ml Wasser gehalten
werden
bis zu 100
Larven sollten in diesem Stadium nur mit
angemessenem Larvenfutter (z.B. Paramecien
oder Spezialtrockenfutter) gefüttert werden, so
das Haltung auch in stehendem nicht
zirkulierendem Wasser möglich ist. Täglich
Wasserqualität kontrollieren auf Trübung und
Futterreste.
bis zu 50
Larven sollten in einem rezirkulierenden System
mit Wasseraufbereitung gehalten werden, das >
2-maligen Wasseraustausch pro Tag realisiert.
Alternativ Haltung im isolierten Gefäß mit
Belüftung und Wasserwechsel alle 2-3 Tage.
bis zu 25
Juvenile Fische sollten in einem rezirkulierenden
System mit Wasseraufbereitung gehalten werden,
das in etwa stündlichen Wasseraustausch
realisiert.
bis zu 25
(ca.
25
(ca. > 90
50
bis zu 10
Junge Adulte sollten in einem rezirkulierenden
System mit Wasseraufbereitung gehalten werden,
das mindestens stündlichen Wasseraustausch
realisiert.
Adulte sollten in einem rezirkulierenden System
mit Wasseraufbereitung gehalten werden, das
mindestens
zweifach
stündlichen
Wasseraustausch realisiert.
Bei niedrigeren Wasseraustauschraten sind die
Besatzdichten zu reduzieren (z.B. bis zu 5 Fische
bei einfachem stündlichem Wasseraustausch). In
einem statischen Aquarium ohne Rezirkulation
aber mit internem Biofilter und Belüftung sollte nur
1 Zebrabärbling pro Liter gehalten werden.
Tabelle 2: Besatzdichten in Abhängigkeit vom Alter
51
"http://zfin.org/zf_info/zfbook/stages/"
14
Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed
Anmerkung zu Tabelle 2:
A.
B.
C.
In der EU COMMISSION REGULATION (EC) No 889/2008 of 5 September 2008 werden für bioorganische Fischzuchtbedingungen in Section 9 des Annex XIIIa für Salomide Frischwasserfische
Besatzdichten von unter 15 Kg/m3 und für tropische Frischwasserfische von unter 10kg/m3 bei
mindestens 60% Sauerstoffsättigung als Bedingung "organischer Fischproduktion" gefordert.
Besatzdichten in der typischen "organischen Forellenzucht" in Deutschland sind bis zu 10 kg Fisch pro
Kubikmeter Wasser oder 10 Gramm pro Liter.
Bei den Angaben in der Tabelle zu Zebrabärblingen werden z.B. bei jungen Adulten (63 TnB ca. 200 mg
pro Fisch 52. Dichten von 5 Gramm pro Liter eingehalten. Das mittlere Gewicht eines 150 TnB
Weibchens ist 1 Gramm 53, somit auch bei Adulten unterhalb oder gleich10 g pro Liter Besatzdichte.
Zebrafische können auch einzeln und in Paaren gehalten werden. Wissenschaftliche
genetische Arbeit mit Zebrabärblingen bedingt in vielen Fällen, dass neue genetische
Situationen zuerst nur in einzelnen Tieren charakterisiert werden können. Dazu
gehören neue Mutationen, neue Transgene, Kombinationen von verschiedenen
Mutationen oder Transgenen, welche alle als Heterozygote in der Regel ganz
normale und gesunde Fische sind. Der Fortschritt der genetischen Forschung mit
biomedizinischen sowie Grundlage-Forschungsfragen hängt entscheidend davon ab,
dass solche genetisch definierten Einzeltiere gehalten werden können bis eine
Nachfolgegeneration gezüchtet wird, also im Regelfall 3 bis 4 Monate. Eine ähnliche
Problemstellung gibt es z.B. auch für die genetische Arbeit mit Mäusen - hier werden
am Tier Markierungen gesetzt, die Einzeltiere eindeutig identifizieren (z.B.
Ohrenmarkierungen oder implantierte Chips). Bei Zebrabärblingen sind solche
Markierungsmethoden auf Grund der Zartheit der Tiere (Adulte nur ca. 1 Gramm Implantate unmöglich) und der schnellen Regeneration der Flossen
(Schwanzflossenmarkierungen “heilen" in zwei bis drei Wochen) nicht möglich.
Deswegen sollte auch die Einzelhaltung von Zebrabärblingen weiterhin möglich sein.
Hier ist ein eventueller Verlust an Wohlbefinden des Schwarmfisches Zebrabärbling
in der Einzelhaltung abzuwägen gegen die in Säugermodellen üblichen Verletzungen
bei der Markierung von Tieren. Zebrabärblinge zeigen auch nach 3 Monaten
Einzelhaltung beim Verpaaren normales Paarungsverhalten und Eiablage- und
Befruchtungsraten, die denen von in Gruppen gehaltenen Tiere ähneln, solange die
Futter- und Haltungsbedingungen gut sind. Die größte Gefahr für die Gesundheit der
Fische bei Einzelhaltung scheint die Überfütterung zu sein, überfütterte Fische
verweigern auch das normale Paarungsverhalten. Deswegen sollten Zebrabärblinge
in Einzelhaltung mit geeignetem Futter vorsichtig gefüttert und sorgfältig kontrolliert
werden. Als Futter eignen sich so z.B. besonders lebende Artemien und reduziertes
oder kein Trockenfutter.
5.
Anästhesie und Euthanasie
Mehrere Methoden der Betäubung von Zebrabärblingen stehen zur Verfügung, wobei
die Forschung hierzu noch nicht abgeschlossen ist. Bewusstes Schmerzempfinden
ist bei Knochenfischen noch nicht nachgewiesen worden 54. Die folgenden Absätze
spiegeln daher nur den derzeitigen Wissensstand wieder. Die für das
52
Siccardi et al., Zebrafish. Sep 2009; 6: 275–280
Lawrence et al., Aquaculture 368–369 (2012) 103–108
54
J.D. Rose et al., Can fish feel pain? FISH and FISHERIES , 2014, 15, 97–133
53
15
Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed
Schmerzsystem von Säugern charakteristischen A-delta- und C-Nervenfasern
existieren zumindest in erwachsenen Fischen. Die von Säugern bekannten
schmerzverarbeitenden Gehirnstrukturen sind vorhanden, auch wenn ihre Funktion
nicht klar ist. Rezeptoren, welche Kälteschmerz vermitteln, wurden bei Fischen nicht
gefunden 55 . Daher wird hypothermische Behandlung, d. h. Abkühlung oder
Eintauchen in Eiswasser, von Fischen vermutlich nicht als schmerzhaft empfunden.
Dieser Eindruck wird auch durch Verhaltensbeobachtungen bestätigt.
Nach der neuesten Übersicht über Betäubung und Euthanasie bei Zebrabärblingen
durch Matthews & Varga 56, ist MS-222 das am häufigsten gebrauchte Beruhigungsund Betäubungsmittel beim Zebrabärbling. Die Dosis-Wirkungs-Beziehung von MS222 hängt von Alter, Größe und metabolischem Zustand ab. Eine Zunahme der
Sensitivität gegenüber MS-222 konnte in 3 bis 9 Tage alten Larven beobachtet
werden, wahrscheinlich durch die Veränderungen der Detoxifizierungsaktivität in der
Leber. Mittlere tödliche Konzentrationen bei 4 bis 7 Tage alten Zebrabärblingslarven
deuten auf fundamentale Veränderungen in der Entwicklung hin, die mit der Reifung
der Kiemen57 und der Leber 58,59 einhergehen. MS-222 wird häufig für die Sedierung
(0,01 mg/ml 60), die Betäubung (0,168 mg/ml 61) und das Abtöten (0,2 – 0,3 mg/ml 62)
von Zebrabärblingen verwandt. Die angewandte Konzentration für die Betäubung
kann in Abhängigkeit von Eingriffsdauer und Größe der Fische von den publizierten
Konzentrationen abweichen.
Außer MS-222 steht auch Eugenol als Betäubungsmittel zur Verfügung. Eugenol ist
günstiger in der Anschaffung und ist in geringeren Dosen wirksam. Einige Stadien
und vollständige Betäubung werden mit vergleichsweise geringeren Konzentrationen
weniger schnell mit Eugenol induziert, jedoch dauert die Erholungsphase länger als
mit MS-22263. Eine Dosis von 2 - 5 mg/L wird empfohlen, um adulte Zebrabärblinge
ruhigzustellen, 60 - 100 mg/L, um sie zu betäuben 64 . Des Weiteren hat Eugenol
einen besseren Sicherheitsfaktor als MS-222 und scheint die Effekte von dichtem
Besatz und Behandlungsstress zu mindern. Diese Annahme beruht auf Studien, bei
denen Plasma-Cortison und neutrophile Funktion bei der Dickkopfelritze gemessen
Ashley, P.J., L.U. Sneddon, and C.R. McCrohan, Properties of corneal receptors in a teleost fish. Neuroscience
letters, 2006. 410(3): p. 165-8.
Ashley, P.J., L.U. Sneddon, and C.R. McCrohan, Nociception in fish: stimulus-response properties of receptors on
the head of trout Oncorhynchus mykiss. Brain research, 2007. 1166: p. 47-54.
56
Matthews, M., Varga, Z.M. (2012) Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53: 192-204
57
Shadrin, A.M., Ozernyuk, N.D. (2002) Development of the gill system in early ontogenesis of the zebrafish and
nine-spine stickleback. Ontogenez. 33: 118-123.
58
Field, H.A., Ober, E.A., Roeser, T., Stainier, D.Y. (2003) Formation of the digestive system in zebrafish. I. Liver
morphogenesis. Dev. Biol. 253: 279-290.
59
Sakaguchi, T.F., Sadler, K.C., Crosnier, C., Stainier, D.Y. (2008) Endothelial signals modulate hepatocyte
apicobasal polarization in zebrafish. Curr Biol. 18: 1565-1571.
60
Trevarrow, B. (2007) Section 7.59. In: The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio
rerio; Westerfield, M., ed.). Eugene, University of Oregon Press.
61
Westerfield, M. (2007) The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). Eugene,
University of Oregon Press.
62
Wilson, J.M., Bunte, R.M., Carty, A.J. (2009) Evaluation of rapid cooling and tricaine methanesulfonate
(MS222) as methods of euthanasia in zebrafish (Danio rerio). JAALAS 48: 785-789.
63
Grush, J., Noakes, D. (2004) The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio (Hamilton).
Zebrafish 1: 46-53.
64
Grush, J., Noakes, D. (2004) The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio (Hamilton).
Zebrafish 1: 46-53.
55
16
Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed
wurden 65 , 66 . Allerdings ist Eugenol in der Handhabung schwierig, da es extrem
schwer löslich ist, an Oberflächen klebt (z. B. an Keschern und Gefäßen) und zu
Geruchsbelästigungen führt. Somit ist nicht auszuschließen, dass durch Verwendung
von Eugenol Tiere sowie Tierhauspersonal unbeabsichtigt mit Eugenol in Kontakt
kommen können. Die Verwendung von Eugenol wird daher also problematisch
betrachtet. Obwohl Kühlung (Hypothermie) als Betäubungsmittel bei einigen
Knochenfisch-Arten angewendet wird, wird es für adulte Zebrabärblinge nicht
empfohlen. Zur Anästhesie ist MS-222 besser geeignet.
Für eine schonende und schmerzfreie Euthanasie empfehlen Matthews & Varga 67
das Eintauchen in Eiswasser gefolgt von einer Dekapitation. Im Vergleich zu einer
Überdosis MS-222 führt hypothermaler Schock schneller zum Ausbleiben von
Lebenszeichen (Bewegung des Operculums, Gleichgewichtsverlust, und
Herzstillstand), vermutlich weil das Gewebe dieser kleinen Fischen innerhalb weniger
Sekunden auf die letale Temperatur abgekühlt wird. Die Methode ist auch leichter
durchzuführen und sicherer für das Personal als der Gebrauch von MS-22268. Daher
sind weniger Fehler im Laboralltag (z. B. mit der Dosierung) zu erwarten.
Histopathologische Untersuchungen von adulten Zebrabärblingen brachten keinen
Nachweis von Eiskristallbildung 69. Die neuere Forschung hat dazu geführt, dass die
staatliche Gesundheitsbehörde der USA (National Institutes of Health, NIH) nach
langen Diskussionen die Eiswasser-Immersion als humanste Euthanasie-Methode
für Zebrabärblinge anerkannt hat 70.
Für 5 bis 9 Tage alte (‚early stage‘) Embryonen und Larven ist der Gebrauch von
MS-222 auch in sehr hohen Konzentrationen bis 1000 mg/L keine effektive Methode,
um sie abzutöten, da sie ihren Sauerstoffbedarf über die Haut decken. Daher ist
hypothermischer Schock eine effektivere Methode für diese frühen
Entwicklungsstadien, solange sie für mindestens 20 Minuten inkubiert werden.
6.
Krankheitsprophylaxe
Zur Krankheitsprophylaxe zählen alle Maßnahmen die verhindern, dass sich Keime
im System übermäßig anreichern oder neue Keime von außen eingeschleppt und in
den Anlagen verbreitet werden. Somit ist es nötig, sich mit guter Praxis um die Filter-,
Wasser- und Beckenpflege zu beschäftigen. Im Einzelnen sollten folgende
Grundregeln beachtet werden:
65
Palic, D., Herolt, D., Andreasen, C., Menzel, B. (2006) Anesthetic efficacy of tricaine methanesulfonate,
metomidate and Eugenol: Effects on plasma cortisol concentration and neutrophil function in fathead minnows
(Pimephales promelas Rafinesque, 1820). Aquaculture 254: 675-685.
66
Welker, T., Lim, C., Yildirim-Aksoy, M. (2007) Effect of buffered and un-buffered tricaine methanesulfonate
(MS-222) at different concentrations on the stress responses of channel catfish, Ictalurus punctatus. J Appl.
Aquacult.
67
Matthews, M., Varga, Z.M. (2012) Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53: 192-204.
68
Wilson, J.M., Bunte, R.M., Carty, A.J. (2009) Evaluation of rapid cooling and tricaine methanesulfonate
(MS222) as methods of euthanasia in zebrafish (Danio rerio). JAALAS 48: 785-789.
69
Blessing, J.J., J.C. Marshall, and S.R. Balcombe, Humane killing of fishes for scientific research: a comparison
of two methods. Journal of fish biology, 2010. 76(10): p. 2571-7.
70
http://oacu.od.nih.gov/ARAC/documents/Zebrafish.pdf
17
Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed
UV-Strahler müssen regelmäßig kontrolliert und ggfs. entkalkt werden.
Je nach Fischbesatz ist ein 5-20%iger Wasseraustausch mit geeignetem
Wasser pro Tag in den Anlagen anzustreben.
Für die Filterpflege und Beckenreinigung sollten Routinezeiten festgelegt und
dokumentiert werden.
Tote Fische müssen schnellstmöglich aus den Becken entfernt werden und
Aufzeichnungen gemacht werden, um mögliche Gesundheitsproblem
frühzeitig zu entdecken.
Gesunde Becken zuerst, kranke Fische zuletzt versorgen.
Kein Lebendfutter wie Tubifex aus Zoohandlungen verwenden. Lebendfutter
wie Artemien, Paramecien und Rotiferen müssen unter kontrollierten
Bedingungen in der Anlage gezüchtet werden
Fütterung immer vor den Pflegemaßnahmen oder nachdem die Hände
gründlich gereinigt und desinfiziert wurden.
Kescher, Becher und andere Fangeinrichtungen immer nach Gebrauch
gründlich reinigen und trocknen lassen.
Das Bleichen der Eier ist eine wichtige Anforderung. Das sollte der einzige
Weg sein, Fische in die Anlage zu importieren.
Fische und Eier von außerhalb immer zuerst in die Quarantäne nehmen. Von
der Quarantäne nur gebleichte Eier in die Fischanlagen übernehmen niemals
erwachsene Fische.
Strikte Trennung aller Fischräume und Kreisläufe hinsichtlich der
Gerätschaften und Versorgung. Gerätschaften (Netze, Fischbehälter) sollten
vor Einsatz in anderen Räumen nach Möglichkeit autoklaviert werden. Beim
Wechsel von Kreislauf zu Kreislauf ist Händewachen eine wichtige
Prophylaxemaßnahme.
7.
Autoren
Prof. Dr. Herwig Baier
Max-Planck-Institut für Neurobiologie, Martinsried
E-Mail: hbaier@neuro.mpg.de
Prof. Dr. Thomas Braunbeck
Centre for Organismal Studies (COS), Heidelberg
E-Mail: braunbeck@uni-hd.de
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Haltungsbedingungen Zebrabärblinge EUFishBioMed
Dr. Thomas Dickmeis
Karlsruher Institut für Technologie, KIT
E-Mail: thomas.dickmeis@kit.edu
Prof. Dr. Wolfgang Driever
Universität Freiburg
E-Mail: driever@biologie.uni-freiburg.de
Sabine Fischer
Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim
E-Mail: sabine.fischer@mpi-bn.mpg.de
Karin Finger-Baier
Max-Planck-Institut für Neurobiologie, Martinsried
E-Mail: kfinger@neuro.mpg.de
Prof. Dr. Nick Foulkes
Karlsruher Institut für Technologie, KIT
E-Mail: nicholas.foulkes@kit.edu
Dr. Robert Geisler
Karlsruher Institut für Technologie, KIT
E-Mail: robert.geisler@kit.edu
Prof. Dr. Rene Ketting
Institute of Molecular Biology, Mainz
E-mail: r.ketting@imb.de
Enrico Kühn
Max-Planck-Institut für Neurobiologie, Martinsried
E-Mail: ekuehn@neuro.mpg.de
Prof. Dr. Didier Stanier
Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim
E-Mail: didier.stainier@mpi-bn.mpg.de
Prof. Dr. Dr. Manfred Schartl
Biozentrum, Universität Würzburg
E-Mail: phch1@biozentrum.uni-wuerzburg.de
Prof. Dr. Stefan Schulte-Merker
Universität Münster
E-Mail: s.schulte@hubrecht.eu
Prof. Dr . Uwe Strähle
Karlsruher Institut für Technologie, KIT
E-Mail: uwe.straehle@kit.edu
Dr. Nadine Wittkopp
Institute of Molecular Biology, Mainz
E-mail: n.wittkopp@imb.de
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