13. hamburger studierendentagung

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01
13.
HAMBURGER
STUDIERENDENTAGUNG
Tagungsort:
HOCHSCHULE FÜR
ANGEWANDTE WISSENSCHAFTEN HAMBURG
Campus Bergedorf, Hörsaal 0.45
Ulmenliet 20
21033 Hamburg
6
Inhaltsverzeichnis
Seite
Programm
3
Vorträge
5
- 18
Block I
5
-
Block II
10
- 13
Block III
14
- 18
Poster
19
- 46
2
9
Veranstalter:
Life Science Nord Management GmbH
Life Science Nord e.V.
Tagungsorganisation:
Life Science Nord Management GmbH
Markus Kräutner
kraeutner@lifesciencenord.de
In Kooperation mit:
Prof. Friedrich Ueberle (HAW), Prof. Jürgen Stettin (HAW), Prof. Ulrich Hahn (UHH), Prof. Michael Amling (UKE), Dr.
Michael Hahn (UKE), Prof. Michael M. Morlock (TUHH), Prof. Bernd Niemeyer (HSU HH),
Weitere Informationen unter:
www.lifesciencenord.de
Beteiligte Hochschuleinrichtungen:
Hochschule für Angewandte Wissenschaften Hamburg (HAW)
Helmut-Schmidt-Universität / Universität der Bundeswehr Hamburg (HSU HH)
Technische Universität Hamburg-Harburg (TUHH)
Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf (UKE)
Universität Hamburg (UHH)
3
Life Science Unternehmen vor Ort
Gold-Sponsor
Aussteller
4
9.45 - 10.30 Uhr
Block I
Vorsitz: Prof. Dr. Friedrich Ueberle

Application of Total X-Ray Fluorescence (TXRF) Spectrometry to Monitor Trace Elements in the Micro Range
during Fermentation
Richard Arthur, HAW

Druckgesteuertes Ad- und Desorptionsverfahren für die Antikörperaufreinigung
Martin Brillowski, HSU HH

Methodenetablierung zur Bestimmung metabolischer Aktivitäten in einem miniaturisierten
dreidimensionalen Zellmodell
Stephan Fallis, TUHH
5
ABSTRACT
Application of Total X-Ray Fluorescence (TXRF) Spectrometry to Monitor Trace Elements in the
Micro Range during Fermentation
R. Arthur, P. Scherer (HAW, Fak. LS)
TXRF spectrometry has been applied in the last years for the analysis of trace elements in some aqueous
samples. This is due in part to the relatively fast sample preparation, the simultaneous multi-element
capability and its sensitivity in the ppb range (Klockenkämper and von Bohlen, 2014). Hence, the aim was to
adapt the method to monitor the dissolved elements in the µg/L-range during anaerobic fermentation which
gives an insight into the specific consumption and bioavailability during bacterial growth. However, there are
high salts concentrations of phosphates, sulfates, carbonates and bicarbonates in the fermenter slurry, which
could easy prohibit determination of trace elements (Marguí et al., 2010). Another special unresolved problem
of TXRF spectrometry is the ubiquitous overlapping cobalt signal (Kα) by iron signal (Kβ).
Measuring extremely low element concentrations at a high salt background
To overcome the salt problems, several methods were investigated.The concentrations of Co, Ni, Se and W
lay in the range of 10 - 100 µg L-1 (ppb) and the results showed recoveries of all the elements between 89102 %. The calculated lowest limit of detection for all the elements ranged between 1 and 4 µg L-1.
In order to investigate the influence of organic and salt matrices on TXRF analysis, several experiments with
spiked fermenter samples were performed. Co, Ni, Se and W with different amounts in the range of 10 - 200
µgL-1 were applied. The results showed that salty organic samples containing trace elements in the micro
range need to be pretreated by centrifugation and microwave digestion steps.
Figure 1: Layout of sample preparation of fermenter samples for TXRF Analysis.
Estimation of cobalt in high iron fermentation medium
Results with a prepared standard solution containing different amounts of elements showed an overlap of the
Fe (Kβ) and Co (Kα) energy lines as the concentration of Fe may be up to 400 times that of Co in anaerobic
fermenters. This interference generally results in inaccurate evaluation of Co peaks in fermenter and
environmental samples. This interference effect was reduced by application of liquid phase extraction of Fe6
Chloro complexes in ethyl ether. The results of the analyses revealed a reduction of Fe concentration from
25 mgL-1 to < 0.25 mgL-1. The hidden cobalt in the presence of iron could now be detected.
Therefore, it is possible, for the first time, to estimate cobalt at linearity (10 µg L-1 – 1000 µg L-1) in the presence
of about 25, 0000 µg L-1 iron in fermenters with a high salt background by TXRF-instruments.
References
Klockenkämper, R. and von Bohlen, A., 2014. Worldwide distribution of Total Reflection X-ray Fluorescence
instrumentation and its different fields of application: A survey. Spectrochimica Acta Part B: Atomic
Spectroscopy, 99: 133-137.
Marguí, E., Tapias, J.C., Casas, A., Hidalgo, M. and Queralt, I., 2010. Analysis of inlet and outlet industrial
wastewater effluents by means of benchtop total reflection X-ray fluorescence spectrometry.
Chemosphere, 80(3): 263-270.
7
Druckgesteuertes Ad- und Desorptionsverfahren für die
Antikörperaufreinigung
MA Martin Brillowski
Betreuer: Prof. Dr. Oliver Ullrich, HAW; Prof. Dr.-Ing Bernd Niemeyer, HSU HH
Zur Isolierung, Reinigung und Aufkonzentrierung biotechnologischer Wertstoffe kommen
verschiedene Trenn- und Reinigungsverfahren im Downstream Processing zum Einsatz. Ziel ist die
effiziente und aktivitätsschonende Reinstoffdarstellung. Die Affinitätstrennung ist ein solches
Verfahren, das sich die biospezifische Wechselwirkung des Zielstoffes mit einem geschickt
auszuwählenden Liganden zunutze macht. Im Falle von
Antikörpern wären dies z.B. Antigene, die auf eine
Adsorption
Aufgabelösung
Oberfläche, wie Silikagel chemisch angebunden
(immobilisiert) werden. Nach dem Adsorptionsschritt
des Wertstoffes aus der Aufgabelösung an den
Regeneration
immobilisierten Liganden und der Ausspülung von
Resten der Aufgabelösung im Waschgang wird der
interagierende Wertstoff (Antikörper) desorbiert und
ausgespült (siehe Abbildung). Diese Desorption wird
konventionell
meistens
mit
Änderung
des
Desorption
Lösungsmittels, zum Beispiel Veränderung des pHWaschgang
Wertes bzw. durch Temperaturänderung bewirkt.
Als Neuerung in der Masterarbeit soll ein Verfahren erprobt werden, in dem statt mit chemischen
Schematische Darstellung der AffiniZusatzstoffen ausschließlich physikalischen Parameter die Desorption
bewirken. Dabei bietet sich
tätstrennung
der Druck zu einer Steuerung des Ad- bzw. Desorptionsgleichgewichtes an. Als Modellsystem
wurde das Affinitätspaar His6-Rab11a als Ligand (Antigen) und ein dazu spezifischer anti-Rab11
Antikörper als Zielstoff ausgewählt, um den Druckeinfluss auf das Sorptionsverhalten zu
untersuchen. Die Analytik erfolgt über SDS-PAGE sowie anschließendem Western Blot. Die
Immundetektion der Antikörper kann sowohl mittels Chemielumineszenz als auch Fluoreszenz
erfolgen.
Ein weiterer Fokus liegt auf der Erprobung unterschiedlicher Immobilisierungsverfahren und
deren Wirkung auf den oben aufgezeigten Stofftrennprozess.
Die Ergebnisse belegen den Einfluss der Immobilisierungsprozedur auf die AK-Trennung.
Weiterhin konnte die Wirkung unterschiedlicher Drücke zur adsorptiven Stofftrennung bestätigt
werden.
8
Etablierung einer Methode zur Bestimmung metabolischer Aktivität
in einem miniaturisierten dreidimensionalen Zellmodell
Stephan Fallis, Studiengang M.Sc. Mediziningenieurwesen, Technische Universität Hamburg
Ziel: Medizinische Substanzen werden noch immer mit Hilfe von umstrittenen und zunehmend
verbotenen Tierversuchen erprobt, bevor diese am Menschen validiert werden. Die Aussagekraft
von Medikamententests ist ohnehin stark begrenzt, wenn Ergebnisse von Tieren auf den
Menschen übertragen werden, weshalb ein sehr hoher Anteil der erfolgreichen Sicherheits- und
Wirkungstestungen am Tier beim Menschen versagen. Eine mögliche Alternative wird durch
sogenannte organ-on-a-chip geboten, in welche Zellen im dreidimensionalen Mikromaßstab unter
Langzeit-Kultivierung gezüchtet werden können. Ein Zellenverbund im organspezifischen Kontext
soll den entsprechenden funktionalen und charakteristischen Metabolismus eines nativen Organs
möglichst realitätsnah ausführen.
Diese Projektarbeit befasst sich mit Hautmodellen und deren Charakterisierung für Diffusions- und
Permeationsprozesse in einem Multi-Organ-Chip der Firma TissUse GmbH. Zu diesem Zweck
werden Keratinozyten der Zelllinie HaCaT und primäre Fibroblasten im Verbund kultiviert und
deren metabolische Aktivität durch experimentelle Untersuchungen beschrieben. Die
Konzentrationsänderung von Stoffwechseledukten und -produkten wird durch die Ermittlung von
Glukoseverbrauch und Laktatprodukion der einzelnen Modelle dargestellt. Dazu muss eine
geeignete Methode etabliert werden, mit welcher sich Messwerte bestimmen lassen und in
nachfolgenden Untersuchungen eingesetzt werden kann.
Methoden: Zunächst wurden zwei verschiedene Kollagen-Gel Modelle in „Transwell® Permeable
Supports Inserts“ untersucht. Beim ersten Modell wurden lediglich HaCaT auf das ausgehärtete
Kollagen aufgebracht (KH), beim zweiten Modell wurden zusätzlich vor der Aushärtung noch
Fibroblasten in das Gel eingebettet (KFH). Die metabolische Untersuchung von Glukose und
Laktat wurde in Abhängigkeit der Zeit in einem Kurzzeitversuch (kurz = Probenentnahme alle zwei
Stunden) und Langzeitversuch (lang = zwei Probenentnahmen pro Tag) durchgeführt. Im letzten
Schritt wurde ein vereinfachtes Hautmodell (MFH) bestehend aus MatriDerm® (Kollagen-ElastinMatrix) mit eingebetteten Fibroblasten und aufgebrachten HaCaT hergestellt und untersucht.
Ergebnisse: Für die Zellmodelle wurden folgende Daten durch linearer Regression berechnet,
wobei die Werte für KH zu gering ausfielen und nicht dargestellt werden: Der Glukoseverbrauch in
g/(l∙s) von KFH lag zwischen 6,1∙10-6 (lang) bis 6,7∙10-6 (kurz) und die Laktatproduktion in g/(l∙s)
zwischen 27,5∙10-6 (lang) bis 37,8∙10-6 (kurz). In den Versuchen mit MFH konnte ein
Glukoseverbrauch in g/(l∙s) zwischen 7,9∙10-6 (lang) bis 24,9∙10-6 (kurz) und eine Laktatproduktion
in g/(l∙s) zwischen 7,5∙10-6 (lang) bis 15,9∙10-6 (kurz) ermittelt werden. Weiterhin ließen sich
Verdunstungseffekte des Mediums in den Langzeitversuchen feststellen, welche womöglich einen
negativen Einfluss auf die Qualität der Ergebnisse besitzen.
Schlussfolgerung: Eine Methode zur Bestimmung metabolischer Aktivität in einem miniaturisierten dreidimensionalen Zellmodell konnte erfolgreich etabliert werden. Eine Voraussetzung für die
Anwendung an Hautmodellen ist der Einsatz von Fibroblasten, die ohnehin für die Herstellung von
hautähnlichen Modellen notwendig sind. Es konnte nachgewiesen werden, dass bereits in Kurzzeitversuchen von ca. 8 Stunden bei geeigneten Modellen metabolische Veränderungen durch die
Konzentrationsbestimmung von Glukose und Laktat in experimentellen Untersuchungen detektierbar sind. Weiterhin sind Langzeitversuche über mehrere Tage aufgrund der Verdunstungseffekte
kritisch in der Durchführung und sollten vermieden werden.
Der Glukoseverbrauch und die Laktatproduktion von miniaturisierten Hautmodellen mit Fibroblasten können mit dieser Methode berechnet werden und die resultierenden Ergebnisse könnten für
weitere Untersuchungen zur Charakterisierung in einem Multi-Organ-Chip genutzt werden.
9
11.15 - 12.00 Uhr
Block II
Vorsitz: Prof. Dr. Ulrich Hahn

Next Generation Sequencing - eine unverzichtbare Technologie zur Identifizierung der genetischen Ursache
bei seltenen monogenen Erkrankungen
Frederike Harms, UKE

Entwicklung einer lichtbasierten Therapie zur Behandlung des Hand-Fuß Syndroms
Monika Eversmann, HAW

3D Finite Elemente Simulation der Polarisation und des Transmembranpotentials bei elektromagnetischer
Exposition biologischer Zellen im Radiofrequenzbereich
Nils Kielian, HSUHH
10
Abstract Studierendentagung 2016 – Frederike L. Harms
Next-Generation Sequencing – Eine unverzichtbare Technologie zur Identifizierung der
genetischen Ursache bei seltenen monogenen Erkrankungen
Per Definition gilt eine Erkrankung in der Europäischen Union als selten, wenn nicht mehr als 5
von 10.000 Menschen betroffen sind. Schätzungen zufolge leben etwa vier Millionen Menschen
in Deutschland mit einer von weltweit etwa 8.000 bekannten seltenen Erkrankungen – eine nicht
zu vernachlässigende Anzahl an Patienten, deren klinische Versorgung und Therapie sichergestellt werden muss.
Obwohl für viele nach den Mendel’schen Regeln vererbte Erkrankungen das ursächliche
Krankheitsgen bereits bekannt ist, gibt es auch heutzutage noch viele Patienten ohne eine
molekulare Diagnose. Die Next Generation Sequencing (NGS) – Technologie ist im Vergleich zu
der klassischen Sanger-Sequenzierung eine schnelle, effektive und kostengünstige Methode zur
Aufdeckung der genetischen Ursache bzw. Identifizierung von Krankheitsgenen für seltene monogene Erkrankungen. Hierbei wird das gesamte humane Genom (Whole Genome Sequencing,
WGS) bzw. große Teile, so z. B. alle kodierenden Sequenzabschnitte (Whole Exome Sequencing,
WES), in einem Sequenzieransatz analysiert. Durch eine bioinformatische Analyse und Filterung
der NGS-Sequenzdaten sowie nachfolgende Evaluierung und Validierung der etwa 20.000 bis
30.000 Sequenzvarianten pro Person werden schließlich solche identifiziert, die putativ mit der
Krankheit in Zusammenhang stehen.
Im Rahmen unseres Forschungsprojektes habe ich bislang die WES-Sequenzdaten von sieben
Eltern-Kind-Trios, fünf Geschwisterpaaren sowie zwei Betroffenen und einem Gesunden aus einer
großen Familie ausgewertet. Die Krankheitsbilder sind vielfältig, aber eine monogene Ursache ist
bei allen Betroffenen sehr wahrscheinlich. Bei fünf der sieben Eltern-Kind-Trios konnte eine de
novo Mutation in einem bereits für die jeweilige Erkrankung bekannten Krankheitsgen identifiziert
werden. Für drei bereits in den ersten Lebensmonaten verstorbene Geschwisterkinder mit dem
sogenannten „stiff baby syndrome“ sowie für eine Familie mit mehreren, von einer chronischen
Lebererkrankung betroffenen Personen konnten die Sequenzvarianten durch eine Segregationsanalyse in der jeweiligen Familie auf jeweils eine putativ pathogene Sequenzveränderung reduziert werden. Transkript-Analysen sollen nun zeigen, ob die mutierte mRNA aberrant gespleißt,
stabil ist oder abgebaut wird. Für ein Geschwisterpaar mit mentaler Retardierung identifizierte ich
im Rahmen einer internationalen Kollaboration ein neues Krankheitsgen. Erste funktionelle Analysen zeigen einen Funktionsverlust des von den mutierten Allelen kodierten Transkriptionsfaktors
in seiner DNA-Bindeaffinität.
Mit einer Aufklärungsrate von 62% ist damit eindrücklich gezeigt, dass die neuen Sequenziertechnologien, und hier das WES, entscheidend zu einer molekularen Diagnose und gegebenenfalls
sogar zur Prophylaxe oder Therapie der untersuchten Erkrankungen beitragen. Durch weiterführende funktionelle Untersuchungen, sowohl auf RNA- als auch auf Protein-Ebene, wollen wir Einblicke in die molekularen Grundlagen und damit in den Pathomechanismus ausgewählter Krankheitsbilder erhalten.
11
Entwicklung einer lichtbasierten Therapie für die Behandlung des HandFuß Syndroms
Monika Eversmann
Medizintechnik, Betreuer: Prof. Dr.Ing Friedrich Überle und Prof. Dr. Jürgen Stettin
Bachelorarbeit
Abstract
Hintergrund Das Hand-Fuß Syndrom (HFS) eine sehr häufig auftretende Nebenwirkung
der Chemotherapie. Es ist durch eine deutlich eingegrenzte Reaktion der Haut an Hand- und
Fußflächen charakterisiert und beinhaltet ein breites Spektrum an Symptomen, welches sich
über Kribbeln,
Erythema, Schwellungen, Schmerzen, Blasen- und Geschwürbildung
erstreckt. In vielen Fällen sind die Patienten durch Schmerzen, offene Blasen und
Geschwürbildung stark in ihrem alltäglichen Leben eingeschränkt. Das Ziel dieser
Bachelorarbeit war es, eine Theorie zur Entstehung und Behandlung des HFS aufzustellen.
Methode
Es wurde eine ausführliche Literatursuche in Pubmed und google
scholar durchgeführt, um Publikationen zu den Ursachen, Symptomen und Pathogenese des
HFS zu identifizieren.
Ergebnisse Es wurden 93 Publikationen identifiziert von denen sieben inhaltlich und
qualitativ ausreichend waren, um eine Theorie für die Entstehung des HFS aufzustellen. Der
Großteil der Publikationen deutet darauf hin, dass es sich bei dem HFS um eine
Entzündungsreaktion der Haut handelt, welche durch die Medikamente der Chemotherapie
ausgelöst werden. Diese Entzündung kann mithilfe von Magnetfeldern oder blauem Licht
behandelt werden. Diese Theorie wurde anhand einer weiteren Literaturrecherche überprüft.
Anhand der zweiten Literaturrecherche wurde eine Behandlungsmethode für das HFS
entwickelt, welche in Zukunft über eine Machbarkeitsstudie belegt wird.
Fazit Das HFS kann durch eine physikalische Therapie behandelt werden, allerdings muss
die Wirksamkeit dieser Methode in Zukunft belegt werden.
Development of a light-based treatment method for the hand-foot
syndrome
Monika Eversmann
Biomedical engineering, Supervisor: Prof.Dr.Ing Friedrich Überle, Prof.Dr. Jürgen Stettin
Bachelor Thesis
Abstract
Background The hand-foot syndrome is a frequent occurring side effect of the
chemotherapy. It is characterized by a clearly localized reaction of the skin on the palms of
hands and feet. It includes a broad spectrum of symptoms like tingling sensation, erythema,
swellings, pain, ulceration and blister formation. In many cases patients are highly impaired
in their daily lifes by pain, open ulcers and blisters. The aim of this bachelor thesis was to
postulate a theory as to how the HFS originates and can be treated.
Method
A detailed literature search was performed in Pubmed and google
scholar in order to identify publications about the cause, symptoms and pathogenesis of the
hand-foot syndrome.
Results
93 publications were identified, of which seven had sufficient content
and quality in order to postulate a theory as to how the HFS originates. The majority of
publications indicate that the HFS is an infectious skin reaction, which is caused by the
medication of the chemotherapy. This infection can be treated by magnetic fields or blue
light. This theory was assessed by another literature search. According to the second
literature search a treatment method for the HFS was developed, which needs to evaluated
during a feasibility study.
Conclusion The HFS can be treated by a physical treatment, but the effectiveness of this
method needs to be evaluated in the future.
12
3D Finite Elemente Simulation der Polarisation und des Transmembranpotentials bei elektromagnetischer Exposition biologischer Zellen im Radiofrequenzbereich
Nils Kielian, Sebastian Böhmelt, Michael Dudzinski, Marco Rozgic,
Lars-Ole Fichte, Marcus Stiemer
Helmut-Schmidt-Universität / Universität der Bundeswehr
Ziel: Durch eine ungleiche Verteilung verschiedener Ionen innerhalb und außerhalb einer
Zelle entsteht eine Potentialdifferenz, die als Transmembranpotential (TMP) bezeichnet wird.
Das TMP beeinflusst maßgeblich den Zellstoffwechsel, insbesondere die Fähigkeit einer Zelle, ihren pH-Wert zu regulieren. Hiervon ist wiederum die Wirksamkeit essenzieller Enzyme
abhängig. Die zelluläre Kontrolle des pH-Wertes geschieht über aktive und passive Transportmechanismen in der Zellmembran. Wird die Zelle nun einem äußeren elektrischen Feld
ausgesetzt, so wird hierdurch die Zellmembran polarisiert, was zu einem veränderten TMP
und somit zu einer Beeinträchtigung der transmembranen Transportmechanismen führen
kann. Das Ziel dieser Arbeit ist die Bestimmung der Polarisation und des TMPs einer Zelle in
Abhängigkeit von ihren geometrischen Eigenschaften anhand einer numerischen Simulation.
Methode: Die durchgeführte numerische Simulation basiert auf der Methode der Finiten
Elemente. Diese wird zur Lösung der elektroquasistatischen Approximation der Maxwellgleichungen eingesetzt. Das elektroquasistatische Modell beschreibt die Dynamik kapazitiver
Felder. Diese entstehen über der Zellmembran infolge der durch ein äußeres Wechselfeld
bewirkten Verschiebung von Ladungsträgern zu den Grenzflächen der Zellmembran. In der
Regel besitzen biologische Zellen eine sehr dünne, schlecht leitende Zellmembran, welche
maßgeblich für die elektrischen Eigenschaften der Zelle im Frequenzbereich von 10kHz –
100 MHz verantwortlich ist (Bereich der β-Dispersion).
Um das dispersive Verhalten biologischer Zellen zu simulieren, wird ein vereinfachtes 3DZellmodell, welches auf das Zellinnere, die Zellmembran und die extrazelluläre Elektrolytlösung reduziert ist, eingesetzt. Da Zellen mit einer Membrandicke von wenigen Nanometern
und einem Zellradius im Mikrometerbereich numerisch schwierig zu behandeln sind, wurde
eine iterative Gebietszerlegungsmethode verwendet. So lassen sich numerische Lösungen
gebietsweise separat berechnen und über die Übergangsbedingungen für das elektrische
Feld, die elektrische Fluss- und die elektrische Stromdichte miteinander koppeln.
Der Algorithmus wurde anhand analytisch berechenbarer Beispiele verifiziert und durch Bestimmung des dispersiven Verhaltens einer Kugelzelle im elektrischen Feld validiert.
Ergebnisse: Mit dem entwickelten Iterationsverfahren konnte der β-Dispersionsverlauf für
verschiedene Zellgeometrien qualitativ und quantitativ simuliert werden. Darauf aufbauend,
wurden Parameterstudien durchgeführt, wobei die Lage einzelner Zelle verändert, die Außenraumgeometrie des Zellmodells variiert, die Form der Zelle von einer Kugel zu unterschiedlichen Ellipsoiden abgewandelt und die Membrandicke geändert wurden. So konnte
das TMP der Zellen ermittelt und dessen Abhängigkeit von Zell- und Feldeigenschaften dargestellt werden.
Schlussfolgerung: Die entwickelte Methode ermöglicht die Bestimmung einer zellulären Befeldungsdosis und ist somit Voraussetzung für die Identifikation einer Dosis - Wirkungsbeziehung elektrischer Felder auf biologische Zellen. Ferner zeigt sich, dass die Effekte infolge
der Abweichung realer Zellen von Zellen mit idealisierter Geometrie um Teil signifikant sind.
Dies belegt die Bedeutung des entwickelten Modells im Vergleich zum bisherigen Stand der
Forschung. Die Methode soll in folgenden Untersuchungen auf unterschiedliche Zelltypen
angewendet werden. Ferner kann die durch Kanalproteine ortsabhängige Leitfähigkeit der
Zellmembran zukünftig berücksichtigt werden.
13
15.15 - 16.15 Uhr
Block III
Vorsitz: Prof. Dr. Michael M. Morlock

Immunstimulatorische Eigenschaften des Entamoeba histolytica Lipopeptidphosphoglykans und davon
abgeleiteten synthetischen Analoga
Sarah Corinna Lender, Uni HH, BNITM

Die Bedeutung von CD73-Polymorphismen für die akute Abstoßung nach Lebertransplantation
Lena Onken, UKE

Quantitative in vivo stem cell tracking with Magnetic Particle Imaging
Marc Philip von See, TUHH

Automatic Detection and Classification of Early Repolarization on a 12-Lead Electrocardiogram
Johnson Bankole, HAW
14
Immunstimulatorische Eigenschaften des Entamoeba histolytica Lipopeptidphosphoglykans und davon abgeleiteten synthetischen Analoga
Einleitung/Ziel
Bei der, durch Leishmania major verursachten, kutanen Leishmaniose handelt es sich um
eine weltweit verbreitete, parasitäre Erkrankung, gegen die zur Zeit keine sichere Behandlung existiert [WHO, 2009]. Die Entwicklung eines Medikamentes, welches die wirtseigene
Immunabwehr in der Haut aktivieren kann, wäre zur lokalen Behandlung der kutanen
Leishmaniose geeignet und könnte die derzeitigen Therapie-Optionen sinnvoll ergänzen.
Das Lipopeptidphosphoglykan aus E. histolytica (EhLPPG) weist immunstimulatorische Eigenschaften, aufgrund der Fähigkeit iNKT-Zellen stimulieren zu können, auf [Lotter et al.,
2009]. Da native Moleküle wie EhLPPG jedoch nicht unter GMP-Bedingungen hergestellt
werden können, bieten synthetische Analoga dem gegenüber große Vorteile, wie beispielsweise die Möglichkeit Modifikationen einzufügen.
In dieser Arbeit wurden die synthetischen Analoga des EhLPPGs auf ihre Fähigkeit hin, die
Zytokinproduktion in humanen Immunzellen zu induzieren untersucht, sowie ihre Auswirkungen auf murine und humane L. major-infizierte Makrophagen.
Methoden
Das, durch synthetische Analoga des EhLPPGs, induzierte Zytokinprofil wurde mit Hilfe des
LEGENDplex Assays von BioLegend sehr elegant bestimmt. Er basiert auf dem Prinzip des
Cytometric Bead Array und ermöglicht die Quantifizierung von 13 verschiedenen Zytokinen
im FACS.
Zur Beurteilung der Anti-Leischmanien Aktivität der synthetischen EhLPPG-Analoga wurden
zunächst murine und humane Makrophagen generiert und mit Leishmania major infiziert.
Nach Behandlung der Zellen mit den synthetischen Molekülen wurde die genomische DNA
(der Makrophagen und entsprechend der enthaltenen intrazellulären Parasiten) isoliert. Mit
Hilfe einer qPCR mit TaqMan Sonden wurde die relative Parasitenlast bestimmt und die
Wirksamkeit der synthetischen Analoga des EhLPPGs charakterisiert.
Ergebnisse
Im Gegensatz zum nativen EhLPPG, welches bei allen untersuchten Zytokinen (IFNγ, TNFα,
IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17A, IL-17F, IL-21 und IL-22) eine erhöhte Produktion induzierte, führten die synthetischen Analoga zu einer differenziert-erhöhten Zytokinproduktion. Ein Analogon induzierte eine vermehrte Produktion von TNFα, IL-17A, IL-9 und IL22, wohingegen ein anderes Analogon zu einer signifikant höheren Produktion von IL-13 und
IL-6 führte.
Die relative Parasitenlast nach in vitro Infektion mit L. major wurde nach Behandlung mit den
synthetischen Analoga des EhLPPGs signifikant gesenkt. Dabei zeigten jedoch bei murinen
Makrophagen andere Moleküle als bei humanen Zellen eine signifikante Anti-LeishmanienAktivität.
Schlussfolgerung
Je nach Molekülstruktur wird durch die Stimulation mit synthetischen Analoga des EhLPPGs
ein anderes Zytokinprofil induziert. Die Modifikation der Moleküle bietet daher eine gute Möglichkeit, um je nach gewünschter Therapieanwendung das induzierte Zytokinprofil und damit
die Wirkungsweise zu manipulieren.
Auch zur Behandlung der kutanen Leishmaniose stellen die synthetischen Analoga des
EhLPPGs eine vielversprechende Therapieoption dar, welche nicht gegen den intrazellulären
Erreger gerichtet ist, sondern das Immunsystem dabei unterstützt die Parasiten selbst zu
eliminieren.
Literatur:
Lotter, H., González-Roldán, N., Lindner, B., Winau, F., Isibasi, A., Moreno-Lafont, M., Ulmer, A. J., Holst, O., Tannich, E.,
Jacobs, T. Natural Killer T Cells Activated by a Lipopeptidophosphoglycan from Entamoeba histolytica Are Critically Important
To Control Amebic Liver Abscess. PLoS pathogens, 5:e1000434, 2009.
WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organization, Technical Report Series, 949, 2010.
15
Titel: Die Bedeutung von CD73-Polymorphismen für die akute Abstoßung nach
Lebertransplantation
Die Organtransplantation ist für viele Lebererkrankungen die einzige kurative
Therapiemöglichkeit.
Dabei
sind
akute
Abstoßungsreaktionen
häufig.
Diese
Abstoßungsreaktionen verschlechtern das Outcome. Um sie zu verhindern, ist bei jedem
Patienten eine lebenslange Immunsuppression notwendig, die mit schweren
Nebenwirkungen einhergehen kann. Ziel muss es sein die Dosis der Medikamente in einem
individuellen Therapieprotokoll gering zu halten, ohne das Risiko der Transplantatabstoßung
zu erhöhen. Dafür ist es notwendig das Abstoßungsrisiko der Personen vor Transplantation
abschätzen zu können. Es kann neben anderen Faktoren genetische Einflüsse in Form von
single nucleotide polymorphismen (SNP) auf das Abstoßungsrisiko geben, die als Biomarker
diagnostischen Wert für die Kalkulation des Risikos einer Abstoßungsreaktion haben
könnten.
Gesucht werden daher Biomarker in Form von SNPs auf der DNA aus dem Blut der
Organempfänger. In der vorliegenden Arbeit werden drei SNPs (rs9450279, rs4458647 und
rs6922) untersucht, die in der Region der DNA liegen, die für das Protein CD73 kodieren. Es
ist bekannt, dass Adenosin als Produkt des Enzyms CD73 in Zusammenhang mit der
Regulation des Immunsystems und der Regulation von Entzündungsmechanismen steht und
auf diese Weise die akute Abstoßung nach Lebertransplantation beeinflussen könnte. Darum
wurden die drei SNPs ausgewählt, um zu analysieren, ob sie mit akuter
Lebertransplantatabstoßung assoziiert sind.
Erstlebertransplantierte Patienten mit akuter Abstoßung (n=70) und Patienten ohne akute
Abstoßung (n=137) werden miteinander verglichen. Es handelt sich um ein retrospektives
Studiendesign mit einem Beobachtungszeitraum von 365 Tagen. Einschlusskriterium ist eine
Immunsuppresion nach standardisiertem Protokoll. Alle Personen wurden am UKE
transplantier. In die spätere Auswertung werden auch das Geschlecht, das Alter bei
Transplantation, die Indikation zur Transplantation und die immunsuppressive Therapie mit
einbezogen.
Mit der isolierten DNA aus den Blutproben der Patienten werden die drei SNPs
durch Endpoint Genotyping am LightCycler bestimmt.
Es wurde in Form einer explorativen, multivarianten Analyse unter Einbezug von Geschlecht
und Alter die Assoziation zwischen den CD73-SNP und akuter Abstoßung analysiert. Für das
dominante Vererbungsmodel (rs9450279 CC+CTTT p=0,566, rs4458647 CCCT+TT
p=0,566 rs6922 GG+GTTT p=0,106),sowie für das rezessive Vererbungsmodell
(rs9450279 CC CT+TT p=0,557, rs4458647 CC+CTTT p=0,506, rs6922 GGGT+TT
p=0,555) als auch für das kodominate Vererbungsmodell (rs9450279CCCT p=0,649/
TTCT p=0,652, rs4458647 CCCT p=0,666/ TTCT p=0,592, rs6922 GGGT p=0,248/
TTGT p=0,061) wurden keine signifikanten Unterschiede in der Verteilung der SNPs
zwischen dem Kollektiv mit Abstoßung und ohne Abstoßung gefunden.
Die Ergebnisse geben keinen Hinweis auf eine Assoziation zwischen den CD73 SNP und
einer akuten Abstoßung nach Lebertransplantation. Diese SNPs sind deshalb ungeeignet,
um das Risiko einer Abstoßungsreaktion präoperativ zu kalkulieren.
16
Quantitative in vivo stem cell tracking with Magnetic Particle Imaging
Introduction
Magnetic Particle Imaging (MPI) is a new tracer imaging modality with high sensitivity and
ideal contrast that does not use ionizing radiation and employs superparamagnetic iron oxide
nanoparticles (SPIONs), i.e. Resovist®, as kidney-safe contrast agent. Linearity and shiftinvariance properties for image reconstruction have been shown in theory, simulation and
experiment. Current hardware provides a resolution on the millimeter scale and MPI signal is
not attenuated by organic tissue in theory. Any stem cell therapy approach requires targeted
cell delivery and successful cell engraftment. Targeted cell delivery remains an open challenge. Labeling human mesenchymal stem cells (hMSC) with Resovist® is known to be efficient, persistent, biocompatible, safe and non-toxic. In this work, injected, Resovist® labeled
hMSC were detected and roughly quantified in vivo with MPI.
Methods
All MPI studies were performed on a 3D MPI scanner with 7 T / m magnetic field gradient.
Six pairs of MPI and fluorescent tracer samples were embedded equivalently under porcine
tissue layers with increasing tissue depth to compare their signal intensity attenuation.
A calibration of the hardware was performed to obtain the relation of MPI signal intensity to
amount of Resovist® using Resovist® standards. Stem cells were labeled with Resovist® and
average encapsulated cellular amount of Resovist® was determined by MPI and ICP assay.
Cell viability and labelling efficiency were investigated after labeling.
Briefly, four groups of rats anesthetized under isoflurane received tail vein injections of 5×106
to 8×106 Resovist-labeled hMSCs in 1 mL PBS (n=3, Groups 1 and 2), 100 μL Resovist
stock solution diluted to 1 mL in PBS (n=3, Group 3), or 1 mL isotonic saline solution (n=3,
Group 4). Groups 1, 3 and 4 were sacrificed one hour after injection for immediate postmortem MPI and CT imaging. Group 2 animals were monitored and imaged with MPI in vivo at 1,
3, 6, and 9 days post injection and were sacrificed via isoflurane at day 12 followed by postmortem MPI and CT imaging.
Results
The comparison of MPI versus fluorescent signal intensity of tracers embedded equivalently
under porcine tissue layers with increasing tissue depth indicates that the MPI signal remains
constant whereas the optical signal attenuates exponentially with tissue depth.
Resovist labeling of mesenchymal stem cells with a labeling concentration of 40 µg Fe / mL
resulted in a labeling efficiency of about 95-100% of the cells containing iron according to
Prussian blue staining and average iron uptake was 77.7 pg / cell. An MTT assay revealed
no significant difference in viability between labeled and unlabeled hMSC batches.
In post-mortem animals scans 1 hour after injection (Group 1), strong MPI signal intensity
could be located in the lungs corresponding to approximately 52 ng Fe / mm³ in lung tissue.
This indicates that hMSC get initially entrapped in the lung vasculature due to a first-pass
effect and is in accordance with literature. At 12 days post injection (Group 2), MPI imaging
indicates a significant decrease in total iron content of the animals with a relocation of the
majority of the signal to the liver. Animals with pure Resovist injections (Group 3) showed
immediate uptake of the tracer into the liver, consistent with reports of the biodistribution of
Resovist after systemic administrations. No MPI signal was detected from the saline-only
injected animals (Group 4).
The longitudinal in vivo MPI scans of Group 2 animals at 1, 3, 6, and 9 days post injection
show a gradual redistribution of labeled hMSC from the lungs to the liver as early as 24
hours after injection. The liver signal also decayed with an average half-life of 4.6 days.
Conclusion
Current stem cell tracking techniques are either based on optical signals that are highly attenuated by organic tissue (i.e. fluorescent or bioluminescent tracers), employ ionizing radiation (i.e. X-ray based and scintigraphic methods), or give negative contrast (MRI). In this
work, Magnetic Particle Imaging was successfully used for in vivo stem cell tracking in rats
for the first time. MPI has none of the above stated drawbacks and can well be used to noninvasively detect and roughly quantify Resovist® labeled hMSC with excellent contrast and
high sensitivity.
17
Thema: Automatic Detection and Classification of Early Repolarization on a 12-Lead
Electrocardiogram
Name: Johnson Bankole, Biomedical Engineering, HAW Hamburg
Betreuer: Prof. Dr. Petra Margaritoff (HAW Hamburg) and Prof. Dr. Renate Schnabel (Universitäres
Herzzentrum Hamburg)
Fachgebiet: Biosignal Processing and Bioinformatics
Art der Arbeit: Master-Thesis
ABSTRACT
BACKGROUND: Early repolarization (ER) is defined as an elevation of the QRS-ST segment in at least
one inferior or lateral leads on the 12-lead ECG. ER is a clinically relevant phenotype that has been
associated with increased mortality which is reported to be as high as 10% in the general population and
even higher in some healthy subgroup.
In order to enhance clinical diagnosis of ER, this thesis aims to develop an algorithm that can automatically
detect and classify signs of early repolarization pattern (ERP) on an electrocardiographic (ECG) tracing.
The algorithm output is expected to be a classification of whether an ECG response segment is ‘normal’,
‘slurred’ or ‘notched’.
METHODS: Training, test and cross-validation sets of normal ECG tracings were selected from synthetic
ECG data produced in matlab and ECG from PTB database, with sampling rate of 500 samples/sec. Both
slurring and notching were randomly added to the end part of the QRS complex of some of the ECGs from
both sets. The ECG signals were preprocessed using multi-beat averaging method for each lead. The
zerocrossing detection of salient points, such as peaks, troughs and points of inflection were done reliably
using signal derivatives. A neural network pattern recognition classification model was then applied to each
set of the ECG tracings.
RESULTS: The algorithm was applied to a composite simulated and real ECG containing normal, slurred
and notched segments.
CONCLUSIONS: This paper has demonstrated that automatic detection and classification of each the
three segments on a 12-Lead ECG can indeed be done with very high level of accuracy, and specificity and
sensitivity. The automated classification method could be used to enhance clinical diagnosis and treatment
of patients with Early repolarization.
18
Poster
Poster-Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Vorname
Nils
Merle
Nicole
Derya
Ole
Silke
Tobias
Tigran
Fabian
Ramin
Moritz
Christian
Florian
Robin
Lars
Christina
Katharina
Patrycja
Janet
Sebastian
Deniz
Jana
Niklas
Jens
Abtin
Daniel
Thilo
19
Name
Rademacher
Rotzoll
Hilsenbeck
Katik
Struck
Allers
Schäfer
Kharatyan
Müller
Shakiba
Eickmeyer
Witte
Miera
Sieg
Radtke
Burmeister
Klüver
Kadlubowska
Hirsch
Antonczyk
Lehnert
Kreins
Widderich
Beringhoff
Rad
Schetelig
Sothmann
Abstract: Caffeine as environmental marker
Elisabeth Engler-Hüsch, Nils Rademacher, Prof. Dr. S. Töfke
Caffeine can be used to detect fecal contaminations in running waters. During this work the
detection and the determination method by means of HPLC and DAD were optimized. Solid
phase extraction was used for preconcentration of trace quantities of caffeine before
determination (measuring range: β(Caffeine) = 10 µg l-1 – 100 µg l-1). The caffeine content of
samples from different running waters and plants were examined. Zea mays was used as a
model plant for the uptake of caffeine.
The aim of this work was to determine the optimal solvent mixture for isocratic elution, the
flow rate and the stationary phase of the separating column to get an optimal separation of
caffeine and interfering peaks with a good resolution. Furthermore the caffeine concentration
of different water samples had to be determined. The model plant was used to determine the
amount of caffeine a plant takes up from an available amount.
The approach was a solid phase extraction of the water samples and a caffeine
determination with the HPLC. The maize plants swelled and sprouted. Afterwards the plants
were growing in a caffeine solution for two weeks. The plant samples were dried and a direct
extraction was performed before solid phase extraction and caffeine determination.
The results of the optimization were a flow substance composition of 12% acetonitrile and
88% ultrapure water at a flow rate of 1 ml min-1, and the use of the column RP-select B.
Furthermore the measuring range (β(Caffeine) = 10 µg l-1 – 100 µg l-1) with a detection limit of
0.89 µg l-1 and a limit of quantification of 3.01 µg l-1 was determined.
The result of the water samples from the river Trave is a higher caffeine concentration after
intake of a wastewater treatment plant (17.09.2014: 1.28 µg l-1; 11.02.2015: 0.35 µg l-1)
compared to the caffeine concentration before the intake (17.09.2014: 0.09 µg l-1;
11.02.2015: 0.17 µg l-1). The sample from the river Alster has a caffeine concentration of
0.27 µg l-1. In every water sample trace quantities of caffeine were detected. This implies the
fecal contamination of the waters by human beings. The caffeine concentrations are in a
range of 90 to 1300 ng l-1.
The investigation of algae from the river Trave (11.05.2015) has as result a caffeine content
of 0.92 µg(caffeine)/mg(sample). The maize plant (growing in caffeine solution) has a caffeine
content of 60.34 μg(caffeine)/mg(sample). The caffeine content in the roots is 52.11
μg(caffeine)/mg(sample).
20
21
Molecular biological investigation of the P3 region of hepatitis A virus
N. Hilsenbeck, M. Schübel and Prof. Dr. B. Flehmig
Abstract
The aim of the molecular biological investigation of the faster growing variant SPS of the
hepatitis A virus (HAV) from Mediagnost GmbH (Reutlingen) was to identify nucleotide
changes in the variant compared to the original hepatitis A virus strain GBM. Therefore, the
P3 region of the HAV genome was amplified, cloned, sequenced and analysed.
Subpopulations were found in both strains and eight nucleotide changes were identified in
the variant. Five of the eight SPS nucleotide changes were located in the region 3D which
codes for the RNA-dependent RNA polymerase. This could be one of the reasons for a
better growth of the HAV variant SPS. The other three nucleotide changes in the variant
HAV SPS were found in the 3A region of the HAV genome which codes for the precursor of
the VPg (virus protein genomic) that acts as the primer for the RNA replication. Four of the
eight SPS nucleotide changes led to a change in the amino acid sequence. Additionally, it
could be shown that the found nucleotide changes were established by continuing passaging
of the variant. This applies for nucleotide changes with a change in the amino acid sequence
as well as for the silent nucleotide changes.
22
Is there a difference in Heart Rate Variability
between Heavy Snoring and Obstructive Sleep Apnea?
Sarah Bahn B.Sc., Derya Katik B.Sc., Atabek Bicer B.Eng., Duygu Kabaktepe B.Sc.,
Dr. med. Egbert Happe, Prof. Dr. Jürgen Lorenz
ABSTRACT
Objective: With age, around 60% of men snore, with 36% considered as heavy snorers, and
41% of women snore, including 20% heavy snorers3. Sleep apnea is a common sleep
disorder that is characterized by pauses in breathing or shallow breathing during sleep5.
Symptoms may be daytime sleepiness and fatigue associated with sleep disturbance4. In
obstructive sleep apnea (OSA), the most common type of sleep apnea, the airway collapses
and becomes blocked during sleep, leading to loud snoring when trying to breath5. Heart rate
variability (HRV) describes the variation between consecutive heartbeats2 and is mediated by
respiratory sinus arrhythmia (RSA), baroreflex-related fluctuation, and thermoregulationrelated fluctuation6. The HRV is altered in patients with OSA.1
Methods: Fifty-seven subjects were selected from patients who had undergone a sleep
study. Recorded electrocardiogram (ECG) data from sleep polysomnography (PSG) was
analyzed in frequency, time and nonlinear domain after preprocessing of the data and
categorization of OSA was performed.
Results: From the fifty-seven subjects, twenty-five heavy snorers were identified with OSA,
sixteen heavy snorers without OSA, twelve subjects without heavy snoring and OSA and four
subjects without heavy snoring but with OSA. The power spectral densities of the low
frequency (LF), very low frequency (VLF) and high frequency (HF) bands of HRV for the
group with OSA and heavy snoring were slightly but not significantly higher than for the
group of heavy snorers without OSA. The ECG R-R intervals from heavy snorers with OSA
were slightly but not significantly longer than in heavy snorers without OSA.
Conclusion: The results show no significant difference in the power spectral densities
between heavy snorers with OSA and heavy snorers without OSA. Snorers with OSA tend to
have a greater HRV than heavy snorers without OSA. Thus, the results do not support
evidence that heavy snorers without OSA yield a difference of HRV to indicate different
cardiovascular risk predictions.
Further studies should clarify how the severity of snoring or a therapy influences the heart
rate variability in sleep and wake stages.
Acknowledgement: We would like to express our special thanks to Prof. Dr. Jürgen Lorenz
and Dr. med. Egbert Happe for their help and support, guidance, valuable comments, time
and effort.
Key words: sleep apnea, obstructive sleep apnea, heart rate variability.
Advances in Knowledge
-
-
Signal processing on heart rate intervals and PSG recordings by using NI LabVIEW software
and MATLAB software
Signal analysis using Kubios HRV software on SOMNOmedics PSG data
Statistical analysis of data using Microsoft Excel
23
The future of infant formula
- Downstream processing of 2‘-Fucosyllactose
Ole Struck, Monja Lampert, Prof. Dr. Gesine Cornelissen and Dr. Jürgen Kuballa
Breast milk is the best form of nutrition for an infant at the initial stage of life. Unfortunately,
breastfeeding is not possible in some cases, for example due to sickness of the mother.
Therefore it is necessary to improve infant formula to get closer to natural breast milk.
2’-Fucosyllactose (2’-FL) is one of the most abundant oligosaccharide in human milk. Due to
the positive effects of human milk oligosaccharides (HMO), HMOs are considered as
nutritional additive for infant formula. In figure 1 a schematic illustration of this trisaccharide is
shown.
The aim of this research is the development of an economic downstream process for
2’-Fucosyllactose from the fermentation broth of engineered Escherichia coli. Additional
requirements for the process are a high purity grade of the product and an easily applicable
scale-up.
Figure 1: 2'-Fucosyllactose; schematic structure (left), structural formula (right);
Glc: glucose, Gal: galactose, Lac: lactose, Fuc: fucose
For the implementation of the aim, different established purification steps were tested and
combined to a functional process.
The first step of the purification is the thermolysis of the fermentation broth to inactivate and
digest the cells. The following centrifugation separates the cells from the supernatant. The
second purification step is the adsorption of the 2’-FL from the supernatant by means of an
activated charcoal column followed by a washing step and the elution with Isopropanol. The
collected product fractions are then concentrated in a rotary evaporator. For the final
purification gel permeation chromatography (GPC) is used. Afterwards the purest fractions
are freeze-dried to generate the crystalline product.
The development results in a simple low-cost process with a highly purified product. With
respect to the targeted markets, the process has to be further improved and extended by
considering the progress in expressions system development and fermentation optimization.
24
25
Autoren: Tobias Schäfer & Sascha Fichter
Identifikation und Validierung von Protein-basierten Biomarkerkandidaten zur Messung neurogenerativer
Prozesse der Multiplen Sklerose
The aim of the study was to validate different candidate molecules for their suitability as protein biomarkers
to measure the extent of neurodegeneration in Multiple Sclerosis, a chronic inflammatory disease of the
central nervous system. A thorough literature search was conducted for previously suggested and potential
novel biomarkers as well as the respective optimal detection system. After the identification of interesting
and promising candidates these assays were tested for sensitivity and specificity criteria. The proteins
FGF-21, NF-L, NF-H and GFAP were identified as the most promising candidates and analyzed in greater
detail. Validated test systems have been used to determine protein levels in clinically homogeneous
cohorts of patients suffering from Multiple Sclerosis and respective age and sex matched healthy donor
control samples. The analyzing systems examined showed in part good specificity but lacked sensitivity for
reliable quantification and biomarker validation. In summary, next generation single molecule detection
systems will be required to faithfully determine protein levels in human blood or CSF specimen.
Die Betreuer meiner Abschlussarbeit waren:
Prof. Dr. phil. nat. Oliver Ullrich, HAW Hamburg, Fakultät Life Sciences
Dr. rer. nat. Ole Pleß, Fraunhofer-Institut für Molekularbiologie und Angewandte Oekologie (IME)
ScreeningPort
26
Consecutive cloning of E. coli and P. pastoris for
heterologous protein expression
by T. Kharatyan and M. May
For heterologous protein expression, microorganisms like the yeast Pichia pastoris are
frequently used due to high yields, cost efficient fermentation and certain
posttranslational modifications. Therefore, selected strains are genetically modified to
obtain the production and secretion of a desired protein.
The content of this academic work is the expression of any heterologous protein in P.
pastoris. In order to save resources, an intermediate step is included which operates
as an amplification of DNA. For this purpose, the genetic material is multiplied in
Escherichia coli with an expression vector and later cropped to the final genetic
construct (expression cassette) for transformation and integration in P. pastoris. Used
methods consist of PCRs including primer design for a Gibson Assembly to produce
the expression vector. In this case, the target gene and a specific vector for the
multiplying microorganism are amplified with certain termini and subsequently linked.
Electroporation is used for transformation into E. coli and transfection into P. pastoris.
Finally, the expression vector is transformed into the expression cassette by enzymatic
cleavage. In order to verify the success of each cloning step, amplification and cutting
patterns are analyzed via agarose gel electrophoresis. Additionally, selection markers
like an ampicillin resistance are added for E. coli and a histidine auxotrophy is
complemented in P. pastoris. The phenotypic growth behavior is characterized on MMand MD-plates.
In conclusion consecutive cloning of E. coli and P. pastoris was applied successfully
in the bachelor thesis “Produktion und Sekretion einer heterologen Xylanase in Pichia
pastoris” with the target protein xylanase A from Thermomyces lannuginosus. Along
the process, an ampicillin resistance was granted to E. coli and a histidine auxotrophy
was complemented in P. pastoris. The success of both cloning steps were verified by
amplification and cutting patterns, while the phenotype was characterized via MM- and
MD-plates.
27
Autoren: Fabian Müller und Waldemar Schäfer
Abstract
Purification of 13 mycotoxins by solid phase extraction in a multiresidue
method
Every year approximately 20 to 25 % of grain corps worldwide are contaminated by fungi. The
most occurring species are of Penicillium, Aspergillus and Fusarium genus – they produce
mycotoxins in certain stage of growth on e.g. grain under specific climate conditions. Because
of global warming and climate changes the contamination of grain corps by fungi is expect to
increase in the coming years. Mycotoxins have an acute and chronical toxic effect on human
beings and livestock within very low concentrations.
To look ahead analytical procedures for the determination of mycotoxins in staple food and
feeds will become more and more important, since the demand of countries governments for
more stringent controls of their imported foodstuff is still rising.
In this paper a multiresidue method for 13 mycotoxins in crop, nuts and dry fruits applying a
solid phase extraction cleanup technology is presented. After the extraction of the mycotoxins
from the matrix by an QuEChERS-like procedure the sample is cleaned up by different solid
phase extraction mechanisms. A change in solvent composition of the mobile phase during a
subsequent cleanup step was crucial for the efficiency in the removal of unwanted coextractives while retaining the mycotoxins of interest.
The preliminary determined LOQs for the method for i.e. aflatoxins were between 0.1 µg/kg
to 0.5 µg/kg. This selective multiresidue protocol represents a valid alternative to the cleanup
with affinity chromatography.
28
Projektstudie: Automated Foci-Counting using ImageJ macro analysis
Ramin Shakiba – Studierender B.Sc. Molecular Life Sciences, Universität Hamburg
Arbeitsgruppe Radioonkologie (UKE), Betreuer: Wael Mansour
Ziel
Das Ziel der Projektstudie war es anhand wissenschaftlicher und statistischer Methoden einen
zuverlässigen und korrekten ImageJ Makro zur Auswertung von Immunofluoreszenz Bildern
zu entwickeln, um die arbeitsintensive und teilweise ungenaue, manuelle Auswertung zu
automatisieren. Die Benutzung des Makro soll einfach und verständlich sein. Die Ergebnisse
der Auswertung sollen in Tabellenform abgespeichert werden. Zum manuellen Abgleich sollen
ebenfalls die vom Makro bearbeiteten Bilder gespeichert werden, sowie die für die Bearbeitung
verwendeten Parameter, um eine Reproduktion der Ergebnisse zu gewährleisten.
Methoden
Die Bilder für die automatische Auswertung wurden mithilfe von Immunofluoreszenzfärbung
den Doppelstrangbruchreperaturproteinen (Foci) gH2AX, 53BP1 und Rad51 im Rahmen
meiner Bachelorarbeit gewonnen. Die Fotos wurden in drei Fluoreszenzkanälen
aufgenommen. Eine Zellkernfärbung (DAPI), ein Kanal (AlexaFluor 488) für Foci und ein Kanal
(AlexaFluor 594) der wahlweise für Foci oder Zellzyklusmarker genutzt werden kann.
Mithilfe des wissenschaftlichen Bildbearbeitungsprogramm ImageJ wurden die Bilder editiert
und ein Makro in der Java basierten ImageJ nativen Makrosprache geschrieben. Die
verschiedenen Parameter, die zur Bildbearbeitung notwendig sind, werden von dem Benutzer
unter Anwendung eines manuellen Protokolls erlangt.
Unter Nutzung statistischer Methoden und im Vergleich mit der manuellen Auszählung
verschiedener Datensätze wurde die automatisierte Methode evaluiert.
Ergebnisse
Die Ergebnisse der Foci Zählung des Makro unterscheiden sich, bei passenden Parametern
nicht nennenswert von der Auszählung zweier mit der manuellen Auszählung vertrauten
Testpersonen. Die Gesamtzahl der gezählten Foci, variierte zwar zwischen den Testpersonen
untereinander und dem Makro z.T. merklich. Allerdings wichen die normalisierten Ergebnisse
nicht signifikant voneinander ab.
Schlussfolgerung
Die Etablierung eines automatischen Makros zur Auswertung von Bildern aus
Immunofluoreszenzexperimenten war erfolgreich. Durch die Semi-automatische Auswertung
behält der Benutzer weiterhin Kontrolle über die vom Makro gezählten Foci, die Methode hat
jedoch zahlreiche Vorteile gegenüber der bisherigen, manuellen Auswertung. Die Analyse
mithilfe des Makros benötigt einen Bruchteil der Zeit, die Auszählung lässt sich durch die
abgespeicherten Parameter korrekt reproduzieren und die Methode schafft eine Form der
Standarisierung, durch die innerhalb der Arbeitsgruppe und auch zwischen Forschern
verschiedener AGs, Missverständnisse in der Interpretation vermieden werden können.
29
Establishment of a continuous alkaline lysis in plasmid DNA purification
Dorothea Hohmann, Moritz Eickmeyer (Hochschule für Angewandte Wissenschaften Hamburg)
Supervision: Dr. Christoph Reich (Richer-Helm BioLogics Hamburg), Prof. Dr. Birger Anspach (Hochschule für
Angewandte Wissenschaften Hamburg)
Bachelor thesis in the field of pharmaceutical biotechnology
Nowadays, the development and production of plasmid DNA (pDNA) used as a
biopharmaceutical in gene therapy and DNA vaccination are an area of intensive medical
and scientific research. The increasing interest in the use of pDNA results in a high demand
for efficient production processes. A crucial step regarding yield and plasmid integrity in the
production process is the release of the pDNA from the host system. This disintegration is
commonly realized by modified alkaline cell lysis according to Birnboim and Doly published
1983.
The aim of the thesis was the establishment of a continuous method for alkaline cell lysis in
the company’s pDNA production process as a replacement of the currently used batch lysis.
In contrast to a batch lysis, a continuous method promises an increase of robustness and
yield while decreasing time and personal efforts.
Within the thesis a plasmid (7.4 kbp) was produced in E.coli cells as a host system. For the
realization of the cell lysis a tubing system was developed and optimized with respect to the
homogeneous mixing and the contact time of the different solutions. The results of these
optimizations regarding pDNA yield as well as the plasmid integrity were evaluated by
chromatographic methods.
A method for continuous cell lysis was established, which achieved an increased yield of 90
% compared to 55 % yield in batch lysis mode. Moreover, the plasmid integrity remained
unchanged and the lysis process was demonstrated to be scalable and reproducible.
30
Zwischen Schaft und Kopf passt immer noch ein Tropf(en)
Eindringverhalten von Flüssigkeiten in modulare Hüftendoprothesen
Christian Witte, Henning Haschke, Annika Krull, Michael M. Morlock
Institut für Biomechanik, Technische Universität Hamburg
Einleitung und Ziel
Die Implantation von Hüftendoprothesen stellt heutzutage den Goldstandard der operativen
Therapie degenerativer Hüftgelenkerkrankungen dar. In den letzten Jahrzehnten nahm der
Einsatz modularer Prothesen zu, welche eine flexible intraoperative Anpassung der
Komponenten an die individuelle Anatomie jedes Patienten ermöglichen. Eine Konussteckverbindung zwischen Prothesenkopf und –schaft erlaubt dabei eine variable Auswahl des
Prothesenkopfes, lässt jedoch neue Kontaktflächen entstehen. Diverse Studien konnten
anhand revidierter Endoprothesen Korrosionserscheinungen an den Konusoberflächen der
verwendeten Komponenten nachweisen. Das Einsetzen von Korrosion wird in-vivo durch
eine Kombination aus wirkenden Körperflüssigkeiten und der Beschädigung der Konusoberflächen in Folge von Relativbewegungen zwischen Prothesenkopf und -schaft
hervorgerufen.
Das Ziel dieser Arbeit war die experimentelle Untersuchung des Eindringverhaltens von
Flüssigkeiten in Konussteckverbindungen. Dabei wurde der Einfluss der Fügekraft sowie der
Oberflächenbeschaffenheit auf die Eindringtiefe der Flüssigkeiten betrachtet.
Methoden
Es wurden Prothesenschäfte sowohl mit glatter als auch mit einem Rillenprofil strukturierter
Oberfläche getestet. Zum Nachweis des Eindringverhaltens der Flüssigkeit wurde eine
Goldbeschichtung (ca. 20nm) auf die Oberfläche des Prothesenschafts aufgebracht, welche
durch eine I2/KI-Lösung nasschemisch entfernt werden konnte. Während der Versuche drang
die Lösung in den Spalt zwischen Prothesenkopf- und -schaftkomponente ein. Nach einem
Trennvorgang der Prothesenkomponenten wurden die Goldrückstände mikroskopisch
untersucht und numerisch ausgewertet. Eine Charakterisierung der Lösung ermöglichte
einen Vergleich zu Körperflüssigkeiten. Zudem wurde eine numerische Untersuchung mit
Hilfe der Methode der finiten Elemente durchgeführt, um geometrische Informationen zur
Kontaktsituation zu erhalten.
Ergebnisse
Die Ergebnisse der Versuche ergaben geringere Eindringtiefen für zunehmende Fügekräfte.
Der Vergleich der glatten und gerillten Prothesenschäfte zeigte keinen Einfluss der
Oberflächengeometrie auf das Eindringverhalten. Die Ergebnisse der numerischen
Simulation ergaben eine verringerte Spaltöffnung und größere Kontaktflächen mit
zunehmender Fügekraft.
Schlussfolgerung
Mit Hilfe der vorgestellten Methode konnte gezeigt werden, dass grundsätzlich bei jeder
Fügekraft Flüssigkeit in die Konussteckverbindung von modularen Prothesen eindringt.
Korrosion setzt den Kontakt mit Körperflüssigkeiten voraus, weswegen eine Abdichtung der
Prothesenverbindung erstrebenswert wäre. Die Fügekraft allein scheint jedoch kein
ausreichender Parameter zu sein, um ein Eindringen vollständig zu verhindern. Die
Beschaffenheit der Prothesenoberfläche hat nach den Ergebnissen dieser Arbeit keinen
Einfluss auf das Eindringen der Flüssigkeit.
31
Autoren: Florian Miera, Matthias Mescher, Eugen Frick
Abstract
Background and objectives: Nearly 50.000 full-time rescuers and many more (medical)
students in Germany have to be trained with seriously ill patients, medical devices, pharmacy,
administrative tasks and teamwork. This is only possible with periodical simulation training.
Aim of this scientific project is the implementation of an innovative ECG simulator by solely
using web technology.
Methods: The simulator is implemented with the help of different established web
components. For the web page structures HTML and CSS are used. Also for user
interaction, JavaScript is implemented. The database communication is done with PHP and
the database is managed with MySQL. The calculation of the ECG signal is achieved with a
MATLAB-based code.
Results: Two kinds of users are addressed with the simulator: the administrator and the
groups of users performing the simulation training (physicians, students etc.). Therefore, two
synchronized interfaces are used. The backend which provides different possibilities of
controlling and manipulating medical parameters, and the frontend delivering the actual ECG
monitoring. Having in mind that a number of groups will use the simulator, a proper group
management is installed. Each group has an own account accessed over a login-mask. The
events during one session are recorded in a changelog (visible for the backend user). For the
purpose of a realistic ECG simulation, a mathematical algorithm based on Fourier series is
used. Furthermore to get a real time (dynamic) ECG plot, the array produced by the
mathematical algorithm is recalculated during the simulation permanently.
Conclusion: In order to simulate the ECG signal by using web technology no additional
software except a web browser is needed. The manipulation of the parameters of the ECGsignal is used to simulate different pathologies like atrial fibrillation with the help of predefined
buttons by calling the stored parameters from the database. For the purpose of extending the
basic function of the ECG simulator to simulate real life scenarios, the visualization of other
vital signs such as blood pressure, temperature, the saturation of peripheral oxygen (SpO2)
and the respiratory rate could be implemented. Moreover, the insert of an acoustic signal would
inform the frontend user about the status namely the heart rate or the saturation of peripheral
oxygen. In order to terminate an asystole, a defibrillator could be installed.
32
Autoren: Robin Sieg, Jan Bautsch
Revelations of cell health through super-resolution imaging of mitochondrial networks
The complex dynamic and interconnecting network structures of mitochondria are highly
responsive to specific functional cellular signals, making them an ideal tool for investigating the
rate and extent of degenerative and generative processes. The inherent conditions prevalent in
the use of electron microscopy disqualify its application in observing living cells, which makes
super-resolution light microscopy the most suitable candidate for such a venture.
To achieve super-resolution images of mitochondria with GSD (Ground State Depletion)
microscopy, keratinocytes were transfected with the switchable fluorescence protein
mito-Dreiklang. A combination of GSD microscopy, total internal reflection (TIRF) microscopy and
wide field microscopy was employed in the quantitative analysis of the area and structure of the
fused mitochondrial network in live keratinocytes treated with known harmful substances and
reagents. The effect of these reagents on the relative state of the mitochondrial network will help
to predict the overall health of the cell.
33
34
Interference Effect of Low-Frequency Noise of Wind Turbines on Heart Rate Variability
Authors: Rosa Ortiz, Christina Burmeister; Examiners: Prof. Dr. Friedrich Ueberle, Prof. Dr. Jürgen Lorenz
Background and Objectives: There is a debate about whether infrasound and low-frequency
noise emitted by wind turbines can have adverse effects upon health and well-being of nearby
living residents. Heart rate variability (HRV) analysis from ECG measurements in healthy
subjects were used to estimate changes of sympathetic and parasympathetic autonomic
nervous system activity under the influence of wind turbine noise in order to specifically look
at the so-called respiratory sinus arrhythmia (RSA). The RSA is predominantly under
parasympathetic (vagal) control, we used paced breathing at 6 breaths per minute yielding a
power peak of HRV at 0.1 Hz. Digital bandpass filtering was systematically applied to examine
the specific contribution of infrasound and low-frequency noise (LFN) on RSA centered at
respiration rate of 0.1 Hz and other time-domain HRV parameters. The hypothesis was that if
IN and LFN affect autonomous cardiac function, then RSA or other HRV parameters should
differ depending on the filter setting of the acoustic signal simulating a wind turbine.
Methods: The HRV was evaluated of 15 volunteers, between the ages of 22 and 30, during a
15-minute period of constant deep paced breathing at 6 breaths per minute (0.1 Hz).
Throughout the evaluation the ECG using the Eindhoven I lead and respiration using a belt of
the Biopac system devices were measured. Control of respiration was recorded to
demonstrate that the breathing pattern paced by an auditory signal was successfully followed
by the study participants. Normal beat-to-beat intervals (IBINN) were determined through peak
detection of R-waves and analyzed using time- and frequency-based and non-linear methods
applied in the KUBIOS-HRV software package. Overall, three generated acoustic signals
simulating a wind turbine were heard by the volunteers via headphones. The three signals
were based on pink noise with an amplitude of 0.8 Hz and consisted of different filter settings.
The first signal was the pure pink noise, in the second signal infrasound was erased by a high
pass filter from 0 to 20 Hz and in the third signal a high pass filter from 0 to 140 Hz was added
to erase the infrasound and LFN. One-factorial analysis of variance with independent factor
noise condition at 3 factor levels (no filter, LFN-filter at 140 Hz and infrasound-filter at 20 Hz)
and post-hoc Student-T-tests using significance level at p < 0.05 were carried out.
Results: Both, the one-factorial analysis and the Student-T-tests, had a non-significant
outcome for the HRV analysis. Filtering at 140 Hz resulted in significantly greater LF (i.e. RSA)
at deep slow breathing at a cycle of 6 breaths per minute in comparison to no filtered noise.
Furthermore, the standard deviation of normal inter beat intervals (SDNN) also approached
statistical difference in this comparison (p=0,06), as did the RMSSD (root mean square of
successive deviations; 0,08). No other HRV parameter had statistical effects. The result of the
respiration analysis was not significant.
Conclusion: Based on the results and the statistical analysis, the examined hypothesis: The
infrasound and the low-frequency noise generated by a wind turbine has no influence on the
heart rate variability could not be rejected. The results are supporting the assumption that LFN
induces a reduction of RSA. Nevertheless, the data was not sufficient to yield a meaningful
statistical effect with a significance level of 0.05. Additional studies are necessary to gather
more information as well as adequate data regarding LFN and infrasound impacts on the body.
The accomplished study shows a tendency towards an influence of the mentioned factors due
to a sympathetic activity probably caused by sound. Nevertheless, the statistical analyses
produced a non-significant outcome. Further development of similar tests could include studies
with test subjects living in the surroundings of wind turbine parks. These test subjects would
be then directly stimulated by real noises, taking different frequencies, attenuation values as
well as wind direction into account.
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Studierende: Malte Bannert (HAW Hamburg), Katharina Klüver (HAW Hamburg)
Fachgebiet: Biotechnologie
Betreuer: M. Sc. N. Wieczorek (IUE, Technische Universität Hamburg Harburg)
Studierendenarbeit / Bachelorthesis
Cultivation of the microalgae Chlorella sorokiniana within the scope of a microalgae
based bio refinery concept
At the microalgae plant in Reitbrook (Hamburg) the Institute of Environmental Technology
and Energy Economics in cooperation with the HanseWerk AG, investigates the cultivation of
the microalgae Chlorella sorokiniana. The aim is to use the biomass of the algae in the
course of a bio refinery concept. This concept can be separated into three major steps
starting with the production and reprocessing of the biomass. Next step is the isolation of the
valuable substances. Finally the remaining biomass is used for the production of biogas. The
cultivation of the microalgae is performed in a flat panel airlift (FPA) reactor, in which the
algae are treated with the exhaust fumes of a cogeneration unit. The carbon dioxide is
converted through photosynthesis into biomass. Besides the carbon dioxide, essential
nutrients are provided to the algae. Hereby the use of residues from fermentation processes
were examined as possible sources of nutrients.
Besides the cultivation in FPA reactors the use of open cultivation systems is widely spread
and was investigated. Therefore a raceway pond was installed and first cultivations were
performed. This method enables the cultivation of larger volumes (4400 l compared to 180 l
in the FPA reactor) and comes with low investment costs. Because of the larger volume and
the missing aeration in the raceway pond, the cultivations have different requirements
compared to the ones in FPA reactors. Addition of sodium hydrogen carbonate as an
alternative carbon source can prevent an early carbon limitation. In this way a maximum bio
dry mass concentration of 0.8 g BDM /l could be achieved. With FPA reactors the maximum
value of bio dry mass concentration reached 16 g BDM /l and therefore better growth
conditions could be found in the closed system.
Eventually the choice of the right cultivation system depends on the desired product.
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Ist der kLa-Wert als Scale-up Kriterium für einen welleninduzierten
Bioreaktor geeignet?
Marina Lesniewski, Patrycja Kadlubowska
Betreuer: Fr. B. Sc. Regina Reglin, Hr. Sebastian Ruhl
Bachelor-Thesis von Marina Lesniewski
Zielsetzung und Methoden
Im Rahmen einer Bachelor-Arbeit wurde eine Maßstabsübertragung einer Fed-Batch
Kultivierung von CHO (Chinese hamster ovary) Zellen von 20 L auf 200 L in einem
welleninduziertem BIOSTAT RM Einweg-Bioreaktor durchgeführt. Als Scale-up Kriterium
wurde der volumenbezogene Sauerstoffübergangskoeffizient (kLa) überprüft.
Abhängig von dem kLa-Wert konnte die Rocking-Rate und der Kippwinkel im RM 20 L und
200 L festgelegt werden. Die Dauer der Fed-Batch Kultivierung betrug insgesamt 17 Tage, bei
der die Fütterungsstrategie mittels eines automatisierten Prozessleitsystems gesteuert wurde.
Die wichtigsten Kultivierungsparameter, die betrachtet wurden, waren: pH-Wert, pO2-Wert,
Begasung, Druck, Temperatur sowie die Analytikparameter: Lebendzellzahl, Viabilität,
Osmolalität, Glucose-, Lactat- und IgG (Produkt)-Konzentration.
Ergebnisse
Während der gesamten Fed-Batch-Kultivierung im BIOSTAT® RM 200 L und BIOSTAT® RM
20 L konnte eine erfolgreiche pH- und pO2-Regelung realisiert werden. Auch der graphische
Verlauf der Messergebnisse der Zellzahl, Viabilität, Laktatkonzentration, Osmolalität sowie der
Produktkonzentration während der Kultivierung waren ähnlich.
Obwohl im RM 200 eine Höchstzellzahl
von 30,3 · 106 Zellen/mL und im RM 20
eine Höchstzellzahl von 25,2 · 106
Zellen/mL erreicht wurde, konnte am
Ende der Kultivierung dennoch in
beiden Systemen eine nahezu gleiche
IgG-Konzentration festgestellt werden.
Im RM 200 L wurden 8,3 g/L IgG und
im RM 20 L 8,8 g/L an Tag 17
Abbildung 1: Graphische Darstellung der Lebendzellzahl und Produktkonzentration
während der Fed-Batch-Kultivierung in RM 200 L und RM 20 L
gemessen (siehe Abbildung 1).
Schlussfolgerung
In Anbetracht der Ergebnisse kann die Maßstabsübertragung als erfolgreich betrachtet
werden. Folglich ist der kLa-Wert als Scale-up Kriterium in einer Fed-Batch-Kultivierung mit
CHO-Zellen im welleninduzierten System geeignet.
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Zusammenfassung
Aus Stroh wird Strom: Vergärung von Stroh mit synthetischer Gülle.
SEBASTIAN ANTONCZYK, PAUL SCHERER (HAW, FAK. LS)
Im Rahmen der EU-Richtlinie für Erneuerbare Energien 2009/28/EC und 28/70/EC
werden Biokraftstoffe aus Abfällen oder Reststoffen per Verordnung eine viermal
bessere CO2-Einsparung zugesprochen als bei Gewinnung aus Nahrungs- und
Futtermittelpflanzen. Stroh erfüllt die Kriterien für ein günstiges, in großen Mengen
vorhandenes und nicht mit der Nahrungsmittelproduktion konkurrierendes Substrat.
Dieses Stroh könnte mit einem anderen landwirtschaftlichen Abfallprodukt, nämlich
Gülle, kovergärt werden. Bislang gilt es wegen dem hohen Ligninanteil als schwer
abbaubar, Lignin selbst ist anaerob garnicht abbaubar. Um mikrobielle und chemische Variationen auszuschließen, wurde zum ersten Mal mit einer eigens entwickelten Chemikalienlösung als synthetische Gülle in Laborfermentern als Modell für
eine Biogasanlage diese Kovergärung unter definierten Bedingungen untersucht.
Weizenstroh wurde zuvor auf 1 mm Korngröße zerkleinert und den Fermentern als
Suspension vollautomatisch 3x pro Tag zugegeben. Ferner wurde die Strohvergärung in etwa 200 Mini-Batch-Fermentern (250 mL Gefäße) mit und ohne Zugabe
der synthetischen Gülle untersucht.
Es konnten relativ gesehen sehr hohe Raumzeitausbeuten von 15 Tagen Fermenteraufenthaltszeit und einer organischen Beladungsrate von 7 kg Organik/m³ und
Tag erzielt werden, was verglichen mit landwirtschaftlichen Betriebsanlagen eine
Steigerung um 100-400% bedeuten würde. Noch entscheidender sind aber die
Absolutgaserträge. Die Methanerträge mit 52% Methan im Biogas lagen bei 281 m³
Methan pro kg Organik im Batchversuch und bei 258 m³ im Konti-Fermenter.
Rechnet man den unvergärbbaren Ligninanteil heraus, kommt man im Labor auf
gleiche Gaserträge wie Mais ohne Lignin (7% Ligninanteil), nämlich 390 m³ Methan
pro kg Organik. Wenn man die Agrarreststoffe in Deutschland von 30 Mill Tonnen
Weizenstroh pro Jahr berücksichtigt, wären lediglich 18 Mill Tonnen Stroh nötig,
um den gesamten Biogasmais in Deutschland aus 800.000 Hektar Anbaufläche
durch Stroh zu ersetzen. Bislang hält man diesen Vergärungsprozess für zu langsam und zu gering in der Gasausbeute, was hier bei entsprechender mechanischer
Vorbehandlung unter definierten Gärbedingungen widerlegt werden konnte.
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Purification & characterization of a recombinant antibiotic peptide produced by
fermentation with P. pastoris
Deniz Lehnert1, Chantal Brämer1, Jan Demmer1, Svenja Peters1, Jacob Brandt1, Thomas Gutsmann2,
Dominik Schwudtke2, Patrick Ziegelmüller3, Gesine Cornelissen1 and Jörg Andrä1
1
Hamburg University of Applied Sciences, Faculty of Life Sciences, Department of Biotechnology, Ulmenliet 20,
D-21033 Hamburg
2
Leibniz Center of Medicine and Biosciences, Division of Biophysics, Parkallee 1-40, D-23845 Borstel
3
University of Hamburg, Institute for Biochemistry and Molecular Biology, Department of Chemistry, Martin-LutherKing Platz 6, D-20146 Hamburg
Introduction: Antimicrobial peptides (AMPs) are small polypeptides with about 6 to 50
residues. They belong to the innate immune system of plants and animals and show
antibiotic activity. AMPs interact physically with biological membranes and thus cause cell
disruption. Due to this mode of action, it is rare that pathogens develop resistances against
AMPs. Hence, AMPs have great potential to complement current antibiotics. In previous
work, a peptide corresponding to helix 3 and 4 of NK-Lysin was modified (ALK-OH) and
recombinantly produced by Pichia pastoris, as a new candidate for antibiotic treatment.
Objectives: Aim of this project was to purify and characterize recombinant peptide ALK-OH.
A method had to be developed to purify the peptide from the culture supernatant. The
molecular identity of the purified target peptide had to be verified and the antibacterial activity
of recombinant ALK-OH had to be compared with that of a synthetic reference peptide.
Methods: Reversed phase chromatography (RP-HPLC) equipped with a C18 column was
used under acetonitrile gradient conditions. Mass determination was done by electrospray
ionisation fourier transform mass spectrometry (ESI-FTMS). Antibacterial activity was
analysed by a microdilution and an agar diffusion assay using standard laboratory strains of
E. coli. A synthetic version of ALK-OH was used as a reference peptide.
Results: Purification of recombinant ALK-OH from culture supernatant was successfully
established using a combination of heat denaturation, centrifugation, and RP-HPLC.
Ultrafiltration steps were additionally applied to improve the purification procedure. The
molecular mass of the purified compound exactly matched that of synthetic ALK-OH. Up to
now, an estimated peptide yield of 1.8 mg/L culture was achieved. Synthetic ALK-OH
displayed effective antibiotic activity.
Conclusion: The developed RP-HPLC method to analyse and purify peptide ALK-OH allows
easy monitoring of further fermentation processes and thus accelerates their optimisation. As
a proof of concept, this project demonstrates the recombinant production of a peptide
antibiotic by P. pastoris and its subsequent purification.
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Optische Kohärenztomographie für die haptische Rückkopplung in der
Robotergestützten Chirurgie
Master-Thesis: Jens Beringhoff, Mechatronics
Institut: Institut für Medizintechnische Systeme, TUHH
Betreuer: Christoph Otte, Prof. Dr. A. Schlaefer
Ziel: Robotergestützte Mikrochirurgie bietet viele Vorteile im Vergleich zu konventionellen
Verfahren. Zwar helfen Robotersysteme medizinische Instrumente sehr genau und zielgerichtet
zu navigieren. Nachteilig sind allerdings die fehlende haptische Rückkopplung und das Fehlen
einer direkten Sichtlinie. Hieraus leitet der Operateur üblicherweise wichtige Informationen zur
Interaktion des Gewebes mit der Instrumentenspitze ab. Systeme für die haptische
Rückkopplung in der basieren auf Kraftmessungen am Instrument selbst, was üblicherweise mit
einer Modifikation dieses Instruments einhergeht. Aufgrund klinischer Anforderungen, können
viele Instrumente allerdings nicht problemlos modifiziert werden. In der Vergangenheit wurden
endoskopische Bildgebungstechniken vorgeschlagen, um die Gewebeoberflächen zu
detektieren und zu verfolgen. Die optische Kohärenztomographie (OCT) erscheint hierfür
besonders geeignet zu sein. OCT liefert Informationen zur Mikrostruktur des Gewebes und
wurde bereits in klinische Endoskope integriert. Daraus motiviert sich die Frage, ob OCT helfen
kann Gewebedeformationen direkt zu erfassen und diese als haptisches Signal an den
Operateur zurückzugeben.
Methoden: Wird Gewebe durch ein chirurgisches Instrument verformt, wirken Kräfte gleichsam
auf Gewebe und Instrument. Diese Kräfte werden üblicherweise durch die Deformation eines
bekannten Materials im Instrument gemessen. Das Gewebe selbst verformt sich aber wesentlich
stärker und kann für kleine Bereiche mit homogenen mechanischen Eigenschaften modelliert
werden. Unser Ansatz invertiert das gängige Prinzip der Kraftmessung und schätzt die
auftretenden Kräfte aus der Gewebedeformation. Die Deformation wird dabei kontaktlos mittels
OCT bestimmt. Es wurde eine robotergeführte Instrumentenspitze unter einem OCT-Scanner
verfolgt und Deformationen der darunterliegenden Gewebeprobe erfasst. Die Deformation wurde
mit variabler Skalierung als Kraftwert an den Benutzer zurückgegeben. Die Steuerung des
Roboters, sowie die Ausgabe der Kräfte erfolgten durch einen Haptic Feedback Controller. Eine
Aufgabenstellung zur Mikromanipulation der Gewebeprobe wurde von 14 Probanden absolviert.
Dabei wurden die tatsächlich auftretenden Kräfte mit und ohne haptische Rückkopplung von
einem Kraftsensor erfasst und statistisch ausgewertet.
Ergebnisse: Mittels OCT konnte die Deformation der Gewebeoberfläche mit bis zu 500 Hz
gemessen und skaliert an den Haptic Feedback Controller übergeben werden. Mit Unterstützung
durch die haptische Rückkopplung schnitten alle Probanden besser ab. Geringer waren dabei
die maximal ausgeübte Kraft, sowie die kumulierte Zeit über einem definierten
Kraftschwellenwert. Außerdem konnte die Aufgabenstellung in kürzerer Zeit absolviert werden.
Schlussfolgerung: Es wurde ein System zur Untersuchung der haptischen Rückkopplung im
Kontext der robotergestützten Chirurgie vorgestellt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine
kontaktlose Messung der Interaktionskräfte zwischen Instrument und Gewebe möglich ist.
Daraus motiviert sich vor allem die Frage inwieweit die gemessene Deformation auch für
unterschiedliche ‚Konfigurationen auf die tatsächlich wirkende kraft abgebildet werden kann.
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Ein optisches Mehrkanalhydrophon für die Vermessung von Druckpulsfeldern in der
Ultraschalltherapie
Abtin Jamshidi Rad
Friedrich Ueberle
Einleitung:
Der Ultraschall gehört zu den am häufigsten verwendeten Modalitäten in der medizinischen
Therapie und Diagnostik. Trotz der Verwendung des Ultraschalls seit den 20ern des letzten
Jahrhunderts in der Medizin, ist die Vermessung dieser Schallfelder noch immer komplex und
nicht vollständig beschrieben. Für die Beurteilung der Sicherheit einer Ultraschallmodalität und
der Effektivität einer Ultraschalltherapie sind diese Messungen jedoch notwendig und durch
internationale Normen geregelt. Für Charakterisierung von Lithotriptern dient beispielsweise
der IEC Standard 61846.
Die Anforderungen der Norm an der Messtechnik ist herausfordernd und nicht immer
gleichzeitig erfüllbar. Die Hydrophone müssen einen Dynamikbereich von bis zu 150 MPa und
eine Bandbreite von bis zu 40 MHz aufweisen. Der am häufigsten anzutreffende Hydrophon,
das piezoelektrische Polymer Hydrophon, ist aufgrund der hydrophoben Eigenschaften der
Membran nicht für die Vermessung der Zugkomponente der Druckwelle geeignet. Es kommt
zu einem Abriss der des Wasserfilms und damit zu einer Verzerrung des Messsignals. Da die
Zugamplituden die Entstehung von Kavitation und damit eine Schädigung des Gewebes
begünstigen, ist dieser Umstand bei sicherheitsrelevanten Vermessung der Quelle zu
berücksichtigen. Seit den 90ern des letzten Jahrhunderts werden optischen Hydrophone nach
dem piezooptischen evaluiert. Das Prinzip des optischen Hydrophons beruht auf die
Druckinduzierte Änderung des Brechungsindexes an der Sensorendfläche, wenn die
Schallwelle diesen passiert.
Problemstellung:
Die normgerechte Vermessung des Schallfelds ist für die Zulassung der Ultraschallquelle als
Medizinprodukt vorgeschrieben. Zu diesem Zweck sind diverse Messungen an verschiedenen
Positionen im Schallfeld notwendig. Die Charakterisierung des Schallfelds durch
Einzelmessungen setzt eine möglichst kleine Puls-zu-Puls Variation der Ausgangsleistung der
Quelle voraus, welche für die wenigsten therapeutischen Quellen gegeben ist. Insbesondere
sind hier die ballistischen Quellen mit einer Variation des Schalldrucks von bis zu 50 % zu
nennen.
Zur präzisen Charakterisierung des Schallfelds sollte vorzugsweise das gesamte Schallfeld
durch eine einzige Messung bestimmt werden. Hierzu haben wir eine ein optisches Mehrkanal
Hydrophon entwickelt. Mit diesem sind wir imstande die 6 dB Fokusbreite der meisten,
therapeutischen Druckpulsquellen durch einen einzelnen Puls zu vermessen.
Ergebnisse:
Die Evaluation des Mehrkanal Hydrophons erfolgt an eine hochstabile piezoelektrische
Druckpulsquelle (EMS Swiss PiezoClast). Das Schallfeld der Quelle wird zunächst mit einem
kalibrierten faseroptischen Hydrophon über mehrere Einzelmessungen und anschließend mit
dem Mehrkanalhydrophon durch eine Einzelmessung vermessen. Es zeigen sich für alle
charakteristischen Parameter des Schallfelds eine gute Übereinstimmung zwischen beiden
Messungen. Mit dem Multispot Hydrophon steht uns gegenwärtig ein optimaler Sensor für die
Vermessung instabiler Druckpulsquellen zur Verfügung.
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Entwicklung eines Flussphantoms und einer modellbasierten adaptiven Segmentierung zur
Analyse zerebraler Pulsation in 4D-MRT-Bildsequenzen
Daniel Schetelig
Einführung: Bei zerebralen Aneurysmen handelt es sich um krankhafte Aussackungen von
Blutgefäßen im Gehirn, die bei einer Ruptur starke Schädigungen verursachen können.
Solche Schädigungen können von motorischen und kognitiven Ausfällen bis hin zum Tod
reichen. Die Prognose und Einschätzung für die geeignete Therapie eines diagnostizierten
Aneurysmas hängen derzeit maßgeblich von der Größe und der Lokalisation des
Aneurysmas ab. Hämodynamische und mechanische Eigenschaften des Gefäßsystems
werden gegenwärtig für die Risikoeinschätzung der Aneurysmen nicht genutzt. Es liegt
jedoch nahe, dass diese hämodynamischen Faktoren einen bedeutenden Einfluss auf die
Entstehung, das Wachstum und schlussendlich auch die Ruptur von Aneurysmen haben. So
wäre zu erwarten, dass bei einer zeitlichen Betrachtung der Volumina von Aneurysmen sich
diese stärker als Normalgewebe ausdehnen, da Aneurysmen durch die Dehnung des
Gewebes schwächere mechanische Eigenschaften aufweisen sollten. Könnte dieser
grundsätzliche Zusammenhang nachgewiesen werden, wäre dies Ausgangspunkt dafür, die
mechanischen Eigenschaften von Aneurysmen auf Basis von Bilddaten zu klassifizieren. Auf
diese Weise könnten ggf. Aussagen darüber getroffen werden, in welchem Zeitfenster mit
einer Ruptur des Aneurysmas zu rechnen wäre, was in der klinischen Praxis von immensem
Vorteil sein könnte.
Ziel: Grundlage eines derartigen Ansatzes ist allerdings eine zuverlässige Segmentierung
zur verlässlichen Berechnung der Volumina von Aneurysmen bzw. des restlichen
Gefäßsystems. Zwar wurde in bisherigen Studien bereits versucht, auf Basis von zeitlichen
Bilddaten die Pulsation zu quantifizieren, allerdings wurde hierbei nicht auf
Intensitätsschwankungen, die bei den genutzten Aufnahmemethoden auftreten,
eingegangen, sodass nicht klar ist, inwieweit die gemessenen Werte einer wahren
Deformation entsprechen oder zumindest teilweise auf Intensitätsvariationen zurückzuführen
sind. In dieser Arbeit soll der Einfluss der Intensitätsvariationen auf die Quantifizierung der
geometrischen Eigenschaften des Gefäßsystems nähergehend untersucht werden.
Methoden: Um den Einfluss der Intensitätsschwankungen herrührend aus dem Einfluss von
Kontrastmittel oder Geschwindigkeitsvariation näher zu untersuchen und eine
Quantifizierung zu ermöglichen, wurde ein Hardwarephantom zur Entwicklung eines
Goldstandards der Segmentierung
entwickelt und auf
dessen Basis ein
Segmentierungsalgorithmus basierend auf einem adaptiven Region Growing Verfahren
entworfen.
Ergebnisse: Mithilfe der Phantomdaten war es möglich zu zeigen, dass die Variation der
Geschwindigkeit und der Einfluss von Kontrastmittel eine Variation der Intensität zur Folge
hat, die als geometrische Deformation fehlgedeutet werden kann. Die Phantomdaten wurden
mithilfe eines standardmäßigen Segmentierungsverfahrens und des neu entworfenen
Segmentierungsverfahrens
analysiert
und
verglichen.
Das
standardmäßige
Segmentierungsverfahren bildete dabei den zeitlichen Intensitätsverlauf im betreffenden
Gefäß nach und konnte Schwankungen in der Intensität nur geringfügig ausgleichen. Das
neu entworfene Segmentierungsverfahren war dagegen in der Lage, die durch
Kontrastmitteleinfluss bzw. Geschwindigkeitsvariation auftretenden Intensitätsvariationen
auszugleichen, und erlaubt damit eine präzisere Quantifizierung der geometrischen
Eigenschaften. Die Segmentierungsverfahren wurden nicht nur an Phantomdaten, sondern
auch an Patientendaten getestet, die ähnliche Ergebnisse zeigten.
Schlussfolgerung: Es konnte gezeigt werden, dass die Intensitätsvariation, herrührend aus
dem Einfluss von Kontrastmittel oder der Variation der Flussgeschwindigkeit, einen
relevanten Einfluss auf die Quantifizierung d. geometrischen Eigenschaften hat und bei der
Segmentierung berücksichtigt werden muss.
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VMAT-Dosisakkumulation in Lungen- und Leber-SBRT: Analyse und messtechnische
Verifikation von Genauigkeit und Einflussparametern
Thilo Sothmann
Ziel: Die Strahlentherapie von Lungen- und Leber-Tumoren hat sich in den letzten Jahren
von der 3D-konformalen konventionell fraktionierten Therapie zur stereotaktischen volumenmodulierten Bogenbestrahlung (VMAT) mit wenigen Bestrahlungssitzungen entwickelt.
Diese Entwicklung erhöht das Risiko von sogenannten „Interplay“-Effekten, d. h. einem ungünstigen Zusammenspiel zwischen individueller Tumorbewegung und dynamisch veränderbaren Bestrahlungsparametern. In dieser Arbeit sollen „Interplay“-Parameter identifiziert und
ihre Auswirkungen auf die 4D-VMAT-Dosisakkumulation (Simulation der tatsächlich applizierten Dosis unter Berücksichtigung der Tumorbewegung) bestimmt werden. Hierfür werden
mittels synthetischen und realen Tumorbewegungen Bewegungsplattform-Messungen
durchgeführt und mit entsprechenden simulierten 4D-Dosisverteilungen verglichen.
Σ
Methoden: Die Simulation der applizierten 4D-Dosisverteilung (𝐷ref
𝑥 ) unter bekannten
Bewegungsmustern (𝜑ref ,𝑡𝑖,𝑗 ,𝑘 ) und gegebenen statischen Bogensegmentdosen (𝐷𝑡𝑖,𝑗 ,𝑘 ) wird
durch folgende Summation über Segmente, Bögen und Bestrahlungsfraktionen beschrieben:
𝑛
𝑛
𝑛
(𝑗 )
Seg
Bog
Σ
fx
𝐷ref
𝑥 = Σ𝑖=1
Σ𝑗 =1
Σ𝑘=1
𝐷𝑡𝑖,𝑗 ,𝑘 ∘ 𝜑ref ,𝑡𝑖,𝑗 ,𝑘
𝑥 .
Bogensegmentdosis
Bogendosis
Dosis pro Fraktion
Gesamte Dosis
Verwendete Bewegungstrajektorien waren fünf synthetische Sinustrajektorien mit variierender Bewegungsperiode und -richtung sowie zwei reale Patiententumortrajektorien mit variierender Amplitudenirregularität. Die experimentelle Verifikation der simulierten 4DDosisverteilungen erfolgte mittels einer computergesteuerten 4D-Bewegungsplattform und
einem darauf montierten hochauflösenden Flächendetektor. Zusätzlich wurde auf dem Detektor ein aus Festwasser-, Tumor- und Knocheneinsatz bestehendes Lungenphantom angebracht und ein synthetischer VMAT-Bestrahlungsplan erstellt.
Der synthetische VMAT-Bestrahlungsplan wurde unter Verwendung der oben genannten
Bewegungsmuster auf das bewegte Messphantom appliziert. Als Referenzdosisverteilung
diente die auf dem statischen Detektor applizierte und gemessene Dosisverteilung.
Resultierende gemessene und simulierte Dosisverteilungen wurden mittels einer auch klinisch eingesetzten Dosisverifikationsmethode (sog. γ-Index, Kombination aus räumlicher
Distanz und Dosisdifferenz zwischen zwei Pixeln) verglichen. Zusätzlich erfolgte die Untersuchung des Einflusses von der Synchronisation der Atemphasen mit Messungs- und Simulationsstart. Hierfür wurde die 4D-Dosisakkumulation mit systematisch variierter Atemstartphase ausgeführt und mit den gemessenen Dosisverteilungen verglichen.
Ergebnisse: Mit Fokus auf den Vergleich zwischen Dosismessungen unter Bewegungseinfluss und Dosissimulationen unter Bewegungseinfluss ergeben sich hohe Übereinstimmungen für alle verwendeten Bewegungstrajektorien. Allerdings nehmen die verbleibenden Abweichungen zwischen Messung und Simulation mit der Stärke der Atemirregularität/variabilität und gewählter Bogensegmentgröße zu.
Ein Einfluss der Atemkurvenstartphase wurde mittels Vergleich zwischen geplanter statischer und simulierter Dosisverteilung unter Bewegungseinfluss für eine synthetische und
eine reale Bewegung untersucht. Es ergab sich für die reale Bewegung ein großer Einfluss
auf die Genauigkeit der 4D-Dosisakkumulation durch systematische Phasenverschiebungen.
Schlussfolgerung: Die Übereinstimmungen zwischen simulierten Dosisverteilungen mit
Bewegungseinfluss und gemessenen Dosisverteilungen mit Bewegungseinfluss lassen die
Schlussfolgerung zu, dass die Simulationen eine verlässliche Voraussage der Bewegungseffekte in der volumenmodulierten Bogenbestrahlung liefern. Somit könnte nach weiteren
Tests und Berücksichtigung der Atemkurvenstartphase die Tumorabdeckung in der hypofraktionierten VMAT-Technik für bewegte Ziele verifiziert werden.
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