michael döngi 27.01.2016

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Fluoreszenzmikroskopie
MICHAEL DÖNGI
27.01.2016
Fluoreszenz
Jablonski Diagramm
Emittiertes Licht ist in der Regel energieärmer (langwelliger) als absorbiertes Licht
(Stokessche Regel)!
Auflösungsgrenze - Abbe-Limit -
𝜆
sin 𝛼 =
𝑥
𝜆
sin 𝛼 =
𝑥∗𝑛
Brechungsindex (𝑛) von Luft =1; Wasser = 1.33; Öl und Glas ≈ 1.5
𝜆
sin 𝛼 =
𝑥∗𝑛
𝜆
𝑥=
𝑛 ∗ sin α
Brechungsindex (𝑛) von Luft =1; Wasser = 1.33; Öl und Glas ≈ 1.5
𝑁𝐴 = 𝑛 ∗ sin α
𝜆
𝑥=
𝑛 ∗ sin α
𝑁𝐴 = 𝑛 ∗ sin α
𝜆
𝑥=
𝑁𝐴
Auflösungsgrenze - Rayleigh-Kriterium (Konvention) Beugung
𝜆>𝐷
Auflösungsgrenze - Rayleigh-Kriterium Beugung
𝜆>𝐷
𝑓 ∗ 1.22 ∗ 𝜆
𝑟=
𝐷
Auflösungsgrenze - Rayleigh-Kriterium -
𝑓 ∗ 0.61 ∗ 𝜆
𝑥=
𝐷
0.61 ∗ 𝜆
𝑥=
𝑁𝐴
λ = 500 nm
x-y-Auflösung:
Öl
Luft
NA = 1.4 NA = 0.75
217 nm 407 nm
Auflösungsgrenze - Axiale Auflösung -
2∗𝜆∗𝑛
𝑥=
𝑁𝐴2
λ = 500 nm
x-y-Auflösung:
z-Auflösung:
Öl
NA = 1.4
217 nm
765 nm
Luft
NA = 0.75
407 nm
1778 nm
Konfokale Fluoreszenzmikroskopie
Detektor
(Photomultiplier)
"Pinhole"
Dichroischer
Spiegel
Laser
Fokusebene
im Objekt
Objekt
Photomultiplier (Photoelektronenvervielfacher)
Bildentstehung
Räumliche Auflösung (Pixelgröße, Nyquist-Theorem)
Zeitliche Auflösung
Bildentstehung
•Es ensteht kein Bild im optischen Sinne
•Laserkoordinate und Intensität werden im Rechner zu einem Bild
kombiniert
•Die dargestellten Farben sind frei wählbar, der PMT detektiert nur
die Anzahl der Photonen und damit die Lichtintensität und nicht die
Wellenlänge des Lichtes.
Modulation der Laserintensität - PolarisatorenLaserlicht ist meist linear polarisiert
• λ/2-Plättchen (Verzögerungsplatte)
• Pockels cell
• AOTF oder AOTM
2-Photonenmikroskopie
Anregung mit
1 Photon bei 400 nm
2 Photonen bei 800 nm
3 Photonen bei 1200 nm
2-Photonenmikroskopie
Die Wahrscheinlichkeit,
dass 2 Photonen quasi
gleichzeitig auf ein
Farbstoffmolekül
auftreffen, ist nur in
einem sehr kleinen
Volumen in der
Focusebene gegeben.
2-Photonen vs. 1-Photon Laser Scanning Mikroskopie
1-Photon LSM:
2-Photonen LSM:
Pro:
• Verschieden farbige Fluoreszenzmoleküle
getrennt von einander anregbar
• Bei schwacher Fluoreszenz ist durch
Öffnung des PH (unter Einschränkung der
Auflösung) eine Signalerhöhung möglich
Pro:
• Konfokale Anregung
• Geringere Streuung des Anregungslichts
durch Gewebe  höhere Eindringtiefe
• Geringere Phototoxizität
Contra:
• Keine konfokale Anregung
• Geringere Eindringtiefe
• Höhere Phototoxizität
Contra:
• Separation verschieden farbiger
Fluoreszenzmoleküle oftmals nur durch
Emissionsfilter möglich
„Superresolution Microscopy“
2014 wurde der Nobelpreis für Chemie an Stefan Hell, Eric Betzig und William E. Moerner
verliehen „for the development of super-resolved fluorescence microscopy“
Auflösungsgrenzen liegt jeweils bei ca. 20 nm.
STED - Stimulated Emission Depletion PALM - Photoactivated Localization Microscopy STORM - Stochastic Optical Reconstruction Microscopy -
Stefan Hell
Eric Betzig, William E. Moerner
Xiaowei Zhuang
STED - Stimulated Emission Depletion Confocal laser scanning microscopy
Overlayed with “doughnut”-shaped depletion beam
Fluorescence from the “zero” area
+
=
The STEDup - Stimulated Emission Depletion Excitation
laser
Beam
scanner
Sample holder/
XYZ-stage
Phase Mask
(generation of
‚doughnut‘)
Excitation: 635 nm;
Detetection: 670/40 nm;
pulsed STED: 760 nm @ 76 MHz
Resolution: <50nm
Sample holder/
XYZ-stage
STED
Laser
STED - Stimulated Emission Depletion -
Konfokal
STED
STED - Stimulated Emission Depletion konfokal
Living cell, Actin-Chromobody
STED
Ilgen, unpublished
PALM bzw. STORM - Photoactivated Localization Microscopy bzw.
Stochastic Optical Reconstruction Microscopy • Verwendet werden Photoaktivierbare fluoreszierende Proteine (GFP
Varianten, können durch Licht bestimmter Wellenlänge und Intensität gezielt
aktiviert und deaktiviert werden)
Stochastic Optical Reconstruction Microscopy -
Zunächst sind alle PAFPs inaktiv
Durch einen kurzen
Lichtblitz mit Licht
geeigneter Wellenlänge
werden einige wenige
PA-FPs aktiviert. Die
Aktivierung erfolgt nach
dem Zufallsprinzip.
PA-FPs liegen im
aktivierbaren Zustand
vor.
Anregung der PA-FPs.
Emissionslicht wird
dedetktiert.
Fortschreitende
Belichtung führt zum
bleichen der PA-FPs.
Zuvor detektierte PAFPs sind nicht mehr
aktivierbar.
Es erfolgt eine erneute
Aktivierung einer
zufälligen
Subpopulation von PAFPs.
…n-Zyklen später…
…gefolgt von einer aufwendigen Nachprozessierung (Dekonvolution etc.) der
Bilddateien:
Xu, K., Zhong, G., and Zhuang, X. 2013. Science 339:452–456
Anwendungsbeispiele von LSM
Visualisierung dynamischer Prozesse - Calcium Imaging Anregungsspektrum von Fluo-4
hohe Calciumkonzentration
Isosbestischer Punkt
(360 nm)
niedrige Calciumkonzentration
300
400
500
Wellenlänge (nm)
600
Beladen der Zellen mit Farbstoff
• Farbstoffinjektion
• Diffusion aus der Patch-Pipette
•Elektroporation
•Verwendung membrangängiger
Acetoxymethylester (AM)
Beladung mit Acetoxymethylester
Fura-2
(nicht membranpermeabel)
Fura-2 Acetoxymethylester
(membranpermeabel)
O
O
O
O
O
O
CH2COH2OCCH3
H3CCOH2OCH2C
-
H3CCOH2OCH2C
N
N
CH2COH2OCCH3
-
OCH2C
O
O
O
O
OCH2CH2O
CH2CO-
OCH2C
O
Esterase
N
N
O
OCH2CH2O
O
O
CH3
CH3
N
N
O
O
COH2OCCH3
COO
O
O
CH2CO
-
ATP-induzierte
Calciumfreisetzung
in Astrozyten des
Bulbus olfactorius
Spontane Calciumwellen im ONL
Visualisierung dynamischer Prozesse - Natrium Imaging 3µM gramicidin D, 100 µM ouabain
Doengi et al., PNAS 2009
Fluorochrome - Die Qual der Wahl • Das Absorptions- und Emissionsspektrum besteht nicht nur aus dem
jeweiligen Maximum!
• Fluorescence SpectraViewer
www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labelingchemistry/fluorescence-spectraviewer.html

michael döngi 27.01.2016

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