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Orientierungsspezifische Studie der
Cytochrom-c-Oxidase in einer biomimetischen
Architektur auf Metalloberflächen
Eine kombinierte Untersuchung mit
oberflächenverstärkter resonanter Ramanspektroskopie
und Elektrochemie
Diplomarbeit
Markus Alexander Plum
Fachbereich Physik
Max-Planck-Institut
für Polymerforschung
Mainz, Mai 2007
Die vorliegende Arbeit wurde am
Max-Planck-Institut für Polymerforschung in Mainz
unter Anleitung von
Prof. Dr. K. Kremer, Prof. Dr. W. Knoll und Dr. R. Naumann
in der Zeit von April 2006 bis Mai 2007 angefertigt.
Die Arbeit wurde von Prof. Dr. L. Köpke
von der Universität Mainz mitbetreut.
INHALTSVERZEICHNIS
I
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung und Motivation
1.1 Atmungskette . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.1 Mitochondrale Atmungskette . . . . . . . . . .
1.1.2 Prokaryotische Atmungskette . . . . . . . . . .
1.2 Cytochrom c . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3 Cytochrom-c-Oxidase . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3.1 Struktur der Cytochrom-c-Oxidase . . . . . . .
1.3.2 Katalytischer Zyklus der Cytochrom-c-Oxidase .
1.4 His-Tag-Technologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.5 Motivation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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2 Theoretische Grundlagen und Messmethoden
2.1 Oberflächenplasmonenresonanz . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.1.1 Elektromagnetische Beschreibung von Oberflächenplasmonen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.1.2 Anregung von Oberflächenplasmonen . . . . . . . . . .
2.1.3 Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie . . . . .
2.2 EIS - Elektrochemische Impedanzspektroskopie . . . . . . . .
2.2.1 Messprinzip der Elektrochemischen Impedanzspektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2.2 Graphische Darstellungen der Impedanzspektren . . . .
2.2.3 Schaltkreiselemente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2.4 Einfache Ersatzschaltkreise . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2.5 Spezielle Ersatzschaltkreise . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3 CV - Cyclovoltammetrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.1 Cyclovoltammetrie von gelösten Redoxspezies . . . . .
2.3.2 Cyclovoltammetrie von oberflächengebundenen Redoxspezies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.3 IR-Drop Kompensation . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4 Spektroelektrochemie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4.1 Potentiostatische Messungen . . . . . . . . . . . . . . .
2.4.2 Zeitaufgelöste Messungen . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.5 Ramanspektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.5.1 Darstellung des Raman-Effekts über das Energietermschema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.5.2 Klassische Deutung des Raman-Effekts . . . . . . . . .
2.5.3 Resonanter Raman-Effekt . . . . . . . . . . . . . . . .
2.5.4 Oberflächenverstärkungseffekt . . . . . . . . . . . . . .
2.5.5 Resonanz Ramanspektroskopie an Metalloporphyrinen
1
1
3
4
5
7
7
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17
17
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54
55
56
56
57
60
61
62
INHALTSVERZEICHNIS
II
3 Probenherstellung für SPR, EIS und CV
3.1 Herstellung von TSG-Elektroden . . . . . . . . . . . . . . .
3.2 Funktionalisierung der TSG-Elektrode . . . . . . . . . . . .
3.3 Anbindung der Cytochrom-c-Oxidase an die Elektrodenoberfläche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4 Cytochrom-c-Oxidase in der up- oder down-Konfiguration . .
3.5 Cytochrom-c-Oxidase N139C . . . . . . . . . . . . . . . . . .
66
. 66
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. 73
. 75
4 Messaufbau für SPR, EIS und CV
76
5 Messergebnisse und Diskussion (Teil 1)
5.1 Überprüfung des ptBLM-Aufbaus . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.1 Ergebnisse und Diskussion der Oberflächenplasmonenresonanz - Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.2 Ergebnisse und Diskussion der elektrochemischen Impedanz-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2 Aktivierung der Cytochrom-c-Oxidase in der up-Konfiguration
5.2.1 Ergebnisse und Diskussion der elektrochemischen Impedanz-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.2 Ergebnisse der CV-Messungen . . . . . . . . . . . . . .
5.2.3 Diskussion der CV-Messungen . . . . . . . . . . . . . .
5.3 Potentialtitration der Cytochrom-c-Oxidase in der up-Konfiguration mit und ohne Cytochrom c . . . . . . . . . . . . . .
5.3.1 Ergebnisse und Diskussion der EIS-Potentialtitration .
5.4 Aktivierung der Cytochrom-c-Oxidase in der down-Konfiguration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.4.1 Ergebnisse und Diskussion der CV-Messungen mit der
Mutante N139C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
80
80
6 Probenherstellung für SERRS
6.1 Herstellung der Silberelektroden . . . . . . . . . . . .
6.2 Polieren der Silber-Elektroden . . . . . . . . . . . . .
6.3 Elektrochemisches Aufrauhen der Silber-Elektroden .
6.4 Funktionalisierung und Proteinanbindung . . . . . . .
6.4.1 Untersuchungen mit Cytochrom c . . . . . . .
6.4.2 Untersuchungen mit der Cytochrom-c-Oxidase
80
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. 102
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. 103
. 104
. 104
. 104
7 Messaufbau für SERRS
7.1 Messaufbau für die potentiostatischen Messungen . . . . . .
7.2 Messaufbau für die zeitaufgelösten Messungen . . . . . . . .
7.3 Zelldesign der SERRS-Zelle . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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. 109
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INHALTSVERZEICHNIS
7.3.1
7.3.2
III
Zelldesign der alten Ramanzelle . . . . . . . . . . . . . 110
Zelldesign der neuen Ramanzelle . . . . . . . . . . . . 112
8 Messergebnisse und Diskussion (Teil 2)
8.1 Oberflächenaufrauhung der Silberelektroden . . . . . . . . .
8.1.1 Durchführung der elektrochemischen Aufrauhung . .
8.1.2 Optimierung der verwendeten Aufrauhungszeiten . .
8.2 SERRS-Messungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.2.1 Ergebnisse und Diskussion der SERRS-Messungen mit
Cytochrom c . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.2.2 Ergebnisse und Diskussion der SERRS-Messungen mit
der Cytochrom-c-Oxidase . . . . . . . . . . . . . . .
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114
114
115
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. 118
. 123
9 Zusammenfassung und Ausblick
130
9.1 Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
9.2 Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
A Anhang
A.1 Datenmessung und Datenauswertung . . . . . . . . . . . . .
A.1.1 Messung und Auswertung der SPR-Daten . . . . . .
A.1.2 Messung und Auswertung der EIS-Daten . . . . . . .
A.1.3 Messung und Auswertung der CV-Daten . . . . . . .
A.1.4 Auswertung der SERRS-Daten . . . . . . . . . . . .
A.2 Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A.2.1 Lösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A.2.2 Chemikalien und Materialien . . . . . . . . . . . . .
A.2.3 Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A.3 Rotations-Raman-Effekt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A.4 Konstruktionszeichnung der neuen SERRS-Zelle . . . . . . .
A.5 Versuchsaufbau für eine RDE-Messung . . . . . . . . . . . .
A.6 Polieren und Aufrauhen der Silberelektroden . . . . . . . . .
A.6.1 Polieren der Silberelektroden . . . . . . . . . . . . . .
A.6.2 Neu entwickelte Poliervorschrift . . . . . . . . . . . .
A.6.3 AFM-Bilder der polierten und chemisch aufgerauten
Silberelektroden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
134
. 134
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. 135
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. 151
. 151
. 151
. 152
B Glossar
157
Abbildungsverzeichnis
158
Tabellenverzeichnis
163
INHALTSVERZEICHNIS
IV
Literatur
164
Danksagungen
174
1 EINLEITUNG UND MOTIVATION
1
1
Einleitung und Motivation
Ein Membranprotein ist ein in die Lipidschicht einer Biomembran eingelagertes Protein. Diese Proteine können als Transmembranproteine die Lipiddoppelschicht der Zellmembran vollständig durchziehen und eine Art Tunnel
bilden, um wichtige Transportfunktionen zu übernehmen. Sie bedingen eine
selektive Permeabilität der Zelle und sorgen so für einen Stoffaustausch zwischen Organellen und der Zellaußenwelt. Der Transport kann dabei aktiv, also
unter Verbrauch von Energie, oder passiv, ohne Energieverbrauch, erfolgen.
Dadurch kann eine Versorgung der Zelle, aber auch die Aufrechterhaltung
eines bestimmten Zellmilieus oder eines bestimmten Membranpotentials gewährleistet werden [1].
Eine weitere Funktion von Membranproteinen ist die Katalyse wichtiger biochemischer Reaktionen, zum Beispiel zur Energiegewinnung. Dies ist von
großer Bedeutung für die Versorgung und Aufrechterhaltung der Lebensfunktionen eines Organismus [1].
Detaillierte Untersuchungen zur Funktion und Kinetik dieser wichtigen Proteinklasse sind zur Zeit aufgrund der mangelnden Stabilität der Proteine und
der benötigten Membranumgebung nur schwer durchführbar.
Die Herstellung von Protein verankerten Lipiddoppelschichtmembranen1 eröffnet eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten zur Beobachtung von Membranproteinen. Die ptBLM-Technik ermöglicht ”in-situ” Untersuchungen, die
die Verwendung als Modellmembransysteme zur Erforschung grundlegender biophysikalischer Prozesse einschließt. Durch die direkte Verbindung des
Membranproteins mit einer Elektrode mit Hilfe der His-Tag-Technologie ist
es möglich, potentiostatische Messungen vorzunehmen [2].
Im Folgenden werden das Transmembranprotein Cytochrom-c-Oxidase und
sein Substrat Cytochrom c, die in dieser Arbeit untersucht werden, eingeführt
und der derzeitige Forschungsstand erläutert.
1.1
Atmungskette
Die Hydrolyse der Phosphorsäureanhydrid - Bindung des Adenosintriphosphats (ATP) stellt die wichtigste Energiequelle der endergonischen Abläufe
in Zellen aller Organismen dar. In aeroben Organismen, von Bakterien bis
hin zu den Säugetieren, werden 90 % des Adenosintriphosphats durch die
Atmungskette erzeugt [1].
1
Eine Protein verankerte Lipiddoppelschichtmembrane wird auch als ptBLM-System
(protein tethered bilayer lipid membrane system) bezeichnet.
2
Abbildung 1.1: Die Atmungskette.
Die Atmungskette besteht - wie in Abbildung 1.1 gezeigt2 - aus einer Elektronentransportkette (Komplex I-IV) und einer ATP-Synthase (Komplex V).
Die im Zuge des Abbaus von Nährstoffen gebildeten reduzierten Reduktionsäquivalente FADH2 und NADH werden über die Atmungskette reoxidiert.
Die Elektronen werden hierbei unter der Bildung von Wasser auf Sauerstoff
als terminalen Elektronenakzeptor übertragen. Die große Differenz der Normalpotentiale von NADH/NAD+ (φ = − 0.32 V) zu H2 O/O2 (φ = + 0.81 V)
wird genutzt, um die durch die Enzyme der Atmungskette katalysierte Kaskade gekoppelter Redoxreaktionen anzutreiben. Zusammenfassend läuft dabei
die exergonische Knallgasreaktion - die Oxidation von Wasserstoff zu Wasser - ab. Nach der chemiosmotischen Theorie dient die bei diesem Prozess
freiwerdende Energie primär zum Aufbau eines elektrochemischen Protonengradienten. Dieses elektrochemische Potential wird zur Phosphorylierung von
ADP durch die ATP-Synthase genutzt. Das so erhaltene ATP ist die universelle Energiewährung der Zelle [1].
Die Atmungskette läuft bei Eukaryoten in den Mitochondrien und bei Prokaryoten3 im Cytoplasma ab [1].
2
In dieser Arbeit wurden alle Röntgenstrukturbilder mit dem frei zugänglichen Programm ”Chimera” erstellt.
3
Als Eukaryoten werden alle Lebewesen mit Zellkern zusammengefasst. Prokaryoten
dagegen haben keinen Zellkern
1.1.1
3
Mitochondrale Atmungskette
Ein Mitochondrium enthält neben seiner äußeren Membran, die an den Intermembranraum grenzt, noch eine innere Membran, welche direkten Kontakt
zur Matrix hat. Den Raum zwischen diesen beiden Membranen nennt man
Intermembranraum [1].
Die Komplexe der eukaryotischen Atmungskette sind, wie in Abbildung 1.2 zu
sehen, in der Mitochondrienmembran lokalisiert. Die Atmungskette besteht
aus den Enzym-Komplexen I bis V und den Elektronenüberträgern Cytochrom c und Ubichinon, auch Coenzym Q genannt. Die Enzym-Komplexe
I bis V sind in der inneren Mitochondrienmembran eingelagert. Das in verschiedenen Stoffwechselwegen gewonnene Reduktionsäquivalent NADH wird
an Komplex I (NADH - Ubichinon - Oxidoreduktase) zu NAD+ reoxidiert.
Die Elektronen werden daraufhin auf ein in der Membran lösliches Ubichinon
(CoQ) übertragen. Ubichinon kann zusätzlich von Komplex II (SuccinatUbichinon - Oxidoreduktase)4 reduziert werden. Ubichinon überträgt die
Elektronen wiederum auf Komplex III (Ubichinon - Cytochrom - c - Oxidoreduktase, auch bc1 -Komplex genannt). Dieser Komplex hat die Aufgabe, das wasserlösliche Cytochrom c zu reduzieren, welches als Elektronenmediator zwischen Cytochrom bc1 und Komplex IV (Cytochrom-c-Oxidase)
fungiert. Die Cytochrom-c-Oxidase katalysiert die Übertragung der Elektronen auf molekularen Sauerstoff. Der Elektronentransport über die Komplexe
I, III und IV ist an eine Translokation von Protonen durch die Membran
gekoppelt und trägt somit zum Aufbau eines Protonengradienten und des
Membranpotentials bei. Diese bilden gemeinsam den elektrochemischen Potentialgradienten, welcher wiederum gemäß der chemiosmotischen Theorie
zur ATP-Synthese aus ADP und Pi (anorganisches Phosphat) genutzt werden kann [1].
4
Der Komplex II oxidiert FADH2 , welches ebenfalls ein in verschiedenen Stoffwechselwegen gewonnenes Reduktionsäquivalent ist. FADH2 kommt nicht bei allen Lebewesen
vor. Dementsprechend fehlt dann dieser Komplex, wie in Abbildung 1.2 zu sehen.
4
Abbildung 1.2: Die mitochondrale Atmungskette und ihre Lokalisation im
Mitochondrium.
1.1.2
Prokaryotische Atmungskette
Die Enzyme der Atmungskette sind bei Prokaryoten in der Cytoplasmamembran lokalisiert. Die Untereinheitenstruktur bakterieller Atmungskettenenzyme ist weitaus einfacher als die mitochondrialer Proteine. Aus diesem Grund
werden bakterielle Systeme häufig als Untersuchungsmodelle respiratorischer
Prozesse herangezogen. Zudem bieten prokaryotische Systeme den Vorteil,
dass sie sich einfacher auf genetischer Ebene verändern lassen. Die meisten Bakterien verfügen über weit verzweigte Elektronentransportketten, die
ihnen eine Anpassung an unterschiedliche Wachstumsbedingungen ermöglichen. Ein breites Spektrum an terminalen Oxidasen lässt hierbei auf verschiedene aerobe und anaerobe Elektronentransportwege schließen [1].
1.2
5
Cytochrom c
Cytochrom c gehört zu den bestuntersuchten Cytochromen5 überhaupt. Detaillierte Informationen findet man in [3].
Die Cytochrom c-Strukturen von Rinderherz und Thunfisch wurden bereits
in den frühen 70er Jahren mittels Röntgenstrukturanalyse erkundet [4][5]. Im
Jahre 1990 gelang Bushnell die Aufklärung der 3D-Struktur von RinderherzCytochrom c mit einer sehr hohen Auflösung [6].
Da der Schwerpunkt dieser Arbeit auf der Cytochrom-c-Oxidase liegt, wird
im Folgenden nur auf die Struktur des Cytochrom c eingegangen. Cytochrom
c aus Rinderherz (Abbildung 1.3) enthält eine kovalent gebundene Hämgruppe, die über zwei Thioetherbrücken zwischen den Thiolgruppen der Cysteine
14 und 17 und den Vinylgruppen des Porphyrinrings an das Proteinrückgrat
gebunden ist (Abbildung 1.3 und 1.4). Wie in Abbildung 1.4 zu sehen, sind
die Imidazolgruppe des Histidins 18 und die Aminosäure Methionin 80 die
Liganden des Häm-Eisens.
Abbildung 1.3: Die Röntgenstruktur des Cytochrom c (Rinderherz) mit Häm
- Gruppe.
5
sen.
Cytochrome sind Proteine, die eine oder mehrere prosthetische Hämgruppen aufwei-
Abbildung 1.4: Die Röntgenstruktur des Cytochrom c (Rinderherz) mit Häm - Gruppe und Liganden.
6
1.3
7
Cytochrom-c-Oxidase
Die Cytochrom-c-Oxidase ist, wie oben beschrieben, das terminale Enzym der
Atmungskette. Dieses Enzym katalysiert den Transfer von vier Elektronen,
die nacheinander von Cytochrom c geliefert werden, zum Sauerstoffmolekül.
Die Reduktion des Sauerstoffmoleküls zu Wasser ist mit einer Verschiebung
("Pumpen") von vier Protonen über die innere Mitochondrienmembran verbunden [7].
1.3.1
Struktur der Cytochrom-c-Oxidase
Die atomaren Strukturen der mitochondrialen Cytochrom-c-Oxidase aus Rinderherz [8] und der bakteriellen Cytochrom-c-Oxidase aus Paracoccus denitrificans [9] wurden mittels Röntgenkristallographie bestimmt.
Cytochrom-c-Oxidase aus Paracoccus denitrificans besteht - wie in Abbildung 1.5 zu sehen - aus 3 Kernuntereinheiten (I: grün, II: gelb und III: blau)
und einer kleinen, nicht konservierten Untereinheit IV unbekannter Funktion
(schwarz) [10].
Das Enzym besitzt 4 redox-aktive Metallzentren. Elektronen gelangen von
Cytochrom c über das binukleare CuA -Zentrum zum low-spin Häm a und
werden von dort zum aktiven Zentrum, bestehend aus high-spin Häm a3 und
CuB , transportiert (Abbildung 1.5 und 1.6)6 . High-spin bedeutet hierbei, dass
das Zentralion Eisen aufgrund der Hundschen Regel die größtmögliche Zahl
ungepaarter d- Elektronen besitzt und mit einer Reihe verschiedener Liganden reagiert. Beim low-spin-Zustand liegt dagegen die geringstmögliche Zahl
ungepaarter d-Elektronen vor, so dass eine verminderte Reaktion mit Liganden stattfindet.
Basierend auf der Kristallstruktur werden 3 mögliche Protonentransferwege
(K-, D- und H-Weg) vorgeschlagen, wobei letzterer zumindest in Prokaryoten funktionell keine Rolle zu spielen scheint. Die Bedeutung der anderen
beiden Wege ist durch intensive funktionelle Untersuchungen an Mutanten
eindeutig nachgewiesen. Der K-Weg führt über Lys-354 und Thr-351 zur
Hydroxyl-Gruppe von Tyr-280 am katalytischen Zentrum7 . Der D-Weg führt
über Asp-124 über eine Reihe von Aminosäuren zu Glu-278 (siehe Abbildung
1.7). Von dort ist der weitere Weg der Protonen nicht genau bekannt [11].
6
Ein Brückenligand dient im Allgemeinen als Verbindungsbrücke zweier Metallzentren
in einem Komplex.
7
Im Folgenden wird immer Paracoccus denitrificans Nummerierung verwendet.
Abbildung 1.5: Die Röntgenstruktur der Cytochrom-c-Oxidase von Paracoccus denitrificans und ihre redox-aktiven
Metallzentren. Das binukleare CuA -Zentrum befindet sich in Untereinheit II (gelb). Die Redoxzentren
Häm a, Häm a3 und CuB sind dagegen in Untereinheit I (grün).
8
9
Abbildung 1.6: Vergrößerung der Cytochrom-c-Oxidase-Redox-Zentren von
Paracoccus denitrificans mit den entsprechenden Liganden.
Die Seitenketten von Häm a enthalten unter anderem Vinyl Gruppen (-CH=CH2 ), Formyl - Gruppen (-CH=O) und eine
Farnesyl - Gruppe (-CHOH(-CH2 CH2 CH=CCH3 )3 -CH3 ).
10
Abbildung 1.7: Protonenwege in der Cytochrom-c-Oxidase von Paracoccus
denitrificans. Der K-Weg der CcO führt über Lys-354 und
Thr-351 zur Hydroxyl-Gruppe von Tyr-280 am katalytischen
Zentrum. Der D-Weg führt über Asp-124 über eine Reihe
von Aminosäuren zu Glu-278 und von dort aus weiter ins
katalytische Zentrum. Die Untereinheiten III und IV wurden
aus Gründen der Übersichtlichkeit weggelassen.
1.3.2
11
Katalytischer Zyklus der Cytochrom-c-Oxidase
Die Cytochrom-c-Oxidase ist eines der am intensivsten untersuchten Membranproteine. Trotzdem wird nach wie vor kontrovers diskutiert, wie viele
Protonen an welcher Stelle im Reaktionszyklus gepumpt werden. Die Protonentransportwege sind bis heute noch ungeklärt. Viele verschiedene Modelle wurden hierzu aufgestellt. Abbildung 1.8 zeigt schematisch die Hauptzwischenprodukte bei der katalytischen Sauerstoffreduktion durch die Cytochrom-c-Oxidase nach Michel [12].
Ausgehend vom vollständig oxidierten Zustand O (=oxidized) wird nach Aufnahme des ersten Elektrons der Ein-Elektronen-reduzierte E-Zustand (=electronated) erreicht.
Die Zufuhr des zweiten Elektrons führt zur zwei-Elektronen-reduzierten Spezies R (=reduced). Sauerstoff kann nun an das reduzierte Häm a3 binden und
das Zwischenprodukt A bilden.
Abbildung 1.8: Das Modell des konventionellen katalytischen Cytochrom-cOxidase-Zyklus.
12
Eine elektronische Umordnung innerhalb des binuklearen Zentrums führt zur
Bildung des PM -Zustandes8 .
Die Zufuhr des dritten Elektrons liefert über den Pr -Zustand den F-Zustand
(=oxoferryl). Dabei wird die O-O-Bindung aufgebrochen und Wasser gebildet. Das führt zu der Translokation von zwei Protonen.
Die Aufnahme des vierten Elektrons führt schließlich über den H-Zustand
zum vollständig oxidierten Zustand O. Auch hier wird wieder Wasser gebildet. Es gibt eine erneute Translokation von zwei Protonen.
Die von der Cytochrom-c-Oxidase katalysierte Reaktion lässt sich dadurch
mit Hilfe der folgenden Nettogleichung beschreiben:
+
3+
+
4 · Fe2+
cytc + 8 · Hmatrix + O2 → 4 · Fecytc + 2 · H2 O + 4 · H
1.4
His-Tag-Technologie
1988 berichtete Hochuli erstmals von einem kurzkettigen Affinitätspeptid,
bestehend aus wahlweise fünf oder sechs Histidinen, dem so genannten ”HisTag” [15]. Mit diesem His-Tag fusionierte Proteine zeigten eine bemerkenswerte Affinität zu Ni2+ -Metall-Chelat- Komplexen, die ebenfalls von Hochuli
ein Jahr zuvor entscheidend weiter entwickelt wurden [16].
Der His-Tag kann nach Zugabe einer Nickel-Ionen-Lösung spezifisch an zweiwertige Nickel-Ionen binden. Das Ni2+ -Ion ist in einem oktaedrischen Komplex mit Wassermolekülen gebunden. Diese können durch Histidin verdrängt
werden, wodurch ein sehr stabiler Chelat-Komplex entsteht. Die Ni2+ -Ionen
können durch Nitrilo-tri-essigsäure-Reste gebunden werden und mit zwei
Histidin-Resten des Proteins im Austausch gegen Wasser interagieren. Diese
Spezifität gewährleistet, dass das Protein bindet.
Dieser His-Tag kann nicht nur für die Aufreinigung, sondern auch für die
Immobilisierung von Proteinen auf einer TSP-NTA-codierten Oberfläche genutzt werden (Abbildung 1.9)9 .
8
Dieser Name stammt von der ursprünglichen Annahme, dass das Enzym in dieser
Form ein Peroxid (Fe(III)-O-O-Cu2+ ) oder Hydroperoxid (Fe(III)-OOH Cu2+ ) am aktiven
Zentrum gebunden hat. In letzter Zeit verdichten sich aber die Hinweise, dass die O-OBindung in dieser Spezies bereits gespalten ist und eine Oxoferryl-Struktur (Fe(IV)=O−
2
HO-Cu2+ ) vorliegt [13][14].
9
TSP=thiobis propionic acid (Thiobis-Propionsäure) und NTA=nitrilotriacetic acid
(Nitrilo-tri-essigsäure)
13
Abbildung 1.9: Immobilisierung eines Proteins mit Hilfe der His-TagTechnologie.
1.5
14
Motivation
Membranproteine konnten bisher aufgrund ihrer Komplexität nur in Lösungen oder in vesikulären Systemen studiert werden. Die Untersuchung von
Redoxprozessen gelang häufig nur mit Hilfe von Mediatoren.
Das Ziel dieser Arbeit ist die nähere Untersuchung der Redoxkaskade eines
komplexen Membranproteins - der Cytochrom-c-Oxidase - in einem biomimetischen Membransystem. Hierfür wird das ptBLM-System10 verwendet, mit
dessen Hilfe eine Kontrolle über die Orientierung des auf einer Metalloberfläche angebundenen Proteins möglich ist (Abbildung 1.10). Unserer Gruppe
stehen zwei Orientierungen zur Verfügung. Dabei ist das Enzym entweder an
der Untereinheit I oder an der Untereinheit II mit einem His-Tag manipuliert
(Abbildung 1.10).
Abbildung 1.10: Die zwei unterschiedlichen Konfigurationsmöglichkeiten der
uns zur Verfügung stehenden Cytochrom-c-Oxidase. Der
His-Tag und die Verankerung an die Metalloberfläche sind
vergrößert dargestellt. Links im Bild: Das Enzym mit HisTag an Untereinheit II (orange). Rechts im Bild: Das Enzym
mit His-Tag an Untereinheit I (rot). Die Untereinheiten III
und IV sind gelb bzw. schwarz dargestellt.
10
ptBLM: protein tethered bilayer lipid membrane system
15
Ein großer Vorteil des ptBLM-Systems besteht darin, definierte elektrische
Potentiale an die Oberfläche anzulegen und damit das Protein in einen reduzierten, oxidierten oder einen beliebigen Zwischenzustand zu bringen. Das
hierfür mit einem His-Tag manipulierte Enzym verändert dabei weder seine
enzymatischen Eigenschaften noch seine Struktur. Das ermöglicht eine ”insitu” Analyse, mit deren Hilfe man quantitative Informationen über Konformationsänderungen und den Ladungstransfer dieses schwer zu studierenden
Proteins erhält.
Im Rahmen dieser Diplomarbeit sollen drei Membranproteine unter Ausnutzung der ptBLM-Technik durch eine Kombination von spektroskopischen und
elektrochemischen Messmethoden erforscht werden:
• Erst vor kurzem hat unsere Gruppe die Cytochrom-c-Oxidase mit HisTag an Untereinheit II erfolgreich durch den direkten Elektronentransfer aktiviert. Der Nachweis erfolgte durch Cyclovoltammetrie (CV) und
oberflächenverstärkte resonante Ramanspektroskopie (SERRS: Surfaceenhanced-resonance Raman Spectroscopy) [17]. Ein Teil dieser Arbeit
besteht in der Fortführung der Untersuchung der Cytochrom-c-Oxidase
mit His-Tag an Untereinheit II durch SERRS und durch die zeitaufgelöste oberflächenverstärkte resonante Ramanspektroskopie (TR-SERRS:
time-resolved Surface-enhanced-resonance Raman Spectroscopy). Dieses sehr komplizierte Messverfahren erlaubt detaillierte Einblicke in die
Kinetik des Enzym-Mechanismus, der bis heute kontrovers diskutiert
wird.
• Studien an durch Mutation veränderten Enzymen fördern das Verständnis über die verwendeten Ladungstransportwege. Deshalb beschäftigt sich diese Arbeit auch mit einer Mutation der Cytochrom-c-Oxidase
mit His-Tag an Untereinheit II (Mutante N139C).
• Der Schwerpunkt dieser Arbeit besteht im Studium der Cytochrom-cOxidase mit His-Tag an Untereinheit I. Dieses Enzym hat genau die
entgegengesetzte Orientierung auf der Oberfläche wie die Cytochrom-cOxidase mit His-Tag an Untereinheit II (siehe Abbildung 1.10). Es soll
überprüft werden, ob sich diese Orientierung auch durch den direkten
Elektronentransfer oder/und mit Hilfe des Elektronendonators Cytochrom c aktivieren lässt. Im Falle der erfolgreichen Aktivierung sollen
Studien über Elektronentransferprozesse und Protonentranslokationen
vorgenommen werden.
16
Der ptBLM-Aufbau wird in allen drei Fällen simultan mit Hilfe von Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie (SPR) und elektrochemischer Impedanzspektroskopie (EIS) überwacht. Die Funktionsfähigkeit der Proteine wird
mit der elektrochemischen Impedanzspektroskopie, der Cyclovoltammetrie
und der oberflächenverstärkten resonanten Ramanspektroskopie beobachtet.
Zusätzlich werden in dieser Arbeit die Eigenschaften des natürlichen Substrats (Cytochrom c) sowie dessen Wechselwirkung mit dem Enzym geprüft.
2 THEORETISCHE GRUNDLAGEN UND MESSMETHODEN
2
17
Theoretische Grundlagen und Messmethoden
In diesem Kapitel werden die Methoden der OberflächenplasmonenresonanzSpektroskopie, der elektrochemischen Impedanzspektroskopie, der Cyclovoltammetrie und der Ramanspektroskopie vorgestellt und ihre theoretischen
Grundlagen behandelt. Mit diesen Methoden werden die wichtigsten Eigenschaften der Proben charakterisiert.
2.1
Oberflächenplasmonenresonanz
Obwohl sich Oberflächenplasmonen bereits durch die Theorie von Maxwell
aus dem Jahr 1873 erklären ließen, wurden sie erst 1957 durch Ritchie theoretisch beschrieben [18]. Die ersten Messungen der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR, surface plasmon resonance) wurden 1959 von Turbadar veröffentlicht [19]. 1968 wurde erstmals von Otto und in einer anderen Messanordnung von Kretschmann und Raether die Oberflächenplasmonenresonanz
zur Bestimmung des Brechungsindexes verwendet [20][21].
2.1.1
Elektromagnetische Beschreibung von Oberflächenplasmonen
An der Grenzfläche zwischen Metall und Dielektrikum kann es zu kollektiven
Oszillationen des quasi-freien Elektronengases im Metall kommen, welche
an elektromagnetische Wellen gekoppelt sind. Diese so genannten Oberflächenplasmonen oder auch plasmonischen Oberflächenpolaritoren propagieren
entlang der Grenzfläche. Sie werden durch Dissipation ihrer Energie in das
Metall stark gedämpft. Diese Dämpfung geschieht in Ausbreitungsrichtung
der Oberflächenplasmonen, wobei fast die gesamte Energie in Wärme umgewandelt wird [22][23].
Zur Herleitung der orts- und zeitabhängigen Feldverteilung der Oberflächenplasmonen benötigt man die makroskopischen Maxwellgleichungen in Materie [24]:
divD = 4π #ext
(2.1)
1 ∂B
=0
c ∂t
divB = 0
rotE +
rotH −
4π
1 ∂D
=
j
c ∂t
c ext
(2.2)
(2.3)
(2.4)
18
Betrachtet man nun ein homogenes isotropes Medium, bei dem sowohl die
Ladungs- als auch die Stromdichte Null sind:
D = %E
H=
B
µ
j ext = 0
#ext = 0 ,
so vereinfachen sich die Maxwell-Gleichungen zu
divE = 0
(2.5)
1 ∂H
=0
c ∂t
divH = 0
(2.6)
rotE + µ
(2.7)
1 ∂E
=0
(2.8)
c ∂t
Hierbei sind % = %(ω) und µ = µ(ω) die makroskopischen Responsefunktionen. Die meisten Materialien haben eine Permeabilität von µ ≈ 1 [24]. Unter
Annahme von Laserlicht, welches in guter Näherung monochromatisch ist,
wird hier dispersionsfrei gerechnet. Im Folgenden wird das magnetische Feld
betrachtet. Berechnungen für das elektrische Feld ergeben sich äquivalent.
Mit Hilfe von
rotrotH = −∆H
µ(ω) ≈ 1
rotH − %
und Gleichung (2.6) lässt sich Gleichung (2.8) umformen zu:
∆H = %
1 ∂ 2H
c2 ∂t2
(2.9)
Gesucht wird eine Lösung der Wellengleichung für den monochromatischen
Fall. Für die Lösung dieses Problems wählt man den folgenden Ansatz [24]:
H(r, t) = H(r) · e(−iωt)
(2.10)
Setzt man Gleichung (2.10) in (2.9) ein, so erhält man die zeitunabhängige
Helmholzgleichung:
ω2
(∆ + 2 %) · H(r) = 0
(2.11)
c
Diese Gleichungen werden durch den Ansatz
H(r) = H0 · eikr
mit beliebiger Amplitude H0 gelöst [24].
(2.12)
19
Durch Einsetzen und Ausführen des Laplace-Operators erhält man die folgende Bedingung:
ω2%
2
−k + 2 = 0
c
c2 k2
c2 k2
= 2
%
n
Der hier eingeführte Brechungsindex n ist im Allgemeinen komplex:
√
n = % = nr + iκ
⇒ ω2 =
Wie in [24] beschrieben stellt die Lösung von Gleichung (2.11) eine elliptisch
polarisierte Welle dar. Wählt man einen festen Wellenvektor k0 (reell, beliebige Richtung) und eine reelle Amplitude H0 , so erhält man den Spezialfall
einer linear polarisierten Welle.
Oberflächenplasmonen sind Lösungen an einer Grenzfläche, bei denen das
elektromagnetische Feld an der Grenzfläche gebunden ist und an ihr entlangpropagiert.
Aus den makroskopischen Maxwellgleichungen kann man die Stetigkeitsbedingungen für die Felder an der Grenzfläche unseres Problems bestimmen und
erhält die Bedingung, dass die Vektorkomponenten von E, H und k parallel
zur Grenzfläche kontinuierlich von einem ins andere Medium gehen müssen
[24].
Trifft nun eine linear polarisierte Welle auf eine Grenzfläche, so müssen die
Kontinuitätsbedingungen erfüllt werden. Diese linear polarisierte Welle kann
in eine parallel polarisierte (p-polarisierte) und in eine senkrecht polarisierte
(s-polarisierte) Welle aufgeteilt werden11 [25]. Die Kontinuitätsbedingungen
können für s - und p - Polarisation getrennt betrachtet werden. Jede andere
Polarisation ergibt sich als lineare Superposition.
Im Folgenden betrachtet man eine Grenzfläche zwischen einem Dielektrikum
(1) und einem Metall (2) mit den dazugehörigen Dielektrizitätskonstanten %1
und %2 . Die Grenzfläche soll - wie in Abbildung (2.1) zu sehen ist - in der
y-z-Ebene lokalisiert sein und durch die Stelle x = 0 gehen.
Man kann zeigen, dass man mit s-polarisiertem Licht12 kein Oberflächenplasmon anregen kann [22].
Aus diesem Grund kann man o.B.d.A. die folgende Annahme für die eintreffende Welle machen:
ky1 = ky2 = ky = 0
11
Der Polarisationszustand bezieht sich jeweils auf die Einfallsebene des eingestrahlten
Lichts. Bei s-polarisiertem Licht liegt der Vektor E in der Ebene der Grenzfläche.
12
In diesem Fall hat man lediglich eine elektrische Feldkomponente in y-Richtung, also
parallel zur Grenzfläche.
20
Abbildung 2.1: Die Feldverteilung eines Oberflächenplasmons senkrecht zur
Grenzfläche.
Für p - Polarisation gilt in unserem Fall:
und
E(r, t) = (Ex , 0, Ez )
H(r, t) = (0, Hy , 0, )
Unser Ansatz (2.12) vereinfacht sich dann zu:
H1 (x, z) = H01 · eikx1 · x+ikz1 · z
H2 (x, z) = H02 · e−ikx2 · x+ikz2 · z
,x < 0
(2.13)
,x > 0
Durch Einsetzen in Gleichung (2.11) und Ausführen des Laplace-Operators
erhält man in beiden Fällen:
kx2 + kz2 =
Auflösen nach kx liefert:
!
ω2
%
c2
ω2
% − kz2
c2
Somit erhält man die folgende Feldverteilung in Abhängigkeit von x:
!
ω2
ikx1 · x
H1 (x) = H01 · e
mit
kx1 =
%1 − kz21 , x < 0 (2.14)
c2
!
ω2
−ikx2 · x
H2 (x) = H02 · e
mit
k x2 =
%2 − kz22 , x > 0 (2.15)
c2
kx =
21
Als nächstes soll die Komponente Ez für beide Medien berechnet werden.
Dazu kann man Gleichung (2.8) verwenden:
rotH(r, t) −
1 ∂E(r, t)
∂
1 ∂
%
=0 ⇒
Hy = % Ez
c
∂t
∂x
c ∂t
Mit Hilfe von Gleichung (2.12) kann man diese Gleichung weiter umformen:
∂
1
−i c ∂
Hy = iω % Ez ⇒ Ez =
Hy
∂x
c
% ω ∂x
Nähert man sich der Stelle x=0 von der Seite des Dielektrikums, so erhält
man mit Gleichung (2.14):
Ez1 =
−i c
ikx Hy
%1 ω 1 1
Ganz analog erhält man:
E z2 =
−i c
(−i)kx2 Hy2
%1 ω
Durch die Kontinuitätsbedingung an der Stelle x = 0
Ez1 = Ez2
Hy1 = Hy2
erhält man die Existenzbedingung für Oberflächenplasmonen:
kx1
%1
=−
kx2
%2
(2.16)
Diese Gleichung kann nur erfüllt werden, wenn die dielektrischen Konstanten %1 und %2 unterschiedliche Vorzeichen haben. Diese Bedingung ist an
Grenzflächen zwischen einem Dielektrikum und einem Metall im optischen
Frequenzbereich erfüllt [22].
Setzt man nun kx1 und kx2 aus den Gleichungen (2.14) und (2.15) ein und
verwendet die Kontinuitätsbedingung kz1 = kz2 = kz , so erhält man:
!
ω
%1 · %2
kz = ·
(2.17)
c
%1 + %2
An dieser Stelle sei nochmals darauf hingewiesen, dass es sich bei %1 und %2
um frequenzabhängige Funktionen handelt. Aus Gleichung (2.10) folgt unter
22
Verwendung von (2.18) die gesamte orts- und zeitabhängige Feldverteilung
des magnetischen Feldes in den beiden Medien:
H1 (x, z, t) = H01 · ei(kx1 · x+kz · z−ωt)
H2 (x, z, t) = H02 · ei(−kx2 · x+kz · z−ωt)
mit:
kx1
(2.18)
ω
=
c
"
%21
%1 + %2
k x2
ω
=
c
"
%22
%1 + %2
ω
kz = ·
c
!
%1 · %2
%1 + %2
Die Eindringtiefen senkrecht zur Grenzfläche, nach denen das Feld in den
beiden Medien auf e−1 abgefallen ist, berechnen sich als Kehrwert des jeweiligen kx . Betrachtet man zum Beispiel die magnetische Feldverteilung an
einer Luft-Gold-Grenzfläche (%Au = −12,1 + i · 1,3), an der ein Oberflächenplasmon angeregt wird, so erhält man abhängig von der Laserwellenlänge
Eindringtiefen von ca. 100 nm bis 500 nm [22] [26].
2.1.2
Anregung von Oberflächenplasmonen
Eine Anregung von Oberflächenplasmonen durch ein einfallendes Photon ist
nur möglich, wenn die Impulserhaltung erfüllt ist. Im vorliegenden Fall muss
die Wellenvektorkomponente des Photons in Ausbreitungsrichtung kP h,z identisch mit der Wellenzahl des Plasmons kz sein (siehe Abbildung 2.2). Durch
den Einfallswinkel θ kann kP h,z verändert werden:
kP h,z =| kP h | · sin θ
,
(2.19)
wobei der Betrag des Photon-Wellenvektors mit Hilfe der Maxwellgleichungen gegeben ist durch [24]:
| kP h |=
ω √
· %D
c
(2.20)
Vergleicht man die Dispersionsrelation des Oberflächenplasmons und die
Dispersionsrelation des einfallenden Photons aus den Gleichungen 2.17 und
2.20, wird sofort klar, dass es zu keiner Impulsgleichung kommen kann, da
für alle Einfallswinkel gilt:
kP h,z < kz
(2.21)
Um eine Kopplung des einfallenden Photons an das Oberflächenplasmon zu
erreichen, muss die Impulskomponente des einfallenden Photons in Ausbreitungsrichtung kP h,z erhöht werden.
23
Abbildung 2.2: Das Verhältnis von Wellenvektoren eines aus dem Dielektrikum einfallenden Photons und eines Oberflächenplasmons.
Hierzu kann man die Methode der Prismenkopplung verwenden, bei der das
Licht aus einem höherbrechenden Medium (Prisma) mit dem Dielektrizitätskoeffizienten
%p > %D
auf die Grenzfläche eingestrahlt wird [22]. Damit kann die Impulserhaltung
für genau einen Winkel erfüllt werden und es gilt:
!
ω √
ω
%D · %M
kP h = kz
mit kP h = · %p sin θ und kz = ·
c
c
%D + %M
!
%D · %M
1
⇒ sin θ = √ ·
(2.22)
%p
%D + %M
Diese Gleichung lässt sich bei Kenntnis der Dispersionsverläufe des Prismas,
des Metalls und des Dielektrikums numerisch lösen.
Eine der meist verwendeten Methoden für Prismenkopplung stellt die Kretschmann - Konfiguration in Abbildung (2.3) dar. P-polarisiertes Licht wird aus
dem höherbrechenden Medium auf eine ca. 50 nm dicke Metallschicht eingestrahlt. Das durch die Metallschicht tretende evaneszente Feld kann unter
geeignetem Einfallswinkel an der gegenüberliegenden Grenzfläche ein Oberflächenplasmon anregen.
24
Abbildung 2.3: Die Prismenkopplung nach der Kretschmann-Konfiguration.
2.1.3
Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie
Die Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie ist ein optisches Messverfahren und erlaubt unter anderem die Detektion ultradünner dielektrischer
Schichten von wenigen Nanometern Dicke [22]. Sie beruht auf dem Prinzip,
dass Oberflächenplasmonen für eine gegebene Frequenz nur unter bestimmten
Einfallswinkeln angeregt werden können. In der Regel wird die winkelabhängige Intensität eines von der Metall-Dielektrikum-Grenzfläche reflektierten,
p-polarisierten Laserstrahls verwendet. Der Anregungswinkel des Oberflächenplasmons wird durch die Dissipation13 der Energie in die Metallschicht
als Intensitätsminimum erkennbar (siehe Abbildung 2.4).
Brechungsindexänderungen im Bereich des evaneszenten Feldes eines Oberflächenplasmons lassen sich als Verschiebung des Anregungswinkels detektieren [21].
Wird eine dünne dielektrische Schicht auf das Metall aufgebracht, so ändert
sich - wie in Abbildung 2.4 gezeigt - die Dispersionsrelation. Deshalb kann
die Adsorption von dielektrischen, dünnen Schichten an der Metalloberfläche
beobachtet werden.
13
Dissipation bezeichnet in der Physik die kontinuierliche Energieumwandlung eines
offenen Systems in thermische Energie.
25
Abbildung 2.4: Links: Änderung der Dispersionsrelation des Oberflächenplasmons durch Anlagerung einer dielektrischen Schicht.
Rechts: Resultierende Verschiebung des Anregungswinkels im
Winkelspektrum.
Die Änderung des Oberflächenplasmons bzw. des Anregungswinkels ist dabei
proportional zur Dicke der Schicht und der Differenz der Brechungsindizes
der Schicht und des Dielektrikums:
∆θ = θ1 − θ0 ∼ (NSchicht − NDielektrikums ) · d
Bei bekanntem Brechungsindex kann somit die geometrische Dicke einer angelagerten Schicht gemessen werden [27].
Zusätzlich hat man die Möglichkeit der zeitaufgelösten Messung von Adsorptionsprozessen an der Oberfläche des Systems. Durch die Wahl eines Einfallswinkels an dem nahezu linearen Bereich der Flanke erreicht man in guter Näherung einen proportionalen Zusammenhang zwischen reflektierter Intensität
und Schichtzunahme [28]. Dies ist in Abbildung 2.5 zu sehen. In diesem Fall
wurde eine Kinetikmessung eines Adsorptionsprozesses aufgezeichnet. Man
erkennt deutlich eine Verschiebung des Anregungswinkels im linken Bild und
die zeitliche Auflösung des Adsorptionsprozesses durch die Messung der Intensität bei konstantem Winkel. Des Weiteren ist der Winkel der Totalreflektion θc eingezeichnet. Er tritt in unserem Fall mit nGold < nPrisma auf und es
gilt für diesen nach dem Gesetz von Snellius [24]:
nGold
.
Θc = arcsin
nPrisma
Aus dieser Gleichung wird offensichtlich, dass sich θc im Laufe der Messung
nicht verändert.
26
Abbildung 2.5: Erläuterung der Kinetikmessung.
In der vorliegenden Arbeit wird die Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie ausschließlich zur Kontrolle des Architekturaufbaus der ptBLM-Probe
genutzt14 . Der schrittweise erfolgende Aufbau des ptBLM-Systems kann dadurch label- und zerstörungsfrei überprüft werden. Zusätzlich wurde mit der
oben erwähnten Methode der zeitliche Verlauf des Architekturaufbaus verfolgt.
14
ptBLM steht für Protein verankerte Lipiddoppelschichtmembran (protein-tetheredBilayer-Lipid-Membrane).
2.2
27
EIS - Elektrochemische Impedanzspektroskopie
Da man mit der SPR-Spektroskopie lediglich adsorbierte Schichtdicken nachweisen kann, wird zur Überprüfung des ptBLM-Aufbaus noch zusätzlich die
Impedanzspektroskopie verwendet. Die Impedanzspektroskopie beruht auf
der gleichzeitigen Messung der Beeinflussung von Phase und Amplitude einer Wechselspannung durch die Probe. Die resultierende Antwort beinhaltet
Informationen über die elektrischen Eigenschaften des Systems, insbesondere an ihren inneren Grenzflächen. Mit diesen Informationen ist es nicht nur
möglich den Systemaufbau zu überprüfen, sondern man kann auch die Dynamik bewegter Ladungen berechnen [29].
Obwohl die ersten elektrochemischen Untersuchungen mit Wechselstrom schon
Ende des 19. Jahrhunderts z.B. durch Kohlrausch [30] veröffentlicht wurden
und das Konzept der elektrischen Impedanz 1884 von Heaviside [31] eingeführt wurde, erlebte die Methode erst mit der rasanten Entwicklung elektronischer Bauteile, insbesondere der Operationsverstärker, den entscheidenden
Durchbruch. Moderne Impedanzanalysatoren bieten heutzutage die Möglichkeit Impedanzen im Frequenzbereich von einigen Millihertz bis zu einigen
Megahertz zu bestimmen. Traditionell wird die EIS für Korrosionsbeobachtungen, Batterien und elektrolytische Abscheidungen sowie die Charakterisierung von Halbleitern verwendet. In den letzten Jahren fand sie zusätzlich einen weit verbreiteten Einsatz in der Biotechnologie. Ein wesentlicher
Vorteil der Methode ist die zerstörungs- und labelfreie Messung mit recht
geringem instrumentellen Aufwand. Biologische Systeme können somit in ihrer natürlichen Umgebung untersucht werden. Auf Grund der hohen Empfindlichkeit für Membrandefekte bzw. Veränderungen in der Durchlässigkeit
der Membran durch funktionelle Membranproteine ist EIS eine besonders
gut geeignete Messmethode, um Aussagen über die Membranqualität und
die Funktion von Membranproteinen zu machen. Diese Informationen würde
man auf Grund der Auflösungslimitierung nur sehr kompliziert mit optischen
Methoden erhalten [32].
2.2.1
Messprinzip der Elektrochemischen Impedanzspektroskopie
Die Impedanzspektroskopie ist eine Erweiterung der Impedanzanalyse. Hierbei wird das zu untersuchende System mit einem elektrischen Signal angeregt15 . Das System wird aus seiner Gleichgewichtslage gebracht und die
resultierende Antwort des Systems auf diese Störungen aufgezeichnet.
15
Dafür wird meistens eine sinusförmige Wechselspannung in einem Frequenzbereich von
10−3 bis 106 Hertz verwendet.
28
Hierzu benötigt man drei Elektroden:
• An die Arbeitselektrode wird das Störsignal angelegt. Die Proteine sind
direkt mit ihr verbunden.
• Die Gegenelektrode wird verwendet um das Antwortsignal aufzuzeichnen.
• Die Referenzelektrode wird als Bezugspunkt benötigt, da es nur möglich ist Potentialdifferenzen zu messen. Das absolute Potential einer
einzelnen Elektrode ist grundsätzlich nicht experimentell messbar [25].
Es gibt verschiedene Möglichkeiten der elektrischen Anregung, die man bei
der EIS verwenden kann. Die am häufigsten angewendete Störungsart ist die,
bei der die Impedanz direkt im Frequenzbereich gemessen wird [29]. Dazu
wird dem an der Zelle angelegten Potential eine sinusförmige Wechselspannung E(t) überlagert:
E(t) = E0 · sin(ω · t)
E0 ist die Amplitude der Wechselspannung und ν ihre Frequenz. Der Zusammenhang zwischen Winkelgeschwindigkeit ω und Frequenz ν ist gegeben
durch ω = 2πν.
Der resultierende Antwortstrom I(t) ist mit der Phase Φ verschoben und hat
eine Amplitude I0 :
I(t) = I0 · sin(ω · t + Φ)
Mit der letzten Gleichung wurde ein lineares Antwortverhalten des Systems
vorausgesetzt16 . Die Amplitude der angelegten Wechselspannung sollte deshalb möglichst klein gewählt werden, da dann die starke Nichtlinearität vernachlässigbar ist. Eine gute Näherung für ein lineares Antwortverhalten erhält man für E0 < 25 mV bei 25◦ C [29].
Der folgende Ausdruck, analog zum Ohmschen Gesetz, erlaubt uns die Impedanz des Systems zu berechnen:
Z(t) =
sin(ω · t)
E0 · sin(ω · t)
E(t)
=
= Z0
I(t)
I0 · sin(ω · t + Φ)
sin(ω · t + Φ)
Mit Hilfe der Relationen [33]:
eiΦ = cos Φ + i · sin Φ
sin2 Φ + cos2 Φ = 1
tan Φ =
sin Φ
(2.23)
cos Φ
kann man die Impedanz als komplexe Funktion darstellen.
16
Bei einem nicht-linearen System würde der Antwortstrom Oberschwingungen der Anregungsfrequenz enthalten und die Auswertung der Informationen deutlich komplizierter
machen.
29
Abbildung 2.6: Die Impedanz in der komplexen Gaußschen Zahlenebene.
Die angelegte Spannung und die Stromantwort werden nun komplex beschrieben17 (Abbildung 2.6):
E(t) = E0 · eiωt
I(t) = I0 · ei(ωt−Φ)
Hieraus lässt sich der komplexe Widerstand des betrachteten Systems berechnen:
Z=
E(t)
E0 · eiωt
E0 iΦ
=
=
· e =| Z | · eiΦ = Z # + iZ ##
i(ωt−Φ)
I(t)
I0 · e
I0
(2.24)
Hierbei sind auf Grund der Gleichungen (2.23) der Realteil von Z (Resistanz)
und der Imaginärteil von Z (Reaktanz) gegeben durch:
Z # ≡ Re(Z) =| Z | · cos(Φ)
Z ## ≡ Im(Z) =| Z | · sin(Φ)
In Gleichung (2.24) stehen die beiden signifikanten Messgrößen | Z | und Φ.
Der Modul | Z | (Betrag der Impedanz) und das Argument φ (Phasenverschiebung) sind mit Hilfe der Gleichungen (2.23) gegeben durch:
$ ## %
#
Z
#
2
##
2
| Z |= (Z ) + (Z )
(2.25)
Φ = arctan
Z#
Man erkennt in Gleichung (2.24), dass die Zeitabhängigkeit der angelegten
Spannung bzw. des resultierenden Stroms verschwunden ist. Die Impedanz
17
Die physikalisch sinnvolle Lösung muss natürlich reell sein. Hier wird lediglich die
komplexe Darstellung aufgrund der einfachen und eleganten Schreibweise verwendet.
30
ist somit - vorausgesetzt, das System selbst ist zeitunabhängig - zeitinvariant
und (normalerweise) frequenzabhängig.
Manchmal ist es auch vorteilhaft Messergebnisse mit Hilfe der Admittanz zu
analysieren. Der Zusammenhang zwischen Admittanz Y und Impedanz Z ist
gegeben durch:
1
= Y = Y # + iY ##
Z
Die Admittanz stellt also eine komplexe Leitfähigkeit dar. Den Realteil von
Y (Konduktanz) und den Imaginärteil von Y (Suszeptanz) erhält man auf
folgende Art:
Y = Y # + iY ## =
⇒
Y# =
1
1
Z#
iZ ##
= #
=
−
Z
Z + iZ ##
(Z # )2 + (Z ## )2 (Z # )2 + (Z ## )2
Z#
(Z # )2 + (Z ## )2
und
Y ## =
−Z ##
(Z # )2 + (Z ## )2
Im Allgemeinen wird die Impedanz über einen bestimmten Frequenzbereich
gemessen, d.h. die Anregungsamplitude E0 bleibt gleich, aber die Frequenz
ändert sich. Werden nun bei verschiedenen Frequenzen der resultierende
Strom I0 und der dazugehörige Phasenwinkel Φ gemessen, so ergibt sich zu
jeder Frequenz ein Wertepaar von Z # und Z ## .
Die so erhaltenen Messergebnisse werden mit Hilfe von Ersatzschaltkreisen
simuliert, in denen die Schaltkreiselemente die mögliche physikalische Situation im System widerspiegeln sollen. Dadurch erhält man die gewünschten
Informationen über Widerstände und Kapazitäten des Systems [29].
Im Folgenden werden die wichtigsten Elemente der Ersatzschaltkreise sowie
die unterschiedlichen Auftragungsarten der Ergebnisse dargestellt.
2.2.2
Graphische Darstellungen der Impedanzspektren
Die Darstellung der Impedanzspektren kann im Bode-Plot, im Nyquist-Plot
oder in der frequenzreduzierten Admittanz erfolgen. Welche Informationen
man aus den unterschiedlichen Auftragungsarten herauslesen kann, wird in
Kapitel 2.2.4 erläutert.
Der Bode-Plot ist der wichtigste Plot zur Analyse von Impedanzmessungen
und wurde zuerst 1938 von Bode verwendet [34]. Der Vorteil dieser Darstellung ist die Anschaulichkeit des Frequenzverhaltens im untersuchten System.
Im Bode-Plot sind der Betrag der Impedanz und die Phasenverschiebung gegen die Frequenz aufgetragen. Die Frequenz wird dabei logarithmisch aufgetragen. Dadurch wird das Verhalten über den großen verwendeten Frequenzbereich anschaulich dargestellt.
31
Der Impedanz-Plot wurde erstmals 1960 von Sluyther theoretisch und experimentell verwirklicht [35][36]. Hierbei wird die einfachste Auftragungsmöglichkeit gewählt. Der negative Imaginärteil der Impedanz (−Z ## ) wird gegen
den Realteil (Z # ) aufgetragen. Diese so genannte Ortskurve wird auch häufig
als Nyquist-Plot bezeichnet.
Der Gebrauch der Admittanzebene wurde 1969 von Bauerle eingeführt [37].
In der vorliegenden Arbeit wird der frequenzreduzierte Admittanz-Plot
verwendet. Die Division der Admittanz durch die Winkelgeschwindigkeit ω
liefert die frequenzreduzierte Admittanz Y /ω. Den Graphen erhält man, indem der negative Imaginärteil der frequenzreduzierten Admittanz −Y ## /ω
gegen den Realteil Y # /ω aufgetragen wird.
2.2.3
Schaltkreiselemente
Im Folgenden werden die drei in der vorliegenden Diplomarbeit verwendeten Schaltkreiselemente Widerstand, Kondensator und konstantes Phasenelement eingeführt. In Abschnitt 2.2.4 wird das Verhalten von Widerstand
und Kondensator dann ausführlicher behandelt.
Abbildung (2.7) zeigt die Liniendiagramme für Widerstand und Kondensator18 .
• Für einen rein ohmschen Widerstand (R) gibt es zwischen Strom
und Spannung keine Phasenverschiebung.
• Misst man dagegen ein rein kapazitives Element (C) eilt der Strom
der Spannung um π/2 voraus.
• Die untersuchten Systeme verhalten sich nicht immer ideal. Stattdessen
verhalten sie sich wie ein konstantes Phasenelement (CPE). Die
Impedanz des CPE- Elements ist wie folgt definiert:
ZCP E =
A
(iω)α
Diese Gleichung beschreibt ein rein kapazitives Element für den Fall,
dass A = 1/C und α = 1 gilt. Ein rein ohmscher Widerstand wird
beschrieben, falls A = R und α = 0 gilt. Für ein CPE-Element gilt
0 < α < 1 und A ist eine frequenz-unabhängige reelle Konstante. Es gibt
mehrere Theorien über das nicht-ideale Verhalten der untersuchten Systeme, jedoch wurde bisher keine allgemein akzeptiert. Das Verhalten
18
Induktivitäten spielen in den zu untersuchenden Systemen dieser Diplomarbeit keine
maßgebliche Rolle und werden hier nicht behandelt.
32
des CPE-Elementes wurde zum Beispiel der Inhomogenität der Grenzflächen zugeschrieben. In einer anderen Theorie wird das konstante
Phasenelement auch auf die Verteilung, die selbst schon die mikroskopischen Materialeigenschaften aufweist, z. B. durch Ecken, Kanten und
Stufen an Grenzflächen zwischen Probe und Kontakt, zurückgeführt
[29][38].
Experimentell erhält man für α Werte zwischen 0,5 (für eine ideal poröse Elektrode) und ungefähr 1 (für eine fast perfekte glatte Elektrode).
Je näher α bei dem Wert 1 liegt, desto glatter ist die Oberfläche [39].
CPE-Elemente als Ersatzschaltkreiselemente müssen mit Vorsicht verwendet werden, da sie keine physikalische Bedeutung haben und eine
allgemein akzeptierte Theorie noch nicht vorliegt.
Abbildung 2.7: Strom- und Spannungs-Liniendiagramm für Widerstand und
Kondensator.
2.2.4
33
Einfache Ersatzschaltkreise
Ohmscher Widerstand: Abbildung 2.8 zeigt den Nyquist,den Bode- und
den frequenreduzierten Admittanz-Plot19 . In diesem Fall handelt es sich um
eine Simulationsmessung eines ohmschen Widerstandes (rot: 50 kΩ und blau:
100 kΩ).
Mit Hilfe des ohmschen Gesetzes erhält man die Impedanz eines rein ohmschen Widerstandes. Sie besitzt keinen Imaginärteil und ist frequenzunabhängig:
ZR =
E
I ·R
=
=R
I
I
⇒
ZR# = R
und
ZR## = 0 (2.26)
Der Nyquist–Plot zeigt also nur einen Wert, der dem des Widerstandes entspricht.
Die frequenzreduzierte Admittanz eines reinen Widerstandes kann man mit
Hilfe von Gleichung (2.26) berechnen:
YR =
1
1
=
ZR
R
⇒
YR#
1
=
ω
ω·R
und
YR##
=0
ω
Der frequenzreduzierte Admittanz-Plot zeigt demnach eine Gerade parallel
zur x-Achse.
Über den Bode-Plot erkennt man, dass es sich um ein rein ohmsches System
handeln muss. Über den kompletten Frequenzbereich ist die Phasenverschiebung bei beiden Widerständen 0◦ und man erhält für den Betrag der Impedanz den Widerstand R. Mit Hilfe von Gleichung (2.25) lässt sich dieses
Verhalten berechnen:
$ ## %
#
Z
#
2
##
2
Φ = arctan
=0
| Z |= (Z ) + (Z ) = R
Z#
19
Die Daten für diese und auch die folgenden Abbildungen wurden mit der Software
ZView simuliert. Die Simulation wurde in dem für uns messbaren Frequenzbereich von
10−3 bis 106 Hertz durchgeführt.
34
Abbildung 2.8: Frequenzreduzierter Admittanz-, Nyquist- und Bode-Plot für
einen reinen Widerstand (rot: 50 kΩ und blau: 100 kΩ).
Kondensator: Die Impedanz eines reinen Kondensators besitzt einen frequenzabhängigen Imaginärteil und keinen Realteil. Dies lässt sich wie folgt
berechnen:
Mit Hilfe von Q = C · E und der Annahme, dass C zeitinvariant ist, erhält
man:
E(t) = E0 · eiωt
⇒
Q(t) = Q0 · eiωt
Daraus folgt die Impedanz eines rein kapazitiven Elements:
ZC =
Also erhält man:
ZC =
−i
ω·C
⇒
Q
Q
E
=
=
I
I ·C
Q̇ · C
ZC# = 0
und
(2.27)
ZC## =
−1
ω·C
(2.28)
35
Der Nyquist-Plot (Abbildung 2.9) zeigt demnach eine Gerade entlang der
Y-Achse, welche durch die Stelle Z # = 0 geht.
Die frequenzreduzierte Admittanz eines Kondensators kann man mit Hilfe
von Gleichung (2.28) berechnen:
YC =
1
= iω · C
ZC
⇒
YC#
=0
ω
und
YR##
=C
ω
Der frequenzreduzierte Admittanz-Plot kann demnach nur einen Wert - den
des untersuchten Kondensators - enthalten.
Über den Bode-Plot erkennt man, dass es sich um einen reinen Kondensator handeln muss. Über den kompletten Frequenzbereich ist die Phasenverschiebung bei beiden Messungen 90◦ (siehe Abschnitt 2.2.3). Den Betrag der
Impedanz und den Phasenwinkel berechnet man mit (2.25):
$ ## %
#
1
Z
π
#
2
##
2
Φ = arctan
| Z |= (Z ) + (Z ) =
=−
#
ωC
Z
2
Aus diesem Grund erhält man für die Impedanz in Abhängigkeit von der
Frequenz eine Gerade, aus deren Lage auf die Kapazität zurückgeschlossen
werden kann. Über den kompletten Frequenzbereich ist die Phasenverschiebung bei beiden Kondensatoren 90◦ . Somit eilt der Strom der Spannung um
π/2 voraus (siehe Abbildung 2.7).
36
Abbildung 2.9: Frequenzreduzierter Admittanz-, Nyquist- und Bode-Plot für
einen Kondensator (rot: 5µF und blau: 50µF).
Parallelschaltung aus Widerstand und Kondensator: Die Impedanz
dieser Schaltung berechnet man mit Hilfe der Kirchhoffschen Gesetze [25]
und den Gleichungen (2.26) und (2.28) wie folgt:
Z=
1
R
1
=
+ i·ω·C
⇒
#
Z =
Z ## =
1
− i·ω·C
R
1
+ ω2 · C 2
R2
1
R
1
R2
+
ω2
· C2
=
=
1
R
1
R2
+
1+
ω2
ω2
· C2
− i·
R
· C 2 · R2
−ω · C
−R2 · ω · C
=
1
1 + ω 2 · C 2 · R2
+ ω2 · C 2
R2
1
R2
ω·C
+ ω2 · C 2
und
37
Man kann zeigen, dass Z # und Z ## die Parameterdarstellung eines Kreises mit
Radius R/2 und Mittelpunkt (R/2; 0) erfüllen:
%2
$
R2
R
#
Z −
+ (Z ## )2 =
2
4
(Kreisgleichung aus [33])
Da Z ## ≤ 0, erhält man im Nyquist-Plot in Abbildung 2.10 nur einen Halbkreis. Der Kreis schneidet - für den Fall, dass man über alle Frequenzen misst
- die x-Achse an den Stellen Z # = 0 und Z # = R und eignet sich deshalb sehr
gut dazu direkt den Widerstand abzulesen. Die frequenzreduzierte Admittanz
dieses Schaltkreises kann man wie folgt berechnen:
Y =
1
1
= + i·ω·C
Z
R
⇒
Y#
1
=
ω
ω·R
und
Y ##
=C
ω
Demnach erhält man im frequenzreduzierten Admittanz-Plot eine Gerade
parallel zur x-Achse, die die y-Achse im Punkt P(0; C) schneidet.
Anhand des Bode-Plots erkennt man, dass sich das System bei hohen Frequenzen wie ein Kondensator, bei niedrigen dagegen wie ein Widerstand verhält. Dies lässt sich durch Berechnung des Betrages der Impedanz und des
Phasenwinkels mit Hilfe von Gleichung (2.25) bestätigen:
"$
%2 $
%2 √ 2
R
−R2 · ω · C
R + R4 · ω 2 · C 2
+
=
| Z |=
1 + ω 2 · C 2 · R2
1 + ω 2 · C 2 · R2
1 + ω 2 · C 2 · R2
Φ = arctan
&
R2 · ω · C
− 1+ω
2 · C 2 · R2
R
1+ω 2 · C 2 · R2
'
= arctan(−R · ω · C)
Man erhält also folgende Abhängigkeiten:
ω→0
ω→∞
⇒
⇒
| Z |→ R
| Z |→
1
→0
ω·C
und
und
Φ→0
Φ→−
π
2
38
Abbildung 2.10: Frequenzreduzierter Admittanz-, Nyquist- und Bode-Plot
für eine Parallelschaltung aus Kondensator und Widerstand.
Reihenschaltung aus Widerstand und Kondensator: Abbildung 2.11
zeigt den frequenzreduzierten Admittanz-, den Nyquist- und den Bode-Plot.
Die Impedanz dieser Schaltung berechnet man mit Hilfe der Kirchhoffschen
Gesetze [25] und den Gleichungen (2.26) und (2.28) wie folgt:
Z = ZR + ZC = R +
−i
ω·C
⇒
und
Z# = R
Z ## =
−1
ω·C
Mit Hilfe dieser Gleichung lässt sich das frequenzabhängige Verhalten des
Imaginärteils der Impedanz und das frequenzunabhängige Verhalten des Realteils der Impedanz erklären. Die Admittanz berechnet sich zu:
1
R + ω ·i C
1
R
1
ω·C
= 2
= 2
+ i· 2
Y = =
Z
R + ω2 ·1 C 2
R + ω2 ·1 C 2
R + ω2 ·1 C 2
R − ω ·i C
⇒
R
Y = 2
R + ω2 ·1 C 2
#
und
##
Y =
1
ω·C
R2 +
1
ω2 · C 2
39
Man kann zeigen, dass Y # und Y ## die Parameterdarstellung eines Kreises
mit Radius C/2 und Mittelpunkt (0; C/2) in der frequenzreduzierten Admittanzebene erfüllen20 . Da Y # /ω ≤ 0, erhält man im frequenzreduzierten
Admittanz-Plot einen Halbkreis. Der Kreis schneidet - für den Fall, dass
man über alle Frequenzen misst - die y-Achse an den Punkten Y ## /ω = 0
und Y ## /ω = C und eignet sich deshalb sehr gut um direkt die Kapazität
abzulesen.
Anhand des Bode-Plots erkennt man, dass sich das System bei hohen Frequenzen wie ein Widerstand, bei niedrigen dagegen wie ein Kondensator verhält. Dies lässt sich durch Berechnung des Betrages der Impedanz und des
Phasenwinkels mit Hilfe von Gleichung (2.25) bestätigen:
"
$
%2 !
−1
1
= R2 + 2 2
| Z |= R2 +
ω·C
ω ·C
Φ = arctan
$
−1
ω·C
R
%
= arctan
Man erhält also die folgenden Abhängigkeiten:
ω→0
⇒
ω→∞
20
1
ω·C
| Z |→ R
| Z |→
⇒
$
−1
ω·C ·R
%
und
Φ→−
und
Φ→0
π
2
Dies wurde bereits im vorherigen Abschnitt in ganz ähnlicher Form für eine Parallelschaltung aus Widerstand und Kondensator in der Impedanz-Ebene dargestellt.
40
Abbildung 2.11: Frequenzreduzierter Admittanz-, Nyquist- und Bode-Plot
für eine Reihenschaltung aus Kondensator und Widerstand.
2.2.5
Spezielle Ersatzschaltkreise
Ersatzschaltkreis für einen idealen Monolayer: Für einen Monolayer,
der an einer Elektrode angebunden ist und sich in einer Flüssigkeit befindet,
erhält man einen Ersatzschaltkreis21 wie in Abbildung 2.12. Der Ersatzschaltkreis für den Monolayer besteht aus einem Widerstand und einer Kapazität,
welche parallel zueinander geschaltet sind. C steht für die Kapazität des Monolayers. Fließen elektronische Ströme, muss man zusätzlich noch für den
Ladungstransfer einen parallel geschalteten Widerstand R2 annehmen. Dieser Schaltkreis wird mit einem weiteren Widerstand in Reihe geschaltet. R1
berücksichtigt den Widerstand der Flüssigkeit und der Kontaktkabel. Wie im
vorherigen Abschnitt ausführlich dargestellt, ist es nun möglich, den Betrag
der Impedanz, die Admittanz, etc. auszurechnen und damit die unterschiedlichen Plots zu erklären.
21
Widerstände und Kapazität der Schaltkreiselemente wurden in einem ungefähr passenden Größenbereich gewählt [40].
41
Abbildung 2.12: Frequenzreduzierter Admittanz-, Bode- und Nyquist-Plot
eines idealen Monolayer-Ersatzschaltkreises.
Für den hohen Frequenzbereich verhält sich das System wie ein ohmscher
Widerstand R1 in Serie mit einem Kondensator C1 . Im niedrigen Frequenzbereich verhält sich das System stattdessen wie eine Reihenschaltung aus R1
und R2 .
Für den jeweiligen Frequenzbereich erhält man:
ω→∞
ω→0
⇒
⇒
| Z |→ Z # = R1
| Z |→ Z # = R1 + R2
und
und
Φ → 0◦
Φ → 0◦
An dieser Stelle sieht man sehr gut den Vorteil des Nyquist-Plots bzw. des
frequenzreduzierten Admittanz-Plots. Mit Hilfe dieser Darstellungen lassen
sich die Widerstände bzw. die Kapazität des Systems sehr einfach direkt ablesen.
42
Ersatzschaltkreis für ein ideales ptBLM-System: Ein ptBLM-System
besteht aus einem Monolayer auf einer Elektrode. An diesem Monolayer werden über einen ”His-Tag-Anker” Proteine gebunden. In dieser Arbeit handelt es sich bei den angebundenen Proteinen um Membranproteine. Man
simuliert mit Hilfe einer Lipiddoppelschicht eine Proteinmembran, um eine proteingerechte Umgebung herzustellen. Lipiddoppelmembranen besitzen
auf Grund ihrer Impermeabilität für Ionen einen hohen Widerstand im MΩBereich. Diese Impermeabilität ist jedoch stark potentialabhängig. Mit Hilfe
der Membran ist es somit möglich, Konzentrationsgradienten und damit Potentialdifferenzen aufrecht zu erhalten. Die Membran ist also in der Lage,
Ladungen zu separieren, weswegen sie auch kapazitive Eigenschaften besitzt.
Aus diesem Grund wird unser Monolayerschaltkreis mit einem parallelen RCGlied erweitert, welches in Reihe geschaltet wird (siehe Abbildung 2.13) [41].
Widerstände und Kapazitäten werden in dieser Simulation in dem jeweils passenden Größenbereich gewählt [42] [40]. Auch hier ist es wiederum möglich,
den Kurvenverlauf der einzelnen Auftragungsarten anhand der im vorherigen Abschnitt durchgeführten Prozedur zu erklären. Darauf wird hier jedoch
verzichtet und lediglich eine qualitative Beschreibung durchgeführt:
Der Nyquist-Plot zeigt, sofern die Zeitkonstanten22 der beiden RC-Glieder
weit genug auseinander liegen, zwei Halbkreise. In unserem Fall ist dies nicht
so. Die Zeitkonstanten liegen relativ dicht beieinander, weshalb sich die Halbkreise überschneiden. Die Schnittpunkte der Kurve mit der x-Achse ergeben
sich additiv aus den Einzelwiderständen des Systems.
Der Graph des frequenzreduzierten Admittanz-Plots schneidet die y-Achse
an dem Punkt, der für den Wert des kleineren Kondensators C1 steht. Mit
abnehmender Frequenz bildet sich dann ein Halbkreis. Dieser steht für den
Kondensator mit höherer Kapazität. Im niedrigen Frequenzbereich verhält
sich das System stattdessen wie eine Reihenschaltung aus den Widerständen, weshalb der Graph dann in eine Gerade übergeht.
22
Die Zeit, die ein System nach einer Anregung benötigt um wieder in seine Gleichgewichtslage zurückzukehren, bezeichnet man als Relaxationszeit τ = R · C
43
Abbildung 2.13: Frequenzreduzierter Admittanz-, Bode- und Nyquist-Plot
eines idealen ptBLM-Ersatzschaltkreises.
Der Bode-Plot dieser ptBLM-Simulation verhält sich analog zu dem eines
Monolayers. Auf Grund des eingefügten RC-Gliedes steigt der Phasenwinkel
bei kleineren Frequenzen erneut an. Bei kleiner werdender Frequenz nähert
sich der Phasenwinkel (analog zum Monolayer) dem Wert Φ = 0. Der Betrag der Impedanz wird auf Grund der zweiten Zeitkonstante im mittleren
44
Frequenzbereich ebenfalls verändert. Man erhält die folgende Abhängigkeit:
ω→∞
ω→0
⇒
⇒
| Z |→ Z # = R1
und
| Z |→ Z # = R1 + R2 + R3
Φ → 0◦
und
Φ → 0◦
Die Systeme, die in dieser Diplomarbeit untersucht werden, sind jedoch keine
idealen Systeme. Aus diesem Grund müssen die Ersatzschaltkreise den jeweiligen Bedingungen angepasst werden. Dies geschieht zum Beispiel durch den
Ersatz eines Schaltkreisgliedes durch ein CPE-Element (Abschnitt 2.2.3).
2.3
CV - Cyclovoltammetrie
Mit den bisher vorgestellten Methoden war es möglich, den Aufbau des
ptBLM-Systems zu überprüfen. Jedoch sind die Informationen (zum Beispiel über kinetische Parameter unseres Systems), die man mit Hilfe von EIS
und SPR erhalten kann, für unserer Zwecke nicht ausreichend. Da es sich
bei den in dieser Diplomarbeit untersuchten Proteinen um Redox-Proteine
handelt, wird deshalb zur näheren Untersuchung der Proben die Cyclovoltammetrie verwendet. Diese Methode hat sich zur Charakterisierung redoxaktiver Verbindungen etabliert und lässt Rückschlüsse auf den Mechanismus
einer elektrochemischen Reaktion zu.
Die Cyclovoltammetrie gehört wie die Impedanzspektroskopie zu den elektrochemischen Messmethoden. Bei der Impedanzspektroskopie wurde ein kleines
alternierendes Störsignal angelegt und der resultierende Strom gemessen. Bei
der Cyclovoltammetrie dagegen werden durch eine Dreiecksspannung Potentiale jenseits des elektrochemischen Gleichgewichts angelegt. Der Arbeitselektrode (siehe Abschnitt 2.2.1) und damit der zu untersuchenden Probe wird
ausgehend von einem Anfangspotential ein sich zeitlich linear änderndes Potential aufgeprägt (siehe Abbildung 2.14). Die dabei in der Messzelle vor
sich gehenden Prozesse führen zu einem charakteristischen Stromsignal. Der
Stromfluss wird, wie in Abbildung 2.14 zu sehen, als Funktion der zwischen
Arbeitselektrode und Referenzelektrode angelegten Spannung aufgezeichnet.
45
Abbildung 2.14: (a) „Dreiecksform“ des angelegten Potentials als Funktion
der Zeit. (b) Strom-/Zeit-Kennlinie einer Messlösung, die
eine oxidierte und eine reduzierte Form einer Redox-Spezies
enthält. (c) Cylovoltammogramm dieser Messlösung. Ea : anodisches Spitzenpotential; Ec : kathodisches Spitzenpotential; E1 und E2 : Umkehrpotentiale; Ia und Ic : anodischer bzw.
kathodischer Spitzenstrom.
An chemischen Reaktionen sind sehr häufig auch Elektronentransferprozesse
oder allgemein Ladungstransferreaktionen beteiligt. Diese Transferreaktionen
sind deshalb in der Natur weit verbreitet und seit dem Aufkommen moderner
Reaktionstheorien in den 20er und 30er Jahren des zwanzigsten Jahrhunderts
Gegenstand vieler experimenteller und theoretischer Arbeiten [43]. Elektronentransferprozesse betrachtete man lange Zeit als rein thermodynamische
Phänomene. Die Kinetik von Elektronentransferprozessen blieb dabei nahezu unbekannt. Diese Ansicht änderte sich grundlegend, als klar wurde, dass
Elektronentransferprozesse eine endliche Geschwindigkeit aufweisen, deren
Betrag von Aktivierungsparametern abhängt [44]. In der Elektrochemie ver-
46
schob sich damit allmählich der methodische Schwerpunkt von der statischen
zur dynamischen Strommessung.
Unter den zahlreichen dynamischen Messmethoden der elektroanalytischen
Chemie23 , die in den letzten Jahrzehnten entwickelt wurden, hat die Cyclovoltammetrie (CV) eine besonders große Popularität erlangt. Zwei Aspekte haben zu dieser Entwicklung wesentlich beigetragen: Die theoretischen
Grundlagen der Methode wurden unter anderem von Randles und Sevcik bereits 1948 mathematisch exakt analysiert, so dass alle wichtigen Varianten
elektrochemischer Prozesse in ihrer Beziehung zum voltammetrischen Signal
quantitativ interpretiert werden können [45] [46]. Moderne numerische Methoden ermöglichen außerdem die Berechnung von Cyclovoltammogrammen
für komplexe Elektrodenprozesse [47]. Zusätzlich dient die Cyclovoltammetrie zur Untersuchung potentialabhängiger Phasengrenzflächenreaktionen wie
Adsorptionsprozessen [48]. Entscheidend für den Durchbruch der Methode
war jedoch die Tatsache, dass man in sehr kurzer Zeit Informationen über
die Thermodynamik von Redoxprozessen und die Kinetik von Elektronentransferreaktionen erhalten kann.
Zum Beispiel ist es möglich, anhand der Peakpotentiale das so genannte Mittelwertpotential auszurechnen:
E1/2 =
Epc + Epa
2
Das Mittelwertpotential liegt sehr nahe am thermodynamischen Redox-Potential E0 , welches dadurch schnell geschätzt werden kann.
In der vorliegenden Arbeit werden die benötigten kinetischen Daten durch
Variation der Spannungsvorschubgeschwindigkeit (Scan-Rate) ν gewonnen:
ν = dE/dt
(2.29)
Man unterscheidet zwei verschiedene Arten von Strömen, faradayische und
nicht-faradayische Ströme.
Nicht-faradayische Ströme sind von elektrostatischer Natur und in keinster
Weise mit einer elektrochemischen Reaktion verbunden. Sie resultieren aus
der Reorganisation der Ionen im Elektrolyten nahe der Elektrodengrenzfläche
und werden auch kapazitive Ströme Ic genannt. Für einen Spannungsverlauf
E = Einit +ν · t, bei konstanter Grenzschichtkapazität Cdl und der Annahme,
dass man nur einen Lösungsmittelwiderstand Rs hat, erhält man:
IC =
23
(
)
Einit −t/Rs · Cdl
·e
+ ν · Cdl 1 − e−t/Rs · Cdl
Rs
(2.30)
Hierzu gehört auch die in Abschnitt 2.2 bereits diskutierte elektrochemische Impedanzspektroskopie.
47
Das bedeutet, der kapazitive Strom nimmt mit zunehmender Spannungsvorschubgeschwindigkeit und zunehmender Grenzschichtkapazität zu. Beim
Rücklauf des CV bekommt der zweite Summand ein negatives Vorzeichen,
so dass sich Hin- und Rückrichtung des CV nach Abklingen des transienten
Anteils um ∆I = 2νCdl unterscheiden [48].
Faradayische Ströme haben ihre Herkunft im heterogenen Ladungstransfer
zwischen Elektrode und einer Redoxspezies im Elektrolyt, der immer mit
einem chemischen Stoffumsatz verbunden ist. Den quantitativen Zusammenhang liefern die Faradayschen Gesetze [48].
2.3.1
Cyclovoltammetrie von gelösten Redoxspezies
Die einfachste Faradaysche Elektrodenreaktion besteht im heterogenen Ladungstransfer von einer elektroaktiven Spezies (zum Beispiel: Fe) zur Elektrode (zum Beispiel: Ag) oder umgekehrt, bekannt als Ein-Elektronen-Transfer24 .
Je nach der Richtung des Ladungstransports unterscheidet man anodische
und kathodische Ströme:
Ein anodischer Strom fließt, wenn
• positive Ladungsträger von der (Arbeits-) Elektrode in eine Redoxspezies im Elektrolyten übergehen.
• negative Ladungsträger von der Redoxspezies im Elektrolyten in die
Elektrode übergehen.
Dieser Vorgang stellt eine Oxidation dar, und die Elektrode wird als Anode
bezeichnet.
Ein kathodischer Strom fließt, wenn
• positive Ladungsträger von der Redoxspezies im Elektrolyten in die
Elektrode übertreten.
• negative Ladungsträger von der Elektrode in eine Redoxspezies im
Elektrolyten übergehen.
Jetzt stellt der Vorgang eine Reduktion dar, und die Elektrode wird als Kathode bezeichnet. Die messbare Gesamtstromdichte j setzt sich additiv aus
der anodischen und der kathodischen Teilstromdichte zusammen. Im elektrochemischen Gleichgewicht E = E0 laufen beide Teilreaktionen gleich schnell
24
Kompliziertere Mechanismen werden in dem Übersichtsartikel ”Cyclovoltammetrie die Spektroskopie des Elektrochemikers” von Jürgen Heinze oder ausführlicher in den
Übersichtswerken von Balzani behandelt [49][50].
48
ab und es findet makroskopisch kein Stoffumsatz statt [51]. Nur wenn das
Potential an der Elektrode von E0 verschieden ist, kann auch ein Strom fließen. Die Abweichung des Elektrodenpotentials unter Stromfluss von seinem
Gleichgewichtspotential bezeichnet man als Überspannung:
η = E − E0
(2.31)
Zwei Prozesse prägen die Faradaysche Elektrodenreaktion:
• der heterogene Ladungstransfer zwischen Elektrode und Lösung
• der diffusionsbedingte Massentransport
Der heterogene Ladungstransfer an der Phasengrenzfläche Elektrode/Elektrolyt wird durch die Butler-Volmer-Gleichung, die Grundgleichung der elektrochemischen Kinetik, beschrieben [49]:
(
)
I = n · F · A · k0 Cox · e−α · n · F · ν/R · T − Cred · e(1−α) · n · F · ν/R · T
(2.32)
Hierbei ist α der Durchtritts- oder Symmetriefaktor, ν die Überspannung
aus Gleichung (2.31), T die Temperatur, R die molare Gaskonstante und F
die Faradaykonstante. Des Weiteren steht n für die Anzahl der übertragenen Elektronen und A für die aktive Elektrodenoberfläche. Nach der ButlerVolmer-Gleichung hängt der Strom von den Oberflächenkonzentrationen Cox
und Cred der beteiligten Redoxpartner, dem aktuellen Elektrodenpotential
E und der Standardgeschwindigskeitkonstanten des heterogenen Durchtritts
k0 ab. Aufgrund ihres Konzentrationsunterschieds zur übrigen Lösung führen
die potentialabhängigen Oberflächenkonzentrationen zu einem diffusionskontrollierten Massentransport. Die Konzentrationsverteilung in der Diffusionsschicht lässt sich aus dem zweiten Fickschen Gesetz berechnen [49]:
∂ 2 Cox
∂Cox
= Dox ·
∂t
∂x2
und
∂Cred
∂ 2 Cred
= Dred ·
∂t
∂x2
(2.33)
In dieser Gleichung stehen Dox und Dred für den Diffusionskoeffizienten der
oxidierten bzw. reduzierten Redox-Spezies. Allerdings gilt das Ficksche Gesetz nur für eine lineare Diffusion, die jedoch meistens annähernd vorherrscht
[49].
Der Konzentrationsgradient an der Elektrodenoberfläche ist dem Ladungsfluss direkt proportional:
$
%
$
%
I
∂Cox
∂Cred
j=
∼ −Dox
= Dred
(2.34)
n·F ·A
∂x x=0
∂x x=0
49
Der an der Arbeitselektrode messbare Strom setzt sich aus einem Anteil für
den heterogenen Ladungstransfer und einem Anteil für den Massentransport
zusammen. Die jeweiligen Anteile hängen mit den Gleichungen (2.32) und
(2.34) zusammen [49].
Man unterscheidet nun drei Fälle voneinander:
Quasireversibler Fall: In diesem allgemeinen Fall bestimmen sowohl Ladungstransfer als auch Massentransport den messbaren Strom
Reversibler Fall: Bei einem reversiblen Prozess ist die Geschwindigkeit
des heterogenen Ladungstransfers so groß, dass sich an der Phasengrenzfläche
ein thermodynamisches Gleichgewicht einstellt. Die Butler-Volmer-Gleichung
vereinfacht sich dadurch zur Nernst-Gleichung.
Abbildung 2.14 zeigt ein Cyclovoltammogramm eines reversiblen Redoxsystems, das sowohl die oxidierte Form als auch die reduzierte Form eines
Redoxpaares enthält. Das Experiment wird bei einem Potential Einit mit
Eup < Einit < Edown gestartet. Läuft die Spannung zuerst in Richtung positiver Potentiale, so wird entsprechend der Nernst-Gleichung:
$
%
[Cox ]
R·T
· ln
E = E0 +
(2.35)
n·F
[Cred ]
die reduzierte Form in die oxidierte Form umgesetzt (R: Gaskonstante, T :
Temperatur, F : Faradaykonstante, C: Konzentration, n: Anzahl der Elektronen, E 0 : Standardpotential). Das bedeutet, die Oberflächenkonzentrationen
hängen nur noch vom Elektrodenpotential ab und werden nicht mehr durch
heterogene kinetische Effekte beeinflusst. Der Strom an der Elektrodenoberfläche wird ausschließlich durch den Massentransport als langsamsten Schritt
kontrolliert [49].
Der Verbrauch der Reaktanden an der Elektrodenoberfläche führt zu einem
ausgeprägten Konzentrationsgradienten. Dieser Gradient fördert eine schnellere Diffusion der Reaktanden und somit den Strom. Der Potentialscan läuft
weiter und der Strom wird zunehmend von der endlichen Diffusionsgeschwindigkeit der Moleküle gehemmt, bis er schließlich ein Maximum erreicht. Beim
Maximum am Potential Epc ist die effektive Konzentration der herandiffundierenden Moleküle an der Elektrodenoberfläche identisch mit Null. Jedes herandiffundierte Moleküle wird sofort umgesetzt. Da der Konzentrationsgradient weiter zunimmt, nimmt der Strom I entsprechend der Cotrell-Gleichung
√
n·F ·A· D·C
(2.36)
I=
√ √
π· t
50
mit t−1/2 ab, bis der Umkehrpunkt Edown erreicht ist. In dieser Gleichung
steht A für die elektrochemisch aktive Oberfläche der Elektrode, D und C für
den Diffusionskoeffizienten bzw. die Ausgangskonzentration des Substrates
[52][53].
Für den Rückweg des Potentialscans gelten obige Ausführungen analog für
den Reduktionsvorgang.
Ein ideal reversibler Vorgang hat folgende Charakteristika:
• k0 > 10−1 cm/s
• Der Potentialabstand zwischen den Spitzenwerten ist bei 25◦ C gegeben
durch
59
∆Ep = |Epc − Epa | =
mV ,
n
wobei n für die Anzahl der Elektronen steht, die während eines Redoxprozesses umgesetzt werden.
• Das Peakpotential ist unabhängig von der Spannungsvorschubgeschwindigkeit.
• Die Peakbreite bei halber Peakstromhöhe ist für alle Spannungsvorschubgeschwindigkeiten gleich. Sie entspricht 28 mV pro umgesetztem
Elektron. Je höher die Anzahl der Elektronen, die während eines Redoxprozesses umgesetzt werden, desto schmaler wird der Peak. Damit
ist es möglich die Anzahl der Elektronen zu bestimmen.
• Die Beträge der Peakströme nehmen linear mit der Quadratwurzel
der Spannungsvorschubgeschwindigkeit zu. Sie sind durch die RandlesSevcik-Gleichung gegeben:
√
I ≈ 2,69 · 105 · n3/2 · A · C · D · ν
(2.37)
In dieser Gleichung steht I für Ipa bzw. Ipc und n für die Anzahl der Elektronen. C steht für die Konzentration der umgesetzten Redox-Spezies Cox bzw.
Cred und D für den jeweiligen Diffusionskoeffizienten [48][49].
Irreversibler Fall: Bei diesem Prozess ist der Ladungstransfer an der Elektrode sehr langsam (k0 < 10−5 cm/s). Abhängig vom Potential hat nur die
anodische oder kathodische Durchtrittsreaktion eine messbare Geschwindigkeit [49]. Hierbei wird der Strom also nicht, wie im reversiblen Fall, durch die
Diffusion kontrolliert, sondern durch den Ladungstransfer. Beim irreversiblen
51
Ladungsübergang wird der Abstand zwischen dem anodischen und dem kathodischen Peakpotential größer. Man benötigt also ein größeres Überpotential um die Redox-Spezies zu reduzieren oder zu oxidieren. Außerdem reduziert
sich die Peakhöhe. Total irreversible Systeme zeichnen sich bei Veränderung
der Spannungsvorschubgeschwindigkeit durch eine Verschiebung des Peakpotentials aus.
Ein weiteres mögliches Kriterium für eine irreversible Reaktion ist das Fehlen des Peaks für die Rückreaktion des Produkts. Das ist die Folge des im
Vergleich zum reversiblen System langsameren Elektronentransfers, der bewirkt, dass die umgesetzte Redox-Spezies aus dem Elektrodenbereich herausdiffundiert oder durch Weiterreaktion nicht mehr für die Rückreaktion zur
Verfügung steht [48].
2.3.2
Cyclovoltammetrie von oberflächengebundenen Redoxspezies
Bis jetzt wurde in der Diskussion der Cyclovoltammetrie immer davon ausgegangen, dass sich Reaktanden und Produkte frei in Lösung befinden. In
diesem Abschnitt soll nun der Fall von oberflächengebundenen Redoxmolekülen dargestellt werden. Hier spielen Diffusionsphänomene keine Rolle mehr.
Im idealen Fall ist die Peakseparation identisch mit 0 mV. Die Peakbreite bei
halber Peakstromhöhe beträgt bei 25◦ C [48]
∆E = 3,53
R·T
= 90,6 mV pro Elektron.
n·F
(2.38)
In Abbildung 2.15 ist ein Cyclovoltammogramm einer ideal reversiblen oberflächengebundenen Redoxspezies schematisch dargestellt.
Der Peakstrom hängt in diesem Fall ab von der konstanten Oberflächenbelegung der Redox-Moleküle Γtot = Γox +Γred , der aktiven Elektrodenoberfläche
A, der Spannungsvorschubgeschwindigkeit ν, der Faradaykonstanten F , der
Gaskonstanten R und der Temperatur T . Wieder spielt die Anzahl der übertragenen Elektronen eine Rolle:
I=
n2 · F 2 · ν · A · Γtot
4·R·T
(2.39)
Im Gegensatz zur diffusionskontrollierten reversiblen Umsetzung von gelösten Redoxmolekülen ist der Peakstrom nicht direkt proportional zur Quadratwurzel der Spannungsvorschubgeschwindigkeit (Gleichung 2.37), sondern
laut Gleichung 2.39 direkt proportional zu ν [48].
52
Abbildung 2.15: Schematisches Cyclovoltammogramm einer ideal oberflächengebundenen Redoxspezies.
2.3.3
IR-Drop Kompensation
Wegen der endlichen Leitfähigkeit des Elektrolyten kommt es zu einem Spannungsabfall, den man als IR-Drop bezeichnet. In einem Cyclovoltammogramm macht sich der IR-drop negativ bemerkbar durch eine Vergrößerung der Peakpotentialdifferenz, durch eine Verbreiterung der Peaks und eine
Verringerung des Peakstroms. Diese Verzerrung der experimentellen Kurven
kann, wie in Abbildung 2.16 zu sehen, drastisch ausfallen. Der Effekt ist umso
größer, je größer der Widerstand der Lösung und je größer der Faradaysche
Strom ist. Der Faradaysche Strom wiederum steigt mit zunehmender Konzentration des Substrats und zunehmender Spannungsvorschubgeschwindigkeit
an.
Die wichtigsten Methoden für eine Verkleinerung des IR-Drops sind:
• Verringerung des Lösungsmittelwiderstands durch Erhöhung der Leitsalzkonzentration
• elektronische Kompensation
Auf Grund der Empfindlichkeit unseres ptBLM-Systems25 wurde die elektronische Kompensation zur IR-Drop-Kompensation verwendet.
25
Membranproteine benötigen eine spezielle Umgebung. Sie würden bei hohen Leitsalzkonzentrationen denaturieren.
53
Bei der elektronischen Kompensation - auch ”positive feedback methode” genannt - wird mit einer Korrekturspannung gearbeitet [54]. Die optimale Höhe
dieser Spannung kann durch eine Impedanzmessung (Messung des Lösungsmittelwiderstandes) ermittelt werden.
Abbildung 2.16: Cyclovoltammogramm (a) ohne und (b) mit IR-Drop.
2.4
54
Spektroelektrochemie
Mit Hilfe von EIS und CV kann man zwar die Aktivität der oberflächengebundenen Proteine nachweisen und kinetische Parameter ausrechnen, jedoch
ist keine detaillierte Spezies-Analyse möglich. Wenn ein Protein zum Beispiel
aus mehreren Redoxzentren besteht26 , liefert die Cyclovoltammetrie bzw. die
elektrochemische Impedanzspektroskopie einen Stromwert, welcher dann alle
anwesenden Prozesse repräsentiert. So erhält man keine direkte Information
über die Redoxspezies und deren Redoxzustände. Zudem ist keine Aussage
über die strukturellen Veränderungen des Systems möglich.
Die Schwingungs-Spektroskopie ist eine wichtige Methode, um Informationen
über Schwingungs- und Rotationszustände von Molekülen zu erhalten. Mit
diesen Informationen lassen sich Aussagen über den Redox-, Koordinationsund Ligandenzustand von Metallkomplexen machen. Diese Metallkomplexe
liegen in allen Hämproteinen vor, wie zum Beispiel beim Cytochrom c oder
bei der Cytochrom-c-Oxidase.
Durch die Kombination dieser elektrochemischen und spektroskopischen Methoden, kurz durch die ”Spektroelektrochemie”, ist es möglich, redoxbedingte
und strukturelle Veränderungen von Proteinen nachzuweisen und zuzuordnen. Die Kombination von elektrochemischen Experimenten mit ”in situ”
Spektroskopie wurde in den letzten 25 Jahren mit erhöhter Aufmerksamkeit
studiert und die meisten Spektroskopiearten, wie zum Beispiel UV-visible-,
Infrarot- und Ramanspektroskopie miteinbezogen. Aufgrund der Kombination zweier völlig verschiedener Messmethoden sind die Experimente meist
sehr komplex aufgebaut und man benötigt spezielle Apparaturen. Die größte
Schwierigkeit besteht darin, einen experimentellen Aufbau zu konstruieren,
der eine hohe Sensitivität für die spektroskopische und elektrochemische Untersuchung aufweist [51].
Man kann zwei Messmethoden, die in dieser Diplomarbeit Verwendung finden, voneinander unterscheiden:
2.4.1
Potentiostatische Messungen
Das an der Oberfläche gebundene Protein wird durch eine angelegte konstante Spannung in einen definierten Zustand (reduziert, oxidiert oder ein
Zwischenzustand) gezwungen. Daraufhin liefert die Schwingungsspektroskopie die oben erwähnten Informationen.
26
in unserem Fall die vier Redoxzentren der Cytochrom-c-Oxidase
2.4.2
55
Zeitaufgelöste Messungen
Ein großer Nachteil der schwingungsspektroskopischen Methoden ist der kleine Wirkungsquerschnitt und der damit verbundene Zeitaufwand der Messung. Aus diesem Grund musste ein spezielles Messverfahren für die Zeitauflösung entwickelt werden [55]:
Eine Rechteckspannung wird an die Elektrode, an die das Protein gebunden ist, angelegt. Start- und Endpotential (Ei und Ef ) werden so gewählt,
dass sich das Protein bei den jeweiligen Potentialen in einem vollkommen
oxidierten und vollkommen reduzierten Zustand befindet. Nach einer Verzögerungszeit δ findet eine Schwingungsspektroskopie-Messung im Intervall ∆t
statt (Abbildung 2.17). Die Zeitauflösung ist damit durch die Wahl von δ und
∆t begrenzt. Nach dem Messvorgang muss das System wieder in den Ausgangszustand gebracht werden, so dass beim nächsten Messvorgang genau
dieselben Voraussetzungen gegeben sind. Man misst also die durchschnittliche Änderung des Systems zwischen t=δ und t=δ+∆t. Die Potentialsprünge
werden z mal wiederholt, so dass die tatsächliche Messzeit z · ∆t beträgt. Die
Anzahl der Wiederholungen z muss so gewählt werden, dass man ein vernünftiges Signal-Rausch-Verhältnis erhält. Da es in unserem Fall nicht möglich
ist den Detektor zu triggern, ist er während der kompletten Messzeit z · Tc
aktiv, was leider zu einem verstärkten Hintergundrauschen führt.
Abbildung 2.17: Das Prinzip der zeitaufgelösten Messmethode.
2.5
56
Ramanspektroskopie
Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurde als Schwingungsspektroskopieart die
Ramanspektroskopie gewählt, deren theoretische Grundlagen in diesem Kapitel dargelegt werden sollen.
Die Ramanspektroskopie beruht auf der als Raman-Effekt bezeichneten inelastischen Streuung von Licht an Molekülen. Theoretische Grundlagen, unter anderem von Smekal [56], führten 1928 zur Entdeckung des Effektes durch
Raman und Krishnan [57]. Nur zwei Jahre später erhielt Raman für seine
Entdeckung den Nobelpreis für Physik.
2.5.1
Darstellung des Raman-Effekts über das Energietermschema
Eine einfache qualitative Darstellung des Raman-Effekts27 , welche schon wesentliche Züge darlegt, kann mit einem Energietermschema erfolgen.
Bestrahlt man ein Molekül mit einem Photon der Energie (E = h · f ), die
klein genug ist, um das erste Anregungsniveau nicht zu erreichen28 , wird es
vom Grundniveau in ein so genanntes virtuelles Niveau angehoben. Virtuell
heißt hier, dass es sich nicht um einen stationären Zustand im quantenmechanischen Sinne handelt. Es wird weder der nächste elektronische Anregungszustand noch ein Vibrationszustand erreicht. Nach der Anregung relaxiert
das Molekül unter Emission eines Photons. Hierbei kann man drei Fälle unterscheiden (siehe Abbildung 2.18):
Bei der Rayleigh-Streuung (a) wechselwirkt das Molekül mit dem einfallenden Photon und befindet sich anschließend wieder im nicht schwingungsangeregten elektronischen Grundzustand. Die Wellenlängen von einfallender und
gestreuter Strahlung sind identisch.
Bei der Stokes-Raman-Streuung (b) werden beim Streuprozess Schwingungen im Molekül angeregt. Die gestreute Strahlung ist um den Betrag der zur
Schwingungsanregung benötigten Energie ärmer und weist somit eine größere
Wellenlänge als die einfallende Strahlung auf.
Bei der Anti-Stokes-Raman-Streuung (c) befindet sich das Molekül vor dem
Streuprozess in einem schwingungsangeregten Zustand (z.B. v = 1) und relaxiert nach der Wechselwirkung mit dem Photon in einen schwächer angeregten Zustand (z.B. v = 0). Die Energie der Schwingung wird auf das gestreute Photon übertragen, welches dadurch eine höhere Energie und damit eine
27
In dieser Arbeit wird unter Raman-Effekt im Allgemeinen immer der VibrationsRaman-Effekt bezeichnet. Der Rotations-Raman-Effekt wird im Abschnitt A.3 kurz erläutert.
28
Wird das erste Anregungsniveau erreicht, kann das Photon absorbiert werden. Dann
treten zusätzliche Effekte auf, wie zum Beispiel Fluoreszenzstrahlung.
57
kürzere Wellenlänge als das einfallende Photon aufweist. Dieser Streuvorgang
tritt üblicherweise mit geringerer Wahrscheinlichkeit als die Stokes-Streuung
auf, da er von der Besetzungsdichte des schwingungsangeregten Zustandes
abhängt. Die Besetzung folgt der Boltzmann-Verteilung und ist stark temperaturabhängig. Der Quotient aus der Anzahl der Moleküle im Zustand ν = 1
und der Anzahl der Moleküle im Zustand ν = 2 ist gegeben durch:
n1
= e−(E1 −E2 )/kB · T
n2
Bei Raumtemperatur befinden sich jedoch die meisten Moleküle im Grundzustand. Folglich haben die Stokes-Linien eine höhere Intensität als die AntiStokes-Linien [58].
Abbildung 2.18: Die Energieniveaus bei der elastischen und inelastischen
Streuung.
2.5.2
Klassische Deutung des Raman-Effekts
Die klassische Deutung des Raman-Effekts basiert auf einem Wellenmodell.
Im Feld einer elektromagnetischen Welle oszillieren geladene Teilchen. Bei der
Wechselwirkung zwischen dem Molekül und der elektromagnetischen Welle
kommt es zu einer periodischen Verschiebung der Elektronen und Protonen
aus den Gleichgewichtslagen. Durch das äußere Feld wird daher ein Dipolmoment im Molekül induziert. Dieses Dipolmoment ist proportional zum elektrischen Feld, das das Dipolmoment induziert hat. Der Proportionalitätsfaktor
heißt Polarisierbarkeit [24]:
µ = α·E
58
Das elektrische Feld der elektromagnetischen Welle am Ort des Moleküls
verändert sich mit der Zeit:
E = E0 cos(2πf0 t)
(2.40)
Hierbei ist E0 der maximale Wert des elektrischen Feldes, f die Frequenz der
Strahlung und t die Zeit.
Die klassische Theorie fordert nun eine Abstrahlung mit der Frequenz f .
Man nimmt an, dass die Polarisierbarkeit für eine feste Frequenz konstant ist
[24]. In Molekülen können jedoch gewisse Rotationen und Vibrationen dafür
sorgen, dass sich die Polarisierbarkeit ändert. Zum Beispiel verändert sich die
Form eines zweiatomigen Moleküls periodisch durch eine Vibration. Wenn die
Elektronenwolke nicht mit diesen Vibrationen konstruktiv interferiert, erhält
man eine Veränderung der Polarisierbarkeit. Für sehr kleine Abweichungen
kann man die Polarisierbarkeit in einer Taylorreihe entwickeln [58]:
α = α0 +
∂α
· Q + ...
∂Q
(2.41)
α0 ist die Polarisierbarkeit im Gleichgewichtszustand. Q steht für die Nor∂α
malkoordinaten der Kerne29 und ∂Q
ist die Rate, in der die Polarisierbarkeit
relativ zu Q im Gleichgewichtszustand verändert wird. α hat nun die Bedeutung eines molekularspezifischen dreidimensionalen Parameters und wird als
Polarisationstensor bezeichnet.
Bei kleinen Veränderungen kann die Variation der Kernkoordinaten durch
eine harmonische Schwingung dargestellt werden:
Q = Q0 cos(2πf t)
(2.42)
Dadurch kann man die Terme höherer Ordnung vernachlässigen. Einsetzen
von Gleichung (2.42) in (2.41) liefert:
α ≈ α0 +
∂α
· Q0 cos(2πf t)
∂Q
(2.43)
Mit Hilfe von Gleichung (2.40) erhält man damit für das Dipolmoment [58]:
µ = αE = α0 E0 cos(2πf0 t) +
∂α
· Q0 E0 cos(2πf0 t) cos(2πf t)
∂Q
Dies lässt sich unter Verwendung von [33]:
1
cos β cos γ = [cos(β − γ) + cos(β + γ)]
2
29
In dem obigen zweiatomigen Spezialfall wäre Q = r − re .
(2.44)
59
umschreiben zu:
µ = α0 E0 cos(2πf0 t) +
∂α
· Q0 E0 [cos(2π(f0 − f )t) + cos(2π(f0 + f )t)] (2.45)
∂Q
Die letzte Gleichung zeigt, dass die Streustrahlung drei Anteile mit unterschiedlichen Frequenzen aufweist. Der erste Term beschreibt die RayleighStreuung, der zweite die Stokes-, der dritte die Anti-Stokes-Signale. Der Polarisationstensor ändert sich nicht im Term für die Rayleigh-Streuung, dafür
jedoch in den Termen für Stokes- und Anti-Stokes-Linien. Hierdurch zeigt
sich die fundamentale Bedingung für das Auftreten der Raman-Streuung.
Eine Schwingung ist nur dann raman-aktiv, wenn sich in ihrem Verlauf die
Polarisierbarkeit ändert [58]:
∂α
*= 0
(2.46)
∂Q
Die Intensität eines Raman-Streuvorgangs ist proportional zum Quadrat der
mittleren Polarisierbarkeit |α|2 und als Dipolabstrahlung zur vierten Potenz
der reziproken Streuwellenlänge [24]:
|α|2 · E 2
IR ∼
λ4
Die vorgestellte klassische Theorie der Raman-Streuung ist zwar sehr anschaulich, doch kann sie einige der beobachteten Phänomene bei den RamanExperimenten nicht erklären. Die Theorie wurde im Laufe der Zeit mit den
Methoden der Quantenmechanik behandelt. Eine ausführliche Diskussion
der quantenmechanischen Beschreibung des Raman-Effekts findet man unter
[59]. Diese Theorie erlaubt es bei Molekülen, die sich im Rahmen der Theorie genügend genau beschreiben lassen, die Form der Raman-Spektren recht
präzise zu berechnen.
Ein großer Nachteil der Ramanspektroskopie ist der extrem kleine Wirkungsquerschnitt des Streuvorgangs, der 12-14 Größenordnungen unter dem Wirkungsquerschnitt der Fluoreszenz liegt. Man erhält Wirkungsquerschnitte
von 10−31 bis 10−29 cm2 /Molekül [60].
Durch den kleinen Wirkungsquerschnitt hat man eine extrem kleine Sensitivität. Normalerweise kann man dieses Problem mit hohen Konzentrationen
der zu analysierenden Redox-Spezies oder durch die Erhöhung der Laserleistung lösen.
Das im Rahmen dieser Diplomarbeit untersuchte System beinhaltet jedoch
einen Monolayer von Proteinen, welche auf einer Oberfläche gebunden sind.
Dadurch sind sowohl der Konzentration als auch der Laserleistung Grenzen
gesetzt.
60
Aber es tritt noch ein weiteres Problem auf. Die Ramanspektroskopie kann
verwendet werden um die verschiedenen chemischen Komponenten einer Substanz zu analysieren, da man sie mit den theoretischen Einzelspektren vergleichen kann. Allerdings handelt es sich bei den hier untersuchten Proteinen
um größere komplizierte Moleküle. Die Raman-Spektren wären also extrem
kompliziert, da die Proteine aus sehr vielen Moden bestehen, die sich zudem
noch überlagern können. Auch wenn nicht alle Übergänge aufgrund der Bedingung (2.46) ”raman-aktiv” sind, wäre eine Auswertung der Spektren fast
unmöglich.
Um dieses System zu untersuchen benötigt man spezielle Verstärkungsfaktoren, die in den folgenden Kapiteln behandelt werden.
2.5.3
Resonanter Raman-Effekt
Der resonante Raman-Effekt wurde erstmalig von Shorygin erwähnt [61],
1961 von Albrecht theoretisch vorhergesagt [62] und konnte 1972 von Spiro
an Cytochrom c nachgewiesen werden [63].
Die Intensität des Raman-Effekts ist von der Frequenz des Primärlichtes
weitgehend unabhängig, sofern sich seine Quantenenergie von der Anregungsenergie eines elektronischen Übergangs hinreichend stark unterscheidet. Wie
im vorherigen Abschnitt erwähnt, endet das Lichtquant der Anregung des
Raman-Effekts in einem virtuellen Niveau. Nähert sich nun - wie in Abbildung 2.19 zu sehen - die Energie des Primärlichtes der Anregungsenergie
eines ”reellen” elektronischen Übergangs, wird die Raman - Streuwahrscheinlichkeit größer. Eine solche Verstärkung des Raman-Effekts bezeichnet man
als resonanten Raman-Effekt. Die Intensität des Raman-Effekts wird durch
diesen Effekt um mehrere Größenordnungen verstärkt [64]. Man erreicht Verstärkungen um einen Faktor von 103 bis 106 .
Der resonante Raman-Effekt hat eine enorme Bedeutung für die Untersuchung von großen Molekülen. Mit ihm ist es möglich bestimmte schwingungsfähige Teile des Moleküls selektiv voneinander zu untersuchen. Dazu wird die
Probe mit Primärlicht angeregt, dessen Frequenz in der Nähe eines reellen
Anregungsniveaus der zu untersuchenden Molekülteile liegt. So erhält man
ein ”Teil-Raman-Spektrum”, das zu diesen Gruppen gehört, das wesentlich
intensiver ist als das Raman-Spektrum der restlichen Molekülteile [65].
Der große Nachteil der resonanten Raman-Spektroskopie ist das erhöhte Auftreten von Fluoreszenz und Photodegradation30 .
30
Bei der direkten Photodegration wird das Licht von der Probe absorbiert, und der so
angeregte Molekülteil reagiert unter chemischer Veränderung.
61
Abbildung 2.19: Erläuterung des resonanten Ramaneffekts.
2.5.4
Oberflächenverstärkungseffekt
1974 wurde von Fleischmann eine außerordentliche Verstärkung von RamanBanden des Pyridins in Gegenwart von Chlorid an einer elektrochemisch
aufgerauhten Silberelektrode beschrieben [66]. Bei diesem Oberflächenverstärkungseffekt (SERS: Surface Enhanced Raman-Scattering) kann eine Verstärkung des Streuquerschnitts gegenüber den freien Molekülen um bis zu
sechs Größenordnungen auftreten, sofern das Molekül hierbei an der SERSaktiven Metalloberfläche adsorbiert ist. Als Oberflächenmaterial kommen einige Übergangsmetalle in Betracht. Am gebräuchlichsten sind Silber, Gold
und Kupfer [67].
Da die Intensität der Raman-Streuung abhängig ist von der Stärke des induzierten Dipols, der seinerseits von der Molekülpolarisierbarkeit und dem
lokalen elektrischen Feld bestimmt wird, werden zwei Teileffekte für die enormen Verstärkungen verantwortlich gemacht :
• die Verstärkung des lokalen elektrischen Feldes, welches durch den elektrischen Feldvektor des einfallenden und des abgestrahlten Lichtes an
der Oberfläche erzeugt wird. Dieser wird CEME (classical electromagnetic enhancement) genannt.
62
• die Erhöhung der Molekülpolarisierbarkeit a, der sog. chemische Anteil.
Die Meinungen über die Wichtigkeit des letzt genannten Effekts sind unterschiedlich. Die Abhängigkeit des CEME-Effekts von der Entfernung d eines Streuzentrums von der Oberfläche konnte ohne Näherungen berechnet
werden. Allerdings wird meistens das Ergebnis der dipolaren PlasmonenNäherung für Silberkugeln verwendet [68]. Dabei erhält man eine Abhängigkeit von
CEME ∼ [r/(r + d)]12
für Moleküle. Für einen Monolayer, der sich in einem Abstand d von der
Silberelektrode befindet, erhält man stattdessen:
CEME ∼ [r/(r + d)]10
Demnach nimmt der Effekt sehr schnell ab, je weiter man sich von der Oberfläche entfernt. Des Weiteren tritt SERS-Aktivität dann am stärksten auf,
wenn die Metalloberflächen Nanostrukturen im Bereich von 1-100 nm aufweisen [69].
2.5.5
Resonanz Ramanspektroskopie an Metalloporphyrinen
Porphyrine sind unter anderem in häm-basierten Proteinen enthalten, wie im
Cytochrom c und in der Cytochrom-c-Oxidase. Sie sind organisch-chemische
Farbstoffe und bestehen aus vier Pyrrol-Ringen, die durch vier Methin Gruppen zyklisch miteinander verbunden sind (Abbildung 2.20).
Für die Interpretation spektroskopischer und vieler chemischer Phänomene
an Porphyrinen ist es notwendig, den Orbitalaufbau und das resultierende elektronische Absorptionsspektrum von Metalloporphyrinen zu verstehen.
Die Absorptionseigenschaften von Porphyrinen (z.B.: Cytochrom c in Abbildung 2.21) können mit dem so genannten 4-Orbitalmodell von Gouterman
beschrieben werden [70][71]. Das LUMO31 besteht aus einem degenerierten
π ∗ -Paar mit einer eg -Symmetrie. Die zwei HOMOs32 , a1u und a2u , haben
dagegen fast dasselbe Energieniveau. Das π-Elektronensystem der Metalloporphyrine hat einen sehr geringen HOMO-LUMO-Energieabstand von ca.
2 eV und absorbiert deshalb sehr stark im sichtbaren Bereich [72].
31
LUMO (Lowest Unoccupied Molecular Orbital) ist das niedrigst besetzte Orbital eines
Moleküls.
32
HOMO (Highest Occupied Molecular Orbital) ist das höchste besetzte Orbital eines
Moleküls.
63
Abbildung 2.20: Porphyringerüst eines D4h - Metalloporphyrins mit den Substituenten X und Y. Die zu unterscheidenden Kohlenstoffatome sind mit α, β und m gekennzeichnet. M steht für das
zentrale Metallatom und N für ein Stickstoffatom.
Auf Grund der ähnlichen Energiedifferenzen von a1u → eg und a2u → eg
können beide elektronischen Energieübergänge nicht voneinander unterschieden werden. So addieren sich die Übergangsdipole zu der so genannten BBande, auch Soret-Bande genannt, während sie sich bei der Q0 -Bande gegenseitig auslöschen. Die Qν -Bande hat ihren Ursprung in Vibrationsübergängen
(0 → 1), welche durch das Mischen der elektronischen Energieniveaus von Q
und B hervorgerufen werden [72].
Es gibt also drei mögliche resonante Anregungswellenlängen. Zum einen kann
man eine Resonanz mit der Soret-Bande erzeugen:
λex = 413,1 nm
% ≈ (1 − 6) · 105 M−1 cm−1
,
zum anderen die Q-Bande anregen:
λex = 520,8 nm
bzw.
530,9 nm
% ≈ (1 − 4) · 104 M−1 cm−1
So ist es möglich Vibrationsmoden von unterschiedlicher Symmetrie selektiv
zu untersuchen [73][74].
64
Abbildung 2.21: Absorptionspektrum von Cytochrom c mit der schematischen Darstellung des 4-Orbital-Modells.
In dieser Diplomarbeit wird ein Laser als Primärlichtquelle genutzt. Man
verwendet eine Wellenlänge von 413,1 nm um mit dieser Energie die elektronischen Energieniveaus der Häm-Gruppen der Proteine in Resonanz zu
bringen. Die Spektren werden in einem Hoch-Frequenzbereich, dem MarkerBanden-Bereich (1250 cm−1 bis 1750 cm−1 ), aufgenommen. Diese Region enthält die so genannten Marker-Banden, die ihren Ursprung in den Porphyrinmoden haben. Die Porphyrinmoden sind sehr sensitiv für Veränderungen des
Oxidations-, Spin- und Koordinationszustandes des Eisenatoms in der HämGruppe. Des Weiteren ist es möglich Veränderungen in der näheren Umgebung der Häm-Gruppe zu detektieren. Bei einer Anregung von 413,1 nm
werden hauptsächlich die total symmetrischen (A1g )-Moden verstärkt [75].
65
Nach [72] sind die Moden ν2 , ν3 , ν4 , ν10 und ν11 im Marker-Banden-Bereich
dominant, wobei die letzten beiden schwächer sind und B1g - Symmetrie aufweisen. Die Benennung der Moden stammt von Kitagawa, der die einzelnen
Moden eines NiOEP-Spektrums nummeriert hat [76][77]. Eine vollständige
Auflistung aller Moden findet man in [75].
In Abbildung 2.22 sind die dominanten Moden für Metalloporphyrine im
Marker-Banden-Bereich dargestellt33 . Bei der Cytochrom-c-Oxidase ist es
sogar möglich die Häm a - und die Häm a3 - Gruppe voneinander zu unterscheiden [78] [79] [80].
Abbildung 2.22: Illustration der dominanten Moden für Metalloporphyrine
im Marker-Banden-Bereich, bezogen auf Abbildung 2.20.
33
ν2 enthält hauptsächlich ν(Cβ − Cβ )-Moden, ν3 dagegen ν(Cα − Cm )sym , ν4 wiederum
ν(P yr.half − ring)sym . ν10 enthält hauptsächlich ν(Cα − Cm )asym -Moden und ν2 dagegen
ν(Cβ − Cβ )-Moden.
3 PROBENHERSTELLUNG FÜR SPR, EIS UND CV
3
66
Probenherstellung für SPR, EIS und CV
Dieses Kapitel beschreibt die Konstruktion eines ptBLM-Systems (protein
tethered bilayer membrane system) auf einer ultraflachen dünnen Elektrode34 . Als Elektrodenmaterial wird eine TSG-Elektrode (template stripped
gold electrode) verwendet. Dies hat mehrere Gründe:
Silber hat als Elektrodenmaterial zwar einen höheren Verstärkungsfaktor für
Oberflächenplasmonen, jedoch erweist sich die ultraflache Goldschicht als wesentlich stabiler und langlebiger als die von Silber. Zusätzlich hat man bei
Gold ein wesentlich größeres Potentialfenster für cyclovoltammetrische Messungen zur Verfügung.
Analog zu einer vorausgegangenen Arbeit [42] werden die Proteine auf einer
ultraflachen funktionalisierten Goldschicht angebunden. Die Herstellung und
die Funktionalisierung einer ultraflachen Goldschicht wird in den folgenden
Abschnitten erläutert. Des Weiteren werden die zwei verwendeten His-Tag
manipulierten Cytochrom-c-Oxidasen mit ihrer unterschiedlichen Orientierung und die Mutante N139C vorgestellt.
3.1
Herstellung von TSG-Elektroden
Die TSG-Elektroden werden wie in [40] beschrieben hergestellt. Hierbei verwendet man Siliziumwafer (26 mm x 45 mm x 0,625 mm), die in einer 78◦ C
warmen Lösung (Wasser35 , Wasserstoffperoxid und Ammoniak im Verhältnis
5:1:1) gereinigt werden. Dazu wird ein Magnetrührer verwendet. Nach einer
Stunde werden die Siliziumwafer gründlich zuerst mit Wasser und dann mit
Ethanol gespült. Nach dem Trocknen der Wafer unter einem Argonstrom
werden sie mit einer 50 nm dicken Goldschicht bedampft (Abbildung 3.1).
Um ein gleichmäßiges Aufdampfen zu gewährleisten, wird der Probenhalter
der Aufdampfanlage, in den die Wafer eingebaut werden, rotiert. Die Aufdampfrate wird kleiner als 0,1 nm/s gehalten. Zusätzlich wird ein Vakuum
von p < 5 · 10−6 mbar verwendet. Nach dem Aufdampfen werden die Proben
aus dem Probenhalter der Aufdampfmaschine entfernt.
Als nächstes werden LaSFN9-Gläser36 mit Hilfe von EPO-TEK 353ND-4 auf
34
Für eine genaue Beschreibung der verwendeten Materialien, Lösungen und Geräte
wird auf den Anhang (refmaterial) verwiesen.
35
An dieser und an allen anderen Probenvorbereitungspunkten wurde als Wasserquelle
deionisiertes Wasser von einer MilliQ - Reinigungsanlage verwendet.
36
Die LaSFN9-Gläser (26 mm x 76 mm x 1,5 mm) werden zuvor halbiert und unter fließendem Wasser von anhaftenden Glaspartikeln befreit. Gereinigt werden die Objektivträger in einer 2% igen Hellmanex-Lösung, die für 15 Minuten ins Ultraschallbad gestellt wird.
Zuletzt werden die Träger gründlich mit Wasser gespült und mit Stickstoffgas getrocknet.
67
die Goldschicht geklebt37 . Durch die lange Haltbarkeit der geklebten Wafer
kann dieser Vorbereitungsschritt von den folgenden getrennt werden.
Abbildung 3.1: Die Herstellung einer TSG-Elektrode.
37
Der Kleber EPO-TEK 353ND-4 wird vor Gebrauch für eine Stunde bei einem Druck
von p < 5 · 10−3 mbar evakuiert, um Luftblasen zu entfernen, die bei der SPR-Messung
erheblich stören würden.
3.2
68
Funktionalisierung der TSG-Elektrode
Vor Gebrauch der TSG-Elektrode wird der Silizium-Wafer entfernt (Abbildung 3.1) und für 120 Minuten in eine DTSP-DTP-Lösung in trockenem DMSO gestellt, wobei sich ein Monolayer aus TSP und TP bildet38 . Nach sorgfältigem Spülen mit DMSO, Ethanol und Wasser werden die TSG-Elektroden
für 48 Stunden mit Hilfe einer ANTA-Lösung funktionalisiert. Hierbei reagiert das ANTA mit dem TSP zu einem TSP-NTA-Adukt und einem Succimidylring, der nach der Funktionalisierung mit Hilfe von Wasser weggespült
wird. Wie in Abbildung 3.2 dargestellt, findet keine Reaktion zwischen ANTA und TP statt. Nur das TSP dient als Basis für den His-Tag-Anker.
His-Tag fusionierte Proteine zeigen eine bemerkenswerte Affinität zu Ni2+ Metall-Chelat-Komplexen (Abschnitt 1.4). Zur Bildung dieses Komplexes
wird die TSG-Elektrode in eine Nickellösung gestellt (Abbildung 3.3). Nach
30 Minuten werden die Elektroden sorgfältig mit Wasser gereinigt.
Abbildung 3.2: Die Funktionalisierung der TSG-Elektrode.
38
TSP steht für thiobis (N-succinimidyl propionate) und TP für thiobis (propionic
acid). Die genauen Bezeichnungen der verwendeten Chemikalien befinden sich im Anhang
(A.2.2).
3.3
69
Anbindung der Cytochrom-c-Oxidase an die Elektrodenoberfläche
Die Cytochrom-c-Oxidase besitzt als Membranprotein eine Oberfläche mit
hydrophoben und hydrophilen Teilen. Aus diesem Grund wird als Proteinlösungmittel eine DDM-Puffer-Lösung benutzt. Das DDM bildet Mizellen oder
bindet direkt an das Protein. So befinden sich die verschiedenen Bereiche des
Proteins in einer für sie geeigneten Umgebung.
Für die Immobilisierung wird die TSG-Elektrode in eine DDM-Lösung gebracht, in der sich das Protein mit einer Konzentration von 100 nM/L befindet. Dadurch binden die His-Tag fusionierten Proteine an die Ni2+ -MetallChelat-Komplexe. Nach 30 Minuten werden die in dieser Zeit nicht angebundenen Proteine durch den Austausch der vorhanden Lösung mit einer reinen
DDM-Lösung entfernt.
Abbildung 3.3: Die Herstellung einer ptBLM-Probe. In diesem Fall ist die
Cytochrom-c-Oxidase mit His-Tag an Untereinheit I (rot)
verwendet worden. Die Untereinheiten II, III und IV sind
in orange, gelb und schwarz dargestellt.
Als nächstes wird durch eine Dialyse ein Bilayer gebildet, der als künstliche Proteinmembran fungieren soll. Zuerst wird die DDM-Lösung durch ei-
70
ne DDM-Lipidlösung ersetzt und Biobeads hinzugegeben. Diese nehmen das
DDM in sich auf und das DDM wird durch Lipid ersetzt. Es bildet sich, wie
in Abbildung 3.4 zu sehen, die für das Protein benötigte Membranumgebung.
Nach ca. 15 Stunden ist die Dialyse abgeschlossen. Die Zelle wird mit einem
PBS-Puffer gespült um die Biobeads mit dem aufgesaugten DDM und dem
überschüssigen Lipid zu entfernen.
Die Architektur eines ptBLM-Systems, bei dem als Protein die Cytochromc-Oxidase mit His-Tag an Untereinheit I verwendet wurde, ist in Abbildung
3.5 dargestellt [81] [79].
71
Abbildung 3.4: Die Dialyse.
72
Abbildung 3.5: Die Architektur einer ptBLM-Probe, bei der als Protein die
Cytochrom-c-Oxidase mit His-Tag an Untereinheit I verwendet worden ist. Die horizontalen Längenangaben beziehen
sich auf den Teil des Enzyms, der aus dem Bilayer in die
Lösung weist. Die funktionalisierte Elektrode ist vergrößert
abgebildet.
3.4
73
Cytochrom-c-Oxidase in der up- oder down-Konfiguration
In dieser Diplomarbeit spielen zwei unterschiedlich His-Tag-manipulierte Proteine eine entscheidende Rolle (siehe Abschnitt 1.5). Zur Verfügung stehen
die Cytochrom-c-Oxidase von Rhodobacter sphaeroides und die Cytochromc-Oxidase von Paracoccus denitrificans. Röntgenkristallstrukturanalysen zeigen, dass man bei diesen beiden Varianten der Cytochrom-c-Oxidase von einem identischen Elektronen- und Protonenweg ausgehen kann [82] [83] [84].
Ein Vorteil des ptBLM-Systems ist der Submembranraum, der als Reservoir
für Ionen dient. Ein weiterer großer Vorteil des ptBLM-Systems ist die strikte
Kontrolle über die Orientierung des Proteins, je nachdem, an welcher Stelle
sich der His-Tag am Protein befindet [2]:
Bei Rhodobacter sphaeroides ist der His-Tag an den C-Terminus von Untereinheit II (orange) angebracht. Dagegen ist bei Paracoccus denitrificans der
His-Tag an den C-Terminus von Untereinheit I (rot) befestigt (Abbildung
3.6). Auf diese Art und Weise kann das Enzym in zwei verschiedenen Orientierungen immobilisiert werden.
Bei der down-Konfiguration wird die Cytochrom c-Bindungsseite direkt mit
der Elektrode verbunden. Die Elektrode ersetzt dabei das in der Natur für
die Aktivierung notwendige Cytochrom c. Mit Hilfe von Sauerstoff und Protonen aus der Pufferlösung und den von der Elektrode gelieferten Elektronen
wird Wasser gebildet. Die durch diesen Vorgang gewonnene Energie wird für
das Pumpen von Protonen in den Raum zwischen Membran und Elektrode
verwendet.
Bei der up-Konfiguration liegt die Cytochrom c-Bindungsseite der Elektrode
gegenüber und zeigt zur Außenseite des ptBLM-Systems. In dieser Konfiguration kann das Enzym durch die Zugabe von Cytochrom c aktiviert werden.
In Anwesenheit von Sauerstoff sollte die in der Einleitung beschriebene katalysierte Reaktion stattfinden:
+
3+
+
4 · Fe2+
cytc + 8 · Hinnen + O2 → 4 · Fecytc + 2H2 O + 4 · Haußen
Abbildung 3.6: Die zwei unterschiedlichen Konfigurationsmöglichkeiten der uns zur Verfügung stehenden Cytochromc-Oxidase. Links im Bild: Das Enzym mit His-Tag an Untereinheit II. Aktivierbar durch direkten
Elektronentransfer. Rechts im Bild: Das Enzym mit His-Tag an Untereinheit I. Aktivierbar durch
Cytochrom c (grün). Die Untereinheiten III und IV sind gelb bzw. schwarz dargestellt.
74
3.5
75
Cytochrom-c-Oxidase N139C
Um die Protonenpfade zu ermitteln werden verschiedene Mutanten verwendet (siehe Abschnitt 1.3.1). Die Cytochrom-c-Oxidase N139C ist eine Mutante mit His-Tag an Untereinheit II. Demnach handelt es sich um eine Mutation der down-Konfiguration. Bei dieser Mutante wird, wie in Abbildung 3.7
zu sehen, die Aminosäure Asp-139 (Asparaginsäure) durch die Aminosäure
Cys-139 (Cystein) ersetzt. Durch diese Mutation wird der D-Kanal verändert. Damit soll das Pumpen der Protonen verhindert werden. Das Enzym
besitzt jedoch weiterhin eine hohe katalytische Aktivität [85].
Abbildung 3.7: Die Cytochrom-c-Oxidase N139C. Dargestellt sind nur die
Untereinheiten I (rot) und II (orange).
4 MESSAUFBAU FÜR SPR, EIS UND CV
4
76
Messaufbau für SPR, EIS und CV
Wie bereits in Abschnitt 1.5 erwähnt, wird der Aufbau des ptBLM-Systems
simultan mit Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie (SPR-Spektroskopie) und elektrochemischer Impedanzspektroskopie (EIS) untersucht. Dafür benötigt man eine kombinierte Messapparatur (Abbildungen 4.1 und 4.2)
[40][86].
Monochromatisches Licht eines He-Ne-Lasers (λ = 632,8 nm) wird mit einem
mechanischen Chopper (2) rechteckmoduliert. Die Justage des Laserstrahls
erfolgt wie üblich über Irisblenden (1). Mit einem Polarisator (3) wird das
Licht p-polarisiert. Die Laserintensität kann über einen zweiten Polarisator
(3) variiert werden. Der Laserstrahl fällt auf ein Prisma an dessen Basis
mittels Immersionsöl der LaSFN-9-Objektträger der TSG-Elektrode optisch
gekoppelt ist39 . Das Prisma, das Immersionsöl und der Objektträger besitzen
den gleichen Brechungsindex. Das von der Probe reflektierte Licht wird durch
eine Linse mit Brennweite f = 50 mm auf eine Photodiode fokussiert. Das
Signal wird mit Hilfe eines Lock-In Verstärkers gemessen und an den PC
(PC 1) weitergeleitet. Probe und Detektor sind auf einem Zweikreisgoniometer montiert und werden mit 5-Phasen-Schrittmotoren, deren Steuerung
ebenfalls über diesen PC erfolgt, bewegt.
Abbildung 4.1: Der Messaufbau für SPR, EIS und CV.
39
Diese Konstruktion wird über einen Reiter zusammengehalten.
77
In Abbildung 4.2 ist das verwendete Zelldesign40 und der Einbau der Zelle in den Reiter zu sehen, welcher wiederum in die Messapparatur eingebaut wird. Die Abdichtung zwischen Glas und Zelle erfolgt über Dichtringe
(nicht eingezeichnet), die als Elektrodenbegrenzung dienen. Die Dichtungsringe haben einen Innendurchmesser von 1 cm, so dass man eine Oberfläche
von A = π · r2 = 0,785 cm2 zur Verfügung hat.
Für die elektrochemischen Messungen (EIS und CV) wird eine Drei - Elektroden - Anordnung verwendet41 . Die aufgedampfte Goldschicht dient als
Arbeitselektrode (6). Ein Platindraht (ø = 1 mm, Länge = 5 cm) wird als Gegenelektrode (5) verwendet. Dieser wird mit Hilfe einer Teflonummantelung
abgedichtet. Die Referenzelektrode (4) besteht aus einem chlorierten Silberdraht42 , der bis zur Hälfte in ein Glasrohr (Länge = 5 cm) geführt wird43 .
Das Glasrohr wird mit 3 molarer Kaliumchlorid-Lösung gefüllt. Es handelt
sich also um eine Ag/AgCl,KClkonz. -Referenzelektrode. Diese wird ebenfalls
durch eine Teflonummantelung abgedichtet. Mit Hilfe von Ein- (7) und Auslaufkanälen (8) kann die Flüssigkeit in der Zelle auch während einer Messung
ausgetauscht oder von Sauerstoff befreit werden. Zum Entfernen des Sauerstoffs wird die Flüssigkeit in ein anderes, mit Sauerstoffzehrsystem44 gefülltes
Gefäß geleitet. Zusätzlich wird Argon eingeführt, damit kein Sauerstoff in die
Lösung diffundiert.
Eine weitere etwas größere Öffnung in der Zelle braucht man, um bei Bedarf
Biobeads hinzuzugeben. Diese Öffnung wird - außer für den Fall der Zugabe
von Biobeads - mit Hilfe eines Teflon-Stopfens (9) abgedichtet.
In Abbildung 4.3 ist die komplette Messzelle mit Halterung (Reiter) sowie
mit den Anschlüssen für die Elektroden bzw. mit dem Ein- und Auslass für
den Lösungsaustausch zu sehen.
Mit einem Autolab-Potentiostaten, den man über einen PC (PC 2) steuert,
werden die elektrochemischen Messungen durchgeführt. Die Impedanzspektren nimmt man mit einer Anregungsamplitude von 10mV auf. Mit der Wahl
dieser Amplitude wird eine Störung des Systems weitgehend ausgeschlossen
(siehe Abschnitt 2.2.1).
40
Die Zelle besteht aus Teflon. Dieses säurebeständige Material lässt sich nach Gebrauch
mit Hilfe eines Schwefelsäurebads sehr gut reinigen und wiederverwenden.
41
Da sich der Messaufbau von EIS und der Cyclovoltammetrie (CV) nicht unterscheidet,
konnten mit derselben Apparatur auch die CV-Experimente gemacht werden.
42
Der chlorierte Silberdraht wird mit Hilfe einer Galvanisierungseinheit in Kombination
mit Silberdraht (ø = 1 mm, Länge = 5 cm) und 0,1 M Kaliumchlorid-Lösung hergestellt.
43
Ein an der Spitze des Glasröhrchens angebrachter kleiner dünner Platindraht
(ø = 0,1 mm, Länge = 5 mm) sorgt dafür, dass zwischen dem Elektrodeninneren und der
Pufferlösung Ladungsträger diffundieren können. Diese Spezialanfertigung wurde vom
hauseigenen Glasbläser hergestellt.
44
Hierbei handelt es sich um eine spezielle Lösung (siehe Anhang A.2.1).
78
Abbildung 4.2: Das Zelldesign der SPR-Zelle und der Einbau in den Reiter.
Abbildung 4.3: Komplette Messzelle mit Halterung (Reiter) und den Anschlüssen für die Elektroden bzw. dem Einund Auslass für den Lösungsaustausch.
79
5 MESSERGEBNISSE UND DISKUSSION (TEIL 1)
5
80
Messergebnisse und Diskussion (Teil 1)
5.1
Überprüfung des ptBLM-Aufbaus
In dieser Arbeit wird die Oberflächenplasmonenresonanz - Spektroskopie in
Kombination mit der Impedanz - Spektroskopie verwendet. Um die Schichtdickenänderung und die Bestimmung der elektrischen Eigenschaften während
des ptBLM-Aufbaus an ein und derselben Probe zu verfolgen, wird im Folgenden die Überprüfung eines ptBLM-Aufbaus gezeigt. Als Beispiel wird die
Cytochrom-c-Oxidase mit His-Tag an Untereinheit I (up-Konfiguration) verwendet.
Da die Änderungen bei der Funktionalisierung der Elektrode (siehe Abschnitt
3.2) zu klein sind, wird lediglich die Proteinanbindung und die Dialyse beobachtet.
5.1.1
Ergebnisse und Diskussion der Oberflächenplasmonenresonanz - Spektroskopie
Die in Abschnitt 2.1.3 beschriebene Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie kann zur Detektion von Brechungsindexveränderungen verwendet
werden.
Die aufgenommenen SPR-Spektren sind in Abbildung 5.1 dargestellt. Die Reflektivität wird dabei gegen den Winkel des vom Prisma reflektierten Lichts
aufgetragen.
Um sicherzustellen, dass die Probe überhaupt ein Plasmon liefert, wird als
Test ein Spektrum an Luft (schwarz) aufgenommen. Um einen geeigneten
Winkel für die Kinetikmessung zu finden, wird die Zelle mit DDM-Lösung
gefüllt und ein weiteres Spektrum (rot) aufgenommen45 . Man erkennt eine
positive Verschiebung des Plasmon-Resonanzwinkels aufgrund des erhöhten
Brechungsindexes. Für die Kinetikmessung ist ein Winkel von 54,5◦ geeignet.
An diesem nahezu linearen Bereich der Flanke erreicht man in guter Näherung einen proportionalen Zusammenhang zwischen reflektierter Intensität
und Schichtzunahme (siehe Abschnitt 2.1.3).
Vor (Punkt A) und nach (Punkt B) der Proteinanbindung wird die Kinetikmessung unterbrochen und SPR-Spektren aufgenommen (rot bzw. blau).
Wenn sich der Proteinlayer anlagert, verschiebt sich der Resonanzwinkel des
angeregten Oberflächenplasmons ins Positive. Der Grund hierfür ist der höhere Brechungsindex, den die angelagerte Schicht, im Vergleich zur Lösung,
hat.
45
Winkel von mehr als 60◦ können mit der verwendeten Apparatur nicht gemessen werden.
81
Abbildung 5.1: Kinetikmessung zur Überprüfung des ptBLM-Aufbaus. Die
dazugehörigen SPR-Spektren wurden an Luft (schwarz), vor
(rot) und nach (blau) der Anbindung, sowie vor (orange) und
nach (grün) dem PBS-Spülen aufgenommen.
Die Kinetik zeigt die zeitliche Auflösung des Anbindungsprozesses. Die Reflektivität steigt während dieser Zeit.
Die Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie ist aber auch zur Überprüfung der Membranbildung geeignet. Nach 30 Minuten (Punkt B) wird
die Zelle zuerst mit einer DDM-Lösung und danach mit einer Lipidlösung
gespült. Die Reflektivität ändert sich nicht, weil sich der Brechungsindex des
verwendeten Lösungsmittels kaum ändert46 . Nach Zugabe der Biobeads setzt
die Dialyse ein. Die Kinetik zeigt einen sehr langsamen aber deutlichen Anstieg der Reflektivität, der sich folgendermaßen erklären lässt:
Der reine Proteinlayer ist nicht so dicht gepackt wie der Layer, bestehend
aus Protein und Membran. In diesem Fall ändert sich nicht die Schichtdicke,
46
DDM- und Lipidlösung unterscheiden sich nur in einer geringen Menge an DiPhyPC.
Eine Änderung des Brechungsindex kann deshalb vernachlässigt werden.
82
sondern der Brechungsindex der bereits angelagerten Schicht. Der Resonanzwinkel des angeregten Oberflächenplasmons verschiebt sich ins Positive. Deshalb steigt die Reflektivität in der Kinetikmessung. Abbildung 5.1 zeigt keinen weiteren Anstieg der Reflektivität am Punkt C. Die Dialyse ist jedoch
an diesem Punkt noch nicht abgeschlossen, da ein vorzeitiges Spülen mit
PBS in anderen Versuchen eine Denaturierung der Proteine zur Folge hatte.
Wahrscheinlich benötigt die Membran zur Stabilisierung und Reorganisation
noch zusätzlich Zeit. Aus diesem Grund wird die Zelle - wie in Abschnitt
3.3 beschrieben - erst nach ungefähr 15 Stunden am Punkt D mit PBS gespült. Direkt vor (orange) und nach (grün) der PBS-Spülung wird jeweils
ein Spektrum aufgezeichnet. Zwischen den beiden SPR-Spektren stellt man
keinen Unterschied fest. Folglich ändert sich auch nicht die Reflektivität in
der Kinetikmessung. Allein der Membranaufbau ist für die zweite Reflektivitätsänderung verantwortlich.
5.1.2
Ergebnisse und Diskussion der elektrochemischen ImpedanzSpektroskopie
Auch durch die elektrochemische Impedanz-Spektroskopie soll der Aufbau
des ptBLM-Systems überprüft werden. Die Messungen erfolgen mit den gleichen Proben, an denen auch mittels SPR der ptBLM-Aufbau beobachtet
wird. Dazu wird die Kinetikmessung nicht unterbrochen. Während der EISMessung ist keine Veränderung der Reflektivität in der Kinetikmessung zu
erkennen. Eine Störung des Systems durch die gewählte Anregungsamplitude
von 10 mV kann somit ausgeschlossen werden (Abschnitt 4).
Zur Überprüfung des ptBLM-Aufbaus wird ein Impedanz-Spektrum nach der
Proteinanbindung aufgenommen. Außerdem wird die Rekonstitution vor und
nach dem PBS-Spülen (Abbildung 5.1, Punkt D) überprüft47 .
Der Vergleich der Fitergebnisse für den Widerstand und die Kapazität vor
und nach der Dialyse dient zur Kontrolle des Membranaufbaus. Tabelle 5.1
zeigt die Ergebnisse der einzelnen Fits48 :
47
Alle Messungen werden bei einem Potential von 0 mV vs. Ag/AgCl,KClkonz. aufgenommen. Dies entspricht einem Potential von 200 mV vs. NHE (siehe Abschnitt A.1) [87].
Für eine genaue Beschreibung der Datensatzauswertung wird auf den Anhang verwiesen
(Abschnitt A.1.2).
48
Aufgrund von Kontaktproblemen und eines Gerätedefekts konnte nicht jede Messung
in dem gewünschten Intervall von 50 kHz bis 3 mHz durchgeführt werden. Dieser Umstand
erhöht den Fehler bei den entsprechenden Fits.
nach Anbindung
nach Dialyse
nach PBS-Spülung
R [Ω]
7,6 · 105 ± 1,3 · 105
1,4 · 106 ± 0,4 · 106
1,4 · 106 ± 0,3 · 106
83
C [F]
1,4 · 10 ± 0,2 · 10−5
8,3 · 10−6 ± 0,5 · 10−6
7,3 · 10−6 ± 0,4 · 10−6
−5
Tabelle 5.1: Fit-Ergebnisse der EIS-Messung zur Überprüfung des ptBLM Aufbaus.
Abbildung 5.2: Überprüfung des ptBLM-Aufbaus mit Hilfe der EIS. Oben:
Bode-Plot. Unten: frequenzreduzierter Admittanz- und Nyquist-Plot. Die Messpunkte sind in dieser Darstellung miteinander verbunden.
84
Analog zu [42], erhält man nach der Anbindung der Cytochrom-c-Oxidase
einen Widerstand von mehreren hundert kΩ und eine Kapazität von einigen
µF. Nach der Bildung der Membran steigt der Membranwiderstand und die
Kapazität der Membran fällt drastisch ab. Dies stimmt ebenfalls mit den
Ergebnissen aus [42] überein. Der Anstieg des Widerstandes lässt sich durch
die Bildung der Membran erklären, die eine abdichtende Wirkung hat.
Die Kapazität einer dielektrischen Schicht wird durch ihre Dicke und ihre dielektrische Konstante bestimmt. Für reine tBLMs (tethered bilayer lipid membranes), bei denen kein Protein vorhanden ist, erhält man experimentell Widerstandswerte von einigen MΩ · cm2 und Kapazitäten kleiner als
0,5µF/cm2 [88].
Bei der Bildung des Bilayers wird das Wasser (zusammen mit dem Detergenz)
in der Proteinumgebung durch das Lipid verdrängt. Die dielektrische Konstante des verwendeten Lipids ist mit % ≈ 2,2 [42] sehr viel kleiner, als die von
Wasser (% ≈ 80, [1]) oder die von Proteinmolekülen (% ≈ 20 − 30, [89][90])49 .
Deshalb erwartet man einen Abfall der Kapazität. Dies wird durch die Messung bestätigt: Die Kapazität geht nach der Dialyse von C = 14µF/cm2 auf
C = 8,3µF/cm2 zurück.
Nach der Spülung mit PBS verändert sich der Widerstand der Membran
nicht. Lediglich die Kapazität verringert sich um einen geringen Faktor. Dies
hängt wahrscheinlich mit einer Reorganisation des Bilayers zusammen. Nach
der Spülung mit PBS-Puffer befinden sich keine Biobeads mehr in der Messzelle. Dadurch kann vielleicht ebenfalls eine Veränderung der Kapazität hervorgerufen werden.
Die gemessenen Werte stimmen mit [17] überein50 . Deshalb kann man auch
im vorliegenden Fall von einer hohen Oberflächenbedeckung der Proteine von
über 90 % ausgehen.
5.2
Aktivierung der Cytochrom-c-Oxidase in der upKonfiguration
Die Cytochrom-c-Oxidase mit His-Tag an Untereinheit I (Cytochrom c-Bindungsstelle befindet sich gegenüber der Arbeitselektrode) wird nach der Überprüfung des ptBLM-Aufbaus mit einer Cytochrom c - Lösung aktiviert.
49
Der Wert aus [90] stammt vom Lysozym (ebenfalls ein Enzym) in Lösung und entspricht wahrscheinlich am ehesten dem Dielektrizitätswert der Cytochrom-c-Oxidase.
50
In [17] wurde die Cytochrom-c-Oxidase in der down-Konfiguration (His-Tag an Untereinheit II) für die Konstruktion eines ptBLM-Systems verwendet. Bei dieser Konfiguration
ist es möglich mit Hilfe der Cyclovoltammetrie auf eine Protein-Oberflächenbedeckung von
über 90 % zurückzuschließen.
85
Dazu werden bei verschiedenen Cytochrom c-Konzentrationen sowohl Impedanz - Spektren aufgenommen, als auch Untersuchungen mit Hilfe der Cyclovoltammetrie durchgeführt51 . Für die Messungen wird reduziertes Cytochrom
c verwendet, um den in der Natur auftretenden Vorgang zu imitieren. Zusätzlich werden cyclovoltammetrische Messungen für den physiologisch weniger
interessanten Fall des oxidierten Cytochrom c durchgeführt.
5.2.1
Ergebnisse und Diskussion der elektrochemischen ImpedanzSpektroskopie
Zur Aktivierung der Cytochrom-c-Oxidase in der up-Konfiguration werden
der Lösung verschiedene Cytochrom c Konzentrationen zugesetzt.
Die EIS-Spektren werden bei einem Potential von 200 mV vs. NHE als Funktion der Cytochrom c-Konzentration aufgezeichnet. In Abbildung 5.3 sind
die Messergebnisse dargestellt. Man erkennt im Nyqist-Plot einen deutlichen
Rückgang des Widerstandes bei zunehmender Cytochrom c-Konzentration.
Die Kapazität dagegen bleibt unverändert, wie der frequenzreduzierte Admittanz - Plot zeigt. Die EIS-Daten werden, wie in Abschnitt A.1.2 beschrieben,
ausgewertet und der Widerstand gegen die Cytochrom c-Konzentration aufgetragen (Abbildung 5.4). Man kann den Abfall des Membranwiderstandes
mit einer Exponentialfunktion darstellen. Eine Sättigung wird nicht erreicht,
da man bei weiterer Erhöhung der Cytochrom c-Konzentration das ptBLMSystem zerstört52 .
Durch die Aktivierung der Cytochrom-c-Oxidase werden Protonen aktiv vom
Submembranraum in die Lösung gepumpt. Bedingt durch diesen Protonenstrom wird der Membranwiderstand effektiv verringert53 . Diese Annahme
wird bestätigt durch die Tatsache, dass der Effekt durch Zusatz einer 0,6 mM
Kaliumcyanid-Lösung54 ausgeschaltet werden kann [42].
51
Auf eine Fehlerrechnung für die jeweils verwendete Cytochrom c-Konzentration, sowie
für die Spannungsvorschubgeschwindigkeit wird im Folgenden verzichtet. Hierfür können
keine aussagekräftigen Angaben gemacht werden.
52
Dies liegt vermutlich an der Veränderung des pH-Wertes. Das Cytochrom c aktiviert
das Enzym und die Cytochrom-c-Oxidase pumpt Protonen. Dadurch verringert sich der
Membranwiderstand. Der verwendete Puffer sorgt für einen annähernd konstanten pHWert während der kompletten Messreihe. Werden jedoch zu viele Protonen gepumpt, so
verändert sich der pH-Wert drastisch. Dies verursacht eine Denaturierung der Proteine.
53
Der Rückgang des Membranwiderstandes hängt jedoch noch von anderen Faktoren ab
54
Cyanid-Ionen (CN− ) sind Inhibitoren der Cytochrom-c-Oxidase [1].
86
Abbildung 5.3: Aktivierung der Cytochrom-c-Oxidase durch reduziertes Cytochrom c. Links oben: Bode-Plot. Unten: Nyquist- und frequenzreduzierter Admittanz-Plot. Die Messpunkte sind in
dieser Darstellung miteinander verbunden.
87
Abbildung 5.4: Widerstand des ptBLM-Systems aufgetragen gegen die Konzentration des reduzierten Cytochrom c.
5.2.2
Ergebnisse der CV-Messungen
Die Cytochrom-c-Oxidase benötigt für die enzymatischen Redoxprozesse Sauerstoff. Bei der Cyclovoltammetrie werden deshalb Messungen sowohl mit,
als auch ohne Sauerstoff durchgeführt. Ebenso werden Untersuchungen mit
reduziertem und oxidiertem Cytochrom c vorgenommen55 .
Messungen mit Sauerstoff: Hierzu wird oxidiertes bzw. reduziertes Cytochrom c der gleichen Konzentration (C = 1 mM) zu dem ptBLM-System
hinzugegeben. Die Cyclovoltammogramme, gemessen in Abhängigkeit von
der Spannungsvorschubgeschwindigkeit (Scan-Rate-Studie) sind in Abbildung
5.5 dargestellt56 .
55
Bei Zugabe von oxidiertem Cytochrom c wird das Startpotential (Einit = 0,5 V) so
gewählt, dass das oxidierte Cytochrom c nach dem Start oxidiert bleibt (bis E = 0,7 V),
dann reduziert und darauf reoxidiert wird. Gibt man stattdessen reduziertes Cytochrom c
hinzu wird das Startpotential (Einit = 0,25 V) so gewählt, dass das reduzierte Cytochrom
c nach dem Start reduziert bleibt (bis E = 0,2 V) und dann erst oxidiert wird.
56
Bei der Scan-Raten-Studie mit reduziertem Cytochrom c werden zusätzlich noch Messungen mit 2 mV/s, 5 mV/s, 0,3 V/s, 0,7 V/s, 1 V/s, 2 V/s, 3 V/s, 4 V/s, 5 V/s, 8 V/s, 10 V/s
durchgeführt.
88
Abbildung 5.5: Scan-Raten-Studie (schwarz: 10 mV/s, rot: 50 mV/s, orange:
100 mV/s, blau: 500 mV/s, cyan: 900 mV/s) mit oxidiertem
(links) und chemisch reduziertem (rechts) Cytochrom c in
Kombination mit der ptBLM immobilisierten Cytochrom-cOxidase in der up-Konfiguration.
Für eine Referenzmessung wird eine Lösung mit 1 mM oxidiertem Cytochrom c auf die Oberfläche einer funktionalisierten Elektrode (TP/TSPNickelchelat-NTA-Oberfläche) ohne Cytochrom-c-Oxidase gegeben. Es werden ebenfalls Cyclovoltammogramme in Abhängigkeit von der Spannungsvorschubgeschwindigkeit gemessen.57 .
Alle CV-Daten werden - wie im Anhang A.1.3 beschrieben - ausgewertet.
Dadurch erhält man für jedes Cyclovoltammogramm eine anodische und eine kathodische Stromdichte (Peakhöhe) mit dem dazugehörigen anodischen
bzw. kathodischen Peakpotential (Peakposition).
In Abbildung 5.6 sind die kathodischen und anodischen Stromdichten der
Cyclovoltammogramme gegen die Wurzel der Spannungsvorschubgeschwindigkeit aufgetragen (Randles–Sevcik Plot).
57
Hierfür werden die folgenden Scan-Raten gewählt: 5 mV/s, 8 mV/s, 10 mV/s, 50 mV/s,
80 mV/s, 0,1 V/s, 0,2 V/s, 0,3 V/s, 0,4 V/s, 0,5 V/s, 0,7 V/s, 0,9 V/s, 1,2 V/s, sowie 3 V/s.
89
Abbildung 5.6: Der Randles–Sevcik Plot für oxidiertes (grün, schwarz) und
reduziertes (rot) Cytochrom c mit (rot, grün) und ohne
(schwarz) Cytochrom-c-Oxidase in der up-Konfiguration.
Die Daten werden mit Hilfe der Software Origin linear gefittet. Eine Ausnahme hierbei sind die anodischen Stromdichten von reduziertem Cytochrom c
in Anwesenheit des Enzyms (rot), die nur bis 1 V/s durch eine Gerade gefittet werden. Ab einer Spannungsvorschubgeschwindigkeit von 1 V/s wird in
diesem Fall als Fitfunktion ein exponentieller Abfall gewählt:
f (x) = f (x0 ) + A · eR0 · x
mit:
f (x0 ) = (5,14 ± 0,00) · 10−6
A = (3,00 ± 0,00) · 10−5
µ·A
cm2
und
µ·A
cm2
,
R0 = −(0,84 ± 0,00)
#
s/V
.
90
Die Fitergebnisse für die linearen Fits (f (x) = bx) befinden sich in der folgenden Tabelle:
Cyt cox
Cyt cox +CcO
Cyt cred +CcO
banodisch [A s1/2 V−1/2 cm−2 ]
(1,64 ± 0,21) · 10−6
(2,00 ± 0,25) · 10−5
(1,42 ± 0,10) · 10−5
bkathodisch [A s1/2 V−1/2 cm−2 ]
−(3,00 ± 0,15) · 10−6
−(3,00 ± 0,12) · 10−5
−(9,90 ± 0,26) · 10−6
Tabelle 5.2: Fit-Ergebnisse des linearen Fits für den Randles–Sevcik Plot.
Um die Standard-Geschwindigkeitskonstante k0 des heterogenen ElektronenTransfer-Schrittes zum Cytochrom c zu berechnen, werden die Peakpotentiale
als Funktion der Scan-Rate aufgetragen (siehe Abbildung 5.7). Die Spannungsvorschubgeschwindigkeit wird dabei logarithmisch aufgetragen. Geht
man zu immer höheren Spannungsvorschubgeschwindigkeiten über, so steigt
die Abweichung des reduzierten und oxidierten Peakpotentials vom Standardpotential. Dadurch sind quantitative Aussagen über die Kinetik des Elektronentransfers möglich [91].
Mit Hilfe des speziell für diese Anwendung geschriebenen Programms Jellyfit
werden die Daten gefittet. Der Fit dieses so genannten Trumpet-Plots ermittelt nicht nur die Standard-Geschwindigkeitskonstante, sondern auch den
Wert des vorherrschenden Standardpotentials E0 [92] [93]. Tabelle 5.3 zeigt
die von dem Programm gelieferten Fitergebnisse für eine Raumtemperatur
von 20◦ C (T= 293 K).
E0 [V]
0.409
k0 [1/s]
73.13
Tabelle 5.3: Fit-Ergebniss des Trumpet-Plots.
91
Abbildung 5.7: Peakpotentiale als Funktion der Scan-Rate (Trumpet-Plot)
des reduzierten Cytochrom c in Kombination mit der upKonfiguration.
Messungen ohne Sauerstoff: Abbildung 5.8 zeigt Cyclovoltammogramme, die mit 50 mV/s aufgezeichnet wurden. Als Referenz wird die Cytochromc-Oxidase in einer PBS-Lösung verwendet (schwarz). Nach dem Austausch
der PBS-Lösung durch eine 1 mMol Cytochrom c-Lösung (oxidiert und reduziert) werden erneut Cyclovoltammogramme in Abwesenheit von Sauerstoff
aufgenommen. Diese werden mit den Cyclovoltammogrammen überlagert,
die in Anwesenheit von Sauerstoff aufgenommen worden sind.
92
Abbildung 5.8: 50 mV/s Cyclovoltammogramm von oxidiertem (links) und
reduziertem (rechts) Cytochrom c [1 mMol/l] in Kombination
mit der Cytochrom-c-Oxidase in der up-Konfiguration (mit
und ohne Sauerstoff).
5.2.3
Diskussion der CV-Messungen
Cyclovoltammetrische Messungen mit oxidiertem Cytochrom c:
Mit der Cytochrom-c-Oxidase und oxidiertem Cytochrom c erhält man bei
einer Scan-Rate von 50 mV/s einen Reduktions-Peak. Dieser befindet sich
bei 389 mV, gefolgt von einem Reoxidations-Peak bei 468 mV. Damit lässt
sich das Standartpotential mit Hilfe des Mittelwertpotentials annähern (Abschnitt 2.3). Aus der Differenz erhält man:
E0 ≈ E1/2 = 428 mV
Dieses Standardpotential ist um 200 mV höher als das gemessene Standardpotential eines vorgefertigten Cytochrom c-Cytochrom-c-Oxidase-Komplexes,
der auf einer mercaptopropanol modifizierten Elektrodenoberfläche adsorbiert [94]. Andererseits stimmt der in der vorliegenden Arbeit gemessene
Wert mit dem einer anderen Gruppe überein [95] [96]. Diese Arbeitsgruppe
verbindet zuerst einen Bilayer mit einer Goldelektrode und inkorporiert danach das Enzym. Im letztgenannten Fall hat die Cytochrom c-Bindungsseite
diesselbe Orientierung wie die Cytochrom-c-Oxidase in der up-Konfiguration.
In anderen Arbeitsgruppen befindet sich das Mittelwertpotential von Cytochrom c, angebunden an einer glatten bzw. aufgerauhten Silber-Oberfläche
bei E1/2 = 250 mV bzw. E1/2 = 262 mV [97]. Das Mittelwertpotential von
Cytochrom c, angebunden an einer 4-mercaptopyridine modifizierten Goldbzw. Silber-Oberfläche, liegt bei E1/2 = 254 mV [98].
93
Der Elektronentransfer durch das Enzym könnte eine mögliche Erklärung für
diese Verschiebung des Cytochrom c- Redoxpotentials um fast 200 mV sein.
Deshalb kann man zu dem Schluss kommen, dass das Cytochrom c an der
Cytochrom c-Bindungsseite der Cytochrom-c-Oxidase reduziert und oxidiert
wird. Der Elektronen-Transfer geht also durch das Enzym hindurch. Dadurch
ist die Tunnel-Barriere mit ungefähr 12 nm (siehe Abbildung 3.5) extrem
groß.
Der direkte Elektronen-Transfer zwischen der Cytochrom-c-Oxidase und der
Elektrode ohne Cytochrom c konnte nicht nachgewiesen werden (Abbildung
5.8), obwohl er auf Grund der kürzeren Tunnel-Barriere wesentlich verständlicher wäre.
Cyclovoltamogramme von oxidiertem Cytochrom c mit der Cytochrom-cOxidase in der up-Konfiguration (mit und ohne Sauerstoff gemessen) sind in
Abbildung 5.8 zu sehen. In Anwesenheit von Sauerstoff ist ein deutlicher Anstieg der Peakstromdichte (jp,kathodisch = −4, 9 µAcm−2 ) im Vergleich zu der
sauerstofffreien Messung (jp,kathodisch = −0, 8 µAcm−2 ) zu sehen. Diesen Effekt kann man als katalytischen Strom interpretieren. Er hat seinen Ursprung
in der oft wiederholten Reduktion des Cytochrom c, das mit Sauerstoff immer
wieder durch das Enzym katalytisch reoxidiert wird. Diese katalytische Reoxidation kann nur mit Sauerstoff und mit der damit verbundenen Aktivität des
Enzyms stattfinden. Der Vor-Peak in Abbildung 5.8 resultiert nach [48] aus
der Absorption der reduzierten Spezies des Cytochrom c-Redox-Paars.
Abbildung 5.6 zeigt die mit Sauerstoff gemessenen anodischen und kathodischen Stromdichten von oxidiertem Cytochrom c mit und ohne Cytochromc-Oxidase in der up-Konfiguration. Die Stromdichten sind in beiden Fällen
linear von der Wurzel der Spannungsvorschubgeschwindigkeit abhängig. Es
handelt sich also hierbei um einen diffusionskontrollierten Prozess [48]. In
Anwesenheit des Enzyms erkennt man für die kathodischen Ströme eine deutliche Veränderung der Steigung um eine Größenordnung58 . Auch hier ist der
katalytische Effekt dafür verantwortlich:
Das oxidierte Cytochrom c kann bei entsprechenden Potentialen reduziert
werden. Jedoch erhält man in Anwesenheit des Enzyms einen zusätzlichen
Strom. Das Cytochrom c bindet an das Enzym an, wird reduziert und wird
dann über das Enzym katalytisch reoxidiert. Das oxidierte Cytochrom c wird
daraufhin auf Grund des angelegten Potentials wieder reduziert und der Vorgang wiederholt sich.
Diese Interpretation ermöglicht es, nicht nur den Anstieg der Stromdichte
in Anwesenheit des Enzyms zu erklären, sondern auch den Rückgang der
Stromdichte bei den sauerstofffreien Messungen.
58
Das Verhalten der anodischen Ströme wird im nächsten Abschnitt besprochen.
94
Cyclovoltammetrie mit reduziertem Cytochrom c: Auch hier erkennt man bei der Verwendung von reduziertem Cytochrom c in Kombination mit dem ptBLM-System einen Anstieg der Stromdichte in Gegenwart
von Sauerstoff (siehe Abbildung 5.8). Dieser Effekt konnte bei exakt demselben Standartpotential von 430 mV bereits in [99] festgestellt werden. In
dieser Referenz beobachtete man jedoch viel geringere Stromdichten. Der
Anstieg der anodischen Ströme in Anwesenheit von Sauerstoff wird in [99]
der elektrochemischen Oxidation der oxoferryl oder ferredoxyl-Spezies zugeschrieben. Diese Spezies sind Zwischenprodukte des katalytischen Zyklus und
befinden sich direkt am katalytischen Zentrum (Häm a3 /CuB ). Dies führt zu
dem Schluss, dass es sich auch in diesem Fall um einen katalytischen Strom
handelt. Durch das reduzierte Cytochrom c wird die Cytochrom-c-Oxidase
aktiviert. Dabei wird Sauerstoff verbraucht und es bilden sich oxyferryl oder
ferredoxyl-Spezies, die über die Elektrode zu Sauerstoff regeneriert werden.
Durch diesen katalytischen Effekts ist es auch möglich die höheren anodischen Stromdichten in Gegenwart des Enzyms im Randles-Plot (Abbildung
5.6) zu erklären. In diesem Fall zeigt sich kaum ein Unterschied bei Verwendung von reduziertem und oxidiertem Cytochrom. Die Steigung der Geraden
für die anodischen Ströme des oxidierten Cytochrom c ohne Enzym, ist dabei
um eine Größenordnung kleiner.
In allen drei Fällen erhält man eine lineare Abhängigkeit der anodischen und
kathodischen Stromdichten von der Wurzel der Spannungsvorschubgeschwindigkeiten. Es handelt sich also um diffusionskontrollierte Prozesse, bei denen
jeweils ein reversibler Elektronenaustausch mit Hilfe des Cytochrom c stattfindet.
Eine nähere Betrachtung der kathodischen Ströme zeigt Folgendes59 :
In Gegenwart des Enzyms erkennt man deutlich kleinere Stromdichten bei
Verwendung von reduziertem statt oxidiertem Cytochrom c (Abbildung 5.6).
Das reduzierte Cytochrom c versorgt das Enzym mit einem Elektron und
wird oxidiert. Durch das negative Potential der Elektrode wird das Cytochrom über das Enzym wieder reduziert und gibt sein Elektron an das Enzym
wieder ab. Für den Fall des oxidierten Cytochrom c muss dieses jedoch zuerst
reduziert werden, um das Enzym zu aktivieren. Dieser zusätzlich auftretende
(faradaischen) Prozess bewirkt eine höhere Stromdichte.
Ein weiteres wichtiges Phänomen ist in Abbildung 5.6 zu erkennen. Die anodische Stromdichte ist für den Fall des reduzierten Cytochrom c nur bis
ungefähr 1 V/s linear von der Wurzel der Spannungsvorschubgeschwindigkeit abhängig. Danach fällt die Stromdichte exponentiell ab. Dieser Effekt
59
Im vorherigen Abschnitt wurde bereits die unterschiedliche Steigung der Geraden von
oxidiertem Cytochrom c mit und ohne Enzym durch einen katalytischen Effekt erklärt.
95
hängt direkt mit dem Umsatz des Enzyms zusammen. Bei höheren Spannungsvorschubgeschwindigkeiten ist das Enzym nicht mehr in der Lage dem
sich schnell ändernden Potential zu folgen. Dabei werden immer weniger reduzierte Cytochrom c-Moleküle regeneriert, was letztendlich zu einem Abfall
der Stromdichte führt.
Diese Vermutung wird durch den Trumpet-Plot bestätigt, bei dem eine steigende Abweichung des reduzierten und oxidierten Peakpotentials vom Standardpotential bei einer Scan-Rate von 1 V/s zu beobachten ist. Die Auswertung mit dem Programm Jellyfit ergibt für das verwendete System eine Geschwindigkeitskonstante von k0 = 73 s−1 und ein Standardpotential von E0 = 409 mV. Die berechnete Geschwindigkeitskonstante befindet
sich in der selben Größenordnung wie die eines Cytochrom c-Cyctochrom-cOxidase-Komplexes (k0 = 20 s−1 ) [94] und das berechnete Standardpotential
(E0 = 409 mV) liegt in demselben Bereich wie in [99] (E0 = 430 mV).
5.3
Potentialtitration der Cytochrom-c-Oxidase in der
up-Konfiguration mit und ohne Cytochrom c
Wie in den vorherigen Abschnitten gezeigt, pumpt die Cytochrom-c-Oxidase
nach ihrer Aktivierung durch Cytochrom c Protonen. Als Konsequenz des
Turnovers60 , sollte sich bei der Cytochrom-c-Oxidase in der up-Konfiguration
eine positive Potentialdifferenz bilden (bezogen auf die Außenseite gegenüber
dem Submembranraum). Messungen des Membranpotentials an Liposomen
mit inkorporierter Cytochrom-c-Oxidase (aktiviert durch Cytochrom c) ergeben Werte um die 50 mV [100].
5.3.1
Ergebnisse und Diskussion der EIS-Potentialtitration
Um die Abhängigkeit des ptBLM-Systems vom Potential zu überprüfen werden Impedanz-Spektren bei unterschiedlichen Potentialen aufgenommen. Dazu werden mehrere Messreihen mit unterschiedlichen Cytochrom c - Konzentrationen aufgestellt61 . Der gewählte Potentialbereich liegt dabei zwischen
50 mV und 400 mV. Die Messergebnisse einer dieser Messreihen sind in Abbildung 5.9 dargestellt. Die Auswertung erfolgt analog zu Abschnitt 5.2.1.
60
Als Turnover bezeichnet man den Umsatz eines Produktes oder einer Substanz pro
Zeiteinheit.
61
Bei diesem Versuch wurde ausschließlich mit reduziertem Cytochrom c gearbeitet.
96
Abbildung 5.9: Ergebnisse der Potentialtitration für eine 1, 82 · 10−4 molare
Cytochrom c-Lösung.
Zur Überprüfen der Messung wird zuerst der Widerstand gegen die Konzentration des Cytochrom c aufgetragen (Abbildung 5.10). Der bereits in
Abschnitt 5.2.1 aufgetretene exponentielle Abfall ist wiederzuerkennen.
97
Abbildung 5.10: Potentialtitration: Auftragung Widerstand gegen Konzentration ergibt bei allen Potentialen den erwarteten exponentiellen Abfall. Die Messpunkte sind in dieser Darstellung
miteinander verbunden.
Zur Verdeutlichung der Abhängigkeit des ptBLM-Systems vom Potential
wird, wie in Abbildung 5.11 zu sehen, der Widerstand gegen das angelegte
Potential aufgetragen. Man erkennt einen deutlichen Unterschied zwischen
der Messreihe ohne und den Messreihen mit Cytochrom c. Diese komplexen
Impedanz-Spektren lassen sich nur qualitativ interpretieren:
Membranen sind für bestimmte Ionen permeabel, wie zum Beispiel K+ - und
Cl− -Ionen [101]. Die Messreihe ohne Cytochrom c reflektiert den ”passiven”
Ionentransfer durch die Membran. Ionen werden dabei durch die Membran
transportiert. Dieser Vorgang ist abhängig von den Konzentrationsunterschieden und Potentialdifferenzen zwischen Submembranraum und Membranaußenseite [101].
Wird nun Cytochrom c hinzugegeben, so erhält man zwei zusätzliche Effekte.
Einerseits kommt der durch die enzymatischen Redoxprozesse hervorgerufene ”aktive” Protonentransport hinzu. Andererseits spielen nun faradaische
Ströme eine Rolle, die ihren Ursprung in der Reduktion und Oxidation des
Cytochrom c haben.
Das Maximum des passiven Ionentransports bei 300 mV kann man wie folgt
erklären. Der passive Transport der Anionen und Kationen bewirkt einen
Rückgang des gemessenen Membranwiderstands. Der Widerstand wird maximal, wenn sich ein Gleichgewicht zwischen den Permeabilitäten für Anionen
und Kationen einstellt. Bei Potentialen um 0 mV dominiert der passive Ionentransport. Eine Zugabe von Cytochrom c bewirkt keine Veränderung des
Membranwiderstands. Der gleiche Effekt deutet sich ansatzweise bei dem Potential von 400 mV an.
98
In Anwesenheit von Cytochrom c erhält man zwei Maxima:
• Das erste Maximum um 170 mV kann mit der Potentialdifferenz zwischen Membranaußenseite und dem Submembranraum zusammenhängen. Bei der hier verwendeten Konfiguration werden Protonen des Submembranraums zur Membranaußenseite transportiert. Dabei entsteht
eine Potentialdifferenz von ungefähr 50 mV (siehe oben). Werden die
an die Arbeitselektrode angelegten Potentiale negativer, so wird auch
das Potential des Submembranraums negativer und der Protonentransport gehemmt. Damit wird der Membranwiderstand vergrößert. Bei Potentialen kleiner als 100 mV ist der passive Ionentransport dominant.
Dadurch verkleinert sich der Membranwiderstand, und ein Maximum
entsteht.
• Das zweite Maximum um 340 mV lässt sich durch das Cytochrom c Standardpotential erklären. Bei diesem Potential sind die faradaischen
Ströme im Gleichgewicht, wodurch sich der gemessene Membranwiderstand vergrößert.
Abbildung 5.11: Potentialtitration: Auftragung Widerstand gegen Potential.
Der mögliche Kurvenverlauf ist in dieser Darstellung integriert.
5.4
99
Aktivierung der Cytochrom-c-Oxidase in der downKonfiguration
In einer vorausgegangen Arbeit konnte bereits der direkte Elektronentransfer
der Cytochrom-c-Oxidase mit His-Tag an Untereinheit II (down-Konfiguration) nachgewiesen werden [17]. In dieser Konfiguration ist das Enzym über die
Arbeitselektrode aktivierbar. Werden nun Messungen ohne Sauerstoff vorgenommen, verliert die Cytochrom-c-Oxidase ihre katalytische Wirkung. An
der Elektrode unterschiedlich angelegten Spannungen zwingen das Enzym in
den reduzierten, oxidierten oder einen Zwischenzustand. Mit der Cyclovoltammetrie konnten zwei Peaks ermittelt werden:
• Der erste Peak bei E ≈ 422 mV konnte man den Protonen zuordnen, die
zuerst in den Submembranraum gepumpt und danach an der Elektrode
zu Wasserstoff werden (2H+ → H2 ).
• Der zweite Peak bei E ≈ 202 mV hat seinen Ursprung im direkten
Elektronentransfer zwischen Enzym und Elektrode (Reduktion der vier
Redox-Zentren der Cytochrom-c-Oxidase) [17].
Messungen ohne Sauerstoff zeigten eine starke Verringerung der Stromdichte
für den letztgenannten Bereich. Unter anaeroben Bedingungen entfällt das
Protonenpumpen.
Außerdem konnte man eine direkte Aktivierung der Cytochrom-c-Oxidase
in der up-Konfiguration in einem Potentialbereich von -600 mV bis +600 mV
ausschließen (siehe Abbildung 5.12) [17].
Im Folgenden wird die Mutanten N139C zur Konstruktion eines ptBLMSystem verwendet und mit cyclovoltammetrischen Messungen untersucht.
100
Abbildung 5.12: Cyclovoltammogramme (Scan-Rate von 10 mV/s) von der
Cytochrom-c-Oxidase in der down-Konfiguration mit (rot)
und ohne Sauerstoff (schwarz) und von der Cytochrom-cOxidase in der up-Konfiguration (blau).
5.4.1
Ergebnisse und Diskussion der CV-Messungen mit der Mutante N139C
Abbildung 5.13 zeigt Cyclovoltamogramme der Cytochrom-c-Oxidase mit
His-Tag an Untereinheit II mit und ohne Mutation. Dabei werden Messungen, sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen vorgenommen.
Man erkennt, dass das Austauschen von nur einer einzigen Aminosäure drastische Folgen hat. Nach [85] werden bei der Mutante in Anwesenheit von
Sauerstoff keine Protonen gepumpt. Statt der beiden Peaks, die man beim
Wild-Typ (mit His-Tag) erhält, sieht man bei der Mutante nur noch einen
Peak. Das Peakpotential für die Reduktion der vier Redox-Zentren der Mutante ist im Vergleich zum Wild-Typ (mit His-Tag) ins Negative verschoben.
Eine Erklärung hierfür ist das Fehlen der gepumpten Protonen. Des Weiteren
kann schon eine durch die Mutation minimal hervorgerufene Konformationsänderung ein Grund für eine Peakpotential-Verschiebung sein.
101
Abbildung 5.13: Cyclovoltammogramme der Mutante N139C und des WildTyp in Gegenwart (links, Scan-Rate: 10 mV/s) und Abwesenheit (rechts, Scan-Rate: 100 mV/s) von Sauerstoff.
Messungen ohne Sauerstoff (Abbildung 5.13, rechts) ergeben bei der Mutante einen sehr viel kleineren Strom als beim Wild-Typ (mit His-Tag). In
beiden Fällen erkennt man sowohl eine Reduktion als auch eine Oxidation
des Enzyms.
6 PROBENHERSTELLUNG FÜR SERRS
6
102
Probenherstellung für SERRS
Im Gegensatz zu den in der Elektrochemie verwendeten Goldelektroden müssen die verwendeten Silberelektroden für die SERR-Spektroskopie eine bestimmte Rauhigkeit als Voraussetzung für die Oberflächenverstärkung der
Raman-Streuung aufweisen (siehe Abschnitt 2.5.4). Der Oberflächenverstärkungseffekt hängt stark von dem verwendeten Material ab [60]. Deshalb wird
in diesem Experiment als Elektrodenmaterial Silber verwendet62 .
Dieses Kapitel beschreibt die Herstellung und Präparation einer chemisch
aufgerauhten Silberoberfläche63 .
Analog zu vorausgegangen Arbeiten werden die Proteine auf einer chemisch
aufgerauhten Silberelektrode angebunden [55] [78]. Die Silberelektroden werden vor der Aufrauhung mit einer Poliermaschine poliert. Die aufgerauhte
Silberelektrode wird danach für das jeweilige Experiment entweder mit einem
reinen TP-Monolayer oder einem DTSP-DTP-Monolayer funktionalisiert.
6.1
Herstellung der Silberelektroden
Weil mit den präparierten Proben keine SPR-Spektroskopie gemacht wird,
benötigt man keine ultradünnen Schichten, so dass man auf eine Herstellung
von TSG-Elektroden verzichtet kann. Für die Herstellung der Silberelektroden wird stattdessen ein Silberstab zersägt. Diese (ø = 10 mm, Höhe ≈ 7 mm)
haben auf einer Seite ein Gewinde (ø = 4 mm), damit sie in die entsprechende
Apparatur eingebaut werden können64 . Die Präparation ist für neue und gebrauchte Elektroden identisch. Die Elektroden sind zwar wieder verwendbar,
verlieren jedoch durch die erneute Polierung an Höhe.
62
Mehrere Veröffentlichungen zeigen bei Verwendung von Silber-, Gold- oder aufgerauhten Silberelektroden in Kombination mit Cytochrom c kaum eine Veränderung im gemessenen Cyclovoltammogramm [98] [97]. Aus diesem Grund sind die Ergebnisse, die man mit
den unterschiedlichen Elektroden erhält, vergleichbar.
63
Eine genaue Beschreibung der verwendeten Materialien und Geräte befindet sich im
Anhang.
64
Da die Elektrode einen Zylinder darstellt, man jedoch lediglich eine Oberfläche von
A = 0,785 cm2 benötigt (analog zur Goldelektrode aus Abschnitt 4), wird ein Teflonmantel
(øinnen =10 mm, øaußen =11 mm, Höhe=7 mm) als Begrenzung verwendet. Die Silberelektroden und die Teflonmäntel wurden von der Feinmechanik-Werkstatt des MPIP Mainz
hergestellt.
6.2
103
Polieren der Silber-Elektroden
Die Silberelektroden werden mit einer abgewandelten Form der ”Stewart’s
Methode für Edelmetalle” poliert65 . Bei allen Polierschritten wird mit einem
möglichst geringen Druck gearbeitet. Dadurch vermeidet man einen allzu
großen Abrieb und das Eindringen von Schleifpartikeln in die Silberlektrode.
In der folgenden Tabelle ist die Vorgehensweise dargestellt:
Oberfläche
CarbiMet P600 SiC
CarbiMet P1200 SiC
ChemoMet-Tuch
ChemoMet-Tuch
ChemoMet-Tuch
Schmiermittel U/min
wassergekühlt
150
wassergekühlt
150
1 µm Al2 O3 Suspension
300
0,3 µm Al2 O3 Suspension
300
0,05 µm Al2 O3 Suspension
300
Zeit [s]
30
30
30
30
30
Tabelle 6.1: Poliervorschrift für Ag-Elektroden
Die Silberelektroden werden zwischen den einzelnen Polierschritten sorgfältig mit Wasser gewaschen oder alternativ für 10 Minuten ins Ultraschallbad gestellt. Dadurch wird verhindert, dass das verwendete Poliermittel den
nächsten Polierschritt kontaminiert. Zum Schluss werden die Silberelektroden zuerst mit Wasser und dann mit Ethanol für jeweils 30 Minuten ins
Ultraschallbad gestellt.
6.3
Elektrochemisches Aufrauhen der Silber-Elektroden
Das elektrochemische Aufrauhen der Silberelektroden erfolgt in einer im Rahmen der Diplomarbeit speziell angefertigten Zelle. Die Silberelektrode wird
auf einen Stahlkern, der sich in der Mitte eines Teflonzylinders befindet, hineingeschraubt und auf diese Weise kontaktiert. Der Teflonzylinder wird mit
0,1 M KCL-Lösung gefüllt. Referenz- und Gegenelektrode werden von oben
in die Lösung gehalten66 . Die Vorgehensweise der elektrochemischen Aufrauhung wird wie in [55] durchgeführt. Nach der Reinigung durch naszierenden
Wasserstoff entfernt man die entstehenden Luftblasen. Dadurch erhält man
65
Dies geschah in Zusammenarbeit mit der Firma Buehler, bei der diese Poliervorschriften erhältlich sind. Der Grund der individualisierten Poliervorschrift ist in Abschnitt A.6
zu finden.
66
Auch hier wird eine 3 Elektrodenanordnung verwendet (siehe Abschnitt 4).
104
im nächsten Schritt eine gleichmäßige Aufrauhung mit (70/20/20)67 . Danach
wird die Oberflächenaufrauhung in drei Schritten durchgeführt:
Schritt
Reinigung
Aufrauhung
Aufrauhung
angelegte Spannung vs. Ag/AgCl,KClkonz.
-2.0 V für ∼ 10 s
+0.3 V und -0.3 V für jeweils 70 s
+0.3 V und -0.3 V für jeweils 20 s
Wdh.
1
1
2
Tabelle 6.2: Protokoll zum Aufrauhen der Ag-Elektroden mit (70/20/20).
6.4
6.4.1
Funktionalisierung und Proteinanbindung
Untersuchungen mit Cytochrom c
Für die Untersuchungen mit Cytochrom c wird die aufgerauhte Silberelektrode mit einer DTP-Lösung für 2 Stunden funktionalisiert (Abbildung 6.1).
Danach wird entweder eine oxiderte oder eine chemisch reduzierte Cytochrom
c-Lösung hinzugegeben. Nach 30 Minuten Anbindungszeit beginnt man mit
den Messungen.
6.4.2
Untersuchungen mit der Cytochrom-c-Oxidase
Die Cytochrom-c-Oxidase von Rhodobacter sphaeroides mit His-Tag an Untereinheit II (down-Konfiguration) wird mit SERRS untersucht. Die Silberelektrode wird - wie in Abschnitt 3.2 und 3.3 beschrieben - funktionalisiert.
Nach der Proteinanbindung bildet man die Membran durch eine Dialyse. Das
fertige ptBLM-System ist in Abbildung 6.2 dargestellt.
67
(70/20/20) steht für die unterschiedlichen Aufrauhungszeiten in den jeweiligen Schritten: +0,3 V für 70 s, -0,3 V für 70 s, +0,3 V für 20 s, -0,3 V für 20 s, +0,3 V für 20 s, -0,3 V für
20 s. Die angelegte Spannung bezieht sich auf eine Ag/AgCl,KClkonz. -Referenzelektrode.
105
Abbildung 6.1: Funktionalisierung der Silberelektrode durch einen SAM (Self
Assembling Monolayer).
106
Abbildung 6.2: Die Cytochrom-c-Oxidase in der down-Konfiguration, angebunden auf einer aufgerauhten Silberelektrode.
7 MESSAUFBAU FÜR SERRS
7
107
Messaufbau für SERRS
Durch die Kombination von elektrochemischen Experimenten mit ”in-situ”
Raman-Spektroskopie benötigt man einen speziellen experimentellen Aufbau,
der zugleich eine hoher Sensitivität für die spektroskopische und elektrochemische Untersuchung aufweist. Aus diesem Grund wird eine verbesserte Variante des Aufbaus von [55] verwendet. Wie bereits in Abschnitt 2.4 erwähnt,
unterscheidet man potentiostatische von zeitaufgelösten Messungen. Der experimentelle Aufbau ist dabei gleich und muss lediglich für die zeitaufgelösten
Messungen erweitert werden. In dieser Diplomarbeit finden beide Methoden
Verwendung. Daher werden beide Aufbauten in den folgenden Abschnitten
erläutert. Die für die Messungen verwendete alte Ramanzelle wird beschrieben und die neu konstruierte Ramanzelle vorgestellt.
7.1
Messaufbau für die potentiostatischen Messungen
Der Messaufbau für die potentiostatischen Messungen ist schematisch in Abbildung 7.1 dargestellt. Die Aufnahme der SERRS-Spektren von der Silberoberfläche erfolgt durch Anregung bei 413 nm mit einem Kryptonlaser. Der
Strahlengang wird mit Hilfe eines Systems aus Irisblenden und Spiegeln justiert. Bevor der Laserstrahl in das Spektrometer geführt wird, wird er durch
einen Monochromator geleitet. Dadurch werden störende Plasmalinien des
Lasers entfernt. Das gestreute Licht wird im 90◦ -Winkel zur Strahlrichtung
auf den Spektrometerspalt (d = 11µm) mit einem Wasser-Immersionsobjektiv
fokussiert. Durch den Strahlteiler (ST) kann das gestreute Licht entweder auf
eine CCD-Kamera geleitet werden, die man zum Fokussieren verwendet, oder
auf das mit flüssigem Stickstoff gekühlte Symphony CCD-Detektor System
geführt werden.
Bevor das gestreute Licht auf den gekühlten CCD-Detektor trifft, kommt
es durch zwei Notchfilter (NF) und einen Spektrographen. Jeder Notchfilter
sorgt dafür, dass das gestreute elastische Licht (Raleigh-Signal) unterdrückt
wird. Der Spektrograph enthält ein optisches Gitter (1800 Linien/mm) mit
dessen Hilfe das Licht dispergiert wird. Bei der verwendeten Apparatur beträgt die spektrale Breite 3,13 cm−1 . Die Laserintensität auf der Probenoberfläche stellt man kleiner als 0,2 mW ein. Dies verhindert die Denaturierung
der Proteine und vermindert die Photoreduktion. Der so genannte ”MarkerBanden-Bereich” (siehe Abschnitt 2.5.5) ist in dem typischen Messbereich
(1100 cm−1 bis 1900 cm−1 ) integriert.
Die Kalibrierung des Spektrometers erfolgt durch die Silizium - Linie bei
520,07 cm−1 und durch die mit Weißlicht hervorgerufene Nulllinie.
Die SERRS-Zelle ist mit einem Autolab-Potentiostaten verbunden. Dieser
108
legt die gewünschte Spannung an die Probe an und wird über einen PC
(PC 1) gesteuert. Die Daten, die man mit Hilfe der stickstoffgekühlten CCDKamera erhält, werden an einen PC (PC 2) weitergegeben.
Abbildung 7.1: Der Messaufbau für potentiostatische SERRS-Messungen.
7.2
Messaufbau für die zeitaufgelösten Messungen
Das Prinzip der zeitaufgelösten Messung ist bereits in Abschnitt 2.4.2 beschrieben worden. Der erweiterte Messaufbau für dieses Prinzip ist in Abbildung 7.2 dargestellt.
Das benötigte Rechteckspannungssignal, dass an die Elektrode gelegt werden
soll, wird von einem Funktionsgenerator (Funkt. 1) erzeugt und an den mit
der SERRS-Zelle verbundenen Autolab-Potentiostaten weitergegeben. Ein
zweiter Funktionsgenerator (Funkt. 2) erzeugt ebenfalls ein Rechteckspannungssignal.
109
Dieses Signal wird zum Aktivieren und Deaktivieren des Laserstrahls an einen
”Akustooptischen Modulator” (AOM) gelegt68 . Die Signale werden über ein
Oszilloskop (nicht eingezeichnet) getriggert.
Abbildung 7.2: Der erweiterte Messaufbau für zeitaufgelöste SERRSMessungen.
7.3
Zelldesign der SERRS-Zelle
Die Durchführung von zeitaufgelösten spektroelektrochemischen Messungen
verlangt ein spezielles Zelldesign. Die Zelle muss dabei mehrere Eigenschaften besitzen:
Die Silberelektrode muss sehr schnell gedreht werden können, damit die durch
den Laser hervorgerufene Photoreduktion begrenzt werden kann [55]. Für
sauerstofffreie Messungen muss der Sauerstoff aus der Zelle dauerhaft entfernt
werden können. Für zeitaufgelöste Messungen ist es nötig, an der Arbeitselektrode ein hochfrequentes Rechteckspannungssignal anzulegen. Deshalb muss
68
Der AOM ist ein optisches Bauelement, mit dem Laserstrahlen manipuliert werden
können. In einfachster Anwendung kann ein AOM in Kombination mit einer Irisblende
(IB) als Schalter eingesetzt werden, der sehr schnell zwischen Blockieren und Durchlassen
schalten kann [102]. Der AOM ist dabei um mehrere Größenordnungen schneller, als der
in [55] verwendete mechanische Schalter.
110
ein möglichst rauschfreier Kontakt zum Autolab-Potentiostaten hergestellt
werden.
In den folgenden zwei Abschnitten wird der Aufbau der alten Ramanzelle
beschrieben und die Verbesserungen der neu konstruierten Ramanzelle vorgestellt.
7.3.1
Zelldesign der alten Ramanzelle
Als Arbeitselektrode verwendet man eine mit der Oberfläche nach oben gerichtete, rotierende Scheiben-Elektrode (RDE) [17]. Die Silberelektrode mit
Teflonmantel (siehe Abschnitt 6.1) wird - wie in Abbildung 7.3 gezeigt auf einen Stahlstift geschraubt. Der Stahlstift dreht sich als Achse in Kugellagern und wird erschütterungsarm über einen Zahnriemen durch einen
Mini-Elektromotor angetrieben. Mit diesem Motor kann man den Stahlstift
und damit auch die Silberelektrode mit bis zu 900 RPM rotieren lassen.
Ein mit Puffer-Lösung gefüllter Teflon-Zylinder befindet sich zwischen Elektrode und Stahlstift. Der Zylinder wird durch die aufgeschraubte Elektrode
mit dem Stahlstift fixiert.
Die Silberelektrode (Arbeitselektrode) wird über einen Schleifkontakt mit
dem Autolab-Potentiostaten verbunden (WEout )69 . Gegen- und Referenzelektrode werden zusammen mit dem Immersionsobjektiv und einem Schlauch
zum Entfernen des Sauerstoffs in einem Teflondeckel befestigt und mit Gummiringen (nicht abgebildet) abgedichtet. Der Teflondeckel wird auf die Messzelle aufgeschraubt. Das Objektiv wird mit dem Spektrometer verbunden
und kann zum Fokussieren in der Höhe verstellt werden.
69
Auch in diesem Fall verwendet man - wie in Abschnitt 4 beschrieben - eine 3Elektrodenanordnung. Hier jedoch mit dem Unterschied, dass die Arbeitselektrode aus
Silber und nicht aus Gold besteht.
111
Abbildung 7.3: Das Zelldesign der alten Messzelle.
Abbildung 7.4: Bild der alten Messzelle ohne Objektiv und Tefloneinsatz.
7.3.2
112
Zelldesign der neuen Ramanzelle
Die Konstruktion der alten Messzelle hatte erhebliche Nachteile:
Der Schleifkontakt zeigte ein hohes Untergrundrauschen. Um es zu minimieren werden jetzt die rotierende Achse und der Autolab-Potentiostaten über
einen speziell entwickelten Quecksilberkontakt verbunden70 .
Es war schwierig die alte Zelle abzudichten. Durch das Rotieren des gesamten Teflonzylinders lief die Zelle häufig aus. Dadurch befanden sich Referenzund Gegenelektrode nicht mehr in der Lösung. Zusätzlich zerstörte der PBSPuffer die Kugellager. Mit einem nachträglich eingebauten Wellenbrecher
konnte das Auslaufen der Zelle, zwar vermindert, aber nicht völlig verhindert werden. Die enormen Strömungen, hervorgerufen durch die Rotation
des kompletten Zylinders, führten dazu, dass sich Gegen- und Referenzelektrode nicht immer in der Pufferlösung befanden.
Aus diesen Gründen rotiert bei dem neuen Zelldesign (Abbildungen 7.5 und
7.6) lediglich die Achse mit der aufgeschraubten Silberelektrode. Der Teflonzylinder (cyan) wird in der Zelle fixiert und dreht sich nicht.71 . Das Auslaufen
der Zelle verhindert eine Gleitringdichtung. Zusätzlich ist ein stärkerer Motor
in die Zelle eingebaut72
70
Dies geschah in Zusammenarbeit mit Dr. Maarten Van Brussel (Autolab Eco Chemie
B.V.).
71
Der Teflonzylinder kann jedoch herausgenommen und durch ein Schwefelsäurebad gereinigt werden.
72
Das Design wurde in Zusammenarbeit mit der Feinmechanik-Werkstatt und der Elektronikabteilung des MPIP Mainz erstellt. Eine detaillierte Konstruktionszeichnung ist im
Anhang (Abschnitt A.4) zu finden. Die Position des Quecksilberkontaktes, der noch eingebaut werden muss, ist angegeben.
113
Abbildung 7.5: Das Zelldesign der neuen Messzelle. Der Deckel mit Objektiv,
Referenz- und Gegenelektrode ist nicht eingezeichnet.
Abbildung 7.6: Querschnitt der neuen Messzelle. Der Deckel mit Objektiv,
Referenz- und Gegenelektrode ist nicht eingezeichnet. Der
herausnehmbare Zylinder (cyan) besteht aus Teflon. Der Einsatz besteht aus Teflon (weiß) und Plexiglas.
8
114
Messergebnisse und Diskussion (Teil 2)
8.1
Oberflächenaufrauhung der Silberelektroden
8.1.1
Durchführung der elektrochemischen Aufrauhung
Bei der elektrochemischen Aufrauhung (70/20/20) wird der, bei den unterschiedlich angelegten Potentialen73 , gemessene Strom gegen die Zeit aufgetragen (Abbildung 8.1).
Bei positiven Spannungen (E = 500 mV) werden aus der Elektrode Silberionen gelöst, die dann bei negativen Spannungen (E = −100 mV) wieder
an die Elektrode binden. Durch die Diffusion der Silberionen kommt es zu
einer Aufrauhung. Zu weit diffundierte Silberionen binden jedoch nicht mehr
an die Elektrode. Der Strom geht deshalb nach einer gewissen Zeit auf Null
zurück.
Abbildung 8.1: Elektrochemisches Aufrauhen der Silberelektroden.
73
(70/20/20) steht für die unterschiedlichen Aufrauhungszeiten in den jeweiligen Schritten: +0, 5 V für 70 s, −0, 1 V für 70 s, +0, 5 V für 20 s, −0, 1 V für 20 s, +0, 5 V für 20 s,
−0, 1 V für 20 s. Die angelegte Spannung bezieht sich auf eine NHE-Referenzelektrode.
8.1.2
115
Optimierung der verwendeten Aufrauhungszeiten
Durch den Vergleich der Aufnahmen von verschieden aufgerauhten Silberelektroden durch das Rasterkraftmikroskop (AFM) soll die Aufrauhungszeit
optimiert werden (Abbildung 8.2). Um weitere Substrukturen auf der aufgerauhten Oberfläche auszuschließen, werden zudem Bilder mit dem Nanoscope
(Abbildung 8.3) aufgenommen74 .
In Tabelle 8.1 ist die Standardabweichung σ der jeweiligen Probe für eine 16x16 µm2 -Fläche (Nanoscope-Messung) und für eine 5x5 µm2 - Fläche
(AFM-Messung) dargestellt. Erwartungsgemäß, nimmt die Oberflächenrauhigkeit mit längeren Aufrauhzeiten zu und führt zu einer Aufrauhung in
dem gewünschten Größenbereich von mehreren Nanometern. Die AFM- und
Nanofocus-Bilder lassen erkennen, dass Probe (b) sehr ungleichmäßig aufgerauht ist. Sind die gebildeten Spitzen - wie bei Probe (d) - zu stark, kann
es zu Problemen bei der Anbindung der Proteine und der darauf folgenden
Membranbildung kommen. Probe (c) ist am homogensten aufgerauht und
damit am besten geeignet.
Probe
(a) poliert
(b) 20/5/5
(c) 70/20/20
(d) 210/60/60
σAFM
4,4 nm
70 nm
80 nm
120 nm
σNanoscope
11 nm
76 nm
79 nm
117 nm
Tabelle 8.1: Ergebnisse der AFM und Nanoscope-Daten.
74
Die AFM und Nanoscope Bilder wurden in Zusammenarbeit mit Helma Burg und Andreas Best (Arbeitskreis Butt, MPIP-Mainz) angefertigt und ausgewertet. Weitere Bilder
befinden sich im Anhang (A.6).
116
Abbildung 8.2: AFM-Bilder der unterschiedlich aufgerauhten Silberelektroden. (a) keine Aufrauhung, (b) Aufrauhung mit 20/5/5, (c)
70/20/20, (d) 210/60/60. Die Höhenskala geht bei allen vier
Bildern von 0 nm bis 200 nm.
117
Abbildung 8.3: Nanoscope-Bilder der unterschiedlich aufgerauhten Silberelektroden. (a) keine Aufrauhung, (b) Aufrauhung mit
20/5/5, (c) 70/20/20, (d) 210/60/60. Die unterschiedlichen
Höhenskalen sind in dem jeweiligen Bild eingezeichnet.
8.2
118
SERRS-Messungen
Mit cyclovoltammetrischen Messungen lässt sich das Standardpotential von
Cytochrom c ermitteln. Das Cytochrom c wird an einer Oberfläche angebunden und elektrisch reduziert, bzw. oxidiert. Diese Messungen beinhalten
jedoch keine Angaben über Konformationsänderungen. Durch die oberflächenverstärkte resonante Ramanspektroskopie (SERRS) gewinnt man Informationen über die Struktur der Häm-Gruppe und ihrer Umgebung. Dadurch
lassen sich Aussagen über den Spin, den Oxidations- und den Konformationszustand des Eisens treffen. Bei der Cytochrom-c-Oxidase ist es sogar
möglich, die beiden vorhandenen Häm-Gruppen voneinander zu unterscheiden (Abschnitt 2.5.5).
Alle Spektren werden, wie in den Abschnitten 7.1 und A.1.4 beschrieben,
gemessen und ausgewertet. Bei den SERRS-Messungen wird eine Laserintensität von circa 0,1 mW auf der Probenoberfläche verwendet. Die Messdauer
beträgt 30 Sekunden.
8.2.1
Ergebnisse und Diskussion der SERRS-Messungen mit Cytochrom c
Ergebnisse: Um die elektrochemisch reduzierten und oxidierten Spektren
zu überprüfen, wird jeweils eine Messung mit oxidierter und chemisch reduzierter Cytochrom c-Lösung durchgeführt. Während der Messungen befindet
sich die Cytochrom c-Lösung in der Messzelle. Die Spektren sind in Abbildung 8.4 gezeigt.
Für die potentiostatischen Messungen wird das an die Silberoberfläche (DTPmodifiziert) angebundene Cytochrom c durch das an die Elektrode angelegte
Potential in einen reduzierten, einen oxidierten, oder einen Zwischenzustand
gezwungen. Die Spektren werden in einem Potentialbereich von 40 mV bis
350 mV aufgenommen (Abbildung 8.5). Zeitaufgelöste Messungen verlangen
eine Rückkehr des Systems in den Ausgangszustand (siehe Abschnitt 2.4.2).
Deshalb wird eine potentiostatische Rücktitration in einem Potentialbereich
von 350 mV bis -510 mV durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 8.6
dargestellt.
119
Abbildung 8.4: SERRS-Spektren von oxidiertem (rot) und chemisch reduziertem (blau) Cytochrom c. Die Messungen werden mit einer
DTP - modifizierten Silberoberfläche durchgeführt.
120
Abbildung 8.5: Potentialtitration des Cytochrom c ((a) 40 mV, (b) 90 mV ,
(c) 140 mV, (d) 240 mV, (e) 350 mV).
121
Abbildung 8.6: Rücktitration des Cytochrom c ((a) 350 mV, (b) 190 mV, (c)
90 mV, (d) -110 mV, (e) -210 mV, (f) -310 mV, (g) -410 mV,
(h) -510 mV).
Diskussion: Sowohl das oxidierte, als auch das chemisch reduzierte SERRSSpektrum sind in Übereinstimmung mit den entsprechenden resonanten Raman - Spektren75 eines 6cLS Cytochrom c im nativen B1-Zustand [103][104]76 .
In [103] und [105] hat man identische SERR-Spektren auf einer mit einem
PySH-Monolayer bzw. mit einem Carboxylat-SAM funktionalisierten Elektrode erhalten und kann so eine Veränderung der Proteinstruktur durch die
Anbindung an die Silberoberfläche ausschließen.
Die Abbildungen 8.4 und 8.5 zeigen vier Phorphyrin-Moden, mit denen man
Aussagen über Spin, Redoxzustand und Koordinationszahl des Eisenatoms
75
Bei resonanten Raman-Spektren wird das Cytochrom c nicht an eine Oberfläche angebunden, sondern in Lösung gemessen.
76
In der zweiten Referenz wird das dem Rinderherz-Cytochrom c sehr ähnliche
Pferdeherz-Cytochrom c verwendet.
122
gewinnen kann (Siehe Abschnitt 2.5.5). Tabelle 8.2 zeigt die Moden und Lagen der Banden für das jeweilige Spektrum.
Mode
ν2
ν3
ν4
ν10
Cytcox [cm−1 ]
1587
1503
1374
1641
Cytcred [cm−1 ] Cytc350mV [cm−1 ] Cytc40mV [cm−1 ]
1593
1584
1589
1489
1503
1490
1362
1373
1362
1638
-
Tabelle 8.2: Moden und Lagen der Banden sowohl für Spektren mit oxidiertem und reduziertem Cytochrom c, als auch für Spektren mit
Cytochrom c, bei denen ein Potential von 40 mV bzw. 350 mV
an die Elektrode angelegt wird.
Reduziert man das Cytochrom c, so verringert sich die ν4 -Mode um ∼ 10cm−1 .
Die Reduktion des Eisens führt zu einer erhöhten Elektronendichte. Es erfolgt
ein Ausgleich der negativen Ladung durch π-Rückbindung (back donation).
Dies führt zu einer partiellen Besetzung der π ∗ -Orbitale des Porphyrins und
damit zur Schwächung der C–C- und C–N-Bindungen. Es resultiert eine Frequenzverschiebung der ν4 -Bande zu einer kleineren Wellenzahl. Diese Mode
wird so zu einem Indikator für den Redoxzustand des Häm-Eisens [3].
Die Frequenzverschiebungen der anderen Banden sind abhängig von der Änderung des Fe–N(Pyrrol)-Abstands, der so genannten ”core size”-Änderung
Bei der Potentialtitration erhält man eine geringfügige Veränderung der Wellenzahlen für die einzelnen Banden. Dies lässt sich auf die unterschiedlich
durchgeführten Basislinienkorrekturen zurückführen. Außerdem verursacht
die Kalibration der Apparatur einen Messfehler.
Das Protein kann durch die Elektrode erfolgreich oxidiert werden. Das Redoxpotential von Cytochrom c sollte sich demnach in dem Potentialbereich
von 40 mV bis 350 mV befinden. Die Arbeiten [103] und [97], bei denen das
Mittelwertpotential von Cytochrom c mit ∼195 mV bzw. 262 mV genau zwischen den gemessenen Oxidations- und Reduktionspotentialen liegt,77 bestätigen dies. Das Cytochrom c-Redoxpotential befindet sich mit E0 =260 mV
außerdem in dem verwendeten Potentialbereich [106].
Allerdings tritt bei der Rücktitration ein Problem auf: In Abbildung 8.6 er77
In [97] wird die Silberelektrode zwar aufgerauht, aber nicht mit einem SAM funktionalisiert.
123
kennt man, dass eine vollständige Reduktion durch die Elektrode selbst bei
Potentialen von -510 mV nicht möglich ist. Eine denkbare Erklärung ist die
Desorption des Proteinlayers und die damit verbundene Denaturierung des
Cytochrom c. Das Ablösen des Proteinlayers wurde bereits bei Elektrolytlösungen mit hoher Salzkonzentration beobachtet [103]. Nach [94] zeigt Cytochrom c nach der Denaturierung einen dramatischen Rückgang des Redoxpotentials. Demnach könnten die Proteine während der Messung ihre native
Form verlieren. Allerdings sollte man für diesen Fall Konformationsänderungen im SERRS-Spektrum erkennen. Das Protein befindet sich jedoch immer
noch im 6cLS-Zustand.
8.2.2
Ergebnisse und Diskussion der SERRS-Messungen mit der
Cytochrom-c-Oxidase
Analog zu einer vorausgegangenen Arbeit wird die Cytochrom-c-Oxidase in
der down-Konfiguration ohne Sauerstoff untersucht [17]. Dazu wird die Probe in die Zelle eingebaut. Das Einleiten von Argongas in die Zelle für (45
Minuten) entfernt die Hauptmenge des Sauerstoffs. Als Puffer wird das Sauerstoffzehrsystem verwendet, das den Restsauerstoff entfernt.
Ergebnisse der potentiostatischen Messung: Für die Potentialtitration wird ein Potentialbereich von -710 mV bis -10 mV gewählt (Abbildung
8.7)78 . In diesem wird das Enzym oxidiert und reduziert. Dies zeigt ein Vergleich mit den cyklovoltammetrischen Messergebnissen aus Abbildung 5.13.
Um zu testen, ob sich das System wieder in den Ausgangszustand zurückbringen lässt, wird - wie in Abbildung 8.9 zu sehen - das Enzym erst oxidiert
(rot), dann reduziert (blau) und dann wieder oxidiert (schwarz).
78
Die Spektren, die bei -10 und-110mV aufgenommen werden, unterscheiden sich nicht.
124
Abbildung 8.7: Potentialtitration der Cytochrom-c-Oxidase ((a)-710 mV,
(b)-610 mV, (c)-510 mV, (d)-410 mV, (e)-310 mV, (f)-210 mV,
(g)-110 mV).
Abbildung 8.8: Die zu den Peaks gehörenden Moden für die oxidierten (rot:
-110 mV) und reduzierten Spektren (blau: -710 mV).
125
Abbildung 8.9: Wiederholte Oxidation (rot und schwarz: -110 mV) und Reduktion (blau: -710 mV) der Cytochrom-c-Oxidase.
126
Ergebnisse der zeitaufgelösten Messung: Für die zeitaufgelöste Messung wird eine Rechteckspannung mit einer Frequenz von 2,5 Hz (=
* 400 ms)
gewählt (Abbildung 8.10). Diese oxidiert (E = −10 mV) und reduziert (E =
−710 mV) das Enzym periodisch. Nach einer Verzögerungszeit δ findet eine SERRS-Messung in einem Intervall ∆t = 20 s statt. Nach dem Messvorgang muss das System wieder in den Ausgangszustand gebracht werden,
so dass beim nächsten Messvorgang genau dieselben Voraussetzungen vorhanden sind. Man misst also die durchschnittliche Änderung des Systems
zwischen t = δ und t = δ + ∆t. Die Potentialsprünge werden wiederholt.
Aufgrund der durch das Zelldesign bedingten geringen Haltbarkeit der Probe ist nur eine Messzeit von 200 s möglich. Die tatsächliche Messzeit beträgt
jedoch nur 10 s.
Die Wahl dieser Parameter erfordert 20 Messschritte für eine komplette
Zeitauflösung.
Um zu testen, ob das gewählte Zeitfenster von 2,5 Hz groß genug ist, werden
zwei Messungen durchgeführt:
Bei der ersten Messung wird die Verzögerungszeit δ so gewählt, dass sich das
Enzym im oxidierten Zustand befindet (Einstellung a). In diesem Fall wird
vor jeder SERRS-Messung bereits für 180 ms eine Spannung von -10 mV an
die Elektrode gelegt.
Bei der zweiten Messung wird die Verzögerungszeit δ so gewählt, dass sich das
Enzym im reduzierten Zustand befindet (Einstellung b). In diesem Fall wird
vor jeder SERRS-Messung bereits für 180 ms eine Spannung von -710 mV an
die Elektrode gelegt.
Abbildung 8.11 zeigt die erhaltenen Spektren für die beiden Parametereinstellungen a (Oxidation) und b (Reduktion).
127
Abbildung 8.10: Die Parameter der zeitaufgelösten SERRS-Messung.
Abbildung 8.11: SERRS-Spektren der down-Konfiguration für die Parametereinstellungen a (oxidiert, rot) und b (reduziert, blau).
128
Diskussion: Die beobachteten Raman-Moden von Häm a und Häm a3 erlauben die Identifikation von Spin, Oxidations- und Koordinationszustand
[107]. Zusätzlich enthalten die Cytochrom-c-Oxidase-Häm-Gruppen vom Typ
a konjugierte Vinyl- und Formyl-Substituenten. Diese erzeugen resonanzraman-aktive Streckschwingungen zwischen 1610 cm−1 und 1680 cm−1 [79].
In Abschnitt 8.2.1 wird die ν4 -Bande als ein Indikator für den Redoxzustand
des Häm c-Eisens bezeichnet. Dies trifft jedoch auch auf die Häm-Gruppen
der Cytochrom-c-Oxidase zu. Wird das Enzym reduziert, resultiert eine Verschiebung der ν4 -Bande zu kleineren Wellenzahlen [107]. Abbildung 8.7 zeigt
eine solche Verschiebung der ν4 -Bande von 1372 cm− 1 nach 1358 cm− 1. Folglich lässt sich das Enzym (beide Häm-Gruppen) über die Elektrode reduzieren
(blau) und oxidieren (rot).
Die SERRS-Spektren stimmen ziemlich gut überein mit den entsprechenden resonanten Raman-Spektren [107]. Kleine Abweichungen vom resonanten
Raman-Spektrum79 sind entweder im Bereich der Messfehler (∼ 2 cm−1 ) oder
haben ihren Ursprung im ”elektrochemischen Stark-Effekt” [104]. Der Vergleich mit dem resonanten Raman-Spektrum zeigt, dass nicht alle Strukturen
aufgelöst werden können. Dazu sind längere Messzeiten, oder das Aufaddieren mehrerer Spektren wie in [17] nötig. Das Resonanz-Raman-Spektrum
enthält zwei Häm-Gruppen in unterschiedlichen Spin- und Ligandenzuständen: Einerseits das Häm a (6cLS) und andererseits das Häm a3 (6cHS) [79].
Abbildung 8.7 zeigt ein komplexes Vibrationsspektrum. Aufgrund der unzureichenden Auflösung lassen sich nur bedingt Aussagen über den Koordinationszustand und den Spin machen. In Tabelle 8.3 sind die Moden und
Lagen der Banden für das oxidierte und reduzierte Spektrum dargestellt.
Die hier vorliegenden Spektren zeigen alle eine ν2 (a)-Mode bei ∼1585 cm−1 .
Hierbei handelt es sich um die Low-Spin-Marker Linie des Häm a. Nach [107]
befindet sich diese Bande zwischen 1584 cm−1 und 1586 cm−1 . Die ν2 (a3 )Mode bei ∼1566 cm−1 ist in den vorliegenden Spektren schwach ausgeprägt.
Dies ist die Highspin-Linie des Häm a3 , die je nach Redoxzustand zwischen
1562 cm−1 und 1569 cm−1 liegt [107].
Im oxidierten Zustand erscheint bei 1634 cm−1 die Porphyrins-Mode ν10 des
Häm a [107]. Dagegen ist die Bande bei ν11 = 1515 cm−1 ein eindeutiges
Merkmal für eine reduzierte Häm a-Gruppe [79].
79
Bei resonanten Raman-Spektren wird das Enzym nicht an eine Oberfläche angebunden, sondern in Lösung gemessen.
Mode (Häm)
ν2 (a)
ν2 (a3 )
ν4 (a,a3 )
ν10 (a)
ν11 (a)
νC=O (a)
129
CcO(-110mV) [cm−1 ] CcO(-710mV) [cm−1 ]
1585
1585
1566
1566
1372
1358
1634
1517
1647
1611
Tabelle 8.3: Moden und Lagen der Banden der Cytochrom-c-Oxidase Spektren, bei denen ein Potential von -10 mV bzw. -710 mV an die
Elektrode angelegt wird.
Eine deutliche Frequenzverschiebung erkennt man bei der νC=O -Mode. Hier
machen sich die Formyl-Streckschwingungen des Häm a bemerkbar. In der
oxidierten Form80 liegt die Bande bei 1646 cm−1 , in der reduzierten Form
dagegen bei 1611 cm−1 . Diese Frequenzverschiebung resultiert aus einer Veränderung der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Substituenten und
Gln-471 bzw. Arg-52 [79][78].
Im Gegensatz zu dem Versuch mit Cytochrom c ist hier eine wiederholte
Reduktion und Oxidation des Enzyms im selben Potentialfenster durchführbar. Dies ermöglicht die Durchführung einer zeitaufgelösten Messung (Abschnitt 2.4.2). Zur Festlegung des kleinstmöglichen Zeitfensters, bei dem eine
wiederholte Oxidation/Reduktion beobachtet werden kann, werden mehrere Messungen mit unterschiedlichen Zeitfenstern gemacht. Abbildung 8.11
zeigt eine zeitaufgelöste Messung bei einer Pulsfrequenz von 2,5 Hz. Gemessen wird am Anfang (reduzierter Fall, Abbildung 8.10 (b)) und am Ende des
Potentialpulses (oxidierten Fall, Abbildung 8.10 (a)). Man erkennt, dass es
möglich ist, das Enzym zu reduzieren und zu oxidieren.
Für eine komplette Zeitmessung müssten alle 20 Schritte durchlaufen werden.
Da die Messdauer durch die Verwendung der alten SERRS-Zelle begrenzt
war, konnten keine Zwischenschritte gemessen werden.
80
In den vorliegenden Spektren ist dies leider nur im reduzierten Zustand zu erkennen.
Dies liegt wahrscheinlich an der unzureichenden Auflösung der Spektren.
9 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK
9
9.1
130
Zusammenfassung und Ausblick
Zusammenfassung
Überprüfung des ptBLM-Aufbaus: Bei der Konstruktion eines ptBLMSystems handelt es sich um eine besonders schwierige und vor allem zeitaufwendige Probenvorbereitung. Der kleinste Fehler im Aufbau verursacht eine
Denaturierung der Proteine und damit den sofortigen Abbruch des Versuchs.
Die Aktivität der Enzyme hängt entscheidend von der Qualität der Membran
ab. Um die Zuverlässigkeit der Messergebnisse zu kontrollieren, ist mit jedem
Versuch eine Überprüfung des ptBLM-Aufbaus verknüpft.
Die Anbindung der Cytochrom-c-Oxidase (His-Tag an Untereinheit I) an
eine DTSP/DTP-Nickelchelat-NTA-modifizierte Goldelektrode ließ sich mit
der Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie zeitlich auflösen. Mit Hilfe der Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie und der elektrochemischen Impedanzspektroskopie gelang der Nachweis einer ptBLM-System Bildung. Bei der Verwendung der Cytochrom-c-Oxidase mit His-Tag an Untereinheit II (Wild-Type und Mutante N139C) erhielt man äquivalente Ergebnisse, so dass der korrekte ptBLM-Aufbau für alle drei Protein-Typen
erfolgreich überprüft werden konnte. Außerdem konnte man in allen Fällen
von einer sehr hohen Protein-Oberflächenbedeckung ausgehen.
Aktivierung der Cytochrom-c-Oxidase mit His-Tag an Untereinheit I: Die katalytische Aktivität der Cytochrom-c-Oxidase mit His-Tag
an Untereinheit I wurde sowohl mit reduziertem, als auch mit oxidiertem
Cytochrom c effektiv ”in-situ” beobachtet. Dabei handelte es sich jeweils
um einen diffusionskontrollierten Prozess. Es konnte gezeigt werden, dass
es bei dieser Konfiguration zu einem Elektronenaustausch zwischen Enzym
und Elektrode kommt. Dieser Elektronentransfer trat jedoch nur in Anwesenheit von Cytochrom c auf. Die Anbindung von Cytochrom c führt vermutlich zu einer Konformationsänderung. Dadurch kann womöglich ein Öffnen
des Elektronendurchgangsweges initialisiert werden. Der Elektronentransfer
scheint dabei über das Häm a3 stattzufinden [96]. Diese Vermutung bestätigt
sich durch resonante Raman-Untersuchungen. Hierbei zeigt sich, nach dem
Anbinden von Cytochrom c an die Cytochrom-c-Oxidase, eine Strukturveränderung in der Umgebung von Häm a und Häm a3 [108]. Außerdem ist das
katalytische Zentrum (Häm a3 /CuB ) das Redox-Centrum, dass sich im Fall
der up-Konfiguration der Elektrode am nächsten befindet. Der Mechanismus
dieses Prozesses ist jedoch bisher noch nicht verstanden.
Die Umsatzrate und das Standardpotential des ptBLM-Systems konnten in
Kombination mit der up-Konfiguration in Anwesenheit von reduziertem Cy-
131
tochrom c berechnet werden. Die Ergebnisse führen zu dem Schluss, dass sich
das Enzym ohne Funktionsverlust in das ptBLM-System einfügen lässt.
Die EIS-Potentialtitration zeigt, dass man bei der Interpretation der Ergebnisse folgende Effekte berücksichtigen muss:
• Der von den Konzentrationsunterschieden und Potentialdifferenzen zwischen Submembranraum und Membranaußenseite abhängige passive
Ionentransport.
• Der durch die enzymatischen Redoxprozesse hervorgerufene aktive Protonentransport.
• Die faradaischen Ströme, die ihren Ursprung in der Oxidation und Reduktion des Cytochrom c haben.
Dadurch erkennt man die Komplexität des verwendeten Systems. Den passiven Ionentransport kann man durch Messungen ohne Cytochrom c von den
anderen Effekten trennen. Bei der Aktivierung mit Cytochrom c treten diese
drei Effekte gleichzeitig auf.
Mutante N139C: Die cyclovoltammetrischen-Messungen zeigen, dass die
Mutante N139C bei einer Spannungsvorschubgeschwindigkeit von 100 mV/s
keine Protonen pumpt. Es besteht ein deutlicher Unterschied zwischen den
Cyclovoltammogrammen von Mutante und Wild-Type. Es ist erstaunlich,
dass der Austausch von nur einer einzigen Aminosäure derart drastische Folgen für die Funktion eines Enzyms hat.
SERRS- und TR-SERRS Messungen mit Cytochrom c und der
Cytochrom-c-Oxidase mit His-Tag an Untereinheit II: SERRS Messungen zeigten eine Absorption des Cytochrom c auf einer aufgerauhten funktionalisierten Silberoberfläche. Durch den Vergleich mit Resonanz
Raman-Spektren und Cyklovoltammogrammen wurde festgestellt, dass das
Protein bei der Adsorption sowohl seine Form als auch seine Funktion beibehält. Das Protein ließ sich durch eine Veränderung des an der Elektrode angelegten Potentials oxidieren. Eine Rückreduktion des Proteins gelang selbst
bei stark negativen Potentialen nicht.
Zeitaufgelöste Messungen waren aufgrund dieser Irreversibilität nicht durchführbar. Die Cytochrom-c-Oxidase mit His-Tag an Untereinheit II (down Konfiguration) ließ sich unter Ausschluss von Sauerstoff über die Elektrode
reduzieren und oxidieren, wie die Cyclovoltammetrie und die oberflächenverstärkte resonante Ramanspektroskopie bestätigte. Dieser Vorgang ließ sich
zudem wiederholt durchführen.
132
In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass für eine zeitaufgelöste SERRS-Messung
das Zeitfenster kleiner als 400ms gewählt werden kann. Dazu waren sehr
viele Messungen nötig, da die Lebensdauer des Enzyms aufgrund der alten
SERRS-Zelle sehr begrenzt war. Dennoch konnte der Ansatz einer Zeitauflösung nachgewiesen werden. Die Messdauer betrug 200 Sekunden. In dieser
Zeit wurde das Enzym 500 mal hintereinander reduziert und wieder reoxidiert. Die effektive Messzeit betrug dabei jedoch nur 10 Sekunden.
Die Auflösung war deshalb sehr viel schlechter als bei der Potentialtitration. Längere Messzeiten oder eine Erhöhung der Laserleistung waren jedoch
aufgrund der zur Verfügung stehenden Zelle und der auftretenden Photoreduktion nicht möglich. Ein Defekt des Ramanspektrometers machte in der
zweiten Hälfte der Diplomarbeit SERRS-Messungen unmöglich. Aus diesem
Grund wurde besonderer Wert auf eine Optimierung des Raman-Messsystems
gelegt:
Die Ausnutzung des oberflächenverstärkten Ramaneffekts erforderte eine gute Qualität der aufgerauhten Silberoberfläche. Im Verlauf der Arbeit wurde
die Technik zum Polieren der Proben geändert. Um das Signal - Rauschverhältnis der Messungen zu optimieren wurden die Proben nicht mehr von
Hand, sondern mit Hilfe einer Maschine und einer im Rahmen der Diplomarbeit speziell entwickelten Vorschrift poliert. Eine erhöhte Stabilität der Membran und damit eine längere Haltbarkeit der Proteine war das Ziel81 . Die für
die Probenpräparation verwendete Poliermethode und die Aufrauhzeit wurden durch eine Analyse von unterschiedlich aufgerauhten Oberflächen mittels
AFM und Nanoscope optimiert.
Mit der im Rahmen der Diplomarbeit neukonstruierten Messzelle erwartet
man eine wesentliche Verlängerung der Messzeit und ein deutlich verbessertes elektrisches Signal-Rausch-Verhältnis. Gerade der letztgenannte Punkt
ist hierbei von besonderer Bedeutung: Bei einer effektiven Messzeit von 10
Sekunden wird das Enzym mit hohen Geschwindigkeiten rotiert und 500 mal
hintereinander reduziert und wieder reoxidiert. Der Quecksilberkontakt in der
neu konstruierten Zelle eignet sich ideal für solche extremen Bedingungen.
9.2
Ausblick
Zeitaufgelöste SERRS- Messungen mit Cytochrom c sind aufgrund der Irreversibilität in den gemessenen Spektren nicht durchführbar. Nach [103] ist
es jedoch möglich bei geringen Salzkonzentrationen im verwendeten Puffer
ein reversibles Cytochrom c-SERRS-Spektrum zu erhalten. Damit würde der
81
Die handpolierte Probe enthielt Kratzer im µm-Bereich, die eine Ausbildung der Membran erschwerten (siehe A.6.1).
133
zeitaufgelösten Messung nichts mehr im Wege stehen.
Im Fall der up-Konfiguration konnte ein exponentieller Abfall bei hohen Scanrates mit reduziertem Cytochrom c festgestellt werden. Man ist gespannt, ob
sich mit oxidiertem Cytochrom c ein ähnliches Verhalten bei höheren Scanrates erkennen lässt. Die Ergebnisse der EIS-Potentialtitration konnten nur
qualitativ diskutiert werden. Zudem ist der Mechanismus des katalytischen
Prozesses bisher noch nicht verstanden. Messungen mit Hilfe der Ramanspektroskopie, die sehr sensitiv auf Strukturveränderungen reagiert, könnten
in Kombination mit elektrochemischen Messungen zu einer besseren Einsicht
in diese komplexen Prozesse führen.
Die Kinetik des Elektronentransfers lässt sich durch TR-SERRS Messungen mit der Cytochrom-c-Oxidase mit His-Tag an Untereinheit II (downKonfiguration) besser verstehen. Nach zeitaufgelösten Messungen ohne Sauerstoff interessieren auch zeitaufgelöste Messungen mit Spuren von Sauerstoff. Das Enzym ist dann katalytisch aktiv. Um die Auflösung der TRSERRS-Messung zu erhöhen wird man versuchen, das Zeitfenster von 400 ms
zu minimieren, was aber wiederum eine Signaloptimierung erfordert.
Die Erforschung des Protonendurchgangsweg erfordert intensive Scanratestudien der mutierten Cytochrom-c-Oxidase N139C sowohl mit, als auch ohne
Sauerstoff. Erkenntnisse über den Protonenpump-Mechanismus gewinnt man
auch durch Untersuchungen anderer Mutanten[85].
Die RDE-Voltammetrie liefert weitere Informationen über die Kinetik des
Katalyseprozesses [109]. Geplant sind Messungen mit einer rotierenden Scheiben-Elektrode (RDE: rotating disc electode). Die Arbeitselektrode rotiert
mitsamt dem ptBLM-System bei genau definierten Umdrehungszeiten. In
dieser Arbeit wurde ein neuer Messaufbau für eine geeignete Autolab-RDE
erstellt (siehe Anhang A.5).
Die Funktionsweisen anderer Membranproteine - wie zum Beispiel des Reaktionszentrums oder des bc1 -Komplexes-, lassen sich mit Hilfe des ptBLMSystems genauer studieren. Das Reaktionszentrum und der bc1 -Komplex sollen in ein ptBLM-System eingefügt und mit elektrochemischen Methoden
untersucht werden. Dadurch wird die Neugierde geweckt, in einem nächsten Schritt zu erkunden, ob sich die SERRS-Spektren von den RR-Spektren
[110][111][112][113] nicht unterscheiden.
A ANHANG
A
A.1
134
Anhang
Datenmessung und Datenauswertung
Alle Datensätze werden nach der jeweiligen Bearbeitung/Auswertung ins
Programm Origin importiert und dargestellt.
Bei allen Versuchen wird für die Potentialmessung eine Ag/AgCl,KClkonz. Referenzelektrode verwendet. Um die Spektren mit der Literatur vergleichen zu können wird das Standardpotential der Normal-Wasserstoffelektrode
(NHE) verwendet. Aus diesem Grund werden die Spektren um 200 mV ins
Positive verschoben [87].
A.1.1
Messung und Auswertung der SPR-Daten
Die Daten werden mit Hilfe eines speziell für diesen Aufbau entwickelten Programms (Wasplas) aufgenommen. Die Winkelbereiche für Spektren-Messung
an Luft und in Flüssigkeit sind in Abbildung A.1 wiedergegeben. Hierbei sollten in den beiden wichtigen Bereichen (Totalreflektion und Plasmon) möglichst viele Messpunkte aufgenommen werden. Für die Kinetiken wurde ein
Winkel von 54,5◦ (siehe Abschnitt 2.1.3) gewählt. Für Spektrenmessungen
während einer laufenden Kinetik wurde die Kinetikmessung kurz unterbrochen.
Das Programms Waspview ermöglicht eine gute Darstellung der Daten.
A ANHANG
135
Abbildung A.1: Gemessene Winkelbereiche der SPR-Spektren. Links: an
Luft. Rechts: in Lösung.
A.1.2
Messung und Auswertung der EIS-Daten
Die Daten werden mit der Software FRA (Eco Chemie, B.V.) aufgenommen. Das Programm normiert dabei die Daten automatisch auf eine Fläche
von 1 cm2 . Für alle Impedanzspektren wird ein Messintervall von 50 kHz bis
3 mHz gewählt. Die Daten werden danach mit Hilfe der Software ZView (Version 2.6) ausgewertet. Dafür wird ein komplexer nichtlinearer Fitalgorithmus
für die jeweiligen Schaltkreismodelle verwendet. Abbildung A.2 zeigt einen
mit diesem Algorithmus gefitteten Datensatz. Hierbei wird mit dem in der
Abbildung dargestellten Schaltkreis gefittet (Fitergebnis:rot). Der zum Fitten der Daten verwendete Schaltkreis und die Fitergebnisse sind in Abbildung A.2 dargestellt. Die Ergebnisse weichen kaum von den in Abschnitt
2.2.5 angegebenen Werten für einen idealen ptBLM ab. Der Grund für die
Verwendung eines CPE-Elements sind Inhomogenitäten. Bei dem in der Di-
A ANHANG
136
plomarbeit verwendeten Monolayer handelt es sich um eine Schicht aus TP
[thiobis (propionic acid] und Ni2+ -Metall-Chelat-Komplexen. Dadurch treten Inhomogenitäten auf, für die ein CPE-Element verwendet werden kann
(Abschnitt 2.2.3). In dem Schaltkreis wird dabei der Kondensator durch das
konstante Phasen-Element ersetzt. Der Wert von α = 0,84 für die verwendete funktionalisierte Elektrode liegt genau zwischen dem Wert einer ideal
porösen und einer perfekt glatten Elektrode (siehe Abschnitt 2.2.3).
Der verwendete Schaltkreis besteht außerdem aus einem parallelen RC-Glied,
das den Widerstand und die Kapazität des Proteinlayers darstellt82 . Nach der
Rekonstitution repräsentiert das RC-Glied den Widerstand und die Kapazität der Protein-Lipid-Membran.
Diese Diplomarbeit stellt nur die Fit-Ergebnisse für den Widerstand und
die Kapazität der Protein-Lipid-Membran, beziehungsweise des Proteinmonolayers dar, weil sich die restlichen Werte von der Größenordnung kaum
unterscheiden.
Abbildung A.2: Datensatz, der mit Hilfe des komplexen nichtlinearen Fitalgorithmus der Software ZView gefittet wurde. Der verwendete Schaltkreis zum Fitten symbolisiert ein ptBLM-System.
Das Schaltkreissymbol −−
+− steht für ein CPE-Element.
82
Da der Proteinlayer dicht gepackt und von Detergenzmolekülen umgeben ist, kann
man ihn näherungsweise als Membran darstellen.
A ANHANG
A.1.3
137
Messung und Auswertung der CV-Daten
In diesem Fall werden die Daten mit Hilfe der beim Autolab-Potentiostaten
mitgelieferten Software (Gpes von Eco Chemie, B.V.) ermittelt. Das Programm normiert dabei die Daten automatisch auf eine Fläche von 1 cm2 .
Falls möglich wird die in Abschnitt 2.3.3 erwähnte elektronische IR-DropKompensation durchgeführt83 .
Die Daten werden mit Hilfe der Gpes-Software ausgewertet. Für die Basislinien-Korrektur des oberen und unteren Kurvenverlaufs verwendet das Programm eine polynome Funktion (Abbildung A.3). Dadurch ist es möglich,
die kapazitive Komponente des Stroms zu subtrahieren (Abbildung A.4).
Auf Grund der Potentialauftragung gegen die Normal-Wasserstoffelektrode
werden die Spektren um 200 mV ins Positive verschoben.
Durch einen Export des Datensatzes in das Programm Origin ist es möglich
mit Hilfe eines Gauss-Fits die Höhe und die Lage der Peaks zu bestimmen.
Die Fitergebnisse sind in Abbildung A.4 integriert:
Peak
1
2
Höhe [µA]
Lage [mV]
26,62 ± 0,07 462,28 ± 0,34
−41,74 ± 0,17 387,94 ± 0,39
Tabelle A.1: Lagen und Höhen der Peaks für das gewählte Beispiel
83
Bei der elektronischen Kompensation kann es bei kleinen Scanrates zu zusätzlichen
Oszillationen kommen. Da der IR-Drop-Effekt erst bei hohen Scanrates eine wichtige Rolle
spielt, wurde die Kompensation bei Scanrates ab 1-5 V/s eingeschaltet.
A ANHANG
138
Abbildung A.3: Beispiel einer Basislinien-Korrektur mit Hilfe der Gpes Software.
A ANHANG
139
Abbildung A.4: Bestimmung der Peakhöhen und der Lage der Peaks mit Hilfe der Origin - Software.
A.1.4
Auswertung der SERRS-Daten
Um die im Experiment erhaltenen Raman-Spektren unabhängig von der Anregungswellenlänge darzustellen, werden die Intensitäten gegen die Wellenzahldifferenz aufgetragen84 .
84
Die Wellenzahldifferenzen zwischen eingestrahltem Licht und Streulicht entsprechen
den aus Schwingungsanregungen resultierenden Energiedifferenzen zwischen anregender
und gestreuter Strahlung. Demnach handelt es sich also um die relative Verschiebung
der Streustrahlung zur Anregungswellenlänge. So entspricht z.B. eine Raman-Bande von
1000 cm−1 bei einer Anregungswellenlänge von 785 nm (12738,85 cm−1 ) einer Wellenlänge
von 851,8 nm (11738,85 cm−1 ).
A ANHANG
140
Die Daten werden mit Hilfe der bei dem Spektrometer mitgelieferten LabspecSoftware erst vorbehandelt und dann ausgewertet:
Die Vorbehandlung von Spektren wird definiert als jedwede mathematische
Manipulation von Daten vor der eigentlichen Analyse. Sie wird dazu verwendet, irrelevante, zufällige oder systematische Variationsquellen zu reduzieren
oder komplett zu entfernen [114]. Allerdings werden bei der Vorbehandlung
die spektralen Informationen verändert, was entweder positive oder negative Einflüsse auf das Ergebnis haben kann. Deshalb muss immer abgewogen
werden, ob die positiven oder negativen Einflüsse bei der Vorbehandlung von
Spektren überwiegen [114].
Die in dieser Diplomarbeit verwendeten Vorbehandlungen sind:
• Basislinienkorrektur: Für die Basislinienkorrektur gibt es mehrere
Methoden. Die einfachste Möglichkeit ist, einen konstanten Offset vom
Spektrum abzuziehen. Eine weitere Möglichkeit besteht in der Subtraktion einer Geraden. Diese Methode wird in dieser Arbeit verwendet und
ist in Abbildung A.5 (b) dargestellt.
• Entfernen von Spikes: Da geladene Teilchen (z.B.: Myonen) ein Signal in der CCD auslösen können, werden die Spektren zusätzlich von
”Spikes” (Spitzen) befreit (Abbildung A.5 (c)).
• Glätten der Spektren: Glättungsmethoden werden zur Reduktion
des willkürliche auftretenden Rauschens verwendet, mit dem Ziel das
Signal/Rausch-Verhältnis zu verbessern. Die grundlegende Annahme
dabei ist, dass das Rauschen eine höhere Frequenz besitzt als das beobachtete Signal. Es gibt mehrere Verfahren zum Glätten von Spektren.
Ein falsch gewähltes Verfahren, bzw. ein zu hoher Glättungsfaktor kann
die Situation im Spektrum verfälschen. In dieser Dimplomarbeit wird
die Methode des gleitenden Durchschnitts verwendet. Dabei wird ein
Fenster von n Punkten benutzt, um aus ihnen den Mittelwert zu berechnen (Abbildung A.5 (d)).
A ANHANG
141
Abbildung A.5: Die in dieser Diplomarbeit durchgeführte Vorbehandlung der
Ramanspektren.
A ANHANG
A.2
Material
A.2.1
Lösungen
142
Folgende Lösungen wurden für diese Diplomarbeit selbst hergestellt:
• ANTA-Lösung: Die ANTA-Lösung besteht aus MilliQ-Wasser, in dem
0,15 M ANTA und 0,5 M Kaliumcarbonat gelöst sind. Die Lösung wird
mit Hilfe von Kaliumhydroxid auf pH 9.8 titriert.
• Cytochrom c-Lösung (oxidiert): Hierbei werden 50 mg Cytochrom
c in 1ml PBS-Puffer gelöst. Das verwendete Cytochrom c enthält weniger als 5% reduziertes Cytochrom c. Ein chemisches Oxidieren wird
daher nicht benötigt.
• Cytochrom c-Lösung (reduziert): Hierbei werden 50 mg Cytochrom
c in 1 ml PBS-Puffer gelöst und danach mit Natriumdithionit reduziert. Nach der Verwendung von Sephadex-Entsalzungssäulen erhält
man dann eine salzfreie Lösung mit reduziertem Cytochrom c.
• DDM-Lösung: Die DDM-Lösung besteht aus PBS-Puffer und DDM
(1 mg/ml)
• DTSP-DTP-Lösung: DTSP und DTP werden im Verhältnis 60:40 in
trockenem DMSO (2 mg DTSP/ml) gelöst85 .
• DTP-Lösung: Hierfür wird DTP in DMSO (1,33 mg DTP/ml) gelöst.
• Hellmanex-Lösung: Diese Lösung wird mit Hilfe von MilliQ-Wasser
und Hellmanex II (20 µl/ml) hergestellt.
• Lipid-Lösung: Die Lipid-Lösung (eigentlich eine Suspension) besteht
aus DDM-Lösung in der DiPhyPC (0,01 mg/ml) gelöst ist. Da das Lipid
einige Zeit benötigt, um sich gut zu verteilen, wird diese Suspension 24
Stunden vor Gebrauch hergestellt, mit Hilfe eines Reagenzglasschüttlers
gemischt (10 Minuten) und dann ins Ultraschallbad (1 Stunde) gestellt.
• Nickellösung: Die Nickellösung besteht aus Nickel(II)-chlorid (40 mM),
Essigsäure (50 mM) und MilliQ-Wasser. Sie wird mit Kaliumhydroxid
auf pH 5.5 titriert.
85
Unsere Gruppe hat herausgefunden, dass sich diese DTSP-DTP-Konzentration als
ideal erweist [115].
A ANHANG
143
• PBS-Puffer: Der in der Diplomarbeit verwendete PBS-Puffer86 enthält Kaliumphosphat (0.1 M), Kaliumchlorid (0.05 M) und MilliQ-Wasser. Er wird mit Hilfe von Salzsäure auf pH 8 titriert.
• Sauerstoffzehrsystem: Das Sauerstoffzehrsystem besteht aus PBSPuffer in dem die drei Komponenten Glukose (3 mg/ml), Glukose-Oxidase (75 µg/ml) und Katalase (12,5 µ/ml) gelöst sind [116]. Das Prinzip
dieses Systems wird im folgenden dargestellt:
Glukose-Oxidase
Glukose + O2 + H2 O −−−−−−−−−→ Glukonsäure + H2 O2
Katalase
2H2 O2 −−−−−→ 2H2 O + O2
• Schwefelsäurebad: Hierfür wird konzentrierte Schwefelsäure verwendet. Zur Aktivierung wird 0,1 mg/ml Ammoniumperoxodisulfat verwendet.
A.2.2
Chemikalien und Materialien
Die verwendeten Chemikalien stammen hauptsächlich von den Firmen SigmaAldrich und Fluka Chemie GmbH. Der Hersteller steht in der folgenden Auflistung in eckigen Klammern. An erster Stelle steht die an manchen Stellen
der Diplomarbeit verwendete Abkürzung, gefolgt von dem Namen der Substanz:
• Ammoniak (NH3 ): 32% ig [WTL Laborbedarf GmbH]
• Ammoniumperoxodisulfat (H8 N2 O8 S2 ) [Fluka]
• ANTA: Nα! ,Nα!! -bis(carboxymethyl)-L-lysine (C10 H18 N2 O6 ) [Fluka]
• Argon mit Reinheitsgrad 6.0 [Westfalen AG in Münster]
• Biobeads SM-2 adsorbent 20-50 mesh [Bio-Rad Laboratories, Inc.]
• Cytochrom c: Rinderherz [Sigma]
• Die Cytochrom-c-Oxidase (down-konfiguration87 von Rhodobacter sphaeroides) und die Cytochrom-c-Oxidase (Mutante N139C, down-Konfiguration von Rhodobacter sphaeroides) wurden geliefert von Robert
B. Gennis, Department of Biochemistry, University of Illinois
86
PBS (phosphate buffered saline) ist eine Abkürzung für salzartigen Phosphatpuffer
und damit ein wenig informative Bezeichnung.
87
Der His-Tag befindet sich an der Untereinheit 2
A ANHANG
144
• Die Cytochrom-c-Oxidase (up-Konfiguration88 from Paracoccus denitrificans) wurde geliefert von Bernd Ludwig University of Frankfurt
• DDM: n-Dodecyl-β-D-maltoside [Sigma]
• DiphyPC: 1,2 Diphytanoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine [Avanti Polar
Lipids, Inc]
• DMSO: Dimethylsulfoxid [Acros Organics]
• DTP: dithiobis (propionic acid) [Sigma]
• DTSP: dithiobis (N-succinimidyl propionate) [Sigma]
• Essigsäure (C2 H4 O2 ) [Fluka]
• Ethanol (C2 H6 O): absolut Ethanol [Sigma]
• Gleitringdichtung, bestehend aus zwei Teilen: 921-0100-R-SSE-G4 und
REP-T-999 [technico vertriebsges. mbH + Co. KG]
• Glucose Oxidase: Type VII von Asperigillus niger (Schwarzschimmel)
[Sigma]
• Glukose: D-(+)-Glucose [Sigma]
• Gold : Feingoldgranulat 99,99% [ESG Edelmetall Service GmbH&Co.
K]
• Hellmanex II [Hellma]
• Immersionsöl [Cargille Laboratories, Inc.]
• Kaliumchlorid (KCl) [Sigma]
• Kaliumcarbonat (K2 CO3 ) [Sigma]
• Kaliumhydroxid (KOH) 85%ig [WTL Laborbedarf]
• Kaliumphosphat (K2 HPO4 :) [Fluka]
• Katalase von der Rinderleber [Sigma]
• Kleber: TSG EPO-TEK, 2 Komponentenkleber (Verhältnis 1:10) [Polytec]
88
Der His-Tag befindet sich an der Untereinheit 1
A ANHANG
145
• Kleber: Leitender Kleber, nach Erhitzung von 180◦ für eine Minute erhält man einen Durchgangswiderstand von 0.00005 Ω cm/cm3 und eine
Scherfestigkeit von 0.091 N/cm2 [Electrade GmbH]
• Kugellager [GRW Miniaturkugellager Germany]
• Natriumdithionit (Na2 S2 O4 ) [Fluka]
• Nickel(II)-chlorid Hexahydrat (NiCl2 *6H2 O) [Fluka]
• Objektträger: BK7 mit Brechungsindex n=1,5 [Menzel-Gläser]
• Objektträger: LaSFN-9 mit Brechungsindex n=1,845 [Hellma]
• O-Ringe: Chemraz-O-Ringe (Dicke: 1,5 mm, innen = 10 mm) aus Perfluorelastomeren mit hoher chemischer Beständigkeit [Green Tweed]
• Platindraht: ø= 1,0 mm und Reinheitsgrad: 99,99% [Chempur]
• Platindraht: ø= 0,1 mm und Reinheitsgrad: 99,99% [Chempur]
• Plexiglas [Cadillac Plastic’s]
• Poliertuch: Chemomet I [Buehler]
• Poliertuch: SiC Grinding paper for metallography wet or dry Grit P
600 [Buehler]
• Poliertuch: SiC Grinding paper for metallography wet or dry Grit P
1200 [Buehler]
• Prisma LaSFN-9 mit Brechungsindex n=1,845 [Spindler&Hoyer]
• Salzsäure (HCl) 37% ig [WTL Laborbedarf]
• Schwefelsäure (H2 SO4 ) [Acros Organics]
• Sephadex G-25 Medium PD-10 Entsalzungssäule [GE Healthcare]
• Silberdraht:ø= 1,0 mm und Reinheitsgrad 99,99% [Chempur]
• Silberstab: ø= 10 mm und Reinheitsgrad 99,99%
• Siliziumwafer-Spezialanfertigung [CrysTec GmbH]
• Stickstoff (flüssig) und Dewargefäß für Transport [Air Liquide]
• Stickstoff mit Reinheitsgrad 4 [Westfalen AG in Münster]
A ANHANG
146
• Teflon [Cadillac Plastic’s]
• Wasserstoffperoxid (H2 O2 ): 35% ig [Sigma]
• Zahnflachriemen mit Zahnriemenscheiben [Rheinwerkzeug KG]
A.2.3
Geräte
In der folgenden Auflistung befinden sich die verwendeten Geräte. An erster
Stelle steht der in der Diplomarbeit verwendete Begriff, gefolgt von dem
verwendeten Modell. In eckigen Klammern steht der Hersteller:
• AOM (Akustooptischer Modulator): MT200/A0.5, 400 nm [Opto - Elektronik]
• Aufdampfanlage: fl 400 mit auto 306 [Edwards]
• Autolab: Autolab Instrument (PGSTAT302) ausgestattet mit einem
FRA2-Modul für Impedanzmessungen, einem ECD-Modul-Verstärker
für niedrige Ströme, einem ADC750 Modul für schnelle Skanmessungen
und einem SCAN-GEN Modul [Eco Chemie, B.V.]
• Blaspistole: Elektra Beckum BP 200 [Metabo]
• Chopper: 197 [EG&G]
• Fünf-Phasen-Schrittmotor [Huber]
• Funktionsgenerator: 33250A 80 MHz [Agilent Technologies]
• Galvanisierungseinheit [Labor Elektronik]
• Immersionsobjektiv: Lumplfl100xw/1,00 [Olympus]
• Laser (λ=413,1 nm): Innova 90 K [Coherent]
• Laser (λ=632,8 nm): 1105P [JDS Uniphase]
• Lock-In Verstärker: 5210 [EG&G]
• Magnetrührer: MR 3001 K [Heidolph]
• Monocromator: LaserspecIII [Spectrolab]
• Motor (1,2 mNm Dauerdrehmoment): 1319T012S in Kombination mit
Getriebe: 141 (Übersetzung 14:1) [Faulhaber]
A ANHANG
147
• Motor (16 mNm Dauerdrehmoment): 2342S01C R in Kombination mit
Getriebe: 231 (Übersetzung 3.71:1) [Faulhaber]
• Nanofocus: NanoFocus µsurf confocal microscope kombiniert mit 100x
Objektiv [Nanoscope]
• Oszilloskop: 9354AM [Le croy]
• pH-Meter: pH-Meter 766 Calimatic [Knick]
• Polarisator [Fa. Halle]
• Poliermaschine: Phoenix 4000 in Kombination mit Probenhalter und
Nivellierscheibe: 160 MM DMR [Buehler]
• Raman Spektrometer: LabRam, HR800 [HORIBA Jobin Yvon] in Kombination mit einem Symphonie CCD Detektor [HORIBA Jobin Yvon],
einem Mikroskop: BX41 dimensions [Olympus] und einem Notchfilter: Holographic Notch-PlusT M Filter-413,0-1,0 [Kaiser optical systems,
Inc.]
• RDE (rotating disc electrode): Autolab, type RDE [Eco Chemie, B.V.]
• Rasterkraftmikroskop: AFM (Atomic Force Microscope) Dimension 3100
CL Olympus89 [Veeco]
• Reagenzglasschüttler: Reax 2000 [Heidolph Instruments GmbH]
• Ultraschallbad: Super RK510 H [Sonorex]
• Zweikreisgoniometer [Huber]
89
Bei den Messungen wurden folgenden Parameter verwendet: non-contact mode
OMCL-AC160TS-W2, K = 42 N/m, Range: 33.5 - 94.1 N/m, F0 = 300 kHz, Range: 278 389 kHz.
A ANHANG
A.3
148
Rotations-Raman-Effekt
Analog zum Vibrations-Raman-Effekt ändert sich auch die Polarisierbarkeit
durch die Molekülrotation [64]. Die Quantisierung der Rotationsniveaus erfolgt üblicherweise mit der Rotationsquantenzahl J. Auf eine eingehende Darstellung, insbesondere zu den Auswahlregeln, wird hier verzichtet. Anhand
der Termschema-Darstellung (Abbildung A.6) ist die Lage der Rotationslinien im Spektrum beschreibbar. Die Rotations-Raman-Linien sind um die
Vibrationslinie und Rayleigh-Linie angeordnet. Die Intensität ist wesentlich
schwächer und aufgrund der geringen Energiedifferenz der Rotationsniveaus
ist zur Detektion eine hohe spektrale Ausflösung nötig.
Abbildung A.6: Der Rotationsramaneffekt.
A ANHANG
A.4
149
Konstruktionszeichnung der neuen SERRS-Zelle
Abbildung A.7: Konstruktionszeichnung der neuen SERRS-Zelle. Die Längenangaben sind in Millimeter.
A.5
Versuchsaufbau für eine RDE-Messung
Hierfür werden die mit Gold bedampften Si-Wafer nicht auf eine Glasplatte,
sondern auf einen Bleizylinder (ø= 10 mm) mit eingebautem Gewinde geklebt. Nach dem Entfernen des Si-Wafers wird der Zylinder auf einen Stahlstab des gleichen Durchmessers geschraubt. Der Stab besitzt ein weiteres
Gewinde, mit dem er sich an eine Autolab-RDE befestigen lässt. Damit sich
ausschließlich die Goldschicht als leitendes Material in der Lösung befindet,
wird ein Teflonzylinder über die Probe gestülpt (siehe Abbildung A.8). Um
die Arbeitselektrode (Autolab RDE) mit der Goldschicht zu kontaktieren
A ANHANG
150
wird ein speziell leitender Kleber mit geringem Widerstand (Durchgangswiderstand = 0.00005 Ω cm/cm3 ) verwendet. Die Funktionalisierung der Elektrode kann auch in diesem Fall außerhalb des Gefäßes stattfinden. Sowohl die
Autolab-RDE als auch Referenz und Gegenelektrode werden, wie auch bei
den anderen Messungen an einen Autolab-Potentiostaten angeschlossen.
Abbildung A.8: Messaufbau der rotierenden Scheiben-Elektrode.
A ANHANG
A.6
A.6.1
151
Polieren und Aufrauhen der Silberelektroden
Polieren der Silberelektroden
Das Polieren der Silberelektrode wurde am Anfang der Diplomarbeit noch
von Hand gemacht. Hierzu kam ein Poliertuch (SiC Grinding paper for metallography wet or dry Grit P 600) in Kombination mit Ethanol zum Einsatz.
Der Unterschied zwischen einer handpolierten und einer maschinenpolierten
(Poliervorschrift siehe Abschnitt 6.2) Probe ist in Abbildung A.9 zu sehen.
Die tiefen Krater der handpolierten Probe können die Bildung einer stabilen
Membran verhindern.
Abbildung A.9: Nanofokusbild: Unterschied zwischen einer handpolierten
(links) und einer maschinenpolierten Probe (rechts).
A.6.2
Neu entwickelte Poliervorschrift
Bei Stewart’s Methode für Edelmetalle wird nach der Politur mit Siliziumcarbit (SiC) Diamantpaste als Poliermittel verwendet. Bei der Präparation
mit Diamantpasten können sich jedoch Diamantkörner in die Silberelektroden eindrücken. Deshalb poliert man stattdessen mit unterschiedlich groben
Aluminiumoxidsuspensionen (Tonerde). Die Tonerde ist weniger aggressiv
und kann durch den hohen Anteil der Oxidpartikel die meisten Kratzer beseitigen. Nach dem Polieren werden die Silberelektroden zum Entfernen der
Schleifpartikel in ein Ultraschallbad gestellt. Abbildung A.10 zeigt ein Bild
(Nanofokus), bei dem man eine starke Erhöhung erkennen kann. Vermutlich
A ANHANG
152
handelt es sich dabei um einen Schleifpartikel, der sich in die Oberfläche eingedrückt hat.
Abbildung A.10: Nanofokusbild der polierten Silberelektrode.
A.6.3
AFM-Bilder der polierten und chemisch aufgerauten Silberelektroden
In den folgenden Abbildungen sind die Höhen- und Phasenbilder der AFMMessung zu sehen. Zusätzlich wurde für jede Probe eine Sektionsanalyse
(5x5µm-Fläche) gemacht. Bei der polierten Probe erkennt man immer noch
viele kleinere Kratzer, die jedoch durch das elektrochemische Aufrauhen entfernt werden:
A ANHANG
Abbildung A.11: AFM-Bild der polierten Silberelektrode.
153
A ANHANG
154
Abbildung A.12: AFM-Bild der aufgerauhten (20/5/5) Silberelektrode.
A ANHANG
155
A ANHANG
156
B GLOSSAR
B
157
Glossar
• ADP: Adenosine diphosphate
• ATP: Adenosine triphosphate
• AgCl: Silberchlorid
• AFM: Atomic force microscopy (Rasterkraftmikroskop)
• AOM: Akusto-optischer Modulator
• CCD: Charge-coupled device
• CcO: Cytochrom-c-Oxidase
• CV: Cyclovoltammetrie/Cyclovoltammogramm
• Cyt c: Cytochrom c
• EIS: elektrochemische Impedanzspektroskopie
• NHE: Normal hydrogen electrode (Normal-Wasserstoff-Elektrode)
• ptBLM: Protein-tethered bilayer lipid membrane (Protein verankerte Lipiddoppelschichtmembranen)
• pH: pondus Hydrogenii/ -lg[H3 O+ ]
• pH-Wert: der mit -1 multiplizierte Zehner-Logarithmus der Aktivität der
Oxoniumionen (H3 O+ )
• RDE: Rotierende Disk-Elektrode
• RR: Resonance Raman
• RPM: Rotations per minute
• SAM: Self-assembled monolayer (selbstorganisierende Monoschicht)
• SERS: surface enhanced raman spectroscopy
• SERRS: surface enhanced resonance raman spectroscopy
• SPR: surface plasmon resonance
• tBLM Tethered bilayer lipid membrane (verankerte Lipiddoppelschichtmembranen)
• TR-SERRS: time-resolved surface enhanced resonance raman spectroscopy
• ø: Durchmesser
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
158
Abbildungsverzeichnis
1.1
1.2
Die Atmungskette. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Die mitochondrale Atmungskette und ihre Lokalisation im Mitochondrium. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3 Die Röntgenstruktur des Cytochrom c (Rinderherz) mit Häm - Gruppe. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.4 Die Röntgenstruktur des Cytochrom c (Rinderherz) mit Häm - Gruppe und Liganden. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.5 Die Röntgenstruktur der Cytochrom-c-Oxidase von Paracoccus denitrificans und ihre redox-aktiven Metallzentren. Das binukleare CuA Zentrum befindet sich in Untereinheit II (gelb). Die Redoxzentren
Häm a, Häm a3 und CuB sind dagegen in Untereinheit I (grün). . .
1.6 Vergrößerung der Cytochrom-c-Oxidase-Redox-Zentren von Paracoccus denitrificans mit den entsprechenden Liganden. Die Seitenketten von Häm a enthalten unter anderem Vinyl - Gruppen (CH=CH2 ), Formyl - Gruppen (-CH=O) und eine Farnesyl - Gruppe
(-CHOH(-CH2 CH2 CH=CCH3 )3 -CH3 ). . . . . . . . . . . . . . . . .
1.7 Protonenwege in der Cytochrom-c-Oxidase von Paracoccus denitrificans. Der K-Weg der CcO führt über Lys-354 und Thr-351 zur
Hydroxyl-Gruppe von Tyr-280 am katalytischen Zentrum. Der DWeg führt über Asp-124 über eine Reihe von Aminosäuren zu Glu278 und von dort aus weiter ins katalytische Zentrum. Die Untereinheiten III und IV wurden aus Gründen der Übersichtlichkeit weggelassen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.8 Das Modell des konventionellen katalytischen Cytochrom-c-OxidaseZyklus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.9 Immobilisierung eines Proteins mit Hilfe der His-Tag-Technologie. .
1.10 Die zwei unterschiedlichen Konfigurationsmöglichkeiten der uns zur
Verfügung stehenden Cytochrom-c-Oxidase. Der His-Tag und die
Verankerung an die Metalloberfläche sind vergrößert dargestellt. Links
im Bild: Das Enzym mit His-Tag an Untereinheit II (orange). Rechts
im Bild: Das Enzym mit His-Tag an Untereinheit I (rot). Die Untereinheiten III und IV sind gelb bzw. schwarz dargestellt. . . . . .
2.1 Die Feldverteilung eines Oberflächenplasmons senkrecht zur Grenzfläche. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2 Das Verhältnis von Wellenvektoren eines aus dem Dielektrikum einfallenden Photons und eines Oberflächenplasmons. . . . . . . . . .
2.3 Die Prismenkopplung nach der Kretschmann-Konfiguration. . . . .
2.4 Links: Änderung der Dispersionsrelation des Oberflächenplasmons
durch Anlagerung einer dielektrischen Schicht. Rechts: Resultierende
Verschiebung des Anregungswinkels im Winkelspektrum. . . . . . .
2.5 Erläuterung der Kinetikmessung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
4
5
6
8
9
10
11
13
14
20
23
24
25
26
2.6
2.7
2.8
2.9
2.10
2.11
2.12
2.13
2.14
2.15
2.16
2.17
2.18
2.19
2.20
2.21
2.22
3.1
3.2
3.3
3.4
159
Die Impedanz in der komplexen Gaußschen Zahlenebene. . . . . . . 29
Strom- und Spannungs-Liniendiagramm für Widerstand und Kondensator. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Frequenzreduzierter Admittanz-, Nyquist- und Bode-Plot für einen
reinen Widerstand (rot: 50 kΩ und blau: 100 kΩ). . . . . . . . . . . 34
Frequenzreduzierter Admittanz-, Nyquist- und Bode-Plot für einen
Kondensator (rot: 5µF und blau: 50µF). . . . . . . . . . . . . . . . 36
Frequenzreduzierter Admittanz-, Nyquist- und Bode-Plot für eine
Parallelschaltung aus Kondensator und Widerstand. . . . . . . . . 38
Frequenzreduzierter Admittanz-, Nyquist- und Bode-Plot für eine
Reihenschaltung aus Kondensator und Widerstand. . . . . . . . . . 40
Frequenzreduzierter Admittanz-, Bode- und Nyquist-Plot eines idealen Monolayer-Ersatzschaltkreises. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
Frequenzreduzierter Admittanz-, Bode- und Nyquist-Plot eines idealen ptBLM-Ersatzschaltkreises. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
(a) „Dreiecksform“ des angelegten Potentials als Funktion der Zeit.
(b) Strom-/Zeit-Kennlinie einer Messlösung, die eine oxidierte und
eine reduzierte Form einer Redox-Spezies enthält. (c) Cylovoltammogramm dieser Messlösung. Ea : anodisches Spitzenpotential; Ec :
kathodisches Spitzenpotential; E1 und E2 : Umkehrpotentiale; Ia und
Ic : anodischer bzw. kathodischer Spitzenstrom. . . . . . . . . . . . 45
Schematisches Cyclovoltammogramm einer ideal oberflächengebundenen Redoxspezies. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
Cyclovoltammogramm (a) ohne und (b) mit IR-Drop. . . . . . . . 53
Das Prinzip der zeitaufgelösten Messmethode. . . . . . . . . . . . . 55
Die Energieniveaus bei der elastischen und inelastischen Streuung.
57
Erläuterung des resonanten Ramaneffekts. . . . . . . . . . . . . . . 61
Porphyringerüst eines D4h - Metalloporphyrins mit den Substituenten X und Y. Die zu unterscheidenden Kohlenstoffatome sind mit α,
β und m gekennzeichnet. M steht für das zentrale Metallatom und
N für ein Stickstoffatom. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
Absorptionspektrum von Cytochrom c mit der schematischen Darstellung des 4-Orbital-Modells. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
Illustration der dominanten Moden für Metalloporphyrine im MarkerBanden-Bereich, bezogen auf Abbildung 2.20. . . . . . . . . . . . . 65
Die Herstellung einer TSG-Elektrode. . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
Die Funktionalisierung der TSG-Elektrode. . . . . . . . . . . . . . 68
Die Herstellung einer ptBLM-Probe. In diesem Fall ist die Cytochromc-Oxidase mit His-Tag an Untereinheit I (rot) verwendet worden.
Die Untereinheiten II, III und IV sind in orange, gelb und schwarz
dargestellt. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
Die Dialyse. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
3.5
3.6
3.7
4.1
4.2
4.3
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
Die Architektur einer ptBLM-Probe, bei der als Protein die Cytochrom-c-Oxidase mit His-Tag an Untereinheit I verwendet worden
ist. Die horizontalen Längenangaben beziehen sich auf den Teil des
Enzyms, der aus dem Bilayer in die Lösung weist. Die funktionalisierte Elektrode ist vergrößert abgebildet. . . . . . . . . . . . . . .
Die zwei unterschiedlichen Konfigurationsmöglichkeiten der uns zur
Verfügung stehenden Cytochrom-c-Oxidase. Links im Bild: Das Enzym mit His-Tag an Untereinheit II. Aktivierbar durch direkten
Elektronentransfer. Rechts im Bild: Das Enzym mit His-Tag an Untereinheit I. Aktivierbar durch Cytochrom c (grün). Die Untereinheiten III und IV sind gelb bzw. schwarz dargestellt. . . . . . . . .
Die Cytochrom-c-Oxidase N139C. Dargestellt sind nur die Untereinheiten I (rot) und II (orange). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Der Messaufbau für SPR, EIS und CV. . . . . . . . . . . . . . . . .
Das Zelldesign der SPR-Zelle und der Einbau in den Reiter. . . . .
Komplette Messzelle mit Halterung (Reiter) und den Anschlüssen
für die Elektroden bzw. dem Ein- und Auslass für den Lösungsaustausch. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Kinetikmessung zur Überprüfung des ptBLM-Aufbaus. Die dazugehörigen SPR-Spektren wurden an Luft (schwarz), vor (rot) und nach
(blau) der Anbindung, sowie vor (orange) und nach (grün) dem PBSSpülen aufgenommen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Überprüfung des ptBLM-Aufbaus mit Hilfe der EIS. Oben: BodePlot. Unten: frequenzreduzierter Admittanz- und Nyquist-Plot. Die
Messpunkte sind in dieser Darstellung miteinander verbunden. . . .
Aktivierung der Cytochrom-c-Oxidase durch reduziertes Cytochrom
c. Links oben: Bode-Plot. Unten: Nyquist- und frequenzreduzierter
Admittanz-Plot. Die Messpunkte sind in dieser Darstellung miteinander verbunden. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Widerstand des ptBLM-Systems aufgetragen gegen die Konzentration des reduzierten Cytochrom c. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Scan-Raten-Studie (schwarz: 10 mV/s, rot: 50 mV/s, orange: 100 mV/s,
blau: 500 mV/s, cyan: 900 mV/s) mit oxidiertem (links) und chemisch reduziertem (rechts) Cytochrom c in Kombination mit der ptBLM immobilisierten Cytochrom-c-Oxidase in der up-Konfiguration.
Der Randles–Sevcik Plot für oxidiertes (grün, schwarz) und reduziertes (rot) Cytochrom c mit (rot, grün) und ohne (schwarz) Cytochromc-Oxidase in der up-Konfiguration. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Peakpotentiale als Funktion der Scan-Rate (Trumpet-Plot) des reduzierten Cytochrom c in Kombination mit der up-Konfiguration. .
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5.11
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8.2
8.3
50 mV/s Cyclovoltammogramm von oxidiertem (links) und reduziertem (rechts) Cytochrom c [1 mMol/l] in Kombination mit der
Cytochrom-c-Oxidase in der up-Konfiguration (mit und ohne Sauerstoff). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ergebnisse der Potentialtitration für eine 1, 82 · 10−4 molare Cytochrom c-Lösung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Potentialtitration: Auftragung Widerstand gegen Konzentration ergibt bei allen Potentialen den erwarteten exponentiellen Abfall. Die
Messpunkte sind in dieser Darstellung miteinander verbunden. . . .
Potentialtitration: Auftragung Widerstand gegen Potential. Der mögliche Kurvenverlauf ist in dieser Darstellung integriert. . . . . . . .
Cyclovoltammogramme (Scan-Rate von 10 mV/s) von der Cytochromc-Oxidase in der down-Konfiguration mit (rot) und ohne Sauerstoff
(schwarz) und von der Cytochrom-c-Oxidase in der up-Konfiguration
(blau). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Cyclovoltammogramme der Mutante N139C und des Wild-Typ in
Gegenwart (links, Scan-Rate: 10 mV/s) und Abwesenheit (rechts,
Scan-Rate: 100 mV/s) von Sauerstoff. . . . . . . . . . . . . . . . . .
Funktionalisierung der Silberelektrode durch einen SAM (Self Assembling Monolayer). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Die Cytochrom-c-Oxidase in der down-Konfiguration, angebunden
auf einer aufgerauhten Silberelektrode. . . . . . . . . . . . . . . . .
Der Messaufbau für potentiostatische SERRS-Messungen. . . . . .
Der erweiterte Messaufbau für zeitaufgelöste SERRS-Messungen. .
Das Zelldesign der alten Messzelle. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bild der alten Messzelle ohne Objektiv und Tefloneinsatz. . . . . .
Das Zelldesign der neuen Messzelle. Der Deckel mit Objektiv, Referenz- und Gegenelektrode ist nicht eingezeichnet. . . . . . . . . . .
Querschnitt der neuen Messzelle. Der Deckel mit Objektiv, Referenzund Gegenelektrode ist nicht eingezeichnet. Der herausnehmbare Zylinder (cyan) besteht aus Teflon. Der Einsatz besteht aus Teflon
(weiß) und Plexiglas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Elektrochemisches Aufrauhen der Silberelektroden. . . . . . . . . .
AFM-Bilder der unterschiedlich aufgerauhten Silberelektroden. (a)
keine Aufrauhung, (b) Aufrauhung mit 20/5/5, (c) 70/20/20, (d)
210/60/60. Die Höhenskala geht bei allen vier Bildern von 0 nm bis
200 nm. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Nanoscope-Bilder der unterschiedlich aufgerauhten Silberelektroden.
(a) keine Aufrauhung, (b) Aufrauhung mit 20/5/5, (c) 70/20/20, (d)
210/60/60. Die unterschiedlichen Höhenskalen sind in dem jeweiligen
Bild eingezeichnet. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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SERRS-Spektren von oxidiertem (rot) und chemisch reduziertem
(blau) Cytochrom c. Die Messungen werden mit einer DTP - modifizierten Silberoberfläche durchgeführt. . . . . . . . . . . . . . . . .
8.5 Potentialtitration des Cytochrom c ((a) 40 mV, (b) 90 mV , (c) 140 mV,
(d) 240 mV, (e) 350 mV). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.6 Rücktitration des Cytochrom c ((a) 350 mV, (b) 190 mV, (c) 90 mV,
(d) -110 mV, (e) -210 mV, (f) -310 mV, (g) -410 mV, (h) -510 mV). .
8.7 Potentialtitration der Cytochrom-c-Oxidase ((a)-710 mV, (b)-610 mV,
(c)-510 mV, (d)-410 mV, (e)-310 mV, (f)-210 mV, (g)-110 mV). . . .
8.8 Die zu den Peaks gehörenden Moden für die oxidierten (rot: -110 mV)
und reduzierten Spektren (blau: -710 mV). . . . . . . . . . . . . . .
8.9 Wiederholte Oxidation (rot und schwarz: -110 mV) und Reduktion
(blau: -710 mV) der Cytochrom-c-Oxidase. . . . . . . . . . . . . . .
8.10 Die Parameter der zeitaufgelösten SERRS-Messung. . . . . . . . .
8.11 SERRS-Spektren der down-Konfiguration für die Parametereinstellungen a (oxidiert, rot) und b (reduziert, blau). . . . . . . . . . . .
A.1 Gemessene Winkelbereiche der SPR-Spektren. Links: an Luft. Rechts:
in Lösung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A.2 Datensatz, der mit Hilfe des komplexen nichtlinearen Fitalgorithmus
der Software ZView gefittet wurde. Der verwendete Schaltkreis zum
Fitten symbolisiert ein ptBLM-System. Das Schaltkreissymbol −
−
+−
steht für ein CPE-Element. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A.3 Beispiel einer Basislinien-Korrektur mit Hilfe der Gpes - Software.
A.4 Bestimmung der Peakhöhen und der Lage der Peaks mit Hilfe der
Origin - Software. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A.5 Die in dieser Diplomarbeit durchgeführte Vorbehandlung der Ramanspektren. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A.6 Der Rotationsramaneffekt. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A.7 Konstruktionszeichnung der neuen SERRS-Zelle. Die Längenangaben sind in Millimeter. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A.8 Messaufbau der rotierenden Scheiben-Elektrode. . . . . . . . . . . .
A.9 Nanofokusbild: Unterschied zwischen einer handpolierten (links) und
einer maschinenpolierten Probe (rechts). . . . . . . . . . . . . . . .
A.10 Nanofokusbild der polierten Silberelektrode. . . . . . . . . . . . . .
A.11 AFM-Bild der polierten Silberelektrode. . . . . . . . . . . . . . . .
A.12 AFM-Bild der aufgerauhten (20/5/5) Silberelektrode. . . . . . . . .
A.13 AFM-Bild der aufgerauhten (70/20/20) Silberelektrode. . . . . . .
A.14 AFM-Bild der aufgerauhten (210/60/60) Silberelektrode. . . . . . .
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TABELLENVERZEICHNIS
163
Tabellenverzeichnis
5.1
Fit-Ergebnisse der EIS-Messung zur Überprüfung des ptBLM - Aufbaus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2 Fit-Ergebnisse des linearen Fits für den Randles–Sevcik Plot. . . .
5.3 Fit-Ergebniss des Trumpet-Plots. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.1 Poliervorschrift für Ag-Elektroden . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.2 Protokoll zum Aufrauhen der Ag-Elektroden mit (70/20/20). . . .
8.1 Ergebnisse der AFM und Nanoscope-Daten. . . . . . . . . . . . . .
8.2 Moden und Lagen der Banden sowohl für Spektren mit oxidiertem
und reduziertem Cytochrom c, als auch für Spektren mit Cytochrom
c, bei denen ein Potential von 40 mV bzw. 350 mV an die Elektrode
angelegt wird. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8.3 Moden und Lagen der Banden der Cytochrom-c-Oxidase Spektren,
bei denen ein Potential von -10 mV bzw. -710 mV an die Elektrode
angelegt wird. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A.1 Lagen und Höhen der Peaks für das gewählte Beispiel . . . . . . .
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Danksagungen
All denen, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben, gilt mein Dank.
Für die freundliche Betreuung seitens des Max-Planck-Instituts für Polymerforschung bedanke ich mich besonders bei Frau Dr. Naumann. Über den Beistand
bei Fragen und Problemen hinaus engagierte sie sich für meine Arbeit und meine
Person. Ich danke Herrn Prof. Kremer und Herrn Prof. Knoll für die Möglichkeit
meine Diplomarbeit am MPI-P zu absolvieren.
Dank geht an Marcel Friedrich für die Einführung in die hohe Kunst der TRSERRS-Spektroskopie und in die Herstellung und Untersuchung von ptBLM-Systemen. Der Dank geht auch an Vinzenz Kirste, Slavoj Kresak und Asmorom Kibrom für die Unterstützung im Labor und für die Hilfe bei den elektrochemischen
Messungen.
Außerdem bedanke ich mich bei Hans-Jörg Menges für die vielen Ratschläge und
die Unterstützung im Raman-Labor.
Den Werkstätten am MPI-P (Feinmechanik und Elektronik) danke ich für die professionelle Realisierung meiner Konstruktionen und die schnelle Bearbeitung unplanmäßiger Aufträge. Hierbei gilt besonderer Dank Herrn Gerstenberg und Herrn
Richter für die Unterstützung bei der Konstruktion der neuen SERRS-Zelle.
Für die Anfertigung der AFM- und Nanoscope-Aufnahmen bedanke ich mich bei
Helma Burg und Andreas Best.
Ich bedanke mich bei der gesamten Knoll-Gruppe für die herzliche Aufnahme und
das angenehme, internationale Arbeitsklima.
Mein herzlichster Dank gilt meiner gesamten Familie und meiner Freundin für
die aufbauende Unterstützung.

Diplomarbeit - www2.mpip

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Ruhr-Universität Bochum Fakultät für Chemie Forschung 2004