doc
download 
Report Transcription
PDF
LABORWELT Nr. 2 / 2007 - Vol. 8 exBiFC – verbesserte Analyse von ProteinProtein-Interaktionen Detergenz-freie Aufreinigung von Membranproteinen Proteomics Analyse von ProteinNetzwerken als Basis für das Drug Screening Marktübersicht: Contract Manufacturing Antikörperfabrik: Ressource für Forschungsantikörper Biobanken für die Proteomforschung Neues Verfahren zur Auftrennung von Protein-Isoformen BIOCOM AG Das -Themenheft www.roche-applied-science.com www.roche-applied-science.com www.roche-applied-science.com ® LightCycler ® 480 LightCycler ® 480 LightCyclerPCR 480System Real-Time Real-Time Real-Time PCR PCR System System Hunt for new targets: Hunt for new Hunt for new targets: targets: High-Resolution Melting Meets High-Resolution Melting High-Resolution Melting Meets Meets High-Performance PCR High-Performance High-Performance PCR PCR LightCycler ® 480 Gene Scanning Software reveals LightCycler ®between 480 Gene Scanning Software reveals differences wild types and variants by LightCycler ® 480 Gene Scanning Software reveals differences wild A types and variants by grouping of between HRM curves. fragment of the human differences between wild types and variants by grouping of was HRM curves.from A fragment of thethe human LPLH3 gene amplified blood using grouping of HRM curves. A fragment of the human LPLH3 gene® was amplified from blood using the LightCycler 480 High Resolution Melting Master. LPLH3 gene® was amplified from blood using the LightCycler 480 analysis High Resolution Melting Master. Difference curve enables differentiation LightCycler® 480 High Resolution Melting Master. Difference curve analysis differentiation between wild-type (green),enables homozygous G to T mutant Difference curve analysis enables differentiation between (green), homozygous (red), andwild-type heterozygous (blue) samples. G to T mutant between wild-type (green), homozygous G to T mutant (red), and heterozygous (blue) samples. (red), and heterozygous (blue) samples. For general laboratory use. Not for use in diagnostic procedures. Purchase of this product is accompanied by a limited license to use it in the PCR process, including homogeneous PCR For general laboratory use. Not for use in diagnostic procedures. methods described in U.S. Patents Nos. 5,994,056, 6,171,785, 6,569,627 and corresponding patents outside the United States, Purchase of this product accompanied bya athermal limited license to use itin in the PCR process, including homogeneous PCR for life general science research inisconjunction with use automated performance of the PCR process For laboratory use. Notcycler forwhose use diagnostic procedures. methods in U.S. Patents 5,994,056, 6,171,785, 6,569,627 andNo corresponding patentsor outside the United States, is covereddescribed by the up-front license Nos. fee, i.e., an authorized thermal cycler. real-time apparatus system patent rights or Purchase of this productinisconjunction accompanied limitedcycler license to use it in the automated PCR process, including homogeneous PCR for life science research withby a athermal whose use in the performance of the No PCRrights process any other patent rights owned by Applera Corporation are conveyed expressly, by implication or by estoppel. for methods described in U.S. Patents Nos. 5,994,056, 6,171,785, 6,569,627 andNo corresponding patentsor outside the United States, is covered by the up-front licenseany fee,ini.e., andiagnostic authorized thermal cycler. real-time apparatus system patent rights or any other application, including vitro application, are conveyed expressly, by implication or by estoppel for life science research in conjunction with a thermal cycler whose use in the automated performance of the PCR process any other rights by Applera Corporation are conveyed patent expressly, by implication by estoppel. rights for under U.S.patent Patents Nos.owned 6,174,670 and 6,245,514 and corresponding claims outside theorUnited States, No or any other is covered by the up-front licenseany fee,ini.e., andiagnostic authorizedapplication, thermal cycler. No real-time apparatus implication or system patent rights or any other application, including vitro are conveyed expressly, or by estoppel patents owned by Roche Molecular Systems, Inc. and F. Hoffmann-La Roche Ltd, claimingbyreal-time amplification and any other patent rights owned by Applera Corporation are conveyed expressly, by implication or by estoppel. No rights for under U.S.methods. Patents Nos. 6,174,670 and 6,245,514 corresponding patent claims outsidefrom the Evotec United OAI States, any of other detection The product is covered in-partand by US 5,871,908, co-exclusively licensed AG.orParts the any other application, including any vitro diagnostic are conveyed expressly, byreal-time implication or by estoppel ® in patents bythe Roche Molecular Systems, andapplication, F. Hoffmann-La Roche Ltd, claiming amplification and Softwareowned used for LightCycler 480 System Inc. are licensed from Idaho Technology Inc., Salt Lake City, UT, USA under U.S.methods. Patents Nos. 6,174,670 and 6,245,514 corresponding patent claims outsidefrom the Evotec United OAI States, any of other detection The product is covered in-partand by US 5,871,908, co-exclusively licensed AG.orParts the LIGHTCYCLER is trademark of®Roche. Other brands or Hoffmann-La product names are trademarks ofreal-time their respective holders. patents owned byathe Roche Molecular Systems, and F. Roche Ltd,Inc., claiming amplification and Software used for LightCycler 480 System Inc. are licensed from Idaho Technology Salt Lake City, UT, USA © 2007 Roche Diagnostics GmbH. All rights reserved. detection methods. The product is covered in-part by US 5,871,908, co-exclusively licensed from Evotec OAI AG. Parts of the LIGHTCYCLER is athe trademark of®Roche. Otherare brands or product names are trademarks their respective Software used for LightCycler 480 System licensed from Idaho Technology Inc., Salt of Lake City, UT, USA holders. © 2007 Roche Diagnostics GmbH. All rights reserved. LIGHTCYCLER is a trademark of Roche. Other brands or product names are trademarks of their respective holders. © 2007 Roche Diagnostics GmbH. All rights reserved. The LightCycler® 480 System offers new tools for mutation scanning The LightCycler® 480 System newThis tools for mutation based on high-resolution meltingoffers (HRM). sensitive scanning post-PCR The LightCycler® 480 System offers new toolshighly for mutation scanning based on high-resolution melting (HRM). This highly sensitive post-PCR method enables high-throughput SNP screening at a much lower cost. based on high-resolution melting (HRM). This highly sensitive post-PCR method enables high-throughput SNP screening at a much lower cost. method enables high-throughput SNP screening a much cost. � Discover genetic variation — fast: Choose theatfirst fullylower integrated � Discover genetic variation — fast: Choose the first fully integrated PCR/HRM solution for 96and 384-well plates. � Discover genetic variation — fast: Choose the first fully integrated PCR/HRM solution for 96- and 384-well plates. 96-research: and 384-well plates. � PCR/HRM Expand the solution scope offor your Benefit from innovative software � Expand the scope of your research: Benefit from innovative software and a novel HRM master mix with unmatched PCR compatibility. � Expand the scope of your research: Benefit from software and a novel HRM master mix with unmatched PCRinnovative compatibility. and a novel HRM master mix with unmatched PCR compatibility. � Avoid unnecessary sequencing: Streamline your research by taking � Avoid unnecessary sequencing: Streamline your research by taking advantage of a highly robust and convenient mutation scanningbymethod. � Avoid unnecessary sequencing: Streamline your research taking advantage of a highly robust and convenient mutation scanning method. advantage of a highly robust and convenient mutation scanning method. Take your PCR to new heights. Take your to new heights. Learn morePCR at www.lightcycler480.com Take your to new heights. Learn morePCR at www.lightcycler480.com Learn more at www.lightcycler480.com Roche Diagnostics GmbH Roche GmbH Roche Diagnostics Applied Science Roche Diagnostics GmbH Roche Applied Science 68298 Mannheim Roche Applied Science 68298 Mannheim Germany 68298 Mannheim Germany Germany I Zum Thema N Proteomics – Ausdauer statt Hype gefragt Die mit ihm verbundenen großen Hoffnungen hat das Forschungsgebiet der Proteomics vom Vorgänger-Hype der Genomforschung geerbt. Nachdem immer klarer wurde, dass die Ergebnisse von DNA-Microarrays allein zur Vorhersage von Zellfunktionen oder gar Krankheiten nur bedingt geeignet erscheinen, ruhen nun die Erwartungen auf den Funktionsträgern der Zelle. Große Hoffnungen setzen etwa die mehr als 100 Krebsforscher, die sich im Februar auf dem PAMM-Wintermeeting am Berliner Max-Delbrück-Centrum trafen (vgl. Seite 30), in die Analyse von krebsrelevanten Signalwegen und die dafür charakteristischen Proteinbiomarker. Doch trotz aller Aufbruchstimmung wurde auch klar, dass die aktuellen Proteomicstechnologien – gemessen am Entwicklungsstand der DNA-Microarray-Technologie – noch einen weiten Weg vor sich haben. Die nachdenklichen Töne stehen in starkem Kontrast zu zahlreichen in den Medien präsentierten Visionen einer „verstehenden und wissensbasierten“ Diagnostik und Arzneimittelentwicklung. Neben die Idee einer Diagnostik und Therapie auf Basis von Proteinmustern und Markerproteinen, die Aufschluss über die Kennzeichen von krank und Bitte nutzen Sie unseren Kennziffer-Service: online unter www.biocom.de oder auf unserer Fax-Seite (S. 48). Wenn Sie ein Produkt interessiert, einfach Nummer ankreuzen, Name und Adresse angeben und faxen/mailen – Sie erhalten umgehend Informationen unserer Inserenten. gesund geben soll, tritt im Labor zunehmend eine stärkere Wahrnehmung der biologischen Grenzen dieser vergleichenden Analyse. Ob es etwa gelingt, aus dem biologischen Rauschen interindividueller Proteinvariabilität in Patientenproben schließlich die relevanten Informationen zu filtern, muss sich danach erst noch erweisen (vgl. Seite 4). Eine wahre Flut von Publikationen zu regulatorischen Protein-Netzwerken dokumentiert dagegen einen schrittweisen Fortschritt, aber auch die große Komplexität auf dem Weg zu einem molekularen Verständnis von Krankheiten. Erst im März veröffentlichte eine Gruppe um Ruedi Aebershold gemeinsam mit einer exemplarischen „Masterkarte“ humaner Protein-Wechselwirkungen eine Strategie, um die von Proteinkomplexen kontrollierten Proteinnetzwerke systematisch zu erfassen. Zugleich versuchen dänische Forscher um Sören Brunak klinische Phänotypen mit Proteinkomplexen zu korrelieren. Eine Gruppe um Erich Wanker vom MDC Berlin fasst die Daten jetzt in der neuen Ressource UniHI zusammen (vgl. S. 10). Dazu kommen neue Verfahren, die die in vivo-Erfassung der Protein-Interaktionen weiter verbessern (vgl. S. 6). Langsam, aber stetig versprechen diese immer mehr Informationen über die Rolle von Proteinen in der Krankheitsgenese. Viel Lesevergnügen wünscht Thomas Gabrielczyk Die Kompexität des Humanproteoms und seiner Subproteome spiegelt sich in der Gestaltänderung von Schmetterlingen während deren Metamorphose. Feine Unterschiede in der Proteinexpression führen zu einem völlig anderen Phänotyp. Foto: fotolia Kennziffer 11 LW 02 · Informationen ordern? · www.biocom.de LABORWELT T R O INHALT STATEMENT Biobanken aus Sicht der Proteomforschung Dr. Friedrich Lottspeich, Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried BLITZLICHT ExBiFC – Methode zur in vivo-Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen 4 6 Dr. Horst Wolff et al., GSF Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit, Neuherberg WISSENSCHAFT Funktion durch Netzwerke: von Proteinen und ihren Wechselwirkungen 10 Prof. Dr. Erich Wanker et al., Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin, Berlin BLITZLICHT Mikroproteomics in Formalin-fixierten Geweben Dr. Robertus Hendriks et al., Merck KGaA, Darmstadt REPORT Antibody Factory – Erzeugung von Schlüsselreagenzien für die Proteomforschung im Hochdurchsatz 14 16 Prof. Dr. Stefan Dübel et al., Technische Universität Braunschweig BLITZLICHT Multiplex-2D-Western blotting und interne Standardisierung mit dem ECL Plex-System 22 Dr. Rita Marouga et al., GE Healthcare, Uppsala BLITZLICHT Native Extraktion von Transmembranproteinen Dr. Jörg von Hagen et al., Merck KGaA, Darmstadt NETZWERK Zucker nutzbar machen – Proteomforschung im Fokus 25 28 Dr. Michael Hamacher et al., Medizinisches Proteomcenter, Universität Bochum MARKTÜBERSICHT 3rd Halle Conterence – Produktion rekombinanter Proteine 34 Dr. Ole Fütterer, Scil Proteins GmbH, Halle MARKTÜBERSICHT Contract Manufacturing 35 Verbände 46 Stellenmarkt 39 Produktwelt 47 Fax-Seite 48 Termine 50 Impressum 50 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 | 3 L E S E R F O R U M Statement Biobanken aus der Sicht der Proteomanalyse Dr. Friedrich Lottspeich, MPI für Biochemie, Martinsried; Präsident der DGPF und EuPA Bisher wenige Proteinbiomarker Zum einen gibt es klare technische Gründe: Proteomanalysen von Plasma stellen heute bezüglich Komplexität und dynamischem Bereich eine kaum zu bewältigende Herausforderung dar. Etwa 20 hochabundante Proteine machen 99% der Proteinmenge des Plasmas aus. Die diagnostisch interessanten Proteine kommen in viel geringerer Menge vor und müssen aus einer Vielzahl von Proteinen (wie etwa den Millionen Antikörpern, die jeder Mensch besitzt) wie eine Nadel im Heuhaufen erst gefunden, identifiziert und letztendlich auch noch quantitativ bestimmt werden. Dabei wirkt erschwerend, dass viele Proteine im Plasma in vielen unterschiedlichen Formen vorkommen – zum Beispiel unterschiedlich glykosyliert, phosphoryliert, prozessiert und abgebaut, etc –, wobei bekannt ist, dass nur einzelne dieser Proteinspezies diagnostisch relevant sind. Die Techniken der quantitativen Proteomanalyse sind erst im Laufe der letzten Jahre mit dem Einsatz nicht radioaktiver Isotopen-Label weiterentwickelt worden. Parallel 4 | 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 dazu wurden die massenspektrometrischen Techniken in Bezug auf Durchsatz, Sensitivität und Genauigkeit erheblich verbessert. Bis heute sind jedoch nur wenige quantitative Plasmaproteomanalysen in der Literatur beschrieben, die jedoch keineswegs die erwartete große Anzahl von Proteinen zeigen. Individualisierte Proteomforschung Die fehlenden spektakulären Erfolgsmeldungen der Proteom-basierten Biomarkersuche beruhen aber auch auf biologischen Ursachen. Die genetische Heterogenität der Menschen, ihre unterschiedlichen Lebensgewohnheiten und unterschiedlichen Umwelteinflüsse, die unsere Individualität begründen, spiegeln sich auch auf der Ebene der Proteine wider. Die Unterschiede zwischen den Proteinmustern einzelner Individuen sind oft viel ausgeprägter als krankheitsbedingte Deregulationen. Nur mit einer großen Zahl von Probanden und unter immensem analytischem und statistischem Aufwand ist es möglich, die krankheitskorrelierten und damit diagnostisch/prognostisch interessanten Änderungen im Proteinmuster valide zu erfassen. Wie könnten Lösungen für die Zukunft aussehen? Neben den dauernd fortschreitenden Verbesserungen der Proteomtechniken müssen auch grundsätzliche Überlegungen angestellt werden, um eine machbare und finanzierbare Biomarkersuche auf Proteomebene zu erreichen. Da offensichtlich eine umfassende und erfolgreiche Plasmaproteomanalyse durch den Vergleich von Patienten mit jeweils gesunden Kontrollkollektiven bisher nicht besonders erfolgreich war, könnte versucht werden, die genetische Heterogenität zu umgehen und eine „individualisierte“ Proteomanalyse durchzuführen. Hierbei können Biobanken eine zentrale Rolle spielen. So enthält etwa die Biobank der Blutspender des Blutspendedienstes des Bayerischen Roten Kreuzes Proben von vielen teilnehmenden Blutspendern, die über einen längeren Zeitraum mehrfach Blut spenden. Einige dieser Spender werden irgendwann in ihrem Leben erkranken und dürfen nach der Krankheitsdiagnose nicht mehr Blut spenden. Die gelagerten Blutproben bieten eine einzigartige Möglichkeit – das Einverständnis der Spender vorausgesetzt – retrospektiv zu untersuchen, ob und wie Friedrich Lottspeich (Jahrgang 1947) studierte Chemie an der philosophischen Fakultät der Universität Wien. 1978 promovierte er bei Pehr Edman am Max-PlanckInstitut für Biochemie in Martinsried. Dort wurde er 1984 zum Leiter der Arbeitsgruppe Mikrosequenzierung am Genzentrum der Universität München berufen. Nach seinen Habilitationen an den Universitäten München und Innsbruck kehrte er 1990 als Leiter der Proteinanalytik ans MPI zurück. Lottspeich ist Präsident der Deutschen Gesellschaft für Proteomforschung und seit August 2005 Präsident der neugegründeten European Proteome Association (EuPA). lange bevor die Krankheit erkennbar war, im Blut der einzelnen Spender schon Veränderungen in der Proteinzusammensetzung vorhanden waren. Solche Prognosemarker zu erfassen und zu erforschen, könnte gerade bei multifaktoriellen Erkrankungen von großer diagnostischer, therapeutischer und präventiver Bedeutung sein. Beim Einsatz der Biobanken für proteomanalytische Untersuchungen müssen natürlich auch ethische Aspekte beachtet werden, sie sind aber normalerweise viel weniger kritisch als bei DNA-fokussierten Biobanken, obgleich auch für Blut- und Gewebeproben gilt, dass man aus ihnen Erkenntnisse über Erkrankungen gewinnen kann und diese Ergebnisse unter Umständen eine erhebliche Tragweite haben können. Während aber genetische Marker, gerade bei multifaktoriellen Erkrankungen, lediglich einen für den Einzelfall und eine Therapieentscheidung wenig hilfreichen Risikoprozentsatz anzeigen, kann der Protein/Proteom-basierte Ansatz mit humanen Biomaterialien Marker erfassen, die gegebenenfalls lange vor einem Krankheitsausbruch messbaren Veränderungen unterliegen und diese konkret anzeigen. Diese noch vor dem Auftreten äußerer Symptome erkannten akuten Gesundheitsrisiken können dann zu frühzeitig einsetzenden therapeutischen Maßnahmen führen. Sie tragen zur Prävention bei und verhindern möglicherweise das Auftreten schwerer und kostenintensiver Erkrankungen. Kennziffer 12 LW 02 · www.biocom.de Eine der treibenden Kräfte zur Weiterentwicklung der Proteomanalyse ist die Erwartung, über die Analyse von Proteinmustern molekulare Grundlagen von Krankheiten sowie auch Krankheitsdispositionen oder Reaktionen von Individuen auf bestimmte Medikamente besser verstehen zu können. Die Pharma-Industrie erhofft sich neue Targets zur Entwicklung von Medikamenten und zur Umsetzung innovativer therapeutischer Ansätze. Bis heute sind spektakuläre Erfolge der Proteomics-basierten Biomarkersuche allerdings ausgeblieben. Es konnten zwar in fast allen klinischen Proteomstudien von Blut/Plasma oder Serum deutliche Unterschiede in den Proteinmustern von Gesunden und Kranken festgestellt und damit auch eine Anzahl von Biomarkerkandidaten veröffentlicht werden; einer soliden Validierung als Biomarker hat aber bislang keiner dieser Kandidaten standgehalten. So stehen wir vor der Situation, dass über Proteomics gefundene valide Proteinmarker für diagnostische oder prognostische Zwecke trotz eines weltweit immensen Einsatzes und eines enormen Erwartungsdrucks immer noch fehlen, obwohl kaum bezweifelt werden kann, dass sie vorhanden sind. Woran liegt das? LABORWELT Performance Simplicity Elegancy The new Biometra Thermocycler also available as basic version TProfessional Thermocycler Powered by Biometras‘ 15-years experience Large graphical display High speed silver block Easy spreadsheet programming www.biometra.com +49 551 50686-0 info@biometra.com www.tprofessional.com B L I T Z L I C H T Interaktionsanalyse ExBiFC – eine Methode zur in vivo-Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen fluoreszierenden Proteins wieder ein funktionstüchtiges Protein, das nachfolgend seine charakteristische Fluoreszenz zeigt. Ein Problem dieser Technik besteht darin, dass in Abwesenheit einer Interaktion, keine Möglichkeit besteht, die erfolgreiche Expression der beiden Konstrukte direkt in lebenden Zellen Horst Wolff1, Andrea Hartl1, Hanna M. Eilken2, Kamyar Hadian1, Manja Ziegler1, Ruth Brack-Werner1, GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit, Institut für molekulare Virologie1, Institut für Stammzellforschung2, Neuherberg Proteine leisten einen wesentlichen Teil ihrer zellulären Funktionen in einem komplexen Netzwerk aus Protein-Protein-Interaktionen. Diese Interaktionen spielen sowohl bei physiologischen als auch pathologischen Prozessen eine entscheidende Rolle. Die Aufklärung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen ist daher eine der entscheidenden Aufgaben der Proteomforschung. Eine Voraussetzung dafür ist eine möglichst breite Basis an komplementären Methoden zur Analyse von Interaktionen. Wir konnten eine bereits bestehende Technik zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen, die sogenannte bimolekulare Fluoreszenzkomplementierung (BiFC), verbessern und weiterentwickeln. Die neue Methode der erweiterten (extended) Fluoreszenzkomplementierung (exBiFC)1 ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung von Expression und Interaktion von Proteinen in lebenden Zellen. Abb. 2: Schematische Darstellung des exBiFCPrinzips. Exprimieren die beiden Basis-Konstrukte kein Protein von Interesse oder aber keine interagierenden Proteine, bleibt die Komplementierung des YFP aus (links). Exprimieren die beiden Basis-Konstrukte Proteine von Interesse die miteinander interagieren, vollzieht sich die Komplementierung des YFP (rechts). Hier ist dies für das HIV-1-Protein sRev und das zelluläre Protein Risp gezeigt. Key Words: exBiFC, fluoreszierende Proteine, Interaktion, Rev, HIV zu überprüfen. Ebenfalls kann die Lokalisation der beiden zu untersuchenden Proteine nicht ohne weitere, aufwendigere Prozeduren (wie Immunfärbungen) bestimmt werden. Stand der Technik Es existiert heute eine Reihe von Methoden zur Charakterisierung von Protein-Interaktionen die teils in vitro und zum Teil in lebenden Zellen eingesetzt werden können. Vor fünf Jahren wurde erstmals die Methode der bimolekularen Fluoreszenzkomplementierung (BiFC)2 in lebenden Zellen publiziert. Diese macht sich die gentechnische Trennung eines fluoreszierenden Proteins (FP) in zwei Hälften zunutze, an die jeweils die codierende Sequenz eines zu untersuchenden Proteins gekoppelt wird. Diese beiden Fusions-Proteine können in Zellen exprimiert werden, und sind dann an sich nicht fluoreszent. Erst wenn es durch eine enge Wechselwirkung der beiden Proteine von Interesse dazu kommt, dass auch die beiden Hälften des fluoreszierenden Proteins in räumliche Nähe zueinander gelangen, findet eine Fluoreszenzkomplementierung statt. Dabei bilden die beiden Hälften des Abb. 1: Die grundlegenden exBiFC-Plasmid-Konstrukte. CMV: Promotor, der die Transkription des Konstruktes in einer Vielzahl von Säugetierzellen antreibt. CFP: codierende Sequenz für das cyan fluoreszierende Protein. mRFP1: codierende Sequenz für das monomere, rot fluoreszierende Protein. An der mit einem Stern markierten Stelle kann die codierende Gensequenz für ein zu untersuchendes Protein von Interesse eingesetzt werden. Zwischen den codierenden Sequenzen für die vollständigen und geteilten fluoreszierenden Proteine und des Proteins von Interesse wurden Sequenzen für flexible Peptidketten eingesetzt. 6 | 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 Interaktionsanalyse durch exBiFC Unsere neue exBiFC-Technik1 zur Interaktionsanalyse umgeht die genannten Limitierungen, indem zwischen das Protein von Interesse und eine entsprechende Hälfte des fluoreszierenden Proteins jeweils ein andersfarbiges, vollständiges fluoreszierendes Protein ‚gehängt‘ wird. Wir benutzten für die Hälften des fluoreszierenden Proteins das gelb fluoreszierende Protein (YFP) sowie cyan (CFP) und rot (mRFP1) fluoreszierende Proteine, um die beiden Fusions-Proteine zu markieren und zu unterscheiden. Dabei entsteht ein Basiskonstrukt das für CFP und die N-terminale Hälfte von YFP codiert (C-YN) und ein weiteres, das für mRFP1 und die Cterminale Hälfte von YFP codiert (R-YC) (Abb. 1). In diese kann jeweils die codierende Gensequenz eines Proteins von Interesse kloniert werden. Werden diese Konstrukte gleichzeitig in Zellen exprimiert, zeigt sich sowohl eine Rot- als auch eine Cyan-Fluoreszenz (Abb. 2 links). Findet – ausgelöst durch Interaktion der beiden Proteine von Interesse miteinander – eine Fluoreszenzkomplementierung von YFP statt, resultiert daraus eine zusätzliche GelbFluoreszenz (Abb. 2 rechts). Kennziffer 13 LW 02 · www.biocom.de Die Aufklärung von Wechselwirkungen im Netzwerk der zellulären Protein-Interaktionen führt zu einem besseren Verständnis zahlreicher physiologischer und pathologischer Vorgänge, etwa bei der Signalübertragung, Genexpression, Apoptose oder auch bei Virusinfektionen. Eine erfolgreiche und effiziente therapeutische Beeinflussung zellulärer Prozesse setzt detaillierte Kenntnisse der Protein-Wechselwirkungen in der Zelle voraus. LABORWELT GE Healthcare Success is based on knowledge, not chance A system for success Making the right decision at the right time is crucial to your success, from basic research through drug discovery and development, to manufacturing and QC. So wherever you work, the highest quality, information-rich interaction data from a BiacoreTM system enables you to make each critical decision with confidence – because every Biacore system is supported by more than 15 years of knowledge and experience. Select the perfect solution for your application – from the company that continues to set the standard for label-free interaction analysis. www.biacore.com © 2007 General Electric Company – All rights reserved. GE Healthcare Biacore AB, a General Electric Company. B L I T Z L I C H T Die Vorteile dieser Technik zeigen sich zum einen in der inhärenten Kontrolle der Expression, auch wenn keine Interaktion stattgefunden hat. Die Gefahr falsch-negativer oder auch falsch-positiver Interaktionsergebnisse kann damit reduziert werden. Zellen, die entweder keines oder nur eines der beiden Konstrukte exprimieren, können von der Auswertung ausgeschlossen werden. Ebenso können Zellen, die ein extremes Überexpressionsniveau der Proteine zeigen, als Quelle von falschpositiven Resultaten erkannt werden. Durch die Ermittlung der Stärke der Rot- und CyanFluoreszenz, können zusätzlich eine Einschätzung der Expressionsstärke der beiden Interaktionspartner und eine Normalisierung auf diese vorgenommen werden, da sich eine geringe Expression eines Partners etwa limitierend auf die maximal mögliche GelbFluoreszenz auswirkt. Zum anderen kann die Analyse der Lokalisierung der beiden einzelnen Partner sowie des Interaktionskomplexes unter Umständen weitere Einsicht in die Natur der Interaktion liefern. ExBIFC am Beispiel des HIV-1-Rev-Proteins Wir analysierten Interaktionen des Rev-Proteins des humanen Immundefizienz-Virus (HIV), um die entwickelte Technik zu testen. Rev spielt eine wesentliche Rolle in der frühen Phase der Virusinfektion einer Zelle, und es ist bekannt, dass es sowohl mit sich selbst als auch mit einer Vielzahl von zellulären Partnern interagieren kann3. Erst kürzlich konnte unsere Arbeitsgruppe einen neuen zellulären Faktor, RISP, als Interaktionspartner von Rev identifizieren4. Zunächst wurden in die beiden Basis-Konstrukte C-YN und R-YC Abb. 3: Fluoreszenzmikroskopie von exBiFC in menschlichen Zellen. Die Aufnahmen in der linken Spalte zeigen eine Negativkontrolle.Nur die Basis-Konstrukte R-YC und C-YN werden exprimiert, und die Fusionsproteine verteilen sich gleichmäßig in der ganzen Zelle. Es kommt nicht zur gezielten Fluoreszenzkomplementierung, und im YFP-Kanal ist nur eine schwache Hintergrundfluoreszenz zu sehen. Das homo-oligomerisierende Rev-Protein zeigt hingegen mit sich selbst eine ausgeprägte YFP-Komplementierung (mittlere Spalte). Auch das zelluläre Risp-Protein interagiert mit Rev und löst eine (etwas geringere) Komplementierung aus (rechte Spalte). Zusätzlich ist jeweils ein Phasenkontrastbild gezeigt. Maßstab: 10 µm. 8 | 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 die Gensequenzen für die zu untersuchenden Proteine Rev und Risp kloniert. Danach müssen die Konstrukte mit einer Methode der Wahl in die Zielzellen (HeLa) transfiziert werden. Wir verwenden dafür in der Regel das FuGene6-Transfektionsreagenz (Roche), haben aber ebenfalls gute Erfahrungen mit der Nucleofection (Amaxa) gemacht. Je nach Zelltyp und Methode des Gentransfers werden die Zellen dann für 24 bis 48 Stunden bei optimalen Wachstumsbedingungen inkubiert. Nach dieser Zeit ist in der Regel genug Protein hergestellt, und es haben sich ausreichend Interaktionskomplexe ausgebildet, um die Fluoreszenz der Zellen analysieren zu können. Da das Temperaturoptimum für die Ausbildung der Fluoreszenz mancher fluoreszierender Proteine, wie auch YFP, niedriger als 37 °C liegt, kann es in manchen Fällen bei schwachen Komplementierungseffekten zu Nachweisproblemen kommen. Sollte dies auftreten, kann das kurzfristige (20 min) Inkubieren der Zellen bei 4-20 °C eine Abhilfe sein. Die Analyse eines exBiFC-Experimentes kann prinzipiell mit jedem Gerät vorgenommen werden, das in der Lage ist, die zelluläre Fluoreszenz von CFP, YFP und mRFP1 zu bestimmen. Fluoreszenz-Mikroskopie, Fluoreszenz-Plattenlesegeräte und Durchflusszytometer stellen die bedeutendsten Varianten dar. Die exBiFC-Analyse mittels Durchflusszytometrie bietet sich an, wenn eine große Zahl an Zellen (> 103) untersucht werden soll, weil beispielsweise schwache, statistisch zu belegende Effekte erwartet werden und gleichzeitig die intrazelluläre Lokalisation der Proteine nicht von Interesse ist. Wir benutzten ein FACSAria-Durchflusszytometer (Becton Dickinson) und detektierten CFP, YFP und mRFP1 mit den Kanälen Ex: 488, Em: 530/30; Ex: 407, Em: 480/30 und Ex: 543, Em: 610/20 (Daten nicht gezeigt). Wir verwenden für unsere Untersuchungen bevorzugt die Fluoreszenzmikroskopie, da sie im Gegensatz zum Plattenlesegerät oder einem Durchflusszytometer auch Informationen über die Lokalisierung der Proteine liefert. Die fluoreszenzmikroskopische Bildaufnahme erfolgt derzeit durch einen Zeiss CellObserver und die Bildauswertung durch die Software AxioVision 4.6 (Carl Zeiss Imaging Solutions). Um Fehlmessungen zu vermeiden, ist es von wesentlicher Bedeutung, dass die FluoreszenzSignale nicht in unerwünschte Kanäle streuen. Das bedeutet, dass zum Beispiel das YFP-Bild nur Signale von YFP enthalten darf und nicht etwa Anteile von CFP oder mRFP. Für die Trennung von CFP, YFP und mRFP1 wurden in unserem Ansatz die Filtersätze 436/20 FT 455 BP 480/40 (CFP); 500/20 FT 515 BP 535/30 (YFP) und 530-585 FT 600 LP 615 (mRFP1) benutzt, die die Anforderung optimaler Signaltrennung erfüllen. Fluoreszenzmikrokopische Aufnahmen von drei Experimenten zeigen das Prinzip von exBiFC anhand einer Negativkontrolle sowie der Rev-Rev- und Rev-Risp-Interaktion LABORWELT B L I T Z L I C H T Abb. 4: Quantitative Analyse des exBiFC-Effektes. Auf der y-Achse ist die auf die CFP- und mRFP-Expression normalisierte YfP-Fluoreszenz aufgetragen. Einzelne Symbole im Graphen repräsentieren einzelne Zellen beziehungsweise die Stärke ihrer Gelbfluoreszenz im Verhältnis zur addierten Rot- und Cyan-Fluoreszenz. Der Median durch die Population ist als horizontaler Balken dargestellt. Je höher der Wert der exBiFC-Effizienz, desto mehr relative gelbe Fluoreszenz zeigen die Zellen. In der Grafik ganz links gezeigt befindet sich die Negativkontrolle. Nur an ein Konstrukt (C-YN) wurde ein Protein von Interesse fusioniert (hier das HIV-1-Rev-Protein). Es kommt nicht zu Komplementierung. Das homo-oligomerisierende RevProtein zeigt hingegen mit sich selbst eine ausgeprägte YFP-Komplementierung (Mitte). Auch das zelluläre Risp-Protein interagiert mit Rev und löst eine (etwas geringere) Komplementierung aus (rechts). Leistungen von exBiFC und Ausblick ExBiFC ist eine zu FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer), Two-Hybrid-SysteLABORWELT men, biochemischen Ansätzen oder anderen Interaktionsassays komplementäre Methode. Sie kann und soll andere Methoden nicht vollständig ersetzen. Die Möglichkeit zur internen Normalisierung macht die exBiFC-Technik jedoch zu einer besonders verlässlichen, robusten und einfach durchzuführenden Technologie. Sie kann mit dem StandardMethodenarsenal der Molekular- und Zellbiologie durchgeführt werden und ist weder zeitaufwendig noch kostenintensiv. Sie eignet sich daher nicht nur zur Bestätigung bereits bekannter Interaktionen, sondern prinzipiell auch besonders für Screenings im größeren Maßstab, da die Zahl der falsch-positiven Ergebnisse gering ausfällt. Literatur [1] [2] [3] [4] miRtect-IT ™ miRNA Labeling and Detection Kit Based on splinted-ligation technology – miRNA is directly labeled by ligation, then visualized. • Speed - capture and label miRNA in just over 2 hours • Sensitivity - detect miRNA in as little as 50 ng or less of total RNA • Quantitative Results - accurate miRNA measurement in 6 hours Wolff, H., Hartl, A., Eilken, H.M., Hadian, K., Ziegler, M., Brack-Werner, R., BioTechniques 41 (2006), 688-692. Hu, C.D., Chinenov, Y., Kerppola, T.K., Mol. Cell 7 (2002), 449-456. Kjems, J., Askjaer, P., Adv Pharmacol 48 (2000), 251-298. Kramer-Hämmerle, S., Ceccherini-Silberstein, F., Bickel, Ch., Wolff, H., Vincendeau, M., Werner, T., Erfle, V., Brack-Werner, R, BMC Cell Biol 6 (2005), 20. Korrespondenzadresse Now in Europe Dr. Horst Wolff GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit Institut für molekulare Virologie Arbeitsgruppe Retrovirale Regulation Ingolstädter Landstraße 1 85764 Neuherberg eMail: horst.wolff@gsf.de Kennziffer 14 LW 02 · www.biocom.de USB Europe GmbH Hauptstrasse 1 79219 Staufen Germany in lebenden Zellen (Abb. 3). Zu erkennen ist, dass nur bei stattfindender Interaktion im YFPKanal deutliche Signale zu sehen sind. Für alle Experimente wurde pro Kanal jeweils dieselbe Belichtungszeit eingestellt. Die quantitative Analyse von Bildern und die grafische Darstellung und statistische Auswertung der Daten ist für die Publikation der Ergebnisse essentiell. Die Nutzung eines Durchflusszytometers liefert bereits durch die Messung der Zellen jeweils einen Wert für die Stärke der CFP-, YFP- und mRFP-Fluoreszenz einer Zelle. Mikroskopische Bilddaten müssen zuerst einer Bildanalyse unterzogen werden, bevor für jede Zelle ein Fluoreszenz-Wert zur weiteren Auswertung erhalten wird. Dabei können einerseits Zellen manuell am Computer umrandet und markiert oder aber automatisch durch die Bildanalyse-Software erkannt und ausgewertet werden. In beiden Fällen wird jeweils ein Intensitäts-Wert pro Zelle und Bildkanal (CFP, YFP oder mRFP) erhalten, der gegebenenfalls noch um den Hintergrundwert des Bildes reduziert werden kann. Als quantitative Abschätzung für die Interaktionsstärke hat sich die Berechnung des Verhältnisses des gesamten YFP-Signals einer Zelle zum summierten Signal von CFP und mRFP derselben Zelle bewährt. Die qualitativen Eindrücke die sich bei Betrachtung von Abbildung 3 gewinnen lassen, können dadurch in numerische Werte umgewandelt werden (Abb. 4). Quantitative miRNA detection in less than one day T: +49 (0)76 33-933 40 0 F: +49 (0)76 33-933 40 20 www.usbweb.com custserv@usbweb.de 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 | 9 Protein-Interactomics Kennziffer 15 LW 02 · www.biocom.de Funktion durch Netzwerke: von Proteinen und ihren Wechselwirkungen Patrick Umbach, Matthias Futschik, Ulrich Stelzl, Erich E. Wanker, Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin, AG Neuroproteomforschung, Berlin Die Zahl vollständig sequenzierter Genome nimmt immer schneller zu. Trotzdem wissen wir nach wie vor zu wenig über die eigentlichen funktionellen Zusammenhänge der Genprodukte. Seit einigen Jahren etablieren sich jedoch Forschungsansätze, mit denen versucht wird, das komplexe Zusammenspiel der Proteine als System zu begreifen. Umfassende Netzwerke humaner Proteine werden zu einem ‚Interaktom’ zusammengestellt, das die Wechselwirkungen zwischen den Proteinen in einer Karte darstellt. Die zellulären Aufgaben der bekannten 22.000 Gene des Menschen sollen so in einen globalen Zusammenhang gestellt werden, mit dem ehrgeizigen Ziel nicht nur das Funktionieren des Organismus auf der zellulären Ebene zu beschreiben, sondern letztlich auch die molekularen Ursachen komplexer Krankheiten zu ergründen. Komplexe, genetisch beeinflusste neuronale Erkrankungen, wie zum Beispiel Morbus Alzheimer oder die Huntingtonsche Krankheit, stellen in der modernen Medizin nach wie vor immense Herausforderungen dar, deren Ursachen sich mit klassischen biologischen Methoden nicht hinreichend ergründen lassen. Vielmehr ist ein systemisches Verständnis zugrundeliegender molekularer Zusammenhänge notwendig, um globale pathologische Veränderungen in der Zelle zu verstehen. Ohne dieses Verständnis wird es schwer möglich sein, biologische Indikatoren für komplexe Erkrankungen zu identifizieren oder gar Therapien zu entwickeln. Die systematische Untersuchung der Wechselwirkungen der menschlichen Proteine wird eine entscheidende Rolle in der Aufklärung zellulärer Krankheitsprozesse spielen. Die Bestimmung krankheitsrelevanter Proteinnetzwerke und ihr dynamisches Verhalten sind dabei unerlässlich. Erste, vielbeachtete Studien zeigen, dass die Betrachtung zellulärer Netzwerke Rückschlüsse auf die prinzipielle molekulare Organisation der Zelle zulässt, auch wenn diese Netzwerkkarten im Moment noch statisch, fehlerbehaftet und unvollständig sind. In den vergangenen Jahren wurden weltweit methodische Voraussetzungen und apparative Infrastrukturen geschaffen, die mit hoher Effizienz die Bestimmung potentieller menschlicher Protein-Protein- Wechselwirkungen in einem genomweiten Ansatz erlauben. Das dabei eingesetzte Hefe-ZweiHybrid (Y2H, Yeast Two-hybrid)-Verfahren ist eine zur Zeit einzigartige experimentelle Methode der Proteomforschung zur Tab. 1: Übersicht über die in UniHI eingebundenen Protein-Protein-Interaktionsdaten. [Chaurasia et al]. Alle Daten in UniHI werden regelmäßig aktualisiert. Weitere Interaktionsnetzwerke werden in zukünftigen Versionen von UniHi integriert. Netzwerke Proteine Interaktionen Methoden Referenz Version MDC-Y2H CCSB-Y2H CCSB-LIT HRPD-BIN RPRD-COMP DIP 1703 1549 2192 5908 1277 1033 3186 2754 4067 15508 4468 1303 Y2HAssay Y2HAssay Literatur Literatur Literatur Literatur [1] [3] [3] [7] [7] [8] 23.09.2005 31.10.2005 31.10.2005 01.06.2006 01.06.2006 01.06.2006 BIND COCIT REACTOME ORTHO HOMOMINT OPHID 4273 3737 679 6225 4127 4785 5863 6580 12639 71466 10174 24991 Literatur Text-Mining Literatur Orthologie Orthologie Orthologie [9] [10] [11] [12] [13] [14] 12.12.2005 18.11.2005 01.06,2006 17.11.2005 01.06.2006 14.12.2005 10 | 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 W I S S E N S C H A F T Erstellung von Interaktionskarten des Human-Proteoms. Diese Karten erlauben die Untersuchung des vielfältigen Zusammenwirkens von hunderten Proteinen und werden so in der Zukunft die Beschreibung von weitreichenden Veränderungen in der Zelle ermöglichen, die bei komplexen Krankheiten auftreten. Wechselwirkungsmuster werden mit Hilfe bioinformatischer Prozesse analysiert und mit molekularund zellbiologischen Verfahren im Detail untersucht. Neben der Y2H-Methode, die statische Interaktionskarten liefert, werden Verfahren entwickelt, um dynamische Veränderungen der Wechselwirkungen besser zu erfassen. Ziel ist es, Möglichkeiten zu finden, diese Dynamik im Krankheitsfall zu beeinflussen. Gelingt dies, so werden genomweite Protein-Interaktionsnetzwerke einen Beitrag zu molekularmedizinischen Therapieansätzen in der zur Bekämpfung neurodegenerativer Erkrankungen und von anderen genetisch beeinflussten Volkskrankheiten leisten. Yeast-Two-Hybrid-Screens Das Y2H-Verfahren wurde zunächst für Proteinnetzwerke von Hefe, Fadenwurm und Fruchtfliege eingesetzt, später dann auf das Proteom des Menschen angewandt1. Die Methode basiert auf der Erkenntnis, dass Transkriptionsfaktoren, die das Auslesen von Proteinen aus ihren Genen steuern, in eine Aktivierungs- und eine DNA-Bindungsdomäne zerlegt werden können. Beide Domänen behalten dabei ihre Funktionalität. Werden die Domänen mit zwei unterschiedlichen menschlichen Proteinen verknüpft und diese Konstrukte in Hefe exprimiert, wird ein neuer Transkriptionsfaktor gebildet, der das Ablesen von Reportergenen aktiviert, wenn beide Proteine interagieren. Über Wachstumstests der Hefezellen kann dann die Wechselwirkung zwischen den zwei Proteinen nachgewiesen werden. Die Methode wurde weitgehend automatisiert, Millionen potentieller Wechselwirkungen können damit in kurzer Zeit untersucht werden. Auf Basis der Karten können Krankheitsproteine, die in der Pathogenese möglicherweise abnormale Wechselwirkungen eingehen, gezielt untersucht werden. Nicht-experimentelle Ansätze zum Kartieren von Protein-Interaktionen Neben der Y2H-Methode werden zur Zeit weitere Ansätze verfolgt, um das humane Interaktom zu kartieren. Neben der massenspektrometrischen Identifikation von Wechselwirkungen werden sogenannte literatur- und orthologiebasierte NetzwerLABORWELT Kein Bulle Schweinchen, Huhn oder Fisch Tut uns leid ihr Tiere. Bedingt durch den Druck, auf fleischlose Medien umzusteigen, werdet ihr nicht mehr gebraucht. Mit ueber 50 fleischlosen Peptonen, Extrakten und Hydrolysaten hat Marcor genau die richtigen Zusatzstoffe fuer ein komplett "fleischloses" Medien-Menue. Und das ist keine Ente. Wenden Sie sich noch heute and einen unserer Verkaeufer oder besuchen Sie uns auf unserer Internetseite marcordev.com und informieren Sie sich ueber die Liste unserer fleischlosen Medienzusatzstoffe. Vertretung für Deutschland, Österreich und die Schweiz: 341 MICHELE PLACE CARLSTADT, NJ 07072 201- 935-2111 • FAX: 201- 935-5223 E-MAIL: sales@marcordev.com www.marcordev.com HARTGE INGREDIENTS GMBH Georgsplatz 6 D-20099 Hamburg Telefon (040) 33 30 59 32 & 10 Telefax (040) 32 64 98 e-mail: hi@hartge-ingredients.de W I S S E N S C H A F T ke erstellt. Literaturbasierte Netzwerke beruhen auf klassischer Literaturrecherche oder automatischer Textsuche. Durch diese nichtexperimentellen Ansätze können viele einzelne Interaktionen gefunden und zu Netzwerken zusammengefasst werden. Orthologiebasierte Netzwerke sind ebenfalls nicht auf Experimente gestützt, sondern werden mit Hilfe der Bioinformatik hergeleitet. Unter der Annahme, dass Wechselwirkungen in der Evolution konserviert sind, wird von nachgewiesenen Proteininteraktionen anderer Organismen auf die Existenz von Wechselwirkungen humaner Proteine geschlossen. Zusammenführen der Daten Um die Ergebnisse der verschiedenen Kartierungen gemeinsam betrachten zu können, wurde am Institut für Theoretische Biologie der Humboldt-Universität und am Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in Berlin die Datenbank ‚Unified Human Interactome’, UniHI (www.mdc-berlin.de/unihi) entwickelt. Sie führt die unterschiedlichen Interaktionsprojekte zusammen und macht sie in einer Maske vergleichbar. Das UniHIPortal enthält derzeit Daten von mehr als 17.000 verschiedenen Proteinen in 150.000 Wechselwirkungen. Die Daten setzen sich aus zehn verschiedenen humanen Interaktionsnetzwerken zusammen, die auf experimentellen Y2H-Screens, Literatur- und Orthologiedatensätzen basieren. UniHI enthält Informationen über die Annotation und Expression interagierender Proteine sowie zahlreiche Vernetzungen zu weiteren Datenbanken. Besonderen Wert wurde auf eine einfach zu bedienende und dennoch flexible Benutzeroberfläche gelegt. Unterschiedliche Filter erlauben es, die Suche nach Interaktionen genauer zu spezifizieren. Insgesamt ermöglicht die integrierte 12 | 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 Plattform Forschern, schnell und bequem umfassende Information über menschliche Proteininteraktionen zu erhalten. Ein wichtiger Grund für die Entwicklung von UniHI war, dass nur wenige Interaktionen gleichzeitig in verschiedenen Netzwerken zu finden sind. Die Tatsache, dass sich die bisher entwickelten Netzwerke nur geringfügig überschneiden, lässt sich auf unterschiedliche Zielsetzungen und Methoden der Interaktionsforscher zurückführen6. Da die Mehrzahl der Interaktionen jeweils nur in einer Datenbank verzeichnet waren, mussten Anwender unterschiedliche Datenbanken einzeln abfragen. Diese zeitraubende Prozedur ist durch UniHI überwunden. Wird das integrierte Netzwerk visualisiert, werden die komplementären Anteile der einzelnen Datenquellen deutlich (Abb. 1). Neue Wissensbasis für die Wirkstoffentwicklung Trotz der Vielzahl der Kartierungsprojekte ist zur Zeit nur ein Bruchteil der Wechselwirkungen in den Zellen wirklich erfasst. Dennoch können auf Grund der vorhandenen Daten uncharakterisierte Proteine in neue Funktionszusammenhänge gebracht werden. So wurden mit dem Y2H-Verfahren für mehr als 200 bekannte Krankheitsproteine des Menschen neue Interaktionspartner gefunden. Diese Proteine können in regulatorischen Signalwegen eine Rolle spielen, wie etwa zwei neu identifizierte, tumorassoziierte Proteine, die die Aktivität des Wnt-Signalwegs beeinflussen 2. Um globale Funktionszusammenhänge in Zellen zu erkennen, müssen – neben den genan nten Kart ieru ngsmethoden – Verfahren aus der funktionellen Genom forsc hu ng, wie zu m Beispiel die Expressionsprofilierung, verfolgt werden. Literatur [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] Stelzl U, et al. 2005, Cell, 122, 957-968 Stelzl U und Wanker EE, 2006, Curr.Op.in Chem.Biol. 10, 551-558 Rual J F, et al. 2005, Nature 437, 1173-1178 Goehler H et al. 2004, Mol Cell, 15, 853-865 Chaurasia G, et al. 2007, Nucleic Acids Res. 35 Database issue:D590-4. Futschik M et al, 2007, Bioinformatics, im Druck Peri S et al. 2003, Genome Res. 13, 2363-71 Salwinski L et al. 2004, Nucleic Acids Res. 32 Database issue:D449-D451 Bader et al 2001 Nucleic Acids Res. 29, 242-245 Ramani et al. 2005 Genome Biology 6:R40 Joshi-Tope G et al. 2005, Nucleic Acids Res. 33 Database issue:D428-D432 Lehner et al 2004 Genome Biology 5:R63 Persico M et al 2005 BMC Bioinformatics 6(Suppl 4):S21 Brown et al 2005 Bioinformatics 21(23): 4223-29 Korrespondenzadresse Prof. Dr. Erich Wanker Arbeitsgruppe Neuroproteomforschung Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Robert-Rössle-Str. 10 13125 Berlin Tel.: +49-(0)30-9406-2157 Fax: +49-(0)30-9406-2552 eMail: e.wanker@mdc-berlin.de Kennziffer 16 LW 02 · www.biocom.de Abb. 1: Visualisierung des UniHI-Interaktionsnetzwerkes [5]. Die Punkte und Linien repräsentieren die Proteine und Wechselwirkungen. Die größten Beiträge sind in dunkelblau (MDC-Y2H), rot (Reactome), dunkelgrün (Orphid) und hellgrün (Hommint) eingezeichnet. Die grauen Einträge bezeichnen Proteine und Wechselwirkungen, die in mehreren Karten gefunden wurden. Im Nat ionalen Genomforschu ngsnetz (NGFN) haben sich Forschergruppen zu krankheitsbezogenen Netzwerken (KGs) und systematisch-methodischen Plattformen (SMPs) zusammengeschlossen, um in einem gemeinsamen, koordinierten Ansatz die Ursachen wichtiger Volkskrankheiten aufzuklären und neue Wege zur Entwicklung von Therapien zu eröffnen. Die SMPProtein führt mit einem inhaltlichen Fokus auf neurodegenerat ive Erk ran ku ngen Methoden der systematischen Proteomforschung wie Y2H, Massenspektrometrie und DNA-Arrays zusammen, um genregulatorische Netzwerke zu analysieren. Für neu identifizierte krankheitsrelevante Proteine werden in Substanzbibliotheken kleine Moleküle gesucht, die für weitere zellbiologische Untersuchungen oder als Ausgangssubstanzen für pharmazeutische Wirkstoffe (Leadstrukturen) eingesetzt werden können. Die dreidimensionalen Strukturen von Proteinkomplexen werden durch Röntgenkristallographie und KryoElektronenmikroskopie aufgeklärt. Eine Vielzahl von Forschungsaktivitäten konzentrieren sich auf Basis entschlüsselter Genome und analysierter Proteome immer mehr auf die systematische Kartierung der Wechselwirkungen zwischen Genprodukten, DNA und Botenstoffen. Diese Aufgabe ist bei weitem komplexer als die Identifizierung der verschiedenen Moleküle in lebenden Zellen. Insbesondere ist die zeitliche Dynamik von Interaktionen der vielleicht wichtigste Schlüssel zum Verständnis des menschlichen Organismus. LABORWELT Flash & Glow Luminescence Kinetic & End Point Fluorescence Blue & Red Scintillation Assays Time Resolved Fluorescence Absorbance Fluorescence Polarization GPCR Functional Assays (cAMP & Calcium Flux) GPCR Binding Assays Many more (Enzyme, Ion Channel & Membrane Potential Assays) © 2005 PerkinElmer, Inc. All trademarks or registered trademarks are the property of PerkinElmer, Inc. and/or its subsidiaries. 400041C_01 Screen with confidence — we’re with you all the way. Years ago, PerkinElmer introduced the first multilabel plate readers. Today we offer instruments and consumables for every assay technology, application and throughput that your lab needs. And our R&D investment never stops, because we’re always searching for new ways to help you, now and in the future. Our new CellLux™ Cellular Fluorescence Workstation is a fully automated walk away solution for robust cellular assays. With its broad excitation and emission wavelength range, plus simultaneous dual emission and dual excitation capabilities, you can run a choice of cellular kinetic assays. For example, our fast and flexible EnVision™ Multilabel Reader is better than ever. With its new AlphaScreen™ HTS Turbo Option, you can take advantage of this sensitive and homogeneous luminescence technology, and run at high throughput. What does our commitment mean to you? You can screen with confidence, because we’re with you all the way. To learn more about our plate readers and imagers, visit our website at www.perkinelmer.com/platereaders. TopCount® MicroBeta® VICTOR3™ EnVision™ ViewLux™ DEACH.marketing@perkinelmer.com (800) 762-4000 (U.S. and Canada) Tel. (D): 0800-181-00 32 (+1) 203-925-4602 Tel. (CH): 0800-000-015 For a complete listing of ourTel.global visit www.perkinelmer.com/lasoffices (A): offices, 0800-111-933 www.perkinelmer.com CellLux™ B L I T Z L I C H T Klinische Proteomforschung Mikro-Proteomics in Formalin-fixierten Geweben Dr. Jörg von Hagen, Dr. Uwe Michelsen, Sandra Nitschke, Dr. Sven Andrecht, Anja Seiler, Dr. Robertus Hendriks, Merck KGaA Unzählige Sammlungen von Formalin-fixierten Gewebeproben stehen der medizinischen Forschung zur Verfügung und stellen eine bisher wenig genutzte Informationsquelle auf Proteinebene dar. Begleitet von detaillierten klinischen Informationen, wie dem Krankheitsverlauf, dem Ansprechverhalten auf Medikamente und Verträglichkeitsdaten, stellen diese Probensammlungen eine riesige Fundstätte für die Identifizierung von Protein-Biomarkern mit hohem diagnostischen und therapeutischem Wert dar. Key Words: Formalin-Fixierung, Clinical Proteomics, pathologisches Gewebe, Biomarker, Protein-Extraktion, immunologischer Nachweis, Massenspektrometrie Die Analyse von Proteinen gewinnt in der Medizin zunehmende Bedeutung – insbesondere durch die Analyse von Gewebeproben mit dem Ziel, Anzeichen einer Erkrankung oder den Nachweis einer krankhaften Veränderung festzustellen. Hierzu ist es essentiell, alle Proteine einer gegebenen Probe quantitativ zu extrahieren, da nur die Analyse aller beteiligten Proteine in ihrer Gesamtheit Rückschlüsse auf Krankheiten und deren Entstehung zulässt. Die vergleichende Analyse des Gesamtproteoms von erkranktem und gesundem Cytokeratin: Zytoskelett (50 kDa) Gewebe mittels Massenspektrometrie befindet sich derzeit noch in einem frühen Entwicklungsstadium, verspricht jedoch, die Proteom-Komplexizität der Mikroumgebung des Gewebes zu entschlüsseln und Biomarker-Informationen mit geeigneter pathologischer und histologischer Relevanz zu liefern. Formalin-Fixierung von Geweben Die Formalin-Fixierung von Geweben ist ein Routinevorgang, der ein leicht la- Calnexin: Membran (90 kDa) GADPH: Zytoplasma (147 kDa) gerungsfähiges Archiv generiert, dessen Proben pathologisch mittels verschiedener Techniken gut vorcharakterisiert sind. Große Sammlungen von tierischen und human-fixierten Geweben werden bei Raumtemperatur über Jahrzehnte gelagert. Für die überwiegende Mehrheit der Proben liegen zudem klinische und experimentelle Informationen vor, die die Gewebe-Biobanken als ein extrem wertvolles Reservoir für mögliche Biomarker erscheinen lassen. Formalin ist das gängigste Fixierungsmittel bei der Präparation histologischer Proben und wird, wegen des geringen Preises und der guten Fixierungswirkung, vielerorts und seit mehr als hundert Jahren eingesetzt. Die Fixierung mit Formalin hat aber den Nachteil, dass es zu einer Quervernetzung der Proteine mit der Probenmatrix kommt. Dadurch werden die Proteine generell unlöslich und stehen damit einer weiteren Analytik nicht zur Verfügung. Durch Einsatz des ProteoExtract ® Formalin Fixed Tissue Kit können die Proteine unter Erhalt ihrer Primärstruktur auch aus diesen Proben extrahiert werden, um sie weiter zu analysieren. Auf diese Weise wird die gängigste Fixierungsmethode mit Formalin in ihrer Anwendbarkeit erweitert, ohne die Möglichkeiten der nachfolgenden Analytik einzuschränken. Damit können unter Einsatz des neuen Verfahrens Proben mit der modernen Proteinanalytik untersucht werden, die bereits sehr lange mittels Einsatz von Formalin konserviert wurden, das heißt, eine zeitliche Begrenzung der Analysierbarkeit von Proben entfällt. Immunologischer Nachweis von extrahierten Proteinen Aus mit Formalin fixierter Maus-Leber wurden Proteine mit Hilfe des ProteoExtract® Formalin Fixed Tissue Kit isoliert. Die Ergebnisse der Western-Blot Analyse bestätigten die Integrität der isolierten Proteine in der zu erwartenden molekularen Größe. Die aufgeführten Beispiele in Abbildung 1 zeigen das Ergebnis der selektionsfreien Extraktionsprozedur, mit der sowohl Proteine aus dem Zytoskelett (Cytokeratin), der Zellmembran (Calnexin) und aus dem Zytoplasma (GAPDH) gleichermaßen nachgewiesen werden können. Differentielle Proteomanalyse aus Formalin-fixiertem Gewebe Abb.1: Formalin-fixiertes Maus-Lebergewebe wurde mit dem ProteoExtract® Formalin Fixed Tissue Kit isoliert. Die erhaltenen Proteine wurden gefällt und anschließend im Probenpuffer auf ein SDS-Gel aufgetragen, aufgetrennt, auf eine Membran transferiert und immunologisch nachgewiesen. 14 | 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 In der pharmazeutischen Forschung werden im Rahmen der Suche nach Biomarkern, oder nach neuen Zielmolekülen oft vergleichende Untersuchungen von krankem und gesundem Gewebe durchgeführt. Dabei ist es von Interesse, Proteine zu finden, die in einer der Versuchsbedingungen differentiell (über- oder unterexprimiert) vorkommen. LABORWELT Abb. 2: Die massenspektrometrische Analyse von humanen Zervix-Karzinom-Proben im Vergleich zu Normalgewebe (Uterus) zeigt einen deutlichen Unterschied in der Funktion und Lokalisation der extrahierten und identifizierten Proteine. LABORWELT Dabei handelt es sich um Uridinphosphorylase Transferrin, HSP 27, Serotonin, LOST1 und die Guanylat-Cyclase 2. Dabei wurden mit Hilfe der Proteindatenbank und der generierten Massenlisten aus der Elektrospray-Massenspektrometrie nur Proteine als gehaltvoll identifiziert eingeordnet, wenn diese mindestens durch zwei unterschiedliche Peptidsequenzen aus der Proteindatenbank nachgewiesen werden konnten. Im Vergleich zu anderen Methoden erlaubt das beschriebene Verfahren die Isolierung sowie die Charakterisierung von löslichen Proteinen der nativen Größe und ist kompatibel zur Massenspektrometrie und somit für eine Vielzahl von proteinbiochemischen Analysetechniken, die eine Biomarkeridentifizierung über den Vergleich von normalen und erkranktem Gewebe ermöglichen. Literatur [1] Devaja, O., King, R.J., Papadopoulos, A., Raju, K.S., Eur J Gynaecol Oncol. (1997);18(1):16-22 Korrespondenzadresse Dr. Jörg von Hagen Merck KGaA PLS R&D C&B Frankfurter Straße 250 64271 Darmstadt Tel.: +49-(0)6151-725903 Fax: +49-(0)6151-72915093 eMail: joerg.von.hagen@merck.de www.merck.de Kennziffer 17 LW 02 · www.biocom.de In einem Experiment (Abb. 2) wurden in einem solchen Ansatz Proben aus gesundem Gebärmuttergewebe mit dem entsprechenden Krebsgewebe verglichen. Die Proben wurden nach Entnahme Formalin-fixiert und in Paraffin eingebettet. Aus diesen Proben wurden nach Entparaffinierung mittels des ProteoExtract® Formalin Fixed Tissue Kit die Proteine isoliert. Zur Reduzierung der Probenkomplexizität wurden die Proteine zunächst einer Kationenaustauschchromatographie unterzogen, die resultierenden Fraktionen nach Elution unterschiedlicher Salzstufen mit Trypsin verdaut und anschließend durch ESI-LCMassenspektrometrie analysiert sowie über Datenbankrecherche identifiziert. Das Profil der Massenspektrogramme der beiden Proben zeigt kaum einen Unterschied und belegt damit die Reproduzierbarkeit der Methode. Erst die Auswertung der Massenlisten und Identifizierung individueller Proteine, welche mit mindestens zwei Peptiden pro Protein nachgewiesen werden konnten, und der Gruppierung nach Funktion und Lokalisation, zeigt deutliche Unterschiede zwischen den beiden zu vergleichenden Proben (siehe Balkendiagramme in Abbildung 2). Dieses einfache Experiment verdeutlicht wie in einem Experiment nach Reduzierung der Probenkomplexizität aus bisher der Proteomanalyse nicht zugänglichen Probenmaterialien viele aussagekräftige Daten gewonnen werden können. So wurden in dem oben beschriebenen initialen Experiment sechs bekannte Proteine 1 im Kontext der Tumorgenese der Gebärmutter identifiziert. 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 | 15 Antibody Factory E P O R T Schlüsselreagenzien für die Proteomforschung im Hochdurchsatz Dr. Thomas Schirrmann, Dr. Michael Hust, Prof. Dr. Stefan Dübel, Technische Universität Braunschweig, Institut für Biochemie und Biotechnologie Dr. Zoltán Konthur, Max-Planck-Institut für molekulare Genetik, Berlin Dr. Ronald Frank, Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, Braunschweig Dr. Lars Toleikis, Deutsches Ressourcenzentrum für Genomforschung, Heidelberg Die Entwicklung der DNA-Sequenzierungstechnologien wurde durch die Aufgabe, das gesamte menschliche Genom zu entschlüsseln, vorangetrieben. Fünf Jahre nach Ende des Humangenomprojektes ist das Verständnis der Funktion der durch die rund 23.000 Gene kodierten Proteine des menschlichen Genoms jedoch immer noch rudimentär. Einer der limitierenden Faktoren dabei ist das Fehlen einer Hochdurchsatzmethode zur Herstellung von Antikörpern für die zellbiologische und biochemische Charakterisierung der vielen unbekannten Genprodukte und ihrer Interaktionspartner. In dem innerhalb des Nationalen Genomforschungsnetzes (NGFN) geförderten Projektes „Antibody Factory“ werden deshalb Methoden entwickelt, um Antikörper in vitro in großer Zahl herstellen zu können. Die in vitro-Herstellung mittels Phagendisplay bietet die Vorteile einer einfachen Automatisierung und der preiswerten Produktion in E. coli, kommt vollständig ohne Versuchstiere aus, ist weitgehend miniaturisierbar und benötigt nur sehr geringe Mengen der meist begrenzt verfügbaren Antigene. Begleitend werden verschiedene neuartige Methoden zur Antigenherstellung und für die Validierung der Antikörper in höherem Durchsatz untersucht. Key Words: Antibody Factory, Phagendisplay, rekombinante Antikörper, Proteome Binders Die systematische Erforschung des menschlichen Genoms, also die zunächst nicht hypothesengetriebene Untersuchung von Ort, Stärke und Zeit der Expression einer größeren Zahl von Genen mit DNA-Microarrays, hat der biomedizinischen Forschung bereits wertvolle neue Erkenntnisse gebracht. Schnell wurden aber auch die Abb. 1: Struktur und Forschungsaufgaben der Antibody Factory 16 | 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 Grenzen dieser Methodik deutlich: die große Zahl von Splicevarianten und die vielfältigen posttranslationalen Modifikationen machten bald klar, dass die Analyse des Transkriptoms allein nicht ausreicht, um ein systembiologisches Verständnis der Proteine und ihrer Wechselwirkungen zu erlangen. Um aber die volle funktionelle Komplexität des menschlichen Proteoms in gleicher Weise erforschen zu können wie das entsprechende Transkriptom, wird eine umfassende, standardisierte Kollektion von Antikörpern gegen die Genprodukte und ihre Modifikationen und funktionellen Varianten benötigt. Verfügbarkeit und Kosten für Forschungsantikörper Zwar sind viele Tausende Antikörper kommerziell erhältlich, jedoch sind die meisten davon gegen wenige, oft gleiche Antigene gerichtet (zum Beispiel mehr als verschiedene 900 Antikörper gegen den Tumorsuppressor p53). Dagegen gibt es für die überwältigende Mehrheit der Produkte der identifizierten offenen Leserahmen (ORFs, open reading frames) im Humangenom keine Binder. Zudem sind die verfügbaren Antikörper von sehr unterschiedlicher Qualität, Affinität und Reinheit, was einen standardisierten und parallelen Einsatz in modernen Technologien, wie etwa auf Microarrays, stark kompliziert. Polyklonale Antiseren stellen nur eine limitierte Ressource dar, sind nicht monospezifisch und deshalb für viele Anwendungen nicht geeignet. Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern erfordert den Einsatz der Zellkulturtechnik und ist damit etwa zehnfach teurer. Die momentanen Marktpreise von etlichen Tausend Euro für die Generierung monospezifischer Antikörper liegen deshalb in einem Bereich, der eine Entwicklung von Antikörpern gegen 23.000 oder mehr Proteine zu Forschungszwecken nicht erlaubt. Die tierbasierten Antikörpergenerierungsmethoden sind seit vielen Jahren technologisch ausgereizt – hier gibt es deshalb keine Möglichkeit einer Kostenminimierung in der substantiellen Größenordnung, die für ein Projekt dieser Größe notwendig wäre. Anders bei den in-vitro-Selektionsmethoden: hier wurde die TechnologieEntwicklung im vergangenen Jahrzehnt vor allem von der neuartigen Möglichkeit zur Herstellung beliebiger menschlicher Antikörper als Therapeutika getrieben – die Kosten für Antigenbereitstellung, Antikörperselektion und -validierung spielten dabei kaum eine Rolle. In Tabelle 1 sind die Anforderungen an eine Antikörperselekti- Kennziffer 18 LW 02 · www.biocom.de R LABORWELT Custom Monoclonal Antibodies in Just 8 Weeks! Fragen Sie in München nach dem NFGN-Angebot für Laborwelt Leser! Let us find the perfect match for your antigen in our library of 16 billion antibodies! The HuCAL GOLD® recombinant antibody library is High affinity monovalent or bivalent constructed from fully human antibody sequences Fab fragments ready for screening against your antigen. Up to 5 unique antibodies delivered in No animals, no immunizations — just high affinity just 8 weeks monoclonal antibodies faster than you ever thought Start with DNA and let us make the antigen possible ready for use in just 8 weeks! for you The library is ideal for antibodies against highly We only charge when we deliver! homologous antigens from any species, and the use of blocking protocols allows easy selection of epitope specific antibodies. AbD Serotec Munich Tel: +49 89 899 27 234 Fax: +49 89 899 27 5234 Email: sales.muc@ab-direct.com www.ab-direct.com/HuCAL R onsmethode für die Wirkstoffentwicklung den Erfordernissen für die Proteomforschung gegenübergestellt. Es wird klar, dass fast alle Parameter – angefangen von der Verfügbarkeit der Antigene bis zur Parallelisierung der Validierungsassays – völlig andere Optimierungsstrategien erfordern1. Für die funktionelle Genomforschung im akademischen Umfeld ist daher eine neue Technologie gefordert, die es ermöglicht, in einer integrierten, automatisierten Pipeline eine große Anzahl unbekannter Antigene ausgehend von der Gen-Accession-Nummer zu bearbeiten, und am Ende die entsprechenden Antikörper in biochemisch identischem Format, gleicher Reinheit und Qualität zu erhalten. Ein zentraler Befund der in Tabelle 1 dargestellten Analyse ist, dass im Moment keine entsprechende Pipeline kommerziell oder im akademischen Bereich zur Verfügung steht, und deshalb substantielle Entwicklungs- und Forschungsarbeit geleistet werden muss, um dem Ziel einer systematischen Analyse des Proteoms mit Antikörpern näherkommen. Die „Antibody Factory“ hat innerhalb des Nationalen Genomforschungsnetz (NGFN) den Auftrag erhalten, diese Entwicklung durchzuführen. Ausgangsmaterial Antigen Ein großer Teil des Aufwandes für die Herstellung eines Antikörpers gegen ein unbekanntes Protein entsteht zunächst durch die Antigenherstellung. Zwar ist E P O R T die größte Zahl an proteinkodierenden Sequenzen mittlerweile in Form sehr großer Gensammlungen als cDNAs und ORFs verfügbar. Kleinere, gut lösliche Proteine lassen sich in E. coli produzieren und über entsprechende Tags aufreinigen. Eine große Zahl an Proteinen, insbesondere aus höheren Organismen, kann jedoch in E. coli nur schlecht oder gar nicht produziert werden, und eine erfolgreiche Translation bedeutet nicht, dass die Proteine korrekt gefaltet sind. Deshalb konnten allgemein einsetzbare Protokolle für die Proteinproduktion und -aufreinigung bisher nicht erarbeitet werden, und eine individuelle Optimierung der Antigenproduktion und -reinigung ist im Hochdurchsatz unmöglich. Ein möglicher Ausweg besteht darin, die Menge des benötigten Antigens für Antikörperselektion, -screening und -validierung dramatisch zu reduzieren. Auf diese Weise könnten schon in vitro-Translationen und Aufreinigungen im Kleinstmaßstab genügen, um eine ausreichende Menge an Antigenmaterial zu liefern. Eine weitere Alternative ist die Verwendung von synthetischen Peptiden, deren Aminosäureabfolge aus der Sequenzinformation der Targetproteine oder -gene abgeleitet werden kann. Automatisierbare Verfahren zur chemischen Peptidsynthese mittels der parallelisierten „SPOT-Synthese-Methode“ sind etabliert2. Daraus ergeben sich jedoch zwei wichtige Einschränkungen. Zum einen hat sich gezeigt, dass nur wenige Peptide eines Proteins geeignet sind, um gegen diese Antikörper zu selektieren. Antikörper, die gegen Peptide erfolgreich selektiert wurden, erkennen nicht immer das native Antigen und sind deshalb in ihrer Anwendung nicht für jeden Assay geeignet sind. Ein Ausweg ist hier die Verwendung einer größeren Zahl verschiedener Peptide für jedes einzelne Proteinantigen. Daher werden entsprechende hochparallelisierte Verfahren im Rahmen der „Antibody-Factory“ entwickelt. In der Antibody Factory werden auch Erfahrungen gesammelt, um bioinformatische Verfahren so zu optimieren, dass damit in Zukunft eine bessere Vorhersage der Eignung verschiedener Peptidstücke aus einem Protein zur Selektion möglich wird und so die pro Antigen auszutestende Peptidzahl wieder verringert werden kann. In-vitro-Antikörperselektion durch Phagendisplay Konventionelle Antikörpertechnologien, wie die Erzeugung polyklonaler Antiseren durch Immunisierung von Tieren oder die Generierung monoklonaler Antikörper durch die Hybridomtechnik, sind von einer in-vivo-Immunantwort abhängig. Damit ist es schwierig bis unmöglich, spezifische Antikörper gegen hochkonservierte und damit nichtimmunogene, toxische oder instabile Proteine zu generieren. Im Gegensatz dazu erfordern in vitro-Antikörperselektionstechniken, wie das Phagendisplay, keine in vivo-Immunantwort. So konnten mithilfe des Phagendisplays Antikörper gegen hochinteressante, aktive Proteinkonformationen, zum Beispiel nach Tab. 1: Unterschiedliche Anforderungen bei der Entwicklung von Antikörpern für therapeutische Anwendung gegenüber der Proteomforschung Ansatz Hypothesen-getrieben Systematisch Hauptfeld Target-Proteine (Antigen) Therapeutische Anwendung Einzelne Proteine Bekannt und i. d. R. gut charakterisiert Verfügbar Proteom-Forschung Sehr große Zahl an Proteinen i. d. R. unbekannt und nicht charakterisiert Häufig nicht verfügbar, d. h. Antigenproduktion muss in den Gesamtprozess integriert sein Anzahl an Schritten nicht limitiert Minimale Anzahl von Schritten Selektionskosten unkritisch Optimierung auf geringstmögliche Selektionskosten Optimierung für minimale Fehlerrate einige Prozent Fehlerrate akzeptabel Umklonierung nach Selektion notwendig Individuelle Anpassung an Antigen Umklonierung nach Selektion zu aufwendig Optimiert auf Robustheit und Durchsatz, d. h. individuelle Anpassung an Antigen unmöglich Individuelle Optimierung auf bestimmte Anwendung (Affinität, Stabilität usw.) Eigenschaften optimiert auf geringe Immunogenität, Pharmakokinetik Große Mengen an wenigen Bindern Individuelle Optimierungen zu aufwendig Optimiert auf Kompatibilität zu bestehenden Standardassays Validierung Umfangreiche, individuell ausgewählte Assays mit größeren Antigenmengen Miniaturisierbare, automatisierbare, parallelisierbare Assays mit geringen Antigenmengen Quellen Viele Firmen Kein kommerzieller Service für die benötigte Anzahl/KostenRelation verfügbar Kosten Wenig limitierend (Hauptkosten für Kunden sind spätere Lizenzgebühren) Optimiert für minimale Kosten pro Antigen Selektionsprozess Antikörper 18 | 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 Geringe Mengen an sehr vielen Bindern LABORWELT R E P O R T Kofaktor-Bindung, gewonnen werden3 – im Tiersystem ist dies unmöglich. Außerdem lassen sich tierbasierte Antikörpertechnologien schwierig parallelisieren und nicht miniaturisieren – zur Immunisierung sind signifikant größere Antigenmengen nötig als für eine Phagenselektion. Phagendisplay kann komplett ohne Formatwechsel in Mikrotiterplatten durchgeführt werden, und die Antikörperfragmente müssen nicht in teurer Säugerzellkultur produziert werden, sondern werden von E. coli sekretiert. Vorteile der in vitro-Gewinnung von Forschungsantikörpern Ein signifikanter Vorteil der in-vitro-Antikörpergewinnung ist, dass im Augenblick der Selektion am Antigen neben dem Bindereagens selbst auch das dafür kodierende Gen gewonnen wird. Dies ermöglicht, falls das Antigen in einer systematischen Studie als interessant auffällt, eine einfache Umklonierung zur Veränderung der Eigenschaften des Antikörpers und dadurch eine Anpassung an eine große Vielfalt funktioneller Assays (Abb. 2). Das in der „Antibody Factory“ vorhandene Spektrum an Vektoren erlaubt bereits verschiedenste Anwendungen, wie zum Beispiel die Umwandlung in viele IgG-Typen aus Maus und Mensch, den knock-down von Oberflächenrezeptoren in Säugerzellen durch Intrabodies und sogar die direkte Weiterentwicklung in ein Therapeutikum – denn die Antikörpersequenzen der Phagenbibliotheken der „Antibody Factory“ sind von vornherein menschlichen Ursprungs. Antikörperselektion Das Prinzip des Antikörper-Phagendisplays beruht auf der genetischen Fusion der antigenbindenden Bereiche von Antikörpern (zum Beispiel single chain Fv (scFv) oder Fab-Fragment), mit dem Protein pIII filamentöser Bakteriophagen4. Dadurch werden die Antikörperfragmente auf der Phagenoberfläche präsentiert (Antikörperphage) und gleichzeitig deren genetische Information in dem jeweiligen Phagenpartikel verpackt, so dass eine Kopplung von Genotyp und Phänotyp erreicht wird. Die Selektion erfolgt dann durch die antigenspezifische Bindung von Antikörperphagen an das immobilisierte Antigen. In Anlehnung an die Goldwäscher wird dieses Verfahren auch als „Panning“ bezeichnet. Die Immobilisierung des Antigens kann beispielsweise an die Oberfläche von Mikrotiterplatten oder an magnetische Mikrosphären erfolgen. Nach intensiven Waschschritten zur Entfernung unspezifischer Antikörperphagen werden die spezifischen Binder abgelöst und zur Infektion von E. coli-Zellen eingesetzt. Durch Wiederholung des gesamten Zyklus LABORWELT Abb. 2: Die rekombinante Natur von Antikörpern aus dem Phagendisplay ermöglicht einfache Änderungen des Formats und Anpassung an verschiedene Testsysteme. Gezeigt sind bereits in der „Antibody Factory“ verfügbare Systeme. Eine große Vielfalt weiterer Formate ist möglich. – meistens zwei bis drei Mal – werden die antigenspezifischen Antikörperphagen soweit angereichert, dass durch ein Screening Einzelklone identifiziert und isoliert werden können. Ein wichtiger Vorteil des Phagendisplays ist, dass das biochemische Milieu, zum Beispiel pH, Salzkonzentration, Temperatur, der Einsatz von Kompetitoren oder Kofaktoren etc., für die Selektion in vitro exakt eingestellt werden kann, wobei die Robustheit der Phagenpartikel eine große Bandbreite an Selektionsbedingungen erlaubt5,6. Für einen proteomweiten Ansatz sind „universelle“ Antikörperphagenbliotheken erforderlich, die auf dem naiven Repertoire von Antikörpergenen oder auf synthetisch randomisierten Antigenbindungsdomänen beruhen. Diese Bibliotheken müssen möglichst von sehr hoher Diversität (> 5 x 108) sein, um gegen jedes Target einen passenden Binder zu enthalten. Neben der Diversität einer Antikörpergenbibliothek spielt auch die optimale Präsentation der Antikörperfragmente auf den Phagen eine sehr wichtige Rolle für das Phagendisplay. Antikörper und deren rekombinante Derivate enthalten Disulfidbrücken, deren Ausbildung erst im Periplasma von E. coli erfolgen kann. Außerdem kann es zu Problemen bei ihrer Faltung in E. coli kommen, weshalb optimierte Phagendisplay-Vektoren für die Herstellung entwickelt worden sind7,8. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden zwei „naive“ humane Antikörpergenbibliotheken (HAL4,7) mit sehr hoher Diversität (>5x 109) konstruiert8. Darüber hinaus ermöglicht der Einsatz von Hyperphage, einem speziellen Helferphagen mit deletiertem gIII-Gen, ein polyvalentes Display, da keinerlei WildtyppIII-Protein gebildet werden kann9,10. Das polyvalente Display erhöht in der ersten und kritischen Selektionsrunde die Chance, einen antigenspezifischen Binder aus der Ausgangsbibliothek anzureichern. In den folgenden Runden wird dann durch Wechsel auf einen herkömmlichen M13Helferphagen auf ein monovalentes Display umgeschaltet, um die höheraffinen Binder zu selektieren. Automatisierung und Parallelisierung Die Automatisierung und Parallelisierung der Antikörperselektionen ist ein weiterer wichtiger Schritt, um einen Durchsatz bei der Antikörpergenerierung zu erreichen, der den Anforderungen der systematischen Proteomanalyse genügt. Die Verwendung von Mikrotiterplatten oder von magnetischen Mikrosphären zur Immobilisierung der Antigene ermöglicht schon jetzt eine größere Parallelisierung vieler Antikörperselektionen und lässt sich durch Roboterisierung weitestgehend automatisieren11. Neue Technologien, wie die Verwendung sogenannter Patch-arrays, auf denen Peptide hochparallel direkt chemisch synthetisiert werden, werden untersucht, um gleichzeitig die nötige Menge an eingesetzter Antikörperphagenbibliothek erheblich zu reduzieren. Screening und Produktion Die Analyse der selektierten Binder ist ein weiterer limitierender Schritt in einem auf 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 | 19 R P O R T Laborwelt Hintergrund weisreagenzien für die eine systematische Proteomanalyse definiert werden können. Die Antikörperfabrik (Antibody Factory) hat die Aufgabe, Methoden der in-vitroAntikörperherstellung zu entwickeln, die es ermöglichen, zu annehmbaren Kosten Antikörper gegen jedes Protein des Menschen herzustellen. Diese Aufgabe teilen sich mehrere Labors, die deutschlandweit zusammenarbeiten. An dem vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) im Rahmen des Nationalen Genomforschungsnetzes (NGFN) geförderten Vorhaben sind neben dem Institut für Biochemie und Biotechnologie der Technischen Universität Braunschweig (Koordination) das Max-Planck-Institut für molekulare Genetik in Berlin, das Deutsche Ressourcenzentrum für Genomforschung (RZPD) in Heidelberg und Berlin sowie das Helmholtz-Institut für Infektionsforschung (vormals GBF) in Braunschweig beteiligt. Die „Antibody Factory“ ist Teil eines europaweiten Netzes („ProteomeBinders“), das sich dieser sehr umfangreichen biomedizinischen Forschungsaufgabe verschrieben hat. Weitere Information sind unter www. antibody-factory.de zu finden.. Fazit Die Antibody Factory hat bewiesen, dass eine deutliche Weiterentwicklung der in vitro-Antikörperselektion mithilfe des Phagendisplays für die Bedürfnisse eines systematischen Forschungsansatzes möglich ist, und damit die Tür zur Herstellung von Bindemolekülen für die Proteomforschung in großer Zahl weit aufgestoßen. Erste wichtige Ziele auf dem Weg zu einer kostensparenden Pipeline zur Herstellung und Validierung einer großen Zahl von Antikörpern wurden erreicht. Dabei wurde die erfolgreiche Generierung von Antikörperfragmenten gegen eine Vielzahl von Antigenen demonstriert, darunter auch gegen problematische Targets, wie Rezeptoren mit sieben Transmembrandomänen und andere Antigene großer biomedizinischer Relevanz. Die noch vor uns liegende Aufgabe ist trotzdem gigantisch: die eigentliche Produktionsphase von Nachweisreagenzien für jedes humane Protein für die Forschung wird von ihrem Umfang vergleichbar mit dem Humangenomprojekt sein. Sie sollte deshalb in internationalen Verbünden angegangen werden14. Antikörperformate und Assaykompatibilität Validierung Literatur Im Phagendisplay werden üblicherweise Antikörperfragmente generiert, die über zusätzliche Peptid-Tags aufgereinigt und mit entsprechenden Nachweisreagenzien in vielen Standardassays nachgewiesen werden können. Viele Anwendungen in der Forschung sind jedoch hinsichtlich ihrer Detektionsreagenzien auf IgGs adaptiert. Außerdem sind scFv- und Fab-Fragmente im Gegensatz zu IgGs monovalent. Eine Lösung stellt die Konvertierung in das IgG-Format oder in ein IgG-ähnliches oder bivalentes Antikörperformat dar (Abb. 2). Entsprechende Expressionsvektoren mit kompatiblen Restriktionsschnittstellen (Kassettensystem) wurden entwickelt, die beispielsweise die Fusion von scFv-Genfragmenten mit dem Fc-Teil von IgGs vereinfachen. Diese scFv-Fc-Fusionskonstrukte verfügen über IgG-ähnliche Eigenschaften wie den Aviditätseffekt durch Bivalenz und den Nachweis durch verfügbare Fc-spezifische Sekundärantikörperkonjugate. In der Antibody Factory wurden aber auch völlig neue Antikörperformate, wie das „scFab“-Format, entwickelt, die die Vorteile des Fab-Formates (konstante Domänen, bessere Stabilität) mit denen der scFv-Fragmente (nur eine Polypeptidkette) kombinieren und eine verbesserte Kompatibilität zu Standardimmunassays aufweisen12. Eine wichtige Arbeitsaufgabe für eine Antikörperplattform ist der Validierungsprozess der generierten Antikörper. Das Primär-Screening mittels Antigen-ELISA verbraucht deutlich mehr Antigen als der gesamte Antikörperselektionsprozess. Für ein Sekundär-Screening können weitere Negativkontrollen eingesetzt werden, beispielsweise um Kreuzreaktivitäten auszutesten. Durch Alternativen zum ELISA wie die aus den Arraytechnologien bekannte Multiple Spotting-Technik (MIST) kann die benötigte Menge an Antigen bei gleichbleibender Validierungsqualität ganz erheblich gesenkt werden13. Arraybasierte Proteinchips ermöglichen wiederum Tests auf Kreuzreaktionen gegenüber hunderten bis tausenden Proteinen. Für viele Antikörper können detaillierte Daten über die Spezifität und Kreuzreaktivität auch mittels peptidbasierter Epitopanalysen erreicht werden, sofern die Peptide nicht bereits für die Selektion eingesetzt werden. Diese Möglichkeit ist jedoch auf Antikörper beschränkt, die keine konformationalen Epitope erkennen. Die weitere Validierung kann auch die Affinitätsbestimmung der generierten Binder, zum Beispiel mittels Oberflächenplasmonresonanz (Biacore ®), einschließen. Für die unmittelbare Zukunft wird eine zentrale Frage sein, Qualitätskriterien zu etablieren, nach denen Nach- [1] [2] [3] 20 | 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] Hust, M. and Dübel, S., Trends in Biotechnology 22 (2004), 8-14. Frank, R., Tetrahedron 48 (1992), 9217-9232. Nizak, C., Monier, S., del Nery, E., Moutel, S., Goud, B., Perez, F., Science 300 (2003), 984-987 Breitling, F., Dübel, S., Seehaus, T., Klewinghaus, I., Little, M., Gene 104 (1991), 147-153 Hust, M., Dübel, S. and Schirrmann, T., Meth. Mol. Biol. 408 (2007). Hust, M. and Dübel, S., Meth. Mol. Biol. 295 (2005), 71-95. Kirsch, M., Zaman, M., Meier, D., Dübel, S., Hust, M., Journal of Immunological Methods 301 (2005), 173-185. Hust, M., Toleikis, L. and Dübel, S., Handbook of therapeutic antibodies. Kapitel: Antibody phage display. Ed. Dübel, S., Willey-VCH-Verlag (2007). Rondot, S., Koch, J., Breitling, F., Dübel, S., Nature Biotechnology 19 (2001), 75-78A. Soltes, G., Hust, M., Ng, K.K.Y., Bansal, A., Field, J., Stewart, D.I.H., Dübel, S., Cha, S., Wiersma, E., Journal Biotechnology 127 (2007), 626-237. Konthur, Z., Hust, M.. Dübel, S., Gene 364 (2005), 19-29. Hust, M., Jostock, T., Menzel, C., Voedisch, B., Mohr, A., Brenneis, M., Kirsch, M.I., Meier, D., Dübel, S., BMC-Biotechnology 7:14 (2007). Angenendt P, Wilde J, Kijanka G, Baars S, Cahill DJ, Kreutzberger J, Lehrach H, Konthur Z, Glokler J., Anal. Chem. 76 (2004), 2916– 2921. Taussig, M.J. et al. Nature Methods 4 (2007), 13-17. Korrespondenzadresse Prof. Dr. Stefan Dübel Technische Universität Braunschweig Institut für Biochemie und Biotechnologie Abteilung Biotechnologie Spielmannstr. 7 38106 Braunschweig Tel.: +49-(0)531-391-5731 Fax: +49-(0)531-391-5763 eMail: s.duebel@tu-bs.de Kennziffer 19 LW 02 · www.biocom.de Durchsatz optimierten Antikörperselektionsprozess. Polyklonale Phagen-ELISA mit Antikörperphagengemischen aus den einzelnen „Panning“-Runden geben meistens unzureichende Information über den Erfolg einer Selektion. Auch monoklonale Phagen-ELISA einzelner Antikörperphagenklone können falsch-positive Ergebnisse liefen, da nicht selten Antikörperfragmente nur in Fusion mit dem Phagenprotein pIII ihr Antigen erkennen und durch das Panning angereichert werden. Deshalb wird das Primär-Screening in der Antibody Factory ausschließlich mit löslich in E. coli produzierten Antikörperfragmenten mittels Antigen-ELISA durchgeführt. Durch ein spezielles Vektordesign können die Antikörperfragmente als pIII-Fusionsprotein auf der Phagenhülle präsentiert oder auch als lösliches Antikörperfragment direkt produziert werden. Dadurch entfällt der kosten- und zeitintensive Schritt der Umklonierung in einen E. coli-Expressionsvektor. Antikörperselektion und -screening können mittlerweile in ein- und demselben Bakterienstamm stattfinden. Damit hat die Antibody Factory bereits einen wichtigen Meilenstein in einer kostengünstigen Hochdurchsatzmethode erreicht. E LABORWELT 24. APRIL 14 – 18 Uhr Investors Special – Venture Lounge „Life Science, Medizintechnik & Nanotechnologie“ 15 – 18 Uhr BioTOP Agenda: Entwicklung von Biopharmazeutika – Aktuelle Trends entlang der Wertschöpfungskette 18:30 Uhr V. Bionnale der Biotechnologie · Empfang 25. APRIL 9 – 17 Uhr Regenerative Medicine in Germany and France – State of the Art and Future Perspectives P L AT I N P A R T N E R G O L D PA R T N E R S I L B E R PA R T N E R M E D I E N PA R T N E R B L I T Z L I C H T Protein-Analytik mini VE Vertical Electrophoresis System (GE Healthcare) durchgeführt. Multiplex 2D-Western blotting und interne Standardisierung mit dem ECL Plex-System Dr. Rita Marouga. GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Sweden 2D-Elektrophorese Das PC-3U-Zelllysat wurde durch Einsatz des 2D-Clean-Up Kit (GE Healthcare) für die 2D-Elektrophorese vorbereitet. Die Proteinkonzentration wurde mit dem 2DQuant Kit (GE Healthcare) bestimmt. PC3U-Lysat, entsprechend einer Menge von 50 µg Gesamtprotein, wurde mit 400 pmol CyDye DIGE Fluor, Cy2 minimal dye für 30 Minuten auf Eis markiert. Obgleich die zweidimensionale Gelelektrophorese allgemein nicht als moderne Technologie gilt, bleibt sie doch die vielleicht beste aller derzeit verfügbaren Protein-Separationstechnologien – und neue kommerzielle Verbesserungen der Trennstategie – etwa die 2D-DIGE von GE Healthcare – verbessern ihre Leistungsfähigkeit noch weiter. Ein einzelnes 2D-Gel kann Tausende von Proteinspots auflösen. Ein Vergleich der Intensitäten individueller Spots liefert sowohl qualitative als auch quantitative Informationen über Veränderungen, zum Beispiel in gesundem und erkrankten Gewebeproben. Die 2D-DIGE umfasst die Markierung zweier verschiedener Protein-Gemische mit zwei unterschiedlichen Cyanin-Farbstoffen, die bei jeweils verschiedenen Anregungswellenlängen fluoreszieren. Die so markierten Proteinproben werden dann in einem einzelnen 2D-Gel aufgetrennt. Die Größen- und Ladungs-angepassten Farbstoffe gewährleisten dabei die Co-Migration identischer Proteine. Die einzigartige Nutzung eines internen (Misch)standards aller Proben stellt sicher, das die sichtbaren Veränderungen der Proteinexpression tatsächlich vorhanden und fehlerfrei sind. GE Healthcare entwickelt und vermarktet fortgeschrittene Werkzeuge für die Biomarker- und Wirkstoffforschung und hat seine 2D-DIGE-Plattform unlängst um ein quantitatives Western blot-System erweitert, das auf der beschriebenen CyaninFarbstoff-Plattform aufbaut. Das Amersham ECL Plex™ Western blotSystem basiert auf empfindlichen, mit CyDye™-Farbstoffen konjugierten sekundären Antikörpern und wird derzeit meist nach der Proteinauftrennung mit eindimensionalen SDS-PAGE-Gelen (1D-Gele) eingesetzt. Das ECL Plex Western-blotting bietet neben Sensitivität, Linearität und einem dynamischen Bereich von fast vier Größenordnungen, die Möglichkeit Multiplex-Analysen durchzuführen, wie etwa die gleichzeitige Detektion von zwei Protein-Epitopen auf derselben Membran1. Multiplexing ist ein leistungsstarkes und oft bei der 1D-Elektrophorese eingesetzes Hilfsmittel, um ein interessierendes Protein im Vergleich zu einem konstitutiv exprimierten Haushaltsprotein zu quantifizieren, das die Bedingungen in der jeweiligen Probe anzeigt. Dieser neue Ansatz stellt einen “internen Standard” zur Verfügung, der eine verlässlichere Quantifizierung spezifischer Proteine ermöglicht. Diese Studie beschreibt – zusätzlich zu dem etablierten 1D-Arbeitsablauf – ein zweidimensionales Western-blot-Verfahren auf Basis fluoreszierender sekundärer Antikörper. 1D-Elektrophorese Humane Prostata-Krebszellen (PC-3U) 3 wurden in RIPA-Puffer (50nM Tris-HCL, pH 8,0, 150mM NaCl, 10% Glycerin, 1% NP40, 0,5% Desoxycholat) lysiert und auf 12% Tris-Glycin-Gele (Novex) geladen, in einer vierfachen Verdünnungsreihe mit 30µg bis 0,47µg Gesamtprotein. Die Gelelektrophorese wurde für 2,5 Stunden bei einer Spannung von 100 V in einem Abb. 1: 1D-Elektrophorese eines PC-3U-Zellextraktes. A. ECL Plex Cy3-konjugierte SekundärAntikörper gegen GSK3β; B: ECL Plex Cy5-konjugierte Sekundär-Antikörper gegen phosphorylierte Formen von GSK3β (pGSK3β) 22 | 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 Abb. 2: Farbbilder von 1D-Western blot-Scans. A: ECL Plex Cy3-konjugierte Sekundär-Antikörper gegen das GSK3β-Protein; B: ECL Plex Cy5-konjugierte Sekundär-Antikörper gegen die phosphorylierte Form von GSK3β; C: Überlagerung von A und B. Das Molekulargewicht (kDa) ist links angezeigt Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 mM Lysin gestoppt. Für jedes Immobiline DryStrip-Gel wurde unmarkiertes PC-3UZelllysat (entsprechend 25µg Protein) mit Cy2-markiertem PC-3U-Zelllysat (entsprechend 5 µg Protein) gemischt. Die eletrophorestische Trennung in der ersten Dimension wurde auf 7 cm Immobiline DryStrip pH 7-11-Gelen durchgeführt, und selektiert, weil der vorhergesagte pI von GSK3β bei 8,95 liegt. Eine Mischung des markierten und unmarkierten PC-3U-Zelllysates (entsprechend 30 µg Protein) wurde mittels cup loading auf die rehydratisierten Strips aufgetragen, und die Proben wurden bei 11 kVh auf dem Ettan IPGphor III-Instrument fokussiert4. Die Auftrennung in der zweiten Dimension durch SDS-PAGE wurde im miniVE Vertical Electrophoresis System unter Einsatz von 12% Tris-Glycin-Gelen mit 2D-Wells durchgeführt. ECL Plex Fluorescent rainbow Markers wurden zwecks Größenbestimmung auf das Gel geladen. Proteinproben wurden zunächst behutsam bei 15 mA für 15 Minuten in das Gel geladen, gefolgt von einer zweistündigen Auftrennung bei 30 mA pro Gel. LABORWELT B L I T Z L I C H T Protein blotting/ Fluoreszenzdetektion Nach der elektrophoretischen Auftrennung wurden die Gele auf Hybond-LFP-Membranen übertragen. Für den Transfer für 2,5 Stunden bei 25V wurde eine TE 22 Mini Tank Transfer-Einheit eingesetzt. Danach wurde über Nacht bei 4 °C in 2%igem ECL Advance Blocking Reagent inkubiert. Um die beta-Formen der GlycogenSynthase-Kinase-3 zu visualisieren, wurden die Blots dann mit den Primärantikörpern Polyclonal-anti-phospho-GSK-3β (Ser9) aus Kaninchen und Monoclonal-anti-GSK-3β aus der Maus (1:1000 Verdünnung TBS + 0,1% Tween-20; TBST) über Nacht bei 4 ºC inkubiert. Die Blots wurden jeweils zwei Mal für 5 Minuten in TBST gewaschen. Dann wurden sie unter Lichtschutz für eine Stunde mit sekundären Antikörpern inkubiert: ECL Plex-Ziegen-α-Kaninchen-IgGCy5 und ECL Plex Ziegen-α-Maus-IgG-Cy3 (1:2.500 Verdünnung in TBST). Die Membranen wurden dreimal schnell gewaschen und danach viermal für je 5 Minuten in TBST gewaschen, gefolgt von zwei kurzen Waschschritten in TBS. Die Membranen wurden vor dem Scanning für eine Stunde bei 40 ºC getrocknet. Das Imaging wurde auf einem Typhoon 9410-Scanner (GE Healthcare) unter Einsatz eines 633-nm (Rot)-Lasers mit einem 670BP30Filter für die Cy5-konjugierten Antikörper sowie eines 532-nm (Grün)-Lasers mit einem 580BP30-Filter für die Cy3-konjugierten Antikörper durchgeführt. Der PMT-Wert wurde eingestellt, bis die intensivste Bande annähernd Sättigung erreicht hatte. Die Bilder wurden dann mittels der ImageQuant TL-Software (GE Healthcare) ausgewertet. darunter die Phosphorylierung von GSK3β4. Die TGF-β-Aktivierung induziert normalerweise eine signifikante Phosphorylierung von GSK3β, doch in dieser Studie wurde lediglich unaktiviertes PC-3U-Zelllysat verwendet. Wir detektierten daher eine Phosphorylierung, ohne jede TGFβ-Aktivierung. Dies kann durch den permanenten danamischen Zellprozess der Phosphorylierung/Dephosphorylierung erklärt werden. Wie ein Überlagerungsbild der anti- GSK3β- und anti-phospho-GSK3β (Ser9)-Scans klar zeigt, ist eine Population von GSK3β in PC-3U-Zellen ohne TGF-β-Aktivierung phosphoryliert. Ergebnisse der 2D-Gelelektrophorese Die zweidimensionale Gelelektrophorese im Miniformat erlaubt eine hohe Auflösung bei der Proteinauftrennung nach dem unterschied- lichen PI und Molekulargewicht der Proteine. Zugleich ermöglicht das Miniformat eine gut handhabbare und schnelle Auftrennung, verglichen zur traditionelleren großformatigen 2D-Gelelektrophorese. In dieser Arbeit, wurde ein Teil des in der 2D-Gelelektrophorese eingesetzten PC3U-Zelllysates mit CyDye DIGE Fluor Cy2 minimal dye markiert, um das Gesamtprotein direkt zu visualiseren, ohne später die Membran anfärben zu müssen. Abbildung 3A zeigt eine Überlagerung der Cy2-, Cy3- und Cy5-Scans, des Gesamtproteins (blau), von GSK3β (grün) und pGSK3β (rot). Abbildung 3B zeigt ausschließlich die zwei Formen des Targetproteins, GSK3β (grün) and pGSK3β (rot). Unterschiedliche Epitope an derselben Position, die von beiden Antikörpern detektiert wurden, erscheinen gelb (Abb. 3A u. 3B). Die Positionen der detektierten Spots stimmen mit Kennziffer 20 LW 02 · Informationen ordern? · www.biocom.de Novagen® & Calbiochem® NEU Sample Preparation Brochure Tools for Protein Research ProteoExtract®Formalin Fixed Tissue Kit Zur Extraktion von löslichen, ganzen Proteinen aus Formalin-fixiertem und in Paraffin eingebettetem Gewebe Ergebnisse der 1D-Gelelektrophorese Nach Einsatz einer Mischung der fluoreszierenden ECL Plex-Ziegen-α-Maus-IgG-Cy3und ECL Plex-Ziegen-α-Maus-IgG-Cy5-Antikörper wurden GSK3β and phospho-GSK3β (Ser9) simultan in einem Blot detektiert. (Abb. 1). Der anti-GSK3β-Primär-Antikörper erkannte zwei Banden bei etwa 48 und 51 kDa (Abb. 1A). Die 48-kDa-Bande entspricht GSK3β, während die 51-kDa-Bande GSK3α repräsentiert – laut Hersteller ein Resultat der Kreuzreaktivität des Primärantikörpers. Der anti-pGSK3β-Primärantikörper erkannte zudem zwei Proteinbanden bei 48 und 49-50 kDa (Abb. 1B). Die 48-kDa-Bande korrespondiert mit an Serin-9 phosphoryliertem GSK3β. Die 49- bis 50-kDa-Bande einscheint ein wenig schmierig, als nicht distinkt aufgetrennte Protein-Isoform. Möglicherweise korrespondiert dieser Befund mit unterschiedlichen Phosphorylierungszuständen von GSK3β, die im Gel unterschiedlich weit wandern. Eine weitere mögliche Erklärung ist, dass die 49- bis 50-kDa-Bande unspezifisch ist und demzufolge nicht GSK3β entspricht. TGF-β ist ein starker Wachstumsfaktor, der eine Reihe zellulärer Prozesse stimuliert, LABORWELT • Hervorragende Übersicht unserer Produkte im Bereich Proteinextraktion und Proteinaufreinigung • Applikationsliste und Anwendungsbeispiele Bestellen Sie Literatur gratis auf unserer Website: www.merckbio.eu/LITERATURE Sample Prep AdvertR1.indd 1 • Für Gewebe, Blöcke und Objektträger (sowohl frische als auch ältere Proben) • Detergenzienfreie Lösungen • Für gefärbte oder ungefärbte Gewebeproben • Hohe Proteinausbeute: liefert reichlich Material für verschiedene Folgeanalysen (z.B. Western Blot, ESI LC/MS und MALDI MS) Für weitere Informationen kontaktieren Sie bitte Ihren lokalen Ansprechpartner: oder unser Team vom Technischen Service: www.merckbio.eu/ AccountManagers 0800 1003 496 (Freephone) techservice@merckbio.eu 30/03/2007 17:05:00 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 | 23 ���������������� ���� �������������������������������������������� ������ �������� ����������������� ����������������� ���������������� � ���������� ��� �� � ������������� �� ��� ��� �� �� ������������������ ��� ���������������������������������� �������������������������������� ������������������������������������� ��������������������������������� ����������������������������������� ����������������������������������� ������������������������������ ��������������������������������� ��������������������������������� ������������������������������������ ������������������������������������� ����������������������������������� ������� ������������������������������������ ��������� ���������������������� ���������������������� ������������� ����������������� ������������������������ ����������������������� 24 | 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 Abb 3: Bilder eines 2D-Western blot-Scans. A: Überlagerung von Cy2-, Cy3- und Cy5- Bildern; B: Überlagerung der Cy3- und Cy5-Bilder; C: Cy3-Bild; D: Cy5-Bild. Gesamtprotein (minimal Cy2markiert, blau), der ECL Plex Cy3-konjugierte Sekundär-Antikörper ist gegen das GSK3β (grün) und der ECL Plex Cy5-konjugierte Antikörper gegen die phosphorylierte Form von GSK3β (rot) gerichtet. Das Molekulargewicht und der pH-Bereich sind in Feld A gezeigt. A. Protein-Spots vom GSK3β (48kDa), GSK3α (51kDa) und der an Ser 9 phosphorylierten Form von GSKβ sind angezeigt. den vorhergesagten pIs von 8,95 und 8,98 und den Molekulargewichten von 48 und 51 kDa für die α- und β-Formen von GSK3 gut überein. (http://au.expasy.org/tools/pi_tool.html). Unterschiedliche Phosphorylierungszustände werden auf 2D-Gelen als Spot-“Bänder” angezeigt, abhängig von der Zahl der unterschiedlichen Zustände. Dabei bewirkt eine Phosphatgruppe eine Verschiebung zur Anode sowie eine geringfügige Größenzunahme (80 Da). GSK3β verfügt über sechs potentielle Phosphorylierungstellen (Ser9, Ser21, Thr43, Tyr216, Ser389 und Thr390; Cell Signalling). Rein rechnerisch5 liegt der vorhergesagte isoelektrische Punkt von unphosphoryliertem GSK3β bei 8,98 und für ein aufsteigend an den sechs Stellen phosphoryliertes GSK3β bei jeweils 8,90, 8,81, 8,71, 8,59, 8,44 und 8,825 (voll phosphoryliert). Es erscheint wahrscheinlich, dass die in Abbildung 3A-C gezeigten SpotBänder mit den unterschiedlichen Phosphorylierungszuständen der GSK3-Isoformen korrespondieren. Das Molekulargewicht der zwei Proteinspots im Zusammenhang mit phosphoryliertem GSK3β in Abbildung korrespondieren dagegen nicht mit dem Molekulargewicht der 49- bis 50-kDa-Bande, die in den Abbildungen 1B, 2B und 2C zu sehen ist. Dies weist darauf hin, dass die 49- bis 50kDa-Bande des 1D-Ansatzes nicht GSK3β zuzuordnen ist. Die Resultate des 2D-Western-Ansatzes zeigen, dass die 48 kDa-Bande, die phosphoryliertem GSK3β in 1D-Experimenten entspricht, im 2D-Experiment in mindestens fünf distinke Protein-Isoformen aufgelöst werden kann, wobei zwei Isoformen an Serin-9 phosphoryliert sind (nachgewiesen durch den Anti-phosphoGSK3β (Ser9)-Primärantikörper). Schlussfolgerungen Die vorliegende Studie belegt die hohe Leistungsfähigkeit des ECL Plex Western BlottingSystems sowohl in klassischen 1D- als auch den zunehmend genutzten 2D-Western blotting-Ansätzen. Die Ergebnisse des 1D-Western blottingExperimentes zeigen, dass die unphosphorylierte sowie phosphorylierte Formen von GSK3β in PC-3U-Zellen ohne TGF-β-Aktivierung detektiert werden können. Das 2D-Western blotting-Experiment nach 2D-DIGE-Proteinauftrennung lieferte signifikant mehr Informationen über Phosphorylierungszustände als 1D-Western blotting. Die 48-kDa-Bande, die in 1D-Experimenten GSK3β zugeordnet wurde, konnte in mindestens fünf verschiedene ProteinIsoformen aufgelöst werden, von denen zwei an Serin-9 phosphoryliert sind. Literatur [1] [2] [3] Application note: Multiplex protein detection using the ECL Plex fluorescent Western blotting system, GE Healthcare, 28-4015-40, Edition AA (2005). Application note: Multiplex protein detection in 2-D gel electrophoresis using the Amersham ECL Plex fluorescent Western blotting system, GE Healthcare, 28-9042-34, Edition AA (2005). Franzén, Å. et al, Different signals mediate transforming growth factorbeta1-induced growth inhibition and extracellular matrix production in prostate carcinoma cells, Exp. Cell Res. 1993, 207, 1-7 Kontakt Claudia Thiele, GE Healthcare eMail: claudia.thiele@ge.com LABORWELT B L I T Z L I C H T Probenvorbereitung Native Extraktion von Transmembranproteinen Dr. Jörg von Hagen, Dr. Uwe Michelsen, Dr. Robertus Hendriks, Merck KGaA, Darmstadt Die Kommunikation von Zellen mit ihrer Umgebung beruht auf membrangebundenen Rezeptorproteinen, die die Membran durchspannen. Mit ihrem extrazellulären Teil binden diese hochspezifisch körpereigene Liganden und übermitteln das durch die Bindung erzeugte Signal durch Strukturänderungen in das Innere der Zelle. Dort werden Reaktionen ausgelöst, denen weitere Reaktions-Kaskaden folgen können. In diesem Artikel wird ein neuartiges Extraktionsverfahren für Transmembranproteine vorgestellt, die aufgrund ihrer starken Verankerung in der Zellmembran – durch 1 bis 12 membrandurchspannende Domänen – und ihrer damit verbundenen Hydrophobizität nur schwer zu extrahieren sind. Key Words: Membranproteine, native Extraktion, Transmembranproteine, Signaltransduktion, Phosphorylierung, Proteomics, GPCR Ein Großteil der bekannten humanen, pharmazeutisch relevanten Zielmoleküle sind mit Membranen assoziierte Proteine. Transmembranproteine stellen eine wichtige Gruppe von Proteinen dar, die insbesondere über ihre Si- gnalübertragungsfunktion an der Entstehung von Erkrankungen beteiligt sein können und daher von zentraler Bedeutung für die pharmazeutische Wirkstoff-Findung sind. Konsequenterweise hängt der Erfolg entsprechender Forschungsprojekte maßgeblich davon ab, Informationen über die Struktur und Funktion dieser Proteintargets zu gewinnen. Trotz ihrer biologischen Bedeutung und dem damit verbundenen hohen Forschungsinteresse ist es nach wie vor schwierig, die Funktion dieser Proteine experimentell zu analysieren. Transmembranproteine bestehen aus sequentiell-kumulierten, hydrophoben Aminosäureketten, die diese in der umgebenden Membranstruktur verankern. Daraus resultiert ihre Unlöslichkeit in wässrigen Systemen. Um die Löslichkeit zu verbessern und die Proteine in vitro untersuchen zu können, werden im Allgemeinen Detergenzien oder andere oberflächenaktive Substanzen eingesetzt. Bei Kontakt von Membranproteinen mit Detergenzien wird aber die native Struktur und Funktion verändert. Dies stellt zum gegenwärtigen Zeitpunkt ein gravierendes Hindernis bei der Analyse und Funktionsaufklärung von Membranproteinen dar. Häufig werden Detergenzien ionischer Natur, zum Beispiel Natriumdodecylsulfat (SDS) oder nicht-ionische Detergenzien wie Triton-X 100 eingesetzt. SDS denaturiert das gesamte Proteom und schränkt dadurch die weiteren Analysemöglichkeiten stark ein. Nichtionische Detergenzien (zum Beispiel Triton-X 100) sind in der Isolierung von Membranproteinen Kennziffer 21 LW 02 · Informationen ordern? · www.biocom.de Das BioMedizinZentrumDortmund BMZ bietet als Einrichtung des TechnologieZentrumDortmund optimale Bedingungen für Start-Ups und junge Unternehmen im Bereich der Life Sciences. Für die Bereiche Biomedizin, Bioinformatik und Biomikrostrukturtechnik bietet das BMZ seinen Nutzern folgende Dienstleistungen an: • Bereitstellung moderner Büro- und Laborinfrastruktur • Technisches Facility Management • Unterstützung bei der Geschäftsentwicklung • Nationales & internationales Networking • PR & Marketing-Maßnahmen info@bmz-do.de Innerhalb des BMZ bietet das Zentrum für Angewandte Proteomik ZAP in Zusammenarbeit mit den Universitäten Bochum und Dortmund State-of-the-art-Technologien in folgenden Bereichen: Innerhalb des BMZ bietet das Zentrum für Angewandte Chemische Genomik ZACG in Zusammenarbeit mit der Universität Dortmund und des Max-Planck-Instituts Dortmund Expertise in folgenden Bereichen: • Quantitative Proteomik • 2D-DIGE Technologien • Glykoanalytik • Protein Biochips • Biostatistik & Bioinformatik LABORWELT • Antibiotikaforschung • Biotechnologische Syntheseoptimierung • Adressierbare mikro- und nano-Arrays • Membran-Protein-Wechselwirkungen • Wirkstoffbibliotheken info@zap-do.de info@zacg-do.de 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 | 25 Kontakt: BMZ · Otto-Hahn-Straße 15 · 44227 Dortmund · Telefon + 49 231 97 42-130 · info@bmz-do.de · www.bmz-do.de ������������������������������������������ ���� ���������� A B C ������� �������������� ������������� ��� � � �� � � � � � � �� � � � ������ ������ �������������������������������� ����������������������������������� ������������������������������������� ����������������������������������� ������������������������������������� ��������������������������������� ����������������������������������� ��������������������������������� ������������������������������������� ����������������������������������� ��������������������������������� ������������������������������� Abb.1: Die Immunoblot-Analyse von drei Membranproteinen (A: EGF-Rezeptor, B: Frizzled-4, C: CELSR-3) nach Extraktion aus der humanen Mammakarzinomzell-Linie MDA-MB 468 mit Hilfe des ProteoExtract-Transmembrane Extraction Kits ermöglicht den Nachweis der sieben-transmembran-passierenden Proteine Frizzled-4 (B4) und CELSR3 (C4). Die zu erwartende molekulare Größe des CELSR3-Proteins mit 358 KDa kann nur mit dem neuen Verfahren nachgewiesen werden. Die Verwendung von Triton-X 100 (A; B; C Spur 3) funktioniert zufriedenstellend nur bei dem einfach membranpassierenden Protein, dem EGF-Rezeptor (A3). Die Solubilisierung mittels SDS (C Spur1) führt zu geringen Signalintensitäten. In Spur 2 sind jeweils die membranfreien Fraktionen mit den vornehmlich zytoplasmatischen Proteinen aufgetragen. – insbesondere bei mehrfach transmembranösen Proteinen – ineffektiv bezüglich der Selektivität und Quantität. Aus diesen Gründen ist es wünschenswert, eine Extraktionsmethode zu nutzen, die Membranproteine in ihrer nativen oder aktiven Struktur erhält und in hoher Ausbeute und Reinheit extrahiert. Von besonderer Bedeutung sind die schwer zu isolierenden G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), mehrfach membranpassierende Proteine mit sieben bis zwölf Transmembrandomänen1. Extraktion von 7-transmembranösen Proteinen Der ProteoExtract® Transmembrane Extraction Kit wendet ein neues Detergenz-freies Extraktionsverfahren an, das neben hohen Proteinausbeuten kompatibel zu den gängigsten Proteinanalysemethoden ist. Zudem zeichnet sich das Verfahren durch mildere Bedingungen aus, als es vergleichsweise die Extraktion mit Hilfe von Triton-X 100 erlaubt. Wie in Abbildung 1 dargestellt, liefert die Extraktion einfach transmembranöser Proteine, hier am Beispiel des EGF-Rezeptors, vergleichbare Ergebnisse mit den beiden Verfahren auf der Basis von Detergenzien. Als Kontrolle wurde ein SDSGesamtlysat verwendet. Ein deutlicher Unterschied lässt sich jedoch bei der Quantifizierung von dem Protein Frizzled-4 (Abb. 1B), einem 7-transmembranösen Molekül beobachten, welches in die Signaltransduktion des WntSignalwegs involviert ist. Das neue Verfahren führt zu einer deutlich verbesserten Ausbeute dieses Proteins. Die auf Triton-X 100 basierende Extraktion zeigt kein Signal in der WesternBlot-Analyse. Das Signal der SDS-Extraktion kann lediglich als marginal bezeichnet werden. Die hervorragenden solubilisierenden Eigenschaften des Kits lassen sich besonders gut am Beispiel der Extraktion und dem folgenden Nachweis des Proteins ‚Cadherin EGF-lag ������� ����������������������������������� ��������� ���������������������� ���������������������� ������������� ����������������� ������������������������ ����������������������� 26 | 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 Abb. 2: Die native Membranextraktion mit dem ProteoExtract® Transmembrane Extraction Kit (TM-X) ermöglicht das Durchführen von Enzymaktivitätstests. In Volumenäquivalenten der extrahierten Membranfraktionen humaner Gewebekulturzellen wurde die Aktivität des endogenen Enzyms Alkalische Phosphatase untersucht. Das Experiment dokumentiert eine signifikante Zunahme der Enzymaktivität im Vergleich zu SDS und Triton X-100-Extrakten. LABORWELT B L I T Z L I C H T seven-pass G-type receptor 3’ (CELSR3) nachvollziehen. In diesem Beispiel (Abbildung 1C) ist weder in der Extraktion mit SDS noch mittels Triton-X 100 ein Signal in der zu erwartenden molekularen Größe von 358 Kilodalton zu erkennen. Die Extraktion mit dem ProteoExtract® Transmembrane Extraction Kit führt hier zu einem deutlichen Nachweis des Proteins in seiner nativen Größe. 1 2 3 Extraktion nativer Membranproteine Die Funktionsaufklärung membranständiger Proteine und Proteinkomplexe ist eine Grundvoraussetzung für das Verständnis zellulärer Regulationsprozesse. Isolierungsverfahren von Membranproteinen mittels Detergenzien in Verbindung mit mechanischen Separationsverfahren (Zentrifugation, Zellaufschluss) basieren in der Regel auf deren intrinsischer Hydrophobizität. Das neue Verfahren verfolgt eine zweistufige Anreicherungsstrategie von nativen Membran- und Membran-assoziierten Proteinen. Nach der Extraktion von MDA-MB 468-Zellen mit dem ProteoExtract® Transmembrane Extraction Kit konnte die Aktivität des endogenen Enzyms Alkalische Phosphatase spezifisch in der Membranfraktion nachgewiesen werden (Abb. 2). Dies dokumentiert, dass Membranproteine in nativer und funktioneller Form erhalten werden und – am Beispiel des GPI verankerten Proteins alkalische Phosphatase – selektiv angereichert werden konnten. Phosphosignal-Analyse von Membranfraktionen Die Bedeutung der Molekülgruppe der Rezeptor-Tyrosinkinasen wird dadurch unterstrichen, dass derzeit 90% der Targets Abb. 3: Phosphotyrosin-spezifische Immunpräzipitation von Membranextrakten und anschließender Nachweis des phosphorylierten EGF-Rezeptors mittels Western-Blot-Analyse. Die Spur 1 zeigt im SDS-Gesamtlysat die zu erwartende molekulare Größe des EGF-Rezeptors (nicht volumenäquivalenter Auftrag). Die Spuren 2 und 3 sind Extrakte, die in einer Phosphotyrosin-spezifischen Immunpräzipitation unterzogen wurden und anschließend mittels anti-phospho-EGF-Rezeptor-Antikörper detektiert wurden. Spur 2 zeigt die Ausbeute eines Triton-X 100 Extraktes. Spur 3 mit deutlich höherer Ausbeute wurde mittels des ProteoExtract® Transmembrane Extraction Kit extrahiert. Eine indirekte Quantifizierung der in der Immunpräzipitation eingesetzten Antikörpermenge sowie der vergleichbare Probenauftrag in der SDS-PAGE lässt sich anhand der schweren Kette des eingesetzten IP-Antikörpers (50 KDa) belegen. in der pharmazeutischen Wirkstofffindung Membranproteine darstellen. Die Aufklärung der Signalweiterleitung von der Membran in den Zellkern ist von elementarer Bedeutung für das Verständnis der molekularen Krankheitsentstehung. In diesem Kontext spielt die Phosphorylierung des EGF-Rezeptors bei der Entwicklung epithelialer Tumore (zum Beispiel Brust- und Darmkrebs) eine zentrale Rolle und ist daher Ansatzpunkt moderner Biopharmazeutika (wie etwa Herceptin und Erbitux). Die Analyse von Signaltransduktionen über Phosphorylierungen bedingt die Verwendung von Extraktionsmitteln, die keinen inhibierenden oder dephosphorylierenden Einfluss ausüben. Das neue Verfahren erlaubt die funktionelle Analyse von phosphorylierten Membranproteinen und somit die Analyse zellulärer Regulationsprozesse. Dabei können die Membranextraktionen direkt, mittels phosphospezifischer Antikörper detektiert werden, oder es können phosphospezifische Partialproteome über eine Immunpräzipitation (Abb. 3) angereichert werden. Literatur [1] [2] Caunt, J.C., Finch, A.R., Sedgley, K.R, McArdle, C.A., Trends Endocrinol Metab. (2006) 17(7):276-83. Tabernero, J., Salazar, R. Casado, E. Martinelli, E. Gomez P., Baselga J. Annals of Oncology 15 2004;15: 55-62 Korrespondenzadresse Dr. Jörg von Hagen Merck KGaA – PLS R&D C&B Frankfurter Straße 250 64271 Darmstadt Tel.: +49-(0)6151-725903 Fax: +49-(0)6151-72915093 eMail: joerg.von.hagen@merck.de Kennziffer 22 LW 02 · Informationen ordern? · www.biocom.de LABORWELT 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 | 27 N Standort E T Z W E R K Zucker nutzbar machen – moderne Proteomforschung im Fokus Nicola Klare1, Petra Grünewald2, Katrin Marcus1, Helmut E. Meyer1, Andre van Hall2, Michael Hamacher11,Medizinisches Proteom-Center, Ruhr-Universität Bochum, 2 TechnologieZentrumDortmund Management GmbH Eine der wichtigsten Aufgaben der heutigen Forschung ist die zielgerichtete Entwicklung neuer und spezifischer Methoden und Verfahren, die der wirtschaftlichen Verwertung zugeführt werden. Die vielfach in der universitären Forschungslandschaft erarbeiteten Strategien zum Verständnis und zur Bekämpfung von Krankheiten sowie innovative Analysekonzepte müssen ihren Weg nicht nur in die medizinische Anwendung, sondern auch in die wirtschaftliche Umsetzung finden. Unterstützung finden solche Entwicklungsansätze zum Beispiel in EU-Rahmenprogrammen sowie in deutschen Forschungsmaßnahmen wie zum Beispiel dem Nationalen Genomforschungsnetz. Diese Maßnahmen zielen genau darauf ab, einen wirtschaftlichen Mehrwert mithilfe der Forschungsförderung zu generieren und verhelfen der Forschung zu internationaler Konkurrenzfähigkeit. Vor einem Jahr hat das Wirtschaftsministerium Nordrhein-Westfalens gemeinsam mit dem Innovationsministerium die „Lebenswissenschaftliche Innovationsplattform Dortmund“ initiiert. Diese Plattform vereinigt unter anderem das Zentrum für Angewandte Chemische Genomik (ZACG) und das Zentrum für Angewandte Proteomik (ZAP). Beide Projekte werden von der TechnologieZentrumDortmund Management GmbH koordiniert und sind im BioMedizinZentrumDortmund angesiedelt. Wissenschaftliche Partner des Zentrums für Angewandte Proteomik sind das Medizinische Proteom-Center der Ruhr-Universität Bochum unter der Leitung von Professor Helmut E. Meyer sowie die Lehrstühle für Biostatistik (Prof. Katja Ickstadt, Prof. Wolfgang Urfer) und Bioinformatik (Prof. Petra Mutzel, Prof. Bernhard Steffen) der Universität Dortmund. In insgesamt fünf Teilprojekten erforschen und entwickeln die Mitarbeiter neue Strategien auf den Gebieten Quantitative Proteomik, Diffe- rence in Gel Electrophoresis (DIGE), Glykoproteomik, Proteinbiochips und Bioinformatik. Die Erkenntnisse sollen zeitnah einer Weiterentwicklung in der Wirtschaft und Industrie zugeführt werden. Im Folgenden wird dieser Transfergedanke anhand der Glykoproteomik eingehender beschrieben. Forschungsansatz Glykosylierung Die meisten Proteine bestehen nicht nur aus einer Aminosäuresequenz, sondern werden nach der Translation weiter modifiziert. Eine der wichtigsten Modifikationen ist die Glykosylierung, die kovalente Anknüpfung von Kohlenhydratanteilen. Der prozentuale Gehalt an Kohlenhydraten schwankt je nach Glykoprotein zwischen einem und 90 Prozent. Die Glykosylierung wurde lange Zeit nur als ein lästiges Anhängsel betrachtet, das die Aufarbeitung dieser Proteine erschwert. In den vergangenen zehn Jahren hat sich diese Auffassung stark gewandelt, und die Bedeutung der Zuckerketten wurde erkannt. Die Glykane rückten immer mehr in den Fokus der Wissenschaft, und es entwickelte sich eine neue biologische Disziplin – die Glykomik (in Anlehnung an die Begriffe Genomik und Proteomik). Glykanstrukturen sind an so wichtigen Prozessen wie der Zell-Zell-Kommunikation, Differenzierung, Infektion und Metastasierung von Krebszellen entscheidend beteiligt. Die Glykane beeinflussen wesentliche Protein-Eigenschaften, wie dessen Löslichkeit, isoelektrischen Punkt und räumliche Struktur (Konformation). Die Analytik von Glykanen gestaltet sich schwieriger als etwa die Sequenzierung von Proteinen oder DNA, da ihre Struktur wesentlich komplexer ist. Zunächst können Glykane auf zweierlei Art mit dem Protein verbunden sein: N-glykosidisch über den Stickstoff der Aminosäure Asparagin oder O-glykosidisch über den Sauerstoff von Serin oder Threonin. Glykane bestehen aus einzelnen Monosaccharid-Bausteinen. Beim Menschen handelt es sich dabei um etwa 12 verschiedene Einfachzucker. Jeder Baustein hat allerdings mehrere Bindungsstellen, so dass komplexe verzweigte Strukturen entstehen können. Hinzu kommt die Möglichkeit der Bindung aus zwei verschiedenen räumlichen Ebenen, wodurch α- und β- Anomere entstehen. Zum Schluss werden die freien Hydroxylgruppen komplexer Glykane oft mit Sialinsäuren modifiziert. An der Existenz dieser endständigen Zuckerreste erkennt zum Beispiel das Ubiquitin-Proteasomen-System, ob ein Serumprotein überaltert ist und aus dem Stoffwechsel entfernt werden muss. Auf der Suche nach der Zuckeranwendung Abb. 1: Das ZAP ist im BMZ in Dortmund beheimatet. Hier bietet sich mit den ebenfalls ansässigen Biotechnologie-Unternehmen, den benachbarten Forschungseinrichtungen sowie der Universität Dortmund ein hervorragendes Umfeld für den beabsichtigten Technologietransfer. 28 | 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 Sehr viele therapeutisch und diagnostisch verwendete Proteine wie zum Beispiel AnLABORWELT N E T Z W E R K Gebiet der neurodegenerativen Erkrankungen gelegt werden. Es gibt bereits einige Hinweise, dass die Glykosylierung bestimmter Proteine bei der Entstehung von Morbus Alzheimer und Morbus Parkinson eine Rolle spielt. Etablierung einer wirtschaftlichen Transferkultur Abb. 2: IEF/SDS-PAGE des CandyCaneMW-Marker (32µg): 1. Dimension: IPG-Strips, 7 cm, pH 3-11; 2. Dimension: Tris/Glycin-Gel, 15%. Der CandyCaneMW-Marker besteht aus einem Gemisch von Glykoproteinen und nicht glykosylierten Proteinen. Links: Färbung mit GlycoPro von Sigma – markiert sind die gefärbten Glykoproteine. Rechts: Färbung desselben Gels mit Silber, markiert sind Glykoproteine (blau) und nicht glykosylierte Proteine (schwarz). tikörper werden heute in überexprimierenden Zellsystemen rekombinant hergestellt. Da nur eukaryotische Organismen die zellulären und enzymatischen Voraussetzungen für die Bildung komplexer Glykane besitzen, ist die Wahl des geeigneten Expressionssystems und die Kontrolle der exakten Glykosylierung für den Hersteller von Glykokonjugaten immens wichtig. Im Teilprojekt 3 des ZAP soll ein effektives Verfahren entwickelt werden, um die korrekte Glykosylierung eines Glykoproteins zu überprüfen. Hierbei ist nicht nur die Struktur der Zuckerketten interessant, sondern auch, ob alle potentiellen Glykosylierungsstellen am Protein besetzt und alle gewünschten Isoformen vorhanden sind. Methodisch werden hierbei die unterschiedlichen physikalisch chemischen Eigenschaften der Glykane genutzt, die enzymatisch oder chemisch vom Protein abgetrennt werden können. In einem HPLC-Verfahren lassen sie sich nach ihrer Größe, ihrem Verzweigungsgrad, ihren Modifikationen und sogar nach ihrer anomeren Struktur auftrennen und einzeln analysieren. Lektine sind meist pflanzliche Proteine, die sehr spezifisch bestimmte Glykanstrukturen erkennen und binden können. Mit ihrer Hilfe gelingen sowohl Trennung als auch Nachweise einzelner Glykane aus komplexen Mischungen. Die Massenspektrometrie kommt bei der Überprüfung der Glykosylierungsstellen zum Einsatz. Der enzymatische Verdau eines Glykoproteins erzeugt spezifische Peptide, die mit der exakten Glykosylierung eine definierte Masse aufweisen. Die Verknüpfung der einzel- nen Monosaccharid-Bausteine kann mit Hilfe von Enzymen (so genannten Exoglycosidasen) geschehen, die spezifisch die Art der Bindung zwischen den Einfachzuckern erkennen und einzelne Moleküle abspalten. In Kombination mit der MALDI-TOF-Massenspektrometrie ist dieses Verfahren on-target möglich. Analyse von Glykosylierungsfehlern All diese Verfahren lassen sich auch in differentiellen Studien nutzen. Da Zuckerketten an zahlreichen essentiellen zellbiologischen Prozessen beteiligt sind, mag es nicht verwundern, dass eine fehlerhafte Glykosylierung zu pathologischen Veränderungen führen kann. Andernfalls können erbliche oder erworbene Schäden auch zu einer abnormen Glykosylierung führen. Es sind bereits zahlreiche Krankheiten bekannt, die mit einer abweichenden Glykanstruktur in Verbindung gebracht werden. Im Rahmen der Glykoproteomik ist geplant, mittels der DIGE-Technik das Proteom von Geweben differentieller Zustände aufzutrennen und mit zuckerspezifischen Färbetechniken selektiv Glykoproteine nachzuweisen und eventuelle Unterschiede der Zustände zu finden. Die Glykane oder Glykopeptide interessanter Proteinspots lassen sich direkt aus dem Gel für die weiteren Analysen isolieren. Auf diese Weise könnten spezifisch veränderte Glykanstrukturen identifiziert und diese als Marker für bestimmte Krankheiten definiert werden. Im Zentrum für Angewandte Proteomik soll besonderes Augenmerk auf das Das vorwettbewerbliche Verwertungskonzept des ZAP-Teilprojektes Glykoproteomik ist ein gutes Beispiel für vorbereitende Maßnahmen, um universitäres Gedankengut und Analysestrategien einer wirtschaftlichen Nutzung zuzuführen. Solche Anstrengungen können sicherlich nicht allein stehen, sondern müssen von einer geeigneten Infrastruktur, nachfolgenden Maßnahmen und dem Willen der beteiligten Institutionen und Personen begleitet sein. Beides ist im BioMedizinZentrum und gerade im östlichen Ruhrgebiet mit den Universitäten in Bochum und Dortmund gegeben. Ein Ausbau dieser Aktivitäten wird von allen Beteiligten angestrebt. So ist die Lebenswissenschaftliche Innovationsplattform Dortmund auf gutem Wege, die beabsichtigte Funktion als Keimzelle für ein Cluster für die Verwertung im Bereich der angewandten Biotechnologie umzusetzen. Interessenten aus Wirtschaft und Akademie sind herzlich willkommen, die damit verbundene Etablierung einer Transferkultur im wissenschaftlichen Umfeld zu begleiten. Die Lebenswissenschaftliche Innovationsplattform wird durch die Europäische Union (EU) und durch das Land Nordrhein-Westfalen gefördert. Korrespondenzadressen Dr. Petra Grünewald BioMedizinZentrumDortmund TechnologieZentrumDortmund Management GmbH Otto-Hahn-Straße 15, 44227 Dortmund Tel.: +49-231-9742-178, Fax: +49-231-9742-159 eMail: gruenewald@tzdo.de Dr. Nicola Klare Medizinisches Proteom-Center Ruhr-Universität Bochum eMail: nicola.klare@ruhr-uni-bochum.de www.medizinisches-proteom-center.de www.zap-do.de; www.bmz-do.de Kennziffer 23 LW 02 · Informationen ordern? · www.biocom.de ����������������������� �������������������������������������������� ��������������������������������������������������������������������������� ��������������������������������������������������������������������� ����������������������������������������������������������������������������������������������������� ������������������������������������������������������������������������������������ ����������������������������������������������������������������������������� ��������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� R 28th PAMM Winter Meeting E P O R T Krebsforschung im Fokus Bericht von der Tagung der EORTC Mit 160 Besuchern aus 14 europäischen Ländern, den USA, Russland und Singapur fand das erstmals am Max-Delbrück-Centrum (MDC) für molekulare Medizin in Berlin veranstaltete 28. PAMM-Meeting Anfang Februar eine noch bessere Resonanz als das Vorjahrestreffen der Präklinischen Gruppe der European Organization for Research and Treatment of Cancer (EORTC). Im Fokus des Kongresses, in dessen Rahmen neben Forschungsstars auch Nachwuchswissenschaftler ihre Arbeit präsentieren konnten, standen die vorklinische und klinische Entwicklung neuartiger Krebsmedikamente, Fortschritte bei der Identifikation von prognostischen und prädiktiven Biomarkern und in der funktionellen Bildgebung. Ein heißdiskutiertes Thema war auch Identifikation und Charakterisierung sogenannter Krebsstammzellen – erstmals in Hirmntumoren/Leukämien aufgespürte veränderte Stammzellen, die möglicherweise maßgeblich zur Aggressivität von Tumoren beitragen. Obgleich die Forscher keine Durchbrüche vermeldeten, bestand auf dem Expertentreffen von Grundlagen- und Industrieforschern Einigkeit darüber, dass eine individualisierte Krebstherapie binnen fünf bis zehn Jahren Realität werden wird. Motor der Entwicklung sei eine immense gemeinsame Anstrengung, Biomarker (und neue therapeutische Ziele) zu identifizieren, die einerseits helfen, die Wirkung einer Krebstherapie beim Patienten individuell einzuschätzen (Prognosebiomarker), andererseits den Firmen eine frühe Voraussage über die Wirksamkeit und Toxikologie-Effekte neuartiger Krebswirkstoffe liefern (Prädiktive Biomarker) und damit Entwicklungskosten einsparen helfen. Kongressorganisatorin Dr. Iduna Fichtner (MDC Berlin) betonte, dass die Interessenlage der Kliniker und der Unternehmen sich dabei recht deutlich unterscheide, dass es aber eine gute, sich ergänzende Zusammenarbeit gebe, denn es sei ein gemeinsames Interesse, die Forschung voranzutreiben. Proteomics-Technologien optimieren Während das Hauptinteresse der Kliniker sich auf Biomarker richte, die eine Prognose des Krankheitsverlaufes und eine daran angepasste Kombinationstherapie ermöglichen, gehe es der unter hohem Wirtschaftlichkeitsdruck stehenden Industrie hauptsächlich darum, die Effizienz der Wirkstoffentwicklung zu erhöhen. Im Falle eines bestimmten biologischen Wirkstoffes gelte es für die Firmen deshalb, Biomarker zu finden, die frühzeitig eine Aussage über dessen Wirksamkeit, Verträglichkeit und – bei sogenannten „Targeted Therapies“ – auch die Selekton der Responder-Patientengruppe ermöglichen, bei der das Medikament wirksam ist. Entscheidend für das Tempo des Forschungsfortschrittes ist aus Sicht Fichtners vor allem die Technologieentwicklung in der Proteomforschung. Derzeit wisse niemand, ob die breit eingesetzten, weil technologisch viel weiterentwickelten cDNA-Microarrays „irgend ein klinisch relevantes Ergebnis hervorbrächten“, so die Pharmakologin. So sei auf dem Kongress ein Biomarker für Chemotherapieresistenz vorgestellt worden, der auf der Proteinebene, nicht aber auf der genetischen Ebene nachgewiesen werden konnte. Derzeit kranke die Proteomforschung jedoch noch an wenig leistungsfähigen Methoden und dem Fehlen valider, standardisierter Proteinchips. Das Forschungsfeld Biomarker entwickelt sich nach Aussage von PAMM-Präsidentin Dr. Nadia Zaffaroni, RRCCS, Mailand, derzeit so dynamisch, „dass selbst Fachleute den Publikationen kaum folgen können“. Im Zuge der Biomarker-Suche gehe es auch immer um die Identifizierung neuer Signalwege, die krebsrelevante Eigenschaften wie Zellteilung, Invasivität und Metastasierung, die Neoangiogenese oder Apoptose beeinträchtigen, und der damit verknüpften Targets. Denn Zielmoleküle wie zum Beispiel der EGF-Rezeptor und dessen Inhibitoren (wie Iressa) hätten sich als nicht ausreichend wirksam und als mit Nebenwirkungen behaftet erwiesen. Eine große Herausforderung sei es zudem, das richtige Target für die richtige Krebsart zu finden. Denn ein- und dasselbe Zielmolekül (wie zum Beispiel der Her2neu-Rezeptor bei Brust- und Gebärmutterkrebs) können in den vielgestaltigen verschiedenen Krebsarten unterschiedliche Wirkungen vermitteln. Angesichts der Vielfalt der Erscheinungsformen von Krebs verspreche allein schon die individuell abgestimmte Dosisoptimierung von Chemotherapeutika einen beträchtlichen Gewinn für die Krebsbehandlung. Auf der Tagung ging es in sechs Themenblöcken um „Novel targeted therapies“; „Genomics and proteomics – predictive potential“; „Stem cells und tumor cells“, „Cancer-related cellular pathways“, „funcional imaging“ und „Science meets industry“. Novel targeted therapies Seit der Identifizierung aller 518 humanen Kinasen sowohl als Targets als auch als Biomarker im Blickpunkt: Regulatorische Proteine in Signaltransduktionswegen wie VEGF 30 | 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 Targeted therapies setzen meist zugleich hochselektiv an mehreren Zielmolekülen – meist Kinasen – an, die verschiedenartige krebsrelevante Prozesse oder Signalwege beeinträchtigen und das Tumorwachstum LABORWELT ������������������������������������ ��������������� ������������������������������������������������� ���������������������������������������������� ������������������������������������������������� ������������������������������������������������ ����������������������������������������������� ����������������������������������� ��������������������������� �� � ����������������������������� ������������������������ Zeit für Diskussion auf dem PAAM-Winter Meeting 2007 hemmen. Dabei überwiegen derzeit targeted therapies zur Behandlung diverser Leukämien. Erst in jüngerer Zeit ist auch die Behandlung solider Tumoren hinzugekommen, die durch ihre biologischen Eigenschaften nur schwer durch Wirkstoffe zu erreichen sind (z.B. hoher Turgor, Chemo- und Radioresistenz, hohe Zelldichte und Zellheterogenität). Ein Problem der meisten Kinase-Hemmstoffe ist, dass diese durch Mutationen des Zielmoleküls, an die diese binden, meist wirkungslos werden. Michael Lahn (Eli Lilly, Indianapolis) stellte präklinische Ergebnisse mit einem niedermolekularen Dihydropyrroloazol-Inhbitor des Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) vor, der in Krebszellen das Tumorwachstum durch Verlust seiner Eigenschaften als Tumorsuppressor ankurbelt. Derzeit sind zwar injizierbare antisense- und Antikörper-Wirkstoffe gegen TGF-beta in der klinischen Entwicklung, bisher aber noch keine oral einehmbaren Wirkstoffe, wie derzeit von Lilly entwickelt. Bisherige Tierversuche deuten nach Darstellung Lahns darauf hin, dass der Wirkstoff das Tumorwachstum verlangsamt. Parallel zur Wirkstoffentwicklung wird untersucht, welche Tumore TGF-beta überexprimieren und damit als Ziel in Betracht kommen. Klaus Strebhardt, (Unklinik Frankfurt/Main) berichtete über Ansätze, mit kleinen, oral verabreichbaren Inhibitoren der Polo-like Kinase 1 (PLK1) die Zellteilung (Mitose) zu unterbinden und so das Absterben der Krebszellen einzuleiten. Dieser Ansatz verspricht erstmals bei einem gezielten Anprechen des Targets mit einer targeted therapy eine Tumorremission und nicht nur ein Anhalten des Tumorwachstums. Ein entsprechender Wirkstoff (BI2536) wird derzeit auch von Boehringer Ingelheim klinisch erprobt. �� � ������������������������������ ���������������������������������� �������������������������������� ������� �������������������������������� ��������������� ������������ ������������������������ �������������� �������������������������������������������������������� Genomics and proteomics – predictive potential Kennziffer 24 LW 02 · Informationen ordern? · www.biocom.de LABORWELT ������������������������������������������������������������������������������������ ��������������������������������������� Marc van de Vijver (Netherlands Cancer Institute, Amsterdam) berichtete über die Suche nach aussagekräftigen Expressionsprofilen um den Verlauf früher (Phase I-II) Brustkrebstumoren vorauszusagen. Eine Chipanalyse von knapp 300 Tumoren zeigte, dass eine „aktivierte Wund-ähnliche Signatur“ unabhängig von Standarddiagnose-Hilfsmitteln (Histologie) statistisch signifikante Aussagen zur Brustkrebs-Prognose und eine 70-Gen-Expressionsanalyse eine Zuordnung des Tumorstadiums ermöglicht und damit Ärzten ein 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 | 31 R E P O R T Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme einer Nestin-positiven Krebsstammzelle weiteres Hilfsmittel zur frühzeitigen RisikoStratifizierung von Patienten zur Verfügung stellt. Schwieriger erscheint es laut van de Vijver, die Wirkung einer Chemotherapie vorauszusagen. Im Gegensatz zu unlängst von US-Forschern vorgelegten MicroarrayAnalysen, deren Signaturen angeblich eine Wirkung von Chemotherapeutika voraussagen helfen, konnten die Niederländer keinen signifikanten Zusammenhang mit der Antwort von Brustkrebs auf Chemotherapeutika feststellen. Zu a nderen Ergebn issen kom mt ei ne Gruppe um Heinz-Herbert Fiebig (Oncotest-Institut, Freiburg), die Daten zur in vivo-Wirksamkeit des Chemotherapeutikums Cisplatin bei Blasen, Darm-, Magen-, Lungen-, Brust-, Eierstock- und Bauchspeicheldrsenkrebs mit einer Signatur von 121 Genen bioinformatisch korreliert hat: Nach experimenteller Validierung sagten sie die Tumor-Sensitivität mit einem Fehler von 17% (Falsch-negative) und die Krebsresistenz mit 26% (Falsch-positive) voraus. Her2neu-positives Gewebe eines ductalen Mammakarzinoms 32 | 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 Allerdings ist die Quote der falsch-positiven Ergebnisse noch weit davon entfernt, ein auch ethisch akzepables Resultat zu liefern. Gleichwohl ließe sich bereits mit diesem Ergebnis eine bessere Auswahl von Drug Respondern vornehmen. Annette Sommer (Bayer Schering Pharma AG, Berlin) erklärte, dass sich die Bemühungen der Pharmaindustrie angesichts wachsenden wirtschaftlichen Druckes auf die Unternehmen auf die Reduktion der Zahl von Versagerkandidaten in klinischen Studien konzentriere. Dabei würde auf die Suche valider Stratifizierungs-, Wirksamkeits- und Tox-Marker gesetzt, die eine frühzeitige Entscheidung über das Fortführen/Einstellen klinischer Programme ermöglichten. Derzeitige Engpässe bei der zellbasierten Suche nach solchen Biomarker-Signaturen krankten daran, dass die zur Verfügung stehenden Tumoren sich in Zellkultur veränderten und daher die Verhältnisse in vivo nur wenig aussagekräftig nachstellten. Daher seien die Unternehmen auf der Suche nach Methoden, die die Isolierung von primären Tumorzellen in ausreichender Menge erlauben. Zudem würden zunehmend primäre Tumorzellen in immundefekte Mausmodellen eingebracht, um zu einer Testsituation zu kommen, die die klinische Situation besser wiedergibt. Stem cells und tumor cells Dass das Konzept der Entstehung von Tumoren aus Krebsstammzellen noch in den Kinderschuhen steckt, zeigten auch die Beiträge der entsprechenden Session. Ein vielversprechender Ansatz, um die vermutlichen Ursprungszellen der bösartigen Entartung und allen Krebswachstums auszumachen, ist laut PAMM-Präsidentin Zaffaroni die Kultivierung der Stammzellen, die allerdings nur 1% aller Tumorzellen auszumachen scheinen. Derzeit konzentriere sich die Forschung darauf, Krebsstammzellen in soliden Tumoren überhaupt erst einmal zu finden und anschließend durch bestimmte Marker zu charakterisieren sowie aus den umgebenden Zellen aufzureinigen. Zudem werde versucht, bereits isolierte Krebsstammzellen im Labor zu kultivieren, um sie biochemisch und molekularbiologisch analysieren zu können. Wenn sich das Konzept der Krebsstammzelle als korrekt erwiese, könnte dies, so Kongressorganisatorin Fichtner, die ganze Krebsforschung revolutionieren, da nur noch eine bestimmte Zellpopulation vernichtet werden müsse, um den Krebs zu besiegen. Gabriela Dontu (University Michigan) stellte das Enzym Alkohol-Dehydrogenase (ALDH1) als Funktionsmarker für Brustkrebsstammzellen vor, der in 6% der Zellpopulation aufzufinden ist. GewebeMicroarray-Analysen verschiedener BrustLABORWELT E Kennziffer 25 LW 02 · Informationen ordern? · www.biocom.de P O R T R tumoren zeigen, dass der Marker in rund 30% der Zellen gefunden wird und mit einer schlechten Prognose korreliert. John Stingl (StemCell Technologies Inc., Vancouver) berichtete, dass das Etablieren einer Mausstammzellkultur durch Isolieren von Tumorzellen gelungen sei, die die Marker CD24 und alpha-6Integrin exprimieren. Auch das Ansprechen relativ neuer Krebssignalwege mit Hilfe von biologischen oder synthetischen Wirkstoffen zählt zu den Ansätzen, die erst seit dem vergangenen Jahrzehnt verstärkt verfolgt werden. Cancer-related cellular pathways Suzanne Eccles (Institute of Cancer Research, Sutton) berichtete über neue Ansätze, das Wachstum von Tumoren durch Hemmung der Neubildung von Tumorgefäßen und von oncogenen Kinasen zu blockieren. Phosphoinositol-3-Kinasen (PI3) blockieren danach in vitro die Chemomigration von Krebszellen und die Zellproliferation sowie in vivo die Tumorangiogenese. Zudem zeigte Eccles, dass die Hemmung von PI3, PLCgamma und Map-Kinasen deutlich die Invasivität von Tumorzellen herabsetzt. Auch in vitro-Analysen von HSP90-Chaperonen deuten darauf hin, dass diese sowohl antimetastatische sowie Angiogenese-hemmende Eigenschaften besitzen. Ulrike Stein (MDC, Berlin) zeigte, dass die Expression des Metastase-Faktors Metastasin von der Expression des beta-CateninSignalweges in Darmkrebszellen abhängt. Eine Beinflussung dieses Signalweges erscheint daher ein vielversprechender Ansatz der Grundlagenforschung, der helfen könnte, die Therapie von Darmkrebspatienten zu verbessern. Einen „alten“ neuen Weg, die Metastasierung als entscheidende Todesursache in den Griff zu bekommen, untersucht eine Gruppe um Michael Ristow (Univ. Jena). Neue Ergebnisse weisen darauf hin, dass das Umschalten der Energieerzeugung in Krebszellen von der Glykolyse auf Zellatmung mit Hilfe des Proteins Frataxin die Tumorproliferation sowie Metastasierung effektiv bremsen könnte. NEW Customised complete monoclonal antibodies 200 µg antigen 3 – 4 months customer’s property Berlin • Germany • www.biogenes.de • +49 (0)30-65 76 23 96 Fortschritte beim Functional Imaging Bildgebende Verfahren wie MRI, PET oder CT geben trotz ihrer derzeit limitierten Auflösung bio/pharmazeutischen Unternehmen schon heute wertvolle Informationen über den Wirkort, Effektivität und die Verteilung von Arzneimittelkandidaten. PET-Scans mit 18Fluorodesoxy-Glucose-markierten Wirkstoffen geben laut Julian Matthews (University of Manchester) Aufschluss über die in vivo-Verteilung, -Abbau und Metabilisierung von nur picomolaren Wirkstoffkonzentrationen. Laut Carla Molthoff (Univ Medical Center, Amsterdam) können die Imaging-Verfahren im Tiermodell dazu eingesetzt werden, um zu messen, ob ein Wirkstoff sein Target erreicht und wirksam ist. Damit werde das Imaging immer mehr zur Brücke zwischen dem Tierversuch und der klinischen Erprobung. Produkte für die Proteinkristallisation: � Mikrodispenser „Phoenix“ mit Nano-Modul (Dispensierung von 96 x 50 nl in < 30 Sek.) � „CrysCam“ – Digitalmikroskop � Proteinkristallisationsplatten Tagungsinformation Dr. Iduna Fichtner Max-Delbrück-Centrum für Moelkulare Medizin Experimentelle Pharmakologie Fax: +49-(0)30-9406-3823 eMail: fichtner@mdc-berlin.de LABORWELT Thelenberg 6 · 53567 Asbach Kennziffer 26 LW 02 · Informationen ordern? · www.biocom.de Dunn Labortechnik GmbH Tel. 0 26 83 / 4 30 94 · Fax 0 26 83 / 4 27 76 e-mail: info@dunnlab.de · Internet: www.dunnlab.de 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 | 33 M A R K T Ü B E R S I C H T 3rd Halle Conference Highlights in der Produktion rekombinanter Proteine Dr. Ole Fütterer, Scil Proteins GmbH, Halle Bereits zum dritten Mal fand vom 1. bis 3. März 2007 die Halle Conference in Halle an der Saale statt. Rund 400 Vertreter aus dem nationalen und internationalen akademischen und industriellen Bereich präsentierten aktuelle Forschungs- und Entwicklungsergebnisse. Zentrale Themen waren die Entwicklung und Produktion neuer therapeutischer Proteinwirkstoffe und deren Verbesserung durch chemische Modifikation. „Meet old friends and make new ones“, so Prof. Dr. Rainer Rudolph, Leiter des Instituts für Biochemie an der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg und Hauptorganisator der Halle Conference, sei die eigentliche Aufgabe der Konferenz. Die von der Industrie gesponsorte Veranstaltung erfreut sich wachsender Beliebtheit, da sie wie keine andere, Studenten und ihre Dozenten mit hochkarätigen Vertretern der roten Biotechszene und der pharmazeutischen Industrie zusammenbringt. der pharmazeutischen Wirkstoffproduktion aus E. coli sehr oft anzutreffen sind. Solche Prozesse, in denen das aggregierte und mißgefaltete Protein gelöst und in seine native Form „zurück“-gefaltet wird, stellen hohe Anforderungen an das proteinchemische Know-how der Prozessentwickler. Dies wurde von Dr. Jörg Schäffner (Scil Proteins) anhand mehrerer Fallstudien gezeigt. Intelligente Prozesse erzielen eine Wiedergewinnung von mehr als 90% des nativen Zielproteins über diesen Schritt. Trend zu Fragmenten und Kostenreduktion Effizienzsteigerungen bei der Produktaufreinigung Den Tenor der Konferenz traf Prof. Dr. Dr. Rolf Werner, Leiter des weltweiten Geschäftsbereichs Biopharmaceuticals bei der Boehringer Ingelheim GmbH & Co KG schon zu Beginn der Veranstaltung: Der Trend in der biotechnologisch-pharmazeutischen Forschung gehe von Antikörpern hin zu Antikörperfragmenten und kleineren Bindeproteinen, die unter anderem in der Lage seien die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden und kostengünstig in E. coli hergestellt werden können. Die Steigerung der Proteinausbeute durch höhere Expression und/oder Wiedergewinnungsraten erzeugt aber auch neue Probleme, so Dr. Kjell Eriksson von GEHealthcare. Mit CaptoTMadhere stellte dieser ein speziell für die Antikörper neu entwikkeltes Chromatographiemedium vor. Größeren Proteinmengen im Upstream-Prozess müssen danach effizientere Trennmethoden entgegengesetzt werden, um eine Kostenexplosion während der Proteinreinigung zu verhindern. Die Beiträge von Dr. Jürgen Hubbuch (Forschungszentrum Jülich) und Dr. Christian Eckermann (Boehringer Ingelheim) zum Thema Automation beziehungsweise Hochdurchsatz-Screening in der Prozessentwicklung stellten beispielhaft dar, wie die Vielzahl an Trennmedien und -methoden zu einer effizienteren Reinigungsentwicklung führen können. Allerdings wurde auch ersichtlich, dass nach wie vor kein Durchbruch bei neuartigen Trennmethoden erzielt werden konnte. Ein weiterer Grund für den Bedarf an effizienteren Trennverfahren wurde in der Session „Improving therapeutic proteins by chemical modifications“ dargelegt. Am Beispiel der Produktion von PEGyliertem rekombinantem Interferon alpha 2a, zeigte Dr. Klaus Reichert (Roche Diagnostics), dass Durchschnitt in E. coli: 15 Gramm/Liter Steigender Kostendruck und die damit notwendig werdende Optimierung der Produktionsprozesse setzt auf allen Stufen an. Die großen Fortschritte in der Expressionsleistung wurden während der Tagung eindrucksvoll gezeigt. Die Fermentationsausbeuten in humanen Zellkulturen haben längst die 1 g Protein-pro-Liter-MediumHürde überschritten und liegen derzeit, nach Angaben von Dr. Robert Hof (DSM Biologics), bei rund 3 g/L. Im E. coli-System liegt die durchschnittlich zu erreichende Fermentationsausbeute nach wie vor deutlich über den Werten der Zellkultur. Bei Boehringer Ingelheim etwa, mit bis zu 15 g/L aus Inclusion Body-Prozessen, die in 34 | 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 die Kapazität von Ionenaustauschchromatographiemedien um einen Faktor 10 unter der des nicht-PEGylierten Moleküls liegen kann. Heterogenes Bild bei der chemischen Modifikation Dass die chemische Modifikation von therapeutischen Molekülen dennoch höchst interessant ist, legen Daten der Berliner Celares GmbH (Dr. Ralf Krähmer) nahe. Durch geeignete PEGylierung konnte die in-vivo-Halbwertszeit eines therapeutischen Wirkstoffes drastisch erhöht und dadurch die einzusetzende Dosis um den Faktor 1.000 reduziert werden. Besonders kleine Proteinwirkstoffe mit geringem Molekulargewicht profitieren von der chemischem Dr. Ulrike Fiedler (Scil Proteins, links) in der Diskussion mit Dr. Patrick Bäuerle (Mitte, Micromet AG, Martinsried) Modifikation, so Dr. Krähmer, um das schnelle Ausscheiden durch die Nieren zu verhindern. Nicht immer scheint die chemische Modifikation sinnvoll, wie Prof. Dr. Andreas Plückthun (Universität Zürich) in der Session „New Binding Molecules“ zeigen konnte. Die in seiner Arbeitsgruppe modifizierten Ankyrine drangen im PEGylierten Zustand deutlich schlechter in Tumorgewebe ein als unPEGyliert. Ankyrine, die wie die anderen während der Konferenz vorgestellten Bindeproteine (AffilineTM, BITETM-Moleküle oder Antikörperfragmente), schnell herstellbar, robust und genetisch leicht modifizierbar sind, sind heute noch in der präklinischen und frühen klinischen Phase der Entwicklung. Mit ersten marktfähigen Produkten kann ab 2011 oder 2012 gerechnet werden. Korresponzenzadresse Dr. Ole Fütterer Scil Proteins GmbH Heinrich-Damerow-Str. 1 06120 Halle Tel.: +49-(0)345-27996-330 Fax: +49-(0)345-27996-332 eMail: ole.fuetterer@scilproteins.com www.scilproteins.com LABORWELT LABORWELT bis zu 1g Antikörper; Produktion in Rollerflaschen zertifiziert nach DIN EN ISO 9001:2000 seit 1999, Arbeiten und Dokumentation können nach Absprache mit dem Kunden GLP-oder GMPkonform erfolgen Es sind verschiedene Modifikationen nach Absprache möglich (Kopplung von Mabs an Marker oder Proteine, Komplette Entwicklung in 3-4 Monaten, Produktion: abhängig von der Menge ca. 3-8 Wochen Qualitätskontrolle entsprechend DIN EN ISO 9001:2000 Die Dokumentation wird nach den Anforderungen des Kunden erstellt. Wir geben Unterstützung bei Zulassungsfragen mit unseren Arbeiten. 6. Produktionskapazität und Produktionssysteme 7. Zertifikate /cGMP 8. Produktmodifikationen 9. Zeitfenster für Projektentwicklung 10. Qualitätskontrolle 11. Regulatory Support 12. Track Record Hybridomzelllinien; Produktionsausbeute ca. 40-80mg/l 5. Eingesetzte Expressionssysteme Ja Ja Ja, in enger Abstimmung mit dem Kunden Herstellung monoklonaler Antikörper innerhalb ca. 6 Monaten. Humanisierung von monoklonalen Antikörpern cGMP Hybridoma-Zelllinie besonders geeignet für „bio-reactor scale up“, weil sehr robust. HEK / rabit 240E-w, mg bis g Herstellung monoklonaler und polyklonaler Antikörper im Kundenauftrag Komplette Entwicklung und Produktion von monoklonalen Antikörpern (Zelllinien nach optimierter Hybridomatechnologie) im Kundenauftrag, weitere Verarbeitung: Pärchensuche, Modifizierung, Assayentwicklung 4. Dienstleistungsangebot F&E, Pharmazeutische Industrie, Universitäten monoklonale Antikörper aus Kaninchen. Polyklonale Antikörper aus Kaninchen, Meerschweinchen und Huhn (IgY) Diagnostik, Biotech, Pharma; Forschung: Universitäten, Kliniken, Großforschungseinrichtungen, MPI 2. Zielgruppen BioLux GmbH Brommerstr. 19 70563 Stuttgart Tel.: +49-(0)711-9018185 support@biolux-gmbh.de Ansprechpartner: Dr. Klaus Höhnel 3. Produkte BioGenes GmbH Köpenicker Straße 325 D-12555 Berlin Dagmar Schwertner Dagmar.Schwertner@biogenes.de 1. Firmendaten, Ansprechpartner 12 verschiedene Produkte hergestellt, längjährige Kundenbindung Qualitätssicherung: Sicherstellung, dass alle cGMP-relevanten Anforderungen erfüllt werden. Zusammenarbeit mit Kunden und Behörden. Durchführung von Audits und Selbstinspektionen. Approval der Produktfreigabe. Überprüfung von Master Batch Records. Qualitätskontrolle: Freigabe von Rohmaterialien, Durchführung von Inprozesskontrollen, Monitoring der Produktionsräumlichkeiten, Freigabe der Bulkwirkstoffe Ca. 9 Monate PEGylierung GMP / EMEA Fermenter mit 10, 100, 1.000 L Arbeitsvolumen (Batch, Fed-Batch) Bakterien und Hefen, 100 – 400 g/ 1.000 L Batch Mikrobielle Fermentation, Produktaufreinigung, Abfüllung des Bulkwirkstoffes (API), Herstellung von mikrobiellen Zellbänken (MCB und WCB), bioanalytische Dienstleistungen Rekombinante Proteine, Arzneimittelwirkstoffe Pharmaindustrie, Biotechnologieunternehmen BIOMEVA GmbH, Czernyring 22 69115 Heidelberg Dr. Thomas Pultar, CEO Qualitäts-Management System mit QM-Beauftragten Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen, Biotin, Enzymen (AP, HRP), Phycobiliproteinen, Lyophilisierungen, Herstellung von Immunaffinitätssäulen, Proteinmarkierungen, Bead-Kopplungen TÜV DIN EN ISO 9001:2000 Batch, Fed-Batch, Flaschen-, Hohlfaser- Rollersysteme etc., Kapazität unbegrenzt P3-X63-Ag8.653 hybridomas Antikörperherstellung: Antigensynthese, KLHKopplungen, Peptidsynthesen, Produktion polyklonaler Antikörper (versch. Spezies), CustomKomplettpakete, ELISA, Affinitätsreinigung von Antikörpern, Markierung von Antikörpern, Produktion monoklonaler Antikörper, Produktion von Kulturüberstand, Fragmentierungen, Immobilisierung von Biomolekülen, Kryokonservierung, spezifische Affinitätsmatrices, Testentwicklung, Biomedizinische Dienstleistungen Forschungsinstitute, Pharma- /Biotech-Industrie etc. Charles River Laboratories, Research Models and Services, Germany GmbH Stolzenseeweg 32-36 D-88353 Kisslegg Dr. Frank Günther Manager Biomedical Services Tel.: +49-(0)731-1431980 Fax: +49-(0)731-1431981 frank.guenther@de.crl.com M A R K T Ü B E R S I C H T Marktübersicht: Contract Manufacturing Das Ausgliedern der Produktion pharmazeutischer Wirkstoffe ist im Aufwind. Binnen fünf Jahren soll der derzeitige 13,5 Milliarden-EuroMarkt (Quelle: Kalorama) für die Lohnherstellung von Pharmazeutika auf rund 20 Milliarden Euro anwachsen. Stärkstes Wachstumssegment mit einem aktuellen Jahresumsatz von 2 Miliarden Euro: die Protein- und Antikörperproduktion. LABORWELT gibt mit dieser Marktübersicht einen Überblick über das Angebot der Contract Manufacturing-Anbieter, die an der aktuellen LABORWELT-Befragung teilgenommen haben. 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 | 35 Vorhanden, IBA und IBA Biologics Langjährige Erfahrungen im Bereich „contract manufacturing“. Forschungs-, Industriekunden 36 | 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 N/A Cell Line Development Process Development & Scale Up Analytical Development & Qualification cGMP Manufacturing Quality Control & Regulatory Support Project Management Insect & mammalian Sf9 & Hi5 (Baculovirus) • CHO • Drosophila S2 • GS-CHO hybridomas • Myelomas • PER.C6 Bacterial E.coli B • E.coli K-12 • Bacillus subtilis • Pichia pastoris 1. Keele: Fermentation development: 4 x 7L Microbial, 2 x 7L Mammalian • cGMP manufacture: 2 x 100 rollerbottles. 1x 20L, 1x 50L, 1x 200L stirred tank • Facility area: Process development: 390 m2, Class 10,000 clean rooms: 223 m2, Class 100,000 clean rooms: 166 m2, QC: 186 m2, Stores: 158 m2, Plant: 539 m2, Total: 2300 m2, 2. Oxford: Fermentation development: 4 x 7L, 1 x 20 L stirred tank, stirred tanks • cGMP manufacture: 1x 20L, 2x 30L, 1x 100L stirred tank/perfusion • Facility area: Process development: 65 m2, Class 1,000 clean rooms: 10 m2, Class 10,000 clean rooms: 230 m2, Class 100,000 clean rooms: 227 m2, QC: 8 m2, Stores: 16 m2, Plant: 111 m2, Total: 1500 m2, European clinical trials directive, MHRA inspection 2005, FDA compliant Production of recombinant protein, viruses and DNA for Phase I-III 3-6 months 2 QPs Yes 93 products for 36 clients • 152 batches for 44 programmes 3. Produkte 4. Dienstleistungsangebot 5. Eingesetzte Expressionssysteme 6. Produktionskapazität und Produktionssysteme 7. Zertifikate /cGMP 8. Produktmodifikationen 9. Zeitfenster für Projektentwicklung 10. Qualitätskontrolle 11. Regulatory Support 12. Track Record Vorhanden, IBA und IBA Biologics Projektabhängig auf Anfrage IBA Biologics auf Anfrage Von 1l-10l Kulturvolumen (IBA) Große Kulturvolumen, IBA Biologics E.coli, S. cerevisiae, Baculovirus (IBA) Zellkultur (nähere Informationen bei IBA Biologics) Auftrags-Klonierung, -Expression, und -Reinigung von rekombinanten Proteinen mit Hilfe von Strep-tag und 6xHistidine-tag Analyse ( z.B. MALDI/TOF, 2D-Gelektrophorese) von Proteinen. Herstellung monoklonaler Antikörper (Maus, Ratte). Auftragsherstellung von monoklonalen Antikörpern (Maus, Ratte), rekombinanten Proteinen (Strep-tag®, 6xHistidine-tag) Biotech- und Pharmafirmen sowie Universitäten und Forschungsinstitute IBA Biologics GmbH Mascheroder Weg1, 38124 Braunschweig Tel.: +49-(0)531-6181-170 Fax: +49-(0)531-6181-701 Dr. Joachim Bertram, IBA_Biologics@gbf.de 2. Zielgruppen IBA GmbH Rudolf-Wissell-Str. 28, 37079 Göttingen, Tel.: +49-(0)551-50672-0 Fax: +49-(0)551-50672-181 info@iba-go.com, www.iba-go.com/ Dr. Uwe Carl, info@iba-go.com Cobra Biomanufacturing Stephenson Building Keele Science Park, Keele UK ST5 5SP Philip Ridley-Smith, Business Development and Group Marketing Manager philip.ridley-smith@cobrabio.com 1. Firmendaten, Ansprechpartner 10jährige Erfahrung in der Herstellung humaner Proteasen (Matrix Metalloproteinasen, ADAMTS, HtrA) & ELISA (InviLISA® Aggrecanase Activity Assay, InviLISA® human Act MMP-13) Patente & Publikationen Leitprojekt mit Aventis Proteinreinheitsbestimmung (SDS-PAGE) Aktivitätsbestimmung Rekombinante Proteasen: 3 - 6 Monate DIN EN ISO 9001:2000 und EN ISO 13485:2003. Batch-Verfahren Milligramm-Bereich E.coli Baculovirus-Expressionssystem Expression von rekombinanten humanen Proteasen - Aufreinigung Rekombinante humane Proteasen - monoklonale & polyklonale Antikörper - ELISA Pharmaindustrie Biotechnologiefirmen (Entwicklung von diagnostischen Assays/medizinischen Tests) Rheumaforschung (Osteoporose, Arthritis) Krebsforschung Invitek GmbH Robert-Rössle-Str. 10 D-13125 Berlin www.invitek.de Protein Expression Group Ansprechpartner: Dr. Anja Talke proteinexpression@invitek.de Tel.: +49 (0)30-9489 2906 Fax: +49 (0)30-9489 2909 M A R K T Ü B E R S I C H T LABORWELT LABORWELT Herstellung nach cGMP • ISO 13485 zertifiziert (Tierhaltung) • EN EC 1774:2002 Zertifizierung • Registriert nach FDA • USDA-lizenzierte Einrichtungen – Class R Forschungslizenz – Class B Handelslizenz – NIH-geprüft – NCIE-geprüfte Tierhaltung 12. Track Record 11. Regulatory Support Mabs: mehr als 700 verschiedene monoklonale Antikörper zwischen 10 mg und 100 g rek. Proteine: mehr als 50 verschiedene Projekte in Säugerzellen und E.coli Partner: mabs: Roche Diagnostics GmbH, Biosensor Applications AB, BRAHMS AG, r-Biopharm AG, rennesens GmbH, Phadia GmbH, Immundiagnostik AG, DKFZ u.a. rek. Proteine: BAYER HealthCare GmbH, APIT Laboratories GmbH, OncoMab GmbH, Biomedica Group u.a. auf Anfrage ELISA gegen das Antigen • In vivo- und in vitro-Assays • Western Blot • IP • IHC • FACS Kapillarelektrophorese, SEC, RP-HPLC, MALDI-TOF, Sequenzierung, Endotoxinbestimmung, Mykoplasmentest, ELISA, projektbezogene Tests DIN EN ISO9001:2000 7. Zertifikate /cGMP verschiedene Produktionsskalen, Antikörperreinigungen und Konjugationen Abhängig von den Kundenbedürfnissen können Projekte die 1-400 Tiere umfassen 10. Qualitätskontrolle Zellkultur (Batch, Fed-Batch, Perfusion) Spinnersysteme, begast (50) Stirred Tanks (8 Systeme – 2 bis 30 Liter) 6. Produktionskapazität und Produktionssysteme Monoklonale Antikörper: Maus, Ratte, andere Nagetiere Polyklonale Antikörper: Kaninchen, Huhn, Meerschweinchen, Schaf, Ziege, Maus, Esel Monoklonale Antikörper: • Hybridoma-Entwicklung: 6-8 Monate • Ascites: 2-3 Monate Polyklonale Antikörper • Immunisierung von 2 oder mehr Kaninchen: 70-90 Tage • Ziegen- oder Schafimmunisierung: 150 Tage E.coli Säugerzellen (CHO, HEK, K562, BHK) 5. Eingesetzte Expressionssysteme Antikörperentwicklung • Produktion kundenspezifischer monoklonaler und polyklonaler Antiköper • Produktion monoklonaler Antikörper (Zellkultur, Ascites) • Antikörperaufreinigung • Antikörperkonjugate und Labeling • Peptidsynthese • Assayentwicklung • Klonierung • Entwickung stabiler Zelllinien • Microarray IHC Antikörperproduktionen (6 Wochen bis 3 Monate) Process Development (3 bis 9 Monate, projektbezogen) Auftragsproduktion (nonGMP) Process Development Downstream-Prozessentwicklung Säugerzellkultivierung Herstellung präklinischer Muster 4. Dienstleistungsangebot • Monoklonale Antikörper • Ascites • In vitro monoklonale Produktion • Polyklonale Antikörper • Antikörperaufreinigung • Antikörperkonjugation • Peptidsynthese • Antikörper Fragmentation und Reinigung 9. Zeitfenster für Projektentwicklung monoklonale Antikörper (IgG, IgM – Maus, Ratte, human, rek.) rekombinante Proteine Zelllinienentwicklung 3. Produkte • Pharmazeutische Industrie • Biotechnologische Industrie • Universitäten • Klinische Labors • FITC • DTAF • Biotin • Peroxidase • Alkalische Phosphatase • Rhodamin • Cy3, Cy5 • Photoproteine • R-PE • R-PE/Cy5 • Alexa Fluor® Farbstoffe • Kundenspezifische Protokolle Diagnostik (Medical/Food/Drugs) Pharma Forschungseinrichtungen 2. Zielgruppen Millipore GmbH Florian Meier Am Kronenberger Hang 5 65824 Schwalbach technischerservice@millipore.com Tel.: +49-(0)6196-494 299 8. Produktmodifikationen InVivo Biotech Services GmbH Neuendorfstraße 24a D-16761 Hennigsdorf Tel.: +49 (0) 3302 883 735 Fax: +49 (0) 3302 883 736 info@invivo.de www.invivo.de Dr. Wolfgang Weglöhner 1. Firmendaten, Ansprechpartner hängt vom Service ab HuCAL - 8 Wochen Markierungen: 1-2 Wochen Reinigung: 5-7 Tage Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen (FITC, RPE, APC, ALexa-Dyes, Pacific Blue etc) sowie Enzymen uä (Biotin, AP, HRP) aktuell ISO 9001:2000 - Planung für GMP: 2007/2008 Batch nur Hybridomazelllinien Herstellung monoklonaler Antikörper - HuCAL Anzucht, Reinigung, Lagerung von Hybridomazelllinien sowie Markierung monoklonale AK F&E sowie Biotech-Industrie MorphoSys AbD GmbH Immermannstr. 13 D-40210 Düsseldorf Freya Wedekind CONTRACT MANUFACTURING 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 | 37 ORPEGEN Pharma, Gesellschaft für biotechnologische Forschung Entwicklung und Produktion m.b.H. Czernyring 22 69115 Heidelberg (Dr. Lars Krause, Pharm.Biotechnologie; Dr. Monika Singhofer-Wowra, QAO; Prof. Dr. Christian Birr, CEO ) Mittelständische und internationale Pharma- & Biotech-Industrien, priv. und öffentl. Forschungsinstitute, Biotech-Neugründungen Rekombinante und Hybridoma-basierte mAKs, rekomb. Glycoproteine ( EPO, GCSF, GM-CSF, u.ä.) Auftrags-F&E (Prot.chem., Molek.biol, Immunologie, Zellbiologie), Entw. von Assays und Zellinien. Analytik nach GLP/GMP. GMP-gemäße Auftragsproduktion von Glykoprotein-Wirkstoffen(API) und synth.Peptidwirkstoffen Proprietäre Expressions-Vectoren (BHK-, CHO-, Insektenzell; einlizensierte Human-Zelllinie; durchschnittl.Ausbeuten ca. 20-80 mg / L) Kontinuierliche (Perfusion, Fließbett) Fermentationssysteme ( ca. 5000 L / Woche) sowie Batch- und Fed-Batch-Ferm. (n x 100, 10, 1 L) GenTG-Prod.genehmigung; GMP/GLP ( QP & QC für APIs), cGMP (cQP), DIN ISO 9001/2000; FDA-inspiziert. Auftragsentwicklung von Molekülmodifikationen (chem. & rekombinant) Vier parallele GMP-Module (Reinraum-Neubau) für Produktentwicklung bis Routineproduktion verfügbar; Zeitfenster für Projektentw. nach Absprache mit Klientel ( durschnittl.Abwickl. 6-8 Monate) ICH-gemäße QC, QA, QP (Pharm.-GLP/GMP) ORPEGEN verfaßt Zulassungsdossiers im CTD-Format; betreibt Assays für klin. Studien an Patientenproben Seit 25 Jahren im Bio- und Pharma-Business; 1989-94 Entw. und Produktion von rhEPO für Klienten durchgeführt (incl.Phase III). Tech.Transfer-Preis d. Bundesreg. 1984; Prof. Birr, Mitglied d. TechnologieRates des Bundeskanzlers Kohl. 1. Firmendaten, Ansprechpartner 2. Zielgruppen 3. Produkte 38 | 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 4. Dienstleistungsangebot 5. Eingesetzte Expressionssysteme 6. Produktionskapazität und Produktionssysteme 7. Zertifikate /cGMP 8. Produktmodifikationen 9. Zeitfenster für Projektentwicklung 10. Qualitätskontrolle 11. Regulatory Support 12. Track Record Ausgründung aus dem Fraunhofer IME Gründer haben komplette, industriell erfolgreiche Prozesse entwickelt und implementiert nach Kundenwunsch und in Zusammenarbeit mit Fraunhofer IME Entsprechend GMP und GLP Freie Kapazitäten Projektabhängig Diverse nach Kundenwünschen GMP * State-of-the art * Non-GMP bis 100L * GMP: 2 Linien jeweils bis 350 L * Adäquate Aufreinigungssyteme * Viele gängige sowie eigene patentgeschützte Expressionssysteme * Bakterien * Hefen * Säugetierzellen * Pflanzliche Zellen * „Vom Gen zum Produkt“ * Machbarkeitsstudien * Prozessoptimierung * Prozessentwicklung * Produktion rekombinanter Proteine (non-GMP) * Produktion rekombinanter Proteine nach GMP eigene monoklonale Antikörper Biogenerika weltweit: * Biotechunternehmen * Pharmaunternehmen (klein, mittel, groß) * Interessenten für Biogenerika * Universitäten und Forschungseinrichtungen PharmedArtis GmbH Forckenbeckstr. 6 D-52074 Aachen Tel.: +49-(0)171-74-52566 Fax: +49-(0)241-6085-10000 info@pharmedartis.de Dr. Georg Melmer QM-System Markierung mit Fluorochromen aller Wellenbereiche, Markierung mit Biotinderivaten, Antikörpermarkierung mit Enzymen (AP, HRP, ß-Gal etc.), Markierung mit Phycobiliproteinen, Lyophilisierungen, Herstellung von Immunaffinitätssäulen, Kopplung an Beads, Glas Batch, Fed-Batch, Flaschen-, Hohlfaser- Rollersysteme etc., Kapazität P3-X63-Ag8.653, Y123 hybridomas Antikörpertechnologie: Herstellung und Produktion von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern, Komplettpakete und individuelle Lösungen, Org.-chem. Synthese niedermolekularer Antigene, KLH-Kopplungen, Peptidsynthesen, Epitopauswahl und -mapping, Komplettpakete, ELISA, Affinitätsreinigung von Antikörpern, Isolierung monospezifischer Antikörper, Antikörpermarkierung, Produktion von Kulturüberstand, Fragmentierungen, Immobilisierung von Biomolekülen, Lagerung, spezifische Affinitätsmatrices, Testentwicklung HYDRA®-Affinitätsmatrices, ImmunoSelect®-Adhäsionsträger Universitäten, Forschungsinstitute, Pharma-, Biotech-Industrie, Diagnostika-Hersteller etc. Squarix biotechnology GmbH Elbestraße 10 D-45768 Marl Dr. Christian Mengede Antikörpertechnologie Tel.: +49-(0)-2365-915-278 Fax: +49-(0)-2365-915-254 mengede@squarix.de M A R K T Ü B E R S I C H T LABORWELT S T E L L E N M A R K T Akademischer Stellenmarkt Veröffentlichen Sie Ihre Stellenanzeigen zielgruppengerecht in unserem akademischen Stellenmarkt, der allen nicht-kommerziellen Instituten für ihre Stellenausschreibungen kostenlos zur Verfügung steht. Bitte senden Sie dazu Ihre Anzeige (1/4 Seite 90 mm breit x 122,5 mm hoch, Logo – jpg oder tiff, 300 dpi Auflösung) an a.macht@biocom.de. Annahmeschluß für die nächste LABORWELT-Ausgabe 3/07 (Erscheinungstermin 15.06.2007) ist der 1. Juni. Universitätsmedizin Göttingen Georg-August- Universität Herzzentrum Göttingen Arbeitsgruppe Kardiovaskuläre Molekulargenetik Naturwissenschaftliche(r) Doktorandin/Doktorand - Entgeltgruppe 13 TV-L- In der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Ralph Knöll (Kardiovaskuläre Molekulargenetik, gentechnisch veränderte Tiermodelle) am Herzzentrum Göttingen ist zum nächstmöglichen Zeitpunkt eine Doktoranden-Stelle mit der Hälfte der regelmäßigen Arbeitszeit zu besetzen. Die Aktivitäten der Arbeitsgruppe konzentrieren sich auf mechanosensorische Prozesse, die sowohl Ursache als auch Folge einer Herzmuskelschwäche, einer Hypertrophie oder einer diastolischen Dysfunktion sein können. Die Arbeitsgruppe ist beteiligt an diversen Koordinationsprogrammen der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Klinische Forschergruppe), des Nationalen Genomforschungsnetzes (NGFN) und der Europäischen Union (EU-Gene-Heart). Voraussetzungen sind: Abgeschlossenes Hochschulstudium vorzugsweise im Bereich Biologie. Gute Kenntnisse der englischen Sprache in Wort und Schrift sind erforderlich. Solide methodische Kenntnisse in der Zell- und Molekularbiologie sowie Erfahrungen bei der Generierung und /oder kardiovaskulären Analyse von gentechnisch veränderten Tieren wären ein zusätzlicher Gewinn. Weitere Informationen erhalten Sie unter der Telefon: +49(0)551 39 5316. Formlose Anfragen können auch an die E-Mail-Adresse rknoell@med.uni-goettingen.de gesandt werden. Ihre Bewerbung mit den üblichen Unterlagen richten Sie bitte an: Prof. Dr. R. Knöll, Arbeitsgruppe Kardiovaskuläre Molekulargenetik Herzzentrum, Universitätsmedizin Göttingen Georg-August-Universität, 37099 Göttingen Telefon: +(49 (0)551 39 5316, Fax: +49 (0)551 39 13592 Otto von Guericke University Magdeburg The interdisciplinary “Research Center Dynamic Systems in Biology/Medicine and Process Engineering” and the “Magdeburg Center for Biomolecular System Dynamics and Regulation” funded by the Federal State of Saxony-Anhalt within the “Excellence Program” and by the Federal Ministery of Education and Research within the FORSYS program “Research Units in Systems Biology” offer the following positions: Research Group Leaders (TV-L) Computational Biology/Systems Biology The groups will be funded initially for three years and continued based on favorable external review. Applicants who have a commitment to scientific excellence as documented by a strong and independent research program in topics like: – Theoretical and/or experimental analysis of signal transduction or regulatory networks to be treated as continuous and/or discrete systems – Nonlinear dynamics and its relation to cellular function – Structure and parameter identification of molecular or genetic networks – Analysis and modification of cellular regulation processes are especially encouraged to apply. The centers provide an internationally competitive research environment including state-of-the-art technology platforms such as protein chemistry, mass spectrometry and high-end microscopy. The Otto von Guericke University wishes to increase the proportion of female academic personnel. Women are therefore explicitly encouraged to apply. Handicapped persons with equivalent qualification will be given preference. Full applications should be sent by May 10, 2007 to Ref No. 39/2007 Otto von Guericke University Magdeburg, Human Resources Department (K2) P.O.B. 4120, D-39016 Magdeburg/Germany The International Max Planck Research School for Molecular and Cellular Biology (IMPRS-MCB) of the Max-Planck Institute of Immunobiology and the Albert-Ludwigs-University in Freiburg, Germany invites suitable candidates to apply for a position in our International PhD program 2007 which is going to start in October 2007 in Freiburg, Germany. We invite applications from all countries. Applicants must hold a Bachelor’s degree with honours (Bsc Hons, 4 years of study), a Masters degree or a Diplom (or equivalent) in biology, biochemistry, medicine, chemistry, or related fields. It is not necessary to hold the degree at the point of application. However, you must have been awarded your degree prior to the start of the program in October. Candidates have to be fluent in written and spoken English and document their proficiency in English (TOEFL etc.). German is not required. Applications are reviewed by the selection committee of the Research School. Based on their academic qualification, motivation, suitability to the program and on two confidential letters of recommendation, candidates are selected for personal interviews in Freiburg. Online-registration and full details of the requirements for the application including the application form can be found at www.imprs-mcb.mpg.de. The closing date for applications is 27 April 2007. LABORWELT 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 | 39 S T E L L E N M A R K T Die III. Med. Klinik und Poliklinik der Johannes Gutenberg Universität Mainz sucht zum nächstmöglichen Termin Wissenschaftliche/r Mitarbeiter/in Pharma Max-Planck-Institut für Neurobiologie Martinsried/München im Rahmen eines BMBF-geförderten Drittmittelprojektes. Department of Molecular Neurobiology Martinsried/ Munich, Germany invites applications for one position: Zielsetzung des Projektes ist die Entwicklung von neuen Arzneimitteln basierend auf rekombinanten Ribonukleinsäure (RNA)-Impfstoffen Research Technician Aufgabengebiet: Diese Stelle ist dem Gebiet Arzneimittelforschung und Entwicklung im Bereich zwischen Grundlagenforschung und klinischer Medizin zugeordnet. Der Stelleninhaber(in) wird in einem exzellenten multidisziplinären Team von Ärzten/innen, Wissenschaftlern und technischen Assistenten/innen für die arzneimitteltaugliche (GMP) Herstellung, Aufreinigung und biochemische Charakterisierung von rekombinanten Ribonukleinsäuren verantwortlich sein. Neben fundierten Kenntnissen in den Bereichen Biochemie/ Molekularbiologie sind Kenntnisse in der GMP-Herstellung und Analytik von rekombinanten Arzneimitteln sehr erwünscht. in Signal Transolution Einstellungsvoraussetzungen: – Abgeschlossenes Studium der Biochemie, Biotechnologie, Medizin oder Pharmazie und mindestens 5 Jahre Forschungstätigkeit bzw. praktische Erfahrung. – Fundierte Kenntnisse im Aufgabengebiet. – Fähigkeit, wissenschaftliche Detailgenauigkeit mit einer pragmatisch-zielorientierten, effektiven Arbeitsweise zu kombinieren. You will perform biochemical as well as cell biology experiments in mammalian cell and primary cultures. Candidates should have working experience in an academic research laboratory and should be able to work independently. Preferably experience in cell culture. The position is limited for two years. The Max-Planck Institute of Neurobiology is a leading international research institute with an exceptional strength in developmental, molecular, systems and computational neurobiology. We offer outstanding research and training opportunities in an international environment. Working language in the lab is English. Disabled individuals will be preferred and are especially encouraged to apply. Please send your application with full CV and names of referees to Max-Planck-Institut für Neurobiologie Frau Dr. Amparo Acker-Palmer Am Klopferspitz 18, 82152 Planegg-Martinsried e-mail: palmer@neuro.mpg.de www.neuro.mpg.de Das Projekt ist zunächst auf 3 Jahre befristet. Vergütung erfolgt nach TVL mit allen im öffentlichen Dienst üblichen Leistungen. Die Johannes Gutenberg-Universität Mainz ist bestrebt, den Anteil der Frauen im wissenschaftlichen Bereich zu erhöhen und bittet daher Wissenschaftlerinnen sich zu bewerben. Technische/r Assistent/in (BTA, CTA oder MTA) im Rahmen eines BMBF-geförderten Drittmittelprojektes. Zielsetzung des Projektes ist die Entwicklung von neuen Arzneimitteln basierend auf rekombinanten Ribonukleinsäure (RNA)-Impfstoffen Ihr Aufgabengebiet: Der Stelleninhaber(in) wird als Assistent/in in einem Forschungsteam die immunologische Testung von arzneimitteltauglichen rekombinanten Krebsimpfstoffen (RNA, DNA) unterstützen. Voraussetzung: – Abgeschlossene Berufsausbildung (BTA, CTA oder MTA) – Berufserfahrung in: Molekularbiologie (Klonierung ausgehend von DNA und RNA, Herstellung, Manipulation, Reinigung und Charakterisierung von Nukleinsäuren) und /oder Immunologie (Kenntnisse in der sterilen Kultur, Expansion und Charakterisierung von Immunzellen wie Flowzytometrie, Zellfärbung mit Antikörpern und Mikroskopie, Immunhistologische Verfahren, Testverfahren zur Messung der Zellproliferation, Zytotoxizität und Zytokinsekretion, ELISA-Verfahren, Transfektion von Zellen mit Plasmiden und Selektion von Zellklonen) und /oder Proteinbiochemie (Expression, Aufreinigung und Charakterisierung von rekombinanten Proteinen) – Fähigkeit zur selbständigen und interdisziplinären Arbeit – Fähigkeit, wissenschaftliche Detailgenauigkeit mit einer pragmatisch-zielorientierten, effektiven Arbeitsweise zu kombinieren. Die Stelle ist zunächst auf 2 Jahre befristet. Vergütung erfolgt nach TVL mit allen im öffentlichen Dienst üblichen Leistungen. Schwerbehinderte werden bei entsprechender Eignung bevorzugt berücksichtigt. Ihre Bewerbung mit den üblichen Unterlagen richten Sie bitte an: Klinikum der Johannes Gutenberg Universität Mainz Univ.- Prof. Dr. Ugur Sahin, z.Hd. Frau Heinen Verfügungsgebäude 911, Obere Zahlbacherstraße 63, 55131 Mainz wheinen@mail.uni-mainz.de 40 | 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 91,5x110mm Postdoctoral Position (3 years) in Plant Genomics Root fungal endophytes of the order Sebacinales form a unique mutualistic symbiosis with Arabidopsis that results in disease resistance and yield increase. We seek a young postgraduate Biologist or Biochemist with experience in genomic/proteomics and strong motivation to pursue basic research in metabolic reprogramming of host plant and fungal symbiont. Gießen is an inexpensive, cosmopolitan city in the hub of Europe, with a thriving culture. Justus-Liebig-University is one of the successful universities of the German Research Excellence Initiative. Please send your application until April 27, 2007 to: Prof. Dr. Karl-Heinz Kogel, Justus-Liebig-Universität Gießen Interdisciplinary Research Centre for BioSystems, Land use and Nutrition Heinrich-Buff-Ring 26-32, D-35392 Gießen Tel.: 0641-99-37490 E-mail: Karl-Heinz.Kogel@agrar.uni-giessen.de http://www.uni-giessen.de/ipaz LABORWELT S T E L L E N M A R K T Die III. Med. Klinik und Poliklinik der Johannes Gutenberg Universität Mainz sucht zum nächstmöglichen Termin eine(n) Doktoranden/in im Rahmen eines BMBF-geförderten Drittmittelprojektes. Für ein Forschungsprogramm zur Entwicklung von pharmakologisch optimierten Ribonukleinsäuren als rekombinante Impfstoffe und Immunadjuvantien. Ihre Aufgabengebiet: Der Stelleninhaber(in) wird in einem Forschungsteam die arzneimitteltaugliche Herstellung, Aufreinigung und biochemische und funktionelle Charakterisierung von rekombinanten Nukleinsäuren (RNA, DNA) unterstützen. Voraussetzung: – Abgeschlossenes naturwissenschaftliches Studium bzw. Studium der Biotechnologie – Experimentelle Forschungserfahrung mit detaillierten Kenntnissen in den Bereichen Molekularbiologie (Klonierung ausgehend von DNA und RNA, Herstellung, Manipulation, Reinigung und Charakterisierung von Nukleinsäuren) und Proteinbiochemie (Expression, Aufreinigung und Charakterisierung von rekombinanten Proteinen) – Fähigkeit zur selbständigen und interdisziplinären Arbeit – Fähigkeit, wissenschaftliche Detailgenauigkeit mit einer pragmatisch-zielorientierten, effektiven Arbeitsweise zu kombinieren. Geboten wird eine gut betreute, anspruchsvolle wissenschaftliche, anwendungsorientierte Tätigkeit in einem teamorientierten Umfeld und etablierter Infrastruktur. Das Projekt ist zunächst auf 3 Jahre befristet. Vergütung erfolgt nach TVL mit allen im öffentlichen Dienst üblichen Leistungen. Die Johannes GutenbergUniversität Mainz ist bestrebt, den Anteil der Frauen im wissenschaftlichen Bereich zu erhöhen. Center for Neurology, Universitätsklinikum Tübingen Ph.D. position (BAT IIA/2) Drosophila Group, Department of Cellular Neurology, Hertie-Institute for Clinical Brain Research, Bist Du daran interessiert molekulare Mechanismen zu untersuchen, die die Stabilisierung bzw. den Abbau der Synapsen kontrollieren? In unserem Labor wird die neuromuskuläre Verbindungen von Drosophila als Model genutzt. Hierbei ermöglicht uns ein spezieller Assay Veränderungen an individuellen Synapsen über einen Zeitraum von mehreren Tagen in lebenden Tieren zu verfolgen (Rasse et. al. 2005). Wir wollen verstehen, wie Störungen des axonalen Transports Synapsen-Abbau auslösen und wie wir den einsetzenden negativen Feed-back-loop unterbrechen können. In von uns bereits durchgeführten Screens konnte eine große Bandbreite an Mutanten mit strukturellen und funktionellen synaptischen Defekten identifiziert werden. Deine Aufgabe wäre es unser Team (1 medizinische + 2 biologische Doktorandinnen + mehrere Diplomanden) weiter zu verstärken und mitzuhelfen herauszufinden, wie genau die identifizierten Gene interagieren um zu „entscheiden“ welche Synapsen stabilisiert werden, und welche eliminiert werden. Ferner sollst Du herausfinden, wie axonaler Transport Synapsenaufbau kontrolliert, und wie Synapsen axonalen Transport regulieren. Ein besonderes Anliegen Deiner Arbeit ist es eine „Brücke“ vom mutierten Molekül zum Verhaltensdefekt zu schlagen. Methodisch sind Erfahrungen mit Molekular Biologie, Drosophila Genetik, Konfokaler Mikroskopie, Elektronenmikroskopie, Bildanalyse/Bioinformatik und Biochemie von Vorteil, aber keine Vorraussetzung für eine erfolgreiche Bewerbung. (1) Rasse et. al. (2005) Glutamate receptor dynamics organising synapse formation in vivo, Nature Neuroscience, 8: 898-905 Schwerbehinderte werden bei entsprechender Eignung bevorzugt berücksichtigt. see also: http://hih-tuebingen.de/zellbiologie/forschungsgruppen/arbeitsgruppe-drosophila/ Ihre Bewerbung mit den üblichen Unterlagen richten Sie bitte an: Klinikum der Johannes Gutenberg Universität Mainz Univ.- Prof. Dr. Ugur Sahin z.Hd. Frau Heinen Verfügungsgebäude 911, Obere Zahlbacherstraße 63, 55131 Mainz wheinen@mail.uni-mainz.de Bewerbungen bitte per e-mail (als PDF oder Word –Dokument) an: tobias.rasse@medizin.uni-tuebingen.de oder per Post an folgende Adresse senden: Tobias Rasse, Department of Cellular Neurology, Hertie-Insitute for Clinical Brain Research, University of Tübingen, Otfried-Müller Str. 27, D-72076 Tübingen, Germany LABORWELT 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 | 41 S T E L L E N M A R K T Postdoctoral Position at the Georg-Speyer-Haus A postdoc position is available at the Georg-Speyer-Haus, AG Dietrich, within a European project (Euroflu) studying molecular factors and mechanisms of transmission and pathogenicity of highly pathogenic Avian Influenza Virus (HPAIV). Within the project of the AG Dietrich, HPAIV factors will be analyzed that are involved in the recognition and targeting of avian and human Influenza viruses to the cellular receptors. Based on the phage display technology, peptide ligands for these structures will be selected that should interfere with infection or mimic entry epitopes for further development of inhibitors. Applicants must hold a PhD in Biology/Biochemistry, be highly motivated and integrate themselves into a young team. An excellent background in molecular biology, biochemistry or cell biology is required and experience in virology, preferentially Influenza viruses, is of advantage. The position is available immediately and initially for 3 years but can be prolonged thereafter. Applicants should send a CV and the usual documents including references to Dr. Ursula Dietrich Georg-Speyer-Haus, Paul-Ehrlich-Strase 42-44, 60596 Frankfurt Tel.: 069-63395-216, FAX: 069-63395-297 Email: ursula.dietrich@em.uni-frankfurt.de Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Medizinische Fakultät Institut für Anatomie und Zellbiologie Im Institut ist die Stelle eines/r Wissenschaftlichen Mitarbeiter/in zu besetzen Aufgabenschwerpunkte: – Beteiligung an den Lehrveranstaltungen des Anatomischen Instituts – Aktive Beteiligung an den Forschungsarbeiten zur Physiologie und Pathologie der frühen Embryonalentwicklung und Frühschwangerschaft bei Säugern, insbes. – Energie- und Fettstoffwechsel bei Säugetier-Embryonen und embryonalen Stammzellen (IGF-Familie, Adipokine) – Wirkung von „endokrinen Disruptoren“ auf die frühe Embryonalentwicklung, auf embryonale Stammzellen und auf die Ovarfunktion (Phthalate, Dioxin, PCBs) – Ah-Rezeptor-Signaltransduktion in der Oogenese und Follikulogenese Qualifikationsmerkmale: Hochschulabschluß in Medizin, Veterinärmedizin oder Naturwissenschaften, möglichst mit Promotion geplante Einstellung: sofort Arbeitszeit und Bezahlung: 40 Stunden/Woche; TV-L Bitte richten Sie Ihre Bewerbungen an: Professor Bernd Fischer Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Medizinische Fakultät Institut für Anatomie und Zellbiologie Große Steinstraße 52, 06097 Halle (Saale) Tel.: (0345) 557-1701 oder -1702, bernd.fischer@medizin.uni-halle.de 42 | 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 Am Institut für Klinische Chemie und Pathobiochemie sowie KlinischChem. Zentrallaboratoriums des UKA ist zum frühestmöglichen Termin, befristet für die Dauer von vorerst 2 Jahren, die Stelle eines/ einer wissenschaftlichen Mitarbeiters/-in mir der vollen wöchentlichen Arbeitszeit (zur Zeit 38,50 Std./W. TV-L) zu besetzen. Zu Ihrer Aufgabe gehört die eigenverantwortliche Leitung von Forschungsprojekten, die darauf abzielen, das pathogenetische Geschehen fibrosierender Lebererkrankungen zu verstehen. Insbesondere soll die Regulation profibrogener Markergene und deren Beteiligung am Krankheitsgeschehen auf molekularer, zellbiologischer und biochemischer Ebene untersucht werden. Im Rahmen des Projektes besteht für den/die Bewerber/-in die Möglichkeit, eine eigene Arbeitsgruppe aufzubauen. Dazu ist eine intensive Beteiligung an der Einwerbung von Drittmitteln erforderlich. Dabei wird der/die Bewerber/-in durch ein motiviertes Team aus Naturwissenschaftlern und Medizinern unterstützt. Detaillierte Informationen zu den wissenschaftlichen Aktivitäten des Instituts sind im Internet www.klinische-chemie.ukaachen.de abrufbar. Ihr Profil: Sie sind promovierte/-r Biologe/-in, Biochemiker/-in oder Chemiker/ -in und haben ein erhöhtes Interesse an der kompetenten Bearbeitung wissenschaftlicher Fragestellungen. Die Vergütung richtet sich nach den Bestimmungen des TV-L mit den im öffentlichen Dienst üblichen sozialen Leistungen. Die RWTH Aachen ist für ihre Bemühungen um die Gleichstellung von Mann und Frau mit dem „Total-E-Quality-Award“ ausgezeichnet worden. Bewerbungen von Frauen sind ausdrücklich erwünscht. Bei gleicher Eignung, Befähigung und fachlicher Leistung werden Frauen bevorzugt berücksichtigt, sofern nicht in der Person eines Mitbewerbers liegende Gründe überwiegen. Auf § 8 Abs. 6 Landesgleichstellungsgesetz NW wird verwiesen. Die RWTH Aachen ist für ihre Bemühungen um die Ausbildung und Beschäftigung schwerbehinderter Menschen mit dem Prädikat „behindertenfreundlich“ ausgezeichnet worden. Bewerbungen geeigneter schwerbehinderter Menschen sind ausdrücklich erwünscht. Dies gilt auch für Gleichgestellte im Sinne von § 2 SGB IX. Bewerbungen werden erbeten an den Direktor des Instituts für Klinische Chemie und Pathobiochemie sowie des KlinischChemischen Zentrallaboratoriums, Herrn Univ.-Prof. Dr. med., Prof. h. c. (RCH) A. M. Gressner, des Universitätsklinikums Aachen, Pauwelsstr. 30, 52074 Aachen. Telefonische Informationen unter: 0241 / 80 88683 Herr Priv.-Doz. Dr. R. Weiskirchen, e-mail: agressner@ukaachen.de, Internet: www.ukaachen.de Am Anatomischen Institut der Ludwig-Maximilians-Universität ist eine wissenschaftliche Mitarbeiterstelle (Postdoktoranden, Mediziner/innen oder Naturwissenschaftler/innen) sofort zu besetzen. Erfahrungen auf dem Gebiet der Elektrophysiologie/Zellbiologie/Molekularbiologie sind erwünscht. Weitere Informationen sind im Internet (http://www.anatomie.med.tu-muenchen.de/) erhältlich. Prof. Dr. Artur Mayerhofer, Anatomisches Institut der LMU Biedersteiner Str. 29, 80802 München, Tel.: 089-4140-3150 Bitte senden Sie Ihre Bewerbungen per E-mail an Karin.Metzrath@lrz.uni-muenchen.de LABORWELT S T E L L E N M A R K T DFG-Graduiertenkolleg 1045/2 (Ph.D. Fellowship) Mykotoxine im Kontext von Produktion, Qualität und Verarbeitung Modulation of host cell functions as a new approach to treat viral and bacterial infections. Doktorandenstelle (E 13/TV-L/2) The Universities of Duisburg-Essen, Bochum and Duesseldorf zum 1. Mai 2007 zu besetzen invite applications for im Projekt Zentrale Analytik (HPLC-MS und Real-time PCR) im Verbundprojekt Qualitätsgerechte Pflanzenproduktion unter veränderten Rahmenbedingungen: Mykotoxine im Kontext von Produktion, Qualität und Verarbeitung Die Aufgabe der Zentralanalytik wird die Mykotoxinbestimmung (HPLC/MS-MS) und die Adaptation und Durchführung von artspezifischen Real-time PCR-Assays für Fusarium spp. Der/die einzustellende Doktorand/in wird neue HPLC-MSMethoden entwickeln bzw. bestehende Methoden an neue Matrices anpassen, den Austausch mit den anderen Teilprojekten koordinieren und sie bei der Interpretation analytischer Ergebnisse unterstützen. Außerdem wird er/sie für die Organisation von Real-time PCR-Analysen verantwortlich. Bei Routinearbeiten wird er/sie von einer ganztags tätigen technischen Assistentin unterstützt. Die Bewerberinnen/Bewerber sollen fundierte Kenntnisse chemisch-analytischer Prinzipien besitzen, umfassende praktische Erfahrung mit HPLC mitbringen und massenspektrometrische Detektion verstehen. Praktische Erfahrungen mit HPLC-MS-Kopplung und/oder Real-time PCR wären von Vorteil, sie sind jedoch nicht obligatorisch. Voraussetzung für die Promotion ist eine abgeschlossene Hochschulausbildung, Absolventen/innen des Studiums Lebensmittelchemie oder Chemie können wahlweise an der Fakultät für Chemie promovieren. 12 Ph.D. fellowships (Dr. rer. Nat./Dr. med.) for 3 years The Institute of Virology and the Institute of Molecular Biology of the University of Duisburg-Essen, the Institute of Molecular and Medical Virology of the University of Bochum, and the Institute of Medical Microbiology, the Institute of Molecular Medicine, and the Clinic of Gastroenterology, Hepatology and Infectiology of the University of Duesseldorf have initiated a novel scientific collaboration encompassing virology, bacteriology, immunology and cell biology to study pathogenhost interactions. The research focuses on aspects of immune activation and signal transduction in an infected host and is sponsored by the DFG. We are seeking candidates with a strong background in Virology, bacteriology, immunology, or molecular biology and a fundamental dedication towards biomedical research. Excellent knowledge in English, team spirit and extraordinary motivation are expected. Candidates should not be older than 28 years. The positions are open from 1 July 2007. The monthly salary is Euro 1.450,00 (tax-free grant). Bewerbungen werden akzeptiert bis die Stelle besetzt ist. Anfragen und Bewerbungen richten Sie bitte an: Please send electronic applications before 15 March 2007, including CV, summary of training/experience, references and preferred area of research (virology, immunology, signal transduction, cell biology) to the coordinators of the scientific programme at the Institute of Virology in Essen, Germany: Dr. Ursula Hettwer, E-Mail: uhettwe at gwdg.de, Tel. 0551 / 3913230 Prof. Dr. Petr Karlovsky, E-Mail: pkarlov at gwdg.de, Tel. 0551 / 3912918 Prof. Dr. M. Roggendorf or Prof. Dr. U. Dittmer Coordination: Delia Cosgrove, e-mail: delia.cosgrove@uni-due.de Bei gleicher Eignung werden bei der Auswahl Schwerbehinderte bevorzugt. ScieCon_laborwelt_210x137 30.03.2007 11:13 Uhr Seite 1 ScieCon München 2007 Let Life Schirmherrschaft: M Munich BioTech Dev el op m e n t Sponsoren: LABORWELT 16. Mai 2007 10 bis 18 Uhr Hörsaalgebäude Klinikum Großhadern, München Biologie, Medizin, Biotechnologie, Biochemie, Bioinformatik, Chemie… Sciences meet you Die Firmenkontaktmesse der Life Sciences i! Eintritt fre • Infos über Chancen und Anforderungen auf dem Arbeitsmarkt • Persönliche Kontakte zu Unternehmen der Life Science Branche • Vermittlung von Jobs, Praktika, Diplom- und Doktorarbeiten • Rahmenprogramm mit interessanten Vorträgen: Referenten u. a. Leibniz-Preisträger Prof. Dr. Patrick Cramer, Genzentrum München Exklusiv für ScieCon-Besucher: Matching-Plattform auf www.EuroBioJobs.org Weitere Infos auf www.ScieCon.info! Veranstalter: München 2007 Medienpartner: 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 | 43 www.btS-eV.de S T E L L E N M A R K T Das Institut für Neurophysiologie (Direktor Herr Prof. Hescheler) sucht zum nächstmöglichen Zeitpunkt im Rahmen eines Drittmittelprojektes eine/n Wissenschaftliche/r Mitarbeiter/-in (Post-Doktorand/-in) zunächst befristet für 1 Jahr, die Vergütung erfolgt nach TV-L E13, in Vollzeit und eine/n Wissenschaftliche/r Mitarbeiter/-in (Doktorand/-in) zunächst befristet für 1 Jahr, die Vergütung erfolgt nach TV-L E13, in Teilzeit (19,25 Std./Woche) Aufgabengebiet: Die Mitarbeiter/-innen sollen eigenständig elektrophysiologische Untersuchungen an nativen embryonalen Kardiomyozyten sowie Kardiomyozyten aus embryonalen Stammzellen der Maus durchführen. Insbesondere soll, mit Hilfe einer am Institut für Neurophysiologie neu entwickelten Technik zur Herstellung lebendiger Herzschnitte, die elektrische Integration dieser Zellen nach Transplantation in infarzierte Mäuseherzen untersucht werden. Neben elektrophysiologischen Studien mit Glas-Mikroelektroden und microelectrode arrays (MEAs) sind Zellkulturarbeiten und DifferenzierungsVerfahren anzuwenden. Das Projekt wird von der Else Körner-FreseniusStiftung unterstützt und soll in Zusammenarbeit mit der Klinik III für Innere Medizin, Arbeitsgruppe Herr Dr. Müller-Ehmsen, durchgeführt werden. Einstellungsvoraussetzungen: Mediziner/-in, Biologe/Biologin, Biophysiker/-in, Pharmazeut/-in mit Promotion bzw. mit dem Ziel einer Promotion. Erwünscht: Kenntnisse in Elektrophysiologie (Mikroelektroden/MEAs), zellbiologischen Arbeitsmethoden, Computerauswertung sowie gute Englischkenntnisse. Bewerbungen von Frauen werden bei gleicher Eignung, Befähigung und fachlicher Leistung bevorzugt berücksichtigt, sofern nicht in der Person eines Mitbewerbers liegende Gründe überwiegen. Gleiches gilt für Bewerbungen von Schwerbehinderten. Für telefonische Auskünfte steht Ihnen Herr Dr. Halbach unter der Rufnummer (0221) 478-87099 zur Verfügung. Ihre Bewerbung richten Sie bitte mit den üblichen Unterlagen per Post oder Email (bitte Unterlagen zu einer Datei zusammenfassen) innerhalb von 4 Wochen nach Erscheinen der Anzeige an: Prof. Dr. J. Hescheler, Institut für Neurophysiologie Robert-Koch-Str. 39, 50931 Köln Email: j.hescheler@uni-koeln.de Wir bitten um Verständnis, dass wir aus administrativen Gründen Ihre Bewerbungsunterlagen nicht zurücksenden, sofern Sie uns nicht einen ausreichend frankierten und an Sie adressierten Rückumschlag beifügen. 44 | 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 Am Institut für Physiologie und Pathophysiologie der Johannes Gutenberg-Universität Mainz ist die Stelle einer / eines wissenschaftlichen Angestellten (BAT IIa, E13, ggf. Akad. Rat) ab sofort zu besetzen. Die Arbeitsgruppe untersucht mit in vitro elektrophysiologischen, zellulär neuroanatomischen, molekularbiologischen und zellulär bildgebenden Verfahren normale und pathophysiologische Entwicklungsvorgänge im cerebralen Cortex von Mäusen und Ratten. Informationen unter http://physiologie.uni-mainz.de/physio/luhmann/index.htm Aufgaben: Durchführung von Drittmittel-geförderten Projekten zur Cortexentwicklung. Mitarbeit bei nationalen und internationalen Kooperationen. Lehre in der Medizin (Physiologie). Voraussetzungen: Abgeschlossenes Hochschulstudium. Ziele: Ausbildung zum Erwerb eines eigenen wissenschaftlichen Profils. Ausbildung in Forschung und Lehre. Möglichkeit zur Habilitation. Schriftliche Bewerbungen (Lebenslauf, Publikationsverzeichnis, Zeugnisse, Nennung von Referenzen) senden Sie bitte elektronisch an: Prof. Dr. Heiko J. Luhmann, Institut für Physiologie und Pathophysiologie Universität Mainz, Duesbergweg 6, D-55128 Mainz Email: luhmann@uni-mainz.de Die Arbeitsgruppe Pharmazeutische Biologie der Universität des Saarlandes (Standort Saarbrücken) beschäftigt sich mit der Untersuchung von zellulären Mechanismen der Entstehung und Behandlungsmöglichkeiten entzündlicher Erkrankungen. Entzündungsprozesse sind außer bei Infektionserkrankungen auch an einer Vielzahl nicht-infektiöser Prozesse wie Arteriosklerose oder Tumoren beteiligt. Für ein durch die Deutsche Krebshilfe e.V. gefördertes Projekt zur Untersuchung eines Autoantigens in Lebertumoren ist zum nächstmöglichen Zeitpunkt eine Stelle für eine/n Doktoranden/in mit Hochschulabschluss in Pharmazie, Biologie oder Biochemie zu besetzen. Wir suchen dafür eine/n motivierte/n kommunikations- und teamfähige/n Mitarbeiter/in. Die Methodik im genannten Projekt umfasst neben dem Arbeiten mit transgenen Mäusen verschiedenste zell- und molekularbiologische Techniken (real-time PCR, Western blots, Gelshiftanalysen, Konfokalmikroskopie, etc.). Die Bezüge richten sich nach den Bestimmungen des TV-L (insbesondere nach den für die Hochschule geltenden Sonderregelungen des §40). Die Universität des Saarlandes strebt nach Maßgabe des Frauenförderplanes eine Erhöhung des Anteils an Frauen in diesem Aufgabenbereich an. Sie fordert daher Frauen nachdrücklich auf, sich zu bewerben. Schwerbehinderte werden bei gleicher Eignung bevorzugt berücksichtigt. Bewerbungen werden bis 7. Mai mit vollständigen Unterlagen (ggf. auch per e-mail als pdf file < 1 MB) erbeten an: Universität des Saarlandes, Prof. Dr. Alexandra K. Kiemer Pharmazeutische Biologie Postfach 15 11 50, 66041 Saarbrücken pharm.bio.kiemer@mx.uni-saarland.de Bitte reichen Sie nur Kopien ein, da die Bewerbungsunterlagen nicht zurückgesandt werden. Ebenso bitten wir Sie, auf Hefter o.ä. zu verzichten. LABORWELT S T E L L E N M A R K T At the Johannes Kepler University Linz (Austria), Institute of Biophysics a three year PhD Position in Biophysics is available to study the molecular mechanism of ion and water transport across potassium channels (see PNAS (2004) 101, 4805-4809). Studies involve protein reconstitution into planar bilayers and electrophysiological characterisation. The successful applicant will exploit electrochemical microscopy and fluorescent correlation spectroscopy. Your environment: A young, lively, international and interdisciplinary research team in an excellently equipped research laboratory is waiting for you to join and give you training in cutting edge technologies in a strongly growing research field. Your profile: You have an excellent master’s degree or diploma in Biophysics, Biochemistry or Biology. Preference will be given to individuals younger than 28. Applications including cover letter, full c.v., and copies of graduation certificates should be sent as soon as possible. The position is open until filled. Please send your application to Univ.-Prof. Peter Pohl, Johannes Kepler University Linz, Institute of Biophysics, Altenberger Straße 69, A-4040 Linz, Austria or per e-mail: peter.pohl@jku.at. You can also contact Prof. Pohl at telephone no.: +43/(732)2468-9269. Kontakt zu Verbänden Im Jahr 2007 erscheint LABORWELT zweimonatlich, IVW geprüft. Alle Abonnenten des Branchen-Magazins |transkript sowie die Mitglieder der nachfolgenden Gesellschaften erhalten LABORWELT regelmäßig mit freundlicher Empfehlung ihrer Organisationen. Wer sich darüber hinaus für einen Beitritt interessiert, erreicht die Gesellschaften unter folgenden Kontaktdaten: Verband Deutscher Biologen DECHEMA Fachsektion Biotechnologie Theodor-Heuss-Allee 25 60486 Frankfurt/Main Tel.: +49-(0)-69-7564-289 Fax: +49-(0)-69-7564-272 www.dechema.de Deutsche Gesell. für Proteomforschung c/o MPI für Biochemie Am Klopferspitz 18a 82152 Martinsried Tel.: +49-(0)-89-8578-3964 Fax: +49-(0)-89-8578-2802 c.kleinhammer@dgpf.org www.dgpf.org Österreichische Gesell. für Biotechnologie c/o Boehringer Ingelheim Austria GmbH Dr. Boehringer-Gasse 5-11 A-1121 Wien Tel.: +43-(0)-1-80105-2311 Fax: +43-(0)-1-80105-9311 www.boku.ac.at/oegbt/ Deutsche Gesellschaft für Genetik c/o Genetisches Institut der Universität Gießen Heinrich-Buff-Ring 58-62 35392 Gießen Tel.: +49-(0)-641-99-35463 Fax: +49-(0)-641-99-35469 www.gfgenetik.de Gesellschaft für Signaltransduktion c/o Prof. Dr. Ralf Hass Med. Hochschule Hannover AG Biochemie u. Tumorbiol. 30625 Hannover Tel.: +49-(0)-511-532-6070 Fax: +49-(0)-511-532-6071 www.sigtrans.de Gesellschaft für Pharmakologie u.Toxikologie e.V. DGHM c/o Gesellschaft für Hygiene & Mikrobiologie Josef-Schneider-Str. 2 97080 Würzburg Tel.: +49-(0)-931-201-46936 Fax: +49-(0)-931-201-46445 www.dghm.de LABORWELT Corneliusstr. 6 80469 München Tel.: +49-(0)-89-26024573 Fax: +49-(0)-89-26024574 info@vdbiol.de www.vdbiol.de Geschäftsstelle der DGPT Achenbachstr. 43 40237 Düsseldorf Tel.: +49-(0)-211-600-692-77 Fax: +49-(0)-211-600-692-78 mitglieder@dgpt-online.de www.dgpt-online.de Nationales Genomforschungsnetz c/o DLR – Koblenzerstr. 112 53177 Bonn-Bad Godesberg Tel.: +49-(0)-228-3821-331 Fax: +49-(0)-228-3821-332 pm-ngfn@dlr.de www.ngfn.de Deutsche Gesellschaft für Neurogenetik c/o Institut für Humangenetik Uni Gießen/Schlangenzahl 14 35392 Gießen Tel.: +49-(0)-641-99-41600 Fax: +49-(0)-641-99-41609 www.med.uni-giessen.de /genetik/dgng.html Netzwerk Nutrigenomforschung Arthur-Scheunert-Allee 114 14558 Bergholz-Rehbrücke Tel.: +49-(0)-33200 88 385 Fax: +49-(0)-33200 88 398 verein@nutrigenomik.de www.nutrigenomik.de Netzwerk RNA-Technologien c/o Prof. Dr. Volker A. Erdmann Freie Universität Berlin Thielallee 63, 14195 Berlin Tel.: +49-(0)-30-8385 6002 Fax: +49-(0)-30-8385 6413 erdmann@chemie.fu-berlin.de www.rna-network.com 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 | 45 P R O D U K T W E L T Probenvorbereitung Probenkontaminationen bei der Lyophilisation vermeiden Dr. Klemens Hoegenauer, Novartis AG, Wien; Dr. Induka Abeysena, Genevac, Ipswich Immer häufiger wird in vielen Laboratorien die Lyophilisierung bei der Aufreinigung von Proben eingesetzt. Mit dieser Methode erhält man „wiegbare“ Proben die leicht wieder gelöst werden können. Eine aktuelle Studie des Instituts für biomedizinische Forschung der Firma Novartis in Österreich berichtet über ein dort eingesetztes neues Verfahren zur Herstellung von lyophilisierten Proben. Unter Verwendung eines Genevac HT-4X S-Evaporationssystems werden Proben mit einer flaumigen Konsistenz erhalten, ohne Restrückstände des Lösungsmittels und ohne die Gefahr von Kreuz-Kontamination. Abb. 1: Vials in der „High volume Deep Wellplatte“ als Probenhalter Als Modellsubstanzen für die Versuche zur Lyophilisierung wurden die Aminosäuren L-Asparagin (L-Asn), L-Asparaginsäure (LAsp), L-Arginin (L-Arg) sowie ein Makrolid und ein zyklisches Peptid gewählt. Basierend auf vorhandenen Erfahrungen bezüglich der Löslichkeit wurde für diese Substanzen eine Reihe passender Lösungsmittelgemische mit unterschiedlichen Volumina wie nachfolgend aufgeführt ausgewählt. – 1,4-Dioxan (C4H8O2 ) – zwischen 2 ml und 3 ml – Tert-Butanol (C4H10O ) – zwischen 2 ml und 3 ml – H2O – zwischen 1ml und 1.5 ml – 1,4-Dioxan und H2O (1:1) – ungefähr 2 ml – Tert-Butanol und H2O (1:1) – ungefähr 2 ml. Die Lösungsmittelvolumen wurden mit einer 1 ml-Spritze abgemessen. Um einen optimalen Gefrierprozess zu ermöglichen, muss ausreichend Lösungsmittel zugege- ben werden, da die Proben ausschließlich durch die Nutzung des Vakuums gefroren werden. Die Bearbeitung der Proben bei „vollem“ Vakuum über einen Zeitraum von 20 Minuten hat zieht folgende Effekte nach sich: – 1,5 ml H2O werden auf 1,4 ml reduziert – 3,0 ml 1,4-Dioxan werden auf 1,4 ml reduziert – 3,0 ml Tert.-Butanol werden auf 1,6 ml reduziert – Am Ende der Bearbeitungszeit sind alle Proben komplett gefroren. Die Proben wurden in 4 ml Storage-Vials lyophilisiert, die ohne Schraubdeckel in einer High volume Deep-Wellplatte (24-well/10 ml, siehe Abb. 1) positioniert wurden. Diese Mikroplatte ist eine ideale Halterung – weil sie handelsüblich verfügbar ist, optimal zu den verwendeten Vials passt (kein „Hervorstehen“), besonders aber durch die „Zwischenstreben“, die Proben auch vor zuviel Hitzeeinwirkung schützen, und damit ein optimales Lyophilisieren auch nur weniger Proben ermöglicht. Schutz der Proben vor Kreuzkontamination Bei beiden Programmen werden gut lyophilisierte Proben erhalten, es besteht jedoch das Risiko des Austritts von „Probenstaub“ in das System. Bei Proben mit trockener, „flaumiger“ Konsistenz können Spuren (Probensstaub) Tab.: Die Proben sind unter Verwendung eines der folgenden Programme getrocknet worden Programm 1 (Lyophilisation mit “Wärmezufuhr”) Voll-Vakuum, keine Wärme, 2 Std. 2 Stunden bei 40 C Nur Vakuum für 3 Stunden “Very low” Rotorgeschwindigkeit (50g) 46 | 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 Programm 2 (Lyophilisation ohne “Wärmezufuhr”) Nur Vakuum für 7 Stunden “Very low” Rotorgeschwindigkeit (50g) Abb. 1: Genevac HT-4X Evaporator während des Abluftprozesses in die Evaporationskammer gelangen und somit andere Proben kontaminieren. Eine Möglichkeit dies zu vermeiden, ist die Kontrolle der Luftzufuhr in das System durch Beschränkung des Lufteinlasses. Zusätzlich wurden bei Novartis die Proben mit einer flexiblen „Einmal-FilmFolie“ abgedeckt. Diese Folie wurde mit einer Standardkanüle an mehreren Stellen je Vial „gelocht“ damit die entstehenden Dämpfe entweichen können. Dieses Vorgehen schützt nachweislich die Proben sehr effektiv. Mit Hilfe der Proton-NMR sind die Proben nach der Lyophilisierung getestet worden. Es konnten weder Rückstände von Lösungsmitteln oder eine Kreuzkontamination nachgewiesen werden. Selbstverständlich muss die Folie vorsichtig entfernt werden, da sich Probenstaub auch aufgrund elektrostatischer Aufladung auch daran anlagern kann. Ein alternatives Verfahren zur Vermeidung von Kontamination ist der Einsatz einer höheren G-Kraft bei der Evaporation. Dadurch werden die Proben in ihrer Konsistenz etwas weniger „flaumig“ beziehungsweise kompakter und damit weniger anfällig für die Aufwirbelung von Probenstaub während des Abluftvorganges. Bei den Genevac HTSystemen (Abb. 2) kann die G-Kraft durch die Änderung der Rotorgeschwindigkeit (g = 500/high und g = 300/low) angepasst werden. Auch wenn diese Methode in der vorliegenden Studie nicht untersucht wurde, so wird sie doch eingesetzt. Korrespondenzadressen Dr. Klemens Hoegenauer Institut für biomedizinische Forschung, Novartis, Wien Dr. Induka Abeysena Genevac Ltd. Ipswich, UK Tel.: +44-(0)1473-240000 eMail: induka.abeysena@genevac.co.uk LABORWELT P R O D U K T W E L T Kennziffer 29 LW 02 · Informationen ordern? · www.biocom.de Effiziente Entfernung von Lösungsmitteln Genevac, ein Spezialist für Technologien zur Lösungsmittelentfernung, hat für seine Zentrifugal-Evaporatoren HT-4X, HT-8, HT-12 und HT-24 eine neue Option zur Effizienzsteigerung bei der Trocknung von Proben vorgestellt. Die „Auto-Defrost & Drain“-Einrichtung ermöglicht das automatische Ausleiten flüchtiger Lösungsmittel aus dem Kondenser zwischen den einzelnen Stufen einer Trocknungsmethode sowie eine vollständige Enteisung und Spülung des Systems am Ende des Prozesses. Dadurch werden die zuerst abdampfenden, flüchtigen Lösungsmittel im Kondenser gesammelt und können leicht entfernt werden. Um anschließend Lösungsmittel mit höherem Siedepunkt zu entfernen, können Genevac-Evaporatoren mit Auto Defrost & Drain-Funktion schnell den erforderlichen geringeren Druck erreichen. Dadurch wird das Problem der VakuumBeeinträchtigung durch Austritt siedender Lösungsmittel aus dem Kondenser vermieden. Bei Lösungsmittelgemischen mit hohem und niedrigem Siedepunkt (wie DMSO oder DMF mit Dichlormethan) kann die Entfernung des höher siedenden Lösungsmittels sogar verhindert werden. Durch die neue Funktion können Applikationen, die eine Kennziffer 31 LW 02 · www.biocom.de Mehrsprachige Finnpipette Entfernung von Lösungsmittelgemischen mit unterschiedlichem Siedepunkt, wie etwa bei der Lyophilisation oder Evaporation von HPLC-Fraktionen, automatisch durchgeführt Thermo Fisher Scientific hat die welterste elektronische Pipette mit sechssprachiger Benutzerführung vorgestellt. Per Tastendruck kann in der LCD-Anzeige der Finnpipette Novus-Reihe jetzt zwischen Englisch, Französisch, Deutsch, Italienisch, Spanisch und Schwedisch gewählt und so Fehlbedienungen vorgebeugt werden. Zudem bietet die Serie 10 verschiedene Pipettierfunktionen sowie neun Geschwindigkeiten, was eine rasches und effizientes Pipettieren erlaubt. Kennziffer 32 LW 02 · www.biocom.de Neuer Spezialkatalog werden. Dies steigert die Effektivität und Wirtschaftlichkeit des Evaporationsprozesses. Ein weiterer Vorteil der neuen Funktion ist, dass die Vorbereitung des Systems für den nächsten „Run“ ebenfalls automatisch geschieht. Informationen zu „Auto-Defrost und Drain“ gibt es bei Genevac über die eMail salesinfo@genevac.co.uk oder telefonisch unter +44-1473-240000. Kennziffer 30 LW 02 · Informationen ordern? · www.biocom.de Porvair Sciences hat einen 64-seitigen Katalog für Wissenschaftler, die mit Mikroplatten und Mikroplattentechnologie arbeiten, vorgestellt. Der Mikroplatten-Spezialkatalog ist in die Kapitel Festphasenextraktion, Um- Reinraumtechnik nach GMP-Norm Die Reinraum-Module der Spetec GmbH aus dem bayerischen Erding werden ab sofort nach den Vorgaben der GMP-Norm gefertigt, die unter anderem Eigenschaften festgelegt, um Geräte im medizinischen, pharmazeutischen und im Lebensmittelbereich einzusetzen. Mit Hilfe von Laminar Flow-Modulen ist es möglich, genau dort Reinraumbedingungen zu ermöglichen, wo diese gerade erforderlich sind. Die effektive Reinraumfläche kann je nach Größe des Moduls zwischen 0,24 QuadratLABORWELT metern (m 2) und 1,12 m 2 liegen. Für die Herstellung der Flow-Module FMS werden nur hochwertige Materialien gemäß den GMP-Richtlinien verwendet. Das Laminar Flow-Modul ist mit einem Reinluftfilter des Typs H14 ausgestattet. Mit der laminaren Luftströmung von 0,45 m/s wird ein Isolationsfaktor von 104 erreicht. Dies bedeutet, dass die Luftqualität unterhalb dem Laminar Flow-Modul gegenüber der Umgebung, um das 10.000fache verbessert wird. Es wird eine Reinklasse von 100 erreicht. Der Filter H14 ist in der Lage, 99,995% aller Partikel mit einer Größe von mehr als 0,12 µm zurückzuhalten. Für größere Partikel (> 0,3 µm) erhöht sich der Grad der Rückhaltung auf 99,9995%. Das Reinraum-Modul wird mit einem Edelstahlrahmen an der Decke befestigt und dient quasi als Reinluftdusche über dem jeweiligen Arbeitsplatz. Das Reinraum-Modul findet zum Beispiel Anwendung über Operationsplätzen im klinischen Bereich oder beim Ansetzen und bei der Abfüllung von Arzneimitteln in Apotheken. weltwissenschaften, Lagerung & Sammlung, Mikroplattengeräte und Automatisierung unterteilt. Diese enthalten neben einer Beschreibung der Anwendungsfelder eine Orientierungshilfe zur schnellen Auswahl der jeweils optimalen Mikroplattenprodukte. Ausführliche Beschreibungen werden durch technische Spezifikationen, Teilenummern und eine Internetadresse abgerundet, über die sowohl der Endpreis als auch die Verfügbarkeit abgerufen werden können. Ein kostenloses Exemplar des neuen Katalogs kann von Porvair Sciences angefordert werden. 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 | 47 P R O D U K T W E L T Kennziffer 33 LW 02 · Informationen ordern? · www.biocom.de Neue Nikon DS-Qi1Mc-Digitalkamera Der Optikspezialist Nikon aus Düsseldorf hat im März ein neues System für die Life Sciences vorgestellt. Die monochrome DSQi1Mc-Digitalkamera liefert hochauflösende, qualitativ hochwertige Fluoreszenzbilder lebender Zellen (Live Cell Imaging). Ein Peltier-gekühlter 1.3 Megapixel CCD-Chip ermöglicht dabei sehr rauscharme Aufnahmen in einer Auflösung von 1280x1024 Pixel. Durch den speziell für die Fluoreszenz entwickelten Analog-Digital-Konverter (ADC) werden dabei bis zu 32 Bilder pro Sekunde und damit ein echtes Live-Bild verwirklicht. Darüber hinaus werden durch verbesserte Dynamikwerte, ein verbessertes Rauschverhalten sowie eine hohe Empfindlichkeit der Kamera klare und kontrastrastreiche Aufnahmen möglich. Ausgestattet ist die neue Kamera DSQi1Mc zudem mit einem programmierbaren Verstärker (PGA) für schwache Signale oder alternativ für kürzere Belichtungszeiten. Der Verstärkungsgrad des CCD lässt sich dadurch unkompliziert stufenweise für kleinere Belichtungszeiten oder für höhere Bildraten optimieren. In Verbindung mit einer Nikon DS-U2Kontrolleinheit werden die Daten mittels einer USB 2.0-Schnittstelle in den Rechner übertragen. Optimal auf dieses System abgestimmt ist Nikons Bildanalyse-Software NIS-Elements, mit der die Bilder PC-gestützt komfortabel aufgenommen, analysiert und dokumentiert werden können. Die Nikon DS-Qi1Mc bietet damit eine breite Anwendbarkeit für Fluoreszenzanwendungen zu einem für Wissenschaftler attraktiven PreisLeistungsverhältnis. Kennziffer 34 LW 02 · Informationen ordern? · www.biocom.de Kennziffer 35 LW 02 · www.biocom.de Sterile und sichere Homogenisierung Die Schweizer Xiril AG (www.xiril.com) hat eine neue Technologie zur Probenhomogenisierung und -dispensierung vorgestellt. Dispomix® vereint Sterilität mit Sicherheit und einfacher Handhabung. Die stets geschlossene Dispomix®-Tube schützt die Probe vom Moment der Probennahme bis zur abschließenden Entnahme des Homogenats. Ein sauberer Flüssigkeitstransfer vor und nach der Prozessierung auf dem Dispomix®-Drive wird durch ein Septum im Tube gewährleistet. Hierdurch werden Kontaminationen, Aerosole oder der Kontakt mit potentiell infektiösem oder toxischem Material wirksam vermieden. Die Dispomix®-Tube dient sowohl der Probennahme, als auch dem Transport und der Homogenisierung und reduziert dadurch signifikant die Anzahl Prozessschritte und Kosten. Auch eine Vollautomatisierung ist möglich. Datenabhängige Scanoption für Massenspektrometer Eine neue Data-Depending-Scanning Option namens TurboDDSTM hat die Firma Varian für ihr 500-MS-Ionenfallenmassenspektrometer entwickelt. Lediglich wenige und einfache Kriterien müssen vorgegeben werden, um automatisierte komplexe Tandem-Massenspektrometrie- (MS/MS) oder MSn-Messungen durchzuführen. TurboDDSTM arbeitet mit einem patentierten Algorithmus zur automatischen Bestimmung der optimalen Dissoziationsparameter und liefert nach Herstellerangaben hochqualitative Daten fünf Mal schneller als übliche Geräte. Komplexe massenspektrometrische Sequenzen können in einer einzigen chromatographischen Trennung verwirklicht werden. Dadurch wird die Zeit für Strukturanalytik reduziert. Hochaufgelöste Spektren und ein Massenbereich von bis zu 3500 amu stellen noch mehr Informationen aus den zu untersuchenden Proben zur Verfügung. Die TurboDDSTM-Option erfüllt die Anforderungen im pharmazeutischen, biotechnologischen und akademischen Anwendungsbereich, ermöglicht qualitative Informationen LABORWELT über unbekannte Substanzen und bietet Unterstützung bei der Strukturaufklärung. Der Anwendungsbereich reicht von der Analyse und Identifikation von Arzneimit- Kennziffer 36 LW 02 · www.biocom.de Zellkultur-Profiling telmetaboliten in biologischen Proben bis hin zum Mapping und zur Sequenzierung von Peptiden und Proteinen. Die Ergebnisse werden mittels der Varian MS-Workstation-Software verarbeitet und können direkt in Standard-Datenbanken und Applikationssoftwareprodukte von Drittanbietern zur weiteren Analytik exportiert und eingebunden werden. Guava Technologies hat ein Produktbulletin veröffentlicht, in dem das Unternehmen seine CellHeath TM Profiling-Applikationen beschreibt (www.guavatechnologies. com/main/library/index.cfm). Beim Profiling der wichtigsten zellulären Indikatoren – etwa der apoptotischen Fraktion und des Apoptosestadiums, der Zellzählung und Viabilität, der Phasen des Zellzyklus, Transfektionseffizienz, oder Expression von Oberflächenantigenen – sollen es die Guava CellHeathTM Profiling Applikationen Labors ermöglichen, einheitliche Standards für die zelluläre Leistung festzulegen. Die Guava Systeme, die für das CellHeathTM Profiling eingesetzt werden, zeichnen sich aus durch ihre kompakte Größe, ihre einfache Menüführung und eine gute Performance aus. 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 | 49 Impressum E R V I C 16.-17.04.07: Workshop: Product Quality Review, Heidelberg Info: APV e.V. (Tel./Fax: +49-6131-9769-0/-69, E-Mail: apv@apv-mainz.de, Web: www.apv-mainz.de) LABORWELT (ISSN 1611-0854) erscheint zweimonatlich im Verlag der 16.-20.04.07: Mikro, Nano, Materialien – Highlights aus den Life Sciences, Hannover BIOCOM AG Stralsunder Str. 58-59 13355 Berlin Tel./Fax: 030/264921-0 / 030/264921-11 E-Mail: laborwelt@biocom.de Internet: www.biocom.de 18.-19.04.07: 12th Bi-Annual Biotech Patenting Conference, München Redaktion: Dipl.-Biol. Thomas Gabrielczyk Tel. 030/264921-50 Anzeigenleitung: Oliver Schnell Tel. 030/264921-45, E-Mail: o.schnell@biocom.de Leserservice: Angelika Werner Tel. 030/264921-40 Bildtechnik und Layout: Heiko Fritz Graphik-Design: Michaela Reblin Druck Mayer & Söhne, 86551 Aichach Mitglieder der DECHEMA-Fachsektion Biotechnologie, der Österreichischen Gesellschaft für Biotechnologie ÖGBT, der Gesellschaft für Genetik GfG, der Deutschen Gesellschaft für Proteomforschung DGPF, des Verbandes Deutscher Biologen vdbiol, der Deutschen Gesellschaft für Neurogenetik DGNG, der Deutschen Gesellschaft für Pharmakologie und Toxikologie DGPT, der Gesellschaft für Signaltransduktion STS, des Vereins zur Förderung der Nutrigenomforschung, der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie DGHM, des RiNA RNA-Netzwerkes sowie die Wissenschaftler des Nationalen Genomforschungsnetzes NGFN erhalten die Zeitschrift im Rahmen ihrer Mitgliedschaft. Für einen regelmäßigen Bezug von LABORWELT ist eine kostenlose Registrierung unter www.biocom.de oder per Fax (siehe Seite 53) erforderlich. Namentlich gekennzeichnete Beiträge stehen in der inhaltlichen Verantwortung der Autoren. Alle Beiträge sind urheberrechtlich geschützt. Ohne schriftliche Genehmigung der BIOCOM AG darf kein Teil in irgendeiner Form reproduziert oder mit elektronischen Systemen verarbeitet, vervielfältigt oder verbreitet werden. Die Druckauflage von 20.000 Exempl. ist IVW-geprüft, Stand 1. Quartal 2007: © BIOCOM AG, Berlin ® BIOCOM ist eine geschützte Marke der BIOCOM AG, Berlin BIOCOM® AG 50 | 8. Jahrgang | Nr. 2/2007 E Info: Katrin Manka, IVAM (Tel.: +49-231-9742-7081, E-Mail: km@ivam.de, Web: www.ivam.de) Info: Susan Jacques, C5 (Tel.: +44-207-878-6889, E-Mail: S.Jacques@c5-online.com, Web: www.C5-Online.com/biotech) 18.04.07: Forschungs- und Innovationsmanagement in der Weißen Biotechnologie, Dortmund Info: ChemBioTec (Tel.: +49-231-755-7392, E-Mail: info@chembiotec.de, Web: www.chembiotec.de) 19.04.07: Tissue Engineering Products – Neue gesetzliche Vorgaben an die Herstellung und deren praktische Umsetzung, Hamburg Info: TuTech Innovation GmbH (Tel.: +49-40-76629-6346, E-Mail: lifesciences@tutech.de, Web: www.tutech.de/qz) 22.-25.04.07: 7th Carbohydrate Bioengineering Meeting, Braunschweig Info: Heike Geiling, DECHEMA e.V. (Tel.: +49-69-7564-280, E-Mail: geiling@dechema.de, Web: www.dechema.de/CBM7) 26.-28.04.07: European Course for Life Sciences Executives, ECLE, Bad Schauenburg (CH) Info: Dr. Susanne Daniel, ECLE Executive Office, c/o ECPM (Tel.: +49-7621-163443, E-Mail: info@ecle.ch, Web: www.ecpm.ch/ecle) 02.-03.05.07: Developments in Gene Expression Profiling, London (UK) Info: Melanie Mulazzi, ACI Europe Ltd. (Tel.: +44-20-7368-1654, E-Mail: mmulazzi@acius.net, Web: www.acius.net) 03.-06.05.07: EMBO Conference on Chromatin and Epigenetics, Heidelberg Info: Antje Seeck, EMBL Heidelberg (E-Mail: seeck@embl.de, Web: http://www-db.embl.de/jss/EmblGroupsOrg/conf_55) 03.05.07: Klinische Studien in der Biotechnologie und Pharmazie, Düsseldorf Info: VDI Wissensforum IWB GmbH (Tel.:/Fax +49-211-6214-201/-154, E-Mail: wissensforum@vdi.de, Web: www.vdi-wissensforum.de) 03.-04.05.07: Biosimilar Medicines: Opportunities for Sustainable Healthcare, London (UK) Info: The European Generic Medicines Association (Web: www.gpaconferences.com) 06.-09.05.07: BIO 2007, Boston (USA) Info: (Web: www.bio2007.org) 7.5-10.5.07: MipTec 2007, Basel (CH) Info: Friederike Gutmann, AKM Congress Service, Basel (Tel./Fax: +41-61-686-77-11/-88, E-Mail: f.gutmann@akm.ch , Web: www.miptec.com 08.05.07: European Downstream Technology Forum 2007, Göttingen Info: Beate Sommerfeld, Sartorius College Göttingen (Tel.: +49-551-308-3318, E-Mail: beate.sommerfeld@sartorius.com, Web: www.sartorius.com/downstream) 14.-16.05.07: High Performance Proteomics, Dortmund Info: Nadine Palacios Bustamante, MPC (Tel.: +49-234-32-292-63, E-Mail: nadine.palaciosbustamante@rub.de, Web: www.zap-do.de) 16.05.07: ScieCon 2007, München Info: Lars Ullerich, btS (Tel.: +49-89-2180-5606, E-Mail: sciecon07@bts-ev.de, Web: www.sciecon.info) 21.-25.05.07: 6th Training Course on High-Troughput (HT) Drug Metabolism/Disposition, Amsterdam (NL) Info: EUFEPS, Stockholm (Tel.: +46-8-723-50-00, Fax: +46-8-411-32-17, E-Mail: secretariat@eufeps.org, Web: www.eufeps.org) 22.-25.05.07: Compound Management, Integrity & QC 2007, London (UK) Info: IQPC Pharma (Tel.: +44-207-3368-9300, E-Mail: enquire@iqpc.co.uk, Web: www.iqpc.co.uk/gb-2784/diary) 30.05.-1.06.07: European BioPerspectives 2007, Köln Info: Matthias Neumann, Dechema e.V. (Tel.: +49-69-7564-254, E-Mail: neumann@dechema.de, Web: www.bioperspectives.org) 30.05.-02.06.07: 91. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Pathologie e.V., Magdeburg Info: Dr. Heike Diekmann, Conress Communication Consulting (Tel./Fax: +49-221-801-449-0/-29, E-Mail: info@heikediekmann.de, Web: www99.mh-hannover.de/institute/pathologie/dgp/Z_Tagung_DGP.html) 04.-06.06.07: 10th Symposium on Computer Applications in Biotechnology, Cancun (MEXIKO) Info: Jaime A. Moreno, Universidad Nacional Autónoma de México (E-Mail: secretariat@cab2007.org, Web: www.cab2007.org) 04.-06.06.07: NanoTrends 2007, Köln Info: IIR GmbH (Tel.: +49-6196-585-133, E-Mail: registration@iir.de, Web: www.nanotrends.de) 11.-15.06.07: MiNaT-Kongreß 2007, Stuttgart Info: Klaus Zimmer, VDMA e.V., Fachverband Micro Technology (Tel.: +49-69-66-03-1315/-1861, E-Mail: Klaus.Zimmer@vdma.org, Web: www.minat-congress.de) 11.-14.06.07: bioLOGIC Europe 2007, Genf (CH) Info: Bianca Geldenhuys, Terrapinn Ltd. (Tel.: +44-207092-1224, Fax: +44-207-242-2320, E-Mail: bianca. geldenhuys@terrapinn.com, Web: http://www.terrapinn. com/2007/bioLOGIC) 13.-14.06.07: EuroPLX32 – Collaborative agreements in prescription drugs from clinical candidates to value added generics, Köln Info: Dr. Norbert Rau, RauCon (Tel.: +49-6222-9807-0, Fax: +49-6222-9807-77, E-Mail: nr@raucon.com, Web: www. europlx.com) 13.-15.06.07: NanoBio-Europe 2007, Münster Info: Holger Winter, CeNTech GmbH (Tel.: +49-251-5340-6200, Fax: +49-251-5340-6102, E-Mail: office@centech.de, Web: www.nanobio-europe.com) 16.-19.06.07: European Human Genetics Conference 2007, Nice (F) Info: Jerome del Picchia, ESHG 2007 Secretariat (Tel.: +43 1 405 13 83 22, Fax: +43 1 407 82 74, E-Mail: eshg2007@medacad.org , Web: http://www.eshg.org/ eshg2007) 18.-19.06.07: NAROSSA 2007, Poznan (PL) Info: Dr. Frank Pudel, ÖHMI Consulting GmbH (Tel.: +49-3918507-0, E-Mail: narossa@oehmi-consulting.de, Web: www. narossa.de) 23.-27.06.07: 9th Symposium on Bacterial Genetics and Ecology (BAGEC09), Wernigerode Info: Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft, Braunschweig (Tel.: +49-3641-35-33-225 , E-Mail: bageco9@conventus.de, Web: http://conventus.de/bageco9/) 01.-06.07.07: EMBO Workshop on Intracellular RNA Localization & Localized Translation, Il Ciocco (I) Info: Antje Seeck, EMBL Heidelberg (E-Mail: seeck@embl.de, Web: http://cwp.embo.org/w07-11) Kennziffer 27 LW 02 · www.biocom.de S LABORWELT 2007 European BioPerspectives 30 May – 1 June 2007 • Cologne • Germany Hosts: 30 May 2007 DISTINGUISHED SPEAKERS Per Berglund, Stockholm, Sweden • Ralph Bock, Golm, Germany • Al Cunningham, Bozeman, USA • Emmanuel Delamarche, Zurich, Switzerland • Jaime Finguerut, Piracicaba, Brazil • Levi Garraway, Boston, USA • J. Bruce German, Davis, USA • Robert Huber, Martinsried, Germany • Kai Johnsson, Lausanne, Switzerland • Juha Kere, Huddinge, Sweden • Hans Kast, Ludwigshafen, Germany • Sang Yup Lee, Daejon, Korea • Friedrich Lottspeich, Martinsried, Germany • Chris Lowe, Cambridge, UK • Bo Mattiasson, Lund, Sweden • Andres Metspalu, Tartu, Estonia • Alfred Oberholz, Düsseldorf, Germany • Andreas Offenhäuser, Jülich, Germany • Steve Oliver, Manchester, UK • Christian Patermann, Brussels, Belgium • Atanas Pavlov, Plovdiv, Bulgaria • Marie-Noëlle Pons, Nancy, France • Manfred Reetz, Mülheim, Germany • Bernd Riedl, Wuppertal, Germany • Steen Riisgaard, Bagsvaerd, Danmark • Dietmar Schomburg, Braunschweig, Germany • Kári Stefánsson, Reykjavik, Iceland • Janet Thornton, Hinxton, UK • Rob van Leen, Heerlen, The Netherlands • Marc van Montagu, Ghent, Belgium • Harald zur Hausen, Heidelberg, Germany En Route to the Knowledge-Based Bio-Economy A high-level conference of the German Presidency of the Council of the European Union presenting: – visions of industry, science and politics – plenary lectures, workshops and panel discussion – presentation of the Cologne Paper on strategic issues for research and industry 31 May – 1 June 2007 BioPerspectives The third conference of this format will again unite 18 major biosciences societies and biotech organisations in presenting: – an outstanding scientific lecture programme – an industry exhibition – and tech transfer partnering sessions Topics: www.bioperspectives.org Organiser: Sponsors: Co-Organisers: – – – – – – – Proteomics/Functional Genomics/Systems Biology Protein & RNA Engineering/Structural Biology/ Bioinformatics Molecular and Personalized Medicine, Nutrition Industrial Biotechnology Chemical Biology Plant Biotechnology/Renewable Resources Nanobiotechnology NEW ENGLAND BIOLABS in a word, fast. Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase from New England Biolabs EXTREME PRECISION WITH UNPARALLELED SPEED AND ROBUSTNESS With Phusion High-Fidelity DNA Polymerase, there is no need to compromise any aspect of your PCR performance. A superior choice for cloning, this recombinant polymerase has an error rate 50-fold lower than Taq DNA Polymerase, making it the most accurate thermostable polymerase available. Phusion DNA Polymerase is supplied in a variety of formats, or with a hot start modification for increased specificity. Advantages: � � � Kennziffer 28 LW 02 · www.biocom.de � � Extreme Fidelity – Highest of any thermostable polymerase High Speed – Extension times are dramatically reduced Robustness – Reduce reaction failures with minimal optimization High Yield – Increase product yields with minimal enzyme amounts Specificity – Hot start modification reduces non-specific amplification � Phusion High-Fidelity DNA Polymerase r F-530S/L � Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase r F-540S/L � Phusion High-Fidelity PCR Master Mix r with HF Buffer with GC Buffer F-531S/L F-532S/L Phusion High-Fidelity PCR Kit r F-553S/L � r = Recombinant I N T E R N E T- B E S T E L L U N G E N , N E U I G K E I T E N U N D T E C H N I S C H E I N F O R M AT I O N E N . Experience extreme speed and yield with Phusion High-Fidelity DNA Polymerase. A 3.8 kb fragment from human beta globin gene was amplified according to suppliers’ recommendations using varying extension times. Phusion DNA Polymerase was able to amplify the fragment with a combined annealing and extension step of only 1 minute. Also, a single unit of Phusion DNA Polymerase produced higher yields than 2.5 or 5 units of Pyrococcus furiosus DNA Polymerases. Phusion™ is a trademark of Finnzymes Oy www.neb-online.de Ihr zuverlässiger Partner für die Molekularbiologie: � New England Biolabs GmbH Frankfurt/Main Deutschland Tel. +49/(0)69/305-23140 Fax +49/(0)69/305-23149 email: info@de.neb.com � New England Biolabs Inc. Ipswich, MA USA 1-800-NEB-LABS email: info@neb.com internet: www.neb.com the leader in enzyme technology
