THE HISTORY OF CRYOGENIC STORAGE

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THE HISTORY OF
CRYOGENIC STORAGE
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ENTWICKLUNGEN BEI DER KRYOGENISCHEN LAGERUNG
Roel van den Bosch, Cryogenic Industry Consultant. Deutsche Bearbeitung Labtec Services AG
Geschichte
Die Kryotechnik hat sich im 19. Jahrhundert
als Ergebnis von wissenschaftlichen Versuchen zur Verflüssigung von permanenten
Gasen entwickelt. Unter den bekannten permanenten Gasen fanden Sauerstoff und
Stickstoff als Hauptbestandteile der Luft die
grösste Beachtung. Bei der Verflüssigung
von Gasen spielte der schottische Chemiker
James Dewar (1842–1923) eine wichtige
Rolle.
Er war es, der im Jahre 1892 die erste Isolierflasche für die Lagerung und den Transport von flüssigen Gasen entwickelte. Diese
Art von Vakuumflaschen wird heute noch
weithin verwendet,
und einzelne davon werden nach
dem Namen ihres
Erfinders
immer
noch Dewar genannt.
Dewar Gefässe der ersten Generation
Kryotechnik
Kryotechnik ist die Wissenschaft der Erzeugung und Untersuchung von Tieftemperaturbedingungen. Das Wort Kryotechnik kommt
vom griechischen Wort "kryos" (κρύος) für
Frost, Eis. In der Kryotechnik als wissenschaftliche Disziplin bezieht sich der Begriff
kryogenisch auf Temperaturen von rund 100°C bis hinunter zum absoluten Nullpunkt
(-273°C).
Kryokonservierung
Dies ist ein Verfahren, bei dem beispielsweise Zellen oder ganze Gewebe durch Abkühlung bis auf kryogenische Temperaturen wie
-196°C (den Siedepunkt von flüssigem Stickstoff) konserviert werden. Bei diesen Temperaturen endet jegliches biologisches Leben.
Wird aber das konservierte Material gegen
Eisbildung ausserhalb der Zellen, Dehydrierung oder Eisbildung im Inneren der Zellen
nicht ausreichend geschützt, dann wird es
häufig während des Gefrierprozesses
und/oder während des Schmelzens beschädigt, was sich auf die Lebensfähigkeit negativ
auswirken wird.
Kryoprotektoren, stufenweises Gefrieren und
kontrolliertes Schmelzen stellen Mittel und
Mechanismen zur Verminderung von Frostschäden dar.
Flüssiger Stickstoff (Liquid Nitrogen LN2)
Flüssiger Stickstoff ist eine relativ kostengünstige kryogenische Flüssigkeit und deshalb im Gebrauch für verschiedene kryogenische Verfahren weit verbreitet. Gasförmiger
Stickstoff (N2) bildet den Grossteil der Atmosphäre (78.03%). Unter atmosphärischem
Druck kondensiert (verflüssigt sich) gasförmiger Stickstoff (N2) bei einer Temperatur
von -196°C und gefriert bei -210°C. Flüssiger
Stickstoff ist inaktiv, farblos, nicht ätzend,
nicht brennbar und extrem kalt. Sehr kleine
Mengen von Flüssigkeit verdampfen zu grossen Gasmengen.
James Dewar 1842 – 1923
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Aus einem Liter LN2 entstehen 700 Liter
von N2-Gas.
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Flüssiglagerung
Seit James Dewar 1892 den Vakuum-Dewar
erfunden hat, wurde und wird weiterhin dieser Behälter für langfristige Lagerung in flüssigem Stickstoff verwendet.
Kryokonservierung in flüssigem Stickstoff bei
einer Temperatur von -196°C war während
Jahrzehnten die bevorzugte Methode für
kryogenische Lagerung. Obwohl das Eintauchen von Stoffen in flüssigen Stickstoff und
deren Entnahme daraus eine gefahrvolle
und unangenehme Tätigkeit darstellt, war
es für viele Jahre die einzige zur Verfügung
stehende Methode; Materialien bei einer
Temperatur unter dem Rekristallisationspunkt (RP) von Wasser zu lagern. Dieser
Punkt liegt bei rund minus 135°C.
Dazumal war bereits bekannt, dass Zellen
auch langfristig lebensfähig und unverändert
bleiben, wenn sie bei Temperaturen von 196°C gelagert werden, also sichere 60 Grad
vom Rekristallisationspunkt entfernt, also
oberhalb der Temperatur wo Eiskristalle irreparable Schäden am gelagerten Material
verursachen können. Zudem bot die Lagerung bei konstanten -196°C den bestmöglichen Temperaturgradient, bei dem durch
Temperaturschwankungen
verursachte
Schäden ausgeschlossen werden konnten.
Querkontaminierung und ansteckende
Krankheiten
Wie alle Flüssigkeiten ist auch flüssiger
Stickstoff ein möglicher Träger von Kontaminierungsstoffen. Während langfristiger Kryokonservierung sammeln sich Eisablagerungen in Lagerdewars an, und dieses Eis stellt
unter Umständen ein Risiko von mikrobischer
Kontaminierung der gelagerten Proben dar.
Eis sammelt sich in LN2 oberhalb eines offenen Dewar in der Atmosphäre an. Dieses Eis
fällt in den im Gefäss befindlichen flüssigen
Stickstoff oder es bildet sich Eis an den kalten Oberflächen des Dewar oder am Aufbewahrungsbehälter, der in das LN2 im Gefäss
eingebracht wird. Solch eine zunehmende
Menge von Eiskristallen schliesst anderes
Material wie Bakterien, Pilzsporen und allgemeine Schmutzpartikel im flüssigen Stickstoff ein.
Zusätzlich besteht auch das Risiko, dass
flüssiger Stickstoff selbst zum Überträger von
biologischer Kontamination unter den eingelagerten Proben wird. Man hat klare Beweise
für die Übertragung von Hepatitis B zwischen
gefrorenen Knochenmarkproben in einem
Lagertank mit flüssigem Stickstoff gefunden,
die zu einer klinischen Infektion bei Transplantationspatienten geführt haben (Teddar
et al., 1995; Fountain et al., 1997).
Zweifellos sind geeignete aseptische Verfahren und andere Laborregeln die Grundlage
für den Schutz der gelagerten Proben, aber
was häufig übersehen und unterschätzt wird,
ist das mögliche Einströmen von flüssigem
Stickstoff in die Probengefässe während des
Eintauchens. Unter einwandfreien Bedingungen mögen moderne Gefässe perfekt und
dicht zum Eintauchen geeignet sein, aber der
Hersteller der solchen Vials hat keine Kontrolle über die Handhabung des Gefässverschlusses. Dies ist auch der Grund dafür,
dass die Mehrheit der Hersteller von Probenlagergefässen heutzutage auffordern, ihre
Produkte nicht in flüssigen Stickstoff einzutauchen.
Lagerung in Flüssigem Stickstoff
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So gesehen besteht auch bei den modernsten Vials die Möglichkeit von Undichtigkeiten.
Abgesehen davon, dass kryogenische Temperaturen Kunststoffvials und dem Verschlussmaterial stark zusetzen, kommt die
grösste Gefahr vom Druckgefälle, das bei der
Abkühlung der Gefässe um 200 Grad Celsius
entsteht. Eine vorhandene Gasmenge wird
durch ihren Druck, ihr Volumen und ihre
Temperatur bestimmt, entsprechend der
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Gleichung: pV = nRT. Wenn die Temperatur
beim Eintauchen in flüssigen Stickstoff zurück geht, reduziert sich der Druck in den
Lagergefässen ebenfalls, wobei ein erheblicher Druckunterschied entsteht, wodurch
flüssiger Stickstoff in das Innere der Vials
gepresst werden kann. Dies vor allem wenn
der Verschluss nicht ordnungsgemäss zugeschraubt ist, eine deformierte Dichtung aufweist oder zu fest zugeschraubt wird. Abgesehen vom Querkontaminierungsrisiko kann
das Eindringen von flüssigem Stickstoff dann
eine Explosion verursachen, wenn die Gefässe ins Labor gebracht werden und der
eingeschlossene Stickstoff in dieser Umgebung schnell zum Sieden kommt.
(Zur Erinnerung: bei der Umwandlung von
LN2 in N2 tritt eine Ausdehnung auf das 700fache ein.)
die für die gewöhnliche Lagerung in Flüssigkeit verwendet werden. Im Falle der Dampflagerung wird der Pegel von LN2 im Behälter
auf einen Drittel reduziert und die Gestelle
mit den Proben werden entweder von der
Flüssigkeit durch den Einsatz einer Plattform
getrennt oder die untersten Positionen der
Gestelle (die in der Flüssigkeit befindlichen
Plätze) werden nicht für die Lagerung der
Proben verwendet.
Bei Lagerung in Dampf kommen die Proben
nicht mit LN2 in Berührung, aber neben diesem grossen Vorteil gibt es auch bedeutende
Nachteile wie:
1. Verlust von Lagerkapazität, indem der
Teil, wo sich das LN2 befindet, nicht genutzt
werden kann.
2. Die Dampftemperatur hängt zu stark vom
LN2-Pegel ab.
3. Die Möglichkeit grosser vertikaler Temperaturgradienten ist vorhanden.
Wird biologisches Material nicht bei Temperaturen unter dem Rekristallisationspunkt
von wässrigen Lösungen (ca. -130 bis 140°C; Mazur, 1970) gelagert, verschlechtert
sich während langfristiger Lagerung die Lebensfähigkeit.
Probengefässe und Boxen aus Polycarbonat für die Lagerung bei -196°C
Als in den 1980er Jahren erstmals HIV/AIDS
bekannt wurde, bereitete das Risiko der
Querkontamination bei der Lagerung von
Proben in flüssigem Stickstoff zunehmend
Sorge. Später wurden die Befürchtungen
bestätigt (Bielanski et al., 2000), dass im
Falle der Kontaminierung von flüssigem
Stickstoff mit einem Virus, Embryos die in
unversiegelten Behältern in diesem Stickstoff
lagern, durch diese Viren verseucht werden
können.
Wir können abschliessend feststellen, dass
HIV/AIDS sowie andere ansteckende Krankheiten den Wechsel von der traditionellen
Lagerung in flüssigem Stickstoff zu einer
solchen in Stickstoffdampf geführt haben.
Dampf-Phasen-Lagerung
Die Lagerung von Proben im Dampf von
flüssigem Stickstoff schaltet das mögliche
Risiko von Querkontaminierung durch flüssigen Stickstoff aus. Diese Art der Lagerung
wird meistens in denselben Kühlbehältern
(Typ Dewar oder Selbstfüller) vorgenommen,
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Dampfphasenlagerung in Standard Behälter
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Dies mag für Materialien angehen, die in
grosser Zahl eingefroren werden und bei
denen ein gewisser Verlust der Lebensfähigkeit keine praktischen Probleme aufwirft,
wohl kann es aber für anderes wertvolles
Probematerial solche Probleme verursachen.
Man schrieb das Jahr 2000, als ein amerikanischer Hersteller von Tiefkühlgeräten für
kryogenische Lagerung (Custom Biogenic
Systems) das erste System für -190°C Trockenlagerung als praktisch erste grössere
Neuheit für kryogenische Lagerung seit den
Tagen von James Dewar entwickelte.
Das übliche Ziel ist es, Proben bei einer
Temperatur gut unter dem Rekristallisationspunkt aufzubewahren, und je grösser der
Puffer zwischen diesem Punkt und der herrschenden Lagertemperatur ist, desto sicherer
ist die Lagerung. Leider weisen viele herkömmliche Lagersysteme grosse vertikale
Temperaturgradienten auf, wobei es leicht
möglich ist, dass Proben Temperaturen über
dem Rekristallisationspunkt ausgesetzt sind.
Ferner sind bestimmte Materialien selbst für
Temperaturwechsel im Bereich zwischen 130 und -190°C anfällig. Hybridome (Zellkulturen von Hybridzellen), als Beispiel, sind
bekannt, für die Empfindlichkeit bei dauernden Temperaturwechsel.
Eine gleichbleibende Lagertemperatur mit
dem grösstmöglichen Puffer zum Rekristallisationspunkt und dem bestmöglichen
Gradient stellt die Ideallösung dar. Herkömmliche
Dampf-Phasen-Tiefkühlgeräte
können diese Idealbedingungen nicht erfüllen. Einige Produkte wurden mit Hitzeweichen nachgerüstet, um die Verdampfung von
LN2 zwecks Herabsetzung der Dampftemperatur zu erhöhen, aber abgesehen davon,
dass solche Vorrichtungen den Verbrauch
von LN2 steigern und die Eisbildung rund um
den Deckel erhöhen können, erreichen sie
immer noch nicht die Stabilität und die Temperatur, die eine einwandfreie Langzeitlagerung bieten sollte.
Neueste Entwicklungen
-190°C Trockenlagerung
Eigentlich beruhen alle früheren Methoden
der kryogenischen Lagerung auf der Erfindung von James Dewar, also auf einer Art
von Lagerung, die während über 100 Jahre
gebräuchlich war. In der Zwischenzeit hat
sich viel entwickelt, z.B. auf dem Gebiet der
Zellkulturen. Man stelle sich nur all die neuen
Medien und neuen Techniken in der Probenvorbereitung vor, doch letzten Endes landet
das meiste Probenmaterial immer noch in
einem Dewar mit flüssigem Stickstoff. Mit
grossem Aufwand hat man die Lebensfähigkeit der gelagerten Materialien gesteigert,
aber nur wenig wurde geändert, sobald es
um die kryogenische Lagerung geht.
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Trockenlagersystem mit LN2 im Mantel
Dieses neue Lagerungssystem verwendet
das gleiche Vakuumgefäss wie konventionelle Tiefkühlgeräte, aber anstatt den Fundus
von flüssigem Stickstoff im Tank zu haben,
befindet sich das LN2 in den Wänden dieses
Tiefkühlgerätes. Abgesehen von der hierdurch erzielten Verminderung des Risikos
einer Querkontaminierung durch LN2 (es
befindet sich eben kein LN2 im Tank), konnte
man im Lagerungsbereich eine Luftzirkulation einrichten, mit der
durch die Kombination
der Konvektion von
Boden und Wänden
von oben bis unten
eine sehr stabile Temperatur von rund 190°C erzielt wird. Dies
zusammen mit der
Tatsache, dass das
gesamte Innere des Tiefkühlgerätes für die
Lagerung zur Verfügung steht, macht diese
Methode künftig zum bevorzugten kryogenischen Lagerungsverfahren.
Es gibt natürlich auch mechanische Tiefkühlgeräte, die in der Lage sind, kryogenische
Temperaturen zu erreichen. Hersteller wie
Thermo und Sanyo beliefern den Markt mit
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solchen Geräten, in denen ebenfalls keine
Berührung mit der Flüssigkeit eintreten kann.
Diese Geräte gehören deshalb auch zur
Trockenlagerungskategorie. Der einzige
Unterschied zwischen diesen mechanischen
Trockenlagerungssystemen und den nichtmechanischen Geräten besteht darin, dass
die tiefste Lagertemperatur bei ersteren 152°C beträgt verglichen mit -192°C bei den
anderen.
weder Situation verhüten, die Funktionen
oder Unversehrtheit von Geweben und Zellen nachteilig beeinflussen könnte.
Sind bei Ihnen Gewebe und Zellen noch in
einer Dampftemperatur gelagert, die eventuell zu warm ist oder einen zu grossen Gradienten hat, empfehlen wir ihnen eine entsprechende Risikoanalyse zu erstellen.
Zweifelsohne haben die Trockenlagerungssysteme mit einem Temperaturbereich von
ca. -190°C eine grosse Zukunft. Sie bieten
die Vorteile von LN2 (stabile Temperatur
etwa 60°C entfernt vom Rekristallisationspunkt) ohne dessen Nachteile (Querkontaminierung durch LN2 und risikobelastete Handhabung durch den Anwender).
Europäische Richtlinien
Alle europäischen Regierungen haben sich
ernsthaft mit den Risiken von Querkontaminierung wie auch von Verminderung der
Lebensfähigkeit durch grosse vertikale Temperaturgradienten während der Kryolagerung
befasst. Besonders im Hinblick auf menschliche Gewebe und Zellen, hat die Europäische
Gemeinschaft die Richtlinie 2004/23/EG des
Europäischen Parlaments und des Rates
vom 31. März 2004 zur Festlegung von Qualitäts- und Sicherheitsstandards für die
Spende, Beschaffung, Testung, Verarbeitung, Konservierung, Lagerung und Verteilung von menschlichen Geweben und Zellen
erlassen. Die Frist zur Verwirklichung ist
im April 2006 abgelaufen.
Artikel 20.3 dieser Richtlinien bezieht sich
darauf, dass Einrichtungen in ihren Standardbetriebsverfahren besondere Vorschriften aufnehmen sollen, um die Kontaminierung anderer Gewebe und Zellen zu verhindern.
Sind menschliches Gewebe oder Zellen bei
Ihnen heute noch in flüssigem Stickstoff gelagert respektive getaucht, dann wäre es
wahrscheinlich an der Zeit, die Lagerungsstrategie neu zu überdenken.
Artikel 21.3 dieser Richtlinien bezieht sich
darauf, dass Einrichtungen Verfahren ausgestalten und anwenden, die den Eintritt jed-
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Schlussfolgerungen
Während 100 Jahren war Kryolagerung
gleichbedeutend mit Lagerung in flüssigem
Stickstoff. Die zunehmende Zahl von ansteckenden Krankheiten hat zu einem Wechsel
von der Lagerung in Flüssigkeit zur Lagerung
in Dampf geführt. Während die Entwicklung
der Techniken, Media und Kryoprotektoren
zur Verbesserung der Lebensfähigkeit beigetragen haben, hat umgekehrt der Übergang
zur Dampflagerung mit grossen vertikalen
Temperaturunterschieden eine Verminderung der Lebensfähigkeit der gelagerten
Proben verursacht.
Sowohl als Folge des oben erwähnten als
auch einer Risikoanalyse auf Grund der neuen europäischen Richtlinien findet heute ein
Wechsel
zu
den
neuen
-190°CLagersystemen statt, kryogenischen Tiefkühlgeräten, die speziell dafür konstruiert
wurden, ohne Stickstoff im Lagerraum zu
arbeiten.
Zusammenfassung
Die Entwicklungen bei der Kryolagerung
laufen von Flüssiglagerung zur Dampflagerung
und
heute
zu
-190°CTrockenlagerung.
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