Mass Spectrometer (MS)

(484.1.4024 :‫המעבדה לקביעה כמותית של תרופות (מספר קורס‬
Quantitative analysis of drugs- student's laboratory
‫גז כרומטוגרף – ספקטרומטרייאת מסות‬
Gas Chromatography - Mass Spectrometry (GC-MS)
‫ ניתן לראות באתר האינטרנט‬Power Point -‫מצגת ב‬
(www.bgu.ac.il/HL) .High Learn ‫בתוכנית‬
.)‫ (משרד‬08-647-9354 '‫להתקשר לשמעון טל‬
e-mail: sbs@bgu.ac.il ‫או‬
: ‫ בעיות‬-
‫‪Gas Chromatography‬‬
‫• ‪ ,GC-MS‬הנה הטכניקה האנליטית האולטימטיבית לגילוי‪,‬‬
‫זיהוי וכימות של חומרים נדיפים או הניתנים לנידוף‪.‬‬
‫• ‪ GC-MS‬משמש במגוון רחב ביותר של תעשיות כימיות‪,‬‬
‫פטרוכימיות‪ ,‬מזון‪ ,‬בדיקות סביבתיות‪ ,‬אנליזה פורנסית‪,‬‬
‫אנליזה של תרופות‪ ,‬בדיקות רפואיות‪ ,‬בקרת תהליכים‬
‫כימיים ומחקר‪.‬‬
‫• בדיקת ‪ GC-MS‬מהווה הוכחה קבילה משפטית‪.‬‬
‫‪Gas Chromatography‬‬
‫• משמש להפרדת חומרים מתערובת‪.‬‬
‫• התערובת מוזרקת עוברת נידוף וכל חומר יוצא ומובל‬
‫בקולונה ע"י גז‪.‬‬
‫פאזה נחה = קולונה המכילה שיכבה מיקרוסקופית של נוזל או פולימר‬
‫פאזה נעה = גז אינרטי דוגמת הליום ‪ ,‬חנקן או מימן‬
‫• החומרים מופרדים ע"פ תגובה עם הקולונה בזמנים‬
‫שונים‪ .‬נתונים נוספים המשפיעים על ההפרדה‪ :‬קצב זרימת הגז והטמפרטורה‪.‬‬
‫• זמן השהייה בקולונה תלוי בפולריות של החומר בהשוואה‬
‫לזו של הקולונה‪ .‬ספיחה של החומר לקירות הקולונה או לחלקיקים‬
‫המשמשים מארז בקולונה‪.‬‬
‫פקטורים המשפיעים על הפרדת החומרים ב‪GC -‬‬
‫• נדיפות החומר‪ :‬חומרים בעלי נקודת רתיחה (נידוף) נמוכה יעברו מהר יותר דרך קולונת‬
‫ה‪ GC -‬מאשר חומרים בעלי נקודת רתיחה גבוהה‪.‬‬
‫• פולאריות החומרים‪ :‬חומרים פולאריים ינועו יותר באיטיות‪ ,‬במיוחד אם קולונת ה‪GC -‬‬
‫אף היא פולארית‪.‬‬
‫• טמפרטורת הקולונה‪ :‬הגדלת טמפרטורת הקולונה מאיצה את יציאת החומרים בתערובת‪.‬‬
‫• פולאריות החומר הארוז בקולונה‪ :‬בדרך כלל כל החומרים ינועו באיטיות על קולונה‬
‫פולארית‪,‬עם זאת חומרים פולאריים ינועו אף יותר לאט מהאחרים‪.‬‬
‫• קצב זרימת הגז דרך הקולונה‪ :‬הגברת מהירות הזרימה של הגז המוביל מגבירה‬
‫את מהירות תנועת החומרים העוברת דרך הקולונה‪.‬‬
‫• אורך הקולונה‪ :‬ככל שהקולונה ארוכה יותר כך יעוכבו החומרים המצויים בה וזמן רב יותר‬
‫יידרש לשם מעבר דרך הקולונה‪ .‬קולונות ארוכות הינן טובות יותר להפרדה יעילה‪.‬‬
‫באופן כללי הפקטור העיקרי הנלקח בחשבון בהפרדת חומרים ב‪ GC -‬הוא נקודת הרתיחה‬
‫של החומרים השונים‪ .‬הפקטור השני הנלקח בחשבון הוא פולאריות החומרים השונים‪.‬‬
Diagram of a gas chromatograph
Flame Ionization (FID)
Thermal Conductivity Detector (TCD)
Mass Spectrometry (MS)
‫השפעת העלאת הטמפרטורה בקולונה על הפרדת חומרים‬
‫)‪Mass Spectrometer (MS‬‬
‫• ספקטרומטריית מסות הינה שיטה המשמשת לאנליזה כימית‪ ,‬חקר‬
‫תגובות בפאזה גזית‪ ,‬קביעת מסות אטומיות וכן לקביעת שכיחויות‬
‫של איזוטופים‪.‬‬
‫• במכשיר זה מולקולות החומר הנבדק עוברות יינון וחלקן מתפרק‬
‫לשברים (פרגמנטים)‪ ,‬הן טעונים והן לא טעונים‪ .‬היונים מאופיינים‬
‫ע"י יחס מסה‪-‬למטען )‪ (m/z‬ויציבות יחסית‪.‬‬
‫• ההתפרקות מתרחשת תוך שבירת קשרים כימיים ולעיתים תוך‬
‫יצירת קשרים כימיים חדשים‪.‬‬
‫השיטה הנפוצה ביותר ליינון מולקולות החומר (‪ )M‬היא פגיעה בעזרת‬
‫אלומת אלקטרונים בעלי אנרגיה של כ‪:7000 kJ/mol -‬‬
‫‪M+. + 2e‬‬‫כאשר ‪ M+‬הוא היון המולקולרי‪.‬‬
‫‪M + e-‬‬
‫)‪Mass Spectrometer (MS‬‬
‫• מס‪-‬ספקטרומטריה הינה חקר השפעת אנרגית היוניזציה על‬
‫המולקולה‪.‬‬
‫• היונים החיוביים המתקבלים מואצים לאזור בו נוכח שדה מגנטי או‬
‫שדה חשמלי‪.‬‬
‫• ליונים בעלי יחס מסה למטען )‪ (m/z‬שונה מסלולים שונים בשדות‬
‫הללו ולכן ניתן להפרידם ולקבוע את יחס ה‪ (m/z)-‬עבור כל אחד‬
‫ואחד מהם וכן לקבוע את מספריהם (שכיחויותיהם) היחסיים‪.‬‬
‫‪The Mass Spectrum of Methane‬‬
‫דוגמא‪:‬ספקטרום המסות של מתאן‬
‫‪100 Base peak‬‬
‫‪M+ = 16‬‬
‫‪Molecular ion‬‬
‫‪[C12H4]+.‬‬
‫ הפיק הגבוהה ביותר בספקטרום מכונה‬‫‪ base peak‬וכל שאר הפיקים מצוינים‬
‫יחסית אליו‪.‬‬
‫ הפיקים מצוינים כקווים אנכיים‪.‬‬‫ תהליך יצירת הפרגמנטים נוצר ע"פ‬‫חוקיות כימית פשוטה הניתנת לחיזוי‪.‬‬
‫ היונים הנוצרים ישקפו את הקטיונים‬‫או הרדיקלים הקטיונים היציבים ביותר‪.‬‬
‫ הפיק בעל המשקל המולקולארי הגבוהה ביותר‬‫בדרך כלל מיצג את "מולקולת האם"‬
‫)‪,(parent molecule‬פחות אלקטרון‪M +1 = 17 ,‬‬
‫והוא מכונה היון המולקולארי‬
‫‪[C13H4]+.‬‬
‫)‪.molecular ion (M+‬‬
‫‪m/z‬‬
‫‪C‬‬
‫‪86‬‬
‫‪H‬‬
‫‪M+‬‬
‫‪= 15‬‬
‫‪C12H3+‬‬
‫‪[C12H2]+.‬‬
‫‪C12H+‬‬
‫‪16‬‬
‫‪8‬‬
‫‪1.11‬‬
‫‪H‬‬
‫‪3‬‬
‫‪12 13 14 15 16 17‬‬
‫‪H‬‬
‫‪Relative ion intensity‬‬
‫ספקטרום מסות הוא דיאגרמה (תרשים)‬
‫אשר על ציר ה‪ X-‬שלה נמצא היחס‬
‫)‪ (m/z‬של כל יון ויון ואילו השכיחויות‬
‫היחסיות של היונים נמצאות‬
‫על ציר ה‪ Y-‬של הדיאגרמה‪.‬‬
‫‪H‬‬
‫‪[C12]+.‬‬
‫)‪Mass Spectrometer (MS‬‬
‫למרות תהליך יצירת היונים בדוגמא ואיבוד חלק גדול מהחומר‪,‬‬
‫עדיין טכניקת ה‪ MS-‬נחשבת רגישה מאוד ורק כמויות זעומות של‬
‫חומר משמשות לבסוף לאנליזה‪.‬‬
‫• במקרה של דוגמא מוצקה החומר מונח על חוד של פין מתכת בתוך‬
‫אזור תחת וואקום גבוהה‪ .‬במקרה זה הדוגמא עוברת נידוף או‬
‫המראה למצב הגזי‪ ,‬בדרך כלל בעזרת חימום‪.‬‬
‫• גזים ונוזלים מוחדרים דרך צינורית מעבר )‪ (inlet‬עם בקרת זרימה‬
‫והמולקולה במצב הגזי עוברת יינון על ידי מקור יוניזציה (בהתאם‬
‫למכשיר) ולאחר מכן ממשיכה לקראת אפיון באנליזאר (בהתאם‬
‫למכשיר) ‪.‬‬
Mass Spectrometer (MS)
:‫ספקטרומטר כולל שלושה חלקים‬-‫כל מס‬
1) Ionizer
2) Ion (or mass) Analyzer
3) Detector
Mass Spectrometer (MS)
– Ionization techniques
1. Electron Impact (EI)
2. Chemical Ionization (CI)
3. Atmospheric Pressure Chemical
Ionization (APCI)
4. Electrospray Ionization (ESI)
5. Fast Atom Bombardment (FAB)
6. Matrix Assisted Laser Desorption
Ionization (MALDI)
‫‪MS- Ionization techniques‬‬
‫ייצור יונים מולקולריים ע"י יינון אלקטרוני )‪1) Electron Impact (EI‬‬
‫• כמות האנרגיה המושקעת זהה לאנרגית היוניזציה‪ ,‬המסופקת ע"י יינון אלקטרוני ומובילה‬
‫ליצירת הצורה הרדיקלית (מתקבל הצורון ‪. (M +.‬‬
‫• האלקטרונים נוצרים ע"י חוט להט של טונגסטאן ומואצים בשדה אלקטרוני של ‪70 eV‬‬
‫דרך תא יוניזציה מהפילמנט ללוכד‪ ,‬תחת שליטה של שדה מגנטי‪ .‬האלקטרונים מגיבים‬
‫עםמולקולות החומר המנודף‪.‬‬
‫• האינטריאקציה בין האלקטרונים לחומר גורמת לסילוק אלקטרון (לעיתים שניים)‬
‫מהרמה הערכית )‪( .(valence orbitals‬לעיתים נדירות נילכד אלקטרון במולקולה)‪.‬‬
‫•‪M + e- → M-‬‬
‫‪M + e- → M+• + 2e-‬‬
‫‪electron capture‬‬
‫‪Electron pair formation‬‬
‫‪1000 times less likely‬‬
‫‪Energy transfered to‬‬
‫‪ion radical‬‬
EI
‫יינון אלקטרוני אידיאלי‬
‫•‬
‫•‬
‫אנרגית היוניזציה הנדרשת למרבית המולקולות היא‪.8 - 12 eV :‬‬
‫עודף אנרגיה עשוי להוביל לפירוק קשרים במולקולה המיוננת‪.‬‬
‫אספקת אנרגיית היינון ב‪ EI -‬היא ‪.70 eV‬‬
‫ניצולת היונים תלוייה באנרגיה המושקעת‪.‬‬
‫בהשקעה של ‪ 70 eV‬באזור המישורי הרבה יותר קל ליצר ספטרא של יונים‬
‫יציבים באופן רציף‪.‬‬
‫‪MS- Ionization techniques‬‬
‫ייצור יונים מולקולריים ע"י יינון כימי )‪2) Chemical Ionization (CI‬‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫במקום שהינון יווצר ע"י שדה חשמלי חזק העשוי לפרק את המולקולה לפרגמנטים‬
‫שונים‪ ,‬משלבים את הדוגמא עם יונים של גז )‪ (electron-poor species‬הנוצרים‬
‫לאחר הפגזה עם אלקטרונים‪.‬‬
‫היון של הגז תורם יון מימן לדוגמא וזאת ע"מ לייצב עצמו‪.‬‬
‫הדוגמא המיוננת (בתוספת יון מימן – ‪ )H+‬עוברת לזיהוי דרך הספקטרומטר‪.‬‬
‫התנאים הדרושים‪:‬‬
‫עודף גדול )‪ (104:1‬של הגז )‪ (R‬ביחס לדוגמא )‪( .(M‬דוגמא לגז‪.)R = methane(CH4) :‬‬‫‪-‬שימוש באנרגיה אלקטרונית גבוהה )‪(500 eV‬ובתנאי לחץ בתחום ‪.10-150 Pascal‬‬
‫‪.‬‬
‫•‬
‫היון הראשוני שנוצר בגז הצפוף הוא‪R+ :‬‬
‫•‬
‫יונים ראשוניים מגיבים בתהליך התנגשות עם מולקולות גז נוספות ליצירת קטיונים‬
‫‪.‬‬
‫‪R+ + R‬‬
‫‪RH+ + (R - H).‬‬
‫שניוניים ע"י העברת מימן‪.‬‬
‫‪R + e-‬‬
‫• יון מתאן )‪ ,(CH5+‬בעל מימן נוסף‪ ,‬משמש כחומצת לואיס‪ ,‬ומגיב באופן חזק עם‬
‫מולקולות אורגניות בסביבתו וזאת בלחץ של ‪ 20 pascal‬בלבד‪.‬‬
‫ריאקציות אפשריות של גז עם דוגמא בשיטת ה‪CI -‬‬
‫‪MS- Ionization techniques‬‬
‫)‪3) Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI‬‬
‫•‬
‫בשיטת ה‪ APCI -‬זרם של דוגמא נוזלית עובר בצורת תרסיס בעזרת לחץ אויר‬
‫(זרם חנקן בעל עוצמה) ממכשיר ה‪ HPLC -‬לגלאי ה‪.MS -‬‬
‫• תרסיס‪ ,‬טיפות נוזל‪ ,‬עובר בלחץ אטמוספרי דרך צינורית קוורץ מחוממת )‪.(5000C‬‬
‫• הטיפות מכוונות לאלקטרודת פריקה )‪.(1-3.5 kV‬‬
‫• האלקטרודה ממוקמת בסמוך לחריץ קטן המוביל לאזור וואקום גבוהה הכולל אנליזר‪.‬‬
‫• יונים הנוצרים בטיפות הנוזל מגיבים עם החומר הנבדק‪.‬‬
‫• מולקולות שעברו פרוטונציה או דה‪-‬פרוטונציה נוצרים בדומה ל‪CI -‬‬
‫)‪ [M+H]+ (posetive‬או )‪[M-H]- (negetive‬‬
‫‪MS- Ionization techniques‬‬
‫)‪4) Electrospray Ionization (ESI‬‬
‫ זרם נוזלי של הדוגמא נכנס כתרסיס‬‫דרך צינור נימי קטן (פלדת אל‪-‬חלד)‬
‫המצוי במתח קבוע של ‪.4 kV‬‬
‫ נוצרות טיפות נוזל טעונות‪.‬‬‫ היונים נוצרים ע"י מנגנון נידוף כך‬‫שהחלקיקים המיוננים עוברים‬
‫הלאה לתוך המס‪-‬ספקטרא לזיהוי‪.‬‬
‫היתרון של השיטות ‪ APCI‬ו‪ESI -‬‬
‫הינה בכך שהם אפשרו קבלת‬
‫מס‪-‬ספקטרא לחומרים פולאריים‬
‫שאינם נדיפים‪.‬‬
‫בשיטת ה‪ ESI -‬ניתן לבצע אנליזה גם למקרו‪-‬מולקולות (חלבונים‪ ,‬פולימרים‪ ,‬אוליגונוקלאוטידים וכו')‬
‫מאחר וישנה אפשרות לטעינה מרובה‪.‬‬
‫טכניקת הפרדת יונים‬
‫•‬
‫כיצד נוכל להבחין בין יחסים שונים של מסה‪-‬למטען )‪(m/z‬בצורה ניסיונית?‬
‫•‬
‫מאבחן‪-‬יונים )‪ (mass-analyzer‬הינו רכיב במס‪-‬ספקטרומטר המאפשר לבצע‬
‫סלקציה לפי ערכי ‪ m/z‬מסוימים‪.‬‬
‫לאחר יצירת היונים במקור היינון‪ ,‬הם מואצים לתוך המס‪-‬אנלייזר ע"י שדה‬
‫אלקטרוני‪.‬‬
‫•‬
‫בחירת מאבחן‪-‬היונים תלוי ב‪:‬‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫הרזולוציה הנדרשת‬
‫טווח המסות‬
‫קצב סריקה‬
‫מגבלות החשיפה‬
‫היישום נקבע ע"פ אופי הכימיקל או החומר הביו‪-‬כימי‪.‬‬
‫לכל סוג אנלייזר ישנו מאפיין הפעלה שונה‪ ,‬בחירת האנלייזר המתאים לעיתים‬
‫מצריכה למידה של החומר‬
‫)‪Mass Spectrometer (MS‬‬
‫‪Types of mass/charge analyzers‬‬
‫אנלייזר רציף‬
‫דומה לפילטר או מונוכרומטור המשמש לספקטרוסקופיה אופטית‪.‬‬
‫אנלייזר רציף מעביר ‪m/z‬בודד לגלאי והמס‪-‬ספקטרא מתקבלת‬
‫ע"י סריקת האנלייזר דרך ערכי ‪ m/z‬שונים‪.‬‬
‫כאשר נבחר ‪ m/z‬בודד‪ ,‬כל שאר היונים בערכי ‪ m/z‬שונים נעלמים‪,‬‬
‫מה שמוריד את ערך ה‪(S/N -‬יחס סיגנל לרעש) ומאפשר המשכיות‬
‫אנליזה ברגישות גבוהה‪.‬‬
‫סוגים‪:‬‬
‫‪Sector‬‬
‫‪quadrupole‬‬
‫אנלייזר פעימות‬
‫אוסף מס‪-‬ספקטרום מלא המתקבל מפעימה בודדת של יונים‪ ,‬בעת ובעונה אחת‪.‬‬
‫מה שמביא לידי עלייה גדולה בערך ‪.S/N‬‬
‫סוגים‪:‬‬
‫)‪Time of flight (TOF‬‬
‫‪Ion cyclotron resonance‬‬
‫‪quadrupole ion trap.‬‬
‫)‪Mass Spectrometer (MS‬‬
‫‪Magnetic sectors analyzer‬‬
‫•‬
‫•‬
‫העיקרון הוא מעבר היונים דרך עקומת מגנט המפריד יונים ע"פ התנע והמטען‪.‬‬
‫מכשירי ה‪ magnetic sector -‬הינם בעלי רזולוציה גבוהה ובעלי טווח מסות‬
‫גבוהה יותר מאנליזרים אחרים דוגמת ‪ ,quadrupole‬עם זאת הם דורשים‬
‫משאבות וואקום חזקות ולעיתים קצב הסריקה הוא איטי יותר‪.‬‬
‫טווח המסות המקובל‬
‫ב‪ magnetic sector -‬הוא‬
‫‪ , 5000 m/z‬אך יכול להיות‬
‫מורחב עד ל‪.30,000 m/z -‬‬
Ion selection
The Mass Spectrometer
Magnetic field
B
Focusing
slits
Accelerating
voltage
m/z = B2r2e/2V
Where m = mass,
e = electron charge,
z = # of charges/ion
r = radius of curvature
V (1-10keV)
Increase B
Focused ion M+
Ion M+
Ionizing
voltage
Radius r
Sample
inlet
Low
vacuum
Detector
‫‪Electric sectors / double focusing Mass Specs‬‬
‫•‬
‫מכשירי ה‪ magnetic sector -‬משולבים לעיתים בסדרה עם ‪ electric sector‬לקבלת‬
‫רזולוציה גבוהה ‪.‬‬
‫•‬
‫ה‪ electric sector -‬כולל שתי עקומות דרכן מוזרם מתח חשמלי ידוע המכוון את היון‬
‫במעבר באנלייזר‪ .‬המתח הנקבע קובע את מסלול היון בעקומת האנלייז‪.‬‬
‫‪ -‬רדיום מסלול היון נקבע ע"פ‪:‬‬
‫• ה‪ electric sector -‬לא יפריד יונים להם אנרגיה קינטית זהה‪.‬‬
‫• במכשיר המשולב )‪(electric sector + magnetic sector‬ישנה שונות‬
‫באנרגיות הקינטיות של היונים הנוצרים במקומות שונים ומשום כך ישנו יתרון‬
‫בשילוב של השניים ע"מ להגדיל את הרזולוציה‪.‬‬
‫• למעשה ה‪ electric sector -‬משפר את הרזולוציה של ה‪magnetic sector -‬‬
‫ע"י הפחתת הפיזור של האנרגיה הקינטית של היונים השונים‪.‬‬
‫• בדרך כלל במכשיר משולב יופיע ה‪ electric sector -‬לפני ה‪. magnetic sector -‬‬
‫)‪Mass Spectrometer (MS‬‬
‫‪quadrupole analyzer‬‬
‫ זהו האנלייזר הנפוץ ביותר בשימוש‪.‬‬‫היתרונות הן‪:‬‬
‫• קומפקטי‪.‬‬
‫• קצב סריקה מהיר‪.‬‬
‫• יעילות שידור גבוהה‪.‬‬
‫• עוצמת וואקום נמוכה או בינונית‪.‬‬
‫• מכשיר זול‪ ,‬אחזקה פשוטה‪.‬‬
‫רזולוציה של‪.1 m/z units :‬‬
‫טווח מסות‪ :‬ניתן למצוא מ‪ 1000m/z-‬ועד ‪. 4000m/z‬‬
‫• האנלייזר כולל ארבעה מוטות (‪ )quadrupole‬של אלקטרודות המסודרים מסביב אחד מעל השני‪.‬‬
‫• כאשר היוים נעים דרך ה‪ ,quadrupole -‬הם מסוננים לפי ערך ה‪ m/z -‬שלהם כך שרק‬
‫ערך בודד של ‪ m/z‬יוכל לעבור לגלאי ביציאה מהאנלייזר‪.‬‬
‫• הערך ‪ m/z‬העובר דרך האנלייזר )‪ (resonant ion‬נקבע ע"י‬
‫ה‪ radio frequency (RF) -‬וה‪ DC voltage -‬שהועברו לאלקטרודות‪.‬‬
‫עקרון פעולה של ‪quadrupole‬‬
‫‪ RF/DC voltage‬מייצר שדה‬
‫של תנודות במרחב הפועל כמסנן‬
‫להעברת ערך ה‪ m/z -‬הנבחר‪.‬‬
‫ארבע אלקטרודות המחוברים בזוגות‪,‬‬
‫פוטנציאל ‪ RF‬מסופק בין זוגות האלקטרודות‬
‫מערכת מורכבת של‬
‫תנועות יוצרת גל‬
‫תלת ממדי )‪(3D‬‬
‫מחזור שני‪ :‬היונים‬
‫החיוביים נדחקים‬
‫בצורה מאונכת‬
‫מחזור ראשון‪ :‬היונים‬
‫החיוביים נדחקים‬
‫בצורה מאוזנת‬
‫שדה קוודרופולי מעביר יונים נבחרים דרך אמפליטודות של גלים תלת ממדיים‬
‫)‪Mass Spectrometer (MS‬‬
‫‪Time-of-flight (ToF) Mass Analyzers‬‬
‫ האנלייזר של ‪ TOF‬מפריד‬‫יונים ע"פ זמן המסע שלהם‬
‫בתוך שפופרת ‪.‬‬
‫• במכשיר ה‪ TOF -‬יונים חיוביים נוצרים באופן מחזורי ע"י הפגזה של הדוגמא עם‪ :‬פולסים‬
‫מהירים של אלקטרונים‪ ,‬יונים שניוניים או פוטונים הנוצרים בהקרנת לייזר‪.‬‬
‫• היונים הנוצרים מואצים ע"י פולסים של שדה אלקטרוני בערך של ‪ 103 to 104 V‬להם‬
‫תדירות זהה לזו של פולסי היוניזציה‪ ,‬אם כי בפיגור מה מאחור‪.‬‬
‫• החלקיקים המואצים עוברים לתוך שפופרת סחף בה שדה פנוי‪ .‬אורך שפופרת הסחף הוא‬
‫בטווח של ‪. 0.5 – 3.0 meters‬‬
‫• לכל היונים הנכנסים לשפופרת ישנה את אותה אנרגיה קינטית‪ .‬מהירות היונים בשפופרת‬
‫משתנה ביחס הפוך למסה שלהם‪ ,‬כאשר החלקיקים הקלים מגיעים לגלאי מוקדם מאלו הכבדים‪.‬‬
‫‪Two kinds of ToF analyzers‬‬
‫‪– Linear time-of-flight mass spectrometer‬‬
‫‪– Reflectron time-of-flight mass spectrometer‬‬
‫תכונות של אנלייזר ‪:TOF‬‬
‫• מאוד פשוט‪ ,‬דורש שדה חשמלי ולא מגנטי‪.‬‬
‫• לא יעיל במסות נמוכות‪ ,‬פחות מ‪.500 -‬‬
‫• יעילות העברת יונים גבוהה‪ ,‬מעט מגבלות בתהליך הזיהוי בגלאי‪.‬‬
‫• אין גבול עליון של ‪( m/z‬יתרון במקרו‪-‬מולקולות)‪.‬‬
‫‪Theory of ToF analyzers‬‬
‫ מאחר וכל היונים מואצים דרך אותו מרחק ע"י אותו כוח לפני הכניסה לשפופרת ה‪,TOF -‬‬‫לכולם ישנה אותה אנרגיה קינטית‪.‬‬
‫‪ -‬יונים קלים יותר ינועו מהר יותר‬
‫ לאחר האצת היונים‪ ,‬הם ניכנסים לשפופרת הטיסה )‪ (ToF tube‬ונסחפים דרך השפופרת ע"י‬‫המהירות שהם צברו‪.‬‬
‫• יונים בעלי ערך ‪ m/z‬נמוך יגיעו לגלאי ראשונים‪.‬‬
‫• המס‪-‬ספקטרא מתקבל ע"י מדידת הסיגנל ע"י הגלאי כפונקציה של הזמן‪.‬‬
‫• מאחר ומדובר באנלייזר פעימות מתקבלים ערכי ‪ S/N‬גבוהים‪ ,‬מאחר וכל היונים מזוהים בו זמנית‪.‬‬
‫יישום שיטת המס‪-‬ספקטרא על ביו‪-‬מקרומולקולות‬
‫הטכניקות המשמשות כיום לאנליזה של ביו‪-‬מקרומולקולות‪:‬‬
‫‪• ESI-MS: Electrospray Ionization Mass Spectrometry‬‬
‫‪• MALDI-MS: Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry‬‬
‫ מס‪-‬ספקטרומטריה של פולימרים הייתה בלתי אפשרית ממספר סיבות‪:‬‬‫‪ .1‬החומר אינו נדיף‪.‬‬
‫‪ .2‬היה צורך לבצע תחילה פירוק של המולקולה הגדולה ורק אחר כך לנסות ולזהות‪.‬‬
‫ שיטת ה‪ MALDI -‬שפותחה ע"מ לתת תשובה לאנליזה של מקרומולקולות שימשה בעיקר‬‫לקבלת משקל מולקולרי‪ ,‬רצפים או דרגת ניקיון עבור חלבונים‪ ,‬פפטידים ואוליגונוקלאוטידים‪.‬‬
‫במקרה של פולימרים ניתן היה לקבל‪:‬‬‫את המשקל המולקולרי המוחלט‪.‬‬
‫אינפורמציה מיבנית‪ ,‬יחידות חוזרות‪ ,‬קבוצות פונקציונליות וכדו'‪.‬‬
‫סקירה כללית של ‪MALDI-MS‬‬
‫ מס‪-‬ספקטרוסקופיה של ‪.Time-of-flight‬‬‫ תהליך היוניזציה מתבצע ע"י פולסים של‬‫לייזר למשך ננו‪-‬שניה‪.‬‬
‫ השיטה משלבת שימוש במטריקס בו משולבת‬‫הדוגמא לשם יינון יעיל‪.‬‬
‫תפקיד המטריקס )‪:(matrix‬‬
‫ בידוד החומר הנבדק למניעת פירוק‪.‬‬‫ בליעת האנרגיה מהלייזר‪.‬‬‫ העברת האנרגיה למולקולה ללא הרס המולקולה‬‫(מכונה גם יוניזציה רכה)‪.‬‬
‫ הגברת קצב היוניזציה של החומר הנבדק‪.‬‬‫חומרי מטריקס המצויים בשימוש‪:‬‬
Block diagram of MALDI- Linear TOF MS
‫בחינה במס‪-‬ספקטרא במקביל לקבלת ‪MS1, MS2, MS3‬‬
‫אנליזת ‪ MS‬במקביל )‪ (Tandem MS or MS/MS‬משמשת בעיקר לקבלת אינפורמציה‬
‫מבנית על החומר הנבדק‪.‬‬
‫ תחילה מקבלים ספקטרא המהווה ‪ ,MS1‬ממנו בוחרים יונים ראשונים‪,‬‬‫המהווים את "יוני האם" )‪.(parent ions‬‬
‫ "יון אם"‪ ,‬בעל ערך ‪ m/z‬מסויים ‪ ,‬עובר הלאה לפרגמנטציה נוספת במס‪-‬ספקטרא‬‫ומתקבל ספקטרום המהווה ‪ MS2‬ומכונה "יוני הבת" )‪. (daughter ions‬‬
‫‪ -‬למעשה ניתן להתייחס ל‪ MS1 -‬כאל מקור יוני עבור ‪.MS2‬‬
‫‪MS1‬‬
‫‪MS2‬‬
‫דוגמאות מס‪-‬ספקטרא )‪ (EI‬לחומרים שונים‪-‬‬
‫סיווג ע"פ קבוצות פונקציונליות‬
‫אלכוהול‪:‬‬
‫יון מולקולת האלכוהול הינו קטן או כלל לא ניראה‪ .‬בדרך כלל מתרחש ביקוע הקשר ‪C-C‬‬
‫הסמוך לחמצן‪ .‬באלכוהול מתבצע איבוד של מולקולת מים‪.‬‬
‫דרך יצירת היון באלכוהול‪:‬‬
‫‪H‬‬
‫‪H‬‬
‫‪O‬‬
‫‪O‬‬
‫אלדהיד‪:‬‬
‫ביקוע של הקשרים בסמוך לקבוצת הקרבוניל גורמת לאיבוד מימן (משקל מולקולארי פחות ‪)1‬‬
‫או לאיבוד של ‪( CHO‬יון מולקולארי פחות ‪.)29‬‬
‫דרך יצירת היון באלדהיד‪:‬‬
‫‪H‬‬
‫‪H‬‬
‫‪O‬‬
‫‪O‬‬
‫אלקאנים‪:‬‬
‫באלקאנים היון המולקולארי מופיע‪ ,‬אך בעוצמה נמוכה‪ .‬הפרגמנטציה כוללת קבוצה של פיקים‪,‬‬
‫בהפרש של ‪ 14‬יחידות‪ ,‬המיצגים איבוד של מתילן )‪ (CH2‬בכל פעם ולבסוף קבוצת מתיל‪.‬‬
‫דרך יצירת היון באלקאנים‪:‬‬
‫אמידים‪:‬‬
‫אמידים ראשוניים מראים ‪ base peak‬לפי תהליך של שיחלוף ‪ , McLafferty‬כמתואר מטה‪.‬‬
‫אמינים‪:‬‬
‫הפיק של היון המולקולארי באמין הראשוני הינו מספר אי‪-‬זוגי‪.‬‬
‫ביקוע‪-‬אלפא לחנקן הינו ביקוע מקובל באמינים‪.‬‬
‫ באמין שניוני הפיק של היון המולקולארי אף הוא מספר אי‪-‬זוגי‪.‬‬‫פיק הבסיס )‪ (base peak‬נוצר לאחר ביקוע של הקשר ‪ C-C‬הסמוך לקשר ‪.C-N‬‬
‫דרך יצירת היון באמין‪:‬‬
‫‪N‬‬
‫‪H‬‬
‫‪N‬‬
‫‪H‬‬
‫ארומטים‪:‬‬
‫הפיקים של היון המולקולארי בארומטים הוא חזק ובולט עקב המבנה היציב‪.‬‬
‫חומצה קרבוקסילית‪:‬‬
‫בחומצות עם שרשרת קצרה‪ ,‬הפיקים הבולטים הינם אלו לאחר איבוד של ‪17( OH‬פחות יחידות)‬
‫ו‪( COOH -‬פחות ‪ 45‬יחידות) וזאת עקב הביקוע של הקשרים בסמוך ל‪. C=O -‬‬
‫דרך יצירת היון בקרבוקסיל‪:‬‬
‫‪O‬‬
‫‪O‬‬
‫‪OH‬‬
‫אסתר‪:‬‬
‫פרגמנטים מופיעים לפי ביקוע הקשר הסמוך לקשר ‪( C=O‬איבוד קבוצת אלקוקסי ‪ )–OR ,‬ושיחלוף‬
‫ממני‪.‬‬
‫דרך יצירת היון באסתר‪:‬‬
‫‪O‬‬
‫‪O‬‬
‫‪O‬‬
‫אתר‪:‬‬
‫פרגמנטציה מתרחשת בעמדה אלפא לאטום החמצן ( קשר ‪ C-C‬הסמוך לחמצן)‪.‬‬
‫דרך יצירת היון באתר‪:‬‬
‫‪O‬‬
‫‪O‬‬
‫הלידים‪:‬‬
‫הנוכחות של אטומי כלורין או ברומין מזוהה בדרך כלל ע"פ הפיקים של האיזוטופים השונים‪.‬‬
‫קטונים‪:‬‬
‫הפיקים העיקריים בפרגמנטציה נוצרים מביקוע של קשרי ‪ C-C‬הסמוכים לקבוצת הקרבוניל‪.‬‬
‫דרך יצירת היון בקטון‪:‬‬
‫‪O‬‬
‫‪O‬‬