30. Undersökning av aminosyror i surkål

30. Undersökning av
aminosyror i surkål
VAD GÅR LABORATIONEN UT PÅ?
Du ska
– l ära dig tekniken vid tunnskiktskromatografi, TLC
– undersöka vad som händer med proteinerna och
polysackariderna vid mjölksyrajäsning av vitkål
– använda tunnskiktskromatografi för att separera de
aminosyror som bildas av proteinerna
– identifiera de separerade aminosyrorna
– utföra några enkla test på surkålsspadets innehåll
Mjölksyrajäsning
Mjölksyrajäsning är en typ av fermentering (jäsning) av livsmedel och
innebär att livsmedlet delvis oxideras. Oxidationen sker genom
inverkan av enzymer som finns i bakterier av släktet Lactobacillus. De
räknas till mjölksyrabakterierna. Det är några av dessa bakterier som
gör att färsk mjölk omvandlas till filmjölk.
Mjölksyrajäsning kan användas som konserveringsmetod. Det beror
på att den bildade mjölksyran sänker pH så mycket att andra bakterier
inte kan föröka sig. Samtidigt med fermenteringen sker en viss
förändring av livsmedlet. Bl.a. bryts proteiner och polysackarider ned
till mindre molekyler.
Surkål
Surkål är exempel på en mjölksyrajäst grönsak. Mjölksyrajäsning var
ursprungligen en konserveringsmetod för råvaror och livsmedel. Men
vissa fermenterade livsmedel har också andra fördelar och därför
anses t.ex. surkål vara nyttig mat (se uppgift 3, Experiment B).
Surkål kan tillverkas på följande sätt:
•
Strimla vitkål och banka strimlorna med en mortelpistill. Lägg
dem sedan i ett glaskärl eller en rostfri skål.
•
Häll en koksaltlösning (masshalten koksalt ca 1,5 %) över kålen så att den precis täcks av vätskan. Pressa ned kålen med
hjälp av en tallrik och en tyngd så att kålen inte kommer i kontakt med luft.
•
Låt skålen stå i rumstemperatur ca 1 vecka.
Du ska nu undersöka vad som händer med kålen när
mikroorganismerna bearbetar den i anaerob miljö och då använda en
kromatografiteknik som kallas tunnskiktskromatografi.
Liber AB. Denna sida får kopieras.
104
Tunnskiktskromatografi – teori
Man använder ofta tunnskiktskromatografi, TLC (Thin-Layer
Chromatography), för att separera och identifiera små joner och
molekyler, t.ex. aminosyror. Några droppar av provlösningen
appliceras (”fästs”) på en plast- eller glasplatta som är täckt med ett
inert, poröst material, t.ex. kiselgel (porösa korn av kiseldioxid).
Plattan ställs sedan ner i en behållare med lite vätska, det s.k.
elueringsmedlet, se figur. Elueringsmedlet är en blandning av olika
lösningsmedel. I denna laboration ska du använda ett elueringsmedel
som innehåller vatten, saltsyra, propanol och butanon. Vätskeblandningen sugs in i det porösa skiktet på kromatografiplattan. Vätskan
bildar där en mobil (rörlig) fas som sakta vandrar fram genom den
stationära (stillastående), fasta fasen.
Lösningsmedlen väljs så att ett av dem adsorberas starkare till den
stationära fasen än de andra. På kornen bildas ett tunt vätskeskikt där
det särskilt starkt adsorberade lösningsmedlet dominerar. Denna
adsorberade, stationära vätskefas har alltså en annan sammansättning
än den mobila vätskefasen. Kiselgelen på de TLC-plattor som du ska
använda adsorberar framför allt vatten.
plastfilm
prover
;;;;
yyyy
;;;;
yyyy
elueringsmedel
När lösningsmedelsfronten kommer fram till startpunkten – den punkt
där ett prov applicerats – löses de ämnen som ingår i provet. Ämnena
fördelas på olika sätt mellan den adsorberade, stationära lösningsmedelsfasen och den mobila vätskefasen alltefter ämnenas löslighet i
de båda faserna. En viss del av ett ämne kommer att finnas i den
stationära vätskefasen, resten i den mobila fasen. Varje ämne fördelas
mellan de båda faserna så att följande jämvikt – en fördelningsjämvikt
– ställer in sig:

→ ämne A (i mobil vätskefas)
ämne A (i stationär vätskefas) ←

För varje ämne kan man ange en jämviktskonstant
K=
[A (mobil)]
[A (stationär)]
Man har valt elueringsmedel så att de ämnen som ingår i provet får
olika värden på jämviktskonstanten. Därför kommer ämnena att föras
framåt med olika hastighet: det ämne som har störst löslighet i den
stationära vätskefasen (dvs minst K) vandrar långsammast medan det
ämne som är lösligast i den mobila vätskefasen (störst K) rör sig
snabbast.
Ämnenas molekyler vandrar ständigt mellan den stationära fasen och
den mobila fasen så att fördelningsjämvikten behålls under
vandringen.
Kromatograferingen avbryts när vätskefronten närmar sig plattans
övre kant. Innan man lokaliserar och identifierar de olika ämnena
måste kromatogrammet torkas och ev. också ”framkallas” med något
färgreagens eller belysas med UV-ljus av lämplig våglängd. De olika
ämnena kommer då att synas som färgade eller mörkare fläckar.
Liber AB. Denna sida får kopieras.
105
EXPERIMENT A.
TUNNSKIKTSKROMATOGRAFI
Utrustning
1 eller 2 tunnskiktsplattor med beläggning av silikagel (kiseldioxid),
1 eller 2 kromatografikärl eller bägare 400 cm3 hög modell, plastfilm
(som lock till bägarna), några kapillärrör, pincett, värmelampa eller
hårtork.
Kemikalier
Spad från surkål (helst egen tillverkning men den kan också köpas i
hälsokostaffär).
Späd en volymsdel surkålsspad med två volymsdelar etanol.
Filtrera den uppkomna fällningen.
Referenslösningar (5 mg/cm3) av följande aminosyror: alanin, leucin,
valin, asparaginsyra, prolin och glutamin.
Elueringsvätska: propanol, butanon och saltsyra (3,0 mol/dm3) i
volymsproportionerna 12:3:5.
Framkallare: Etanol-eller acetonlösning av ninhydrin (masshalt 1 %)
Utförande
1.
Häll elueringsvätska i ett kromatografikärl till ca 0,5 cm höjd.
Skaka kärlet så att väggarna blir fuktade.
Lägg på locket eller sätt parafilm över kärlet. Låt det sedan stå
några minuter. Då blir luften i kärlet mättad med elueringsmedlets ångor.
2.
Ta fram en tunnskiktsplatta1. Använd pincett.
OBS! Ta inte med fingrarna på plattans beläggning. Risk för
föroreningar som stör analysen!
Markera svagt på plattan/plattorna en baslinje som
figuren visar (använd t.ex. en blyerts).
Märk ut åtta punkter på denna linje. Numrera dem 1–8.
(Använder du två plattor anpassar du punkterna till
detta.)
Gör upp en tabell med rubriken Tabell 1. Aminosyror i
referenslösningarna enl. modellen på s. 105.
Anteckna i tabellen att du ska applicera spad från
surkålen i punkterna 3 och 6 på plattorna och
referenslösningar i de övriga punkterna (se figur).
1,5–2 cm
3.
1
2
3
4
5
6
7
1
Läraren bör på förhand ha klippt ut plattor som passar till kromatografikärlet/bägaren.
Eventuellt måste två plattor användas.
Liber AB. Denna sida får kopieras.
106
8
4.
Applicera lösningarna i de angivna punkterna på följande sätt:
Doppa en kapillärpipett i en av lösningarna.
Torka av spetsen mot ett filtrerpapper.
Tryck pipettspetsen lätt mot en av punkterna på plattan.
Torka fläcken försiktigt med en värmelampa eller
med varmluft från en hårtork.
Upprepa proceduren ett par gånger med samma lösning. (Genom att applicera flera små droppar och torka mellan varje
droppe får man mindre och mer koncentrerade provfläckar än
om man sätter på flera droppar på en gång.)
Applicera på samma sätt de övriga lösningarna.
5.
Sätt försiktigt ned plattan i kromatografikärlet (se figur s. 102).
OBS! Baslinjen får inte nå ned i elueringsvätskan.
6.
Låt plattan stå i ca 45 min.
Utför under tiden experiment B.
7.
Ta upp plattan ur kromatografikärlet.
Markera vätskefrontens läge.
8.
Torka plattan i ett värmeskåp vid ca 100 ºC.
9.
Framkalla aminosyrorna genom att – i dragskåp – doppa ned
plattan i ninhydrinlösning. Använd handskar och pincetter när
du lyfter plattan i och ur ninhydrinlösningen.
10.
Torka plattan i värmeskåpet vid 100 ºC.
Ta ut plattorna efter 10 min och granska dem.
Uppgifter
1.
Gör en tabell med rubriken Tabell 2. Aminosyror i surkålsspadet enl. modellen på s. 106.
2.
Identifiera några aminosyror i surkålsspadet med hjälp av referenslösningarna.
För in syrornas namn i tabell 2.
3.
Jämför aminosyrorna i ditt kromatogram med de aminosyror
som registrerats i HPLC kromatogrammet i figuren nedan.
Liber AB. Denna sida får kopieras.
107
Ett jonbytarkromatogram av surkålsspad som visar förekomsten av ett flertal aminosyror. Kromatogrammet har erhållits
med HPCL-teknik. Talen vid topparna anger tiden i minuter från försökets start. (Se vidare i Gymnasiekemi B s. 192.)
Tilläggsuppgifter
Under kromatograferingen har ju de olika ämnena vandrat olika
långt på kromatografiplattan. Varje ämne karakteriseras av sitt s.k.
Rf-värde. Det definieras på följande sätt (se figur):
Rf ( A) =
Vätskefront
b
den sträcka ämne A vandrat
a
=
den sträcka vätskefronten vandrat b
a
Baslinje
1.
Mät vandringssträckan dels för vätskefronten (sträckan b i figuren), dels för var och en av referenserna i punkterna 1, 2, 4, 5, 7
och 8 (sträckan a i figuren).
Anteckna värdena i tabell 1.
Beräkna Rf-värdena och för in dem i tabellen.
2.
Mät hur långt några av aminosyrorna i surkålsspadet har vandrat.
För in värdena i tabell 2.
Beräkna Rf-värdena och för in dem i tabell 2.
Jämför aminosyrornas Rf-värden med Rf-värdena för referenserna i tabell 1.
Tabell 1. Aminosyror i referenslösningarna.
Vätskefrontens vandring: b = ………… cm
Fläck
Aminosyrans namn och formel
a/cm
Rf
1
osv
8
Liber AB. Denna sida får kopieras.
108
Tabell 2. Aminosyror i surkålsspadet
Vätskefrontens vandring: b = ………… cm
Fläck
a/cm
Rf
Aminosyrans namn
I
osv
V
Elueringsvätskan hälls i särskilt kärl. Läraren ger anvisningar om hur
ninhydrinlösningen ska hanteras.
Experiment B. Bestämning av surkålsspadets pH m.m.
Medan aminosyrorna vandrar på kromatografiplattan kan du göra
följande undersökningar på spadet från surkålen och på lösningarna av
albumin, alanin och tyrosin:
1. Bestämning av pH
2. Fehlings prov
3. Biuretprovet
4. Xantoproteinprovet
Teori
Med Fehlings prov kan man undersöka om spadet innehåller någon
reducerande sockerart. Till ett prov av spadet sätts lösningar av
kopparsulfat och natriumhydroxid. Därefter värms blandningen.
Biuretprovet visar om det finns ämnen som innehåller två eller fler
peptidbindningar. Också i detta fall sätter man lösningar av kopparsulfat och natriumhydroxid till provet men blandningen värms inte.
Xantoproteinprovet visar om spadet innehåller aminosyror med
aromatisk ring. Vid denna undersökning sätter man salpetersyra till
provlösningen och värmer blandningen.
Utrustning
Bägare 400 cm3, provrör, dropprör, värmeplatta eller brännare,
trefot och nät, pH-meter med tillbehör.
Kemikalier
Surkålsspad, albuminlösning (masshalt 2 %), alaninlösning (5 mg/cm3),
tyrosinlösning (5 mg/cm3), HNO3 5 mol/dm3, Fehling I och Fehling II,
buffertlösningar för kalibrering av pH-metern.
Liber AB. Denna sida får kopieras.
109
Utförande
Gör i ordning en tabell med rubriken Tabell 3. Resultat av olika på
prov på surkålsspad, albumin, alanin och tyrosin (se modellen nedan).
1. Bestämning av pH
Kalibrera pH-metern.
Mät pH på ett prov av surkålsspadet.
För in pH-värdet i tabell 3.
2. Fehlings prov
Till detta prov (och till xantoproteinprovet) ska du använda ett varmt
vattenbad, t.ex. en bägare med kokande vatten.
Häll ca 2 cm3 av surkålsspadet i ett provrör.
Tillsätt 3 droppar Fehling I och minst 3 droppar Fehling II (provet
måste bli basiskt).
Värm provet några minuter i vattenbadet.
Notera ev. förändringar och för in resultatet i tabell 3.
3. Biuretprovet
Du ska göra detta prov dels på surkålsspadet, dels på referenslösningar
som innehåller albumin, alanin resp. tyrosin.
Häll 2 cm3 av de fyra lösningarna i var sitt provrör.
Sätt 3 droppar Fehling I1 och 3 droppar Fehling II2 till varje
provlösning.
Notera ev. färgändringar efter ett par minnuter.
För in resultatet i tabell 3.
4. Xantoproteinprovet
Detta prov ska – liksom biuretprovet – utföras på såväl surkålsspadet
som referenslösningarna.
Sätt 2 cm3 salpetersyra (3 mol/dm3) till varje provlösning.
Värm provrören några minuter i vattenbadet.
Notera ev. färgförändringar. För in resultatet i tabell 3.
Tabell 3. Resultat av olika prov på surkålsspad, albumin, alanin och tyrosin
pH
Fehlings prov
Albumin
----
-------
Alanin
----
-------
Tyrosin
----
-------
Biuretprov
Xantoproteinprov
Surkålsspad
1
2
Fehling I innehåller CuSO4 och
Fehling II innehåller NaOH, dvs. de reagens som används vid biuretprovet
Liber AB. Denna sida får kopieras.
110
Innehållet i provrören kan hällas ut i vasken tillsammans med mycket
vatten efter avslutade försök.
Uppgifter och frågor
1.
I punkterna 2, 3 och 4 ovan har du utfört Fehlings prov, biuretprovet resp. xantoproteinprovet.
Ta reda på vilka reaktioner som sker i de olika proven.
2.
Skriv en kortfattad redogörelse där du anger vilka slutsatser du
kan dra om vad som sker vid fermentering av vitkål med Lactobacillus. Vad bildas av proteinerna resp. av polysackariderna
i vitkålen?
3.
Ta reda på varför många anser att fermenterade grönsaker/matvaror är särskilt nyttiga.
Riskbedömning
Måttligt riskfylld laboration. Ninhydrinlösningen hanteras i dragskåp
eller i dragbänk. Ninhydrin irriterar huden och färgar den violett.
Använd handskar och pincetter då ninhydrinlösning används.
Ninhydrinspray får ej användas.
Fehlings lösning II är basisk. Salpetersyra är sur. Båda är frätande.
Skölj genast med kallt vatten om du fått lösning på hud eller kläder.
Vid spill eller stänk – torka upp och/eller skölj med vatten.
Elueringslösningen hälls i särskilt kärl för ev. återanvändning.
Liber AB. Denna sida får kopieras.
111