Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer

Transcription

Bruksanvisning till
Transgenomic Kits
för detektion av mutationer
med användning av mikrofluidisk
kapillärelektrofores
Läs dessa anvisningar noga innan du använder dessa produkter.
Spara denna bruksanvisning för framtida bruk.
Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores
Sid 1
Denna sida har avsiktligt lämnats tom
Sid 2
Innehållsförteckning
Tillverkare: RAScan och ACE Kits .......................................................................... 7 Ansvarsfriskrivning för översättning ........................................................................ 7 Licenser, varumärken och upphovsrätt................................................................... 7 Kontaktuppgifter ..................................................................................................... 8 DEL I RAScan Kits ............................................................................................... 9 Kapitel 1 RAScan Kits CE IVD.............................................................................. 10 1.1 Avsedd användning.................................................................................................................. 10 1.2 Indikationer................................................................................................................................ 10 1.3 Beställningsinformation........................................................................................................... 10 1.4 Principer för RAScan Kits CE IVD ........................................................................................... 11 1.4.1 KRAS och NRAS ....................................................................................................................................... 11 1.5 Analysprocedur ........................................................................................................................ 12 1.5.1 Somatisk mutationsdetektion med RAScan Kits ‐ en översikt ............................................................... 12 1.5.2 SURVEYOR Nuclease .............................................................................................................................. 12 1.6 Att tänka på avseende arbetsflöde ......................................................................................... 14 1.6.1 Analys av patientprover med RAScan Kits ............................................................................................. 16 1.7 Härledning av kittets kontrollsubstanser ............................................................................... 17 1.8 Kontrollparametrar .................................................................................................................. 17 1.8.1 Kvalitetskontroll av RAScan Complete Kit CE IVD .................................................................................. 17 1.8.2 Användning av kontrollplasmid‐DNA ..................................................................................................... 18 1.9 komponenter ............................................................................................................................. 19 1.9.1 RAScan Kits ............................................................................................................................................. 19 1.9.2 Antal reaktioner per kit .......................................................................................................................... 20 1.10 Reagensberedning ................................................................................................................. 20 1.11 Förvaring och hållbarhet........................................................................................................ 20 1.12 Ytterligare nödvändig utrustning och reagenser ................................................................ 20 1.13 Varningar och försiktighetsåtgärder .................................................................................... 21 1.14 Primär provinsamling, hantering och förvaring .................................................................. 21 1.15 Prestationsegenskaper .......................................................................................................... 21 1.15.1 LOD för mutationer med SURVEYOR med RAScan Combination Kit .................................................... 21 1.15.2 Sekvensbekräftelse .............................................................................................................................. 22 1.15.3 Analysprocessens begränsningar ......................................................................................................... 22 Kapitel 2 Allmänna PCR-villkor för RAScan ......................................................... 23 2.1 Termocykelprogram för amplifieringsprotokoll .................................................................... 23 2.2 Kvalitetskontroll av PCR-produkter ........................................................................................ 23 Kapitel 3 Allmänna villkor för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning för RAScan .... 24 3.1 SURVEYOR Nuclease-nedbrytning ......................................................................................... 24 3.2 Storleksfragmentering ............................................................................................................. 25 Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores
Sid 3
Kapitel 4. Universella sekvenseringsreaktioner för RAScan Kits .......................... 25 Kapitel 5 Fragmentstorleksbestämning av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar
med mikrofluidisk kapillärelektrofores ................................................................... 25 5.1 Exempel med användning av ett Caliper LabChip-instrument ............................................ 25 5.2 RAScan bestämningsmetod .................................................................................................... 26 5.3 Granskning av mikrofluidiska kapillärelektroforesdata ....................................................... 26 Kapitel 6 Stegvisa instruktioner för RAScan KRAS Exon 2 Kit ............................. 26 6.1 INLEDANDE inställning/kalibrering av mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem............ 26 6.2 Att tänka på avseende templat ................................................................................................ 26 6.3 Amplifieringsprotokoll ............................................................................................................. 26 Kapitel 7 Stegvisa instruktioner för RAScan KRAS exoner 3 och 4 Kit................. 28 7.1 Inledande inställning/kalibrering av mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem .......... 28 7.2 Att tänka på avseende templat ................................................................................................ 28 7.3 Amplifieringsprotokoll ............................................................................................................. 28 Kapitel 8 Stegvisa instruktioner för RAScan NRAS exoner 2, 3 och 4 Kit ............ 31 8.1 Inledande inställning/kalibrering av mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem .......... 31 8.2 Att tänka på avseende templat ................................................................................................ 31 8.3 Amplifieringsprotokoll ............................................................................................................. 31 Kapitel 9 Stegvisa instruktioner för RAScan Complete Kit .................................... 34 9.1 Inledande inställning/kalibrering av mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem .......... 34 9.2 Att tänka på avseende templat ................................................................................................ 34 9.3 Amplifieringsprotokoll ............................................................................................................. 34 Kapitel 10 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda
Microfluidic kapillärelektrofores............................................................................. 36 10.1 Analys av resultat ................................................................................................................... 36 10.2 Granskning av resultat ........................................................................................................... 36 10.3 Tolkning av resultat ................................................................................................................ 41 Kapitel 11 Översikt av platta för RAScan Kits ....................................................... 48 11.1 Platta, arrangemang 1 ............................................................................................................ 48 11.2 Platta, arrangemang 2 ............................................................................................................ 48 11.3 Kontroll-DNA-stämplar ........................................................................................................... 49 Kapitel 12 Referenser för RAScan Kits................................................................. 50 DEL II ACE™ Kits................................................................................................ 51 Kapitel 1
Allelspecifika
PCR-och
storleksbestämningsanalyser
för
mutationsdetektion ............................................................................................... 53 1.1 Avsedd användning av ACE Kits ............................................................................................ 53 1.2 Indikationer för ACE Kits ......................................................................................................... 53 1.3 Beställningsinformation........................................................................................................... 54 1.4 Härledning av kittets kontrollsubstanser ............................................................................... 54 1.5 ACE Kit-komponenter .............................................................................................................. 54 1.6 Antal prover som kan testas med ett ACE-kit........................................................................ 55 Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores
Sid 4
1.7 Övrig nödvändig utrustning och reagenser som krävs för ACE Kits ................................ 55 1.8 Reagensberedning för ACE Kits ............................................................................................. 55 1.9 Förvaring och hållbarhet efter första användningen av ACE Kits....................................... 55 1.10 Varningar och försiktighetsåtgärder för ACE Kits .............................................................. 55 1.11 Förberedande provtagning, hantering och förvaring av ACE Kits .................................... 56 1.12 Somatisk mutationsdetektion med ACE - en översikt ........................................................ 57 1.13 Fragmentstorleksbestämning av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar med
mikrofluidisk kapillärelektrofores ................................................................................................. 57 1.13.1 Exempel med användning av ett Caliper LabChip‐instrument ............................................................. 57 1.13.2 Procedur för mutationsbestämning med ACE Kit ................................................................................ 57 1.14 Granskning av mikrofluidiska kapillärelektroforesdata ..................................................... 58 Kapitel 2 ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD ............................................................ 58 2.1 Indikationer för användning av ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD .......................................... 58 2.2 Principer för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD ......................................................................... 58 2.3 Den allelspecifika PCR Primer-analys som används i ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD .... 59 2.4 Stegvisa instruktioner för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD................................................... 60 2.4.1 Att tänka på avseende templat .............................................................................................................. 60 2.4.2 Allelspecifikt PCR‐protokoll för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD ............................................................... 60 2.4.3 Termocyklerprogram för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD ......................................................................... 62 2.5 Användning av BRAF kontrollplasmid-DNA för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD............... 62 2.6 Storleksfraktionering för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD .................................................... 62 Kapitel 3 ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE ..................................................... 63 3.1 Indikationer för användning av ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD ........................... 63 3.2 Principer för ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD .......................................................... 64 3.3 Amplikonstorleksanalysen som används i ACE Kit for EGFR Exon 19 .............................. 65 3.4 Den allelspecifika analysen som används i ACE Kit för EGFR Exon 21 ............................. 66 3.5 Stegvisa anvisningar för ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD ...................................... 67 3.5.1 Att tänka på avseende templat .............................................................................................................. 67 3.5.2 Allelspecifikt och storleksbaserat PCR‐protokoll för ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 ............................ 67 3.5.3 Termocyklerprogram för allelspecifikt PCR‐protokoll ............................................................................ 69 3.6 Användning av EGFR kontrollplasmid-DNA .......................................................................... 70 3.7 Storleksfragmentering ............................................................................................................. 70 Kapitel 4 ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD .............................................. 70 4.1 Indikationer för användning av ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD ........................... 70 4.2 Principer för ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD .......................................................... 71 4.3 G719 allelspecifik analys som används i ACE Kit för EGFR Exon 18 and 20 CE IVD ....... 72 4.4 T790M allelspecifik analys som används i ACE Kit EGFR Exon 18 and 20 CE IVD ........... 73 4.5 Stegvisa anvisningar för ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD ...................................... 74 4.5.1 Att tänka på avseende templat .............................................................................................................. 74 4.5.2 Allelspecifikt och storleksbaserat PCR‐protokoll för ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD ................. 74 Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores
Sid 5
4.5.3 Termocyklerprogram för allelspecifikt PCR‐protokoll ............................................................................ 76 4.6 Användning av EGFR kontrollplasmid-DNA .......................................................................... 76 4.7 Storleksfragmentering ............................................................................................................. 77 Kapitel 5 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Caliper
LabChip Instrument .............................................................................................. 77 5.1 Analys av resultat ..................................................................................................................... 77 5.2 Granskning av resultat ............................................................................................................. 77 5.3 Tolkning av elektroferogramresultat ...................................................................................... 79 Kapitel 6 Analys av alla ACE Kit EGFR-analyser ................................................. 85 Kapitel 7 Referenser för ACE Kits ........................................................................ 86 Bilaga A – Laboratorieinstallation för PCR-analyser ............................................. 87 Bilaga B – Felsökningsguide ................................................................................ 88 Problem 1 — RAScan och ACE Kits Låg PCR-avkastning eller ingen PCR-produkt vid
analys på agarosgel eller på mikrofluidiskt kapillärelektroforesinstrument ............................ 88 Problem 2 — RAScan Kits Flera PCR-produkter vid analys på agarosgel ............................... 89 Problem 3 — RAScan Kits: Inga klyvningsprodukter observeras vid analysen efter
behandling av heteroduplex med SURVEYOR Nuclease ........................................................... 90 Problem 4 — RAScan Kits: Höga bakgrundsstörningar efter behandling med SURVEYOR
Nuclease .......................................................................................................................................... 91 Problem 5 — ACE Kits: Extra toppar på elektroferogrammet på grund av allelspecifik
primning........................................................................................................................................... 92 Problem 6 — RAScan Kits: SURVEYOR Nuclease-nedbrytningstoppar i negativa
kontroller ......................................................................................................................................... 92 Problem 7 – RAScan Kits: Misslyckade SURVEYOR Nuclease-resultat ................................... 93 Problem 8 — ACE Kits: Misslyckade resultat .............................................................................. 93 Problem 9 — RAScan och ACE Kits: Oväntade toppar i elektroferogrammet ......................... 94 Problem 10 — RAScan Kits: Kontamination av prover med kitkontroller (mikrokapillär
elektrofores) .................................................................................................................................... 95 Problem 11 — RAScan Kits: Kontamination av prover med kitkontroller (sekvensering) ..... 96 Problem 12 — RAScan och ACE Kits: Mikrofluidisk kapillärelektrofores, t.ex. Caliper
LabChip............................................................................................................................................ 97 Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores
Sid 6
Tillverkare: RAScan och ACE Kits
Tillverkare: RAScan och ACE Kits
Tillverkare
M
Transgenomic, Inc.
12325 Emmet Street, Omaha, NE 68164, USA
Tel +1-402-452-5400
EGrepresentant
P
Transgenomic Limited
40 Watt Road, Hillington Park, Glasgow G52 4RY, UK
Tel +44-141-892-8800
Ansvarsfriskrivning för översättning
Transgenomic, Inc. har vidtagit alla åtgärder för att säkerställa att denna översättning är korrekt. Om du
undrar över någon information i denna översatta version av handboken bör du läsa i den engelska
versionen: Instructions for Use of Transgenomic’s Kits For the Detection of Mutations Using
Microfluidic Capillary Electrophoresis – 482504(EN)
http://world.Transgenomic.com/files/literature/482504-EN.pdf och/eller kontakta Transgenomic på support
@transgenomic.com.
Licenser, varumärken och upphovsrätt
SURVEYOR Nuclease: Denna produkt tillverkas enligt en exklusiv licens för amerikanska patent
6,699,980, 6,391,557, 5,869,245, deras motsvarigheter i andra länder samt andra sökta patent.
Användning av SURVEYOR Nuclease kräver licens från Transgenomic. Akademiska, ideella och
vinstdrivande organisationer har begränsad rätt att använda SURVEYOR Nuclease för forskning genom
inköp av denna produkt. Återförsäljning eller andra tillämpningar är strängt förbjudna. Var vänlig kontakta
Transgenomic för mer information.
DNA Polymerase: Användning av denna produkt täcks av ett eller flera av följande amerikanska patent
och motsvarande upphovsrätter utanför USA:, 5,789,224, 5,618,711, 6,127,155 samt patentanspråk
utanför USA som motsvarar US Patent No. 4,889,818. Köp av denna produkt inkluderar en begränsad,
icke-överlåtbar immunitet mot skadeståndsanspråk för intrång i ovanstående patent endast för användning
av denna produkt för köparens egna interna forskning. Inga rättigheter enligt något annat patentanspråk
(t.ex. den patenterade 5' Nuclease-processen i de amerikanska patenten 5,210,015 och 5,487,972), ingen
rätt att utföra någon patenterad metod och ingen rätt att utföra kommersiella tjänster på något sätt,
inklusive bland annat att rapportera resultaten av köparens aktiviteter mot avgift eller annan kommersiell
ersättning, medges, vare sig uttryckligen eller underförstått eller på grund av förverkande. Denna produkt
är endast avsedd för forskning. Diagnostisk användning under Roches patent kräver en separat licens från
Roche. Ytterligare information om köp av licenser kan erhållas från Director of Licensing, Applied
Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA.
Transgenomic och SURVEYOR är registrerade varumärken och spirallogotypen, Advancing Personalized
Medicine, ACE samt Rascan är varumärken som tillhör Transgenomic, Inc. Alla övriga varumärken tillhör
sina respektive innehavare.
© 2013 Transgenomic, Inc. Med ensamrätt. Tryckt i USA.
Sid 7
Kontaktuppgifter
Kontaktuppgifter
Huvudkontor
Europa
Transgenomic, Inc.
Transgenomic Limited
12325 Emmet Street
40 Watt Road
Omaha,
Hillington Park, Hillington
Nebraska 68164
Glasgow G52 4RY
USA
Storbritannien
Tel: (888) 233-9283* eller +1 (402) 452-5400
Tel:
+44 141 892 8800
Fax: +1 (402) 452-5401
Fax:
+44 141 883 5967
E-post: support@transgenomic.com
E-post: support@transgenomic.com
*Endast i Nordamerika
www.Transgenomic.com
Dokumentnr. 482504(SV) rev-02
Sid 8
DEL I RAScan Kits
DEL I RAScan Kits
Sid 9
Kapitel 1 RAScan Kits CE IVD
1.1 Avsedd användning
Endast för professionellt bruk. Transgenomics RAScan Kits CE IVD är en in vitro diagnostisk
analys som upptäcker somatiska mutationer i exoner 2, 3 och 4 i KRAS- och NRAS-generna.
Dessa potentiella mutationer påvisas av SURVEYOR® Nuclease-klyvningstoppar och inkluderar
de mutationer som har känd klinisk signifikans. Dessa kit är utformade för användning i ett kliniskt
diagnostiskt laboratorium av utbildad personal som testar DNA som utvunnits ur formalinfixerad
paraffininbäddad vävnad.
Dessa bruksanvisningar kan hämtas på http://world.transgenomic.com/files/literature/482504SV.pdf.
1.2 Indikationer
Kliniker kan använda RAScan Kits CE IVD följt av fragmentstorleksbestämning på ett mikrofluidiskt
kapillärelektroforessystem såsom Caliper LabChip® MultiDX för att underlätta fastställande av om
patienters kolorektala cancertumörer kanske inte svarar på anti-EGFR-behandling såsom
panitumumab.
RAScan Kits CE IVD får inte användas för diagnos av kolorektal cancer eller någon annan form
av cancer.
RAScan Kits CE IVD är analyser som detekterar förekomsten av potentiella somatiska mutationer i
exoner 2, 3 och 4 hos KRAS- och/eller NRAS-generna, men som inte bekräftar mutationens
sekvensidentitet. För att bestämma exakt vilken mutation som detekteras krävs ytterligare
analys, t.ex. DNA-sekvensering.
Analysresultaten med detta kit kommer visserligen att visa patientens mutationsstatus, men andra
kliniska faktorer bör beaktas. Resultat som erhålls med RAScan Kits CE IVD bör inte vara den
enda metod som används för att besluta om behandling av patienter med kolorektal cancer.
Det är viktigt att notera att användning av ett mikrofluidiskt kapillärelelektroforessystem för att
identifiera prover som är positiva för en KRAS- eller NRAS-mutation med dessa kit endast bör
utgöra en vägledning och att alla mutationer måste bekräftas genom ytterligare analys, t.ex.
DNA-sekvensering.
1.3 Beställningsinformation
Produktnum
mer
Produktnamn
Storlek
RAScan Kits
713120
RAScan™ Kit KRAS Exon 2 CE IVD
100 reaktioner
713130
RAScan™ Kit KRAS Exons 3 & 4 CE IVD
100 reaktioner
713140
RAScan™ Kit NRAS Exons 2, 3 & 4 CE IVD
100 reaktioner
713110
RAScan™ Complete Kit CE IVD
230 reaktioner
Sid 10
1.4 Principer för RAScan Kits CE IVD
1.4.1 KRAS och NRAS
KRAS och NRAS ingår i genfamiljen RAS, vilken kodar för proteiner som är involverade i att sända
signaler inuti cellerna. När Ras-proteiner "slås på" av inkommande signaler, aktiveras andra celler
som är involverade i tillväxt, differentiering och överlevnad av celler. Mutationer i KRAS, NRAS
och andra relaterade gener kan leda till att Ras-proteiner blir permanent aktiverade, vilket leder till
överaktiv signalering även vid avsaknad av inkommande signaler och detta kan leda till sådan
okontrollerad cellförökning som är typisk för cancer. Mutationer som aktiverar Ras-proteiner
permanent återfinns i ~25% av tumörer hos människor och i upp till 90% vid cancerformer.
RAScan Kits är analyser för detektion av alla sekvensförändringar samt ändringar i form av
tillägg/deletioner i exoner 2, 3 och/eller 4 hos KRAS- och NRAS-generna. Positiva kontroller
tillhandahålls i detta kit för mutationer i kodon 12, 61, 117 och 146 i KRAS-genen och kodon 12,
61 och 146 i NRAS-genen.
Dessa kit använder Transgenomics patentskyddade SURVEYOR Nuclease-teknik och
tillhandahåller, i samverkan med mikrofluidisk kapillärelektrofores, en enkel och känslig detektion
av potentiella mutationer. De kan detektera en blandning av 5-10% muterat DNA i en bakgrund av
ej muterat DNA. Kontrollstudier har påvisat extremt hög överensstämmelse i väldefinierade prover
med kolorektal cancer.
På grund av att dessa analyser har en hög känslighet i förhållande till Sanger-sekvensering,
rekommenderas att laboratoriets installation är optimerad för att undvika korskontamination av
prover eller kontroller. Ett exempel på ett idealiskt laboratoriearrangemang finns i Bilaga A–
Laboratorieinstallation för PCR-analyser.
Sid 11
1.5 Analysprocedur
1.5.1 Somatisk mutationsdetektion med RAScan Kits - en översikt
Detektion och bekräftelse av mutationer med SURVEYOR Nuclease innefattar följande figur:
Figur 1.
RAScan förhandsscreening i tre enkla steg Steg 1: PCR‐amplifiera prov‐DNA
Steg 2: SURVEYOR Nuclease‐klyvning
Steg 3: Storleksbaserad analys med mikrofluidisk kapillärelektrofores Steg 1 - Förbered PCR-amplikoner från muterat (test) och normalt (referens) DNA, och fortsätt
efter den sista PCR-amplifieringscykeln med att smälta alla dubbla strängar och därefter långsamt
låta dem svalna för optimal uppkomst av hetero- och homoduplexer (heteroduplexer uppstår när
en sträng i en Wild-Type-sekvens härdas med en sträng av en muterad sekvens).
Steg 2 – Behandla en del av den härdade heteroduplex-/homoduplex-blandningen med
SURVEYOR Nuclease. SURVEYOR Nuclease kommer att skära av båda strängarna med
heteroduplex DNA och bilda DNA-fragment. Kontrollen Wild-Type DNA, som behandlats på
samma sätt, fungerar som bakgrundskontroll.
Steg 3 - Analysera DNA-fragmenten med ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem.
Formeringen av nya kluvna produkter, till följd av förekomsten av en eller flera avvikelser, påvisas
genom förekomsten av ytterligare elektroferogramtoppar. Migrationstiden för de kluvna
produkterna anger storleken på fragmenten och därmed avvikelsens eller avvikelsernas
ungefärliga placering.
1.5.2 SURVEYOR Nuclease
Transgenomics SURVEYOR Nuclease är en avvikelsespecifik (mismatch-specific) växtbaserad
DNA-endonukleas som kan söka efter kända och okända mutationer och polymorfismer i
heteroduplex DNA8. Enzymet klyver DNA med hög precision på ställen med avvikelser i basen och
andra förändringar. Denna DNA-endonukleas klipper av båda strängarna på en DNA-heteroduplex
på 3’-sidan av det avvikande stället. Tillägg/deletioner och bassubstituerande avvikelser
identifieras men klyvningens effektivitet varierar beroende på sekvensen på avvikelsen.
Sid 12
Figur 2: Verkningssätt för
SURVEYOR Nuclease.
Endonukleasen känner igen en
avvikelse och klyver på 3’-sidan på
varje bas i avvikelsen. Detta klyver
den dubbla DNA-strängen och
lämnar kvar ett 3’-överhäng av ett
enda baspar.
SURVEYOR Nuclease har använts i många olika sammanhang för att korrekt detektera en rad
mutationer och polymorfismer i gener. Det bör noteras att SURVEYOR Nuclease har använts för att
bekräfta förekomsten av kända mutationer i ett antal gener som associeras med njurcancer,
lungcancer, cancer i huvud och nacke, leukemi, endometriecancer och för att förutsäga resultatet av
strålbehandling9,10,11.
RAScan Kits CE IVD har utformats för att klyva avvikelser i KRAS och NRAS exoner 2, 3 och/eller
4 för efterföljande analys med en mikrofluidisk kapillärelektrofores, t.ex. Caliper LabChip MultiDX.
Observera följande:

Om ett prov är 100% muterat DNA, kan inga heteroduplex bildas och provet kommer
att visas som "Wild-Type". Biopsiprover från tumörer kommer dock att innehålla
Wild-Type-celler på grund av tumörheterogenicitet och/eller kontamination av
normala vävnader; notera att prover med 5% och 95% muterat DNA kommer att ha
identiska elektroferogram.

Endast den DNA-polymeras som tillhandahålls med detta kit får användas för denna
analys.

Följ de specifika anvisningarna i laboratoriets Bruksanvisning till mikrofluidisk
kapillärelektrofores.
För att framgångsrikt använda dessa kit rekommenderar vi att du läser igenom den här
handboken och noggrant följer alla instruktioner och riktlinjer. Nya användare bör utföra de
kontrollexperiment som beskrivs i avsnittet Användning av kontroll-DNA-plasmider.
Om du har ytterligare frågor eller behöver hjälp kan du kontakta (888) 233-9283 (endast
Nordamerika), +1 (402) 452-5400 eller +44 (0) 141 892 8800 (Europa) och begära "KRAS- och
NRAS-support". Alternativt kan du mejla oss på: SUPPORT@Transgenomic.com.
Sid 13
1.6 Att tänka på avseende arbetsflöde
I allmänhet bör bearbetning av alla prov utföras från början till slut enligt beskrivningen i den här
bruksanvisningen. Om bearbetningen av ett prov stoppas innan alla steg är klara, ska DNA
förvaras i -20 °C vid angivna punkter. Man bör dock undvika att utsätta ett fruset prov för upprepad
upptining och förvaring (-18 till -25 °C) av PCR-amplifierad DNA eller SURVEYOR Nuclease
nedbrytningsprodukter under längre perioder (>1 vecka).
Analys av prover bör följa nedan illustrerade arbetsflöde:
Skrapa
vävnad
1
DNAisolering
och
PCR
2
Gelelektrofores
3
Ange Robust/Svag PCR
4
SURVEYOR Nuclease och
RAScan
Misslyckades
5
RAScan Positiv
RAScan Negativ
7
6
Ingen
detekterad
avvikelse
Sekvensbekräftelse
8
Sekvenskvalitet
misslyckades
Sekvenskvalitet godkänd
9
Mutationer i KRAS eller NRAS
kodon G12, G13, A59, Q61,
K117 or A146
Ingen
detekterad
avvikelse
Figur 3. Arbetsflöde för RAScan Kit-analys
Anmärkningar till figur 3
1. Isolera DNA från FFPE med vedertagen laboratorieteknik.
2. Utför PCR och kontrollera DNA-kvaliteten genom gelelektrofores med användning av en
s.k. DNA-ladder (medföljer ej).
3. Registrera om PCR-bandet är robust (cirka ≥40 ng/µl) eller svagt (cirka <20 ng/µl).
Om det finns flera PCR-band ska färsk genomisk DNA beredas från FFPE och analysen
upprepas enligt illustration i figur 3.
4. Gå vidare till SURVEYOR Nuclease-behandling följt av fragmentstorleksbestämning på ett
mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem för prover som angetts som antingen robust PCR
eller svag PCR efter PCR-amplifiering.
Observera ett det vid en svag PCR-bestämning kan finnas otillräcklig DNA för att få
meningsfulla resultat på ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem men det kan finnas
tillräckligt med DNA för sekvensering.
Sid 14
5. Se Bilaga B – Felsökningsguide för exempel på misslyckade RAScan-resultat. Alla
prover med ett misslyckat RAScan-resultat bör köras om antingen genom att:
a. upprepa PCR om det finns tillräckligt med genomisk DNA kvar
b. extrahera DNA på nytt från FFPE; detta bör vara andrahandsalternativet eftersom
det som regel inte är önskvärt att skära ytterligare ett FFPE-block.
c.
Om en annan sektion eller block används bör hela analysen upprepas eftersom
nedbrytningsskillnader kan bero på tumörheterogenicitet.
6. Om det inte finns några synliga klyvningstoppar ska ett negativt RAScan-resultat
registreras, d.v.s. NVD = Ingen detekterad avvikelse.
7. Om ett prov visar SURVEYOR Nuclease-klyvningsprodukter (motsvarar inte relevant WildType-kontroll), måste det skickas för sekvensbekräftelse.
8. Om sekvensbekräftelseanalysen inte godkänns, ska man antingen:
a. upprepa PCR om det finns tillräckligt med genomiskt DNA kvar
b. extrahera DNA på nytt från FFPE; detta bör vara andrahandsalternativet eftersom
det som regel inte är önskvärt att skära ytterligare snitt från ett FFPE-block.
9. Om sekvensbekräftelsen är godtagbar betyder resultatet antingen:
a. Wild-Type-sekvens, d.v.s. ingen avvikelse detekterad (NVD); eller
b. Avvikelse detekterad. Om sekvensbekräftelsen visar någon basförändring som
leder till aminosyraförändring vid KRAS eller NRAS:
i. kodon 12
ii. kodon 13
iii. kodon 59
iv. kodon 61
v. kodon 117; eller
vi. kodon 146
bedöm som positiv för KRAS- eller NRAS-mutation.
Observera följande:

Det är möjligt att ha en positiv RAScan-bestämning som också ger resultatet "Ingen
avvikelse detekterad" vid ett sekvensbekräftelsetest. Detektionsnivån (LOD) för
SURVEYOR Nuclease på mikrofluidiska kapillärelektroforessystem kan vara så låg som
2% mutation i 98% Wild-Type-DNA för vissa mutationer, medan LOD för sekvensering är
cirka 10-25% mutation i 90-75% Wild-Type-DNA.

Om ett prov är 100% muterat DNA, kan inga heteroduplex bildas och provet kommer att
visas som "Wild-Type". Tumörbiopsiprover kommer dock att innehålla Wild-Type-celler på
grund av tumörheterogenicitet och/eller kontaminerande normalvävnad.

Prover med 5% och 95% muterat DNA kommer att ha identiska elektroferogram.

Positiva RAScan-resultat kan bero på andra basförändringar än de som har befunnits
vara KRAS- eller NRAS-aktiverande. Dessa mutationer är sällsynta och måste bekräftas
av en annan metod, t.ex. DNA-sekvensering, för att fastställa om ett positivt RAScanresultat är en KRAS-eller NRAS-aktiverande mutation eller ej.

Den formalinfixationsprocess som används vid beredning av FFPE-tumörbiopsiprover kan
orsaka deaminering av cytosin. Denna deaminering omvandlar cytosin till uracil.
Polymerasen "läser" denna uracil som tymin och införlivar adenin i de kopierade
strängarna. Detta kommer sedan att se ut som en mutation där den normala G nu har
bytts ut mot A som orsakar en G:C- till A:T-mutation. Dessa är artefaktmutationer som
uppstått på grund av fixationsprocessen och inte äkta somatiska mutationer. Detta
förekommer sällan, men om de kopieras tidigt under PCR-cykeln kommer de att "se ut
som" mutationer. De upprepas inte när PCR-analysen upprepas.
Sid 15
Exempel på potentiella cytosindeamineringsmutationer i KRAS som skulle kunna beaktas vid
beslut om patientvård är:
-
Kodon 12: GGT> AGT (G12S) eller GAT (G12D)
-
Kodon 13: GGC> AGC (G13S), GAC (G13D) eller GGT (G13G, en tyst mutation)
-
Kodon 146: GCA>ACA (A146T)
Exempel på potentiella cytosindeamineringsmutationer i NRAS som skulle kunna beaktas vid
beslut om patientvård är:
-
Kodon 12: GGT> AGT (G12S) eller GAT (G12D)
-
Kodon 13: GGT> AGT (G13S), GAT (G13D) eller GGC (G13G, en tyst mutation)
-
Kodon 146: GCC>ACC (A146T)
Därför rekommenderas att sådana mutationer bekräftas med duplikatanalys av samma genomiska
DNA eller att alla prover omfattas av duplikatanalys från analysens början.
1.6.1 Analys av patientprover med RAScan Kits
RAScan Kits CE IVD bör endast användas i samband med det arbetsflöde som visas nedan.
Arbetsflöde
Patientprov
Test KRAS
Test KRAS
Test NRAS
Exon 2
Exoner 3 och 4
Exoner 2, 3 och 4
Test KRAS och
NRAS
Rapportera
resultat
Figur 4: Arbetsflöde med RAScan Kits
för screening av KRAS och/eller NRAS
För förslag på hur plattor med 96 brunnar kan arrangeras för analys av alla KRAS och NRAS
exoner 2-4, se Kapitel 11 Översikt av platta för RAScan Kits.
Sid 16
1.7 Härledning av kittets kontrollsubstanser
De kontrollsubstanser som tillhandahålls i detta kit är plasmida kloner av KRAS och NRAS exoner
2-, 3- och 4-sekvenser. Alla kloner har sekvenserats för att verifiera sekvensens
överensstämmelse genom jämförelse med NCBI-referenssekvenser: NG_007524.1 (KRAS) och
NG_007572 (NRAS). Wild-Type-kontroller för KRAS och NRAS exoner 2, 3 och 4 finns i en enda
plasmid som har linjäriserats för att ge upphov till DNA-fragment av cirka 200-300 bp amplifierbar
Wild-Type-sekvens. Mutationskontrollerna KRAS och NRAS Mutants, Exons 2, 3 och 4 finns i en
enstaka plasmid som också innehåller respektive Wild-Type-sekvens för den exon som är av
intresse. Vidare linjäriseras denna plasmid, vilket ger samma 200-300 bp-fragment som kommer
att amplifieras som en 50:50-blandning av muterat till Wild-Type.
Alla kontroller har en genetisk "stämpel" och restriktionsenzympunkter. Se Kapitel 11.3
Kontrollernas DNA-stämplar; dessa är variationer av KRAS eller NRAS Wild-Type-sekvenser i
en region som inte förväntas ha mutationer och som kan användas för att felsöka
provkontamination av mutationskontroller. Tillsats av restriktionsenzympunkter resulterar i positiva
och Wild-Type-kontroller bestående av huvudsakligen fragmenterad plasmid och inte
dubbelsträngat plasmid-DNA. Se Bilaga B - Felsökningsguide, problem 5, för ett exempel på
DNA-sekvenserande elektroferogram som visar kontaminering av sekvensen med den "stämpel"
som finns i kitkontrollerna.
"KRAS- och NRAS Wild-Type Control"-sekvenser konstruerades genom syntes och kloning till
en vektor av exoner 2, 3 och 4 av KRAS och NRAS med användning av NCBI-referenssekvenser
NG_007524.1 (KRAS) och NG_007572 (NRAS). Restriktionsenzympunkten vid 5' och 3' för varje
kloningsregion. DNA-sekvensering bekräftade att den enda förändringen jämfört med
referenssekvensen var de förändrade baserna vid den "stämplade" regionen (Kapitel 11.3
Kontroll-DNA- stämplar).
"KRAS and NRAS Mutant Control"-sekvenser konstruerades genom syntes och kloning av
exoner 2, 3 och 4 avKRAS och NRAS Wild-Type- och Mutant-sekvenser för varje amplikon till en
vektor med användning av NCBI-referenssekvenser NG_007524.1 (KRAS) och NG_007572
(NRAS). Wild-Type kontrolldelarna av sekvenserna var desamma som de som användes i KRAS
och NRAS Control Wild-Type-plasmiden. De muterade kontrollsekvenserna är desamma som
Wild-Type-sekvenserna med undantag av en mutation vid relevant kodon. DNA-sekvensering
bekräftade att den enda förändringen jämfört med referenssekvensen var de förändrade baserna
vid den "stämplade" regionen beträffande muterade kontroller (Kapitel 11.3 Kontroll-DNAstämplar).
1.8 Kontrollparametrar
1.8.1 Kvalitetskontroll av RAScan Complete Kit CE IVD
Kontroll-DNA-plasmider ingår i detta kit för att tillhandahålla kvalitetskontroller vid specifika steg i
analysprocessen. För amplifieringsprotokollet, erbjuder dessa kontroller ett sätt att säkerställa
att Master Mix-blandningarna är korrekt preparerade och att amplifieringen fungerar korrekt.
Kontrollsubstanser utan templat (där vatten tillförs istället för DNA-templat) krävs också för att
kontrollera förekomsten av eventuell kontamination av kitkomponenter från ett ovidkommande
DNA-templat.
I nedbrytningsstadiet av SURVEYOR Nuclease, tillhandahåller amplikonerna från dessa
kontrollplasmid-DNA en effektiv kontroll att förhållandena för klyvningsreaktion (beredning av
SURVEYOR Nuclease Digest Master Mix-blandning och inkuberingsförhållanden) var
tillfredsställande. Vid analysstadiet efter fragmentstorleksbestämning på ett mikrofluidiskt
kapillärelektroforessystem, av SURVEYOR Nuclease-nedbrutna Wild Type-kontroller erhålls
vägledningen om hur ett prov utan mutation kommer att se ut i varje amplikon och de muterade
kontrollerna ger vägledning om var klyvningsprodukternas toppar motsvarande dessa mutationer i
KRAS och NRAS exoner 2, 3 och 4, kommer att elueras, även vid låga nivåer (se figur 5-16).
Klyvningsprodukttoppar som motsvarar andra mutationer i KRAS eller NRAS exoner 2, 3 och 4
kan elueras i något avvikande positioner.
Sid 17
Om PCR-amplikonerna inte motsvarar resultaten som beskrivs i 2.2 Kvalitetskontroll av PCRprodukter, se Bilaga B - Felsökningsguide eller kontakta teknisk support
(SUPPORT@Transgenomic.com) innan du går vidare med ytterligare provanalyssteg.
1.8.2 Användning av kontrollplasmid-DNA
Kitet levereras med två kontroll-DNA som anges i tabell 1.9 Komponenter.
Dessa kontroll-DNA klyvs med ett restriktionsenzym för att fragmentera plasmid-DNA. Wild-Typekontrollen består av en plasmid som innehåller alla KRAS och NRAS Wild-Type-kontrollsekvenser.
Muterad kontroll består av en plasmid som innehåller en blandning av alla KRAS och NRAS WildType-kontrollsekvenser, samt en muterad sekvens i var och en av KRAS exoner 2, 3 och 4 och
även NRAS exoner 2, 3 och 4. Dessa muterade sekvenser skiljer sig från Wild-Type vid ett
enstaka baspar inom varje exon. De nedbrutna kontrollerna tillhandahålls i separata flaskor, var
och en med en koncentration på 105 kopior/µl.
KRAS och NRAS exoner 2, 3 och 4 Forward och Reverse PCR-primrar som krävs för PCRamplifiering tillhandahålls separat i kittets lådor. Följ anvisningarna för varje kit för användning av
dessa kontroller.
VI REKOMMENDERAR STARKT ATT NYA ANVÄNDARE FÖRST UTFÖR
EXPERIMENTEN MED ENBART KONTROLLSUBSTANSERNA INNAN TESTNING
GÖRS PÅ GENOMISKA PROVER
Sid 18
1.9 komponenter
RAScan Kits levereras som en enda sats innehållande följande komponenter.
1.9.1 RAScan Kits
Komponent
hNummer
Färg på
rörets lock
RAScan
KRAS
Exon 2
RAScan
KRAS
Exons 3
och 4
RAScan
NRAS
Exon 2,
3 och 4
RAScan
Complete
Lila
Svart
2
1
2
1
2
1
5
3
Rosa
1
1
1
3
Amber
Rött
1
1
1
1
1
1
1
2
Gult
1
1
1
1
Grönt
1
1
1
1
Låda med PCR-kontroller och SURVEYOR
nedbrytningskomponenter
710160
710161
708049
710167
710164
710430
710431
®
SURVEYOR Nuclease W
®
SURVEYOR Enhancer W2
®
SURVEYOR Enhancer
Cofactor
0.15 M MgCl2 Solution
®
SURVEYOR Stop Solution V
CRC K- & NRAS Wild-Type
a
CRC K- & NRAS Mutants
ab
# Rör i kitet
Låda med PCR-komponenter och kontroller
703310
DNA Polymerase
Genomskinligt
1
1
1
3
703312
DNA Polymerase
Genomskinligt
-
-
1
-
703315
DNA Polymerase 10x PCR
Buffer
Genomskinligt
1
1
1
2
703065
dNTPs (10 mM)
Genomskinligt
1
1
1
-
705020
dNTPs (10 mM)
Genomskinligt
-
-
-
2
710155F
KRAS Primer: Exon 2 Forward
Blått
3
-
-
1
710155R
KRAS Primer: Exon 2 Reverse
Blått
3
-
-
1
710157F
KRAS Primer: Exon 3 Forward
710157R
710154F
710154R
710156F
710156R
710452F
710452R
710453F
710453R
710454F
710454R
710153F
710153R
KRAS Primer: Exon 3 Reverse
KRAS Primer: Exon 4A Forward
KRAS Primer: Exon 4A Reverse
KRAS Primer: Exon 4B Forward
KRAS Primer: Exon 4B Reverse
NRAS Primer Exon 2 Forward
NRAS Primer Exon 2 Reverse
Universal Sequencing Primer 1
Universal Sequencing Primer 2
Blått
-
1
-
1
Blått
Blått
Blått
Blått
Blått
Blått
Blått
Blått
Blått
Blått
Blått
Orange
Orange
2
2
1
1
1
1
1
2
2
1
1
1
1
1
1
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
Sid 19
1.9.2 Antal reaktioner per kit
RAScan Kits är utformade för att medge testning av följande antal reaktioner:
Antal
reaktioner
Antal
kontroller/sats
RAScan KRAS Exon 2 CE IVD
100
3
RAScan KRAS Exons 3 & 4 CE IVD
100
9
RAScan NRAS Exons 2, 3 & 4 CE IVD
100
9
RAScan Complete Kit CE IVD
230
21
Kit
Det totala antalet prover som kan testas med ett kit beror på hur stora omgångar som testas.
Detta beror på att en uppsättning kontrollreaktioner (Wild-Type-kontroll, positiv kontroll och kontroll
utan templat) måste inkluderas för varje amplikon som inkluderas på en provplatta.
OBS! Om flera plattor körs, måste en uppsättning med de kontroller som anges ovan köras
på varje platta.
Med en större provsatsstorlek ökar antalet prover som kan testas med ett kit, vilket minskar den
genomsnittliga reagenskostnaden per prov.
1.10 Reagensberedning
Alla reagenser som ingår i detta kit är användningsklara. En del komponenter behöver tinas upp,
och/eller blandas i en vortexblandare eller mikrocentrifug före användning. Reagenser måste
kombineras för att skapa Master Mix-blandningar och reaktionsblandningar. Se mer information
under ifrågavarande Analysprocedur-kapitel för det RAScan Kit som används.
1.11 Förvaring och hållbarhet
Kitterna ska förvaras i temperaturer mellan -18 ºC och -25 °C i en frys med konstant temperatur
tills de ska användas. Notera utgångsdatumet för varje kit som tas emot. Använd inte kittet efter
passerat utgångsdatum.
SURVEYOR nukleasblandning som tillreds i avsnittet 3.1 Nedbrytning med SURVEYOR
Nuclease ska användas omedelbart eftersom SURVEYOR Nuclease W avaktiveras med tiden
när det förekommer tillsammans med de andra komponenterna i SURVEYOR Nuclease
reaktionsblandning.
1.12 Ytterligare nödvändig utrustning och reagenser
Ytterligare komponenter och utrustning som krävs för att använda RAScan Kits CE IVD för ett
mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem inkluderar följande:
Mikrofluidiskt kapillärelektroforesinstrument, t.ex. Caliper LabChip MultiDX
Mikrofluidiska kapillärelektroforesbuffrar och -lösningar
Lämpligt DNA-chip för mikrofluidisk kapillärelektrofores (t.ex. DNA1000 för Caliper
LabChip MultiDX-instrument)
Vatten för molekylärbiologi
0,2 ml-PCR rör, remsor eller platta med 96 brunnar
Mikropipetter
Pipettspetsar
Isbad
Vortexblandare
Mikrocentrifug
Termocykler
Agarosgeler och utrustning för agarosgelelektrofores
10% blekmedel eller liknande rengöringsmedel
Laboratoriets material, utrustning och rutiner för rengöring av PCR-produkten och för
cykling av sekvenseringsreaktioner bör användas.
Sid 20
1.13 Varningar och försiktighetsåtgärder
Ingen av reagenserna i dessa kit utgör en hälsorisk i de kvantiteter som förekommer.
Transgenomics materialsäkerhetsblad för varje kit - kan hämtas efter behov från
http://world.transgenomic.com/files/literature/713000-SV.pdf
Det finns inga ämnen i dessa kit med animaliskt eller humant ursprung som innebär en
infektionsrisk.
Dessa kit får endast användas av personer som har utbildats i korrekta laboratorietekniker.
Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och ögonskydd vid arbete med
komponenterna i dessa kit. Efter användningen ska komponenterna i varje kit kasseras som
sjukvårdsavfall och enligt lokala lagar och föreskrifter.
Alikvoter av reagenser som pipetterats från rören i dessa kit är endast avsedda för engångsbruk.
Komponenterna i dessa kit har validerats som fortfarande stabila efter 25 upptiningscykler. Använd
inte dessa kit om antalet upptiningscykler har överskridits.
1.14 Primär provinsamling, hantering och förvaring
RAScan Kits CE IVD har validerats för användning med DNA som utvunnits från formalinfixerade
paraffininbäddade (FFPE) kolorektala cancertumörprover. För optimal DNA-extraktion ska
vävnaden fixeras i formalin i 14-24 timmar innan den bäddas in i paraffin.
Tumörbiopsier är en heterogen blandning av tumörceller och icke-tumörceller. Vidare är själva
tumörcellen en heterogen blandning av tumörceller med mutationer och tumörceller utan
mutationer. Eftersom dessa somatiska mutationer kanske inte är jämnt fördelade i tumören, kan
analysresultaten från olika sektioner i samma tumör skilja sig åt. För att öka möjligheten att
upptäcka en mutation, bör DNA från vävnadens tumörregion isoleras genom att endast
tumörområdet skrapas från objektglaset med en ny, steril skalpell för varje nytt objektsglas.
För framgångsrik användning av dessa kit bör extraherat DNA uppfylla kriterierna i Att tänka på
avseende templat.
OBS! Extraherade DNA-prover som inte används för omedelbar analys med dessa kit ska
förvaras vid -20 ºC till -80 ºC
1.15 Prestationsegenskaper
1.15.1 LOD för mutationer med SURVEYOR med RAScan Combination Kit
Validering av RAScan Kits för mikrofluidiska kapillärelektroforessystem med användning av
plasmidkloner av alla indicerade mutationer har visat att SURVEYOR Nuclease-toppar kan
detekteras i en blandning av 5-10% mutation i en Wild-Type-bakgrund.
Observera att topparnas profil för specifika mutationer kan variera beroende på antalet
prover som har körts på ett enskilt chip.
Automatisk sekvensering av både framåtriktade och bakåtriktade strängar misslyckas ofta med att
detektera mutationer vid nivåer under 10% i blandningar med Wild-Type-DNA. Tillsammans med
resultaten från SURVEYOR Nuclease är det möjligt att med högre säkerhet tolka 5-10%
elektroferogram för mutant sekvensering.
Om en provanalys visar ett positivt RAScan-resultat utan någon detekterbar KRAS- eller
NRAS-mutation med DNA-sekvensering, rekommenderar vi att resultatet "No Variant
Detected" (ingen avvikelse detekterad) registreras. Ytterligare detaljer finns i avsnittet Att
tänka på avseende arbetsflödet.
Sid 21
1.15.2 Sekvensbekräftelse
Fortsätt med sekvensbekräftelse för alla positiva RAScan-resultat
sekvensidentiteten för KRAS eller NRAS exoner 2, 3 eller 4-mutationer.
för
att
fastställa
Fortsätt inte med sekvensbekräftelse om RAScan-resultatet var negativt. Provet kan rapporteras
som Wild-Type eller NVD (ingen avvikelse detekterad).
Universal Sequencing-primrar som inkluderas i detta kit är avsedda för sekvensbekräftelse.
Framåtriktad primer är PN 710153F (Universal Sequencing Primer 1) och bakåtriktad primer är PN
710153R (Universal Sequencing Primer 2).
1.15.3 Analysprocessens begränsningar
Kontaminerande ämnen som överförs genom extraktion av formalinfixerade paraffininbäddade
prover kan inverka negativt på PCR-amplifieringen och nedbrytningsprocessen med SURVEYOR
Nuclease. Rutinerna för kvalitetskontroll som beskrivs under Kvalitetskontroll av PCR-produkter
säkerställer att extraherat DNA är lämpligt för användning i detta kit.
Detta kit har validerats för analys av formalinfixerade paraffininbäddade kolorektala
cancertumörprover. Det har inte validerats för diagnostisk användning med vare sig andra typer av
cancer eller med färska eller frusna biopsiprover.
Läs i Bilaga B - Felsökningsguide för felsökning av onormala resultat och information om
faktorer som kan påverka analysen.
Försiktighet måste iakttas för att undvika överföring och korskontamination med detta kit. På grund
av analysmetodens extrema känslighet, måste försiktighetsåtgärder vidtas vid följande punkter:

Se till att alla prover hanteras på ett sådant sätt att korskontamination mellan prover inte
kan förekomma

Arbeta i en PCR-arbetsstation eller annat lämpligt utrymme där arbetsområdet kan
exponeras för UV-ljus innan PCR-amplifieringsreaktionerna förbereds.

Använd separat PCR-arbetsstation eller -rum för att öppna proverna efter PCRamplifiering för kvalitetskontroll med gelelektrofores.

Förberedelse för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning bör göras i ett separat rum eller en
annan PCR-arbetsstation än den där inledande PCR gjordes.

Se till att kittets plasmidkontroller hanteras separat från testproverna under alla
analysstadier.
o
Kontrollera att alla lösningar, kontroll utan templat, samt prov-DNA-brunnar är
förslutna innan rören med kontrollplasmid-DNA öppnas.
o
KONTROLLER SKA HANTERAS SIST. Tillsätt kontrollplasmid-DNA till lämpliga
rör endast EFTER DET ATT ALLA kontroller utan templat och provbrunnar har
förslutits.
o
När rören med kontroll-DNA har förslutits ska ALLA rör och lock torkas av med
DNA-destruerande medel (t.ex. 10% blekmedel) innan de överförs till ett annat
område.

Obs! Om 10% blekmedel används måste en ny sats blandas varje vecka.
Se till att pipettering av prover i plattor med 96 brunnar inte möjliggör provkontamination av
intilliggande brunnar på grund av stänk vid blandningen eller på grund av att pipettspetsarna inte
bytts ut.
Sid 22
Kapitel 2 Allmänna PCR-villkor för RAScan
Kapitel 2 Allmänna PCR-villkor för RAScan
2.1 Termocykelprogram för amplifieringsprotokoll
1. Använd följande termocykelprotokoll för PCR-amplifiering och heteroduplexformering:
Inledande denaturering
95 C
5 minuter
Touchdown-amplifiering
15 cykler
95 C
30 sekunder
62 C, -0,5 ºC/cykel
30 sekunder
72 C
25 sekunder
Amplifiering
30 cykler
95 C
30 sekunder
55 C
30 sekunder
72 C
25 sekunder
Sista förlängning
1 cykel
72 C
2 minuter
Heteroduplexformering
95 ºC
2 minuter
≤12 C
Vänta
2.2 Kvalitetskontroll av PCR-produkter
1. Amplikonernas kvalitet och kvantitet bör kontrolleras med gelelektrofores (eller
motsvarande) innan du fortsätter med SURVEYOR Nuclease-nedbrytning eftersom robust
nedbrytning sker vid ≥40 ng/µl.
2. Analysera en alikvot av PCR-produkt tillsammans med flera olika mängder av en 100-bp
DNA-ladder.
3. Använd denna ladder till att beräkna koncentrationen av amplifierad DNA.
4. Bara ett enda band >40 ng/µl som motsvarar huvud-PCR-produkten ska synas.
5. Kontrollera att tillsatt DNA-templat höll tillräckligt hög kvalitet om det finns flera band (se
Bilaga B – Felsökningsguide).
6. Kontrollera att tillsatt DNA-templat höll tillräckligt hög kvalitet om ingen produkt kan iakttas
(se Bilaga B – Felsökningsguide). Om kvaliteten motsvarar specifikationerna, ska du
öka volymen på templatet till 4,0 µl per 50 µl reaktion (minska vattenmängden per reaktion
till 31,0 µl).
7. Inga PCR-produkter ska synas i kontrollprovet utan templat. Om DNA-produkter kan
iakttas med denna kontroll har kontamination antagligen skett. Se Bilaga B –
Felsökningsguide.
8. Ange PCR som robust eller svag PCR.
a. Robust PCR ska ha ett enda band med minst 40 ng/µl.
b. Svag PCR ska ha ett enda band med mindre än 20 ng/µl.
c.
Fortsätt med SURVEYOR Nuclease-nedbrytning med både robusta och svaga PCRbestämningar.
TIPS: I det här stadiet kan PCR-produkter förvaras vid -20 ºC eller kallare i upp till en
vecka.
Sid 23
Kapitel 3 Allmänna villkor för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning för RAScan
Kapitel 3 Allmänna villkor för SURVEYOR Nucleasenedbrytning för RAScan
3.1 SURVEYOR Nuclease-nedbrytning
1. När prov-PCR har bedömts vara av tillräckligt hög kvalitet och kvantitet, ska nedbrytning
med SURVEYOR Nuclease utföras enligt beskrivningen nedan. En provkoncentration om
minst 40 ng/ul krävs för optimal nedbrytning med SURVEYOR Nuclease
2. Tina rören med 0,15 M MgCl2 Solution och SURVEYOR Enhancer Cofactor på is.
3. Tillsätt 10,0 µl av varje PCR-amplifierat prov till ett nytt 0,2 ml PCR-rör eller brunn på en
platta med 96 brunnar.
4. Om du gör flera prover, bered en ny blandning av 0,15 M MgCl2-lösning, SURVEYOR
Enhancer Cofactor, SURVEYOR Enhancer W2 och SURVEYOR Nuclease W
(SURVEYOR Nuclease-blandning).
Använd följande tabell som en guide för beredning av Master Mix för Surveyor Nucleasenedbrytning för analys av flera prover. Exemplet nedan har tillräckliga mängder för en Master Mix
med 10 prover.
Beakta att en Master Mix-volym som är något större är denna beräkning krävs för att ge utrymme
för visst svinn vid pipettering.
Antal SURVEYOR Nuclease-nedbrytningsreaktioner:
Volymberäkning:
0,15 M MgCl2-lösning
SURVEYOR Enhancer Cofactor (µl)
SURVEYOR Enhancer W2 (µl)
SURVEYOR Nuclease W (µl)
Total volym Master Mix:
Tillsätt 5 µl SURVEYOR Nuclease Master Mix till varje
PCR-amplifierat prov (µl)
Total volym SURVEYOR Nucleasenedbrytningsreaktion:
10
10,0
10,0
10,0
20,0
50,0
10,0
15,0
a. Centrifugera varje reagens före användning.
b. Vortexblanda varje reagens försiktigt före pipettering; centrifugera under en kort stund
i ~10 sekunder efter varje vortexmoment.
c.
Tillför följande komponenter för, varje nedbrytning, till ett 0,2 ml PCR (eller större)
mikrocentrifugeringsrör.
1,0 µl 0,15 M MgCl2-lösning (PN 710167)
1,0 µl SURVEYOR Enhancer Cofactor (PN 708049)
1,0 µl SURVEYOR Enhancer W2 (PN 710161)
2,0 µl SURVEYOR Nuclease W (PN 710160)
eller tillsätt 5 µl Master Mix som beretts enligt tabellen ovan.
5. Vortexblanda försiktigt Master Mix för SURVEYOR Nuclease i 10 sekunder på låg
hastighet.
6. Centrifugera Master Mix för SURVEYOR Nuclease i 10 sekunder på låg hastighet.
7. Placera Master Mix för SURVEYOR Nuclease på is tills den är redo att användas.
Sid 24
Kapitel 3 Allmänna villkor för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning för RAScan
Obs! Master Mix för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning som beretts i steg 7 ska
användas omedelbart eftersom SURVEYOR Nuclease W blir inaktivt över tid vid
förekomst av de övriga komponenterna i Master Mix för SURVEYOR Nucleasenedbrytning.
8. Pipettera en alikvot om 5,0 µl av Master Mix för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning i varje
rör eller brunn som innehåller en alikvot om 10,0 µl amplifierad PCR-produkt (se steg 3
ovan).
9. Efter pipetteringen, förslut och centrifugera 0,2 ml PCR-rören eller plattan med 96 brunnar
i 10 sekunder.
10. Vortex-blanda försiktigt 0,2 ml PCR-rör eller platta med 96 brunnar i 10 sekunder.
11. Centrifugera i 10 sekunder på låg hastighet (detta moment är extra viktigt om
nedbrytningen görs i ett instrument utan uppvärmt lock).
12. Inkubera i 42 °C i 30 minuter.
13. Tillsätt 10 µl SURVEYOR Stop Solution (PN 710164) i varje rör eller brunn, förslut och
vortexblanda försiktigt (total SURVEYOR Nuclease reaktionsvolym är 25,0 µl).
TIPS: SURVEYOR nedbrytningsprodukter kan lagras vid ≤ -20 ºC i upp till en vecka.
3.2 Storleksfragmentering
1. Ladda provnedbrytningsprodukterna i ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem för
fragmentstorleksanalys.
2. Analysera de resulterande elektroferogrammen och virtuella gelerna för att avgöra vilka
prover och amplikoner som har potentiella mutationer och som behöver analyseras med
Sanger DNA-sekvensering.
Kapitel 4. Universella sekvenseringsreaktioner för
RAScan Kits
Universal Sequencing Primers (PN 710153F och 710153R) tillhandahålls för användning vid DNAsekvensering av alla prover som amplifierats med tillhandahållna PCR-primrar. De PCRamplikoner som skapades före SURVEYOR Nuclease-nedbrytning ska användas för
sekvensering.
Det
är
viktigt
att
två
oberoende
granskare
analyserar
sekvenseringselektroferogrammen.
Kapitel 5 Fragmentstorleksbestämning av SURVEYOR
Nuclease-nedbrytningar med mikrofluidisk
5.1 Exempel med användning av ett Caliper LabChip-instrument
Caliper LabChip-systemet ställs in, körs och analyseras enligt bruksanvisningen. Tillhörande
Caliper LabChip Software används för granskning av data, bearbetning av elektroferogram och för
att generera rapporter.
Notera att ett positivt RAScan-resultat INTE bekräftar mutationens identitet. Sådana
omständigheter som provkvalitet, ovanliga förhållanden vid körningen samt chipets skick
kan alla påverka resultatets precision. Vidare kommer mycket sällsynta mutationer i andra
kodoner än 12, 13, 61, 117 och 146, t.ex. kodoner 11 och 14 att ge klyvningsprodukter med
användning av RAScan. Sekvensbekräftelse krävs för alla KRAS och NRAS exoner 2, 3 eller
4 RAScan-nedbrytningsresultat som visar att en mutation kan förekomma i provet. DNAsekvensering eller en jämförbar metod kan användas för att fastställa identiteten hos en
KRAS- eller NRAS-mutation och om mutationen är KRAS- eller NRAS-aktiverande eller ej.
Sid 25
Kapitel 5 Fragmentstorleksbestämning av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar med mikrofluidisk
5.2 RAScan bestämningsmetod
1. Förbered laboratoriets mikrofluidiska kapillärelektroforessystem enligt anvisningar i
tillverkarens bruksanvisning till instrumentet. (Läs även i HT DNA-anvisningarna till 1Kanalysen för Caliper LabChip MultiDX-instrumentet).
a. Säkerställ att SURVEYOR nedbrytningsprodukter är i en platta som är godkänd för
användning på instrumentet.
b. Öppna instrumentets programvara och välj lämpliga kommandon för att starta
analysen när chip, reagenser och prover har laddats korrekt i instrumentet.
c.
Börja körningen när plattan och instrumentet har ställts in och alla parametrar är
klara. Utför rengöring och förvaring av materialen enligt beskrivning i tillverkarens
anvisningar när körningen är klar.
5.3 Granskning av mikrofluidiska kapillärelektroforesdata
Se exempel på specifika KRAS- och NRAS-resultat i Kapitel 10 Analys och tolkning av
Fragment Dimensionering Använda Microfluidic kapillärelektrofores.
Kapitel 6 Stegvisa instruktioner för RAScan KRAS Exon
2 Kit
6.1 INLEDANDE inställning/kalibrering av mikrofluidiskt
kapillärelektroforessystem
Läs i bruksanvisningen till ditt system när SURVEYOR Nuclease-plattan ställs i ordning för
analys på ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem, beträffande korrekt användning och
underhåll av instrumentet.
Se exempel för specifika KRAS och de nationella regleringsmyndigheterna Kapitel 10 Analys och
tolkning av Fragment Dimensionering Använda Microfluidic kapillärelektrofores.
6.2 Att tänka på avseende templat
1. För FFPE-isolerat DNA-templat, använd normala laboratorierutiner för att bedöma kvalitet
och kvantitet på extraherat DNA för att se till att det finns tillräckligt templat för PCR.
2. 260/280 absorptionsförhållandet ska vara över 1,80.
3. För att underlätta PCR-inställningen bör den effektiva koncentrationen av templat vara
12,5 ng/µl. Späd vid behov ut DNA-förlagorna med graderat molekylärbiologiskt vatten.
6.3 Amplifieringsprotokoll
1. Ta ut 10 µM-primrar, 10 mM dNTPs och DNA Polymerase 10X PCR Buffer (PN 703315)
ur frysen och tina på is.
2. Vortexblanda alla komponenter efter upptining (~10 sekunder) så att de blandas noga,
centrifugera en kort stund (~10 sekunder) för att tillförsäkra att ingen vätska finns kvar på
rörens lock och lägg på is.
3. Förbered Master Mix-blandningarna på is.
Använd följande tabell som en guide för beredning av Master Mix för KRAS Exon 2-reaktioner:
Sid 26
Kapitel 6 Stegvisa instruktioner för RAScan KRAS Exon 2 Kit
Master Mix-guide för 2 µl DNA-prover (DNA@12,5 ng/µl)
Antal reaktioner (7 prover + 3 kontroller):
10
Volymberäkning:
Vattenvolym (µl)
DNA Polymerase 10X PCR Buffer (µl)
dNTPs (µl)
Forward Primer (µl)
Reverse Primer (µl)
DNA Polymerase (µl)
Total volym Master Mix
330**
50
40
25
25
10
480,0
**OBS! Användaren bör sträva efter att ha minst 25 ng DNA per 50 µl PCR-reaktion.
När de extraheras är DNA-koncentrationerna mindre än 12,5 ng/µl. Öka volymen
extraherat DNA proportionerligt för att tillförsäkra 25 ng per reaktion. Minska vidare
volymen vatten i Master Mix-blandningarna med samma mängd (upp till 5 µl) för att få 50
µl per reaktion. Alla prover som prepareras med dessa Master Mix-blandningar
kommer att behöva extraherat DNA som har spätts ut till ungefär samma lägsta
koncentrationsgrad. Vi rekommenderar inte att koncentrationer av extraherat DNA på
<5 ng/µl används.
4.
I samtliga fall kommer KRAS och NRAS Wild-Type Control (PN 710430) och KRAS och
NRAS Mutant Positive Control (PN 710431) att användas för förberedelse av var och en
av de enskilda Wild-Type- och Mutant-kontrollreaktionerna för varje KRAS-exon 2.
(a) För Master Mix (MM-K2), KRAS Exon 2, kommer ytterligare tre reaktioner att
krävas per provplatta: KRAS Wild-Type Control, KRAS Mutant Control Exon 2 och
KRAS Exon 2 kontroll utan templat 1.
Obs! Beakta att en Master Mix-volym som är något större är denna beräkning krävs
för att ge utrymme för visst svinn vid pipettering.
5. Märk 0,2 ml PCR-rör eller brunnar i en 96-hålsplatta med vederbörlig provinformation.
6. Märk 2,0 ml centrifugeringsrör för beredning av Master Mix-blandning.
7. Tillför nödvändig mängd molekylärbiologiskt vatten till 2,0 ml centrifugeringsrören som är
märkta "Master Mix".
8. Tillsätt nödvändig mängd DNA Polymerase 10X PCR Buffer till Master Mix-röret.
9. Tillsätt nödvändig mängd 10 mM dNTPs till Master Mix-rören.
10. Tillsätt nödvändig mängd KRAS Exon 2 Forward Primer till Master Mix-röret.
11. Tillsätt nödvändig mängd KRASExon 2 Reverse Primer till respektive Master Mix-rör.
12. Centrifugera DNA Polymerase i ~10 sekunder.
13. Vortexblanda DNA Polymerase i ~10 sekunder.
14. Tillsätt nödvändig mängd DNA Polymerase och AmpErase till Master Mix-rören.
15. Förslut Master Mix-röret.
16. Vortexblanda Master Mix-röret i ~30 sekunder och centrifugera det därefter i ~10 sekunder
före användning.
17. Förvara på is tills det används.
18. Pipettera 48,0 µl Master Mix i lämpliga brunnar och byt pipettspets om du använder en
pipett med en kanal. Var noga med att undvika spill och stänk mellan hålen om en
repeterpipett används. Förvara plattan på is.
Sid 27
Kapitel 6 Stegvisa instruktioner för RAScan KRAS Exon 2 Kit
19. Tillsätt 2,0 µl av varje provtemplat-DNA eller vatten (templat utan kontroll - NTC) till
lämpliga brunnar. Använd separata pipettspetsar för varje prov och undvik
korskontaminering av proverna genom stänk. Förslut alla brunnar med med prov-DNA och
NTC med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller förslut 0,2 ml
PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt.
20. ENDAST EFTER DET ATT STEG 19 HAR FULLBORDATS FÅR KITTETS
KONTROLLTEMPLAT-DNA (PN 710430 och 710431) öppnas. Pipettera 2.0 µl av KRAS
och NRAS Wild-Type-kontroll (PN 710430) i respektive brunn eller rör för Wild-Typekontroll innan KRAS och NRAS Mutants Positive Control (PN 710431) öppnas. När WildType-kontrollerna har förslutits ska KRAS och NRAS Mutants Positive Control (PN
710431) öppnas och 2,0 µl pipetteras i var och en av brunnarna eller rören för muterade
kontroller. Förslut därefter varje brunn eller rör. Genom att tillsätta kitkontrollerna som de
sista proverna som läggs till minskar risken för att något prov-DNA kontamineras. Förslut
varje brunn med remsor med 8 proppar (om en platta med 96 brunnar används) eller
förslut 0,2 ml PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt.
OBS! Det är god laboratoriepraxis att placera kontroller utan templat i brunnar som inte ligger
intill muterade kontroller eller prover.
OBS! För förslag på hur plattor med 96 brunnar kan arrangeras för analys av alla KRAS
och NRAS exoner 2-4, se Kapitel 11 Översikt av platta för RAScan Kits.
21. Vortexblanda (~1/2 hastighet) i 10 sekunder.
22. Centrifugera i 1-2 minuter för att tillförsäkra att alla lösningar har samlats i brunnarnas eller
rörens botten. Kontrollera att lösningarna är på botten av brunnen eller röret. Upprepa
centrifugeringen i annat fall.
Kapitel 7 Stegvisa instruktioner för RAScan KRAS
exoner 3 och 4 Kit
7.1 Inledande
inställning/kalibrering
av
mikrofluidiskt
12,5 ng/µl. Späd ut DNA-förlagorna med graderat molekylärbiologiskt vatten om så
behövs.
Sid 28
Kapitel 7 Stegvisa instruktioner för RAScan KRAS exoner 3 och 4 Kit
Använd följande tabell som en guide för beredning av Master Mix för var och en av KRAS
exon 3-, KRAS exon 4A- och KRAS exon 4b-reaktionerna:
10
Volymberäkning:
Vattenvolym (µl)
dNTPs (µl)
330**
50
40
25
25
10
480
<5 ng/µl används.
4.
I samtliga fall kommer KRAS och NRAS Wild-Type Control (PN 710430) och KRAS och
NRAS Mutants Positive Control (PN 710431) att användas för förberedelse av var och en
av de enskilda Wild-Type- och Mutant-kontrollreaktionerna för varje KRAS-exon.
a. För Master Mix (MM-K3), KRAS exon 3, kommer ytterligare tre reaktioner att krävas
per provplatta: K- och NRAS Wild-Type Control, K- och NRAS Mutants Control Exon 3
och KRAS Exon 3 No Template Control 2.
b. För Master Mix (MM-K4A), KRAS Exon 4A kommer ytterligare tre reaktioner att
krävas per provplatta: K- och NRAS Wild-Type Control, K-& NRAS Mutants Positive
Control Exon 4A och KRAS Exon 4A No Template Control 3.
c.
För Master Mix (MM-K4B), KRAS Exon 4B kommer ytterligare tre reaktioner att
krävas per provplatta: K- och NRAS Wild-Type Control, K-& NRAS Mutants Positive
Control Exon 4B och KRAS Exon 4B No Template Control 4.
OBS! Beakta att en Master Mix-volym som är något större är denna beräkning krävs
8. Tillsätt nödvändig mängd DNA Polymerase 10X PCR Buffer till Master Mix-rören.
10. Tillsätt nödvändig mängd KRAS Forward Primer till respektive Master Mix-rör.
11. Tillsätt nödvändig mängd KRAS Reverse Primer till respektive Master Mix-rör.
15. Förslut Master Mix-rören.
Sid 29
Kapitel 7 Stegvisa instruktioner för RAScan KRAS exoner 3 och 4 Kit
16. Vortexblanda Master Mix-rören i ~30 sekunder och centrifugera därefter i ~10 sekunder
före användning.
korskontaminering av proverna genom stänk. Förslut alla brunnar med prov-DNA och NTC
med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller förslut 0,2 ml PCRrören. Se till att propparna sluter till ordentligt.
KONTROLLTEMPLAT-DNA (PN 710430 och 710431) öppnas. Pipettera 2,0 µl av K- och
NRAS Wild-Type-kontroll (PN 710430) i respektive brunn eller rör för Wild-Type-kontroll
för varje kontroll och förslut varje brunn eller rör innan K- och NRAS Mutant Positive
Control (PN 710431) öppnas. När Wild-Type-kontrollerna för alla exoner har förslutits ska
K- och NRAS Mutants Positive Control (PN 710431) öppnas och 2,0 µl pipetteras i var och
en av brunnarna eller rören för muterade kontroller för varje exon. Förslut därefter varje
brunn eller rör. Genom att tillsätta kitkontrollerna som de sista proverna som läggs till
minskar risken för att något prov-DNA kontamineras. Förslut varje brunn med remsor med
8 proppar (om en platta med 96 brunnar används) eller förslut 0,2 ml PCR-rören. Se till att
propparna sluter till ordentligt.
Sid 30
Kapitel 8 Stegvisa instruktioner för RAScan NRAS exoner 2, 3 och 4 Kit
Kapitel 8 Stegvisa instruktioner för RAScan NRAS
exoner 2, 3 och 4 Kit
8.1 Inledande
av
mikrofluidiskt
behövs.
Använd följande tabell som en guide för beredning av Master Mix för var och en av NRAS
exon 2-, NRAS exon 3- och NRAS exon 4-reaktionerna:
Sid 31
10
Volymberäkning:
Vattenvolym (µl)
dNTPs (µl)
330**
50
40
25
25
10
480
<5 ng/µl används.
4. I samtliga fall kommer K- och NRAS Wild-Type Control (PN 710430) och K- och NRAS
Mutants Positive Control (PN 710431) att användas för förberedelse av var och en av de
enskilda Wild-Type- och Mutant-kontrollreaktionerna för varje NRAS-exon.
a. För Master Mix (MM-N2), NRAS Exon 2 kommer ytterligare tre reaktioner att
behövas per provplatta för K- och NRAS Wild-Type Control , K- och NRAS Mutants
Positive Control Exon 2 och NRAS Exon 2 No Template Control 5.
b. För Master Mix (MM-N3), NRAS Exon 3 kommer ytterligare tre reaktioner att
c.
För Master Mix (MM-N3), NRAS Exon 4 kommer ytterligare tre reaktioner att
7. Tillför nödvändig mängd molekylärbiologiskt vatten till 2,0 ml centrifugeringsrör som är
10. Tillsätt nödvändig mängd NRAS Forward Primer till respektive Master Mix-rör.
11. Tillsätt nödvändig mängd NRAS Reverse Primer till respektive Master Mix-rör.
före användning.
Sid 32
korskontaminering av proverna genom stänk. Förslut alla brunnar med med prov-DNA och
NTC med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller förslut 0,2 ml
PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt.
för varje kontroll och förslut varje brunn eller rör innan K- och NRAS Mutants Positive
K- och NRAS Mutants Positive Control (PN 710431) öppnas och 2,0 µl pipetteras i var och
OBS! Det är god laboratoriepraxis att placera kontroller utan templat i brunnar som inte
ligger intill muterade kontroller eller prover.
Sid 33
Kapitel 9 Stegvisa instruktioner för RAScan Complete Kit
9.1 Inledande
av
mikrofluidiskt
behövs.
1. Ta ut 10 µM-primrar, 10 mM dNTPs och DNA Polymerase 10X PCR Buffer ur frysen och
tina på is.
Använd nedanstående tabell som en vägledning för beredning av en Master Mix för var och
en av KRAS Exon 2-, KRAS Exon 3-, KRAS Exon 4A-, KRAS Exon 4B-, NRAS Exon 2-,
NRAS Exon 3- och NRAS Exon 4-reaktionerna:
10
Volymberäkning:
Vattenvolym (µl)
dNTPs (µl)
330**
50
40
25
25
10
480
<5 ng/µl används.
4. I samtliga fall kommer K- och NRAS Wild-Type Control (PN 710430) och K- och NRAS
Mutants Positive Control (PN 710431) att användas för förberedelse av var och en av de
Sid 34
enskilda Wild-Type- och Mutant-kontrollreaktionerna för varje KRAS- och NRAS-exon som
testas. De exonspecifika primrarna i de olika Master Mix-blandningarna avgör de specifika
regioner som kommer att amplifieras.
a. För Master Mix (MM-K2), KRAS exon 2, kommer ytterligare tre reaktioner att
krävas per provplatta: K- och NRAS Wild-Type Control, K- och NRAS Positive
Mutants Control och KRAS Exon 2 No Template Control 1.
b. För Master Mix (MM-K3), KRAS Exon 3, kommer ytterligare tre reaktioner att
c.
För Master Mix (MM-K4A), KRAS Exon 4A kommer ytterligare tre reaktioner att
d. För Master Mix (MM-K4B), KRAS Exon 4B kommer ytterligare tre reaktioner att
e. För Master Mix (MM-N2), NRAS Exon 2 kommer ytterligare tre reaktioner att
behövas per provplatta för K- och NRAS Wild-Type Control , K- och NRAS
Positive Mutant Control Exon 2 och NRAS Exon 2 No Template Control 5.
f.
För Master Mix (MM-N3), NRAS Exon 3 kommer ytterligare tre reaktioner att
Positive Mutant Control och NRAS Exon 3 No Template Control 6.
g. För Master Mix (MM-N4), NRAS Exon 4 kommer ytterligare tre reaktioner att
Positive Mutant Control och NRAS Exon 4 No Template Control 7.
10. Tillsätt nödvändig mängd KRAS eller NRAS Forward Primer till respektive Master Mix-rör.
11. Tillsätt nödvändig mängd KRAS eller NRAS Reverse Primer till respektive Master Mix-rör.
före användning.
18. Pipettera 48,0 µl Master Mix i lämpliga brunnar och byt pipettspetsar om du använder en
19. Tillsätt 2,0 µl av varje provtemplat-DNA eller vatten (No Template Control) till lämpliga
brunnar. Använd separata pipettspetsar för varje prov och undvik korskontaminering av
proverna genom stänk. Förslut alla brunnar med prov-DNA och templat utan kontroll med
remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller förslut 0,2 ml PCR-rören.
Se till att propparna sluter till ordentligt.
Sid 35
för varje kontroll och förslut varje brunn eller rör innan K- och NRAS Postitive Mutants
K- och NRAS Positive Mutants Control (PN 710431) öppnas och 2,0 µl pipetteras i var och
Kapitel 10 Analys och tolkning av Fragment
Dimensionering Använda Microfluidic
10.1 Analys av resultat
Granskaren ska visuellt undersöka gelbilder och elektroferogram för alla prover för att fastställa
förekomst/frånvaro av en mutation. När en visuell inspektion av gelbilder och elektroferogram
utförs bör banorna för No Template Control, Wild-Type Control och Positive Control undersökas
först för att fastställa att:

det inte förekommer kontaminering i No Template Control

endast obeskurna homoduplextoppar förekommer i Wild-Type-kontrollen

positiv kontroll har de specifika toppar (elektroferogram) eller band (gel) som
genereras av SURVEYOR Nuclease-nedbrytning
Den positiva kontroll (PN 710431) som används för att bekräfta att SURVEYOR Nuclease är aktiv
och för att identifiera den region i gelen där bandmönstren som ses i proverna kan indicera
förekomst av en potentiell mutation.
Wild-Type-kontrollen (PN 710430) är komparator för provets bandmönster; förekomst av distinkta
band i ett prov som inte finns i Wild-Type-kontrollen indicerar att provet bör skickas för DNAsekvensanalys.
10.2 Granskning av resultat
För jämförelse och kontroll ska man ALLTID utföra SURVEYOR Nuclease-nedbrytning på var och
en av kontrollerna (Wild-Type- och positiva kontroller), en kontroll utan templat (NTC), samt provDNA, vilka ska köras med samma provplatta på mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem.
I nedbrytningsstadiet av SURVEYOR Nuclease, tillhandahåller amplikonerna från dessa
kontrollplasmid-DNA en effektiv kontroll att förhållandena för klyvningsreaktion (beredning av
SURVEYOR Nuclease-blandning och inkuberingsförhållanden) var tillfredsställande. I
analysstadiet och i följande exempel användes ett Caliper LabChip-system och kurvorna av dessa
SURVEYOR Nuclease-nedbrutna kontrollamplikoner ger en vägledning om var DNA-fragmenten
efter klyvningen vid dessa specifika mutationers avvikelseställe kommer att elueras, även vid låga
nivåer (se figurer 5-16).
Sid 36
Kapitel 10 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Microfluidic kapillärelektrofores
Om antingen PCR-amplikonerna eller SURVEYOR Nuclease-klyvningsfragment som härletts av
kontroll-DNA inte motsvarar beskrivna resultat, se Bilaga B -Felsökningsguide eller kontakta
Transgenomics tekniska support innan nästa steg i provanalysen tas.
SURVEYOR Nuclease klyver vid alla avvikelser som uppstår till följd av heteroduplex
formering mellan Wild-Type och muterat DNA, inte bara mutationer i exoner 2, 3 eller 4.
SURVEYOR Nuclease bekräftar avvikelsen. Mutationens specifika basförändringsidentitet krävs
för bestämning av KRAS- och NRAS-aktiverande status och den måste bekräftas med en annan
metod, t.ex. sekvensering.
Obs! Det är viktigt att kontrollera att ingen "stämpel"-sekvens förekommer i varje
sekvenseringselektroferogram för att bekräfta att mutationen inte beror på att provet kontaminerats
av en av kittets kontroller.
Obs! Om provet är Wild-Type vid relevanta kodon av intresse och den "stämplade" sekvensen
förekommer, är provet kontaminerat och analysen måste göras om. Förekomst av "stämpeln"
anger att provet kan vara kontaminerat med en av kittets Wild-Type-kontroller. Denna
kontamination kan maskera eventuell lågnivåmutation i provet. Se A.2 Kontrollernas DNAstämplar för information om kontrollernas stämpelsekvenser.
Nedanstående exempel ges endast i illustrerande syfte och ska INTE användas för att avgöra
identiteten hos någon specifik mutation. Bekräftelse av identiteten hos en mutation krävs för att
oåterkalleligt fastställa förekomsten av en specifik basförändring i exoner 2, 3 eller 4 i KRASoch/eller NRAS-genen.
I alla exempel följdes tillvägagångssättet som beskrivs i avsnittet Stegvisa anvisningar till fullo.
Sid 37
bp
Prov 4
Prov 3
Prov 2
Prov 1
KRAS Wild-Type Control
KRAS Positive Control
Exon 2
Kontroll utan templat
KRAS
HT DNA 1K Ladder
bp
←Ej beskuren homoduplex
←Toppar i SURVEYOR
←Nedbrytningsregion
Figur 5: En Caliper LabChip gelbild av SURVEYOR Nuclease nedbrytningsfragment efter
PCR-amplifiering av KRAS exon 2. I ovanstående exempel innehåller kontrollen utan templat
inga band och det förekommer därför ingen kontamination av proverna. Den positiva kontrollen
visar de 2 distinkta band som genereras av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningen av G12D
mutationskontroll, vilket indicerar att enzymet är aktivt. Wild-Type-kontrollen har endast en tydlig ej
beskuren homoduplextopp, vilket visar att det inte förekommer någon kontamination av muterat
DNA.
Proverna 1, 3 och 4 visar distinkta band i brunnarna som är i korrekt region; dess prover innehåller
sannolikt mutationer. Utan DNA-sekvensering är det emellertid omöjligt att avgöra vilka
mutation(er) som förekommer eller om mutationerna är i kodoner 12 eller 13. I vissa prover kanske
mutationerna inte finns vid kodon 12 eller 13, och därför skulle provet anses vara KRAS Exon 2
Wild-Type beträffande kodon 12 eller 13. Prov 2 visar det obeskurna homoduplexbandet och det
finns därför inga tecken på någon mutation i provet. Detta prov behöver inte bekräftas med DNAsekvensering och kan klassificeras som KRAS exon 2 Wild-Type beträffande kodon 12 och 13.
Förutom visuell inspektion av gelbilderna kan det vara bra att jämföra provernas elektroferogram
med de positiva kontroller och Wild-Type-kontroller som medföljer i kittet. Det är bäst att använda
funktionen "Överlappningsförskjutning" för elektroferogrammen som återfinns längst ned på fliken
"Egenskaper". Det finns även andra alternativ. Figur 6 nedan visar elektroferogrammen för
samma prover som visades i gelbildsläget ovan.
Sid 38
Figur 6: Elektroferogrammen för samma uppsättning som visades på gelbilden i figur 5.
Toppmönstren i proverna 1, 3 och 4 (rosa, blågröna och lila linjer) var inte exakt likadana och
befinner sig i den region där mutationer i kodon 12 eller 13 återfinns. Bekräftelse med DNAsekvensering krävs för att identifiera den specifika basförändringen. Visuell granskning av
elektroferogrammen för prov 2 (ljusbrun linje) visar ett baslinjemönster som liknar Wild-Typekontrollen och DNA-sekvensering behövs inte.
Prov 1
Prov 3
Prov 4
Framåtriktad
avläsning
Bakåtriktad
avläsning
Figur 7: Sekvensanalys av prover 1, 3 och 4 från figur 10. Prover 1, 3 och 4 från figur 6
analyserades ytterligare med DNA-sekvensering. Prov 1 har en G13D-mutation; Prov 3 har en
G13C-mutation och Prov 4 har en G12C-mutation. Dessa prover illustrerar (a) förmågan hos
SURVEYOR Nuclease att detektera potentiella mutationer och (b) SURVEYOR Nuclease
oförmåga att fastställa exakt placering eller specifik basförändring hos mutation(erna) i provet.
Sid 39
Figur 8: Caliper LabChip elektroferogram av SURVEYOR Nuclease nedbrytningsfragment
efter PCR-amplifiering av NRAS exon 2. I exemplet ovan visar den positiva kontrollen de 2
distinkta band som genereras av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningen av G12D
mutationskontroll, vilket indicerar att enzymet är aktivt. Wild-Type-kontrollen har endast en tydlig ej
beskuren homoduplextopp, vilket visar att det inte förekommer någon kontamination av muterat
DNA.
Proverna 1 och 3 (bruna och gröna linjer) var distinkta band i korrekt region. Prov 1 har två band
och prov 3 verkar ha fyra band. Prov 3 har sannolikt en dubbel mutation men utan DNAsekvensering är det omöjligt att avgöra vilka mutationer som förekommer eller om mutationerna är
i kodoner 12 eller 13 för vare sig prov 1 eller prov 3. I vissa prover kanske mutationerna inte finns
vid kodon 12 eller 13, och därför skulle provet anses vara NRAS Exon 2 Wild-Type beträffande
kodon 12 eller 13. Prov 2 (rosa linje) visar det obeskurna homoduplexbandet och det finns därför
inga tecken på någon mutation i provet. Detta prov behöver inte bekräftas med DNA-sekvensering
och kan klassificeras som NRAS exon 2 Wild-Type beträffande kodon 12 och 13.
Prov 1
G12D
Prov 3
G12D och A18T
Figur 9: Sekvensanalys av prov 1 och 3 från figur 8. Prover 1 och 3 från figur 8 analyserades
ytterligare med DNA-sekvensering. Prov 1 har en G12D-mutation (svart pil) och prov 3 har två
mutationer: en G12D (svart pil) och en A18T (den lila rutan i figuren visar förekomst av A18Tmutationen i prov 3 samt frånvaron i samma region i prov 2). Dessa prover illustrerar (a) förmågan
hos SURVEYOR Nuclease att detektera potentiella mutationer och (b) SURVEYOR Nuclease
oförmåga att fastställa exakt placering eller specifik basförändring hos mutation(erna) i provet.
Sid 40
10.3 Tolkning av resultat
Figur 10: KRAS Exon 2 SURVEYOR Nuclease nedbrytningsprodukter (elektroferogram och
virtuella gelbilder) Caliper LabChip-analys av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar av KRAS
Positive Control Exon 2, KRAS Control Wild-Type and DNA som isolerats från FFPE-sektioner.
KRAS Positive Control Exon 2 är en blandning av Wild-Type och muterade G12D-plasmider som
uppstår i nedbrytningstoppar om 74 and 116 bp (röd linje). Vid jämförelse mellan oc för prover 1-4
med Wild-Type-elektroferogram (grön linje), är det tydligt att proverna 1, 3 och 4 (rosa, blågröna
och lila linjer) har potentiella mutationer. Nedbrytningsmönstret för prov 2 (ljusbrun linje) liknar
Wild-Type-kontrollens mönster. Därför måste proverna 1, 3 och 4 sekvenseras för att bekräfta
förekomst eller frånvaro av mutation vid relevant kodon för KRAS exon 2, medan prov 2 inte
behöver sekvenseras.
Sid 41
Figur 11: KRAS Exon 3 SURVEYOR Nuclease nedbrytningsprodukter (virtuella gelbilder
och elektroferogram) Caliper LabChip-analys av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar av KRAS
Positive Control Exon 3, KRAS Control Wild-Type och CRC DNA som isolerats från FFPEsektioner. KRAS Positive Control Exon 3 är en blandning av Wild-Type och muterade Q61Hplasmider som uppstår i nedbrytningstoppar om 67 and 133 bp (röd linje). Vid jämförelse av
nedbrytningsmönstren för proverna 1-4 med Wild-Type-elektroferogram (grön linje), är det tydligt
att proverna 2 och 4 (ljusbruna och lila linjer) har potentiella mutationer. Nedbrytningsmönstret för
prov 1 och 3 (rosa och ljusbruna linjer) liknar Wild-Type-kontrollens mönster. Därför måste
proverna 2 och 4 sekvenseras för att bekräfta förekomst eller frånvaro av mutation vid relevant
kodon förKRAS exon 3, medan proverna 1 och 3 inte behöver sekvenseras.
Sid 42
Figur 12: KRAS Exon 4A SURVEYOR Nuclease nedbrytningsprodukter (virtuella gelbilder
och elektroferogram) Caliper LabChip-analys av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar av KRAS
Positive Control Exon 4A, KRAS Control Wild-Type och CRC DNA som isolerats från FFPEsektioner. KRAS Positive Control Exon 4A är en blandning av Wild-Type och muterade K117Nplasmider som uppstår i nedbrytningstoppar om 80 and 88 bp (rosa linje). Vid jämförelse av
nedbrytningsmönster för prover 1-4 med Wild-Type (grön linje) elektroferogram är det uppenbart
att prov 3 (blågrön linje) har en möjlig mutation. Nedbrytningsmönstret för proverna 1, 2 och 4
(rosa, ljusbruna och lila linjer) liknar mönstret hos Wild-Type-kontrollen. Därför bör prov 3
sekvenseras för att bekräfta förekomst eller frånvaro av mutation vid relevant kodon för KRAS
exon 4A, medan proverna 1, 2 och 4 inte behöver sekvenseras.
Sid 43
Figur 13: KRAS Exon 4B SURVEYOR Nuclease nedbrytningsprodukter (elektroferogram
och virtuella gelbilder) Caliper LabChip-analys av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar av
KRAS Positive Control Exon 4B, KRAS Control Wild-Type and DNA som isolerats från FFPEsektioner. KRAS Positive Control Exon 4B är en blandning av Wild-Type och muterade A146Tplasmider som uppstår i nedbrytningstoppar om 78 and 116 bp (röd linje). Vid jämförelse av
att proverna 2 och 4 (ljusbruna och lila linjer) har potentiella mutationer. Nedbrytningsmönstret för
prov 1 och 3 (rosa och ljusbruna linjer) liknar Wild-Type-kontrollens mönster. Därför måste
kodon förKRAS exon 4B, medan proverna 1 och 3 inte behöver sekvenseras.
Sid 44
Figur 14: NRAS Exon 2 SURVEYOR Nuclease nedbrytningsprodukter (elektroferogram och
virtuella gelbilder). Caliper LabChip-analys av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar av NRAS
Positive Control Exon 2, NRAS Control Wild-Type och DNA som isolerats från FFPE-sektioner.
NRAS Positive Control Exon 2 är en blandning av Wild-Type och muterade G12D-plasmider som
uppstår i nedbrytningstoppar om 75 and 161 bp (röd linje). Vid jämförelse av
att proverna 1 och 2 (rosa och ljusbruna linjer) har potentiella mutationer. Nedbrytningsmönstret
för prov 3 och 4 (ljusbruna och lila linjer) liknar Wild-Type-kontrollens mönster. Därför måste
kodon förNRAS exon 2, medan proverna 3 och 4 inte behöver sekvenseras.
Sid 45
virtuella gelbilder) Caliper LabChip-analys av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar av NRAS
Positive Control Exon 3, NRAS Control Wild-Type and DNA som isolerats från FFPE-sektioner.
NRAS Positive Control Exon 3 är en blandning av Wild-Type och muterade Q61K-plasmider som
uppstår i nedbrytningstoppar om 77 and 126 bp (röd linje). Vid jämförelse av
att proverna 1-3 (rosa, ljusbruna och blågröna linjer) har potentiella mutationer.
Nedbrytningsmönstret för prov 4 (lila) liknar Wild-Type-kontrollens mönster. Därför måste proverna
1 - 3 sekvenseras för att bekräfta förekomst eller frånvaro av mutation vid relevant kodon för
NRAS exon 3, medan prov 4 inte behöver sekvenseras.
Sid 46
virtuella gelbilder) Caliper LabChip-analys av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar av NRAS
Positive Control Exon 4, NRAS Control Wild-Type and DNA som isolerats från FFPE-sektioner.
NRAS Positive Control Exon 4 är en blandning av Wild-Type och muterade A146T-plasmider som
uppstår i nedbrytningstoppar om 68 and 165 bp (röd linje). Nedbrytningsmönstret för prov 1 - 4
(rosa, ljusbruna, blågröna och lila linjer) liknar Wild-Type-kontrollens mönster. Därför behöver
proverna 1 - 4 inte sekvenseras.
Sid 47
Kapitel 11 Översikt av platta för RAScan Kits
11.1 Platta, arrangemang 1
Det arrangemang av plattan som föreslås nedan är för RAScan-analys av alla sju KRAS- och
NRAS-exonerna samtidigt i 10 prover.
1
2
A: KRAS KRAS Ex KRAS Ex
Ex 2
2 WT
2 Mut
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Prov 1
Prov 2
Prov 3
Prov 4
Prov 5
Prov 6
Prov 7
Prov 8
Prov 9
Prov 10
Tom
Tom
Tom
NTC
KRAS
Ex 2
NTC
KRAS
Ex 3
NTC
KRAS
Ex 4A
NTC
KRAS
Ex 4B
NTC
NRAS
Ex 2
NTC
NRAS
Ex 3
NTC
NRAS
Ex 4
B: KRAS KRAS Ex KRAS Ex
Ex 3
3 WT
3 Mut
C: KRAS KRAS Ex KRAS Ex
Ex 4A
4A WT 4A Mut
D: KRAS KRAS Ex KRAS Ex
Ex 4B
4B WT 4B Mut
E: NRAS NRAS Ex NRAS Ex
Ex 2
2 WT
2 Mut
F: NRAS NRAS Ex NRAS Ex
Ex 3
3 WT
3 Mut
G: NRAS NRAS Ex NRAS Ex
Ex 4
4 WT
4 Mut
H:
Tom
Tom
Förklaring: Ex = Exon; WT = Wild-Type; Mut = Mutation; NTC = No Template Control (kontroll
utan templat)
11.2 Platta, arrangemang 2
Det arrangemang av plattan som föreslås nedan är för RAScan-analys av alla sju KRAS- och
NRAS-exonerna samtidigt i 9 prover.
1
2
A: KRAS KRAS Ex KRAS Ex
Ex 2
2 WT
2 Mut
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Prov 1
Prov 2
Prov 3
Prov 4
Prov 5
Prov 6
Prov 7
Prov 8
Prov 9
NTC
KRAS
Ex 2
B: KRAS KRAS Ex KRAS Ex
Ex 3
3 WT
3 Mut
NTC
KRAS
Ex 3
C: KRAS KRAS Ex KRAS Ex
Ex 4A
4A WT 4A Mut
NTC
KRAS
Ex 4A
D: KRAS KRAS Ex KRAS Ex
Ex 4B
4B WT 4B Mut
NTC
KRAS
Ex 4B
E: NRAS NRAS Ex NRAS Ex
Ex 2
2 WT
2 Mut
NTC
NRAS
Ex 2
F: NRAS NRAS Ex NRAS Ex
Ex 3
3 WT
3 Mut
NTC
NRAS
Ex 3
G: NRAS NRAS Ex NRAS Ex
Ex 4
4 WT
4 Mut
NTC
NRAS
Ex 4
H:
Tom
Tom
Tom
Tom
Tom
Tom
Tom
Tom
Tom
Tom
Tom
Tom
Förklaring: Ex = Exon; WT = Wild-Type; Mut = Mutation; NTC = No Template Control (kontroll
utan templat)
Sid 48
11.3 Kontroll-DNA-stämplar
Sekvenser med en "stämpel" anges nedan.
Förklaring: De vanligaste mutationsområdena markeras med lila. Sekvenser med VERSALER
är kodande baser; ej kodande baser anges med gemener.
Kontrollernas genetiska "stämpel" är markerad i gult; denna avvikelse från KRAS eller
NRAS Wild-Type-sekvensen, i en region som inte förväntas ha mutationer, kan användas
för att felsöka provkontamination av muterade kontroller. Se Bilaga B - Felsökningsguide,
problem 5, för ett exempel på en RAScan-kurva av sådan kontamination.
KRAS Exon 2-"stämpel"
Amplikonstorlek: 190 bp. För att skapa KRAS Exon 2-kontrollplasmidens genetiska stämpel har
TAT ändrats till ATA. Kodon 12 och 13 har också markerats nedan. Den muterade kontrollen är
samma förutom att kodon 12 har muterats till G12D (GGT>GAT).
GCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAAATAGAT
KRAS Exon 3-"stämpel"
Amplikonstorlek: 200 bp. För att skapa KRAS Exon 3-kontrollplasmidens genetiska stämpel har
Wild-Type, TAT, ändrats till ATA. Kodon 59 och 61 har också markerats nedan. Den muterade
kontrollen är samma förutom att kodon 61 har muterats till Q61H (CAA>CAC).
GAATGGTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG
KRAS Exon 4A-"stämpel"
Amplikonstorlek: 168 bp. För att skapa KRAS Exon 4A-kontrollplasmidens genetiska stämpel har
Wild-Type, AGA, ändrats till TCT. Kodon 117 har också markerats nedan. Den muterade
kontrollen är samma förutom att kodon 117 har muterats till K117N (AAA>AAT).
AATAAATGTGATTTGCCTTCTAGAACAGTTCTCAC
KRAS Exon 4B-"stämpel"
Amplikonstorlek: 194 bp. För att skapa KRAS Exon 4B-kontrollplasmidens genetiska stämpel har
Wild-Type, AGT, ändrats till TCA. Kodon 146 har också markerats nedan. Den muterade
kontrollen är samma förutom att kodon 146 har muterats till A146T (GCA>ACA).
TCAGCAAAGACAAGACAGgtatcaaac
NRAS Exon 2-"stämpel"
Amplikonstorlek: 236 bp. För att skapa NRAS Exon 2-kontrollplasmidens genetiska stämpel har
Wild-Type, ACA, ändrats till TGT. Kodon 12 och 13 har också markerats nedan. Den muterade
kontrollen är samma förutom att kodon 12 har muterats till G12D (GGT>GAT).
ccatgtggttcttgctggtgtgaaATGACTGAGTACAAACTGGTGGTGGTTGGAGCAGGTGGTGTT
Wild-Type, GAC, ändrats till CTG. Kodon 59 och 61 har också markerats nedan. Den muterade
kontrollen är samma förutom att kodon 61 har muterats till Q61K (CAA>AAA).
ACAGCTGGACAAGAAGAGTACAGTGCCATGAGACTGCAA
Wild-Type, CAA, ändrats till GTT. Kodon 117 och 146 har också markerats nedan. Den muterade
kontrollen är samma förutom att kodon 146 har muterats till A146T (GCA>ACA).
AACAAGTGTGATTTGCCAACAAGGACAGTTGATACAAAAGTTGCCCACGAACTGGCCAAGAGTTACGGGATT
CCATTCATTGAAACCTCAGCCAAG
Sid 49
Kapitel 12 Referenser för RAScan Kits
Kapitel 12 Referenser för RAScan Kits
1. Amgen News Release (2013) New analyses identify predictive biomarkers for Vectibix®
(panitumumab) in patients with metastatic colorectal cancer.
http://wwwext.amgen.com/media/media_pr_detail.jsp?-year=2013&releaseID=1820728
2. Peeters M et al (2013) Massively parallel tumor multigene sequencing to evaluate response
to panitumumab in a randomized phase III study of metastatic colorectal cancer. Clin Cancer
Res. 19 1902-12.
3. De Roock W et al (2010) Association of KRAS p.G13D mutation with outcome in patients with
chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. JAMA 304
1812-20.
4. Peeters M et al (2013) Mutant KRAS codon 12 and 13 alleles in patients with metastatic
colorectal cancer: assessment as prognostic and predictive biomarkers of response to
panitumumab. J Clin Oncol. 31 759-65.
5. Andre T et al (2013) Panitumumab combined with irinotecan for patients with KRAS wild-type
metastatic colorectal cancer refractory to standard chemotherapy: a GERCOR efficacy,
tolerance, and translational molecular study. Ann Oncol. 24 412-9.
6. Loupakis F et al (2009) KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to
cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild-type metastatic colorectal cancer. Br
J Cancer 101 715-21.
7. De Roock W et al (2010) Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the
efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal
cancer: a retrospective consortium analysis. Lancet Oncol. 11 753-62.
8. Qiu P et al (2004) Mutation detection using Surveyor™ nuclease. Biotechniques 36 702-707.
9. Kuang Y et al (2009) Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant
non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15 2630-6.
10. Mitani N et al (2007) Surveyor nuclease-based detection of p53 gene mutations in
haematological malignancy. Ann. Clin. Biochem. 44 557-9
11. Engelman JA et al (2006) Allelic dilution obscures detection of a biologically significant
resistance mutation in EGFR-amplified lung cancer. J. Clin. Invest. 116 2695-2706.
Se även http://world.transgenomic.com/files/literature/482146.pdf för referenser om SURVEYOR
Nuclease och dess tillämpningar.
Sid 50
DEL II ACE™ Kits
DEL II ACE™ Kits
Sid 51
DEL II ACE™ Kits
Denna sida har avsiktligt lämnats tom
Sid 52
Kapitel 1 Allelspecifika PCR-och storleksbestämningsanalyser för mutationsdetektion
Kapitel 1 Allelspecifika PCR-och
storleksbestämningsanalyser för mutationsdetektion
1.1 Avsedd användning av ACE Kits
Endast för yrkesmässig användning. Transgenomics ACE (Allele Specific PCR Enrichment) Kits CE
IVD är diagnostiska analyser in vitro som detekterar specifika somatiska mutationer vid specifika
kodoner i BRAF- och EGFR-generna, plus alla deletioner och komplexa mutationer i relevant region
av EGFR Exon 19. Specifika punktmutationer fastställs för BRAF exon 15, EGFR exoner 18, 20 och
21 men de EGFR exon 19-deletioner som detekteras kan inte sekvensbestämmas av dessa analyser.
Specifikt fastställande av exakt exon 19-deletion eller komplex mutation behöver fastställas med
DNA-sekvensering. Alla mutationer och deletioner påvisas av distinkta fragmentlängder när de
sparareras med mikrofluidisk kapillärelektrofores. Dessa kit är utformade för användning i ett kliniskt
diagnostiskt laboratorium av utbildad personal som testar DNA som utvunnits ur formalinfixerad
paraffininbäddad vävnad.
Dessa bruksanvisningar kan hämtas på
http://world.transgenomic.com/files/literature/482504-SV.pdf
1.2 Indikationer för ACE Kits
Kliniker kan använda ACE Kits CE IVD följt av fragmentstorleksbestämning på ett mikrofluidiskt
kapillärelektroforessystem för att underlätta fastställande av om en patients tumör kommer att svara
på behandling eller ej. Var god läs i det specifika kapitlet för varje analys.
ACE Kits CE IVD får inte användas för diagnos av lungcancer, kolorektal cancer, bröstcancer eller
någon annan form av cancer.
ACE Kits CE IVD är analyser som detekterar och bekräftar förekomst av specifika somatiska
mutationer i BRAF- och EGFR- generna. Deletioner i EGFR exon 19 detekteras av denna analys
men bekräftas inte. För att bestämma exakt deletion i EGFR exon 19 krävs ytterligare analys,
t.ex. DNA-sekvensering.
kliniska faktorer bör beaktas. Resultat som erhålls med ACE Kits CE IVD bör inte vara den enda
metod som används för att besluta om behandling av patienter med lungcancer, kolorektal
cancer eller bröstcancer.
Det är viktigt att notera att användning av ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem för att identifiera
mutationer med dessa kit endast är specifikt för de mutationer som kan upptäckas. Andra
mutationer i omgivande kodoner upptäcks inte med dessa kit.
Sid 53
Denna allelspecifika analys ger en hög känslighet för mutationsdetektion och därför bör dessa
bruksanvisningar, instruktioner för hantering av lösningar samt analysprotokoll följas för att minimera
risken för kontamination. Kitet bör endast hanteras i ett område som anses fritt från DNAkontaminanter.
1.3 Beställningsinformation
Produktnum
mer
Produktnamn
Storlek
ACE Kits
714150
ACE™ KIT EGFR Exons 18 and 20 CE IVD
100 reaktioner
714160
ACE™ KIT EGFR Exons 19 and 21 CE IVD
100 reaktioner
714120
ACE™ KIT BRAF Exon 15 CE IVD
100 reaktioner
1.4 Härledning av kittets kontrollsubstanser
De kontroller som medföljer dessa kit är plasmidkloner av relevanta gensekvenser för BRAF eller
EGFR. Alla kloner har sekvenserats för att verifiera sekvensens överensstämmelse genom jämförelse
med NCBI-referenssekvenser: NG_007873.2, NG_007726.3 och NG_012113.2.
Alla kontroller i detta kit måste hanteras isolerade från genomisk provberedning för att
förhindra korskontamination.
Om du har ytterligare frågor eller behöver hjälp kan du kontakta (888) 2339283 (endast Nordamerika),
+1 (402) 4525400 eller +44 (0) 141 892 8800 (Europa) och begära "support". Du kan även skicka epost till support@transgenomic.com. Skriv "ACE Kit Support" i ämnesraden.
Ytterligare detaljer om kontrollernas DNA-sekvenser finns i avsnitten Användning
kontrollplasmid-DNA i respektive kapitel för den ACE Kit som testas i laboratoriet.
1.5 ACE Kit-komponenter
Antal rör i kitet
Katalog
Nummer
703310
Komponent
ACE
Kit
BRAF
Exon
15
ACE Kit EGFR
Exons 19 & 21
ACE Kit EGFR
Exons 18 & 20
Genomskinligt
1
1
1
Vitt
1
1
1
Genomskinligt
Blått
Grönt
Blått
Blått
Blått
Grönt
1
1
1
-
1
1
1
1
1
1
-
Färg på
rörets lock
703065
707251
707244
707551
707552
707553
707545
DNA Polymerase 250 U
DNA Polymerase 10X PCR
Buffer
dNTPs (10 mM)
ACE BRAF Primer Mix
BRAF ab Mix
Primer Mix 1(EGFR Ex 19 Del)
Primer Mix 2 (EGFR L858R)
Primer Mix 3 (EGFR L861Q)
EGFR Ex 19 ab
707543
EGFR Ex 21 ab L858R
Grönt
-
1
-
707544
EGFR Ex 21 ab L861Q
ACE EGFR (Exon 18) Primer
Mix
EGFR Ex 18 ab G719
ACE EGFR Exon 20 Primer
Mix
EGFR Ex 20 ab T790M
Grönt
-
1
-
Blått
-
-
1
Grönt
-
-
1
Blått
-
-
1
Grönt
-
-
1
703315
707652
707642
707651
707641
Sid 54
av
1.6 Antal prover som kan testas med ett ACE-kit
Alla ACE-kit är utformade för att genomföra sammanlagt 100 reaktioner. Det totala antalet
reaktioner och det antal prover som kan testas beror på antalet exoner som testas och på den
genomsnittliga satsstorleken hos de prover som testas vid varje tillfälle. Detta beror på att en
uppsättning kontroller måste testas i varje provomgång.
1.7 Övrig nödvändig utrustning och reagenser som krävs för ACE Kits
Ytterligare komponenter och utrustning som behövs för att använda ACE Kits innefattar följande:
Mikrofluidiskt kapillärelektroforesinstrument, t.ex. Caliper LabChip MultiDX
Mikrofluidiska kapillärelektroforesbuffrar och -lösningar
Lämpligt DNA-chip för mikrofluidisk kapillärelektrofores (t.ex. DNA1000 för Caliper LabChip Multi
Dx-instrument)
Vatten för molekylärbiologi
0,2 ml-PCR rör, remsor eller platta med 96 brunnar
Mikropipetter
Pipettspetsar
Isbad
Vortexblandare
Mikrocentrifug
Termocykler
10% blekmedel eller liknande rengöringsmedel
1.8 Reagensberedning för ACE Kits
Alla reagenser som ingår i dessa kit är användningsklara. En del komponenter behöver tinas upp,
vortexblandas eller centrifugeras i en mikrocentrifug före användning. Ytterligare information finns i
avsnittet Analysprocedur, nedan. Reagenser behöver kombineras för att producera Master Mixblandningar och reaktionsblandningar. En fullständig beskrivning ges under Analysprocedur
nedan.
1.9 Förvaring och hållbarhet efter första användningen av ACE Kits
Kittet ska förvaras vid -18 ºC till -25 °C i en frys med konstant temperatur (d.v.s. utan
avfrostningscykel) tills de ska användas. Notera utgångsdatumet för varje kit som tas emot.
Använd inte kittet efter passerat utgångsdatum.
1.10 Varningar och försiktighetsåtgärder för ACE Kits
Ingen av reagenserna i dessa kit utgör en hälsorisk i de kvantiteter som förekommer.
Transgenomics materialsäkerhetsblad för vart och ett av dessa kit kan laddas ner från följande
webbplats http://world.transgenomic.com/files/literature/714000-SV.pdf.
Det finns inga ämnen i dessa kit med animaliskt eller humant ursprung som innebär en
infektionsrisk.
Dessa kit får endast användas av personer som har utbildats i korrekta laboratorietekniker. Använd
alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och ögonskydd vid arbete med komponenterna i
detta kit.
Vidare måste dessa kit användas i en lokal som är fri från potentiell DNA-kontamination.
Efter användningen ska kittets komponenter kasseras som sjukvårdsavfall och enligt lokala lagar
och föreskrifter.
Alikvoter av reagenser som pipetterats från rören i dessa kit är endast avsedda för engångsbruk.
Komponenterna i dessa kit har validerats som fortfarande stabila efter 20 upptiningscykler. Använd
inte dessa kit om antalet upptiningscykler har överskridits.
1.11 Förberedande provtagning, hantering och förvaring av ACE Kits
Alla ACE Kits har validerats för användning med DNA som extraherats från formalinfixerade
paraffininbäddade tumörprover som är lämpliga enligt avsnittet "Indikationer för användning" för
varje enskilt kit. För optimal DNA-extraktion ska vävnaden fixeras i formalin i 14-24 timmar innan den
bäddas in i paraffin.
Tumörbiopsier är en heterogen blandning av tumörceller och icke-tumörceller. Vidare är själva
tumörcellen en heterogen blandning av tumörceller med mutationer och tumörceller utan mutationer.
Eftersom dessa somatiska mutationer kanske inte är jämnt fördelade i tumören, kan analysresultaten
från olika sektioner i samma tumör skilja sig åt. För att öka möjligheten att upptäcka en mutation, bör
DNA från vävnadens tumörregion isoleras genom att endast tumörområdet skrapas från objektglaset
med en ny, steril skalpell för varje nytt objektsglas.
För att uppfylla viktiga värden avseende kvalitetskontroll för att framgångsrikt använda dessa kit, ska
extraherat DNA uppfylla följande standarder:
1. UV-spektrofotometri (t.ex. uppmätt med NanoDrop®-instrument eller en UV-spektrofotometer
med mikrokyvetter) kan användas för att avgöra DNA-koncentrationen. Eftersom DNA som
isolerats från FFPE-vävnader kan vara ytterst fragmenterad bör denna koncentration
användas som en vägledning och kommer inte nödvändigtvis att korrekt fastställa mängden
"amplifierbar" DNA i ett prov.
o
260/280 nm absorptionsförhållandet ska vara >1,80
o
Varje provs templatkoncentration ska vara utspädd till 12,5 ng/µl. Sammanlagt
används 25 ng per PCR.
2. En alternativ metod för att fastställa amplifierbart DNA är att använda en qPCR-analys.
Denna qPCR-analys bör ge amplikoner i storleksområdet 100–130 bp.
Extraherade DNA-prover som inte används för omedelbar analys med dessa kit ska förvaras vid 20 ºC till -80 ºC
Sid 56
1.12 Somatisk mutationsdetektion med ACE - en översikt
Figur 1:
Mutationsdetektion med ACE Kit omfattar tre steg:
Steg 1: Isolera genomisk DNA
Steg 2: PCR‐amplifiera prov‐DNA
Steg 3: Storleksbaserad mutationsbekräftelse med mikrofluidisk kapillärelektrofores
Steg 1 – Isolera tillräcklig genomisk DNA av hög kvalitet från lämpliga FFPE-vävnadssnitt.
Steg 2 – Amplifiera proverna tillsammans med kittets positiva kontroll med användning av
medföljande ACE primermix för de genetiska regioner som undersöks.
Steg 3 - Analysera DNA-fragmenten med ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem.
Uppkomsten av specifika toppar efter PCR-amplifiering kommer att indicera exakt mutation i
provet för BRAF och EGFR exoner 18, 20 och 21. Beträffande de deletioner som detekteras i
EGFR exon 19, kan själva deletionen upptäckas men inte den exakta DNA-sekvensen.
1.13 Fragmentstorleksbestämning av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar
med mikrofluidisk kapillärelektrofores
1.13.1 Exempel med användning av ett Caliper LabChip-instrument
Caliper LabChip-systemet ställs in, körs och analyseras enligt bruksanvisningen. Tillhörande
Caliper LabChip Software används för granskning av data, bearbetning av elektroferogram och för
att generera rapporter.
Obs! Endast de specifika mutationerna i varje kit kan detekteras med dessa analyser.
Mutationer i andra kodoner detekteras inte av ACE-analyserna. Vidare upptäcker ACE Kit
EGFR Exon 19 deletioner i EGFR exon 19, men kittet kan inte särskilja den exakta
sekvensnivån.
1.13.2 Procedur för mutationsbestämning med ACE Kit
Förbered laboratoriets mikrofluidiska kapillärelektroforessystem enligt anvisningar i tillverkarens
bruksanvisning till instrumentet. (Läs även i HT DNA-anvisningarna till 1K-analysen för Caliper
LabChip MultiDX-instrumentet).
1. Säkerställ att ACE Kit PCR nedbrytningsprodukter är i en platta som är godkänd för
användning på instrumentet.
2. Öppna instrumentets programvara och välj lämpliga kommandon för att starta analysen
när chip, reagenser och prover har laddats korrekt i instrumentet.
3. Börja körningen när plattan och instrumentet har ställts in och alla parametrar är klara.
4. Utför rengöring och förvaring av materialen enligt beskrivning i tillverkarens anvisningar
när körningen är klar.
1.14 Granskning av mikrofluidiska kapillärelektroforesdata
Inspektera den virtuella gelbilden och elektroferogrammen som är specifika för varje kit för att
avgöra förekomst av en specifik mutation eller deletion. Läs i ifrågavarande kapitel beträffande
exempel på analyser med Caliper LabChip mikrofluidisk kapillärelektroforesplattform. För exempel
på resultat av mikrofluidisk kapillärelektrofores med användning av en Caliper LabChip-plattform,
läs i Kapitel 5 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Caliper LabChip
instrument.
Kapitel 2 ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD
2.1 Indikationer för användning av ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD
Endast för yrkesmässig användning. Kliniker kan använda Transgenomics ACE (Allele Specific
PCR Enrichment) Kit BRAF Exon 15 CE IVD följt av fragmentstorleksbestämning på ett
mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem för att avgöra om en patients tumör kommer att svara på
Vemurafenib (Zelboraf®) som är godkänt för behandling av melanom som är positiva
förBRAF V600-mutation. ACE Kit Exon 15 CE IVD får inte användas för diagnos av hudcancer
eller någon annan form av cancer.
ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD är en analys som detekterar och bekräftar förekomst av V600E
(Val600Glu), V600E2 (Val600Glu) och V600K (Val600Lys) somatiska mutationer i BRAF-genen.
kliniska faktorer bör beaktas. Resultat som erhålls med ACE Kit BRAF Kit Exon 15 CE IVD bör
inte vara den enda metod som används för att besluta om behandling av patienter med
metastaserande melanom.
Det är viktigt att notera att användning av ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem för att
identifiera mutationer med dessa kit endast är specifikt för de mutationer som kan upptäckas.
Andra mutationer i omgivande kodoner upptäcks inte med dessa kit.
bruksanvisningar, procedurer och analysprotokoll följas för att minimera risken för kontamination.
Detta kit bör endast hanteras i ett område som anses fritt från DNA-kontaminanter.
2.2 Principer för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD
BRAF-genen kodar en medlem i Raf kinas-familjen och ingår i RAS-RAF signalbanan och är en
aktivator av MEK och ERK. Valinen vid position 600 i exon 15 i BRAF-proteinet är det aktiverande
segmentet i kinasdomänen. Mutationer som orsakar aminosyrabyte i denna valin orsakar ökningar
i BRAF kinasaktivitet och i transformationen av celler in vivo.
BRAF V600-mutationer återfinns i 8% av cancerpatienterna och anses, i likhet med KRASmutationer, vara självaktiverande vilket leder till en bristande respons på tyrosinkinashämmare
såsom cetuximab (Erbitux®) och panitumumab (Vectibix®)1. BRAF V600-mutationer återfinns i 40 60% av alla melanom.
Den vanligaste mutationen är V600E (Val600Glu), ett aminosyrabyte från valin till glutaminsyra.
Tillsammans med V600E2(Val600Glu)- och V600K-mutationen (Val600Lys), är V600E ett mål för
läkemedlet vemurafenib (Zelboraf®) som har godkänts för behandling av melanom2,3. V600E and
V600E2 är de beteckningar som Transgenomic använder för att skilja de två olika mutationerna
som leder till samma aminosyrabyte.
På grund av att dessa analyser har en hög sensitivitet, rekommenderas att laboratoriets
installation är optimerad för att undvika korskontamination av prover eller kontroller. Ett exempel
på ett idealiskt laboratoriearrangemang finns i Bilaga A–Laboratorieinst-llation för PCRanalyser.
Sid 58
2.3 Den allelspecifika PCR Primer-analys som används i ACE Kit BRAF Exon
15 CE IVD
Denna multiplexa allelspecifika PCR kommer att amplifiera BRAF Wild-Type, V600E (c.1799T>A),
V600E2 (c.1799_1800TG>AA) samt V600K (c.1798_1799GT>AA) vilket ger amplikonstorlekar om
132 bp, 112 bp, 122 bp respektive 103 bp. Denna allelspecifika längdskillnad i PCR-produkter kan
användas för att analysera prover i ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem.
BRAF Primer Mix har fyra primrar: en enkel framåtriktad primer och fyra bakåtriktade primrar. Var
och en av de fyra bakåtriktade primrarna är specifika för en allel – Wild-Type, V600E, V600E2 och
V600K.
Figur 1 Översikt av BRAF allelspecifik PCR-analys
V600 WT
BRAF Positive Control
V600K
V600E
BRAF Primer Mix
bestående av:
Blandning av WildType och BRAF V600K
V600E2
Blandning av WildType och BRAF V600E
allelspecifika primrar plus
"svansar" för
storleksavskiljning +
När det allelspecifika termocyklerprogrammet är klart analyseras produkterna på ett mikrofluidiskt
kapillärelektroforessystem, t.ex. Caliper LabChip MultiDX.
!
Obs! För att framgångsrikt använda detta kit rekommenderar vi att du läser igenom den
här handboken och noggrant följer alla instruktioner och riktlinjer. Nya användare bör
utföra de kontrollexperiment som beskrivs i avsnittet 2.5 Användning av BRAF
kontrollplasmid-DNA för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD.
Vidare krävs att användarna arbetar i DNA-arbetsstationer eller andra områden
som kan rengöras ytterst noga för att minimera DNA-kontamination av
reaktionerna.
Läs i Bilaga A–Laboratorieinstallation för PCR-analyser.
2.4 Stegvisa instruktioner för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD
2.4.1 Att tänka på avseende templat
Obs! Användning av en PCR-arbetsstation med UV-lampa och HEPA-filter rekommenderas
starkt.
Alla ytor eller utrustningar som kommer att användas vid denna ACE-analys bör rengöras
med en lösning som kommer att förstöra DNA som kan förekomma på sådana ytor. Det
finns många lösningar som dekontaminerar DNA från laboratorieytor; dock fungerar de flesta
av dessa inte för att förstöra DNA-fragment under 500 bp5. Om laboratoriet arbetar med
DNA som isolerats från FFPE-sektioner bör ytor och utrustning dekontamineras med en
10% blekmedelslösning som bereds varje vecka.
Obs! Kontrollera att korrekt personlig skyddsutrustning används vid hantering av
blekmedelslösningar. Läs i lokala säkerhetsrutiner för laboratoriet.
Kvaliteten på extraherat templat-DNA som ska testas bör ha följande egenskaper:
1. Koncentrationen ska vara ≥ 12,5 ng/µl.
2. A260/280-förhållandet ska vara ≥ 1,8.
2.4.2 Allelspecifikt PCR-protokoll för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD
1.
dNTPs-lösningen tillhandahålls med en koncentrationsgrad av 10 mM total
deoxinukleotid (2,5 mM av var och en av de fyra deoxinukleotiderna).
2.
BRAF-primrarna är en enstaka, förblandad lösning som innehåller en universell
framåtriktad primer och 4 allelspecifika bakåtriktade primrar för specifik amplifiering av
Wild-Type, V600E2, V600E och V600K-mutationer.
3.
Ta upp BRAF Primer Mix, dNTPs, 10X PCR Buffer, DNA Polymerase samt BRAF
Positive Control ur frysen och tina på is. Vortexblanda var och en efter upptining i 5 10 sekunder och centrifugera därefter rören under en kort stund för att säkerställa att
ingen reagens finns kvar på rörens lock eller på sidorna.
4.
Placera återigen alla rören på is.
5.
Förbered Master Mix-blandningen på is.
6.
Använd följande tabell som en guide för beredning av Master Mix för 10 (tio)
reaktioner:
Antal reaktioner: (8 prover + 2 kontroller)
10
Volymberäkning
Vattenvolym (µl)
10X PCR Buffer (µl)
dNTPs (µl)
BRAF Primer Mix (µl)
335,0
50,0
40,0
50,0
5
480,0
Sid 60
!
7.
Beräkna nödvändiga volymer för alla angivna Master Mix-blandningar med användning
av ovanstående tabell. OBS!
a. Ytterligare två reaktioner kommer att behövas för BRAF Positive Control samt för
BRAF kontroll utan templat.
Obs! Beakta att en Master Mix-volym som är något större är denna beräkning krävs
8.
Märk 0,2 ml PCR-rör eller brunnar i en 96-hålsplatta med lämplig provinformation.
9.
Märk 2,0 ml centrifugeringsrör för beredning av Master Mix-blandning.
10. Tillför nödvändig mängd molekylärbiologiskt vatten till Master Mix-röret.
11. Tillsätt nödvändig mängd 10X PCR Buffer till Master Mix-röret.
12. Tillsätt nödvändig mängd dNTPs-lösning till Master Mix-röret.
13. Tillsätt nödvändig mängd BRAF Primer Mix till Master Mix-röret.
14. Centrifugera DNA Polymerase-röret i cirka 10 sekunder.
15. Knacka försiktigt på DNA Polymerase-röret för att blanda innehållet.
16. Centrifugera återigen DNA Polymerase-röret i cirka 10 sekunder.
17. Tillsätt nödvändig mängd DNA Polymerase till Master Mix-rören. För inte ner
pipettspetsen hela vägen ner i polymerasröret; den ska föras ner till strax under
enzymlösningens yta. Detta förhindrar förlust av enzym som annars skulle fastna på
pipettrörets plastyta.
18. Förslut Master Mix-röret.
19. Vortex-blanda Master Mix-röret i cirka10 sekunder före användning.
20. Förvara på IS tills det används.
21. Centrifugrea ner Master Mix-röret före alikvotering för att avlägsna eventuell lösning
från rörets sidor eller lock.
22. Pipettera 48,0 µl Master Mix i lämpliga brunnar eller rör och byt pipettspets om du
använder en pipett med en kanal. Se till att det inte spiller/stänker mellan hålen om en
23. ENDAST EFTER DET ATT STEG 22 HAR FULLBORDATS FÅR KITTETS POSITIVA
KONTROLL-DNA ÖPPNAS. Tillsätt 2,0 µl vatten (kontroll utan templat) till passande
brunn eller rör. När pipettering av kontroll utan templat är klar, ska brunnen förslutas
med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller sätt lock på 0,2 ml
PCR-röret. Se till att proppen sluter till ordentligt.
24. Tillsätt 2,0 µl av varje provtemplat-DNA som ska vara tinad (om DNA har förvarats
frusen), vortexblandad och centrifugerad, till lämpliga brunnar. När provpipetteringen är
klar, slut till alla brunnar med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta)
eller sätt på proppar på 0,2 ml PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt.
25. Tillsätt 2,0 µl BRAF Positive Control till passande brunn eller rör. När
kontrollpipetteringen är klar, slut till alla brunnar med remsor med 8 proppar (om du
använder en 96-hålsplatta) eller sätt på proppar på 0,2 ml PCR-rören. Se till att
27. Centrifugera 0,2 ml PCR-rören eller plattorna.
Inspektera plattorna eller 0,2 ml PCR-rören. Kontrollera att vätskan är på botten av brunnen.
Centrifugera återigen i annat fall.
Sid 61
2.4.3 Termocyklerprogram för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD
1. Använd följande termocyklerprotokoll för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD allelspecifik
PCR:
95 C
5 minuter
Amplifiering
38 cykler
95 C
30 sekunder
61 C
45 sekunder
72 C
25 sekunder
Sista förlängning
72 C
1 cykel
2 minuter
Förvaring
≤12 C
Vänta
2. Säkerställ att den totala programtiden är 2 timmar och 10 minuter, detta motsvarar
rampningstiden 1,5 ºC/sekund.
vecka.
3. Analysera
lämplig
mängd
på
det
mikrofluidiska
kapillärelektroforesinstrumentet.
4. För analys med ett Caliper LabChip MultiDX-instrument: överför 10 µl av varje PCR till en
platta med 96 brunnar, tillsätt 15 µl vatten, blanda på instrumentet.
2.5 Användning av BRAF kontrollplasmid-DNA för ACE Kit BRAF Exon 15
CE IVD
Detta kit tillhandahålls med en BRAF positiv kontroll för BRAF. Denna består av plasmider med
insatser. Den positiva kontrollen innehåller: en blandning av Wild-Type-klon och tre
mutationskloner (V600E, V600E2 samt V600K).
Följ anvisningarna i det allelspecifika PCR-protokollet för att använda denna kontroll.
VI REKOMMENDERAR STARKT ATT NYA ANVÄNDARE FÖRST UTFÖR EXPERIMENTEN
MED ENBART KONTROLLSUBSTANSEN INNAN TESTNING GÖRS PÅ GENOMISKA
PROVER
2.6 Storleksfraktionering för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD
2. Analysera de resulterande elektroferogrammen och virtuella gelbilderna för att avgöra
vilka prover som har mutationer.
3. För exempel på resultat av mikrofluidisk kapillärelektrofores med användning av en
Caliper LabChip-plattform, läs i Kapitel 5 Analys och tolkning av Fragment
Dimensionering Använda Caliper LabChip instrument.
Sid 62
Kapitel 3 ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD
Kapitel 3 ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE
3.1 Indikationer för användning av ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD
Endast för yrkesmässig användning. Kliniker kan använda Transgenomics ACE (Allele Specific
PCR Enrichment) Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD följt av fragmentstorleksbestämning på ett
mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem för att underlätta fastställande av om patient med icke
småcellig lungcancer kommer att svara EGFR tyrosinkinashämmare (TKI) såsom erlotinib
(Tarceva) och gefitinib (Iressa). ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD får inte användas för
diagnos av lungcancer eller någon annan form av cancer.
ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD är en analys som detekterar och bekräftar förekomst av
somatiska mutationer i exon 21 L858R och L861Q samt deletioner i exon 19 i EGFR-genen. Alla
deletioner som är större än 9 bp samt komplexa mutationer i EGFR exon 19 detekteras men kan
inte sekvensbestämmas av dessa analyser. Specifikt fastställande av exakt exon 19-deletion
behöver fastställas med DNA-sekvensering.
kliniska faktorer bör beaktas. Resultat som erhålls med ACE Kit EGFR Kit Exons 19 and 21 CE
IVD bör inte vara den enda metod som används för att besluta om behandling av patienter
med icke småcellig lungcancer (NSCLC).
Det är viktigt att notera att användning av ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem för att
identifiera mutationer eller deletioner med detta kit endast är specifikt för de mutationer eller
deletioner som kan upptäckas. Andra mutationer i omgivande kodoner upptäcks inte med
dessa kit.
Sid 63
3.2 Principer för ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD
EGFR-genen kodar ett transmembrant glykoprotein, epidermal tillväxtfaktorreceptor, och som är
en av cellens proteinkinaser. Den extracellulära domänen hosEGFR binder epidermal tillväxtfaktor
(EGF); bindning av EGF till EGFR leder till dimerisering av EGFR, vilket stimulerar dess
tyrosinfosforyleringsaktivitet vilket orsakar en signalkaskad i MAPK- och AKT-banorna och leder till
cellförökning.
Mutationer i EGFR återfinns i många typer av cancer. Många av dessa mutationer orsakar
aktivering av EGFR utan EGF-bindning. Tyrosinkinashämmare (TKI:er) hämmar
mutationsaktiverad EGFR genom att blockera anknutna signalbanor för cellförökning. Det finns två
huvudklasser av TKI:er: (1) monoklonala antikroppshämmare cetuximab (Erbitux®) och
panitumumab (Vectibix®.) som binds vid den extracellulära domänen och (2) små
molekylhämmare, såsom gefitinib (Iressa®) och erlotinib (Tarceva®) som binds vid den interna
kinasdomänen.1-4
Deletioner i EGFR exon 19 och punktmutationer i exon 21 kodoner 858 och 861 är de vanligaste
aktiverande mutationerna vid kolon- och lungcancer1.
Förekomst av mutationer i G719X (G719A, G719C eller G719S) i EGFR exon 18 ger känslighet för
TKI:er.2,3 T790M-mutationen i EGFR exon 20 är den vanligaste mutationen som skapar resistens
mot TKI:er.2,4
Analyserna ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 eller ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD kan
alla utföras under samma PCR-termocykelförhållanden. Läs i Kapitel 5 Analys och tolkning av
Fragment Dimensionering Använda Caliper LabChip instrument.
På grund av att dessa analyser har en hög känslighet, rekommenderas att laboratoriets installation
är optimerad för att undvika korskontamination av prover eller kontroller. Ett exempel på ett
idealiskt laboratoriearrangemang finns i Bilaga A–Laboratorieinstallation för PCR-analyser.
Sid 64
3.3 Amplikonstorleksanalysen som används i ACE Kit for EGFR Exon 19
EGFR Exon 19-analysen amplifierar sekvensen där de flesta deletioner har observerats, nämligen
kodoner 744-761. I prover som saknar deletion kommer en enstaka topp motsvarande WildType , 102 bp, att ses på elektroferogrammet i ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem såsom
Caliper LabChip MultiDX. Om en deletion förekommer syns två toppar: Wild-Type 102-bp-toppen
(från normala celler i biopsiprovet) och en mindre topp som motsvarar deletionen. EGFR Exon 19
Positive Control är den övre änden av deletionsregionen 24 bp varvid den positiva kontrollen
innehåller toppar om 78 bp för 24 bp-deletionen och 102 bp för den deletionsfria (Wild-Typekontrollen).
Specifika deletionskontroller medföljer visserligen detta kit men de bör endast användas som
storleksreferenser. De kan inte användas för att avgöra deletionens exakta natur, eftersom den
specifika storleken hos en detekterad deletion inte beaktar om provets sekvens innehåller en
deletion plus ett tillägg, t.ex. p.L747_A750>P, c.2239_2248TTAAGAGAAG>C.
Provet måste sekvenseras för att fastställa den specifika deletion som detekterats.
På grund av begränsningar i ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem, såsom Caliper LabChip
MultiDX-systemets uppklarningsförmåga, kommer deletioner som är mindre än 9 bp inte att
detekteras; dock är ~99,8% av beskrivna exon 19-deletioner och komplexa mutationer ≥9 bp,
enligt COSMIC.1
Figur 3 Översikt av EGFR Exon 19 storleksbaserad PCR-analys
Exon 19
Wild-Type
Kodoner 744-761
102-bp
PCR Product
Exon 19
15-bp Deletion
p.E746_A750del
78-bp
PCR Product
Analys med mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem
15-bp del
78-bp
WT
102-bp
EGFR Exon 19 Primer Mix
bestående av:
5’ PCR Primer
+
3’ PCR Primer
Sid 65
3.4 Den allelspecifika analysen som används i ACE Kit för EGFR Exon 21
De två allelspecifika PCR-primrarna i detta kit kommer att amplifiera (1) EGFR Wild-Type och L858R
(c.2573T>G) vilket ger amplikonstorlekar om 101 bp respektive 116 bp; och (2) EGFR Wild-Type och
L861Q (c.2582T>A) vilket ger amplikonstorlekar om 138 bp respektive 153 bp. Dessa allelspecifika
längdskillnader i PCR-produkter kan användas för att analysera prover i ett mikrofluidiskt
kapillärelektroforessystem.
EGFR Exon 21 Primer-blandningar har två primrar: (1) för EGFR L858R är det en blandning av två
framåtriktade primrar, en för Wild-Type och en för L858R samt en bakåtriktad primer; och (2) för
EGFR L861Q är det en blandning av en framåtriktad primer och två bakåtriktade primrar, en för WildType och en för L861Q.
Figur 3 Översikt av EGFR Exon 21 L858R och L861Q allelspecifika PCR-analyser
L858R
L858R
Wild-Type
CTG GAC Wild-Type
L858R
CGG GCC Wild-Type
+
L858R
Wild-Type
101 bp
L858R
116 bp
L861Q
L861Q
Wild-Type
CTG
GAC
Wild-Type
L861Q
CAG
GTC
+
EGFR L858 Primer Mix eller EGFR L861
Primer Mix bestående av:
Wild-Type
138 bp
L861Q
153 bp
Allelspecifika primrar plus "svansar" för
storlekssärskiljning;
+
5’ för L861 eller 3’ för L858 PCR-primrar
!
utföra de kontrollexperiment som beskrivs i avsnittet 3.6 Användning av EGFR
kontrollplasmid-DNA.
Vidare krävs att användarna arbetar i DNA-arbetsstationer eller andra områden som
kan rengöras ytterst noga för att minimera DNA-kontamination av reaktionerna.
Läs i Bilaga A–Laboratorieinstallation för PCR-analyser.
3.5 Stegvisa anvisningar för ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD
Analyserna ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD eller ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD
kan alla utföras under samma PCR-termocykelförhållanden. Se Kapitel 6 Analys av alla ACE Kit
EGFR-analyser.
starkt.
Alla ytor eller utrustningar som kommer att användas vid denna ACE-analys bör rengöras med
en lösning som kommer att förstöra DNA som kan förekomma på sådana ytor. Det finns många
lösningar som dekontaminerar DNA från laboratorieytor; dock fungerar de flesta av dessa inte
för att förstöra DNA-fragment under 500 bp. Om laboratoriet arbetar med DNA som isolerats
från FFPE-sektioner bör ytor och utrustning dekontamineras med en 10% blekmedelslösning
som bereds varje vecka.
Obs! Kontrollera att korrekt personlig skyddsutrustning används
vid
hantering
av
3.5.2
Allelspecifikt och
Exons 19 and 21
storleksbaserat
PCR-protokoll
för
ACE
Kit
EGFR
1.
dNTPs-lösningen tillhandahålls med en koncentrationsgrad av 10 mM total deoxinukleotid
(2,5 mM av var och en av de fyra deoxinukleotiderna).
2.
EGFR-primrarna är förblandade singellösningar som innehåller:
a. en universell framåtriktad primer och en universell bakåtriktad primer för specifik
amplifiering av alla deletioner och komplexa mutationer i EGFR exon 19.
b. en universell bakåtriktad primer och allelspecifika framåtriktade primrar för specifik
amplifiering av EGFR exon 21 Wild-Type samt L858R-mutationen.
c.
3.
en universell framåtriktad primer och allelspecifika bakåtriktade primrar för specifik
amplifiering av EGFR exon 21 Wild-Type samt L861Q-mutationen.
Ta upp lämplig Primer Mix, dNTPs, 10X PCR Buffer, DNA Polymerase samt lämpliga
positiva kontroller ur frysen och tina på is. Vortexblanda var och en efter upptining i 5 - 10
sekunder och centrifugera därefter rören under en kort stund för att säkerställa att ingen
reagens finns kvar på rörens lock eller på sidorna.
a. Det finns tre Master Mix-blandningar när ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVDanalyserna genomförs:
4.
i.
EGFR exon 19-deletioner
ii.
EGFR exon 21 L858R
iii.
EGFR exon 21 L861Q
Placera alla rören på is.
Sid 67
!
5.
Använd följande tabell som en guide för beredning av Master Mix för 10 (tio) reaktioner
för varje analys:
Antal reaktioner: (8 prover + 2 kit-kontroller)
10
Volymberäkning
Vattenvolym (µl)
dNTPs (µl)
Lämplig EGFR Exon Primer Mix (µl)
6.
335,0
50,0
40,0
50,0
5
480,0
Beräkna nödvändiga volymer för alla angivna Master Mix-blandningar med användning
av ovanstående tabell. OBS!
a. För ovanstående Master Mix-blandningar som beskrivs i steg 3, kommer
ytterligare två reaktioner att behövas:
i. En positiv kontroll för varje specifik reaktion.
ii. En kontroll utan templat för varje specifik reaktion.
7.
Bered lämpliga Master Mix-blandningar som beskrivs i steg 3 och lägg alla rör på is.
8.
9.
10.
Tillför nödvändig mängd molekylärbiologiskt vatten till Master Mix-röret.
11.
Tillsätt nödvändig mängd 10X PCR Buffer till Master Mix-röret.
12.
Tillsätt nödvändig mängd dNTPs-lösning till Master Mix-röret.
13.
Tillsätt nödvändig mängd av lämplig Primer Mix till Master Mix-röret.
14.
Centrifugera DNA Polymerase-röret i cirka 10 sekunder.
15.
Knacka försiktigt på DNA Polymerase-röret för att blanda innehållet.
16.
Centrifugera återigen DNA Polymerase-röret i cirka 10 sekunder.
17.
Tillsätt nödvändig mängd DNA Polymerase till Master Mix-rören. För inte ner
18.
Förslut Master Mix-röret.
19.
Vortex-blanda Master Mix-röret i cirka10 sekunder före användning.
20.
Förvara på IS tills det används.
21.
Centrifugrea ner Master Mix-röret före alikvotering för att avlägsna eventuell lösning
från rörets sidor eller lock.
22.
Pipettera 48,0 µl Master Mix i lämpliga brunnar eller rör och byt pipettspets om du
23.
ENDAST EFTER DET ATT STEG 22 HAR FULLBORDATS FÅR KITTETS POSITIVA
brunn eller rör. När pipettering av kontroll utan templat är klar, ska brunnen förslutas
Sid 68
med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller sätt lock på 0,2 ml
PCR-röret. Se till att proppen sluter till ordentligt.
24.
Tillsätt 2,0 µl av varje provtemplat-DNA som ska vara tinad (om DNA har förvarats
frusen), vortexblandad och centrifugerad, till lämpliga brunnar. När provpipetteringen är
klar, slut till alla brunnar med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta)
eller sätt på proppar på 0,2 ml PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt.
25.
Tillsätt 2,0 µl lämplig positiv kontroll till lämplig brunn. När kontrollpipetteringen är klar,
slut till alla brunnar med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller
sätt på proppar på 0,2 ml PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt.
26.
Vortexblanda (~1/2 hastighet) i 10 sekunder.
27.
Centrifugera 0,2 ml PCR-rören eller plattorna.
28.
Inspektera plattorna eller 0,2 ml PCR-rören. Kontrollera att vätskan är på botten av
brunnen. Centrifugera återigen i annat fall.
3.5.3 Termocyklerprogram för allelspecifikt PCR-protokoll
1.
Använd följande termocyklerprotokoll för ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD eller
ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD PCR.
2.
Säkerställ att den totala programtiden är 2 timmar och 10 minuter, detta motsvarar
95 C
5 minuter
Amplifiering
38 cykler
95 C
30 sekunder
61 C
30 sekunder
72 C
25 sekunder
Sista förlängning
1 cykel
72 C
2 minuter
Förvaring
≤12 C
Vänta
TIPS: I det här stadiet kan PCR-produkter förvaras vid -20 ºC eller kallare i upp till
en vecka.
3. Analysera lämplig mängd på det mikrofluidiska kapillärelektroforesinstrumentet.
a. För analys med ett Caliper LabChip MultiDX-instrument: överför 10 µl av varje
PCR till en platta med 96 brunnar, tillsätt 15 µl vatten, blanda noga och ladda
på instrumentet.
Sid 69
3.6 Användning av EGFR kontrollplasmid-DNA
ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD tillhandahålls med lämpliga positiva kontroller för analys
av EGFR exon 19-deletioner, EGFR Exon 21 L858R- eller L861Q-mutationer. Dessa består av
plasmider med tillägg. De positiva kontrollerna innehåller blandningar av Wild-Type- och muterade
sekvenser eller regioner som interrogeras av varje analys.
PROVER
2. Analysera de resulterande elektroferogrammen och de virtuella gelbilderna för att avgöra
3. För exempel på resultat av mikrofluidisk kapillärelektrofores med användning av en Caliper
LabChip-plattform, läs i Kapitel 5 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering
Använda Caliper LabChip instrument.
4.1 Indikationer för användning av ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD
Endast för yrkesmässig användning. Kliniker kan använda Transgenomics ACE (Allele Specific PCR
Enrichment) Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD följt av fragmentstorleksbestämning på ett
mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem för att underlätta fastställande av om patient med icke
småcellig lungcancer kommer att svara EGFR tyrosinkinashämmare (TKI) såsom erlotinib (Tarceva®)
och gefitinib (Iressa®). ACE EGFR Exons 18 and 20 CE IVD får inte användas för diagnos av
lungcancer eller någon annan form av cancer.
ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD är analyser som detekterar och bekräftar förekomst av
somatiska mutationer i exon 18 G719X och exon 20 T790M i EGFR-genen.
kliniska faktorer bör beaktas. Resultat som erhålls med ACE Kit EGFR Kit Exons 18 and 20 bör inte
vara den enda metod som används för att besluta om behandling av patienter med icke
småcellig lungcancer (NSCLC).
Det är viktigt att notera att användning av ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem för att identifiera
mutationer eller deletioner med detta kit endast är specifikt för de mutationer eller deletioner som kan
upptäckas. Andra mutationer i omgivande kodoner upptäcks inte med dessa kit.
Sid 70
4.2 Principer för ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD
EGFR-genen kodar ett transmembrant glykoprotein, epidermal tillväxtfaktorreceptor, och som är en
av cellens proteinkinaser. Den extracellulära domänen hosEGFR binder epidermal tillväxtfaktor
(EGF); bindning av EGF till EGFR leder till dimerisering av EGFR, vilket stimulerar dess
tyrosinfosforyleringsaktivitet vilket orsakar en signalkaskad i MAPK- och AKT-banorna och leder till
cellförökning.
Mutationer i EGFR återfinns i många typer av cancer. Många av dessa mutationer orsakar aktivering
av EGFR utan EGF-bindning. Tyrosinkinashämmare (TKI:er) hämmar mutationsaktiverad EGFR
genom att blockera anknutna signalbanor för cellförökning. Det finns två huvudklasser av TKI:er: (1)
monoklonala antikroppshämmare cetuximab (Erbitux®) och panitumumab (Vectibix®.) som binds vid
den extracellulära domänen och (2) små molekylhämmare, såsom gefitinib (Iressa®) och erlotinib
(Tarceva®) som binds vid den interna kinasdomänen.1-4
Deletioner i EGFR exon 19 och punktmutationer i exon 21 kodoner 858 och 861 är de vanligaste
aktiverande mutationerna i kolon- och lungcancer.1
Förekomst av mutationer i G719X (G719A, G719C eller G719S) i EGFR exon 18 ger känslighet för
TKI:er.2,3 T790M-mutationen i EGFR exon 20 är den vanligaste mutationen som skapar resistens mot
TKI:er.2,4
På grund av att dessa analyser har en hög sensitivitet, rekommenderas att laboratoriets installation är
optimerad för att undvika korskontamination av prover eller kontroller. Ett exempel på ett idealiskt
laboratoriearrangemang finns i Bilaga A–Laboratorieinstallation för PCR-analyser.
Sid 71
4.3 G719 allelspecifik analys som används i ACE Kit för EGFR Exon 18 and 20
CE IVD
Denna multiplexa allelspecifika PCR kommer att amplifiera EGFR Wild-Type-, G719A (c.2156G>C)-,
G719C (c.2155G>T)- samt G719S (c.2155G>A)-sekvenser vilket ger amplikonstorlekar om 93 bp,
103 bp, 112 bp respektive 121 bp. Denna allelspecifika längdskillnad i PCR-produkter kan användas
för att analysera prover i ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem.
EGFR Exon 18 Primer Mix har fem primrar: en framåtriktad primer och fyra bakåtriktade primrar. Var
och en av de fyra bakåtriktade primrarna är specifika för en allel – Wild-Type, G719A, G719C samt
G719S.
Figur 5 Översikt av EGFR Exon 18 G719 allelspecifik PCR-analys
EGFR Positive Control
G719A
G719C
Blandning av Wild-Type
och EGFR G719A
G719S
WT
Blandning av Wild-Type
och EGFR G719C
EGFR G719 Primer Mix
bestående av:
allelspecifika primrar plus
"svansar" för
storleksavskiljning +
5’ PCR-primer
Sid 72
4.4 T790M allelspecifik analys som används i ACE Kit EGFR Exon 18 and 20
CE IVD
Denna multiplexa allelspecifika PCR kommer att amplifiera EGFR Exon 20 Wild-Type och T790M
(c.2369C>T) vilket ger amplikonstorlekar om 108 bp respektive 124 bp. Denna allelspecifika
längdskillnad i PCR-produkter kan användas för att analysera prover i ett mikrofluidiskt
kapillärelektroforessystem.
EGFR Exon 18 Primer Mix har fem primrar: en framåtriktad primer och fyra bakåtriktade primrar. Var
och en av de fyra bakåtriktade primrarna är specifika för en allel – Wild-Type and T790M.
Figur 6 Översikt av EGFR Exon 20 T790M allelspecifik PCR-analys
EGFR T790 Primer Mix bestående av:
allelspecifika primrar plus "svansar"
för storleksavskiljning
+
5’ PCR-primer
När det allelspecifika termocyklerprogrammet är klart analyseras produkterna på ett mikrofluidiskt
kapillärelektroforessystem, t.ex. Caliper LabChip MultiDX.
!
utföra de kontrollexperiment som beskrivs i avsnittet 4.6 Användning av lämplig EGFR
kontroll-DNA-plasmid.
Vidare krävs att användarna arbetar i DNA-arbetsstationer eller andra områden som
kan rengöras ytterst noga för att minimera DNA-kontamination av reaktionerna.
Läs i Bilaga A – Laboratorieinstallation för PCR-analys beträffande förslag till
laboratoriearrangemang.
Sid 73
!
4.5 Stegvisa anvisningar för ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD
Analyserna ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD eller ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD
kan alla utföras under samma PCR-termocykelförhållanden. Se Kapitel 6 Analys av alla ACE Kit
EGFR-analyser.
starkt.
Alla ytor eller utrustningar som kommer att användas vid denna ACE-analys bör rengöras med
en lösning som kommer att förstöra DNA som kan förekomma på sådana ytor. Det finns många
lösningar som dekontaminerar DNA från laboratorieytor; dock fungerar de flesta av dessa inte
för att förstöra DNA-fragment under 500 bp5. Om laboratoriet arbetar med DNA som isolerats
från FFPE-sektioner bör ytor och utrustning dekontamineras med en 10% blekmedelslösning
som bereds varje vecka.
Obs! Kontrollera att korrekt personlig skyddsutrustning används
vid
hantering
av
4.5.2
Allelspecifikt och storleksbaserat
Exons 18 and 20 CE IVD
1.
PCR-protokoll
för
ACE
Kit
EGFR
dNTPs-lösningen tillhandahålls med en koncentrationsgrad av 10 mM total deoxinukleotid
(2,5 mM av var och en av de fyra deoxinukleotiderna).
2.
EGFR-primrarna är förblandade singellösningar som innehåller:
a. en universell framåtriktad primer och 4 allelspecifika bakåtriktade primrar för specifik
amplifiering av EGFR exon 18 Wild-Type samt G719X-mutationer (G719A, G719C
samt G719S).
b. en universell framåtriktad primer och allelspecifika bakåtriktade primrar för specifik
amplifiering av EGFR exon 20 Wild-Type samt T790M-mutationen.
3.
Ta upp lämplig Primer Mix, dNTPs, 10X PCR Buffer, DNA Polymerase samt lämpliga
positiva kontroller ur frysen och tina på is. Vortexblanda var och en efter upptining i 5 - 10
sekunder och centrifugera därefter rören under en kort stund för att säkerställa att ingen
reagens finns kvar på rörens lock eller på sidorna.
a. Det finns två Master Mix-blandningar när ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVDanalyserna genomförs:
4.
i.
EGFR Exon 18 G719X
ii.
EGFR Exon 20 T790M
Placera alla rören på is.
Sid 74
5.
Använd följande tabell som en guide för beredning av Master Mix för 10 (tio) reaktioner för
varje analys:
Antal reaktioner: (8 prover + 2 kit-kontroller)
10
Volymberäkning
Vattenvolym (µl)
dNTPs (µl)
Lämplig EGFR Exon Primer Mix (µl)
6.
335,0
50,0
40,0
50,0
5
480,0
Beräkna nödvändiga volymer för alla angivna Master Mix-blandningar med användning av
ovanstående tabell. OBS!
b. För ovanstående Master Mix-blandningar som beskrivs i steg 3, kommer ytterligare
två reaktioner att behövas:
i. En positiv kontroll för varje specifik reaktion.
ii. En kontroll utan templat för varje specifik reaktion.
OBS! Beakta att en Master Mix-volym som är något större är denna beräkning krävs för
att ge utrymme för visst svinn vid pipettering.
7.
Bered lämpliga Master Mix-blandningar som beskrivs i steg 3 och lägg alla rör på is.
8.
9.
10.
Tillför nödvändig mängd molekylärbiologiskt vatten till Master Mix-röret.
11.
Tillsätt nödvändig mängd 10X PCR Buffer till Master Mix-röret.
12.
Tillsätt nödvändig mängd dNTPs-lösning till Master Mix-röret.
13.
Tillsätt nödvändig mängd av lämplig Primer Mix till Master Mix-röret.
14.
Centrifugera DNA Polymerase-röret i cirka 10 sekunder.
15.
Knacka försiktigt på DNA Polymerase-röret för att blanda innehållet.
16.
Centrifugera återigen DNA Polymerase-röret i cirka 10 sekunder.
17.
Tillsätt nödvändig mängd DNA Polymerase till Master Mix-rören. För inte ner
18.
Förslut Master Mix-röret.
19.
Vortex-blanda Master Mix-röret i cirka10 sekunder före användning.
20.
Förvara på IS tills det används.
21.
Centrifugrea ner Master Mix-röret före alikvotering för att avlägsna eventuell lösning från
rörets sidor eller lock.
22.
Pipettera 48,0 µl Master Mix i lämpliga brunnar eller rör och byt pipettspets om du
Sid 75
23.
ENDAST EFTER DET ATT STEG 22 HAR FULLBORDATS FÅR KITTETS POSITIVA
brunn eller rör. När pipettering av kontroll utan templat är klar, ska brunnen förslutas med
remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller sätt lock på 0,2 ml PCRröret. Se till att proppen sluter till ordentligt.
24.
Tillsätt 2,0 µl av varje provtemplat-DNA som ska vara tinad (om DNA har förvarats frusen),
vortexblandad och centrifugerad, till lämpliga brunnar. När provpipetteringen är klar, slut till
alla brunnar med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller sätt på
proppar på 0,2 ml PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt.
25.
Tillsätt 2,0 µl lämplig positiv kontroll till lämplig brunn. När kontrollpipetteringen är klar, slut
till alla brunnar med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller sätt på
proppar på 0,2 ml PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt.
26.
Vortexblanda (~1/2 hastighet) i 10 sekunder.
27.
Centrifugera 0,2 ml PCR-rören eller plattorna.
28.
Inspektera plattorna eller 0,2 ml PCR-rören. Kontrollera att vätskan är på botten av
brunnen. Centrifugera återigen i annat fall.
4.5.3 Termocyklerprogram för allelspecifikt PCR-protokoll
3.
Använd följande termocyklerprotokoll för ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD eller
ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD PCR.
3.13 Säkerställ att den totala programtiden är 2 timmar och 10 minuter, detta motsvarar
95 C
5 minuter
Amplifiering
38 cykler
95 C
30 sekunder
61 C
30 sekunder
72 C
25 sekunder
Sista förlängning
1 cykel
72 C
2 minuter
Förvaring
≤12 C
Vänta
vecka.
4. Analysera lämplig mängd på det mikrofluidiska kapillärelektroforesinstrumentet.
a. För analys med ett Caliper LabChip MultiDX-instrument: överför 10 µl av varje
PCR till en platta med 96 brunnar, tillsätt 15 µl vatten, blanda noga och ladda på
instrumentet.
4.6 Användning av EGFR kontrollplasmid-DNA
ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD tillhandahålls med lämpliga positiva kontroller för analys
av EGFR exon 18 G719X- samt EGFR Exon 20 T790M-mutationer. Dessa består av plasmider
med tillägg. De positiva kontrollerna innehåller blandningar av Wild-Type- och muterade sekvenser
eller regioner som interrogeras av varje analys.
Sid 76
PROVER
2. Analysera de resulterande elektroferogrammen och de virtuella gelbilderna för att avgöra
För exempel på resultat av mikrofluidisk kapillärelektrofores med användning av en Caliper
LabChip-plattform, läs i Kapitel 5 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda
Caliper LabChip instrument.
Kapitel 5 Analys och tolkning av Fragment
Dimensionering Använda Caliper LabChip Instrument
5.1 Analys av resultat
Granskaren ska visuellt undersöka gelbilder och elektroferogram för alla prover för att fastställa
förekomst/frånvaro av en mutation i den angivna regionen som motsvarar den positiva kontrollen i
specifik ACE Kit. När en visuell inspektion av gelbilder och elektroferogram utförs bör banorna för
No Template Control och Positive Control undersökas först för att fastställa att:

det inte förekommer kontaminering i kontrollen utan templat.

den positiva kontrollen har de specifika toppar (elektroferogram) eller band (gel)
som genereras av den specifika ACE Kit som används.

alla prover utan bevis för en Wild-Type-topp flaggas för uppföljning eftersom DNA
som isolerats från FFPE-sektioner av tumörer som regel inte är 100% muterad.
De positiva kontrollerna används för att identifiera regionen i elektroferogrammet där specifika
mutationer kan fastställas med hjälp av inriktning med motsvarande toppar i den positiva
kontrollen för det specifika kittet.
5.2 Granskning av resultat
För jämförelse och kontroll ska positiva kontroller och kontroller utan templat ALLTID beredas för
varje ACE Kit och köras i samma provplatta i det mikrofluidiska kapillärelektroforessystemet.
I analysstadiet och i följande exempel användes ett Caliper LabChip-system.
Elektroferogramkurvorna för positiv kontroll visar placeringen av de specifika topparna för de
angivna mutationerna eller det generella området för deletionerna för EGFR exon 19. Kontrollen
utan templat kan ha några toppar på grund av artefakter från PCR-primern, men inga provtoppar
får finnas. Detta undersöker om det finns kontaminerande DNA i provet eller i området. Om
kontrollen utan templat är positiv, är hela analysen ogiltig och måste upprepas.
Om antingen elektroferogrammen eller de virtuella gelbilderna som erhållits från positiva kontrollDNA inte motsvarar beskrivna resultaten, se Bilaga B-Felsökningsguide eller kontakta
Transgenomics tekniska support innan ytterligare åtgärder i provanalysen vidtas.
Nedanstående exempel ges endast i illustrerande syfte och ska INTE användas för att avgöra
identiteten hos någon specifik mutation i ett prov. Bekräftelse av en mutations identitet genom
jämförelse av den positiva kontrollens toppmönster med provets i samma analysfönster är
nödvändigt för att otvetydigt fastställa de specifika basförändringarna för punktmutationerna och
för förekomst av en deletion i EGFR Exon 19 ACE-analysen.
Sid 77
Kapitel 5 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Caliper LabChip Instrument
Prov 4
Prov 3
Prov 2
Prov 1
ACE Kit BRAF Positive Control
No Template Control
HT DNA 1K Ladder
I alla exempel följdes tillvägagångssättet som beskrivs i avsnittet Stegvisa anvisningar för det
ACE Kit som användes till fullo.
Övre markör
BRAF V600WT
BRAF V600E2
BRAF V600E
BRAF V600K
Nedre markör
Figur 7: En Caliper LabChip gelbild av analys av BRAF Exon 15 för V600WT(132 bp),
V600E2 (122 bp), V600E (112 bp) och V600K (103 bp). I ovanstående exempel innehåller
kontrollen utan templat inga band och det förekommer därför ingen kontamination av proverna.
Den positiva kontrollen visar de 4 distinkta band som genererats av BRAF ACE Kit-analysen där
banden visar WT och de tre mutationerna som detekterats vid V600. Det finns synliga band
ovanför den nedre markören och dessa är primerartefakter. Banden med högre molekylvikt är
artefakter av allelspecifik PCR-primning oberoende av om den förekommer en mutation.
Prov 1 och 3 har band som är i linje med V600E-mutationen medan prov 2 har ett band som är i
linje med V600K-mutationen. Alla prover harV600WT-bandet eftersom de alla kommer från DNA
som isolerats från FFPE-tumörvävnad. Mutationsresultaten blir följande:
Prov 1 – V600E
Prov 2 – V600K
Prov 3 – V600E
Prov 4 – Wild-Type vid V600
Sid 78
5.3 Tolkning av elektroferogramresultat
Den visuella granskningen av gelbilderna underlättar vid fastställande av förekomst eller frånvaro
av mutationstoppar i elektroferogrambilderna. Det kan vara bäst att förskjuta elektroferogrammen
så att inriktning av provtopparna med topparna i den positiva kontrollen kan användas för att
bestämma eventuella mutationer i ett provelektroferogram. Figur 8 nedan visar
elektroferogrammen för samma prover som visades i gelbildsläget ovan.
Nedre
markör
Övre
markör
Prov 4
Prov 3
Prov 2
112 bp
122 bp
Prov 1
132 bp
103 bp
ACE Kit BRAF
Inriktad tid
Positive Control
NTC
Inriktad tid
Figur 8: Elektroferogrammen för samma provuppsättning som visades på gelbilden i figur
7. Toppmönstren i proverna 1 och 3 (bruna och rosa linjer) är i linje med V600WT- och V600Etopparna för BRAF Positive Control (röd linje). Därför innehåller dessa prover V600E-mutationen.
Toppmönstret för prov 2 (grön linje) är i linje med V600 Wild-Type- och V600K-topparna i den
positiva kontrollen (röd linje) och därför innehåller detta prov en V600K-mutation. Prov 4
(mörkbrun linje) är endast i linje med V600WT-toppen och därför finns det inte någon V600
punktmutation i detta prov. Det elektroferogram som visas till höger är en förstoring av regionen
som markerats med en röd ruta i huvudelektroferogrammet. De övre och nedre markörerna som
visas är artefakttoppar på grund av PCR-primrarna och artefakttoppar med högre molekylvikt på
grund av de allelspecifika PCR-primningsreaktionerna.
Sid 79
Nedre
markör
Övre
markör
Prov 4
Prov 3
Prov 2
78 bp
Prov 1
ACE Kit EGFR
Exon 19 Positive
Control
102 bp
Inriktad tid
Figur 9: Elektroferogram av DNA från FFPE-tumör som analyserats med ACE Kit EGFR
Exon 19-analysen. Toppmönstren i proverna 1 och 2 (bruna och gröna linjer) är i linje med EGFR
Exon 19 Wild-Type (utan deletion) och i regionen mellan EGFR Exon 19 Wild-Type och 24 bp
deletionstopparna i EGFR Exon 19 Positive Control (röd linje). Därför innehåller dessa prov
EGFR Exon 19-deletioner eller komplexa mutationer. Toppmönstret för prov 3 och 4 (rosa och
blå/bruna linjer) är i linje med Wild-Type (utan deletion) Positive Control (röd linje) och därför finns
det inga deletioner eller komplexa mutationer i dessa prov. Det elektroferogram som visas till
höger är en förstoring av regionen som markerats med en röd ruta i huvudelektroferogrammet. De
övre och nedre markörerna som visas är artefakttoppar på grund av PCR-primrarna och
artefakttoppar med högre molekylvikt på grund av de allelspecifika PCR-primningsreaktionerna.
Sid 80
Region för
primerartefakt
Nedre
markör
Övre
markör
Prov 4
Prov 3
Prov 2
101 bp
116 bp
Prov 1
ACE Kit EGFR
Exon 21 L858
Positive Control
Inriktad tid
NTC
Exon 21-analys för L858R. Toppmönstren i prov 2, 3 och 4 (gröna, rosa och mörkbruna linjer) är i
linje med EGFR Exon 21 L858 Wild-Type- och L858R-topparna för EGFR Exon 21 L858 Positive
Control (röd linje). Därför innehåller dessa prov EGFR exon 21 L858R-mutationer. Prov 1
(mörkbrun linje) är endast i linje med L858WT-toppen och därför finns det inte någon L858R
punktmutation i detta prov. Proverna 2 och 4 har låga och mycket låga toppar för L858Rmutationen; dock är förekomst av mutation tydlig vid jämförelse mellan elektroferogrammen för
prov 1 med elektroferogrammen för prov 2 och 4. Det elektroferogram som visas till höger är en
förstoring av regionen som markerats med ruta i huvudelektroferogrammet. De övre och nedre
markörerna som visas är artefakttoppar på grund av PCR-primrarna och artefakttoppar med högre
molekylvikt på grund av de allelspecifika PCR-primningsreaktionerna.
Sid 81
Region för
primerartefakt
Nedre
markör
Övre
markör
Prov 4
Prov 3
Prov 2
Prov 1
ACE Kit EGFR
Exon 21 L861
Positive Control
Inriktad tid
153 bp
138 bp
NTC
Inriktad tid
Exon 21-analys för L861Q. Toppmönstren i prov 2 och 4 (gröna och mörkbruna linjer) är i linje
med EGFR Exon 21 L861 Wild-Type- och L861Q-topparna för EGFR Exon 21 L861 Positive
Control (röd linje). Därför innehåller dessa prov EGFR exon 21 L861R-mutationer. Prov 1 och 3
(bruna och rosa linjer) är endast i linje med L861WT-toppen och därför finns det inte någon L861Q
punktmutation i detta prov. Prov 2 har låga toppar för L861Q-mutationen; dock är förekomst av
mutation tydlig vid jämförelse mellan elektroferogrammen för prov 1 med elektroferogrammen för
prov 2. Det elektroferogram som visas till höger är en förstoring av regionen som markerats med
en röd ruta i huvudelektroferogrammet.
De övre och nedre markörerna som visas är
artefakttoppar på grund av PCR-primrarna och artefakttoppar med högre molekylvikt på grund av
de allelspecifika PCR-primningsreaktionerna.
Sid 82
Nedre
markör
Övre
markör
Prov 4
Prov 3
Prov 2
Prov 1
ACE Kit EGFR
Exon 18 Positive
Control
Inriktad tid
NTC
93 bp
G719X
G719A,
G719C,
G719S
Exon 18-analys för G719X. Toppmönstren i prov 2, 3 och 4 (gröna, rosa och mörkbruna linjer) är
i linje med EGFR Exon 18 G719 Wild-Type- och G719X-topparna för EGFR Exon 18 G719
Positive Control (röd linje). Således innehåller dessa prov EGFR Exon 18 G719X-mutationer (det
finns viss korshybridisering med G719C och antingen G719S eller G719S och därför kan man inte
alltid enkelt avgöra exakt vilken G719-mutation som förekommer. I det här fallet är prov 2 och 4
G719S och prov 3 är G719A). Prov 1 (brun linje) är endast i linje med G719WT-toppen och därför
finns det inte någon G719X punktmutation i detta prov. Prov 4 har en låg topp för G719Xmutationen; dock är förekomst av mutation tydlig vid jämförelse mellan elektroferogrammen för
prov 1 med elektroferogrammen för prov 4. Det elektroferogram som visas till höger är en
förstoring av regionen som markerats med ruta i huvudelektroferogrammet. De övre och nedre
markörerna som visas är artefakttoppar på grund av PCR-primrarna och artefakttoppar med högre
molekylvikt på grund av de allelspecifika PCR-primningsreaktionerna.
Sid 83
Region för
primerartefakt
Prov 4
Nedre
markör
Övre
markör
Prov 3
Inriktad tid
Prov 2
Inriktad tid
Prov 1
ACE Kit EGFR
Exon 20 Positive
Control
NTC
108 bp
124 bp
Exon 20-analys för T790M. Toppmönstren i prov 1 och 2 (bruna och gröna linjer) är i linje med
EGFR Exon 20 T790 Wild-Type- och T790M-topparna för EGFR Exon 20 T790 Positive Control
(röd linje). Därför innehåller dessa prov EGFR exon 20 T790M-mutationer. Prov 3 och 4 (rosa
och mörkbruna linjer) är endast i linje med T790WT-toppen och därför finns det inte någon T790M
punktmutation i dessa prov. Proverna 1 och 2 har låga toppar för T790M-mutationen; dock är
förekomst av mutation tydlig vid jämförelse mellan elektroferogrammen för prov 4 med
elektroferogrammen för prov 1 och 2. Det elektroferogram som visas till höger är en förstoring av
regionen som markerats med en ruta i huvudelektroferogrammet. De övre och nedre markörerna
som visas är artefakttoppar på grund av PCR-primrarna och artefakttoppar med högre molekylvikt
på grund av de allelspecifika PCR-primningsreaktionerna.
Sid 84
Kapitel 6 Analys av alla ACE Kit EGFR-analyser
Kapitel 6 Analys av alla ACE Kit EGFR-analyser
Eftersom alla termocykelförhållanden är desamma för alla ACE Kit EGFR-analyserna kan alla
analyserna göras samtidigt på en platta.
1
A:
POS
CTRL
EGFR Ex
18 G719
2
Prov
3
POS
CTRL
EGFR Ex
20 T790
4
Prov
5
POS
CTRL
EGFR Ex
19 DEL
6
Prov
7
POS
CTRL
EGFR Ex
21 L858
8
Prov
9
POS
CTRL
EGFR Ex
21 L861
10
11
Tom
Prov
12
NTC
EGFR Ex
18 G719
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Tom
NTC
EGFR Ex
20 T790
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Tom
NTC
EGFR Ex
19 DEL
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Tom
NTC
EGFR Ex
21 L858
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Tom
NTC
EGFR Ex
21 L861
F: Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Tom
Tom
G: Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Tom
Tom
H: Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
Prov
B:
C:
B:
E:
Tom
Tom
För felsökning av analyserna, se
Bilaga B – Felsökning eftersom många av
felsökningsmomenten handlar om behov av DNA av hög kvalitet eller felsökning av det specifika
mikrofluidiska kapillärelektroforesinstrumentet.
Sid 85
Kapitel 7 Referenser för ACE Kits
Kapitel 7 Referenser för ACE Kits
1. Dhomen N et al (2012) Therapeutic targeting of the epidermal growth factor receptor in human
cancer. Crit. Rev. Oncog. 17(1):31-50.
2. COSMIC
Catalogue
of
Somatic
Mutations
in
http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/gene/analysis?ln=EGFR#histo.
Cancer
–
EGFR
3. Wu J et al (2011) Effectiveness of tyrosine kinase inhibitors on "uncommon" epidermal growth
factor receptor mutations of unknown clinical significance in non-small cell lung cancer. Clin.
Cancer Res. 17(11):3812-21.
4. Pao W et al (2005) Acquired resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib is
associated with a second mutation in the EGFR kinase domain. PLoS Med. 2(3) e73.
Sid 86
Bilaga A – Laboratorieinstallation för PCR-analyser
Bilaga A – Laboratorieinstallation för PCR-analyser
För att erhålla tillförlitliga och kontaminationsfria PCR-resultat bör god laboratoriesed iakttas vid
planering av PCR-laboratoriet.
När laboratoriet planeras ska man beakta behovet av separationsutrymme mellan beredning av
PCR-amplifiering och aktiviteter efter amplifiering. Det är viktigt att separera (i) DNA-isolering: (ii)
PCR-amplifiering; och (iii) aktiviteter efter PCR, t.ex. att öppna rör med amplifierade prover vid
förberedelse för att köra geler och förbereda andra analyser, t.ex. SURVEYOR Nucleasenedbrytning och DNA-sekvensering.
Det är också viktigt att laboratorieutrustning och material tilldelas varje område och att de endast
används i det specifika området. Avtorkning av alla ytor med 10% (v/v) blekmedel, som bereds ny
varje vecka, kommer att underlätta eliminering av DNA-fragment, ≤ 500 bp, som templat för PCR.
Det kan vidare vara gynnsamt att behandla plastmaterial och lösningar med UV-ljus med kort
våglängd i 7-10 minuter med användning av en UV Crosslinker.
Obs! Enzymer och DNA som ska amplifieras får inte behandlas med UV-ljus.
Användning av skyddskläder, frekventa byten av handskar samt att torka av handskarna med 10%
(v/v) blekmedelslösningen kommer att vara till stor hjälp för att reducera kontamination.
Det bör minst finnas ett arrangemang som liknar det tvårumsarrangemang som visas i
nedanstående diagram som är specifikt utformat för PCR och analys med SURVEYOR Nuclease.
Organisation av PCR-laboratorium
Sid 87
Bilaga B – Felsökningsguide
Effektiv användning av alla RAScan Kits följt av fragmentstorleksbestämning eller ACE Kits med
användning av ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem är beroende av framgångsrikt
genomförande av ett antal moment. Ett av de mest avgörande stegen är PCR-amplifiering som
måste resultera i produktion av specifika, jämnstora DNA i tillräcklig kvantitet för att kunna
detekteras efter hybridisering och klyvning. Detta beror i sin tur på kvaliteten på det ursprungliga
provet. Att utföra analysen med DNA som inte motsvarar kriterierna för kvalitet och kvantitet
rekommenderas inte.
Obs! Om det är första gången du använder RAScan eller ACE Kits, bör du utföra experimenten i
avsnitten Användning av kontrollplasmid-DNA när du har läst igenom och förstått avsnittet
Stegvisa anvisningar som motsvarar de RAScan eller ACE Kits som används. Se till att du har
resultaten från kontroll-DNA innan du kontaktar Transgenomics tekniska support.
Denna Felsökningsguide omfattar en rad problem som du kan komma att stöta på medan du
använder RAScan eller ACE Kits för fragmentstorleksbestämning på ett mikrofluidiskt
kapillärelektroforessystem samt förslag på hur du kan lösa dem.
De exempel som visas kommer från både KRAS- och NRAS-exoner.
Beträffande den modell av mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem som har använts, läs i
tillverkarens Bruksanvisning för detaljerad information beträffande användning och underhåll av
instrumentet. Handboken innehåller specifika processer för att kontrollera och underhålla
mikrochipprestanda och inkluderar felsökningsinformation.
Problem 1 — RAScan och ACE Kits Låg PCR-avkastning eller ingen PCRprodukt vid analys på agarosgel eller på mikrofluidiskt
kapillärelektroforesinstrument
Robust och svag
PCR-AVKASTNING
God
Dålig
PCRPCRavkastning avkastning
MÖJLIG ORSAK
LÖSNING
Dålig kvalitet på DNA
templat
Gör om reningen av DNA; gå igenom den
använda reningsmetoden Om FFPE-extraherat
DNA är alltför fragmenterat kan alternativa FFPEblock krävas.
För mycket RNA i
provet som orsakar för
högt beräknad DNAkoncentration.
Upprepa RNase-behandling av DNA-provet och
rena DNA:t på nytt.
Termocyklern är inte
kalibrerad.
Kalibrera termocyklern.
Otillräckligt
templat.
Öka mängden templat.
med
RNAband
Obs! Högkvalitativ DNA från FFPE ska användas. DNA bör ha en koncentration på 12,5 ng/µl
enligt bestämning genom absorption av 260 nm, ha en absorptionsgrad vid 260/280 nm som
överstiger 1,8 samt vara högre än 90% DNA (d.v.s. fritt från den mesta tRNA- och rRNAkontaminationen enligt visuell bedömning på agarosgel). Förvara DNA-prover vid
-20 °C till -80 °C.
Sid 88
Analys av DNA-templat som extraherats från paraffininbäddad vävnad kräver flera
försiktighetsåtgärder. Extraherat DNA kan behandlas med uracil DNA-glykosylas (UNG) för att
förebygga amplifiering av DNA-fragment som innehåller deaminerade C-rester. En hög
procentandel av det A260-absorberande material som extraheras från paraffininbäddad vävnad
kommer ofta inte att amplifieras väl under PCR. Genom att använda en större mängd DNA till
starten kan man ofta producera en tillräcklig mängd med amplifieringsprodukt. FFPE-tumörsektioner
med en hög andel tumörceller bör väljas i största möjliga mån. Mikrodissektion kan också användas
men detta är tidsödande och rekommenderas inte vid allmän laboratorietestning.
Problem 2 — RAScan Kits Flera PCR-produkter vid analys på agarosgel
FLERA PCR-PRODUKTER
God
PCR med
PCRflera
avkastning
band
MÖJLIG ORSAK
LÖSNING
För låg härdningstemperatur
Kontrollera termocyklern kalibrering.
Obs! PCR ska producera en tillräckligt stor avkastning (>40 ng/µl) av EN ENSTAKA amplifierad
typ av korrekt storlek. DNA-polymeras och DNA- polymeras 10X PCR-buffert som tillhandahålls i
detta kit måste användas för PCR. Amplikoner från kontrollerna bör brytas ned med SURVEYOR
Nuclease och köras parallellt för att exkludera missvisande bakgrundsstörningar genom visuell
jämförelse av kurvornas profiler. Granska varje amplifierad DNA-produkt före nedbrytning med
gelelektrofores eller mikrofluidisk kapillärelektrofores för att säkerställa att det är en enstaka typ av
förväntad storlek.
Sid 89
Problem 3 — RAScan Kits: Inga klyvningsprodukter observeras vid
analysen efter behandling av heteroduplex med SURVEYOR Nuclease
INGA KLYVNINGSPRODUKTER
Position
för saknade
heteroduplex
Nedre
markör Ej beskuren
homoduplextopp
MÖJLIG
ORSAK
LÖSNING
Andelen
avvikande mål
är för liten.
Kontrollera analysen
med hjälp av
kontrollsubstanserna.
Ineffektiv
formering av
heteroduplex
Följ korrekt PCR- och
hybridiseringsprocess
. Använd nyss
hybridiserad DNA vid
SURVEYOR
Nucleasenedbrytning.
Övre
markör
Utför ny PCRamplifiering med
genom att (1)
använda samma
kvantitet DNAtemplat; (2) öka
mängden start-DNA;
eller (3) isolera färsk
DNA från samma eller
en annan FFPEsektion.
Overksam
SURVEYOR
Nuclease
Utför
kontrollreaktionen för
att kontrollera
enzymfunktionen.
Använd endast färsk
SURVEYOR
Nuclease Master Mix.
Obs! SURVEYOR Nuclease klyver huvudsakligen avvikelser i heteroduplex. Andelen
heteroduplex i förhållande till homoduplex i det hybridiserade provet avgör storleken på
SURVEYOR Nuclease-nedbrytningssignal. Om KRAS- eller NRAS-mutationen förekommer i
väldigt låga koncentrationer i det genomiska DNA-provet, kan signalen vara för svag för att ge ett
positivt resultat.
Det är viktigt att se till att hybridiseringssteget ingår i termocykelprogrammet (se
Amplifieringsprotokoll-avsnittet för ifrågavarande kit) för att maximera effektiviteten i
heteroduplexformationen. Heteroduplex är mycket ineffektivt formade under vanliga PCRreaktioner.
Varning! Kommersiellt tillgänglig PCR-buffert varierar dramatiskt med avseende på innehåll och
formlerna är ofta inte definierade av leverantörerna. Ett flertal buffertar är INTE kompatibla med
SURVEYOR Nuclease på grund av pH-värdet eller förekomsten av tillsatser, ytaktiva ämnen eller
andra varumärkesskyddade ingredienser. ANVÄND INTE någon annan polymeras eller 10X
polymerasbuffert än de som tillhandahålls i detta kit.
Sid 90
Problem 4 — RAScan Kits: Höga bakgrundsstörningar efter behandling med
SURVEYOR Nuclease
HÖGA BAKGRUNDSSTÖRNINGAR
Hög
MÖJLIG ORSAK
LÖSNING
Suboptimalt
hybridiseringssteg
Gör så här:
bakgrundsstörning
Se till att DNAkoncentrationen är i nivån ≥25
ng/µl för PCR-reaktionen.
Upprepa steget för bildning av
heteroduplex och var noga
med att följa rekommenderad
metod, se 12.7.1.
Nedre
Övre
markör
markör
Obeskuren
homoduplex-
Mängden DNA är för
låg.
Kontrollera avkastning och
kvalitet på DNA-templat
Obestämda PCRprodukter.
Kontrollera avkastning och
kvalitet på DNA-templat.
SURVEYOR Enhancer
W2 och/eller
SURVEYOR Enhancer
Cofactor har förlorat
verkan.
Kontrollera kittets
utgångsdatum
Obs! Det kan hända att SURVEYOR Nuclease rispar dubbelsträngad DNA vid slumpvist
matchade ställen. Detta orsakar bakgrundsstörningar efter nedbrytning. Denna aktivitet dämpas av
SURVEYOR Enhancer W2 och dess Cofactor utan att ha andra negativa effekter på klyvningen av
avvikelser. SURVEYOR Enhancer W2 och SURVEYOR Enhancer Cofactor inkluderas i detta kit
och ska alltid användas.
Då denna typ av rispning fortfarande förekommer, genereras mindre toppar på ett mikrofluidiskt
kapillärelektroforessystem. Nedbrytningen av Wild Type-kontrollen kommer att visa dessa
mindre toppar. Denna jämförelse används för att söka efter skillnader i elektroferogrammönstren
mellan Wild-Type-kontrollen och provet och används vid jämförelse av provets mönster med WildType-kontrollen.
Sid 91
Problem 5 — ACE Kits: Extra toppar på elektroferogrammet på grund av
allelspecifik primning
Extra toppar
MÖJLIG ORSAK
Primer-
Artefakt-
dimers
toppar
Extra toppar är
vanliga på grund
av primning av de
allelspecifika
reaktioner. Dessa
är i distinkta
regioner utanför de
storlekar i den
positiva kontrollen
som används för
mutationsbestämni
ng
Flera toppar i
mutationsbestämni
ngsregionen
indicerar möjlig
kontamination av
kittets positiva
kontroll
Inriktad tid (sek.)
LÖSNING
Dessa regioner
ignoreras och stör inte
de specifika
bestämningarna av
mutationer eller
deletioner
Dekontaminera
området och upprepa
ACE-reaktionerna
Obs! På grund av multiplexreaktionerna finns det potentiella PCR-biprodukter som kan vara
mindre eller större än de toppar som används för att bestämma mutationen. Dessa toppar
ignoreras eftersom de är artefakter av PCR-reaktionen.
Problem 6 — RAScan Kits: SURVEYOR Nuclease-nedbrytningstoppar i
negativa kontroller
NEDBRYTNINGSTOPPAR
KONTROLLER
I
NEGATIVA
Nedbrytnings
toppar
Nedre
markör
Ej beskuren
homoduplextopp
MÖJLIG ORSAK
LÖSNING
Kittets innehåll har
kontaminerats med
KRAS- eller NRASamplikoner eller
plasmidkontroller
Kassera alla
kitkomponenter
och använd ett
nytt kit.
Kontakta
Transgenomic
tekniska support för
att diskutera
eventuella orsaker
och källor till
kontaminationen
Övre
markör
Sid 92
Problem 7 – RAScan Kits: Misslyckade SURVEYOR Nuclease-resultat
SURVEYOR
NUCLEASENEDBRYTNINGEN
AV
POSITIVA
KONTROLLER HAR MISSLYCKATS
Positiv kontroll
Wild-Type-kontroll
MÖJLIG ORSAK
LÖSNING
SURVEYOR
Nuclease tillsattes
inte
Bryt ned ett nytt prov
SURVEYOR
Nucleasenedbrytning skedde
vid fel temperatur
Bryt ned ett nytt prov
Problem 8 — ACE Kits: Misslyckade resultat
ACE PCR-ANALYS MISSLYCKADES
Positiv kontroll
Prov 1
Prov 2 (misslyckad analys)
Kontroll utan templat
MÖJLIG ORSAK
LÖSNING
Prov-DNA tillsattes
inte
Analysera provet på nytt
Prov-DNA av av
otillräcklig kvalitet
eller kvantitet
Kontrollera DNAkvaliteten och -kvantiteten
och isolera vid behov
DNA på nytt från en
annan FFPE-sektion och
analysera om.
Sid 93
Problem 9 — RAScan och ACE Kits: Oväntade toppar i elektroferogrammet
YTTERLIGARE TOPPAR ELLER ARTEFAKTTOPPAR
RAScan Kits
Oväntade
nedbrytnings
-
Ej beskuren
homoduplextopp
MÖJLIG
ORSAK
LÖSNING
Mutation på
ovanlig plats.
Sekvensera
provet för att
bekräfta
mutation.
Toppar
som är mycket
smala och som
är slumpvis
placerade på
grund av damm
i provet/skatter i
detektorn.
Kontrollera att
rör, lösningar
o.s.v. är fria från
damm och
analysera
proverna igen.
Positiv kontrolltoppar
Wild-Type-kontroll
Nedre markör
RAScan och ACE Kits
Övre
markör
Specifika
toppar av
fördefinierad
storlek, t.ex.
överföring av
ladder-DNA.
Rengör
mikrochip,
munstycken och
luftcylinder.
Ring för att
begära service
om detta
fortsätter.
Sid 94
Problem 10 — RAScan Kits: Kontamination av prover med kitkontroller
(mikrokapillär elektrofores)
NEDBRYTNINGSMÖNSTER SOM
ÖVERENSSTÄMMER MED FÖREKOMST AV
BLANDADE POSITIVA KONTROLLERS
STÄMPLADE REGION OCH WILD-TYPE
HETERODUPLEX
MÖJLIG ORSAK
LÖSNING
Exempel på SURVEYOR Nuclease-nedbrytning med
stämplad plasmid i ett prov.
Dålig
pipetteringsteknik
Var försiktig vid
pipettering för att
undvika
korskontamination.
Nedre
markör
Flera toppar
som pekar på
kontamination
Ej beskuren
homoduplextopp
Prov med flera
mutationer eller
kontamination
Muterat prov
Wild-Type-prov
Normala giltiga provtoppar
Den övre kurvan
(grön linje) är ett
exempel som kan
vara (1) ett prov
med mer än en
mutation eller (2)
potentiell
kontamination.
Om samma
mönster
observeras i
prover i
intilliggande
brunnar eller i
alla proverna har
kontamination
skett.
Kontrollera
kontrollstämplarna
s sekvensregioner
för kontamination
av positiv kontroll.
Skicka prover för
sekvensering och
kontrollera
stämpelregionens
sekvens.
Sid 95
Problem 11 — RAScan Kits: Kontamination av prover med kitkontroller
(sekvensering)
ANALYS AV "STÄMPLAD" REGION
AV
SEKVENSERINGSELEKTROFERO
GRAM VISAR
SE EXEMPEL NEDAN:
MÖJLIG ORSAK
LÖSNING
Dålig
pipetteringsteknik
Var försiktig vid pipettering för
att undvika korskontamination.
Arbetet sker inte i en
UV-arbetsstation
Kontrollera att arbetsmiljö och
arbetsområdet är lämpliga
Laboratoriet saknar
lämpligt luftflöde
Kontrollera kontrollstämplarnas
sekvensregioner för
kontamination av muterad
kontroll.
Det saknas separat
laboratorieområde för
PCR-förberedelse och
arbete efter PCR
Kontakta Transgenomic
teknisk support:
support@transgenomic.com
EXEMPEL: Sekvensering visar att NRAS Exon 2 stämpelregioner kontaminerar ett prov.
Kodon 12 och
13-region av
NRAS exon 2
Plasmidkontrollens
"Stämpel"-region av
NRAS exon 2
Giltigt prov:
Provet är Wild-Type (GGT GGT)
och ingen "stämpel" (ACA)
Kontaminerat:
Provet är Wild-Type (GGT GGT)
"Stämpeln" (A/TC/GA/T) förekommer
Giltigt prov:
Provet är muterat (GGT GG/AT)
och ingen "stämpel" (ACA)
Kontaminerat:
Provet är muterat (GG/AT GGT).
"Stämpeln" (A/TC/GA/T) förekommer
Sid 96
Problem 12 — RAScan och ACE Kits: Mikrofluidisk kapillärelektrofores, t.ex.
Caliper LabChip
Problem
Avvikande elektroferogram eller
storleksbestämnings-ladders; Varierande
retentionstid som inte korrigeras av den
automatiska inriktningskomponenten i
instrumentets programvara;
Problem rörande baslinje
MÖJLIG ORSAK
LÖSNING
Alla problem
Kontakta teknisk hjälp för ditt
kapillärelektroforesinstrument.
Chip
Chip är ömtåliga och därför
måste de hanteras med
försiktighet. Lösningen på ett
dåligt chip är att byta ut det mot
ett nytt (ha ett extra chip till
hands)
Gel
Buppeltoppar och
damm
Baslinjen sjunker för den övre markören
och ibland för de största fragmenten
Programvaran flaggar som regel dessa
med ett rött eller gult "!" på gelen, plattans
layout och kurvans namn. I detta
elektroferogram visar den nedre markören
en liten artefakt, med huvudprodukt och
övre markör följda av en sjunkande kurva.
Varierande
retentionstid som
inte korrigeras av
den automatiska
inriktningskompone
nten i instrumentets
programvara
Gelen kan ta slut snabbt
eftersom det inte finns någon
möjlighet att anpassa till
körningar med olika antal
prover.
Dessa är sällsynta men kan
uppstå och därför ska man
vara försiktig när man laddar
prover och beakta den
omgivning där instrumentet är
placerat.
Indikation på felfunktion i
chipet. Ett nytt chip måste
beställas.
Sid 97

Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer

Transcription

Similar documents

Pt-eGFRmedel,relativ Ny analys från 14 oktober 2015

KRAS-NYTT - Kalmar radioamatörsällskap

Kras Mutasyonu Olmayan(KRAS wild tip ) Kolorektal Kanserli

Mutationer och pandemier

Xarelto vp.120910

Alzheimerssjukdom och genetiskvägledning

Nummer 2/2013 - ESR Resonans