מחקרים חדשים של Negda

‫‪Dr. Elizabeth E. Half‬‬
‫דר' אליזבט הלף‬
‫‪Head, Gastrointestinal Malignancy Unit‬‬
‫מנהלת היחידה למניעת ממאירויות מערכת העיכול‬
‫‪Department of Gastroenterology‬‬
‫ותסמונות משפחתיות של סרטן‬
‫‪Rambam- Health Care Campus‬‬
‫רמב"ם‪-‬הקריה הרפואית לבריאות האדם‬
‫‪Haifa Israel‬‬
‫חיפה‬
‫הדוח הסופי על ההשפעה של ®‪ Negda‬על שורת תאים‬
‫מטרת המחקר‪ :‬להעריך את ההשפעה של ריכוזים שונים של ®‪ Negda‬על תאים של סרטן‬
‫המעי הגס‪.‬‬
‫חומרים ושיטות‪:‬‬
‫ההשפעה של ®‪ Negda‬נבדקה על ‪) HT-29‬שורת תאים של סרטן המעי הגס( באמצעות‬
‫גדילה‪ .‬הגדילה של התאים נקבעה באמצעות חמש שיטות שונות‪:‬‬
‫‪ .1‬ספירת תאים באמצעות ‪) FACS‬מיון תאים על ידי פלורסנציה( ומיקרוסקופ אור‬
‫לפני ואחרי טיפול ב‪.Negda®-‬‬
‫‪ .2‬ערכת לקביעה קולורימטרית של קספאז ‪) 3‬מק"ט ‪,R&D systems ,BF3100‬‬
‫מיניאפוליס‪ ,‬ארה"ב(; פעילות של קספאז ‪ 3‬מציינת שלב אפופטוטי של התאים‪.‬‬
‫‪) ECIS® .3‬חישת עכבה חשמלית של מצע התא(‪ .‬לקריאת פרטים על השיטה‪:‬‬
‫‪http://www.biophysics.com/ecis-theory.php‬‬
‫‪ :AlamarBlue .4‬מודד מטבוליזם של התאים כאינדיקציה לכושר החיים שלהם‪.‬‬
‫‪ .5‬צביעת אנקסין ‪ :5‬קביעת אפופטוזיס באמצעות ‪.FACS‬‬
‫ת‪.‬ד‪ 9602 .‬חיפה ‪ ,31096‬טל‪ ,04-7773855 .‬פקס ‪04-8543058‬‬
‫‪P.O.B. 9602, Haifa 31096 Israel, Tel.972-4-7773855, Fax-972-4‬‬‫‪8543058‬‬
‫דוא"ל ‪e-mail: e_half@rambam.health.gov.il :‬‬
‫‪Dr. Elizabeth E. Half‬‬
‫דר' אליזבט הלף‬
‫‪Head, Gastrointestinal Malignancy Unit‬‬
‫מנהלת היחידה למניעת ממאירויות מערכת העיכול‬
‫‪Department of Gastroenterology‬‬
‫ותסמונות משפחתיות של סרטן‬
‫‪Rambam- Health Care Campus‬‬
‫רמב"ם‪-‬הקריה הרפואית לבריאות האדם‬
‫‪Haifa Israel‬‬
‫חיפה‬
‫משטר מינון‬
‫משקל האבקה בכמוסה הוא ‪ 0.663‬גרם‪ .‬האבקה הומסה בדימתיל סולפוקסיד )‪(DMSO‬‬
‫בכל הניסויים‪.‬‬
‫טבלה ‪ :1‬המרכיבים של הכמוסה‬
‫ויטמין ‪D3‬‬
‫רימון‬
‫שורש ג'ינג'ר‬
‫כורכומין‬
‫תה ירוק‬
‫סה"כ ‪%‬‬
‫לטבליה‪0.671 gr. /‬‬
‫‪1800‬‬
‫‪200‬‬
‫‪25‬‬
‫‪250‬‬
‫‪113‬‬
‫‪588‬‬
‫‪% mg‬‬
‫‪50mg‬‬
‫‪29.80625931‬‬
‫‪3.725782414‬‬
‫‪37.25782414‬‬
‫‪16.84053651‬‬
‫‪87.63‬‬
‫‪14.90313‬‬
‫‪1.862891‬‬
‫‪18.62891‬‬
‫‪8.420268‬‬
‫‪43.82‬‬
‫מסקנה‪ :‬ב‪ 50-‬מ"ג של האבקה יש ‪ 18.62‬מ"ג כורכומין‪.‬‬
‫טבלה ‪ :2‬ריכוז כורכומין במלאי העבודה‬
‫מלאי‪ 50 Negda® :‬מ"ג ‪ 2 /‬מ"ל‬
‫‪DMSO‬‬
‫‪2000µl‬‬
‫‪)18.62 mg‬כורכומין(‬
‫‪DMSO‬‬
‫‪0.025272816‬‬
‫‪25272.81611‬‬
‫‪ M‬כורכומין‬
‫‪ µM‬כורכומין‬
‫‪368.38 g/mol‬‬
‫‪) Mw‬כורכומין(‬
‫ת‪.‬ד‪ 9602 .‬חיפה ‪ ,31096‬טל‪ ,04-7773855 .‬פקס ‪04-8543058‬‬
‫‪P.O.B. 9602, Haifa 31096 Israel, Tel.972-4-7773855, Fax-972-4‬‬‫‪8543058‬‬
‫דוא"ל ‪e-mail: e_half@rambam.health.gov.il :‬‬
‫‪Dr. Elizabeth E. Half‬‬
‫דר' אליזבט הלף‬
‫‪Head, Gastrointestinal Malignancy Unit‬‬
‫מנהלת היחידה למניעת ממאירויות מערכת העיכול‬
‫‪Department of Gastroenterology‬‬
‫ותסמונות משפחתיות של סרטן‬
‫‪Rambam- Health Care Campus‬‬
‫רמב"ם‪-‬הקריה הרפואית לבריאות האדם‬
‫‪Haifa Israel‬‬
‫חיפה‬
‫טבלה ‪ :3‬ריכוזים שנעשה בהם שימוש‬
‫נפח‬
‫‪0.25µl‬‬
‫‪0.5µl‬‬
‫‪1 µl‬‬
‫‪1.5 µl‬‬
‫‪3 µl‬‬
‫‪6 µl‬‬
‫ריכוז כורכומין‬
‫‪6.31 µM‬‬
‫‪12.63 µM‬‬
‫‪25.27 µM‬‬
‫‪37.90 µM‬‬
‫‪75.81 µM‬‬
‫‪149.30 µM‬‬
‫הערה‪ :‬בגלל הצבע הטבעי של כורכומין‪ ,‬שממסך את הקריאות של הצפיפות האופטית‬
‫באמצעות ספקטרופוטומטר ושיש לו פלורוסנציה עצמית במדידת ‪ ,FACS‬הריכוז של‬
‫®‪ Negda‬הוגבל בטווח ‪ .6.31 µM -149.3 µM‬כדי להגיע לריכוז הזה‪ 50 ,‬מ"ג של האבקה‬
‫הומסו ב‪ 2-‬מ"ל ‪ DMSO‬ובזה השתמשו לניסויים נוספים‪.‬‬
‫ת‪.‬ד‪ 9602 .‬חיפה ‪ ,31096‬טל‪ ,04-7773855 .‬פקס ‪04-8543058‬‬
‫‪P.O.B. 9602, Haifa 31096 Israel, Tel.972-4-7773855, Fax-972-4‬‬‫‪8543058‬‬
‫דוא"ל ‪e-mail: e_half@rambam.health.gov.il :‬‬
‫‪Dr. Elizabeth E. Half‬‬
‫דר' אליזבט הלף‬
‫‪Head, Gastrointestinal Malignancy Unit‬‬
‫מנהלת היחידה למניעת ממאירויות מערכת העיכול‬
‫‪Department of Gastroenterology‬‬
‫ותסמונות משפחתיות של סרטן‬
‫‪Rambam- Health Care Campus‬‬
‫רמב"ם‪-‬הקריה הרפואית לבריאות האדם‬
‫‪Haifa Israel‬‬
‫חיפה‬
‫ניסוי ‪ :#1‬ספירת תאים באמצעות ‪ FACS‬לפני ואחרי הטיפול‬
‫התאים טופלו בשלושה מינונים שונים של ®‪ 6ul ,3ul ,1ul :Negda‬במשך ‪ 24‬שעות‪ .‬התאים‬
‫נספרו באמצעות ‪ .FACS‬היו שתי בקרות שליליות‪ :‬תאים בלי טיפול )מצעים בלבד( ותאים‬
‫עם ‪ DMSO‬בלבד‪.‬‬
‫איור ‪ :1‬ספירת תאים בתגובה תלוית מינון ל‪Negda®-‬‬
‫ספירת תאי ‪ - HT‐29‬תגובה למינון‬
‫‪8.00E+05‬‬
‫‪7.00E+05‬‬
‫‪6.00E+05‬‬
‫‪4.00E+05‬‬
‫‪3.00E+05‬‬
‫‪cells/ml‬‬
‫‪5.00E+05‬‬
‫‪2.00E+05‬‬
‫‪1.00E+05‬‬
‫‪0.00E+00‬‬
‫‪DMSO‬‬
‫‪Negda‬‬
‫‪135.62µl‬‬
‫‪Negda‬‬
‫‪406.94µl‬‬
‫‪Negda‬‬
‫‪801.44µl‬‬
‫‪Media‬‬
‫מסקנה‪ :‬ספירת התאים הסרטניים קטנה כשהריכוז של ®‪ Negda‬גדל באופן תלוי מינון )ראו‬
‫איור ‪.(1‬‬
‫ת‪.‬ד‪ 9602 .‬חיפה ‪ ,31096‬טל‪ ,04-7773855 .‬פקס ‪04-8543058‬‬
‫‪P.O.B. 9602, Haifa 31096 Israel, Tel.972-4-7773855, Fax-972-4‬‬‫‪8543058‬‬
‫דוא"ל ‪e-mail: e_half@rambam.health.gov.il :‬‬
‫‪Dr. Elizabeth E. Half‬‬
‫דר' אליזבט הלף‬
‫‪Head, Gastrointestinal Malignancy Unit‬‬
‫מנהלת היחידה למניעת ממאירויות מערכת העיכול‬
‫‪Department of Gastroenterology‬‬
‫ותסמונות משפחתיות של סרטן‬
‫‪Rambam- Health Care Campus‬‬
‫רמב"ם‪-‬הקריה הרפואית לבריאות האדם‬
‫‪Haifa Israel‬‬
‫חיפה‬
‫ניסוי ‪ :#2‬פעילות קספאז ‪3‬‬
‫כדי לקבוע האם זה )איור ‪ (1‬היה תוצאה של אפופטוזיס‪ ,‬נעשה שימוש בערכה קולורימטרית‬
‫של פעילות קספאז ‪ 3‬כדי לקבוע אפופטוזיס בתאי ‪ HT-29‬אחרי טיפול במינונים שונים של‬
‫®‪ 1.5µl ,1µl ,0.5µl ,0.25µl) Negda‬שהיו שווי ערך ל‪,25.27µM ,12.6µM ,6.31µM-‬‬
‫‪ 37.9µM‬של כורכומין(‪ .‬כפעולה משלימה‪ ,‬התאים גם נספרו אחרי הטיפול באמצעות‬
‫מיקרוסקופ אור‪.‬‬
‫ערכת לקביעה קולורימטרית ‪ -‬בוצע בשלושה עותקים‪.‬‬
‫טבלה ‪ :4‬ספירת תאים באמצעות מיקרוסקופ אור אחרי הטיפול‬
‫טיפול‬
‫מצע‬
‫‪Negda 0.25 µl‬‬
‫‪Negda 0.5 µl‬‬
‫‪Negda 1 µl‬‬
‫‪Negda 1.5 µl‬‬
‫‪DMSO‬‬
‫ת‪.‬ד‪ 9602 .‬חיפה ‪ ,31096‬טל‪ ,04-7773855 .‬פקס ‪04-8543058‬‬
‫ספירת תאים‬
‫‪P.O.B. 9602, Haifa 31096 Israel, Tel.972-4-7773855, Fax-972-4‬‬‫‪8543058‬‬
‫דוא"ל ‪e-mail: e_half@rambam.health.gov.il :‬‬
‫‪Dr. Elizabeth E. Half‬‬
‫דר' אליזבט הלף‬
‫‪Head, Gastrointestinal Malignancy Unit‬‬
‫מנהלת היחידה למניעת ממאירויות מערכת העיכול‬
‫‪Department of Gastroenterology‬‬
‫ותסמונות משפחתיות של סרטן‬
‫‪Rambam- Health Care Campus‬‬
‫רמב"ם‪-‬הקריה הרפואית לבריאות האדם‬
‫‪Haifa Israel‬‬
‫חיפה‬
‫איור ‪ :2‬פעילות קספאז ‪ 3‬לתא‬
‫פעילות קספאז ‪3‬‬
‫‪1.00E‐07‬‬
‫‪8.00E‐08‬‬
‫‪6.00E‐08‬‬
‫‪2.00E‐08‬‬
‫‪activity/cell‬‬
‫‪4.00E‐08‬‬
‫‪0.00E+00‬‬
‫‪dmso‬‬
‫‪negda‬‬
‫‪negda‬‬
‫‪negda‬‬
‫‪negda‬‬
‫‪33.87µM 67.79µM 135.64µM 203.44µM‬‬
‫‪media‬‬
‫‪‐2.00E‐08‬‬
‫‪‐4.00E‐08‬‬
‫מסקנה‪ :‬ספירת התאים הסרטניים קטנה כשהריכוז של ®‪ Negda‬גדל באופן תלוי מינון‬
‫)טבלה ‪ .(4‬אפשר להסביר זאת על ידי גידול באפופטוזיס כפי שמראה מחקר פעילות‬
‫הקספאז ‪) 3‬איור ‪.(2‬‬
‫ת‪.‬ד‪ 9602 .‬חיפה ‪ ,31096‬טל‪ ,04-7773855 .‬פקס ‪04-8543058‬‬
‫‪P.O.B. 9602, Haifa 31096 Israel, Tel.972-4-7773855, Fax-972-4‬‬‫‪8543058‬‬
‫דוא"ל ‪e-mail: e_half@rambam.health.gov.il :‬‬
‫דר' אליזבט הלף‬
‫מנהלת היחידה למניעת ממאירויות מערכת העיכול‬
‫ותסמונות משפחתיות של סרטן‬
‫‪Dr. Elizabeth E. Half‬‬
‫‪Head, Gastrointestinal Malignancy Unit‬‬
‫‪Department of Gastroenterology‬‬
‫‪Rambam- Health Care Campus‬‬
‫רמב"ם‪-‬הקריה הרפואית לבריאות האדם‬
‫‪Haifa Israel‬‬
‫חיפה‬
‫ניסוי ‪ :#3‬ההשפעה של ®‪ Negda‬על תאי ‪ HT-29‬מבוצע באמצעות ®‪) ECIS‬חישת‬
‫עכבה חשמלית של מצע התא(‪.‬‬
‫תאי סרטן המעי הגס ‪ HT-29‬נזרעו בריכוז של‬
‫‪ 18‬שעות טופלו בשני עותקים‪.‬‬
‫והודגרו במשך הלילה‪ ,‬ואחרי‬
‫איור ‪ :3‬תוצאות ‪ - ECIS‬הצבעים מייצגים את הטיפולים השונים‬
‫ת‪.‬ד‪ 9602 .‬חיפה ‪ ,31096‬טל‪ ,04-7773855 .‬פקס ‪04-8543058‬‬
‫‪P.O.B. 9602, Haifa 31096 Israel, Tel.972-4-7773855, Fax-972-4‬‬‫‪8543058‬‬
‫דוא"ל ‪e-mail: e_half@rambam.health.gov.il :‬‬
‫‪Dr. Elizabeth E. Half‬‬
‫דר' אליזבט הלף‬
‫‪Head, Gastrointestinal Malignancy Unit‬‬
‫מנהלת היחידה למניעת ממאירויות מערכת העיכול‬
‫‪Department of Gastroenterology‬‬
‫ותסמונות משפחתיות של סרטן‬
‫‪Rambam- Health Care Campus‬‬
‫רמב"ם‪-‬הקריה הרפואית לבריאות האדם‬
‫‪Haifa Israel‬‬
‫חיפה‬
‫תיאור ותוצאות‪:‬‬
‫שחור ‪ -‬בקרה שלילית )בלי טיפול(‪ ,‬התאים ממשיכים לשגשג‪.‬‬
‫ורוד ‪ ,DMSO -‬אחרי שהוסף ‪ DMSO‬התאים נסוגו אבל אחרי ‪ 25‬שעות התאים חידשו את‬
‫יכולתם לשגשג‪.‬‬
‫אדום ותכלת ‪ .33.3µg/ml Negda® -‬שוב התאים התאוששו זמן קצר אחרי הטיפול‪.‬‬
‫ירוק וצהוב ‪ .66.6µg/ml Negda® -‬צפיפות התאים קטנה‪.‬‬
‫כחול ואפור ‪ .100µg/ml Negda® -‬צפיפות התאים קטנה בלי התאוששות‪.‬‬
‫מסקנה‪ :‬מדידות של התנגדות התא למוליכות )‪ (ECIS‬מצביעות על צפיפות התאים‪.‬‬
‫כשצפיפות התאים גדלה‪ ,‬יש יותר תאים עם כושר חיים‪ .‬התוצאות מצביעות על כך שהגדלת‬
‫המינון של ®‪ Negda‬גרמה לקיטון בצפיפות התאים באופן תלוי מינון‪.‬‬
‫ת‪.‬ד‪ 9602 .‬חיפה ‪ ,31096‬טל‪ ,04-7773855 .‬פקס ‪04-8543058‬‬
‫‪P.O.B. 9602, Haifa 31096 Israel, Tel.972-4-7773855, Fax-972-4‬‬‫‪8543058‬‬
‫דוא"ל ‪e-mail: e_half@rambam.health.gov.il :‬‬
‫‪Dr. Elizabeth E. Half‬‬
‫דר' אליזבט הלף‬
‫‪Head, Gastrointestinal Malignancy Unit‬‬
‫מנהלת היחידה למניעת ממאירויות מערכת העיכול‬
‫‪Department of Gastroenterology‬‬
‫ותסמונות משפחתיות של סרטן‬
‫‪Rambam- Health Care Campus‬‬
‫רמב"ם‪-‬הקריה הרפואית לבריאות האדם‬
‫‪Haifa Israel‬‬
‫חיפה‬
‫ניסוי ‪ - #4‬כושר חיים של תאים באמצעות ‪AlamarBlue‬‬
‫הניסוי הזה נערך באותו הפורמט שתואר בניסוי הקודם‪.‬‬
‫‪ ‬‬
‫איור ‪ :4‬אחוז כושר החיים של התאים באמצעות ‪AlamarBlue‬‬
‫‪ ‬‬
‫‪ %‬כושר החיים של התאים באמצעות‬
‫‪AlamarBlue‬‬
‫‪120.00‬‬
‫‪100.00‬‬
‫‪80.00‬‬
‫‪60.00‬‬
‫‪40.00‬‬
‫‪20.00‬‬
‫‪0.00‬‬
‫‪media‬‬
‫‪negda 33 mM negda 66 mM negda 100‬‬
‫‪mM‬‬
‫‪dmso‬‬
‫מסקנה‪ :‬כשהמינון של ®‪ Negda‬גדל כושר החיים של התאים הסרטניים קטן‪.‬‬
‫ת‪.‬ד‪ 9602 .‬חיפה ‪ ,31096‬טל‪ ,04-7773855 .‬פקס ‪04-8543058‬‬
‫‪P.O.B. 9602, Haifa 31096 Israel, Tel.972-4-7773855, Fax-972-4‬‬‫‪8543058‬‬
‫דוא"ל ‪e-mail: e_half@rambam.health.gov.il :‬‬
‫‪Dr. Elizabeth E. Half‬‬
‫דר' אליזבט הלף‬
‫‪Head, Gastrointestinal Malignancy Unit‬‬
‫מנהלת היחידה למניעת ממאירויות מערכת העיכול‬
‫‪Department of Gastroenterology‬‬
‫ותסמונות משפחתיות של סרטן‬
‫‪Rambam- Health Care Campus‬‬
‫רמב"ם‪-‬הקריה הרפואית לבריאות האדם‬
‫‪Haifa Israel‬‬
‫חיפה‬
‫ניסוי ‪ :#5‬מידת האפופטוזיס באמצעות אנקסין ‪ V‬באמצעות ‪FACS‬‬
‫הניסוי הזה נערך באותו הפורמט שתואר בניסוי הקודם‪.‬‬
‫איור ‪ :5‬אנקסין ‪ V‬באמצעות ‪FACS‬‬
‫ת‪.‬ד‪ 9602 .‬חיפה ‪ ,31096‬טל‪ ,04-7773855 .‬פקס ‪04-8543058‬‬
‫‪P.O.B. 9602, Haifa 31096 Israel, Tel.972-4-7773855, Fax-972-4‬‬‫‪8543058‬‬
‫דוא"ל ‪e-mail: e_half@rambam.health.gov.il :‬‬
‫דר' אליזבט הלף‬
‫מנהלת היחידה למניעת ממאירויות מערכת העיכול‬
‫ותסמונות משפחתיות של סרטן‬
‫‪Dr. Elizabeth E. Half‬‬
‫‪Head, Gastrointestinal Malignancy Unit‬‬
‫‪Department of Gastroenterology‬‬
‫‪Rambam- Health Care Campus‬‬
‫רמב"ם‪-‬הקריה הרפואית לבריאות האדם‬
‫‪Haifa Israel‬‬
‫חיפה‬
‫תוצאות‪ :‬כל נקודה בתרשים ה‪ FACS-‬מייצגת תא בודד‪ .‬תאים ירוקים הם תאים נורמליים‬
‫לא אפופטוטיים‪ .‬תאים צהובים נצבעו על ידי אנקסין ‪ ,V‬כלומר אלה תאים אפופטוטיים‪.‬‬
‫כפי שאפשר לראות באיור ‪ ,5‬ככל שהריכוז של ®‪ Negda‬עולה‪ ,‬יותר תאים עוברים מהאזור‬
‫הירוק לאזור הצהוב‪.‬‬
‫מסקנה‪ :‬האפופטוזיס גדל בטיפול באמצעות ®‪ Negda‬באופן תלוי מינון‪.‬‬
‫מסקנה סופית לגבי ההשפעה של ®‪ Negda‬על שורת תאים של סרטן המעי הגס ‪HT-‬‬
‫‪ :29‬מהמחקרים האלה במבחנה נראה שכשהריכוז של ®‪ Negda‬גדל‪ ,‬כושר החיים והשגשוג‬
‫של התאים קטן ואילו האפופטוזיס גדל בבירור באופן תלוי מינון‪.‬‬
‫בברכה‪,‬‬
‫ד"ר אליזבט הלף‬
‫ת‪.‬ד‪ 9602 .‬חיפה ‪ ,31096‬טל‪ ,04-7773855 .‬פקס ‪04-8543058‬‬
‫‪P.O.B. 9602, Haifa 31096 Israel, Tel.972-4-7773855, Fax-972-4‬‬‫‪8543058‬‬
‫דוא"ל ‪e-mail: e_half@rambam.health.gov.il :‬‬