Die Institute Institut für Ökologische Chemie

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Institut für Ökologische Chemie
Institute of Ecological Chemistry
Neuherberg
(Direktor / Director: Prof. Dr. Antonius Kettrup)
hemikalien und deren Gemische prägen gegenüber differierenden Wirkorten der Zoo-, Phyto- und Mikrosphäre der Umwelt verschiedene molekulare
Wirkungsmuster aus. Diese Wirkungsmuster
werden komplementär mit physikalischchemischer Analytik chemikalienorientiert
und mit biochemisch-biologischer Analytik
wirkungsorientiert identifiziert und verglichen. Persistente und insbesondere
darunter polare, niedermolekulare (MW <
10.000) Moleküle stehen dabei im Vordergrund, weil sie in ihrer Wirk- und Indikatorfunktion bisher nicht die notwendige Beachtung fanden und eine zentrale Rolle für die
biologische Regulation haben. Deshalb sind
die Forschungsarbeiten prozessorientiert,
damit mögliche Optimierungen in Systemen
wissenschaftlich begründet werden können.
Diese Arbeiten sind den folgenden
Forschungsschwerpunkten des Instituts
zuzuordnen:
• Erfassung ökotoxischer molekularer Wirkungsmuster chemischer Stressoren
• Verteilung, Bindung, Abbau von Chemikalien
• Reaktivität und Struktur von Huminstoffen
• Exposition der Umwelt und des Menschen
durch Partikel und adsorbierte Schadstoffe
• Entwicklung neuer Messmethoden für
organische Verbindungen und Metaboliten
• Veränderung des Eintrages luftgetragener
Schadstoffe in Biogeosysteme
• Spurenelemente und deren Speziesanalytik in medizinisch-biologischen und
Umweltproben
Im Berichtsjahr waren 23 Wissenschaftler
(innen), 3 Nachwuchswissenschaftler(innen),
60 Gastwissenschaftler(innen), 16 Doktorand(innen) und 34 technische Mitarbeiter
C
hemicals and their mixtures develop
various molecular patterns in different regions of the environmental
zoo-, phyto- and microspheres. These
patterns are identified and compared complementarily by chemico-physical analysis
with respect to their chemical substances
and by biochemical-biological analysis
regarding their effects. Persistent and
particularly polar, low-molecular molecules
(MW < 10,000) are of interest here, since
their property and indicator functions have
not found due attention yet and play a
central role for the regulatory system.
The research activities are hence processoriented to allow future optimisations in
systems to be substantiated from a scientific point of view.
The investigations are organised according to the following main research topics.
• Determination of the ecotoxic molecular
patterns of action of chemical stress
factors
• Distribution, binding, and degradation
of chemicals
• Reactivity and structure of humic
substances
• Environmental and human exposure by
particles and particle adsorbed pollutants
• Development of new methods for
measuring organic compounds and
metabolites
• Alteration of airborne substances input
into biogeosystems
• Trace elements and metal species
analysis in medical-biological and
environmental samples.
In 2003 there were 23 scientists, 3 junior
scientists, 60 visiting scientists, 16 postgraduate students, and 34 technicians
C
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(innen) im Institut tätig, zum Teil im Rahmen
von sonderfinanzierten Projekten (Zuwendungsgeber: Bund, Länder, Kommunen,
Landesämter, Stiftungen, Industriefirmen,
EU, DFG).
In diesem Jahr berichten wir beispielhaft
über
Multikomponentenverfahren zur
Bestimmung polarer Pflanzenschutzmittelwirkstoffe
Für eine Vielzahl von Pflanzenschutzmittelwirkstoffen sind Grenzwerte für Lebensmittel in der Rückstands-Höchstmengenverordnung (RHmV) angegeben. Es werden
daher laufend Lebensmittel, aber auch
deren Ausgangsprodukte, auf diese Wirkstoffe untersucht. Um nicht für jede Substanz ein eigenes Verfahren anwenden zu
müssen, werden möglichst viele Substanzen
in Multikomponentenverfahren gemeinsam
analysiert. Ein sehr häufig eingesetztes
Verfahren erlaubt die gemeinsame Analyse
von über 400 Wirkstoffen und deren Abbauprodukten mit Hilfe der Gaschromatographie (GC) und verschiedenen Detektionsmethoden. Es gibt jedoch viele Wirkstoffe und
insbesondere Abbauprodukte, die schwer-
at the institute, many working in grantfunded projects (grantees: federal, state,
and local government and offices;
foundations; industry; EC; and DFG).
flüchtig oder bei hohen Temperaturen instabil sind und deshalb nicht mit der Gaschromatographie analysiert werden können. Für
diese Substanzen mussten bisher sehr
umständliche, störanfällige und teure Analysenverfahren angewendet werden.
Durch die erfolgreiche Kopplung von
Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie (LC/MS) steht ein sehr selektives und empfindliches Analysenverfahren
zur Verfügung, mit dem prinzipiell diese
schwerflüchtigen und empfindlichen Substanzen bestimmt werden könnten. Damit
stellt ein auf der LC/MS basierendes Multikomponenten-Analysenverfahren eine
dringend benötigte Ergänzung zur bisherigen Analytik von Pflanzenschutzmitteln dar.
Bisher war aber fraglich, ob die LC/MS
wirklich für eine Multikomponenten-Analytik
geeignet ist. Dieser Frage wurde in einem
von der Deutschen Forschungsgemeinschaft
Abb. 1: Flüssigkeitschromatograph HP 1100 mit Massenspektrometer API 2000
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a) ESI (+)
3.2e4
3.0e4
2.8e4
2.6e4
2.4e4
2.2e4
2.0e4
1.8e4
1.6e4
1.4e4
1.2e4
1.0e4
8000
6000
4000
2000
0.0
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Pirimicarb
m/z 239 씮 72
1.20e4
1.10e4
b) ESI (–)
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Dichlorprop
m/z 233 씮 161
1.00e4
9000
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0.0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Zeit (min)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Zeit (min)
Abb. 2: Chromatogramme von Pirimicarb (10 pg/µl) und Dichlorprop (10 pg/µl) in einer komplexen
Raps-Matrix
(DFG) unterstützten Forschungsvorhaben
am Institut für Ökologische Chemie nachgegangen. Anhand von über 100 der wichtigsten Pflanzenschutzmittelwirkstoffe und
Metaboliten mit sehr unterschiedlichen
physikalisch-chemischen Eigenschaften
sollte geklärt werden, ob und unter welchen
Bedingungen die LC/MS für diese Substanzen eine robuste und sichere Analysenmethode darstellen kann. Zudem musste ein
geeignetes Aufarbeitungsverfahren für sehr
unterschiedliche Lebensmittel entwickelt
werden, das die sichere und möglichst
kostengünstige Analyse erlaubt.
Das für diese Untersuchung verwendete
LC/MS-System ist ein Triple-QuadrupolMassenspektrometer API 2000 der Fa.
Applied Biosystems, kombiniert mit einem
Flüssigkeitschromatographen HP 1100 der
Fa. Agilent (Abb. 1). Als Kopplung beider
Geräte können wahlweise zwei Techniken
eingesetzt werden: die Elektrospray Ionisierung (ESI) und die Atmospheric Pressure
Chemical Ionisierung (APCI). Beide Techniken ionisieren die aus der LC eluierenden
Substanzen unter Atmosphärendruck, und
diese gelangen über verschiedene Linsensysteme in den Vakuumteil des Massenspektrometers. Hier wird durch drei in Reihe
angeordnete Quadrupol-Massenfilter und
eine weitere Ionisierung der Analyten eine
hervorragende Selektivität der Messung
erreicht. Für eine möglichst empfindliche
Analyse müssen eine Reihe von Gasflüssen,
Temperaturen, Linsenspannungen und
Potentiale im Massenspektrometer optimiert
werden. Die meisten Parameter sind substanzunabhängig, es müssen aber neben
Ausgangsion und Tochterion bis zu 6 Parameter für jede einzelne Substanz optimiert
werden. Ist diese Arbeit einmal getan, können die optimierten Parameter in Methoden
für Interface und Massenspektrometer
zusammengefasst werden. Zusammen mit
den optimierten Parametern der LC-Methode lassen sich nun die über 100 Wirkstoffe
und Metaboliten analysieren.
Der Vergleich der Ionisierung mit ESI und
APCI zeigte, dass nur wenige Substanzen
ein höheres Signal mit APCI erreichten.
Daher wurden die Analysen einheitlich mit
ESI durchgeführt, allerdings mit verschiedenen Polaritäten. Die Säuren, Phenole sowie
einige Wirkstoffe aus der Gruppe Benzoylharnstoffe und Phenylharnstoffe zeigten
deutlich höhere Signale nach Ionisierung
mit negativer Polarität, während die anderen Wirkstoffe bessere Ergebnisse mit positiver Polarität erbrachten. Es wurden daher
zwei Analysenmethoden entwickelt, um alle
Substanzen analysieren zu können. Außer
für einige wenige Wirkstoffe konnten mit
einem Injektionsvolumen von 10 µl Bestimmungsgrenzen von 100 fg/µl bis 10 pg/µl
erreicht werden. Damit ist die LC/MS empfindlich genug, um Konzentrationen im
Bereich der niedrigsten Grenzwerte in
Lebensmitteln nach RHmV (10 µg/kg) sicher
analysieren zu können.
Die doppelte Ionisierung und Massense-
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Probe
Vorzerkleinerung mit der Labormessermühle
Extraktion mit dem Dispergiergerät
Methanol/Wasser bzw. Aceton/Wasser
2
Flüssig-flüssig-Verteilung
an Hydromatrix
3
1
ChemElut (Varian)
Dichlormethan
Festphasenextraktion
an SDB
HR-P (Macherey&Nagel)
Aceton
Flüssig-flüssig-Verteilung
Aceton/Ethylacetat/Cyclohexan
Aceton/Wasser
Size-Exclusion-Chromatography
SX3 (BioBeads)
Ethylacetat/Cyclohexan
Festphasenextraktion
Oasis MAX
1. Ethylacetat/Cyclohexan/Aceton
2. 2% Ameisensäure in Aceton
Abb. 3: Verschiedene Verfahren zur Extraktreinigung nach Aceton/Wasser- oder Methanol/WasserExtraktion
lektion erlaubt eine einzigartige Selektivität,
so dass selbst in einer komplexen Matrix,
wie z.B. einem Rapsextrakt, keine Interferenzen im Chromatogramm auftreten, wie in
Abbildung 2 zu erkennen ist. Prinzipiell
könnte deshalb nach der Extraktion auf eine
Extraktreinigung verzichtet werden. Entsprechende Versuche zeigten aber schnell,
dass die mitextrahierten Matrixbestandteile
zu einer Verschmutzung der Ionenoptik
führten und damit zu einer Verringerung
der Empfindlichkeit. Gravierender waren
aber die sogenannten Matrixeffekte.
Dabei handelt es sich um eine Verstärkung
oder, in der LC/MS häufiger, eine Verminderung des Signals durch gleichzeitig eluierende Matrixbestandteile. Diese Substanzen
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werden zwar im Chromatogramm nicht
sichtbar (Abb. 2), sie können aber während
der Ionisierung zu einer Veränderung der
Ionenausbeute führen und damit z.B. zu
einem kleineren Signal eines Analyten in
der Probe im Vergleich zum Kalibrierstandard. Diese Signaländerung kann bis zu
90 % betragen und würde das Analysenergebnis extrem verfälschen.
Daher wurden im Institut für Ökologische
Chemie verschiedene Strategien überprüft,
die Matrixeffekte zu verringern oder trotz
der Matrixeffekte ein korrektes Ergebnis zu
erzielen. Eine Möglichkeit besteht darin, die
störenden mitextrahierten Begleitstoffe
durch eine intensive Extraktreinigung vollständig abzutrennen. Dazu wurde die Multi-
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methode DFG-S19 erweitert, so dass nach
einer Aceton/Wasser-Extraktion eine Flüssigflüssig-Verteilung, eine Size-ExclusionChromatography (SEC) und eine Festphasen-Aufreinigung (SPE) an einem Anionenaustauscher durchgeführt wurden. Als
Alternative wurden zwei einfache Reinigungsverfahren nach Methanol/WasserExtraktion durchgeführt, eine einfache
Flüssig-flüssig-Verteilung mit Hilfe von
Hydromatrix und eine Festphasenextraktion
an einem hydrophoben Styrol-Divinylbenzol-Polymer (SDB) (Abb. 3). Diese drei Verfahren wurden mit verschiedenen Pflanzenproben durchgeführt, die stark unterschiedliche Wasser-, Säure- und Fettgehalte
aufwiesen. Für die meisten Probenarten
reichten die einfachen Reinigungsverfahren
aus, um die Matrixeffekte auf ein akzeptables Maß zu reduzieren. Bei einigen Matrizes
wie Hopfen, Oliven oder Raps traten jedoch
selbst nach intensiver Extraktreinigung
beträchtliche Signalreduktionen auf.
Obwohl ein Großteil der mitextrahierten
Probenbestandteile durch die verschiedenen
Prozesse eliminiert werden konnte, blieb ein
Teil der störenden Substanzen mit ähnlichen
physikalischen Eigenschaften wie die der
Analyten im Extrakt zurück. Die intensive
Extraktreinigung zeigte dabei keine Vorteile
gegenüber der einfachen Extraktreinigung
mit SDB.
Eine weitere Möglichkeit, die Matrixeffekte
zu neutralisieren, ist der Einsatz von isotopenmarkierten internen Standards. Die
Untersuchungen ergaben exakte Ergebnisse
trotz starker Matrixeffekte. Leider kann diese
Methode nur für wenige Analyten eingesetzt
werden, da zur Zeit nur eine geringe Zahl
an isotopenmarkierten Wirkstoffen erhältlich
ist.
Gute Möglichkeiten, exakte Ergebnisse zu
erzielen, sind die Kalibrierung über Matrixstandards, d.h. die Kalibrierlösung wird in
einem nicht belasteten Extrakt der zu untersuchenden Matrix angesetzt, bzw. die Standardaddition, d.h. die Kalibrierlösung wird
der Probe in verschiedenen Konzentrationen
direkt zugesetzt. Damit erfolgt die Signalunterdrückung in Probe und Kalibrierstandard gleichermaßen. Beide Methoden sind
deutlich aufwändiger, führen aber zu richtigen Ergebnissen.
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Abb. 4: Extraktion einer Reis-Probe
Am Institut für Ökologische Chemie wurde
schließlich ein Verfahren entwickelt, mit
dem mehr als 100 Wirkstoffe und Metaboliten selbst in komplexen Matrizes schnell
und sicher bestimmt werden können. Die
Extraktion wird mit Methanol im Dispergiergerät durchgeführt, ein Aliquot mit 0,1 %
Phosphorsäure verdünnt, an einer SDBFestphase gereinigt und im LC/MS mit zwei
verschiedenen Methoden analysiert (Abb. 4).
Nach dem gleichen Verfahren wird aus einer
unbelasteten Probe ein Extrakt hergestellt,
mit einer bestimmten Menge der zu analysierenden Substanzen versetzt und als
Matrixstandard zur Kalibrierung verwendet.
Neben der Analyse von pflanzlichen Proben
kann das Verfahren mit leichten Modifikationen ebenso für die Bestimmung von Pflanzenschutzmittelwirkstoffen in anderen Umweltproben eingesetzt werden.
Das Verfahren wurde bereits für die Analyse von Wasser-, Boden-, Sediment- und
Pflanzenproben erfolgreich eingesetzt.
Die Kalibrierung erfolgte dabei über interne
Standards bzw. durch Standardaddition.
Die Bestimmungsgrenzen lagen deutlich
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unterhalb der in der Trinkwasserverordnung
(TVO) und in der RHmV für Nahrungsmittel
festgesetzten Grenzwerte.
Das Verfahren wird auch in Zukunft in
vielen Projekten am IÖC eingesetzt werden
können und damit die Anzahl der analysier-
Zusammenarbeit
Sechs Wissenschaftler des Instituts nehmen Lehrverpflichtungen an der Technischen Universität München,
der Ludwig-Maximilians-Universität München und der
Technischen Universität Graz wahr.
Die Mitarbeiter des Instituts sind Mitglieder bzw. Berater
nationaler und internationaler Organisationen und
Gremien (ACS: Fachgruppen „Anorganische Chemie“
und „Umweltanalytik“; ARGE Alpen-Adria: Arbeitsgruppe „Immissionen und Waldschäden“; BMBF: Projektträger „Umwelt- und Klimaforschung“; DFG: Senatskommission „Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe“,
Arbeitskreise „Analysen in biologischem Material“ und
„Luftanalysen“; DGMK: Fachgruppe „Analytik“; DIN:
Ausschuss „Gefahrstoffe/Arbeitsschutz“; EUROSTAR:
Auditcommission „Thermoanalyse und Thermodynamik“; GDCh: Fachgruppen „Analytische Chemie“,
„Kernmagnetische Resonanz“ und „Umweltchemie und
Ökotoxikologie“, Diskussionskreis „Analytik im Umwelt-
baren Substanzen beträchtlich erhöhen. Da
diese bisher analysierten Substanzen einen
sehr großen Polaritätsbereich umfassen,
können auch andere Substanzen leicht
integriert werden und das Verfahren damit
laufend erweitert werden.
schutz“; GMS: Wissenschaftlicher Beirat; GUC-VDI:
Fachausschuss „Produktionsintegrierte Wasser-/Abwassertechnik“; ICTAC: Fachgruppe „Thermoanalyse“,
Arbeitsgruppe „Environmental Workgroup“; SECOTOX;
VDI/DIN: Kommission „Reinhaltung der Luft“, Arbeitskreise „Messen von PCP/Lindan“, „Messen von Dioxinen“ und „Passivsammler“; WWF/Ford Foundation:
Forschungsprogramm „Conservation of the
Mediterranean Monk Seal“).
Das IÖC kooperiert mit zahlreichen Forschungseinrichtungen im In- und Ausland (Albanien, Australien,
Belgien, China, Dänemark, Estland, Finnland, Frankreich,
Griechenland, Indien, Israel, Italien, Japan, Jordanien,
Kenia, Marokko, Niederlande, Norwegen, Österreich,
Polen, Rumänien, Russland, Schweiz, Spanien,
Slowakische Republik, Südafrika, Thailand, Tschechische
Republik, Türkei, Ungarn, USA, Vietnam).
Ausgewählte Veröffentlichungen
Dorfner, R., Ferge, T., Kettrup, A., Zimmermann, R.,
Yeretzian, C.: Real-time monitoring of 4-vinylguaiacol,
guaiacol, and phenol during coffee roasting by resonant
laser ionization time-of-flight mass spectrometry. J.
Agric. Food Chem. 51, 5768-5773 (2003)
Li, X., Matuschek, G., Herrera, M., Wang, H., Kettrup, A.:
Investigation of pyrolysis of Chinese coals using thermal
analysis/mass spectrometry. J. of Thermal Analysis and
Calorimetry 71, 601-612 (2003)
Michalke, B.: Element speciation definitions, analytical
methodology, and some examples. Ecotoxicology and
Environmental Safety 56, 122-139 (2003)
208 GSF
Pfister, G., Jüttner, I., Severin, G., Schramm, K.-W.,
Kettrup, A.: Controlled release experiments with nonylphenol in aquatic microcosms. Environmental Toxicology
and Chemistry 22, 182-188 (2003)
Schmitt-Kopplin, Ph., Junkers, J.: Capillary zone electrophoresis of natural organic matter. J. of Chromatography
A 998, 1-20 (2003)