Aufbau eines Messsystems zur optischen Online

Transcription

BACHELOR-THESIS
Aufbau eines Messsystems zur
optischen Online-Analytik im Bioreaktor
ausgeführt im Fachbereich Medizintechnik
der Fakultät für Mechatronik - und Medizintechnik
an der Hochschule Ulm
vorgelegt von
Fabian Lissek
Matrikelnummer: 44242
Datum: 15. Juli 2011
Betreuer:
Erstprüfer:
Zweitprüfer:
Dipl. Ing. Rudolf Miller
Prof. Dr. rer. nat. Martin Heÿling
Prof. Dr. med. Dr.-Ing. Ronald Blechschmidt-Trapp
Bearbeitungszeitraum:
März 2011 - Juli 2011
I
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit versichere ich, Fabian Lissek, dass ich die vorliegende Bachelor-Thesis mit dem
Thema:
Aufbau eines Messsystems zur optischen Online-Analytik im Bioreaktor
im Fachbereich Medizintechnik/Biotechnologie der Fakultät Mechatronik und Medizintechnik an der Hochschule Ulm, selbstständig verfasst und keine anderen als die angegebenen
Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.
Ort, Datum
Unterschrift
II
Danksagung
An dieser Stelle bedanke ich mich besonders bei Herrn Professor Dr. rer. nat. Martin Heÿling
und Herrn Professor Dr. med. Dr.-Ing. Ronald Blechschmidt-Trapp für ihre Betreuung während meiner Bachelor-Thesis.
Weiterer Dank gilt Herrn Dipl. Ing. Rudolf Miller, welcher mir mit seinem Sachverständnis, insbesondere im biotechnologischen Fachbereich, stets zur Seite stand.
Auÿerdem bedanke ich mich bei Herrn Dipl. Ing. Steen Maier und Herrn Gerhard Keller
für ihr freundliche Unterstützung in mechanischen und motortechnischen Fragestellungen,
sowie für die Versorgung mit Materialien jeglicher Art.
Zu guter Letzt möchte ich mich von Herzen bei meinen Eltern und bei meiner Freundin
Alexandra für den starken Rückhalt bedanken, den ich während meines gesamten Studiums
und dieser Arbeit erfahren durfte.
III
Zusammenfassung
In der folgenden Arbeit wird der Aufbau und die Erprobung eines Messsystems zur Detektion
von Fluoreszenz in einem 7l Laborfermenter der Fakultät für Mechatronik und Medizintechnik der Hochschule Ulm behandelt. Das Messsystem soll in der Zukunft zur Online-Analytik
genutzt werden um die aktuelle Glukosekonzentration während eines Fermentationsprozesses
der Hefe Saccharomyces cerevisiae zu bestimmen. Der Messaufbau besteht aus einer UV-VIS
Lichtquelle, der Tauchsonde FDP-7IR200-2-VAR der Firma Avantes und dem Spektrometer
RedTide USB-650 der Firma OceanOptics.
Zum Vergleich verschiedener Möglichkeiten Fluoreszenz anzuregen, wurde die UV-VIS
Lichtquelle durch Hochleistungs-LEDs von LED-Engin, als auch durch die Motorisierung eines manuellen Monochromators aus dem Spektralphotometer Spekol 11 der Firma Zeiss umgesetzt. Durch eine Motor-Getriebe-Kombination der Firma Maxon Motor sowie die in LabView realisierte Steuerungssoftware kann der Monochromator mittels RS232-Schnittstelle
über den PC betrieben werden. Ebenfalls Inhalt der Arbeit ist die Konstruktion eines speziell für diesen Zweck ausgelegten Motorgehäuses, die Diskussion der Möglichkeiten Licht in
optische Fasern einzukoppeln sowie die Feststellung der Nachweisgrenzen des Messsystems
mittels Verdünnungsreihen von Chlorophyll a und Chininsulfat.
Die Tauglichkeit des Messsystems wurde schlieÿlich durch Modellversuche im Schüttelkolben sowie durch eine Batchfermentation von Saccharomyces cerevisiae im Laborfermenter
der Hochschule Ulm belegt. Durch die Ergebnisse der Verdünnungsreihen konnte eine ausreichende Empndlichkeit des Messsystems nachgewiesen werden. Auÿerdem war es möglich
den Fermentationsprozess durch den Verlauf der Fluoreszenzsignale nachzuvollziehen, woraus eine gute Eignung des Messaufbaus für die Onlineanalytik resultiert.
IV
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung und Aufgabenstellung
1
2 Grundlagen
3
2.1
Optische Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
2.1.1
Prinzip der Luminiszenz
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4
2.1.2
Bedeutung von Biouorophoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
2.1.3
Aufbau eines Gittermonochromators
. . . . . . . . . . . . . . . . . .
8
2.2
Chlorophyll und Chininsulfat
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11
2.3
Der Organismus Sacharomyces cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13
2.4
Fermentationstechnik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
15
2.4.1
Fermentationsprozess . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
15
2.4.2
Aufbau und Regelung eines Bioreaktors . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
3 Material und Methode
3.1
3.2
3.3
Materialien
20
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
20
3.1.1
Laborfermenter der Hochschule Ulm
. . . . . . . . . . . . . . . . . .
20
3.1.2
Lichtquellen zur Fluoreszenzanregung . . . . . . . . . . . . . . . . . .
22
3.1.3
Tauchsonde FDP-7IR200-2-VAR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
23
3.1.4
Spektrometer RedTide USB-650 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24
3.1.5
Mikrobanksystem der Firma Linos
. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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26
3.2.1
Dimensionierung des Motors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
26
3.2.2
Konstruktion des Motorgehäuses
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
29
3.2.3
Programmierung der Motorsteuerung . . . . . . . . . . . . . . . . . .
32
3.2.4
Kalibrierung des Motors
35
Automatisierung des Monochromators
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Optimierung der Lichteinkopplung
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
37
3.3.1
Lichteinkopplung am Monochromator . . . . . . . . . . . . . . . . . .
37
3.3.2
Aufbau einer LED-Lichtquelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
38
3.3.3
Problematik der Lichteinkopplung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
41
V
3.4 Versuchsübersicht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4.1 Aufbau der Fluoreszenzmessungen . . . . . . . . . . . . .
3.4.2 Verdünnungsreihen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4.3 Fluoreszenzdetektion von S. cerevisiae im Schüttelkolben
3.4.4 Batch-Fermentation von S. cerevisiae im Bioreaktor . . .
4 Ergebnisse
4.1
4.2
4.3
4.4
Motorsteuerung und Lichtausbeute . . . . . . . . . . . .
Bestimmung der Nachweisgrenzen . . . . . . . . . . . . .
Fluoreszenzdetektion von S. cerevisiae im Schüttelkolben
Batch-Fermentation von S. cerevisiae im Bioreaktor . . .
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5 Schlussfolgerung und Ausblick
71
Literaturverzeichnis
72
A Anhang
74
A.1 Zeichnungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
A.2 Quellcode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
A.3 Datenblätter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
VI
Abbildungsverzeichnis
Abb. 2.1: Übersicht zu verschiedenen Anwendungsgebieten der Optischen Spektroskopie 21 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Abb. 2.2: Fluoreszierendes Chlorophyll im Oinemessaufbau bei einer Anregungswellenlänge von 460 nm (Beleuchtung über Faser und Kollimatorlinse von links) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Abb. 2.3: Anregungs- und Emissionswellenlängen von Porphyrinen (rot) 11 . . .
Abb. 2.4: Anregungs- und Emissionswellenlängen von NADH (oben) und FAD
(unten) 11 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Abb. 2.5: Zusammenfassung der Stowechselpfade in der Glykolyse und dem Citratcyklus Beteiligte Biouorophore sind Orange markiert 15 . . . . .
Abb. 2.6: Beugungsprinzip am Reexionsgitter 8 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Abb. 2.7: Anordnung des Monochromators aus dem Messsystem Spekol 11 . . .
Abb. 2.8: Der Monochromator aus dem optischen Messsystem Spekol 11 der Firma Zeiss . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Abb. 2.9: Absorptions- und Fluoreszenzspektrum von Chlorophyll a 22 . . . . .
Abb. 2.10: Blau uoreszierendes Chininsulfat 11 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Abb. 2.11: Absorptions- und Fluoreszenzspektrum von Chininsulfat in Schwefelsäure 11 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Abb. 2.12: Darstellung der verschiedenen Wachstumsphasen währen einer BatchFermentation 13 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Abb. 2.13: Schematische Darstellung eines Rührkesselreaktors 17 . . . . . . . . .
Abb. 3.1: Der Laborfermenter der Fakultät für Medizintechnik und Mechatronik
der Hochschule Ulm 13 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Abb. 3.2: Spektrum der Hochdruck-Quecksilberdampampe HgE/3 6 . . . . . .
Abb. 3.3: Schematische Darstellung der Tauchsonde FDP-7IR200-2-VAR der Firma Avantes 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Abb. 3.4: Die Tauchsonde FDP-7IR200-2-VAR der Firma Avantes . . . . . . . .
Abb. 3.5: Spektrometer RedTide USB-650 von OceanOptics . . . . . . . . . . .
Abb. 3.6: Das Vier-Stangen-Systems von Linos Hier: Fokussierung von Licht auf
eine Faser mittels einer Linse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Abb. 3.7: Würfel zur Oinemessung von Fluoreszenz in einer Küvette . . . . .
Abb. 3.8: Mechanisches Funktionsprinzip des Monochromators . . . . . . . . .
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VII
Abb. 3.9: Motor Maxon EC-max 30 [1], Getriebe Maxon GP 42 C [2], Encoder
HEDL 5540 [3], Positionssteuerung EPOS2 24/5 [4] . . . . . . . . . . 28
Abb. 3.10: Die Einzelkomponenten des Motorgehäuses . . . . . . . . . . . . . . . 29
Abb. 3.11: An der Kupplung montierter Motor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
Abb. 3.12: Montierter Motor mit Gehäuse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
Abb. 3.13: Ursprüngliche mechanische Wellenlängenbegrenzung des Monochromators . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
Abb. 3.14: Initialisierungsdialog der Steuerungssoftware . . . . . . . . . . . . . . 32
Abb. 3.15: Programmoberäche der Steuerungssoftware . . . . . . . . . . . . . . 33
Abb. 3.16: Lampengehäuse des Monochromators . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
Abb. 3.17: Regressionsgerade zur Bestimmung der Proportionalitätsfaktors . . . 36
Abb. 3.18: Montage des SMA-Adapters am Monochromator . . . . . . . . . . . . 37
Abb. 3.19: Schematische Darstellung der Lichteinkopplung am Ausgangsspalt (Draufsicht) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
Abb. 3.20: Die Spektren der drei LED-Lichtquellen von LED-Engin . . . . . . . 39
Abb. 3.21: LED-Lichtquelle mit den Anregungswellenlängen 365 nm, 400 nm und
460 nm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
Abb. 3.22: LED-Fasereinkopplung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
Abb. 3.23: Schematische Darstellung der Lichteinkopplung im LED-Gehäuse (Draufsicht) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
Abb. 3.24: Schematische Darstellung der numerischen Apertur am Lichtwellenleiter 42
Abb. 3.25: Schematische Darstellung des Aufbaus zur Oine- und Atlinemessung 43
Abb. 3.26: Schematische Darstellung des Aufbaus zur Onlinemessung . . . . . . 44
Abb. 3.27: Diagramm zur Ermmittlung der Nachweisgrenze . . . . . . . . . . . . 46
Abb. 3.28: Versuchsaufbau der Fluoreszenzdetektion im Schüttelkolben . . . . . 48
Abb. 3.29: Lampenspektrum einer Halogenlampe mit und ohne Kantenlter . . . 49
Abb. 4.1: Leistungen der Lichtquellen des Monochromators nach Einkopplung
in eine Faser mit 1000 µm (*gemessen bei der Detektionswellenlänge
405 nm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Abb. 4.2: Intensität der Chlorophylluoreszenz bei 644 nm Anregungswellenlänge: 460 nm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Abb. 4.3: Intensität der Fluoreszenz von Chininsulfat bei 480 nm Anregungswellenlänge: 365 nm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Abb. 4.4: Fluoreszenzspektren der verschiedenen Medien Synth. Medium (Tauchsonde), YPD-Medium (Küvette) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Abb. 4.5: Fluoreszenzspektrum der Hefe S. cerevisiae mit und ohne Anwendung
eines Kantenlters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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VIII
Abb. 4.6: Zeitlicher Verlauf der Fluoreszenz von NADH bei Zugabe von Ethanol
Anregungswellenlänge: 365 nm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Abb. 4.7: Zeitlicher Verlauf der Fluoreszenz von FAD bei Zugabe von Ethanol
Abb. 4.8: Zeitlicher Verlauf der Fluoreszenz von NADH bei Zugabe von Glukose
Abb. 4.9: Zeitlicher Verlauf der Fluoreszenz von FAD bei Zugabe von Glukose
Abb. 4.10: Fluoreszenzspektrum von NADH nach Zugabe von 5 ml Ethanol Anregungswellenlänge: 365 nm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Abb. 4.11: Fluoreszenzspektrum von NADH nach Zugabe von 500 mg Glukose
Abb. 4.12: Fluoreszenzsignal der Hefe in den ersten sechs Stunden der BatchFermentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Abb. 4.13: Fluoreszenzverlauf von NADH Anregungswellenlänge: 365 nm . . . . .
Abb. 4.14: Aufzeichnung der Prozessgröÿen OUR, RQ und O2 und OD (Gleitender Durchschnitt 10. Ordnung) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Abb. 4.15: Auswertung der Zellzählung mittels der Neubauer Zählkammer (Polynomische Trendlinie 3. Ordnung) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Abb. 4.16: Ethanolzugabe und anschlieÿende Erhöhung der Rührerdrehzahl sowie
Abschalten der Begasung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Abb. 4.17: Fluoreszenzmessung während einer Batchfermentation mittels Durchussküvette Anregungswellenllänge: 460nm . . . . . . . . . . . . . .
70
Abb. A.1:
Abb. A.2:
Abb. A.3:
Abb. A.4:
Abb. A.5:
Abb. A.6:
Abb. A.7:
Abb. A.8:
Abb. A.9:
Abb. A.10:
Abb. A.11:
Abb. A.12:
Abb. A.13:
Abb. A.14:
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Schaltplan der LED-Lichtquelle . . . . . . . .
Konstruktionszeichung des Führungsringes . .
Konstruktionszeichung des Motorgehäuses . .
Konstruktionszeichung des Metallstifts . . . .
Konstruktionszeichung der Kupplung . . . . .
Konstruktionszeichung des LED-Kühlkoerpers
Konstruktionszeichung der SMA-Aufnahme . .
Initialisierung der Ports . . . . . . . . . . . .
Schlieÿen der Ports . . . . . . . . . . . . . . .
Quellcode der Motorsteuerung (Sequenz 0/6) .
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IX
Abb. A.15: Quellcode der Motorsteuerung (Sequenz 5/6) . . . . . . . . . . . . . .
87
Abb. A.16: Quellcode der Motorsteuerung (Sequenz 6/6) . . . . . . . . . . . . . .
88
Abb. A.17: Abbildung des Spektralphotometers Spekol11 von Zeiss . . . . . . . .
89
Abb. A.18: Technische Daten des Spektralphotometers Spekol11 von Zeiss . . . .
90
Abb. A.19: Technische Daten des Elektromotors EC-Max 30 . . . . . . . . . . . .
91
Abb. A.20: Technische Daten des Getriebes GP 42 C . . . . . . . . . . . . . . . .
92
Abb. A.21: Technische Daten des Encoders HEDL 5540
. . . . . . . . . . . . . .
93
Abb. A.22: Technische Daten der Positionssteuerungen von Maxon (1/2) . . . . .
94
Abb. A.23: Technische Daten der Positionssteuerungen von Maxon (2/2) . . . . .
95
Abb. A.24: Auszug aus "Hardware Referenceÿur Berechnung der Spannungsversorgung des EPOS
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
96
Abb. A.25: Datenblatt der Spannungsversorgung für das EPOS (1/2) . . . . . . .
97
Abb. A.26: Datenblatt der Spannungsversorgung für das EPOS (2/2) . . . . . . .
98
Abb. A.27: Technische Daten der Durchussküvette 131-QS . . . . . . . . . . . .
99
Abb. A.28: Auszug aus dem Datenblatt der 365nm LED von LED-Engin (1/2)
.
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Abb. A.34: Datenblatt des LED-Konverters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
106
X
Tabellenverzeichnis
Tab. 2.1: Anregungs- und Emmissionsmaxima endogener Fluorophore 19, 10 . . . 5
Tab. 2.2: Reaktionsgleichungen der Stowechselvorgänge Atmung und Gärung
der Hefezelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
Tab. 2.3: Reaktionsgleichungen des Crabtree-Eekts und der Atmung mit Ethanol als Substrat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
Tab. 3.1: Auistung der durch das Sensorsytem erfassbaren Gröÿen am Bioreaktor der Hochschule Ulm 7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tab. 3.2: Kenndaten der Motor-Getriebe-Kombination von Maxon . . . . . . .
Tab. 3.3: Kenndaten des Motors zur Errechnung der Spannungsversorgung für
das EPOS2 24/5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tab. 3.4: Parameter des Initialisierungsdialoges . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tab. 3.5: Zusammensetzung des synthetischen Kulturmediums welches für die
Fluoreszenzmessung der Hefe im Schüttelkolben sowie für die BatchFermentation genutzt wurde . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tab. 3.6: Auistung der für die Bestimmung der Nachweisgrenzen verwendeten
Substanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tab. 3.7: Konzentration der Substanzen im jeweiligen Lösungsmittel . . . . . .
Tab. 3.8: Umgebungsbedingunen bei der Batch-Fermentation . . . . . . . . . .
Tab. 4.1: Leistungsmessung nach der Einkopplung in Lichtwellenleiter mit verschiedenen Durchmessern Lichtquelle: Monochromator . . . . . . . . .
Tab. 4.2: Leistungsmessung nach der Einkopplung in Lichtwellenleiter mit verschiedenen Durchmessern Lichtquelle: LED . . . . . . . . . . . . . . .
Tab. 4.3: Nachweisgrenzen der Verdünnungsreihen von Chlorophyll a und Chininsulfat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tab. 4.4: Ergebnisse der Verdünnungsreihen mit Chlorophyll a . . . . . . . . .
Tab. 4.5: Ergebnisse der Verdünnungsreihen mit Chininsulfat . . . . . . . . . .
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55
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XI
Abkürzungsverzeichnis
(N H4 )2 SO4
Ammoniumsulfat
Abb.
Abbildung
AT P
Adenosintriphosphat
CaCl2
Calciumchlorid
CCD
Charge-Coupled Device
CoA
Coenzym A
CuSO4
Kupfersulfat
EP OS
Easy to Use Positioning System
F AD
Flavin-Adenin-Dinukleotid, oxidierte Form
F ADH2
Flavin-Adenin-Dinukleotid, reduzierte Form
F eCl3
Eisen-III-Chlorid
F MN
Flavinmononucleotid
F W HM
Full Width at Half Maximum, Halbwertsbreite
Gl.
Gleichung
KCl
Kaliumchlorid
LED
Light Emitting Diode, Leuchtdiode
M gSO4
Magnesiumsulfat
M nSO4
Mangansulfat
NA
Numerische Apertur
N AD
Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid, oxidierte Form
N ADH
Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid, reduzierte Form
N ADP
Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat, oxidierte Form
XII
N ADP H
Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat, reduzierte Form
N H 4 H2 P O4
Ammoniumdihydrogenphosphat
OD
Optische Dichte
OU R
Oxygen Uptake Rate
pCO2
Partialdruck des Kohlenstodioxid
P MMA
Polymethylmethacrylat
pO2
Partialdruck des Sauerstos
ppb
Parts Per Million
RQ
Respiratorischer Quotient
RS232
Recommended Standard 232
SM A
Sub-Miniature-A
T ab.
Tabelle
U SB
Universal Serial Bus
U V /V IS
Ultravioletter und sichtbarer Wellenlängenbereich
Y PD
Yeast Peptone Dextrose
ZnSO4
Zinksulfat
1. Einleitung und Aufgabenstellung
1
In der Chemie und Biotechnologie werden viele Produkte durch die Kultivierung von Mikroorgansimen gewonnen. Ein wesentlicher Bestandteil bei der Produktherstellung ist die
Steuerung und Regelung der Prozesse zur Qualitätskontrolle. Durch die routinemäÿige Überwachung von Parametern wie pH-Wert, Temperatur, pO 2 oder pCO2 können Informationen
über den aktuellen Verlauf der Produktherstellung gewonnen werden und bei evtl. Veränderungen kann zeitnah eingegrien werden. Während die oben genannten Gröÿen jedoch
online, direkt im Bioreaktor gemessen werden können, gibt es auch Substanzen wie Glukose
und Ethanol z.B. bei der Fermentation der Hefe Sacharomyces cerevisiae, bei denen dies nicht
möglich ist. In den letzten Jahren wurden vermehrt optische Messmethoden zur Prozesskontrolle eingesetzt und weiterentwickelt. Neben Messverfahren wie der In-situ-Mikroskopie zur
Feststellung von Zellzahl und Zellgröÿe erfreut sich auch die optische Spektroskopie groÿer
Beliebtheit. 20 Mit ihrer Hilfe können Biouorophore, die im Stowechsel eine wichtige Rolle
spielen, ohne Zeitverzögerung gemessen werden. Da vor allem die Stoe Glukose und Ethanol
bei den Stowechselvorgängen von Hefe mit einbezogen werden, kann durch Beobachtung
der Fluorophore auf die aktuelle Konzentration dieser Substanzen rückgeschlossen werden.
Das Ziel der Arbeit ist der Aufbau einer Messvorrichtung zur Detektion von Fluoreszenz
und Absorption im Laborfermenter der Fakultät für Mechatronik und Medizintechnik der
Hochschule Ulm. Dazu soll Licht einer UV/VIS-Lichtquelle über eine Tauchsonde in einen
Bioreaktor eingekoppelt werden. Die Tauchsonde ermöglicht sowohl Fluoreszenz- als auch
Absorptionsmessungen innerhalb des Reaktors. Die Auswertung der Signale soll über ein
einfaches Spektrometer erfolgen. Zur Umsetzung dieser Aufgabenstellung lässt sich die Arbeit in mehrere Teilbereiche untergliedern.
An erster Stelle steht der Aufbau einer Lichtquelle zur Fluoreszenzanregung. Zum einen
werden LEDs in den entsprechenden Anregungswellenlängen genutzt und zum anderen gibt
es die Möglichkeit einen Monochromator zu motorisieren, um eine PC-gesteuerte durchstimmbare Lichtquelle zu erhalten. Für beide Lichtquellen wird eine Vorrichtung zur Einkopplung des Lichts in eine optische Faser der Tauchsonde benötigt. Desweiteren müssen die verschiedenen Systeme auf ihre Funktionalität überprüft werden. Anhand von gut
uoreszierenden Substanzen wie Chlorophyll und Chininsulfat sollen z.B. Auösung, ScanGeschwindigkeit und typische Nachweisgrenzen für Fluorophore überprüft werden.
2
Nach Aufbau des Messsystems wird zunächst versucht Fluoreszenz zu detektieren, welche durch die Stowechselvorgänge der Hefe Sacharomyces cerevisiae hervorgerufen wird.
Dies kann zum einen durch Nutzung der Tauchsonde sowie auch durch Oine- oder Bypassmessungen im Modelversuch in einem Schüttelkolben erfolgen. Hauptziel ist schlieÿlich die
Durchführung von Fluoreszenzessungen und die Auswertung der Ergebnisse bei einer Fermentation von Sacharomyces cerevisiae im Bioreaktor der Hochschule Ulm. Diese Messung
sollte idealerweise mit einer gut messbaren Gröÿe verglichen werden, die in der Literatur
schon öfters erfolgreich bestimmt worden ist und welche evtl. auch auf anderem Wege im
Laborfermenter ermittelt werden kann. Möglichkeiten wären hier z.B. Ethanol, Glukose,
pH-Wert oder die Sauerstokonzentration. Vor allem Zusammenhänge zwischen Regelungsparametern am Bioreaktor sowie der Zellmassenkonzentration und der Fluoreszenz der Mikroorgansimen sollen herausgearbeitet werden.
2. Grundlagen
3
2. Grundlagen
2.1. Optische Spektroskopie
Neben Ausnahmen wie der Polarimetrie oder der Refraktrometrie versteht man unter Optischer Spektroskopie im Allgemeinen die Gesamtheit aller qualitativen und quantitativen
Analyseverfahren, die auf der Wechselwirkung von Licht mit toter oder lebender Materie
beruhen. 21 Licht bzw. elektromagnetische Strahlung kann von der zu untersuchenden Materie gestreut, reektiert oder absorbiert werden und erlaubt dadurch Rückschluss über Beschaenheit und Zustand der Materie. Die Untersuchung der Materie erfolgt stets unter
besonderer Berücksichtigung der Wellenlänge λ. Die Wellenlänge kann auch in Form der
Wellenzahl ν angegeben werden, welche dem Kehrwert von λ entspricht. Es existieren verschiedene Spektroskopiearten, welche sich im genutzten Spektralbereich und ihrem Eekt
auf die zu untersuchende Materie unterscheiden. Für die folgende Arbeit wurde die Optische
Spektroskopie im ultravioletten und sichtbaren (UV-VIS) Spektralbereich genutzt, für welche
die Anregung von Valenzelektronen charakteristisch ist. Optische Spektroskopie bietet viele
Vorteile im Vergleich zu anderen Analyseverfahren. Sie ist nicht destruktiv oder invasiv und
mit ihrer Hilfe können auch extrem schnelle Vorgänge im Bereich von 1 · 10−15 s untersucht
werden. Die zu untersuchenden Stoe können sowohl üssig als auch fest oder gasförmig
sein und sie bietet die Möglichkeit kleine Stomengen bis hinunter zu 1 · 10−18 mol durch
Lumineszenz nachzuweisen. Das breite Anwendungsgebiet der Optischen Spektroskopie ist
in Abb. (2.1) dargestellt. 21
Abbildung 2.1.: Übersicht zu verschiedenen Anwendungsgebieten der Optischen Spektroskopie 21
2. Grundlagen
4
2.1.1. Prinzip der Luminiszenz
Für ein besserers Verständnis des Messaufbaus, wird im folgenden das Prinzip der Fluoreszenz beschrieben, welches in der optischen Spektroskopie häug Anwendung ndet. Fluoreszenz wird durch die Eigenschaft von Molekülen hervorgerufen, Licht einer bestimmten
Wellenlänge zu absorbieren. Dabei kann es beinahe gleichzeitig zur Emission von elektromagnetischer Strahlung einer meist gröÿeren Wellenlänge kommen. Grundsätzlich wird dieses
Phänomen als Lumineszenz bezeichnet. Normalerweise besitzen Atome oder Moleküle einen
charakteristischen Energiezustand. Wird den Molekülen durch Bestrahlung mit Licht Energie zugeführt, absorbieren Elektronen Photonen und gelangen auf ein höheres Energieniveau.
Die Elektronen können sich jedoch nicht auf diesem Niveau halten und fallen praktisch augenblicklich in ihren Ursprungszustand zurück. Dabei setzen sie die aufgenommene Energie
wieder frei und es kommt zur Lumineszenz. Lumineszenz wird unterschieden nach Art der
Anregung und teilweise auch nach Lebensdauer des höheren Energiezustandes. Bei einem
schnellen Rückfall im Bereich von ca. 1 · 10−8 s spricht man von Fluoreszenz. Bei einer Dauer von 1 · 10−3 s wird der Vorgang als Phosphoreszenz bezeichnet. 8 Vor dem Rückfall geben
die angeregten Moleküle teilweise auch Wärme ab. Deshalb kann das emittierte Licht auch
etwas energieärmer als das Anregungslicht sein. Energieärmere Strahlung besitzt eine gröÿere Wellenlänge und damit auch eine andere Lichtfarbe als kurzwelliges Licht. Man spricht
hierbei von einer Rotverschiebung oder dem Stokes-Shift. Im Vergleich zum Anregungslicht
beträgt die Verschiebung des Fluoreszenzlichts häug zwischen 20 nm 50 nm. 12 Abb. (2.2)
stellt gut sichtbar die rote Fluoreszenz von Chlorophyll a dar.
Abbildung 2.2.: Fluoreszierendes Chlorophyll im Oinemessaufbau bei einer Anregungswellenlänge von
460 nm (Beleuchtung über Faser und Kollimatorlinse von links)
2. Grundlagen
5
2.1.2. Bedeutung von Biouorophoren
In Zellen gibt es zahlreiche verschiedene Biomoleküle, welche eine Autouoreszenz besitzen.
Diese kann Aufschluss über Stowechselvorgänge in der Zelle geben. Besonders interessant
für diese Arbeit ist das Fluoreszenzverhalten von Porphyrinen sowie der Pyridinnukleotide
NAD(P)H und Flavinen wie z.B. FAD, FMN und Riboavin. Flavine und Pyridinnukleotide
sind in der Zelle an über hundert Redoxreaktionen beteiligt und spielen dadurch eine zentrale Rolle in den Stowechselvorgängen. Sie fungieren in der Glykolyse und im Citratzyklus
als Elektonenaktzeptoren, um diese in der Atmungskette zur Regenerierung von ATP zur
Verfügung zu stellen. Die oxidierte Form der Pyridinnukleotide NAD(P) + kann durch die
Aufnahme von zwei Elektronen zu NAD(P)H + H + reduziert werden und erlangt dadurch
Fluoreszenzeigenschaften. Im Gegensatz dazu kann das Flavin FAD nur in seiner oxidierten
Form uoreszieren, das heiÿt vor der Aufnahme von Elektronen und der Umwandlung in
FADH2 . 15 Porphyrine bilden ein wichtiges Glied in der Atmungskette der Hefezelle, in dem
sie durch die Bildung von Komplexen mit Metallionen Elektronen innerhalb der Mitochondrien weiterleiten. 14 Durch Anregung dieser Biouorophore wird es möglich über die Detektion
der Fluoreszenz den aktuellen biologischen Zustand der Zelle zu charakterisieren, um bei
einer Fermentation die Umgebungsbedingungen optimal anzupassen. Die zur Anregung der
Fluorophore notwendigen Wellenlängen sind in Tab. (2.1) zusammengefasst. Abb. (2.3) und
Abb. (2.4) zeigen jeweils das Anregungs- und Emissionsspektrum der Fluorophore FAD und
NADH sowie der Porphyrine.
Tabelle 2.1.: Anregungs- und Emmissionsmaxima endogener Fluorophore 19 , 10
Endogene Fluorophore Anregungsmaximum Emissionsmaximum
nm
nm
Flavine
370, 450
520-530
NADH
240, 360
460-470
NADPH
240, 360
460-470
Porphyrine
400-450
630, 690
Enzyme und Coenzyme
2. Grundlagen
Abbildung 2.3.: Anregungs- und Emissionswellenlängen von Porphyrinen (rot) 11
Abbildung 2.4.: Anregungs- und Emissionswellenlängen von NADH (oben) und FAD (unten) 11
6
2. Grundlagen
7
Abbildung 2.5.: Zusammenfassung der Stowechselpfade in der Glykolyse und dem Citratcyklus
Beteiligte Biouorophore sind Orange markiert 15
In Abb. (2.5) sind die Reaktionen der Glykolyse und des Citratcyklus zusammengefasst.
Dabei wird ein Glukosemolekül (C 6 -Körper) zu zwei Pyruvaten (C 3 -Körper) verstowechselt.
Pyruvat ist das vorläuge Endprodukt der Glykolyse und wird in der mitochondrialen Matrix
durch die Pyruvatdehydrogenase unter aeroben Bedingungen in Acetyl-CoA umgewandelt.
Acetyl-CoA kann schlieÿlich in den Citratcyklus eingeschleust werden, welcher neben der
Entstehung der Pyridinnukleotide in der Glykolyse, als Hauptlieferant für NADH und FAD
dient. Ein weiteres Nebenprodukt des Cytratyklus ist CO 2 . Die entstandenen Pyridinnukleotide werden schlieÿlich zur Atmungskette transportiert, wo sie ihre Elektronen über die
Atmungskettenkomplexe an terminale Sauerstomoleküle abgeben, wodurch sich letztendlich Wasser bildet. Die entstehende Energie wird zur Bildung von ATP verwendet. 14 Unter
anaeroben Bedingungen entsteht hingegen das Nebenprodukt Ethanol durch die alkoholische
Gärung, welches unter Umständen als Substrat für die Hefezelle dienen kann. Wird während
der aeroben Stowechselvorgänge die Sauerstozufuhr unterbrochen, hat dies zur Folge dass
durch Anreicherung der Pyridinnukleotide die NADH-Fluoreszenz ansteigt bzw. die FAD
Fluoreszenz absinkt.
2. Grundlagen
8
2.1.3. Aufbau eines Gittermonochromators
Um die verschiedene Anregungswellenlängen einzustellen wird im Messaufbau unter anderem ein Gittermonochromator verwendet. Der Monochromator wurde aus dem optischen
Messsystem Spekol 11 der Firma Zeiss entnommen und bedient sich eines Reexionsgitters,
dessen Funktionsweise in Abb. (2.6) veranschaulicht wird.
Abbildung 2.6.: Beugungsprinzip am Reexionsgitter 8
m · λ
θm = arctan cos θ0 −
g
(2.1)
Der Reexionswinkel θm des für die Anregung wichtigen Beugungsmaximums erster Ordnung, kann durch Gl. (2.1) berechnet werden. Dazu muss der Einfallswinkel θ0 und die
Gitterkonstante g bekannt sein. Für die erste Beugungsordnung wird m = 1 gesetzt. Des
Weiteren geht in die Gleichung auch die Wellenlänge λ mit ein. Somit wird jeder, auf das Gitter treenden Wellenlänge ein anderer Beugungswinkel θm zugeordnet, woraus letztendlich
die Zerlegung des Lichts resultiert. So kann durch Verändern der Gitterposition die Wellenlänge bestimmt werden, da durch Variation des Einfallswinkels θ0 das Spektrum verschoben
wird und jeweils eine andere Wellenlänge auf den Ausgangspalt fokussiert wird.
2. Grundlagen
9
Abbildung 2.7.: Anordnung des Monochromators aus dem Messsystem Spekol 11
Abb. (2.7) zeigt schematisch den inneren Aufbau des genutzten Monochromators. Das am
Eingangsspalt eingestrahlte Licht wird zuerst durch einen Spiegel auf die erste Optik abgebildet, welche das Licht parallelisiert. Das Licht trit dann auf das reektierende Streugitter,
an dem die elektromagnetischen Wellen wie in Abb. (2.6) dargestellt, durch Beugung in einzelne Wellenlängen zerlegt und zurückgeworfen werden. Das vom Gitter ausgehende Licht
fällt daraufhin auf eine weitere Optik, wodurch es nun auf den Ausgangsspalt fokussiert werden kann. Das parallele Licht im Aufbau bewirkt, dass alle Beugungsmaxima erster Ordnung
gebündelt werden und so die höchst mögliche Intensität am Ausgangsspalt genutzt wird. Die
Auÿenansicht des für die Arbeit genutzten Spektrometers ist in Abb. (2.8) zu sehen. Die
mechanische Funktionsweise zur Änderung der Gitterposition wird in Kap. (3.2.1) detailliert
behandelt.
2. Grundlagen
Abbildung 2.8.: Der Monochromator aus dem optischen Messsystem Spekol 11 der Firma Zeiss
10
2. Grundlagen
11
2.2. Chlorophyll und Chininsulfat
Für die Fluoreszenz-Probemessungen werden zwei verschiedene Stoe benutzt. Zum einen
der grüne Blattfarbsto Chlorophyll und zum anderen der Sto Chininsulfat welcher unter
anderem in Tonic-Getränken vorhanden ist. Das Chlorophyll dient vor allem der Überprüfung
und Beurteilung der Funktionalität des Messaufbaus, da es ein leicht anzuregender, photostabiler und stark uoreszierender Sto ist. Es existieren verschiedene Arten von Chlorophyll.
In den Versuchen wurde jeweils Chlorophyll a verwendet. In Abb. (2.9) ist das Absorptionspektrum von Chlorophyll a dargestellt. Vor allem die Tatsache, dass eines der beiden
Absorptionsmaxima im Bereich der Wellenlängen von 400 nm 500 nm liegt, macht Chlorophyll a zu einem sehr gut geeigneten Testmedium, da auch spätere Messungen mit diesen
Anregungswellenlängen durchgeführt werden. Das Fluoreszenzspektrum des Chlorophylls bei
einer Anregungswellenlänge von 460 nm ist ebenfalls in Abb. (2.9) zu sehen. Auällig ist hier
die starke Rotverschiebung.
Abbildung 2.9.: Absorptions- und Fluoreszenzspektrum von Chlorophyll a 22
2. Grundlagen
12
Chinin ist ein Sto, welcher auch häug als Arzneimittel z.B. gegen Malaria oder Muskelkrämpfe eingesetzt wird. In diesem Fall wurde er aber wegen der Fluoreszenzeigenschaften,
die mit denen von NADH vergleichbar sind, als Testmedium ausgewählt. Chininsulfat uoresziert in sauren Lösungen bei ca. 450 nm und wird im UV-Bereich bei 365 nm angeregt.
Dieser Eekt wurde schon im Jahr 1845 entdeckt und konnte 1981 von Walter Beyeler et al.
genutzt werden, um die Nachweisgrenzen einer neuartigen Sonde zur Fluoreszenzdetektion
von NADH zu bestimmen. 3 Im Versuch war es damals möglich einen Grenzwert von 0,5
ppb Chininsulfat in stickstohaltigem Wasser nachzuweisen. Durch den Vergleich mit dieser
Messung soll vor allem die Empndlichkeit des Messaufbaus überprüft werden. Abb. (2.10)
und Abb. (2.11) zeigt die Fluoreszenz sowie das Absorptions- und Emissionsspektrum von
Chininsulfat in 1M Schwefelsäure .
Abbildung 2.10.: Blau uoreszierendes Chininsulfat 11
Abbildung 2.11.: Absorptions- und Fluoreszenzspektrum von Chininsulfat in Schwefelsäure 11
2. Grundlagen
13
2.3. Der Organismus Sacharomyces cerevisiae
Als Modellorganismus wurde aus mehreren Gründen die Hefe Saccharomyces cerevisiae ausgewählt. Hefen besitzen einen sehr hohen Stellenwert in der Biotechnologie und werden unter
anderem zur Herstellung von Insulin, Enzymen und Impfstoen wie z.B. gegen Hepatits-B
verwendet. Hefen sind klassische eukaryontische Zellen und werden der Familie der Schlauchpilze oder auch Ascomycetes zugeordnet. S. cerevisiae wird allgemein auch als Bäckerhefe
bezeichnet und besitzt eine lange Tradition in ihrer Nutzung. Als Modellorganismus ist sie
besonders geeignet, da ihr komplettes Genom entschlüsselt ist und weil die Kulturbedingungen für den so genannten Zuckerpilz sehr einfach sind. Hefezellen sind ca. 5 µm 10 µm
groÿ, rund oder oval und besitzen eine feste Zellwand. Die Vermehrung von Hefen erfolgt im
Normalfall asexuell durch Knospung wobei an Mutter- und Tochterzelle jeweils eine Narbe
zurückbleibt. Die durchschnittliche Lebensdauer eine Mutterzelle liegt daher bei ungefähr 25
Vermehrungszyklen. 9 S. cerevisiae kann zwischen zwei Mechanismen zur Energiegewinnung
wechseln. Je nach Sauerstoangebot nutzt die Hefe entweder die Atmung oder die Gärung
um Substrat, in diesem Fall Glukose, in Energie umzuwandeln. Damit gehört sie zur Gruppe
der fakultativen Anaerobier. Biotechnologisch kann S. cerevisiae also unter anaeroben Stowechelbedingungen zur Produktion von Ethanol und unter aeroben Bedingungen zur Erzeugung von Biomasse genutzt werden. Der aerobe Abbauweg liefert im Vergleich eine weitaus
höhere Energieausbeute für die Zelle und hat damit einen gröÿeren Biomassenzuwachs zur
Folge. Die beiden Stowechselvorgänge lassen sich in den folgenden Reaktionsgleichungen
(Tab. 2.2) zusammenfassen.
Tabelle 2.2.: Reaktionsgleichungen der Stowechselvorgänge Atmung und Gärung der Hefezelle
Atmung
Gärung
C6 H12 O6
+
6O2
=
6CO2
+
6H2 O
Glukose
+
Sauersto
=
Kohlendioxid
+
Wasser
C6 H12 O6
=
2C2 H5 OH
+
2CO2
Glukose
=
Ethanol
+
Kohlendioxid
Unter dem Umstand, dass der Hefezelle ein Überangebot an Glukose zur Verfügung steht,
kann auch unter aeroben Bedingungen Ethanol als Stowechselprodukt entstehen. Dieser
Vorgang tritt ab einer Glukosekonzentration von 0,1 g l−1 auf und wird als Crabtree-Eekt
bezeichnet.
2. Grundlagen
14
Da diese aerobe Gärung zu einem vermindertem Zellwachstum führt, ist sie bei der Biomassenproduktion unerwünscht. In einer Batch-Fermentation lässt sie sich allerdings nicht
vermeiden. Ist keine Glukose als Substrat für die Hefezelle vorhanden, kann das durch den
Crabtree-Eekt gebildete Ethanol als Energielieferant dienen (vgl. Kap. 2.1.2 Abb. 2.5).
Die Reaktionsgleichungen des Crabtree-Eekts sowie die Ethanolversowechselung sind in
Tab. (2.3) zusammengefasst.
Tabelle 2.3.: Reaktionsgleichungen des Crabtree-Eekts und der Atmung mit Ethanol als Substrat
Crabtree
Atmung
C6 H12 O6
+
0,25O2
=
1,92C2 H5 OH
+
2,16CO2
+
6H2 O
Glukose
+
Sauersto
=
Ethanol
+
Kohlendioxid
+
Wasser
C2 H5 OH
+
3O2
=
2CO2
+
3H2 O
Ethanol
+
Sauersto
=
Kohlendioxid
+
Wasser
Da S. cerevisiae den Stowechsel je nach Sauerstoangebot anpassen kann, bietet sich im
späteren Versuch vor allem die Möglichkeit den Einuss des Sauerstogehalts im Medium auf
die stowechselbedingte Fluoreszenz zu untersuchen. Der Modellorganismus wird während
des Fermentationsprozesses nicht geschädigt.
2. Grundlagen
15
2.4. Fermentationstechnik
2.4.1. Fermentationsprozess
Biotechnologische Produkte werden in der Industrie hauptsächlich durch Fermentation in
Bioreaktoren hergestellt. Der Bioreaktor fungiert dabei als abgegrenzter Raum, in dem in
Anwesenheit und unter Mitwirkung eines Biokatalysators Stoumwandlung stattndet. 4 Die
Biokatalysatoren sind in diesem Fall die kultivierten Mikroorganismen, deren Lebens- und
Wachstumsbedingungen maÿgeblich durch die Eigenschaften des genutzten Bioreaktors bestimmt werden. Das Ziel einer Fermentation ist stets die Produktion bestimmter Produkte,
welche in Biomasse bzw. Zellmaterial und Stowechselprodukte eingeteilt werden. Um den
Organismen Nährstoe zur Verfügung zu stellen kann zwischen zwei verschieden Arten von
Kulturmedien gewählt werden. Die eine Art dieser Medien wird als synthetisches Medium
bezeichnet, in welchem alle chemischen Inhaltsstoe bekannt sind. Die andere Art nennt
sich Komplexmedium. Es besteht meist aus Naturstoen, wodurch die Zusammensetzung
des Mediums nicht genau deniert werden kann. Bioreaktoren oder auch Fermenter nden
unter anderem im Umweltschutz, in der Landwirtschaft, in der Pharma- und Chemieindustrie sowie in der Nahrungsmittelindustrie ihre Anwendung. Ein Fermentationsprozess kann
in die fogenden drei Zeitphasen eingeteilt werden.
Upstreaming
Das Upstreaming bezeichnet die komplette Vorbereitung der Fermentation.
Dazu zählt unter anderem das Ansetzen des Kulturmediums als auch die Sterilisierung
desselben und sämtlicher Bauteile des Bioreaktors sowie die Züchtung der Vorkulturen.
Fermentation
Die eigentliche Fermentation dient der Gewinnung des gewünschten Produkts
unter kontrollierten Bedingungen z.B. durch Regelung von Parametern wie dem pHWert oder der Temperatur.
Downstreaming
Das Downstreaming ist der letzte, und unter Umständen sehr aufwändige
Prozess, bei dem die Produkte isoliert, konzentriert und schlieÿlich aufgereinigt werden.
Zur Kultivierung von Mikroorganismen in Bioreaktoren gibt es verschiedene Möglichkeiten. Die in dieser Arbeit genutzte Technik wird als Batch-Fermentation bezeichnet und zählt
zu den Submersverfahren. Charakteristisch für diese Verfahren ist, dass die Mikroorganismen
in einer Nährlösung gezüchtet werden und dabei ständig von Substrat umgeben sind. Der
Sauerstotransport wird dabei durch künstliche Strömungen um ein vielfaches gesteigert,
mit dem Ziel die Stowechselaktivität zu erhöhen. Beim Batch-Verfahren benden sich vor
Beginn der Fermentation alle Nährstoe, bis auf Sauersto und eventuelle Korrekturmittel
wie Antischaum, Säure und Lauge im Bioreaktor.
2. Grundlagen
16
Die Fermentation beginnt schlieÿlich nach Sterilisierung des Fermenters und des Mediums mit der Beimpfung des Reaktors mit der zu züchtenden Reinkultur. Das Ende der
Fermentation wird in der Regel erreicht, sobald einer der Nährstoe aufgebraucht ist. Der
Wachstumsvorgang der Mikroorganismen lässt sich allgemein in sechs verschiedene Phasen
einteilen. Diese kommen vor allem durch Änderungen in der Zusammensetzung von Biomasse, Nährstoen und produzierten Produkten innerhalb des Bioreaktors zustande, welche
hauptsächlich den Stowechsel der Mikroorganismen beeinussen. Die genaue Einteilung der
Phasen ist in Abb. (2.12) dargestellt.
Abbildung 2.12.: Darstellung der verschiedenen Wachstumsphasen währen einer Batch-Fermentation 13
Lag-Phase Mit dem Animpfen durch eine Reinkultur beginnt der Zellwachstumsprozess.
Zunächst müssen sich die Mikroorgansimen an die neuen Umgebungsbedingungen anpassen, wodurch das Wachstum vorerst stark verlangsamt ist.
Beschleunigungsphase Die kurze Phase zwischen Lag- und Exponetieller Wachstumsphase
wird als Beschleunigungsphase bezeichnet. Die Zellen teilen sich erstmals, da mittlerweile Transportsysteme und Enzyme zum Substratabbau und Stowechsel gebildet
worden sind.
Exponentielle Wachstumsphase Unter optimalen Bediungungen erreicht das Wachstum
nun maximale Geschwindigkeit und die Mikroorgansimen könnnen ungehindert wachsen, so lange genügend Substrat vorhanden ist. Die Wachstumsrate ist dabei konstant.
Übergangsphase Das Wachstum wird durch einen steigenden Mangel an Substrat gehemmt.
Die Wachstumsrate verringert sich und das Wachstum kommt anschlieÿend zum Stillstand.
2. Grundlagen
17
Stationäre Phase
Wenn kein Substrat mehr vorhanden ist oder zu viele toxische Sto-
wechselprodukte gebildet werden, sterben Zellen ab. Durch Zellyse freigesetzte Substrate können eine geringe Vermehrungsrate aufrecht erhalten. Absterbende und neu
gebildete Zellen liegen im Gleichgewicht.
Absterbephase
Sind die Energiereserven komplett erschöpft, sterben nun mehr Zellen ab
als neu entstehen können und die Biomassenkonzentration nimmt wieder ab.
2.4.2. Aufbau und Regelung eines Bioreaktors
Für den Fermentationsprozess muss ein Bioreaktor all die Bedingungen bieten, welche für
die gewünschte Stoumwandlung gefordert werden und die je nach Mikroorganismus mehr
oder weniger umfangreich ausfallen können. Trotz starker Variationen sind einige Grundanforderungen für die Konstruktion eines Bioreaktors unabdingbar. Folgende Punkte müssen
stets beachtet werden:
Sterilität
Der Reaktor darf keine Fremdkeime enthalten, die sich im Reaktor vermehren
könnten und den Fermentationsprozess stören würden. Dazu muss es möglich sein den
Reaktor samt aller Anschlüsse zu sterilisieren. Jegliche Stoströme, die in den Reaktor
ieÿen, müssen steril sein.
Nutzung von nicht toxischen Substanzen
Für den Bau des Reaktors müssen Materialien
verwendet werden, welche keine Substanzen an das Medium abgeben können. Fermenter unter einem Reaktorvolumen von 10 l werden häug aus Glas gefertigt. Andere
genutzte Materialien sind Edelstahl oder spezielle Kunststoe.
Physiologisch optimale Bedingungen
Der Bioreaktor muss so ausgelegt werden, dass alle
im Reaktor bendlichen Stoe über das gesamte Reaktorvolumen verteilt werden können. Auch die physikalischenen Eigenschaften wie die Temperatur sollten im gesamten
Reaktor gleich sein.
Der am häugsten genutzte Bioreaktor ist der Rührkesselreaktor. Eine schematische Darstellung zeigt Abb. (2.13). Grund für die weit verbreitete Nutzung ist deren groÿes Anwendungsgebiet, das sie ihrer Flexibilität in der Anpassung an gewünschte Prozessbedingungen
verdanken. Der Reaktor selbst ist meist zylindrisch und wird von einem wasserdurchossenem Mantel umgeben, welcher der Temperaturregelung dient. Am Boden bendet sich ein
Begasungsring um die Organismen mit Sauersto zu versorgen.
2. Grundlagen
18
Der Sauerstoeintrag wird durch das Rührwerk verstärkt, welches neben dem gleichmäÿigen Vermischen von Nährstoen, Korrekturmitteln und Mikroorganismen vor allem auch
Luftblasen zerkleinert. Des weiteren dient der Rührer auch der Verbesserung des Wärmeaustausches zwischen der Flüssigkeit und der Innenäche des Doppelmantels. Für die Fluoreszenzmessungen im Reaktor hat der Rührer allerdings eher negative Auswirkungen, da durch
die ständige Bewegung von Gasblasen ein starkes Messrauschen durch reektiertes oder gestreutes Licht entstehen kann.
Abbildung 2.13.: Schematische Darstellung eines Rührkesselreaktors 17
2. Grundlagen
19
Die Kultivierungsvorgänge innerhalb eines Reaktors sind sehr komplex, nichtlinear und
zeitvariant. 13 Beim Batch-Verfahren besteht daher die eigentliche Regelungsaufgabe vor allem darin optimale Umgebungsbedingungen für die Organismen zu schaen. Meist können
wesentliche Prozessgröÿen nur mit groÿem Aufwand erfasst werden, um sie schlieÿlich durch
entsprechende Parameter zu optimieren. Hauptsächlich weden dabei Normwerte mit den aktuellen Istwerten verglichen und daraufhin angepasst. Die Messung der Prozessgröÿen kann
an unterschiedlichen Orten stattnden, welche nachfolgend aufgeführt sind.
Oine
Bei der Oinemessung müssen entsprechende Proben aus dem Reaktor entnommen
und im Labor analysiert werden. Da dies eine starke Zeitverzögerung mit sich bringt, in
der sich die Zellen verändern können, ist diese Messung für eine Regelung nur bedingt
bzw. gar nicht geeignet.
Online- oder Atlinemessung durch Bypass
Über einen Bypass werden die Proben auto-
matisch entnommen, analysiert und danach wieder dem Reaktor zugeführt. Bei dieser
Methode können Veränderungen der Zellen auftreten und machen auch dieses Messsystem für Regelungsaufgaben nur bedingt geeignet. Jedoch eignet es sich für erste
Fluoreszenzversuche, weil Hefen relativ einfache Fermentationsbedingungen erfordern
und sich nicht so schnell verändern.
Online im Fermenter
Das ideale Messsystem für die Regelung ist die Onlinemessung im
Fermenter mittels spezieller Sonden, da hierbei keine Zeitverzögerung auftritt. Besondere Anforderungen an die Sonden sind u.a. Sterilisierbarkeit, hohe Emndlichkeit,
hohe Genauigkeit und ein schnelles Ansprechverhalten.
3. Material und Methode
20
3.1. Materialien
3.1.1. Laborfermenter der Hochschule Ulm
Abbildung 3.1.: Der Laborfermenter der Fakultät für Medizintechnik und Mechatronik der Hochschule
Ulm 13
Bei dem Bioreaktor der Fakultät für Mechatronik und Medizintechnik der Hochschule Ulm
handelt es sich um einen 7 l
Laborfermenter der Firma Bioengineering. Der Aufbau und
die Erweiterung um eine Abgasanalytik, sowie das Regelungs- und Steuerungssystem, realisiert mit dem Prozessleitsystem WinErs, sind aus früheren Abschlussarbeiten hervorgegangen.
23 , 18 , 7
Über das Sensorsystem des Bioreaktors können für die Regelung wichtige Gröÿen
erfasst werden, was es ermöglicht in den Fermentationsprozess einzugreifen. Eine Zusammenfassung dieser Gröÿen ndet sich in Tab. (3.1). Direkt im Anschluss folgt die Auistung
der beeinussbaren Parameter um die Umgebungsbedingungen an den aktuellen Verlauf der
Fermentation anzupassen.
21
Tabelle 3.1.: Auistung der durch das Sensorsytem erfassbaren Gröÿen am Bioreaktor der Hochschule Ulm 7
Erfassbare Prozessgröÿen
Temperatur im Reaktor
Rührerdrehzahl des Magnetrühres
pH-Wert des Mediums
Optische Dichte des Reaktorinhalts
Sauerstopartialdruck
O2 und CO2 in der Abluft durch Abgasanalyse
Schaumbildung im Reaktor
Volumenstrom des Luft-Durchussreglers
Temperatur
Die Temperatur kann über den wassergefüllten Mantel des Bioreaktors geregelt
werden.
Rührerdrehzahl
Der Bioreaktor besitzt einen Magnetrührer, über welchen für eine optimale
Durchmischung und Zerteilung der Gasblasen gesorgt werden kann.
Luft- und Sauerstozufuhr
Über zwei Massendurchussregler wird dem Bioreaktor Luft
oder Sauersto zugeführt. Der Volumenstrom kann dabei zwischen 0 l min−1 und 10 l min−1
betragen.
Säure, Lauge und Antischaum
Über Rollenpumpen können Säure, Lauge und Antischaum
zugeführt werden. Eine weitere Rollenpumpe dient der Entnahme von Proben zur
Oine-Analytik. Es ist wichtig die durch das Rühren bedingte Schaumentwicklung zu
unterbinden, da sie zur Verstopfung von Abluftltern führen kann und Zellen durch
sie mechanisch belastet werden. 4
Glukosezufütterung
Für die Zufuhr von weiteren Stoen wie Glukose existiert ein weiterer
steuerbarer Pumpenantrieb.
22
3.1.2. Lichtquellen zur Fluoreszenzanregung
Zur Anregung der Fluoreszenz der Bioorganismen stehen zwei verschiedene Lichtquellen
zur Verfügung. Zum einen ein manuell einstellbarer Monochromator und zum anderen drei
Hochleistungs-LEDs mit den Anregungswellenlängen 365 nm, 400 nm und 460 nm und einer
Leistung von jeweils 5 W. Der Monochromator wurde aus dem Messsystem Spekol 11 der
Firma Zeiss entnommen und hat am Ausgangsspalt eine spektrale Bandbreite von 11 nm.
Er kann in Kombination mit einer 20 W Halogenlampe mit kontinuierlichem Spektrum oder
aber mit einer 50 W Quecksilberdampampe betrieben werden. Der Wellenlängenbereich des
Monochromators erstreckt sich von 340 nm bis 850 nm. Das Linienspektrum der Quecksilberdampampe HgE/3 ist in Abb. (3.2) zu sehen. Unter den Peaks sind die für die Anregung
der Fluorophore wichtigen Wellenlängen 365 nm, 405 nm und 436 nm vertreten.
Abbildung 3.2.: Spektrum der Hochdruck-Quecksilberdampampe HgE/3 6
23
3.1.3. Tauchsonde FDP-7IR200-2-VAR
Für die Online-Messung im Bioreaktor soll die Tauchsonde FDP-7IR200-2-VAR der Firma
Avantes genutzt werden. Der Aufbau dieser Sonde zeigt sich in Abb. (3.3) und Abb. (3.4).
Die Sonde besitzt sieben Fasern mit einem jeweiligen Durchmesser von 200 µm. Sechs dieser
Fasern dienen der Einkopplung des Lichts in den Bioreaktor und damit der Fluoreszenzanregung. Eine Faser leitet das Fluoreszenzsignal aus dem Bioreaktor heraus, wo es dann
wiederum in ein Spektrometer eingekoppelt werden kann. Am Ende der Sonde bendet sich
ein Aufsatz mit einer weiÿen, diusen Oberäche, welcher hauptsächlich für Absorptionsmessungen genutzt wird (Abb. 3.4a). Die Oberäche bewirkt eine Reektion des Anregungslichts um die Abschwächung der elektromagnetischen Strahlung beim Durchgang durch eine
absorbierende Probe zu bestimmen. Der Sondenaufsatz ist im Abstand zum Sondenende
verstellbar, wodurch der optische Weg des Lichts nach Verlassen der Faser zwischen 0,5 mm
und 20 mm betragen kann. Die für die Arbeit wichtigere Fluoreszenzmessung ndet ohne den
Sondenaufsatz statt, da das Anregungslicht die eigentliche Messung stören würde. Zwar verstärkt die Oberäche auch Fluoreszenzlicht, jedoch wird hier eine minimale Verschlechterung
des Signals für eine störungsärmere Messung in Kauf genommen. Die Fasern der Tauchsonde sind für einen Wellenlängenbereich von 350 nm 2000 nm ausgelegt und besitzen jeweils
einen SMA-Anschluss.
Abbildung 3.3.: Schematische Darstellung der Tauchsonde FDP-7IR200-2-VAR der Firma Avantes 2
(a) Sondenaufsatz zur Absorptionsmessung
24
(b) Tauchsonde mit optischem Ein- und
Ausgang
Abbildung 3.4.: Die Tauchsonde FDP-7IR200-2-VAR der Firma Avantes
3.1.4. Spektrometer RedTide USB-650
Um die Fluoreszenz der Bioorganismen zu detektieren wird das Spektrometer Red Tide
USB-650 von OceanOptics genutzt, welches in Abb. (3.5) dargestellt ist. Das Spektrometer ist für den Wellenlängenbereich von 350 nm bis 1000 nm ausgelegt und besitzt einen
CCD-Array-Sensor mit 650 Pixeln. Der Eingangsspalt des Spektrometers hat eine Breite
von 25 µm und das Auösungsvermögen beträgt ca. 2 nm (FWHM). Optische Fasern können
über einen SMA-Anschluss angeschraubt werden und die Auswertung der optischen Signale
erfolgt über die Software SpectraSuite von OceanOptics im Zusammenspiel mit MS Oce
Excel. Der CCD-Chip des Spektrometers besitzt, wie andere CCD-Sensoren auch, einen Dunkelstrom, welcher durch die spontane Bildung von freien Ladungsträgern durch Wärme im
lichtempndlichen Halbleiter entsteht. Bei hohen Integrationszeiten kann dadurch ein sehr
starkes Messrauschen entstehen. Daher muss vor jeder Messung das Spektrum des Dunkelstroms bei der entsprechenden Integrationszeit gemessen und schlieÿlich bei der Erfassung
der Fluoreszenzsignale subtrahiert werden.
Abbildung 3.5.: Spektrometer RedTide USB-650 von OceanOptics
25
3.1.5. Mikrobanksystem der Firma Linos
Zur Erprobung der bestmöglichen Lichteinkopplung in optische Fasern wird das Mikrobanksystem von Linos genutzt. Über das Vier-Stangen-Prinzip, welches in Abb. (3.6) veranschaulicht ist, lassen sich verschiedenen Abbildungs- und Beleuchtungsaufbauten realisieren.
Zudem können die einzelnen Bauteile mechanisch bearbeitet werden um die Lichtquellen, insbesondere den Monochromator, mit den SMA-Anschlüssen kompatibel zu machen. Besonders
hervorzuheben ist ein Bauteil in Form eines Würfels, durch welchen sich Oinemessungen
von Fluoreszenz realisieren lassen. Das System bietet gute Bedingungen für Fluoreszenzmessungen, da kein Fremdlicht in den Würfel und die angeschlossenen Fasern einfallen kann. Das
Bauelement ist in Abb. (3.7) dargestellt. Der SMA-Faseradapter für das Anregungslicht und
der Adapter für die Fluoreszenzdetektion stehen im rechten Winkel zueinander, wodurch bei
der Messung keine Störungen durch das Anregungslicht auftreten können. In Kombination
mit einer Durchussküvette, kann das Würfelsystem auch für eine Bypassmessung am Bioreaktor genutzt werden.
Abbildung 3.6.: Das Vier-Stangen-Systems von Linos
Hier: Fokussierung von Licht auf eine Faser mittels einer Linse
Abbildung 3.7.: Würfel zur Oinemessung von Fluoreszenz in einer Küvette
26
3.2. Automatisierung des Monochromators
3.2.1. Dimensionierung des Motors
Längerfristig gesehen ist es wünschenswert für die Regelung der Fermentations-Prozesse eine
Möglichkeit zu schaen, Fluoreszenzmessungen automatisch und ohne Personal durchzuführen. Ein erster Schritt in diese Richtung ist die Motorisierung des Monochromators. Hier soll
eine computergesteuerte, genau durchstimmbare Lichtquelle entstehen. Weitere Vorteile der
Nutzung des Monochromators sind auch, dass er mit verschiedenen Lichtquellen erweitert
werden kann und dass er eine relativ geringe spektrale Bandbreite aufweist. Häug liegen die
Wellenlängen von anregendem und emittiertem Licht nah beieinander, was zu einer Störung
der Fluoreszenzsignals führen kann. Durch eine schmale Bandbreite wird dies verhindert. Im
ursprünglichen Zustand des Monochromators wurde die Wellenlänge über ein Drehrad an der
Auÿenseite manuell eingestellt. Durch das Ein- oder Herausdrehen einer Welle, konnte die
Position des Beugungsgitters verändert werden. Daraus folgte eine Veränderung des Einfallwinkels des Lichts auf das Reexionsgitter und somit auch eine Veränderung der Wellenlänge
die auf den Ausgangsspalt traf. Das Prinzip der Mechanik ist in Abb. (3.8) veranschaulicht.
Abbildung 3.8.: Mechanisches Funktionsprinzip des Monochromators
27
Um diesen manuellen Betrieb zu ersetzen, wurde zuerst die Kraft gemessen, welche aufgewendet werden muss um die Welle zu drehen. Mit Hilfe einer Federwaage konnte im Abstand
von 35 mm vom Mittelpunkt des Drehknaufs eine Kraft von 10 N festgestellt werden. Daraus resultiert demnach ein Drehmoment von 0,35 N m, welches der Motor aufbringen muss.
Der gewählte Elektromotor maxon EC-max 30 besitzt ein Nennmoment von 0,0332 N m und
eine Leerlaufdrehzahl von 9250 min−1 . Durch das Getriebe maxon GP 42 C mit einer Untersetzung von 43:1 wird das Moment auf 1,4276 N m erhöht, was einer fünachen Sicherheit
entspricht. Die Drehzahl wird folglich um den Faktor 43 auf 215 min−1 reduziert. Tab. (3.2)
zeigt die wichtigsten Eigenschaften der Motor-Getriebe-Kombination im Überblick. Zusätzliche Informationen zu Motor und Getriebe nden sich in den Datenblättern im Anhang.
Tabelle 3.2.: Kenndaten der Motor-Getriebe-Kombination von Maxon
Elektomotor
Nennmoment [N m]
Leerlaufdrehzahl [min −1 ]
Getriebe
Untersetzung
Nennmoment nach Getriebe [N m]
Leerlaufdrehzahl nach Getriebe [min −1 ]
Maxon EC-max 30
0,0332
9250
Maxon GP 42 C
43:1
1,4276
215
Weitere wichtige Komponenten zur Ergänzung des Motors sind der Encoder HEDL 5540
und die Steuerungseinheit EPOS2 24/5 von Maxon. Durch diese Hardware kann der Motor
über eine RS232 Schnittstelle angesteuert werden. Der Encoder ermöglicht dabei das Auslesen verschiedener Motorinformationen wie den Motorstrom, die Motorkoordinaten oder die
aktuelle Geschwindigkeit. Über das EPOS können dem Motor neue Befehle wie Drehzahl
und Drehrichtung zugeteilt werden.
28
Der optimale Spannungswert VCC zur Versorgung des EPOS wird nach Datenblatt (siehe Anhang) durch Gl. (3.1) berechnet. Die einzusetzenden Kennwerte des Motors sind in
Tab. (3.3) zusammengestellt.
VCC
1
UN Δn
=
· nB +
· MB ·
+1
n0
ΔM
0, 9
(3.1)
Tabelle 3.3.: Kenndaten des Motors zur Errechnung der Spannungsversorgung für das EPOS2 24/5
MB
33,20
Nenndrehzahl [min −1 ]
nB
7240,00
Grenzdrehzahl [min −1 ]
n0
15000,00
Δn
ΔM
59,10
Un
24,00
VCC
23,91
Dauerdrehmoment [mN m]
Kennliniensteigung [min −1 mN m]
Nennspannung [V]
Errechnete Versorgungsspannung [ V]
Nach Einsetzen der Werte resultiert schlieÿlich eine Spannungsquelle mit ca. 24 V. Gleichzeitig muss die Spannungsquelle laut Datenblatt einen Strom von 5 A liefern was eine Leistung von 120 W ergibt. Der komplette Aufbau der Motorsteuerung und das Motor-GetriebeSystems sind in Abb. (3.9) dargestellt. Das Datenblatt zur verwendeten Spannungsquelle
ndet sich im Anhang.
Abbildung 3.9.: Motor Maxon EC-max 30 [1], Getriebe Maxon GP 42 C [2], Encoder HEDL 5540 [3],
Positionssteuerung EPOS2 24/5 [4]
29
3.2.2. Konstruktion des Motorgehäuses
Um den Elektromotor an den Monochromator zu montieren wurde eine Metallkonstruktion
aus vier Komponenten gefertigt. Die Bauteile sind in Abb. (3.10) zu sehen. Die genauen
Konstruktionszeichnungen sowie die verwendeten Materialien sind dem Anhang beigefügt.
(a) Motorgehäuse
(c) Kupplung
(b) Montierter Klemmring
(d) Metallbolzen
Abbildung 3.10.: Die Einzelkomponenten des Motorgehäuses
Die Funktionsweise der Halterung lässt sich folgendermaÿen beschreiben. Das Rundgehäuse (Abb. 3.10a) bewirkt die Sicherung des Motors gegen Eigenrotation. Dies kommt dadurch
zustande, dass am Getriebe ein Klemmring (Abb. 3.10b) befestigt ist, in welchen ein Metallbolzen (Abb. 3.10d) eingeschraubt wird. Durch den Formschluss zwischen Bolzen und
Langloch und den Kraftschluss zwischen Klemmring und Getriebe wird folglich zum einen
die Rotation des Elektromotors verhindert und zum anderen erst die Möglichkeit gegeben,
dass der Elektromotor die Welle drehen kann. Um ein Rotieren des Rundgehäuses selbst zu
verhindern, wird es durch drei Madenschrauben M5 gegen Verdrehen gesichert. Der Motor
selbst wird nicht durch das Gehäuse gehalten, sondern ist über die Kupplung (Abb. 3.10c)
an den Monochromator montiert. Die Kupplung wird im innern mit einer M6 Mutter gegen
die Welle des Monochromators verspannt und die Welle des Getriebes ist ebenfalls mit einer
Madenschraube M3 in der Kupplung gesichert.
30
In der Welle des Monochromators bendet sich zudem ein 2 mm Metallstift, welcher als
Mitnahme für die Kuppplung dient und die Drehbewegung ermöglicht. Das Langloch im
Gehäuse wird benötigt, da sich der Motor im Betrieb durch das Drehen der Welle zum Monochromator hin- oder von ihm wegbewegt. Mit einer Länge von 90 mm, ist das Langloch
deshalb groÿzügig bemessen, da es auch die Möglichkeit bietet, die zuvor erwähnte, sich im
Gehäuse bendende M3 Madenschraube der Kupplung festzuziehen. Auf Grund der Verkabelung kann der Motor erst nach Befestigen des Gehäuses montiert werden. Abb. (3.11) und
Abb. (3.12) veranschaulichen noch einmal die wichtigsten im Text genannten Funktionen.
Abbildung 3.11.: An der Kupplung montierter Motor
Abbildung 3.12.: Montierter Motor mit Gehäuse
31
Da der Motor sehr starke Kräfte entwickelt, welche den Monochromator schädigen können, wurden bei der Konstruktion schon einige Sicherheiten mit eingebracht. Im Inneren
des Monochromators befand sich zuvor die in Abb. (3.13) gezeigte mechanische Wellenlängenbegrenzung. Sie war zuvor an der Welle zum Verstellen der Gitterposition befestigt und
schränkte bei manuellem Betrieb den wählbaren Wellenlängenbereich ein. Bei Rotation der
Welle konnte sie gegen zwei Schrauben anschlagen und verhinderte somit ein Weiterdrehen.
Da das Material an diesen beiden Endanschlägen jedoch nicht besonders stabil war wurde die
Wellenlängenbegrenzung entfernt und die Endanschläge wurden auf andere Art und Weise
realisiert. Die untere Grenze des Wellenlängenbereichs wird jetzt durch die Länge der Kupplung (Abb. 3.11) festgelegt. Sie ist so dimensioniert, dass beim Anschlagen der Kupplung an
der Auÿenwand auch gleichzeitig die niedrigst mögliche Wellenlänge erreicht wird. Als Endanschlag für die gröÿte Wellenlänge dient das Langloch (Abb. 3.12) in dem der Metallbolzen
ein Weiterbewegen des Motors verhindert. Diese beiden Begrenzungen sind jedoch nur eine
zweite Sicherheit und werden durch die Programmierung noch erweitert. Da das Anfahren
der Endpunkte trotzdem starke mechanische Belastungen für das Gehäuse bewirkt, ist die
Software so ausgelegt, dass die beiden Punkte im fehlerfreien Betrieb nie angefahren werden.
Abbildung 3.13.: Ursprüngliche mechanische Wellenlängenbegrenzung des Monochromators
32
3.2.3. Programmierung der Motorsteuerung
Die Programmierung der Steuerungssoftware ist mit der Programmierumgebung LabView
realisiert worden. Maxon hat zur Ansteuerung des Motors eine eigene Toolbox entwickelt,
welche in LabView implementiert werden kann. Die Kommunikation zwischen PC und EPOS
erfolgt wie zuvor erwähnt durch eine RS232 Schnittstelle. In Abb. (3.14) und Abb. (3.15)
sind zum einen der Initialisierungsdialog und zum anderen die Bedienoberäche dargestellt.
Bevor die Bediensoftware gestartet wird, sorgt der Initialisierungsdialog dafür, dass für die
Kommunikation zwischen PC und EPOS wichtige Grundeinstellungen vorgenommen werden
können. Die Parameter sind in Tab. (3.4) erklärt.
Abbildung 3.14.: Initialisierungsdialog der Steuerungssoftware
Tabelle 3.4.: Parameter des Initialisierungsdialoges
Device Name
Name des Models der Positionssteuerung
Protocol Stack Name
Auswahl des Protokollstapels
Interface Name
Bezeichnung der genutzten Schnittstelle
Port Name
Port an welchem das EPOS angeschlossen ist
Baudrate
Verwendete Schrittgeschwindigkeit
Timeout
Maximale Wartezeit bei der Datenübertragung
Abbildung 3.15.: Programmoberäche der Steuerungssoftware
33
34
Die Bedienoberäche besteht aus vier Elementen. Den `Grundeinstellungen', der `Bewegungssteuerung', der `Positionssteuerung' und den `Motordaten'. Unter `Grundeinstellungen'
nden sich die Grundbedienelemente. Der Motor kann hier Ein- und Ausgeschaltet werden
und durch die `Wellenlängenbegrenzung' lässt sich ein Sicherheitssystem aktivieren, das das
Anfahren von Wellenlängen auÿerhalb des denierten Bereichs nicht zulässt. Diese Funktion
hindert den Motor daran die Endanschläge anzufahren. Des Weiteren können hier die Einstellungen des Initialisierungsdialoges geändert werden und das Programm lässt sich durch
einen Klick auf `Programm Stoppen' komplett beenden. Die Funktion des Kalibrierwertes
und des zugehörigen Buttons `Position festlegen' wird zu einem späteren Zeitpunkt erklärt.
Im Abschnitt `Bewegungssteuerung' ndet sich die digitale Version der manuellen Bedienung des Monochromators wieder. Durch Klicken und Halten der Maustaste auf den
entsprechenden Buttons kann die Wellenlänge vergröÿert oder verkleinert werden. Die zuvor
am Drehknopf vorhandene Skala wurde hier durch ein Textfeld ersetzt, von dem die aktuelle
Wellenlänge abgelesen werden kann.
Im Feld `Positionssteuerung' kann eine manuell eingegebene Wellenlänge automatisch angefahren werden. Dies geschieht, in dem man nach der Eingabe auf den Button `Position
anfahren' klickt. Zum einen kann die Rotationsbewegung des Elektromotors durch einen
Klick auf `Halt' unterbrochen werden und zum anderen wird auch hier die Wellenlängenbegrenzung beachtet. Ist diese aktiviert können zwar Wellenlängen auÿerhalb des Bereichs
eingegeben werden, das Anfahren der entsprechenden Position wird jedoch bei Erreichen der
Grenzwerte unterbrochen.
Die `Motordaten' dienen als Kontrollanzeige während des Betriebes des Motors. Es kann
der Motorstrom und die Getriebegeschwindigkeit beobachtet, sowie auch die auf das Getriebe bezogene Drehzahl geändert werden. Der angezeigte Motorstrom wird zu dem intern
verwendet um die mechanische Sicherheit über die Endanschläge weiter zu verbessern. Sollte
der Motor im Fehlerfall einen der beiden Endpunkte erreichen, steigt folglich der gemessene Motorstrom an. Die Software vergleicht ständig den aktuellen Motorstrom mit einem
Grenzwert von 1000 mA. Entsteht eine solche Stromspitze und übersteigt diesen Grenzwert,
stoppt das Programm die Motorbewegung. In manchen Fällen kann es dazu kommen, dass
der Anlaufstrom zu einer kurz anhaltenden Stromspitze führt. Damit die Software dies nicht
sofort als Endanschlag identiziert wurden zwei Maÿnahmen ergrien.
35
Im Quellcode wurde ein kurzer Timer implementiert, der die Dauer zwischen Messung und
Vergleich der Ströme verzögert. Dadurch wird ermöglicht, dass sich die Stromspitze wieder
zurückbilden kann ohne dass die Software den Motor stoppt. Die Dauer des Timers beläuft
sich auf eine geringe Zeitspanne von 50 ms, wodurch die Sicherheit nicht beeinträchtigt wird.
Um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass ungewollte Stromspitzen entstehen, wurde
der Motor auÿerdem so konguriert, dass das Anfahren mit einer geringen Beschleunigung
stattndet. Der komplette Quellcode der Software ndet sich im Anhang.
3.2.4. Kalibrierung des Motors
Bevor alle zuvor aufgezählten Funktionen genutzt werden können, muss der Software ein
Kalibrierwert mitgeteilt werden. Durch ihn wird errechnet, wie lange der Motor sich drehen
muss, um eine gewünschte Wellenlänge zu erreichen. Dieser Kalibrierwert ist eine beliebige
Wellenlänge zwischen 350 nm und 650 nm, welche mit dem Spektrometer vor dem Betrieb
gemessen werden muss. Bedingung bei der Messung ist, dass die für die Wellenlänge maximal
mögliche Intensität gemessen wird. Auÿerdem ist der Kalibrierwert nur so lange gültig, wie
sich die Lichtquelle vor dem Eingangsspalt des Monochromators an der gleichen Position bendet. Um eine jeweils gleiche Positionierung zu ermöglichen wurde an der Lampenhalterung
(Abb. 3.16) ein Abstandshalter in Form von Unterlagscheiben angebracht. Die Positionierungsschraube kann dadurch nur bis zu einer bestimmten Position eingedreht werden, welche
nicht veränderbar ist. Durch diese Abstandshalter ist es auch möglich verschiedene Lampen
in ihrer Position so aufeinander abzustimmen, dass der Kalibrierwert für mehrere Lichtquellen gültig ist, da sich ihre optischen Achsen an derselben Stelle benden. Nach Eingabe der
entsprechenden Wellenlänge muss die Kalibrierung mit einem Klick auf `Position festlegen'
bestätigt werden.
(a) Lampengehäuse für die
(b) Abstandhalter am Lampengehäuse
Quecksilberdampampe bzw. die Halogenlampe
Abbildung 3.16.: Lampengehäuse des Monochromators
36
Die interne Berechnung der Position erfolgt über einen Proportionalitätsfaktor, der sich aus
einer Regressionsgeraden ergibt. Da sich die Motorposition über LabView auslesen lässt, und
sich die Wellenlänge durch das Drehen der Welle linear verändert, wird dieser Faktor aus diesen beiden Werten gebildet. Um ein möglichst genaues Ergebnis zu erzielen, wurde zu diesem
Zweck die Halogenlampe genutzt, da sie ein kontinuierliches Spektrum und dementsprechend
viele Messwerte liefern kann. Die sich aus der Messreihe ergebende Regressionsgerade ist in
Abb. (3.17) dargestellt. Die Gerade sowie die Funktionsgleichung, aus der sich der Proportionalitätsfaktor ablesen lässt, wurden mit Excel erstellt. Aus der Gleichung kann somit ein
Faktor von 857,5 abgelesen werden, durch welchen die Motorkoordinate geteilt werden muss,
um die aktuelle Wellenlänge zu errechnen und anzuzeigen. Der y-Achsenabschnitt ist hier
zu vernachlässigen und kommt dadurch zustande, dass der Motor bei Beginn der Messreihe
schon eine aktuelle Motorkoordinate besitzt. Diese hat aber keinen Einuss auf die Errechnung des Proportionalitätsfaktors.
Abbildung 3.17.: Regressionsgerade zur Bestimmung der Proportionalitätsfaktors
37
3.3. Optimierung der Lichteinkopplung
3.3.1. Lichteinkopplung am Monochromator
Um das Anregungslicht in den Bioreaktor einkoppeln zu können, muss es zuerst in eine optische Faser fokussiert werden. Am Monochromator wird zu diesem Zweck ein modiziertes
Bauteil der Mikrobank der Firma Linos verwendet. In Abb. (3.18a) sind die zusätzlichen
Bohrungen mit einem Durchmesser von 6 mm zu erkennen, welche die Montage ermöglichen.
(a) Linos-Bauelemente
(b) Montierte optische Faser
Abbildung 3.18.: Montage des SMA-Adapters am Monochromator
Da am Monochromator zwei Schrauben vorhanden waren, welche nach dem Ausbau des
Gerätes keine Verwendung mehr hatten, konnten diese aufgebohrt werden und dienen dadurch als Führung für die Stangen des Mikrobanksystems. Über das erweiterte Linos-Bauelement
kann dann die SMA-Aufnahme für die optischen Fasern montiert werden. Der Aufbau ist zu
dem durch eine Optik erweiterbar, um das Licht gegebenenfalls zu fokussieren. Das System
ist in Abb. (3.18b) sowie durch die Schematik in Abb. (3.19) veranschaulicht.
38
Abbildung 3.19.: Schematische Darstellung der Lichteinkopplung am Ausgangsspalt (Draufsicht)
3.3.2. Aufbau einer LED-Lichtquelle
Wie schon zuvor erwähnt können Einzelmessungen auch mit LEDs in den Anregungswellenlängen 365 nm, 400 nm und 460 nm durchgeführt werden. Die LEDs sind von der Firma
LEDEngin, werden über einen LED-Konverter mit 700 mA betrieben und zeichnen sich vor
allem durch ihre hohe elektrische Leistung von 5 W aus. Wie in Abb. (3.20) zu sehen besitzen die LEDs auch eine verhältnismäig schmale Bandbreite. In der Grak ist auÿerdem
zu erkennen, dass der Peak der 400 nm LED um einige Nanometer abweicht. Weitere Daten der LEDs und des Konverters nden sich im Anhang. Die drei Lichtquellen sind in ein
Kunststogehäuse eingebaut, in welchem sie über Schalter jeweils einzeln betrieben werden
können. Das Gehäuse ist in Abb. (3.21) dargestellt. Für jede LED ist ein SMA-Adapter
vorhanden, wodurch die Wellenlänge durch wechseln des Anschlusses geändert werden kann.
Um eine gute Wärmeabfuhr zu gewährleisten wurden die LEDs mit Wärmeleitkleber auf einem Aluminiumblock befestigt, welcher zusammen mit der Aufnahme für die SMA-Adapter
als Kühlkörper dient. In Abb. (3.22) sowie Abb. (3.23) ist der Aufbau der Lichteinkopplung
im Detail zu erkennen. Die Schrauben werden benötigt um den Aluminiumblock von auÿen
am Gehäuse zu befestigen und um die Faseraufnahme und den Kühlkörper gegeneinander
zu verspannen. Auÿerdem erkennbar ist die Nut um die Kabel nach auÿen zu führen ohne
sie einzuklemmen. Die Bauteile wurden in Anlehnung an die Maÿe der LINOS Bauelemente
gefertigt. Konstruktionszeichnungen sowie eine Skizze des Schaltplans nden sich im Anhang.
Abbildung 3.20.: Die Spektren der drei LED-Lichtquellen von LED-Engin
Abbildung 3.21.: LED-Lichtquelle mit den Anregungswellenlängen 365 nm, 400 nm und 460 nm
39
40
(a) Aufnahme für den SMA-Adapter (links) und
(b) Zusammengesetzte Lichteinkopplung
aufgeklebte LED (rechts)
Abbildung 3.22.: LED-Fasereinkopplung
Abbildung 3.23.: Schematische Darstellung der Lichteinkopplung im LED-Gehäuse (Draufsicht)
41
3.3.3. Problematik der Lichteinkopplung
Die Einkopplung des Lichts am Monochromator ist mit sehr starken Verlusten verbunden.
Dies hat verschiedene Gründe. Die 50 W Quecksilberdampampe setzt sehr viel der abgegebenen Leistung in Wärme um, wodurch sich die Leistung bei 405 nm gemessen auf ca. 30 mW
reduziert. Im Vergleich dazu liefert die LED nach Einkopplung in eine Faser ca. 20 mW.
Zusätzlich verstärkt wird dieser Leistungsverlust durch die Optik und die spaltförmige Austrittsönung des Monochromators sowie durch die Tatsache dass nicht das komplette Licht
im Lampengehäuse nach vorne abstrahlt. Am Ausgangsspalt erreicht der Monochromator
dadurch eine Leistung von ca. 128 µW. Hinzu kommt schlieÿlich, dass sich nur ein Bruchteil
der spaltförmigen Lichtquelle am Monochromator Ausgang in eine optische Faser einkoppeln
lässt. Um die Leistung zu erhöhen, wurde versucht das Licht durch ein optisches System zu
bündeln und auf die Faser zu fokussieren. Die Möglichkeiten werden hier allerdings durch
die numerische Apertur der Glasfaserkabel eingeschränkt.
N A = n · sin(αmax )
(3.2)
Wie in Gl. (3.2) zu sehen ergibt sich die N A aus dem Produkt des Sinus des halben objektseitigen Önungswinkels αmax und dem Brechungsindex n des Immersionsmediums, welcher
hier vernachlässigt werden kann, da sich das Licht ständig in Luft bewegt. Daraus folgt für
spätere Berechnungen n = 1. Bei optischen Leitern kann über die N A der Önungswinkel
des aus dem Ende des Leiters austretenden Lichtkegels berechnet werden. Diese Beziehung
ist in einer Skizze in Abb. (3.24) verdeutlicht. Im Umkehrschluss kann von der Faser also nur
Licht durch Totalreexion weitergeleitet werden, welches unter dem durch die N A vorgegebenen oder einem kleinerem Winkel einfällt. Über den Önungswinkel und den Linsenradius
kann schlieÿlich durch eine einfache trigonometrische Beziehung (Gl. 3.3) der Mindestabstand
zwischen Linse und Faser berechnet und damit auch die Mindestbrennweite fmin bestimmt
werden.
fmin =
dlinse
2
tan(αmax )
(3.3)
Abbildung 3.24.: Schematische Darstellung der numerischen Apertur am Lichtwellenleiter
42
43
3.4. Versuchsübersicht
3.4.1. Aufbau der Fluoreszenzmessungen
Wie in den vorherigen Kapiteln bereits erwähnt kann die Fluoreszenz der Biouorophore
auf zwei verschiedene Arten gemessen werden. In diesem Kapitel wird das Messprinzip der
beiden Methoden noch einmal verdeutlicht. In Abb. (3.25) ist der Aufbau der ersten Methode schematisch dargestellt. Mit dem Würfelelement lassen sich vor allem Oine- und
Atlinemessungen realisieren. In der Mitte des Würfels bendet sich eine Küvette, gefüllt mit
der zu untersuchenden Fluoreszenzprobe. Über die beiden SMA-Adapter kann jeweils eine
optische Faser am Würfel befestigt werden, um zum einen das Anregungslicht einzukoppeln
und zum anderen das Fluoreszenzsignal an das CCD-Spektrometer weiterzuleiten. Die in
den SMA-Adaptern integrierten Kollimatorlinsen dienen einerseits der Parallelisierung des
Anregungslichts und andererseits der Fokussierung des Fluoreszenzsignals auf die Detektionsfaser. Im genutzten Messaufbau wurde zur Einkopplung eine Faser mit einem Durchmesser
von 1000 µm und für die Detektion eine Faser mit 600 µm Durchmesser verwendet.
Abbildung 3.25.: Schematische Darstellung des Aufbaus zur Oine- und Atlinemessung
44
Die für die Verdünnungsreihen genutzten Makroküvetten von der Firma Brand haben ein
Standardmaÿ von 12,5 mm × 12,5 mm, besitzen eine Wanddicke von ungefähr 1 mm und bestehen aus dem Kunststo PMMA. Um den Aufbau für eine Atlinemessung zu nutzen kann
des weiteren eine Durchussküvette eingebaut werden. Für die in Kap. (3.4.4) beschriebene
Batchfermentation wurde eine Durchussküvette der Firma Hellma verwendet. Sie besteht
aus dem Quarzglas Suprasil und trägt die genaue Bezeichnung 131-QS.
Die zweite Messmethode ist die schon oft angesprochene Onlinemessung mittels Tauchsonde. Eine Skizze des Messaufbaus zeigt Abb. (3.26). Die Tauchsonde bendet sich hier
direkt in der uoreszierenden Lösung bzw. dem Kulturmedium für S. cerevisiae. Über die
LEDs oder den Monochromator werden die Anregungswellenlängen eingekoppelt, welche im
Nahfeld vor dem Sondenkopf Fluoreszenz hervorrufen sollen. Ist Fluoreszenz vorhanden wird
diese von der detektierenden Fasern ebenfalls an das CCD-Spektrometer weitergeleitet und
kann ausgewertet werden.
Abbildung 3.26.: Schematische Darstellung des Aufbaus zur Onlinemessung
45
3.4.2. Verdünnungsreihen
Um die Empndlichkeit des Messaufbaus zu überprüfen, wurden Fluoreszenzmessungen in
zwei verschiedenen Verdünnungsreihen durchgeführt. Des Weiteren wurde daraufhin versucht, Fluoreszenz bei der Hefe S. cerevisiae zu detektieren, um die Eignung des Messsystems für weitere Versuche im Bioreaktor zu bestätigen. In den folgenden Tabellen sind die für
die Versuche wichtigen chemischen und biologischen Substanzen aufgelistet. Zudem ndet
sich hier auch die Zusammensetzung des genutzten synthetischen Kulturmediums welches
an der Hochschule Mannheim entwickelt wurde. 9 Das standardmäÿig für die Hefefermentation verwendete YPD-Komplexmedium aus Glukose, Pepton und Hefeextrakt kann für die
Versuche nicht verwendet werden, da es eine zu starke Eigenuoreszenz besitzt. Im Rahmen
der Fluoreszenzmessungen von S. cerevaesiae wurde von der handelsüblichen Wieninger Hefe
Gebrauch gemacht. Dabei entsprechen 1,786 g frische Bäckerhefe ungefähr 0,5 g Trockenmasse.
Tabelle 3.5.: Zusammensetzung des synthetischen Kulturmediums welches für die Fluoreszenzmessung der
Hefe im Schüttelkolben sowie für die Batch-Fermentation genutzt wurde
Komponente
Konzentration Herstellerinformation
(NH4 )2 SO4
16,0 g l−1
Merck 101211
MgSO4 × 7 H2 O
1,15 g l−1
Merck 105886
NH4 H2 PO4
1,25 g l−1
Roth 0268
5,0 g l−1
Merck 104936
10,0 mg l−1
AppliChem A2088
105,0 mg l−1
AppliChem A1716
1,0 mg l−1
AppliChem A0969
CaCl2 × 2 H2 O
420,0 mg l−1
Merck 102382
FeCl3 × 6 H2 O
15,3 mg l−1
Roth P742
ZnSO4 × 7 H2 O
8,8 mg l−1
BDH Prolabo 29253
MnSO4 × H2 O
10,5 mg l−1
AppliChem A2088
CuSO4 × 5 H2 O
2,4 mg l−1
Roth P025
Polypropylenglykol
1,0 mg l−1
BDH Prolabo 297776T
30,0 g l−1
BDH Prolabo 27480
KCl
Calcium-D(+)pantothenat
myo-Inosit
D(+)-Biotin
D(+)-Saccharose
46
Tabelle 3.6.: Auistung der für die Bestimmung der Nachweisgrenzen verwendeten Substanzen
Komponente Herstellerinformation
Chlorophyll a
Ethanol
Chininsulfat
H2 SO4
Sigma-Aldrich C5753
Merck 100983
AlfaAesar A17036
Merck 100713
Abbildung 3.27.: Diagramm zur Ermmittlung der Nachweisgrenze
Die Nachweisgrenzen des CCD-Spektrometers und damit die Empndlichkeit desselben
wird durch eine reine Oinemessung errechnet. Für die Messungen wurde Chlorophyll a in
reinem Ethanol und Chininsulfat in einer 0,1N Schwefelsäure gelöst. Nach der Bestimmung
der Intensitäten der Fluoreszenz der beiden Stoe werden die Counts und die zugehörigen
Konzentrationen in einem Diagramm aufgetragen. Werte welche sich näherungsweise linear verhalten werden durch eine Ursprungsgerade interpoliert. Da bei allen Messungen ein
Grundrauschen bedingt durch das verwendete Spektrometer vorhanden ist, muss dieses bei
der Interpolation gegen Null beachtet werden. Durch wiederholtes Messen des Rauschens
und Bilden der mittleren Standardabweichung entsteht so ein Grenzwert unter welchem kein
eindeutig als Fluoreszenz identizierbares Signal mehr messbar ist. Der Schnittpunkt dieses
Grenzwertes mit der Trendlinie der Verdünnungsreihe ist somit auch gleichzeitig die niedrigst
nachweisbare uoreszierende Konzentration in der jeweiligen Lösung.
47
Für jede Fluoreszenzmessung sowie auch bei der Bestimmung des Grundrauschens wurden
zehn Spektren aufgenommen und jeweils der Mittelwert der Intensitäten bei den einzelnen
Wellenlängen gebildet. Eine Beispielskizze des Diagramms zur Auswertung der Signale zeigt
Abb. (3.27). Es ist noch zu erwähnen, dass diese Auswertung nur für die beiden Wellenlängen mit der jeweils höchsten Intensität erfolgt. Die Konzentrationen der verschiedenen
Verdünnungsreihen sind in Tab. (3.7) aufgelistet.
Tabelle 3.7.: Konzentration der Substanzen im jeweiligen Lösungsmittel
Chlorophyll a [mg l−1] Chininsulfat [mg l−1]
200,000
10,000
100,000
5,000
50,000
2,500
25,000
1,250
12,500
0,625
6,250
0,313
3,125
0,156
1,563
0,078
0,781
0,039
0,391
Da die Tauchsonde ungefähr fünfmal empndlicher als der Aufbau zur Oinemessung
ist, kann das Ergebnis der Verdünnungsreihen von Chininsulfat und Chlorophyll a mit diesem Faktor multipliziert werden. Eine Überprüfung des Ergebnisses soll dann durch die
Fluoreszenzmessung von Hefe erfolgen (Kap. 3.4.3). In diesem Fall wird die Tauchsonde
für die Messungen genutzt. Auÿerdem werden hier ähnliche Umgebungsbedinungen hergestellt, welche später auch bei der Batchfermentation herrschen werden und in den folgenden
Kapiteln näher beschrieben sind. Um einen Vergleich zu den Versuchen von Walter Beyeler et al. im Jahre 1981 herzustellen werden die ermittelten Konzentrationen abschlieÿend
in ein ppb-Verhältnis umgerechnet. 3 Ursprünglich war auch eine Tauchsondenmessung in
gelöstem Chininsulfat geplant. Auf Grund des niederen pH-Wertes der verdünnten Schwefelsäure, musste diese aber verworfen werden, da das Sondenmodell laut Hersteller nicht für
ein solches Milieu ausgelegt ist.
48
Bezüglich der ppb-Verhältnisse muss noch darauf hingewiesen werden, dass zwei verschiedene Denition gebräuchlich sind. Es wird unterschieden zwischen dem ppb-Teilchenverhältnis
und dem ppb-Massenverhältnis. Ersteres bezieht sich auf das reine Verhältnis der Anzahl der
Moleküle und kann über die molare Masse und die entsprechende Teilchenanzahl der einzelnen Atome berechnet werden. Für das ppb-Massenverhältnis gilt die Denition, dass sich
ein µg eines Stoes in einem kg des Lösungsmittels bendet, was einem ppb entspricht. Bei
nicht wässrigen Lösungen wie Ethanol in der Verdünnungsreihe muss hier vor allem auf die
Dichte geachtet werden.
3.4.3. Fluoreszenzdetektion von S. cerevisiae im Schüttelkolben
Um die Tauglichkeit der Tauchsonde für eine Batch-Fermentation im Bioreaktor festzustellen, wurde vorerst versucht Fluoreszenz von Hefe in einem Erlenmeyerkolben zu detektieren.
Der Versuchsaufbau ist in Abb. (3.28) veranschaulicht. Um Reektionen zu reduzieren wurde
der Schüttelkolben mit einer schwarz beschichteten Alufolie umgeben. Durch einen beheizbaren Magnetrührer konnte Hefe und Medium ständig durchmischt werden und die Temperatur
wurde auf 30 ◦C festgelegt. Zur Unterstützung der Durchmischung sind in den Schüttelkolben
drei Strombrecher eingelassen. Wichtig beim Versuchsaufbau war es, die Tauchsonde gut zu
xieren, da Bewegungen der Sonde ein sehr starkes Messrauschen verursachen können. Des
Weiteren fand während des Versuchs keine Begasung mit Sauersto statt. Zur Hervorrufung
der Fluoreszenz wurde eine Konzentration von 5 g l−1 Trockenmasse in 200 ml des synthetischen, substratfreien Mediums gelöst.
Abbildung 3.28.: Versuchsaufbau der Fluoreszenzdetektion im Schüttelkolben
49
Als Nachweis, dass es sich bei den gemessenen Signalen tatsächlich um die Fluoreszenz der
Biouorophore handelt, wurde der Versuch in zwei Varianten durchgeführt. Der im Medium
gelösten Hefe wurde zum einen 5 ml Ethanol und zum anderen 500 mg Glukose hinzugefügt, nach dem sie mehrere Minuten auf konstanter Temperatur gehalten worden war. In
beiden Fällen sollte ein leichter Anstieg der Fluoreszenz von NADH und ein Abfall der FADFluoreszenz feststellbar sein (siehe Kap. 2.1.2).
Letztendlich musste natürlich auch die Möglichkeit ausgeschlossen werden, dass es sich
bei der gemessenen Strahlung nicht um Streulicht der Lichtquelle handelt. Zu diesem Zweck
kam ein Kantenlter zum Einsatz, welcher nur Anregungslicht unterhalb von 410 nm passieren lässt. In Abb. (3.29) ist der Eekt des Filters auf die Strahlung einer Halogenlampe
dargestellt.
Abbildung 3.29.: Lampenspektrum einer Halogenlampe mit und ohne Kantenlter
Zur Auswertung der Signale wurde zum einen das Gesamtspektrum der einzelnen Zustände
dokumentiert und zum anderen die Intensität der Fluoreszenzmaxima von NADH und FAD
über der Zeit aufgetragen. Die Integrationszeit für die Fluoreszenzdetektion betrug 2 s und
jeder Messwert entspricht dem Mittelwert von zwanzig Einzelmessungen. Zur Reduzierung
des Rauschens wurden die Kurven leicht geglättet.
50
3.4.4. Batch-Fermentation von S. cerevisiae im Bioreaktor
Nachdem im letzten Versuch die Eignung der Tauchsonde für die Fluoreszentdetektion von
Mikroorgansimen untersucht wurde, kam sie jetzt bei einer Batch-Fermentation im Bioreaktor zum Einsatz. Dies sollte Aufschluss darüber geben, ob die genutzten Komponenten
des Messsystems auch bei realen Fermentationsbedingungen brauchbare Ergebnisse liefern.
Für die Fermentation von S. cerevisiae wurde auch im Bioreaktor das bereits erwähnte synthetische Medium genutzt. Die Inhaltsstoe wurden auf ein Gesamtvolumen von 4 l hochgerechnet, in 3 l Wasser gelöst und anschlieÿend autoklaviert. Zusätzlich wurde 1 l Glukoselösung angesetzt und ebenfalls sterilisiert. Beim Ansetzen des Mediums war zu beachten, dass
die nicht temperaturbeständigen Vitamine D(+)-Biotin und Calcium-D(+)pantothenat erst
nach dem Autoklavieren über einen Sterillter zugegeben werden. Die für die Fermentation vorgegebenen Sollwerte der relevanten Prozessgröÿen sind in Tab. (3.8) zusammengestellt.
Tabelle 3.8.: Umgebungsbedingunen bei der Batch-Fermentation
Prozessgröÿe
Hefekonzentration zu Beginn
Temperatur
Rührerdrehzal
pH-Wert
Sauerstogehalt im Medium
Sollwert
2 g l−1
30 ◦C
600 min−1
5
60 %
Zur Überwachung des Prozesses und der späteren Auswertung wurden alle in Kap. (3.1.1)
aufgezählten, über das Sensorsystem erfassbaren Gröÿen herangezogen und durch das Prozessleitsystem dokumentiert. Die Regelung des pH-Wertes erfolgte durch 0,5M Salzsäure so
wie eine 10 % Ammoniaklösung. Um die Schaumentstehung zu unterbinden, wurde ein Silikonöl verwendet. Vor Beginn der Fermentation musste der Bioreaktor mit Alufolie umwickelt
werden, um den Einfall von Tageslicht in die Detektionsfaser der Tauchsonde zu verhindern
und das Fluoreszenzsignal nicht zu stören. Der Laborfermenter wurde schlieÿlich mit 2,5 l
Medium sowie 1 l Glukoselösung befüllt und auf die entsprechende Temperatur erwärmt. Der
Start der Fermentation erfolgte schlieÿlich durch Zugabe von 28 g Bäckherhefe, gelöst in 0,5 l
des verbliebenen Mediums, was bei einem Gesamtvolumen von 4 l einer Konzentration von
ungefähr 2 g l−1 Trockenmasse an Hefezellen entspricht.
51
Während des Fermetationsvorganges wurden mehrere Messungen vorgenommen, welche
anschlieÿend mit den erfassten Prozessgröÿen verglichen und ausgewertet werden sollen. Neben der Tauchsondenmessung bei einer Anregungswellenlänge von 365 nm wurde auch eine
Atlinemssung über eine Rollenpumpe mit einer Anregungswellenlänge von 460 nm durchgeführt. In das Würfelelement wurde ein Kurzpasslter mit einer Wellenlänge von 470 nm
integriert um eine Signalstörung durch langwelligeres Anregungslicht auszuschlieÿen. Die Erfassung der Fluoreszenzsignale erfolgte durch eine Integrationszeit von 2 s und die Mittelung
der Intensitäten über zehn Einzelmessungen. Für beide Messarten wurden fünf dieser gemittelten Spektren im Abstand von 20 min in Excel exportiert, wodurch für jede Intensität
ein Mittelwert aus fünfzig Messwerten entstand. Des Weiteren wurden auch die Fluoreszenzmaxima von NADH und FAD über den gesamten Fermentationszeitraum aufgezeichnet. Um
einen Vergleichswert zu der erfassten optischen Dichte zu erhalten, war es nötig zusätzlich bei
jeder Messung der Spektren eine Probe aus dem Reaktor zu entnehmen und einzufrieren, um
später mittels einer Neubauer-Zählkammer die Zellzahl zu diesen Zeitpunkten zu bestimmen.
Da mit dem verwendeten Medium bisher noch keinerlei Erfahrung gemacht werden konnte,
war es somit möglich das Zellwachstum auf verschiedenen Art und Weise über die Zeit zu
beoabachten. Nach dem Verbrauch der Substrate Glukose und Ethanol konnte schlieÿlich der
Versuch des vorhergegangenen Kap. (3.4.3) wiederholt werden. Den Mikroorganismen wurden 30 ml Ethanol zugefügt und das Signal mit einer Integrationszeit von 4 s aufgezeichnet,
um eine höhere Empndlichkeit zu erreichen und geringe Schwankungen in der Fluoreszenz
festzustellen. Durch Variieren des Begasungsvolumens sowie der Rühredrehzahl wurde anschlieÿend untersucht welche Einüsse diese beiden Gröÿen auf das Messrauschen und den
Signalverlauf haben.

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