nanoporöse membranmaterialien für die anwendung als 3d

Ausgewählte Forschungsergebnisse
Geschäftsfeld
B I O L O G I S C H E U N D M A K R O M O L E K U L A R E M AT E R I A L I E N
Gruppe
P O LY M E R F O L I E N U N D M E M B R A N E N
Prof. Dr. Andreas Heilmann | Telefon +49 345 5589-180 | andreas.heilmann@iwmh.fraunhofer.de
verbesserte Funktionalität
NANOPORÖSE MEMBRANMATERIALIEN FÜR
DIE ANWENDUNG ALS 3D-BIOCHIP-ARRAY
Die Mikroarray-Biochip-Technologie ist ein wichtiges Werkzeug
(thermomechanische Prägung) oder 30 µm (laserstrukturiert).
für die Diagnostik in Medizin, Pharmazie, Biochemie, Genetik
In den Spots befindet sich die 3D-Porenmatrix mit einer
und Mikrobiologie. Klassische Biochips (Mikroarrays) bestehen
Schichtdicke von 50 µm sowie einem Porendurchmesser von
aus einer Vielzahl von systematisch angeordneten kleinen
225 nm bei einer Porosität von 42 Prozent.
Spots auf einem planen Träger aus Glas, Kunststoff oder Metall. Durch den Übergang von der planen 2D-Matrix zu einer
Chemische Aktivierung
porösen 3D-Matrix auf Basis von nanoporösem Aluminiumoxid
Um eine feste Kopplung von Oligonukleotiden beziehungs-
erfolgt eine deutliche Vergrößerung der nutzbaren Oberfläche.
weise Nukleinsäuren (DNS) an die Oberfläche in den Spots zu
Die damit mögliche Miniaturisierung der Chipgröße und die
gewährleisten, müssen die Poreninnenwände zuvor aktiviert
Verringerung des Probenvolumens führt durch die signifi-
werden. Zur Aktivierung wurde der Organosilan-Linker 3-Ami-
kante Erhöhung der Sondenmolekülanzahl und -dichte zu
nopropyltrimethoxysilan eingesetzt. Dadurch erhält die Ober-
einer erheblichen Erhöhung der Messempfindlichkeit und
fläche des Biochip-Arrays eine positive Ladung mit reaktiven
-geschwindigkeit.
primären Aminen (-NH3). Durch die elektrostatische Wechselwirkung der positiv geladenen Aminosilan-Gruppen mit den
Membranherstellung und Charakterisierung
negativ geladenen Gruppen des DNS-Phosphatrückgrads kann
Als Ausgangsmaterial für die Herstellung der Biochip-Arrays
nun eine feste elektrostatische Bindung zwischen den Aminen
wird hochreines Aluminium verwendet. Die Dimensionierung
(+NH3) und der DNS in den Spots erfolgen. Der Nachweis der
der Array-Spots auf der Aluminiumoberfläche erfolgt durch
Silanisierung mit 3-Aminopropyltrimethoxysilan erfolgte mit-
eine thermomechanische Prägung oder durch Laserbearbei-
tels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und energiedis-
tung. Bei der anschließenden anodischen Oxidation von Alu-
persiver Röntgenspektroskopie (EDX-Nanospotanalyse). Durch
minium entsteht eine nanoporöse Oxidschicht, die sich durch
die Detektion von Silizium und Stickstoff konnte anhand der
senkrecht zur Oberfläche angeordnete, parallele Nanoporen
erhaltenen EDX-Spektren für die hergestellten Biochip-Arrays
auszeichnet (Abbildung 1). Die Porengröße kann durch die
eine Aktivierung der Poreninnenwand nach Silanisierung mit
Herstellungsparameter zwischen 20 und 450 nm eingestellt
3-Aminopropyltrimethoxysilan nachgewiesen werden.
werden. Die Schichtdicke wird durch die Anodisierungszeit
bestimmt. Durch weitere nasschemische Ätzschritte wird das
DNA-Immobilisierung
Aluminium von der Rückseite entfernt und die Poren der
An die erfolgreiche Aktivierung schließt sich die Biofunk-
erhaltenen Membran durch Entfernung der Barriereschicht
tionalisierung mit den DNS-Sondenmolekülen an. Als
geöffnet.
Sondenmoleküle wurden hybridisierungsfähige und mit
Die so entwickelten Biochips haben eine Gesamtgröße von
Cyanine-Farbstoffen (Cy3 und Cy5) fluoreszenzmarkierte
26 x 76 mm mit optisch transparenten Spots von 300 µm
DNS-Sequenzen mit unterschiedlichen Basenpaaren (66 BP)
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Fraunhofer-Institut für Werkstoffmechanik IWM l Walter-Hülse-Straße 1 l 06120 Halle l www.iwm.fraunhofer.de
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Schematische Darstellung des nanoporösen 3D-Biochip-Arrays.
genutzt. Die Immobilisierung der in die Spots eingebrachten
DNS-Sondenmoleküle erfolgte durch ein anschließendes
UV-Crosslinking. Nach verschiedenen Waschschritten wird
mittels eines Plate-Readers die Fluoreszenzintensität der gebunden DNS-Sondenmoleküle gemessen. Es zeigte sich, dass
die Kopplung der DNS-Sondenmoleküle vorrangig über die
400 nm
Aminogruppen der Silanschicht erfolgt und eine unspezifische
300 nm
Bindung am reinen Substrat vernachlässigbar ist. Die Immobilisierungseffizienz und Stabilität der DNS-Sonden der neuartigen
1 Porenstruktur des nanoporösen Aluminiumoxids: Bruchfläche (links),
3D-Biochip-Arrays sind im Vergleich zu herkömmlichen,
Oberfläche (rechts).
kommerziell verfügbaren, mit Aminogruppen-funktionalisierten
Slides in Abbildung 2 dargestellt. Die über die Fluoreszenzinten­
sität ermittelte Konzentration der DNS-Sondenmoleküle ist 5,3
bis 19,4 Mal höher als bei herkömmlichen 2D-Biochip-Arrays.
Annika Thormann, Prof. Dr. Andreas Heilmann
Cy3-Fluoreszenzsignal in optischer Dichte
100 000
10 000
1000
100
AI203-BioChip-Array
AI203-BioChip-Array nach 26 Tagen
GBO-HTA®-Slide
GBO-HTA®-Slide nach 26 Tagen
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DNA-Sondenkonzentration in µg/Spot
2 Vergleich der Immobilisierungseffizienz von nanostrukturierten
3D-Biochip-Arrays und herkömmlichen GBO-HTA®-Slides.
Fraunhofer-Institut für Werkstoffmechanik IWM l Walter-Hülse-Straße 1 l 06120 Halle l www.iwm.fraunhofer.de
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